ES2821375T3 - Tratamiento de afecciones respiratorias - Google Patents

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Abstract

Un reactivo de union capaz de unirse especificamente al receptor de quimiocinas CCR1 para su uso en el tratamiento de una afeccion respiratoria, en donde el reactivo de union se inmoviliza sobre un soporte solido contenido dentro de una columna de aferesis, a la que se aplica sangre periferica de un paciente, retirando asi las celulas que expresan CCR1 de la sangre periferica del paciente, en donde el reactivo de union capaz de unirse especificamente a CCR1 se selecciona de un anticuerpo y una quimiocina, en donde la quimiocina es CCL5 (RANTES).

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento de afecciones respiratorias
Campo de la invención
Las diversas realizaciones de la presente invención se refieren a productos y métodos de tratamiento de afecciones inflamatorias, tales como afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). También se describen análisis diagnósticos con fines terapéuticos.
Antecedentes de la invención
Los trastornos de las vías respiratorias, tales como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), se caracterizan normalmente por dificultad para respirar como resultado de flujo de aire reducido a los pulmones. Estos síntomas se provocan frecuentemente por inflamación de las vías respiratorias; por ejemplo, la bronquitis crónica es una forma de EPOC asociada a una excesiva inflamación de los bronquios.
Además de la dificultad para respirar, la obstrucción de las vías respiratorias y la inflamación asociada puede provocar daño pulmonar progresivo. En el caso de pacientes con EPOC, el estrechamiento permanente de las vías respiratorias puede conducir a complicaciones tales como infecciones de las vías respiratorias bajas, insuficiencia cardíaca y por último lugar insuficiencia pulmonar.
La EPOC es una enfermedad respiratoria muy común y en la mayoría de caso, el tabaco es la causa.
Los pacientes se tratan normalmente usando inhaladores que contienen fármacos "broncodilatadores". Sin embargo, estos son de uso limitado para pacientes con vías respiratorias permanentemente obstruidas y/o enfermedad terminal caracterizada por un extenso daño a los pulmones.
La aféresis es un tratamiento usado para la reducción de hemoderivados, tales como anticuerpos, lipoproteínas de baja densidad (LDL) y glóbulos sanguíneos. La leucaféresis es el tratamiento de aféresis usado para la retirada de glóbulos blancos, los leucocitos. El paciente se conecta a un sistema de circulación extracorpórea de la sangre; la sangre se saca de una vena en un brazo, pasa través de un dispositivo de columna y se devuelve en el otro brazo del paciente. El documento de patente WO2010/029317 describe columnas de aféresis útiles para tratar afecciones inflamatorias que incluyen una quimiocina inmovilizada sobre un soporte sólido.
Sumario de la invención
Las quimiocinas son una clase de moléculas de citocina implicadas en el reclutamiento y la activación celular en la inflamación. Las quimiocinas causan la quimiotaxia y la activación de diversas subpoblaciones de células en el sistema inmunitario. La actividad de las quimiocinas está mediada principalmente por la estrecha unión a sus receptores sobre la superficie de los leucocitos. En ciertas realizaciones, la presente invención se basa en la realización de que se puede explotar la interacción entre quimiocinas y las células que expresan sus receptores para el tratamiento de afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En particular, las diversas afecciones respiratorias, en particular la sarcoidosis y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), incluyen un componente inflamatorio. Mientras que la sarcoidosis se considera predominantemente una afección respiratoria, el tratamiento general de la sarcoidosis que afecta cualquier órgano del cuerpo puede ser posible dentro del alcance de las diversas realizaciones de la presente invención. Los inventores han determinado que dirigir el elevado reclutamiento de células que expresan receptores de quimiocinas específicos al sitio de inflamación presenta un nuevo enfoque terapéutico para tratar dichas afecciones. Además, en dichas afecciones, la expresión de receptores de quimiocinas en cada célula se puede aumentar otra vez proporcionando un enfoque terapéutico para tratar dichas afecciones. Se muestra en el presente documento que los sujetos que padecen afecciones respiratorias tales como la sarcoidosis presentan elevada frecuencia de células de que expresan receptores de quimiocina en la sangre periférica. Los sujetos con sarcoidosis presentan elevada frecuencia de células que expresan CCR1, tales como monocitos que expresan CCR1, en comparación con controles sanos. También se muestra en el presente documento que las células que expresan CCR1 se pueden retirar usando un reactivo de unión adecuado, en particular RANTES (en forma biotinilada) inmovilizado sobre una matriz adecuada. Similarmente, se muestra en el presente documento que los monocitos también expresan CCR2. Los monocitos que expresan CCR2 pueden ser reducidos en pacientes con sarcoidosis usando un reactivo de unión adecuado, en particular MCP-1, en forma biotinilada, inmovilizado sobre una matriz adecuada. También se muestra en el presente documento que los sujetos que padecen afecciones respiratorias tales como sarcoidosis presentan elevada frecuencia de células que expresan CCR7, tales como linfocitos que expresan CCR7, y también linfocitos T de memoria central, en comparación con controles sanos. También se muestra en el presente documento que las células que expresan CCR7 se pueden retirar usando un reactivo de unión adecuado, en particular MIP3b (en forma biotinilada) inmovilizado sobre una matriz adecuada.
Así, en ciertas realizaciones, la invención sirve para reducir el reclutamiento de leucocitos inflamatorios, que expresan receptores de quimiocinas característicos, y posiblemente expresan receptores de quimiocinas característicos a niveles elevados, hasta sitios de inflamación asociados a afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Esto se logra usando reactivos de unión específica para capturar leucocitos inflamatorios que expresan receptores de quimiocinas específicos del paciente. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la invención proporciona en un primer aspecto un método de tratamiento de afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), que comprende aplicar sangre periférica de un paciente a una columna de aféresis cargada con un soporte sólido que comprende uno o más reactivos de unión capaces de unirse específicamente a CCR1, inmovilizado directa o indirectamente sobre el soporte, retirando así las células de receptores de quimiocina que expresan CCR1 de la sangre periférica del paciente. La sangre periférica de la que se han retirado las células que expresan receptores de quimiocinas se puede devolver entonces al paciente para completar el tratamiento. La invención se puede basar así en un circuito extracorpóreo continuo en algunas realizaciones. Alternativamente, en ciertas realizaciones, la invención puede comprender etapas de obtener sangre periférica del paciente, aplicar la sangre periférica a la columna y posteriormente devolver la sangre periférica de las que se han retirado las células que expresan receptores de quimiocinas al paciente.
Como se muestra en el presente documento, se pueden inmovilizar reactivos de unión adecuados sobre un soporte sólido, ya sea directa o indirectamente, para generar una columna de aféresis adecuada para capturar células que expresan receptores de quimiocinas relevantes. Donde se observan elevados niveles de expresión de receptores de quimiocinas, dichas células se pueden retirar preferentemente de la sangre periférica usando las columnas de las diversas realizaciones de la invención. Así, los métodos de las diversas realizaciones de la invención se pueden dirigir a células CCR1 alto como se define en el presente documento para su retirada de la sangre periférica. La expresión "Alto" se puede determinar según técnicas convencionales de citometría de flujo. El nivel se mide con respecto a niveles de expresión del receptor de quimiocinas en células tomadas de un sujeto sano. La Figura 17 adjunta proporciona un ejemplo de una estrategia de apertura.
En el presente documento, referencia a CCR2, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 y/o CCR7 pretende englobar la selección de uno cualquiera o más, hasta todos, de los receptores de quimiocinas listados. Además, la combinación de CCR2, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1 y/o CXCR2 se contempla explícitamente como una agrupación separada, para incluir una cualquiera o más de CCr 2, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1 y CXCR2.
En otras realizaciones, la invención proporciona además un reactivo de unión capaz de unirse específicamente al receptor de quimiocinas CCR1, para su uso en el tratamiento de afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), en donde el uno o más reactivos de unión se inmoviliza, directa o indirectamente, sobre un soporte sólido contenido dentro de una columna de aféresis, a la que se aplica sangre periférica de un paciente, retirando así el receptor de quimiocinas CCR1, que expresa células de la sangre periférica del paciente. En ciertas realizaciones, la invención también proporciona el uso de uno o más reactivos de unión capaces de unirse específicamente al receptor de quimiocinas CCR1 para su uso en la fabricación de una columna de aféresis para el tratamiento de afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), en donde el uno o más reactivos de unión se inmoviliza sobre un soporte sólido contenido dentro de la columna de aféresis, al que se aplica sangre periférica de un paciente, retirándose así una o más de células que expresan receptores de quimiocinas CCR1 de la sangre periférica del paciente.
Todas las realizaciones descritas con respecto a los métodos de tratamiento de las diversas realizaciones de la invención se aplican a estos aspectos cambiando lo que haya que cambiar y no se repiten por motivos de brevedad. Así, la siguiente discusión hecha con referencia a las diversas realizaciones de los métodos de tratamiento también es aplicable a los aspectos de uso médico de la invención.
En ciertas realizaciones, la invención tiene como objetivo tratar una gama de afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Mediante tratamiento se indica una reducción en las células que expresan receptores de quimiocinas específicas en la sangre periférica del paciente. La reducción puede comprender una reducción en las células que expresan receptor de quimiocinas CCR1 a niveles elevados en pacientes enfermos. El paciente es normalmente un paciente humano, pero el término paciente puede incluir tanto sujetos animales humanos como no humanos en algunas realizaciones. En el contexto de las diversas realizaciones de la presente invención, esto implica una reducción en las células que expresan CCR1, tales como una o más de células que expresan CCR1alto, en la sangre periférica del paciente. Las células que expresan CCR1 comprenden, consisten esencialmente en o consisten en monocitos, macrófagos, linfocitos, en particular linfocitos T y/o eosinófilos en ciertas realizaciones. En realizaciones específicas, las células retiradas para tratar afecciones respiratorias tales como sarcoidosis comprenden monocitos, en particular monocitos que expresan CCR1.
Los monocitos se producen por la médula ósea de precursores de células madres hematopoyéticas llamadas monoblastos. Los monocitos se pueden diferenciar en macrófagos o células dendríticas. Los monocitos y su descendencia de macrófagos y células dendríticas cumplen varias funciones en el sistema inmunitario que incluyen fagocitosis, presentación de antígenos y producción de citocinas. Los monocitos se pueden caracterizar con referencia a la expresión del marcador superficial celular CD14, opcionalmente junto con CD16. Los monocitos clásicos se pueden caracterizar por la expresión de alto nivel del receptor de CD14 de la superficie celular (monocito CD14++ CD16-). Los monocitos no clásicos se pueden caracterizar por la expresión de bajo nivel de CD14 y con coexpresión adicional del receptor de CD16 (monocito CD14+CD16++). Los monocitos intermedios se pueden caracterizar por la expresión de alto nivel de CD14 y la expresión de bajo nivel de CD16 (monocitos CD14++CD16+). Los macrófagos derivan de monocitos y son los responsables de proteger los tejidos de sustancias extrañas. Son células que poseen un gran núcleo suave, una gran área de citoplasma y vesículas internas para procesar material extraño. El término "macrófago" se puede referir a una célula derivada de monocitos que expresa uno o más de los siguientes marcadores de la superficie celular CD14, CD11b, lisozima M, MAC-1/MAC-3 y CD68. El término macrófago incluye tanto macrófagos activados como no activados. Los macrófagos activados se pueden caracterizar por la expresión de uno o más de CD69, ENG, FCER2 e IL2RA, HLA-DR, CD86. Los macrófagos no activados no han recibido todavía las señales de activación mediante, por ejemplo, receptores de TLR y, por tanto, expresan menos marcadores de activación sobre la superficie celular que se correlaciona con menor maduración. Los macrófagos M1 se pueden caracterizar por la expresión de uno o más de CD16+CD32+CD64+ y secretan principalmente IL-23 y IL-1, TNF, IL-6 y altos niveles de IL-12 y además, moléculas efectoras tales como iNOS y ROI. Los macrófagos M1 tienen características citotóxicas a diferencia de los macrófagos M2. Los macrófagos M2se pueden caracterizar por la expresión de uno o más de SRA/B+CD163+MR+CD14+ y expresan TGFp, IL-10 e IL-1Ra. Los macrófagos asociados a tumor (TAM) comparten muchas características con los macrófagos m 2 y se consideran macrófagos M2 polarizados. El paradigma M1/M2 también se pueden encontrar en subconjuntos de monocitos, donde monocitos CD14+CD16-CXC3R1bajo se consideran el subconjunto "inflamatorio" y CD14bajoCD16+CXC3R1alto son los monocitos "residentes".
Los tres tipos principales de linfocitos son linfocitos T, linfocitos B y linfocitos citolíticos espontáneos (NK). El término "linfocito T" incluye linfocitos T CD4+ tales como linfocitos T cooperadores (linfocitos Th1 y linfocitos Th2) y linfocitos T CD8+ tales como linfocitos T citotóxicos. Los linfocitos Th1 se pueden caracterizar por la expresión de CCR5 y/o por la producción de IFN-y. Los linfocitos Th2 se pueden caracterizar por la expresión de CCR3 y/o por la producción de IL-4.
Los métodos reivindicados se pueden, en particular, dirigir a eosinófilos. La eosinofilia es un componente importante de ciertas afecciones respiratorias y se puede definir como la presencia de más de 500 eosinófilos/microlitro de sangre. Así, la reducción de los números de eosinófilos circulantes representa un enfoque terapéutico importante. Los eosinófilos, o los granulocitos de eosinófilo, son glóbulos blancos y representan un componente importante del sistema inmunitario. Junto con los mastocitos, también controlan mecanismos asociados a la alergia y el asma. Son granulocitos que se desarrollan durante la hematopoyesis en la médula ósea antes de migrar a la sangre.
El nombre "eosinófilo" deriva de las propiedades eosinófilas de "afición por los ácidos" de la célula. Normalmente transparente, es esta afinidad la que provoca que parezcan rojo ladrillo después de la tinción con eosina, un colorante rojo, usando el método de Romanowsky. La tinción se concentra en pequeños gránulos dentro del citoplasma celular, que contiene muchos mediadores químicos, tales como histaminas y proteínas tales como peroxidasa de eosinófilos, ribonucleasa (RNasa), desoxirribonucleasas, lipasa, plasminógeno y proteína básica mayor. Estos mediadores son liberados por un proceso denominado desgranulación después de la activación del eosinófilo, y son tóxicos para tanto parásitos como tejidos hospedadores.
Los eosinófilos se desarrollan y maduran en la médula ósea. Se diferencian de las células precursoras de mieloide en la respuesta a las citocinas interleucina 3 (IL-3), interleucina 5 (IL-5) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF). Los eosinófilos producen y almacenan muchas proteínas de gránulos secundarios antes de su salida de la médula ósea. Después de la maduración, los eosinófilos circulan en la sangre y migran a sitios inflamatorios en tejidos en respuesta a quimiocinas tales como CCL11 (eotaxina-1), CCL24 (eotaxina-2), CCL5 (RANTES) y MCPl/4. Los eosinófilos se pueden activar por citocinas de tipo 2 liberadas de un subconjunto específico de linfocitos T cooperadores (Th2); IL-5, GM-CSF e IL-3 son importantes para la activación de eosinófilos, así como la maduración. Se ha mostrado que CD44 y CD69 representan diferentes tipos de marcadores de activación de la superficie celular para eosinófilos humanos. CD69 está ausente de eosinófilos "frescos", pero se expresa después de la activación (usando citocinas). Por otra parte, CD44 se expresa constitutivamente, pero la expresión se regula significativamente por incremento en respuesta a la activación (Matsumoto et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., Volumen 18, Número 6, junio, 1998 860-866). Los marcadores específicos de célula para eosinófilos incluyen CD9 y CDw125.
CCR2, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 y/o CCR7 expresados en estas células anteriormente mencionadas se unen a quimiocinas tales como CCL2 (se une a CCR2), CCL3, CCL5, CCL9 (se une a CCR1), CCL11 (se une a CCR3), CCL12 (se une a CCR2), CCL-14 (se une a CCR1), CCL16 (se une a CCR1), CCL28 (se une a c Cr 3), CCL24 (se une a CCR3), CCL26 (se une a c Cr 3) y/o CXCL8 (se une a CXCR1 y CXCR2). Parece que las quimiocinas MP1y (CCL9),
MRP-2 (CCL10), MIp-15 (CCL15) y CCL23 se unen a CCR1 solo.
Las quimiocinas eotaxina (CCL11) y CCL24 (eotaxina-2) solo se unen a CCR3.
La quimiocina MIP1p (CCL4) solo se une CCR5.
CXCR1 se une a CXCL6, CXCL7, CXCL8.
CXCR2 se une a CXCL1,2, 3, 5, 6, 7, 8.
CCR1 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el receptor 1 de quimiocina (motivo C-C). El ID de HGNC para este gen es 1602. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 3p21. El símbolo y nombre previo CMKBR1, SCYAR1. Sinónimos de este gen incluyen CD191, CKR-1, MIP1a R. La secuencia de referencia de Entrez Gene para CCR1 es 1230 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCR2 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el receptor 2 de quimiocina (motivo C-C). El ID de HGNC para este gen es 1603. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 3p21. El símbolo y nombre previo para el gen es CMKBR2. Sinónimos de este gen incluyen CC-CKR-2, CD192, CKR2, FLJ78302, MCP-1-R. La secuencia de referencia de NCBI es NM_001123041.2 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCR3 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el receptor 3 d quimiocina (motivo C-C). El ID de HGNC para este gen es 1604. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 3p21.3. El símbolo y nombre previo para el gen es CMKBR3. Sinónimos de este gen incluyen CC-CKR-3, CD193 y CKR3. La secuencia de referencia de Genbank para CCR3 es AF247361.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCR5 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el receptor 5 de quimiocina (motivo C-C). El ID de HGNC para este gen es 1605. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 3p21. El símbolo y nombre previo para el gen es CMKBR5. Sinónimos de este gen incluyen CC-CKR-5, CD195 CKR-5, IDDM22 y CKR5. La secuencia de referencia de Entrez Gene para CCR5 es 1234 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CXCR1 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el receptor 1 de quimiocina (motivo C-X-C). El ID de HGNC para este gen es 6026. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 2q35. El símbolo y nombre previo para el gen es CMKAR1, IL8RA, "receptor de interleucina 8, alfa". Sinónimos de este gen incluyen CD181, CDw128a, CKR-1. La secuencia de referencia de Genbank para CXCR1 es U11870.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CXCR2 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el receptor 2 de quimiocina (motivo C-X-C). El ID de HGNC para este gen es 6027. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 2q35. El símbolo y nombre previo para el gen es IL8RB, "receptor de interleucina 8, beta". Sinónimos de este gen incluyen CD182, CMKAR2. La secuencia de referencia de Genbank para CXCR2 es U11869.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCR7 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el receptor 7 de quimiocina (motivo C-C). El ID de HGNC para este gen es 1608. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q 12-q21.2. El símbolo y nombre previo para el gen es CMKBR7, EBI1. Sinónimos de este gen incluyen BLR2, CD197 y CDw197. La secuencia de referencia de RefSeq para CCR7 es NM_001838.3 como está disponible el 13 de junio de 2011.
Las diversas realizaciones de los métodos de la invención pueden implicar las interacciones de unión específica con uno cualquiera o más de estos marcadores de la superficie celular adicionales, además de la retirada basada en la unión a CCR1.
Se pueden preparar reactivos de unión adecuados para unirse específicamente a estos marcadores de la superficie celular.
El tratamiento según las diversas realizaciones de la invención puede dar como resultado el alivio o la mejora de los síntomas, la prevención de la progresión, la regresión de la afección o la recuperación completa. Los parámetros medibles del tratamiento satisfactorio incluyen uno o más, hasta todos, de la función pulmonar con espirometría, PEF, biopsia de pulmón, pulsioximetro, paO2, paCO2. En realizaciones específicas, un único tratamiento es suficiente para provocar una reducción de aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o 70 %, o más alta, hasta 80 %, 90 %, 95 % o más, o cualquier intervalo de valores entre y que incluyen estas cantidades, del receptor de quimiocinas CCR1 específico, que expresa células de la sangre periférica del paciente. En realizaciones específicas, se logra al menos aproximadamente 50 % de reducción en un único tratamiento. Así, el tratamiento satisfactorio se puede definir con referencia a la reducción de CCR1. El tratamiento puede conducir a la reducción de entre aproximadamente 100 y 500 millones de células que expresan CCR1, tales como monocitos, en ciertas realizaciones y más particularmente a aproximadamente 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 millones de células que expresan CCR1.
Por la unión a la columna mediante la interacción de reactivo de unión-receptor de quimiocinas, se inmovilizan las células que expresan los receptores de quimiocinas. Estas células inmovilizadas expresan receptores de quimiocinas no ocupados adicionales, que pueden ser del mismo tipo o diferente de los usados para la captura. Estos receptores de quimiocinas adicionales pueden permitir que quimiocinas circulantes que contribuyen a la afección inflamatoria sean capturadas de la sangre periférica. Así, una reducción en los niveles de quimiocinas circulantes (específicas) puede proporcionar una medida de tratamiento satisfactorio.
Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la duración del tratamiento y dependerá de factores tales como el caudal de sangre periférica. La duración del tratamiento puede estar vinculada a la monitorización del propio tratamiento, considerándose el tratamiento completo una vez un parámetro medible del tratamiento ha alcanzado un umbral definido. Se puede emplear cualquier parámetro adecuado como se trata en el presente documento. Así, por ejemplo, el tratamiento se puede considerar completo cuando se logra una reducción en las células que expresan CCR1, tal como un 50 % de reducción en una o más de las células que expresan CCR1. El sistema de aféresis puede funcionar a un caudal de aproximadamente 10-80 ml/min, o más específicamente entre aproximadamente 20-70 ml/min, o entre aproximadamente 30-60 ml/min. En realizaciones específicas, el tratamiento se realiza durante un periodo de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110,120, etc., minutos, o cualquier intervalo de valores entre y que incluye estas cantidades. El tratamiento normalmente no tiene como objetivo retirar todas las células que expresan el receptor de quimiocinas en la sangre periférica, ya que se requiere un nivel basal de las células en sujetos sanos. Sin embargo, se ha encontrado que solo se necesitan aplicar bajos volúmenes de sangre a las columnas de las diversas realizaciones de la invención para lograr niveles eficaces de reducción de las células que expresan receptores de quimiocinas. Así, en ciertas realizaciones, aproximadamente 10-80 % o más, específicamente aproximadamente 20, 30, 40 o 50 %, o cualquier intervalo de valores entre y que incluye estas cantidades, de la sangre del paciente se aplica a la columna en un único tratamiento. El volumen de sangre que circula a través de la columna o el sistema de aféresis puede estar en la región de aproximadamente 1000-3000 ml, tal como aproximadamente 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 o 2000 ml o cualquier intervalo de valores entre y que incluye estas cantidades. El tratamiento se puede considerar completo una vez ha circulado este volumen de sangre. Se pueden administrar anticoagulantes al paciente antes de cada sesión de tratamiento. Se puede usar una disolución adecuada, tal como una solución salina estéril, que opcionalmente incluye un anticoagulante tal como heparina, para cebar el sistema (extracorpóreo) de aféresis. Se puede añadir un volumen de anticoagulante adicional al circuito al comienzo de cada sesión de tratamiento, por ejemplo como inyección en bolo.
En ciertas realizaciones, la invención se basa en un reactivo de unión que es capaz de unirse específicamente a un receptor de quimiocinas. Esta reacción de unión específica permite retirar las células que expresan el receptor de quimiocinas de la sangre periférica del paciente cuando la sangre pasa sobre el soporte sólido sobre o dentro del cual se inmoviliza el reactivo de unión. Los receptores de quimiocinas específicos de interés incluyen CCR2, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 y/o CCR7. El reactivo de unión puede ser cualquier reactivo de unión capaz de unirse específicamente al receptor en cuestión. Por "unión específica" se indica que el reactivo de unión muestra especificidad suficiente de la unión y afinidad de unión/cinética apropiada para permitir la retirada de células que expresan uno o más de CCR2, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 y/o CCR7 de la sangre periférica. Aunque no se excluye que el reactivo de unión sea capaz de unirse a otras moléculas, tales como otros receptores de quimiocinas, el reactivo de unión se unirá preferentemente a células que expresan CCR1 y en particular a células que expresan niveles elevados de CCR1 (como se define adicionalmente en el presente documento). El reactivo de unión capaz de unirse específicamente a CCR1 puede ser o un agonista o un antagonista de CCR1. Como la patología se basa en la regulación por incremento de la expresión o señalización por CCR1, en ciertas realizaciones el reactivo de unión capaz de unirse específicamente a CCR1 es un antagonista de CCR1.
Las quimiocinas son normalmente, aunque no necesariamente exclusivamente (particularmente en el caso de formas truncadas o modificadas), agonistas de su receptor relacionado y sirven para activar las células que expresan el receptor relevante, como apreciaría un experto en la técnica. Se considera, en general, que los anticuerpos contra el receptor de quimiocinas relevante son antagonistas, como apreciaría un experto en la técnica. Los ejemplos específicos de reactivos de unión incluyen proteínas o polipéptidos, tales como anticuerpos y ligandos de receptor, en particular quimiocinas. El reactivo de unión puede ser una molécula de ácido nucleico en ciertas realizaciones. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un aptámero. Los aptámeros de ácido nucleico son polinucleótidos de aproximadamente 15-40 nucleótidos de largo. Los aptámeros de ácido nucleico se pueden preparar usando el proceso SELEX (evolución sistémica de ligandos por enriquecimiento exponencial) o cualquier otro proceso conocido por los expertos en la técnica.
En otras realizaciones, el reactivo de unión puede ser un péptido, y en ciertos casos, un aptámero de péptido. Los aptámero de péptido son moléculas de reconocimiento artificiales que consisten en una secuencia de péptidos variable insertada en una proteína de armazón constante (Baines IC, Colas P. Peptide aptamers as guides for small molecule drug discovery. Drug Discov Today. 2006;11:334-341). Están disponibles varias metodologías, tales como presentación en fagos, presentación en ribosomas y sistemas de cribado de dos híbridos de levadura para cribar una biblioteca de posibles ligantes basados en péptidos. Similarmente, se pueden usar armazones de proteína basados en dominios tales como fibronectinas, repeticiones de anquirina, proteína A, dominios SH3, lipocalinas y ubiquitina como ligante. Nuevamente, están disponibles varias tecnologías, tales como presentación en fagos y presentación en ribosomas para cribar una biblioteca de ligantes basados en proteína. Similarmente, las bibliotecas de candidatos a compuestos químicos se pueden cribar para unión específica al receptor de quimiocinas relevante usando técnicas de cribado adecuadas conocidas en la técnica, que pueden ser cribados de alta resolución en ciertas realizaciones. El candidato a ligante se puede inmovilizar sobre un soporte sólido y se determina la capacidad del agente para retener específicamente células que expresan el receptor de quimiocinas de interés o receptores de quimiocinas marcados. Se puede aplicar una gama de tipos de células a los soportes sólidos para confirmar la especificidad de unión, o alternativamente se puede aplicar una muestra mixta (tal como sangre periférica) al soporte sólido. Se puede confirmar la retención del tipo de célula de interés (que expresa el receptor de quimiocinas apropiado) para identificar ligantes adecuados. Una variedad de antagonistas de molécula pequeña de CCR-2 los tratan Xia M y Sui Z en Expert Opin Ther Pat. 2009 Mar; 19(3):295-303 - Recent developments in CCR2 antagonists.
En el contexto de las diversas realizaciones de la presente invención, el término "quimiocina" también comprende quimiocinas biotiniladas o marcadas de otro modo. El término "quimiocina" también comprende versiones modificadas y truncadas de la quimiocina y fragmentos de quimiocina con la condición de que la forma modificada o truncada retenga su capacidad para unirse a su receptor relacionado (y así siga siendo funcional en el contexto de las diversas realizaciones de la invención). La quimiocina no necesita retener necesariamente la actividad biológica ya que es la afinidad de unión específica por CCR1 lo que se requiere. En ciertas realizaciones, la quimiocina carece de actividad biológica, por ejemplo, en términos de activación del receptor de CCR1. Se pueden hacer modificaciones para mejorar la síntesis de proteínas, por ejemplo uniformidad de producto y rendimiento. Como conocen los expertos en la técnica, las modificaciones a modo de ejemplo pueden comprender adiciones, sustituciones, deleciones u otras modificaciones de aminoácidos a uno o más aminoácidos en la quimiocina. Las modificaciones pueden comprender la sustitución del aminoácido no mutante con aminoácidos no naturales tales como norleucina (NLeu) y aminoácidos derivatizados, tales como ácido piroglutámico (piroGlu). Dichas modificaciones se puede hacer para minimizar la formación de productos secundarios durante el almacenamiento y el uso de las columnas de las diversas realizaciones de la invención. Se pueden hacer modificaciones para mejorar el marcado, por ejemplo, la inclusión de un espaciador de polietilenglicol (PEG) para facilitar la biotinilación. La biotinilación y/o la conjugación con fluorocromos u otros grupos marcadores de la quimiocina se realizan de un modo que no afecta sustancialmente la capacidad de unión del receptor. Se prefiere la biotinilación específica de sitio u otro marcado, ya que el marcado no selectivo de quimiocinas puede comprometer la actividad de unión del receptor. En general, se prefiere la biotinilación u otro marcado, en o hacia el extremo C de la proteína, ya que los inventores han encontrado que las modificaciones en este área son, en general, bien toleradas (en términos de un efecto mínimo sobre la capacidad de unión al receptor). La biotinilación se puede llevar a cabo de manera específica de sitio en cualquier aminoácido adecuado. Los ejemplos de aminoácidos adecuados incluyen lisina, ácido diaminopropiónico y ornitina. En general, se puede hacer referencia a Natarajan S et al, Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 40, 567-74; Baumeister B, Int. J. Peptide Res. And Therapeutics, 2005, 11, 139­ 141; Bioconjugate techniques 2a edición, Greg T. Hermanson.
Las truncaciones pueden implicar la deleción de cualquiera de los aminoácidos del extremo N o C según convenga, o ambos. Normalmente, la versión truncada retendrá los restos requeridos para que la quimiocina se pliegue correctamente, por ejemplo para retener una estructura de pliegue de quimiocina, de acuerdo con el requisito de que una versión truncada debe retener la capacidad para unirse al receptor relevante (expresado por (sobre la superficie de) un leucocito). Las moléculas de quimiocina incluyen normalmente enlaces disulfuro entre los restos 1° y 3° y 2° y 4° de cisteína, respectivamente, como entendería un experto en la técnica. Donde las secuencias se presentan en el presente documento, se supone que estos enlaces disulfuro se formarán en la proteína plegada (a menos que se establezca de otro modo). Las versiones truncadas pueden comprender cualquiera entre 1 y 100 aminoácidos menos, tal como 1, 2, 3, 4, 5, etc., aminoácidos, que la secuencia de aminoácidos no mutante en ciertas realizaciones. Por supuesto, las versiones truncadas pueden comprender una modificación adicional como se detalló en el presente documento. La versión modificada o truncada puede tener 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos global con la quimiocina no mutante de longitud completa (donde una deleción se cuenta como una diferencia en la secuencia de aminoácidos) en ciertas realizaciones. En la secuencia común entre las moléculas (es decir, los aminoácidos que no se han delecionado), puede haber 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos en ciertas realizaciones. La identidad de secuencia se puede determinar usando algoritmos conocidos, tales como análisis BLAST o GAP (programa GCG) (aplicar parámetros por defecto), que están libremente disponibles. Las quimiocinas pueden carecer del péptido señal del extremo N que se escinde durante la síntesis in vivo.
Las quimiocinas específicas útiles en las diversas realizaciones de la presente invención para unirse a CCR1, CCR3 y/o CCR5 incluyen CCL5 (RANTES). RANTES es capaz de unirse a receptores de quimiocinas implicados en las afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Más específicamente, RANTES es útil para retirar células que expresan CCR1, CCR3 y/o CCR5 de la sangre de un paciente.
Las quimiocinas útiles específicas para unirse a CCR1 incluyen CCL9, MRP-2 (CCL10), CCL14, CCL15, CCL16 y CCL23.
Se pueden aplicar cada una de las quimiocinas descritas en mayor detalle en el presente documento (con referencia a las figuras relevantes y secuencias de aminoácidos, como se expone en las SEQ ID NOs).
Se puede aplicar cada una de las quimiocinas modificadas y truncadas descritas en mayor detalle en el presente documento (con referencia a las secuencias de aminoácidos relevantes, como se expone en SEQ ID NOs y los ejemplos experimentales adjuntos). Dichas formas modificadas pueden instruir al experto con respecto a las formas modificadas adicionales de las mismas quimiocinas y otras quimiocinas que pueden ser adecuadas para su uso en la invención. Las quimiocinas muestran homología de secuencias variable que varía desde menos de 20 % hasta más de 90 %, pero todas comparten estructuras terciarias muy similares que consisten en un extremo N alterado, seguido por un bucle largo (el bucle N) que termina en una hélice 3io, una hoja p de 3 cadenas y una hélice de extremo C. La topología global se estabiliza por enlaces disulfuro. Esta estructura terciaria común es una característica común de la familia de las proteínas quimiocinas (Fernandez EJ y Lolis E., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 202, 42, 469-99; Allen SJ et al, Annu. Rev. Immunol., 2007, 25, 787-820).
Las truncaciones dentro de esta región del extremo N pueden mantener la unión al receptor, pero pueden conducir a un cambio o pérdida de función (por ejemplo, Zhang YJ et al, J. Biol. Chem., 1994, 269, 15918; Gong J-H y Clark-Lewis I., J. Exp. Med., 1995, 181, 631-640; Fernandez EJ y Lolis E., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 202, 42, 469­ 99; Allen SJ et al, Annu. Rev. Immunol., 2007, 25, 787-820). También se pueden hacer truncaciones en el extremo C de la quimiocina y mantener la actividad de unión al receptor (Treating Inflammatory Disorders, Ola Winqvist and Graham Cotton, documento de patente WO2010/029317).
En otras realizaciones, se usan fragmentos y variantes de quimiocinas en los dispositivos y métodos como se desvela en el presente documento. Más particularmente, dichos fragmentos y variantes retienen la capacidad para unirse específicamente a su receptor de quimiocinas relacionado. Los expertos en la técnica conocen que las quimiocinas comparten dominios de unión específicos de receptor, que incluyen un pliegue monomérico similar, caracterizado, por ejemplo, por un dominio alterado del extremo amino, seguido por una región de núcleo conservado, que consiste en el denominado "bucle N", tres cadenas p antiparalelas y una hélice a del extremo carboxilo. Aunque está ligado a teoría, se cree que la interacción de quimiocina-receptor de quimiocinas es un mecanismo de dos etapas, en el que el núcleo de la quimiocina interacciona primero con un sitio de unión formado por los dominios extracelulares del receptor, mientras que se forma otra interacción entre el extremo N de la quimiocina y un segundo sitio de unión en el receptor para desencadenar la activación de receptor. Así, un "fragmento", tal como un fragmento funcional de una quimiocina, pretende significar una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína que retiene la unión de su receptor relacionado. El fragmento puede incluir, por ejemplo, la región de pliegue monomérico, o porciones de los mismos, tal como el dominio del extremo amino, la región de núcleo conservada y/o el "bucle N", las cadenas p antiparalelas y/o la hélice a del extremo carboxilo o combinaciones y porciones de los mismos.
Además, se reconoce que un polipéptido puede estar mutado considerablemente sin alterar materialmente una o más funciones de polipéptido, por ejemplo, sin alterar la unión específica y/o el plegamiento de la proteína. Se conoce bien que el código genético está degenerado, y así codones diferentes codifican los mismos aminoácidos. Incluso donde se introduce una sustitución de aminoácidos, la mutación puede ser conservativa y no tiene impacto material sobre las funciones esenciales de una proteína (véase, por ejemplo, Stryer, Biochemistry 4a Ed., W. Freeman & Co., New York, NY, 1995). Esto incluye, por ejemplo, la capacidad de la proteína para unirse a e interaccionar con otras proteínas, tales como una quimiocina truncada que se une a su receptor relacionado.
En algunos ejemplos, se puede delecionar parte de una cadena de polipéptidos sin alterar o eliminar todas sus funciones. Por ejemplo, la deleción de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 aminoácidos en el extremo C y/o N, tal como deleciones de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos en el extremo C y/o N, puede dar como resultado una quimiocina que retiene la función, tal como unión específica de su receptor relacionado. Dichas truncaciones pueden retener la función completa de una proteína entera, y/o pueden permitir funciones retenidas, tales como las interacciones proteína-proteína como en el caso de interacciones ligando-receptor. También se pueden usar quimiocinas que tienen deleciones de un número pequeño de aminoácidos, por ejemplo, menos de aproximadamente 20 % (tal como menos de aproximadamente 18 %, menos de aproximadamente 15 %, menos de aproximadamente 10 %, menos de aproximadamente 8 %, menos de aproximadamente 5 %, menos de aproximadamente 2 %, o menos de aproximadamente 1 %) del número total de aminoácidos en la quimiocina no mutante en los métodos y dispositivos desvelados en el presente documento. Además, se pueden preparar inserciones o adiciones en la cadena de polipéptidos, por ejemplo, añadiendo marcas de epítopes, sin alterar o eliminar sus funciones (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1998). Otras modificaciones que se pueden hacer sin alterar materialmente una o más funciones de un polipéptido incluyen, por ejemplo, modificaciones químicas y bioquímicas in vivo o in vitro o la incorporación de aminoácidos poco usuales. En algunos ejemplos, un fragmento funcional de una quimiocina puede consistir en aproximadamente 10 o más, aproximadamente 25 o más, aproximadamente 50 o más, aproximadamente 75 o más, aproximadamente 100 o más, aproximadamente 125 o más, aproximadamente 150, aproximadamente 175 o más, o aproximadamente más o 200 o más restos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de quimiocina.
En algunos ejemplos, la quimiocina o un fragmento funcional de la misma tiene un aminoácido que tiene al menos aproximadamente 60 % o 65 % de identidad de secuencia, aproximadamente 70 % o 75 % de identidad de secuencia, aproximadamente 80 % o 85 % de identidad de secuencia, aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia en su longitud completa en comparación con una secuencia de referencia, tal como las detalladas en el presente documento, por ejemplo, usando NCBI Blast 2.0 gapped BLAST establecido a los parámetros por defecto. El alineamiento también se puede realizar manualmente por inspección. También se pueden hacer una o más modificaciones de aminoácidos conservativas en la secuencia de aminoácidos de la quimiocina, tanto una adición, deleción como una modificación, que no altera sustancialmente la estructura tridimensional del polipéptido o su capacidad para unirse al receptor relacionado. Por ejemplo, una sustitución de aminoácidos conservativa no afecta la capacidad de la quimiocina para unirse específicamente a su receptor relacionado. Se conocen bien en la técnica las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Los siguiente seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
Se pueden modificar péptidos, tales como quimiocinas y fragmentos de las mismas, mediante varias técnicas químicas para producir derivados que tienen esencialmente la misma actividad o función - tal como unión a un receptor relacionado - que los péptidos sin modificar, y que opcionalmente tienen otras propiedades deseables. Por ejemplo, se pueden proporcionar grupos ácido carboxílico de la proteína, tanto en la cadena del extremo carboxilo como lateral, en forma de una sal de un catión farmacéuticamente aceptable o esterificar para formar un éster C1-C16, o se convierte en una amida de fórmula NR1R2 en donde R1 y R2 son cada uno independientemente H o alquilo C1-C16, o se combinan para formar un anillo heterocíclico, tal como un anillo de 5 o 6 miembros. Los grupos amino del péptido, tanto la cadena del extremo amino como lateral, pueden estar en forma de una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable, tal como HCI, HBr, acético, benzoico, tolueno sulfónico, maleico, tartárico y otras sales orgánicas, o se pueden modificar en alquilo C1-C16 o dialquilamino o convertir adicionalmente en una amida.
Los grupos hidroxilo de las cadenas laterales del péptido se pueden convertir en alcoxi C1-C16 o en un éster C1-C16 usando técnicas bien reconocidas. Los anillos de fenilo y fenólicos de las cadenas laterales de péptido se pueden sustituir con uno o más átomos de halógeno, tales como F, CI, Br o I, o con alquilo C1-C16, alcoxi C1-C16, ácidos carboxílicos y ésteres de los mismos, o amidas de dichos ácidos carboxílicos. Los grupos metileno de las cadenas laterales de péptido se pueden extender a los alquilenos C2-C4 homólogos. Los tioles se pueden proteger con uno cualquiera de varios grupos protectores bien reconocidos, tales como grupos acetamida. Los expertos en la técnica también reconocerán los métodos de introducción de estructuras cíclicas en los péptidos de la presente divulgación para seleccionar y proporcionar limitaciones conformacionales a la estructura que dan como resultado la estabilidad potenciada. Por ejemplo, se puede añadir una cisteína del extremo C o N al péptido, de manera que cuando se oxide el péptido contendrá un enlace disulfuro, generando un péptido cíclico. Otros métodos de ciclado de péptidos incluyen la formación de tioéteres y amidas y ésteres de extremo carboxilo y amino.
Las realizaciones de peptidomiméticos y organomiméticos también están dentro del alcance de la presente divulgación, por lo que la disposición tridimensional de los constituyentes químicos de dichos peptidomiméticos y organomiméticos imitan la disposición tridimensional del esqueleto de péptido y las cadenas laterales de aminoácidos componente, dando como resultado dichos peptidomiméticos y organomiméticos de las proteínas de la presente divulgación. Para las aplicaciones de modelado informático, un farmacóforo es una definición tridimensional idealizada de los requisitos estructurales para actividad biológica. Los peptidomiméticos y organomiméticos se pueden diseñar para ajustar cada farmacóforo con el actual software de modelado informático (usando diseño de fármacos asistido por ordenador o CADD). Véase Waltera "Computer-Assisted Modeling of Drugs", en Klegerman & Groves, eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, pp. 165174 y Principles of Pharmacology Munson (ed.) 1995, Cap. 102, para descripciones de técnicas usadas en CADD. También se incluyen dentro del alcance de la divulgación miméticos preparados usando dichas técnicas.
Los aminoácidos en un péptido, polipéptido, o proteína, se unen, en general, químicamente juntos por enlaces amida (CONH). Además, los aminoácidos se pueden unir juntos por otros enlaces químicos. Por ejemplo, enlaces para aminoácidos o análogos de aminoácidos pueden incluir CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CHH2SO-(estos y otros se pueden encontrar en Spatola, en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (marzo de 1983), Vol. 1, Número 3, Peptide Backbone Modifications (revisión general); Morley, Trends Pharm Sci pp.
463-468, 1980; Hudson, et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185, 1979; Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249, 1986; Harm J. Chem. Soc Perkin Trans. 1307-314, 1982; Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398, 1980; Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533, 1982; Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404, 1983; y Hruby Life Sci 31:189-199, 1982.
CCL2 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 2 de quimiocina (motivo C-C), también conocido como MCP-1. El ID de HGNC para este gen es 10618. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q 11.2-q21.1. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA2 "citocina A2 inducible pequeña (proteína 1 quimiotáctica de monocitos, homóloga a Sig-je de ratón)". Los sinónimos de este gen incluyen GDCF-2, HC11, MCP1, MGC9434, SMC-CF, "proteína quimioatrayente de monocitos-1", "factor quimiotáctico y activante de monocitos", "proteína 1 quimiotáctica de monocitos, homólogo a Sig-je de ratón", "proteína JE secretora de monocitos", "subfamilia A de la citocina inducible pequeña (Cys-Cys), miembro 2". La secuencia de referencia de Genbank para CCL2 es BC009716.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL4 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 4 de quimiocina (motivo C-C). El ID de HGNC para este gen es 10630. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q 12-q23. El símbolo y nombre previo para el gen es LAG 1, SCYA4, "citocina A4 inducible pequeña (homóloga a Mip-1 b de ratón)". Los sinónimos de este gen incluyen Act-2, AT744.1, MIP-1-beta. La secuencia de referencia de Genbank para CCL4 es M23502.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL8 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 8 de quimiocina (motivo C-C), también conocido como MCP-2. El ID de HGNC para este gen es 10635. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q11.2. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA8, "subfamilia A de la citocina inducible pequeña (Cys-Cys), miembro 8 (proteína quimiotáctica de monocitos 2)". Otro sinónimo para este gen es HC14. La secuencia de referencia de Genbank para CCL8 es X99886.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL7 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 7 de quimiocina (motivo C-C), también conocido como MCP-3. El ID de HGNC para este gen es 10634. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q11.2-q12. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA6, SCYA7, "citocina A7 inducible pequeña (proteína quimiotáctica de monocitos 3)". Los sinónimos de este gen incluyen FIC, MARC, MCP-3, MCP3, NC28, "proteína quimioatrayente de monocitos 3", "proteína quimiotáctica de monocitos 3". La secuencia de referencia de Genbank para CCL7 es AF043338 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL13 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 13 de quimiocina (motivo C-C), también conocido como MCP-4. El ID de HGNC para este gen es 10611. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q11.2. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA13, "subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (Cys-Cys), miembro 13". Sinónimos de este gen incluyen CKb10, MCP-4, MGC17134, NCC-1, SCYL1. La secuencia de referencia de Genbank para CCL13 es AJ001634 como está disponible el 13 de junio de 2011.
MCP-5 es una quimiocina de ratón en la familia de las quimiocinas CC. También se conoce como ligando 12 de quimiocina (motivo C-C) (CCL12) y, debido a su similitud con la quimiocina MCP-1 humana, algunas veces se denomina quimiocina relaciona con MCP-1. El gen para MCP-5 se encuentra en un clúster de quimiocinas CC en el cromosoma 11 de ratón. La secuencia de referencia de NCBI para CCL12 es NC_000077.5. Símbolo previo SCYA12 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL3 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 3 de quimiocina (motivo C-C), también conocido como MIP-1a. El ID de HGNC para este gen es 10627. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q12. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA3, "citocina A3 inducible pequeña (homóloga a Mip-1a de ratón)". Sinónimos de este gen incluyen G0S19-1, LD78ALFA, MIP-1-alfa. La secuencia de referencia de Genbank para CCL3 es M23178.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL5 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 5 de quimiocina (motivo C-C), también conocido como RANTES. El ID de HGNC para este gen es 10632. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q 11.2-q 12. El símbolo y nombre previo para el gen es D17S136E, SCYA5, "citocina A5 inducible pequeña (RANTES)". Sinónimos de este gen incluyen "beta-quimiocina RANTES", MGC17164, RANTES, "regulada con la activación, normalmente expresada en T y supuestamente secretada", "SIS-delta", SISd, "subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (Cys-Cys), miembro 5", "proteína p288 específica de linfocitos T", "proteína RANTES específica de linfocitos T", TCP228. La secuencia de referencia de Genbank para CCL5 es AF043341.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
IL8 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para la interleucina 8, también conocida como CXCL8. El ID de HGNC para este gen es 6025. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 4q13-q21. Sinónimos de este gen incluyen 3-10C, AMCF-I, b-ENAP, "ligando 8 de quimiocina (motivo C-X-C)", CXCL8, GCP-1, IL-8, K60, LECT, LUCT, LYNAP, MDNCF, MONAP, NAF, NAP-1, SCYB8, TSG-1. La secuencia de referencia de Genbank para CXCL8 es Y00787.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL11 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 11 de quimiocina (motivo C-C), también conocido como eotaxina. El ID de HGNC para este gen es 10610. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q21.1-q21.2. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA11, "subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (Cys-Cys), miembro 11 (eotaxina)". Sinónimos de este gen incluyen MGC22554 y "eotaxina-1". La secuencia de referencia de Genbank para CCL11 es AB063614.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL15 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 15 de quimiocina (motivo C-C), también conocido como HCC-2 y Lkn-1. El ID de HGNC para este gen es 10613. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q 11.2. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA15, "subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (Cys-Cys), miembro 15". Sinónimos de este gen incluyen "quimiocina 3 CC", "quimiocina CC-2", HCC-2, HMRP-2B, "leucotactina 1", Lkn-1, "proteína 5 inflamatoria de macrófago", "MIP-1 delta", MIP-1d, MIP-5, NCC-3, SCYL3. La secuencia de referencia de Genbank para CCL15 es AF031587.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL14 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 14 de quimiocina (motivo C-C). El ID de HGNC para este gen es 10612. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q11.2. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA14, "subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (Cys-Cys), miembro 14". Sinónimos de este gen incluyen CKb1, HCC-1, HCC-3, MCIF, NCC-2, SCYL2. La secuencia de referencia de Genbank para CCL14 es Z49270.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL16 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 16 de quimiocina (motivo C-C). El ID de HGNC para este gen es 10614. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q 11.2. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA16, "subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (Cys-Cys), miembro 16". Sinónimos de este gen incluyen CKb12, HCC-4, LCC-1, LEC, LMC, Mtn-1, NCC-4, SCYL4. La secuencia de referencia de Genbank para CCL16 es AB007454.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL18 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 18 de quimiocina (motivo C-C) (pulmonar y regulado por activación). El ID de HGNC para este gen es 10616. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q 11.2. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA18, "subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (Cys-Cys), miembro 18, pulmonar y regulado por activación". Sinónimos de este gen incluyen AMAC-1, CKb7, DC-CK1, dCc K1, MIP-4, PARC. La secuencia de referencia de Genbank para CCL18 es Y13710.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL23 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 23 de quimiocina (motivo C-C). El ID de HGNC para este gen es 10622. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 17q 11.2. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA23, "subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (Cys-Cys), miembro 23". Sinónimos de este gen incluyen Ckb-8, CKb8, MIP-3, MPIF-1. La secuencia de referencia de Genbank para CCL23 es U58913.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL24 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 24 de quimiocina (motivo C-C), también conocido como eotaxina-2 y MPIF-2. El ID de HGNC para este gen es 10623. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 7q11.23. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA24, "subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (Cys-Cys), miembro 24". Sinónimos de este gen incluyen "CK-beta-6", Ckb-6, MPIF-2, MPIF2, "eotaxina-2", "factor 2 inhibidor de progenitores mieloides". La secuencia de referencia de Genbank para CCL24 es U85768.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL26 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 26 de quimiocina (motivo C-C), también conocido como eotaxina-3. El ID de HGNC para este gen es 10625. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 7q11.22. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA26, "subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (Cys-Cys), miembro 26". Sinónimos de este gen incluyen "quimiocina IMAC CC", IMAC, MIP-4a, MIP-4alfa, TSC-1, "quimiocina N1", "eotaxina-3", "proteína 4-alfa inflamatoria de macrófagos", "citocina A26 inducible pequeña", "quimiocina-1 del estroma tímico". La secuencia de referencia de Genbank para CCL26 es AF124601.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CXCL1 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 1 de quimiocina (motivo C-X-C) (actividad estimulante del crecimiento de melanoma, alfa). El ID de HGNC para este gen es 4602. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 4q13.3. El símbolo y nombre previo para el gen es "proteína secretora de fibroblastos", FSP, GRO1, "oncogen GRO1 (actividad estimulante del crecimiento de melanoma, alfa)", MGSA. Sinónimos de este gen incluyen GROa, MGSA-a, NAP-3, SCYB1. La secuencia de referencia de Genbank para CXCL1 es J03561.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CXCL2 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 2 de quimiocina (motivo C-X-C). El ID de HGNC para este gen es 4603. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 4q13.3. El símbolo y nombre previo para el gen es GRO2, "oncogen GRO2". Sinónimos de este gen incluyen CINC-2a, GROb, MGSA-b, MIP-2a, SCYb2. La secuencia de referencia de Genbank para CXCL2 es M36820.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CXCL3 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 3 de quimiocina (motivo C-X-C). El ID de HGNC para este gen es 4604. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 4q21. El símbolo y nombre previo para el gen es GRO3, "oncogen GRO3". Sinónimos de este gen incluyen CINC-2b, GROg, MIP-2b, SCYB3. La secuencia de referencia de Genbank para CXCL3 es M36821.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CXCL5 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 5 de quimiocina (motivo C-X-C). El ID de HGNC para este gen es 10642. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 4q13.3. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYB5, "subfamilia B de citocinas inducibles pequeñas (Cys-X-Cys), miembro 5 (péptido activante de neutrófilos derivados de epitelio 78)". Un sinónimo para este gen ENA-78. La secuencia de referencia de Genbank para CXCL5 es X78686.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CXCL6 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 6 de quimiocina (motivo C-X-C). El ID de HGNC para este gen es 10643. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 4q13.3. El símbolo y nombre previo para el gen es el ligando 6 de quimiocina (motivo C-X-C) (proteína quimiotáctica de granulocitos 2). Sinónimos de este gen incluyen CKA-3, GCP-2. La secuencia de referencia de Genbank para CXCL6 es U83303.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
PPBP es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para la proteína básica proplaquetaria (ligando 7 de quimiocina (motivo C-X-C)), también conocida como CXCL7. El ID de HGNC para este gen es 9240. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 412-q13. El símbolo y nombre previo para el gen es THBGB1. Sinónimos de este gen incluyen b-TG1, Beta-TG, "beta-tromboglobulina", "péptido III activante de tejido conjuntivo", CTAP3, CTAPIII, CXCL7, LA-PF4, LDGF, MDGF, NAP-2, NAP-2-L1, "péptido-2 activante de neutrófilos", PBP, "proteína básica plaquetaria", SCYB7, TGB, TGB1. La secuencia de referencia de Genbank para PPBP es M54995.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CXCL11 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 11 de quimiocina (motivo C-X-C). El ID de HGNC para este gen es 10638. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 4q21. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYB9B, SCYB11, "subfamilia B de citocinas inducibles pequeñas (Cys-X-Cys), miembro 11". Sinónimos de este gen incluyen b-R1, H174, I-TAC, IP-9. La secuencia de referencia de Genbank para CXCL11 es U66096.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
CCL19 es el símbolo de gen autorizado por el Comité de Nomenclatura Genética HUGO para el ligando 19 de quimiocina (motivo C-C), también conocido como MIP-3b. El ID de HGNC para este gen es 10617. El gen se sitúa en la posición de cromosoma 9p13. El símbolo y nombre previo para el gen es SCYA19, "subfamilia A de citocinas inducibles pequeñas (Cys-Cys), miembro 19". Sinónimos de este gen incluyen "beta quimiocina exodus-3", " ligando 19 de quimiocina CC", "CK beta-11", CKb11, "quimiocina EBI1-ligando", ELC, exodus-3, "proteína 3-beta inflamatoria de macrófagos", MIP-3b. La secuencia de referencia de Genbank para CCL19 es AB000887.1 como está disponible el 13 de junio de 2011.
Ejemplos de quimiocinas modificadas adecuadas que contienen modificaciones y/o truncaciones se describen con detalle en el presente documento. MCP-1 se ha producido con el resto 75, que puede ser una lisina, como el sitio de biotinilación en la quimiocina (numeración basada en la proteína madura que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2). La biotinilación permite la inmovilización de MCP-1 sobre un soporte sólido (mediante una interacción biotina-avidina). La secuencia de aminoácidos básica de MCP-1, que incluye una secuencia conductora de 23 aminoácidos, se expone como SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de la proteína madura se expone como SEQ ID NO: 2. Los inventores han determinado que las quimiocinas pueden mostrar propiedades de unión mejorada donde la quimiocina se biotinila por un grupo espaciador. El espaciador puede prevenir que el grupo biotina afecte la afinidad de unión de la quimiocina. Se puede emplear cualquier grupo espaciador adecuado. Las modificaciones adicionales pueden proveer la molécula con propiedades ventajosas. La invención también se refiere a derivados de quimiocinas MCP-1 truncadas. La secuencia de aminoácidos de la versión truncada se expone como SED ID NO: 3.
Por consiguiente, en el presente documento se proporciona una quimiocina MCP-1 modificada que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 en las que se han hecho una o más de las siguientes modificaciones:
a) el resto de glutamina 1 de SEQ ID NO: 2 se ha sustituido con piroglutamina
b) el extremo C se produce como un derivado de amida (esto se puede lograr por síntesis en un conector de amida) c) se biotinila el resto (región del extremo C) en la posición 98 de SEQ ID NO: 1 o la posición 75 de SEQ ID NO: 2 o posición 67 de SEQ ID NO: 3, que puede ser un resto de lisina u ornitina u otro resto adecuado para marcado, opcionalmente por un grupo espaciador, para permitir la inmovilización de la quimiocina sobre un soporte sólido; y/o
d) el resto de metionina en la posición 87 de SEQ ID NO: 1 o posición 64 de SEQ ID NO: 2 o posición 56 de SEQ ID NO: 3 se ha sustituido con norleucina.
El aminoácido (región del extremo C), que puede ser un resto de lisina o un equivalente funcional, en la posición 98 de SEQ ID NO: 1 o posición 75 de SeQ ID NO: 2 o posición 67 de SEQ ID NO: 3, se pueden biotinilar por un grupo espaciador adecuado, tal como un grupo espaciador de polietilenglicol (PEG), para permitir la inmovilización de la quimiocina sobre un soporte sólido. En ejemplos específicos, el espaciador de PEG es ácido 3,6-dioxoaminooctanoico. La secuencia y la biotinilación de las quimiocinas MCP-1 modificadas de la invención se muestran en las Figuras 7 a 9, respectivamente. Las quimiocinas MCP-1 modificadas pueden ser agonistas o antagonistas de la actividad de CCR2. Se pueden probar para su actividad en un ensayo adecuado, tal como los ensayos basados en células. En particular, se pueden determinar las propiedades de agonista y antagonista en ensayo funcional basado en células en el receptor CCR2 humano.
MCP-5 solo se une CCR2 y debe ser selectivo en su retirada de células que expresan CCR2. La secuencia de aminoácidos de longitud completa, que incluye el péptido señal, se expone como SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos de la quimiocina MCP-5 procesada de extremo N tiene 82 aminoácidos de longitud y se expone como SEQ ID NO: 5. Un alineamiento de secuencias de aminoácidos sugiere que MCP-5 tiene una extensión de extremo C cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de MCP-1. Los resultados de este alineamiento se muestran en la Figura 10. Así se pueden sintetizar las versiones truncadas del extremo C de MCP-5. Esta versión truncada comprenderá, consistirá esencialmente en o consistirá en los restos 1-76 de MCP-5, expuestos como SEQ ID NO: 6.
Por consiguiente, en el presente documento se proporciona una quimiocina MCP-5 modificada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 4, SEQ iD NO: 5 o SEQ ID NO: 6 en la que el resto de isoleucina en la posición 97 de SEQ ID NO: 4 o en la posición 75 de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 se ha sustituido con lisina. En ciertos ejemplos, la quimiocina MCP-5 modificada comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. La quimiocina MCP-5 modificada se pueden biotinilar en el resto de lisina (o un equivalente funcional) en la posición 97 de SEQ ID NO: 4 o en la posición 75 de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. La biotinilación puede ser por un grupo espaciador adecuado. Los ejemplos específicos del grupo espaciador incluyen un espaciador de PEG, opcionalmente ácido 3,6-dioxoaminooctanoico. En algunas realizaciones, el extremo C se produce como un derivado de amida. Esto se puede lograr por síntesis en un conector de amida. En ciertas realizaciones, la quimiocina MCP-5 modificada comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia y la biotinilación mostrada en la Figura 11. La quimiocina MCP-5 modificada puede ser un agonista o un antagonista de la actividad de CCR2. Se pueden probar para actividad en un ensayo adecuado, tal como ensayos basados en célula. En particular, las propiedades de agonista y antagonista se pueden determinar en un ensayo funcional basado en células en el receptor CCR2 humano.
Se ha producido eotaxina con Lys73 como el sitio de biotinilación en la quimiocina (numeración basada en la proteína madura que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9). La biotinilación permite la inmovilización de eotaxina sobre un soporte sólido (por una interacción biotina-avidina). La secuencia de aminoácidos básica de eotaxina, que incluye una secuencia conductora de 23 aminoácido, se expone como SEQ ID NO: 8. La secuencia de aminoácidos de la proteína madura se expone como SEQ ID NO: 9. Los inventores han determinado que las quimiocinas pueden mostrar propiedades de unión mejoradas donde la quimiocina se biotinila mediante un grupo espaciador. El espaciador puede prevenir que el grupo biotina afecte la afinidad de unión de la quimiocina. Se puede emplear cualquier grupo espaciador adecuado. Las modificaciones adicionales pueden proporcionar la molécula con propiedades ventajosas.
Por consiguiente, en el presente documento se proporciona una quimiocina eotaxina modificada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9, en la que se han hecho una o más de las siguientes modificaciones:
a) el extremo C se produce como un derivado de amida
c) el resto de lisina (región del extremo C) en la posición 96 de SEQ ID NO: 8 o posición 73 de SEQ ID NO: 9 se biotinila, opcionalmente por un grupo espaciador, para permitir la inmovilización de la quimiocina sobre un soporte sólido
d) el resto de metionina en la posición 85 de SEQ ID NO: 8 o posición 62 de SEQ ID NO: 9 se ha sustituido con norleucina
e) la lisina en la posición 96 de SEQ ID NO: 8 o posición 73 de SEQ ID NO: 9 se sustituye con otro aminoácido que puede permitir la biotinilación, tal como ornitina
El resto de lisina (región del extremo C) en la posición 96 de SEQ ID NO: 8 o la posición 73 de SEQ ID NO: 9 se puede biotinilar por un grupo espaciador adecuado, tal como un grupo espaciador de polietilenglicol (PEG), para permitir la inmovilización de la quimiocina sobre un soporte sólido. En ejemplos específicos, el espaciador de PEG es ácido 3,6-dioxoaminooctanoico. La secuencia y la biotinilación de una quimiocina eotaxina modificada de la invención se muestra en la Figura 7. Las quimiocinas eotaxina modificadas pueden ser agonistas o antagonistas de la actividad de CCR3. Se pueden probar para su actividad en un ensayo adecuado, tal como ensayos basados en células. En particular, se pueden determinar las propiedades de agonistas y antagonistas en el ensayo funcional basado en células de aequorina en el receptor CCR3 humano.
Un ejemplo de una quimiocina que contiene modificaciones se describe con detalle en el presente documento (véase Ejemplo 3 más adelante). La CCL8 modificada (MCP-2) corresponde a los restos 1 a 76 de la proteína madura de longitud completa (y carece del péptido señal del extremo N de 23 aminoácidos, que se escinde) y así retiene el pliegue de quimiocina. La Gln en el extremo N de la proteína se somete a formación de piroGlu en condiciones fisiológicas. Así, la Gln1 de la secuencia se puede sustituir con piroglutamina para prevenir que se generen las especies mixtas de Gln del extremo N y piroGlu (SEQ ID NO: 13). Esto mejora el rendimiento de la síntesis y garantiza una preparación homogénea de quimiocinas mediante la fabricación y el uso de columnas. FmocLys(ivDde)-OH se incorpora como resto 75 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 14). La lisina que existe de forma natural en la posición 75 se modifica mediante biotinilación. Se puede incorporar un espaciador de PEG entre la funcionalidad £-amino y la biotina (SEQ ID NO: 15).
Así, en el presente documento también se proporciona una quimiocina modificada que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13:
XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKE
RWVRDSMKHLDQIFQNLXP
X1 = piroGlu (pero puede permanecer como Gln en algunas realizaciones)
X75 = un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espadadora tal como PEG, por ejemplo, K(PEG-biotina).
O SEQ ID NO: 15
XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKE
RWVRDSMKHLDQIFQNLXP
X1 = piroGlu (pero puede permanecer como Gln en algunas realizaciones)
X75 = K(PEG-biotina).
Un ejemplo de una quimiocina de las diversas realizaciones de la invención que contiene modificaciones y se adapta específicamente para su uso en la invención se describe con detalle en el presente documento (véase el Ejemplo 4 más adelante). El CCL5 modificado (RANTES) corresponde a los restos 1 a 68 de la proteína madura de longitud completa (y carece del péptido señal del extremo N de 23 aminoácidos, que se escinde) y así retiene el pliegue de quimiocina. La única metionina (Met67) dentro de la secuencia se muta a lisina, para mitigar la oxidación de este resto durante el ensamblaje de cadenas (SEQ ID NO: 16). Esta sustitución de Met por Lys proporciona una lisina en la posición 67 que se pueden modificar mediante biotinilación. FmocLys(ivDde)-OH se incorpora como resto 67 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 17). La versión biotinilada comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
Así, en otras realizaciones, la invención también se refiere a una quimiocina modificada que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18:
SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVC
ANPEKKWVREYINSLEXS
X es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG (por ejemplo, K(biotina))
Un ejemplo adicional de una quimiocina que contiene modificaciones se describe con detalle en el presente documento (véase el Ejemplo más adelante). La CCL2 modificada (MCP-1) corresponde a los restos 1 a 76 de la proteína madura de longitud completa (y carece del péptido señal del extremo N de 23 aminoácidos, que se escinde) y así retiene el pliegue de quimiocina (SEQ ID NO: 10). La Gln en el extremo N de la proteína (Gln1) se sustituye con piroglutamina para prevenir que se separen especies mixtas de Gln y piroGlu del extremo N. Esto mejora el rendimiento de la síntesis y garantiza una preparación de quimiocinas homogénea mediante la fabricación y el uso de columnas. FmocLys(ivDde)-OH se incorpora como el resto 75 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 11). Se puede incorporar un espaciador adecuado, tal como un espaciador de PEG, entre la funcionalidad £-amino y la biotina. La versión biotinilada comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
Así, otros ejemplos se refieren a una quimiocina modificada que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia de aminoácidos de:
SEQ ID NO: 10:
XPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEIC
ADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT
X = piroGlu o Gln
y/o
SEQ ID NO: 12:
XPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEIC
ADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPXT
XI = piroGlu o Gln
X75 es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG, opcionalmente K(PEG-biotina)
Un ejemplo adicional de una quimiocina que contiene modificaciones se describe con detalle en el presente documento (véase el Ejemplo 9 más adelante). La CCL19 modificada (MIP-3p) corresponde a los restos 1 a 77 de la proteína madura de longitud completa (y carece del péptido señal del extremo N de 21 aminoácidos, que se escinde) y así retiene el pliegue de quimiocina. Se inserta una lisina adicional en el extremo C, en la posición 78. La quimiocina puede así comprender, consistir esencialmente en o consistir en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. FmocLys(ivDde)-OH se incorpora como resto 78 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 20). La funcionalidad de la cadena lateral de £-amino de Lys(78) se modifica mediante biotinilación. Así, la proteína final puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
Así, los ejemplos adicionales se refieren a una quimiocina modificada que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o 21:
SEQ ID NO: 19
GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCA
PPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSSX
X es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila (por ejemplo, K-biotina), opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG, en particular K(PEG-biotina)
SEQ ID NO: 21
GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCA
PPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSSX
X es K(biotina)
Un ejemplo adicional de una quimiocina que contiene modificaciones se describe con detalle en el presente documento (véase el Ejemplo 3 más adelante). La CXCL8 modificada (IL-8) corresponde a los restos 1 a 77 de la proteína madura de longitud completa (y carece del péptido señal del extremo N de 22 aminoácidos, que se escinde) y así retiene el pliegue de quimiocina. Un resto de aminoácido capaz de biotinilación, tal como lisina u ornitina, se añade como resto 78 (SEQ ID NO: 22). FmocLys(ivDde)-OH se puede incorporar como resto 78 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 23). El aminoácido adicional, en particular la lisina u ornitina, en la posición 78 se modifica mediante biotinilación. Se puede incorporar un espaciador adecuado, tal como un espaciador de PEG, entre la funcionalidad de £-amino y la biotina (SEQ ID NO: 24).
Así, otros ejemplos se refieren a una quimiocina modificada que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o 24:
SEQ ID NO: 22
AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKL
SDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENSX
X es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG
SEQ ID NO: 24
AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKL
SDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENSK(PEG-Biotina)
Un ejemplo adicional de una quimiocina que contiene truncaciones y modificaciones se describe con detalle en el presente documento (véase el Ejemplo 3 más adelante). La CXCL8 modificada (IL-8) corresponde a los restos 6 a 77 de la proteína madura de longitud completa, con los primeros 5 aminoácidos del extremo N retirados (y carece del péptido señal del extremo N de 22 aminoácidos, que se escinde) y así retiene el pliegue de quimiocina. Un resto de aminoácido capaz de biotinilación, tal como lisina u ornitina, se añade como resto 78 (SEQ ID NO: 25). Se puede incorporar FmocLys(ivDde)-OH como resto 78 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 26). El aminoácido adicional, en particular la lisina u ornitina, en la posición 78 se modifica mediante biotinilación. Se puede incorporar un espaciador adecuado, tal como un espaciador de PEG, entre la funcionalidad de £-amino y la biotina (SEq ID NO: 27).
Así, los ejemplos adicionales se refieren a una quimiocina modificada que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o 27:
SEQ ID NO: 25
SAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGREL
CLDPKENWVQRVVEKFLKRAENSX
X es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG
SEQ ID NO: 27
SAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGREL
CLDPKENWVQRVVEKFLKRAENSX
X es K(PEG-biotina)
Un ejemplo adicional de una quimiocina que contiene modificaciones se describe con detalle en el presente documento (véase el Ejemplo 9 más adelante). La CCL11 modificada (eotaxina) corresponde a los restos 1 a 74 de la proteína madura de longitud completa (y carece del péptido señal del extremo N de 23 aminoácidos, que se escinde) y así retiene el pliegue de quimiocina (SEQ ID NO: 28). La lisina en la posición 73 se puede modificar mediante biotinilación. FmocLys(ivDde)-OH se incorpora como resto 73 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 29). Se puede incorporar un espaciador adecuado, tal como un espaciador de PEG, entre la funcionalidad de £-amino y la biotina. La versión botinilada comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.
Así, los ejemplos adicionales se refieren a una quimiocina modificada que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 30:
SEQ ID NO: 28
GPASVPTTCCFNLANRKIPLQRLESYRRITSGKCPQKAVIFKTKLAKDICADPKKK
WVQDSMKYLDQKSPTPXP
X es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG, por ejemplo, K(PEG-biotina).
SEQ ID NO: 30
H-GPASVPTTCCFNLANRKIPLQRLESYRRITSGKCPQKAVIFKTKLAKDICADPKKK
WVQDSMKYLDQKSPTPXP-NH2
X es K(PEG-biotina)
Las quimiocinas útiles en las diversas realizaciones de la invención se pueden sintetizar mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Preferentemente, las quimiocinas se sintetizan químicamente ya que esto facilita la modificación y el marcado, etc. Sin embargo, también se pueden emplear enfoques basados en ADN recombinante en combinación con tecnologías apropiadas de marcado y modificación según se requiera. Así, en ciertas realizaciones, la invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica las quimiocinas de las diversas realizaciones de la invención. En ciertas realizaciones, la invención también se refiere a un vector que contiene dicha molécula de ácido nucleico y una célula hospedadora que contiene el vector. El vector puede comprender además un promotor adecuado operativamente unido a la molécula de ácido nucleico, para facilitar la transcripción de la molécula de ARNm correspondiente. La célula hospedadora puede ser capaz de expresar la proteína por transcripción y traducción de la molécula de ácido nucleico que codifica una quimiocina de las diversas realizaciones de la invención.
Las quimiocinas útiles en las diversas realizaciones de la invención se pueden biotinilar por métodos conocidos en la técnica tal como se describen en documento de patente WO 00/50088 A2. Como se indica anteriormente, es preferible el marcado específico de sitio de las quimiocinas de las diversas realizaciones de la invención, aunque se puede emplear cualquier técnica de marcado que no afecte significativamente la capacidad de unión a receptor de la quimiocina. Están disponibles comercialmente diversas quimiocinas biotiniladas específicas de sitio y quimiocinas nativas, por ejemplo, de Almac, Craigavon, R. U. En realizaciones específicas, la una o más quimiocinas se biotinilan por un grupo espaciador. El espaciador se puede emplear para prevenir que el grupo biotina afecte la actividad de la quimiocina, en particular la unión de la quimiocina a su receptor relacionado. Cualquier espaciador adecuado que facilite la retención de propiedades de unión a receptor de la quimiocina se puede emplear en las diversas realizaciones de la invención. Así, en las realizaciones específicas descritas anteriormente, se pueden emplear espaciadores distintos de espaciadores de PEG, según convenga. En realizaciones específicas, el espaciador es un espaciador de polietilenglicol (PEG). Se ha mostrado que PEG es un espaciador eficaz que permite la fijación de biotina a la quimiocina (que entonces se puede inmovilizar sobre el soporte sólido mediante interacción con estreptavidina) sin comprometer la capacidad de unión al receptor.
En el contexto de las diversas realizaciones de la presente invención, el término "anticuerpo" incluye todas las inmunoglobulinas o moléculas de tipo inmunoglobulina con afinidad de unión específica para el receptor de quimiocinas relevante (incluyendo a modo de ejemplo y sin limitación, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, combinaciones de los mismos, y moléculas similares producidas durante una respuesta inmunitaria en cualquier vertebrado, por ejemplo, en mamíferos tales como seres humanos, cabras, conejos y ratones). Las inmunoglobulinas específicas útiles en las diversas realizaciones de la invención incluyen isotipos IgG. Los anticuerpos útiles en las diversas realizaciones de la invención pueden ser de origen monoclonal o policlonal, pero normalmente son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, anticuerpos no humanos, o versiones humanizadas de los anticuerpos no humanos, o anticuerpos quiméricos. Están bien establecidas diversas técnicas para la humanización de anticuerpo y se puede emplear cualquier técnica adecuada. El término "anticuerpo" también se refiere a un ligando de polipéptido que comprende al menos una región variable de cadena ligera o de cadena pesada de inmunoglobulina que reconoce específicamente y se une al epítope de un antígeno, y se extiende a todos los derivados de anticuerpo y fragmentos que retienen la capacidad para unirse específicamente al receptor de quimiocinas relevante. Estos derivados y fragmentos pueden incluir fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 , fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de un solo dominio, fragmentos Fc, etc. El término anticuerpo engloba anticuerpos que comprenden tanto las cadenas pesadas como las ligeras, pero también anticuerpos de cadena pesada (solo). En realizaciones específicas, los anticuerpos se pueden manipular de manera que sean específicos para más de un receptor de quimiocinas, por ejemplo biespecíficos para permitir la unión a dos receptores de quimiocinas diferentes. Los anticuerpos adecuados comercialmente disponibles que se unen a los receptores de quimiocinas de interés se enumeran en la Tabla 1 a continuación. Pueden o pueden no estar marcados. Se puede hacer referencia general a "Antibodies a laboratory manual: By E Harlow and D Lane. pp 726. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988".
Tabla 1. Anticuerpos marcados con fluoróforo comercialmente disponibles contra receptores de quimiocinas es ecíficos
Figure imgf000017_0001
Se describen anticuerpos anti-CCR2, por ejemplo en el documento de patente WO 2010/021697. Los ejemplos adicionales de anticuerpos posiblemente útiles incluyen MLN-1202, un anticuerpo monoclonal anti-CCR2 que está actualmente en ensayos clínicos (Millennium Pharmaceuticals). Las células que expresan receptores de quimiocinas se pueden manipular usando ligantes alternativos, tales como anticuerpos u otros compuestos químicos, como se define en el presente documento, en vez del componente de unión de quimiocina natural. Este enfoque es un nuevo enfoque para tratar afecciones inflamatorias.
Por consiguiente, la invención también proporciona una columna de aféresis cargada con un soporte sólido que comprende un reactivo de unión capaz de unirse específicamente a un receptor de quimiocinas inmovilizado directa o indirectamente sobre el soporte para permitir la retirada de una célula que expresa el receptor de quimiocinas de la sangre periférica de un paciente, en donde el reactivo de unión no es una quimiocina. El reactivo de unión capaz de unirse específicamente al receptor de quimiocinas puede ser un agonista o un antagonista del receptor de quimiocinas. El reactivo de unión capaz de unirse específicamente al receptor de quimiocinas puede ser un anticuerpo.
Así, en otras realizaciones, la invención también proporciona un método de tratamiento de una afección inflamatoria que comprende aplicar sangre periférica de un paciente/sujeto a una columna de aféresis como se ha definido anteriormente (una columna de aféresis cargada con un soporte sólido que comprende un reactivo de unión capaz de unirse específicamente a un receptor de quimiocinas inmovilizado directa o indirectamente sobre el soporte para permitir la retirada de una célula que expresa el receptor de quimiocinas de la sangre periférica de un paciente, en donde el reactivo de unión no es una quimiocina), retirando así las células que expresan los receptores de quimiocinas de la sangre periférica del paciente/sujeto. El método puede comprender devolver la sangre reducida en las células que expresan receptores de quimiocinas al paciente/sujeto.
Similarmente, en otras realizaciones, la invención proporciona un reactivo de unión capaz de unirse específicamente a un receptor de quimiocinas para su uso en el tratamiento de una afección inflamatoria, en donde el reactivo de unión se inmoviliza sobre un soporte sólido contenido dentro de una columna de aféresis como se ha definido anteriormente (una columna de aféresis cargada con un soporte sólido que comprende un reactivo de unión capaz de unirse específicamente a un receptor de quimiocinas inmovilizado directa o indirectamente sobre el soporte para permitir la retirada de una célula que expresa el receptor de quimiocinas de la sangre periférica de un paciente/sujeto, en donde el reactivo de unión no es una quimiocina), a la que se aplica sangre periférica de un paciente, retirando así las células que expresan receptores de quimiocinas de la sangre periférica del paciente.
Estos aspectos de las diversas realizaciones de la invención se pueden integrar en los aspectos terapéuticos más enfocados de las diversas realizaciones de la invención (es decir, tratar afecciones respiratorias tales como sarcoidosis y EPOC y diversos aspectos de las mismas) y así el resto de la divulgación, que incluye todas las realizaciones específicas, se aplica cambiando lo que haya que cambiar.
Se conocen en la técnica los materiales de soporte sólido para inmovilizar los reactivos de unión de las diversas realizaciones de la invención. "Soporte sólido" se refiere, por ejemplo, a materiales que tienen una superficie o superficies rígidas o semirrígidas, y pueden tomar la forma de perlas, resinas, geles, microesferas, u otras configuraciones geométricas. Un material de soporte útil es uno que no activa los glóbulos sanguíneos de manera que haga que coagulen o se adhieran al soporte a medida que la sangre completa periférica se aplica al dispositivo. En ciertas realizaciones, se emplea un soporte tratado con un agente para proveerle de propiedades de anticoagulación, en particular un soporte heparinizado. Alternativamente, la sangre del paciente se puede tratar con un anticoagulante, tal como heparina, antes de la aplicación al soporte. Los materiales de soporte útiles comprenden hidratos de carbono de alto peso molecular, en particular hidratos de carbono que tienen un peso molecular de 100 kDa o más, tales como agarosa, en forma de partícula, opcionalmente reticulada, y celulosa. Otros materiales de soporte preferidos son polímeros, tales como poliestireno carboxilado, y vidrio. El soporte de las diversas realizaciones de la invención se puede proporcionar en forma de partículas o fibras. Las partículas de soporte pueden tener forma regular, tal como esferas o perlas, o forma irregular. Pueden ser porosas o no porosas. Un tamaño de partículas promedio preferido del soporte es desde 50 |jm hasta 2 mm. En ciertas realizaciones se usa Sepharose™, una agarosa en forma de perlas reticuladas, como matriz de columna. Se elige por su capacidad de distribución óptima y se puede proporcionar un gran área disponible para la unión por afinidad. Los soportes sólidos se pueden proporcionar en forma de perlas magnéticas, con el reactivo de unión específico inmovilizado sobre las perlas magnéticas. Después de la captura de las células que expresan receptores de quimiocinas CCR1 de la sangre, las perlas se pueden retirar de la sangre con la ayuda de un separador magnético apropiado.
Se conocen en la técnica métodos de inmovilización de los reactivos de unión sobre un soporte sólido. Se puede inmovilizar un reactivo de unión, tal como una quimiocina, anticuerpo, péptido, ácido nucleico o compuesto químico, sobre el soporte en un modo directo o indirecto. La inmovilización puede ser por medio de un conector adecuado en algunas realizaciones. Un método preferido de inmovilización indirecta de un reactivo de unión, tal como una quimiocina, se basa en la interacción entre las moléculas de biotina y de avidina. "Avidina" o "molécula de avidina" se refiere a cualquier tipo de proteína que une específicamente una biotina a la exclusión sustancial de otras moléculas (pequeñas) que podrían estar presentes en una muestra biológica. Los ejemplos de avidina incluyen avidinas que están naturalmente presentes en clara de huevo, proteína de semilla de aceite (por ejemplo, harina de soja) y grano (por ejemplo, trigo/maíz) y estreptavidina, que es una proteína de origen bacteriano. Así, la biotinilación del reactivo de unión y el uso de una molécula de avidina, tal como la estreptavidina inmovilizada sobre el soporte sólido, permite la fijación fiable del reactivo de unión al soporte sólido según métodos conocidos en la técnica. Específicamente, dicho método puede comprender proporcionar el reactivo de unión en forma biotinilada, proporcionando un soporte sólido que tiene estreptavidina inmovilizada sobre su superficie, poniendo en contacto el soporte con una disolución acuosa del reactivo de unión biotinilado y aclarando el soporte con un disolvente acuoso. Además, las interacciones del par de unión, tales como las interacciones anticuerpo - antígeno, también pueden ser utilizadas para la inmovilización indirecta del reactivo de unión sobre un soporte. En dichas realizaciones, el soporte se puede derivatizar con un miembro de un par de unión, tal como un anticuerpo o fragmento o derivado del mismo, como se define en el presente documento, que tiene afinidad conocida por una secuencia de péptidos particular o hapteno de molécula pequeña. La incorporación del otro miembro del par de unión, tal como un antígeno, secuencia de péptidos o el hapteno sobre o en el reactivo de unión, facilita la inmovilización sobre un soporte sólido recubierto con el anticuerpo o fragmento correspondiente o derivado del mismo. Así, el reactivo de unión se puede modificar para incluir la secuencia de péptidos o hapteno en la molécula lineal, o se puede añadir como una cadena lateral o marca. Se puede emplear cualquier par anticuerpo-antígeno adecuado. El fragmento de anticuerpo o derivado puede ser cualquier fragmento o derivado que retenga la afinidad de unión específica por el antígeno apropiado. Los ejemplos incluyen Fab, fragmentos F(ab')2 , scFV, dominios VH, anticuerpos de un solo dominio (tal como nanocuerpos), anticuerpos de cadena pesada y la versión humanizada de anticuerpos no humanos, etc. Se pueden utilizar otras interacciones de alta afinidad para la inmovilización de los reactivos de unión, en tanto que el reactivo de unión se pueda sintetizar o derivatizar con uno de los componentes de interacción y el soporte sólido se sintetice o derivatice con el otro componente de interacción sin pérdida de actividad de unión (es decir, unión del reactivo de unión al receptor de quimiocinas apropiado). La inmovilización puede ocurrir por esencialmente la misma interacción en la inversa en algunas realizaciones. Así, el reactivo de unión que puede ser una quimiocina, por ejemplo, se puede fijar a un anticuerpo como se define en el presente documento, y derivatizar el soporte sólido con el antígeno. La quimiocina se puede producir como una proteína de fusión con el anticuerpo.
Alternativamente, los reactivos de unión, tales como las quimiocinas y los anticuerpos, se pueden inmovilizar directamente sobre un soporte sólido usando técnicas de bioconjugación establecidas en el campo. Por ejemplo, la inmovilización directa de proteínas sobre soportes sólidos activados con bromuro de cianógeno por funcionalidades amino dentro de la secuencia de la proteína primaria. Alternativamente, se pueden usar funcionalidades sulfhidrilo dentro de las proteínas para inmovilizar directamente la proteína a soportes derivatizados con haluro de alquilo o soportes que contienen funcionalidades tiol libre. En realizaciones adicionales, las proteínas que contienen funcionalidades a-tioéster pueden ser inmovilizadas directamente sobre soportes que contienen restos 1,2-aminotiol (por ejemplo, cisteína del extremo N) usando la reacción de ligación química nativa. Alternativamente, las proteínas modificadas con cetonas y aldehídos se pueden inmovilizar sobre soportes sólidos derivatizados con funcionalidades hidrazinilo, hidrazida y aminoxi usando reacciones de ligación formadoras del enlace hidrazona / oxima (y viceversa). Alternativamente, se puede usar química 'Click' para inmovilizar proteínas sobre soportes sólidos, por lo que la proteína y el soporte se derivatizan con las funcionalidades químicas reactivas mutuamente apropiadas (azidas y alquinos). En otras realizaciones, se puede usar química de ligación de Staudinger para inmovilizar apropiadamente las proteínas derivatizadas sobre los soportes sólidos apropiadamente derivatizados.
El soporte sólido está contenido dentro de o es soportado por la columna de aféresis. Así, por "cargado" se indica que la columna lleva o contiene el soporte sólido de un modo tal que la sangre (periférica) pueda circular por la columna en contacto con el soporte sólido. Así, el soporte sólido proporciona una matriz dentro de la columna a través de la que circula la sangre, en modo continuo en ciertas realizaciones. Esto permite que las células que expresan el receptor de quimiocinas específico se retiren de la sangre que pasa a través de la columna, de forma que la sangre que sale de la columna se reduzca en las células específicas que expresan los receptores de quimiocinas. En realizaciones específicas, la columna de aféresis se carga con un soporte que comprende estreptavidina inmovilizada sobre el soporte y uno o más reactivos de unión biotinilados, tales como quimiocinas, unidos a estreptavidina sobre el soporte. El soporte sólido puede estar comprendido de un hidrato de carbono de alto peso molecular, opcionalmente reticulado, tal como agarosa.
Como se trata anteriormente, el reactivo de unión se acopla al soporte sólido. Se pueden controlar las cantidades relativas de reactivo de unión para garantizar que el acoplamiento entre el soporte sólido y el reactivo de unión sea inmediato, minimizando el riesgo de desacoplamiento del reactivo de unión del soporte sólido. Así, se puede garantizar que existe un exceso relativo de inmovilización de sitios para el reactivo de unión sobre el soporte sólido. Alternativamente, o además, después de la inmovilización del reactivo de unión sobre el soporte sólido, el soporte sólido se puede lavar para retirar el reactivo de unión no unido.
La columna de aféresis utilizada en las diversas realizaciones de la presente invención actúa de tratamiento para la leucaféresis para afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La columna actúa retirando específicamente los monocitos o leucocitos que expresan CCR1 explotando la interacción entre CCR1 expresado sobre la superficie celular y un reactivo de unión específico inmovilizado sobre un soporte sólido contenido dentro de o soportado por la columna. La columna global comprende normalmente, consiste en o consiste esencialmente en tres componentes combinados; 1) una carcasa que contiene o lleva 2) el soporte sólido y 3) uno o más reactivos de unión (inmovilizados encima) que se unen específicamente a uno o más receptores de quimiocinas. La carcasa se puede fabricar de cualquier material adecuado para uso clínico. En ciertas realizaciones, la carcasa está compuesta por un material de plástico. La carcasa incluye un sitio de entrada para la entrada de sangre y un sitio de salida para la sangre (reducida de células diana) para abandonar la columna. La carcasa se puede diseñar para mantener una circulación sanguínea continua mediante la matriz de soporte sólido. La carcasa (como se muestra, por ejemplo, en la Figura 3) puede incluir una porción superior que comprende una placa de distribución (2) en el sitio de entrada (1) para extender la sangre uniformemente sobre todo el área de la matriz. La placa de distribución puede actuar de primera barrera de seguridad que previene que partículas más grandes circulen por la columna y dentro del paciente. Sin embargo, la placa de distribución no es esencial y se puede quitar en algunas realizaciones para reducir la resistencia global en el sistema. La columna puede contener una o más unidades de filtros de seguridad (3 y 4) dispuestos en los sitios de entrada (1) y/o salida (5) de la carcasa de plástico. Dichas unidades de filtro pueden servir para prevenir que partículas mayores que los glóbulos sanguíneos entren y/o salgan de la columna. Las unidades de filtro de seguridad pueden contener una pluralidad de filtros, tales como dos, tres o cuatro filtros diseñados para ser una barrera robusta y detener todas las partículas mayores que los glóbulos sanguíneos que pasan por la columna. La inclusión de filtros de seguridad (3 y 4) en ambos extremos de la columna sirve para minimizar el riesgo de fuga de partículas al paciente, que incluye el supuesto caso en que el dispositivo esté conectado incorrectamente dando como resultado la circulación sanguínea en la dirección opuesta a la prevista. Los filtros de seguridad pueden comprender cualquier tamaño de poro adecuado para prevenir que partículas mayores que los glóbulos sanguíneos pasen por la columna, como sería fácilmente entendido por un experto en la técnica. Están comercialmente disponibles filtros adecuados. En realizaciones específicas, el tamaño de poro del (de los) filtro(s) es entre aproximadamente 60 |jm y 100 jm , más específicamente aproximadamente 80 jm . Los componentes del soporte sólido y del reactivo de unión se tratan con más detalle en el presente documento.
El volumen de la carcasa puede variar dependiendo de los volúmenes de sangre que se tiene previsto que pasen a través de la columna. Normalmente, el volumen de la carcasa es entre aproximadamente 40 ml y 200 ml, más específicamente 50 ml y 150 ml o 60 ml y 120 ml.
La columna se aplica, en general, en forma de un circuito de aféresis. En este contexto, el sistema global incluye la columna de aféresis, los tubos y una bomba apropiada para bombear la sangre alrededor del circuito. El sistema se ilustra en la Figura 4. El paciente (1) está conectado al circuito extracorpóreo por agujas estériles a las venas en los brazos derecho e izquierdo. También se conecta una bolsa de solución salina (3) y la solución salina se bombea con una bomba adecuada (2). Se saca sangre de un brazo del paciente por el sistema de tubos estériles por la bomba de sangre (4) y se pasa por la columna (6) y de nuevo al paciente. El sistema de tubos se puede conectar a la columna por cualquier acoplamiento adecuado, tal como acoplamientos convencionales de luer-lock para diálisis. Los acoplamientos en la columna pueden estar codificados por colores para el correcto ensamblaje. Por ejemplo, los tubos rojos para la entrada en la columna roja y los tubos azules para la salida de nuevo al paciente. Puede estar presente un detector de aire (8) en el circuito. Adicionalmente, se puede emplear presión de entrada (5) y/o sensores Pven (7) para monitorizar la presión en el circuito.
Una bomba de aféresis, tal como la bomba 4008 ADS fabricada por Fresenius Medical Care o la bomba Adamonitor, puede monitorizar la entrada y la salida del paciente. La bomba también puede monitorizar la presión en la circulación extracorpórea. La bomba puede ser capaz de discriminar aire por un colector de burbujas y detector de aire. Se puede disponer un filtro colector de coágulos dentro del colector de burbujas. La bomba también puede incorporar un detector óptico para distinguir entre luz, por ejemplo solución salina o aire presente en el sistema de tubos, y oscuridad, por ejemplo, sangre presente en el sistema de tubos.
Se muestra en la Figura 8 un diagrama esquemático de una bomba adecuada, que muestra el detector de aire y el filtro óptico. Si el sistema de bomba detecta burbujas de aire y fluctuaciones ópticas o si los valores de la presión extracorpórea están fuera del intervalo fijado, entonces la bomba se puede parar inmediatamente. Alternativamente o adicionalmente, se puede emitir una alarma visual / audible.
Los métodos de tratamiento de las diversas realizaciones de la invención se pueden entonces basar en un circuito extracorpóreo. Los métodos se pueden considerar como métodos ex vivo o in vitro y se definen únicamente con referencia a etapas realizadas fuera del paciente. En algunas realizaciones, sin embargo, el método comprende además, antes de la aplicación de la sangre a la columna, la recogida de sangre periférica del paciente. En una realización adicional, el método comprende además, después de la aplicación de la sangre a la columna, infundir la sangre reducida en células que expresan receptores de quimiocinas CCR1 al paciente. Esto es entonces un método de tratamiento de leucaféresis completa. Así, un método de leucaféresis, para tratar afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), comprende recoger sangre periférica del paciente; aplicar la sangre periférica a una columna de aféresis cargada con un soporte sólido que comprende uno o más reactivos de unión capaces de unirse específicamente a uno o más receptores de quimiocinas, en particular el receptor de quimiocinas CCR1, inmovilizado directa o indirectamente sobre el soporte, retirando así las células que expresan CCR1 de la sangre periférica del paciente; e infundir la sangre reducida (de las células que expresan receptores de quimiocinas) al paciente.
La sangre periférica puede ser continuamente recogida del paciente. Similarmente, la sangre reducida puede ser continuamente infundida al paciente, mediante el uso de un circuito apropiado como se describe en el presente documento. Así, el soporte se puede disponer en una columna a través de la que se hace circular la sangre. Esto se puede lograr usando una bomba adecuada, por ejemplo, como también se describe en el presente documento. La circulación sanguínea a través de la columna permite que el (los) reactivo(s) de unión inmovilizado(s) sobre el soporte sólido capturen las células que expresan el receptor de quimiocinas, reduciéndolas así de la sangre y previniendo su contribución a las afecciones respiratorias inflamatorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).
Los métodos de las diversas realizaciones de la invención y reactivos de unión para su uso en los métodos de las diversas realizaciones de la invención pueden requerir que el paciente se haya seleccionado para el tratamiento basándose en la detección de un aumento en el nivel de células que expresan receptores de quimiocinas CCR1 en una muestra obtenida del paciente. Dichos métodos diagnósticos con fines terapéuticos se describen en mayor detalle en el presente documento y se basan, por ejemplo, en la observación de que la expresión de CCR1 puede ser elevada en pacientes con afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Se muestra en el presente documento que los sujetos que padecen afecciones respiratorias tales como sarcoidosis presentan un aumento de la frecuencia de células que expresan receptores de quimiocinas en la sangre periférica. Los sujetos con sarcoidosis presentan un aumento de la frecuencia de células que expresan CCR1, tal como monocitos que expresan CCR1, en comparación con controles sanos. Similarmente, se muestra en el presente documento que los monocitos también expresan CCR2. También se muestra en el presente documento que los sujetos que padecen afecciones respiratorias tales como sarcoidosis presentan un aumento de frecuencia de células que expresan CCR7, tales como linfocitos que expresan CCR7, y también linfocitos T de memoria central, en comparación con controles sanos.
Así, (en este contexto) en ciertas realizaciones la invención también proporciona un método de diagnóstico, monitorización de la progresión de, o monitorización del tratamiento de afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) que comprende determinar:
a) los niveles de células que expresan receptores de quimiocinas CCR1
b) niveles de expresión de CCR1; y/o
c) niveles de células con alta expresión de CCR1 en una muestra obtenida de un sujeto, en donde altos niveles de células que expresan CCR1, altos niveles de expresión de CCR1 o altos niveles de células con alta expresión de CCR1 o niveles elevados de células que expresan CCR1 en comparación con control, niveles elevados de expresión de CCR1 en comparación con un control o niveles elevados de células con alta expresión de CCR1 en comparación con un control indican la presencia o la progresión de afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). También se pueden investigar los niveles de expresión de receptores de quimiocinas, a diferencia de los números de células, ya que niveles elevados de expresión de receptores de quimiocinas por célula también pueden ser diagnósticamente relevantes. En realizaciones específicas, las células relevantes para el diagnóstico, etc., de afecciones respiratorias, tales como sarcoidosis, comprenden monocitos, en particular monocitos que expresan CCR1. En otras realizaciones, las células relevantes para el diagnóstico, etc., de afecciones respiratorias tales como sarcoidosis comprenden linfocitos, específicamente linfocitos T tales como linfocitos T de memoria central.
En el presente documento se define "diagnosticar" para incluir el cribado de una enfermedad/afección o pre-indicación de una enfermedad/afección, identificar una enfermedad/afección o pre-indicación de una enfermedad/afección y comprobar la reaparición de la enfermedad/afección tras el tratamiento. Los métodos de los diversos ejemplos proporcionados en el presente documento también pueden tener valor pronóstico, y esto se incluye dentro de la definición del término "diagnóstico". Se puede usar el valor pronóstico de los métodos de los diversos ejemplos como marcador de la posible susceptibilidad a afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) identificando niveles de uno o más de la expresión de CCR2, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 y/o CCR7 asociada a la afección respiratoria. Así, los pacientes en riesgo se pueden identificar antes de que la enfermedad tenga la oportunidad de manifestarse ella misma en términos de síntomas identificables en el paciente. En ciertos ejemplos, el diagnóstico se puede hacer junto con otros indicadores objetivo de afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC): El diagnóstico de la sarcoidosis se puede hacer basándose en los signos clínicos; rayos X, biopsia, s-Ca, actividad de ACE. También se puede hacer el diagnóstico de EPOC por signos clínicos; espirometría de rayos X y gasometría.
"Monitorizar la progresión de" incluye realizar los métodos para monitorizar la etapa y/o el estado y progresión de las afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La monitorización de la progresión puede implicar realizar los métodos de diagnóstico múltiples veces en el mismo paciente para determinar si los niveles de células que expresan CCR1 están aumentando, disminuyendo o permanecen estables durante un cierto periodo de tiempo. Esto puede ser en el contexto de una pauta de tratamiento.
Se define que "monitorizar el éxito de un tratamiento particular" incluye determinar los niveles de células que expresan CCR1 antes y después de un tratamiento. El tratamiento es, en general, uno que pretende tratar afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), y puede ser un tratamiento según uno de los métodos de las diversas realizaciones de la invención como se define en el presente documento. El tratamiento satisfactorio se puede determinar con referencia a una disminución en las células que expresan CCR1 como resultado de, o después de, el tratamiento. Así, en dichos métodos se determina un nivel de células que expresan CCR1 antes del tratamiento. Se registra este nivel y se hace una evaluación adicional en un momento predeterminado después del tratamiento. La comparación de los niveles de células que expresan CCR1 permite monitorizar el éxito del tratamiento. En realizaciones específicas, un único tratamiento es suficiente para provocar una reducción de aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o 70 %, o más alta, hasta 80 %, 90 %, 95 % o más, o cualquier intervalo de valores entre y que incluye estas cantidades, de células que expresan CCR1 de la sangre periférica del paciente. En realizaciones específicas, se logra al menos aproximadamente 50 % de la reducción en un único tratamiento. Así, un tratamiento satisfactorio se puede definir con referencia a la reducción de células que expresan CCR1. El tratamiento puede conducir a la reducción de entre aproximadamente 100 y 500 millones de células que expresan CCR1, tales como monocitos, en ciertas realizaciones. Se pueden incluir factores adicionales para determinar el tratamiento satisfactorio. Por ejemplo, una ausencia de aumento en células que expresan CCR1 tras el tratamiento puede indicar tratamiento satisfactorio en términos de prevenir la progresión adicional de la afección, combinado opcionalmente con una mejora en otros marcadores o estadificación de las afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).
Por la unión a la columna mediante la interacción de reactivo de unión-receptor de quimiocinas, se inmovilizan las células que expresan receptores de quimiocinas. Estas células inmovilizadas expresan receptores de quimiocinas no ocupados adicionales, que pueden ser del mismo tipo o diferente a los usados para la captura. Estos receptores de quimiocinas adicionales pueden permitir que quimiocinas circulantes que contribuyen a la afección inflamatoria sean capturadas de la sangre periférica. Así, una reducción en los niveles de quimiocinas circulantes (específicos) puede proporcionar una medida de tratamiento satisfactorio. En realizaciones específicas, las células relevantes para el diagnóstico, etc., de afecciones respiratorias tales como sarcoidosis comprenden monocitos, en particular monocitos que expresan CCR1. En otras realizaciones, las células relevantes para el diagnóstico, etc., de afecciones respiratorias tales como sarcoidosis comprenden linfocitos, específicamente linfocitos T, tales como linfocitos T de memoria central.
En realizaciones específicas, las afecciones respiratorias se seleccionan de sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).
La muestra en la que se determinan los niveles de células que expresan CCR1, niveles de expresión de CCR1 y/o niveles de células con alta expresión de CCR1 (definidas como CCR1alta) puede comprender cualquier muestra de tejido o muestra de líquido corporal adecuada. En general, la muestra de prueba se obtiene de un sujeto humano. Normalmente, la muestra es una muestra de sangre, en particular una muestra de sangre periférica. La muestra puede comprender una biopsia de tejido adiposo en ciertas realizaciones. Los métodos pueden implicar determinar niveles de monocitos , macrófagos o linfocitos que expresan CCR1 en ciertas realizaciones. En realizaciones específicas, las células relevantes para el diagnóstico, etc., de afecciones respiratorias tales como sarcoidosis comprenden monocitos, en particular monocitos que expresan CCR1. En otras realizaciones, las células relevantes para el diagnóstico, etc., de las afecciones respiratorias tales como sarcoidosis comprenden linfocitos, específicamente linfocitos T, tal como linfocitos T de memoria central.
Los niveles de células que expresan CCR1, niveles de expresión de CCR1 y/o niveles de células con alta expresión de CCR1 (definidas como CCR1alta) se pueden determinar según cualquier método adecuado. Por ejemplo, se puede emplear citometría de flujo para determinar el número de células que expresan CCR1 en la muestra, para determinar los niveles de expresión de CCR1 y/o para identificar niveles de CCR1alta. Se describen técnicas de citometría de flujo en el presente documento y los ejemplos de anticuerpos adecuadamente marcados comercialmente disponibles para su uso en citometría de flujo se exponen en la Tabla 1, por ejemplo. Alternativamente, el método puede implicar etapas de recoger y fijar las células en la muestra, seguido por incubación con un reactivo de unión adecuado que se une específicamente a las células que expresan receptores de quimiocinas CCR1 en la muestra. Se puede emplear cualquier reactivo de unión adecuado, como se define en el presente documento. Por ejemplo, se puede emplear un anticuerpo específico de CCR1. Se puede adoptar una etapa de lavado después de un periodo de incubación para retirar cualquier reactivo no unido. Un experto en la técnica conocería las etapas de lavado y las condiciones de incubación adecuadas. El reactivo de unión puede ser directamente marcado para permitir que se determine directamente la unión del anticuerpo. Alternativamente, se puede emplear un reactivo de unión secundario, tal como un anticuerpo, que se une al primer reactivo de unión y lleva una marca. Nuevamente, las condiciones de incubación y las etapas de lavado adecuadas serían evidentes para un experto en la técnica. Los reactivos de unión primarios y secundarios pueden formar dos mitades de un par de unión. La interacción de unión no debe prevenir que el reactivo de unión primario se una a las células que expresan el receptor de CCR1, a menos que se emplee un ensayo de competición. Las dos mitades de un par de unión pueden comprender un par de antígeno-anticuerpo, anticuerpoanticuerpo, receptor-ligando, biotina-estreptavidina, etc., en ciertas realizaciones. Otras técnicas usadas para cuantificar los niveles de células que expresan receptores de quimiocina CCR1, para cuantificar niveles de expresión de CCR1 y/o para cuantificar niveles de células de CCR1alta incluyen técnicas basadas en PCR tales como QT-PCR y métodos basados en proteína tales como transferencia Western. La cuantificación se puede lograr con referencia a líneas celulares fijas que llevan números conocidos de diversas células que expresan receptores y/o niveles conocidos de expresión de receptor por célula. Dichas líneas celulares fijas están comercialmente disponibles (por ejemplo, líneas celulares ChemiScreen™ de Millipore). También se pueden emplear métodos análogos a los métodos de tratamiento de las diversas realizaciones de la invención, siendo determinada la unión de las células que expresan CCR1 al soporte sólido después de que la sangre periférica pase a través de la columna.
Se pueden determinar los niveles de células que expresan CCR1, niveles de expresión de CCR1 y/o niveles de células con alta expresión de CCR1 (definidas como CCR1alta) con respecto a un control adecuado. Cuando se diagnostica una afección respiratoria, se puede establecer un nivel umbral de células, nivel de expresión de CCR1 y/o nivel de células con alta expresión de CCR1 (definidas como CCR1alta) en o por encima del cual se hace un diagnóstico positivo. Este umbral se puede determinar basándose en los niveles de medición de células que expresan CCR1, niveles de expresión de CCR1 y/o niveles de células con alta expresión de CCR1 (definidas como CCR1alta) en muestras obtenidas de pacientes enfermos y comparando estos niveles con niveles de células que expresan CCR1, niveles de expresión de CCR1 y/o niveles de células con alta expresión de CCR1 (definidas como CCR1 alta) en muestras obtenidas de sujetos sanos.
En ciertos ejemplos, se diagnóstica un trastorno respiratorio basándose en los niveles de células que expresan receptores de quimiocinas. Se puede hacer un diagnóstico positivo en sujetos basándose en la presencia de más de aproximadamente 10 %, más de aproximadamente 20 %, más de aproximadamente 30 %, más de aproximadamente 40 %, más de aproximadamente 50 %, más de aproximadamente 55 %, más de aproximadamente 60 %, más de aproximadamente 65 %, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 75 %, más de aproximadamente 80 %, más de aproximadamente 85 %, más de aproximadamente 90 %, más de aproximadamente 95 %, o más células que expresan receptores de quimiocinas en la muestra, como un porcentaje de células totales en la muestra. En otros ejemplos, se diagnóstica un trastorno respiratorio basándose en la presencia de un aumento de aproximadamente 1,2 veces o mayor, tal como un aumento de aproximadamente 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 10, 20, 50 o 100 veces o mayor en células que expresan receptores de quimiocinas, con respecto a los controles sanos.
En ejemplos específicos, la sarcoidosis se diagnóstica basándose en los niveles de células que expresan CCR1 o CCR7. Se puede hacer un diagnóstico positivo en los sujetos basándose en la presencia de más de aproximadamente 10 %, más de aproximadamente 15 % o más de aproximadamente 20 % de linfocitos T de memoria central que expresan CCR7 en la muestra, como un porcentaje de células totales en la muestra. Se puede hacer un diagnóstico positivo en sujetos basándose en la presencia de más de aproximadamente 40 %, más de aproximadamente 45 %, más de aproximadamente 50 %, más de aproximadamente 55 %, más de aproximadamente 60 %, más de aproximadamente 65 %, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 75 %, más de aproximadamente 80 % o más de aproximadamente 85 % o más de linfocitos T que expresan CCR7 en la muestra, como un porcentaje de células totales en la muestra. Se puede hacer un diagnóstico positivo en los sujetos basándose en la presencia de más de aproximadamente 60 %, más de aproximadamente 65 %, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 75 %, más de aproximadamente 80 %, más de aproximadamente 85 % o más de aproximadamente 90 % de monocitos que expresan CCR1 en la muestra, como un porcentaje de células totales en la muestra. La sarcoidosis también se puede diagnosticar basándose en la presencia de un aumento de aproximadamente 1,2 veces o mayor, tal como un aumento de aproximadamente 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 10, 20, 50 o 100 veces o mayor en las células específicas que expresan receptores de quimiocinas, con respecto a los controles sanos.
En ciertos ejemplos, la progresión de un trastorno respiratorio, que pueden ser en el contexto de una pauta de tratamiento, se monitoriza basándose en los niveles de células que expresan receptores de quimiocinas en diferentes momentos de tiempo. La progresión de un trastorno respiratorio se puede indicar en sujetos basándose en un aumento de más de aproximadamente 10 %, tal como un aumento de más de aproximadamente 15 %, más de aproximadamente 20 %, más de aproximadamente 25 %, más de aproximadamente 30 %, más de aproximadamente 35 %, más de aproximadamente 40 %, más de aproximadamente 45 %, más de aproximadamente 50 %, más de aproximadamente 55 %, más de aproximadamente 60 %, más de aproximadamente 65 %, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 75 % o más células que expresan receptores de quimiocinas en la muestra, como un porcentaje de células totales en la muestra, en comparación con una muestra tomada del mismo sujeto en un momento de tiempo anterior. En otros ejemplos, la progresión de un trastorno respiratorio se confirma basándose en la presencia de un aumento de aproximadamente 1,2 veces o mayor, tal como un aumento de aproximadamente 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 10, 20, 50 o 100 veces o mayor en células que expresan receptores de quimiocinas, con respecto a una muestra tomada del mismo sujeto en un momento de tiempo anterior.
En realizaciones específicas, la sarcoidosis se monitoriza basándose en los niveles de células que expresan CCR1, tales como monocitos que expresan CCR1. La progresión de la enfermedad, que puede ser en el contexto de una pauta de tratamiento, se pueden indicar en sujetos basándose en la presencia de un aumento de más de aproximadamente 10 %, tal como superior a aproximadamente 15 %, más de aproximadamente 20 %, más de aproximadamente 25 %, más de aproximadamente 30 %, más de aproximadamente 35 %, más de aproximadamente 40 %, más de aproximadamente 45 %, más de aproximadamente 50 %, más de aproximadamente 55 %, más de aproximadamente 60 %, más de aproximadamente 65 %, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 75 % o más células que expresan receptores de quimiocinas en la muestra, como un porcentaje de células totales en la muestra, en comparación con una muestra tomada del mismo sujeto en un momento de tiempo anterior. Se puede monitorizar la regresión o el tratamiento satisfactorio basándose en una disminución similar durante diversos momentos de tiempo. Por ejemplo, se pueden indicar la regresión o satisfactorio tratamiento en sujetos basándose en una disminución de aproximadamente 10 %, tal como una disminución de aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 % o más células que expresan receptores de quimiocinas en la muestra, como un porcentaje de células totales en la muestra, en comparación con una muestra tomada del mismo sujeto en un momento de tiempo anterior. En otros ejemplos, la regresión de trastornos respiratorios se confirma basándose en la presencia de a aproximadamente una disminución de 1,2 veces o mayor, tal como aproximadamente una disminución de 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 10, 20, 50 o 100 veces o mayor en células que expresan receptores de quimiocinas, con respecto a una muestra tomada del mismo sujeto en un momento de tiempo anterior.
En realizaciones específicas, la sarcoidosis se monitoriza basándose en los niveles de células que expresan CCR1 tales como monocitos que expresan CCR1. Se puede hacer la regresión o el tratamiento satisfactorio de la enfermedad en sujetos basándose en una disminución de aproximadamente 50 %, tal como tal como una disminución de aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o más células que expresan CCR1 o CCR7 en la muestra, como un porcentaje de células totales en la muestra o por una disminución de aproximadamente 10 %, tal como una disminución de aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 % o más células que expresan receptores de quimiocinas en la muestra, como un porcentaje de células totales en la muestra, en comparación con una muestra tomada del mismo sujeto en un momento de tiempo anterior.
El software adecuado está libremente disponible (tal como el proyecto R para cálculo estadístico) para realizar el análisis estadístico necesario de los datos obtenidos para calcular un umbral útil. El umbral se puede establecer para maximizar la sensibilidad y/o la especificidad de la prueba. El rendimiento de la prueba a este respecto se puede medir representado una curva de eficacia diagnóstica (ROC) (sensibilidad frente a especificidad). El área bajo la curva proporciona una indicación del rendimiento global de la prueba. Así, una vez se han establecidos los umbrales para diagnosticar la afección, no se tiene que realizar necesariamente un experimento de control separado cada vez que se prueba una muestra. Más bien, la referencia se puede hacer simplemente a los umbrales preexistentes para determinar el diagnóstico. Sin embargo, en ciertas realizaciones, la muestra se prueba junto con una muestra de control tomada de un sujeto sano para proporcionar un comparador basado en condiciones experimentales esencialmente idénticas. La muestra de prueba se prueba, en general, en paralelo con la muestra de control. El nivel de muestras de prueba de células que expresan CCR1, los niveles de expresión de CCR1 y/o los niveles de células con alta expresión de CCR1 (definidas como CCR1alta) se pueden comparar entonces con los de la muestra de control para hacer el diagnóstico. También se puede probar una muestra de control de un paciente enfermo en ciertas realizaciones. La referencia a los controles permite niveles relativos ("altos", "bajos" etc.) de células que expresan CCR1 en la muestra de prueba para que sea fácilmente identificada e interpretar su significancia. La referencia a los controles también permite niveles de expresión relativos de CCR1 ("altos", "bajos" etc.) dentro de la población de células a determinar e interpretar su significancia. Dicha determinación puede indicar, por ejemplo, los niveles promedio de expresión de CCR1 por célula en la muestra de prueba.
Así, en realizaciones específicas, niveles altos o más altos de una o más de células que expresan CCR1 o niveles altos o más altos de uno o más de la expresión CCR1, por ejemplo expresión promedio de CCR1 por célula, o niveles altos o más altos de una o más células de CCR1alta se correlacionan con enfermedad activa o enfermedad más activa. Similarmente, niveles bajos o más bajos de una o más de células que expresan CCR1, o niveles bajos o más bajos de uno o más de la expresión de CCR1, por ejemplo, expresión de CCR1 promedio por célula, o niveles bajos o más bajos de una o más de células CCR1alta, se pueden correlacionar con una ausencia de inflamación o enfermedad activa. Esto se puede definir como "enfermedad menos activa". Se puede prever fácilmente que se puedan evaluar muestras de control y determinar niveles de células que expresan CCR1, niveles de expresión de CCR1 y/o niveles de células con alta expresión de CCR1 (definidas como CCR1h¡) en el intervalo de intensidades de las afecciones respiratorias. Esto puede ayudar a correlacionar los niveles de células que expresan CCR1, niveles de expresión de CCR1 y/o niveles de células con alta expresión de CCR1 (definidas como CCR1alta) en la muestra de prueba con la intensidad relativa de la afección.
Cuando se monitoriza la progresión de, o se monitoriza el tratamiento de afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), las muestras de control se pueden tomar del sujeto en un momento de tiempo anterior. Sin embargo, se pueden basar en valores de referencia conocidos como se trata anteriormente. Así, los niveles relativos de células que expresan CCR1, niveles relativos de expresión de CCR1 que incluyen niveles relativos de promedio CCR1, expresión por célula o niveles relativos de células CCR1alta pueden ser con referencia a muestras tomadas del mismo sujeto en un momento de tiempo diferente. En ciertas realizaciones, la disminución de los niveles de células que expresan CCR1, la disminución de los niveles relativos de expresión de CCR1 que incluye la disminución de los niveles relativos de promedio expresión de CCR1 por célula, o la disminución de los niveles relativos de una o más células CCR1 alta se correlacionan con tratamiento satisfactorio. El tratamiento puede ser cualquier tratamiento adecuado, pero en realizaciones específicas es un tratamiento según las diversas realizaciones de la invención.
Cuando se monitoriza la progresión de afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), niveles elevados de células que expresan CCR1, niveles relativos elevados de expresión de CCR1 que incluyen niveles relativos elevados de la expresión promedio de CCR1 por célula o niveles relativos elevados de células CCR1h¡ pueden indicar la progresión de la afección o enfermedad. Así, si los niveles de células que expresan CCR1, niveles de expresión de CCR1 y/o niveles de células con alta expresión de CCR1 (definidas como CCR1 alta) son elevados en una muestra tomada después de una muestra del mismo paciente, esto puede indicar progresión de la afección.
Puesto que los niveles de células que expresan CCR1, niveles de expresión de CCR1 o niveles de células CCR1alta son diagnósticamente relevantes, la determinación de dichos niveles en una muestra obtenida de un sujeto puede influir en la selección del tratamiento para ese sujeto. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la invención proporciona un método de selección de un tratamiento adecuado para afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) que comprende determinar:
a) los niveles de las células que expresan receptores de quimiocinas CCR1,
b) niveles de expresión de CCR1, y/o
c) niveles de células con alta expresión de CCR1, en una muestra obtenida de un sujeto, en donde altos niveles de células que expresan CCR1, altos niveles de expresión de CCR1, o altos niveles de células con alta expresión de CCR1, o niveles elevados de células que expresan CCR1 en comparación con control, niveles elevados de expresión de CCR1, en comparación con un control o niveles elevados de células con alta expresión de CCR1, en comparación con un control, dan como resultado la selección de un tratamiento como se define en el presente documento para el tratamiento de las afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En ciertas realizaciones, las células que expresan receptores de quimiocinas son células de alta expresión de receptores de quimiocinas, en particular células de alta expresión de CCR1. En realizaciones específicas, las células comprenden monocitos, en particular monocitos que expresan CCR1. En otras realizaciones, las células comprenden linfocitos, específicamente linfocitos T, tal como linfocitos T de memoria central.
En realizaciones específicas, un trastorno respiratorio se trata basándose en la medición de los niveles de células que expresan receptores de quimiocinas. Así, se puede aplicar un tratamiento según las diversas realizaciones de la invención basándose en la presencia de más de aproximadamente 10 %, más de aproximadamente 20 %, más de aproximadamente 30 %, más de aproximadamente 40 %, más de aproximadamente 50 %, más de aproximadamente 55 %, más de aproximadamente 60 %, más de aproximadamente 65 %, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 75 %, más de aproximadamente 80 %, más de aproximadamente 85 %, más de aproximadamente 90 %, más de aproximadamente 95 %, o más células que expresan receptores de quimiocinas en la muestra, como un porcentaje de células totales en la muestra. En otras realizaciones, un trastorno respiratorio se trata según las diversas realizaciones de la invención basándose en la presencia de un aumento de aproximadamente 1,5 veces o mayor, tal como un aumento de aproximadamente 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 10, 20, 50 o 100 veces o mayor en células que expresan receptores de quimiocinas, con respecto a los controles sanos.
En realizaciones específicas, la sarcoidosis se trata basándose en los niveles de células que expresan CCR1. Así, se puede aplicar un tratamiento según las diversas realizaciones de la invención basándose en la presencia de más de aproximadamente 60 %, más de aproximadamente 65 %, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 75 %, más de aproximadamente 80 %, más de aproximadamente 85 % o más de aproximadamente 90 % de monocitos que expresan CCR1 en la muestra, como un porcentaje de células totales en la muestra. La sarcoidosis también se puede tratar basándose en la presencia de un aumento de aproximadamente 1,2 veces o mayor, tal como un aumento de aproximadamente 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 10, 20, 50 o 100 veces o mayor en las células que expresan receptores de quimiocinas específicas, con respecto a los controles sanos.
Para evitar dudas, todas las realizaciones descritas con respecto a los métodos de las diversas realizaciones de la invención se aplican a estos aspectos cambiando lo que haya que cambiar y no se repiten por motivos de brevedad. Específicamente, se pueden indicar afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), junto con uno o más de los siguientes indicadores: El diagnóstico de sarcoidosis se puede hacer basándose en signos clínicos; rayos X, biopsia, s-Ca, actividad de ACE. También se puede hacer el diagnóstico de EPOC por signos clínicos; espirometría de rayos X y gasometría.
En realizaciones específicas, la muestra es una muestra de sangre periférica.
Los métodos y usos médicos de las diversas realizaciones de la invención se pueden así adaptar a la necesidad de pacientes individuales o grupos de pacientes basándose en los diversos métodos de diagnóstico de las diversas realizaciones de la invención. Retirando de la circulación las células que expresan CCR1, tales como monocitos, macrófagos y linfocitos, en particular monocitos, regulados por incremento en diversas afecciones inflamatorias asociadas a afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), se puede controlar un factor importante en el proceso inflamatorio de dichas afecciones.
Las diversas realizaciones de la invención se describirán ahora con más detalle por referencia a las siguientes realizaciones no limitantes y ejemplos:
Descripción de las figuras
FIG. 1a, 1b y 1c - unión de MIP-1a biotinilada por linfocitos T CD4+, CD8+ y monocitos CD14+, respectivamente, obtenidos de sangre periférica de un donante sano;
FIG. 2a, 2b y 2c - unión de MCP-1 biotinilada por linfocitos T CD4+, CD8+ y monocitos CD14+, respectivamente, obtenidos de sangre periférica de un donante sano;
FIG. 3a, 3b y 3c - unión de IL-8 por linfocitos T CD4+, CD8+ y monocitos CD16+, respectivamente, obtenidos de sangre periférica de un donante sano
FIG. 4a - unión de MCP-1 a monocitos (línea discontinua) en sangre periférica tomada de pacientes con EII. El gráfico representa un resumen de cuatro pruebas.
FIG. 4b - unión de anticuerpo contra CCR2 a monocitos (línea) en sangre periférica tomada de pacientes con EII. El gráfico representa un resumen de cuatro pruebas.
FIG. 5a - unión de eotaxina a neutrófilos/eosinófilos (línea discontinua) en sangre periférica. El gráfico representa un resumen de cuatro pruebas.
FIG. 5b - unión de anticuerpo contra CCR3 a neutrófilos/eosinófilos (línea) en sangre periférica. El gráfico representa un resumen de cuatro pruebas.
FIG. 6 - Carcasa y tapa de plástico que muestran la placa de distribución (2) y las unidades de filtro de seguridad (3 y 4).
FIG. 7 - Sistema de leucaféresis entero.
FIG. 8 - Bomba con detector de aire y detector óptico (4).
FIG. 9a - Resultados de las pruebas de reducción in vitro realizadas en la matriz acoplada a bMCP-1 que muestra la capacidad para eliminar células que expresan CCR2 de la sangre de tres donantes sanos.
FIG. 9b - Resultados de las pruebas de reducción in vitro realizadas en la matriz acoplada a RANTES biotinilada que muestra la capacidad de eliminar células que expresan receptores de quimiocinas de la sangre periférica tomada de un donante sano.
FIG. 9c - Resultados de las pruebas de reducción in vitro realizadas en la matriz acoplada a eotaxina biotinilada que muestran la capacidad para eliminar células que expresan CCR3 de sangre de un donante sano.
FIG. 10 - Secuencia y biotinilación, por un grupo espaciador, de derivado de proteína madura MCP-1 que contiene la modificación de Gln a piroGlu.
FIG. 11 - Secuencia y biotinilación, por un grupo espaciador, de derivado de proteína madura MCP-1 que contiene la modificación de Gln a piroGlu y sustitución de Met por Norleu.
FIG. 12 - Secuencia y biotinilación, por un grupo espaciador, de derivado de MCP-1 truncado que contiene la sustitución de Met a Norleu.
FIG. 13 - Alineamiento de secuencias de aminoácidos de MCP-1 y MCP-5.
FIG. 14 - Secuencia y biotinilación, por un grupo espaciador, de derivado de MCP-5 truncado (extremo C) que contiene la modificación de lie a Lys.
FIG. 15 - Secuencia y biotinilación, de derivado de RANTES.
FIG. 16 - Secuencia y biotinilación, por un grupo espaciador, del derivado de la proteína madura eotaxina que contiene amida del extremo C.
FIG. 17 - Ejemplo de criterios de apertura para monocitos que expresan CCR2
FIG. 18 - Frecuencia de monocitos que expresan CCR1 en 20 controles sanos y 2 pacientes con sarcoidosis. Se analizaron la expresión de receptores de quimiocinas y marcadores celulares específicos con citometría de flujo. FIG. 19 - Expresión de CCR1 en comparación con la unión de bRANTES a monocitos de sangre de un paciente con sarcoidosis. Se analizaron la expresión de receptores de quimiocinas, unión de quimiocina y marcadores celulares específicos con citometría de flujo.
FIG. 20 - La reducción de monocitos que expresan CCR1 con matriz de estreptavidina Sepharose conjugada con bRANTES. Se incubaron glóbulos sanguíneos de un control sano con matriz de quimiocina biotiniladaestreptavidina Sepharose. Se recuperaron las células sin unir lavando la matriz. Entonces se analizaron las células (Después de la reducción) con citometría de flujo y se compararon con las células que no se habían incubado con matriz de quimiocina biotinilada (Antes de la reducción).
FIG. 21 - Expresión de CCR2 en monocitos de dos pacientes con sarcoidosis. Se analizaron la expresión de receptores de quimiocinas, unión de quimiocina y marcadores celulares específicos con citometría de flujo.
FIG. 22 - Unión de la quimiocina bMCP-1 a monocitos. Las barras representan la frecuencia de monocitos que se unen a MCP-1 y monocitos que expresan CCR2 en sangre de un paciente con sarcoidosis. La sangre se incubó con quimiocina biotinilada y se analizó con citometría de flujo.
FIG. 23 - Reducción de monocitos que expresan CCR2 con matriz de estreptavidina Sepharose conjugada con bMCP-1. Se incubaron glóbulos sanguíneos de un control sano con matriz de quimiocina biotiniladaestreptavidina Sepharose. Se recuperaron las células sin unir lavando la matriz. Entonces se analizaron las células (Después de la reducción) con citometría de flujo y se compararon con células que no se habían incubado con matriz de quimiocinab (Antes de la reducción).
FIG. 24a - Frecuencia de linfocitos T que expresan CCR7. Las barras representan la frecuencia de linfocitos T que expresan CCR7 en 2 pacientes y 20 controles sanos. Se analizó la expresión de receptores de quimiocinas y marcadores celulares específicos con citometría de flujo. Los linfocitos T se caracterizaron como CD3 positivos. FIG. 24b - Frecuencia de linfocitos T de memoria central en un paciente con sarcoidosis. Los linfocitos T de memoria central se caracterizaron como linfocitos CD3 positivos, CD4 positivos, CD45RA negativos, CCR7 positivos.
FIG. 25 - La reducción de linfocitos T que expresan CCR7 con matriz de estreptavidina Sepharose conjugada con bMIP3b. Se incubaron glóbulos sanguíneos de un paciente con sarcoidosis con matriz de quimiocina biotinilada-estreptavidina Sepharose. Se recuperaron las células sin unir lavando la matriz. Entonces se analizaron las células (Después de la reducción) con citometría de flujo y se compararon con células que no se habían incubado con la matriz de quimiocinab (Antes de la reducción).
Descripción de realizaciones preferidas
Se monitorizaron los niveles en plasma de MCP-1 y MIP-1a en 26 pacientes con sarcoidosis pulmonar activa durante un periodo de dos años. Durante este periodo, los autores muestran que los niveles de estas citocinas estuvieron estrechamente relacionados con la evolución clínica de la enfermedad. Los autores llegan a la conclusión de que los niveles plasmáticos de MCP-1 y MIP-1a son indicadores útiles de la intensidad clínica de la sarcoidosis, y que los niveles "pueden reflejar la evidencia subclínica de la sarcoidosis extratorácica y pueden desempeñar una función en iniciar la migración de monocitos en el tejido". Hashimoto S et al., Clin Exp Immunol, 1998
Se midieron los niveles séricos de MCP-1 en 47 pacientes con sarcoidosis y 10 controles sanos. Los niveles de quimiocina fueron significativamente más altos en el grupo de pacientes, y más específicamente, se correlacionaron positivamente con pacientes en etapas tempranas de la enfermedad. Además, se mostró que MCP-1 se expresaba específicamente por macrófagos asociados a ganglios linfáticos sarcoides. lyonaga K et al, Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis, 1998
Se midieron las citocinas inflamatorias TNF-a, IL-8, MCP-1, MMP9 y GRO-a en 100 pacientes con EPOC y 50 fumadores sanos equiparados. Estos valores se correlacionaron posteriormente con el índice de BODE de intensidad de la enfermedad EPOC. La mayor diferencia en estos biomarcadores se observó en los niveles séricos de MCP-1 que fueron significativamente elevados en el grupo de EPOC. Los autores llegan a la conclusión de que los niveles séricos de MCP-1 pueden ser un candidato clínico para distinguir entre fumadores sanos y pacientes con EPOC estable. Liu SF et al, Respirology, 2009.
Se midieron TNF-alfa, IL-8, MMP-9, MCP-1, TIMP-1 y TIMP-2 en 20 pacientes con EPOC, 10 fumadores asintomáticos y 10 controles sanos no fumadores. Los autores encontraron elevaciones altamente reproducibles y estadísticamente significativas de IL-8 plasmática entre los pacientes con EPOC en comparación con los otros grupos. No se observaron otras correlaciones. Shaker SB et al, Clin Respir J, 2008.
Se muestra en el presente documento que los sujetos que padecen afecciones respiratorias tales como sarcoidosis presentaron un aumento de la frecuencia de células que expresan receptores de quimiocinas en la sangre periférica. Los sujetos con sarcoidosis presentaron un aumento de la frecuencia de células que expresan CCR1, tales como monocitos que expresan CCR1, en comparación con los controles sanos. También se muestra en el presente documento que las células que expresan CCR1 se pueden retirar usando un reactivo de unión adecuado, en particular RANTES (en forma biotinilada) inmovilizado sobre una matriz adecuada. Similarmente, se muestra en el presente documento que los monocitos también expresan CCR2. Los monocitos que expresan CCR2 pueden ser reducidos en pacientes con sarcoidosis usando un reactivo de unión adecuado, en particular MCP-1, en forma biotinilada, inmovilizado sobre una matriz adecuada. También se muestra en el presente documento que los sujetos que padecen afecciones respiratorias tales como sarcoidosis presentaron un aumento de la frecuencia de células que expresan CCR7, tales como linfocitos que expresan CCR7, y también linfocitos T de memoria central, en comparación con controles sanos. También se muestra en el presente documento que las células que expresan CCR7 se pueden retirar usando un reactivo de unión adecuado, en particular MIP3b (en forma biotinilada) inmovilizado sobre una matriz adecuada.
Basándose en esto, los inventores han seleccionado varios receptores de quimiocinas para su uso como dianas para el tratamiento.
Ejemplos 1 a 9
Materiales y métodos
Aislamiento de leucocitos de sangre periférica. Se fijó sangre periférica heparinizada de donantes de sangre sanos o pacientes con enfermedad inflamatoria del intestino (EII) con 4 % de paraformaldehído durante 4 minutos, se hemolizó durante 15 minutos con una disolución al 0,83 % de cloruro de amonio y se lavó dos veces en tampón FACS para obtener una suspensión de leucocitos sanguíneos.
Quimiocinas. Los leucocitos se incubaron durante 30 min en la oscuridad a 4 °C con quimiocina biotinilada y marcada con Alexa647 Fluor® (CCL5, CCL2, CXCL8) (en concentraciones 10 ng/|jl y 50 ng/|jl). Entonces se lavaron las células con tampón FACS y se analizaron por citometría de flujo. Todas las quimiocinas usadas en los ejemplos se proporcionaron por Almac Sciences Scotland Ltd, Edimburgo, Escocia.
Ensayo de citometría de flujo. Se realizó el ensayo de citometría de flujo en un citómetro FACS Calibur de dos láseres (BD Immunocytometry systems, San Jose, Ca, EE. UU.). Se contaron diez mil células y se analizaron en cada muestra. Para el análisis de datos, se usó el software Cell Quest Pro de Becton Dickinson.
Ejemplo 1 - Unión de monocitos a MIP-1a. En el experimento con MIP-1a biotinilada se encontró que aproximadamente 90 % de los monocitos obtenidos de sangre periférica de donantes sanos se habían unido a la citocina después de 30 min de incubación (Fig. 1c), mientras que los linfocitos CD4+ y CD8+ no se habían unido (Fig. 1a y 1b).
Ejemplo 2 - Unión de monocitos a MCP-1. En el experimento con MCP-1 biotinilado se encontró que aproximadamente 90 % de los monocitos obtenidos de sangre periférica de donantes sanos se habían unido a la citocina después de 30 min de incubación (Fig. 2a), mientras que los linfocitos CD4+ y CD8+ no se habían unido (Fig.
2b y 2c).
Ejemplo 3 - Afinidad de glóbulos sanguíneos por IL-8 biotinilada. En la Fig. 3, se muestra la unión a IL-8 biotinilada (CXCL8) de linfocitos CD4+ (Fig. 3a), linfocitos CD8+ (Fig. 3b) y neutrófilos CD16+ (Fig. 3c) obtenidos de donantes sanos. Después de 30 min de incubación, todos los neutrófilos CD16+ se unieron a IL-8. A diferencia, no se observó unión con linfocitos CD4+ ni con linfocitos CD8+.
Ejemplo 4 - Se investigaron monocitos para su expresión de CCR2 (FIG. 4b) y su capacidad para unirse a MCP-1 (FIG. 4a). Se observó la expresión de CCR2 en todos los monocitos, expresando la mayoría de los monocitos altos niveles, usando un anticuerpo anti-CCR2 (FIG. 4b). La unión de MCP-1 a los monocitos mostrados en la FIG. 2a corresponde a la población que expresa CCR2alta mostrada en la FIG. 4b. Así, MCP-1 se une favorablemente a las células que expresan CCR2alta.
Ejemplo 5 - Se investigaron neutrófilos/eosinófilos para su expresión de CCR3, (FIG. 1b) y su capacidad para unirse a eotaxina (FIG. 5a). Se observó la expresión de CCR3 en todos los neutrófilos/eosinófilos, expresando la mayoría de los neutrófilos/eosinófilos altos niveles, usando un anticuerpo anti-CCR3 (FIG. 5b). La unión de eotaxina a los neutrófilos/eosinófilos mostrados en la FIG. 5a corresponde a la población que expresa CCR3alta mostrada en la FIG.
5b. Así, la eotaxina se une favorablemente a células que expresan CCR3alta.
Ejemplo 6 - Preparación de una columna de quimiocinas para la aféresis de glóbulos sanguíneos. A perlas de agarosa reticulada con estreptavidina (ProZyme, San Leandro, CA, EE. UU.) en el intervalo desde 75 |jm hasta 300 |j suspensas (200 ml, -50 %, v/v) en una disolución acuosa de fosfato de sodio 25 mM (pH 7,0) y NaCl 150 mM se añadió la disolución de 75 jg de MIP-1a biotinilada (Almac Sciences) en el mismo tampón a 22 °C y se agitó lentamente a mano durante 3 min. Después de reposar durante otros 20 min, se separó por filtración el soporte, se lavó tres veces con fosfato de sodio/cloruro sódico acuoso neutro y se llenó en una columna de vidrio (d.i. 25 mm, longitud 12 cm).
Ejemplo 7 - Separación de monocitos de sangre periférica de un donante sano con la columna de quimiocinas del Ejemplo 5. Se analizó sangre periférica heparinizada de un donante masculino sano por citometría de flujo para linfocitos CD4+, linfocitos CD8+ y monocitos CD14. Se filtraron 100 ml de la sangre a través de la columna a una tasa de aproximadamente 8 ml por min y se lavaron con tampón FACS. Se analizó la sangre filtrada para las mismas células. Se encontró que aproximadamente 95 % de los monocitos habían sido retenidos por la columna, mientras que se había recuperado más de 90 % de cada uno de los linfocitos CD4+ y CD8+.
Ejemplo 8 - Preparación de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina complejadas con MIP-1a biotinilada. Se mezcló una suspensión acuosa de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina (MagCellect estreptavidina Ferrofluid, 1 ml; R&D Systems, Mineápolis, MN, EE. UU.) con 30 jg de MIP-1a (Almac Sciences) en 50 ml de fosfato de sodio 25 mM (pH 7,0) y NaCI 150 mM y se agitó lentamente durante 1 hora. Las partículas se lavaron tres veces con porciones de 20 ml del mismo disolvente y se conservaron en suspensión a 4 °C.
Ejemplo 9 - Separación de monocitos CD14+ de sangre periférica de un donante sano con las perlas magnéticas de estreptavidina del Ejemplo 7. Se mezclaron 100 ml de sangre heparinizada del donante sano del Ejemplo 7 con las perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina complejadas con MIP-1a biotinilada y se agitaron lentamente durante 40 min. Se separaron las partículas de la sangre por un separador magnético, y la sangre se analizó para monocitos CD14+ y linfocitos CD4+ y CD8+. Mientras que esencialmente no se pudieron detectar monocitos CD14+, los linfocitos CD4+ y CD8+ estuvieron presentes en aproximadamente las cantidades originales.
Ejemplo 10 - Leucaféresis a medida
Diseño y propiedades de la columna
Introducción
La aféresis es un tratamiento establecido usado para la reducción de los componentes de la sangre, tales como anticuerpos, lipoproteínas de baja densidad (LDL) y glóbulos sanguíneos. La leucaféresis es el tratamiento de aféresis usado para la retirada de glóbulos blancos, los leucocitos. El paciente se conecta a un sistema de circulación extracorpórea de la sangre; la sangre se saca de la vena en un brazo, se pasa a través de un dispositivo de columna y se devuelve en el otro brazo del paciente. Los efectos secundarios de los tratamientos de leucaféresis varían de acontecimientos leves como cefalea, mareos, hipotensión, palpitación y rubor observados en 0,1 a 5 % de los pacientes tratados.
La columna
La columna se pretende usar como un tratamiento de leucaféresis para las afecciones respiratorias, en particular sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Se retirarán específicamente leucocitos que expresan CCR2, CCR1, CCR3, CCR5 , CXCR1, CXCR2 y/o CCR7, en particular monocitos, mediante el uso de un reactivo de unión que contiene resina, que explota la interacción CCR2, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 y/o CCR7quimiocina. La columna consiste en tres componentes combinados, la carcasa de plástico, la matriz de estreptavidina (SA) Sepharose™ BigBeadds y una o más quimiocinas biotiniladas unidas a la matriz. El tratamiento se realiza usando las mismas técnicas que un procedimiento de aféresis convencional.
La carcasa de plástico (FIG. 6)
La carcasa de plástico, diseñada para mantener una circulación sanguínea continua a través de la matriz, consiste en un cuerpo transparente y tapa de color rojo. La tapa tiene una placa de distribución (2) en el sitio de entrada (1) para extender la sangre uniformemente sobre todo el área de la matriz. La placa es la primera barrera de seguridad que previene que partículas más grandes circulen por la columna y en el paciente. Las unidades de filtro de seguridad (3 y 4) se disponen en los sitios de entrada (1) y salida (5) de la carcasa de plástico. La unidad de filtro de seguridad contiene tres filtros diseñados para ser una barrera robusta y detener todas las partículas mayores que los glóbulos sanguíneos que pasan a través de la columna. El diseño de la carcasa de plástico se muestra en la Figura 4. El diseño con filtros de seguridad (3 y 4) en ambos extremos del dispositivo de columna minimizará el riesgo de fuga de las partículas en el paciente, que incluye en el supuesto caso de que el dispositivo se coloque al revés con la circulación sanguínea en la dirección opuesta a la esperada.
Estreptavidina Sepharose™ BigBeads
El segundo componente en el dispositivo es la matriz de afinidad llamada estreptavidina Sepharose™ BigBeads (Sepharose™ GE Healthcare, Suecia). Sepharose™ es una forma en perlas reticulada de agarosa, que es un polisacárido extraído de algas marinas. Comúnmente se usan Sepharose™ y agarosa como matrices de columna en las técnicas de afinidad biomédica. Se eligen por su capacidad de distribución óptima y pueden proporcionar un gran área disponible para la unión por afinidad.
Reactivo de unión
Acoplado a la matriz está el tercer componente del dispositivo, uno o más reactivos de unión que se unen específicamente a CCR2, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 y/o CCR7. Se pueden emplear una o más quimiocinas. Estos péptidos pueden ser versiones manipuladas sintéticas de la quimiocina humana, que están truncadas y biotiniladas, pero retienen la actividad de unión al receptor de CCR2, CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 y/o CCR7. Biotinilando la quimiocina manipulada, es capaz de unirse a las moléculas de estreptavidina en la matriz Sepharose™. La unión biotina-estreptavidina se conoce por ser una de las interacciones biológicas más fuertes con una Kd en el orden de 4 x 10-14 M. La relación calculada de sitios de unión de estreptavidina: biotina en la columna es 10:1. Por tanto, el acoplamiento entre la matriz y la quimiocina será inmediato, minimizando el riesgo de desacoplamiento de la quimiocina de la matriz.
El sistema de aféresis
Para realizar la leucaféresis se necesitan los siguientes componentes; la columna, el sistema de tubos y una bomba 4008 ADS (Fresenius Medical Care).
El circuito
El sistema se ilustra en la Figura 7. El paciente (1) se conecta al circuito extracorpóreo por agujas estériles Venflon a las venas en los brazos derecho e izquierdo. También se conecta una bolsa de solución salina (3) y la solución salina se bombea con una bomba ACD (2). Se extrae sangre de un brazo del paciente mediante el sistema de tubos estériles por la bomba de sangre (4) y se pasa a través de la columna (6) y de nuevo al paciente. El sistema de tubos se conecta a la columna por acoplamientos convencionales de luer-lock para diálisis. Los acoplamientos en la columna están codificados por color para el correcto ensamblaje; tubo rojo para la entrada a la tapa de la columna roja y tubo azul para la salida de nuevo al paciente. Está presente un detector de aire (8). Se emplean presión de entrada (5) y sensores Pven (7) para monitorizar la presión en el circuito.
La bomba 4008 ADS
Una bomba de aféresis, de Fresenius Medical Care, monitoriza la entrada y la salida del paciente, la presión en la circulación extracorpórea y puede discriminar aire por un captador de burbujas y detector de aire. Se dispone un filtro colector de coágulos dentro del colector de burbujas. La bomba también tiene un detector óptico para distinguir entre luz, por ejemplo solución salina o aire presente en el sistema de tubos, y oscuridad, por ejemplo, sangre presente en el sistema de tubos.
Se muestra un diagrama esquemático de la bomba, que muestra el detector de aire y el filtro óptico, en la Figura 8. Si el sistema de bomba detecta burbujas de aire y fluctuaciones ópticas o si los valores de presión extracorpóreos están fuera del intervalo fijado, entonces la bomba se detiene inmediatamente y se emite una alarma visual/ audible.
Leyenda para la FIG. 8:
1. Monitor
2. Recipiente para la bolsa de residuos
3. Módulos (izquierdo a derecho - bomba de sangre, bomba ACD, detector de aire)
4. Sitios reservados para módulos adicionales
5. Soporte para el absorbedor
6. Detector de gotas
7. Poste IV
Preparación del paciente
Se administrarán anticoagulantes al paciente antes de cada sesión de tratamiento. Se usará una solución salina estéril con 5000 IE de heparina para cebar el sistema extracorpóreo, a partir de aquí se añadirá una inyección en bolo con 4000 IE de heparina en el circuito al comienzo de cada sesión de tratamiento.
Tiempo de leucaféresis y caudal
El sistema de aféresis debe funcionar a un caudal de 30-60 ml/min. Un tratamiento termina después de hacer circular 1800 ml de sangre.
Condiciones de almacenamiento
Los dispositivos de columna se deben almacenar entre 1 y 25 °C evitando la congelación y temperaturas más elevadas. Los datos de estabilidad > 3 meses no indican diferencia en la funcionalidad con el tiempo o por temperatura (temperatura ambiente y refrigerada). Las columnas se mantendrán en condiciones refrigeradas hasta uso. Se debe evitar el daño mecánico como el resultante de vibraciones violentas y traumatismo. No se debe usar columna conservada fuera de estas recomendaciones.
Condiciones de transporte
Los dispositivos de columna se transportarán en condición refrigerada, evitando la congelación y temperaturas más elevadas. Se debe evitar el daño mecánico como el resultante de vibraciones violentas y traumatismo.
Reducción in vitro de las poblaciones de células diana
Para investigar la capacidad para eliminar células que expresan CCR2, se realizaron pruebas in vitro en la matriz acoplada a bMCP-1. Se recogió sangre de los donantes de sangre y se pasó a través del dispositivo de columna que contenía la matriz acoplada a bMCP-1. Se tomaron muestras de sangre antes y después del paso de columna y se analizaron por citometría de flujo (FACS) para la reducción de las células que expresan CCR2.
Los resultados demuestran la significativa reducción de monocitos que expresan CCR2 de la diana después de la perfusión en matriz. Las pruebas de reducción se realizaron en sangre de tres donantes sanos. Los resultados se muestran en la Figura 9a.
Los resultados in vitro demuestran una reducción específica de hasta 80 % de las células que expresan CCR2 por la columna. En particular, los individuos con menos células que expresan CCR2 alcanzaron inicialmente menor reducción. Los restantes niveles de monocitos fueron aproximadamente 20-30 % en cada caso, independientemente del punto de partida. No se vieron afectadas las células que no expresan CCR2 (datos no mostrados).
Para investigar la capacidad para eliminar células que expresan CCR1,3 y 5, se realizaron pruebas in vitro en la matriz acoplada a RANTES biotinilada. Se recogió sangre de donantes de sangre y se pasó a través del dispositivo de columna que contenía matriz acoplada a RANTES biotinilada. Se tomaron muestras de sangre antes y después del paso de columna y se analizaron por citometría de flujo (FACS) para la reducción de células que expresan CCR1, 3 y 5.
Se sintetizó la molécula RANTES por Almac. La secuencia de aminoácidos de la molécula RANTES biotinilada se expone como SEQ ID NO: 16:
H2N-
SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYI
NSLEKS
-C02H
Esta molécula tiene la metionina que existe de forma natural en la posición 67 sustituida con lisina para facilitar la biotinilación en la posición 67.
Se biotiniló directamente la cadena lateral de Lys 67 dando la estructura primaria de proteína mostrada en la Figura 15. Se plegó la proteína y se formaron enlaces disulfuro entre la primera y la tercera cisteína en la secuencia y entre la 2a y 4a cisteínas.
Los resultados demuestran una reducción significativa de las células que expresan receptores de quimiocinas de la población diana después de la perfusión en matriz. Se realizaron pruebas de reducción en sangre de un donante sano. Los resultados se muestran en la Figura 9b.
Los resultados in vitro demuestran una reducción específica de aproximadamente 20 % de las células que expresan receptores de quimiocinas por la columna. No se vieron afectadas las células que no expresan CCR1,3 y 5 (datos no mostrados).
Reducción in vitro de poblaciones de células diana
Para investigar la capacidad para eliminar células que expresan CCR3, se realizaron pruebas in vitro en la matriz acoplada a eotaxina. Se recogió sangre de donantes de sangre y se pasó a través del dispositivo de columna (incluyendo un separador magnético) que contenía matriz acoplada a eotaxina (perlas de Ma CS). Se tomaron muestras de sangre antes y después del paso de la columna y se analizaron por citometría de flujo (FACS) para la reducción de células que expresan CCR3.
Los resultados demuestran una reducción significativa de los neutrófilos/eosinófilos que expresan CCR3 de la población diana después de la perfusión en la matriz. Se realizaron pruebas de reducción en sangre de un donante sano. Los resultados se muestran en la Figura 9a.
En conclusión, los resultados in vitro demuestran una reducción específica de aproximadamente 25 % de las células que expresan CCR3 por la columna. No se vieron afectadas las células que no expresan CCR3 (datos no mostrados).
Ejemplo 11 - Derivados de MCP1
Se ha producido MCP-1 con el resto 75 como sitio de biotinilación en la quimiocina (numeración basada en la proteína madura que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2). La biotinilación permite la inmovilización de MCP-1 sobre un soporte sólido (por una interacción biotina-avidina). La secuencia de aminoácidos básicos de MCP-1, que incluye una secuencia conductora de 23 aminoácidos, se expone como SEQ ID NO: 1
MKVSAALLCL LLIAATFIPQ GLAQPDAINA PVTCCYNFTN RKISVQRLAS YRRITSSKCP
KEAVIFKTIV AKEICADPKQ KWVQDSMDHL DKQTQTPKT
La secuencia de aminoácidos de la proteína madura se expone como SEQ ID NO: 2
QPDAINA PVTCCYNFTN RKISVQRLAS YRRITSSKCP KEAVIFKTIV AKEICADPKQ
KWVQDSMDHL DKQTQTPKT
Los inventores han determinado que las quimiocinas pueden mostrar propiedades de unión mejoradas donde la quimiocina se biotinila por un grupo espaciador. El espaciador puede prevenir que el grupo biotina afecte la afinidad de unión de la quimiocina.
Así, se sintetizará MCP-1 derivatizada en la funcionalidad de la cadena lateral de £-amino de Lys75 con PEG-biotina (sal de TFA). El espaciador de PEG tendrá ácido 3,6-dioxoaminooctanoico. La Gln en el extremo N de las proteínas se somete a formación de piroGlu en condiciones fisiológicas. Así, la primera glutamina (Gln1) de la secuencia se sustituirá con piroglutamina. La molécula se sintetizará como una amida de extremo C (por la síntesis en un conector de amida). La molécula se muestra esquemáticamente en la Figura 10.
También se sintetizará un análogo de biotina MCP-1 Met a Nleu. La metionina individual dentro de la secuencia se alterará a norleucina, para mitigar contra la oxidación de este resto durante el ensamblaje de cadenas y mejorará la estabilidad del producto final. Esta molécula se muestra esquemáticamente en la Figura 11.
Una vez sintetizada, se determinará la actividad de los diversos derivados de biotina MCP-1 en ensayos basados en célula. En particular, se determinarán las propiedades de agonistas y antagonistas en el ensayo basado en células funcional de aecuorina en el receptor de CCR2 humano.
Ejemplo 12 - Síntesis de un antagonista de CCR2 biotina MCP-1 que se une al receptor sin activación
Se ha mostrado que la actividad de antagonista (J-H Gong y I. Clark-Lewis, J. Exp. Med., 1995, 181, 63) para un derivado de MCP-1 se truncó en el extremo N. En particular, la deleción de los restos 1-8 da como resultado la unión a CCR2 con Kd 8,3 nM. Esta proteína fue incapaz de provocar la quimiotaxia de células CCR2 positivas (CI50 de inhibición de la quimiotaxia 20 nM)
La secuencia de aminoácidos de la versión truncada se expone como SED ID NO: 3:
VTCCYNFTN RKISVQRLAS YRRITSSKCP KEAVIFKTIV AKEICADPKQ KWVQDSMDHL
DKQTQTPKT
Se sintetizará un derivado de esta versión truncada que comprende los restos 9 a 76 de la proteína madura (MCP-1 9-76) con la sustitución Met64 a Nleu y se derivatizó en la funcionalidad de la cadena lateral de £-amino de Lys75 con PEG-biotina (sal de TFA). Esta molécula se muestra esquemáticamente en la Figura 12. El espaciador de PEG será ácido 3,6-dioxoaminooctanoico.
Una vez sintetizada, se determinará la actividad de los diversos derivados de biotinaMCP-1 en ensayos basados en célula. En particular, se determinarán las propiedades de agonista y antagonista en el ensayo funcional basado en células de aequorina en el receptor CCR2 humano.
Ejemplo 13 - Demostrar la retirada de células que expresan CCR2 usando un ligando de quimiocina alternativo para MCP-1
CCR2 también se une a quimiocinas MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5 y HCC-4, además de MCP-1. MCP-5 solo se une a CCR2 y debe ser selectivo en su retirada de células que expresan CCR2. MCP5 es una quimiocina de ratón que se mostró que era quimiotáctica para las células CCR2 humanas con CE50 < 3 nM.
La secuencia de aminoácidos de longitud completa, que incluye el péptido señal, se expone como SEQ ID NO: 4
MKISTLLCLL LIATTISPQV LAGPDAVSTP VTCCYNVVKQ KIHVRKLKSY RRITSSQCPR
EAVIFRTILD KEICADPKEK WVKNSINHLD KTSQTFILEP SCLG
La secuencia de aminoácidos de la quimiocina MCP-5 procesada de extremo N tiene 82 aminoácidos de longitud y se expone como SEQ ID NO: 5
GPDAVSTP VTCCYNVVKQ KIHVRKLKSY RRITSSQCPR EAVIFRTILD KEICADPKEK
WVKNSINHLD KTSQTFILEP SCLG
Un alineamiento de secuencias de aminoácidos sugiere que MCP-5 tiene una extensión de extremo C cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de MCP-1. Los resultados de este alineamiento se muestran en la Figura 13. Basándose en esto, se sintetizará una versión truncada de extremo C de MCP-5. Esta versión truncada comprenderá los restos 1-76 de MCP-5, expuestos como SEQ ID NO: 6:
GPDAVSTP VTCCYNVVKQ KIHVRKLKSY RRITSSQCPR EAVIFRTILD KEICADPKEK
WVKNSINHLD KTSQTFIL
En la versión truncada, Ile75 que se va a sustituir con Lys, se expone como SEQ ID NO: 7:
GPDAVSTP VTCCYNVVKQ KIHVRKLKSY RRITSSQCPR EAVIFRTILD KEICADPKEK
WVKNSINHLD KTSQTFKL
Después de la sustitución, la versión sustituida se biotinilará en la posición 75, una lisina u otro resto adecuado tal como ornitina o ácido diaminopropanoico por un espaciador de PEG (ácido 3,6-dioxoaminooctanoico). La proteína se sintetizará en un conector de amida dando un derivado de amida del extremo C. Esta molécula se muestra esquemáticamente en la Figura 14.
Ejemplo 14 - Derivados de eotaxina
Se ha producido eotaxina con el resto 73 (que se creía que era una lisina) como sitio de biotinilación en la quimiocina (numeración basada en la proteína madura que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9). La biotinilación permite la inmovilización de eotaxina sobre un soporte sólido (por una interacción biotina-avidina). La secuencia de aminoácidos básica de eotaxina, que incluye una secuencia conductora de 23 aminoácidos (péptido señal) se expone como SEQ ID NO: 8,
MKVSAALLWL LLIAAAFSPQ GLAGPASVPT TCCFNLANRK IPLQRLESYR RITSGKCPQK
AVIFKTKLAK DICADPKKKW VQDSMKYLDQ KSPTPKP
La secuencia de aminoácidos de la proteína madura se expone como SEQ ID NO: 9
GPASVPT TCCFNLANRK IPLQRLESYR RITSGKCPQK AVIFKTKLAK DICADPKKKW
VQDSMKYLDQ KSPTPKP
Los inventores han determinado que las quimiocinas pueden mostrar propiedades de unión mejoradas, donde la quimiocina se biotinila por un grupo espaciador. El espaciador puede prevenir que el grupo biotina afecte la afinidad de unión de la quimiocina.
Así, se sintetizará la eotaxina derivatizada en la funcionalidad de la cadena lateral de £-amino de Lys73 con PEG-biotina (sal de TFA). El espaciador de PEG será ácido 3,6-dioxoaminooctanoico. La molécula se sintetizará como una amida de extremo C (por síntesis en un conector de amida) para evitar la formación de dicetopiperazina durante la síntesis. La molécula se muestra esquemáticamente en la Figura 16.
También se sintetizará un análogo de biotina eotaxina Met a Nleu. La única metionina dentro de la secuencia se alterará a norleucina, para mitigar la oxidación de este resto durante el ensamblaje de cadenas y mejorar la estabilidad del producto final.
Una vez sintetizada, se determinará la actividad de los diversos derivados de eotaxina en ensayos basados en célula. En particular, se determinarán las propiedades de agonista y antagonista en ensayo funcional basado en células en el receptor CCR3 humano.
Una vez sintetizada, se determinará la actividad de los diversos derivados de biotinaMCP-5 en los ensayos basados en célula. En particular, se determinarán las propiedades de agonista y antagonista en ensayo funcional basado en células en el receptor CCR2 humano.
Ej empl os 15 a 21 - Sí nt esi s de qui mi oci nas - Prot ocol os general es
Ensamblaje:
Se realizó la síntesis química de quimiocinas usando técnicas convencionales de síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc (SPPS) en un sintetizador de péptidos ABI 433. Se usaron DIC (0,5 M en DMF) y OxymaPure (0,5 M en DMF) para la activación, anhídrido acético (0,5 M en DMF) para la terminación y 20 % de piperidina en DMF para la desprotección de Fmoc. Se utilizó una resina de amida Rink para la generación de quimiocinas de amida del extremo C y resina de Wang para las quimiocinas de ácido del extremo C. Después del ensamblaje, la resina se lavó con DMF y DCM y luego se secó a vacío.
Retirada de la protección Dde:
Se retiró el grupo protector Dde por tratamiento de resina con una disolución de 2,5 % de hidracina en DMF (200 ml) durante un periodo de 2 horas. Entonces se lavó la resina con DMF.
Etapas de marcado:
1. Acoplar Fmoc-ácido 8-amino-3,6-dioctanoico (PEG)
Se hinchó la resina en DMF y luego se añadió una disolución de Fmoc-ácido 8-amino-3,6-dioctanoico (0,38 g, 1 mmoles), disolución de DIC (2 ml, 0,5 M en DMF) y disolución de OxymaPure (2 ml, 0,5 M en DMF). La mezcla se sonicó durante 3 horas y luego se lavó con DMF.
2. Terminación
La resina se terminó con disolución de anhídrido acético (0,5 M en DMF, 10 ml) durante 5 minutos y luego se lavó con DMF.
3. Desprotección de Fmoc
Se llevó a cabo desprotección de Fmoc mediante tratamiento con 20 % de piperidina en disolución de DMF (2 x 50 ml) durante 15 minutos cada vez. La resina se lavó con DMF.
4. Acoplar Biotina-OSu
Se añadió una disolución de Biotina-OSu (341 mg, 1 mmoles) y DIPEA (348|jl) en DMF (10 ml) a la resina y la mezcla se sonicó durante 3 horas. La resina se lavó minuciosamente con DMF y DCM y luego se secó a vacío.
Escisión:
Se trató resina seca con TFA (10 ml) que contenía una mezcla secuestrante que consistía en TIS (500 jl), tioanisol (500 jl), agua (500 jl), DEM (500 jl), EDT (250 jl), NH4l (500 jg ) y fenol (500 jg ) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La disolución se filtró en éter frío y la resina se aclaró con TFA. Se centrifugó el péptido precipitado, se lavó con éter, se centrifugó y se liofilizó.
Protocolo de purificación:
Se purificó el péptido en bruto por HPLC de fase inversa (RP-HPLC) usando una columna Júpiter C18, 250 x 21 mm, 9 ml/min, eluyendo con un gradiente optimizado [Tampón A: agua que contiene 0,1 % de TFA, Tampón B: acetonitrilo que contiene 0,1 % de TFA].
Protocolo de plegamiento:
Se disolvió péptido puro (10 mg) en GnHCI 6 M (16 ml) y luego se diluyó rápidamente hasta concentración 2 M de GnHCI mediante la adición de t R|S 50 mM a pH 8,5 (84 ml) que contenía GSSG 0,3 mM y GSH 3 mM. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas y luego se analizó por RP-HPLC (columna Jupiter C18, 250 x 4,6 mm, 10-60 % de B durante 30 minutos. La purificación por RP-HPLC usando un gradiente optimizado proporcionó el producto deseado.
Ej empl o 15 - Bi ot i naMCP-1 (CCL2)
Molécula diana: MCP-1 derivatizado en la funcionalidad de la cadena lateral de £-amino de Lys(75) con PEG-biotina (sal de TFA)
Modificaciones: Se expresa inicialmente MCP-1 humana correspondiente a los restos 1-76 como 99 aminoácidos que comprenden el pliegue de quimiocina, y un péptido señal de 23 aminoácidos que se escinde. La Gln en el extremo N de la proteína se somete a formación de piroGlu en condiciones fisiológicas. Así, la secuencia de Gln1 se sustituyó con piroglutamina para prevenir que se generaran especies mixtas de Gln y piroGlu de extremo N. Esto mejora el rendimiento de la síntesis y garantiza una preparación homogénea de quimiocinas mediante la fabricación y el uso de columnas. La lisina que existen de forma natural en la posición 75 se modificó mediante biotinilación en la resina. Se incorporó un espaciador de PEG entre la funcionalidad de £-amino y la biotina.
La secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 10) se muestra, antes de la fijación del espaciador de PEG y las moléculas de biotina en el aminoácido 75 (K):
H-XPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEIC
ADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT-NH2
X = piroGlu o Gln
Se ensambló la secuencia de MCP-1 manipulada sobre un soporte sólido (resina de amida de Rink), usando protocolos de Fmoc para la síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en la sección de protocolos generales:
SEQ ID NO: 11
H-XPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEIC
ADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPXT-RESIN
X1 = piroGlu o Gln
X75 = K(ivDde)
Se incorporó FmocLys(ivDde)-OH como el resto 75 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína. Se llevó a cabo la posterior retirada del grupo protector ivDde, seguido por acoplamiento del espaciador de PEG y biotina, como se describe en la sección de protocolos generales. Se llevaron a cabo protocolos de escisión, purificación y plegamiento como se describe para proporcionar la quimiocina activada deseada.
SEQ ID NO: 12
H-XPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEIC
ADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPXT-NH2
X1 = piroGlu o Gln
X75 es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico, y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG, opcionalmente K(PEG-biotina)
Se obtuvieron datos de ionización por electropulverización con espectrometría de masas en tándem (ESI-TOF-EM) de biotinaMCP-1 plegada purificada: obtenidos = 9032,8 Da; esperados 9034,4 Da.
Datos del ensayo funcional:
Se probó biotinaMCP-1 para la actividad de agonista en un ensayo de aequorina contra hCCR2b (Euroscreen) y se informó de un valor de CE50 de 9,6 nM. Véase que CE50 para m CP-1 nativa recombinante es 3,1 nM.
Ej empl o 16 - bi ot i naRANTES (CCL5)
Molécula diana: RANTES derivatizada en la funcionalidad de la cadena lateral de £-amino de Lys(67) con biotina (sal de TFA)
Modificaciones: RANTES humana correspondiente a los restos 1-68 se expresa inicialmente como 91 aminoácidos que comprenden el pliegue de quimiocina y un péptido señal de 23 aminoácidos que se escinde. Se mutó la única metionina (Met67) dentro de la secuencia a lisina, para mitigar la oxidación de este resto durante el ensamblaje de cadenas, que se observó durante la síntesis del derivado de secuencia natural. Esta sustitución de Met a Lys proporcionó una lisina en la posición 67 que se modificó mediante biotinilación en la resina.
La secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 16) se muestra, antes de la fijación de la molécula de biotina, en el aminoácido 67 (K):
H-SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVC
ANPEKKWVREYINSLEKS-OH
Se ensambló la secuencia de RANTES manipulada en un soporte sólido (resina de Wang), usando protocolos de Fmoc para la síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en la sección de protocolos generales:
H-SPYSSDTTPCC FAYIARPLPR AH IKEYFYTSG KCSN PAVV FVTRKN RQVC
ANPEKKWVREYINSLEXS-RESIN
X es K(ivDde)
Se incorporó FmocLys(ivDde)-OH como el resto 67 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 17). La posterior retirada del grupo protector ivDde, seguida por acoplamiento de la biotina, se llevó a cabo como se describe en la sección de protocolos generales. Los protocolos de escisión, purificación y plegamiento se llevaron a cabo como se describe para proporcionar la quimiocina activa deseada (SEQ ID NO: 18).
H-SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVC
ANPEKKWVREYINSLEXS-OH
X es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG (por ejemplo, K(biotina))
Datos de ionización por electropulverización con espectrometría de masas en tándem (ESI-TOF-EM) de biotinaRANTES plegada purificada: obtenidos = 8068,9 Da; esperados 8070,2 Da.
Datos del ensayo funcional:
Se probó biotinaRANTES para la actividad de agonista en un ensayo de aequorina contra hCCR5 (Euroscreen) y se informó un valor de CE50 de 0,5 nM.
Ej empl o 17 - bi ot i naMCP-2 (CCL8)
Molécula diana: MCP-2 derivatizada en la funcionalidad de la cadena lateral de £-amino de Lys(75) con PEG-biotina (sal de TFA)
Modificaciones: MCP-2 humana correspondiente a los restos 1-76 se expresa inicialmente como 99 aminoácidos que comprenden el pliegue de quimiocina, y un péptido señal de 23 aminoácidos que se escinde. La Gln en el extremo N de la proteína se somete a formación de piroGlu en condiciones fisiológicas. Así, Gln1 de la secuencia se sustituyó con piroglutamina para prevenir que se generaran especies mixtas de Gln y piroGlu de extremo N. Esto mejora el rendimiento de la síntesis y garantiza una preparación de quimiocinas homogénea mediante la fabricación y el uso de columnas. La lisina que existe de forma natural en la posición 75 se modificó mediante biotinilación en la resina. Se incorporó un espaciador de PEG entre la funcionalidad de £-amino y la biotina.
Se muestra la secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 13), antes de la fijación del espaciador de PEG y la moléculas de biotina en el aminoácido 75 (K):
H-XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKE
RWVRDSM KH LDQIFQN LKP-N H2
X = piroGlu o Gln
Se ensambló la secuencia de MCP-2 manipulada sobre un soporte sólido (resina de amida de Rink), usando protocolos de Fmoc para la síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en la sección de protocolos generales:
H-XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKE
RWVRDSMKHLDQIFQNLXP-NH2
XI = piroGlu o Gln
X75 = K(ivDde)
Se incorporó FmocLys(ivDde)-OH como el resto 75 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 14). La posterior retirada del grupo protector de ivDde, seguido por acoplamiento del espaciador de PEG y biotina, se llevó a cabo como se describe en la sección de protocolos generales. Se llevaron a cabo protocolos de escisión, purificación y plegamiento como se describe para proporcionar la quimiocina activa deseada (SEQ ID NO: 15):
H-XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKE
RWVRDSM KFI LDQI FQN LXP-N Fl2
X1 = piroGlu o Gln
X75 = un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG, por ejemplo, K(PEG-biotina). Datos de ionización por electropulverización con espectrometría de masas en tándem (ESI-TOF-EM) de biotinaMCP-2 plegada purificada: obtenidos = 9263,6 Da; esperados 9263,8 Da.
Datos del ensayo funcional:
Se probó biotinaMCP-2 para la actividad en un ensayo de aequorina contra hCCR2b (Euroscreen) y se mostró que era un agonista parcial con un valor de CE50 de 50,9 nM. Véase que CE50 para MCP-2 nativa recombinante es 23,5 nM (agonista parcial).
Ej empl o 18 - bi ot i naMI P-3p (CCL19)
Molécula diana: MIP-3p derivatizado en la funcionalidad de la cadena lateral de £-amino de Lys(78) con biotina (sal de TFA)
Modificaciones: MIP-3p humana correspondiente a los restos 1-77 se expresa inicialmente como 98 aminoácidos que comprenden el pliegue de quimiocina y un péptido señal de 21 aminoácidos que se escinde. Se insertó una lisina adicional en el extremo C, en la posición 78, y se modificó mediante biotinilación en la resina.
La secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 19) se muestra, antes de la fijación de la molécula de biotina, en el aminoácido 78 (K):
H-GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCA
PPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSSX-NH2
X es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico, y opcionalmente se biotinila (por ejemplo, K-biotina), opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG, en particular K(PEG-biotina)
Se ensambló la secuencia de MIP-3p manipulada sobre un soporte sólido (resina de amida de Rink), usando protocolos de Fmoc para síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en la sección de protocolos generales:
H-GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCA
PPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSSX-RESINA
X es FmocLys(ivDde)
Se incorporó FmocLys(ivDde)-OH como el resto 78 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 20). La posterior retirada del grupo protector de ivDde, seguido por acoplamiento de la biotina, se llevó a cabo como se describe en la sección de protocolos generales. Se llevaron a cabo protocolos de escisión, purificación y plegamiento como se describe para proporcionar la quimiocina activa deseada (SEQ ID NO: 21).
H-GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCA
PPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSSX-NHs
X es K(biotina)
Datos de ionización por electropulverización con espectrometría de masas en tándem (ESI-TOF-EM) de biotinaMIP-3p plegada purificada: obtenidos = 9148,8 Da; esperados 9149,7 Da.
Datos del ensayo funcional:
Se probó biotinaMip-3p para la actividad de agonista en un ensayo de aequorina contra hCCR7 (Euroscreen) y se informó un valor de CE50 de 11,0 nM. Véase que CE50 para MIP-3p nativa recombinante es 1,6 nM.
Ej empl o 19 - bi ot i nal L-8 (CXCL8)
Molécula diana: IL-8 derivatizada en la funcionalidad de la cadena lateral de £-amino de Lys(78) con PEG-biotina (sal de TFA)
Modificaciones: IL-8 humana correspondiente a los restos 1-77 se expresa inicialmente como 99 aminoácidos que comprenden el pliegue de quimiocina, y un péptido señal de 22 aminoácidos que se escinde. Se insertó una lisina adicional en el extremo C en la posición 78, y se modificó mediante la biotinilación en la resina. Se incorporó un espaciador de PEG entre la funcionalidad de £-amino y la biotina.
Se muestra la secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 22), antes de la fijación del espaciador de PEG y las moléculas de biotina:
H-AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKL
SDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENSX-NH2
X es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG, por ejemplo, K(PEG-biotina)
Se ensambló la secuencia de IL-8 manipulada sobre un soporte sólido (resina de amida de Rink), usando protocolos de Fmoc para la síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en la sección de protocolos generales:
H-AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKL
SDGRELCLDPKENWVQRWEKFLKRAENSX-RESIN
X es K(ivDde)
Se incorporó FmocLys(ivDde)-OH como el resto 78 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 23). Se llevó a cabo la posterior retirada del grupo protector de ivDde, seguido por el acoplamiento del espaciador de PEG y biotina, como se describe en la sección de protocolos generales. Se llevaron a cabo protocolos de escisión, purificación y plegamiento como se describe para proporcionar la quimiocina activa deseada (SEQ ID NO: 24):
H-AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKL
SDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENSX-NH2
X es K(PEG-biotina)
Datos de ionización por electropulverización con espectrometría de masas en tándem (ESI-TOF-EM) de biotinaIL-8 plegada purificada: obtenidos = 9416,9 Da; esperados 9417,0 Da.
Datos del ensayo funcional:
Se probó biotinaIL-8 para la actividad de agonista en un ensayo de aequorina contra hCXCR1 (Euroscreen) y se informó un valor de CE50 de 18,9 nM. Véase que CE50 para IL-8 nativa recombinante es 4,2 nM.
Ej empl o 20 - bi ot i naIL-8 (6-78)
Molécula diana: IL-8 (6-78) derivatizada en la funcionalidad de la cadena lateral de £-amino de Lys(78) con PEG-biotina (sal de TFA)
Modificaciones: Forma truncada de IL-8 correspondiente a los restos 6-77, se han retirado los primeros cinco restos del extremo N y se insertó una lisina adicional en el extremo C en la posición 78, y se modificó mediante la biotinilación en la resina. Se incorporó un espaciador de PEG entre la funcionalidad de £-amino y la biotina.
La secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 25) se muestra, antes de la fijación del espaciador de PEG y las moléculas de biotina:
H-SAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGREL
CLDPKENWVQRVVEKFLKRAENSX-NH2
X es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG
Se ensambló la secuencia de IL-8 manipulada sobre un soporte sólido (resina de amida de Rink), usando protocolos de Fmoc para la síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en la sección de protocolos generales:
H-SAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGREL
CLDPKENWVQRWEKFLKRAENSX-RESINA
X es K(ivDde)
Se incorporó FmocLys(ivDde)-OH como el resto 78 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 26). Se llevó a cabo la posterior retirada del grupo protector de ivDde, seguido por acoplamiento del espaciador de PEG y biotina, como se describe en la sección de protocolos generales. Se llevaron a cabo los protocolos de escisión, purificación y plegamiento como se describe para proporcionar la quimiocina activa deseada (SEQ ID NO: 27):
Figure imgf000038_0001
X es K(PEG-biotina)
Datos de ionización por electropulverización con espectrometría de masas en tándem (ESI-TOF-EM) de biotinaIL-8 plegada purificada (6-78): obtenidos = 8880,50 Da; esperados 8880,4 Da.
Datos del ensayo funcional:
Se probó biotinaIL-8 (6-78) para la actividad de agonista en un ensayo de aequorina contra hCXCRI (Euroscreen) y se informó un valor de CE50 de 6,1 nM. Véase que la CE50 para IL-8 nativa recombinante es 4,2 nM.
Ej empl o 21 - bi ot i naEot axi na (CCL11)
Molécula diana: Eotaxina derivatizada en la funcionalidad de la cadena lateral de £-amino de Lys(73) con PEG-biotina (sal de TFA)
Modificaciones: Eotaxina humana correspondiente a los restos 1-74, se expresa inicialmente como 97 aminoácidos que comprenden el pliegue de quimiocina, y un péptido señal de 23 aminoácidos que se escinde. Se modificó la lisina que existe de forma natural en la posición 73 mediante biotinilación en la resina. Se incorporó un espaciador de PEG entre la funcionalidad de £-amino y la biotina.
Se muestra la secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 28), antes de la fijación del espaciador de PEG y las moléculas de biotina en el aminoácido 73 (K):
H-GPASVPTTCCFNLANRKIPLQRLESYRRITSGKCPQKAVIFKTKLAKDICADPKKK
WVQDSMKYLDQKSPTPXP-NH2
X es un resto de aminoácido que se puede biotinilar, tal como lisina, ornitina o ácido diaminopropiónico y opcionalmente se biotinila, opcionalmente por una molécula espaciadora tal como PEG, por ejemplo, K(PEG-biotina).
Se ensambló la secuencia de eotaxina manipulada sobre un soporte sólido (resina de amida de Rink) usando protocolos de Fmoc para la síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en la sección de protocolos generales:
H-GPASVPTTCCFNLANRKIPLQRLESYRRITSGKCPQKAVIFKTKLAKDICADPKKK
WVQDSMKYLDQKSPTPXP-NH2
X es K(ivDde)
Se incorporó FmocLys(ivDde)-OH como el resto 73 para facilitar el marcado específico de sitio en esta posición de la proteína (SEQ ID NO: 29). La posterior retirada del grupo protector de ivDde, seguido por acoplamiento del espaciador de PEG y biotina, se llevó a cabo como se describe en la sección de protocolos generales. Se llevaron a cabo los protocolos de escisión, purificación y plegamiento como se describen para proporcionar la quimiocina activa deseada (SEQ ID NO: 30):
H-GPASVPTTCCFNLANRKIPLQRLESYRRITSGKCPQKAVIFKTKLAKDICADPKKK
WVQDSMKYLDQKSPTPXP-NH2
X es K(PEG-biotina)
Datos de ionización por electropulverización con espectrometría de masas en tándem (ESI-TOF-EM) de biotinaEotaxina plegada purificada: obtenidos = 8731,3 Da; esperados 8731,3 Da.
Datos del ensayo funcional:
Se probó biotinaEotaxina para la actividad en un ensayo de aequorina contra hCCR3 (Euroscreen) y se mostró que era un antagonista con un valor de CE50 de 211,8 nM. Véase que CE50 para eotaxina nativa recombinante es 10,7 nM (agonista).
Ej empl o 22 - Di agnóst i co y t rat ami ent o de sarcoi dosi s
Materiales y métodos
1. Análisis de citometría de flujo de sangre periférica
Se recogió sangre periférica de pacientes y controles sanos en tubos de heparina. Se lisaron los glóbulos rojos usando tampón Fix (solución salina tamponada con fosfato (PBS) citrato con 4 % de paraformaldehído) durante cuatro minutos a 37 °C y tampón de lisado (p Bs con Tris 10 mM y NH4CI 160 mM, pH 7,5) durante 15 min a 37 °C. Se lavaron las células en PBS con 2 % de suero de crecimiento bovino, se incubaron con 10 % de suero humano durante 15 min a temperatura ambiente (TA) y se tiñó con anticuerpos (Tabla 2) a 4 °C durante 30 min. Las células se analizaron por citometría de flujo en un citómetro de flujo FACS Canto con el software FACSDiva (BD Biosciences).
Figure imgf000039_0001
2. Ensayo de unión de quimiocinas
Se recogió sangre periférica de pacientes y controles sanos en tubos de heparina. Se lisaron los glóbulos rojos usando tampón Fix (solución salina tamponada con fosfato (PBS) citrato con 4 % de paraformaldehído) durante cuatro minutos a 37 °C y tampón de lisado (p Bs con Tris 10 mM y NH4CI 160 mM, pH 7,5) durante 15 min a 37 °C. Se lavaron las células en PBS con 2 % de suero de crecimiento bovino, se incubaron con 10 % de suero humano 15 min a temperatura ambiente (TA) y se tiñeron con anticuerpos específicos de célula junto con quimiocina biotinilada (1 |jM) o el anticuerpo contra receptores de quimiocinas correspondiente a 4 °C durante 30 min (Tabla 1). Se detectó la quimiocina biotinilada por la interacción entre biotina y un fluoróforo conjugado con estreptavidina. Las muestras se analizaron por citometría de flujo en un citómetro de flujo FACS Canto con el software FACSDiva (BD Biosciences).
3. Reducción de células por matriz conjugada con quimiocina biotinilada
Se prepararon células a partir de sangre periférica (sección 1). Se conjugó 1 ml de matriz de Sepharose BigBeads

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un reactivo de unión capaz de unirse específicamente al receptor de quimiocinas CCR1 para su uso en el tratamiento de una afección respiratoria, en donde el reactivo de unión se inmoviliza sobre un soporte sólido contenido dentro de una columna de aféresis, a la que se aplica sangre periférica de un paciente, retirando así las células que expresan CCR1 de la sangre periférica del paciente, en donde el reactivo de unión capaz de unirse específicamente a CCR1 se selecciona de un anticuerpo y una quimiocina, en donde la quimiocina es CCL5 (RANTES).
2. El reactivo de unión de la reivindicación 1, en donde la afección respiratoria se selecciona de sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).
3. El reactivo de unión de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el reactivo de unión capaz de unirse específicamente a CCR1 es un antagonista de CCR1.
4. Un método de monitorización del tratamiento de una afección respiratoria que comprende determinar
a) los niveles de células que expresan receptores de quimiocinas CCR1,
b) niveles de expresión de CCR1; y/o
c) niveles de células con alta expresión de CCR1
en una muestra obtenida de un sujeto, en donde altos niveles de células que expresan CCR1, altos niveles de expresión de CCR1 o altos niveles de células con alta expresión de CCR1 o niveles elevados de células que expresan CCR1 en comparación con control, niveles elevados de expresión de CCR1 en comparación con un control o niveles elevados de células con alta expresión de CCR1 en comparación con un control indican la presencia o la progresión de la afección respiratoria, y en donde el tratamiento es según la reivindicación 1.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la afección respiratoria se selecciona de sarcoidosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en donde la muestra es una muestra de sangre periférica opcionalmente en donde las células son monocitos que expresan CCR1, o linfocitos, específicamente linfocitos T tal como linfocitos T de memoria central.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde niveles más altos de células que expresan CCR1, niveles más altos de expresión de CCR1 y/o niveles más altos de células con alta expresión de CCR1 se correlacionan con enfermedad más activa.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde bajos niveles de células que expresan CCR1, bajos niveles de expresión de CCR1 y/o bajos niveles de células con alta expresión de CCR1 se correlacionan con una ausencia de enfermedad activa o enfermedad menos activa.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde la disminución de los niveles de células que expresan CCR1, de los niveles de expresión de CCR1 y/o de los niveles de células con alta expresión de CCR1 se correlacionan con tratamiento satisfactorio.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en donde el aumento de los niveles de células que expresan CCR1, de los niveles de expresión de CCR1 y/o de los niveles de células con alta expresión de CCR1 indican la progresión de la enfermedad.
11. Una quimiocina CCL5 modificada para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 16 o 18.
12. La quimiocina CCL5 modificada para su uso según la reivindicación 11, en donde el resto en la posición 67 se biotinila para permitir la inmovilización de la quimiocina sobre un soporte sólido.
13. La quimiocina CCL5 modificada para su uso según la reivindicación 12, en donde la biotinilación es por un grupo espaciador de polietilenglicol (PEG).
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