ES2831303T3 - Therapeutic antibodies - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une al segundo bucle extracelular de C5aR humano, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR1, una de CDR2 y una de CDR3, en donde dichas secuencias de CDR comprenden las secuencias SEQ ID NO: 9, 10 y 11, respectivamente, y en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR1, una de CDR2 y una de CDR3, en donde dichas secuencias de CDR comprenden las secuencias SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 12, y en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 16.An antibody that binds to the second extracellular loop of human C5aR, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence of CDR1, one of CDR2 and one of CDR3, wherein said CDR sequences comprise the sequences SEQ ID NO: 9, 10 and 11, respectively, and wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence of CDR1, one of CDR2 and one of CDR3, wherein said CDR sequences comprise the sequences SEQ ID NO: 13, 14 and 15, respectively, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 90% identical to SEQ ID NO: 12, and wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence at least 90% identical to SEQ ID NO: 16.

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Anticuerpos terapéuticosTherapeutic antibodies

Campo técnicoTechnical field

La presente invención se refiere al campo de anticuerpos terapéuticos.The present invention relates to the field of therapeutic antibodies.

AntecedentesBackground

La proteólisis de cada una de las proteínas del complemento C3-C5 da lugar a fragmentos catiónicos amino terminales con moléculas de señalización denominadas anafilotoxinas. La más potente de éstas, C5a, desencadena las respuestas más amplias. Considerando a los componentes de la respuesta inflamatoria como marginación e infiltración de leucocitos, liberación de enzimas proteolíticas unidas a gránulos, producción de oxígeno activado y radicales derivados de nitrógeno, cambios en el flujo sanguíneo y extravasación capilar, junto con la capacidad de contraer el músculo liso, la molécula C5a es el mediador proinflamatorio "completo". A niveles de subnanomolares a nanomolares, la molécula de C5a induce la quimiotaxis de todos los linajes mieloides (neutrófilos, eosinófilos y basófilos, macrófagos y monocitos) y produce permeabilidad vascular que se potencia notablemente por las prostaglandinas y leucocitos circulantes. Mayores concentraciones nanomolares inducen desgranulación y activación de la NADPH oxidasa. Esta amplitud de bioactividad contrasta con otros mediadores inflamatorios. C5a está implicada en la patogénesis de diversos trastornos entre los que se incluyen artritis reumatoide, psoriasis, septicemia, lesión de reperfusión y síndrome de distrés respiratorio del adulto (Gerard y Gerard, 1994; Murdoch y Finn, 2000).Proteolysis of each of the C3-C5 complement proteins gives rise to amino terminal cationic fragments with signaling molecules called anaphylatoxins. The most powerful of these, C5a, triggers the broadest responses. Considering the components of the inflammatory response such as leukocyte marginalization and infiltration, release of granule-bound proteolytic enzymes, production of activated oxygen and nitrogen-derived radicals, changes in blood flow and capillary leakage, along with the ability to contract muscle smooth, the C5a molecule is the "full" pro-inflammatory mediator. At subnanomolar to nanomolar levels, the C5a molecule induces chemotaxis of all myeloid lineages (neutrophils, eosinophils, and basophils, macrophages, and monocytes) and produces vascular permeability that is markedly enhanced by circulating prostaglandins and leukocytes. Higher nanomolar concentrations induce degranulation and activation of NADPH oxidase. This breadth of bioactivity is in contrast to other inflammatory mediators. C5a is involved in the pathogenesis of various disorders including rheumatoid arthritis, psoriasis, sepsis, reperfusion injury, and adult respiratory distress syndrome (Gerard and Gerard, 1994; Murdoch and Finn, 2000).

Las actividades de C5a están mediadas por la unión de C5a a su receptor (C5aR). C5aR pertenece a la familia de receptores acoplados a proteínas G de siete dominios transmembrana. C5aR es un receptor de alta afinidad por C5a, con una Kd de ~1 nM y está localizado en varios tipos celulares diferentes entre los que se incluyen los leucocitos. El número de receptores por célula es extremadamente alto, de hasta 200.000 sitios por leucocito. La activación biológica del receptor se produce por encima del intervalo que satura la unión.The activities of C5a are mediated by the binding of C5a to its receptor (C5aR). C5aR belongs to the family of seven transmembrane domain G protein-coupled receptors. C5aR is a high affinity receptor for C5a, with a Kd of ~ 1 nM and is localized in several different cell types including leukocytes. The number of receptors per cell is extremely high, up to 200,000 sites per leukocyte. Biological receptor activation occurs above the binding saturation range.

La estructura de C5aR se ajusta a la de la familia de receptores con siete dominios transmembrana, estando seguido el extremo N extracelular por siete hélices transmembrana conectadas por dominios interhelicoidales que se alternan como bucles intracelulares y extracelulares y terminando con un dominio C-terminal intracelular. C5aR contiene un dominio extracelular N-terminal extendido. Este dominio N-terminal grande es típico de los receptores acoplados a proteínas G que se unen a péptidos entre los que se incluyen las familias de receptores de IL-8 y de fMet-Leu-Phe (FMLP).The structure of C5aR conforms to that of the receptor family with seven transmembrane domains, the extracellular N-terminus being followed by seven transmembrane helices connected by interhelical domains that alternate as intracellular and extracellular loops and ending with an intracellular C-terminal domain. C5aR contains an extended N-terminal extracellular domain. This large N-terminal domain is typical of peptide-binding G-protein coupled receptors including the IL-8 and fMet-Leu-Phe (FMLP) receptor families.

La inhibición de las respuestas de C5a con antagonistas de C5aR reduce la respuesta inflamatoria aguda mediada por C5a sin afectar a otros componentes del complemento. Con este fin, Se han descrito previamente antagonistas peptídicos de C5aR y anticuerpos anti-receptor de C5a (Watanabe et al., 1995; Pellas et al., 1998; Konteatis et al., 1994; Kaneko et al., 1995; Morgan et al., 1993). Por ejemplo, el documento WO 95/00164 describe anticuerpos dirigidos contra un péptido N-terminal (restos 9-29) de C5aR. Los documentos WO 03/062278 y WO 2008/022390 también describen anticuerpos dirigidos contra C5aR. Tres de estos anticuerpos de ratón se denominaron 7F3, 6C12 y 12D4. Se demostró que estos anticuerpos tenían excelentes propiedades, tales como ser muy eficaces en el bloqueo de la unión de C5a a su receptor, detener la migración dirigida por C5a de neutrófilos in vitro y prevenir la inflamación en modelos animales. Para controlar enfermedades crónicas, puede ser necesario administrar el anticuerpo en ocasiones sucesivas durante meses o años. Sin embargo, un inconveniente de administrar anticuerpos de ratón es que el sistema inmunitario humano puede generar sus propios anticuerpos dirigidos contra el anticuerpo de ratón (la respuesta HAMA). La respuesta HAMA puede neutralizar los anticuerpos de ratón eliminándolos rápidamente de la sangre, impidiendo de esta manera que el anticuerpo de ratón se una a su diana. Para evitar el desarrollo de una respuesta HAMA, una estrategia que se ha adoptado es "humanizar" el anticuerpo de ratón reemplazando el máximo de restos "extraños" en las regiones de unión que no pertenecen al epítopo con secuencias humanas.Inhibition of C5a responses with C5aR antagonists reduces the acute inflammatory response mediated by C5a without affecting other components of complement. To this end, peptide C5aR antagonists and anti-C5a receptor antibodies have been previously described (Watanabe et al., 1995; Pellas et al., 1998; Konteatis et al., 1994; Kaneko et al., 1995; Morgan et al. al., 1993). For example, WO 95/00164 describes antibodies directed against an N-terminal peptide (residues 9-29) of C5aR. WO 03/062278 and WO 2008/022390 also describe antibodies directed against C5aR. Three of these mouse antibodies were named 7F3, 6C12, and 12D4. These antibodies were shown to have excellent properties, such as being highly effective in blocking the binding of C5a to its receptor, stopping C5a-directed migration of neutrophils in vitro, and preventing inflammation in animal models. To control chronic diseases, it may be necessary to administer the antibody on successive occasions over months or years. However, a drawback of administering mouse antibodies is that the human immune system can generate its own antibodies directed against the mouse antibody (the HAMA response). The HAMA response can neutralize mouse antibodies by rapidly removing them from the blood, thereby preventing the mouse antibody from binding to its target. To avoid the development of a HAMA response, one strategy that has been adopted is to "humanize" the mouse antibody by replacing the maximum of "foreign" residues in the non-epitope binding regions with human sequences.

Un problema importante de los procedimientos de humanización ha sido una pérdida de afinidad por el antígeno (Jones et al., 1986), en algunos casos hasta 10 veces o más, especialmente cuando el antígeno es una proteína (Verhoeyen et al., 1988). La pérdida de afinidad es, por supuesto, muy indeseable. Como mínimo, significa que tendrá que inyectarse en el paciente más del anticuerpo humanizado, a un mayor coste y con mayor riesgo de efectos adversos. Incluso más críticamente, un anticuerpo con afinidad reducida puede tener peores funciones biológicas, tales como lisis del complemento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o neutralización de virus. Aunque enfrentada a estas dificultades, se ha descrito la humanización satisfactoria de anticuerpos anti-C5aR humanos en el documento WO 2009/103113.A major problem in humanization procedures has been a loss of affinity for the antigen (Jones et al., 1986), in some cases up to 10 times or more, especially when the antigen is a protein (Verhoeyen et al., 1988) . Loss of affinity is, of course, highly undesirable. At the very least, it means that more of the humanized antibody will have to be injected into the patient, at a higher cost and with a higher risk of adverse effects. Even more critically, an antibody with reduced affinity may have poorer biological functions, such as complement lysis, antibody-dependent cellular cytotoxicity, or virus neutralization. Although faced with these difficulties, the successful humanization of human anti-C5aR antibodies has been described in WO 2009/103113.

Se ha creado una pluralidad de estrategias durante los años para minimizar adicionalmente el riesgo de cualquier reacción secundaria indeseada de la administración de anticuerpos a pacientes, entre las que se incluyen la reducción de la probabilidad de formación de anticuerpos anti-fármaco en los pacientes mediante la generación de anticuerpos "completamente" humanos. A number of strategies have been developed over the years to further minimize the risk of any unwanted side reactions from antibody administration to patients, including reducing the likelihood of anti-drug antibody formation in patients by generation of "fully" human antibodies.

incluso hoy en día, la identificación de anticuerpos adecuados para aplicaciones terapéuticas es una tarea desafiante. Por lo tanto, siguen teniendo un gran interés antagonistas de C5aR alternativos y/o mejorados que puedan usarse en métodos de diagnóstico y/o terapéuticos.Even today, the identification of suitable antibodies for therapeutic applications is a challenging task. Therefore, alternative and / or improved C5aR antagonists that can be used in diagnostic and / or therapeutic methods remain of great interest.

SumarioSummary

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-C5aR que se une al 2o bucle de C5aR humano y al uso del mismo en el tratamiento de una enfermedad o trastorno inmunológico. La región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia con al menos una identidad del 90 % con la SEQ ID NO: 12, y comprende una secuencia de CDR1, una de CDR2 y una de CDR3, que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 9, 10 y 11, respectivamente. La región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia con al menos una identidad del 90 % con la SEQ ID NO: 16, y comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3, que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente.The present invention relates to an anti-C5aR antibody that binds to the 2nd loop of human C5aR and to the use thereof in the treatment of an immune disease or disorder. The variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence with at least 90% identity with SEQ ID NO: 12, and comprises a sequence of CDR1, one of CDR2 and one of CDR3, which comprise the sequences of SEQ ID NO: 9, 10 and 11, respectively. The variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence with at least 90% identity with SEQ ID NO: 16, and comprises a CDR1, a CDR2 and a CDR3, which comprise the sequences of SEQ ID NO: 13 , 14 and 15, respectively.

Los inventores han identificado una serie de anticuerpos que se unen a C5aR humano que son, en varios aspectos, funcionalmente superiores a los anticuerpos anti-C5aR descritos previamente.The inventors have identified a series of antibodies that bind to human C5aR that are, in several respects, functionally superior to previously described anti-C5aR antibodies.

Como se demuestra en el presente documento, los inventores han identificado una serie de anticuerpos humanos que se unen a C5aR humano (hC5aR) y pueden desplazar la unión de hC5a a hC5aR e inhibir la migración de neutrófilos mediada por hC5a. Además, los inventores han convertido satisfactoriamente restos no humanos presentes en la región marco de uno de estos anticuerpos anti-hC5aR en restos de línea germinal humana sin afectar a la potencia del anticuerpo.As demonstrated herein, the inventors have identified a number of human antibodies that bind to human C5aR (hC5aR) and can displace the binding of hC5a to hC5aR and inhibit hC5a-mediated migration of neutrophils. Furthermore, the inventors have successfully converted non-human residues present in the framework region of one of these anti-hC5aR antibodies to human germline residues without affecting the potency of the antibody.

Además, mediante la alteración de la región Fc, los inventores han establecido un anticuerpo anti-hC5aR que no induce la fagocitosis, ADCC o CDC in vitro. Los detalles de la invención serán evidentes a partir de la descripción de las realizaciones ejemplares.Furthermore, by altering the Fc region, the inventors have established an anti-hC5aR antibody that does not induce phagocytosis, ADCC or CDC in vitro. Details of the invention will be apparent from the description of the exemplary embodiments.

En una realización, el anticuerpo anti-C5aR es un anticuerpo humano que se une específicamente a hC5aR, en donde dicho anticuerpo se une preferentemente al segundo bucle extracelular de hC5aR.In one embodiment, the anti-C5aR antibody is a human antibody that specifically binds hC5aR, wherein said antibody preferentially binds to the second extracellular loop of hC5aR.

En una realización, el anticuerpo anti-C5aR se une específicamente a hC5aR, y su región Fc se ha modificado en comparación con secuencias de referencia IgG1, IgG2, IgG4 e IgG4/G2 reduciendo la capacidad de los anticuerpos de inducir la fagocitosis, ADCC y/o CDC a través de la interacción con el receptor Fcgamma (FcyR). En una realización particular, la región Fc del anticuerpo es lgG1 y, en otra realización particular, la región Fc comprende uno o más de los siguientes grupos de mutaciones puntualesIn one embodiment, the anti-C5aR antibody specifically binds to hC5aR, and its Fc region has been modified compared to reference sequences IgG1, IgG2, IgG4 and IgG4 / G2 reducing the ability of the antibodies to induce phagocytosis, ADCC and / or CDC through interaction with the Fcgamma receptor (FcyR). In a particular embodiment, the Fc region of the antibody is IgG1 and, in another particular embodiment, the Fc region comprises one or more of the following groups of point mutations

I) N297Q y/oI) N297Q and / or

II) L234A y L235E y/oII) L234A and L235E and / or

III) G236R y L328R y/oIII) G236R and L328R and / or

IV) N297Q, L234A y L235E y/oIV) N297Q, L234A and L235E and / or

V) N297Q, L234A, L235E y G237A y/oV) N297Q, L234A, L235E and G237A and / or

VI) L234A, L235E, G237A, A330S y P331SVI) L234A, L235E, G237A, A330S and P331S

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de los anticuerpos de acuerdo con la invención para el tratamiento de una enfermedad o trastorno inmunológico.In another aspect, the invention relates to the use of the antibodies according to the invention for the treatment of an immune disease or disorder.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que comprende la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad terapéutica de un anticuerpo como se describe en el presente documento.In another aspect, the invention relates to a method for treating a disease or disorder comprising administering to a subject in need thereof a therapeutic amount of an antibody as described herein.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo de la invención para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto el anticuerpo de la invención. En una realización, el trastorno es un trastorno inmunopatológico tal como una enfermedad autoinmunitaria.In another aspect, the present invention provides an antibody of the invention for use in a method of treating or preventing a disorder in a subject, the method comprising administering the antibody of the invention to the subject. In one embodiment, the disorder is an immunopathological disorder such as an autoimmune disease.

Otros aspectos y realizaciones de la invención serán evidentes a partir de la divulgación del presente documento, incluyendo las realizaciones ejemplares. De las divulgaciones se deduce que la invención proporciona nuevos anticuerpos terapéuticos con los diversos beneficios y ventajas que se caracterizan en el presente documento. Other aspects and embodiments of the invention will be apparent from the disclosure herein, including the exemplary embodiments. It is apparent from the disclosures that the invention provides novel therapeutic antibodies with the various benefits and advantages that are characterized herein.

Breve descripción de los dibujosBrief description of the drawings

La figura 1 muestra alineamientos de las regiones variables de una selección de anticuerpos monoclonales aislados y caracterizados en la solicitud.Figure 1 shows alignments of the variable regions of a selection of monoclonal antibodies isolated and characterized in the application.

La figura 2 muestra la especificidad de unión de una selección de anticuerpos por quimeras de C5aR humanas y de ratón. Unión de 32F3A6, 35F12A2 y 35F32A3 a C5aR quimérico de humano/ratón en comparación con la unión de Ref Ab Q. Se muestran esquemáticamente receptores quiméricos. Las regiones derivadas de C5aR humano y de ratón se muestran con una línea fina y con una línea gruesa, respectivamente. Figure 2 shows the binding specificity of a selection of antibodies by human and mouse C5aR chimeras. Binding of 32F3A6, 35F12A2, and 35F32A3 to human / mouse chimeric C5aR compared to Ref Ab Q binding. Chimeric receptors are shown schematically. The human and mouse C5aR derived regions are shown with a thin line and a thick line, respectively.

La figura 3 muestra alineamientos de las regiones variables de un anticuerpo con las secuencias variables pesadas y ligeras más próximas de línea germinal humana. "/" indica una "rotura en la secuencia, tal como entre segmentos V, D o J.Figure 3 shows alignments of the variable regions of an antibody with the closest human germline heavy and light variable sequences. "/" indicates a "break in the sequence, such as between V, D, or J segments.

Figura 4 Puntuaciones clínicas de tres grupos de tratamiento que han recibido una sola dosis principal (flecha) de 0,5, 1,5 o 10 mg/kg i.p. 5 días después de la inflamación establecida en el modelo de transferencia de suero K/BxN-hC5aR-KO/KI, seguido de 9 dosis diarias de 0,25, 0,5 o 2 mg/kg, respectivamente, representando las barras de error ±SD. Los controles recibieron IgG1 3G12.Figure 4 Clinical scores of three treatment groups that have received a single main dose (arrow) of 0.5, 1.5, or 10 mg / kg i.p. 5 days after inflammation established in the K / BxN-hC5aR-KO / KI serum transfer model, followed by 9 daily doses of 0.25, 0.5 or 2 mg / kg, respectively, representing the error bars ± SD. Controls received IgG1 3G12.

Figura 5 Expresión de proteína C5a en líquido sinovial de pacientes con Artritis Psoriásica y Osteoartritis (controles). El nivel de C5a estaba elevado significativamente en el grupo de pacientes con artritis psoriásica (p = 0,001; Mann-Whitney).Figure 5 Expression of C5a protein in synovial fluid of patients with Psoriatic Arthritis and Osteoarthritis (controls). The C5a level was significantly elevated in the group of patients with psoriatic arthritis (p = 0.001; Mann-Whitney).

Figura 6 Análisis semicuantitativo de la expresión de la proteína C5aR en enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. La expresión de la proteína C5aR se investigó por inmunohistoquímica y se analizó mediante la prueba de Kruskal-Wallis con prueba posterior de comparaciones múltiples de Dunn en GraphPad Prism 5, y se consideró significativo un valor de P<0,05. * P< 0,05; ** P<0,01; *** P<0,001.Figure 6 Semi-quantitative analysis of the expression of the C5aR protein in Crohn's disease and ulcerative colitis. The expression of the C5aR protein was investigated by immunohistochemistry and analyzed by the Kruskal-Wallis test with Dunn's multiple comparison post test in GraphPad Prism 5, and a P value <0.05 was considered significant. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001.

DefinicionesDefinitions

A menos que se indique otra cosa, la proteína recombinante, el cultivo celular y las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos convencionales, bien conocidos por el experto en la materia. Tales técnicas se describen y se explican a través de las fuentes bibliográficas tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley y Sons (1984), J. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta la actualidad), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley y Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta la actualidad).Unless otherwise indicated, the recombinant protein, cell culture, and immunological techniques used in the present invention are standard procedures, well known to those skilled in the art. Such techniques are described and explained through bibliographic sources such as, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), TA Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates to date), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ( 1988), and JE Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons (including all updates to date).

Como se usa en el presente documento, "receptor de C5a", "C5aR", "C5aRI" o "C5aR humano" y variaciones de los mismos, se refieren al receptor 1 del componente 5 del complemento humano que también se conoce en la técnica como receptor de anafilotoxina C5a y el antígeno CD88. C5aR pertenece a la familia de receptores acoplados a proteínas G de siete dominios transmembrana y se une a C5a (Gerard y Gerard, 1991). Se proporciona un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de un C5aR humano en la SEQ ID NO:41, sin embargo, como sabrá el experto en la materia, existen variantes alélicas naturales de esta molécula que también se incluyen en el término "C5aR". Los diversos dominios de C5aR se definen como se indica a continuación:As used herein, "C5a receptor", "C5aR", "C5aRI" or "human C5aR" and variations thereof refer to human complement component 5 receptor 1 which is also known in the art. as the C5a anaphylatoxin receptor and the CD88 antigen. C5aR belongs to the family of seven transmembrane domain G protein-coupled receptors and binds to C5a (Gerard and Gerard, 1991). An example of the amino acid sequence of a human C5aR is provided in SEQ ID NO: 41, however, as the person skilled in the art will know, there are natural allelic variants of this molecule that are also included in the term "C5aR". The various domains of C5aR are defined as follows:

aminoácidos 1 - 37: extremo N de dominio extracelular,amino acids 1-37: N-terminus of extracellular domain,

aminoácidos 38 - 61: dominio transmembrana,amino acids 38-61: transmembrane domain,

aminoácidos 62 - 71: dominio intracelular,amino acids 62-71: intracellular domain,

aminoácidos 72 - 94: dominio transmembrana,amino acids 72-94: transmembrane domain,

aminoácidos 95 - 110: dominio extracelular - bucle extracelular 1,amino acids 95-110: extracellular domain - extracellular loop 1,

aminoácidos 111 - 132: dominio transmembrana,amino acids 111-132: transmembrane domain,

aminoácidos 133 - 149: dominio intracelular,amino acids 133-149: intracellular domain,

aminoácidos 150 - 174: dominio transmembrana,amino acids 150-174: transmembrane domain,

aminoácidos 175 - 206: dominio extracelular - bucle extracelular 2,amino acids 175-206: extracellular domain - extracellular loop 2,

aminoácidos 207 - 227: dominio transmembrana,amino acids 207-227: transmembrane domain,

aminoácidos 228 - 242: dominio intracelular,amino acids 228-242: intracellular domain,

aminoácidos 243 - 264: dominio transmembrana,amino acids 243-264: transmembrane domain,

aminoácidos 265 - 283: dominio extracelular - bucle extracelular 3,amino acids 265-283: extracellular domain - extracellular loop 3,

aminoácidos 284 - 307: dominio transmembrana,amino acids 284-307: transmembrane domain,

aminoácidos 308 - 350: extremo C de dominio extracelular.amino acids 308-350: C-terminus of extracellular domain.

El término "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a la terapia médica de cualquier sujeto humano u otro sujeto animal que lo necesite. Es de esperar que dicho sujeto se haya sometido a un examen físico por un médico o veterinario, que ha recibido un diagnóstico provisional o definitivo que indicaría que el uso de dicho tratamiento específico es beneficioso para la salud de dicho sujeto humano u otro sujeto animal. La programación de tiempos y el objetivo de dicho tratamiento puede variar de un individuo a otro, según el estado de salud del sujeto en ese momento. Por tanto, dicho tratamiento puede ser profiláctico, paliativo, sintomático y/o curativo. En términos de la presente invención, Los tratamientos profilácticos, paliativos, sintomáticos y/o curativos pueden representar aspectos separados de la invención.The term "treatment", as used herein, refers to the medical therapy of any human or other animal subject in need. It is expected that said subject has undergone a physical examination by a physician or veterinarian, who has received a provisional or definitive diagnosis that would indicate that the use of said specific treatment is beneficial to the health of said human or other animal subject. The timing and goal of such treatment may vary from one individual to another, depending on the health status of the subject at that time. Therefore, said treatment can be prophylactic, palliative, symptomatic and / or curative. In terms of the present invention, prophylactic, palliative, symptomatic and / or curative treatments may represent separate aspects of the invention.

En relación con el tratamiento médico, el término "sujeto", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a cualquier animal, en particular, mamíferos, tales como seres humanos, caballos, vacas, gatos y perros, y pueden, cuando sea adecuado, usarse indistintamente con el término "paciente". Preferentemente, el sujeto es un ser humano. Tal como se usan en el presente documento, los términos "tratamiento» o "tratar" y variaciones de los mismos incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención suficiente para reducir o eliminar al menos un síntoma del trastorno.In relation to medical treatment, the term "subject", as used herein, is intended to refer to any animal, in particular mammals, such as humans, horses, cows, cats and dogs, and can, when appropriate, used interchangeably with the term "patient." Preferably the subject is a human. As used herein, the terms "treatment" or "treat" and variations thereof they include the administration of a therapeutically effective amount of an antibody of the invention sufficient to reduce or eliminate at least one symptom of the disorder.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "prevención" o "prevenir" o variaciones de los mismos se refieren a la protección de un sujeto del desarrollo de al menos un síntoma de una enfermedad, o a la reducción de la gravedad de un síntoma de un trastorno.As used herein, the terms "prevention" or "prevent" or variations thereof refer to protecting a subject from the development of at least one symptom of a disease, or reducing the severity of a disease. symptom of a disorder.

Como se usa en el presente documento, la expresión "exposición en la célula" se refiere a proporcionar el anticuerpo de tal manera que sea capaz de contactar/unirse a C5aR humano siempre que esté presente en la célula C5aR. As used herein, the term "exposure in the cell" refers to providing the antibody such that it is capable of contacting / binding to human C5aR as long as it is present in the C5aR cell.

La expresión "concentración efectiva del 50 por ciento" (abreviada como "CE50") representa la concentración de un anticuerpo de la invención que se necesita para conseguir el 50 por ciento de un efecto dado de la molécula a la que se dirige el anticuerpo (por ejemplo, inhibición/desplazamiento de la unión de C5a humana a C5aR humano). Un experto en la materia entenderá que un valor inferior de CE50 corresponde a un anticuerpo más potente.The term "50 percent effective concentration" (abbreviated as "EC50") represents the concentration of an antibody of the invention that is needed to achieve 50 percent of a given effect of the molecule to which the antibody is directed ( eg, inhibition / displacement of the binding of human C5a to human C5aR). One skilled in the art will understand that a lower EC50 value corresponds to a more potent antibody.

Como se usa en el presente documento, la expresión "inhibición" se refiere a una reducción significativa y, posiblemente, una anulación completa, de la actividad definida. Preferentemente, la actividad definida se reduce o se inhibe al menos un 50 por ciento, más preferentemente al menos un 75 por ciento e, incluso más preferentemente, al menos un 90 por ciento.As used herein, the term "inhibition" refers to a significant reduction, and possibly complete abrogation, of defined activity. Preferably, the defined activity is reduced or inhibited by at least 50 percent, more preferably at least 75 percent, and even more preferably at least 90 percent.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, se entenderá que la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", implican la inclusión de un elemento, número entero o etapa indicados, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.Throughout the present specification, the word "comprise" or variations such as "comprises" or "comprising" will be understood to imply the inclusion of an indicated element, integer or stage, or group of elements, integers or stages, but not the exclusion of any other element, integer or stage, or group of elements, integers or stages.

En una realización, una molécula consiste esencialmente en la secuencia definida.In one embodiment, a molecule consists essentially of the defined sequence.

En otra realización, una molécula consiste en la secuencia definida.In another embodiment, a molecule consists of the defined sequence.

En una realización, la molécula, tal como un anticuerpo o secuencia de ADN es una molécula aislada. La expresión "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que se ha separado y/o recuperado de otro/otros componentes de su entorno natural y/o purificado de una mezcla de componentes en su entorno natural.In one embodiment, the molecule, such as an antibody or DNA sequence, is an isolated molecule. The term "isolated antibody" refers to an antibody that has been separated and / or recovered from another component (s) in its natural environment and / or purified from a mixture of components in its natural environment.

El término "anticuerpo", como se cita en el presente documento, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, la "parte de unión a antígeno") o las cadenas individuales de los mismos. Los anticuerpo de longitud completa (o anticuerpos enteros) comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con el antígeno. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (en el presente documento abreviada como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones flanqueantes (FR).The term "antibody", as cited herein, includes whole antibodies and any antigen-binding fragments (ie, the "antigen-binding part") or individual chains thereof. Full-length antibodies (or whole antibodies) comprise four polypeptide chains, two heavy (H) chains, and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds. Each heavy chain is composed of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH). Each light chain is composed of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL). The heavy chain constant region is composed of three domains, CH1, CH2, and CH3. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with the antigen. Each light chain is composed of a light chain variable region (abbreviated herein as LCVR or VL) and a light chain constant region. The light chain constant region is composed of one domain, CL. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, called complementarity determining regions (CDR), interspersed with regions that are more conserved, called flanking regions (FR).

Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.Each VH and VL is made up of three CDRs and four FRs, arranged from the amino end to the carboxy end in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The constant regions of antibodies can mediate the binding of immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells) and the first component (Clq) of the classical complement system.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se usa para describir anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión a antígeno de los mismos (es decir, la "parte de unión a antígeno") o cadenas individuales del mismo que se unen específicamente a su antígeno correspondiente. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, F(ab’)2, F(ab)S, Fv (habitualmente, los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo), Fv monocatenario (scFv; véase, por ejemplo, Bird et al., Science 1988; 242:42S-426; y Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (habitualmente el dominio VH y CHI), y dAb (habitualmente un dominio VH); dominios VH, VL, VhH y V-NAR; moléculas monovalentes que comprenden una sola VH y una sola cadena VL; minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y cuerpos kappa (véase, por ejemplo, III et al. Protein Eng 1997;10:949-57); IgG de camélido; IgNAR; así como una o más CDR aisladas o un parátopo funcional, donde las CDR aisladas o restos de unión a antígeno o polipéptidos pueden asociarse o unirse entre sí para formar un fragmento de anticuerpo funcional. Se han descrito o revisado varios tipos de fragmentos de anticuerpo en, por ejemplo, Holliger y Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136; documento WO2005040219 y Publicaciones de Solicitudes de Patente de Estados Unidos 20050238646 y 20020161201. As used herein, the term "antibody" is used to describe whole antibodies and any antigen-binding fragments thereof (ie, the "antigen-binding part") or individual chains thereof that bind. specifically to its corresponding antigen. Examples of antigen-binding fragments include Fab, Fab ', F (ab) 2, F (ab') 2, F (ab) S, Fv fragments (usually the VL and VH domains of a single arm of an antibody ), Single-chain Fv (scFv; see, for example, Bird et al., Science 1988; 242: 42S-426; and Huston et al. PNAS 1988; 85: 5879-5883), dsFv, Fd (usually the VH domain and CHI), and dAb (usually a VH domain); VH, VL, VhH and V-NAR domains; monovalent molecules comprising a single VH and a single VL chain; minibodies, diabodies, tribodies, tetrabodies, and kappa bodies (see, eg, III et al. Protein Eng 1997; 10: 949-57); Camelid IgG; IgNAR; as well as one or more isolated CDRs or a functional paratope, where the isolated CDRs or antigen-binding moieties or polypeptides can associate or bind with each other to form a functional antibody fragment. Various types of antibody fragments have been described or reviewed in, for example, Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 2S: 1126-1136; WO2005040219 and United States Patent Application Publications 20050238646 and 20020161201.

La expresión "región determinante de complementariedad" ("CDR") o "región hipervariable", cuando se usan en el presente documento, se refiere a los restos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. Las CDR generalmente están compuestas por los restos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de salud y servicios humanos de Estados Unidos, Publicación NIH n.° 91 -3242) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91 -96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917). Típicamente, la numeración de restos de aminoácido en esta región se realiza por el método descrito en Kabat et al., anteriormente citado. Frases tales como "posición de Kabat", "resto de Kabat" y "de acuerdo con Kabat" en el presente documento hacen referencia a este sistema de numeración para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera. Usando el sistema de numeración de Kabat, la secuencia de aminoácidos lineal real de un péptido puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento o inserción en una región marco (FR) o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir inserciones de aminoácidos (resto 52a, 52b y 52c de acuerdo con Kabat) después del resto 52 de CDR H2 y restos insertados (por ejemplo, los restos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del resto 82 de la FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "convencional".The term "complementarity determining region" ("CDR") or "hypervariable region", when used herein, refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for antigen binding. CDRs are generally composed of amino acid residues 24-34 (L1), 50-56 (L2), and 89-97 (L3) in the light chain variable domain and 31-35 (H1), 50-65 (H2 ) and 95-102 (H3) in the heavy chain variable domain; (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) and / or the remnants of a "hypervariable loop" (remnants 26-32 (L1), 50-52 (L2) and 91-96 (L3) in the light chain variable domain and 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) in the heavy chain variable domain; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917). Typically, the numbering of amino acid residues in this region is performed by the method described in Kabat et al., Cited above. Phrases such as "Kabat position", "Kabat residue" and "according to Kabat" herein refer to this numbering system for heavy chain variable domains or light chain variable domains. Using the Kabat numbering system, the actual linear amino acid sequence of a peptide may contain fewer amino acids or additional amino acids corresponding to a shortening or insertion in a framework region (FR) or CDR of the variable domain. For example, a heavy chain variable domain can include amino acid insertions (residue 52a, 52b and 52c according to Kabat) after residue 52 of CDR H2 and inserted residues (e.g. residues 82a, 82b and 82c, etc. according to Kabat) after residue 82 of the heavy chain FR. The Kabat numbering of residues can be determined for a given antibody by aligning the regions of homology of the antibody sequence with a "standard" Kabat numbering sequence.

La expresión restos de la "región marco" o "FR" se refiere a los restos de aminoácido de VH o VL que no están dentro de las CDR, como se define en el presente documento.The term "framework region" or "FR" residues refers to VH or VL amino acid residues that are not within CDRs, as defined herein.

La región del fragmento cristalizable ("región Fc"/"dominio Fc") de un anticuerpo es la región de "cola" de un anticuerpo que interacciona con receptores de la superficie celular denominados receptores Fc, así como algunas proteínas del sistema del complemento.The region of the crystallizable fragment ("Fc region" / "Fc domain") of an antibody is the "tail" region of an antibody that interacts with cell surface receptors called Fc receptors, as well as some proteins of the complement system.

Los anticuerpos monoclonales habitualmente se obtienen fusionando células de mieloma con las células de bazo de un ratón que se ha inmunizado con el antígeno deseado. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos a partir de animales transgénicos (por ejemplo, ratones u otras especies adecuadas) que codifican anticuerpos humanos. Como alternativa, pueden fabricarse anticuerpos monoclonales recombinantes que implican tecnologías denominadas clonación de repertorio o presentación en fagos/presentación en levaduras. La ingeniería de anticuerpos recombinantes implica el uso de virus o levaduras para crear anticuerpos, en lugar de ratones.Monoclonal antibodies are usually obtained by fusing myeloma cells with spleen cells from a mouse that has been immunized with the desired antigen. Human monoclonal antibodies can be obtained from transgenic animals (eg, mice or other suitable species) encoding human antibodies. Alternatively, recombinant monoclonal antibodies can be made involving technologies called repertoire cloning or phage display / yeast display. Recombinant antibody engineering involves using viruses or yeast to create antibodies, rather than mice.

La expresión "anticuerpo humanizado", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo quimérico humano/no humano que contiene secuencias, normalmente al menos las regiones determinantes de complementariedad (secuencias de CDR mínimas) derivadas de una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal no humana. Un anticuerpo humanizado es, por lo tanto, una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que se han reemplazado restos de una región hipervariable del receptor por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas.The term "humanized antibody", as used herein, refers to a human / non-human chimeric antibody that contains sequences, usually at least the complementarity determining regions (minimal CDR sequences) derived from an immunoglobulin sequence of non-human germ line. A humanized antibody is therefore a human immunoglobulin (recipient antibody) in which residues of a hypervariable region of the receptor have been replaced by residues of a hypervariable region of a non-human species (donor antibody), such as a mouse, rat, rabbit, or non-human primate, having the desired specificity, affinity, and capacity.

Los anticuerpos humanizados que comprenden al menos regiones CDR no derivadas de secuencias de la línea germinal humana también pueden denominarse "anticuerpos quiméricos" si los genes de cadena ligera y pesada del anticuerpo se han construido, típicamente por ingeniería genética, a partir de genes de región constante y variable de inmunoglobulina que proceden de diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables de genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes humanos.Humanized antibodies comprising at least CDR regions not derived from human germline sequences may also be referred to as "chimeric antibodies" if the antibody heavy and light chain genes have been constructed, typically by genetic engineering, from region genes. constant and variable immunoglobulin that come from different species. For example, the variable gene segments of a mouse monoclonal antibody can bind to human constant segments.

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como las regiones CDR provienen de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Debe tenerse en cuenta que dichos anticuerpos, sin embargo, comprenden restos de aminoácido que no se encuentran en las secuencias de la línea germinal humana debido a mutaciones que se producen a causa de la maduración in vivo o in vitro. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también proviene principalmente de las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir, sin embargo, restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). Por otro lado, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos o regiones de unión a antígeno alternativas en las que las secuencias de CDR proceden de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón y se han injertado posteriormente en secuencias marco humanas (véase el anticuerpo humanizado anteriormente). El anticuerpo humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Dicho anticuerpo monoclonal humano puede producirse por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada. También pueden aislarse anticuerpos humanos de bibliotecas de secuencias construidas sobre selecciones de secuencias de la línea germinal humana, diversificadas adicionalmente con diversidad de secuencias naturales y sintéticas. Pueden prepararse anticuerpos humanos por inmunización in vitro de linfocitos humanos seguido de transformación de los linfocitos con virus de Epstein-Barr. La secuencia del anticuerpo humano puede identificarse permitiendo la producción del anticuerpo por métodos recombinantes.The term "human antibody", as used herein, is intended to include antibodies that have variable regions in which both the framework regions and the CDR regions are derived from human germline immunoglobulin sequences. It should be noted that such antibodies, however, comprise amino acid residues that are not found in human germline sequences due to mutations that occur due to in vivo or in vitro maturation. Furthermore, if the antibody contains a constant region, the constant region also comes primarily from human germline immunoglobulin sequences. The human antibodies of the invention may, however, include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (eg, mutations introduced by random and site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo). On the other hand, the term "human antibody", as used herein, is not intended to include antibodies or alternative antigen-binding regions in which the CDR sequences are derived from the germ line of another mammalian species, such as a mouse and have subsequently been grafted onto human framework sequences (see humanized antibody above). The human antibody can be a human monoclonal antibody. Said human monoclonal antibody can be produced by a hybridoma that includes a B cell obtained from a non-human transgenic animal, for example, a transgenic mouse, which has a genome that comprises a human heavy chain transgene and a fused light chain transgene. to an immortalized cell. Human antibodies can also be isolated from sequence libraries constructed on selections of human germline sequences, further diversified with diversity of natural and synthetic sequences. Human antibodies can be prepared by in vitro immunization of human lymphocytes followed by transformation of the cells. lymphocytes with Epstein-Barr virus. The sequence of the human antibody can be identified by allowing production of the antibody by recombinant methods.

Además, los anticuerpos humanizados, humanos y completamente humanos pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se efectúan para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo.In addition, humanized, human, and fully human antibodies can comprise residues that are not found on the recipient antibody or the donor antibody. These modifications are made to further refine the performance of the antibody.

La expresión "derivados de anticuerpo" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo, tal como un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.The term "antibody derivatives" refers to any modified form of the antibody, such as a conjugate of the antibody and another agent or antibody.

El término "antígeno" se refiere a la entidad molecular usada para la inmunización de un vertebrado inmunocompetente para producir un anticuerpo que reconozca al antígeno. En el presente documento, el término antígeno se usa en sentido más amplio y, en general, se entiende que incluye moléculas diana que se reconocen específicamente por el anticuerpo, incluyendo de esta manera fragmentos o miméticos de la molécula usada en el proceso de inmunización para inducir el anticuerpo o las moléculas usadas para el cribado tras la inmunización y también moléculas usadas para el cribado en casos en los que se obtienen anticuerpos por métodos alternativos tales como la tecnología de presentación en fagos.The term "antigen" refers to the molecular entity used for the immunization of an immunocompetent vertebrate to produce an antibody that recognizes the antigen. Herein, the term antigen is used in the broadest sense and is generally understood to include target molecules that are specifically recognized by the antibody, thus including fragments or mimetics of the molecule used in the immunization process to inducing the antibody or molecules used for screening after immunization and also molecules used for screening in cases where antibodies are obtained by alternative methods such as phage display technology.

El término "epítopo", como se usa en el presente documento, se define en el contexto de una interacción molecular entre un "polipéptido de unión a antígeno", tal como un anticuerpo, y su "antígeno» correspondiente. En general, "epítopo" se refiere al área o región de un antígeno al que se une específicamente un anticuerpo, es decir, el área o región en contacto físico con el anticuerpo. Un epítopo proteico puede comprender restos de aminoácido en el antígeno que están implicados directamente en la unión al anticuerpo (también denominado componente inmunodominante del epítopo) y otros restos de aminoácido que no están implicados directamente en la unión, tales como restos de aminoácido del antígeno que se bloquean de manera eficaz por el Ac (en otras palabras, el resto de aminoácido está dentro de la "superficie excluida al disolvente" y/o la "huella dactilar" del anticuerpo). Un antígeno dado puede comprender varios epítopos diferentes, que pueden incluir, sin limitación; determinantes antigénicos de péptidos lineales, determinantes antigénicos conformacionales que consisten en uno o más aminoácidos no contiguos localizados de manera que están cercanos entre sí en la conformación nativa (madura); y determinantes antigénicos post-traduccionales que consisten, en su totalidad o en parte, en estructuras moleculares unidas covalentemente al antígeno, tales como grupos de carbohidrato.The term "epitope", as used herein, is defined in the context of a molecular interaction between an "antigen-binding polypeptide", such as an antibody, and its corresponding "antigen". In general, "epitope "refers to the area or region of an antigen to which an antibody specifically binds, that is, the area or region in physical contact with the antibody. A protein epitope may comprise amino acid residues on the antigen that are directly involved in binding to the antibody (also called the immunodominant component of the epitope) and other amino acid residues that are not directly involved in binding, such as amino acid residues of the antigen that are effectively blocked by Ab (in other words, the amino acid residue is within the "solvent excluded surface" and / or the "fingerprint" of the antibody). A given antigen may comprise several different epitopes, which may include, without limitation; determinants linear peptide antigens, conformational antigenic determinants consisting of one or more non-contiguous amino acids located so that they are close to each other in the native (mature) conformation; and post-translational antigenic determinants consisting, in whole or in part, of molecular structures covalently attached to the antigen, such as carbohydrate groups.

A partir del hecho de que las descripciones y definiciones de epítopos, dependiendo del método de mapeo de epítopos utilizado, se obtienen a diferentes niveles de detalle, se deduce que puede realizarse una comparación de epítopos para diferentes Ac en el mismo Ag de manera similar a diferentes niveles de detalle.From the fact that the descriptions and definitions of epitopes, depending on the epitope mapping method used, are obtained at different levels of detail, it follows that an epitope comparison can be made for different Ab on the same Ag in a similar way to different levels of detail.

Los términos "unión", "que se une específicamente" y "especificidad de unión" se usan en el presente documento para describir la selectividad de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.The terms "binding", "specifically binding" and "binding specificity" are used herein to describe the selectivity of an antibody or antigen-binding fragment thereof.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden unirse específicamente a C5aR, lo que indica que el anticuerpo tiene una afinidad significativamente menor por otros antígenos, donde significativamente menor puede ser tal como una afinidad al menos 2 veces menor o 5 veces menor o 10 veces menor. El anticuerpo puede ser además específico de especie, de tal manera que el anticuerpo se una específicamente a C5aR humano pero no a C5aR de ratón con alta afinidad.Antibodies according to the invention can specifically bind to C5aR, indicating that the antibody has significantly lower affinity for other antigens, where significantly lower can be such as at least 2-fold lower or 5-fold lower or 10-fold lower affinity . The antibody may further be species specific, such that the antibody specifically binds human C5aR but not mouse C5aR with high affinity.

La expresión "afinidad de unión" se usa en el presente documento como una medida de la fuerza de una interacción covalente entre dos moléculas, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento del mismo, y un antígeno. La expresión "afinidad de unión" se usa para describir interacciones monovalentes (actividad intrínseca). La afinidad de unión entre dos moléculas, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento del mismo, y un antígeno, a través de una interacción monovalente puede cuantificarse mediante la determinación de la constante de disociación (Kd). A su vez, la Kd puede determinarse mediante la medición de la cinética de la formación y disociación del complejo, por ejemplo, mediante el método SPR. Las constantes de velocidad correspondientes a la asociación y disociación de un complejo monovalente se denominan constante de velocidad de asociación ka (o kon) y constante de velocidad de disociación kd (o koff), respectivamente. Kd se relaciona con ka y kd mediante la ecuación Kd = kd / ka.The term "binding affinity" is used herein as a measure of the strength of a covalent interaction between two molecules, eg, an antibody, or fragment thereof, and an antigen. The term "binding affinity" is used to describe monovalent interactions (intrinsic activity). The binding affinity between two molecules, eg, an antibody, or fragment thereof, and an antigen, through a monovalent interaction can be quantified by determining the dissociation constant (Kd). In turn, Kd can be determined by measuring the kinetics of complex formation and dissociation, for example, by the SPR method. The rate constants corresponding to the association and dissociation of a monovalent complex are called the rate constant of association ka (or kon) and the rate constant of dissociation kd (or koff), respectively. Kd is related to ka and kd by the equation Kd = kd / ka.

Además, "afinidad" se refiere a la fuerza de la unión entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y un ligando (por ejemplo, un antígeno). La afinidad de una molécula X por un ligando Y está representada por la constante de disociación (Kd), que es la concentración de Y que se requiere para ocupar los sitios de combinación de la mitad de las X moléculas presentes en una solución. Una Kd más pequeña indica una interacción más fuerte o de mayor afinidad y se necesita una menor concentración de ligando para ocupar los sitios. De manera similar, la especificidad de una interacción puede evaluarse mediante la determinación y comparación del valor de Kd para la interacción de interés, tal como una interacción específica entre un anticuerpo y un antígeno, con el valor de KD de una interacción que no es de interés.Furthermore, "affinity" refers to the strength of the binding between a single binding site on a molecule (eg, an antibody) and a ligand (eg, an antigen). The affinity of a molecule X for a ligand Y is represented by the dissociation constant (Kd), which is the concentration of Y that is required to occupy the combining sites of half of the X molecules present in a solution. A smaller Kd indicates a stronger or higher affinity interaction and a lower concentration of ligand is required to occupy the sites. Similarly, the specificity of an interaction can be assessed by determining and comparing the Kd value for the interaction of interest, such as a specific interaction between an antibody and an antigen, with the KD value for a non-drug interaction. interest.

Típicamente, la Kd para el anticuerpo con respecto a la diana será 2 veces, preferentemente 5 veces, más preferentemente 10 veces menor que la Kd con respecto a la otra molécula no diana, tal como un material no relacionado o acompañante en el entorno o control. Más preferentemente, la K^d será 50 veces menor, tal como 100 veces menor o 200 veces menor; incluso más preferentemente 500 veces menor, tal como 1.000 veces menor o 10.000 veces menor.Typically, the Kd for the antibody relative to the target will be 2 times, preferably 5 times, more preferably 10 times less than the Kd relative to the other non-target molecule, such as a non-target material. related or companion in the environment or control. More preferably, the K ^d will be 50 times less, such as 100 times less or 200 times less; even more preferably 500 times less, such as 1,000 times less or 10,000 times less.

El valor de esta constante de disociación puede determinarse directamente por métodos bien conocidos y puede calcularse incluso para mezclas complejas por métodos tales como, por ejemplo, los establecidos en Caceci et al. (Byte 9:340-362, 1984). Por ejemplo, la K^d puede establecerse usando un ensayo de unión de filtro de nitrocelulosa de doble filtro tal como el desvelado por Wong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993). En la técnica se incluyen otros ensayos convencionales para evaluar la capacidad de unión de ligandos tales como anticuerpos hacia dianas, entre los que se incluyen, por ejemplo, ELISA, transferencias Western, RIA y análisis de citometría de flujo. La cinética de unión y la afinidad de unión del anticuerpo también puede evaluarse por ensayos convencionales conocidos en la técnica, tales como SPR.The value of this dissociation constant can be determined directly by well-known methods and can be calculated even for complex mixtures by methods such as, for example, those established in Caceci et al. (Byte 9: 340-362, 1984). For example, K ^d can be established using a double filter nitrocellulose filter binding assay such as that disclosed by Wong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993). Other standard assays for assessing the binding ability of ligands such as antibodies to targets are included in the art, including, for example, ELISA, Western blots, RIA, and flow cytometric analysis. The binding kinetics and binding affinity of the antibody can also be assessed by standard assays known in the art, such as SPR.

Puede realizarse un ensayo de unión competitivo en el que la unión del anticuerpo a la diana se compara con la unión de la diana por otro ligando de esa diana, tal como otro anticuerpo. La concentración a la que se produce un 50 % de inhibición se conoce como Ki. En condiciones ideales, la Ki es equivalente a la K^d. El valor de Ki nunca será menor que la K^d, de manera que la medición de la Ki puede sustituirse convenientemente para proporcionar un límite superior para la K^d.A competitive binding assay can be performed in which the binding of the antibody to the target is compared to the binding of the target by another ligand for that target, such as another antibody. The concentration at which 50% inhibition occurs is known as Ki. Under ideal conditions, Ki is equivalent to K ^d . The Ki value will never be less than the K ^d , so the Ki measurement can be conveniently substituted to provide an upper limit for the K ^d .

Tal como apreciará el experto en la materia, la "avidez" se refiere a la fuerza total de interacción entre dos moléculas, tales como un anticuerpo y un antígeno. La avidez depende tanto de la afinidad como de la valencia de las interacciones.As will be appreciated by one of ordinary skill in the art, "avidity" refers to the total force of interaction between two molecules, such as an antibody and an antigen. Avidity depends on both the affinity and the valence of the interactions.

Otros ensayos para determinar la funcionalidad de un anticuerpo dado pueden incluir un ensayo basado en células que es específico para el antígeno dado y el efecto de unión del anticuerpo.Other assays to determine the functionality of a given antibody may include a cell-based assay that is specific for the given antigen and the binding effect of the antibody.

El término "identidad", como se conoce en la técnica, se refiere a la relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos, determinada por comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre polipéptidos, determinada por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más restos de aminoácido. La "identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineamientos de huecos (si existen) dirigidos por un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos"). La identidad de polipéptidos relacionados puede calcularse fácilmente por métodos conocidos. Dichos métodos incluyen, aunque no de forma limitativa, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., ed., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., ed., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).The term "identity", as known in the art, refers to the relationship between the sequences of two or more polypeptides, determined by comparison of the sequences. In the art, "identity" also means the degree of sequence relationship between polypeptides, determined by the number of matches between chains of two or more amino acid residues. "Identity" measures the percentage of identical matches between the smallest of two or more sequences with gap alignments (if any) driven by a particular mathematical model or computer program (ie, "algorithms"). The identity of related polypeptides can easily be calculated by known methods. Such methods include, but are not limited to, those described in Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., ed., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).

Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. En programas informáticos disponibles públicamente se describen métodos para determinar la identidad. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLa St N y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., citado anteriormente). También puede usarse el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la identidad.Preferred methods for determining identity are designed to provide the best match between the sequences tested. Methods for determining identity are described in publicly available computer programs. Preferred computer program methods for determining identity between two sequences include the GCG software package, including GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison , Wis.), BLASTP, BLa St N and FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). The BLASTX program is publicly available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Manual, Altschul et al. NCB / NLM / NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., Cited above). The well known Smith Waterman algorithm can also be used to determine identity.

Por ejemplo, usando el algoritmo informático GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), dos polipéptidos para los que se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia se alinean para una coincidencia óptima de sus respectivos aminoácidos (el "rango de coincidencias", determinado por el algoritmo). Junto con el algoritmo se usan una penalización de apertura de hueco (que se calcula como 3 veces la diagonal media; la "diagonal media" es la media de la diagonal de la matriz de comparación que se está usando; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácido por la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión de hueco (que normalmente es la {fracción (1/10)} multiplicada por la penalización de apertura de hueco), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62. El algoritmo también usa una matriz de comparación estándar (véase Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup. 3 (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62).For example, using the GAP computer algorithm (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), Two polypeptides for which percent sequence identity is to be determined are aligned for optimal match of their respective amino acids (the "range of matches", determined by the algorithm). Along with the algorithm a gap opening penalty is used (which is calculated as 3 times the mean diagonal; the "mean diagonal" is the mean of the diagonal of the comparison matrix being used; the "diagonal" is the score or number assigned to each amino acid perfect match by the particular comparison matrix) and a gap extension penalty (which is typically the {fraction (1/10)} multiplied by the gap opening penalty), as well as a comparison matrix such as PAM 250 or BLOSUM 62. The algorithm also uses a standard comparison matrix (see Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup. 3 (1978) for the PAM comparison matrix 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992) for BLOSUM 62 comparison matrix).

Los parámetros preferidos para una comparación de secuencias de péptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970); Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915-10919 (1992); Penalización por hueco: 12, Penalización por longitud de hueco: 4, Umbral de similitud: 0. Preferred parameters for a peptide sequence comparison include the following: Algorithm: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970); Comparison matrix: BLOSUM 62 from Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915-10919 (1992); Gap penalty: 12, Gap length penalty: 4, Similarity threshold: 0.

El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para comparaciones de péptidos (junto con ausencia de penalización para huecos finales) que usan el algoritmo de GAP.The GAP program is useful with the above parameters. The parameters mentioned above are the default parameters for peptide comparisons (along with no penalty for trailing gaps) using the GAP algorithm.

Una "sustitución de aminoácido conservativa" puede implicar una sustitución de un resto de aminoácido por otro resto, de forma que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del resto de aminoácido en esa posición. Esto se ejemplifica por los siguientes grupos de aminoácidos, con lo que las sustituciones de un aminoácido por un aminoácido diferente del mismo grupo se consideran sustituciones conservativas: Hidrófilos: Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr. Alifáticos: Val, Ile, Leu, Met. Básicos: Lys, Arg, His. Aromáticos: Phe, Tyr, Trp. Además, a menudo puede sustituirse cualquier resto por alanina.A "conservative amino acid substitution" can involve a substitution of one amino acid residue for another residue, such that there is little or no effect on the polarity or charge of the amino acid residue at that position. This is exemplified by the following amino acid groups, whereby substitutions of one amino acid for a different amino acid from the same group are considered conservative substitutions: Hydrophilic: Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr. Aliphatic: Val, Ile, Leu, Met. Basics: Lys, Arg, His. Aromatics: Phe, Tyr, Trp. Furthermore, any residue can often be substituted for alanine.

Además, si se desea, pueden introducirse aminoácidos no naturales o análogos de aminoácidos químicos como una sustitución o adición en la cadena de anticuerpo y/o inmunoglobulina de la presente invención. Estos aminoácidos incluyen, aunque no de forma limitativa, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido 6-amino hexanoico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butiladenina, fenilglicina, ciclohexilalanina, beta-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos diseñadores tales como beta-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos y análogos de aminoácidos en general.Furthermore, if desired, unnatural amino acids or chemical amino acid analogs may be introduced as a substitution or addition in the antibody and / or immunoglobulin chain of the present invention. These amino acids include, but are not limited to, the D-isomers of the common amino acids, 2,4-diaminobutyric acid, α-amino isobutyric acid, 4-aminobutyric acid, 2-aminobutyric acid, 6-amino hexanoic acid, 2- amino isobutyric, 3-amino propionic acid, ornithine, norleucine, norvaline, hydroxyproline, sarcosine, citrulline, homocitrulline, cysteic acid, t-butylglycine, t-butyladenine, phenylglycine, cyclohexylalanine, beta-alanine, fluoro-designers such as amino acids beta-methyl amino acids, Ca-methyl amino acids, Na-methyl amino acids and amino acid analogues in general.

Pueden prepararse mutantes de la secuencia de aminoácidos de la cadena de anticuerpo y/o inmunoglobulina de la presente invención introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en un ácido nucleico descrito en el presente documento o mediante síntesis in vitro del polipéptido deseado. Estos mutantes incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones y sustituciones de restos dentro de la secuencia de aminoácidos. Puede realizarse una combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que el producto polipeptídico final posea las características deseadas. Pueden prepararse polipéptidos mutantes (alterados) usando cualquier técnica conocida en este campo. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede someterse a mutagénesis in vitro. Dichas técnicas de mutagénesis in vitro incluyen la subclonación del polinucleótido en un vector adecuado, la transformación del vector en una cepa "mutadora" tal como la cepa XL-I red de E. coli (Stratagene) y la propagación de las bacterias transformadas durante un número adecuado de generaciones. Los productos derivados del ADN mutado/alterado pueden cribarse fácilmente usando técnicas descritas en el presente documento para determinar si tienen actividad de unión al receptor y/o inhibidora.Mutants of the amino acid sequence of the antibody and / or immunoglobulin chain of the present invention can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes in a nucleic acid described herein or by in vitro synthesis of the desired polypeptide. These mutants include, for example, deletions, insertions, and substitutions of residues within the amino acid sequence. A combination of deletion, insertion, and substitution can be performed to arrive at the final construct, provided that the final polypeptide product possesses the desired characteristics. Mutant (altered) polypeptides can be prepared using any technique known in the art. For example, a polynucleotide of the invention can undergo mutagenesis in vitro. Such in vitro mutagenesis techniques include subcloning the polynucleotide into a suitable vector, transforming the vector into a "mutator" strain such as E. coli strain XL-I red (Stratagene), and propagation of the transformed bacteria during a adequate number of generations. Products derived from mutated / altered DNA can easily be screened using techniques described herein to determine if they have receptor binding and / or inhibitory activity.

Para diseñar mutantes de secuencias de aminoácidos, la localización del sitio de la mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de la característica o características a modificar. Los sitios para la mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por ejemplo, mediante (1) la sustitución en primer lugar con elecciones de aminoácidos conservativas y después con selecciones más radicales dependiendo de los resultados conseguidos, (2) deleción del resto diana o (3) inserción de otros restos adyacentes al sitio localizado.To design amino acid sequence mutants, the location of the mutation site and the nature of the mutation will depend on the characteristic or characteristics to be modified. Mutation sites can be modified individually or serially, for example, by (1) substitution first with conservative amino acid choices and then more radical selections depending on the results achieved, (2) deletion of the target residue, or ( 3) insertion of other debris adjacent to the localized site.

Las deleciones de la secuencia de aminoácidos generalmente varían de aproximadamente 1 a 15 restos, más preferentemente de aproximadamente 1 a 10 restos y típicamente de aproximadamente 1 a 5 restos contiguos. Deletions in the amino acid sequence generally range from about 1 to 15 residues, more preferably from about 1 to 10 residues, and typically from about 1 to 5 contiguous residues.

DescripciónDescription

Los inventores han identificado varios aspectos de relevancia para la funcionalidad y eficacia de agentes terapéuticos biológicos y anticuerpos particulares, y el área principal de la presente invención es anticuerpos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias mediante la inhibición de la unión de C5a a C5aR.The inventors have identified several aspects of relevance to the functionality and efficacy of particular biological therapeutic agents and antibodies, and the main area of the present invention is antibodies for the treatment of inflammatory diseases by inhibiting the binding of C5a to C5aR.

Un aspecto de la divulgación se refiere a uno o más de una serie de anticuerpos que se caracterizan por su funcionalidad y/o la secuencia de aminoácidos de las CDR, la región variable de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras y/o la secuencia del dominio Fc.One aspect of the disclosure relates to one or more of a series of antibodies that are characterized by their functionality and / or the amino acid sequence of the CDRs, the variable region of the heavy and light chains and / or the sequence of the Fc domain.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa que incluye los dominios de anticuerpo y regiones convencionales.In one embodiment, the antibody is a full-length antibody that includes the conventional antibody domains and regions.

En una realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, pudiendo obtenerse dichos fragmentos usando técnicas convencionales de ingeniería de proteínas o recombinantes. Los fragmentos de anticuerpo de la invención pueden fabricarse por truncamiento, por ejemplo, mediante la eliminación de uno o más aminoácidos de los extremos N y/o C de un polipéptido. También pueden generarse fragmentos por una o más deleciones internas. Un anticuerpo de la invención puede ser, o puede comprender, un fragmento de uno cualquiera de los anticuerpos en los que se basa esta invención. Un anticuerpo de la invención puede ser, o puede comprender, una parte de unión a antígeno de uno de esos anticuerpos, o variantes de los mismos. Por ejemplo, el anticuerpo de la invención puede ser un fragmento Fab de uno de esos anticuerpos o variantes de los mismos, o puede ser un anticuerpo monocatenario derivado de uno de estos anticuerpos, o una variante del mismo. In one embodiment, the antibody is an antibody fragment, which fragments can be obtained using conventional recombinant or protein engineering techniques. Antibody fragments of the invention can be made by truncation, for example, by removing one or more amino acids from the N and / or C termini of a polypeptide. Fragments can also be generated by one or more internal deletions. An antibody of the invention may be, or may comprise, a fragment of any one of the antibodies on which this invention is based. An antibody of the invention may be, or may comprise, an antigen-binding portion of one of those antibodies, or variants thereof. For example, the antibody of the invention can be a Fab fragment of one of those antibodies or variants thereof, or it can be a single chain antibody derived from one of these antibodies, or a variant thereof.

Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser de diferentes especies entre las que se incluyen especies de mamífero tales como ratón, rata, conejo, cerdo o primate no humano. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de roedor y, más particularmente, un anticuerpo de ratón. Como alternativa, el anticuerpo puede proceder de una especie que no es un mamífero, tal como un pollo. El anticuerpo puede ser además un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.The antibodies described herein can be from different species including mammalian species such as mouse, rat, rabbit, pig, or non-human primate. The antibody can be a rodent antibody and, more particularly, a mouse antibody. Alternatively, the antibody can be from a species that is not a mammal, such as a chicken. The antibody can further be a humanized antibody or a human antibody.

Un anticuerpo puede tener la capacidad de competir con otro anticuerpo de la invención por la unión a C5aR como se describe en el presente documento. Dichos anticuerpos de competición cruzada pueden identificarse basándose en su capacidad de competir de manera cruzada con un anticuerpo conocido de la invención en ensayos de unión convencionales. Dicha competición cruzada puede sugerir que los dos anticuerpos se unen a epítopos idénticos, parcialmente coincidentes o similares.An antibody may have the ability to compete with another antibody of the invention for binding to C5aR as described herein. Such cross-competing antibodies can be identified based on their ability to cross-compete with a known antibody of the invention in standard binding assays. Such cross-competition may suggest that the two antibodies bind identical, partially matched, or similar epitopes.

Anticuerpos humanosHuman antibodies

Como se describe en los ejemplos del presente documento, los inventores han identificado una serie de anticuerpos anti-C5aR derivados de ratones transgénicos que incluyen los loci de la línea germinal de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos se aíslan como anticuerpos monoclonales de hibridoma y se evalúan las características de unión. Como se ha mencionado, C5aR es un GPCR con siete dominios transmembrana y no es posible producir una forma soluble que retenga la conformación nativa. Para inducir anticuerpos humanos que bloqueen la unión de hC5a a hC5aR, se inmunizaron ratones transgénicos con células que expresaban hC5aR nativo. Sin embargo, fue muy difícil obtener anticuerpos bloqueantes y los inventores realizaron 32 fusiones antes de identificar un anticuerpo humano que tuviera las propiedades bloqueantes deseadas. A partir de 35 fusiones y el cribado de más de 100.000 sobrenadantes de hibridoma, se obtuvo un total de 11 anticuerpos bloqueantes.As described in the examples herein, the inventors have identified a number of anti-C5aR antibodies derived from transgenic mice that include human immunoglobulin germline loci. Antibodies are isolated as hybridoma monoclonal antibodies and binding characteristics are assessed. As mentioned, C5aR is a GPCR with seven transmembrane domains and it is not possible to produce a soluble form that retains the native conformation. To induce human antibodies that block the binding of hC5a to hC5aR, transgenic mice were immunized with cells expressing native hC5aR. However, it was very difficult to obtain blocking antibodies and the inventors performed 32 fusions before identifying a human antibody that had the desired blocking properties. From 35 fusions and screening of more than 100,000 hybridoma supernatants, a total of 11 blocking antibodies were obtained.

Además, debido a la naturaleza de hC5aR, no fue posible determinar la afinidad de los anticuerpos por un análisis Biacore convencional y, por lo tanto, se establecieron análisis basándose en las lecturas dependientes de hC5aR funcional, a partir de las cuales se determinaron los valores de CI50 y CE50 como se describe en el ejemplo 2 y el ejemplo 7.Furthermore, due to the nature of hC5aR, it was not possible to determine the affinity of the antibodies by a conventional Biacore analysis and therefore analyzes were established based on the dependent readings of functional hC5aR, from which the values were determined. of IC50 and EC50 as described in Example 2 and Example 7.

En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo humano que se une a C5aR y además se prefiere que el anticuerpo se una específicamente a hC5aR, de manera que la unión a hC5aR sea más fuerte que la unión a C5aR de otra especie tal como, en particular, C5aR de ratón. El anticuerpo se une al 2° bucle de C5aR humano. En una realización, el anticuerpo se une al 2° bucle extracelular de C5aR humano pero no al 2° bucle extracelular de C5aR murino. En otras realizaciones, el anticuerpo de acuerdo con la invención puede unirse al 2° bucle extracelular de C5aR únicamente en la conformación nativa.In one aspect, the invention relates to a human antibody that binds to C5aR and it is further preferred that the antibody specifically binds to hC5aR, such that binding to hC5aR is stronger than binding to C5aR from another species such as , in particular, mouse C5aR. The antibody binds to the 2nd loop of human C5aR. In one embodiment, the antibody binds to the 2nd extracellular loop of human C5aR but not to the 2nd extracellular loop of murine C5aR. In other embodiments, the antibody according to the invention can bind to the 2nd extracellular loop of C5aR only in the native conformation.

La funcionalidad de un anticuerpo anti-C5aR depende de la capacidad de dicho anticuerpo de inhibir o reducir significativamente la unión de C5a a C5aR.The functionality of an anti-C5aR antibody depends on the ability of said antibody to significantly inhibit or reduce the binding of C5a to C5aR.

En una realización, el anticuerpo de la invención es capaz de inhibir significativamente o reducir la unión de C5a a C5aR. Esto puede determinarse por un ensayo de desplazamiento (SPA) como se describe en el ejemplo 2 del presente documento, a partir del cual pueden determinarse los valores de CI50. Como es evidente por la tabla 1, los 11 anticuerpos aislados y descritos tienen una concentración CI50 menor de 50 nM. En otra realización de la invención, el anticuerpo es capaz de desplazar hC5a en un ensayo SPA, con una CI50 inferior a 50 nM, tal como inferior a 40 nM, tal como inferior a 30 nM, tal como inferior a 20 nM, tal como inferior a 10 nM, tal como inferior a 5 nM o incluso inferior a 4 nM, o con una CI50 inferior a 3 nM o incluso inferior a 2,5 nM o 2,0 nM.In one embodiment, the antibody of the invention is capable of significantly inhibiting or reducing the binding of C5a to C5aR. This can be determined by a displacement assay (SPA) as described in Example 2 herein, from which IC50 values can be determined. As is evident from Table 1, the 11 isolated and described antibodies have an IC50 concentration of less than 50 nM. In another embodiment of the invention, the antibody is capable of displacing hC5a in a SPA assay, with an IC50 of less than 50 nM, such as less than 40 nM, such as less than 30 nM, such as less than 20 nM, such as less than 10 nM, such as less than 5 nM or even less than 4 nM, or with an IC50 of less than 3 nM or even less than 2.5 nM or 2.0 nM.

En otros ensayos se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-C5aR de inhibir la migración dependiente de C5a de neutrófilos humanos y se observó que algunos de los anticuerpos humanos identificados eran inhibidores más potentes de la migración de neutrófilos mediada por C5a que un anticuerpo de C5aR descrito previamente (Q del documento WO 2009/103113). En una realización, el anticuerpo de la invención es capaz de inhibir significativamente la migración de neutrófilos humanos. En una realización, el anticuerpo inhibe la migración a un valor inferior al 50 %, inferior al 40 %, inferior al 30 %, inferior al 20 % o inferior al 10 % en comparación con el nivel de migración observado en presencia de C5a 10 nM y sin anticuerpo anti-C5aR. En esta realización, la migración se mide después de 30 minutos en presencia de C5a 10 nM y anticuerpo en comparación con el nivel de migración observado después de 30 minutos en presencia de C5a 10 nM y sin anticuerpo. Como alternativa, la capacidad de un anticuerpo de inhibir la migración de neutrófilos puede expresarse usando valores de CI50 basándose en la misma configuración. En esta realización, la CI50 es inferior a 2,5 pg/ml, tal como inferior a 2,5 pg/ml, tal como inferior a 1,5 pg/ml, tal como inferior a 1,2 pg/ml o incluso inferior a 1,0 pg/ml.Other assays evaluated the ability of anti-C5aR antibodies to inhibit the C5a-dependent migration of human neutrophils and found that some of the identified human antibodies were more potent inhibitors of C5a-mediated neutrophil migration than a C5aR antibody. previously described (Q of WO 2009/103113). In one embodiment, the antibody of the invention is capable of significantly inhibiting human neutrophil migration. In one embodiment, the antibody inhibits migration to a value less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20% or less than 10% compared to the level of migration observed in the presence of C5a 10 nM and no anti-C5aR antibody. In this embodiment, migration is measured after 30 minutes in the presence of 10 nM C5a and antibody compared to the level of migration observed after 30 minutes in the presence of 10 nM C5a and without antibody. Alternatively, the ability of an antibody to inhibit neutrophil migration can be expressed using IC50 values based on the same settings. In this embodiment, the IC50 is less than 2.5 pg / ml, such as less than 2.5 pg / ml, such as less than 1.5 pg / ml, such as less than 1.2 pg / ml or even less than 1.0 pg / ml.

Como alternativa al análisis Biacore convencional, la funcionalidad de los anticuerpos de hC5aR puede determinarse por un ensayo de unión competitiva en neutrófilos como se describe en el ejemplo 7. Esta funcionalidad se denomina afinidad del anticuerpo y se mide por el ensayo de unión al ligando con competición, pero también podría considerarse la medición de la avidez de la interacción. En una realización, la afinidad o avidez del anticuerpo medida por el ensayo de unión al ligando con competición en neutrófilos en inferior a 0,80 nM, 0,70 nM, 0,60 nM, tal como inferior a 0,50 nM, 0,45 nM, 0,40 nM o 0,35 nM. As an alternative to conventional Biacore assay, the functionality of hC5aR antibodies can be determined by a neutrophil competitive binding assay as described in Example 7. This functionality is called antibody affinity and is measured by the ligand binding assay with competition, but the measurement of the avidity of the interaction could also be considered. In one embodiment, the affinity or avidity of the antibody as measured by the competition ligand binding assay in neutrophils at less than 0.80 nM, 0.70 nM, 0.60 nM, such as less than 0.50 nM, 0 , 45 nM, 0.40 nM or 0.35 nM.

Se exploró otra opción para caracterizar los anticuerpos usando un ensayo de flujo de calcio, que mide la capacidad de un anticuerpo de inhibir la activación de neutrófilos inducida por C5a ex vivo, descrita de forma similar en el ejemplo 7. En una realización adicional, la CI50 del anticuerpo determinada en un ensayo de flujo de calcio es inferior a 7,0 pg/ml, tal como inferior a 50 pg/ml, tal como inferior a 2,5 pg/ml.Another option to characterize the antibodies was explored using a calcium flux assay, which measures the ability of an antibody to inhibit ex vivo C5a-induced neutrophil activation, similarly described in Example 7. In a further embodiment, the IC50 of the antibody determined in a calcium flux assay is less than 7.0 pg / ml, such as less than 50 pg / ml, such as less than 2.5 pg / ml.

Pueden usarse otros ensayos ex vivo adicionales para determinar la capacidad de un anticuerpo de inhibir o neutralizar la maduración de neutrófilos inducida por C5a basándose en efectos secundarios tales como la expresión de CD11b y CD62L. CD11b y CD62L son marcadores de la maduración de neutrófilos ya que se regulan de manera positiva y negativa, respectivamente, tras la activación por la interacción C5a/C5aR.Still other ex vivo assays can be used to determine the ability of an antibody to inhibit or neutralize C5a-induced neutrophil maturation based on side effects such as CD11b and CD62L expression. CD11b and CD62L are markers of neutrophil maturation as they are positively and negatively regulated, respectively, after activation by the C5a / C5aR interaction.

Se determinó el efecto en un ensayo de regulación positiva de CD11b. En una realización, la CI50 determinada en un ensayo de regulación de CD11b es inferior a 3,5 pg/ml, tal como 3,0 pg/ml, tal como inferior a 2,5 pg/ml, tal como inferior a 2,0 pg/ml o tal como 1,5 pg/ml o incluso inferior a 1,0 pg/ml.The effect was determined in a CD11b upregulation assay. In one embodiment, the IC50 determined in a CD11b regulatory assay is less than 3.5 pg / ml, such as 3.0 pg / ml, such as less than 2.5 pg / ml, such as less than 2, 0 pg / ml or such as 1.5 pg / ml or even less than 1.0 pg / ml.

Asimismo, se determinó el efecto del anticuerpo en un ensayo de regulación negativa de CD62L. En una realización, la CI50 determinada en un ensayo de regulación negativa de CD62L es inferior a 1,8 pg/ml, tal como inferior a 1,5 pg/ml, tal como inferior a 1,2 pg/ml o incluso inferior a 1,0 pg/ml.Likewise, the effect of the antibody was determined in a CD62L downregulation assay. In one embodiment, the IC50 determined in a CD62L downregulation assay is less than 1.8 pg / ml, such as less than 1.5 pg / ml, such as less than 1.2 pg / ml, or even less than 1.0 pg / ml.

Se seleccionaron cuatro anticuerpos monoclonales para secuenciación para determinar la secuencia de las regiones variables y, en particular, las secuencias de CDR. En la figura 1 se presenta un alineamiento de secuencias y las secuencias se incluyen asimismo en el listado de secuencias adjunto.Four monoclonal antibodies were selected for sequencing to determine the sequence of the variable regions and, in particular, the CDR sequences. A sequence alignment is presented in Figure 1 and the sequences are also included in the attached sequence listing.

El listado de secuencias incluye las siguientes secuencias relacionadas con anticuerpos aislados:The sequence listing includes the following isolated antibody-related sequences:

SEQ ID NO:1-3:35F32A3 de Vh CDR 1-3SEQ ID NO: 1-3: 35F32A3 of Vh CDR 1-3

SEQ ID 4: 35F32A3 de VhSEQ ID 4: 35F32A3 of Vh

SEQ ID NO:5-7: 35F32A3 de Vl CDR 1-3SEQ ID NO: 5-7: 35F32A3 of Vl CDR 1-3

SEQ ID 8: 35F32A3 de VlSEQ ID 8: 35F32A3 of Vl

De manera similar, las SEQ ID NO: 9 -16 describen 32F3A6Similarly, SEQ ID NO: 9-16 describe 32F3A6

De manera similar, las SEQ ID NO: 17 -24 describen 35F12A2Similarly, SEQ ID NO: 17-24 describe 35F12A2

De manera similar, las SEQ ID NO: 25 -32 describen 35F24A3Similarly, SEQ ID NO: 25-32 describe 35F24A3

Anticuerpos definidos por regiones variables o secuencias de CDRAntibodies defined by variable regions or CDR sequences

Por lo tanto, un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede definirse basándose en las secuencias de CDR, las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras y modificaciones minoritarias de las mismas que pueden realizarse por el experto en la materia sin alterar la funcionalidad del anticuerpo. Esto incluye sustituciones de aminoácidos, deleciones o inserciones de uno o más, tales como uno, dos o tres restos de aminoácido dentro de cada una de las secuencias de CDR.Therefore, an antibody according to the disclosure can be defined based on the CDR sequences, the sequences of the variable regions of the heavy and light chains and minor modifications thereof that can be made by the person skilled in the art without altering the antibody functionality. This includes amino acid substitutions, deletions, or insertions of one or more, such as one, two, or three amino acid residues within each of the CDR sequences.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo que se une a C5aR definido por la secuencia de las regiones CDR, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de los siguientes grupos:In one aspect, the disclosure relates to an antibody that binds to C5aR defined by the sequence of the CDR regions, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 selected from the following groups :

a) SEQ ID 1, 2 y 3, donde ninguna, una, dos o tres de dichas secuencias comprenden 1, 2 o 3 aminoácidos sustituidos con un resto de aminoácido diferente; ya) SEQ ID 1, 2 and 3, where none, one, two or three of said sequences comprise 1, 2 or 3 amino acids substituted with a different amino acid residue; Y

b) SEQ ID 9, 10 y 11, donde ninguna, una, dos o tres de dichas secuencias comprenden 1, 2 o 3 aminoácidos sustituidos con un resto de aminoácido diferente; yb) SEQ ID 9, 10 and 11, where none, one, two or three of said sequences comprise 1, 2 or 3 amino acids substituted with a different amino acid residue; Y

c) SEQ ID 17, 18 y 19, donde ninguna, una, dos o tres de dichas secuencias comprenden 1, 2 o 3 aminoácidos sustituidos con un resto de aminoácido diferente; yc) SEQ ID 17, 18 and 19, where none, one, two or three of said sequences comprise 1, 2 or 3 amino acids substituted with a different amino acid residue; Y

d) SEQ ID 25, 26 y 27, donde ninguna, una, dos o tres de dichas secuencias comprenden 1, 2 o 3 aminoácidos sustituidos con un resto de aminoácido diferente.d) SEQ ID 25, 26 and 27, where none, one, two or three of said sequences comprise 1, 2 or 3 amino acids substituted with a different amino acid residue.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo que se une a C5aR, definido por la secuencia de las regiones CDR, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3;In one aspect, the disclosure relates to an antibody that binds to C5aR, defined by the sequence of CDR regions, wherein the heavy chain variable region of said antibody comprises CDR1, CDR2 and CDR3 sequences;

en donde dicha secuencia de CDR1 comprende las SEQ ID 1, 9, 17, 25 o una de dichas secuencias en donde 1, 2 o 3 aminoácidos están sustituidos con un resto de aminoácido diferente; ywherein said CDR1 sequence comprises SEQ ID 1, 9, 17, 25 or one of said sequences wherein 1, 2 or 3 amino acids are substituted with a different amino acid residue; Y

en donde dicha secuencia de CDR2 comprende las SEQ ID 2, 10, 18, 26 o una de dichas secuencias en donde 1,2 o 3 aminoácidos están sustituidos con un resto de aminoácido diferente; ywherein said CDR2 sequence comprises SEQ ID 2, 10, 18, 26 or one of said sequences wherein 1,2 or 3 amino acids are substituted with a different amino acid residue; Y

en donde dicha secuencia de CDR3 comprende las SEQ ID 3, 11, 19, 27 o una de dichas secuencias en donde 1,2 o 3 aminoácidos están sustituidos con un resto de aminoácido diferente. wherein said CDR3 sequence comprises SEQ ID 3, 11, 19, 27 or one of said sequences wherein 1,2 or 3 amino acids are substituted with a different amino acid residue.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo que se une a C5aR definido por la secuencia de las regiones CDR, en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de los siguientes gruposIn one aspect, the disclosure relates to an antibody that binds to C5aR defined by the sequence of the CDR regions, wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises CDR1, CDR2 and CDR3 sequences selected from the following groups

a) SEQ ID 5, 6 y 7, donde ninguna, una, dos o tres de dichas secuencias comprenden 1, 2 o 3 aminoácidos sustituidos con un resto de aminoácido diferente; ya) SEQ ID 5, 6 and 7, where none, one, two or three of said sequences comprise 1, 2 or 3 amino acids substituted with a different amino acid residue; Y

b) SEQ ID 13, 14 y 15, donde ninguna, una, dos o tres de dichas secuencias comprenden 1, 2 o 3 aminoácidos sustituidos con un resto de aminoácido diferente; yb) SEQ ID 13, 14 and 15, where none, one, two or three of said sequences comprise 1, 2 or 3 amino acids substituted with a different amino acid residue; Y

c) SEQ ID 21, 22 y 23, donde ninguna, una, dos o tres de dichas secuencias comprenden 1, 2 o 3 aminoácidos sustituidos con un resto de aminoácido diferente; yc) SEQ ID 21, 22 and 23, where none, one, two or three of said sequences comprise 1, 2 or 3 amino acids substituted with a different amino acid residue; Y

d) SEQ ID 29, 30 y 31, donde ninguna, una, dos o tres de dichas secuencias comprenden 1, 2 o 3 aminoácidos sustituidos con un resto de aminoácido diferente.d) SEQ ID 29, 30 and 31, where none, one, two or three of said sequences comprise 1, 2 or 3 amino acids substituted with a different amino acid residue.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo que se une a C5aR, definido por la secuencia de las regiones CDR, en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3; en donde dicha secuencia de CDR1 comprende las SEQ ID 5, 13, 21,29 o una de dichas secuencias en donde 1.2 o 3 aminoácidos están sustituidos con un resto de aminoácido diferente; yIn one aspect, the disclosure relates to an antibody that binds to C5aR, defined by the sequence of the CDR regions, wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises CDR1, CDR2 and CDR3 sequences; wherein said CDR1 sequence comprises SEQ ID 5, 13, 21,29 or one of said sequences wherein 1.2 or 3 amino acids are substituted with a different amino acid residue; Y

en donde dicha secuencia de CDR2 comprende las SEQ ID 6, 14, 22, 30 o una de dichas secuencias en donde 1,2 o 3 aminoácidos están sustituidos con un resto de aminoácido diferente; ywherein said CDR2 sequence comprises SEQ ID 6, 14, 22, 30 or one of said sequences wherein 1,2 or 3 amino acids are substituted with a different amino acid residue; Y

en donde dicha secuencia de CDR3 comprende las SEQ ID 7, 15, 23, 31 o una de dichas secuencias en donde 1,2 o 3 aminoácidos están sustituidos con un resto de aminoácido diferente.wherein said CDR3 sequence comprises SEQ ID 7, 15, 23, 31 or one of said sequences wherein 1,2 or 3 amino acids are substituted with a different amino acid residue.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo donde las CDR de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID 1, 2 y 3 o dicha secuencia con 1, 2 o 3 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos y donde las CDR de la cadena ligera variable comprenden las SEQ ID 5, 6 y 7 o dicha secuencia con 1, 2 o 3 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.In one aspect, the disclosure relates to an antibody where the heavy chain variable region CDRs comprise SEQ ID 1, 2 and 3 or said sequence with 1, 2 or 3 amino acid substitutions, deletions and / or insertions and wherein the variable light chain CDRs comprise SEQ ID 5, 6 and 7 or said sequence with 1, 2 or 3 amino acid substitutions, deletions and / or insertions.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo donde las CDR de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID 9, 10 y 11 o dicha secuencia con 1, 2 o 3 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos y donde las CDR de la cadena ligera variable comprenden las SEQ ID 13, 14 y 15 o dicha secuencia con 1.2 o 3 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.In one aspect, the disclosure relates to an antibody where the heavy chain variable region CDRs comprise SEQ ID 9, 10 and 11 or said sequence with 1, 2 or 3 amino acid substitutions, deletions and / or insertions and where the variable light chain CDRs comprise SEQ ID 13, 14 and 15 or said sequence with 1,2 or 3 amino acid substitutions, deletions and / or insertions.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo donde las CDR de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID 17, 18 y 19 o dicha secuencia con 1, 2 o 3 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos y donde las CDR de la cadena ligera variable comprenden las SEQ ID 21,22 y 23 o dicha secuencia con 1.2 o 3 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.In one aspect, the disclosure relates to an antibody where the heavy chain variable region CDRs comprise SEQ IDs 17, 18 and 19 or said sequence with 1, 2 or 3 amino acid substitutions, deletions and / or insertions and where the CDRs of the variable light chain comprise SEQ ID 21,22 and 23 or said sequence with 1,2 or 3 amino acid substitutions, deletions and / or insertions.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo donde las CDR de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID 25, 26 y 27 o dicha secuencia con 1, 2 o 3 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos y donde las CDR de la cadena ligera variable comprenden las SEQ ID 29, 30 y 31 o dicha secuencia con 1.2 o 3 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.In one aspect, the disclosure relates to an antibody where the heavy chain variable region CDRs comprise SEQ ID 25, 26 and 27 or said sequence with 1, 2 or 3 amino acid substitutions, deletions and / or insertions and where the variable light chain CDRs comprise SEQ ID 29, 30 and 31 or said sequence with 1,2 or 3 amino acid substitutions, deletions and / or insertions.

Por lo tanto, un aspecto de la divulgación se refiere a un anticuerpo, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR1, una de CDR2 y una de CDR3, en donde dichas secuencias de CDR comprenden uno de los siguientes grupos de secuencias; SEQ ID 1,2 y 3, SEQ ID 9, 10 y 11, SEQ ID 17, 18 y 19, SEQ ID 25, 26 y 27 o dichas secuencias con hasta dos sustituciones, deleciones y/o inserciones por secuencia y en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR1, una de CDR2 y una de CDR3, en donde dichas secuencias de CDR comprenden uno de los siguientes grupos de secuencias; SEQ iD 5, 6 y 7, SEQ ID 13, 14 y 15, SEQ ID 21, 22 y 23, SeQ ID 29, 30 y 31 o dichas secuencias con hasta dos sustituciones, deleciones y/o inserciones por secuencia.Therefore, one aspect of the disclosure relates to an antibody, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence of CDR1, one of CDR2 and one of CDR3, wherein said CDR sequences comprise one of the following groups of sequences; SEQ ID 1,2 and 3, SEQ ID 9, 10 and 11, SEQ ID 17, 18 and 19, SEQ ID 25, 26 and 27 or said sequences with up to two substitutions, deletions and / or insertions per sequence and where the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence of CDR1, one of CDR2 and one of CDR3, wherein said CDR sequences comprise one of the following groups of sequences; SEQ iD 5, 6 and 7, SEQ ID 13, 14 and 15, SEQ ID 21, 22 and 23, SeQ ID 29, 30 and 31 or said sequences with up to two substitutions, deletions and / or insertions per sequence.

Por lo tanto, un aspecto de la divulgación se refiere a un anticuerpo, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR1, una de CDR2 y una de CDR3, en donde dichas secuencias de CDR comprenden uno de los siguientes grupos de secuencias; SEQ ID 1,2 y 3, SEQ ID 9, 10 y 11, SEQ ID 17, 18 y 19, SEQ ID 25, 26 y 27 o dichas secuencias con hasta una sustitución, deleción y/o inserción por secuencia y en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR1, una de CDR2 y una de CDR3, en donde dichas secuencias de CDR comprenden uno de los siguientes grupos de secuencias; SEQ ID 5, 6 y 7, SEQ ID 13, 14 y 15, SEQ ID 21,22 y 23, SEQ iD 29, 30 y 31 o dichas secuencias con hasta una sustitución, deleciones y/o inserciones por secuencia.Therefore, one aspect of the disclosure relates to an antibody, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence of CDR1, one of CDR2 and one of CDR3, wherein said CDR sequences comprise one of the following groups of sequences; SEQ ID 1,2 and 3, SEQ ID 9, 10 and 11, SEQ ID 17, 18 and 19, SEQ ID 25, 26 and 27 or said sequences with up to one substitution, deletion and / or insertion per sequence and wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence of CDR1, one of CDR2 and one of CDR3, wherein said CDR sequences comprise one of the following groups of sequences; SEQ ID 5, 6 and 7, SEQ ID 13, 14 and 15, SEQ ID 21, 22 and 23, SEQ iD 29, 30 and 31 or said sequences with up to one substitution, deletions and / or insertions per sequence.

Por lo tanto, un aspecto de la divulgación se refiere a un anticuerpo, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR1, una de CDR2 y una de CDR3, en donde dichas secuencias de CDR comprenden uno de los siguientes grupos de secuencias; SEQ ID 1,2 y 3, SEQ ID 9, 10 y 11, SEQ ID 17, 18 y 19, SEQ ID 25, 26 y 27, y en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR1, una de CDR2 y una de CDR3, en donde dichas secuencias de CDR comprenden uno de los siguientes grupos de secuencias; SEQ ID 5, 6 y 7, s Eq ID 13, 14 y 15, SEQ ID 21, 22 y 23, SEQ ID 29, 30 y 31. Therefore, one aspect of the disclosure relates to an antibody, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence of CDR1, one of CDR2 and one of CDR3, wherein said CDR sequences comprise one of the following groups of sequences; SEQ ID 1,2 and 3, SEQ ID 9, 10 and 11, SEQ ID 17, 18 and 19, SEQ ID 25, 26 and 27, and wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a CDR1 sequence , one from CDR2 and one from CDR3, wherein said CDR sequences comprise one of the following groups of sequences; SEQ ID 5, 6 and 7, s Eq ID 13, 14 and 15, SEQ ID 21, 22 and 23, SEQ ID 29, 30 and 31.

Un aspecto de la divulgación se refiere a un anticuerpo en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 80, 85, 90 o 94 % idéntica a la SEQ ID NO: 4, 12, 20 o 28.One aspect of the disclosure refers to an antibody wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 80, 85, 90 or 94% identical to SEQ ID NO: 4, 12, 20 or 28 .

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4, 12, 20 o 28.In one aspect, the disclosure refers to an antibody wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO: 4, 12, 20 or 28.

Un aspecto de la divulgación se refiere a un anticuerpo en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 80, 85, 90 o 94 % idéntica a la SEQ ID NO 8, 16, 24 o 32.One aspect of the disclosure refers to an antibody wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence at least 80, 85, 90 or 94% identical to SEQ ID NO 8, 16, 24 or 32.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO 8, 16, 24 o 32.In one aspect, the disclosure refers to an antibody wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO 8, 16, 24 or 32 .

Por lo tanto, una realización de la divulgación se refiere a un anticuerpo, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 80, 85, 90 o 94 % idéntica a la SEQ ID NO: 4, 12, 20 o 28 y/o en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 80, 85, 90 o 94 % idéntica a la SEQ ID NO 8, 16, 24 o 32.Therefore, one embodiment of the disclosure refers to an antibody, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 80, 85, 90 or 94% identical to SEQ ID NO: 4, 12, 20 or 28 and / or wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence at least 80, 85, 90 or 94% identical to SEQ ID NO 8, 16, 24 or 32.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 y/o en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO 8.In one aspect, the disclosure relates to an antibody, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO: 4 and / or in where the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO 8.

En una aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 12 y/o en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO 16.In one aspect, the disclosure relates to an antibody wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO: 12 and / or wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO 16.

Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 20 y/o en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO 24.Therefore, in one aspect, the disclosure relates to an antibody, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO: 20 and / or wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO 24.

Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 28 y/o en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO 32.Therefore, in one aspect, the disclosure relates to an antibody, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO: 28 and / or wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO 32.

En una realización, la región variable de la cadena pesada del anticuerpo de la invención comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO 39 y la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de la invención comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO 40.In one embodiment, the variable region of the heavy chain of the antibody of the invention comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO 39 and the variable region of the light chain of the antibody of the invention it comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO 40.

En una realización, la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo se identifica por la SEQ ID NO 39 y la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo se identifica por la SEQ ID NO 40.In one embodiment, the heavy chain variable region of said antibody is identified by SEQ ID NO 39 and the light chain variable region of said antibody is identified by SEQ ID NO 40.

Durante la maduración de los anticuerpos, pueden producirse mutaciones espontáneas en la región marco, como se describe en el presente documento en los Ejemplos 6 y 7, la región variable de uno de los anticuerpos monoclonales se comparó con secuencias de la línea germinal de anticuerpo humano para identificar la secuencia de líneas germinales humanas más parecida tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Para minimizar el riesgo de reacción inmunológica, por lo tanto, se decidió optimizar adicionalmente los anticuerpos introduciendo mutaciones puntuales en la región marco para construir un anticuerpo con secuencia de línea germinal humana en las regiones marco, como puede verse en los experimentos, esto no afectó a la funcionalidad del anticuerpo. En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo definido por identidad de secuencia con respecto a una región variable de un anticuerpo de referencia como se describe anteriormente en el presente documento, en donde la región variable de la cadena pesada y/o ligera de dicho anticuerpo comprende una o más mutaciones en la región marco. Puede ser conveniente introducir una o más mutaciones para aumentar la identidad con respecto a la secuencia de línea germinal humana más parecida, aunque también pueden considerarse otras mutaciones. Dicha mutación o mutaciones pueden ser mutaciones conservativas.During antibody maturation, spontaneous framework region mutations can occur, as described herein in Examples 6 and 7, the variable region of one of the monoclonal antibodies was compared to human antibody germline sequences to identify the most similar human germline sequence for both heavy chain and light chain. To minimize the risk of immunological reaction, therefore, it was decided to further optimize the antibodies by introducing point mutations in the framework region to build an antibody with human germline sequence in the framework regions, as can be seen in the experiments, this did not affect to the functionality of the antibody. In one aspect, the disclosure relates to an antibody defined by sequence identity to a variable region of a reference antibody as described hereinbefore, wherein the variable region of the heavy and / or light chain of said antibody comprises one or more mutations in the framework region. It may be desirable to introduce one or more mutations to increase identity to the closest human germline sequence, although other mutations may also be considered. Said mutation or mutations can be conservative mutations.

Anticuerpos definidos por la región FcAntibodies defined by the Fc region

La región Fc permite a los anticuerpos activar el sistema inmunitario y pueden modificarse anticuerpos por ingeniería genética para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más de sus propiedades funcionales, tales como la semivida en suero, la fijación del complemento, unión a receptor de Fc, estabilidad de proteínas y/o citotoxicidad dependiente de antígeno o ausencia de la misma. Además, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, se pueden unir uno o más grupos químicos al anticuerpo) se puede modificar para alterar su glucosilación, para alterar de nuevo una o más propiedades del anticuerpo.The Fc region allows antibodies to activate the immune system and antibodies can be engineered to include modifications within the Fc region, typically to alter one or more of its functional properties, such as serum half-life, complement fixation, Fc receptor binding, protein stability and / or antigen-dependent cytotoxicity or absence thereof. Furthermore, an antibody of the invention it can be chemically modified (eg, one or more chemical groups can be attached to the antibody) it can be modified to alter its glycosylation, to again alter one or more properties of the antibody.

En una realización, el anticuerpo de la invención comprende una región Fc, en donde la región Fc tiene una afinidad de unión a uno o más FcyR reducida o anulada.In one embodiment, the antibody of the invention comprises an Fc region, wherein the Fc region has a reduced or absent binding affinity for one or more Fc and R.

En una realización, el anticuerpo de la invención presenta una afinidad de unión reducida a uno o más FcyR en comparación con secuencias de referencia de Fc de IgG1, IgG2, IgG2/4 o IgG4 como se definen por las SEQ ID NO 33, 34, 35 y 36 respectivamente. Como ciertos aminoácidos específicos pueden ser responsables de la interacción de FcyR y de los efectos sobre los que se reflexiona en el presente documento, puede ser ventajoso aplicar un anticuerpo donde dichos restos de aminoácido específicos de la región Fc se hayan sustituido por un aminoácido diferente. In one embodiment, the antibody of the invention exhibits a reduced binding affinity to one or more Fc and R compared to reference Fc sequences of IgG1, IgG2, IgG2 / 4 or IgG4 as defined by SEQ ID NO 33, 34, 35 and 36 respectively. As certain specific amino acids may be responsible for the interaction of Fc and R and the effects discussed herein, it may be advantageous to apply an antibody where said specific amino acid residues of the Fc region have been replaced by a different amino acid.

En una realización, dicha región Fc incluye una o más mutaciones puntuales en comparación con secuencias de referencia de Fc de IgG1, IgG2, IgG4/G2 o IgG4 como se definen en las SEQ ID 33, 34, 35 y 36 respectivamente, reduciendo la afinidad por uno o más receptores de Fcy o componentes del complemento.In one embodiment, said Fc region includes one or more point mutations compared to reference Fc sequences of IgG1, IgG2, IgG4 / G2 or IgG4 as defined in SEQ ID 33, 34, 35 and 36 respectively, reducing the affinity by one or more Fcy receptors or complement components.

Para evaluar el resultado de introducir mutaciones puntuales en la región Fc, se evaluaron las funciones efectoras para una serie de anticuerpos anti-C5aR como se describe en el ejemplo 4. Se estableció un ensayo de fagocitosis para medir el papel de la región Fc sobre la capacidad de los anticuerpos anti-hC5aR de inducir la fagocitosis de neutrófilos (que expresaban hC5aR) por monocitos humanos. Como puede verse en la tabla 2, varias variantes de Fc reducen el nivel de fagocitosis inducida por los anticuerpos anti-C5aR en el ensayo descrito.To evaluate the result of introducing point mutations in the Fc region, effector functions were evaluated for a series of anti-C5aR antibodies as described in Example 4. A phagocytosis assay was established to measure the role of the Fc region on the ability of anti-hC5aR antibodies to induce phagocytosis of neutrophils (expressing hC5aR) by human monocytes. As can be seen in Table 2, several Fc variants reduce the level of phagocytosis induced by anti-C5aR antibodies in the assay described.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención no induce significativamente la fagocitosis de neutrófilos in vitro, lo que significa que el nivel de fagocitosis no está significativamente por encima del nivel de referencia cuando se mide en ausencia de un anticuerpo anti-C5aR. En una realización, el anticuerpo no produce ninguna inducción detectable de fagocitosis. El ensayo para evaluar el nivel de fagocitosis puede realizarse usando neutrófilos humanos como se describe en el ejemplo 4.In one embodiment, the antibody according to the invention does not significantly induce neutrophil phagocytosis in vitro, which means that the level of phagocytosis is not significantly above the reference level when measured in the absence of an anti-C5aR antibody. In one embodiment, the antibody does not produce any detectable induction of phagocytosis. The assay to assess the level of phagocytosis can be performed using human neutrophils as described in Example 4.

En ensayos alternativos, se evaluó la capacidad de anticuerpos anti-hC5aR de inducir ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) y CDC (citotoxicidad dependiente del complemento). Los ensayos se establecieron para ensayar la capacidad de las variantes de Fc de mediar la depleción de células a través de mecanismos dependientes de ADCC o CDC, y se asumió que eran capaces de imitar actividades en un escenario in vivo.In alternative assays, the ability of anti-hC5aR antibodies to induce ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) and CDC (complement-dependent cytotoxicity) was evaluated. The assays were set up to test the ability of Fc variants to mediate cell depletion through ADCC or CDC dependent mechanisms, and it was assumed that they were capable of mimicking activities in an in vivo setting.

Los ensayos aplican células que expresan hC5aR como células diana y células efectoras (PMBC de las que se han eliminado monocitos) o sueros que contienen complemento para inducir las respuestas descritas en el ejemplo 4. The assays apply cells expressing hC5aR as target cells and effector cells (PMBC from which monocytes have been removed) or complement-containing sera to induce the responses described in Example 4.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención no induce significativamente la ADCC, lo que significa que el nivel de ADCC no está significativamente por encima del nivel de referencia cuando se mide en ausencia de un anticuerpo anti-C5aR. En una realización, el anticuerpo no produce ninguna inducción detectable de ADCC, es decir, el nivel de ADCC no está por encima del nivel de referencia.In one embodiment, the antibody according to the invention does not significantly induce ADCC, which means that the ADCC level is not significantly above the reference level when measured in the absence of an anti-C5aR antibody. In one embodiment, the antibody does not produce any detectable induction of ADCC, that is, the level of ADCC is not above the reference level.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención no induce significativamente la CDC. En una realización, el anticuerpo no produce ninguna inducción detectable de CDC, es decir, el nivel de CDC no está por encima del nivel de referencia.In one embodiment, the antibody according to the invention does not significantly induce CDC. In one embodiment, the antibody does not produce any detectable induction of CDC, that is, the CDC level is not above the reference level.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende una región Fc donde la secuencia se ha modificado para alterar la función o funciones de las células efectoras. La modificación de la secuencia de Fc puede obtenerse por mutaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos. La región Fc de cadena pesada puede ser IgG1, IgG2, IgG4 o una secuencia quimérica de IgG2/4. Las secuencias de referencia se definen en el listado de secuencias como se indica a continuación; IgG1 por SEQ ID NO:33, IgG2 por SEQ ID NO:34, IgG2/4 por SEQ ID NO: 35 e IgG4 por SEQ ID NO: 36.In one embodiment, the antibody according to the invention comprises an Fc region where the sequence has been modified to alter the function or functions of the effector cells. Modification of the Fc sequence can be obtained by point mutations in the amino acid sequence. The heavy chain Fc region can be IgG1, IgG2, IgG4 or an IgG2 / 4 chimeric sequence. Reference sequences are defined in the sequence listing as follows; IgG1 by SEQ ID NO: 33, IgG2 by SEQ ID NO: 34, IgG2 / 4 by SEQ ID NO: 35 and IgG4 by SEQ ID NO: 36.

En una realización, la región Fc es una IgG1 (SEQ ID NO: 33), IgG2 (SEQ ID NO: 34), IgG2/4 (SEQ ID NO: 35) o IgG4 (SEQ ID NO: 36), con una o más de las siguientes mutaciones puntualesIn one embodiment, the Fc region is an IgG1 (SEQ ID NO: 33), IgG2 (SEQ ID NO: 34), IgG2 / 4 (SEQ ID NO: 35), or IgG4 (SEQ ID NO: 36), with one or more of the following point mutations

a. E233Pto. E233P

b. L234A o V234A o F234L o F234Vb. L234A or V234A or F234L or F234V

c. L235E o L235Ac. L235E or L235A

d. G236R o G236Ad. G236R or G236A

e. G237Aand. G237A

f. S239DF. S239D

g. S254Wg. S254W

h. N297Qh. N297Q

i. L328Ri. L328R

j. A330Sj. A330S

k. P331S k. P331S

l. I332El. I332E

La diferencia entre las variantes de Fc reside en su capacidad de interaccionar con FcyR o componentes del sistema de complemento como se ha descrito anteriormente. Las diferencias de secuencia en la región Fc afectan además a la estructura y flexibilidad del anticuerpo, que también pueden afectar a la función del anticuerpo. Tal como se describe en el ejemplo 5 y en la tabla 3, los inventores demuestran además que los anticuerpos anti-hC5aR en los que la región Fc es del tipo IgG1 con o sin mutaciones puntuales adicionales, son inhibidores más potentes de los efectos mediados por hC5aR que anticuerpos correspondientes con la región Fc del tipo IgG4. En consecuencia, una realización de la invención se refiere a cualquiera de los anticuerpos definidos en el presente documento con una región Fc de isotipo IgG1 o al menos una región bisagra Fc de isotipo IgG1.The difference between the Fc variants lies in their ability to interact with FcyR or components of the complement system as described above. Sequence differences in the Fc region further affect the structure and flexibility of the antibody, which can also affect the function of the antibody. As described in Example 5 and Table 3, the inventors further demonstrate that anti-hC5aR antibodies in which the Fc region is of the IgG1 type with or without additional point mutations, are more potent inhibitors of effects mediated by hC5aR than antibodies corresponding to the Fc region of the IgG4 type. Accordingly, one embodiment of the invention relates to any of the antibodies defined herein with an IgG1 isotype Fc region or at least one IgG1 isotype Fc hinge region.

En una realización, la región Fc de IgG1 comprende de 1 a 10 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de Fc de IgG1 como se define en la SEQ ID NO.33. Se prefiere que las regiones Fc comprendan menos mutaciones, tales como de 1 a 8 sustituciones de aminoácidos dentro de a A 231 a 240, o tales como de 1 a 5 sustituciones de aminoácidos dentro de AA 328 a 334. Las sustituciones de aminoácidos se seleccionan preferentemente entre sustituciones que reducen la capacidad del anticuerpo de inducir significativamente la fagocitosis de neutrófilos, la ADCC y/o la CDC in vitro como se ha descrito anteriormente.In one embodiment, the IgG1 Fc region comprises 1 to 10 amino acid substitutions compared to the IgG1 Fc reference sequence as defined in SEQ ID NO.33. It is preferred that the Fc regions comprise fewer mutations, such as 1 to 8 amino acid substitutions within A 231 to 240, or such as 1 to 5 amino acid substitutions within AA 328 to 334. Amino acid substitutions are selected preferably between substitutions that reduce the ability of the antibody to significantly induce neutrophil phagocytosis, ADCC and / or CDC in vitro as described above.

En una realización, la región Fc de anticuerpo es una IgG1 que comprende una o más de las siguientes mutaciones puntuales:In one embodiment, the antibody Fc region is an IgG1 comprising one or more of the following point mutations:

a) N297Q y/oa) N297Q and / or

b) L234A y/ob) L234A and / or

c) L235E o L235A y/oc) L235E or L235A and / or

d) G236R o G236A y/od) G236R or G236A and / or

e) G237A y/oe) G237A and / or

f) L328R y/of) L328R and / or

g) A330S y/og) A330S and / or

h) P331S.h) P331S.

En una realización, la región Fc de anticuerpo es una IgG1 que comprende uno o más de los siguientes grupos de mutaciones puntuales:In one embodiment, the antibody Fc region is an IgG1 comprising one or more of the following groups of point mutations:

a) N297Q y/oa) N297Q and / or

b) L234A y L235E y/ob) L234A and L235E and / or

c) L234A y G236R y/oc) L234A and G236R and / or

d) L235E y G236R y/od) L235E and G236R and / or

e) L234A, L235E y G236R y/oe) L234A, L235E and G236R and / or

f) G236R y L328R y/of) G236R and L328R and / or

g) N297Q, L234A y L235E y/og) N297Q, L234A and L235E and / or

h) N297Q, L234A, L235E y G236R y/oh) N297Q, L234A, L235E and G236R and / or

i) N297Q, L234A, L235E y G237A y/oi) N297Q, L234A, L235E and G237A and / or

j) L234A, L235E, G237A, A330S y P331S.j) L234A, L235E, G237A, A330S and P331S.

k) N297Q, L234A, L235E, G237A, A330S y P331S.k) N297Q, L234A, L235E, G237A, A330S and P331S.

En una realización, la región Fc de anticuerpo es una IgG1 que comprende uno o más de los siguientes grupos de mutaciones puntuales:In one embodiment, the antibody Fc region is an IgG1 comprising one or more of the following groups of point mutations:

a) N297Q y/oa) N297Q and / or

b) L234A y L235E y/ob) L234A and L235E and / or

c) G236R y L328R y/oc) G236R and L328R and / or

d) N297Q, L234A y L235E y/od) N297Q, L234A and L235E and / or

e) N297Q, L234A, L235E y G237A y/oe) N297Q, L234A, L235E and G237A and / or

f) L234A, L235E, G237A, A330S y P331S.f) L234A, L235E, G237A, A330S and P331S.

Será evidente para el experto en la materia que pueden introducirse mutaciones puntuales dentro de la región marco de las cadenas tanto pesadas como ligeras basándose en criterios convencionales para sustituir restos de aminoácido. Pueden usarse ensayos funcionales como los descritos en el presente documento para confirmar que dichas mutaciones no influyen en la funcionalidad del anticuerpo.It will be apparent to one of ordinary skill in the art that point mutations can be introduced within the framework region of both heavy and light chains based on conventional criteria for substituting amino acid residues. Functional assays such as those described herein can be used to confirm that such mutations do not influence the functionality of the antibody.

Como será evidente de lo anterior, la especificidad de unión de los anticuerpos identificados se proporciona por las regiones variables o CDR, y es evidente que la invención incluye diferentes tipos de anticuerpos que poseen una región de unión a antígeno similar.As will be apparent from the foregoing, the binding specificity of the identified antibodies is provided by the variable regions or CDRs, and it is apparent that the invention includes different types of antibodies that possess a similar antigen-binding region.

En una realización de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En una realización de la invención, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano, de ratón, rata, conejo, cerdo o primate no humano. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Como se describe en la parte de definición de la solicitud, un anticuerpo humanizado incluye al menos regiones CDR no derivadas de la secuencia de línea germinal humana. Como es evidente además de lo anterior, un anticuerpo humano puede comprender una o más mutaciones puntuales en comparación con la secuencia de línea germinal, pero generalmente se considera que la secuencia debería tener, al menos en la región marco o región Fc, al menos un 95 % de identidad con secuencias de la línea germinal humana.In one embodiment of the invention, the antibody is a full-length antibody. In one embodiment of the invention, the antibody is an antibody fragment or a single chain antibody. In one embodiment, the antibody is a monoclonal antibody. In one embodiment, the antibody is a non-human human, mouse, rat, rabbit, pig, or primate antibody. In one embodiment, the antibody is a human antibody. As described in the definition part of the application, a humanized antibody includes at least CDR regions not derived from the human germline sequence. As is evident in addition to the above, a human antibody may comprise one or more point mutations compared to the germline sequence, but it is generally considered that the sequence should have, at least in the framework region or Fc region, at least one 95% identity to human germline sequences.

Formulaciones farmacéuticasPharmaceutical formulations

La presente invención incluye además composiciones/formulaciones farmacéuticas, que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y un polipéptido o anticuerpo de acuerdo con la invención, así como kits que comprenden dichas composiciones.The present invention further includes pharmaceutical compositions / formulations, comprising a pharmaceutically acceptable carrier and a polypeptide or antibody according to the invention, as well as kits comprising said compositions.

El anticuerpo de acuerdo con la invención, en un aspecto de la invención, puede formularse en una composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica puede prepararse basándose en el conocimiento general en el campo, tal como en la Farmacopea o en Remington.The antibody according to the invention, in one aspect of the invention, can be formulated in a pharmaceutical composition. Such a pharmaceutical composition can be prepared based on general knowledge in the field, such as the Pharmacopoeia or Remington.

En una realización, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La formulación puede estar en forma de una formulación acuosa o una formulación seca que se reconstituye en agua o una composición de tampón acuoso antes de la administración.In one embodiment, the pharmaceutical composition according to the invention comprises an antibody as described herein in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. The formulation may be in the form of an aqueous formulation or a dry formulation that is reconstituted in water or an aqueous buffer composition prior to administration.

Una composición farmacéutica de anticuerpos de acuerdo con la invención puede comprender una sal y/o tampón, tales como las composiciones descritas en el documento WO2011/104381.A pharmaceutical composition of antibodies according to the invention may comprise a salt and / or buffer, such as the compositions described in WO2011 / 104381.

En otras realizaciones, la composición farmacéutica de anticuerpos de acuerdo con la invención puede ser adecuada para múltiples usos, tales como las composiciones descritas en el documento WO2011/147921.In other embodiments, the pharmaceutical antibody composition according to the invention may be suitable for multiple uses, such as the compositions described in WO2011 / 147921.

Método de tratamientoTreatment method

Un aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo de la invención para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéutica de un anticuerpo como se describe en el presente documento. Como se ha descrito en publicaciones previas tales como el documento WO 2009/103113, los anticuerpos anti-C5aR se pueden utilizar/son adecuados para el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos. Por lo tanto, una realización de la invención se refiere a un anticuerpo de la invención para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno inmunológico, en particular, una enfermedad inflamatoria. El ejemplo 8 del presente documento confirma esto adicionalmente demostrando la funcionalidad de un anticuerpo anti-C5aR de acuerdo con la invención en un modelo de artritis en ratones. Los ejemplos 9-11 demuestran la regulación positiva de C5aR en muestras de tejido de pacientes con artritis psoriásica, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. También se demuestra que un anticuerpo anti-C5aR puede inhibir la migración celular de PMN inducida por líquido sinovial de pacientes con artritis psoriásica.One aspect of the invention relates to an antibody of the invention for use in a method of treating or preventing a disorder in a subject, the method comprising administering to a subject in need thereof a therapeutic amount of an antibody as described herein. document. As described in previous publications such as WO 2009/103113, anti-C5aR antibodies can / are suitable for the treatment of various diseases and disorders. Therefore, one embodiment of the invention relates to an antibody of the invention for use in treating an immune disease or disorder, in particular an inflammatory disease. Example 8 herein confirms this further by demonstrating the functionality of an anti-C5aR antibody according to the invention in a mouse model of arthritis. Examples 9-11 demonstrate upregulation of C5aR in tissue samples from patients with psoriatic arthritis, Crohn's disease, and ulcerative colitis. It is also shown that an anti-C5aR antibody can inhibit PMN cell migration induced by synovial fluid from psoriatic arthritis patients.

Un método de tratamiento puede tener como objetivo la curación de una enfermedad o trastorno, pero en relación con algunas enfermedades entre las que se incluyen enfermedades inmunológicas e inflamatorias, tales como una enfermedad o trastorno crónico, también se considera un tratamiento el alivio de uno o más síntomas, lo cual puede ser una mejoría significativa del sujeto incluso si solo se obtiene un alivio parcial de los síntomas o el efecto es solo temporal o parcial.A method of treatment may be aimed at curing a disease or disorder, but in relation to some diseases including immunological and inflammatory diseases, such as a chronic disease or disorder, a treatment is also considered to be the alleviation of one or more symptoms, which can be a significant improvement to the subject even if only partial relief of symptoms is obtained or the effect is only temporary or partial.

El anticuerpo de la invención puede usarse en el tratamiento de una o más enfermedades entre las que se incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide (AR), psoriasis, artritis psoriásica, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis por lupus, diabetes de tipo I, enfermedad de Grave, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn (EC), colitis ulcerosa (CU), síndrome del intestino irritable, esclerosis múltiple (EM), miocarditis autoinmunitaria, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad pulmonar intersticial, tiroiditis autoinmunitaria, esclerodermia, esclerosis sistémica, osteoartritis, dermatitis atópica, vitíligo, enfermedad de injerto contra hospedador, síndrome de Sjogren, nefritis autoinmunitaria, síndrome de Goodpasture, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, vasculitis asociada a ANCA, uveítis, esclerodermia, pénfigo ampolloso, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Huntington, fibrosis quística, gota, degeneración macular asociada a la edad, alergia, asma y otras enfermedades autoinmunitarias que son el resultado de una inflamación aguda o crónica. En otra realización, la enfermedad o trastorno es una inflamación aguda o crónica, en donde el trastorno puede ser una enfermedad autoinmunitaria. En una realización, el trastorno es artritis reumatoide (AR), artritis psoriásica, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis por lupus, enfermedad inflamatoria intestinal (EII) incluyendo enfermedad de Crohn (EC) o colitis ulcerosa (CU) o síndrome del intestino irritable. En otras realizaciones, el trastorno es AR o LES. Aparte de en enfermedades crónicas, los anticuerpos anti-C5aR pueden ser pertinentes en relación con indicaciones agudas tales como trasplantes, lesión de isquemia/reperfusión (por ejemplo, infarto de miocardio agudo, ictus), septicemia (por ejemplo, SRIS (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica), SDMO (síndrome de disfunción multiorgánica), LPA (lesión pulmonar aguda)), aterosclerosis y hemorragia intracerebral (HIC).The antibody of the invention can be used in the treatment of one or more diseases including, but not limited to, rheumatoid arthritis (RA), psoriasis, psoriatic arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), lupus nephritis, type diabetes I, Grave's disease, inflammatory bowel disease (IBD), Crohn's disease (CD), ulcerative colitis (UC), irritable bowel syndrome, multiple sclerosis (MS), autoimmune myocarditis, Kawasaki disease, coronary artery disease, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), interstitial lung disease, autoimmune thyroiditis, scleroderma, systemic sclerosis, osteoarthritis, atopic dermatitis, vitiligo, graft-versus-host disease, Sjogren's syndrome, autoimmune nephritis, Goodpasture's syndrome, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, chronic inflammatory vasculitis associated with ANCA, uveitis, scleroderma, bullous pemphigus, Alzheimer's disease, lat sclerosis amyotrophic eral, Huntington's chorea, cystic fibrosis, gout, age-related macular degeneration, allergy, asthma, and other autoimmune diseases that are the result of acute or chronic inflammation. In another embodiment, the disease or disorder is an acute or chronic inflammation, wherein the disorder can be an autoimmune disease. In one embodiment, the disorder is rheumatoid arthritis (RA), psoriatic arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), lupus nephritis, inflammatory bowel disease (IBD) including Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) or bowel syndrome. irritable. In other embodiments, the disorder is AR or SLE. Apart from chronic diseases, anti-C5aR antibodies may be relevant in relation to acute indications such as transplantation, ischemia / reperfusion injury (for example, acute myocardial infarction, stroke), septicemia (for example, SIRS (response syndrome inflammatory systemic), MODS (multi-organ dysfunction syndrome), APL (acute lung injury)), atherosclerosis, and intracerebral hemorrhage (ICH).

En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo, un anticuerpo aislado o composición de anticuerpo como se describe en el presente documento, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno. En otra realización, dicho anticuerpo, anticuerpo aislado o composición de anticuerpo es para el tratamiento de una o más de las enfermedades y trastornos descritos en el presente documento anteriormente en relación con un método de tratamiento.In another aspect, the invention relates to an antibody, an isolated antibody, or an antibody composition as described herein, for the treatment of a disease or disorder. In another embodiment, said antibody, isolated antibody, or antibody composition is for the treatment of one or more of the diseases and disorders described herein above in connection with a method of treatment.

Un aspecto de la invención se refiere al uso de un anticuerpo, un anticuerpo aislado o composición de anticuerpo como se describe en el presente documento, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno puede ser como se ha descrito anteriormente en el presente documento en relación con un método de tratamiento.One aspect of the invention relates to the use of an antibody, isolated antibody, or antibody composition as described herein, for the preparation of a medicament for the treatment of a disease or disorder, wherein the disease or disorder may be as described hereinabove in relation to a treatment method.

MODO DE ADMINISTRACIÓNADMINISTRATION MODE

Un anticuerpo de la invención se puede administrar por vía parenteral, tal como por vía intravenosa, tal como por vía intramuscular, tal como por vía subcutánea. Como alternativa, un anticuerpo de la invención se puede administrar por una vía no parenteral, tal como por vía peroral o tópica. Un anticuerpo de la invención se puede administrar profilácticamente. En una realización preferida, el anticuerpo se administra por vía intravenosa o subcutánea.An antibody of the invention can be administered parenterally, such as intravenously, such as intramuscularly, such as subcutaneously. Alternatively, an antibody of the invention can be administered non-parenterally, such as perorally or topically. An antibody of the invention can be administered prophylactically. In a preferred embodiment, the antibody is administered intravenously or subcutaneously.

La dosificación y programación de tiempos de administración dependerá muy probablemente de diversos factores entre los que se incluyen la enfermedad/trastorno o los síntomas de interés así como el sujeto en cuestión. En general, es de esperar que el anticuerpo se administre en dosis de desde 0,010 mg/kg hasta 4-6 mg/kg. Análogamente, el régimen de dosificación del anticuerpo también dependerá del sujeto individual y de la patología de dicho sujeto, pero es deseable de acuerdo con la invención emplear un tratamiento en el que el anticuerpo (o composición de anticuerpo) se administre al sujeto una vez por semana o cada 2 semanas o, incluso, a intervalos inferiores, tales como una vez al mes.The dosage and timing of administration will most likely depend on various factors including the disease / disorder or symptoms of interest as well as the subject in question. In general, the antibody is expected to be administered in doses of from 0.010 mg / kg to 4-6 mg / kg. Similarly, the dosage regimen of the antibody will also depend on the individual subject and the pathology of said subject, but it is desirable according to the invention to employ a treatment in which the antibody (or antibody composition) is administered to the subject once per week or every 2 weeks or even at lower intervals, such as once a month.

Un anticuerpo de la invención se puede administrar a petición, es decir, el anticuerpo se puede administrar basándose en la experiencia de los pacientes, por ejemplo, cuando aparecen síntomas particulares o cuando la cantidad de biomarcadores particulares alcanza un nivel predefinido.An antibody of the invention can be administered on demand, that is, the antibody can be administered based on the experience of patients, for example, when particular symptoms appear or when the amount of particular biomarkers reaches a predefined level.

TRATAMIENTOS COMBINADOS ESPECÍFICOSSPECIFIC COMBINED TREATMENTS

Los anticuerpos de la invención pueden coadministrarse con uno o más de otros agentes terapéuticos o formulaciones. El otro agente puede ser un agente que potencie los efectos de los anticuerpos de la invención. El otro agente puede estar destinado a tratar otros síntomas o afecciones del paciente. Por ejemplo, el otro agente puede ser un analgésico, un inmunosupresor o un agente antiinflamatorio. El otro agente puede ser otro anticuerpo monoclonal, tal como uno de los descritos en las solicitudes de patente internacional WO 2008/022390 y WO 2009/103113.The antibodies of the invention can be co-administered with one or more other therapeutic agents or formulations. The other agent may be an agent that enhances the effects of the antibodies of the invention. The other agent may be intended to treat other symptoms or conditions of the patient. For example, the other agent can be an analgesic, an immunosuppressant, or an anti-inflammatory agent. The other agent can be another monoclonal antibody, such as one of those described in international patent applications WO 2008/022390 and WO 2009/103113.

La administración combinada de dos o más agentes puede conseguirse de varias maneras diferentes. En una realización, el anticuerpo y el otro agente pueden administrarse juntos en una sola composición. En otra realización, el anticuerpo y el otro agente pueden administrarse en composiciones separadas como parte de una terapia combinada. Por ejemplo, el modulador puede administrarse antes, después o al mismo tiempo que el otro agente. The combined administration of two or more agents can be achieved in several different ways. In one embodiment, the antibody and the other agent can be administered together in a single composition. In another embodiment, the antibody and the other agent can be administered in separate compositions as part of a combination therapy. For example, the modulator can be administered before, after, or at the same time as the other agent.

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden administrarse junto con otros fármacos (por ejemplo, metotrexato, dexametasona y prednisona) y/u otros fármacos biológicos. En una realización de acuerdo con la invención, un anticuerpo puede coadministrarse con uno o más agentes terapéuticos seleccionados del código ATC clase M01C de fármacos antirreumáticos y del código ATC L04 de inmunosupresores como se describe en el documento WO 2009/103113 entre los que se incluyen, pero sin limitación, azatioprina, cloroquina, hidroxicloroquina, ciclosporina, D-penicilamina, sales de oro (aurotiomalato sódico, auranofin), leflunomida, metotrexato, minociclina, sulfasalazina y ciclofosfamida, glucocorticosteroides, ácido micofenólico o micofenolato y tacrolimus y, en una realización distinta, uno o más de Plaquenil, Azulfidina y Metotrexato, dexametasona y/o prednisona.Antibodies according to the present invention can be administered in conjunction with other drugs (eg, methotrexate, dexamethasone, and prednisone) and / or other biological drugs. In one embodiment according to the invention, an antibody can be co-administered with one or more therapeutic agents selected from the ATC class M01C code of antirheumatic drugs and the ATC code L04 of immunosuppressants as described in WO 2009/103113 including including , but not limited to, azathioprine, chloroquine, hydroxychloroquine, cyclosporine, D-penicillamine, gold salts (sodium aurothiomalate, auranofin), leflunomide, methotrexate, minocycline, sulfasalazine and cyclophosphamide, glucocorticosteroids, mycophenolic acid and mycophenolic acid in one embodiment, and mycophenolic acid different, one or more of Plaquenil, Azulfidine and Methotrexate, dexamethasone and / or prednisone.

En otro ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en combinación con otros anticuerpos (por ejemplo, en combinación con anticuerpos que se unen a receptores de quimiocinas, incluyendo, pero sin limitación, CCR2 y CCR3) o con anti-TNF u otros agentes antiinflamatorios o con productos de plasma sanguíneo existentes, tales como productos de gammaglobulinas e inmunoglobulinas disponibles en el mercado usados en tratamientos profilácticos o terapéuticos. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse como composiciones administradas por separado proporcionadas junto con antibióticos y/o agentes antimicrobianos.In another example, the antibodies of the present invention can also be used in combination with other antibodies (eg, in combination with antibodies that bind to chemokine receptors, including, but not limited to, CCR2 and CCR3) or with anti-TNF or other anti-inflammatory agents or with existing blood plasma products, such as commercially available gamma globulin and immunoglobulin products used in prophylactic or therapeutic treatments. The antibodies of the present invention can be used as separately administered compositions provided in conjunction with antibiotics and / or antimicrobial agents.

Por consiguiente, pueden administrarse anticuerpos en combinación con agentes tales como agentes que ya se están usando en autoinmunidad que incluyen, aunque no de forma limitativa, inmunomoduladores tales como IFN-beta, Orencia™ (CTLA4-lg), Humira™ (anti-TNF), Cimzia™ (anti-TNF, PeG Fab), Tysabri™ (mAb de integrina a4), Simponi™, Rituxan/MabThera™, Actemra/RoActemra™, Kineret™, Raptiva, Ustekimumab, antiinflamatorios no esteroideos (AINE) tales como Asprin™, Ibuprofen™ etc., Corticosteroides, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDS) tales como Plaquenil™, Azulfidine™, Methotrexate™, etc., Copaxone™ (acetato de glatiramer), Gilneya™ (fingolimod), antibióticos tales como Flagyl™, Cipro™, medicamentos tópicos (aplicados a la piel) entre los que se incluyen corticosteroides tópicos, cremas de análogos de vitamina D (Dovonex™), retinoides tópicos (Tazorac™), hidratantes, inmunomoduladores tópicos (tacrolimus y pimecrolimus), alquitrán, antralina y otros, y adicionalmente, también puede combinarse con el tratamiento que usa anticuerpos de acuerdo con la invención, fototerapia tal como PUVA, UVB y CellCept™ (micofenolato mofetil).Accordingly, antibodies can be administered in combination with agents such as agents already in use in autoimmunity including, but not limited to, immunomodulators such as IFN-beta, Orencia ™ (CTLA4-lg), Humira ™ (anti-TNF ), Cimzia ™ (anti-TNF, PeG Fab), Tysabri ™ (integrin a4 mAb), Simponi ™, Rituxan / MabThera ™, Actemra / RoActemra ™, Kineret ™, Raptiva, Ustekimumab, non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as Asprin ™, Ibuprofen ™ etc., Corticosteroids, modifying antirheumatic drugs (DMARDS) such as Plaquenil ™, Azulfidine ™, Methotrexate ™, etc., Copaxone ™ (glatiramer acetate), Gilneya ™ (fingolimod), antibiotics such as Flagyl ™, Cipro ™, topical medications (applied to the skin ) including topical corticosteroids, vitamin D analog creams (Dovonex ™), topical retinoids (Tazorac ™), moisturizers, topical immunomodulators (tacrolimus and pimecrolimus), tar, anthralin and others, and additionally, it can also be combined with treatment using antibodies according to the invention, phototherapy such as PUVA, UVB and CellCept ™ (mycophenolate mofetil).

Es posible que el sujeto a tratar ya se esté tratando con uno o más fármacos distintos, en este caso el anticuerpo de la invención puede añadirse a dicho régimen de tratamiento.It is possible that the subject to be treated is already being treated with one or more different drugs, in this case the antibody of the invention can be added to said treatment regimen.

Método para la preparación de anticuerposMethod for the preparation of antibodies

Un anticuerpo puede prepararse por diversos métodos conocidos en la técnica, principalmente basándose en clones de hibridoma para la producción del anticuerpo o expresión del anticuerpo en un hospedador recombinante, describiéndose esto último en el documento WO2010/000864. Basándose en el conocimiento en la técnica, puede construirse una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de anticuerpo deseada y usarse para expresión recombinante de un anticuerpo donde la cadena pesada y ligera pueden expresarse a partir de uno o dos polinucleótidos separados.An antibody can be prepared by various methods known in the art, primarily relying on hybridoma clones for antibody production or antibody expression in a recombinant host, the latter being described in WO2010 / 000864. Based on knowledge in the art, a nucleotide sequence encoding a desired antibody chain can be constructed and used for recombinant expression of an antibody where the heavy and light chain can be expressed from one or two separate polynucleotides.

La presente invención, en un aspecto adicional, se refiere a uno o más polinucleótidos aislados que codifican una secuencia polipeptídica de una cadena de anticuerpo de un anticuerpo descrito en el presente documento.The present invention, in a further aspect, relates to one or more isolated polynucleotides encoding a polypeptide sequence of an antibody chain of an antibody described herein.

Otro aspecto se refiere a una célula hospedadora que comprende uno o más polinucleótidos que codifican una o más secuencias polipeptídicas de una cadena de anticuerpo de un anticuerpo descrito en el presente documento.Another aspect relates to a host cell comprising one or more polynucleotides that encode one or more polypeptide sequences of an antibody chain of an antibody described herein.

La invención se refiere además a un proceso para producir un anticuerpo de acuerdo con la invención, que comprende cultivar una célula hospedadora descrita anteriormente en condiciones que soportan la expresión de una o más secuencias polipeptídicas de una cadena de anticuerpo. El proceso puede incluir además que las cadenas de anticuerpo se codifiquen por dos marcos de lectura abiertos separados en un polinucleótido contiguo y, opcionalmente, que el anticuerpo se recupere a partir de dicho cultivo de células hospedadoras.The invention further relates to a process for producing an antibody according to the invention, which comprises culturing a host cell described above under conditions that support the expression of one or more polypeptide sequences of an antibody chain. The process may further include that the antibody chains are encoded by two separate open reading frames in a contiguous polynucleotide and optionally that the antibody is recovered from said host cell culture.

EjemplosExamples

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos anti hC5aR humanosExample 1: Generation of anti-human hC5aR antibodies

Inmunización y cribadoImmunization and screening

En general, la producción de anticuerpos contra GPCR es difícil porque es muy difícil, si no imposible, producir proteínas solubles que tengan la conformación de la proteína nativa correcta. Tradicionalmente, se han usado células que sobreexpresan GPCR para inmunización, pero las respuestas de anticuerpo resultantes suelen ser muy inespecíficas, lo que hace que sea difícil identificar anticuerpos que tengan el perfil deseado, es decir, que sean capaces de bloquear la unión al ligando y la señalización de GPCR. De hecho, los inventores observaron que era muy difícil desarrollar anticuerpos anti-hC5aR humanos que pudieran bloquear C5a al unirse a C5aR, y se aplicaron varias estrategias de inmunización antes de identificar estos anticuerpos.In general, the production of antibodies against GPCR is difficult because it is very difficult, if not impossible, to produce soluble proteins that have the correct native protein conformation. Traditionally, cells that overexpress GPCR have been used for immunization, but the resulting antibody responses are often very nonspecific, making it difficult to identify antibodies that have the desired profile, that is, that are capable of blocking ligand binding and GPCR signaling. In fact, the inventors found that it was very difficult to develop human anti-hC5aR antibodies that could block C5a by binding to C5aR, and several immunization strategies were applied before identifying these antibodies.

Se inmunizaron ratones HumAb (Medarex) con células L1.2 de ratón (una línea de linfoma de células B de ratón) con alta expresión de C5aR humano (-80.000 copias por célula) (Lee et al Nat. Biotechnol, 2006; 10:1279-1284) y se usaron esplenocitos de ratones inmunizados para fusiones celulares usando procedimientos convencionales. Debido a la ausencia de hC5aR soluble, no pudieron cribarse los sobrenadantes en un ensayo ELISA convencional y, por lo tanto, se estableció un ensayo de unión basado en células. Los sobrenadantes de hibridoma obtenidos se ensayaron con respecto a la unión a una línea de células de rata transfectadas (RBL) que expresaban de manera estable un alto número (~1.000.000 copias por célula) de hC5aR nativo por análisis de FACS como se describe en el documento WO2008/022390. En general, los sobrenadantes de hibridoma se incubaron con una mezcla de células no transfectadas (marcadas con CellTracker) y células transfectadas con hC5aR, o neutrófilos de ratones knockout/knock-in (KOKI) para hC5aR (documento WO 2005/060739) y se incubaron con F(ab’)2 de cabra anti-IgG humana, conjugado con APC (lgG-APC). Se identificaron los sobrenadantes que se unían a células transfectadas con hC5aR pero no a células no transfectadas, y se subclonaron y ensayaron los hibridomas que producían anti-hC5aR con respecto a la unión a neutrófilos humanos y neutrófilos derivados de médula ósea aislados de ratones KOKI (datos no mostrados). Se purificaron anticuerpos anti-hC5aR a partir de los sobrenadantes de hibridoma usando proteína A sepharose y protocolos convencionales.HumAb mice (Medarex) were immunized with mouse L1.2 cells (a mouse B-cell lymphoma line) with high expression of human C5aR (-80,000 copies per cell) (Lee et al Nat. Biotechnol, 2006; 10: 1279-1284) and splenocytes from immunized mice were used for cell fusions using standard procedures. Due to the absence of soluble hC5aR, supernatants could not be screened in a standard ELISA assay and therefore a cell-based binding assay was established. The obtained hybridoma supernatants were assayed for binding to a transfected rat cell line (RBL) stably expressing a high number (~ 1,000,000 copies per cell) of native hC5aR by FACS analysis as described. in WO2008 / 022390. In general, hybridoma supernatants were incubated with a mixture of non-transfected cells (labeled with CellTracker) and cells transfected with hC5aR, or neutrophils from hC5aR knockout / knock-in (KOKI) mice (WO 2005/060739) and were incubated with goat anti-human IgG F (ab ') 2, conjugated with APC (IgG-APC). Supernatants that bound cells transfected with hC5aR but not non-transfected cells were identified, and hybridomas producing anti-hC5aR were subcloned and tested for binding to human neutrophils and bone marrow-derived neutrophils isolated from KOKI mice ( data not revealed). Anti-hC5aR antibodies were purified from the hybridoma supernatants using protein A sepharose and standard protocols.

Ejemplo 2: Identificación y caracterización de anticuerpos anti-hC5aRExample 2: Identification and characterization of anti-hC5aR antibodies

Como ya se ha mencionado, el proceso de obtención de anticuerpos anti-hC5aR humanos fue problemático y tenían que realizarse 32 fusiones antes de identificar un anticuerpo bloqueante de hC5a/hC5aR. A partir de 35 fusiones y del cribado de más de 100.000 sobrenadantes de hibridoma, solo se identificaron 11 clones que pudieran bloquear la unión de hC5a a hC5aR. A continuación se describen los ensayos aplicados en la caracterización de los anticuerpos. El anticuerpo de referencia (Ref. Ab Q) se describe en el documento WO2009/103113. Además, en el ejemplo 7 se describen ensayos adicionales adecuados para determinar la afinidad y funcionalidad en un ensayo de flujo de calcio y en la regulación positiva por CD11 b.As already mentioned, the process of obtaining human anti-hC5aR antibodies was problematic and 32 fusions had to be performed before identifying an hC5a / hC5aR blocking antibody. From 35 fusions and screening of more than 100,000 hybridoma supernatants, only 11 clones were identified that could block the binding of hC5a to hC5aR. The tests applied in the characterization of the antibodies are described below. The reference antibody (Ref. Ab Q) is described in WO2009 / 103113. In addition, example 7 describes additional assays suitable for determining affinity and functionality in a calcium flux assay and upregulation by CD11b.

Ensayo de desplazamientoDisplacement test

Se aplicó un ensayo de centelleo por proximidad (SPA) para determinar la potencia de los anticuerpos anti-hC5aR de desplazar la unión de hC5a a hC5aR. En la patente de Estados Unidos 4568649 se proporciona una descripción detallada del SPA y protocolos proporcionados por el fabricante (Amersham Biosciences). En resumen, se unen fragmentos de membrana que llevan receptor, purificados a partir de células RBL-hC5aR, a micropartículas de centelleo recubiertas con aglutinina de germen de trigo (WGA). Después de la adición de un trazador de hC5a radiomarcado (125I), la unión a los receptores producirá la emisión de luz desde las partículas. De forma específica para el principio del SPA, solo emitirán luz los radioisótopos y partículas que se encuentren en proximidad inmediata entre sí. Es decir, solo la hC5a radiomarcada unida a un receptor está suficientemente próxima a una partícula de WGA como para producir luz. Por lo tanto, la cantidad de luz emitida es una expresión de la cantidad de 125I-hC5a unida al receptor. El ensayo es un ensayo competitivo, en el que anti-hC5aR/hC5a sin marcar compite con el trazador por la unión a los receptores. En el ensayo, se añade una cantidad fija de C5a marcado con 125I a partículas de WGA y receptores C5aR dando como resultado la emisión de una cierta cantidad de luz medida como cuentas por minuto (cpm). Si se añade C5a no marcado o anti-C5aR, su unión a los receptores producirá un menor número de cpm debido al desplazamiento de 125I C5a. El % de desplazamiento se calculó de la siguiente manera:A scintillation proximity assay (SPA) was applied to determine the potency of anti-hC5aR antibodies to displace the binding of hC5a to hC5aR. A detailed description of the SPA and protocols provided by the manufacturer (Amersham Biosciences) is provided in US Patent 4568649. Briefly, receptor-bearing membrane fragments, purified from RBL-hC5aR cells, are bound to wheat germ agglutinin (WGA) coated scintillation microparticles. After the addition of a radiolabeled hC5a tracer (125I), binding to the receptors will cause the emission of light from the particles. Specifically for the SPA principle, only radioisotopes and particles that are in close proximity to each other will emit light. That is, only radiolabeled hC5a bound to a receptor is close enough to a WGA particle to produce light. Therefore, the amount of light emitted is an expression of the amount of 125I-hC5a bound to the receptor. The assay is a competitive assay, in which unlabeled anti-hC5aR / hC5a competes with the tracer for binding to receptors. In the assay, a fixed amount of 125I-labeled C5a is added to WGA particles and C5aR receptors resulting in the emission of a certain amount of light measured as counts per minute (cpm). If unlabeled C5a or anti-C5aR is added, their binding to receptors will produce a lower number of cpm due to the 125I C5a shift. The% displacement was calculated as follows:

5~5máx -100 %5 ~ 5max -100%

S ^{m á x .} S ^max.

S: MuestraS: Sample

Smáx: Unión no específica. Medida añadiendo hC5a no marcado en una cantidad suficiente para desplazar a 125I-hC5a unido específicamente.Smáx: Non-specific binding. Measured by adding unlabeled hC5a in an amount sufficient to displace specifically bound 125I-hC5a.

S0: Unión máxima. Se añade hC5a no marcado.S0: Maximum union. Unlabeled hC5a is added.

El valor de CI50 se define como la concentración que desplaza el 50 % de C5a. El número de cpm se mantuvo constante entre experimentos, por lo tanto, los valores de CI50 son relativos ya que el trazador se desintegra con el tiempo. Se determinó la potencia (CI50) de los anticuerpos anti-hC5aR humanos para desplazar 125I-hC5a y los datos se proporcionan en la tabla 1.The IC50 value is defined as the concentration that displaces 50% of C5a. The number of cpm remained constant between experiments, therefore IC50 values are relative as the tracer disintegrates over time. The potency (IC50) of human anti-hC5aR antibodies to displace 125I-hC5a was determined and the data is provided in Table 1.

Ensayo de migración de neutrófilos (quimiotaxis)Neutrophil migration assay (chemotaxis)

La potencia de los anticuerpos para inhibir la migración de neutrófilos dependiente de hC5a (o mC5a) se analizó en una cámara Boyden. Se tiñeron con calceína neutrófilos aislados de sangre humana o animal y se añadieron al compartimento superior de la cámara Boyden y se mezclaron con los anticuerpos. Se aplicaron hC5a o mC5a al compartimento inferior de la cámara Boyden y actuaron como quimioatrayentes para los neutrófilos. La capacidad de los neutrófilos de migrar a la cámara inferior se determinó mediante el recuento del número de neutrófilos marcados con calceína que pasaron a través de una membrana fluoroblok de 3 o 5 pm.The potency of the antibodies to inhibit hC5a (or mC5a) -dependent neutrophil migration was analyzed in a Boyden chamber. Neutrophils isolated from human or animal blood were calcein stained and added to the upper compartment of the Boyden chamber and mixed with the antibodies. HC5a or mC5a were applied to the lower compartment of the Boyden chamber and acted as chemoattractants for neutrophils. The ability of neutrophils to migrate to the lower chamber was determined by counting the number of calcein-labeled neutrophils that passed through a 3 or 5 pm fluoroblok membrane.

Se obtuvieron PMN (leucocitos PoliMorfoNucleares; granulocitos) humanos a partir de muestras de sangre humana extraída en viales que contenían EDTA. Las células sanguíneas se separaron por centrifugación de sangre (4 partes) a través de un gradiente de Ficoll-Paque PLUS (GE Health Care) (3 partes) durante 30 min (400 x g) a temperatura ambiente. La capa que contenía PMN se suspendió en PBS (solución salina tamponada con fosfato) que contenía dextrano-500 (Sigma) durante 1 h para retirar los eritrocitos contaminantes. El sobrenadante se centrifugó durante 5 min (250 x g) a temperatura ambiente y los eritrocitos restantes se lisaron por ósmosis usando NaCl al 0,2 % durante 55 s. La solución se hizo isotónica mediante NaCl al 1,2 % PBS y se centrifugó a 250 x g durante 5 min, antes de repetir la lisis osmótica. Después de la centrifugación, los PMN se resuspendieron en mezcla de reacción (MR): HBSS (n.° de cat. 14175 Gibco) contiene NaCl 137mM, KCI 5,3 mM, Na2HPO40,33 mM, NaHCO34 mM, KH2PO40,44 mM, Glucosa 5 mM; complementado con MgSO4^7H2O 0,4 mM, MgCl2, 0,5 mM, CaCl20,5 mM, HEPES 20 mM. La densidad celular se determinó por NucleoCounter (Chemometec). La suspensión de PMN contenía >95 % de neutrófilos, lo cual se evaluó por microscopía de muestras teñidas con Giemsa.Human PMNs (PolyMorphoNuclear Leukocytes; Granulocytes) were obtained from human blood samples drawn in vials containing EDTA. Blood cells were separated by centrifugation of blood (4 parts) through a Ficoll-Paque PLUS gradient (GE Health Care) (3 parts) for 30 min (400 x g) at room temperature. The layer containing PMN was suspended in PBS (phosphate buffered saline) containing dextran-500 (Sigma) for 1 h to remove contaminating erythrocytes. The supernatant was centrifuged for 5 min (250 x g) at room temperature and the remaining erythrocytes were lysed by osmosis using 0.2% NaCl for 55 s. The solution was made isotonic with 1.2% NaCl PBS and centrifuged at 250 x g for 5 min, before repeating the osmotic lysis. After centrifugation, the PMNs were resuspended in Reaction Mix (MR): HBSS (Gibco cat # 14175) contains 137mM NaCl, 5.3mM KCl, Na2HPO40.33mM, NaHCO34mM, KH2PO40.44mM , Glucose 5 mM; supplemented with 0.4 mM MgSO4 ^ 7H2O, 0.5 mM MgCl2, 20.5 mM CaCl, 20 mM HEPES. Cell density was determined by NucleoCounter (Chemometec). The PMN suspension contained> 95% neutrophils, which was evaluated by microscopy of Giemsa-stained samples.

Carga de PMN: se disolvió calceína, AM, (Fluka) en DMSO (dimetil sulfóxido) y se diluyó 1000 veces en RM con células (2x106 células por ml) produciendo una concentración de 10 pM. La suspensión se incubó durante 30 min en una incubadora a 37 °C y después se lavó 3 veces con RM para eliminar el exceso de calceína. Finalmente, las células se resuspendieron en RM (4x106 células/ml).PMN loading: Calcein, AM, (Fluka) was dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide) and diluted 1000-fold in cell MRI (2x10 6 cells per ml) producing a concentration of 10 pM. The suspension was incubated for 30 min in a 37 ° C incubator and then washed 3 times with RM to remove excess calcein. Finally, the cells were resuspended in MR (4x106 cells / ml).

La migración se evaluó por la técnica de la cámara Boyden usando FluoroBlok®, tamaño de poro 3 pm, 96 pocillos (n.° cat. 351161.BD Falcon (VWR)). La cámara superior, es decir, los insertos que contenían membrana Fluoroblok se recubrieron con fibrinógeno humano (n.° cat. F3879-1G, Sigma) en PBS a 1 mg/ml a 37 °C durante 2 h. Después del lavado, las membranas se bloquearon con una solución que contenía un 2 % de albúmina de suero bovino (BSA), en PBS. Después de otro lavado usando RM, se añadieron a cada pocilio 105 PMN cargados con calceína con o sin los anticuerpos de hC5aR y se pusieron en la placa receptora (cámara inferior) que contenía la solución de control o el quimioatrayente hC5a (Sigma, C5788). Cada grupo estaba compuesto por al menos 6 pocillos. Posteriormente, la placa se midió a 485/538 nm, 37 °C cada 5 min durante 60 min en un lector de placas (SpectraMax, Molecular devices, o Fluoroscan, Thermo Labsystems.). El valor a 30 min en unidades relativas de fluorescencia se usó como medida de la migración.Migration was assessed by Boyden chamber technique using FluoroBlok®, 3 pm pore size, 96 well (cat # 351161.BD Falcon (VWR)). The upper chamber, that is, the inserts containing Fluoroblok membrane were coated with human fibrinogen (cat # F3879-1G, Sigma) in PBS at 1 mg / ml at 37 ° C for 2 h. After washing, the membranes were blocked with a solution containing 2% bovine serum albumin (BSA), in PBS. After another wash using MR, 105 calcein-loaded PMNs with or without the hC5aR antibodies were added to each well and placed on the receiving plate (lower chamber) containing the control solution or the hC5a chemoattractant (Sigma, C5788) . Each group consisted of at least 6 wells. Subsequently, the plate was measured at 485/538 nm, 37 ° C every 5 min for 60 min in a plate reader (SpectraMax, Molecular devices, or Fluoroscan, Thermo Labsystems.). The value at 30 min in relative fluorescence units was used as a measure of migration.

Ajuste de curvas. La capacidad de los anticuerpos de inhibir la migración se expresó por la CI50 determinada usando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.)Curve adjustment. The ability of the antibodies to inhibit migration was expressed by IC50 determined using GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.)

La tabla 1 incluye los datos del ensayo de desplazamiento y el ensayo de quimiotaxis que ensayó la capacidad de 10 pg/ml de mAb humanos de inhibir la migración dependiente de hC5a (10 nM) de neutrófilos humanos. El valor obtenido en ausencia de anticuerpo se fijó a 100. Se recopilaron datos de 3 donantes. En la tabla 1 se incluyen los valores medios. Los tres mAb 32F3A6, 35F12A2 y 35F32A3 mostraron la máxima potencia en los dos ensayos, que fue igual o ligeramente superior a la potencia de un anticuerpo de control Ref. Ab Q descrito en el documento WO2009/103113.Table 1 includes the data from the displacement assay and the chemotaxis assay that tested the ability of 10 pg / ml of human mAbs to inhibit hC5a-dependent (10 nM) migration of human neutrophils. The value obtained in the absence of antibody was set at 100. Data were collected from 3 donors. Table 1 includes the mean values. The three mAbs 32F3A6, 35F12A2 and 35F32A3 showed maximum potency in the two assays, which was equal to or slightly higher than the potency of a Ref. Ab Q control antibody described in WO2009 / 103113.

Tabla 1. Características funcionales de anticuer os anti hC5aR.Table 1. Functional characteristics of anti hC5aR antibodies.

Caracterización de secuencias de CDR de mAb anti hC5aRCharacterization of anti-hC5aR mAb CDR sequences

Se clonaron de manera recombinante las regiones variables de los Ac anti-hC5aR 35F32A3, 32F3A6, 35F12A2 y 35F24A3 y se caracterizaron las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos usando métodos convencionales. Las secuencias de aminoácidos se incluyen en la figura 1 y en la lista de secuencias adjunta.The variable regions of the anti-hC5aR Ab 35F32A3, 32F3A6, 35F12A2 and 35F24A3 were recombinantly cloned and the nucleotide and amino acid sequences were characterized using standard methods. The amino acid sequences are included in Figure 1 and the accompanying sequence listing.

Caracterización de especificidad de uniónBinding specificity characterization

Se usaron construcciones quiméricas de C5aR de humano-ratón para determinar la región de unión de C5aR. Los receptores quiméricos se expresaron de manera transitoria en células HEK y se determinó la unión de los anticuerpos individuales por FACS como se describió previamente en el documento WO 2008/022390, excepto por el cambio de línea celular. La unión de 32F3A6, 35F32A3 y 35F12A2 fue dependiente de la secuencia humana del bucle extracelular 2, mientras que el extremo N humano era prescindible (figura 2).Chimeric human-mouse C5aR constructs were used to determine the C5aR binding region. Chimeric receptors were transiently expressed in HEK cells and binding of individual antibodies was determined by FACS as previously described in WO 2008/022390, except for cell line switching. The binding of 32F3A6, 35F32A3 and 35F12A2 was dependent on the human sequence of extracellular loop 2, whereas the human N-terminus was dispensable (Figure 2).

Ejemplo 3. Generación de variantes de FcExample 3. Generation of Fc variants

Las cuatro subclases de IgG humanas (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) comparten más de un 95 % de homología en las regiones Fc, pero muestran diferencias importantes en la región bisagra. La región Fc media funciones efectoras, tales como citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En la ADCC, la región Fc de un anticuerpo se une a receptores de Fc de activación (FcyR) en la superficie de células efectoras inmunitarias tales como células asesinas naturales y monocitos, conduciendo a la fagocitosis o lisis de las células establecidas como dianas. En la CDC, la región Fc se une al complemento en un sitio diferente de los sitios de unión a FcyR y los anticuerpos destruirán las células establecidas como diana desencadenando la cascada del complemento en la superficie celular. Las diversas isoformas de IgG ejercen diferentes niveles de funciones efectoras que aumentan en el orden IgG4 < IgG2 < IgG 1 < IgG3. Se generaron varias variantes de Fc de IgG, comprendiendo todas ellas la región variable de Ref Ab Q, por mutagénesis dirigida usando el kit de mutagénesis dirigida QuickChange® (n.° de cat. 200518, Stratagene) y se caracterizaron como se describe en el ejemplo 4.The four subclasses of human IgG (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) share more than 95% homology in the Fc regions, but show important differences in the hinge region. The Fc region mediates effector functions, such as antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cytotoxicity (CDC). In ADCC, the Fc region of an antibody binds to activating Fc receptors (FcyR) on the surface of immune effector cells such as natural killer cells and monocytes, leading to phagocytosis or lysis of the targeted cells. In the CDC, the Fc region binds to complement at a site different from the FcyR binding sites and the antibodies will destroy the targeted cells by triggering the complement cascade on the cell surface. The various isoforms of IgG exert different levels of effector functions that increase in the order IgG4 <IgG2 <IgG 1 <IgG3. Several IgG Fc variants, all comprising the Ref Ab Q variable region, were generated by site-directed mutagenesis using the QuickChange® site-directed mutagenesis kit (Cat. # 200518, Stratagene) and characterized as described in example 4.

Ejemplo 4: Caracterización de funciones efectoras de variantes de FcExample 4: Characterization of effector functions of Fc variants

Afinidad de unión de variantes de Fc a FcgRAffinity of binding of Fc variants to FcgR

La afinidad de las variantes de Fc por FcyR se determinó por mediciones de resonancia de plasmones superficiales (SPR) que se realizaron en un instrumento BIAcore T100 usando un chip sensor CM5 (GE). Las variantes de Fc se inmovilizaron en celdas de flujo usando química de acoplamiento de amina. Para la SPR cinética que mide la afinidad de FcyR por las variantes de Fc, se usaron Hís-FcyR como analitos y se inyectaron en celdas de flujo en tampón HBS-EP. El receptor de alta afinidad FcyRI se inyectó con un caudal de 40 pl/min, un tiempo de contacto de 180 segundos y un tiempo de disociación de 300 segundos. Los otros FcyRI se inyectaron con un caudal de 50 pl/min, un tiempo de contacto de 30 segundos y un tiempo de disociación de 120 segundos. Las superficies de los chips se regeneraron con una solución que contenía NaOH 10 mM y NaCl 500 mM. Las afinidades (valores de Kd) se presentan en la tabla 2A.The affinity of the Fc variants for FcyR was determined by surface plasmon resonance (SPR) measurements that were performed on a BIAcore T100 instrument using a CM5 sensor chip (GE). The Fc variants were immobilized in flow cells using amine coupling chemistry. For kinetic SPR measuring the affinity of FcyR for Fc variants, Hís-FcyR were used as analytes and injected into flow cells in HBS-EP buffer. The high affinity receptor FcyRI was injected at a flow rate of 40 µl / min, a contact time of 180 seconds, and a dissociation time of 300 seconds. The other FcyRIs were injected at a flow rate of 50 µl / min, a contact time of 30 seconds, and a dissociation time of 120 seconds. The chip surfaces were regenerated with a solution containing 10 mM NaOH and 500 mM NaCl. The affinities (Kd values) are presented in Table 2A.

Tabla 2A. Resumen de los resultados obtenidos a partir del análisis de la afinidad de las variantes de Fc por FcyR (Kd en M). (-= sin unión; 0 = sin cambio en la unión; nda = Kd no calculada debido a una unión demasiado débil). (1) una variante de Fc de IgG2/IgG4 que comprende la región CH1 y la región bisagra inferior de IgG2, y la región CH2-H r n I 4 2 m n I 4 in l l m i n n l 22 PTable 2A. Summary of the results obtained from the analysis of the affinity of the Fc variants for FcyR (Kd in M). (- = no union; 0 = no change in union; nda = Kd not calculated due to too weak union). (1) an IgG2 / IgG4 Fc variant comprising the CH1 region and the lower hinge region of IgG2, and the CH2-H region r n I 4 2 m n I 4 in l l m i n n l 22 P

Ensayo de fagocitosisPhagocytosis assay

Para identificar variantes de Fc con capacidades reducidas o nulas de mediar la fagocitosis de neutrófilos, se estableció un ensayo de fagocitosis in vitro. El ensayo de fagocitosis descrito a continuación implica el mareaje de neutrófilos humanos aislados de sangre humana periférica (la célula diana para la fagocitosis) con un colorante fluorescente, CMFDA, y su adición a un cultivo de monocitos humanos, también aislados de sangre periférica humana. Los neutrófilos marcados con CMFDA se recubren previamente con mAb de ensayo (o PBS) y, después de la incubación con los monocitos humanos, se determina por FACT el número de monocitos doblemente positivos para CD14/CMFDA. En la tabla 2B se presentan los resultados de diversas variantes de Fc.To identify Fc variants with reduced or no abilities to mediate neutrophil phagocytosis, an in vitro phagocytosis assay was established. The phagocytosis assay described below involves neutrophil labeling humans isolated from human peripheral blood (the target cell for phagocytosis) with a fluorescent dye, CMFDA, and its addition to a culture of human monocytes, also isolated from human peripheral blood. CMFDA-labeled neutrophils are precoated with test mAb (or PBS) and, after incubation with human monocytes, the number of CD14 / CMFDA double-positive monocytes is determined by FACT. The results of various Fc variants are presented in Table 2B.

Todos los anticuerpos ensayados incluyen las regiones variables del anticuerpo Q descrito en el documento WO2009/103113 y usado como Ref Ab anteriormente.All antibodies tested include the variable regions of the Q antibody described in WO2009 / 103113 and used as Ref Ab above.

Se observó que tanto los monocitos como los macrófagos eran capaces de mediar la fagocitosis dependiente de anticuerpo de neutrófilos y se establecieron ensayos de fagocitosis usando los dos tipos celulares. Los resultados fueron cualitativamente similares en los dos ensayos, pero como el ensayo de macrófagos fue más variable, el análisis se realizó principalmente usando monocitos.Both monocytes and macrophages were found to be capable of mediating antibody-dependent phagocytosis of neutrophils and phagocytosis assays were established using both cell types. The results were qualitatively similar in the two trials, but as the macrophage assay was more variable, the analysis was performed primarily using monocytes.

Preparación de monocitos humanosPreparation of human monocytes

Se aislaron linfocitos y monocitos humanos a partir de sangre venosa periférica recogida de voluntarios humanos sanos en tubos que contenían EDTA como anticoagulante (K2E, BD Biosciences, n.° de cat. 367525) usando centrifugación en gradiente de percoll. 100 ml de sangre generalmente proporcionan ~8 - 20 x 107 células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se añadieron al menos 3 volúmenes de dPBS a las células aisladas que posteriormente se centrifugaron a 100 x g durante 10 min a temperatura ambiente (TA). Después de desechar el sobrenadante, la capa de linfocitos/monocitos se resuspendió en el mismo volumen de una mezcla 50:50 de dPBS:Medio de Cultivo que en la etapa previa y se centrifugó de nuevo a 100 x g durante 10 min a TA. El sobrenadante se desechó y la capa de linfocitos/monocitos se resuspendió a 1 - 2 x 106 células/ml en Medio de Cultivo. Las células resuspendidas se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos (Corning, Costar n.° de cat. 3516) a 2 ml/pocillo con 4 x 106 células/pocillo y se incubaron durante 2 horas a 37 °C en CO2 al 5 %. Las células no adherentes (linfocitos y células muertas) se retiraron por aspiración y las células adheridas (monocitos) se lavaron cuatro veces en 1 ml de Medio de Cultivo (RPMI 1640 (Invitrogen-GIBCo, n.° de cat. 11875) FCS al 10 % (Invitrogen-GIBCO, n.° de cat. 16000) inactivado térmicamente a 56 °C durante 30 min Hepes 25 mM (Invitrogen-GIBCO, n.° de cat. 15630) Pen/Estrep al 1 % (Invitrogen-GIBCO, n.° cat. 15070)) con agitación suave en círculos antes de la aspiración del medio de lavado. Después de lavar los monocitos derivados de sangre, se añadió 1 ml de Medio de Cultivo nuevo a cada pocillo. Se rasparon células de un pocillo y se suspendieron en Medio de Cultivo para estimar el número de monocitos por pocillo.Human monocytes and lymphocytes were isolated from peripheral venous blood collected from healthy human volunteers in tubes containing EDTA as an anticoagulant (K2E, BD Biosciences, cat # 367525) using percoll gradient centrifugation. 100 ml of blood generally provides ~ 8 - 20 x 107 peripheral blood mononuclear cells (PBMC). At least 3 volumes of dPBS were added to the isolated cells which were subsequently centrifuged at 100 x g for 10 min at room temperature (RT). After discarding the supernatant, the lymphocyte / monocyte layer was resuspended in the same volume of a 50:50 mixture of dPBS: Culture Medium as in the previous step and centrifuged again at 100 x g for 10 min at RT. The supernatant was discarded and the lymphocyte / monocyte layer was resuspended at 1-2 x 10 6 cells / ml in Culture Medium. The resuspended cells were seeded in 6-well tissue culture plates (Corning, Costar cat # 3516) at 2 ml / well with 4 x 10 6 cells / well and incubated for 2 hours at 37 ° C in CO2. at 5%. Non-adherent cells (lymphocytes and dead cells) were removed by aspiration and adhered cells (monocytes) were washed four times in 1 ml of Culture Medium (RPMI 1640 (Invitrogen-GIBCo, cat # 11875) FCS al 10% (Invitrogen-GIBCO, Cat. # 16000) heat inactivated at 56 ° C for 30 min. 25 mM Hepes (Invitrogen-GIBCO, Cat. # 15630) 1% Pen / Strep (Invitrogen-GIBCO , cat. # 15070)) with gentle swirling in circles prior to aspiration of the wash medium. After washing the blood-derived monocytes, 1 ml of fresh Culture Medium was added to each well. Cells were scraped from a well and suspended in Culture Medium to estimate the number of monocytes per well.

Preparación de neutrófilos humanosPreparation of human neutrophils

Se aislaron neutrófilos humanos a partir de sangre venosa periférica recogida a partir de voluntarios sanos) usando centrifugación en gradiente de percoll y se tiñeron con CellTracker™ Green (diacetato de 5-clorometilfluoresceína, CMFDA). 100 ml de sangre generalmente proporcionan ~10 - 20 x 107 neutrófilos. La tinción se realizó disolviendo CMFDA CellTracker™ Green en DMSO hasta una concentración final 10 mM. Los neutrófilos se resuspendieron a 1 x 107 células/ml en dPBS y se añadió CMFDA a una concentración final de 2 pM. Las células y el colorante se incubaron durante 15 min a 37 °C. El exceso de colorante se retiró lavando las células 3 veces con 10 ml de dPBS (por centrifugación a 300 x g durante 5 min a TA). Se realizó un recuento celular después de la última etapa de lavado. Los neutrófilos marcados con CMFDA se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en dPBS y se incubaron con anticuerpo (concentración final 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 o 100 pg/ml) o PBS (para el control sin anticuerpo). En algunos ensayos (cuando se indica), la etapa de incubación de neutrófilo Ac también contenía 4 mg/ml de IgG humana. Se incubaron células más anticuerpo durante 30 min a 37 °C. Los neutrófilos se lavaron dos veces con dPBS después de la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a TA y se resuspendieron en Medio de Cultivo a 1 x 107 células/ml. Human neutrophils were isolated from peripheral venous blood collected from healthy volunteers) using percoll gradient centrifugation and stained with CellTracker ™ Green (5-chloromethylfluorescein diacetate, CMFDA). 100 ml of blood generally provides ~ 10 - 20 x 107 neutrophils. Staining was performed by dissolving CMFDA CellTracker ™ Green in DMSO to a final concentration of 10 mM. Neutrophils were resuspended at 1 x 107 cells / ml in dPBS and CMFDA was added to a final concentration of 2 pM. Cells and dye were incubated for 15 min at 37 ° C. The excess dye was removed by washing the cells 3 times with 10 ml of dPBS (by centrifugation at 300 x g for 5 min at RT). A cell count was performed after the last wash step. The CMFDA-labeled neutrophils were resuspended at 2 x 106 cells / ml in dPBS and incubated with antibody (final concentration 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 or 100 pg / ml) or PBS (for the control without antibody). In some assays (where indicated), the Ac neutrophil incubation step also contained 4 mg / ml human IgG. Cells plus antibody were incubated for 30 min at 37 ° C. Neutrophils were washed twice with dPBS after centrifugation at 300 x g for 5 minutes at RT and resuspended in Culture Medium at 1 x 107 cells / ml.

Análisis FACSFACS analysis

Se añadieron neutrófilos marcados con CMFDA, recubiertos previamente con anticuerpo (preparado como se ha descrito anteriormente) a monocitos (como se ha descrito anteriormente) a la concentración deseada en 1 ml de Medio de Cultivo. El volumen total en cada pocillo de la placa de 6 pocillos fue de 2 ml. En algunos ensayos (cuando se indica), el medio de cultivo también contenía 4 mg/ml de IgG humana. Generalmente se usó una relación de 5:1 (neutrófilos:monocitos). Si el número de células adherentes era menor de 4 x 105 por pocillo, se añadían 2 x 106 neutrófilos (es decir, la relación neutrófilo:monocito excedía de 5:1). Si el número de monocitos excedía de 4 x 105 por pocillo, entonces se añadía cinco veces el número de neutrófilos para mantener la relación de neutrófilos:monocitos a 5:1. Los cultivos se incubaron durante 1 hora a 37 °C en una incubadora con un 5 % de CO2.CMFDA-labeled neutrophils, precoated with antibody (prepared as described above) were added to monocytes (as described above) at the desired concentration in 1 ml of Culture Medium. The total volume in each well of the 6-well plate was 2 ml. In some assays (where indicated), the culture medium also contained 4 mg / ml human IgG. A 5: 1 ratio (neutrophils: monocytes) was generally used. If the number of adherent cells was less than 4 x 105 per well, 2 x 106 neutrophils were added (ie, the neutrophil: monocyte ratio exceeded 5: 1). If the number of monocytes exceeded 4 x 105 per well, then five times the number of neutrophils was added to keep the neutrophil: monocyte ratio at 5: 1. The cultures were incubated for 1 hour at 37 ° C in a 5% CO2 incubator.

Después de la incubación, se aspiró el medio para retirar los neutrófilos no adherentes y no ingeridos. Los monocitos adherentes se lavaron (con agitación suave en círculos) tres veces con 1 ml/pocillo de Medio de Cultivo. Los monocitos se recogieron en tubos de 15 ml raspando las células en Medio de Cultivo de los pocillos con raspadores de células (Corning, n.° de cat. CP3010). Las células se centrifugaron a 300 x g durante 5 min a TA y se retiró el sobrenadante. El sedimento celular se resuspendió en 160 pl de paraformaldehído al 1 % (p/v) en PBS para fijarlo antes del FACS. After incubation, the medium was aspirated to remove non-adherent and uningested neutrophils. Adherent monocytes were washed (gently shaking in circles) three times with 1 ml / well of Culture Medium. Monocytes were collected into 15 ml tubes by scraping the cells in Culture Medium from the wells with cell scrapers (Corning, cat # CP3010). The cells were centrifuged at 300 xg for 5 min at RT and the supernatant was removed. The cell pellet was resuspended in 160 µl of 1% (w / v) paraformaldehyde in PBS to fix it prior to FACS.

Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences). Los neutrófilos marcados con CMFDA se identificaron y se midieron en FL-1 (canal de fluorescencia 1) usando isotiocianato de fluoresceína (FITC), y los monocitos se identificaron por tinción de una muestra solo con monocitos con anti-CD14 marcado con ficoeritrina, y se midieron en FL-2 (canal de fluorescencia 2). Se definió una selección de monocitos usando el perfil de FSC (dispersión directa) frente a SSC (dispersión lateral) de la muestra de solo monocitos y se amplió (a lo largo de los ejes de FSC y SSC) para incluir monocitos cuyo tamaño había aumentado durante la incubación. Esta selección excluía la región del perfil de FSC frente a SSC que contenía neutrófilos como se define en el perfil de FSC frente a SSC en una muestra solo de neutrófilos. Se calculó que el grado de fagocitosis era el porcentaje de monocitos FL-1+ en la selección de monocitos total.The samples were analyzed on a FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences). CMFDA-labeled neutrophils were identified and measured in FL-1 (fluorescence channel 1) using fluorescein isothiocyanate (FITC), and monocytes were identified by staining a sample only with monocytes with phycoerythrin-labeled anti-CD14, and they were measured in FL-2 (fluorescence channel 2). A selection of monocytes was defined using the FSC (forward scatter) vs. SSC (side scatter) profile of the monocyte-only sample and expanded (along the FSC and SSC axes) to include monocytes whose size had increased. during incubation. This selection excluded the region of the FSC vs. SSC profile that contained neutrophils as defined by the FSC vs. SSC profile in a neutrophil-only sample. The degree of phagocytosis was calculated to be the percentage of FL-1 + monocytes in the total monocyte selection.

El nivel de referencia de fagocitosis no específica fue el porcentaje de monocitos FL-1+ en una muestra que contenía neutrófilos marcados con CMFDA no recubiertos con anticuerpo (muestra "No Ac"). Se restó el nivel de referencia de cada muestra con Ac antes de introducir los datos (% monocitos FL-1+ frente a concentración de Ac) en un Prism (v4.0c, GraphPad Software Inc) para obtener gráficos. Los datos se sometieron a regresión no lineal usando la curva de dosis-respuesta sigmoidea (pendiente variable), es decir, una ecuación logística de 4 parámetros para determinar los valores de CE50 cuando fuera apropiado.The reference level of non-specific phagocytosis was the percentage of FL-1 + monocytes in a sample containing CMFDA-labeled neutrophils not coated with antibody ("No Ac" sample). The reference level of each sample was subtracted with Ab before entering the data (% FL-1 + monocytes vs. Ab concentration) in a Prism (v4.0c, GraphPad Software Inc) to obtain graphs. Data were non-linearly regressed using the sigmoid dose-response curve (variable slope), ie, a 4-parameter logistic equation to determine EC50 values where appropriate.

Los datos se presentan en la tabla 2B. "-" representa ausencia de fagocitosis detectable y "+" to "++++" representa un nivel de bajo a alto de fagocitosis medido en los ensayos.The data are presented in Table 2B. "-" represents absence of detectable phagocytosis and "+" to "++++" represents a low to high level of phagocytosis measured in the assays.

Ensayos de ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo) y CDC (citotoxicidad dependiente del complemento)ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity) and CDC (complement dependent cytotoxicity) assays

Los siguientes ensayos in vitro se establecieron para ensayar la capacidad de las variantes de Fc de mediar la depleción de células a través de mecanismos dependientes de ADCC o CDC.The following in vitro assays were set up to test the ability of Fc variants to mediate cell depletion through ADCC or CDC dependent mechanisms.

Células dianaTarget cells

En estos ensayos, las células diana eran células Ramos del clon E2 que expresaban hC5aR o neutrófilos humanos. Las células Ramos del clon E2 que expresaban hC5aR se desarrollaron transfectando de manera estable células Ramos del clon E2 con un vector que codificaba hC5aR usando procedimientos convencionales. la línea celular resultante expresa altos niveles de C5aR humano (5-7 veces más que los neutrófilos humanos) y de CD20. Los neutrófilos humanos se obtuvieron como se ha descrito anteriormente en relación con el ensayo de fagocitosis. Las células diana se tiñeron con el tinte fluorescente de membrana celular, PKH-26. El número requerido de células diana (5 x 104/muestra/pocillo x4) se diluyó hasta 15 ml en dPBS y se centrifugó a 1.200 rpm durante 5 min a TA. Después, las células se resuspendieron en PKH-26 2 |uM (100 |ul de solución por cada 1 x 106 células diana). Se dejó que prosiguiera el marcaje a temperatura ambiente durante exactamente 3 minutos antes de añadir un volumen igual de FCS inactivado con calor (o suero humano inactivado con calor (Millipore)) para detener la reacción de marcaje. Después de exactamente 1 min, se añadió RPMI a un volumen total de 15 ml. Las células se centrifugaron como anteriormente y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en medio de ensayo. Para el recubrimiento con alícuotas de anticuerpo (25 |ul, es decir, 5 x 104), se dispensaron células diana marcadas con PKH-26 en pocillos de una placa estéril de 96 pocillos de fondo en U que contenía 25 |ul de anticuerpo a 200 |ug/ml diluido en medio de ensayo (concentración final 100 |ug/ml) y se incubaron a 37 °C en CO2 al 5 % durante 30 min.In these assays, the target cells were clone E2 Ramos cells expressing hC5aR or human neutrophils. Ramos cells from clone E2 expressing hC5aR were grown by stably transfecting Ramos cells from clone E2 with a vector encoding hC5aR using standard procedures. the resulting cell line expresses high levels of human C5aR (5-7 times more than human neutrophils) and CD20. Human neutrophils were obtained as described above in connection with the phagocytosis assay. Target cells were stained with the cell membrane fluorescent dye, PKH-26. The required number of target cells (5 x 104 / sample / well x4) was diluted to 15 ml in dPBS and centrifuged at 1,200 rpm for 5 min at RT. The cells were then resuspended in 2 µM PKH-26 (100 µl of solution per 1 x 106 target cells). Labeling was allowed to continue at room temperature for exactly 3 minutes before adding an equal volume of heat inactivated FCS (or heat inactivated human serum (Millipore)) to stop the labeling reaction. After exactly 1 min, RPMI was added to a total volume of 15 ml. Cells were centrifuged as above and resuspended at 2 x 10 6 cells / ml in assay medium. For coating with aliquots of antibody (25 µl, i.e. 5x104), PKH-26-labeled target cells were dispensed into wells of a sterile 96-well U-bottom plate containing 25 µl of antibody to 200 µg / ml diluted in assay medium (final concentration 100 µg / ml) and incubated at 37 ° C in 5% CO2 for 30 min.

Células efectorasEffector cells

Las células efectoras eran PMBC de las que se habían eliminado monocitos. Las PMBC se obtuvieron como se ha descrito anteriormente. Las células resuspendidas (linfocitos/monocitos) se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos (Corning) a 2 ml/pocillo con ~4 x 106 células/pocillo o en matraces T75 (Corning) a 20 ml por matraz y se incubaron durante 2 horas a 37 °C en CO2 al 5 %. Las células no adherentes (incluyendo los linfocitos y células NK) se retiraron por aspiración y se centrifugaron a 100 x g durante 10 min a TA. Las células se resuspendieron en 20 ml de medio que contenía 100 ng/ml de IL-2 humana recombinante para aumentar el número de linfocitos y células asesinas naturales (NK). Las células se incubaron durante una noche a 37 °C en CO2 al 5 %. Al día siguiente, las células se centrifugaron a 1.400 rpm durante 10 min a TA y después se resuspendieron en medio de ensayo a 2,5 x 107 células/ml para usarse como células efectoras en el ensayo de ADCC.The effector cells were PMBC from which monocytes had been removed. PMBCs were obtained as described above. The resuspended cells (lymphocytes / monocytes) were seeded in 6-well tissue culture plates (Corning) at 2 ml / well with ~ 4 x 106 cells / well or in T75 flasks (Corning) at 20 ml per flask and incubated for 2 hours at 37 ° C in 5% CO2. Non-adherent cells (including lymphocytes and NK cells) were removed by aspiration and centrifuged at 100 x g for 10 min at RT. The cells were resuspended in 20 ml of medium containing 100 ng / ml of recombinant human IL-2 to increase the number of lymphocytes and natural killer (NK) cells. Cells were incubated overnight at 37 ° C in 5% CO2. The next day, cells were centrifuged at 1,400 rpm for 10 min at RT and then resuspended in assay medium at 2.5 x 107 cells / ml to be used as effector cells in the ADCC assay.

Ensayo ADCCADCC trial

Después del marcaje de las células diana con PKH-26 y del recubrimiento con anticuerpo, se añadieron 100 |ul de células efectoras o 100 |ul de medio de ensayo (control, solo células diana) directamente a 50 |ul de células diana. Las muestras se incubaron durante 3 horas más a 37 °C con 5 % de CO2. Las muestras se transfirieron a tubos FACS de microtitulación de 1,2 ml que contenían 10 |ul de tinte de viabilidad To-Pro-3 (TP-3) 10 |uM para una concentración final de -625 nM y las muestras se analizaron por FACS. En un gráfico de FSC frente a SSC, se seleccionaron todas las células excluyendo los desechos. Las células seleccionadas se analizaron en el FL-2 frente a FSC y se seleccionaron las células positivas para FL-2 (es decir, células diana marcadas con PKH-26). Los datos de FACS se analizaron usando el software FlowJo (Tree Star, Inc. v6.3.4). After labeling the target cells with PKH-26 and coating with antibody, 100 µl of effector cells or 100 µl of assay medium (control, target cells only) were added directly to 50 µl of target cells. The samples were incubated for a further 3 hours at 37 ° C with 5% CO2. The samples were transferred to 1.2 ml FACS microtiter tubes containing 10 µl of 10 µM To-Pro-3 (TP-3) viability dye for a final concentration of -625 nM and the samples were analyzed by FACS. On a plot of FSC vs. SSC, all cells were selected excluding debris. Selected cells were tested on FL-2 against FSC and FL-2 positive cells (ie, PKH-26 labeled target cells) were selected. The FACS data was analyzed using FlowJo software (Tree Star, Inc. v6.3.4).

La ADCC específica se calculó restando el % medio de ‘Dianas Solo' TP3+ (A) del % medio de 'Dianas+Efectoras' TP3+ (B) de muestras correspondientes después de restar el % medio de 'Dianas Sin Ac Solo’ TP3+ (C) y el % medio de 'Dianas Sin Ac+Efectoras’ TP3+ (D) respectivamente; es decir,The specific ADCC was calculated by subtracting the mean% of 'Targets Solo' TP3 + (A) from the mean% of 'Targets + Effectors' TP3 + (B) of corresponding samples after subtracting the mean% of 'Targets Without Ac Solo' TP3 + (C ) and the mean% of 'Targets Without Ac + Effectors' TP3 + (D) respectively; namely,

ADCC específica = (B - D) -(A - C) o = (B - A) -(D - C) Ecuación 1Specific ADCC = (B - D) - (A - C) or = (B - A) - (D - C) Equation 1

Los resultados presentados en la tabla 2B, se obtuvieron usando PBMC humanas estimuladas con IL-2 de las que se habían retirado monocitos, predominantemente células NK, pero incluyendo células B, células T y células dendríticas, como población de células efectoras. Las células diana fueron una línea celular transfectada Ramos E2 que expresaba tanto hC5aR como CD20 que permitía el uso del anticuerpo anti-CD20 rituximab como control positivo. Los resultados varían desde "+++", que es indicativo de una variante de Fc que induce la ADCC con una potencia igual al Rituximab, "+/-" que es indicativo de una variante de Fc para la que se observó un alto grado de variación del donante y "-" que es indicativo de una variante de Fc para la que no se detectó una inducción significativa de ADCC. Una variante de Fc que mediaba un aumento de la a Dc C (IgG1_S239D, I332E) (Chu SY, Vostiar I, Karki S et al; Mol Immunol, 2008, 45(15):3926-3933) se incluyó como control positivo para el ensayo.The results presented in Table 2B were obtained using IL-2 stimulated human PBMCs from which monocytes, predominantly NK cells, but including B cells, T cells and dendritic cells, had been removed as the effector cell population. The target cells were a Ramos E2 transfected cell line expressing both hC5aR and CD20 which allowed the use of the anti-CD20 antibody rituximab as a positive control. Results range from "+++" which is indicative of a Fc variant that induces ADCC with a potency equal to Rituximab, "+/-" which is indicative of a Fc variant for which a high degree was observed. of donor variation and "-" which is indicative of an Fc variant for which no significant induction of ADCC was detected. An Fc variant that mediated an increase in a Dc C (IgG1_S239D, I332E) (Chu SY, Vostiar I, Karki S et al; Mol Immunol, 2008, 45 (15): 3926-3933) was included as a positive control for essay.

Ensayo CDCCDC trial

Las variantes de Fc también se analizaron con respecto a su potencia para inducir la CDC. La configuración experimental fue esencialmente como se ha descrito para el ensayo de ADCC con la excepción de que las células efectoras se reemplazaron por suero humano.The Fc variants were also tested for their potency to induce CDC. The experimental setup was essentially as described for the ADCC assay with the exception that the effector cells were replaced with human serum.

Se mezclaron células diana, tales como células Ramos E2 (2 x 106 células/ml) en medio con suero de conejo con actividad del complemento al 3 %, con un volumen igual de solución de anticuerpo 2x (200 pg/ml), que contenía suero de conejo con actividad del complemento al 3 %, en una placa de cultivo de tejidos de fondo en U de 96 pocillos. Un conjunto duplicado de pocillos contenía 25 pl de células Ramos E2 (2 x 106 células/ml) mezcladas con 25 pl de solución de anticuerpo 2x (200 pg/ml) en medio sin complemento. Un conjunto de 3 pocillos contenía 25 pl de células Ramos E2 (2 x 106 células/ml) más 25 pl de medio de ensayo (muestras 'sin Ab’) en suero de conejo con actividad del complemento al 3 %. Otro conjunto de 3 pocillos contenía 25 pl de células Ramos E2 (2 x 106 células/ml) más 25 pl de medio de ensayo (muestras 'sin Ab’) sin complemento. Antes de la incubación, se añadieron a cada pocillo 100 pl de medio de ensayo, con o sin suero de conejo con actividad del complemento al 3 %, según fue apropiado. Las muestras se incubaron durante 3 horas a 37 °C con 5 % de CO2.Target cells, such as Ramos E2 cells (2 x 106 cells / ml) in 3% complement activity rabbit serum medium, were mixed with an equal volume of 2x antibody solution (200 pg / ml), containing Rabbit serum with 3% complement activity, in a 96-well U-bottom tissue culture plate. A duplicate set of wells contained 25 µl of Ramos E2 cells (2 x 106 cells / ml) mixed with 25 µl of 2x antibody solution (200 µg / ml) in non-complement medium. A 3-well set contained 25 µl of Ramos E2 cells (2 x 106 cells / ml) plus 25 µl of assay medium (samples 'without Ab') in rabbit serum with 3% complement activity. Another set of 3 wells contained 25 µl of Ramos E2 cells (2 x 106 cells / ml) plus 25 µl of assay medium ('without Ab' samples) without complement. Before incubation, 100 µl of assay medium, with or without 3% complement activity rabbit serum, was added to each well, as appropriate. The samples were incubated for 3 hours at 37 ° C with 5% CO2.

Determinación de la viabilidad de las células dianaDetermination of target cell viability

El tinte de viabilidad fluorescente To-Pro-3 (Molecular Probes), se añadió a cada muestra inmediatamente antes del análisis por citometría de flujo. La concentración final de To-Pro-3 en cada tubo fue de -62,5 nM. Las células positivas para To-Pro-3 (TP3+) se definieron como no viables o lisadas.Fluorescent viability dye To-Pro-3 (Molecular Probes) was added to each sample immediately prior to flow cytometric analysis. The final To-Pro-3 concentration in each tube was -62.5 nM. Cells positive for To-Pro-3 (TP3 +) were defined as non-viable or lysed.

Citometría de flujo y análisis de datosFlow cytometry and data analysis

Se analizaron muestras en un FACSCalibur (BD Biosciences) y los datos adquiridos se analizaron usando el software FlowJo (v6.3.4, TreeStar Inc.). En el gráfico de dispersión de FSC frente a SSC, seleccionando todas las células excepto los desechos, se recogieron 5.000 acontecimientos de células diana para cada muestra. Se creó un histograma de las células diana seleccionadas en el canal FL-4 que mostró el nivel de captación de To-Pro-3 por las células. Se determinó el número de células TP3+ (es decir, células no viables) en cada muestra - estas se definieron como células en el lado derecho del pico principal - y este número se expresó como un porcentaje de células diana totales en la muestra.Samples were analyzed on a FACSCalibur (BD Biosciences) and the acquired data was analyzed using FlowJo software (v6.3.4, TreeStar Inc.). In the scatter plot of FSC vs. SSC, selecting all cells except debris, 5,000 target cell events were collected for each sample. A histogram of the selected target cells was created in the FL-4 channel showing the level of To-Pro-3 uptake by the cells. The number of TP3 + cells (ie non-viable cells) in each sample was determined - these were defined as cells on the right side of the main peak - and this number was expressed as a percentage of total target cells in the sample.

Las muestras, ensayadas por triplicado, pudieron clasificarse en una de 4 categorías, A, B, C y D, tal como se muestra más adelante en la visión general de categorías.The samples, tested in triplicate, could be classified into one of 4 categories, A, B, C and D, as shown below in the category overview.

Visión eneral de cate oríasOverview of cate orías

Categorías de muestras analizadasCategories of samples analyzed

para cada muestra que contenía anticuerpo, se realizaron reacciones con o sin complemento. Las muestras que contenían anticuerpo sin complemento dieron el nivel de lisis de referencia específica de anticuerpo. Las muestras de las categorías B y D dieron la lisis de referencia no específica de anticuerpo o tanto de anticuerpo como del complemento. For each sample containing antibody, reactions were performed with or without complement. Samples containing antibody without complement gave the antibody-specific reference lysis level. Samples in categories B and D gave the reference non-specific lysis of antibody or both antibody and complement.

El porcentaje de células diana no viables TP3+ (% de lisis) se calculó para cada muestra con un 3 % de complemento y para cada muestra sin complemento. Para cada anticuerpo y control ’sin Ac’, se promediaron los datos de las muestras por triplicado.The percentage of non-viable target cells TP3 + (% lysis) was calculated for each sample with 3% complement and for each sample without complement. For each antibody and control 'without Ac', sample data was averaged in triplicate.

Para calcular la actividad de CDC específica para cada anticuerpo, se restó la lisis específica de anticuerpo en ausencia del complemento (% medio de lisis en muestras ’A’) del % de lisis de la muestra de Ac con complemento (muestras ’Ci/2/3’) antes de restar la lisis de referencia no específica. La lisis de referencia no específica era la lisis en muestras ’sin Ac’ con complemento (% medio de lisis n muestras ’D’) menos la lisis en muestras ’sin Ab’ y sin complemento (% medio de lisis en muestras ’B’). Como control positivo para el ensayo se incluyó la variante de Fc que aumentaba la CDC (IgG1_S254W) (documento WO08030564).To calculate the specific CDC activity for each antibody, the specific lysis of antibody in the absence of complement (mean% lysis in samples' A ') was subtracted from the% lysis of the Ac sample with complement (samples' Ci / 2 / 3 ') before subtracting the non-specific reference lysis. The non-specific baseline lysis was lysis in samples 'without Ab' with complement (mean% lysis n samples 'D') minus lysis in samples 'without Ab' and without complement (mean% lysis in samples 'B' ). As a positive control for the assay, the CDC-increasing Fc variant (IgG1_S254W) (WO08030564) was included.

CDC específica (% lisis) = (C-A)-(D-B) [o =(C-D)-(A-B)] Ecuación 2Specific CDC (% lysis) = (C-A) - (D-B) [o = (C-D) - (A-B)] Equation 2

Se realizó un análisis estadístico en GraphPad Prism (v4.0) para determinar si las diferencias entre cualquiera de los grupos eran significativas. La actividad de CDC específica de cada muestra de los 4 ensayos se introdujo en una hoja de cálculo de acuerdo con el anticuerpo usado. Los grupos se compararon usando un ensayo paramétrico: un análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de un ensayo posterior de comparación múltiple de Tukey.Statistical analysis was performed on GraphPad Prism (v4.0) to determine if the differences between any of the groups were significant. The specific CDC activity of each sample of the 4 assays was entered into a spreadsheet according to the antibody used. The groups were compared using a parametric test: a one-way analysis of variance (ANOVA) followed by a subsequent Tukey multiple comparison test.

Los resultados se incluyen en la tabla 2B. Los resultados varían desde "+++", que es indicativo de una variante de Fc que induce la CDC con una potencia igual al mutante de IgG1 S254W. "+/-" que es indicativo de una variante de Fc para la que se observó un alto grado de variación y "-" que es indicativo de una variante de Fc para la que no se detectó una inducción significativa de CDC.The results are included in Table 2B. Results range from "+++", which is indicative of a CDC-inducing Fc variant with potency equal to the S254W IgG1 mutant. "+/-" which is indicative of a Fc variant for which a high degree of variation was observed and "-" which is indicative of a Fc variant for which no significant induction of CDC was detected.

Tabla 2B. Actividad de variantes de Fc en ensa os de la función efectora basados en células.Table 2B. Activity of Fc variants in cell-based tests of effector function.

Resumen de los resultados obtenidos a partir del análisis de las variantes de Fc en ensayos de fagocitosis, ADCC y CDC. (- = sin función efectora; = función efectora). (1) una variante de Fc de IgG2/IgG4 que comprende la región CH1 y la región bisagra inferior de IgG2, y la región CH2-CH3 restante de IgG4; (2) mutación S228P introducida en la región Fc de IgG4 para eliminar la formación de hemianticuerpos.Summary of the results obtained from the analysis of Fc variants in phagocytosis, ADCC and CDC assays. (- = no effector function; = effector function). (1) an IgG2 / IgG4 Fc variant comprising the region CH1 and the lower hinge region of IgG2, and the remaining CH2-CH3 region of IgG4; (2) S228P mutation introduced in the Fc region of IgG4 to eliminate the formation of hemiaibodies.

Ejemplo 5: Caracterización de la potencia de variantes de Fc anti-hC5aRExample 5: Characterization of the potency of anti-hC5aR Fc variants

Para ensayar si mutaciones en la región Fc afectan a la potencia de los anticuerpos para inhibir la unión de hC5a a hC5aR y la migración de neutrófilos mediada por hC5a, respectivamente, se ensayaron las diferentes variantes de Fc en los ensayos de desplazamiento y migración descritos anteriormente. El ensayo de migración de neutrófilos se realizó como se ha descrito anteriormente con la excepción de que los PMN usados fueron PMN de ratón aislados de ratones hC5aR-KO/KI (knock-out para el receptor de mC5a/knock-in para C5aR humano, documento WO 2005 060739). Las células se obtuvieron del siguiente modo. Se aislaron PMN de médula ósea a partir de fémures y tibias de dos ratones hC5aR-KO/KI. Las células de médula se extrajeron de los huesos por lavado usando PBS antes de filtrar la suspensión de células a través de un filtro de células (BD Falcon, 352350; malla de nailon de 70 micrómetros) en un tubo de 50 ml y centrifugarla (10 min, 1600 rpm). Las células se resuspendieron en medio y se depositaron cuidadosamente como una capa sobre 3 ml de Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) en un tubo estéril de 15 ml. Después de la centrifugación durante 20 minutos a 600 x g a temperatura ambiente, se aísla el sedimento de neutrófilos/eritrocitos. Los eritrocitos se lisan usando tampón de lisis (Sigma, R7757; 8,3 g/l de cloruro amónico en Tris-HCI 10 mM pH 7,5) durante 1 min. Después de dos ciclos de centrifugación y lavado, el sedimento celular se resuspende en mezcla de reacción. La suspensión contenía >95 % de neutrófilos, lo cual se evaluó por microscopía de muestras teñidas con Giemsa. La región variable de los anticuerpos ensayados fue idéntica a la región variable de Ref. Ab Q. Los datos se proporcionan en la tabla 3.To test whether mutations in the Fc region affect the potency of antibodies to inhibit hC5a binding to hC5aR and hC5a-mediated neutrophil migration, respectively, the different Fc variants were tested in the displacement and migration assays described above. . The neutrophil migration assay was performed as described above with the exception that the PMNs used were mouse PMNs isolated from hC5aR-KO / KI mice (knock-out for human mC5a receptor / knock-in for human C5aR, WO 2005 060739). Cells were obtained as follows. Bone marrow PMNs were isolated from the femurs and tibiae of two hC5aR-KO / KI mice. The marrow cells were removed from the bones by washing using PBS before filtering the cell suspension through a cell filter (BD Falcon, 352350; 70 micron nylon mesh) into a 50 ml tube and centrifuging (10 min, 1600 rpm). Cells were resuspended in medium and carefully layered over 3 ml of Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) in a sterile 15 ml tube. After centrifugation for 20 minutes at 600 x g at room temperature, the neutrophil / erythrocyte pellet is isolated. Erythrocytes are lysed using lysis buffer (Sigma, R7757; 8.3 g / L ammonium chloride in 10 mM Tris-HCl pH 7.5) for 1 min. After two cycles of centrifugation and washing, the cell pellet is resuspended in reaction mixture. The suspension contained> 95% neutrophils, which was evaluated by microscopy of Giemsa-stained samples. The variable region of the antibodies tested was identical to the variable region of Ref. Ab Q. The data is provided in Table 3.

En el análisis SPA se observó una diferencia significativa en la potencia para inhibir la unión de hC5a a hC5aR (tabla 3, columna 1). Se analizó una versión de IgG1 del Ref. Ab Q junto con variantes de Fc de IgG Fc adicionales, y los datos mostraron que las variantes de Fc de IgG1 en general inhibían la unión de hC5a de manera más potente que las variantes de Fc tanto IgG4 como IgG2/IgG4. En el análisis también se incluyó un fragmento F(ab’)2 de Ref. Ab Q y se observó que inhibía la unión a hC5a en la misma medida que Ref. Ab Q de longitud completa (IgG4). Estos descubrimientos indicaban que la región bisagra es importante para la capacidad de los anticuerpos de inhibir la unión de hC5a y esta idea se confirmó por el hecho de que fragmentos F(ab’)2 podían inhibir la migración de los neutrófilos en la misma medida que Ref. Ab Q (Tabla 3). Además, se descubrió que las variantes de IgG1 eran más potentes en la inhibición de la migración de los neutrófilos que las IgG que comprendían las regiones bisagra IgG2 o IgG4 (Tabla 3, columna 2).In SPA analysis, a significant difference was observed in the potency to inhibit the binding of hC5a to hC5aR (Table 3, column 1). An IgG1 version of Ref. Ab Q was tested along with additional IgG Fc Fc variants, and the data showed that IgG1 Fc variants in general inhibited hC5a binding more potently than both IgG4 and Fc variants. as IgG2 / IgG4. An F (ab ') 2 fragment from Ref. Ab Q was also included in the analysis and was found to inhibit binding to hC5a to the same extent as full-length Ref. Ab Q (IgG4). These findings indicated that the hinge region is important for the ability of antibodies to inhibit hC5a binding and this idea was confirmed by the fact that F (ab ') 2 fragments could inhibit neutrophil migration to the same extent as Ref. Ab Q (Table 3). Furthermore, IgG1 variants were found to be more potent in inhibiting neutrophil migration than IgGs comprising the IgG2 or IgG4 hinge regions (Table 3, column 2).

La mayor potencia de las versiones de IgG1 de Ref. Ab con respecto a las versiones de IgG4 podía estar relacionada con la mayor avidez debida a la mayor flexibilidad de la región bisagra de IgG. Para investigar esto, se analizó por FACS la unión de las versiones de IgG 1 e IgG4 del Ref. Ab a neutrófilos de referencia. Los datos demostraron que la versión de IgG1 se unía a los neutrófilos con mayor avidez que la versión de IgG4. Datos no mostrados.The higher potency of the IgG1 versions of Ref. Ab over the IgG4 versions could be related to the higher avidity due to the greater flexibility of the IgG hinge region. To investigate this, the binding of the IgG 1 and IgG4 versions of Ref. Ab to reference neutrophils was analyzed by FACS. The data demonstrated that the IgG1 version bound neutrophils more avidly than the IgG4 version. Data not revealed.

En conjunto, estos descubrimientos confirman que una mayor flexibilidad en las regiones bisagra de IgG1 contribuyen a una mayor unión a hC5aR, que conduce a una mayor potencia.Taken together, these findings confirm that greater flexibility in the IgG1 hinge regions contributes to greater binding to hC5aR, leading to greater potency.

Tabla 3. Efecto de variantes de Fc sobre la unión de hC5a (SPA) y la migración de neutrófilos hacia hC5a. (+ = baja actividad += actividad media ++/+ alta .Table 3. Effect of Fc variants on hC5a (SPA) binding and neutrophil migration to hC5a. (+ = low activity + = medium activity ++ / + high.

Ejemplo 6. Generación y caracterización de anticuerpos anti-hC5aR "completamente" humanos.Example 6. Generation and characterization of "fully" human anti-hC5aR antibodies.

En los análisis descritos en el ejemplo 2, se seleccionó el anticuerpo 32F3A6 para estudios adicionales. Durante la clonación recombinante de este anticuerpo, se identificaron siete mutaciones en la región marco de VH que diferían de las secuencias de la línea germinal humana, aunque no se encontraron mutaciones de la región marco en la LC (Figura 3). Las mutaciones se encontraron alineando las secuencias de VH y VL de 32F3A6 con todas las secuencias de la línea germinal humana disponibles. In the assays described in Example 2, the 32F3A6 antibody was selected for further studies. During recombinant cloning of this antibody, seven VH framework mutations were identified that differed from human germline sequences, although no framework region mutations were found in the LC (Figure 3). Mutations were found by aligning the 32F3A6 VH and VL sequences with all available human germline sequences.

Para hacer que el anticuerpo se pareciera aún más al humano, las siete mutaciones puntuales en la región VH de 32F3A6 se retromutaron a los restos de la línea germinal humana y se injertaron en la región Fc de IgG1 que comprendía las cinco mutaciones L234A_L235E_G237A_A330S_P331S que, según se demostró, anulaban la inducción de la fagocitosis, la ADCC y la CDC como se ha descrito anteriormente. El compuesto se denomina 32F3A6 GL.To make the antibody even more human-like, the seven point mutations in the VH region of 32F3A6 were back-mutated to human germline residues and grafted onto the Fc region of IgG1 comprising the five mutations L234A_L235E_G237A_A330S_P331S which, according to were shown to abolish the induction of phagocytosis, ADCC and CDC as described above. The compound is called 32F3A6 GL.

La potencia del anticuerpo retromutado se comparó con la del anticuerpo original y no se observó ninguna diferencia en la potencia para inhibir la unión de hC5a a hC5aR (ensayado en SPA) o en la potencia para inhibir la migración de neutrófilos mediada por hC5a entre 32F3A6 o 32F3A6 GL (datos no mostrados).The potency of the back-mutated antibody was compared to that of the parent antibody and no difference was observed in the potency to inhibit hC5a binding to hC5aR (tested in SPA) or in the potency to inhibit hC5a-mediated neutrophil migration between 32F3A6 or 32F3A6 GL (data not shown).

La capacidad de los anticuerpos completamente humanos descritos anteriormente para inducir la fagocitosis de neutrófilos, ADCC o CDC se evaluó como se ha descrito en el ejemplo 4 y los resultados se resumen en la tabla 4. The ability of the fully human antibodies described above to induce neutrophil phagocytosis, ADCC or CDC was evaluated as described in Example 4 and the results are summarized in Table 4.

Los resultados relacionados con la ADCC específica incluidos en la tabla 4 se obtuvieron usando PBMC humanas de las que se han retirado monocitos como células efectoras y neutrófilos humanos como células diana.The specific ADCC related results included in Table 4 were obtained using human PBMC from which monocytes have been removed as effector cells and human neutrophils as target cells.

Tabla 4. Funciones efectoras celulares mediadas por Fc_de anticuerpos anti-C5aR. "+" representa ausencia de función efectora detectable y "+" a "+++" representa un nivel de bajo a alto de funciones efectoras medidas en los ensa os descritos en el eem lo 4. ND no determinado .Table 4. Cellular effector functions mediated by Fc_of anti-C5aR antibodies. "+" represents absence of detectable effector function and "+" to "+++" represents a low to high level of effector functions measured in the tests described in item 4. ND not determined.

Como se ha observado previamente, las 5 mutaciones puntuales en la región Fc de IgG1 anula la fagocitosis, la ADCC y la CDC en comparación con la región Fc de IgG1 de tipo silvestre.As previously observed, the 5 point mutations in the Fc region of IgG1 abrogate phagocytosis, ADCC and CDC compared to the Fc region of wild-type IgG1.

Ejemplo 7. Caracterización adicional de anticuerpo anti-hC5aR humano (32F3A6 GL)Example 7. Additional characterization of anti-human hC5aR antibody (32F3A6 GL)

Para esclarecer adicionalmente la funcionalidad de los anticuerpos identificados y determinar la afinidad y la potencia, se realizaron ensayos adicionales usando uno de los anticuerpos anti-C5aR en comparación con Ref AB Q. La afinidad se determinó por un ensayo de unión competitiva de ligando en neutrófilos humanos. Se hace referencia a esta funcionalidad como afinidad del anticuerpo medida por ensayo de unión competitiva de ligando, pero también podría considerarse una medición de la avidez de la interacción. Los ensayos ex-vivo miden la capacidad de los anticuerpos de neutralizar las acciones mediadas por C5a en un escenario in-vitro. Los ensayos de potencia midieron la neutralización del flujo de Ca inducido por C5a, la regulación positiva del receptor de CD11b y la regulación negativa de CD62L, respectivamente, en neutrófilos humanos. Los datos obtenidos para 32F3A6GL se proporcionan en la tabla 5.To further elucidate the functionality of the identified antibodies and determine the affinity and potency, additional assays were performed using one of the anti-C5aR antibodies compared to Ref AB Q. Affinity was determined by a neutrophil competitive ligand binding assay. humans. This functionality is referred to as antibody affinity as measured by competitive ligand binding assay, but could also be considered a measure of the avidity of the interaction. Ex-vivo assays measure the ability of antibodies to neutralize C5a-mediated actions in an in-vitro setting. Potency assays measured C5a-induced Ca flux neutralization, CD11b receptor up-regulation, and CD62L down-regulation, respectively, in human neutrophils. The data obtained for 32F3A6GL are provided in Table 5.

Mediciones de afinidadAffinity measurements

Aislamiento de neutrófilos de sangre humana frescaIsolation of Neutrophils from Fresh Human Blood

Se diluyó sangre en 1:1 con PBS 2 % de FBS y se depositó como una capa sobre Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare #17-1440-03) a una relación de 3 partes de Ficoll y 4 partes de sangre (15 ml de Ficoll y 20 ml de sangre en un tubo de 50 ml) y posteriormente se estratificó por centrifugación a 400 x g durante 30 minutos a TA. La banda intermedia de PBMC se retiró suavemente mediante aspiración. Los granulocitos estratificados sobre los glóbulos rojos empaquetados se aspiraron con una pipeta Pasteur de plástico. Los granulocitos y los glóbulos rojos se transfirieron y se sedimentaron en un nuevo tubo de 50 ml. El sedimento se diluyó a 40 ml con PBS 1x y se añadieron 10 ml de una solución de DEXTRAN 500 al 4 % (sigma, 31392) en PBS (proporción 1:5) y se mezclaron suavemente por inversión. Después de 20-30 min, el sobrenadante rico en granulocitos obtenido se transfirió a un nuevo tubo y se centrifugó a 250 x g durante 5 min a TA. Los glóbulos rojos contaminantes se retiraron con lisis osmótica mediante resuspensión del sedimento celular en 7,5 ml de NaCl al 0,2 % y mezcla suave durante 55-60 segundos. Posteriormente, se añadieron 17,5 ml de NaCl al 1,2 % y después se diluyeron a 50 ml con PBS y se centrifugaron a 250 x g durante 5 min. esta etapa se repitió una vez. Los sedimentos celulares posteriormente se resuspendieron en 1 ml de mezcla de reacción (dPBS/RPMI). La viabilidad y el recuento de células se supervisaron usando NucleoCounter®.Blood was diluted 1: 1 with PBS 2% FBS and layered on Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare # 17-1440-03) at a ratio of 3 parts Ficoll to 4 parts blood (15 ml of Ficoll and 20 ml of blood in a 50 ml tube) and subsequently stratified by centrifugation at 400 xg for 30 minutes at RT. The middle PBMC band was gently removed by aspiration. The layered granulocytes on the packed red blood cells were aspirated with a plastic Pasteur pipette. The granulocytes and red blood cells were transferred and pelleted into a new 50 ml tube. The pellet was diluted to 40 ml with 1x PBS and 10 ml of a 4% solution of DEXTRAN 500 (sigma, 31392) in PBS (1: 5 ratio) was added and mixed gently by inversion. After 20-30 min, the obtained granulocyte-rich supernatant was transferred to a new tube and centrifuged at 250 x g for 5 min at RT. Contaminating red blood cells were removed with osmotic lysis by resuspending the cell pellet in 7.5 ml 0.2% NaCl and gentle mixing for 55-60 seconds. Subsequently, 17.5 ml of 1.2% NaCl were added and then diluted to 50 ml with PBS and centrifuged at 250 x g for 5 min. this stage was repeated once. Cell pellets were subsequently resuspended in 1 ml of reaction mix (dPBS / RPMI). Viability and cell count were monitored using NucleoCounter®.

Ensayo de unión competitiva al ligando en neutrófilos. Neutrophil competitive ligand binding assay.

Se purificaron neutrófilos humanos, se lavaron y se resuspendieron en tampón de unión (HEPES 50 mM, pH 7,5, CaCl21 mM, MgCl25 mM y albúmina de suero bovino al 0,5 % (Fracción V IgG libre)) a ~5 x 106 células/ml. Para cada muestra, se sembraron 40 pl de suspensión celular (1 x 105 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos con forma de V (Greiner, n.° de cat. 651101). Los estudios competitivos se realizaron usando 12 concentraciones de ligando competitivo no marcado en diluciones semilogarítmicas empezando con 1 pM como la concentración más alta. Se añadieron 40 pl de anticuerpo considerando un volumen de ensayo final de 120 pl. Se añadieron 40 pl de radioligando [125I] -hC5a (Perkin Elmer, n.° de cat. NEX250) a todas las muestras excepto al control de referencia. La concentración final de radioligando en el ensayo fue de 1 nM y el volumen final fue 120 pl. Todas las muestras se procesaron por triplicado y se incubaron durante 4 h a 4 °C. Después, las células se recogieron por centrifugación a 1200 rpm, a 4 °C durante 2 min y se lavaron tres veces en 100 pl de tampón de lavado (HEPES 50 mM, pH 7,5, CaCl21 mM, MgCl25 mM, NaCl 150 mM y albúmina de suero bovino al 0,5 % (Fracción V IgG libre)). Por último, las células se resuspendieron en 30 pl de tampón de lavado y se transfirieron a una OptiPlate (Perkin Elmer, n.° de cat. 6005290) y se añadieron a cada pocillo 150 pl de MicroScint 20 (Perkin Elmer, n.° de cat. 6013621). Las placas se cubrieron, se mezclaron bien y se contaron en un Top Counter calibrado con 1 h de retraso. En una placa separada se determinó la cantidad total de radioligando añadido al ensayo. El número de cuentas en cada muestra se expresó como valores normalizados en porcentaje, siendo el 100 % el nivel máximo de cuentas cuando se añade [125I]-hC5a 1 nM y no se añade anticuerpo frío, y siendo el 0 % la unión inespecífica determinada en presencia de hC5a frío 1 pM. Los datos se analizaron por regresión no lineal usando PRISM (GraphPad).Human neutrophils were purified, washed, and resuspended in binding buffer (50 mM HEPES, pH 7.5, 21 mM CaCl, 25 mM MgCl, and 0.5% bovine serum albumin (Free IgG Fraction V)) at ~ 5 x 106 cells / ml. For each sample, 40 µl of cell suspension (1 x 105 cells / well) was seeded into a V-shaped 96-well plate (Greiner, cat # 651101). Competitive studies were performed using 12 concentrations of unlabeled competitive ligand in half-log dilutions starting with 1 pM as the highest concentration. 40 µl of antibody were added considering a final test volume of 120 µl. 40 µl of [125I] -hC5a radioligand (Perkin Elmer, cat # NEX250) was added to all samples except the reference control. The final concentration of radioligand in the assay was 1 nM and the final volume was 120 µl. All samples were processed in triplicate and incubated for 4 h at 4 ° C. The cells were then harvested by centrifugation at 1200 rpm, at 4 ° C for 2 min and washed three times in 100 µl of wash buffer (50 mM HEPES, pH 7.5, 21 mM CaCl, 25 mM MgCl, 150 mM NaCl and 0.5% bovine serum albumin (Free IgG Fraction V)). Finally, the cells were resuspended in 30 µl of wash buffer and transferred to an OptiPlate (Perkin Elmer, cat. No. 6005290) and 150 µl of MicroScint 20 (Perkin Elmer, no. Cat. 6013621). Plates were covered, mixed well, and counted on a calibrated Top Counter with 1 hr delay. The total amount of radioligand added to the assay was determined on a separate plate. The number of counts in each sample was expressed as normalized values in percentage, with 100% being the maximum level of counts when 1 nM [125I] -hC5a is added and no cold antibody is added, and 0% being the determined nonspecific binding. in the presence of cold 1 pM hC5a. Data were analyzed by non-linear regression using PRISM (GraphPad).

Ensayo de flujo de calcioCalcium flux test

Tinción de neutrófilos humanos con tinte de células Fluo-4 AMStaining Human Neutrophils with Fluo-4 AM Cell Stain

Se centrifugaron neutrófilos y se lavaron en PBS, después se resuspendieron a 1 x 107 células/ml en tinte de células y se incubaron a temperatura ambiente durante 40 min en la oscuridad. Las células se centrifugaron y se lavaron (para retirar el exceso de tinte), se centrifugaron de nuevo y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en tampón celular. Las células (0,5 ml) se dividieron en alícuotas en tubos FACS de vidrio no estériles - un tubo para cada muestra - se almacenaron a temperatura ambiente y se usaron antes de que hubieran transcurrido dos horas. Cada muestra usó 1 x 106 neutrófilos.Neutrophils were centrifuged and washed in PBS, then resuspended at 1x107 cells / ml in cell stain and incubated at room temperature for 40 min in the dark. Cells were centrifuged and washed (to remove excess dye), centrifuged again, and resuspended at 2 x 10 6 cells / ml in cell buffer. Cells (0.5 ml) were aliquoted into non-sterile glass FACS tubes - one tube for each sample - stored at room temperature and used within two hours. Each sample used 1 x 106 neutrophils.

EnsayoTest

El ensayo de flujo de calcio se llevó a cabo del siguiente modo. En resumen, se analizaron 1 x 106 neutrófilos con Fluo-4 Am en 0,5 ml de tampón celular en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences), seleccionando los neutrófilos usando FSC en el eje x frente a SSC en el eje y. El canal FL-1 (FITC) se usó para medir la fluorescencia de neutrófilos después de la adición de diversos reactivos al tubo (por ejemplo, anticuerpos, C5a, ionomicina - disuelta a 10 veces la concentración final en tampón celular en lugar de I-MGB o C-MGB). La fluorescencia de la muestra se midió de manera continua adquiriéndose el valor de intensidad media de fluorescencia (MFI) cada segundo. Estos datos se guardaron en un fichero CellQuest (BD Biosciences) y se transfirieron a Excel (Microsoft) y Prism (v4.0c, GraphPad Software Inc.) para un procesamiento y análisis adicional. El orden de adición de reactivos a los neutrófilos y los tiempos de incubación variaron de acuerdo con el tipo de ensayo realizado.The calcium flux test was carried out as follows. Briefly, 1 x 106 neutrophils were analyzed with Fluo-4 Am in 0.5 ml of cell buffer on a FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences), selecting neutrophils using FSC on the x-axis versus SSC on the y-axis. Channel FL-1 (FITC) was used to measure neutrophil fluorescence after the addition of various reagents to the tube (e.g., antibodies, C5a, ionomycin - dissolved at 10 times the final concentration in cell buffer instead of I- MGB or C-MGB). The fluorescence of the sample was measured continuously with the mean fluorescence intensity (MFI) value being acquired every second. These data were saved in a CellQuest file (BD Biosciences) and transferred to Excel (Microsoft) and Prism (v4.0c, GraphPad Software Inc.) for further processing and analysis. The order of addition of reagents to the neutrophils and the incubation times varied according to the type of assay performed.

Ensayo de neutralización de C5aC5a neutralization assay

Se preparó una dilución seriada de 3 veces 10x de anticuerpo, con concentraciones que variaban de 1000 pg/ml a 1,37 pg/ml. Se incubaron neutrófilos cargados con Fluo-4 AM (1 x 106 en 0,5 ml de tampón celular) con 50 pl de solución de anticuerpo 10x (concentración final de Ac en el tubo: 100 - 0,137 pg/ml) durante 10 min a temperatura ambiente. Las células más el anticuerpo se analizaron por FACS durante ~60 s para establecer la fluorescencia basal. Después, se añadieron 50 pl de C5a 10 nM para dar una concentración final de ~1 nM y la medición de la fluorescencia se continuó durante otros ~60 s. Si el anticuerpo bloqueaba la liberación de Ca2+ inducida por C5a, no había un pico de fluorescencia. Si el anticuerpo no neutralizaba C5a, entonces había un pico de fluorescencia. Por último, se añadieron 50 pl de ionomicina a 1 pg/ml a una concentración final de 0,1 pg/ml y la medición de fluorescencia se continuó durante otros ~60 s para asegurar que las células aún respondían.A serial 3-fold 10x dilution of antibody was prepared, with concentrations ranging from 1000 pg / ml to 1.37 pg / ml. Neutrophils loaded with Fluo-4 AM (1 x 106 in 0.5 ml of cell buffer) were incubated with 50 µl of 10x antibody solution (final concentration of Ab in the tube: 100 - 0.137 pg / ml) for 10 min at room temperature. Cells plus antibody were analyzed by FACS for ~ 60 s to establish baseline fluorescence. Then, 50 µl of 10 nM C5 was added to give a final concentration of ~ 1 nM and the fluorescence measurement was continued for another ~ 60 s. If the antibody blocked C5a-induced Ca2 + release, there was no fluorescence peak. If the antibody did not neutralize C5a, then there was a fluorescence peak. Finally, 50 µl of ionomycin was added at 1 pg / ml to a final concentration of 0.1 pg / ml and the fluorescence measurement was continued for another ~ 60 s to ensure that the cells were still responding.

Regulación positiva de receptores de CD11bPositive regulation of CD11b receptors

Configuración del ensayoAssay setup

La siguiente configuración se diseñó para determinar la capacidad de los anticuerpos identificados de neutralizar la activación de neutrófilos inducida por C5a mediante la medición de cambios en la expresión de CD11b.The following setup was designed to determine the ability of the identified antibodies to neutralize C5a-induced neutrophil activation by measuring changes in CD11b expression.

Se diluyó anti-C5aR y anticuerpo de control de isotipo en PBS a una concentración final 2x en una dilución seriada de 3 veces (desde 600 a 0,003387 pg/ml) y se dispensaron 50 pl por duplicado en pocillos de placas de 96 pocillo de fondo en U. A cada pocillo se le añadió una alícuota de 50 pl de sangre entera heparinizada. Cuatro series de pocillos de control (por duplicado) contenían 50 pl de PBS más 50 pl de sangre únicamente. Las placas se incubaron durante 20 min a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. Para activar los neutrófilos, se añadieron 50 pl de C5a humana, concentración final 10 o 100 nM según se especifique, a los pocilios que contenían Ac y a una serie de pocilios de control sin anticuerpo. Se añadió PBS (50 gl) a una segunda serie de pocillos de control sin anticuerpo. A una tercera serie de pocillos de control sin anticuerpo se le añadió acetato miristato de forbol (PMA), concentración final 5 gg/ml. Las placas se incubaron de nuevo 20 min a 37 °C en una incubadora con un 5 % de CO2. Finalmente, se añadieron 50 gl de una mezcla de anti-CD11 b-PE (BD Biosciences, n.° de cat. 555388) diluido 1/50 en PBS (concentración final 1/200) a todos los pocillos (excepto a la 4a serie de 2 pocillos de control sin Ac y sin C5a o PMA - estas muestras proporcionaron los valores de MFI basales). Las placas se incubaron de nuevo durante 20 min a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 % y después se centrifugaron durante 3 min a 2.000 rpm para sedimentar las células sanguíneas. El sobrenadante (150 gl) se retiró y los sedimentos se resuspendieron en 200 gl de solución de lisis FACS 1 x para lisar los glóbulos rojos. Después de 5 min a temperatura ambiente, las placas se centrifugaron de nuevo, se retiraron 200 - 225 gl de sobrenadante y los sedimentos se resuspendieron en 160 gl de solución de lisis FACS 1x. Las células se transfirieron a tubos de microtitulación para el análisis por citometría de flujo.Anti-C5aR and isotype control antibody were diluted in PBS to 2x final concentration in a 3-fold serial dilution (from 600 to 0.003387 pg / ml) and 50 µl in duplicate dispensed into wells of 96-well plates U-bottom. A 50 µl aliquot of heparinized whole blood was added to each well. Four sets of control wells (in duplicate) contained 50 µl of PBS plus 50 µl of blood only. Plates were incubated for 20 min at 37 ° C in a 5% CO2 incubator. To activate neutrophils, 50 µl of human C5a was added, 10 or 100 nM final concentration as specified, to Ab-containing wells and to a series of control wells without antibody. PBS (50 gl) was added to a second set of control wells without antibody. Phorbol myristate acetate (PMA), final concentration 5 gg / ml, was added to a third set of control wells without antibody. The plates were incubated again for 20 min at 37 ° C in a 5% CO2 incubator. Finally, 50 gl of a mixture of anti-CD11 b-PE (BD Biosciences, cat # 555388) diluted 1/50 in PBS (final concentration 1/200) was added to all wells (except 4a 2-well control series without Ab and without C5a or PMA - these samples provided the baseline MFI values). The plates were incubated again for 20 min at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator and then centrifuged for 3 min at 2,000 rpm to pellet the blood cells. The supernatant (150 gl) was removed and the pellets were resuspended in 200 gl of 1 x FACS lysis solution to lyse the red blood cells. After 5 min at room temperature, the plates were centrifuged again, 200-225 gl of supernatant was removed and the pellets were resuspended in 160 gl of 1x FACS lysis solution. Cells were transferred to microtiter tubes for flow cytometric analysis.

FACS y análisis de datosFACS and data analysis

El citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences) se configuró con parámetros de compensación establecidos para canales FL-2. Las muestras se seleccionaron para excluir células muertas y desechos. Los neutrófilos se identificaron como células que tenían alta FSC y SSC y se seleccionaron. Se calculó la intensidad de fluorescencia media (MFI) de los neutrófilos seleccionados en el canal FL-2 (CD11 b-PE).The FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences) was configured with set compensation parameters for FL-2 channels. The samples were selected to exclude dead cells and debris. Neutrophils were identified as cells having high FSC and SSC and selected. The mean fluorescence intensity (MFI) of the selected neutrophils in the FL-2 channel (CD11 b-PE) was calculated.

Los resultados se expresaron como un porcentaje de expresión máxima de CD11 b restando el valor de referencia. la expresión máxima de CD11b (MaxCD11b) era la MFI media de los neutrófilos incubados con C5a pero sin Ac. La expresión mínima de CD11 b (referencia) (MinCD11 b) era la MFI media de los neutrófilos incubados sin C5a y sin Ac. La fórmula usada para calcular el % de expresión máxima de CD11 b para cada muestra fue:The results were expressed as a percentage of maximum CD11 b expression by subtracting the reference value. the maximum expression of CD11b (MaxCD11b) was the mean MFI of neutrophils incubated with C5a but without Ab. The minimal expression of CD11 b (reference) (MinCD11 b) was the mean MFI of neutrophils incubated without C5a and without Ab. The formula used to calculate the% maximum expression of CD11 b for each sample was:

% Máxmuestra = (MFImuestra - MFIMín)/ (MFIMáx - MFIMín) x 100% Maxsample = (MFIsample - MFIMin) / (MFIMmax - MFIMin) x 100

Los datos se introdujeron en GraphPad Prism (v4.0) y se ajustaron a la curva sigmoidea de dosis-respuesta (pendiente variable), es decir, una ecuación logística de 4 parámetros usando regresión no lineal para calcular la CE50.Data were entered into GraphPad Prism (v4.0) and fitted to the sigmoid dose-response curve (variable slope), that is, a 4-parameter logistic equation using non-linear regression to calculate the EC50.

Regulación negativa de receptores de CD62LNegative regulation of CD62L receptors

Configuración del ensayoAssay setup

La siguiente configuración se diseñó para determinar la capacidad de los anticuerpos identificados de neutralizar la activación de neutrófilos inducida por C5a mediante la medición de cambios en la expresión de CD62L.The following setup was designed to determine the ability of the identified antibodies to neutralize C5a-induced neutrophil activation by measuring changes in CD62L expression.

El ensayo de CD11b anterior se adaptó para la detección de CD62L usando un anticuerpo conjugado que reconoce CD62L (BD Biosciences, n.° de cat. 559772). Los detalles experimentales específicos para CD62L se proporcionan a continuación.The above CD11b assay was adapted for the detection of CD62L using a conjugated antibody that recognizes CD62L (BD Biosciences, cat # 559772). Specific experimental details for CD62L are provided below.

FACS y análisis de datosFACS and data analysis

El citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences) se configuró con parámetros de compensación establecidos para el canal FL-4. Las muestras se seleccionaron para excluir células muertas y desechos. Los neutrófilos se identificaron como células que tenían alta FSC y SSC y se seleccionaron. Se calculó la intensidad de fluorescencia media (MFI) de los neutrófilos seleccionados en el canal FL-4 (CD62L-APC).The FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences) was configured with set compensation parameters for the FL-4 channel. The samples were selected to exclude dead cells and debris. Neutrophils were identified as cells having high FSC and SSC and selected. The mean fluorescence intensity (MFI) of the selected neutrophils in the FL-4 channel (CD62L-APC) was calculated.

Los resultados se expresaron como un porcentaje de expresión máxima de CD62L restando el valor de referencia. La expresión máxima de CD62L (MaxCD62L) era la MFI media de los neutrófilos incubados sin C5a y sin Ac. La expresión mínima de CD62L (referencia) (MinCD62L) era la MFI media de los neutrófilos incubados con C5a pero sin Ac. La fórmula usada para calcular el % de expresión máxima de CD62L para cada muestra fue:The results were expressed as a percentage of maximum expression of CD62L subtracting the reference value. The maximum expression of CD62L (MaxCD62L) was the mean MFI of neutrophils incubated without C5a and without Ab. The minimal expression of CD62L (reference) (MinCD62L) was the mean MFI of neutrophils incubated with C5a but without Ab. The formula used to calculate the% maximum expression of CD62L for each sample was:

% Máxmuestra = (MFImuestra - MFIMín)/ (MFIMáx - MFIMín) X 100% Maxsample = (MFIsample - MFIMin) / (MFIMmax - MFIMin) X 100

Los datos se introdujeron en GraphPad Prism (v4.0) y se ajustaron a la curva sigmoidea de dosis-respuesta (pendiente variable), es decir, una ecuación logística de 4 parámetros usando regresión no lineal para calcular la CE50.Data were entered into GraphPad Prism (v4.0) and fitted to the sigmoid dose-response curve (variable slope), that is, a 4-parameter logistic equation using non-linear regression to calculate the EC50.

Los resultados de los ensayos anteriores se resumen a continuación en la tabla 5.The results of the above trials are summarized below in Table 5.

Tabla 5. datos obtenidos en ensa o de afinidad Ensa o de fluo de calcio Ensa o de CD11 b CD62L.Table 5. data obtained in Ensa or affinity Ensa or calcium fluoride Ensa or CD11 b CD62L.

Los datos confirmaron que 32F3A6 GL inhibe la acción de C5a de una manera dependiente de la dosis. La inhibición de la liberación de Ca2+ en los neutrófilos aumentó al aumentar las concentraciones de 32F3A6 GL y con una mayor eficacia que Ref. Ab Q como se observa por el menor valor de CI50.The data confirmed that 32F3A6 GL inhibits the action of C5a in a dose-dependent manner. Inhibition of Ca2 + release in neutrophils increased with increasing concentrations of 32F3A6 GL and with greater efficacy than Ref. Ab Q as observed by the lower IC50 value.

De manera similar, 32F3A6 GL también es más eficaz que Ref. Ab Q en el ensayo de regulación de CD11 b y CD62L presentando una potencia 4-5 veces mayor que Ref. Ab Q.Similarly, 32F3A6 GL is also more efficient than Ref. Ab Q in the assay for regulating CD11 b and CD62L exhibiting 4-5 times higher potency than Ref. Ab Q.

El ensayo adicional de 32F3A6 GL en el ensayo de migración de neutrófilos (quimiotaxis) también mostró una dependencia de la dosis con un valor de CI50 de 1,0 pg/ml.The additional 32F3A6 GL assay in the neutrophil migration assay (chemotaxis) also showed a dose dependence with an IC50 value of 1.0 pg / ml.

Ejemplo 8. Modelo de ratones in vivo de artritisExample 8. In vivo mouse model of arthritis

El efecto in vivo se ensayó en un modelo K/BxN en ratones hC5aR KO/KI (documento WO 2009/103113 y Lee et al, Nat Biotechnol. Octubre de 2006; 24(10):1279-84). Los ratones K/BxN desarrollan espontáneamente una enfermedad de tipo autoinmunitaria mediada por Ac circulantes contra GPI (auto-antígeno glucosa 6-fosfato isomerasa). El suero de ratones K/BxN artríticos induce la enfermedad en otras cepas de ratones con muchas características típicas de la AR humana, entre las que se incluyen enfermedad progresiva crónica con destrucción articular.The in vivo effect was tested in a K / BxN model in hC5aR KO / KI mice (WO 2009/103113 and Lee et al, Nat Biotechnol. 2006 Oct; 24 (10): 1279-84). K / BxN mice spontaneously develop a circulating Ab-mediated autoimmune disease against GPI (glucose 6-phosphate isomerase autoantigen). Serum from arthritic K / BxN mice induces disease in other strains of mice with many typical features of human RA, including chronic progressive disease with joint destruction.

AnimalesAnimals

Ratones transgénicos C5aR humano KO/KI (C57BL/6; H-2b; C5aR+/+ humano / C5aR-/- de ratón; abreviatura de la cepa: H5Rtg) de 8 - 27 semanas de edad.Transgenic human C5aR KO / KI mice (C57BL / 6; H-2b; C5aR + / + human / C5aR - / - mouse; strain abbreviation: H5Rtg) 8-27 weeks of age.

Suero K/BxNSerum K / BxN

para producir suero para los experimentos, se cruzaron ratones KRNtg macho con ratones NOD hembra. La descendencia F1 (8-10 semanas de edad) que portaba el transgén KRN, que desarrollaba articulaciones inflamadas, se sacrificó y se recogió sangre por punción cardiaca. Después de 2 horas de incubación a 37 °C y centrifugación durante 10 min a 4.000 rpm, se recogió el suero. Se reunió suero de múltiples ratones, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C. Todos los ratones se inyectaron con el mismo lote de suero K/BxN.To produce serum for the experiments, male KRNtg mice were crossed with female NOD mice. F1 offspring (8-10 weeks old) carrying the KRN transgene, developing swollen joints, were sacrificed and blood was collected by cardiac puncture. After 2 hours of incubation at 37 ° C and centrifugation for 10 min at 4,000 rpm, the serum was collected. Serum from multiple mice was pooled, aliquoted, and stored at -80 ° C. All mice were injected with the same batch of K / BxN serum.

Inducción de artritis y puntuaciónArthritis induction and scoring

Se indujo una artritis inflamatoria en ratones H5Rtg receptores inyectando 150 pl de suero K/BxN i.p. tanto el día 0 como el día 2. El progreso de la enfermedad se supervisó diariamente midiendo el tamaño de la pata y determinando una puntuación clínica basada en el grado de inflamación en las patas delanteras y traseras y en las articulaciones del tobillo. El cambio en el tamaño medio de la pata desde el día 0 se calculó como se indica a continuación. El grosor (en mm) de los tobillos en cada una de las patas traseras se midió diariamente usando un calibre. La media de dichas una o dos lecturas de cada una de las patas traseras fue el tamaño medio diario de la pata (PS). El tamaño medio de la pata el día 0 se restó del tamaño medio diario de la pata para dar el cambio medio en el tamaño de la pata (APS) para cada día del experimento. Se calculó una puntuación clínica para cada pata de cada ratón basándose en el sistema de puntuación mostrado en la tabla 6. La puntuación de las 4 patas se sumó para dar la puntuación clínica total (CS) para cada ratón en cada día del experimento.Inflammatory arthritis was induced in recipient H5Rtg mice by injecting 150 µl of K / BxN serum i.p. on both day 0 and day 2. The progress of the disease was monitored daily by measuring the size of the paw and determining a clinical score based on the degree of inflammation in the front and rear paws and in the ankle joints. The change in mean paw size from day 0 was calculated as follows. The thickness (in mm) of the ankles in each of the hind legs was measured daily using a caliper. The mean of these one or two readings from each of the hind legs was the mean daily leg size (PS). The mean paw size on day 0 was subtracted from the mean daily paw size to give the mean change in paw size (APS) for each day of the experiment. A clinical score was calculated for each paw of each mouse based on the scoring system shown in Table 6. The score of the 4 paws was summed to give the total clinical score (CS) for each mouse on each day of the experiment.

T l i m n i n líni rri iT l i m n i n líni rri i

Para determinar qué ratón entraba en la fase de tratamiento el día 5, se calculó una "Puntuación de AR" para cada ratón multiplicando la puntuación clínica por el cambio en el tamaño de la pata desde el día 0 (en mm). Generalmente, solo los ratones que tenían una Puntuación RA > 0,7 entraban en la fase de tratamiento del estudio. To determine which mouse entered the treatment phase on day 5, an "AR Score" was calculated for each mouse by multiplying the clinical score by the change in paw size from day 0 (in mm). Generally, only mice that had an RA Score> 0.7 entered the treatment phase of the study.

Tratamiento terapéutico con 32F3A6 GLTherapeutic treatment with 32F3A6 GL

Después del inicio de la enfermedad (día 0), los ratones KO/KI hC5aR recibieron una dosis de carga de 32F3A6 GL el día 5 y después 9 dosis diarias. Las dosificaciones de carga fueron 10, 1,5 y 0,5 mg/kg y las dosificaciones diarias 2, 0,5 y 0,25 mg/kg. Las puntuaciones clínicas (media /- SD) para cada grupo de tratamiento se muestran en la figura 4. El tratamiento con NNC0215-0384 produjo una reducción dependiente de la dosis en la inflamación en comparación con los ratones tratados con un anticuerpo de control irrelevante. Se observó un efecto similar basado en cambios en el tamaño medio de la pata (no mostrados)After disease onset (day 0), KO / KI hC5aR mice received a loading dose of 32F3A6 GL on day 5 and then 9 daily doses. The loading dosages were 10, 1.5 and 0.5 mg / kg and the daily dosages were 2, 0.5 and 0.25 mg / kg. Clinical scores (mean / -SD) for each treatment group are shown in Figure 4. Treatment with NNC0215-0384 produced a dose-dependent reduction in inflammation compared to mice treated with an irrelevant control antibody. A similar effect was observed based on changes in mean paw size (not shown)

Ejemplo 9. Nivel de expresión de C5a en pacientes con artritis psoriásicaExample 9. Level of expression of C5a in patients with psoriatic arthritis

Se midió C5a en muestras de líquido sinovial de 11 pacientes con artritis psoriásica y 12 pacientes con osteoartritis como controles. Se siguió el protocolo de un kit ELISA de C5a comercial (BD OptEIA™, kit II ELISA de C5a humana (BD Biosciences; n.° de cat. 557965)). Los datos se proporcionan en la figura 5 y se resumen en la tabla 7 mostrada a continuación. El nivel de C5a estaba elevado significativamente en el grupo de pacientes con artritis psoriásica (p = 0,001; Mann-Whitney), lo que indica que C5a puede ser un inductor de la inflamación sinovial en la artritis psoriásica.C5a was measured in synovial fluid samples from 11 psoriatic arthritis patients and 12 osteoarthritis patients as controls. The protocol of a commercial C5a ELISA kit (BD OptEIA ™, Human C5a ELISA Kit II (BD Biosciences; Cat # 557965)) was followed. The data is provided in Figure 5 and summarized in Table 7 below. The level of C5a was significantly elevated in the group of patients with psoriatic arthritis (p = 0.001; Mann-Whitney), indicating that C5a may be an inducer of synovial inflammation in psoriatic arthritis.

Ejemplo 10. Expresión de C5aR en sinovio de pacientes con artritis psoriásicaExample 10. Expression of C5aR in Synovium of Psoriatic Arthritis Patients

Se obtuvieron cortes de micromatrices de tejidos (TMA) que contenían biopsias sinoviales fijadas con formalina e incluidas en parafina de pacientes con PsA (n=9) y pacientes dentro de los límites normales (n=5), del Biochain Institute Inc. /BioCat GmbH, Heidelberg, Alemania. Una muestra de PsA de la colaboración con el Dr. Bliddal (Frederiksberg Hospital, Dinamarca) y el Dr. S0e (Gentofte Hospital, Dinamarca). Todos los materiales humanos se obtuvieron con un consentimiento informado de los donantes o parientes cercanos y con aprobación por los comités de ética locales pertinentes BioCat Ge, comunicación personal; Cambridge BioSciences, Información del proveedor: Tissue Supply NetWork (www. bioscience. co.uk). La muestra de los Dr. Bliddal/S0e se obtuvo bajo el permiso ético n.° H-4-2009-117. Se usaron los anticuerpos siguientes: Monoclonal de ratón anti-C5aR humano (R&D Systems, MAB3648 clon 347214 (IgG2a)). Control específico de isotipo IgG2a de ratón (Dako, X0943, clon DAK-GO5). Anticuerpo de burro anti-ratón conjugado con biotina Jackson ImmunoReseach (715-065-150).Tissue microarray (TMA) sections containing formalin-fixed and paraffin-embedded synovial biopsies from PsA patients (n = 9) and patients within normal limits (n = 5) were obtained from Biochain Institute Inc. / BioCat GmbH, Heidelberg, Germany. A sample of PsA from collaboration with Dr. Bliddal (Frederiksberg Hospital, Denmark) and Dr. S0e (Gentofte Hospital, Denmark). All human materials were obtained with the informed consent of donors or close relatives and with approval by the relevant local ethics committees BioCat Ge, personal communication; Cambridge BioSciences, Vendor Information: Tissue Supply NetWork (www. Bioscience. Co.uk). The Dr. Bliddal / S0e sample was obtained under Ethical Permit No. H-4-2009-117. The following antibodies were used: Mouse monoclonal anti-human C5aR (R&D Systems, MAB3648 clone 347214 (IgG2a)). Mouse IgG2a isotype specific control (Dako, X0943, DAK-GO5 clone). Biotin-Conjugated Donkey Anti-Mouse Antibody Jackson ImmunoReseach (715-065-150).

La inmunohistoquímica se realizó del siguiente modo. Se eliminó la parafina de las secciones en xileno y se rehidrataron en concentraciones decrecientes de alcoholes. La recuperación del antígeno se realizó en tampón Tris-EGTA (10 mM; 0,5 mM), pH 9,0 en un horno microondas durante 15 min. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó con H2O2 al 3 % y la biotina exógena se bloqueó por incubación con soluciones de bloqueo de avidina y biotina durante 10 min, respectivamente, de acuerdo con el fabricante. La unión no específica se bloqueó por incubación con TBS que contenía un 3 % de leche desnatada, un 7 % de suero de burro, un 3 % de suero humano y 3,2 mg/ml de Poli-L-Lisina (PLL) durante 30 min. Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron en un tampón Tris que contenía un 0,5 % de leche desnatada, un 7 % de suero de burro y un 3 % de suero humano, y la incubación se realizó durante una noche a 4 °C y durante 60 min a temperatura ambiente, respectivamente. La primera etapa de amplificación se realizó por incubación con kit de peroxidasa Vectastain ABC, diluido en tampón Tris-HCI 0,1 M (pH 7,5) que contenía Reactivo Bloqueante de Du Pont (TNB) al 0,5 % durante 30 min, seguida de una segunda etapa de amplificación con incubación en Tyramide biotinilado durante 6 min. La amplificación final se realizó mediante una incubación adicional con el kit de peroxidasa Vectastain ABC, diluido como se ha descrito anteriormente durante 30 min. La reacción cromogénica se consiguió con diaminobencidina. Los núcleos se contratiñeron con hematoxilina y las secciones se rehidrataron, se limpiaron en xileno y se montaron con Eukitt. La evaluación de las TMA para la expresión de la proteína C5aR en AR, OA y sinovio normal se realizó con un diseño ciego para el observador. Para evaluar las secciones se utilizó un microscopio Olympus BX51 equipado con una cámara digital DP70 (Olympus Denmark A/S; Ballerup, Dinamarca).Immunohistochemistry was performed as follows. The sections were dewaxed in xylene and rehydrated at decreasing concentrations of alcohols. Antigen recovery was performed in Tris-EGTA buffer (10 mM; 0.5 mM), pH 9.0 in a microwave oven for 15 min. Endogenous peroxidase activity was blocked with 3% H2O2 and exogenous biotin was blocked by incubation with avidin and biotin blocking solutions for 10 min, respectively, according to the manufacturer. Non-specific binding was blocked by incubation with TBS containing 3% skim milk, 7% donkey serum, 3% human serum, and 3.2 mg / ml Poly-L-Lysine (PLL) for 30 min. The primary and secondary antibodies were diluted in a Tris buffer containing 0.5% skim milk, 7% donkey serum and 3% human serum, and incubation was carried out overnight at 4 ° C and for 60 min at room temperature, respectively. The first amplification step was carried out by incubation with Vectastain ABC peroxidase kit, diluted in 0.1 M Tris-HCI buffer (pH 7.5) containing 0.5% Du Pont Blocking Reagent (TNB) for 30 min. , followed by a second amplification step with incubation in biotinylated Tyramide for 6 min. Final amplification was performed by further incubation with Vectastain ABC peroxidase kit, diluted as described above for 30 min. The chromogenic reaction was achieved with diaminobenzidine. The nuclei were counterstained with hematoxylin and the sections were rehydrated, cleaned in xylene and mounted with Eukitt. Evaluation of TMAs for C5aR protein expression in RA, OA, and normal synovium was performed in an observer blind design. An Olympus BX51 microscope equipped with a DP70 digital camera (Olympus Denmark A / S; Ballerup, Denmark) was used to evaluate the sections.

ResultadosResults

Se encontraron células inmunopositivas para C5aR entremezcladas en agregados linfoides en la capa situada por debajo del revestimiento sinovial en 8 de 10 pacientes con artritis psoriásica, y en el estroma de 10 de 10 pacientes con artritis psoriásica. Los controles no presentaron ninguna tinción de C5aR en estos compartimentos sinoviales (0/5). Se detectaron sinoviocitos inmunopositivos para C5aR en las células de la capa de revestimiento en 4 de 5 controles así como en 10 de 10 pacientes con artritis psoriásica. Los resultados se resumen en la tabla 8 mostrada a continuación. Immunopositive cells for C5aR were found intermixed in lymphoid aggregates in the layer below the synovial lining in 8 out of 10 psoriatic arthritis patients, and in the stroma of 10 out of 10 psoriatic arthritis patients. Controls did not show any C5aR staining in these synovial compartments (0/5). C5aR immunopositive synoviocytes were detected in the coating layer cells in 4 out of 5 controls as well as in 10 out of 10 psoriatic arthritis patients. The results are summarized in Table 8 below.

Tabla 8. detección de células C5aR+ en el sinovio normal y el sinovio de pacientes con artritis psoriásica. Valor de P (prueba exacta de Fischer) para la diferencia entre la expresión de C5aR en pacientes con artritis psoriásica en com aración con el sinovio normal: 0007 a re ados linfoides 00003 estroma .Table 8. Detection of C5aR + cells in the normal synovium and synovium of patients with psoriatic arthritis. P value (Fischer's exact test) for the difference between C5aR expression in patients with psoriatic arthritis compared to normal synovium: 0007 to lymphoid reagents 00003 stroma.

Ejemplo 11. inhibición de la migración de neutrófilos inducida por líquido sinovial de pacientes con artritis psoriásica por anti-C5aR.Example 11. Inhibition of synovial fluid-induced neutrophil migration of psoriatic arthritis patients by anti-C5aR.

Ensayo de migración de granulocitos neutrófilos (quimiotaxis)Neutrophil granulocyte migration assay (chemotaxis)

La potencia de los anticuerpos para inhibir la migración dependiente de hC5a de granulocitos neutrófilos humanos (PMN (leucocitos PoliMorfoNucleares) humanos) se analizó en un ensayo de cámara Boyden usando sistemas de inserto de 96 pocillos BD FluoroBlok.The potency of antibodies to inhibit the hC5a-dependent migration of human neutrophilic granulocytes (human PMNs (PolyMorphoNuclear leukocytes)) was tested in a Boyden Chamber Assay using BD FluoroBlok 96-well insert systems.

Se obtuvieron PMN humanos a partir de muestras de sangre humana extraída en viales que contenían EDTA. Las células sanguíneas se separaron por centrifugación de sangre (4 partes) a través de un gradiente de Ficoll-Paque PLUS (GE Health Care) (3 partes) durante 30 min (400 x g) a temperatura ambiente. La capa que contenía PMN se suspendió en PBS (solución salina tamponada con fosfato) que contenía dextrano-500 (Sigma) durante 1 h para retirar los eritrocitos contaminantes. El sobrenadante se centrifugó durante 5 min (250 x g) a temperatura ambiente y los eritrocitos restantes se lisaron por ósmosis usando NaCl al 0,2 % durante 55 s. La solución se hizo isotónica mediante NaCl al 1,2 % PBS y se centrifugó a 250 x g durante 5 min, antes de repetir la lisis osmótica. Después de la centrifugación, los PMN se resuspendieron en mezcla de reacción (MR): HBSS (n.° de cat. 14175 Gibco) contiene NaCl 137mM, KCI 5,3 mM, Na2HPÜ4 0,33 mM, NaHCÜ3 4 mM, KH2PO40,44 mM, Glucosa 5 mM; complementado con MgSO4^7H2O 0,4 mM, MgCl2, 0,5 mM, CaCl2 0,5 mM, HEPES 20 mM. La densidad celular se determinó por NucleoCounter (Chemometec). La suspensión de PMN contenía >95 % de neutrófilos, lo cual se evaluó por microscopía de muestras teñidas con Giemsa.Human PMNs were obtained from human blood samples drawn in vials containing EDTA. Blood cells were separated by centrifugation of blood (4 parts) through a Ficoll-Paque PLUS gradient (GE Health Care) (3 parts) for 30 min (400 x g) at room temperature. The layer containing PMN was suspended in PBS (phosphate buffered saline) containing dextran-500 (Sigma) for 1 h to remove contaminating erythrocytes. The supernatant was centrifuged for 5 min (250 x g) at room temperature and the remaining erythrocytes were lysed by osmosis using 0.2% NaCl for 55 s. The solution was made isotonic with 1.2% NaCl PBS and centrifuged at 250 x g for 5 min, before repeating the osmotic lysis. After centrifugation, the PMNs were resuspended in Reaction Mix (MR): HBSS (Gibco cat no. 14175) contains 137mM NaCl, 5.3mM KCl, 0.33mM Na2HP44, 4mM NaHPÜ3, KH2PO40, 44 mM, Glucose 5 mM; supplemented with 0.4 mM MgSO4 ^ 7H2O, 0.5mM MgCl2, 0.5mM CaCl2, 20mM HEPES. Cell density was determined by NucleoCounter (Chemometec). The PMN suspension contained> 95% neutrophils, which was evaluated by microscopy of Giemsa-stained samples.

Carga de PMN: se disolvió calceína, AM, (Fluka) en DMSO (dimetil sulfóxido) y se diluyó 1000 veces en RM con células (2x106 células por ml) produciendo una concentración de 10 pM. La suspensión se incubó durante 30 min en una incubadora a 37 °C y después se lavó 3 veces con RM para eliminar el exceso de calceína. Finalmente, las células se resuspendieron en RM (4x106 células/ml).PMN loading: Calcein, AM, (Fluka) was dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide) and diluted 1000-fold in cell MRI (2x10 6 cells per ml) producing a concentration of 10 pM. The suspension was incubated for 30 min in a 37 ° C incubator and then washed 3 times with RM to remove excess calcein. Finally, the cells were resuspended in MR (4x106 cells / ml).

Se obtuvo líquido sinovial (SF) humano de 2 pacientes con artritis psoriásica por punción en la rodilla. Después de retirar las células por centrifugación, las muestras se congelaron y se almacenaron a -80 °C. Para los experimentos de migración, las muestras se descongelaron y se diluyeron 2 veces usando RM que contenía un 0,2 % de EDTA. Human synovial fluid (SF) was obtained from 2 patients with psoriatic arthritis by puncture of the knee. After removing the cells by centrifugation, the samples were frozen and stored at -80 ° C. For migration experiments, samples were thawed and diluted 2-fold using RM containing 0.2% EDTA.

La migración se evaluó por la técnica de la cámara Boyden usando FluoroBlok®, tamaño de poro 3 pm, 96 pocillos (n.° cat. 351161.BD Falcon (VWR)). La cámara superior, es decir, los insertos que contenían membrana Fluoroblok se recubrieron con fibrinógeno humano (n.° cat. F3879-1G, Sigma) en PBS a 1 mg/ml a 37 °C durante 2 h. Después del lavado, las membranas se bloquearon con una solución que contenía un 2 % de albúmina de suero bovino (BSA), en PBS. Después de otro lavado usando RM, se añadieron a cada pocillo 105 PMN cargados con calceína con o sin los anticuerpos de hC5aR (100 pg/ml) y se pusieron en la placa receptora (cámara inferior) que contenía la solución de control o la solución de quimioatrayente (hC5a (Sigma, o muestras de líquido sinovial)). Cada grupo estaba compuesto por 4 - 6 pocillos. La cuantificación de la migración celular se consigue midiendo la fluorescencia de las células en la cámara inferior. Como la membrana FluoroBlok bloquea eficazmente el paso de luz de 490-700 nm, la fluorescencia de las células que no han entrado en la cámara inferior no se detecta a 485/530 nm. la placa se leyó a longitudes de onda de excitación/emisión de 485/538 nm, a 37 °C cada 5 min durante 60 min en un lector de placas de fluorescencia con capacidades de lectura de fondo (SpectraMax, Molecular devices, o Fluoroscan, Thermo Labsystems).Migration was assessed by Boyden chamber technique using FluoroBlok®, 3 pm pore size, 96 well (cat # 351161.BD Falcon (VWR)). The upper chamber, that is, the inserts containing Fluoroblok membrane were coated with human fibrinogen (cat # F3879-1G, Sigma) in PBS at 1 mg / ml at 37 ° C for 2 h. After washing, the membranes were blocked with a solution containing 2% bovine serum albumin (BSA), in PBS. After another wash using MR, 105 calcein-loaded PMNs with or without the hC5aR antibodies (100 pg / ml) were added to each well and placed on the receiving plate (lower chamber) containing the control solution or the solution. chemoattractant (hC5a (Sigma, or synovial fluid samples)). Each group consisted of 4-6 wells. Quantification of cell migration is achieved by measuring the fluorescence of cells in the lower chamber. As the FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm, the fluorescence of cells that have not entered the lower chamber is not detected at 485/530 nm. the plate was read at excitation / emission wavelengths of 485/538 nm, at 37 ° C every 5 min for 60 min in a fluorescence plate reader with background reading capabilities (SpectraMax, Molecular devices, or Fluoroscan, Thermo Labsystems).

La migración se evaluó por valores de fluorescencia a 60 min expresados como valores de fluorescencia relativa. En la tabla 9, La migración en presencia de anticuerpo de isotipo se fija al 100 % y se calcula la capacidad del anticuerpo anti-C5aR de inhibir la migración. La migración se atenuaba claramente por el anticuerpo de hC5aR. la migración inducida por hC5a 10 nM se inhibió un 83 %. Los valores para las tres muestras de SF fueron: 15 %, 70 % y 48 %. Los resultados demuestran que el anticuerpo de C5aR inhibía el efecto quimioatrayente de SF de pacientes con artritis psoriásica.Migration was evaluated by fluorescence values at 60 min expressed as relative fluorescence values. In Table 9, Migration in the presence of isotype antibody is set to 100% and the ability of the anti-C5aR antibody to inhibit migration is calculated. Migration was clearly attenuated by the hC5aR antibody. migration induced by 10 nM hC5a was 83% inhibited. The values for the three SF samples were: 15%, 70% and 48%. The results demonstrate that the C5aR antibody inhibited the chemoattractant effect of SF from psoriatic arthritis patients.

Tabla 9. Migración de PMN en respuesta a hC5a o líquido sinovial de tres pacientes con artritis psoriásica y su inhibición por anticuerpo de hC5aR (anticuerpo Ref Q). Todos los valores se normalizaron para la migración detectada cuando se incubó con anticuerpo de isotipo. Table 9. PMN migration in response to hC5a or synovial fluid from three psoriatic arthritis patients and its inhibition by hC5aR antibody (Ref Q antibody). All values were normalized for migration detected when incubated with isotype antibody.

Ejemplo 12. Expresión de C5aR en el intestino de pacientes con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosaExample 12. Expression of C5aR in the intestine of patients with Crohn's disease and ulcerative colitis

Se obtuvieron muestras de tejido intestinal dentro de límites normales (n=14), de pacientes con colitis ulcerosa (n=21) y enfermedad de Crohn (n=25) de Cambridge Bioscience (Cambridge, Reino Unido). Todos los materiales humanos se obtuvieron con un consentimiento informado de los donantes o parientes cercanos y con aprobación por los comités de ética locales pertinentes BioCat Ge, Información del proveedor: Tissue Supply Network (www. bioscience. co.uk). Los anticuerpos usaron un protocolo de inmunohistoquímica como se describe en el Ejemplo 9.Intestinal tissue samples within normal limits (n = 14) were obtained from patients with ulcerative colitis (n = 21) and Crohn's disease (n = 25) from Cambridge Bioscience (Cambridge, UK). All human materials were obtained with the informed consent of donors or close relatives and with approval by the relevant local ethics committees BioCat Ge, Vendor Information: Tissue Supply Network (www. Bioscience. Co.uk). The antibodies used an immunohistochemistry protocol as described in Example 9.

Puntuación semicuantitativaSemi-quantitative scoring

Las células inmunopositivas para C5aR (C5aR+) se puntuaron semicuantitativamente como se indica a continuación: Los compartimentos linfoides asociados a la mucosa se puntuaron individualmente: Mucosa (M): compartimento de linfocito intraepitelial (IEL) (epitelio de la superficie), lamina propria y epitelio asociado a folículo (FAE). Submucosa (SM): folículos linfoides (solitarios) (ILF), placas de Peyer (íleon)/IEL colónico (colon) y linfocitos infiltrantes aislados. Muscularis Externa (ME): IEL y linfocitos infiltrantes aislados. Cada compartimento se puntuó en una escala de 0-4: 0, ausencia; 1, pocas; 2 una cantidad moderada; 3, muchas y 4, una cantidad abundante de células C5aR+. Se calculó una puntuación acumulada para cada capa intestinal (M, SM, ME) y en total (M+SM+ME) para el intestino entero. Puntuación máx.: M=12, SM=12, ME=8 y para el intestino entero 32. La puntuación semicuantitativa de los datos inmunohistoquímicos para la expresión de la proteína C5aR se analizó por el ensayo de Kruskal-Wallis con ensayo posterior de comparación múltiples de Dunn en GraphPad Prism 5. Un valor de P < 0,05 se consideró significativo. Cells immunopositive for C5aR (C5aR +) were scored semi-quantitatively as follows: Mucosa-associated lymphoid compartments were scored individually: Mucosa (M): intraepithelial lymphocyte (IEL) compartment (surface epithelium), lamina propria, and follicle-associated epithelium (FAE). Submucosa (SM): lymphoid follicles (solitary) (ILF), Peyer's patches (ileum) / colonic IEL (colon) and isolated infiltrating lymphocytes. Muscularis Externa (ME): IEL and isolated infiltrating lymphocytes. Each compartment was scored on a scale of 0-4: 0, absence; 1, few; 2 a moderate amount; 3, many and 4, an abundant number of C5aR + cells. A cumulative score was calculated for each intestinal layer (M, SM, ME) and in total (M + SM + ME) for the whole intestine. Max score: M = 12, SM = 12, ME = 8 and for the whole intestine 32. The semi-quantitative score of the immunohistochemical data for the expression of the C5aR protein was analyzed by the Kruskal-Wallis test with subsequent comparison test Dunn's multiples on GraphPad Prism 5. A value of P <0.05 was considered significant.

ResultadosResults

Se encontraron células de tipo mieloide y neutrófilos positivos para C5aR en el compartimento de linfocitos intraepiteliales, en el epitelio asociado a folículo y como células solitarias en la lámina propria de la mucosa en 23 de 25 pacientes con EC (enfermedad de Crohn), 19 de 21 pacientes con CU (colitis ulcerosa) y en 7 de 14 muestras intestinales normales (valores de P (prueba exacta de Fisher) 0,005 y 0,015, respectivamente). Además, se encontraron células positivas para C5aR en placas de Peyer/folículos linfoides colónicos; folículos linfoides aislados (solitarios) y como células solitarias de la submucosa en 21 de 25 pacientes con EC y 18 de 21 pacientes con CU en comparación con 7 de 14 muestras intestinales normales (valores de P (ensayo exacto de Fisher) 0,03 y no significativo, respectivamente). Por último, se encontraron células positivas para C5aR que infiltraban la capa muscularis externa de pacientes con EC y CU, así como en el intestino normal. Los resultados se presentan en la figura 6 y se resumen en la tabla 10. Basándose en el análisis semicuantitativo, se descubrió que C5aR tiene una expresión significativamente mayor en el intestino de pacientes con EC (P<0,01) y CU (P<0,05) en comparación con el intestino normal en la pared intestinal entera, por ejemplo, la puntuación acumulada en las tres capas intestinales (mucosa, submucosa y muscularis externa).Cells of myeloid type and neutrophils positive for C5aR were found in the intraepithelial lymphocyte compartment, in the follicle-associated epithelium, and as solitary cells in the lamina propria of the mucosa in 23 of 25 patients with CD (Crohn's disease), 19 of 21 patients with UC (ulcerative colitis) and in 7 of 14 normal intestinal samples (P values (Fisher's exact test) 0.005 and 0.015, respectively). In addition, C5aR-positive cells were found in Peyer's patches / colonic lymphoid follicles; isolated (solitary) lymphoid follicles and as solitary cells of the submucosa in 21 of 25 CD patients and 18 of 21 UC patients compared to 7 of 14 normal intestinal samples (P values (Fisher's exact test) 0.03 and not significant, respectively). Finally, C5aR-positive cells were found to infiltrate the muscularis externa layer of patients with CD and UC, as well as in the normal intestine. The results are presented in Figure 6 and summarized in Table 10. Based on semi-quantitative analysis, it was found that C5aR has a significantly higher expression in the intestine of patients with CD (P <0.01) and UC (P < 0.05) compared to the normal intestine in the entire intestinal wall, for example, the cumulative score in the three intestinal layers (mucosa, submucosa and external muscularis).

Tabla 10. Resumen de la expresión de C5aR en el intestino de pacientes con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa en com aración con el intestino normal.Table 10. Summary of C5aR expression in the intestine of patients with Crohn's disease and ulcerative colitis compared to the normal intestine.

Claims (17)

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo que se une al segundo bucle extracelular de C5aR humano, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR1, una de CDR2 y una de CDR3, en donde dichas secuencias de CDR comprenden las secuencias SEQ ID NO: 9, 10 y 11, respectivamente, y en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR1, una de CDR2 y una de CDR3, en donde dichas secuencias de CDR comprenden las secuencias SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 12, y en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 16.1. An antibody that binds to the second extracellular loop of human C5aR, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence of CDR1, one of CDR2 and one of CDR3, wherein said sequences of CDR comprise the sequences SEQ ID NO: 9, 10 and 11, respectively, and wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence of CDR1, one of CDR2 and one of CDR3, wherein said CDR sequences comprise the sequences SEQ ID NO: 13, 14 and 15, respectively, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 90% identical to SEQ ID NO: 12, and wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence at least 90% identical to SEQ ID NO: 16. 2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 94 % idéntica a la SEQ ID NO: 12 y en donde la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 94 % idéntica a la SEQ ID NO: 16. 2. The antibody according to claim 1, wherein the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 94% identical to SEQ ID NO: 12 and wherein the variable region of the light chain of said antibody comprises a sequence at least 94% identical to SEQ ID NO: 16. 3. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el anticuerpo se selecciona entre: 3. The antibody according to any of the previous claims, wherein the antibody is selected from: a. un anticuerpo en dondeto. an antibody where i. la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SeQ ID NO: 12 yi. the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SeQ ID NO: 12 and ii. la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 16,ii. the light chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO: 16, yY b. un anticuerpo en dondeb. an antibody where i. la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 39 yi. the variable region of the heavy chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO: 39 and ii. la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende una secuencia al menos un 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 40.ii. the light chain of said antibody comprises a sequence at least 96, 97, 98 or 99% identical to SEQ ID NO: 40. 4. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el anticuerpo se selecciona entre: 4. The antibody according to any of the previous claims, wherein the antibody is selected from: a. un anticuerpo en dondeto. an antibody where i. la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende la secuencia identificada por la SEQ ID NO: 12 yi. the variable region of the heavy chain of said antibody comprises the sequence identified by SEQ ID NO: 12 and ii. la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende la secuencia identificada por la SEQ ID NO: 16,ii. the light chain of said antibody comprises the sequence identified by SEQ ID NO: 16, yY b. un anticuerpo en dondeb. an antibody where i. la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende la secuencia identificada por la SEQ ID NO: 39 yi. the variable region of the heavy chain of said antibody comprises the sequence identified by SEQ ID NO: 39 and ii. la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende la secuencia identificada por la SEQ ID NO: 40.ii. the light chain of said antibody comprises the sequence identified by SEQ ID NO: 40. 5. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el anticuerpo es capaz de desplazar a C5a en un ensayo de centelleo por proximidad (SPA), con una CI50 inferior a 10 nM.5. The antibody according to any of the previous claims, wherein the antibody is capable of displacing C5a in a scintillation proximity assay (SPA), with an IC50 of less than 10 nM. 6. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el anticuerpo inhibe o reduce significativamente la unión de C5a a C5aR.The antibody according to any of the previous claims, wherein the antibody significantly inhibits or reduces the binding of C5a to C5aR. 7. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde al anticuerpo inhibe significativamente la migración de neutrófilos humanos in vitro.The antibody according to any of the previous claims, wherein the antibody significantly inhibits the migration of human neutrophils in vitro. 8. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el anticuerpo reduce la migración a menos del 20 % en comparación con el nivel de migración observada en presencia de C5a 10 nM y sin anticuerpo.8. The antibody according to any of the previous claims, wherein the antibody reduces migration to less than 20% compared to the level of migration observed in the presence of 10 nM C5a and without antibody. 9. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el anticuerpo tiene una región bisagra Fc del isotipo IgG1.The antibody according to any of the previous claims, wherein the antibody has an IgG1 isotype Fc hinge region. 10. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la región Fc tienen una afinidad de unión reducida a uno o más receptores de Fcy en comparación con secuencias de referencia de IgG1tal como se definen por la SEQ ID NO 33.10. The antibody according to any of the previous claims, wherein the Fc region has a reduced binding affinity to one or more Fcy receptors compared to IgG1tal reference sequences as defined by SEQ ID NO 33. 11. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el anticuerpo no induce significativamente la ADCC, la CDC y/o la fagocitosis de neutrófilos in vitro. The antibody according to any of the previous claims, wherein the antibody does not significantly induce ADCC, CDC and / or neutrophil phagocytosis in vitro. 12. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la región Fc es un muíante de Fc de IgG1 que comprende de 1 a 5 sustituciones de aminoácidos en AA 328 a 334, en donde la secuencia de referencia de Fc de IgG1 Fc es tal como se define en la SEQ ID NO. 33.12. The antibody according to any of the previous claims, wherein the Fc region is an IgG1 Fc mutant comprising 1 to 5 amino acid substitutions in AA 328 to 334, wherein the IgG1 Fc reference sequence Fc is as defined in SEQ ID NO. 33. 13. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la región Fc es IgG 1 (SEQ ID NO: 33) con uno o más de los siguientes grupos de mutaciones puntuales13. The antibody according to any of the previous claims, wherein the Fc region is IgG 1 (SEQ ID NO: 33) with one or more of the following groups of point mutations a. N297Q y/oto. N297Q and / or b. L234A y L235E y/ob. L234A and L235E and / or c. G236R y L328R y/oc. G236R and L328R and / or d. N297Q, L234A y L235E y/od. N297Q, L234A and L235E and / or e. N297Q, L234A, L235E y G237A y/oand. N297Q, L234A, L235E and G237A and / or f. L234A, L235E, G237A, A330S y P331S.F. L234A, L235E, G237A, A330S and P331S. 14. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la región Fc es IgG 1 (SEQ ID NO: 33) con las siguientes mutaciones puntuales: L234A, L235E, G237A, A330S y P331S.14. The antibody according to any of the previous claims, wherein the Fc region is IgG 1 (SEQ ID NO: 33) with the following point mutations: L234A, L235E, G237A, A330S and P331S. 15. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.The antibody according to any of the previous claims, wherein the antibody is a human antibody. 16. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas para uso en medicina.16. The antibody according to any of the previous claims for use in medicine. 17. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 16 para el tratamiento de una enfermedad o trastorno inmunológico, tal como la artritis reumatoide (AR), artritis psoriásica, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis por lupus, enfermedad inflamatoria del intestino (EII) o síndrome del intestino irritable. The antibody for use according to claim 16 for the treatment of an immune disease or disorder, such as rheumatoid arthritis (RA), psoriatic arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), lupus nephritis, inflammatory bowel disease ( IBD) or irritable bowel syndrome.