ES2831014T3 - Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades mediadas por la vía de señalización del complejo NRP-1/OBR - Google Patents

Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades mediadas por la vía de señalización del complejo NRP-1/OBR Download PDF

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Abstract

Un antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR para usar en el tratamiento de una enfermedad que se selecciona del grupo que consiste en cánceres, obesidad y enfermedades relacionadas con la obesidad, caquexia, anorexia, enfermedad renal obstructiva ureteral, enfermedades autoinmunitarias y enfermedades infecciosas en un sujeto que lo necesita, en donde el antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos que tienen la capacidad de bloquear la interacción entre NRP-1 y OBR o la capacidad de bloquear la interacción entre NRP-1 y Leptina.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades mediadas por la vía de señalización del complejo NRP-1/OBR
Campo:
La presente descripción se refiere a métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades mediadas por la vía de señalización del complejo NRP-1/OBR.
Antecedentes:
Subsecuentemente se ha demostrado que la neuropilina-1 (NRP-1), un receptor transmembrana que desempeña un papel central en el desarrollo neuronal (Fujisawa y otros, 1995) participa, además, en el desarrollo de los vasos sanguíneos como un correceptor para dos tipos diferentes de ligandos, la familia semaforina (SEMA) de moduladores de la guía de axones y la familia de estimuladores de angiogénesis del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), respectivamente. NRP-1 necesita formar complejos con receptores pertenecientes a la familia de la plexina, que sirven como elemento transductor de señales para la repulsión axonal y el colapso de los conos de crecimiento neuronal después de la unión de SEMA al complejo NRP-1/plexina (He y Tessier-Lavigne, 1997). NRP-1 interactúa, además, con los receptores de VEGF (VEGFR) y forma un complejo que puede activarse con VEGF-A165 para la angiogénesis normal del desarrollo (Soker y otros, 1998). Además, se ha demostrado que NRP-1 desempeña un papel crítico en la regulación del sistema inmunitario al modular las interacciones entre las células dendríticas y las células T en la periferia y entre los timocitos y las células epiteliales del timo en el timo (Tordjman y otros, 2002). (Lepelletier y otros, 2007). Entre estas funciones fisiológicas normales, NRP-1 participa, además, en la fisiopatología. Por ejemplo, NRP-1 es un receptor del virus HTLV-1 (Ghez y otros, 2006). Además, se acumulan datos que muestran que NRP-1 está involucrado en la oncogénesis (Soker y otros, 2001; Ellis y otros, 2006), pero su papel es aún controvertido. SEMA inhibe el crecimiento celular y disminuye la supervivencia celular al inducir la actividad de PTEN, un inhibidor de la vía PI3cinasa (Cantly y otros, 1999), mientras que VEGF juega un papel opuesto al competir con SEMA por unirse a NRP-1 y proporcionar señalización para la proliferación celular y la supervivencia a través del complejo NRP-1/VEGFR (Bachelder y otros, 2003; Narazaki y Tosato, 2006). En algunas células cancerosas, incluidas las células de cáncer de mama, la expresión de NRP-1 aumenta la proliferación celular y la invasividad a través de mecanismos que no necesariamente involucran ni SEMA ni VEGF, lo que sugiere que ligandos y/o receptores alternativos pueden usar NRP-1 como un correceptor. (Figel y otros, 2008).
La leptina es una pequeña proteína no glicosilada que se expresa no solo en los adipocitos benignos de origen primario sino también en las células cancerosas (Clin Cancer Research 2004). OBR es el receptor de leptina. Se ha demostrado que la leptina regula la expresión génica. Se identificaron más de 64 genes, incluidos los del crecimiento, los reguladores del ciclo celular, de las proteínas de la matriz extracelular y el gen asociado con la metástasis (J of Endocrinol 2008; EBM 2008). La obesidad se considera un riesgo para muchos cánceres. Los niveles séricos de leptina suelen estar elevados en personas obesas. La leptina actúa como agente mitógeno en muchos tejidos; por lo tanto, puede actuar para promover el crecimiento de células cancerosas. De hecho, se demostró que la leptina actúa como un factor de crecimiento para las células del cáncer de próstata in vitro, que induce una mayor migración de las células del cáncer de próstata y la expresión de factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-pl) y el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), y que potencia el crecimiento del cáncer de próstata. Se ha demostrado recientemente que la leptina promueve la diferenciación de las células T cooperadoras 1 (Th1) y modula el inicio y la progresión de las respuestas autoinmunitarias en varios modelos animales de enfermedad. Si el papel de la leptina es fundamental en enfermedades autoinmunitarias mediadas por Th1 o en enfermedades inflamatorias, tales como el síndrome inflamatorio del intestino, entonces puede anticiparse un efecto terapéutico al bloquear la acción de la leptina periférica. Además, se ha demostrado que la leptina está involucrada en la patogénesis de la artritis reumatoide y en el desarrollo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo de ratón para la esclerosis múltiple. En consecuencia, los inhibidores de la vía de señalización de la leptina son muy convenientes para fines terapéuticos.
La existencia del complejo NRP1/OBR/leptina se informó en Olivier Hermine, "La neuropiline, un nouveau co-récepteur de la leptine" el 1 de enero de 2013 (ANR - Agence Nationale de la Recherche).
El documento núm. US 2013/259858 describe un método para tratar el cáncer de mama mediante la predicción del resultado del tratamiento con Her2 mediante la determinación, entre otros, del nivel de expresión de NRP-1.
Se informó que NRP-1 no solo se asocia a la oncogénesis, sino, además, con la malignidad del cáncer de ovario, y esta molécula es un candidato para el tratamiento de las neoplasias malignas de ovario (Baba, Tsukasa, y otros "Neuropilin-1 promotes unlimited growth of ovarian cancer by evading contact inhibition." Gynecologic oncology 105.3 (2007): 703-711).
Resumen:
La presente invención se refiere a un antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR para usar en el tratamiento de una enfermedad que se selecciona del grupo que consiste en cánceres, obesidad y enfermedades relacionadas con la obesidad, caquexia, anorexia, enfermedad renal obstructiva ureteral, enfermedades autoinmunes y enfermedades infecciosas en un sujeto que lo necesita, en donde el antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos que tienen la capacidad de bloquear la interacción entre NRP-1 y OBR o la capacidad de bloquear la interacción entre NRP-1 y Leptina. En particular, la presente invención se define por las reivindicaciones.
Descripción detallada:
Varios estudios han demostrado la implicación de neuropilina-1 (NRP-1) en la progresión tumoral independientemente de sus correceptores conocidos y ligandos afines. Sobre la base de las conexiones crecientes entre el cáncer de mama y la obesidad, y la Leptina y su receptor OBR implicados en este proceso, los inventores postularon que NRP-1 es una nueva diana para el tratamiento del cáncer de mama y, por extensión, de otro cáncer en el que estén implicados OBR y Leptina. Además, la inhibición de la interacción de v Eg F (por ejemplo, con Avastin) con su receptor afín y NRP-1 puede favorecer el aumento de la señalización con Leptina con el complejo de receptor NRP-1/OBR, lo que da como resultado un aumento de metástasis y acortamiento de la supervivencia global.
Mediante el uso de un modelo bien descrito de líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB231 (NRP-1 positivo y OBR positivo) y T47D (OBR bajo y NRP-1 negativo) transducido por shNRP-1 o ADNc que codifica para NRP-1, los inventores demostraron que:
- 1) La Leptina in vitro disminuyó la proliferación celular y aumentó la migración y estos efectos dependieron de la expresión de NRP-1. Los estudios in vivo en modelos de xenoinjerto, ya sea por sobreexpresión de NRP-1 en T47D o por silenciamiento de NRP-1 en MDA-MB231, igualmente mostraron una correlación entre la expresión de NRP-1 y la infiltración de los ganglios linfáticos y esta infiltración aumentó con el tratamiento tumoral con leptina. - 2) NRP-1 forma un complejo con OBR
- 3) la formación del complejo NRP-1/OBR depende de la leptina
- 4) translocación al núcleo del complejo NRP-1/OBR
- 5) la formación del complejo NRP-1/OBR y la translocación nuclear dependen de la fosforilación de NRP-1 y OBR por la Serina/Treonina Proteína quinasa CK2 (CK2). Esto se confirmó por la inhibición de CK2 por 3 compuestos químicos diferentes (TBB, DRB y CX4945) y por el silenciamiento del ARN que evitó no solo la fosforilación de NRP-1 y OBR sino también la formación y la translocación nuclear del complejo NRP-1/OBR.
- 6) Como otros ligandos NRP-1 conocidos (VEGF, Sema3A, TGFp y PDGF), NRP-1 se une directamente a la leptina e induce la oligomerización de OBR tras la unión de la leptina a OBR. La oligomerización da como resultado un aumento de la señalización de OBR. Este último resultado muestra que la leptina puede identificarse como un verdadero ligando de NRP-1 para prevenir su unión, como fue el caso de VEGF y SEMA para bloquear la metástasis inducida por el complejo NRP-1/OBR.
En consecuencia, la caracterización del complejo NRP-1/OBR y su translocación nuclear arrojaron luz sobre una función eventual de NRP-1 como factor de transcripción o activador ya que los inventores detectaron el complejo NRP-1/OBR en el núcleo y el análisis Chip-Seq de NRP-1 de la muestra generada a partir de MDA-MB-231 permitió identificar genes implicados en el metabolismo, en la respuesta de las células inmunitarias y en la metástasis del cáncer de mama y con secuencias enriquecidas que contienen ARN polimerasa II (Pol2) y sitios de unión a factores de transcripción. Esto se confirmó por la detección de la interacción NRP-1 y Pol2.
El nuevo complejo NRP-1/OBR, su fosforilación por CK2, su identificación como receptor nuclear y la asociación de NRP-1 con la ARN polimerasa II abren así un amplio campo de investigación para la comprensión del metabolismo y los trastornos asociados al metabolismo, principalmente la obesidad y la anorexia, lo que da lugar así a nuevas estrategias terapéuticas tales como el uso de inhibidores de CK2.
Por consiguiente, un primer aspecto de la presente descripción se refiere a un método para tratar una enfermedad que se selecciona del grupo que consiste en cánceres, obesidad y enfermedades relacionadas con la obesidad, caquexia, anorexia, enfermedad renal obstructiva ureteral, enfermedades autoinmunitarias y enfermedades infecciosas en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de la vía de señalización de NRP-1/OBR.
Como se usa en la presente descripción, los términos "tratamiento", y "tratar" se refieren a revertir, aliviar, inhibir el progreso de una enfermedad o trastorno como se describe en la presente descripción, o retrasar, eliminar o reducir la incidencia o aparición de un trastorno o enfermedad como se describe en la presente descripción, en comparación con lo que se produciría en ausencia de la medida tomada. Los términos "profilaxis" o "uso profiláctico" y "tratamiento profiláctico" como se usan en la presente descripción, se refieren a cualquier procedimiento médico o de salud pública cuyo propósito es prevenir una enfermedad. Como se usa en la presente descripción, los términos "prevenir", y "prevención" se refieren a la reducción del riesgo de adquirir o desarrollar una afección determinada, o la reducción o inhibición de la recurrencia o dicha afección en un sujeto que no está enfermo, pero que ha estado o puede estar cerca de un sujeto con la enfermedad.
El término "obesidad" se refiere a una afección caracterizada por un exceso de grasa corporal. La definición operativa de obesidad se basa en el Índice de Masa Corporal (IMC), que se calcula como el peso corporal dividido entre la estatura en metros cuadrados (kg/m2). La obesidad se refiere a una afección por la cual un sujeto por lo demás sano tiene un IMC mayor o igual a 30 kg/m2, o una afección por la cual un sujeto con al menos una comorbilidad tiene un IMC mayor o igual a 27 kg/m2. Un "sujeto obeso" es un sujeto por lo demás sano con un IMC mayor o igual a 30 kg/m2 o un sujeto con al menos una comorbilidad con un BMI mayor o igual a 27 kg/m2. Un "sujeto en riesgo de obesidad" es un sujeto por lo demás sano con un IMC de 25 kg/m2 hasta menos de 30 kg/m2 o un sujeto con al menos una comorbilidad con un IMC de 25 kg/m2 hasta menos de 27 kg/m2. Los mayores riesgos asociados con la obesidad pueden ocurrir con un IMC más bajo en personas de ascendencia asiática. En los países de Asia y Asia-Pacífico, incluido Japón, la "obesidad" se refiere a una afección en la que un sujeto con al menos una comorbilidad inducida por la obesidad o relacionada con la obesidad que requiere reducción de peso o que mejoraría con la reducción de peso, tiene un IMC mayor o igual a 25 kg/m2. Un "sujeto obeso" en estos países se refiere a un sujeto con al menos una comorbilidad inducida por obesidad o relacionada con la obesidad que requiere reducción de peso o que mejoraría con la reducción de peso, con un IMC mayor o igual a 25 kg/m2. En estos países, un "sujeto en riesgo de obesidad" es una persona con un IMC de más de 23 kg/m2 hasta menos de 25 kg/m2.
El método descrito en la presente descripción es particularmente adecuado para el tratamiento profiláctico de trastornos relacionados con la obesidad.
El término "enfermedades relacionadas con la obesidad" abarca los trastornos que se asocian con la obesidad, se deben a ella o resultan de ella. Ejemplos de trastornos relacionados con la obesidad incluyen comer en exceso y bulimia, diabetes, hipertensión, concentraciones elevadas de insulina en plasma y resistencia a la insulina, dislipidemia, hiperlipidemia, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de endometrio y cáncer de colon, enfermedad cardíaca, trastornos cardiovasculares, arritmias y ritmos cardíacos anormales, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, cardiopatía coronaria, angina de pecho, infarto cerebral, trombosis cerebral y ataque isquémico transitorio y osteoartritis. Otros ejemplos incluyen afecciones patológicas que muestran una actividad metabólica reducida o una disminución del gasto energético en reposo como porcentaje de la masa total libre de grasa. Otros ejemplos de trastornos relacionados con la obesidad incluyen el síndrome metabólico, también conocido como síndrome X, síndrome de resistencia a la insulina, diabetes tipo II, alteración de la glucosa en ayunas, alteración de la tolerancia a la glucosa, inflamación, tal como inflamación sistémica de la vasculatura, aterosclerosis, hipercolesterolemia, hiperuricemia, así como resultados secundarios de la obesidad tales como la hipertrofia ventricular izquierda. Los trastornos relacionados con la obesidad incluyen, además, las anomalías hepáticas asociadas con la obesidad, como la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), una causa creciente de cirrosis asociada con la obesidad y el síndrome metabólico. De hecho, la NAFLD puede presentarse como esteatosis simple o evolucionar hacia inflamación y esteatohepatitis (NASH), con un 20 % de riesgo de cirrosis después de 20 años. La "dislipidemia" es un factor de riesgo importante para la enfermedad coronaria (CHD). Los niveles plasmáticos bajos de colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL) con niveles normales o elevados de colesterol de baja densidad (LDL) son un factor de riesgo significativo para desarrollar aterosclerosis y enfermedad arterial coronaria asociada en humanos. La dislipidemia se asocia a menudo con la obesidad.
Como se usa en la presente descripción, el término "cáncer" tiene su significado general en la técnica e incluye, pero no se limita a, tumores sólidos y tumores de transmisión hemática. El término cáncer incluye enfermedades de la piel, tejidos, órganos, huesos, cartílagos, sangre y vasos. El término "cáncer" abarca, además, cánceres tanto primarios como metastásicos. Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse mediante métodos y composiciones de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, células cancerosas de vejiga, sangre, huesos, médula ósea, cerebro, mama, colon, esófago, gastrointestinales, encía, cabeza, riñón, hígado, pulmón, nasofaringe, cuello, ovario, próstata, piel, estómago, testículos, lengua o útero. Además, el cáncer puede ser específicamente del siguiente tipo histológico, aunque no se limita a estos: neoplasia, maligna; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de células gigantes y fusiformes; carcinoma de células pequeñas; carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma de células basales; carcinoma de la raíz del pelo; carcinoma de células transicionales; carcinoma de células papilares transicionales; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma combinados; adenocarcinoma trabecular; carcinoma adenoide quístico; adenocarcinoma en pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, poliposis intestinal familiar; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma branquiolo-alveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma cortical suprarrenal; carcinoma endometroide; carcinoma de apéndice cutáneo; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células en anillo de sello; carcinoma ductal infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobulillar; carcinoma inflamatorio; enfermedad mamaria de Paget; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor del estroma ovárico, maligno; coma, maligno; tumor de células de la granulosa, maligno; y roblastoma, maligno; carcinoma de células de Sertoli; tumor de células de Leydig, maligno; tumor de células lipídicas, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extramamario, maligno; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanótico; melanoma de extensión superficial; melanoma maligno en nevo pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrosarcoma; histiocitoma fibroso, maligno; mixosarcoma; liposarcoma; leiomiosarcoma; rabdomiosarcoma; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor mixto, maligno; tumor mixto mulleriano; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma; mesenquimoma maligno; tumor de Brenner, maligno; tumor filodes, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario; teratoma, maligno; estruma ovárico, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiosarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; linfangiosarcoma; osteosarcoma; osteosarcoma yuxtacortical; condrosarcoma; condroblastoma, maligno; condrosarcoma mesenquimatoso; tumor óseo de células gigantes; sarcoma de Ewing; tumor odontogénico, maligno; odontosarcoma ameloblástico; ameloblastoma maligno; fibrosarcoma ameloblástico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; tumor neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebeloso; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurógeno olfatorio; meningioma maligno; neurofibrosarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de células granulares, maligno; linfoma maligno; Enfermedad de Hodgkin; Linfoma de Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno, linfocítico pequeño; linfoma maligno, de células grandes, difuso; linfoma maligno folicular; micosis fungoides; otros linfomas no Hodgkin especificados; histiocitosis maligna; mieloma múltiple; sarcoma de mastocitos; enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células de linfosarcoma; leucemia mieloide; leucemia basófila; leucemia eosinofílica; leucemia monocítica; leucemia de mastocitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; y leucemia de células pilosas.
"Enfermedades autoinmunitarias" en el contexto de la presente descripción, se refiere a enfermedades que surgen de una respuesta inmunitaria sobreactiva del cuerpo contra sustancias y tejidos normalmente presentes en el cuerpo. En otras palabras, el cuerpo ataca a sus propias células o componentes. El sistema inmunitario confunde alguna parte del cuerpo con un patógeno y lo ataca. Esto puede estar restringido a ciertos órganos (por ejemplo, en tiroiditis) o involucrar un tejido particular en diferentes lugares (por ejemplo, enfermedad de Goodpasture que puede afectar la membrana basal tanto en el pulmón como en el riñón). El tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias es típicamente con medicación inmunosupresora que disminuye la respuesta inmunitaria. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias incluyen, entre otras, sarcoidosis, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn (uno de los dos tipos de enfermedad inflamatoria intestinal idiopática "IBD"), dermatomiositis, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, Síndrome de Guillain-Barré (GBS), enfermedad de Hashimoto, hidradenitis supurativa, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso sistémico, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, miastenia gravis, miositis, narcolepsia, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, soriasis, artritis, psoriásica, polimiositis, cirrosis biliar primaria, policondritis recidivante, artritis reumatoide, esclerosis sistémica, arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes"), colitis ulcerativa (uno de los dos tipos de enfermedad intestinal inflamatoria idiopática "IBD"), vasculitis, granulomatosis de Wegener.
Las enfermedades infecciosas típicas incluyen, pero no se limitan a, enfermedades infecciosas crónicas y con mayor preferencia, infecciones virales, por ejemplo, herpes (HSV), VIH, hepatitis B, hepatitis C, etc., infecciones bacterianas intracelulares, por ejemplo, tuberculosis, salmonelosis, listeriosis, etc., e infecciones parasitarias, por ejemplo, malaria, leismaniasis, esquistosomiasis.
Como se usa en la presente descripción, el término "NRP-1" tiene su significado general en la técnica y se refiere a Neuropilina-1. Las neuropilinas son receptores de quinasas no tirosina de 120 a 130 kDa. Hay múltiples variantes de empalme de NRP-1 y NRP-2 e isoformas solubles. La estructura básica de las neuropilinas comprende cinco dominios: tres dominios extracelulares (ala2, blb2 y c), un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. El dominio ala2 es homólogo al complemento de los componentes C1r y C1s (CUB), que generalmente contiene cuatro residuos de cisteína que forman dos puentes disulfuro. El dominio blb2 es homólogo a los factores de coagulación V y VIII. La porción central del dominio c se designa como MAM debido a su homología con las proteínas meprina, AS y receptor tirosina fosfotasa m. Los dominios ala2 y blb2 son responsables de la unión del ligando, mientras que el dominio c es crítico para la homodimerización o heterodimerización.
Como se usa en la presente descripción, el término "OBR" tiene su significado general en la técnica y se refiere al receptor de leptina también conocido como LEPR y CD295. El receptor transmembrana humano tiene al menos cuatro isoformas diferentes con diferentes dominios citoplasmáticos del extremo C-terminal (Barr y otros, 1999, J. Biol. Chem.
274 (30): 21416-21424). La forma completa de ObR (ObR1) tiene 1165 aminoácidos de longitud y contiene dominios extracelulares, transmembrana e intracelulares. El dominio extracelular se une al ligando, mientras que la cola intracelular recluta y activa sustratos de señalización.
Tal como se usa en la presente descripción, el término "complejo NRP-1/OBR" se refiere al complejo resultante de la heterodimerización entre NRP-1 y OBR como se describe en el EJEMPLO. La formación del complejo está mediada por la unión de leptina a OBR y NRP-1. La formación del complejo NRP-1/OBR y la translocación nuclear dependen de la fosforilación de NRP-1 y OBR por la Serina/treonina Proteína quinasa CK2. Como se describe en el EJEMPLO, el complejo NRP-1/OBR se transloca al núcleo e interactúa con la ARN polimerasa II (RNApol2) para desencadenar la expresión de varios genes. En particular, en las células cancerosas, el complejo desencadena la expresión de genes implicados en la metástasis del cáncer. Todos los efectos mediados por la formación del complejo NRP-1/OBR se denominan "vía de señalización NRP-1/OBR/Leptina".
El término "antagonista de la vía de señalización de NRP-1/OBR" significa cualquier compuesto que atenúe la transducción de señales mediada por la formación del complejo NRP-1/OBR como se describe en el EJEMPLO. En particular, el antagonista de la vía de señalización de NRP-1/OBR es un compuesto que inhibe, reduce, anula o de otra manera reduce la formación de dicho complejo. En otros términos, el antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR es un compuesto que inhibe, reduce, anula o de otra manera reduce la vía de señalización desencadenada por la formación del complejo. Tal inhibición puede resultar donde: (i) el antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR descrita en la presente descripción se une a NRP-1 u OBR sin desencadenar la transducción de señales, para reducir o bloquear la formación del complejo NRP-1/OBR; (ii) el antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR inhibe la estabilidad del complejo NRP-1/OBR al impedir la fosforilación mediada por la proteína quinasa CK2; o (iii) el antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR se une a, o inhibe de otra manera la actividad de, una molécula que forma parte de una cadena reguladora que, cuando no se inhibe, da como resultado estimular o facilitar la señal de transducción mediada por el complejo n RP-1/OBR.
En una modalidad, el agente es un anticuerpo. En particular, la presente descripción abarca anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que tienen la capacidad de bloquear la interacción entre NRP-1 y OBR o la interacción entre NRP-1 y leptina. Los anticuerpos pueden tener especificidad para NRP-1 u OBR. En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se dirigen a todo o a una parte del dominio extracelular de OBR. En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se dirigen a un dominio extracelular de NRP-1 u OBR. Más particularmente, la presente descripción proporciona un anticuerpo o parte del mismo capaz de inhibir la unión de OBR y/o NRP-1, cuyo anticuerpo se une a un epítopo ubicado dentro de una región de o Br o NRP-1, cuya región de OBR se une a NRP- 1. Más particularmente, la presente descripción proporciona un anticuerpo o parte del mismo capaz de inhibir la unión de NRP-1 a OBR y/o leptina, cuyo anticuerpo se une a un epítopo ubicado dentro de una región de NRP-1, cuya región de NRP-1 se une a OBR y/o a leptina.
En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, la parte del anticuerpo comprende una cadena ligera del anticuerpo. En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, la parte del anticuerpo comprende una cadena pesada del anticuerpo. En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, la parte del anticuerpo comprende una parte Fab del anticuerpo. En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, la parte del anticuerpo comprende una parte F(ab')2 del anticuerpo. En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, la parte del anticuerpo comprende una parte Fc del anticuerpo. En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, la parte del anticuerpo comprende una parte Fv del anticuerpo. En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, la parte del anticuerpo comprende un dominio variable del anticuerpo. En una modalidad de los anticuerpos o partes de los mismos descritos en la presente descripción, la parte del anticuerpo comprende uno o más dominios CDR del anticuerpo.
Como se usa en la presente descripción, "anticuerpo" incluye tanto anticuerpos de origen natural como no natural. Específicamente, "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos monovalentes y divalentes de los mismos. Además, "anticuerpo" incluye anticuerpos quiméricos, anticuerpos totalmente sintéticos, anticuerpos monocatenarios y fragmentos de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o no humano. Un anticuerpo no humano puede humanizarse mediante métodos recombinantes para reducir su inmunogenicidad en el hombre.
Normalmente, los anticuerpos se preparan de acuerdo con la metodología convencional. Los anticuerpos monoclonales pueden generarse mediante el uso del método de Kohler y Milstein (Nature, 256:495, 1975). Para preparar anticuerpos monoclonales útiles en la presente descripción, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado a intervalos adecuados (por ejemplo, dos veces por semana, semanalmente, dos veces al mes o mensualmente) con formas antigénicas de NRP-1 u OBR. Al animal se le puede administrar un "refuerzo" final de antígeno dentro de una semana antes del sacrificio. A menudo es conveniente usar un adyuvante inmunológico durante la inmunización. Los adyuvantes inmunológicos adecuados incluyen adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, alumbre, adyuvante Ribi, Titermax de Hunter, adyuvantes de saponina tales como QS21 o Quil A, u oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen CpG. Otros adyuvantes adecuados se conocen bien en el campo. Los animales pueden inmunizarse por vía subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intranasal u otras vías. Un animal dado puede inmunizarse con múltiples formas del antígeno por múltiples vías.
Brevemente, NRP-1 u OBR recombinantes pueden proporcionarse mediante expresión con líneas celulares recombinantes, en particular en forma de células humanas que expresan NRP-1 u o Br en sus superficies. Pueden proporcionarse formas recombinantes de OBR o NRP-1 mediante el uso de cualquier método descrito previamente. Se sigue el régimen de inmunización, se aíslan linfocitos del bazo, ganglio linfático u otro órgano del animal y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada mediante el uso de un agente tal como polietilenglicol para formar un hibridoma. Después de la fusión, las células se colocan en medios permisivos para el crecimiento de hibridomas, pero no de las parejas de fusión, mediante el uso de métodos estándar, como se describe (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3ra edición, Academic Press, Nueva York, 1996). Después del cultivo de los hibridomas, los sobrenadantes celulares se analizan para detectar la presencia de anticuerpos de la especificidad deseada, es decir, que se unen selectivamente al antígeno. Las técnicas analíticas adecuadas incluyen ELISA, citometría de flujo, inmunoprecipitación y transferencia Western. Otras técnicas de cribado se conocen bien en el campo. Las técnicas preferidas son aquellas que confirman la unión de anticuerpos a antígenos conformacionalmente intactos, plegados de forma nativa, tales como ELISA no desnaturalizante, citometría de flujo e inmunoprecipitación.
De manera significativa, como se conoce bien en la técnica, solo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está involucrada en la unión del anticuerpo a su epítopo (ver, en general, Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., Nueva York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7ta Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones Fc' y Fc, por ejemplo, son efectores de la cascada del complemento, pero no están involucradas en la unión al antígeno. Un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región pFc', o que se ha producido sin la región pFc', denominado fragmento F(ab')2, conserva ambos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo intacto. De manera similar, un anticuerpo a partir del cual se ha escindido enzimáticamente la región Fc, o que se ha producido sin la región Fc, denominado fragmento Fab, conserva uno de los sitios de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. En lo adelante del proceso, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una porción de la cadena pesada del anticuerpo denominada Fd. Los fragmentos Fd son el principal determinante de la especificidad del anticuerpo (un único fragmento Fd puede asociarse con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd conservan la capacidad de unión al epítopo en aislamiento.
Dentro de la parte de unión al antígeno de un anticuerpo, como se conoce bien en la técnica, existen regiones determinantes de complementariedad (CDR), que interactúan directamente con el epítopo del antígeno, y regiones marco (FR), que mantienen la estructura terciaria del paratopo (ver, en general, Clark, 1986; Roitt, 1991). Tanto en el fragmento Fd de cadena pesada como en la cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG, hay cuatro regiones marco (FR1 a FR4) separadas respectivamente por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDRS). Las CDR, y en particular las regiones de CDRS, y más particularmente las CDRS de cadena pesada, son en gran parte responsables de la especificidad del anticuerpo.
Ahora está bien establecido en la técnica que las regiones no CDR de un anticuerpo de mamífero pueden reemplazarse con regiones similares de anticuerpos conespecíficos o heteroespecíficos y se conserva la especificidad epitópica del anticuerpo original. Esto se manifiesta con la mayor claridad en el desarrollo y uso de anticuerpos "humanizados" en los cuales las CDR no humanas se unen covalentemente a regiones FR y/o Fc/pFc 'humanas para producir un anticuerpo funcional.
En ciertas modalidades, esta descripción proporciona composiciones y métodos que incluyen formas humanizadas de anticuerpos. Como se usa en la presente descripción, "humanizado" describe anticuerpos en donde algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de las regiones CDR se reemplazan con los correspondientes aminoácidos derivados de moléculas de inmunoglobulina humana. Los métodos de humanización incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las patentes de Estados Unidos núms. 4,816,567,5,225,539,5,585,089,5,693,761,5,693,762 and 5,859,205. Las patentes de Estados Unidos núms. 5,585,089 y 5,693,761, y WO 90/07861 proponen, además, cuatro criterios posibles que pueden usarse en el diseño de anticuerpos humanizados. La primera propuesta fue para un aceptor, usa un marco de una inmunoglobulina humana particular que sea inusualmente homóloga a la inmunoglobulina del donante a humanizar, o usa un marco de consenso de muchos anticuerpos humanos. La segunda propuesta fue que, si un aminoácido en el marco de la inmunoglobulina humana es inusual y el aminoácido donante en esa posición es típico de las secuencias humanas, entonces el aminoácido donante puede seleccionarse en lugar del aceptor. La tercera propuesta fue que en las posiciones inmediatamente adyacentes a las 3 CDR en la cadena de inmunoglobulina humanizada, el aminoácido donante puede seleccionarse en lugar del aminoácido aceptor. La cuarta propuesta fue usar el aminoácido donante que reside en las posiciones del marco en las que se predice que el aminoácido tiene un átomo de cadena lateral dentro de 3A de las CDR en un modelo tridimensional del anticuerpo y se predice que es capaz de interactuar con las CDR. Los métodos anteriores son meramente ilustrativos de algunos de los métodos que un experto en la técnica podría emplear para preparar anticuerpos humanizados. Un experto en la técnica estará familiarizado con otros métodos para la humanización de anticuerpos.
En una modalidad de las formas humanizadas de los anticuerpos, algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de las regiones CDR se han reemplazado con aminoácidos de moléculas de inmunoglobulina humana pero donde algunos, la mayoría o todos los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR no están alterados. Se permiten pequeñas adiciones, deleciones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos siempre que no anulen la capacidad del anticuerpo para unirse a un antígeno dado. Las moléculas de inmunoglobulina humana adecuadas incluirían moléculas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. Un anticuerpo "humanizado" conserva una especificidad antigénica específica similar a la del anticuerpo original. Sin embargo, mediante el uso de ciertos métodos de humanización, la afinidad y/o la especificidad de unión del anticuerpo puede aumentarse mediante el uso de métodos de "evolución dirigida", como describen Wu y otros, /. Mol. Biol. 294:151, 1999.
Pueden prepararse, además, anticuerpos monoclonales completamente humanos al inmunizar ratones transgénicos para grandes porciones de loci de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana. Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 5,591,669, 5,598,369, 5,545,806, 5,545,807, 6,150,584. Estos animales se han modificado genéticamente de modo que existe una deleción funcional en la producción de anticuerpos endógenos (por ejemplo, murinos). Los animales se modifican adicionalmente para contener todo o una parte del locus del gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana, de modo que la inmunización de estos animales dará como resultado la producción de anticuerpos completamente humanos contra el antígeno de interés. Después de la inmunización de estos ratones (por ejemplo, XenoMouse (Abgenix), ratones HuMAb (Medarex/GenPharm)), pueden prepararse anticuerpos monoclonales de acuerdo con la tecnología estándar de hibridomas. Estos anticuerpos monoclonales tendrán secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina humana y, por lo tanto, no provocarán respuestas de anticuerpos humanos anti-ratón (KAMA) cuando se administren a seres humanos.
Existen, además, métodos in vitro para producir anticuerpos humanos. Estos incluyen la tecnología de presentación de fagos (Patentes de Estados Unidos núms. 5,565,332 y 5,573,905) y la estimulación in vitro de células B humanas (Patentes de Estados Unidos núms. 5,229,275 y 5,567,610).
Así, como resultará evidente para un experto en la técnica, la presente descripción proporciona, además, fragmentos F(ab')2 Fab, Fv y Fd; anticuerpos quiméricos en los cuales las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se reemplazaron por secuencias homólogas humanas o no humanas; anticuerpos quiméricos del fragmento F(ab')2 en los cuales las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se reemplazaron por secuencias homólogas humanas o no humanas; anticuerpos de fragmentos Fab quiméricos en los cuales las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se reemplazaron por secuencias homólogas humanas o no humanas; y anticuerpos de fragmentos Fd quiméricos en los cuales las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 se reemplazaron por secuencias homólogas humanas o no humanas. La presente descripción incluye, además, los denominados anticuerpos monocatenarios.
Las diversas moléculas y fragmentos de anticuerpo pueden derivarse de cualquiera de las clases de inmunoglobulinas comúnmente conocidas, incluidas, entre otras, IgA, IgA secretora, IgE, IgG e IgM. Las subclases de IgG son, además, bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.
En otra modalidad, el anticuerpo de acuerdo con la presente descripción es un anticuerpo de dominio único. El término "anticuerpo de dominio único" (sdAb) o "VHH" se refiere al dominio variable de cadena pesada única de anticuerpos del tipo que puede encontrarse en mamíferos Camélidos que carecen naturalmente de cadenas ligeras. Estos VHH se denominan, además, "nanobody®". De acuerdo con la presente descripción, sdAb puede ser particularmente sdAb de llama.
En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. El término "anticuerpo biespecífico" tiene su significado general en la técnica y se refiere a cualquier anticuerpo que consiste en un sitio de unión para un primer antígeno diana y un segundo sitio de unión para un segundo antígeno diana. En particular, un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente descripción consiste en un sitio de unión para NRP-1 y un segundo sitio de unión para OBR. Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (ver, por ejemplo, Milstein y otros, 1983, Nature 305:537-39). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. Se describen procedimientos similares en la Publicación Internacional núm. WO 93/08829, y en Traunecker y otros, 1991, EMBO J. 10:3655-59. Otros ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen los acopladores de células T biespecíficos (BiTE) que son una clase de anticuerpos monoclonales biespecíficos artificiales. Los BiTE son proteínas de fusión que constan de dos fragmentos variables de cadena única (scFv) de diferentes anticuerpos, o secuencias de aminoácidos de cuatro genes diferentes, en una única cadena peptídica de aproximadamente 55 kilodaltons. Otros anticuerpos biespecíficos son los que se describen en el documento WO2006064136. En particular, el anticuerpo biespecífico es un formato Fab que se describe en el documento núm. WO2006064136 que comprende un VH o VHH específico para NRP-1 y un VH o VHH específico para OBR.
En algunas modalidades, los antagonistas de la presente descripción se usan en combinación con un agente quimioterapéutico para el tratamiento del cáncer. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluido el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, cloofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos como los antibióticos enedina (por ejemplo , calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma ll y calicheamicina omega ll; dinemicina, incluida dinemicina A; bisfosfonatos, como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y antiobióticos cromóforos relacionados con cromoproteína enedina, aclacinomisinas, actinomicina, autrarnicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluye morfolinodoxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxi-doxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas como mitomicina, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptotozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; Complejo de polisacárido PSK); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel y doxetaxel; clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; complejos de coordinación de platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (por ejemplo, CPT-1 1); inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); retinoides tales como el ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad suficiente del antagonista de la presente descripción para tratar las enfermedades con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico.
Se entenderá que el médico que trata decidirá el uso diario total de los compuestos de la presente descripción dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis específico terapéuticamente eficaz para cualquier sujeto particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la enfermedad que se trata y la gravedad del trastorno; actividad del compuesto específico que se emplea; la composición específica que se emplea, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el momento de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción del compuesto específico que se emplea; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o en coincidencia con el compuesto específico que se emplea; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, es correcto dentro del conocimiento de la técnica comenzar con dosis del compuesto a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado. Sin embargo, la dosis diaria de los productos puede variar en un amplio intervalo de 0,01 a 1000 mg por adulto por día. Típicamente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al sujeto a tratar. Un medicamento contiene típicamente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferentemente de 1 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Normalmente se suministra una cantidad eficaz del fármaco a un nivel de dosificación de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por día, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal por día.
Los antagonistas de la presente descripción se administran como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para formar una composición farmacéutica.
Como se usa en la presente descripción, el término "farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción contraria cuando se administran a un mamífero, especialmente a un ser humano, según sea apropiado. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a un sólido, semisólido o líquido de relleno, diluyente, material de encapsular o auxiliar de formulación no tóxica de cualquier tipo.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el suministro de compuestos de la presente descripción y los métodos para su preparación serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.
En las composiciones farmacéuticas de la presente descripción para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local o rectal, el principio activo (es decir, un antagonista de la presente descripción), solo o en combinación con otro principio activo, puede administrarse en forma de administración unitaria, como una mezcla con soportes farmacéuticos convencionales, a animales y a seres humanos. Las formas de administración unitaria adecuadas comprenden formas de vía oral tales como comprimidos, cápsulas de gel, polvos, gránulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administración sublingual y bucal, aerosoles, implantes, formas de administración subcutánea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, transdérmica, intratecal e intranasal y rectal.
En particular, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede inyectarse. Éstas pueden ser, en particular, soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que tras la adición, en dependencia del caso, de agua estéril o suero fisiológico, permiten la constitución de soluciones inyectables.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma tiene que ser estéril y ser fluida en la medida en que sea fácil para la jeringa. Tiene que ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y tiene que preservarse de la acción contaminante de microorganismos, como bacterias y hongos.
Las soluciones que comprenden compuestos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezcladas adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Pueden prepararse, además, dispersiones en glicerol, polietilenglicol líquido y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Los antagonistas de la presente descripción pueden formularse en una composición en forma neutra o en forma de sal como se describió anteriormente.
El portador puede ser, además, un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación de los antagonistas de la presente descripción en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diversos ingredientes activos estériles en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada y filtrada del mismo.
Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero además, pueden emplearse cápsulas de liberación de fármacos y similares.
Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero debe hacerse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que pueden emplearse a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y agregarse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto. Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación en dependencia de la condición del sujeto que se trata. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.
Los antagonistas de la presente descripción pueden formularse dentro de una mezcla terapéutica para que comprendan aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos, o aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, o aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis más o menos. También pueden administrarse dosificaciones múltiples.
Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tales como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; formulaciones liposomales; cápsulas de liberación prolongada; y cualquier otra forma en uso actualmente.
En algunas modalidades, el antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR se combina con un agente anti-VEGF del tratamiento del cáncer.
Como se usa en la presente descripción, un "agente anti-VEGF" se refiere a una molécula que inhibe la angiogénesis, vasculogénesis o permeabilidad vascular indeseable mediada por VEGF. Por ejemplo, un agente terapéutico anti-VEGF puede ser un anticuerpo u otro antagonista del VEGF. Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que se une a VEGF con suficiente afinidad y especificidad para ser útil en un método de la presente descripción. Un anticuerpo anti-VEGF normalmente no se unirá a otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C, u otros factores de crecimiento como P1GF, PDGF o bFGF. Un anticuerpo anti-VEGF preferido es un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epítopo que el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por hibridoma ATCC® HB 10709 y es un anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad. Un "anticuerpo anti-VEGF de alta afinidad" tiene al menos una afinidad 10 veces mejor por VEGF que el anticuerpo monoclonal anti-VEGF A4.6.1. Preferentemente, el anticuerpo anti-VEGF es un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con el documento núm. WO 98/45331, que incluye un anticuerpo que comprende las CDR o las regiones variables de Y0317. Con mayor preferencia, el anticuerpo anti-VEGF es el fragmento de anticuerpo conocido como ranibizumab (LUCENTIS®). El anticuerpo anti-VEGF ranibizumab es un fragmento Fab humanizado anti-VEGF humano madurado por afinidad. El ranibizumab se produce mediante métodos de tecnología recombinante estándar en el vector de expresión de E. coli y fermentación bacteriana. El ranibizumab no es glicosilado y tiene una masa molecular de -48 000 daltons. Ver los documentos núms. WO98/45331 y US 2003/0190317. Los agentes anti-VEGF incluyen, entre otros, bevacizumab (rhuMab VEGF, Avastin®, Genentech, South San Francisco Calif.), Ranibizumab (rhuFAb V2, Lucentis®, Genentech), pegaptanib (Macugen®, Eyetech Pharmaceuticals, Nueva York NY), maleato de sunitinib (Sutent®, Pfizer, Groton Conn.)
La descripción se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente descripción.
Figuras:
Figura 1: Detección de NRP-1/OBR endógeno en una línea celular de cáncer de mama. A-Detección de ARNm de NRP-1 y OBR en células positivas a MDA-MB231 en comparación con células negativas a T47D. B. Detección del complejo NRP-1/OBR mediante tecnología de ensayo de ligadura de proximidad (PLA: Duolink) en la célula completa (punto rojo) y en el núcleo (punto blanco: fusión entre el punto rojo y dapi) http://www.olink.com/products/duolink/how-use-du-olink. Detección del complejo NRP-1/OBR después de la sobreexpresión de n RP-1 en células T47Dneg solas o con sobreexpresión de OBR: una detección muy baja del complejo NRP-1/OBR en condición de vector vacío (pcDNA3). Un aumento de la detección del complejo NRP-1/o Br cuando NRP-1 se sobreexpresa solo (pcDNA3-NRP-1) o con OBR (pcDNA3NRP-1/OBR). Ningún cambio en la sobreexpresión de OBR solo en comparación con el vector vacío, que indica la especificidad de la señal del complejo NRP-1/OBR. D. Detección de NRP-1/OBR por coinmunoprecipitación: en la fracción citoplasmática (C) y en la fracción nuclear (N) en MDA-MB231 en comparación con T 470.
Figura 2. El complejo NRP-1/OBR depende de la actividad de la proteína quinasa CK2: A. NRP-1 y OBR son ambos sustratos de la holoenzima CK2: la fosforilación in vitro de NRP-1 recombinante de longitud completa y la longitud OBR indican que la subunidad CK2p es indispensable para la actividad CK2. B- Detección de la interacción de la subunidad NRP-1 y CK2p: Mediante el uso de la tecnología PLA, los datos in vitro que muestran la implicación de la subunidad CK2p en la fosforilación de NRP-1 por CK2 se confirman en parte en células MDA-MB231 mediante la detección de la interacción de CK2p con n RP-1 como lo indica el duolink (punto blanco). C. Inhibición de NRP-1/OBR por CX4945, el inhibidor competitivo de ATP de CK2 (Ensayo clínico fase II): el tratamiento con MDA-MB231 con CX4945 (5 pM) durante 4 h induce una disminución en la detección del complejo NRP-1/OBR por PLA (punto rojo) y su localización nuclear (punto blanco) bajo la estimulación de leptina (10 nM). D- inhibición del NRP-1/OBR por el silenciamiento simultáneo de la expresión de CK2a y CK2a' mediante el uso de ARNip que confirma la implicación de CK2 en la formación y localización nuclear del complejo NRP-1/OBR.
Figura 3. Formación del complejo NRP1/OBR inhibida por dos inhibidores alostéricos de la proteína quinasa CK2 en fibroblasto cutáneo de donante sano y paciente anoréxico. El complejo NRP-1/OBR (punto rojo) se detecta mediante la tecnología de ensayo de ligadura de proximidad (PLA o Duolink). Las células se cultivaron en DMEM más 20 % de suero fetal bovino piruvato de sodio L-Glutamato y penicilina y estreptomicina. Las células se trataron o no con inhibidor D3.1 o M4 CK2 durante 4 horas. Las células se lavaron con PBS1X y se fijaron con acetona helada y se rehidrataron con PBS antes de bloquearlas y teñirlas con una anti leptina humana generada en cabra y anti-neurofilina-1 generada en conejo y anti-receptor de leptina OBR generado en ratón. La leptina se detectó mediante el uso de un burro y una cabra Alexa 488 (verde) y n RP-1 y OBR con anti conejo-PLA menos y anti ratón-PLA plus como se describe en el enlace indicado anteriormente. El complejo NRP-1/OBR se inhibe por el tratamiento con D3.1 y M4. El D3.1 parece más eficiente. Curiosamente, la Leptina también se inhibe por inhibidores de CK2.
Figura 4. Detección de leptina y complejo NRP-1/OBR en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del paciente anoréxico: se detectan la leptina y el complejo NRP-1/OBR en PBMC recién aisladas de sangre total heparinizada mediante el uso de centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll. Como se observó en la línea celular de cáncer de mama de células MDA-MB231 y en fibroblastos de donante sano y paciente anoréxico, el complejo NRP-1/OBR se detecta en el núcleo. Células. El complejo NRP1/OBR se detecta, además, en macrófagos de donantes sanos (datos no mostrados). Como se propone en la patente, NRP-1/OBR podría ser un objetivo en la falla del sistema inmunitario que implica la exacerbación de la vía de señalización de leptina y NRP-1/OBR.
Figura 5. Confirmación de interacciones NRP-1, OBR y leptina mediante el uso de una tecnología de Interferometría de Biocapa (BLI) (http://www.fortebio.com/bli-technology.html): La interacción A-Leptina (OB) con OBR se utiliza como un control positivo. La neuropilina-1 humana (hNRP-1) interactúa con la OBR humana con una alta afinidad y específicamente con la leptina humana (hOB) pero no con la leptina murina (mOB). La unión de VEGF165 a hNRP-1 se usa como control positivo. La asociación de B-leptina y Avastin aumenta la transmigración de células MDA-MB231 a través del inserto de poro de 80 ym. El tratamiento con Avastin puede prevenir un control de retroalimentación negativa por VEGF de la vía de señalización proangiogénica de la leptina. VEGF se une a OBR, lo que confirma nuestra hipótesis de que debe investigarse más.
Ejemplo: 1: Neuropilina-1 (NRP-1) induce metástasis de cáncer de mama a través de sus nuevos socios Complejo Leptina/OBR: Identificación de NRP-1 nuclear asociado a secuencias de genes con ARN polimerasa II y sitio de unión al factor de transcripción
Implicación in vitro e in vivo de NRP-1 y leptina en la migración de líneas celulares de cáncer de mama
Las primeras líneas de células de cáncer de mama MBA-MB-231 y T47D se seleccionaron por su expresión alta e indetectable de NRP-1, respectivamente, y la expresión del receptor de leptina (OBR). Con el fin de investigar la asociación de NRP-1 y Leptina en la migración de la línea celular de cáncer de mama, nosotros procedimos al silenciamiento de la expresión de NRP-1 en MDA-MB-231 mediante el uso de enfoques de ARNip o ARNhc o sobreexpresión de NRP-1 en T47D. En contraste con varios datos publicados, nosotros no pudimos observar la proliferación de MDA-MB-231 y T47D-NRP-1 bajo estimulación con Leptina. Sorprendentemente, la represión de NRP-1 por silenciamiento de ARN induce la proliferación de MDA-MD-231. En contraste, la Leptina indujo una migración de MDA-MB-231 que disminuyó en condiciones de siNRP-1. Los datos in vitro se confirmaron in vivo mediante xenoinjertos MDA-MB-231 y T47D en ratones Nude. La modulación de la expresión de NRP-1 por silenciamiento de ARNhc en MDA-MB-231 o por sobreexpresión en T47D indujo un aumento de la proliferación y una disminución de la infiltración de los ganglios linfáticos por MDA-MB-231-shNRP-1 y una disminución de la proliferación y un aumento de la infiltración de los ganglios linfáticos por T47D-NRP-1-RFP en ratones tratados con Leptina.
La leptina induce la formación del complejo NRP-1/OBR que da como resultado la oligomerización de OBR (Duolink, HTRF y BRET) y la translocación nuclear del complejo.
Para confirmar una asociación directa de NRP-1 y leptina en la migración de células de cáncer de mama, nosotros investigamos la interacción NRP-1 y OBR mediante el uso de tecnología de ensayo de ligadura de proximidad (Duolink) en MDA-MB-231 y en T47D-NRP-1. Dado que OBR es un miembro de la familia de receptores de citocinas de clase I, nos preguntamos si la formación del complejo NRP-1/OBR puede o no estar modulado por Leptina. Esta cuestión se investigó de forma endógena en MDA-MB-231 o mediante transfección transitoria de T47D por NRP-1 o por NRP-1/OBR u OBR solo. Después de 24 h de transfección, las células se privaron de suero durante 16 h y luego se estimularon con Leptina (10 nM). Después de 3 h, se detuvo la estimulación al retirar el medio, las células primero se lavaron y luego se fijaron y se analizó la formación del complejo NRP-1/OBR mediante el ensayo de ligadura de proximidad in situ (PLA) Duolink y mediante detección por microscopía confocal. La colocalización se analizó mediante el uso del software JACoP (ImageJ; National Institutes of Health, Bethesda, MD). La colocalización entre moléculas se indicó por un coeficiente de Pearson positivo (r). En primer lugar, la expresión de NRP-1 en T47D transfectado se confirmó mediante RT-PCR. NRP-1 forma un complejo con OBR endógeno como lo muestra la detección de Duolink como un punto rojo en las células transfectadas con pcDNA3-NRP-1. La señal de Duolink aumentó en el T47D cotransfectado con NRP-1 y OBR. Las señales de Duolink en T47D transfectado con el vector vacío pcDNA3 o con el vector que expresa OBR fueron similares. Se observan los mismos resultados en MDA-MB-231. Sorprendentemente, la señal de Duolink se detectó en el núcleo como se muestra en un punto blanco. Mediante el uso del kit de fraccionamiento de proteínas subcelulares, mediante transferencia Western se analizó la localización de NRP-1 y OBR en citoplasma (C), membrana (M), en el extracto nuclear total (N) o en la fracción nuclear soluble (SN) y fracciones unidas a cromatina (CB) en lisado total o después de la coinmunoprecipitación. La pureza de la fracción se evaluó mediante la detección de proteínas específicas de cada fracción tales como Hsp90 para la fracción C, SP1 y HDAC2 para las fracciones SN y CB y específicamente la Calreticulina para el retículo endoplásmico (ER) con el fin de detectar cualquier contaminación por la fracción de membrana del ER en las fracciones nucleares. Como se sospechaba, OBR coinmunoprecipitó con NRP-1 en la fracción citoplasmática (C) y nuclear (N) de MDA-MB-231 pero no en T47D. Así como OBR fosforilado (P-OBR), se detectó NRP-1 en la fracción citoplasmática y en las fracciones nucleares SN y CB de MDA-MB-231 sin suero durante 16 horas y estimulado con 10 nM de Leptina durante 3 horas a 37 °C. P-OBR y NRP-1 coinmunoprecipitaron en las fracciones nucleares, y aumentan con la estimulación con leptina como se observa por microscopía confocal.
La formación del complejo NRP-1/OBR y su translocación nuclear implican la fosforilación de NRP-1 por la proteína quinasa CK2.
Además de la modulación de la formación del complejo NRP-1/OBR por la fosforilación de leptina y OBR, postulamos una posible fosforilación de NRP-1 que puede regular la translocación del complejo al núcleo. Se han informado dos sitios de fosforilación putativos de NRP-1 sin más investigación. El primero en el dominio B extracelular según lo informado por Shintani y otros en 2009 sin anticuerpos disponibles y el segundo en el Treonina 916 ubicado en el dominio citoplasmático como lo informaron Kyle y otros en 2011. Dado que un anticuerpo específico contra P-NRP-1 en el T916 estaba disponible, nosotros investigamos por coinmunoprecipitación la detección de P-NRP-1 en MDA-MB-231 después de la privación del suero y la estimulación por Leptina (10 nM). Sorprendentemente, NRP-1 se fosforila tras la estimulación con Leptina y se localiza en el núcleo en la fracción soluble o en la fracción unida a cromatina con P-OBR. Para confirmar este estado de fosforilación, nosotros investigamos la posible implicación de una serina/treonina quinasa CK2 mediante el uso de uno de sus primeros inhibidores químicos (DRB). En condiciones de privación de suero, se detectó P-NRP-1 como una mancha polarizada en el citoplasma y el núcleo de MDA-MB-231. Curiosamente, en el MDAMB-231 estimulado con Leptina (10 nM), se detectó P-NRP-1 como tinción difusa en el núcleo. El tratamiento con DRB (50 pM) de células estimuladas con Leptina condujo no sólo a la inhibición de la tinción nuclear difusa de P-NRP-1 sino, además, a la disminución de la mancha polarizada de P-NRP-1 observada en células no estimuladas. La inhibición fue específica ya que, en la condición estimulada combinada con DMSO a la misma dilución de DRB, nosotros pudimos observar una tinción nuclear difusa de P-NRP-1.
La fosforilación de NRP-1 por CK2 se confirmó in vitro mediante el uso de proteína recombinante y 32P-ATP. En contraste con la forma soluble de NRP-1 (datos no mostrados), sólo la longitud completa de NRP-1 se fosforiló de una manera dependiente de CK2a y CK2p. Dado que la fosforilación de NRP-1 parece ser inducida no solo con CK2 sino, además, en respuesta a la estimulación con Leptina, nosotros nos preguntamos si la estabilidad del complejo NRP-1/OBR puede verse afectada, además, por la inhibición de CK2.
La investigación se evaluó en MDA-MB-231 transfectado de manera estable con el plásmido shNRP-1 de expresión lentiviral y en T47D transducido de manera estable con el vector de expresión retroviral para NRP-1-RFP estimulado o no con Leptina combinada o no con inhibidores de CK2 (DRB o TBB).
Como se intentó, el complejo NRP-1/OBR se detectó mediante microscopía confocal después de un ensayo de ligadura de proximidad (PLA) Duolink in situ en MDA-MB-231 estimulado con Leptina (10 nM). Esta detección se observó, además, en MDA-MB-231-shGFP, pero mucho menos en MDA-MB-231-shNRP-1, lo cual confirma la asociación de NRP-1 con OBR. Curiosamente, la formación del complejo NRP-1/OBR se inhibió por inhibidores de CK2, pero no por DMSO. Se observó el mismo efecto sobre la formación del complejo NRP-1/OBR en T47D transducido de forma estable con NRP-1-RFP.
Los resultados se confirmaron al silenciar las subunidades de CK2 mediante ARNip en MDA-MB-231. Como se observó en el tratamiento con TBB y DBB, una disminución de la expresión de CK2 indujo una disminución de la formación del complejo NRP-1/OBR en MDA-MB-231-siCK2a y MDA-MB-231-siCK2a' pero no en MDA-MB-231-wt ni en MDA-MB --231-siGFP.
Dado que tanto la formación del complejo NRP-1/OBR como la fosforilación de NRP-1 fueron abolidas por la inhibición de CK2, nosotros supusimos que la vía de señalización de OBR podría verse afectada, además, por la inhibición de CK2. Como se sospechaba, la Leptina indujo un aumento de la fosforilación de OBR y STAT3 en las fracciones citoplasmáticas y nucleares que se inhibió por el tratamiento con TBB de una manera dependiente de la dosis.
El análisis Chip-Seq de NRP-1 de la muestra generada a partir de MDA-MB-231 y el análisis del transcriptoma de los extractos de ARN del xenoinjerto T47D-NRP-1 permitieron identificar genes implicados en la metástasis del cáncer de mama con secuencias que contienen el sitio de unión de la ARN polimerasa II y factores de transcripción y expresión aumentados respectivamente.
Sobre la base de la detección de NRP-1 en el núcleo y especialmente en la fracción unida a la cromatina, nosotros realizamos un Chip-Seq en MDA-MB-231 de privado de suero por 16 h y tratado con dosis crecientes de Leptina (0,2 y 10 nM) durante 3 horas. El ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se realizó con EZ-Magna ChIPTM A mediante el uso de un anti-NRP-1 policlonal purificado generado en conejo (un generoso obsequio del equipo de Alex Kolodkin). Las muestras se diseñaron de la siguiente manera: la mezcla de entrada comprende la entrada de células no estimuladas (NS), células estimuladas con 2 nM de Leptina y células estimuladas con 10 nM de Leptina. Para el control de IgG, nosotros analizamos una mezcla de chip con IgG control de NS, células estimuladas con 2 nM de leptina y células estimuladas con 10 nM de Leptina. El análisis Chip-Seq puede resumirse en 1) mapeo de lecturas en el genoma completo de Homo Sapiens (GRCh37), 2) detección de picos y cobertura mediante la detección de picos en el genoma de referencia y el cálculo de su cobertura en lecturas mapeadas consistió en encontrar una región enriquecida en una de las muestras IP (NS, 2 nM y 10 nM de leptina) pero ausente en ambas muestras de control (mezcla de entrada y mezcla de IgG) y 3) normalización y comparación de bibliotecas. Los números y porcentajes de lecturas mapeadas para cada biblioteca fueron 23226278 (79,66 %) para la muestra de NS Chip, 25247 185 (76,13 %) para la muestra de Chip de 2 nM y 29694919 (75,27 %) para la muestra chip de 10 nM. La detección de picos se realizó con el software SEQMONK. Se detectaron un total de 20 495 picos y se anotaron con el gen más cercano ubicado dentro de los 10 kb de cada pico. Nosotros detectamos 3844 picos a una distancia > 10 kb de un gen, 13893 picos superpuestos a un gen, 1336 picos aguas abajo de un gen <10 kb y 1422 picos aguas arriba de un gen > 10 kb. Curiosamente, el número de picos detectados aumentó con la concentración de Leptina. Nosotros consideramos 3181 genes encontrados en las anotaciones de los 20495 picos de todas las muestras. Luego nosotros mapeamos este conjunto de genes a la base de datos de términos de Gene Ontology (GO) and Pathways de la base de datos Reactome, y extraemos los 50 términos y vías más representados de estas bases de datos. Más interesante aún, se sabe a nivel mundial que las vías identificadas implican a la Leptina y a NRP-1 como la transducción de señales, el metabolismo, el sistema inmunitario, la guía de axones y el metabolismo de los lípidos.
Mediante el uso de datos ENCODE en el sitio web de UCSC, nosotros comparamos el Chip-Seq de NRP-1 con los factores de transcripción Chip-Seq informados. Las secuencias emparejadas llevaron a identificar una secuencia de unión de 140 factores de transcripción además de la ARN polimerasa II (Pol2). Las principales secuencias enriquecidas que se superponen al sitio de inicio de los genes son las que contienen el sitio de unión de factores de transcripción que se sabe que forman un complejo con Pol2, tal como CTCF, o aquellas que se sabe que se asocian entre sí, tales como c-Myc y Max. Curiosamente, el recuento de la secuencia aumentó con la estimulación con Leptina pero con el máximo alcanzado a 2 nM de Leptina pero sin un aumento significativo entre 2 nM y 10 nM de Leptina. La detección de la secuencia de unión de Pol2 planteó la interrogante de si NRP-1 forma un complejo con Pol2. Mediante el uso de un anticuerpo contra un dominio carboxi-terminal (CTD) de Pol2, nosotros pudimos confirmar una interacción entre NRP-1 y RNA Pol2 como lo muestra el ensayo de ligadura de proximidad Duolink in situ con la señal creciente en MDA-MB- 231 estimulada con 10 nM de Leptina en comparación con células no estimuladas. Los resultados de Duolink se confirmaron mediante la coinmunoprecipitación de Pol2 con NRP-1 mediante el uso de un anti-NRP-1 policlonal generado en conejo.
Con el fin de dar un sentido a estos resultados en términos de la posible implicación de las vías de señalización NRP-1/OBR/Leptina en la inducción de las expresiones génicas implicadas en la migración celular, nosotros analizamos un transcriptoma de xenoinjertos. Aunque el Chip-Seq se realizó en MDA-MB-231, nosotros optamos por realizar un transcriptoma de T47D que sobreexpresa xenoinjertos de NRP-1-RFP en comparación con T47D-wt y T47D-RFP tratados o no con Leptina con respecto a la infiltración de ganglios linfáticos inducida por la sobreexpresión de NRP-1 y su aumento por el tratamiento con Leptina. Para determinar cualquier asociación directa de NRP-1 en la expresión génica, nosotros realizamos primero un análisis global del transcriptoma de xenoinjertos T47D-NRP-1 tratados y no tratados con Leptina (n = 8) en comparación con los xenoinjertos de T47D-wt y T47D-RFP tratados y no tratados con Leptina (n = 8). Mediante el uso de Ingenuity Pathways Analysis (IPA), 32 genes implicados en el movimiento celular, la invasión y la migración de líneas celulares de cáncer de mama aumentaron por la sobreexpresión de NRP-1 y disminuyeron 5 genes. El aumento máximo se observó para el gen de la lisil oxidasa (LOX, multiplicado por 2,46, p = 0,008) y, curiosamente, la mayoría de estos genes se enriquecieron en el Chip-Seq de MDA-MB-231 y algunos de ellos contenían picos correspondientes a la secuencia de unión del factor de transcripción como SERPINE1 (gen inhibidor del activador del plasminógeno tipo1, multiplicado por 1,64; p = 0,019) para la secuencia de unión de Pol2 y BCAR1 (gen 1 de resistencia anti estrógenos del cáncer de mama, multiplicado por 1,72; p = 0,003) para la secuencia de unión de CTCF. La disminución de la expresión génica se observa para TNFSF10 (superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando), miembro 10, disminución multiplicada por 3,05, p = 0,034) enriquecida, además, en Chip-Seq pero sin asociación de secuencia de unión al factor de transcripción. El análisis de la expresión génica en T47D-NRP-1-RFP tratado con Leptina en comparación con xenoinjertos no tratados, destacó 66 genes con 31 genes enriquecidos en Chip-Seq de MDA-MB-231 y que no se detectaron en T47D-wt y T47D-RFP tratados o no con Leptina. Solo 4 genes enriquecidos en el Chip-Seq contenían picos asociados al sitio de unión del factor de transcripción como FUS (fusionado en sarcoma, multiplicado por 1,79; p = 0,045) para Pol2 y C12orf45 (marco de lectura abierto del cromosoma 12, multiplicado por 1,29; p = 0,03) para CTCF. El Ingenuity Pathway Analysis permitió confirmar que algunos genes sobreexpresados por la expresión de NRP-1 en T47D estaban relacionados con las redes de Leptina y CK2, tales como SERPINE1, IGFBP3 y CD44. Dado que el inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI.1) relacionado con el gen SERPINE1 se ha asociado a la invasión y metástasis del cáncer de mama, nosotros evaluamos la expresión de PAI.1 mediante inmunotinción en xenoinjertos de T47D-NRP-1-RFP en comparación con T47D-wt y T47D-RFP. Curiosamente, nosotros observamos un aumento de la tinción de PAI.1 en xenoinjertos de T47D-NRP-1-RFP en comparación con T47D-wt y T47D-RFP y este aumento se correlacionó con el tratamiento con Leptina.
Sobre la base de la asociación de la sobreexpresión de NRP-1 en T47D en la infiltración de ganglios linfáticos por T47D-NRP-1-RFP y en el aumento de expresión de genes que se informa que están implicados en la infiltración de ganglios linfáticos en cáncer de mama, como N-myc 1 regulado aguas abajo (NDRG1, multiplicado por 1,81; p = 0,006) el cual también se enriqueció en Chip-Seq con picos relacionados con la secuencia de unión del factor de transcripción de CTCF y p300, nosotros evaluamos el complejo NRP-1/OBR mediante Duolink in situ Ensayo de Proximidad de ligadura en ganglio linfático infiltrado por T47D-NRP-1-RFP. Curiosamente, nosotros pudimos detectar células T47D-NRP-1-RFP como se muestra en rojo debido a la expresión de RFP en xenoinjertos tratados o no tratados con Leptina pero con un aumento de glóbulos rojos en la condición tratada. Se detectó el complejo NRP-1/OBR representado por un punto blanco; así como en células tratadas o no tratadas con localización nuclear que indica la señalización del complejo NRP-1/OBR en el ganglio linfático infiltrado.
Discusión:
Migración de cáncer de mama inducida por Neuropolina-1 e infiltración de ganglios linfáticos a través del complejo Leptina/OBR.
Varios estudios han asociado NRP-1 en la progresión tumoral y la metástasis independientemente de su ligando conocido, tales como los VEGF y las Semaforinas. Sobre la base de nuestros datos publicados sobre el papel de los adipocitos en la regulación de la granulopoyesis a través de NRP-1 y sobre la creciente conexión entre la obesidad y la progresión del cáncer, nosotros postulamos que la Leptina adipocina y su principal receptor OBR pueden ser un nuevo socio de NRP-1. Para confirmar esta hipótesis, nosotros optamos por investigar la asociación de NRP-1 y Leptina en la migración de líneas celulares de cáncer de mama. Las líneas celulares MDA-MB-231 y T47D se seleccionaron por una expresión alta e indetectable de NRP-1 respectivamente, pero que expresaban OBR a un nivel diferente.
La leptina indujo una migración in vitro de MDA-MB-231 que disminuyó por la represión de NRP-1 mediante el uso de ARNip. Lel Xu y otros informaron una evidencia directa de la regulación positiva de NRP-1 en tumores tratados con anti-VEGF (Bevacizumab). Curiosamente, la Leptina aumentó la migración de MDA-MB-231 inducida por 10 pg/ml de Bevacizumab. Esta observación puede ser una primera explicación del fracaso de la terapia del cáncer de mama (aumento de la supervivencia por progresión mientras disminuye la supervivencia general) por Bevacizumad y que fue revocado por la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos, Ee . UU.).
Esto debe investigarse más y puede ser una nueva estrategia para las terapias combinadas anti-leptina y anti-VEGF en el cáncer de mama. Como lo demuestra la infiltración de los ganglios linfáticos, la implicación de NRP-1 en la migración de la línea celular de cáncer de mama se confirmó in vivo por su sobreexpresión en líneas celulares T47D conocidas por su expresión negativa de NRP-1 y por el silenciamiento de shNRP-1 en MDA-MB-231 conocido por su alta expresión de NRP-1 y agresividad. El tratamiento con Leptina aumentó significativamente la infiltración de los ganglios linfáticos con T47D-NRP-1-RFP teñido para el KL1 humano. Sin embargo, a diferencia de MDA-MB-231-shGFP, el tratamiento con Leptina no aumentó la infiltración de los ganglios linfáticos por MDA-MB-231-shNRP-1, como se evaluó mediante tinción con KL1. Los datos in vitro e in vivo son una evidencia directa de la asociación de NRP-1 y Leptina en la migración de líneas celulares de cáncer de mama. Esta implicación de Leptina y NRP-1 concuerda con los datos publicados, pero sin asociación entre Leptina y NRP-1. Curiosamente, otros estudios en otras áreas han reportado Leptina, OBR y NRP-1 pero sin ninguna evidencia de su asociación como un complejo de señalización, por ejemplo, la expresión de Leptina y NRP-1 en un caso de neovascularización coroidea idiopática y la alteración de la expresión de n RP-1 en ratones deficientes en OBR (db/db).
La neuropilina-1 forma un complejo con OBR e induce su oligomerización a través de una unión directa de leptina a OBR y NRP-1.
Se confirmó una asociación directa de NRP-1 y leptina con las migraciones de líneas celulares de cáncer de mama mediante la detección del complejo NRP-1/Ob R en MDA-MB-231 y T47D que sobreexpresan NRP-1.
Mediante el uso de Duolink PLA, nosotros demostramos que una interacción directa, entre NRP-1 y OBR, tiene lugar bajo estimulación con Leptina en comparación con las células privadas de suero y no estimuladas. Esta observación está de acuerdo con la propiedad de OBR como miembro de la familia de receptores de citocinas de clase I, cuya dimerización depende de la unión del ligando. El complejo NRP-1/OBR se confirmó por coinmunoprecipitación de NRP-1 y OBR de manera endógena en MDA-MB-231 y en células Hela transfectadas con OBR-Gf P y/o NRP-1. La inmunoprecipitación de OBR-GFP mediante el uso de un anticuerpo anti-GFP específico condujo a la detección de NRP-1 en la condición de cotransfección de NRP-1 y OBR-GFP, pero no en células Hela transfectadas con NRP-1 solo, lo que confirma la especificidad de este complejo.
Se ha informado que NRP-1 se une directamente a VEGF y aumenta así la afinidad de unión de VEGF a su receptor VEGFR2 (ref) y Sema3A, y permite así su unión a Plexin 3A. Nuestro estudio nos llevó a resaltar un nuevo mecanismo de la función de NRP-1. Igual que VEGF y Sema3A, la leptina es capaz de unirse directamente a NRP-1 como se demuestra por HTRF y microscopía confocal. (mostrar datos de unión directa de leptina a NRP1) Sin embargo, la unión de Leptina a OBR induce la formación del complejo NRP-1/OBR que da como resultado la proximidad física entre NRP-1 y Leptina, como se demostró por la transferencia de energía de NRP-1 a leptina en Análisis de HTRF y oligomerización de OBR después de la unión de NRP-1 como se demuestra mediante análisis BRET. La represión de NRP-1 por siNRP-1 disminuyó la señal BRET y la oligomerización de OBR. La consecuencia de la oligomerización de OBR puede estar vinculada con la aceleración y el aumento de la señalización de leptina/OBR por la sobreexpresión de NRP-1 como se demostró en las células PAEC-NRP-1 en comparación con PAEC-wt. El aumento de la señalización de OBR por NRP-1 puede explicar la propiedad metastásica adquirida por T47D que sobreexpresa NRP-1 como lo demuestra la infiltración de los ganglios linfáticos y su disminución en MDA-MB-231-shNRP-1.
La formación del complejo NRP-1/OBR y su translocación nuclear dependen de la fosforilación de NRP-1 por la proteína quinasa CK2.
El ensayo Duolink PLA revelado por microscopía confocal mostró el complejo NRP-1/OBR en el núcleo representado en un punto blanco como resultado del análisis de colocalización del Duolink en el punto rojo y la tinción DAPI del núcleo mediante el uso del software Jacop. Es la primera vez que se informa que los receptores complejos de membrana se trasladan al núcleo. Este resultado sorprendente se confirmó al inhibir la exportación nuclear del complejo NRP-1/OBR mediante el uso de leptomicina B. MDA-MB-231 cotratado con leptina y leptomicina B mostró una mayor detección del complejo NRP-1/OBR por Duolink en el núcleo que MDA-MB-231 tratado con leptina sola. La localización de NRP-1 y OBR se confirmó por la detección de NRP-1 y OBR en la fracción nuclear así como en la forma soluble, no en la unida a la cromatina. Esta localización es específica ya que nosotros no detectamos calreticulina que pueda ser a partir de alguna contaminación por la membrana del retículo endoplásmico. Incluso a este nivel, no se identificó la función de NRP-1 en el núcleo, nosotros sugerimos que la translocación nuclear del complejo NRP-1/OBR debe estar regulada por su fosforilación. Como se informa en la literatura, NRP-1 puede ser una diana de CK2. Mediante el uso de inhibidores químicos de CK2 TBB o DRB, nosotros pudimos confirmar no solo que NRP-1 es una diana para la fosforilación mediada por CK2, sino que esta fosforilación era indispensable para la estabilidad del complejo NRP-1/OBR y su translocación nuclear tal como estaba demostrado mediante el uso de un anti-P-NRP-1 específico y por Duolink. La inmunotinción de P-NRP-1 muestra claramente que la translocación de NRP-1 depende de su estado fosforilado ya que en MDA-MB-231 privado de suero y sin estimular, P-NRP-1 se concentra en la periferia nuclear. En condición estimulada, nosotros podemos observar una acumulación de P-NRP-1 en el núcleo mientras que esta localización se inhibe por inhibidores de CK2.
Para confirmar la asociación de la fosforilación de NRP-1 con la formación del complejo NRP-1/OBR, nosotros probamos un inhibidor de CK2 usado en la clínica CX4945 y reprimimos las subunidades CK2a y CK2a' en MDA-MB-231 que mostraron los mismos resultados obtenidos con los inhibidores TBB y DRB. Ya se demostró que la actividad de fosforilación de CK2 está implicada en la translocación nuclear de proteínas fosforiladas con importina (ref). Podría ser el caso de NRP-1.
Neuropilin-1 Chip-Seq reveló su asociación con la ARN polimerasa II (Pol2) y los factores de transcripción CTCF y p300: ¿Es NRP-1 un factor de transcripción de un súper activador?
La asociación de NRP-1 en la migración de células de cáncer de mama in vitro e in vivo y su detección en el núcleo de MDA-MB-231 y de T47D-NRP-1-RFP y principalmente en la fracción unida a cromatina planteó la interrogante de si NRP-1 puede asociarse a secuencias de genes implicadas en el movimiento, la migración y la metástasis celular. El análisis Chip-Seq de NRP-1 mostró claramente una correlación entre la estimulación con Leptina y el aumento del número de picos, lo que confirmó la asociación de la señalización de NRP-1 y OBR. Más interesante aún, los picos enriquecidos correspondían a genes relacionados con las funciones de la Leptina, lo que puede ser otro argumento para la acción de n RP-1/OBR. La comparación de secuencias de los datos Chip-Seq de NRP-1 y los datos Chip-Seq del factor de transcripción del proyecto ENCODE permite identificar la unión de secuencias de la ARN polimerasa II (Pol2) y los factores de transcripción. Las principales secuencias enriquecidas fueron para CTCF, TPB (proteína de unión a TATA), TAF1 (factor de iniciación de la transcripción TFIID subunidad 1 o factor asociado a TBP de 250 kDa) y p300. Curiosamente, el número de secuencias enriquecidas correspondientes a la unión de CTCF aumentó aproximadamente al mismo nivel que las secuencias de unión de Pol2, lo que concuerda con los estudios ya informados que establecieron un vínculo entre Pol2 y CTCF (MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, marzo de 2007, p. 1631-1648; Nature, vol 47913 noviembre de 2011). Puede llegarse a la misma conclusión para TBP y TAF1 (ref). Todas estas observaciones nos llevaron a concluir sobre el posible papel de NRP-1 como factor de transcripción 0 factor activador o superactivador, pero se necesitan más investigaciones para confirmarlo.
El análisis del transcriptoma de T47D que sobreexpresa de forma estable NRP-1 reveló genes enriquecidos en NRP-1 Chipseq de MDA-MB-231 e implicados en el movimiento celular y la metástasis del cáncer de mama.
Se admitió claramente que la sobreexpresión de NRP-1 da como resultado tumores más grandes y motilidad celular. Sin embargo, los mecanismos moleculares asociados a la migración celular y metástasis no están completamente aclarados y también se informa la función de NRP-1 independientemente de su ligando conocido, como el VEGF. El equipo de Mikael Klagsbrun ya demostró que el aumento en la migración de células tumorales después de la sobreexpresión de NRP-1 es independiente de VEGF y ellos postularon que la sobreexpresión de NRP-1 induce genes aguas abajo que son responsables de potenciar la motilidad celular (FASEB. 2000, vol. 14).
En nuestro estudio, por sobreexpresión de NRP-1 en T47D y represión en MDA-MB-231 nosotros observamos, además, una correlación entre la expresión de NRP-1 y el aumento o disminución del volumen del tumor, respectivamente. No obstante, el xenoinjerto de NRP-1 que sobreexpresa T47D tiene una disminución del crecimiento tumoral cuando se trata con Leptina, como se observó para el MDA-MB231. Esta disminución del crecimiento tumoral inducida por el tratamiento con Leptina se acompañó de infiltración de ganglios linfáticos que no se observaron en la condición de represión de NRP-1 en MDA-MB-231-shNRP-1.
Esta observación puede llevar a la conclusión de que NRP-1 induce el crecimiento tumoral independientemente de la vía Leptina/OBR y que la señalización del complejo NRP-1/OBR favorece el movimiento celular y la inducción de la migración. La implicación de la Leptina en el crecimiento tumoral y la metástasis ya se ha estudiado, pero los datos publicados son contradictorios en dependencia del tipo de célula cancerosa y los modelos de estudio. En el modelo de cáncer de colon humano, Aparicio T y otros, han demostrado que la leptina estimula la proliferación de células de cáncer de colon in vitro, pero no promueve su crecimiento in vivo en dos modelos de xenoinjertos (Gut 2005; 54:1136-1145). En nuestro caso, la implicación de la leptina in vitro en el crecimiento celular se evaluó por diferentes métodos. Por ensayo MTT e incorporación de (H3)-timidina y por incorporación de BrdU. En todos los casos no pudimos observar un aumento significativo de la proliferación celular y esto se confirmó in vivo. Por otro lado, los estudios in vitro e in vivo demostraron claramente la migración celular inducida por leptina que fue inducida o reprimida por la sobreexpresión de NRP-1 en T47D o la represión en MDA-MB231. Sobre la base de esta observación, nosotros centramos nuestro análisis del transcriptoma en la identificación de genes que ya estaban asociados con la metástasis del cáncer de mama y la infiltración de ganglios linfáticos y que aumentan por la sobreexpresión de NRP-1 y por el tratamiento con leptina en T47D y, más esencialmente, los identificados por Análisis Chipseq de NRP-1 de MDA-MB231. Incluso el máximo de veces de aumento inducido por la sobreexpresión de NRP-1 en T47D fue 2,46, curiosamente aproximadamente el 72 % de los genes aumentados por la sobreexpresión de NRP-1 se enriquecieron con NRP-1 Chipseq y el 17 % de estos genes enriquecidos contenían secuencias correspondientes a la ARN polimerasa II (Pol2) y secuencias de unión de los factores de transcripción CTCF, Rad21, SRF, ERalpha y CEBPB. Curiosamente, ya se demostró que estos genes están modulados por leptina o por NRP-1. Por ejemplo, SERPINE1, se demostró que un gen que expresa PAI.1 (inhibidor del activador del plasminógeno-1) está regulado positivamente en las células endoteliales (Prachi Singh, BBRC, 2010) y su sobreexpresión se encontró en muchos tipos de cáncer relacionados con la obesidad y se asocia con la progresión del cáncer de mama, endometrio, colorrectal, tiroides, renal y de próstata (Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009 ver biblio 97-102). Queda por demostrar claramente la implicación de la acción del complejo NRP-1/OBR sobre la actividad del promotor SERPINE1 mediante la identificación de la secuencia esencial del complejo NRP-1/OBR en asociación con Pol2, ya que la secuencia enriquecida por NRP-1 Chipseq contenía el sitio de unión Pol2. Dos genes llamaron nuestra atención, BCAR1 (Proteína 1/p130 (Cas) de resistencia al estrógeno del cáncer de mama y PTK2 (Proteína tirosina quinasa 2) que no solo aumentan por la sobreexpresión de NRP-1 en T47D, sino que se enriquecieron por NRP-1 Chipseq con secuencias que contienen el sitio de unión del factor de transcripción de CTCF, Rad21, SRF y CEBPB. Curiosamente, se demostró que NRP-1 regula la migración quimiotáctica de células endoteliales y tumorales a través de la vía p130Cas) (Evans y otros, MOL. CÉLL. BIOL., 2011).
En conclusión, este estudio muestra claramente a NRP-1 como un nuevo correceptor de Leptina y OBRa, el descubrimiento del receptor de leptina (OBR) como un nuevo socio de NRP-1 y que este complejo se asocia con la detención del crecimiento de las células del cáncer de mama, pero con un aumento de la infiltración del ganglio linfático. Más interesante aún, este estudio destacó un papel eventual de NRP-1 y/o del complejo NRP-1/OBR como factor de transcripción o activador o superactivador en la regulación de la expresión génica al interactuar con RNAPol2 como se demuestra en la presente descripción y puede ser con otros factores de transcripción como CTCF, P300 y TAF1 que quedan por demostrar. Más interesante aún, estos nuevos datos pueden abrir un amplio campo de investigación del complejo NRP-1/OBR en cáncer, obesidad, sistema inmunitario y diabetes.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR para usar en el tratamiento de una enfermedad que se selecciona del grupo que consiste en cánceres, obesidad y enfermedades relacionadas con la obesidad, caquexia, anorexia, enfermedad renal obstructiva ureteral, enfermedades autoinmunitarias y enfermedades infecciosas en un sujeto que lo necesita, en donde el antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos que tienen la capacidad de bloquear la interacción entre NRP-1 y OBR o la capacidad de bloquear la interacción entre NRP-1 y Leptina.
2. El antagonista de la vía de señalización de NRP-1/OBR para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR se selecciona de anticuerpos dirigidos a un dominio extracelular de NRP-1 u OBR o a un dominio de Leptina.
3. El antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR se combina con un agente anti-VEGF de tratamiento del cáncer.
4. El antagonista de la vía de señalización NRP-1/OBR para usar de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el agente anti-VEGF incluye, pero no se limita a, bevacizumab, ranibizumab, pegaptanib y maleato de sunitinib.
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