ES2819865T3 - Proteínas dirigidas a ortólogos - Google Patents

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Abstract

Un método para identificar un anticuerpo mutante interespecies a partir de un anticuerpo plantilla de una especie, en donde el anticuerpo plantilla muestra una actividad en una primera diana de la especie y el anticuerpo plantilla tiene seis regiones determinantes de complementariedad que comprenden n residuos de aminoácidos, el método comprende las etapas de: i. generar una biblioteca de n conjuntos independientes de anticuerpos mutantes a partir del anticuerpo plantilla, cada conjunto comprende anticuerpos mutantes que tienen un número X de residuos de aminoácidos predeterminados diferentes en una única posición predeterminada de una de las seis regiones determinantes de complementariedad; en donde cada conjunto de anticuerpos mutantes difiere en la única posición predeterminada; y el número de anticuerpos mutantes diferentes generados es equivalente a n x X; ii. seleccionar los anticuerpos mutantes que muestran la actividad en un ortólogo de la primera diana en otra especie; y iii. tamizar los anticuerpos mutantes seleccionados para detectar un anticuerpo mutante interespecies que muestra la actividad en la primera diana.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas dirigidas a ortólogos
Campo de la descripción
En un aspecto particular, la presente descripción es relevante para las proteínas y para su generación mediante el desarrollo de proteínas.
Antecedentes
La ingeniería de proteínas mediante mutagénesis dirigida al sitio y, más recientemente, el desarrollo molecular se ha empleado con éxito para mejorar las propiedades enzimáticas en aplicaciones industriales y las propiedades terapéuticas en los anticuerpos. Características tales como la termoestabilidad, el pH óptimo, la enantioselectividad, la especificidad y la afinidad de unión se han alterado para adaptar mejor las proteínas y los anticuerpos para fines específicos.
Desde su inicio, se han descrito y aplicado muchos métodos diferentes de desarrollo molecular para mejorar las características de la proteína diana. Por ejemplo, se pueden generar y tamizar conjuntos de mutantes puntuales únicos para detectar mutantes mejorados. Después, las sustituciones beneficiosas de un solo aminoácido pueden recombinarse y tamizarse para optimizar aún más las características deseadas en la molécula diana.
Sin embargo, el desarrollo exitoso de una molécula diana que inicia con mutaciones puntuales únicas requiere que los cambios (a veces) sutiles en el rendimiento puedan medirse con exactitud para identificar los mutantes mejorados. En los casos en que no existe un ensayo sensible, las mutaciones puntuales únicas no pueden tamizarse con éxito. Se pueden hacer mutaciones simultáneas de varios sitios, sin embargo, el número de combinaciones creadas aumenta muy rápidamente y alcanza los límites de la eficiencia de clonación y la capacidad de tamizaje.
Bostrom y otros, Methods Mol. Biol.; vol. 525, páginas 353-376, 2009 describen una estrategia para mutar residuos de CDR en un anticuerpo plantilla CB1 contra BR3 para mejorar la afinidad y la especificidad de unión del anticuerpo plantilla. El anticuerpo plantilla CB1 se une a BR3 murino con alta afinidad, pero se une a BR3 humano solo con baja afinidad. El anticuerpo plantilla CB1 se muta para producir una biblioteca de anticuerpos mutantes con el uso de una de tres técnicas diferentes: diseño de diversidad "restringida", diseño de biblioteca "suave" y diseño de diversidad de homólogos. Después, la biblioteca de anticuerpos mutantes se tamiza con el uso de un ensayo ELISA de competencia puntual para seleccionar un anticuerpo mutante que pueda unirse tanto a BR3 humano como a BR3 murino con alta afinidad.
Liang y otros, J. Biol. Chem., vol. 281, núm. 2, páginas 951-961,2005 describen un método para generar anticuerpos interespecies que bloquean el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El método genera bibliotecas de fagos de anticuerpos sintéticos y tamiza las bibliotecas con el uso de ELISA competitivo con VEGF humano y VEGF murino en paralelo.
El documento US 2012/245036 describe la selección de un anticuerpo monoclonal de ratón y la humanización del anticuerpo monoclonal de ratón mediante la clonación de las regiones CDR del anticuerpo y su ligación a los polipéptidos del marco humanos. El método produce así una biblioteca de variantes de IgG humana. Después, la biblioteca de IgG se tamiza para detectar anticuerpos humanizados con una función y/o expresión mejorada en comparación con el anticuerpo monoclonal de ratón. Diversos ensayos para el tamizaje de la biblioteca de IgG que incluyen ELISA funcional.
El documento US 2013/281303 describe un método para generar anticuerpos recombinantes que se unen a un antígeno diana a partir de una biblioteca de células B enriquecida en células B que pueden unirse al antígeno diana. El ARNm expresado en la biblioteca de células B se convierte en ADNc para preparar una biblioteca de inmunoglobulinas que comprende dominios Vh y Vl. Los anticuerpos recombinantes se generan a partir de los dominios Vh y Vl mediante lo cual los anticuerpos recombinantes comprenden combinaciones de cadenas ligeras/cadenas pesadas. Los anticuerpos recombinantes se tamizan con el antígeno diana para identificar los anticuerpos que pueden unirse al antígeno diana.
La patente de Estados Unidos núm. 5,874,304 describe la humanización del gen de la proteína fluorescente verde (GFP) de medusa para adaptar el gen de la GFP para la expresión en células humanas y de mamíferos. El gen humanizado de la GFP se prepara mediante la incorporación de codones preferidos para el uso en genes humanos en la secuencia de ADN del gen de la GFP de medusa. Específicamente, los genes humanizados de la proteína fluorescente verde se optimizan para la expresión en células humanas y de mamíferos mediante el reemplazo de al menos uno, y preferentemente un número significativo, de codones de GFP de medusa con uno o más codones que se usan con más frecuencia en los genes humanos.
El documento US 2011/189157 describe un método para determinar la actividad de la enzima endoglicosidasa a través de las etapas de (i) poner en contacto un sustrato de la endoglicosidasa con una muestra que contiene endoglicosidasa en condiciones suficientes para la degradación del sustrato por la endoglicosidasa, (ii) separar los productos de degradación del sustrato no degradado o parcialmente degradado mediante la unión del sustrato no degradado o parcialmente degradado a una proteína de unión a sulfato de condroitina unida a una fase sólida (por ejemplo, CS-BP o HA-BP), preferentemente a la proteína policatiónica protamina, y (iii) medir la disminución de sustrato intacto relacionada con la actividad endoglicosidasa en la muestra.
Andrews y otros, Protein Engineering, vol. 6, núm. SUPL., página 109, 1993 describen la humanización de la timidilato sintasa bacteriana por mutagénesis dirigida al sitio. La timidilato sintasa bacteriana humanizada puede servir como un sistema modelo para el diseño racional de fármacos. Pohajdak y otros, Transgenic Search, vol. 13, núm. 4, páginas 313-323, 2004 describen un método que usa mutagénesis dirigida al sitio y ligación a enlazador para humanizar el gen de la insulina de tilapia de manera que codifique la insulina humana mientras mantiene las secuencias reguladoras de la tilapia. Wenzlau y otros, Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 1150, páginas 252-255, 2008 describen la producción de proteína murina humanizada por mutagénesis dirigida al sitio.
Resumen de la descripción
[1] La presente descripción se refiere a métodos para identificar anticuerpos mutantes activos interespecies a partir de un anticuerpo plantilla de una especie, donde el anticuerpo plantilla muestra una actividad en una primera diana de la especie y el anticuerpo plantilla tiene seis regiones determinantes de complementariedad que comprenden n residuos de aminoácidos, el método comprende las etapas de (i) generar una biblioteca de n conjuntos independientes de anticuerpos mutantes a partir del anticuerpo plantilla, cada conjunto comprende anticuerpos mutantes que tienen un número X de residuos de aminoácidos predeterminados diferentes en una única posición predeterminada de una de las seis regiones determinantes de complementariedad; en donde cada conjunto de anticuerpos mutantes difiere en la única posición predeterminada; y el número de anticuerpos mutantes diferentes generados es equivalente a n x X; (ii) seleccionar los anticuerpos mutantes que muestran la actividad en un ortólogo de la primera diana en otra especie; y (iii) tamizar los anticuerpos mutantes seleccionados para detectar un anticuerpo mutante interespecies que muestra la actividad en la primera diana.
[2] En la modalidad [1], la X puede ser 19 residuos de aminoácidos.
[3] En la modalidad [1], cada conjunto de anticuerpos mutantes puede generarse mediante la incorporación de N,N,N en la posición de codón predeterminada en un polinucleótido que codifica el anticuerpo plantilla.
[4] En la modalidad [1], la especie puede ser humana.
[5] En la modalidad [4], la otra especie puede seleccionarse de rata, ratón, conejo, hámster, cobaya, mono, perro, gato y primates no humanos.
[6] En la modalidad [1], la especie puede ser una especie no humana seleccionada de rata, ratón, conejo, hámster, cobaya, mono, perro, gato y primates no humanos.
[7] En la modalidad [1], la otra especie puede ser una especie no humana seleccionada de rata, ratón, conejo, hámster, cobaya, mono, perro, gato y primates no humanos.
[8] En la modalidad [1], la especie y la otra especie pueden ser diferentes y seleccionarse independientemente de rata, ratón, conejo, hámster, cobaya, mono, perro, gato y primates no humanos.
[9] En la modalidad [1], la biblioteca de n conjuntos independientes de anticuerpos mutantes puede expresarse en un huésped de producción celular eucariota.
[10] En la modalidad [9], el huésped de producción celular eucariota puede ser un huésped de producción celular mamífero.
[11] En la modalidad [10], el huésped de producción celular mamífero puede seleccionarse de células fibroblásticas de ratón 3T3; células fibroblásticas de hámster sirio BHK21; células epiteliales de perro, MDCK; células epiteliales humanas Hela; células epiteliales de rata canguro PtKl; células plasmáticas de ratón SP2/0; y células plasmáticas de ratón NS0; células renales embrionarias humanas HEK 293; células renales de mono COS; células de ovario de hámster chino CHO, CHO-S; células embrionarias de ratón R1; células embrionarias de ratón E14.1; células embrionarias humanas HI; células embrionarias humanas H9; y células embrionarias humanas PER C.6.
[12] En la modalidad [10], el huésped de producción celular mamífero puede ser una célula GS-NS0 o una célula GS-CHOK1.
[13] En la modalidad [9], la biblioteca de n conjuntos independientes de anticuerpos mutantes puede expresarse con el uso de la presentación en la superficie celular en el huésped de producción celular eucariota.
[14] En la modalidad [13], la presentación en la superficie celular puede ser una presentación en la superficie celular de levadura.
[15] En la modalidad [13], la presentación en la superficie celular es una presentación en la superficie celular de mamífero.
[16] La modalidad [9], el método puede comprender además una etapa de producción del anticuerpo mutante en el mismo huésped de producción celular eucariota
[17] La modalidad [3], la posición de codón predeterminada puede estar en una región determinante de complementariedad.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra cómo se usa el desarrollo posicional integral (CPE™) para generar una base de datos específica de moléculas (EvoMap™).
La Figura 2 muestra un ejemplo de un EvoMap™ y cómo puede implementarse una optimización adicional por desarrollo de sinergia.
La Figura 3 muestra los niveles de expresión de las IgG de longitud completa derivadas de una biblioteca de variantes de codones de Fc en comparación con el nivel de expresión de la IgG de tipo silvestre en la misma línea de células de mamífero.
La Figura 4 muestra un esquema de desarrollo por inserción posicional integral (CPI™).
La Figura 5 ilustra una combinación de métodos de desarrollo: un ácido nucleico alargado de desarrollo por CPI™ se somete a desarrollo posicional integral (CPE™) y se usa para generar una base de datos específica de moléculas (EvoMap™).
La Figura 6 muestra un esquema de desarrollo por deleción posicional integral (CPD™).
La Figura 7 ilustra otra combinación de métodos de desarrollo: un ácido nucleico acortado de desarrollo por CPD™ se somete a desarrollo posicional integral (CPE™) y se usa para generar una base de datos específica de moléculas (EvoMap™).
La Figura 8 muestra un esquema de síntesis posicional integral (CPS™) que puede usarse para combinar mutantes mejorados de CPE™.
La Figura 9 muestra un esquema de un EvoMap™ tridimensional hipotético.
La Figura 10 muestra los datos de afinidad contra una proteína de ratón para 33 anticuerpos interespecies generados en el Ejemplo 11.
La Figura 11 muestra los datos de afinidad contra el ortólogo humano de la proteína de ratón para 33 anticuerpos interespecies generados en el Ejemplo 11.
La Figura 12 muestra el gel de control de calidad obtenido en la etapa 12 del procedimiento descrito en el Ejemplo 8.
Definición de términos
Para facilitar la comprensión de los ejemplos proporcionados en la presente descripción, se describirán ciertos métodos y/o términos que aparecen con frecuencia.
El término "agente" se usa en la presente descripción para denotar un anticuerpo, una mezcla de anticuerpos, una matriz de compuestos localizados espacialmente (por ejemplo, una matriz de péptidos VLSIPS, una matriz de polinucleótidos y/o una matriz de moléculas pequeñas combinatorias), una macromolécula biológica, una biblioteca de presentación de péptidos en bacteriófagos, una biblioteca de presentación de anticuerpos en bacteriófagos (por ejemplo, scFv), una biblioteca de presentación de péptidos en polisomas o un extracto preparado a partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos o células o tejidos animales (mamíferos en particular). La actividad potencial de los agentes como antineoplásicos, antiinflamatorios o moduladores de la apoptosis se evalúa mediante su inclusión en los ensayos de tamizaje descritos a continuación. La actividad potencial de los agentes como inhibidores específicos de la interacción de proteínas (es decir, un agente que inhibe selectivamente una interacción de unión entre dos polipéptidos predeterminados pero que no interfiere sustancialmente con la viabilidad celular) se evalúa mediante su inclusión en los ensayos de tamizaje descritos a continuación.
El término "amino ácido" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier compuesto orgánico que contiene un grupo amino (--NH2) y un grupo carboxilo (-COOH); preferentemente como grupos libres o alternativamente después de la condensación como parte de enlaces peptídicos. Los "veinte alfa-aminoácidos formadores de polipéptidos codificados naturalmente" se comprenden en la técnica y se refieren a: alanina (ala o A), arginina (arg o R), asparagina (asn o N), ácido aspártico (asp o D), cisteína (cys o C), ácido glutámico (glu o E), glutamina (gln o Q), glicina (gly o G), histidina (his o H), isoleucina (ile o I), leucina (leu o L), lisina (lys o K), metionina (met o M), fenilalanina (phe o F), prolina (pro o P), serina (ser o S), treonina (thr o T), triptófano (trp o W), tirosina (tyr o Y) y valina (val o V).
El término "amplificación" significa que se aumenta el número de copias de un polinucleótido.
El término "anticuerpo", como se usa en la presente descripción, se refiere a moléculas de inmunoglobulina intactas, así como a fragmentos de moléculas de inmunoglobulina, tales como fragmentos Fab, Fab', (Fab')2, Fv y SCA, que pueden unirse a un epítopo de un antígeno. Estos fragmentos de anticuerpos, que retienen cierta capacidad de unirse selectivamente a un antígeno (por ejemplo, un antígeno polipeptídico) del anticuerpo del que se derivan, pueden prepararse con el uso de métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, supra) y se describen con más detalle, como sigue. Los anticuerpos pueden usarse para aislar cantidades preparativas del antígeno por cromatografía de inmunoafinidad. Otros usos diversos de tales anticuerpos son para diagnosticar y/o estadificar enfermedades (por ejemplo, neoplasia) y para aplicación terapéutica en el tratamiento de enfermedades, tales como, por ejemplo: neoplasia, enfermedad autoinmunitaria, SIDA, enfermedad cardiovascular, infecciones y similares. Los anticuerpos quiméricos, similares a los humanos, humanizados o completamente humanos son particularmente útiles.
Un fragmento Fab consiste en un fragmento monovalente de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo y puede producirse por digestión de una molécula de anticuerpo completa con la enzima papaína, para producir un fragmento que consiste en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada.
Un fragmento Fab' de una molécula de anticuerpo puede obtenerse mediante el tratamiento de una molécula de anticuerpo completa con pepsina, seguido de reducción, para producir una molécula que consiste en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada. Se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo tratada de esta manera.
Un fragmento (Fab')2 de un anticuerpo puede obtenerse mediante el tratamiento de una molécula de anticuerpo completa con la enzima pepsina, sin reducción posterior. Un fragmento (Fab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab', unidos por dos enlaces disulfuro.
Un fragmento Fv se define como un fragmento diseñado genéticamente que contiene la región variable de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada expresadas como dos cadenas.
Un anticuerpo de cadena sencilla ("SCA") es una molécula de cadena sencilla diseñada genéticamente que contiene la región variable de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada, unidas por un enlazador polipeptídico flexible adecuado.
El término "biosimilar", también denominado "producto biológico de imitación", se refiere a nuevas versiones oficialmente aprobadas de productos biofarmacéuticos innovadores, luego del vencimiento de la patente o exclusividad.
El término "huésped de producción celular", o "huésped de fabricación", se refiere a una línea de células usada para la producción o fabricación de proteínas. Células eucariotas tales como células de mamíferos, que incluyen, pero sin limitarse a, líneas de células humanas, de ratón, de hámster, de rata, de mono, así como líneas de células de levaduras, insectos y plantas. Alternativamente, pueden usarse células procariotas. En un aspecto, un huésped de producción celular mamífero se selecciona de un miembro del grupo que consiste en células fibroblásticas de ratón 3T3; células fibroblásticas de hámster sirio BHK21; células epiteliales de perro, MDCK; células epiteliales humanas Hela; células epiteliales de rata canguro PtKl; células plasmáticas de ratón SP2/0; y células plasmáticas de ratón NS0; células renales embrionarias humanas HEK 293; células renales de mono COS; células de ovario de hámster chino CHO, CHO-S; células embrionarias de ratón R1; células embrionarias de ratón E14.1; células embrionarias humanas HI; células embrionarias humanas H9; células embrionarias humanas PER C.6. En otro aspecto, el huésped de producción celular es una línea de células GS-NS0 o GS-CHOK1. En otro aspecto, el huésped de producción celular se selecciona de células de levadura S. cerevisiae; y células de levadura pichia. En otro aspecto, el huésped de producción celular es una línea de células bacterianas.
Una molécula que tiene una "propiedad quimérica" es una molécula que es: 1) en parte homóloga y en parte heteróloga a una primera molécula de referencia; mientras que 2) al mismo tiempo es en parte homóloga y en parte heteróloga a una segunda molécula de referencia; sin 3) excluir la posibilidad de ser al mismo tiempo en parte homóloga y en parte heteróloga a una o más moléculas de referencia adicionales. En una modalidad no limitante, una molécula quimérica puede prepararse mediante el ensamblaje de un reordenamiento de secuencias moleculares parciales. En un aspecto no limitante, una molécula de polinucleótido quimérico puede prepararse mediante la síntesis del polinucleótido quimérico con el uso de una pluralidad de plantillas moleculares, de manera que el polinucleótido quimérico resultante tenga propiedades de una pluralidad de plantillas.
El término "afín", como se usa en la presente descripción, se refiere a una secuencia génica que se relaciona evolutivamente y funcionalmente entre especies. Por ejemplo, pero sin limitación, en el genoma humano el gen de CD4 humano es el gen afín al gen de 3d4 de ratón, ya que las secuencias y estructuras de estos dos genes indican que son altamente homólogos y ambos genes codifican una proteína que funciona en la señalización de la activación de células T a través del reconocimiento de antígenos restringidos al MHC clase II.
El término "escala comercial" significa la producción de una proteína o anticuerpo a una escala apropiada para la reventa.
Una "ventana de comparación", como se usa en la presente descripción, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguos en donde una secuencia polinucleotídica puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos y en donde la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende las adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math.
2: 482 por el algoritmo de alineamiento de homología de Needlemen y Wuncsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), o por inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, el que produce el mayor porcentaje de homología en la ventana de comparación) generado por los diversos métodos.
Como se usa en la presente descripción, los términos "región determinante de complementariedad" y "CDR" se refieren al término reconocido en la técnica como se ejemplifica en Kabat y Chothia. Las definiciones de CDR también se conocen generalmente como regiones supervariables o lazos hipervariables (Chothia y Leks, 1987; Clothia y otros, 1989; Kabat y otros, 1987; y Tramontano y otros, 1990). Los dominios de región variable comprenden típicamente el extremo amino terminal de aproximadamente 105-115 aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina de origen natural (por ejemplo, aminoácidos 1-110), aunque dominios variables algo más cortos o más largos también son adecuados para formar anticuerpos de cadena sencilla. Las CDR son partes de las inmunoglobulinas que determinan la especificidad de dichas moléculas y hacen contacto con un ligando específico. Las CDR son la parte más variable de la molécula y contribuyen a la diversidad de estas moléculas. Hay tres regiones CDR, CDR1, CDR2 y CDR3, en cada dominio V. CDR-H representa una región CDR de una cadena pesada variable y CDR-L se refiere a una región CDR de una cadena ligera variable. H significa la cadena pesada variable y L significa la cadena ligera variable. Las regiones CDR de una región derivada de Ig pueden determinarse como se describe en Kabat (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta edición, publicación NIH núm. 91-3242 Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Chothia (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917 y Chothia (1989) Nature, 342, 877-883.
El término "integral" se usa en la presente descripción para referirse a una técnica de desarrollo en donde se hacen todos los cambios posibles en cada posición de las CDR de un anticuerpo plantilla y los anticuerpos mutantes se analizan por secuenciación o alguna otra técnica para confirmar que se ha hecho el cambio previsto. La mutagénesis integral se refiere a mutar el ADN que codifica las CDR del anticuerpo plantilla lo que cambia la secuencia de los codones de aminoácidos del anticuerpo plantilla y después determinar mediante secuenciación u otras tecnologías que todas las mutaciones se han hecho y en el caso óptimo distribuido como matriz donde cada clon está en una posición identificable y/o se etiqueta de forma única. Después, se realiza el tamizaje de todos los mutantes expresados para garantizar que todos se expresen de manera integral para un fenotipo mejorado para proporcionar una cobertura integral garantizada, es decir, biblioteca de CPE con tamizaje integral que comprende el proceso de CPE de BioAtla. La expresión de los clones que no se expresan en el sistema de tamizaje también se medirá simultáneamente para garantizar que no se etiqueten incorrectamente como mutaciones negativas o neutras, una vez que se habilite un sistema alternativo para la expresión tal como la transcripción y traducción in vitro. Alternativamente, después del tamizaje podría realizarse la secuenciación de todos los clones, pero esta deberá incluir todos los clones negativos, neutros y mutantes mejorados. Después se añadirá cualquier mutante no identificado en una segunda ronda de tamizaje de producción y un verdadero sistema de mutagénesis integral y tamizaje de expresión/actividad tal como CPE. Esto ha sido posible en parte por los éxitos recientes en la secuenciación de alto rendimiento que no existía anteriormente.
Las "sustituciones conservadoras de aminoácidos" se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas hidroxiladas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.
El término "corresponde a" se usa en la presente descripción para referirse a que una secuencia polinucleotídica es homóloga (es decir, es idéntica, no se relaciona evolutivamente de manera estricta) a la totalidad o a una porción de una secuencia polinucleotídica de referencia, o que una secuencia polipeptídica es idéntica a una secuencia polipeptídica de referencia. En contraposición, el término "complementario a" se usa en la presente descripción para referirse a que la secuencia complementaria es homóloga a la totalidad o a una porción de una secuencia polinucleotídica de referencia. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una "TATAC" de referencia y es complementaria a una secuencia "GTATA" de referencia.
El término "desarrollo de anticuerpos interespecies" se refiere al desarrollo de un anticuerpo que se une a un primer antígeno, preferentemente un antígeno humano, de modo que se una a un ortólogo del primer antígeno, mientras mantiene la actividad de unión al primer antígeno.
Los términos "proteína interespecies" o "péptido interespecies" se refieren a una proteína o péptido desarrollado resultante del desarrollo de anticuerpos interespecies.
El término cantidad "degradante eficaz" se refiere a la cantidad que se requiere para procesar al menos 50 % del sustrato, en comparación con el sustrato que no está en contacto con la enzima. Preferentemente, se degrada al menos 80 % del sustrato.
El término "desinmunización", como se usa en la presente descripción, se refiere a la producción de una variante del anticuerpo plantilla, que se modifica en comparación con una plantilla original al hacer que dicha variante no sea inmunogénica o sea menos inmunogénica en seres humanos. Las moléculas desinmunizadas de acuerdo con la descripción se refieren a anticuerpos o partes de los mismos (CDR) de origen no humano. Los ejemplos correspondientes son anticuerpos o fragmentos de los mismos como se describe en el documento US 4,361,549. El término "desinmunizado" también se refiere a moléculas, que muestran una tendencia reducida a generar epítopos de células T. De acuerdo con esta descripción, el término "tendencia reducida a generar epítopos de células T" se refiere a la eliminación de los epítopos de células T que conducen a la activación de células T específicas.
Además, tendencia reducida a generar epítopos de células T significa la sustitución de los aminoácidos que contribuyen a la formación de epítopos de células T, es decir, la sustitución de los aminoácidos, que son esenciales para la formación de un epítopo de células T. En otras palabras, tendencia reducida a generar epítopos de células T se refiere a la reducción de la inmunogenicidad o la reducción de la capacidad de inducir la proliferación de células T independiente del antígeno. Además, tendencia reducida a generar epítopos de células T se refiere a la desinmunización, que significa la pérdida o reducción de epítopos potenciales de células T de secuencias de aminoácidos que inducen la proliferación de células T independiente del antígeno.
El término "epítopo de células T", como se usa en la presente descripción, se refiere a secuencias peptídicas cortas que pueden liberarse durante la degradación de péptidos, polipéptidos o proteínas dentro de las células y posteriormente presentarse por moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) para desencadenar la activación de células T; ver, entre otros, el documento WO 02/066514. Para los péptidos presentados por el MHC clase II, dicha activación de las células T puede inducir después una respuesta de anticuerpos por estimulación directa de la producción de dichos anticuerpos por células B.
La "digestión" del ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa solo en ciertas secuencias en el ADN. Las diversas enzimas de restricción usadas en la presente descripción están disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se usaron como conoce el experto. Con fines analíticos, típicamente se usa 1 |jg de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 j l de solución tampón. Con el fin de aislar los fragmentos de ADN para la construcción de plásmidos, típicamente se digieren de 5 a 50 jg de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. El fabricante especifica los tampones y cantidades de sustrato apropiados para las enzimas de restricción particulares. Normalmente se usan tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37 °C, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión, la reacción se somete a electroforesis directamente en un gel para aislar el fragmento deseado.
El término "transposición de ADN" se usa en la presente descripción para indicar la recombinación entre secuencias sustancialmente homólogas pero, no idénticas, en algunas modalidades la transposición de ADN puede involucrar un intercambio mediante recombinación no homóloga, tal como mediante sistemas cer/lox y/o flp/frt y similares. La transposición puede ser aleatoria o no aleatoria.
Como se usa en esta descripción, el término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en un antígeno, tal como un polipéptido de fitasa, al que se une el parátopo de un anticuerpo, tal como un anticuerpo específico de fitasa. Los determinantes antigénicos usualmente consisten en grupos de moléculas de superficie químicamente activas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Como se usa en la presente descripción, "epítopo" se refiere a la porción de un antígeno u otra macromolécula que puede formar una interacción de unión que interactúa con el cuerpo de unión de la región variable de un anticuerpo. Típicamente, dicha interacción de unión se manifiesta como un contacto intermolecular con uno o más residuos de aminoácidos de una CDR.
El término "desarrollo" se refiere a un cambio en al menos una propiedad, característica o actividad de una proteína o anticuerpo modificado genéticamente o por síntesis cuando se compara con una proteína o anticuerpo plantilla.
En la presente descripción se proporciona un método para producir a partir de un anticuerpo plantilla un conjunto de anticuerpos progenie en el que se representa un "rango completo de sustituciones de un solo aminoácido" en cada posición de aminoácido en las CDR del anticuerpo plantilla. Como se usa en la presente descripción, "rango completo de sustituciones de un solo aminoácido" se refiere a los 20 alfa-aminoácidos codificados naturalmente formadores de polipéptidos codificados naturalmente, como se describe en la presente descripción.
El término "gen" se refiere al segmento de ADN involucrado en la producción de una cadena polipeptídica; incluye regiones anteriores y posteriores a la región codificante (líder y remolque), así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).
El término "humanizado" se usa para describir anticuerpos en donde las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un animal mamífero, por ejemplo, un ratón, se combinan con una región marco humana. A menudo, los polinucleótidos que codifican las CDR aisladas se injertarán en polinucleótidos que codifican un marco de región variable adecuado (y opcionalmente regiones constantes) para formar polinucleótidos que codifican anticuerpos completos (por ejemplo, humanizados o completamente humanos), fragmentos de anticuerpos y similares. En otro aspecto, además de los anticuerpos de ratón, se pueden humanizar otras especies, tales como, por ejemplo, otro roedor, camello, conejo, gato, perro, cerdo, caballo, vaca, pez, llama y tiburón. En un aspecto amplio, cualquier especie que produzca anticuerpos puede utilizarse en la producción de anticuerpos humanizados. Además, los anticuerpos de la descripción pueden ser quiméricos, similares a los humanos, humanizados o completamente humanos, para reducir su antigenicidad potencial, sin reducir su afinidad por su diana. Los anticuerpos quiméricos, similares a los humanos y humanizados se han descrito generalmente en la técnica. La antigenicidad se reduce mediante la incorporación de tan poca secuencia extraña como sea posible en el anticuerpo híbrido. La preparación de estos anticuerpos híbridos puede llevarse a cabo por métodos bien conocidos en la técnica.
Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consiste en una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también llamadas CDR. La extensión de la región marco y las CDR se han definido con precisión (ver " Sequences of Proteins of Immunological Interest ", Kabat y otros, 1987). Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. Como se usa en la presente descripción, una "región marco humana" es una región marco que es sustancialmente idéntica (aproximadamente 85 o más, usualmente 90-95 o más) a la región marco de una inmunoglobulina humana de origen natural. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR. Las CDR son las principales responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. De acuerdo con esta descripción, una región marco se refiere a una región en el dominio V (dominio VH o VL) de las inmunoglobulinas que proporciona un andamio proteico para las regiones determinantes de complementariedad (CDR) hipervariables que hacen contacto con el antígeno. En cada dominio V, hay cuatro regiones marco designadas FR1, FR2, FR3 y FR4. El marco 1 abarca la región desde el extremo N-terminal del dominio V hasta el inicio de CDR1, el marco 2 se refiere a la región entre CDR1 y CDR2, el marco 3 abarca la región entre CDR2 y CDR3 y el marco 4 se refiere a la región desde el final de CDR3 hasta el extremo C-terminal del dominio V; ver, entre otros, Janeway, Immunobiology, Garland Publishing, 2001, 5ta ed. Por lo tanto, las regiones marco abarcan todas las regiones fuera de las regiones CDR en los dominios VH o VL.
El experto en la técnica puede deducir fácilmente las regiones marco y las CDR de una secuencia dada; ver Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta edición, publicación NIH núm. 91-3242 Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Chothia (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917 y Chothia (1989) Nature, 342, 877-883.
Los beneficios de esta descripción se extienden a "aplicaciones industriales" (o procesos industriales), término que se usa para incluir aplicaciones en la industria comercial propiamente dicha (o simplemente industria), así como aplicaciones industriales no comerciales (por ejemplo, investigación biomédica en una institución sin fines de lucro). Las aplicaciones relevantes incluyen aquellas en áreas de diagnóstico, medicina, agricultura, fabricación y academia.
El término "idéntico" o "identidad" significa que dos secuencias de ácido nucleico tienen la misma secuencia o una secuencia complementaria. Por lo tanto, "áreas de identidad" significa que las regiones o áreas de un polinucleótido o el polinucleótido completo son idénticas o complementarias a las áreas de otro polinucleótido o el polinucleótido.
El término "aislado" significa que el material se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o proteína de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o proteína, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dichos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o proteínas podrían ser parte de una composición, y aún estar aislados porque dicho vector o composición no es parte de su entorno natural.
"Ligación" se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico bicatenarios (Maniatis y otros, 1982, p. 146). A menos que se indique de otro modo, la ligación puede realizarse con el uso de tampones y condiciones conocidas con 10 unidades de ADN ligasa T4 ("ligasa") por 0,5 mg de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a ligar.
Como se usa en la presente descripción, "enlazador" o "espaciador" se refiere a una molécula o grupo de moléculas que conecta dos moléculas, tales como una proteína de unión al ADN y un péptido aleatorio, y sirve para colocar las dos moléculas en una configuración preferida, por ejemplo, de modo que el péptido aleatorio pueda unirse a un receptor con un impedimento estérico mínimo de la proteína de unión al ADN.
El término "presentación en la superficie celular de mamífero" se refiere a una técnica mediante la cual un anticuerpo, o una porción de un anticuerpo, se expresa y presenta en la superficie de una célula huésped de mamífero con fines de tamizaje; por ejemplo, mediante el tamizaje de la unión al antígeno específico mediante una combinación de esferas magnéticas y clasificación de células activada por fluorescencia. En un aspecto, los vectores de expresión en mamífero se usan para la expresión simultánea de inmunoglobulinas tanto en forma secretada como unida a la superficie celular como en DuBridge y otros, documento US 2009/0136950. En otro aspecto, las técnicas de Gao y otros se emplean para un vector viral que codifica una biblioteca de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se presentan en las membranas celulares cuando se expresan en una célula como en Gao y otros, documento US 2007/0111260. Se conoce la presentación de IgG completas en la superficie en células de mamífero. Por ejemplo, Akamatsuu y otros desarrollaron un vector de presentación en la superficie celular de mamífero, adecuado para aislar directamente moléculas de IgG en base a su afinidad de unión al antígeno y su actividad biológica. Con el uso de un vector episomal derivado del virus de Epstein-Barr, las bibliotecas de anticuerpos se presentaron como moléculas de IgG completas en la superficie celular y se tamizaron para detectar la unión al antígeno específico mediante una combinación de esferas magnéticas y clasificación de células activada por fluorescencia. Los plásmidos que codifican los anticuerpos con las características de unión deseadas se recuperaron a partir de las células clasificadas y se convirtieron a la forma para la producción de IgG soluble. Akamatsuu y otros J. Immunol. Methods 2007 327(1-2):40-52. Ho y otros usaron células renales embrionarias humanas 293T que se usan ampliamente para la expresión transitoria de proteínas para la presentación en la superficie celular de anticuerpos Fv de cadena sencilla para la maduración de la afinidad. Las células que expresaban un anticuerpo mutante raro con mayor afinidad se enriquecieron 240 veces mediante una clasificación de células de un solo paso a partir de un gran exceso de células que expresan el anticuerpo WT con una afinidad ligeramente inferior. Además, se obtuvo un mutante altamente enriquecido con una mayor afinidad de unión por CD22 después de una única selección de una biblioteca combinatoria que aleatorizaba un punto caliente de anticuerpo intrínseco. Ho y otros Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells, Proc Natl Acad Sci USA 20 de junio de 2006; 103(25): 9637-9642.
Beerli y otros usaron células B específicas para un antígeno de interés que se aislaron directamente a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes humanos. Las bibliotecas recombinantes de Fv de cadena sencilla (scFv) específicos de antígeno se generan a partir de este grupo de células B y se tamizan mediante la presentación en la superficie celular de mamífero con el uso de un sistema de expresión de virus Sindbis. Este método permite aislar anticuerpos específicos de antígeno mediante una sola ronda de FACS. Las regiones variables (VR) de las cadenas pesadas (HC) y las cadenas ligeras (LC) se aislaron a partir de clones positivos y se produjeron anticuerpos recombinantes completamente humanos como IgG completas o fragmentos Fab. De esta manera, se aislaron varios anticuerpos hipermutados de alta afinidad que se unían a la partícula similar al virus Qp (VLP), un antígeno viral modelo, así como anticuerpos específicos para la nicotina. Todos los anticuerpos mostraron altos niveles de expresión en cultivo celular. Los AcM humanos específicos para la nicotina se validaron preclínicamente en un modelo de ratón. Beerli y otros, Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display, Proc Natl Acad Sci U S A. 23 de septiembre de 2008; 105(38): 14336-14341.
La presentación en la superficie celular de levadura también se conoce, por ejemplo, ver Kondo y Ueda 2004, Yeast cell-surface display-applications of molecular display, Appl. Microbiol. Biotechnol., 64(1): 28-40, que describe, por ejemplo, un sistema de ingeniería de superficie celular que usa la levadura Saccharomyces cerevisiae. Varios sistemas de presentación representativos para la expresión en la levadura S. cerevisiae se describen en Lee y otros, 2003, Microbial cell-surface display, TRENDS in Biotechnol. 21(1): 45-52. También Boder y Wittrup 1997, Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nature Biotechnol., 15(6): 553.
El término "fabricación" se refiere a la producción de una proteína en una cantidad suficiente para permitir al menos las pruebas clínicas de Fase I de una proteína terapéutica, o una cantidad suficiente para la aprobación por entidades reguladoras de una proteína de diagnóstico.
El término "mutación con cambio de sentido" se refiere a una mutación puntual en la que se cambia un solo nucleótido, lo que produce un codón que codifica un aminoácido diferente. Las mutaciones que cambian un aminoácido a un codón de parada se llaman mutaciones sin sentido.
Como se usa en la presente descripción, una "propiedad molecular a desarrollar" incluye la referencia a moléculas compuestas por un anticuerpo y en parte por una secuencia de anticuerpo. Los ejemplos particularmente relevantes -- pero de ninguna manera limitantes -- de propiedades moleculares a desarrollar incluyen salinidad; presión; pH; y concentración de glicerol, DMSO, detergente y/o cualquier otra especie molecular con la que se hace contacto en un entorno de reacción. Ejemplos particularmente relevantes adicionales -- pero de ninguna manera limitantes de las propiedades moleculares a desarrollar incluyen estabilidades -- por ejemplo, la cantidad de una propiedad molecular residual que está presente después de un tiempo de exposición específico a un entorno específico, tal como puede encontrarse durante el almacenamiento.
El término "mapeo multidimensional de epítopos" (MEM) se refiere a la identificación del epítopo y la resolución de los aminoácidos que son importantes para la unión al anticuerpo. La información sobre los sitios de unión (epítopos) de las proteínas reconocidos por los anticuerpos es importante para su uso como herramientas biológicas o de diagnóstico, así como para comprender sus mecanismos de acción. Sin embargo, los antígenos son muy diversos, tanto en su secuencia primaria como en estructuras tridimensionales. Los epítopos generalmente se dividen en 3 categorías: 1) epítopos lineales, es decir, el anticuerpo se une a residuos en una parte lineal de la cadena polipeptídica, 2) epítopos conformacionales, donde el sitio de unión está formado por un elemento estructural (por ejemplo, a-hélice, lazo), 3) epítopos discontinuos donde dos o más tramos independientes de la cadena polipeptídica que se acercan en la estructura tridimensional del antígeno forman la superficie de unión.
El término "mutar" se refiere a crear una mutación en una secuencia de ácido nucleico; en el caso de que la mutación se produzca dentro de la región codificante de una proteína, conducirá a un cambio de codón que puede o no conducir a un cambio de aminoácido.
El término "mutaciones" significa cambios en la secuencia del anticuerpo. Dichas mutaciones pueden ser mutaciones puntuales tales como transiciones o transversiones. Las mutaciones pueden ser deleciones, inserciones o duplicaciones.
Como se usa en la presente descripción, la secuencia de nucleótidos redundante "N,N,G/T" representa 32 tripletes posibles, donde "N" puede ser A, C, G o T.
Como se usa en la presente descripción, la secuencia de nucleótidos redundante "N,N,N" representa 64 tripletes posibles, donde "N" puede ser A, C, G o T.
El término "de origen natural" como se usa en la presente descripción como se aplica al objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (que incluye los virus) que puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural. Generalmente, el término de origen natural se refiere a un objeto como está presente en un individuo no patológico (no enfermo), tal como sería típico para la especie.
Como se usa en la presente descripción, una "molécula de ácido nucleico" está compuesta por al menos una base o un par de bases, en dependencia de si es monocatenaria o bicatenaria, respectivamente. Además, una molécula de ácido nucleico puede pertenecer exclusivamente o quiméricamente a cualquier grupo de moléculas que contienen nucleótidos, como se ejemplifica mediante, pero sin limitarse a, los siguientes grupos de moléculas de ácido nucleico: ARN, ADN, ácidos nucleicos genómicos, ácidos nucleicos no genómicos, ácidos nucleicos de origen natural y no naturales, y ácidos nucleicos sintéticos. Esto incluye, a modo de ejemplo no limitante, los ácidos nucleicos asociados con cualquier orgánulo, tal como las mitocondrias, el ARN ribosomal y las moléculas de ácido nucleico compuestas quiméricamente por uno o más componentes que no son de origen natural junto con componentes de origen natural.
Además, una "molécula de ácido nucleico" puede contener en parte uno o más componentes que no se basan en nucleótidos como se ejemplifica mediante, pero sin limitarse a, aminoácidos y azúcares. Así, a modo de ejemplo, pero no de limitación, una ribozima que está en parte basada en nucleótidos y en parte basada en proteína se considera una "molécula de ácido nucleico".
Además, a modo de ejemplo, pero no de limitación, una molécula de ácido nucleico que se etiqueta con un resto detectable, tal como una etiqueta radioactiva o alternativamente no radioactiva, también se considera una "molécula de ácido nucleico".
Los términos "secuencia de ácido nucleico que codifica" o una "secuencia de ADN codificante de" o una "secuencia de nucleótidos que codifica" una proteína particular -- así como otros términos sinónimos -- se refieren a una secuencia de ADN que se transcribe y traduce a una proteína cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Una "secuencia promotora" es una región reguladora del ADN que puede unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante corriente abajo (dirección 3'). El promotor es parte de la secuencia de ADN. Esta región de secuencia tiene un codón de inicio en su extremo 3'. La secuencia promotora incluye el número mínimo de bases donde se encuentran los elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Sin embargo, después que la ARN polimerasa se une a la secuencia y se inicia la transcripción en el codón de inicio (extremo 3' con un promotor), la transcripción procede corriente abajo en la dirección 3'. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (definido convenientemente por mapeo con nucleasa S1) así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.
Los términos "ácido nucleico que codifica una proteína" o "ADN que codifica una proteína" o "polinucleótido que codifica una proteína" y otros términos sinónimos abarcan un polinucleótido que incluye solamente la secuencia codificante de la proteína, así como un polinucleótido que incluye una secuencia codificante adicional y/o codificante no Cq3.
En una modalidad preferida, una "especie de molécula de ácido nucleico específica" se define por su estructura química, como se ejemplifica mediante, pero sin limitarse a, su secuencia primaria. En otra modalidad preferida, una "especie de molécula de ácido nucleico" específica se define por una función de la especie de ácido nucleico o por una función de un producto derivado de la especie de ácido nucleico. Por lo tanto, a modo de ejemplo no limitante, una "especie de molécula de ácido nucleico específica" puede definirse por una o más actividades o propiedades atribuibles a ella, que incluyen actividades o propiedades atribuibles a su producto expresado.
La presente definición de "ensamblar una muestra de ácido nucleico de trabajo en forma de una biblioteca de ácidos nucleicos" incluye el proceso de incorporar una muestra de ácido nucleico en una colección basada en vectores, tal como mediante la ligación en un vector y la transformación de un huésped. A continuación, se proporciona una descripción de vectores, huéspedes y otros reactivos relevantes, así como ejemplos específicos no limitantes de los mismos. La presente definición de "ensamblar una muestra de ácido nucleico de trabajo en forma de una biblioteca de ácidos nucleicos" también incluye el proceso de incorporar una muestra de ácido nucleico a una colección que no se basa en vectores, tal como mediante ligación a adaptadores. Preferentemente, los adaptadores pueden aparearse a los cebadores de PCR para facilitar la amplificación por PCR.
Por consiguiente, en una modalidad no limitante, una "biblioteca de ácidos nucleicos" está compuesta por una colección basada en vectores de una o más moléculas de ácido nucleico. En otra modalidad preferida, una "biblioteca de ácidos nucleicos" está compuesta por una colección que no se basa en vectores de moléculas de ácido nucleico. En otra modalidad preferida más, una "biblioteca de ácidos nucleicos" está compuesta por una colección combinada de moléculas de ácido nucleico que en parte se basa en vectores y en parte no se basa en vectores. Preferentemente, la colección de moléculas que comprenden una biblioteca puede buscarse y separarse de acuerdo con las especies de moléculas de ácido nucleico individuales.
La presente descripción proporciona un "constructo de ácido nucleico" o, alternativamente, un "constructo de nucleótidos" o, alternativamente, un "constructo de ADN". El término "constructo" se usa en la presente descripción para describir una molécula, tal como un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido de fitasa) que opcionalmente puede unirse químicamente a uno o más restos moleculares adicionales, tales como un vector o partes de un vector. En un aspecto específico -- pero de ninguna manera limitante -- un constructo de nucleótidos se ejemplifica mediante un constructo de expresión de ADN adecuado para la transformación de una célula huésped.
Un "oligonucleótido" (o como sinónimo "oligo") se refiere a un polidesoxinucleótido monocatenario o a dos cadenas complementarias de polidesoxinucleótido que pueden sintetizarse químicamente. Dichos oligonucleótidos sintéticos pueden tener o no un fosfato en 5'. Los que no lo tienen no se ligarán a otro oligonucleótido sin la adición de un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no se ha desfosforilado. Para lograr la amplificación basada en polimerasa (tal como con PCR), se menciona un "oligonucleótido 32 veces redundante que está compuesto, en serie, por al menos una primera secuencia homóloga, una secuencia redundante N,N,G/T y una segunda secuencia homóloga". Como se usa en este contexto, "homólogo" se refiere a la homología entre el oligo y el polinucleótido parental que se somete a la amplificación basada en polimerasa.
Como se usa en la presente descripción, el término "unido operativamente" se refiere a una unión de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o un potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante. Unido operativamente significa que las secuencias de ADN que se unen son típicamente contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en marco de lectura.
Una secuencia codificante está "unida operativamente a" otra secuencia codificante cuando la ARN polimerasa transcribe las dos secuencias codificantes en un único ARNm, que después se traduce en un único polipéptido que tiene aminoácidos derivados de ambas secuencias codificantes. No es necesario que las secuencias codificantes sean contiguas entre sí siempre que a la larga las secuencias expresadas se procesen para producir la proteína deseada.
Como se usa en la presente descripción, el término "ortólogo" se refiere a genes que se relacionan con un gen de referencia por su descendencia de una secuencia de ADN ancestral común, en diferentes especies, que se desarrollaron a partir de un gen ancestral común por especiación. Los ortólogos a menudo, pero no siempre, tienen la misma función. El término "ortólogo" abarca los parálogos. Los parálogos son genes de la misma especie que se desarrollaron por duplicación genética de un gen ancestral común. El término "ortólogo" también incluye un "polipéptido ortólogo", "proteína ortóloga", un "sustrato ortólogo", un "receptor celular ortólogo" y un "péptido ortólogo", y como se usa en la presente descripción se refiere a polipéptidos, proteínas, sustratos, receptores celulares o péptidos que son ortólogos en diferentes especies.
Como se usa en la presente descripción, el término "condiciones fisiológicas" se refiere a temperatura, pH, fuerza iónica, viscosidad y parámetros bioquímicos similares que son compatibles con un organismo viable, y/o que típicamente existen intracelularmente en una célula de levadura o célula de mamífero cultivada viable. Por ejemplo, las condiciones intracelulares en una célula de levadura cultivada en condiciones de cultivo de laboratorio típicas son condiciones fisiológicas. Las condiciones de reacción in vitro adecuadas para cócteles de transcripción in vitro son generalmente condiciones fisiológicas. En general, las condiciones fisiológicas in vitro comprenden NaCl o KCl 50-200 mM, pH 6,5-8,5, 20-45 °C y catión divalente (por ejemplo, Mg++, Ca++) 0,001-10 mM; preferentemente NaCl o KCl a aproximadamente 150 mM, pH 7,2-7,6, catión divalente 5 mM, y a menudo incluyen proteína inespecífica (por ejemplo, BSA) al 0,01-1,0 por ciento. A menudo puede estar presente un detergente no iónico (Tween, NP-40, Tritón X-100), usualmente a aproximadamente 0,001 a 2 %, típicamente 0,05-0,2 % (v/v). El profesional puede seleccionar condiciones acuosas particulares de acuerdo con métodos convencionales. Para orientación general, pueden aplicarse las siguientes condiciones acuosas tamponadas: NaCl 10-250 mM, Tris HCl 5-50 mM, pH 5-8, con adición opcional de catión(ones) divalente(s) y/o quelantes de metales y/o detergentes no iónicos y/o fracciones de membrana y/o agentes antiespumantes y/o agentes de centelleo.
El término "población" como se usa en la presente descripción significa una colección de componentes tales como polinucleótidos, porciones de polinucleótidos o proteínas. Una "población mixta" significa una colección de componentes que pertenecen a la misma familia de ácidos nucleicos o proteínas (es decir, están relacionados) pero que difieren en su secuencia (es decir, no son idénticos) y, por lo tanto, en su actividad biológica.
Una molécula que tiene una "proforma" se refiere a una molécula que experimenta cualquier combinación de una o más modificaciones químicas covalentes y no covalentes (por ejemplo, glicosilación, escisión proteolítica, dimerización u oligomerización, cambio conformacional inducido por temperatura o inducido por pH, asociación con un cofactor, etcétera) en la vía hacia la obtención de una forma molecular más madura que tenga una diferencia de propiedad (por ejemplo, un aumento en la actividad) en comparación con la molécula proforma de referencia. Cuando se pueden distinguir dos o más modificaciones químicas (por ejemplo, dos escisiones proteolíticas, o una escisión proteolítica y una desglicosilación) en la vía hacia la producción de una molécula madura, la molécula precursora de referencia puede denominarse una molécula "preproforma".
Una "propiedad" puede describir cualquier característica, que incluye una característica física, química o de actividad característica de un anticuerpo a optimizar. Por ejemplo, en ciertos aspectos, la propiedad, característica o actividad predeterminada a optimizar puede seleccionarse de reducción de la agregación proteína-proteína, mejora de la estabilidad de la proteína, aumento de la solubilidad de la proteína, aumento de la estabilidad de la proteína frente al pH, aumento de la estabilidad de la proteína frente a la temperatura, aumento de la estabilidad de la proteína en solvente, aumento de la selectividad, disminución de la selectividad, introducción de sitios de glicosilación, introducción de sitios de conjugación, reducción de la inmunogenicidad, mejora de la expresión de proteínas, aumento de la afinidad por el antígeno, disminución de la afinidad por el antígeno, cambio en la afinidad de unión, cambio en la inmunogenicidad, optimización del pH o mejora de la especificidad. Una propiedad "optimizada" se refiere a un cambio conveniente en una propiedad particular en una proteína o anticuerpo mutante en comparación con una proteína o anticuerpo plantilla, respectivamente.
Como se usa en la presente descripción, el término "pseudoaleatorio" se refiere a un conjunto de secuencias que tienen una variabilidad limitada, de manera que, por ejemplo, al grado de variabilidad de los residuos en otra posición, excepto cualquier posición pseudoaleatoria se le permite cierto grado de variación de los residuos, sin embargo, circunscrito.
"Unidades cuasi repetidas", como se usa en la presente descripción, se refiere a las repeticiones a reordenar y, por definición, no son idénticas. De hecho, el método se propone no solo para unidades codificantes prácticamente idénticas producidas por mutagénesis de la secuencia inicial idéntica, sino también para el reordenamiento de secuencias similares o relacionadas que pueden discrepar significativamente en algunas regiones. No obstante, si las secuencias contienen homologías suficientes para reordenarlas mediante esta estrategia, pueden denominarse unidades "cuasi repetidas".
Como se usa en la presente descripción, "biblioteca de péptidos aleatorios" se refiere a un conjunto de secuencias polinucleotídicas que codifica un conjunto de péptidos aleatorios, y al conjunto de péptidos aleatorios codificados por esas secuencias polinucleotídicas, así como las proteínas de fusión que contienen esos péptidos aleatorios.
Como se usa en la presente descripción, "secuencia peptídica aleatoria" se refiere a una secuencia de aminoácidos compuesta por dos o más monómeros de aminoácidos y construida mediante un proceso estocástico o aleatorio. Un péptido aleatorio puede incluir motivos de marco o andamio, que pueden comprender secuencias invariantes.
Como se usa en la presente descripción, "receptor" se refiere a una molécula que tiene una afinidad por un ligando dado. Los receptores pueden ser moléculas de origen natural o sintéticas. Los receptores pueden emplearse en un estado inalterado o como agregados con otras especies. Los receptores pueden unirse, de manera covalente o no covalente, a un miembro de unión, directamente o mediante una sustancia de unión específica. Los ejemplos de receptores incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, que incluyen anticuerpos monoclonales y antisueros reactivos con determinantes antigénicos específicos (tales como virus, células u otros materiales), receptores de membrana celular, receptores con carbohidratos complejos y glicoproteínas, receptores enzimáticos y receptores hormonales.
Las proteínas "sintéticas" son aquellas preparadas por síntesis química.
El término "polinucleótidos relacionados" significa que las regiones o áreas de los polinucleótidos son idénticas y las regiones o áreas de los polinucleótidos son heterólogas.
Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial".
Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia génica o de ADNc de longitud completa proporcionada en un listado de secuencias, o puede comprender una secuencia génica o de ADNc completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 20 nucleótidos de longitud, con frecuencia al menos 25 nucleótidos de longitud y, a menudo, al menos 50 nucleótidos de longitud. Dado que cada uno de dos polinucleótidos puede (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos y (2) puede comprender además una secuencia que es discrepante entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente mediante la comparación de las secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia.
"Índice de repetición (RI)", como se usa en la presente descripción, es el número promedio de copias de las unidades cuasi repetidas contenidas en el vector de clonación.
El término "saturación" se refiere a una técnica de desarrollo en donde se hacen todos los cambios posibles en cada posición de las CDR en un anticuerpo plantilla; sin embargo, el cambio en cada posición no se confirma mediante pruebas, sino que simplemente se asume estadísticamente, en donde se estima que la mayoría de los cambios posibles o casi todos los cambios posibles se producen en cada posición de una plantilla. La mutagénesis por saturación se refiere a mutar el ADN de una región de un gen que codifica una proteína que cambia la secuencia de codones de aminoácidos de la proteína y después tamizar los mutantes expresados de esencialmente todos los mutantes para detectar un fenotipo mejorado en base al sobremuestreo estadístico que se aproxima a una cobertura integral, pero no garantiza una cobertura completa.
El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias polinucleotídicas son idénticas (es decir, nucleótido por nucleótido) en la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula mediante la comparación de dos secuencias alineadas de manera óptima en la ventana de comparación, la determinación del número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, la división del número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y la multiplicación del resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Esta "identidad sustancial", como se usa en la presente descripción, denota una característica de una secuencia polinucleotídica, en donde el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 80 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos 85 por ciento de identidad, a menudo 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, y lo más común al menos 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia de una ventana de comparación de al menos 25-50 nucleótidos, en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula mediante la comparación de la secuencia de referencia con la secuencia polinucleotídica que puede incluir deleciones o adiciones que suman 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación.
El término "mutación silente" se refiere a un cambio de codón que no produce un cambio de aminoácido en un anticuerpo expresado y se basa en la redundancia del uso de codones para la inserción de aminoácidos.
Como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos proteínas se determina mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos sustitutos conservados de una proteína con la secuencia de una segunda proteína. La similitud puede determinarse mediante procedimientos que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, un programa b La ST (herramienta básica de búsqueda de alineamiento local en el Centro Nacional de Información Biológica).
Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo de cadena sencilla" se refiere a un polipéptido que comprende un dominio VH y un dominio VL en enlace polipeptídico, generalmente unidos mediante un péptido espaciador (por ejemplo, [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]x), y que puede comprender secuencias de aminoácidos adicionales en los extremos amino y/o carboxi terminales. Por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla puede comprender un segmento conector para la unión al polinucleótido codificante. Como ejemplo, un scFv es un anticuerpo de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla son generalmente proteínas que consisten en uno o más segmentos polipeptídicos de al menos 10 aminoácidos contiguos sustancialmente codificados por genes de la superfamilia de inmunoglobulinas (por ejemplo, ver Williams y Barclay, 1989, páginas 361-368), codificados con mayor frecuencia por una secuencia génica de cadena pesada o cadena ligera de roedor, primate no humano, aviar, porcino, bovino, ovino, de cabra o seres humanos. Un anticuerpo de cadena sencilla funcional generalmente contiene una porción suficiente de un producto génico de la superfamilia de las inmunoglobulinas para retener la propiedad de unión a una molécula diana específica, típicamente un receptor o un antígeno (epítopo).
Se dice que los miembros de un par de moléculas (por ejemplo, un par anticuerpo-antígeno) se "unen específicamente" entre sí si se unen entre sí con mayor afinidad que a otras moléculas inespecíficas. Por ejemplo, un anticuerpo generado contra un antígeno al que se une de manera más eficiente que a una proteína inespecífica puede describirse como unido específicamente al antígeno.
"Condiciones de hibridación rigurosas" significa que la hibridación se producirá solo si hay al menos 90 % de identidad, preferentemente al menos 95 % de identidad y con la máxima preferencia al menos 97 % de identidad entre las secuencias. Ver Sambrook y otros, 1989.
En la descripción también se incluyen los polipéptidos que tienen secuencias que son "sustancialmente idénticas" a la secuencia de un polipéptido, tal como una de cualquier SEQ ID NO descrita en la presente descripción. Una secuencia de aminoácidos "sustancialmente idéntica" es una secuencia que difiere de una secuencia de referencia solo por sustituciones conservadoras de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones de un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, la sustitución de un aminoácido hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina, por otro, o la sustitución de un aminoácido polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparagina).
Además, una secuencia de aminoácidos "sustancialmente idéntica" es una secuencia que difiere de una secuencia de referencia o por una o más sustituciones no conservadoras, particularmente cuando dicha sustitución se produce en un sitio que no es el sitio activo de la molécula, y siempre que el polipéptido retenga esencialmente sus propiedades conductuales. Por ejemplo, se pueden eliminar uno o más aminoácidos de un polipéptido de fitasa, lo que produce la modificación de la estructura del polipéptido, sin alterar significativamente su actividad biológica. Por ejemplo, se pueden eliminar los aminoácidos amino o carboxilo terminales que no se requieren para la actividad biológica de la fitasa. Dichas modificaciones pueden producir el desarrollo de polipéptidos de fitasa activos más pequeños.
La presente descripción proporciona una "proteína sustancialmente pura". El término "proteína sustancialmente pura" se usa en la presente descripción para describir una molécula, tal como un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de fitasa, o un fragmento del mismo) que está sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y otros materiales biológicos con los que se asocia en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula sustancialmente pura, tal como un polipéptido, puede ser al menos 60 %, en peso seco, la molécula de interés. La pureza de los polipéptidos puede determinarse con el uso de métodos estándar que incluyen, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida (por ejemplo, SDS-PAGE), cromatografía en columna (por ejemplo, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)) y análisis de la secuencia de aminoácidos amino terminal.
Como se usa en la presente descripción, "sustancialmente pura" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición), y preferentemente la fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 a 90 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. Con la máxima preferencia, la especie objeto se purifica a una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular. Las especies solventes, las moléculas pequeñas (<500 Daltons) y las especies iónicas elementales no se consideran especies macromoleculares.
El término "de tipo silvestre", o tipo silvestre", significa que el polinucleótido no comprende ninguna mutación. Un anticuerpo de "tipo silvestre" significa que el anticuerpo estará activo a un nivel de actividad que se encuentra en la naturaleza y comprenderá la secuencia de aminoácidos que se encuentra en la naturaleza.
Descripción detallada
Actualmente, la informática se usa a la vanguardia para guiar el desarrollo de las moléculas de polipéptidos y proteínas al decidir en qué lugar de las moléculas hacer mutaciones en una búsqueda de optimización molecular. La descripción proporciona métodos en donde las mutaciones se realizan de manera sistemática en las seis regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo plantilla, después puede crearse un mapa para proporcionar información útil al final y el mapa se convierte en la guía de dónde enfocar la próxima ronda de mutación. Diversos métodos de desarrollo integral se utilizan solos y en combinación para proporcionar datos altamente predictivos para la optimización de proteínas.
La presente descripción se refiere a métodos para identificar y mapear anticuerpos mutantes formados a partir de, o basados en, un anticuerpo plantilla.
Históricamente, el descubrimiento de anticuerpos se ha realizado en huéspedes eucariotas (euc) y procariotas (proc). Típicamente, en bacterias (E. coli), se descubren anticuerpos de longitud parcial; por ejemplo, en las tecnologías de presentación en fagos, se recuperan Fab y, a veces, se convierten en longitud completa corriente abajo. Existen varias desventajas potenciales para estas estrategias.
En un ejemplo, hay cierta evidencia de que las regiones Fc y Fv se comunican para afectar las propiedades del anticuerpo, tales como la unión y la expresión. Por lo tanto, cuando un fragmento de anticuerpo se optimiza para una propiedad tal como la expresión, la mejora no siempre se traduce en una expresión mejorada en el anticuerpo ensamblado de longitud completa. Por ejemplo, se creó una biblioteca de Fc en un intento de encontrar un Fc "santo grial" que pudiera unirse a cualquier Fv para mejorar la expresión en cualquier huésped.
En un aspecto, también puede realizarse mutagénesis de codones en la región constante para la optimización de la expresión en células de mamífero. Específicamente, se crearon 326 mutantes en la región constante y se expresaron en células HEK 293 y CHO-S. El tamizaje se realizó por ELISA. Varios Fc cumplieron los criterios de expresión mejorada, e incluso se identificaron ciertos Fc optimizados que transferían efectos positivos en múltiples líneas de células; sin embargo, cuando se unió un Fv diferente al Fc, la mejora en la expresión no se transmitió. Esto demuestra que los Fc y Fv se comunican.
Para evitar resultados inesperados tras la recombinación de fragmentos de anticuerpos, en un aspecto preferido, los métodos de la descripción se usan para descubrir moléculas de anticuerpos de longitud completa. En otro aspecto preferido, los métodos de la descripción utilizan huéspedes de células eucariotas.
En una modalidad, el huésped de células eucariotas es un huésped de células de mamífero seleccionado de uno del grupo que consiste en líneas de células CHO, HEK293, IM9, DS-1, THP-1, Hep G2, COS, NIH 3T3, C33a, A549, A375, SK-MEL-28, DU 145, PC-3, HCT 116, Mia PACA-2, ACHN, Jurkat, MM1, Ovcar 3, HT 1080, Panc-1, U266, 769P, BT-474, Caco-2, HCC 1954, MDA-MB-468, LnCAP, NRK-49F y SP2/0; y esplenocitos de ratón y PBMC de conejo. En un aspecto, el huésped de células de mamífero se selecciona de una línea de células CHO o HEK293. En un aspecto específico, el huésped de células de mamífero es una línea de células CHO-S. En otro aspecto específico, el huésped de células de mamífero es una línea de células HEK293. En otra modalidad, el huésped de células eucariotas es un huésped de células de levadura. En un aspecto, el huésped de células eucariotas se selecciona de células de levadura S. cerevisiae o células de levadura pichia.
En otra modalidad, la creación de líneas de células de mamífero puede realizarse comercialmente por una organización contratada de investigación o de fabricación personalizada. Por ejemplo, para anticuerpos recombinantes u otras proteínas, Lonza (Lonza Group Ltd, Basilea, Suiza) puede crear vectores para expresar el producto con el uso de la tecnología GS Gene Expression System™ con líneas de células huésped CHOK1SV o NSO.
En otra modalidad, el desarrollo puede realizarse en huéspedes procariotas (tales como E. coli) y el tamizaje puede producirse en huéspedes eucariotas (por ejemplo, CHO).
Los métodos para el desarrollo de moléculas incluyen métodos no estocásticos. Los métodos publicados incluyen estrategias de mutagénesis no aleatoria. Cualquiera de estas estrategias puede emplearse para desarrollar propiedades del anticuerpo plantilla de la presente descripción hacia una característica deseada, tal como una mejor estabilidad en diferentes entornos de temperatura o pH, o una mejor expresión en una célula huésped. Para los experimentos de desarrollo pueden seleccionarse otras propiedades potencialmente convenientes, tales como resultados de actividad catalítica mejorada, estabilidad de la proteína mejorada en diversas condiciones, selectividad y/o solubilidad mejoradas, y expresión mejorada mediante la mejora de características tales como agregación reducida.
El desarrollo se realiza directamente en un huésped eucariota, tal como un huésped de células de mamífero o un huésped de células de levadura, que se usará para la producción corriente abajo de los anticuerpos desarrollados. Los candidatos pueden desarrollarse para una expresión óptima en el mismo huésped usado para tamizar y/o desarrollar y para fabricar. La optimización de la expresión puede lograrse mediante la optimización de los vectores usados (componentes del vector, tales como promotores, sitios de corte y empalme, extremos 5' y 3' y secuencias flanqueantes), modificación génica de las células huésped para reducir las deleciones y reordenamientos génicos, desarrollo de las actividades génicas en la célula huésped mediante métodos in vivo o in vitro de desarrollo de genes relevantes, optimización de enzimas de glicosilación del huésped mediante el desarrollo de genes relevantes y/o mediante mutagénesis en todos los cromosomas del huésped y estrategias de selección para seleccionar células con capacidades de expresión mejoradas. Las células huésped se describen adicionalmente en la presente descripción.
La tecnología de expresión y tamizaje de la presentación en la superficie celular (por ejemplo, como se definió anteriormente) puede emplearse para tamizar bibliotecas de anticuerpos desarrollados para candidatos a fabricar.
Los métodos actuales de uso generalizado para crear proteínas alternativas a partir de una molécula inicial son las tecnologías de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos y la mutagénesis por casete, en la que la región específica a optimizar se reemplaza con un oligonucleótido mutagenizado por síntesis. En estos casos, se generan varios sitios mutantes alrededor de ciertos sitios en la secuencia original.
En la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, una secuencia corta se reemplaza con un oligonucleótido mutagenizado por síntesis.
Se han producido genes quiméricos mediante la unión de 2 fragmentos de polinucleótidos con el uso de extremos cohesivos compatibles generados por enzima(s) de restricción, donde cada fragmento se deriva de un anticuerpo progenitor (o parental) independiente. Otro ejemplo es la mutagénesis de la posición de un único codón (es decir, para lograr una sustitución, adición o deleción de codón) en un anticuerpo parental para generar anticuerpos mutagenizados en un único sitio.
Además, se han utilizado sistemas de recombinación específica de sitio in vivo para generar híbridos de genes y recombinación entre genes homólogos pero truncados en un plásmido. También se ha informado de mutagénesis por extensión de superposición y PCR.
Se han usado métodos no aleatorios para lograr un mayor número de mutaciones puntuales y/o quimerizaciones, por ejemplo, se han usado estrategias integrales o exhaustivas para generar todas las especies moleculares dentro de un grupo particular de mutaciones, para atribuir funcionalidad a grupos estructurales específicos en un anticuerpo plantilla (por ejemplo, una sola posición de aminoácido específica o una secuencia compuesta por dos o más posiciones de aminoácidos), y para clasificar y comparar grupos específicos de mutaciones. La patente de Estados Unidos número 7033781 titulada "Ingeniería de células enteras mediante la mutagénesis de una porción sustancial de un genoma inicial, que combina mutaciones y opcionalmente las repite" describe un método para desarrollar un organismo hacia las características deseadas. La patente de Estados Unidos número 6764835 titulada "Mutagénesis por saturación en el desarrollo dirigido" y la patente de Estados Unidos número 6562594 titulada "Reensamblaje por ligación sintética en el desarrollo dirigido" describen métodos de desarrollo y tamizaje exhaustivos de las características deseadas de los anticuerpos. Cualquiera de estos métodos puede usarse en el método descrito en la presente descripción.
Existe una diferencia entre los métodos conocidos anteriormente de "mutagénesis por saturación" y las técnicas de desarrollo "integral" preferidas en la presente descripción. La mutagénesis por saturación se refiere a una técnica de desarrollo en donde se hacen todos los cambios posibles en cada posición de un anticuerpo plantilla; sin embargo, el cambio en cada posición no se confirma mediante pruebas, sino que simplemente se asume estadísticamente. El desarrollo integral se refiere a una técnica de desarrollo en donde se hacen todos los cambios posibles en cada posición de un anticuerpo plantilla y los anticuerpos mutantes se analizan para confirmar que se ha hecho el cambio previsto.
Los métodos de saturación son métodos intrínsecamente estadísticos, no integrales y nunca fueron realmente integrales en todas las etapas (por ejemplo, en la generación de mutantes, la identificación de mutantes, la expresión de proteínas mutantes, el tamizaje de proteínas mutantes y la generación, identificación, expresión y tamizaje de mutantes mejorados recombinados). En las técnicas de desarrollo integral, cada molécula se tamiza y confirma en la primera etapa de mutagénesis y además en la segunda etapa de recombinación de los mutantes mejorados o éxitos.
A menos que la mutagénesis por saturación se confirme por secuenciación o algún otro método, la técnica no puede considerarse integral por varias razones posibles. Por ejemplo, 1) los sistemas de clonación no son 100 % eficientes debido a errores de clonación o síntesis, o a moléculas difíciles de clonar o 2) algunas proteínas son tóxicas cuando se expresan y, por lo tanto, no pueden expresarse de manera eficiente. Por lo tanto, es importante confirmar por secuenciación, o alguna otra técnica, en cada etapa. Es útil calificar cada etapa para tamizar la expresión, por lo que los clones que no se expresan no se designan como "negativos" como en trabajos anteriores, simplemente se califican como no expresables. Por lo tanto, se considera que las técnicas integrales son un sistema no estocástico más puro que las técnicas de saturación, como lo confirma la etapa de "confirmación".
Se han desarrollado muchos fármacos, tratamientos y curas con el uso de modelos animales para pruebas preclínicas. Los modelos animales son animales vivos, no humanos, usados durante la investigación de enfermedades humanas. Los modelos animales comunes para las pruebas farmacológicas incluyen especies tales como ratas, ratones, conejos, hámsteres, cobayas, monos, perros, gatos, primates no humanos y otras especies. Los organismos reguladores, tales como la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (FDA), revisan los resultados de las pruebas farmacológicas para garantizar que los fármacos sean inocuos y eficaces. Antes de analizar los fármacos en seres humanos, los organismos reguladores requieren habitualmente la prueba de los fármacos en modelos animales para demostrar la inocuidad y preferentemente la eficacia de los fármacos en los modelos animales. Cuando los fármacos son anticuerpos humanos, a veces se vuelve un desafío analizar los anticuerpos humanos en modelos animales porque los anticuerpos humanos no son funcionales o no son tan inocuos y/o eficaces en los modelos animales. Por consiguiente, los organismos reguladores pueden exigir un gran número de estudios en animales, lo que podría evitarse si se dispusiera fácilmente de un modelo animal adecuado en el que los fármacos funcionen de manera similar a la función en seres humanos.
Por lo tanto, existe la necesidad de generar anticuerpos como fármacos que sean inocuos y eficaces en seres humanos y que también funcionen de manera similar o igual en sistemas de modelos animales, tales como rata, ratón, conejo, hámster, cobaya, mono, perro, gato, primates no humanos y otros no humanos, para la evaluación de los fármacos en sistemas de modelos animales. En un aspecto de la presente descripción, los métodos descritos en la presente descripción se usan para el desarrollo interespecies, para generar anticuerpos que funcionan en seres humanos que también sean activos en un modelo animal.
El fármaco basado en polipéptido actúa sobre una diana en el cuerpo humano. La diana en el ser humano, usualmente una proteína humana es un antígeno, a menudo tiene uno o más ortólogos en modelos animales.
Muchas proteínas humanas tienen ortólogos que existen en otras especies. Por ejemplo, -40 % de los genes de levadura codifican proteínas con un equivalente humano o que tienen una función similar en seres humanos. Las proteínas pueden conservar su función durante la evolución, muchas de ellas con secuencias de aminoácidos o dominios funcionales conservados. Se han reconocido y analizado genes ortólogos ("From Mouse to Human: Evolutionary Genomics Analysis of Human Orthologs of Essential Genes ", Benjamin Georgi, y otros, publicado el 09 de mayo de 2013, Doi: 10.1371/journal.pgen.1003484).
Por otro lado, existen numerosos genes ortólogos que, aunque exhiben cierta semejanza entre diferentes especies, sus funciones han discrepado en diferentes especies. Li y otros ("When orthologs diverge between human and mouse ", Brief Bioinform., vol., 12, páginas 436-441, 2011) documentan muchas diferencias entre los ortólogos de seres humanos y de ratón. Por ejemplo, más de 20 % de los genes humanos son esenciales para la supervivencia humana, mientras que sus ortólogos de ratón no son esenciales para la supervivencia del ratón. Una de las principales preocupaciones en la industria farmacéutica es que un modelo animal no refleja realmente el sistema en seres humanos debido a la discrepancia de algunos de los genes ortólogos. Por lo tanto, puede encontrarse que un candidato farmacológico, tal como un anticuerpo que es eficaz y/o inocuo en un modelo animal, después no es eficaz o es tóxico en seres humanos. Lo contrario también es cierto, que un candidato farmacológico, tal como un anticuerpo que se desarrolla con el uso de un sistema humano, no puede analizarse en un modelo animal debido a esta discrepancia.
En un aspecto, los métodos descritos en la presente descripción se usan para generar anticuerpos interespecies para tener en cuenta la discrepancia funcional de la diana entre especies diferentes, de manera que los anticuerpos interespecies exhiban funciones iguales o similares entre especies en relación con las dianas ortólogas, incluso si puede haberse producido discrepancia de las funciones de los ortólogos entre estas especies.
En un aspecto particular, los métodos descritos en la presente descripción se usan en el desarrollo de anticuerpos interespecies. Se contempla que los métodos de la presente descripción pueden usarse en cualquier ortólogo para generar anticuerpos interespecies útiles como fármacos.
Además, de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción, los anticuerpos con características optimizadas, tales como una mayor afinidad, actividad, estabilidad, expresión u otras características convenientes pueden generarse simultáneamente con anticuerpos interespecies.
Desarrollo posicional integral
Con referencia a la Figura 1, con el uso de un fragmento peptídico lineal como un ejemplo simple, en una primera etapa, se genera un conjunto de variantes de aminoácidos de origen natural (o un subconjunto de los mismos, o derivados de aminoácidos) para cada codón desde la posición 1 a n (n que corresponde al número de residuos en la cadena polipeptídica) mediante un proceso denominado en la presente descripción desarrollo posicional integral (CPE™). Este procedimiento se repite para cada fragmento peptídico del anticuerpo plantilla. Un conjunto mínimo de mutaciones de aminoácidos contiene solamente un codón para cada uno de los 19 aminoácidos naturales. Sin embargo, se reconoce que cada sistema de expresión puede experimentar sesgo de codones, en la cual los grupos de ARNt insuficientes pueden conducir al estancamiento de la traducción, terminación prematura de la traducción, desplazamiento de marcos de traducción e incorporación de aminoácidos incorrectos. Por lo tanto, para la optimización de la expresión, cada conjunto contiene hasta 63 codones diferentes, que incluyen los codones de parada. En la siguiente etapa, las mutaciones se confirman mediante la secuenciación de cada molécula nueva. También pueden emplearse otros métodos de confirmación.
Después, cada conjunto de aminoácidos se tamiza para detectar al menos uno de:
- Función mejorada
- Mutaciones neutras
- Mutaciones inhibitorias
- Expresión
- Compatibilidad del clon con el sistema hospedero.
En un aspecto, se tamizan múltiples características simultáneamente, tales como, por ejemplo, función y expresión mejoradas.
Los datos para cada conjunto se combinan para el anticuerpo plantilla completo y se genera un mapa funcional detallado (denominado en la presente descripción EvoMap™) del anticuerpo plantilla. Este mapa contiene información detallada sobre cómo cada mutación afecta el rendimiento/expresión y/o la capacidad de clonación del anticuerpo plantilla. Permite la identificación de todos los sitios donde no pueden hacerse cambios sin una pérdida en la función de la proteína (tal como la unión al antígeno en el caso de los anticuerpos). También muestra dónde pueden hacerse cambios sin afectar la función. El mapa identifica además los cambios que producen anticuerpos mutantes que no se expresan en el sistema hospedero y, por lo tanto, no evalúan el efecto de la mutación.
En la Figura 1 se muestra un esquema de un EvoMap™ hipotético. Cada posición en las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo plantilla se identifica como un sitio restringido (no mutable), un sitio completamente mutable, un sitio parcialmente mutable o un mutante mejorado para una sustitución de aminoácido específica. Cada sitio parcialmente mutable puede designarse además como susceptible a la sustitución con, por ejemplo, un residuo cargado, o una sustitución con residuo no polar, y un clon y/o molécula que no se expresa que no puede clonarse en el sistema hospedero.
Es posible utilizar el EvoMap™ para reconocer y recombinar sustituciones beneficiosas de un solo aminoácido, y tamizar para optimizar aún más las características deseadas en la molécula diana. Sin embargo, el desarrollo de ciertas características puede requerir dos o más mutaciones simultáneas para ser observables. El EvoMap™ puede explotarse para producir de manera eficiente y rentable un conjunto de anticuerpos mutantes en múltiples sitios de manera no aleatoria. El conjunto de anticuerpos mutantes en múltiples sitios puede tamizarse después para detectar mutantes en múltiples sitios mejorados.
El CPE hace posible el mapa completo de mutaciones de proteínas confirmadas in vivo. La identificación de todo el conjunto de mutantes mejorados hace posibles etapas de desarrollo combinatorio adicionales. El CPE puede utilizarse para reducir el riesgo de inmunogenicidad de los anticuerpos desarrollados mediante la selección de mutaciones no superficiales; la eliminación de epítopos de células T; y la imitación de mutaciones somáticas. En un aspecto, el CPE puede usarse para generar una biblioteca de hasta 5, 10 o 15 aminoácidos, o hasta los 19 aminoácidos. Se hacen cambios en cada posición en las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo plantilla y se tamiza para detectar una característica conveniente, tal como la afinidad de unión o la expresión, y se crea el Evomap™. Las rondas posteriores de mutación y tamizaje pueden usarse para generar los datos para los 19 aminoácidos. A partir del mapa, se identifican los sitios completamente mutables. Estos sitios son útiles para identificar las posiciones que pueden modificarse para crear una nueva colección de moléculas que pueden prepararse y analizarse para nuevas características. Por ejemplo, puede emplearse la informática para identificar los haplotipos de HLA en la secuencia, y pueden hacerse los cambios deseados para evitar estos haplotipos al hacer cambios dirigidos específicos en sitios "neutros" ("completamente mutables") identificados en el mapa, donde la característica principal no se afectará. Esto podría reducir potencialmente el riesgo de inmunogenicidad (se podrían seleccionar mutaciones no superficiales, eliminar epítopos de células T, imitar mutaciones hipersomáticas). Además, el mapa puede mostrar sitios para modificaciones específicas del sitio (glicosilación y conjugación química) para mejorar diversas características. Además, la optimización de mutaciones silentes puede mejorar la expresión de proteínas en una variedad de huéspedes.
Desarrollo interespecies
En un aspecto, el desarrollo interespecies se realiza para producir anticuerpos interespecies.
En un aspecto preferido, el CPE se realiza en un ADN que codifica un anticuerpo plantilla que ha demostrado mostrar actividad, por ejemplo, actividad de unión contra uno o más antígenos de una sola especie, preferentemente un ser humano, para producir una biblioteca de CPE que codifica anticuerpos mutantes de CPE. Después, los anticuerpos mutantes de CPE se expresan y se tamizan con el uso de ensayos tales como ensayos de unión con ortólogos del uno o más antígenos de otra especie para identificar los anticuerpos mutantes de CPE expresados que son activos contra, por ejemplo, se unen a, los ortólogos, preferentemente ortólogos no humanos, para producir anticuerpos mutantes de CPE seleccionados que son activos contra los ortólogos. Se realizan ensayos adicionales para identificar una subpoblación de los anticuerpos mutantes de CPE seleccionados que retienen simultáneamente su actividad hacia uno o más antígenos de la especie original, para producir un anticuerpo mutante interespecies que muestra actividad hacia uno o más antígenos de la especie original y sus ortólogos en la otra especie.
Desarrollo de sinergia
En una modalidad de la presente invención, se genera un EvoMap™ y se utiliza para el desarrollo de sinergia, como se muestra en la Figura 2. En el desarrollo de sinergia, la mutación simultánea en 2-20 sitios seleccionados puede combinarse para producir un efecto combinatorio. El EvoMap™ del anticuerpo plantilla se usa para seleccionar mutaciones puntuales específicas de un solo aminoácido para el ensamblaje de mutaciones de anticuerpos en múltiples sitios.
En el desarrollo de sinergia, las mutaciones puntuales de aminoácidos no desactivantes se seleccionan dentro de los sitios parcialmente mutables que están cerca de sitios no mutables en el EvoMap™. En un aspecto, las mutaciones puntuales no desactivantes seleccionadas son adyacentes a sitios no mutables. En el desarrollo de sinergia, la mutación simultánea de aminoácidos en dos a 20 de los sitios seleccionados se realiza para obtener efectos combinatorios. En un aspecto, la recombinación de dos a 20 mutaciones seleccionadas se usa para producir una biblioteca de variantes de codones que codifican una población de anticuerpos mutantes en múltiples sitios. En un aspecto, las mutaciones se confirman mediante la secuenciación de cada molécula nueva. También pueden emplearse otros métodos de confirmación.
Después de la clonación y la expresión, los anticuerpos mutantes en múltiples sitios producidos se tamizan para detectar al menos una propiedad, característica o actividad predeterminada en comparación con el anticuerpo plantilla. De esta manera, se pueden identificar anticuerpos mutantes mejorados en múltiples sitios. En un aspecto, los anticuerpos mutantes en múltiples sitios se producen mediante síntesis combinatoria de proteínas. Una ventaja del desarrollo de sinergia es que no requiere una estructura cristalina de rayos X de proteínas para dirigir el desarrollo del anticuerpo plantilla. Esta técnica es útil particularmente para proteínas con alta variación de ensayo y otros efectos de múltiples sitios.
De acuerdo con la presente invención, las aplicaciones del desarrollo de sinergia incluyen, pero no se limitan a, el desarrollo de cambios mecanicistas moleculares complejos, desarrollo de proteínas con alta variación de ensayo, desarrollo de especificidad de proteínas, mejora de la expresión en diversos huéspedes de expresión, mejora de la estabilidad de la proteína, y optimización del pH. El desarrollo de sinergia es aplicable a anticuerpos terapéuticos.
En un aspecto de la presente invención, el desarrollo de sinergia puede usarse para optimizar uno o más aspectos de una CDR del anticuerpo plantilla. En este aspecto, el desarrollo de sinergia puede usarse junto con técnicas de humanización de anticuerpos. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón puede seleccionarse para su desarrollo y humanización. Las regiones CDR del anticuerpo se clonan y se secuencian y las regiones CDR individuales (CDR1, CDR2, CDR3) pueden sintetizarse y ligarse a otros nucleótidos que codifican polipéptidos del marco de anticuerpos humanos, seguido de la producción de una biblioteca de variantes de IgG humana. Después, la biblioteca de variantes de IgG humana se tamiza para detectar al menos una propiedad en comparación con el AcM de ratón. En otro aspecto, un polipéptido del marco es un polipéptido de andamio artificial. Las técnicas específicas de preparación de fragmentos de ADNbc, ligación y ensamblaje de ácidos nucleicos, clonación, transfección, expresión, síntesis en fase sólida de bibliotecas, síntesis en fase de solución de bibliotecas, desarrollo posicional integral, síntesis combinatoria de proteínas, cuantificación de la expresión por cuantificación con ELISA y ensayo de p-galactosidasa y ELISA funcional se presentan en la sección de ejemplos.
En otra modalidad de la invención, el desarrollo de sinergia puede usarse para mejorar la afinidad de unión de un anticuerpo plantilla. En esta modalidad, se puede realizar la optimización de la región variable del anticuerpo. Por ejemplo, para la producción de mutantes de anticuerpos, se realiza CPE para las CDR en las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo seleccionado y se genera un EvoMap™. Los mutantes se seleccionan para el reensamblaje; por ejemplo, se seleccionan variantes de la cadena ligera y se seleccionan variantes de la cadena pesada para el ensamblaje. Las mutaciones puntuales de aminoácidos no desactivantes se seleccionan dentro de sitios parcialmente mutables que están cerca de sitios no mutables. La tecnología de reensamblaje que utiliza CPS puede usarse para crear una biblioteca de cadenas pesadas. Las variantes de la cadena ligera pueden combinarse con las variantes de la cadena pesada, clonarse, expresarse y las variantes se tamizan como IgG completas a partir de sobrenadantes de líneas de células de mamíferos. La afinidad de unión para ciertas variantes se evalúa, por ejemplo, mediante el uso de ensayos de instrumentación ELISA, BIAcore y/o Sapidyne, u otras técnicas conocidas por un experto en la técnica.
Desarrollo Flex
En otra modalidad, el CPE/EvoMap puede usarse para identificar y explotar sitios completamente mutables. En un aspecto, la explotación de múltiples sitios completamente mutables se denomina desarrollo Flex y se usa para hacer cambios dirigidos tales como la introducción de sitios para la glicosilación (por ejemplo, codones para aminoácidos para la glicosilación por enlace a N u O; Asn dentro de la secuencia consenso Asn-Aa-Ser-Thr o Ser/Thr) y conjugación química. El desarrollo Flex también puede usarse en el diseño de sitios de escisión de proteasas, la introducción de etiquetas secuenciales para purificación y/o detección, el etiquetado específico del sitio y similares. Además, la optimización de codones de mutaciones silentes puede utilizarse para mejorar la expresión de proteínas. En esta modalidad, denominada desarrollo Flex, después de la expresión de proteínas, las bibliotecas de polipéptidos mutantes producidas se vuelven a tamizar para detectar al menos una propiedad, característica o actividad predeterminada en comparación con el anticuerpo plantilla. En un aspecto, la propiedad predeterminada incluye la reducción de la agregación proteína-proteína, la mejora de la estabilidad de la proteína o el aumento de la solubilidad de la proteína. En otro aspecto, puede usarse cualquier sistema de expresión que glicosile para la introducción de sitios de glicosilación, tales como, por ejemplo, líneas de células de mamíferos, plantas, levaduras e insectos.
En el desarrollo Flex, la evaluación de la bioinformática y las estructuras cristalinas de rayos X de proteínas de proteínas relacionadas, o del anticuerpo plantilla, es útil para la optimización de la plantilla. En un aspecto, los sitios seleccionados no están en residuos de contacto. En otro aspecto, la selección de mutaciones no superficiales de las proteínas permite la reducción del riesgo de inmunogenicidad.
Las aplicaciones del desarrollo Flex incluyen, pero no se limitan a, la reducción de la agregación proteína-proteína, la mejora de la solubilidad de la proteína, la optimización de la farmacocinética mediante bibliotecas de glicosilación, la optimización de la estructura secundaria y terciaria de la proteína y la desinmunización de sitios antigénicos directamente mediante conjuntos de mutaciones o indirectamente a través de enmascaramiento por glicosilación.
En un aspecto del desarrollo Flex, se utiliza un EvoMap™ para identificar los sitios completamente mutables, la generación de CPS se realiza con la inserción de residuos de glicosilación en sitios completamente mutables (o mutaciones silentes para efectos de la traducción), y el tamizaje de la biblioteca glicosilada combinatoria se realiza por análisis analítico (por ejemplo, análisis de espectroscopía de masas, dispersión dinámica de la luz), reducción de la inmunogenicidad (por bioinformática o ensayo) y/o análisis farmacocinético (por ejemplo, en ratones Foxn1nu).
En un aspecto, el desarrollo Flex puede usarse para la desinmunización para eliminar la inmunogenicidad mientras se mantiene la función. La desinmunización por desarrollo Flex puede realizarse mediante el enmascaramiento de la inmunogenicidad con glicosilación, la identificación de las sustituciones de aminoácidos del espectro de mutaciones hipersomáticas humanas que pueden eliminar la inmunogenicidad mientras se mantiene la función, la reducción de la dosis para evadir el potencial de inmunogenicidad y la minimización de los cambios de residuos de aminoácidos no superficiales. Además, pueden usarse bases de datos y algoritmos de inmunogenicidad para identificar y reemplazar los epítopos de unión a MHC potenciales. En un aspecto, la predicción de modificaciones in silico se acopla con CPE o CPE combinado con datos de CPS para generar variantes. En un aspecto, las mutaciones se confirman mediante la secuenciación de cada molécula nueva. También pueden emplearse otros métodos de confirmación.
La tendencia reducida a generar epítopos de células T y/o desinmunización puede medirse mediante técnicas conocidas en la técnica. Preferentemente, la desinmunización de proteínas puede analizarse in vitro mediante un ensayo de proliferación de células T. En este ensayo, las PBMC de donantes que representan > 80 % de los alelos de HLA-DR en el mundo se tamizan para detectar la proliferación en respuesta a péptidos de tipo silvestre o desinmunizados. Idealmente, la proliferación celular solo se detecta al cargar las células presentadoras de antígeno con péptidos de tipo silvestre. Los ensayos adicionales para la desinmunización incluyen ensayos de reestimulación de PBMC humanas in vitro (por ejemplo, ELISA de interferón gamma (TH1) o IL4 (TH2). Alternativamente, se puede analizar la desinmunización mediante la expresión de tetrámeros de HLA-DR que representan todos los haplotipos. Para analizar si los péptidos desinmunizados se presentan en haplotipos de HLA-DR, puede medirse la unión de, por ejemplo, péptidos etiquetados con fluorescencia en PBMC. La medición en ratones transgénicos para HLA Clase I y Clase II de respuestas al antígeno diana (por ejemplo, interferón gamma o IL4). Alternativamente, el tamizaje de bibliotecas de epítopos con células T educadas (MHCI 9 mer; MHCII 20 mer) de PBMC y/o ensayos en ratones transgénicos. Además, la desinmunización puede demostrarse al determinar si se han generado anticuerpos contra las moléculas desinmunizadas.
En otra modalidad, las técnicas de desarrollo Flex pueden utilizarse para la optimización de la expresión. En un aspecto, la presente descripción describe la utilización de métodos de ingeniería de proteínas para desarrollar variantes de Fc con codones optimizados por mutación silente con expresión mejorada en células de mamífero. Una mutación silente es aquella en la que la variación de la secuencia de ADN no produce un cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína. En un aspecto, la mutagénesis de codones se realiza en la región constante para la optimización de la expresión en células de mamífero. Una variante de Fc con codones optimizados con propiedades de expresión mejorada mientras retiene la capacidad de mediar las funciones efectoras mejora la producción de anticuerpos terapéuticos. En este aspecto, por ejemplo, puede desarrollarse una región constante de una molécula de anticuerpo para el tamizaje en diferentes huéspedes de expresión, por ejemplo, el tamizaje de la expresión en líneas de células de mamíferos utilizando CHO, HEK293 y COS-7. En la Figura 3 se muestra un ejemplo de optimización de la expresión mediante mutagénesis de codones en la región constante para la expresión en células de mamífero. Cada uno de los niveles de expresión mostrados es un promedio de 4 puntos de datos, y se confirman en múltiples experimentos. Se demostró la capacidad de múltiples líneas de células para el primer mutante analizado en los sistemas de expresión en líneas de células HEK293 y CHO.
Además, el EvoMap™ puede usarse para generar modelos moleculares computacionales tridimensionales del anticuerpo plantilla, o regiones específicas del mismo, para explorar los mecanismos estructurales involucrados, por ejemplo, en la especificidad y estabilidad entre epítopo y anticuerpo. En la Figura 9 se muestra un EvoMap™ tridimensional hipotético.
La información en el EvoMap también puede combinarse con información estructural (si está disponible) para seleccionar, por ejemplo, solo los residuos superficiales para las mutaciones para aumentar la solubilidad/disminuir la agregación.
Síntesis combinatoria de proteínas
La síntesis combinatoria de proteínas (CPS™) involucra la combinación de éxitos individuales de CPE o cualquier otra técnica de desarrollo para sintetizar anticuerpos con mutaciones combinadas que después se tamizan para detectar características optimizadas de genes y proteínas. Usualmente, los mutantes mejorados o las mutaciones neutras de otras técnicas de desarrollo se combinan en CPS. En la Figura 8 se muestra un esquema de CPS. La CPS integral se refiere a tomar todos los mutantes mejorados teóricos seleccionados y generar todas las combinaciones y secuenciarlas antes del tamizaje de la actividad/expresión para garantizar que los clones existan en el conjunto y determinar si pueden expresarse en el sistema. Esencialmente, en cada mutante habrá mutantes que expresen niveles insuficientes para la detección de la actividad y estos deben calificarse por síntesis y tamizaje integral de proteínas, es decir, el proceso CPS.
En una modalidad, al CPE le sigue la CPS para crear mutantes, que se tamizan para detectar la propiedad deseada. En un aspecto, se puede ahorrar tiempo y recursos en el proceso de CPE cambiando 2 o 3 o 4 aa a la vez en lugar de uno a la vez; entonces, por tanto, si el número de aa en la proteína es N, el número total generado y tamizado para 2 aa a la vez sería (202) x 1^N ; 3 a la vez sería (203) x ^N , etcétera. Por ejemplo, en un aspecto específico (en el ejemplo de 2 aa): el 1er aa en la 1ra posición se combina con los 20 en la 2da posición y todos los otros aa permanecen iguales, después el 2do aa en la 1ra posición se combina con los 20 en la 2da posición de aa y todos los otros aa permanecen iguales. Toda la población se tamiza para detectar mutantes mejorados y después se realiza la mutación en el segundo conjunto de los siguientes dos aa en la línea. En un aspecto similar, esto puede realizarse para 3 aa a la vez o 4 aa a la vez. En otro aspecto, el proceso de CPE sigue opcionalmente con CPS de mutantes mejorados (que incluyen cualquier subconjunto de los mismos).
En un aspecto adicional, toda la biblioteca de CPE se crea por síntesis (mediante la síntesis de todas las moléculas en máquinas disponibles comercialmente). En el caso de que la máquina de síntesis no pueda crear cadenas lo suficientemente grandes, se sintetizan fragmentos y después se ligan para generar moléculas de longitud completa. Esta biblioteca se tamiza y se sigue con CPS para combinar las mutaciones deseadas. Este es un proceso de dos etapas en donde CPE sigue con CPS, no es una etapa de CPE solamente.
En otro aspecto, se genera y tamiza una biblioteca de CPE, después se sigue con CPS que combina los mutantes mejorados de la siguiente manera: si hay 10 mutantes mejorados, se analiza una sola molécula con los 10 cambios, después se analizan todas las versiones de 9 mutaciones, después 8, 7, 6, 5, etcétera, hasta que uno de los grupos no encuentre una molécula mejorada respecto a ninguna en el grupo anterior. Una vez que se identifica una molécula mejorada, el proceso puede finalizar.
En un aspecto adicional, el CPE se realiza para identificar los mutantes mejorados y las mutaciones neutras para afinidad y expresión, después se realiza CPS con combinaciones de mutantes mejorados y mutaciones neutras, y la biblioteca se vuelve a tamizar para detectar mejoras adicionales en características tales como función, afinidad y/o expresión.
En un aspecto adicional, el CPE se realiza en codones del Fc u otro dominio para cambios de glicosilación.
En un aspecto adicional, se realiza CPE o CPE combinado con CPS de CDR de anticuerpo de roedor, después se tamiza para detectar mutantes mejorados, seguido de humanización.
En un aspecto, el CPE o el CPE combinado con CPS más informática se utiliza para convertir CDR de ratón en CDR humanas y viceversa.
En otro aspecto, el CPE o el CPS combinado con CPS se realiza en cadenas pesadas y cadenas ligeras en un vector de cadena doble para la evaluación de tamizaje para detectar el aumento de sensibilidad.
En un aspecto adicional, se realiza CPE o CPE combinado con CPS y las moléculas se tamizan para seleccionar los cambios alostéricos en una molécula.
En un aspecto, cualquiera de las técnicas de desarrollo de la descripción puede comprender síntesis química de oligonucleótidos. Por ejemplo, Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) puede sintetizar oligonucleótidos de alta fidelidad conocidos como "ULTRAmers™" de hasta 200 bases de longitud y hasta 300 mer, con confirmación de control de calidad utilizando la tecnología ESI-LC-MS.
Se puede usar cualquiera de varias técnicas de tamizaje para evaluar el CPE o el CPE combinado con mutantes de CPS. En un aspecto, el CPE o el CPE combinado con mutantes de CPS puede secretarse y presentarse en huéspedes mamíferos. Alternativamente, el CPE o el CPE combinado con mutantes de CPS puede producirse en E.coli y tamizarse en huéspedes mamíferos. En otro aspecto, el CPE se realiza a partir de 15 aa o 10 aa y se sigue con CPS; después se sigue con el resto de los 19 aa restantes. En otro aspecto, el CPE o el CPE combinado con CPS se utiliza para desarrollar proteínas específicamente con cambios de aminoácidos no superficiales. En un aspecto, el CPE puede utilizarse para el mapeo multidimensional de epítopos. En otro aspecto, el CPE o el CPE combinado con el tamizaje de CPS puede realizarse de manera transitoria en células de mamífero. En un aspecto preferido, se realiza CPE, después se realiza la secuenciación y preparación de una matriz de todos los clones, por ejemplo, en un formato basado en chip o basado en pocilios para la expresión y el tamizaje. En otro aspecto, el CPE o el CPE combinado con CPS se utiliza para desarrollar la coordinación de iones metálicos mediante la selección de concentraciones iónicas variables. En un aspecto adicional, se realiza CPE o CPE combinado con CPS, y las proteínas se expresan y tamizan en condiciones libres de células y en organismos vivos no humanos. En un aspecto adicional, se realiza c Pe o CPE combinado con tamizaje múltiple de CPS para múltiples características de las proteínas como la expresión y la unión. En otro aspecto, el CPE o el CPE combinado con c Ps se realiza en un anticuerpo plantilla involucrado en el transporte cerebral y el cruce de membranas; y los mutantes se tamizan para detectar características mejoradas. En un aspecto, el CPE o el CPE combinado con mutantes de CPS se tamiza para detectar las características higroscópicas de las proteínas. En otro aspecto, el CPE o el CPE combinado con mutantes de CPS se analiza para seleccionar anticuerpos dinámicos. En un aspecto, el CPE o el CPE combinado con tamizaje de CPS se realiza fuera de la condición diana para identificar mutantes dentro de la condición diana y viceversa.
En otra modalidad, cualquiera de los aspectos anteriores de CPE o CPE combinado con CPS se utiliza en combinación con un método seleccionado de desarrollo Flex y desarrollo de sinergia realizado a partir de un anticuerpo plantilla.
El término "plantilla" puede referirse a un anticuerpo de base. Como apreciaría un experto en esta técnica, cualquier anticuerpo plantilla puede usarse en los métodos y composiciones de la presente descripción. Los anticuerpos plantilla que pueden mutarse y desarrollarse de este modo pueden usarse para guiar la síntesis de otro anticuerpo o biblioteca de anticuerpos como se describe en la presente descripción.
En una modalidad, los productos de ADN mutagenizados se usan directamente como plantilla para la síntesis in vitro de los anticuerpos mutantes correspondientes. Debido a la alta eficiencia con la que pueden generarse las sustituciones de 19 aminoácidos en un solo residuo, es posible realizar una mutagénesis integral en numerosos residuos de interés, independientemente o en combinación con otras mutaciones dentro del anticuerpo plantilla. Como se usa en la presente descripción, la mutagénesis por "saturación completa" se define como el reemplazo de un aminoácido dado dentro de una proteína, con los otros 19 aminoácidos de origen natural. Por ejemplo, la mutagénesis por saturación de sitios génicos, que explora de manera sistemática todas las sustituciones de un solo aminoácido posibles mínimamente a lo largo de una secuencia de proteína, se describe en Kretz y otros, Methods in Enzymology, 2004, 388:3-11; Short, patente de Estados Unidos núm. 6,171,820; y Short, patente de Estados Unidos núm.
6,562,594. Sin embargo, estas técnicas de saturación se basan en métodos estadísticos y la mutagénesis por saturación no se confirma mediante secuenciación para garantizar que se hayan hecho todas las mutaciones previstas.
En un aspecto, esta descripción proporciona el uso de cebadores de codones (que contienen una secuencia redundante N,N,G/T) para introducir mutaciones puntuales en un polinucleótido que codifica el anticuerpo plantilla, para generar un conjunto de anticuerpos progenie en los que el rango completo de sustituciones de un solo aminoácido se representa en cada posición de aminoácidos (ver la patente de Estados Unidos núm. 6,171,820; ver además, la patente de Estados Unidos núm. 5,677,149). Los oligos usados están compuestos de manera contigua por una primera secuencia homóloga, una secuencia redundante N,N,G/T, y preferentemente pero no necesariamente una segunda secuencia homóloga. Los productos de traducción de progenie corriente abajo del uso de tales oligos incluyen todos los cambios de aminoácidos posibles en cada sitio de aminoácido en las CDR del anticuerpo plantilla, porque la redundancia de la secuencia N,N,G/T incluye codones para los 20 aminoácidos.
El uso de codones es uno de los factores importantes en la expresión génica de mamíferos. Las frecuencias con las que se usan los diferentes codones varían significativamente entre diferentes huéspedes y entre proteínas expresadas a niveles altos o bajos dentro del mismo organismo. La razón más probable de esta variación es que los codones preferidos se correlacionan con la abundancia de los ARNt afines disponibles dentro de la célula. Es posible que el uso de codones y las concentraciones de ARNt aceptores se hayan desarrollado en paralelo, y que la presión de selección para este desarrollo paralelo sea más pronunciada para genes altamente expresados que para genes expresados a niveles bajos.
En un aspecto, uno de tales oligo redundantes (compuesto por un casete redundante N,N,G/T) se usa para someter cada codón original en las CDR de un anticuerpo plantilla a un rango completo de sustituciones de codones. En otro aspecto, al menos dos casetes redundantes N,N,G/T se usan o no en el mismo oligo, para someter al menos dos codones originales en las CDR del anticuerpo plantilla a un rango completo de sustituciones de codones. Por lo tanto, más de una secuencia N,N,G/T puede estar contenida en un oligo para introducir mutaciones de aminoácidos en más de un sitio. Esta pluralidad de secuencias N,N,G/T puede ser directamente contigua o estar separada por una o más secuencias de nucleótidos adicionales. En otro aspecto, los oligos útiles para introducir adiciones y deleciones pueden usarse solos o en combinación con los codones que contienen una secuencia N,N,G/T, para introducir cualquier combinación o permutación de adiciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona el uso de casetes redundantes que tienen menos redundancia que la secuencia N,N,G/T. Por ejemplo, puede ser conveniente en algunos casos usar (por ejemplo, en un oligo) una secuencia de triplete redundante compuesta por solo un N, donde dicho N puede estar en la primera, segunda o tercera posición del triplete. Cualquier otra base que incluya cualquiera de las combinaciones y permutaciones de la misma puede usarse en las dos posiciones restantes del triplete. Alternativamente, puede ser conveniente en algunos casos usar (por ejemplo, en un oligo) una secuencia de triplete redundante N,N,N.
Sin embargo, se aprecia que el uso de un triplete redundante N,N,G/T como se describe en la presente descripción es ventajoso por varias razones. En un aspecto, esta descripción proporciona un medio para generar de manera sistemática y bastante fácil la sustitución del rango completo de aminoácidos posibles (para un total de 20 aminoácidos) en todas y cada una de las posiciones de aminoácidos en un polipéptido. Por lo tanto, para un polipéptido de 100 aminoácidos, la presente descripción proporciona una manera de generar de manera sistemática y bastante fácil 2000 especies distintas (es decir, 20 aminoácidos posibles por posición X 100 posiciones de aminoácidos). Se aprecia que se proporcionan, a través del uso de un oligo que contiene un triplete redundante N,N,G/T, 32 secuencias individuales que codifican 20 aminoácidos posibles. Por lo tanto, en un recipiente de reacción en el que una secuencia polinucleotídica que codifica el anticuerpo plantilla se somete a mutagénesis por saturación con el uso de dicho oligo, se generan 32 polinucleótidos progenie distintos que codifican 20 anticuerpos mutantes distintos. Por el contrario, el uso de un oligo no redundante en la mutagénesis dirigida al sitio conduce a un solo producto de anticuerpo progenie por recipiente de reacción.
Por lo tanto, en una modalidad preferida, cada recipiente de reacción de mutagénesis por saturación contiene polinucleótidos que codifican al menos 20 anticuerpos mutantes de manera que los 20 aminoácidos estén representados en la posición de un aminoácido específico correspondiente a la posición de codón mutagenizada en el polinucleótido parental. Los anticuerpos mutantes 32 veces redundantes generados a partir de cada recipiente de reacción de mutagénesis por saturación pueden someterse a amplificación clonal (por ejemplo, clonarse en un huésped E. coli adecuado con el uso de un vector de expresión) y someterse a tamizaje de expresión. Cuando se identifica un anticuerpo mutante individual mediante tamizaje que presenta un cambio en la propiedad (en comparación con el polipéptido plantilla), este puede secuenciarse para identificar la sustitución de aminoácido responsable de dicho cambio contenido en el mismo.
Se puede usar cualquier método mutagénico de síntesis química o recombinante para generar la población de anticuerpos mutantes. La práctica de la presente descripción puede emplear, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2da Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis y otros, patente de Estados Unidos núm.: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Cabs eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vol. 154 y 155 (Wu y otros eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
En una modalidad, el anticuerpo plantilla se somete a los métodos descritos en la presente descripción para, por ejemplo, mapear y comprender qué posiciones dentro de la CDR afectan la afinidad de unión o además qué posiciones en el Fc afectan la expresión. Las técnicas para preparar y usar diversos constructos basados en anticuerpos y fragmentos de los mismos se conocen bien en la técnica. Un aspecto importante de la presente descripción es la identificación de los residuos que desempeñan, o es probable que desempeñen, un papel en la interacción de interés (interacción antígeno-anticuerpo). Se puede usar cualquier anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la presente descripción.
En una modalidad, cualquiera de las plataformas de desarrollo CPE y CPS puede utilizarse para generar anticuerpos agonistas, es decir, anticuerpos activadores. Estas tecnologías de desarrollo permiten la generación de anticuerpos agonistas más allá de la activación del tipo de reticulación de proteínas más simple y, en particular, permiten la activación de receptores tales como GPL-1 o 2 que son tradicionalmente activados por péptidos.
En un aspecto, los anticuerpos se seleccionan por FACS o microscopía o equivalente para anticuerpos débilmente activadores con el uso de células con señales fluorescentes que fluorescen cuando se activa el receptor de superficie celular. Posteriormente, las herramientas de desarrollo se usan para mejorar esta activación. Después se utiliza la tecnología CPS para combinar los mutantes mejorados.
En otro aspecto, se selecciona un anticuerpo que se une al sitio de activación del receptor como se determina mediante mapeo de epítopos. Las técnicas de CPE se usan para seleccionar mutantes que provocan la estimulación del receptor como se determina por una lectura intracelular tal como fluorescencia en respuesta a la liberación de iones de calcio u otros ensayos que se conocen bien en la técnica. Después se utiliza la tecnología CPS para combinar los mutantes mejorados.
La especificidad de un anticuerpo está determinada por las regiones determinantes de complementariedad (CDR) dentro de las regiones variables de cadena ligera (VL) y las regiones variables de cadena pesada (VH). El fragmento Fab de un anticuerpo, que constituye aproximadamente un tercio del tamaño de un anticuerpo completo, contiene las regiones variables de cadena pesada y ligera, la región constante de cadena ligera completa y una porción de la región constante de cadena pesada. Las moléculas Fab son estables y se asocian bien debido a la contribución de las secuencias de la región constante. Sin embargo, el rendimiento del Fab funcional expresado en sistemas bacterianos es menor que el del fragmento Fv más pequeño que contiene solo las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras. El fragmento Fv es la porción más pequeña de un anticuerpo que aún retiene un sitio de unión al antígeno funcional. El fragmento Fv tiene las mismas propiedades de unión que el Fab, sin embargo, sin la estabilidad conferida por las regiones constantes, las dos cadenas del Fv pueden disociarse con relativa facilidad en condiciones diluidas.
En un aspecto, las regiones VH y VL pueden fusionarse mediante un enlazador polipeptídico (Huston y otros, 1991) para estabilizar el sitio de unión al antígeno. Este fragmento Fv de un solo polipéptido se conoce como anticuerpo de cadena sencilla (scFv). VH y VL pueden disponerse primero con cualquier dominio. El enlazador une el extremo carboxilo terminal de la primera cadena al extremo amino terminal de la segunda cadena.
Un experto en la técnica reconocerá que los fragmentos Fv o Fab de cadena pesada o ligera, o los anticuerpos de cadena sencilla también pueden usarse con este sistema. Se puede mutagenizar una cadena pesada o ligera seguido de la adición de la cadena complementaria a la solución. Después se permite que las dos cadenas se combinen y formen un fragmento de anticuerpo funcional. La adición de secuencias aleatorias inespecíficas de cadenas ligeras o pesadas permite la producción de un sistema combinatorio para generar una biblioteca de diversos miembros.
Generalmente, se genera un polinucleótido de expresión. Este polinucleótido de expresión contiene: (1) un casete de anticuerpo que consiste en un dominio Vh, un péptido espaciador y un dominio Vl unidos operativamente para codificar un anticuerpo de cadena sencilla, (2) un promotor adecuado para la transcripción in vitro (por ejemplo, promotor T7, promotor SP6 y similares) unido operativamente para garantizar la transcripción in vitro del casete de anticuerpo de cadena sencilla que forma un ARNm que codifica un anticuerpo de cadena sencilla, y (3) una secuencia de terminación de la transcripción adecuada para funcionar en una reacción de transcripción in vitro. Opcionalmente, el polinucleótido de expresión también puede comprender un origen de replicación y/o un marcador de selección. Un ejemplo de un polinucleótido de expresión adecuado es pLM166.
Las secuencias Vh y Vl pueden obtenerse convenientemente a partir de una biblioteca de secuencias Vh y Vl producidas por amplificación por PCR con el uso de cebadores específicos de la familia de genes V o cebadores específicos de genes V (Nicholls y otros, J. Immunol. Meth., 1993, 165: 81; WO93/12227) o se diseñan de acuerdo con métodos estándar conocidos en la técnica basados en la información de secuencia disponible. Típicamente, se aíslan las secuencias Vh y Vl de ratón o humanas. Después, las secuencias Vh y Vl se ligan, usualmente con una secuencia espaciadora intermedia (por ejemplo, que codifica un espaciador peptídico flexible en marco), para formar un casete que codifica un anticuerpo de cadena sencilla. Típicamente, se usa una biblioteca que comprende una pluralidad de secuencias Vh y Vl (a veces también con una pluralidad de especies de péptidos espaciadores representadas), en donde la biblioteca se construye con una o más de las secuencias Vh y Vl mutadas para aumentar la diversidad de secuencias particularmente en residuos de CDR, a veces en residuos del marco. Las secuencias de la región V pueden clonarse convenientemente como ADNc o productos de amplificación por PCR para células que expresan inmunoglobulinas. Por ejemplo, las células de hibridoma, o linfoma, u otra línea de células humanas que sintetiza inmunoglobulina de superficie celular o secretada pueden usarse para el aislamiento de ARN poliA+. El ARN se usa después para la síntesis de ADNc cebado con oligo dT con el uso de la enzima transcriptasa inversa (para métodos generales, ver Goodspeed y otros, Gene 1989, 76: 1; Dunn y otros, J. Biol. Chem., 1989, 264: 13057). Una vez que se aísla el ADNc o el producto de PCR de la región V, este se clona en un vector para formar un casete de anticuerpo de cadena sencilla.
Para lograr la construcción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, los genes codificantes se aíslan e identifican. Los genes pueden modificarse para permitir la clonación en un vector de expresión o una transcripción/traducción in vitro. Aunque pueden usarse métodos tales como exploración del ADN con sondas para VH y VL a partir de ADNc de hibridoma (Maniatis y otros, 1982) o la construcción de un gen sintético para VH y VL (Barbas y otros, 1992), un modo conveniente es usar métodos dirigidos por plantilla para amplificar las secuencias de anticuerpos. Se puede amplificar una población diversa de genes de anticuerpos a partir de una muestra de plantilla mediante el diseño de cebadores para las secuencias conservadas en los extremos 3' y 5' de la región variable conocidas como el marco o para las regiones constantes del anticuerpo (Iverson y otros, 1989). Dentro de los cebadores, se pueden colocar sitios de restricción para facilitar la clonación en un vector de expresión. Al dirigir los cebadores a estas regiones conservadas, se mantiene la diversidad de la población de anticuerpos para permitir la construcción de bibliotecas diversas. La especie y la clase de anticuerpo específicas pueden definirse mediante la selección de las secuencias cebadoras como se ilustra por el gran número de secuencias para todos los tipos de anticuerpos proporcionadas en Kabat y otros, 1987.
El ARN mensajero aislado del bazo o la sangre periférica de un animal puede usarse como plantilla para la amplificación de una biblioteca de anticuerpos. En ciertas circunstancias, donde es conveniente presentar una población homogénea de fragmentos de anticuerpos en la superficie celular, el ARNm puede aislarse a partir de una población de anticuerpos monoclonales. El ARN mensajero de cualquier fuente puede prepararse por métodos estándar y usarse directamente o para la preparación de un ADNc plantilla. La generación de ARNm con fines de clonación de anticuerpos se logra fácilmente siguiendo los procedimientos bien conocidos para la preparación y caracterización de anticuerpos (ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988).
La generación de anticuerpos monoclonales (AcM) sigue generalmente los mismos procedimientos que para la preparación de anticuerpos policlonales. Brevemente, un anticuerpo policlonal se prepara mediante la inmunización de un animal con una composición inmunogénica correspondiente y la recolección de antisueros de ese animal inmunizado. Se puede usar una amplia variedad de especies animales para la producción de antisueros. Típicamente, el animal usado para la producción de antisueros es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, una cobaya o una cabra. Debido al volumen de sangre relativamente grande de los conejos, los conejos usualmente se prefieren para la producción de anticuerpos policlonales.
Las composiciones inmunogénicas a menudo varían en inmunogenicidad. Por lo tanto, a menudo es necesario reforzar el sistema inmunitario del huésped, como puede lograrse mediante el acoplamiento de un péptido o polipéptido inmunógeno a un portador. Los portadores ilustrativos y preferidos son hemocianina de lapa californiana (KLH) y albúmina sérica bovina (BSA). Otras albúminas tales como ovoalbúmina, albúmina sérica de ratón o albúmina sérica de conejo también pueden usarse como portadores. Los medios reconocidos para conjugar un polipéptido con una proteína portadora se conocen bien e incluyen glutaraldehído, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimida, carbodiimidas y bencidina bis-diazotizada.
La inmunogenicidad de una composición de inmunógeno particular puede mejorarse mediante el uso de estimuladores inespecíficos de la respuesta inmunitaria, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes ilustrativos y preferidos incluyen adyuvante completo de Freund (un estimulador inespecífico de la respuesta inmunitaria que contiene Mycobacterium tuberculosis muerta), adyuvantes incompletos de Freund y adyuvante de hidróxido de aluminio.
La cantidad de composición de inmunógeno usada en la producción de anticuerpos policlonales varía según la naturaleza del inmunógeno, así como el animal usado para la inmunización. Se puede usar una variedad de vías para administrar el inmunógeno (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). La producción de anticuerpos policlonales puede monitorizarse por recolección de muestras de sangre del animal inmunizado en diversos puntos después de la inmunización. También puede administrarse una segunda inyección de refuerzo. El proceso de refuerzo y titulación se repite hasta lograr un título adecuado. Cuando se obtiene un nivel de inmunogenicidad deseado, el animal inmunizado puede desangrarse y el suero se aísla, se almacena y el bazo se cosecha para el aislamiento del ARNm de la respuesta policlonal o el animal puede usarse para generar AcM para el aislamiento del ARNm de una población homogénea de anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse fácilmente a través del uso de técnicas bien conocidas, tales como las ejemplificadas en la patente de Estados Unidos núm. 4,196,265. Típicamente, esta técnica involucra la inmunización de un animal adecuado con una composición de inmunógeno seleccionado, por ejemplo, un hapteno de molécula pequeña conjugado con un portador, una proteína, polipéptido o péptido purificado o parcialmente purificado. La composición de inmunización se administra de manera eficaz para estimular las células productoras de anticuerpos. Los roedores tales como ratones y ratas son animales de uso frecuente; sin embargo, también es posible el uso de células de conejo, oveja y rana. El uso de ratas puede proporcionar ciertas ventajas (Goding, páginas 60-61, 1986), pero se prefieren los ratones, particularmente el ratón BALB/c, ya que este se usa más habitualmente y generalmente proporciona un mayor porcentaje de fusiones estables.
Después de la inmunización, las células somáticas con potencial para producir anticuerpos, específicamente linfocitos B (células B), se seleccionan para el uso en el protocolo de generación de AcM. Estas células pueden obtenerse a partir de biopsias de bazos, amígdalas o ganglios linfáticos, o de muestras de sangre. Se prefieren las células esplénicas y las células sanguíneas, las primeras porque son una fuente rica de células productoras de anticuerpos que se encuentran en la etapa de plasmablastos en división y la segunda porque la sangre es de fácil acceso. A menudo, se habrá inmunizado un panel de animales y se extraerá el bazo del animal con el título de anticuerpos más alto y se obtendrán los linfocitos del bazo mediante la homogeneización del bazo con una jeringa. Típicamente, un bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente 5 x 107 a 2 x 108 linfocitos.
Después, los linfocitos B productores de anticuerpos del animal inmunizado se fusionan con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal que se inmunizó. Las líneas de células de mieloma adecuadas para el uso en procedimientos de fusión que producen hibridomas preferentemente no producen anticuerpos, tienen una alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que los hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que soportan solamente el crecimiento de las células fusionadas deseadas (hibridomas).
Se puede usar cualquiera de varias células de mieloma, como conocen los expertos en la técnica (Goding, páginas 65-66, 1986; Campbell, 1984). Por ejemplo, cuando el animal inmunizado es un ratón, puede usarse P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XXO Bul; para ratas, puede usarse R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6 son todos útiles en relación con fusiones de células humanas.
Una célula de mieloma murino preferida es la línea de células de mieloma NS-1 (también denominada P3-NS-1-Ag4-1), que está fácilmente disponible en el Repositorio de células mutantes genéticas humanas del NIGMS solicitando el número de repositorio de la línea de células GM3573. Otra línea de células de mieloma de ratón que puede usarse es la línea de células no productoras SP2/0 de mieloma murino de ratón resistente a la 8-azaguanina.
Los métodos para generar híbridos de células esplénicas o de ganglio linfático productoras de anticuerpos y células de mieloma usualmente comprenden mezclar células somáticas con células de mieloma en una proporción de 2:1, aunque la proporción puede variar de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1, respectivamente, en presencia de un agente o agentes (químicos o eléctricos) que promueven la fusión de membranas celulares. Kohler & Milstein (1975; 1976) han descrito métodos de fusión que usan el virus Sendai, y los que usan polietilenglicol (PEG), tal como PEG al 37 % (v/v), de Gefter y otros, 1977). El uso de métodos de fusión inducida eléctricamente también es apropiado (Goding páginas 71-74, 1986).
Los procedimientos de fusión usualmente producen híbridos viables a bajas frecuencias, aproximadamente 1x10-6 a 1x10-8. Sin embargo, esto no plantea un problema, ya que los híbridos fusionados viables se diferencian de las células parentales no fusionadas (particularmente las células de mieloma no fusionadas que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente) mediante el cultivo en un medio selectivo. El medio selectivo es generalmente uno que contiene un agente que bloquea la síntesis de novo de nucleótidos en los medios de cultivo de tejidos. Los agentes ilustrativos y preferidos son aminopterina, metotrexato y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la síntesis de novo de purinas y pirimidinas, mientras que la azaserina solo bloquea la síntesis de purinas. Cuando se usa aminopterina o metotrexato, el medio se complementa con hipoxantina y timidina como fuente de nucleótidos (medio HAT). Cuando se usa azaserina, el medio se complementa con hipoxantina.
El medio de selección preferido es HAT. Solo las células que pueden operar rutas de recuperación de nucleótidos pueden sobrevivir en medio HAT. Las células de mieloma carecen de enzimas clave de la ruta de recuperación, por ejemplo, hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), y no pueden sobrevivir. Las células B pueden operar esta ruta, pero tienen una vida útil limitada en cultivo y generalmente mueren en aproximadamente dos semanas. Por lo tanto, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son los híbridos formados por el mieloma y las células B.
Este cultivo proporciona una población de hibridomas de los cuales se seleccionan hibridomas específicos. Típicamente, la selección de hibridomas se realiza mediante el cultivo de las células por dilución de clones individuales en placas de microtitulación, seguido de la prueba de detección de la reactividad deseada en los sobrenadantes de los clones individuales (después de aproximadamente dos o tres semanas). Los ensayos simples y rápidos incluyen radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, ensayos de citotoxicidad, ensayos de placa, ensayos de unión inmunológica por puntos y similares.
Los hibridomas seleccionados se diluyen en serie y se clonan en líneas de células individuales productoras de anticuerpos a partir de las cuales los clones pueden propagarse después indefinidamente para proporcionar AcM. Las líneas de células pueden explotarse para la producción de AcM de dos maneras básicas. Se puede inyectar una muestra del hibridoma (a menudo en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se usó para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido de células fusionadas. Los fluidos corporales del animal, tales como suero o líquido ascítico, pueden aprovecharse después para proporcionar AcM en alta concentración. Las líneas de células individuales también podrían cultivarse in vitro, donde los AcM se secretan naturalmente en el medio de cultivo a partir del cual pueden obtenerse fácilmente en altas concentraciones. Los AcM producidos por cualquier medio pueden purificarse después, si se desea, con el uso de filtración, centrifugación y diversos métodos cromatográficos tales como HPLC o cromatografía de afinidad.
Después del aislamiento y caracterización del anticuerpo monoclonal deseado, el ARNm puede aislarse con el uso de técnicas bien conocidas en la técnica y usarse como plantilla para la amplificación de la secuencia diana.
Existen varios procesos dependientes de plantillas disponibles para amplificar las secuencias diana antes y después de la mutagénesis. Uno de los métodos de amplificación más conocidos es la reacción en cadena de la polimerasa (denominada PCR) que se describe en detalle en las patentes de Estados Unidos núm. 4,683,195, 4,683,202 y 4,800,159, y en Innis y otros, 1990. Brevemente, en la PCR, se preparan dos secuencias cebadoras que son complementarias a regiones en cadenas complementarias opuestas de la secuencia diana. Se añade un exceso de desoxinucleósidos trifosfatos a una mezcla de reacción junto con una ADN polimerasa, por ejemplo, Taq polimerasa. Si la secuencia diana está presente en una muestra, los cebadores se unirán a la diana y la polimerasa provocará que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia diana mediante la adición de nucleótidos. Al subir y bajar la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores extendidos se disociarán de la diana para formar productos de reacción, los cebadores en exceso se unirán a la diana y a los productos de reacción y el proceso se repite. Preferentemente, se puede realizar un procedimiento de amplificación por PCR con transcriptasa inversa para cuantificar la cantidad de diana amplificada. Las metodologías de reacción en cadena de la polimerasa se conocen bien en la técnica. Con el uso de técnicas de amplificación por enzimas tales como la PCR, pueden diseñarse elementos de control deseados en el cebador y, por lo tanto, se incorporarán al producto de ADN.
Otro método para la amplificación es la reacción en cadena de la ligasa ("LCR"), descrita en el documento EPA núm.
320 308. En la LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias, y en presencia de la secuencia diana, cada par se unirá a cadenas complementarias opuestas de la diana de manera que colinden. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se unirán para formar una sola unidad. Mediante ciclos de temperatura, como en la PCR, las unidades ligadas unidas se disocian de la diana y después sirven como "secuencias diana" para la ligación de los pares de sondas en exceso. La patente de Estados Unidos núm. 4,883,750 describe un método similar a la LCR para unir pares de sondas a una secuencia diana.
La replicasa Qbeta, descrita en la solicitud PCT núm. PCT/US87/00880, también puede usarse como un método de amplificación. En este método, una secuencia replicativa de ARN que tiene una región complementaria a la de una diana se añade a una muestra en presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia replicativa que puede detectarse después.
Un método de amplificación isotérmica, en el que se usan endonucleasas de restricción y ligasas para lograr la amplificación de moléculas diana que contienen nucleótidos 5'-[alfa-tio]-trifosfatos en una cadena de un sitio de restricción también puede ser útil en la amplificación de ácidos nucleicos (Walker y otros, 1992).
La amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) es otro método para llevar a cabo la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que involucra múltiples rondas de desplazamiento y síntesis de cadena, es decir, desplazamiento de mellas. Un método similar, llamado reacción en cadena de reparación (RCR) involucra el apareamiento de varias sondas en una región diana de amplificación, seguido de una reacción de reparación en la que solo están presentes dos de las cuatro bases. Las otras dos bases pueden añadirse como derivados biotinilados para una fácil detección. Una estrategia similar se usa en SDA. Las secuencias específicas de la diana también pueden detectarse con el uso de una reacción de sonda cíclica (CPR). En la CPR, una sonda que tiene secuencias 3' y 5' de ADN inespecífico y una secuencia media de ARN específico se hibrida con el ADN que está presente en una muestra. Tras la hibridación, la reacción se trata con RNasa H y los productos de la sonda se identifican como productos distintivos que se liberan después de la digestión. La plantilla original se aparea a otra sonda cíclica y la reacción se repite.
Otros métodos de amplificación que se describen en la solicitud GB núm. 2 202 328 y en la solicitud PCT núm. PCT/US89/01025, pueden usarse de acuerdo con la presente descripción. En la primera solicitud, los cebadores "modificados" se usan en una síntesis similar a PCR, dependiente de plantilla y enzima. Los cebadores pueden modificarse mediante su etiquetado con un resto de captura (por ejemplo, biotina) y/o un resto detector (por ejemplo, enzima). En la última solicitud, se añade un exceso de sondas etiquetadas a una muestra. En presencia de la secuencia diana, la sonda se une y se escinde catalíticamente. Después de la escisión, la secuencia diana se libera intacta para unirse con la sonda en exceso. La escisión de la sonda etiquetada señala la presencia de la secuencia diana.
Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen sistemas de amplificación basados en transcripción (TAS), que incluyen la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) y 3SR (Kwoh y otros, 1989). En NASBA, los ácidos nucleicos pueden prepararse para la amplificación mediante extracción estándar con fenol/cloroformo, desnaturalización por calor de una muestra clínica, tratamiento con tampón de lisis y columnas minispin para el aislamiento de ADN y ARN o la extracción de ARN con cloruro de guanidinio. Estas técnicas de amplificación involucran el apareamiento de un cebador que tiene secuencias específicas de la diana. Después de la polimerización, los híbridos ADN/ARN se digieren con RNasa H, mientras que las moléculas de ADN bicatenario se vuelven a desnaturalizar por calor. En cualquier caso, el ADN monocatenario se vuelve completamente bicatenario mediante la adición de un segundo cebador específico de la diana, seguido de polimerización. Las moléculas de ADN bicatenario se transcriben después de forma multiplicada por una polimerasa tal como T7 o SP6. En una reacción cíclica isotérmica, los ARN se someten a transcripción inversa a a Dn bicatenario y se transcriben una vez más con una polimerasa tal como T7 o SP6. Los productos resultantes, ya sean truncados o completos, indican secuencias específicas de la diana.
Davey y otros, documento EPA núm. 329822 describen un proceso de amplificación de ácidos nucleicos que involucra la síntesis cíclica de ARN monocatenario ("ARNmc"), ADNmc y ADN bicatenario (ADNbc), que puede usarse de acuerdo con la presente descripción. El ARNmc es una primera plantilla para un primer oligonucleótido cebador, que se alarga mediante la transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN). Después, el ARN se elimina del dúplex ADN:ARN resultante por la acción de la ribonucleasa H (RNasa H, una RNasa específica para ARN en dúplex con ADN o ARN). El ADNmc resultante es una segunda plantilla para un segundo cebador, que también incluye las secuencias de un promotor de ARN polimerasa (ejemplificado por la ARN polimerasa T7) 5' a su homología con la plantilla. Este cebador se extiende después con la ADN polimerasa (ejemplificada por el gran fragmento "Klenow" de la ADN polimerasa I de E. coli), lo que produce una molécula de ADN bicatenario ("ADNbc"), que tiene una secuencia idéntica a la del ARN original entre los cebadores y que tiene, además, en un extremo, una secuencia promotora. La ARN polimerasa apropiada puede usar esta secuencia promotora para producir muchas copias de ARN del ADN. Después, estas copias pueden volver a ingresar al ciclo, lo que conduce a una amplificación muy rápida. Con la elección adecuada de enzimas, esta amplificación puede hacerse de forma isotérmica sin la adición de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza cíclica de este proceso, la secuencia inicial puede elegirse en forma de ADN o ARN.
Miller y otros, solicitud PCT WO 89/06700 describen un esquema de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos basado en la hibridación de una secuencia promotora/cebadora a un ADN monocatenario ("ADNmc") diana seguido de la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es cíclico, es decir, no se producen nuevas plantillas a partir de los transcritos de ARN resultantes. Otros métodos de amplificación incluyen "race" y "PCR unilateral" (Frohman, 1990; O'Hara y otros, 1989).
Los métodos basados en la ligación de dos (o más) oligonucleótidos en presencia de ácido nucleico que tiene la secuencia del "dioligonucleótido" resultante, que amplifican de este modo el dioligonucleótido, también pueden usarse en la etapa de amplificación (Wu y otros, 1989).
Los productos de amplificación pueden analizarse por electroforesis en gel de agarosa, agarosa-acrilamida o poliacrilamida con el uso de métodos estándar (ver, por ejemplo, Maniatis y otros, 1982). Por ejemplo, se puede usar un gel de agarosa al 1 % teñido con bromuro de etidio y visualizarlo bajo luz UV. Alternativamente, los productos de amplificación pueden etiquetarse integralmente con nucleótidos radioetiquetados o etiquetados con fluorescencia. Los geles pueden exponerse después a una película de rayos X o visualizarse bajo los espectros estimulantes apropiados, respectivamente.
Los procedimientos mutagénicos de la presente descripción pueden comprender cualquier estrategia mutagénica que pueda adaptarse a un sitio particular en un gen, es decir, mutagénesis dirigida al sitio o específica de sitio. Debido a que la presente descripción se basa en mutagénesis integral, la presente descripción contempla como modalidades preferidas aquellos procedimientos mutagénicos que son rápidos, eficientes y rentables.
En una modalidad, el procedimiento mutagénico utiliza técnicas de síntesis química. Al hacerlo, es posible colocar exactamente la sustitución en una o más ubicaciones particulares dentro del gen, y también definir específicamente la naturaleza de las alteraciones. Los métodos de síntesis química para ADN se conocen bien en la técnica. En este sentido, se prefieren las técnicas en fase sólida.
Una ventaja del método de síntesis de genes en fase sólida es la oportunidad de mutagénesis con el uso de técnicas de síntesis combinatoria. Las técnicas de síntesis combinatoria se definen como aquellas técnicas que producen simultáneamente grandes colecciones o bibliotecas de compuestos, mediante la unión secuencial de diferentes componentes básicos. Las bibliotecas pueden construirse con el uso de compuestos libres en solución, pero preferentemente el compuesto se une a un soporte sólido, tal como una esfera, partícula sólida o incluso se presenta en la superficie de un microorganismo.
Existen varios métodos de síntesis combinatoria (Holmes y otros, 1995; Burbaum y otros, 1995; Martin y otros, 1995; Freier y otros, 1995; Pei y otros, 1991; Bruce y otros, 1995; Ohlmeyer y otros, 1993), que incluyen la síntesis por división o la síntesis paralela. La síntesis por división puede usarse para producir pequeñas cantidades de un número relativamente grande de compuestos, mientras que la síntesis paralela producirá mayores cantidades de un número relativamente pequeño de compuestos. En términos generales, con el uso de la síntesis por división, los compuestos se sintetizan en la superficie de una micropartícula. En cada etapa, las partículas se dividen en varios grupos para la adición del siguiente componente. Después, los diferentes grupos se recombinan y se dividen para formar nuevos grupos. El proceso se repite hasta que se completa el compuesto. Cada partícula contiene varias copias del mismo compuesto, lo que permite una fácil separación y purificación. La síntesis por división solo puede realizarse con el uso de un soporte sólido.
Una técnica alternativa conocida como síntesis paralela puede realizarse en fase sólida o en solución. Con el uso de la síntesis paralela, se sintetizan diferentes compuestos en receptáculos independientes, a menudo con el uso de automatización. La síntesis paralela puede realizarse en una placa de microtitulación donde pueden añadirse diferentes reactivos a cada pocillo de una manera predefinida para producir una biblioteca combinatoria. La síntesis paralela es la estrategia preferida para el uso con técnicas enzimáticas. Se comprende bien que existen muchas modificaciones de esta técnica y pueden adaptarse para el uso con la presente descripción. Con el uso de métodos combinatorios, se puede sintetizar una gran cantidad de plantillas de genes mutantes.
Con el uso de los cebadores oligonucleotídicos apropiados, la PCR se usa para la síntesis rápida del mutante de ADN que contiene una o más mutaciones en el ADN que codifica el anticuerpo plantilla. La mutagénesis específica del sitio es una técnica útil en la preparación de anticuerpos mutantes, a través de la mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica proporciona además una capacidad fácil de preparar y analizar variantes de secuencia, mediante la incorporación de una o más de las consideraciones anteriores, al introducir uno o más cambios en la secuencia de nucleótidos en el ADN. La mutagénesis específica del sitio permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias de oligonucleótidos específicos que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia cebadora de tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de deleción que se atraviesa. Típicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de longitud, con aproximadamente 5 a 10 residuos en ambos lados de la unión de la secuencia que se altera.
La técnica emplea típicamente un vector bacteriófago que existe tanto en forma monocatenaria como bicatenaria. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos vectores tipo fago están disponibles comercialmente y su uso es generalmente bien conocido por los expertos en la técnica. Los plásmidos bicatenarios también se emplean habitualmente en la mutagénesis dirigida al sitio, lo que elimina la etapa de transferir el gen de interés de un fago a un plásmido.
En general, la mutagénesis dirigida al sitio se realiza primero mediante la obtención de un vector monocatenario o la fusión de dos cadenas de un vector bicatenario que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica la proteína deseada. Se prepara por síntesis un cebador oligonucleotídico portador de la secuencia mutada deseada. Este cebador se aparea después con la preparación de ADN monocatenario, teniendo en cuenta el grado de falta de coincidencia al seleccionar las condiciones de hibridación, y se somete a enzimas de polimerización del ADN, tales como el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la cadena portadora de la mutación. Por lo tanto, se forma un heterodúplex en donde una cadena codifica la secuencia original no mutada y la segunda cadena porta la mutación deseada. Este vector heterodúplex se usa después para transformar células apropiadas, tales como células de E. coli, y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes portadores de la disposición de secuencia mutada.
La preparación de variantes de secuencia del gen seleccionado con el uso de mutagénesis dirigida al sitio se proporciona como un medio para producir especies potencialmente útiles y no pretende ser limitante, ya que existen otras formas en que se pueden obtener variantes de secuencia de genes. Por ejemplo, los vectores recombinantes que codifican el gen deseado pueden tratarse con agentes mutagénicos, tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia.
En ciertas aplicaciones, la sustitución de aminoácidos por mutagénesis dirigida al sitio se aprecia que se requieren condiciones de menor rigurosidad. En estas condiciones, puede producirse hibridación, aunque las secuencias de la sonda y la cadena diana no sean perfectamente complementarias, si no que no coinciden en una o más posiciones. Las condiciones pueden volverse menos rigurosas mediante el aumento de la concentración de sales y la disminución de la temperatura. Por ejemplo, se podría proporcionar una condición de rigurosidad media de aproximadamente 0,1 a 0,25 M de NaCl a temperaturas de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 55 °C, mientras que podría proporcionarse una condición de baja rigurosidad de aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M de sal, a temperaturas que varían de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 55 °C. Por lo tanto, las condiciones de hibridación pueden manipularse fácilmente, y por lo tanto, generalmente será un método de elección en dependencia de los resultados deseados.
En otras modalidades, la hibridación puede lograrse en condiciones de, por ejemplo, Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl23 mM, ditiotreitol 10 mM, a temperaturas entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 37 °C. Otras condiciones de hibridación utilizadas podrían incluir aproximadamente Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 1,5 |j M, a temperaturas que varían de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 72 °C. También puede usarse formamida y SDS para alterar las condiciones de hibridación.
En una modalidad particular, se puede emplear PCR de superposición. Brevemente, se usa un plásmido como plantilla para la primera ronda de PCR. Los productos de PCR de la primera ronda se purifican y se usan, junto con cebadores externos, en la reacción de PCR de extensión superpuesta. Los productos finales contenían el reemplazo dirigido al sitio de un aminoácido dado con todos los demás residuos de aminoácidos posibles.
Los ADN mutagenizados derivados del anticuerpo plantilla de interés pueden clonarse en un plásmido para la transcripción/traducción in vitro o en la modalidad preferida, los elementos de control apropiados se incluyen dentro del producto de PCR para la transcripción/traducción in vitro directa. La transcripción/traducción in vitro de genes usa extractos libres de células para proporcionar las enzimas, los ribosomas y los factores proteicos requeridos. El ARNm sintetizado a partir de las plantillas de ADN deseadas dirige la síntesis de proteínas. La plantilla de ADN debe contener los elementos de control apropiados para el sistema usado, que incluyen un sitio de unión a ribosomas y una secuencia promotora. Un experto en la técnica reconocería claramente los elementos requeridos apropiados para cada sistema.
Las técnicas in vitro para la producción de proteínas en procariotas fueron las primeras en usarse (Zubay y otros, 1970). Posteriormente, se desarrollaron sistemas eucariotas con el uso de germen de trigo (Roberts, 1973) y reticulocitos de conejo (Pelham, 1976). Varios avances nuevos han aumentado la eficiencia de estas técnicas. Los ejemplos incluyen el desarrollo de cepas de E. coli con deficiencia de nucleasas para mejorar los resultados con el uso de plantillas de ADN lineales (Yang, 1980) y el tratamiento de lisados de reticulocitos con nucleasa microcóccica para disminuir cualquier expresión de fondo del sistema.
Los sistemas más recientes desarrollados para la transcripción/traducción in vitro se basan en la transcripción por ARN polimerasas de fago que incluyen SP6 y SP7 (Krieg, 1987, Studier, 1990). El ADN colocado bajo el control de elementos promotores de T7 puede usarse como plantilla para la transcripción in vitro por la ARN polimerasa de T7 o para la transcripción/traducción in vitro completa con adición de la polimerasa a un sistema de síntesis de proteínas procariota o eucariota. Si bien los métodos de la presente descripción pueden usarse con cualquier sistema de transcripción/traducción in vitro, se prefiere el sistema de T7 para la transcripción y se prefiere el uso de un sistema de traducción procariota ya que no se requiere la adición de caperuza al ARN.
G. Caracterización
Los anticuerpos mutantes generados por la presente descripción pueden caracterizarse con el uso de una variedad de técnicas. En general, los anticuerpos mutantes pueden analizarse para determinar el peso molecular aparente correcto con el uso de SDS-PAGE. Esto proporciona una indicación inicial de que el anticuerpo mutante, de hecho, se sintetizó. Cuando se compara con el anticuerpo plantilla, también indica si tiene lugar un plegamiento o procesamiento normal con el mutante. En este sentido, puede resultar útil etiquetar el anticuerpo mutante. Alternativamente, el anticuerpo mutante puede identificarse por tinción del gel.
Más allá de la mera síntesis, los anticuerpos pueden caracterizarse de acuerdo con diversas propiedades y un rango amplio de funciones. Las propiedades incluyen punto isoeléctrico, estabilidad térmica, velocidad de sedimentación y plegamiento. Una manera de examinar el plegamiento es la capacidad de ser reconocido por una pareja de unión afín. El principal ejemplo de esta función es la interacción anticuerpo-antígeno. Una amplia variedad de formatos de inmunoensayo diferentes está disponible con este fin y se conocen bien en la técnica. Principalmente, los cambios en la afinidad o especificidad pueden determinarse cuando el anticuerpo se pone en contacto con un antígeno específico o paneles de antígenos relacionados.
Generalmente, los inmunoensayos pueden dividirse en dos tipos: ensayos heterogéneos que requieren múltiples etapas de separación y ensayos homogéneos que se realizan directamente. Los inmunoensayos heterogéneos en general involucran un antígeno o un anticuerpo inmovilizado en una matriz sólida. Una muestra que contiene un antígeno se pone en contacto con el anticuerpo inmovilizado y la cantidad de complejo formado en el soporte de la matriz se determina a partir de una etiqueta unida directa o indirectamente al complejo inmovilizado. Como se usa en el contexto de la presente descripción, un antígeno se define como una especie que interactúa con un anticuerpo para formar un complejo estable y fuertemente unido. Con fines prácticos, la afinidad de unión es usualmente mayor que aproximadamente 106 M-1 y está preferentemente en el rango de 109 -1015 M-1. El antígeno puede ser cualquiera de varios tipos de moléculas orgánicas, que incluyen hidrocarburos alicíclicos, compuestos aromáticos polinucleares, compuestos halogenados, bencenoides, hidrocarburos polinucleares, heterociclos de nitrógeno, heterociclos de azufre, heterociclos de oxígeno e hidrocarburos alcanos, alquenos, alquinos, etcétera. Las moléculas biológicas son de particular interés, que incluyen aminoácidos, péptidos, proteínas, lípidos, sacáridos, ácidos nucleicos y combinaciones de los mismos. Por supuesto, se comprenderá que estos son solo a modo de ejemplo y que los métodos de inmunoensayo contemplados son aplicables para detectar una variedad extraordinariamente amplia de compuestos, siempre que pueda obtenerse un anticuerpo que se una al antígeno de interés.
Se pueden realizar inmunoensayos heterogéneos como los ensayos tipo sándwich en los que una molécula de interés reacciona con un anticuerpo inmovilizado que se une específicamente a esa molécula con alta afinidad. En una segunda etapa, un conjugado formado a partir del mismo anticuerpo o uno diferente contra el antígeno y una molécula marcadora reacciona con el complejo antígeno-anticuerpo en la matriz de inmovilización. Después de eliminar el exceso de conjugado marcador libre, se mide el conjugado marcador unido, que es proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra.
La detección de la formación de inmunocomplejos se conoce bien en la técnica y puede lograrse a través de la aplicación de numerosas estrategias. Estas estrategias se basan típicamente en la detección de una etiqueta o marcador, tal como cualquiera de las etiquetas secuenciales o etiquetas radioactivas, fluorescentes, quimioluminiscentes, electroquimioluminiscentes, biológicas o enzimáticas conocidas en la técnica. Las patentes de Estados Unidos sobre el uso de tales etiquetas incluyen las patentes de Estados Unidos núm. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,366,241. Por supuesto, se pueden encontrar ventajas adicionales a través del uso de un segundo anticuerpo, como se conoce en la técnica.
Los métodos preferidos para la detección incluyen radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), siendo el ELISA el más preferido debido a una sensibilidad generalmente aumentada. Los ELISA se usan ampliamente en aplicaciones de biotecnología, particularmente como inmunoensayos para una amplia variedad de sustancias antigénicas. La sensibilidad del ELISA se basa en la amplificación enzimática de la señal
Como se usa en la presente descripción, el término "poner en contacto" se define como acercar los componentes de la reacción lo suficientemente cerca entre sí para permitir que se produzca la interacción deseada. El contacto puede lograrse mediante la mezcla de los componentes en solución, por ejemplo, o por interacción heterogénea, tal como por contacto de flujo a través de una columna o matriz de inmovilización que se une a uno de los componentes.
Los anticuerpos producidos y aislados por el método de la descripción se seleccionan para la unión a una diana predeterminada. Típicamente, la diana predeterminada se seleccionará en vista de su aplicabilidad como diana de diagnóstico y/o terapéutica. La diana predeterminada puede ser un epítopo conocido o desconocido. Los anticuerpos generalmente se unen a un antígeno predeterminado (por ejemplo, el inmunógeno) con una afinidad de al menos aproximadamente 1x107 M-1, preferentemente con una afinidad de al menos aproximadamente 5x107 M-1, con mayor preferencia con una afinidad de al menos 1x108 M-1 a 1x109 M-1 o más, a veces hasta 1x1010 M-1 o más. Con frecuencia, el antígeno predeterminado es una proteína humana, tal como por ejemplo, un antígeno de superficie celular humana (por ejemplo, CD4, CD8, receptor de IL-2, receptor de EGF, receptor de PDGF), otra macromolécula biológica humana (por ejemplo, trombomodulina, proteína C, antígeno de carbohidrato, antígeno de sialilo Lewis, L-selectina), o macromolécula no humana asociada a enfermedad (por ejemplo, LPS bacteriano, proteína de la cápside de virión o glicoproteína de envoltura) y similares.
En otro ejemplo, se han publicado varios informes sobre la utilidad diagnóstica y terapéutica de los scFv (Gruber y otros, 1994 op.cit.; Lilley y otros, 1994 op.cit.; Huston y otros, Int. Rev. Immunol 1993, 10:a 195, Sandhu JS, Crit. Rev. Biotechnol., 1992,12: 437).
Los anticuerpos de cadena sencilla de alta afinidad de la especificidad deseada pueden diseñarse y expresarse en una variedad de sistemas. Por ejemplo, los scFv se han producido en plantas (Firek y otros (1993) Plant Mol. Biol. 23: 861) y puede producirse fácilmente en sistemas procariotas (Owens RJ y Young R j , J. Immunol. Meth., 1994,168: 149; Johnson S y Bird RE, Methods Enzymol., 1991, 203: 88). Además, los anticuerpos de cadena sencilla pueden usarse como base para construir anticuerpos completos o diversos fragmentos de los mismos (Kettleborough y otros, Euro J. Immunol., 1994, 24: 952). La secuencia que codifica la región variable puede aislarse (por ejemplo, mediante amplificación por PCR o subclonación) y empalmarse a una secuencia que codifica una región constante humana deseada para codificar un anticuerpo de secuencia humana más adecuado para usos terapéuticos humanos donde la inmunogenicidad se minimiza preferentemente. El(Los) polinucleótido(s) que tiene(n) la(s) secuencia(s) codificante(s) completamente humana(s) resultante(s) puede(n) expresarse en una célula huésped (por ejemplo, a partir de un vector de expresión en una célula de mamífero) y purificarse para formulación farmacéutica.
Los constructos de expresión de ADN incluirán típicamente una secuencia de ADN de control de la expresión unida operativamente a las secuencias codificantes, que incluyen regiones promotoras heterólogas o asociadas naturalmente. Preferentemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas promotores eucariotas en vectores que pueden transformar o transfectar células huésped eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado al huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión a un alto nivel de las secuencias de nucleótidos, y la recolección y purificación de los anticuerpos mutantes "diseñados".
Como se indicó anteriormente, las secuencias de ADN se expresarán en los huéspedes después de unir operativamente las secuencias a una secuencia de control de la expresión (es decir, posicionadas para garantizar la transcripción y traducción del gen estructural). Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huéspedes como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por ejemplo, tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 4,704,362).
Además de microorganismos eucariotas tales como levadura, el cultivo de células de tejidos de mamíferos también puede usarse para producir los polipéptidos de la presente descripción (ver, Winnacker, "From Genes to Clones", VCH Publishers, N.Y., N.Y.). (1987)). Las células eucariotas se usan debido a que en la técnica se han desarrollado varias líneas de células huésped adecuadas que pueden secretar inmunoglobulinas intactas, e incluyen las líneas de células CHO, diversas líneas de células COS, células HeLa, líneas de células de mieloma, células B transformadas o hibridomas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen y otros, Immunol. Rev. 1986, 89: 49), y los sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, citomegalovirus, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino y similares.
La transcripción del ADN eucariota puede aumentarse mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son secuencias que actúan en cis de entre 10 y 30 obp que aumentan la transcripción mediante un promotor. Los potenciadores pueden aumentar eficazmente la transcripción cuando están 5' o 3' a la unidad de transcripción. También son eficaces si se encuentran dentro de un intrón o dentro de la propia secuencia codificante. Típicamente, se usan potenciadores virales, que incluyen potenciadores de SV40, potenciadores de citomegalovirus, potenciadores de polioma y potenciadores de adenovirus. También se usan comúnmente secuencias potenciadoras de sistemas de mamíferos, tales como el potenciador de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón.
Los sistemas de vectores de expresión en mamíferos también incluirán típicamente un gen marcador de selección. Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen, el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen de timidina quinasa (TK) o genes procariotas que confieren resistencia a fármacos. Los primeros dos genes marcadores prefieren el uso de líneas de células mutantes que carecen de la capacidad de crecer sin la adición de timidina al medio de crecimiento. Las células transformadas pueden identificarse después por su capacidad de crecer en medios no complementados. Los ejemplos de genes procariotas de resistencia a fármacos útiles como marcadores incluyen genes que confieren resistencia a G418, ácido micofenólico e higromicina.
Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés pueden transferirse a la célula huésped por métodos bien conocidos, en dependencia del tipo de huésped celular. Por ejemplo, el tratamiento con fosfato de calcio, la lipofección o la electroporación pueden usarse para otros huéspedes celulares. Otros métodos usados para transformar células de mamífero incluyen el uso de Polibreno, fusión de protoplastos, liposomas, electroporación y microinyección (ver, generalmente, Sambrook y otros, supra).
Una vez expresados, los anticuerpos, las cadenas de inmunoglobulina mutadas individuales y los fragmentos de anticuerpos mutados de la descripción pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, que incluyen precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna de fracción, electroforesis en gel y similares (ver, generalmente, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Una vez purificados, parcialmente o con homogeneidad según se desee, los polipéptidos pueden usarse terapéuticamente o en el desarrollo y la realización de procedimientos de ensayo, tinciones inmunofluorescentes y similares (ver, generalmente, Immunological Methods, vol. I y II, Eds. Lefkovits y Pernis, Academic Press, N.Y. N.Y. (1979 y 1981)).
Los anticuerpos interespecies de la presente descripción pueden usarse para diagnóstico y terapia. A modo de ilustración y no de limitación, los anticuerpos pueden usarse para tratar cáncer, enfermedades autoinmunitarias o infecciones virales. Para el tratamiento del cáncer, los anticuerpos se unirán típicamente a un antígeno expresado preferentemente en células cancerosas, tal como erbB-2, CEA, CD33 y muchos otros antígenos bien conocidos por los expertos en la técnica. Para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, los anticuerpos se unirán típicamente a un antígeno expresado en células T, tal como CD4, el receptor de IL-2, los diversos receptores de antígeno de células T y muchos otros antígenos bien conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, ver Fundamental Immunology, 2da ed., W. E. Paul, ed., Raven Press: Nueva York, N.Y.). Para el tratamiento de infecciones virales, los anticuerpos se unirán típicamente a un antígeno expresado en células infectadas por un virus en particular, tal como las diversas glucoproteínas (por ejemplo, gB, gD, gE) del virus del herpes simple y el citomegalovirus, y muchos otros antígenos bien conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, ver Virology, 2da ed., B. N. Fields y otros, eds., (1990), Raven Press: Nueva York, N.Y.).
Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos de la presente descripción son útiles para administración parenteral, es decir, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa. Las composiciones para administración parenteral comprenderán comúnmente una solución del anticuerpo o un cóctel del mismo disuelto en un portador aceptable, preferentemente un portador acuoso. Se puede usar una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4 %, glicina al 0,3 % y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de partículas. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etcétera. La concentración de los anticuerpos mutantes en estas formulaciones puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente 0,01 %, usualmente al menos aproximadamente 0,1 % hasta tanto como 5 % en peso y se seleccionará principalmente en base a los volúmenes de fluidos, viscosidades, etcétera, de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado.
Por lo tanto, una composición farmacéutica típica para inyección intramuscular podría prepararse de modo que contenga 1 ml de agua tamponada estéril y aproximadamente 1 mg de anticuerpo mutante. Una composición típica para infusión intravenosa puede prepararse de modo que contenga 250 ml de solución de Ringer estéril y 10 mg de anticuerpo mutante. Los métodos actuales para preparar composiciones administrables por vía parenteral serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, 20ma Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (2000).
Los biosimilares son agentes terapéuticos basados en proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos (es decir, composición química) idéntica a la de un fármaco ético aprobado que ya no está protegido por patente. En un aspecto, las técnicas de la descripción se utilizan para biosimilares. Si bien es esencial producir la proteína terapéutica en una formulación y composición equivalentes, para ser competitivos en el mercado, el biosimilar debe prepararse de la forma más rápida y económica posible. Los medios de cultivo celular y el desarrollo de procesos son algunas de las partes más costosas y lentas de la preparación y producción de un biosimilar.
El cambio de los codones de mutación silente dentro de una proteína terapéutica cambia el codón usado para la traducción de la proteína, pero conserva la secuencia de aminoácidos dentro de la proteína. Estos cambios de codones en una variedad de posiciones dentro de una molécula, particularmente en el extremo amino terminal pueden tener un impacto significativo en la expresión y, en algunos casos, incluso en la glicosilación. En un aspecto, las técnicas de la descripción se utilizan en el desarrollo, selección y preparación de biosimilares.
Ejemplos
Ejemplo 1A. Reacciones para el desarrollo posicional integral (CPE)
Reacción de mutagénesis
Se diseña un par de cebadores (Mezcla de cebadores 1 y Mezcla de cebadores 2) para cada codón a mutar. El diseño dependerá de la secuencia génica, y las bases de datos de análisis de secuencias tales como Sequencher (Gene Codes Corporation) o VectorNTI® (Life Technologies) pueden usarse para diseñar los cebadores. Para CPE, se diseña un par de cebadores para cada codón a mutar. Un codón diana redundante (NNK o NNN) está en el medio, flanqueado por 20 bases en cada lado (longitud total del cebador: 43 bases, 9f clones para secuenciar para identificar mutantes únicos). El ADN plantilla es un vector de ADN con gen(es) diana.
Preparar las siguientes reacciones en placas de PCR de pared delgada de 96 pocillos o tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml en hielo:
Mezcla de cebadores 1 (2,5 uM) 5 ul
Mezcla de cebadores 2 (2,5 uM) 5 ul
Tampón de ADN polimerasa Pfu turbo 10X 2,5 ul
Plantilla de ADN (5, 10, 25 ng) x ul
dNTP 2 ul
Agua libre de nucleasas QS hasta 24,5 ul
ADN polimerasa Pfu turbo (2,5 U/ul) 0,5 ul
Volumen total de reacción 25 pl
1. Preparar una reacción de control negativo por una placa de 96 pocillos (reemplazar los cebadores con tampón TE) 2. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una centrífuga de mesa
3. Realizar las reacciones en forma cíclica con el uso de los parámetros de ciclo descritos a continuación:
Figure imgf000033_0001
Análisis de control de calidad
1. Para el análisis de QC de las reacciones de amplificación, preparar las siguientes reacciones en placas de PCR de pared delgada de 96 pocillos o tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml:
Reacción de mutagénesis 5 pl
Agua 4 pl
Tampón de aplicación de muestra1 ul
Volumen 10 pl
Aplicar 10 ul en un gel de TAE agarosa al 1 % con bromuro de etidio a 0,5 pg/ml. Usar la escalera DNA plus de 1 kb como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón TAE IX.
Digestión de las reacciones de mutagénesis con enzimas de restricción apropiadas para la clonación en el vector de ADN - Ejemplo para la enzima de restricción Dpnl
1. Añadir 0,5 pl de la enzima de restricción Dpnl (10 U/pl) directamente a cada reacción.
2. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una centrífuga de mesa
3. Incubar a 37 °C en máquinas de PCR durante 2 horas.
4. Transformar 6 mezclas de reacción de cada una de las placas de 96 pocillos en células XLI Blue supercompetentes. Almacenar el resto de las reacciones a -20 °C.
5. Enfriar previamente tubos de PCR de 0,2 ml en hielo. Calentar el medio SOC a 42 °C
6. Descongelar las células XLI Blue supercompetentes en hielo. Cuando se descongelen, mezclar suavemente y preparar alícuotas de 50 pl de células en cada uno de los tubos preenfriados.
7. Añadir 0,8 ul de b-mercaptoetanol a cada alícuota de células. Incubar las células en hielo durante 10 minutos, con agitación suave cada 2 minutos.
8. Añadir 2 ul de la mezcla de reacción a una alícuota de células. Golpear los tubos suavemente.
9. Incubar los tubos en bloques fríos durante 30 minutos.
10. Aplicar un pulso de calor a los tubos en un baño de agua a 42 °C durante 45 segundos.
11. Incubar los tubos en hielo durante 2 minutos
12. Añadir 100 pl de medio SOC precalentado e incubar los tubos a 37 °C durante 1 hora con agitación a 225-250 rpm.
13. Sembrar toda la mezcla de transformación en placas de LB agar que contienen carbenicilina.
14. Incubar las placas a 37 °C durante la noche.
15. Contar las colonias en las placas y seleccionar 12 colonias de cada reacción de transformación para purificación minipreparativa y secuenciación.
Transformación a gran escala
1. Descongelar las células XLI Blue supercompetentes en hielo. Descongelar 20 tubos de células competentes para 96 reacciones. Cuando se descongelen, añadir 4 pl de b-mercaptoetanol a cada tubo de 250 ul de células competentes. Incubar las células en hielo durante 10 minutos, con agitación suave cada 2 minutos.
2. Enfriar previamente tubos de PCR de 0,2 ml en hielo. Calentar el medio SOC a 42 °C.
3. Preparar alícuotas de 50 pl de células en cada uno de los tubos preenfriados.
4. Añadir 2 ul de la mezcla de reacción a una alícuota de células. Golpear los tubos suavemente.
5. Incubar los tubos en bloques fríos durante 30 minutos.
6. Aplicar un pulso de calor a los tubos en un baño de agua a 42 °C durante 45 segundos.
7. Incubar los tubos en hielo durante 2 minutos,
8. Añadir 100 pl de medio SOC precalentado e incubar los tubos a 37 °C durante 1 hora con agitación a 225-250 rpm.
9. Sembrar toda la mezcla de transformación en placas de LB agar que contienen carbenicilina.
10. Incubar las placas a 37 °C durante la noche.
11. Cultivar las células en bloques de 96 pocillos para purificación minipreparativa
12. Preparar el ADN a escala minipreparativa con el uso del kit QIAVac 96 según el protocolo del fabricante.
Ejemplo 1B: Tamizaje para detectar la mejora de la afinidad de los anticuerpos
Transfección
Una semana antes de la transfección, transferir las células 293F a un cultivo en monocapa en medio Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM) complementado con suero.
Un día antes de la transfección, sembrar 0,2 x 105 y 0,4 x 105 células en 100 ul de D-MEM complementado con suero por muestra de transfección en formatos de 96 pocillos.
Para cada muestra de transfección, preparar complejos de ADN-Lipofectamina.
Diluir 0,2 ug de ADN en 50 ul de medio Opti-MEM con suero reducido. Mezclar suavemente.
Diluir 0,125 ul de Lipofectamina en 50 ul de medio Opti-MEM con suero reducido. Mezclar suavemente e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
Combinar el ADN diluido con la Lipofectamina diluida. Mezclar suavemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
Añadir los 100 ul de complejos de ADN-Lipofectamina a cada pocillo que contiene células y medio. Mezclar suavemente mediante balanceo de la placa hacia adelante y hacia atrás.
Incubar las células a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %.
Añadir a cada pocillo 100 vl de D-MEM complementado con suero después de 6 horas. Incubar las células a 37 °C durante la noche en una incubadora de CO2 al 5 %.
Aspirar el medio en cada pocillo. Lavar cada pocillo con 100 ul de 293 SFM II con L-Glutamina 4 mM. Añadir a cada pocillo 100 ul de 293 SFM II con L-Glutamina 4 mM.
Recolectar el sobrenadante para ELISA a las 96 horas después de la transfección.
ELISA funcional
Recubrir placas Nunc-Immuno Maxisorp de 96 pocillos con 100 ul de antígeno a 2 ug/ml en solución de recubrimiento. Cubrir las placas con selladores e incubar durante la noche a 4 C.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de bloqueo. Agitar a 200 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir a las placas duplicados de 100 ul/pocillo de anticuerpo de control (2 ug/ml) en solución de bloqueo.
Añadir a las placas duplicados de 100 ul de sobrenadante de la transfección (SOP 5A). Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. Repetir 3 veces las etapas 11-12.
Añadir a cada pocillo 100 ul de dilución 1:5000 de anticuerpo antihumano de cabra purificado por afinidad conjugado con HRP en solución de bloqueo.
Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
Repetir 3 veces las etapas 17-18.
Añadir a cada pocilio 100 ul de sustrato TMB de Sigma. Incubar a temperatura ambiente y comprobar cada 2-5 minutos. Añadir 100 ul de HCl 1 N para detener la reacción.
Leer a 450 nm.
ELISA de cuantificación
Recubrir placas Nunc-Immuno Maxisorp de 96 pocillos con 100 j l de 10 jg/m l de anti-IgG humana de cabra específico de Fc purificado por afinidad en solución de recubrimiento.
Cubrir las placas con selladores e incubar durante la noche a 4 C.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de bloqueo. Agitar a 200 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir a las placas duplicados de 100 ul/pocillo de concentración estandarizada de IgG sérica humana purificada en solución de bloqueo.
Añadir a las placas duplicados de 100 ul de sobrenadante de la transfección (SOP 5A). Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
Repetir 3 veces las etapas 11-12.
Añadir a cada pocillo 100 ul de dilución 1:5000 de anticuerpo antihumano de cabra purificado por afinidad conjugado con HRP en solución de bloqueo.
Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
Repetir 3 veces las etapas 17-18.
Añadir a cada pocillo 100 ul de sustrato TMB de Sigma. Incubar a temperatura ambiente y comprobar cada 2-5 minutos. Añadir 100 ul de HCl 1 N para detener la reacción.
Leer a 450 nm
Ejemplo 1C: Síntesis combinatoria de proteínas (CPS)
Combinación de los 10 mejores mutantes puntuales únicos por CPS
Para mejorar aún más la afinidad, los 10 mejores mutantes puntuales únicos (5 en la cadena ligera, 5 en la cadena pesada) pueden combinarse en una biblioteca combinatoria, expresarse y tamizarse.
Los mejores mutantes puntuales únicos pueden combinarse mediante una serie de etapas de PCR/PCR de superposición como se describe a continuación. Cualquiera de los mutantes puntuales únicos puede usarse como plantilla para las reacciones de PCR iniciales. En el presente ejemplo, pBAl es la plantilla para las reacciones de PCR iniciales, y los mutantes puntuales únicos están en las CDR I, II y III.
Todos los cebadores de PCR se diseñan de modo que incorporen mutaciones relevantes y coincidan con la plantilla. El diseño dependerá de las bases de datos de genes y de análisis de secuencias tales como Sequencher (Gene Codes Corporation) o VectorNTI® (Life Technologies) que pueden usarse para diseñar los cebadores.
Combinación de mutantes en CDR 1 y CDR3
Realizar las 14 reacciones de PCR para LC y HC: apareamiento a 55 °C, cebadores como se muestra en la tabla a continuación, plantilla pBAl
Figure imgf000036_0001
Comprobar las reacciones de PCR en gel de agarosa
Agrupar las reacciones 1 -4, 5 -12 y 13 -14 para cadenas pesadas y ligeras en una relación 1:1 y purificar los productos de longitud completa (PCR L1, L2, L3, PCR H1, H2, H3) a partir del gel
Combinar los productos de PCR L1, L2, L3 mediante PCR de extensión de superposición con el uso de los productos purificados a partir del gel de la etapa 1C y los cebadores FP1/RP1
Combinar los productos de PCR H1, H2, H3 mediante PCR de extensión de superposición con el uso de los productos purificados a partir del gel de la etapa 1C y los cebadores FP2/RP1
Productos de longitud completa purificados a partir del gel de las etapas 1d y 1e (=PCR de superposición 1; LC: 1,6 kpb, HC: 855 pb
Adición de mutantes en CDR2
Figure imgf000036_0002
Realizar las reacciones de PCR 15 - 22 para LC y HC: apareamiento a 55 °C, cebadores como se muestra en la tabla a continuación, producto de PCR de superposición purificado a partir del gel de la etapa 1f como plantilla
Comprobar la reacción de PCR en gel de agarosa
Agrupar las reacciones 15 - 18, 19 - 22 para cadenas pesadas y ligeras en una relación 1:1 y purificar los productos de longitud completa (PCR L4, L5, PCR H4, H5) a partir del gel
Combinar los productos de PCR L4, L5 mediante PCR de extensión de superposición con el uso de los productos purificados a partir del gel de la etapa 2C y los cebadores FP1/RP1. Combinar los productos de PCR H4, H5 mediante PCR de extensión de superposición con el uso de los productos purificados a partir del gel de la etapa 2C y los cebadores FP2/RP1 (LC: 861 pb)
Purificar los productos de longitud completa a partir del gel de las etapas 2d y2e (=PCR de superposición 2; LC: 1,6 kpb, HC: 855 pb)
Clonación de productos de longitud completa
Cadenas pesadas
(1) Cortar el producto de PCR de superposición de HC de la etapa 2f con RE1/RE2 y clonarlo en el plásmido purificado a partir del gel, cortado con RE1/RE2 y tratado con CIP
(2) Enviar 2 placas de 96 pocillos a secuenciación
(3) Identificar las 32 combinaciones únicas de HC de acuerdo con las secuencias de referencia
(4) Almacenar en glicerol las combinaciones únicas de HC y purificar el ADN plasmídico a escala minipreparativa (5) Agrupar los ADN plasmídicos de HC 1:1, cortar con RE3/RE4 y purificar el inserto (~2,1 kpb) a partir del gel ^ Grupo de HC
Cadenas ligeras
(1) Cortar el producto de PCR de superposición de LC de la etapa 2f con RE5/RE2 y clonarlo en el plásmido purificado a partir del gel, cortado con RE5/RE2 y tratado con CIP
(2) Enviar 2 placas de 96 pocillos a secuenciación
(3) Identificar las 32 combinaciones únicas de LC de acuerdo con las secuencias de referencia
(4) Almacenar en glicerol las combinaciones únicas de LC y purificar los ADN a escala minipreparativa
(5) Cortar los ADN de LC individualmente con RE3/RE4, tratarlos con CIP y purificar la banda de vector a partir del gel
Combinación de LC y HC
Clonar el grupo de HC de la etapa 3a v. en cada LC única de la etapa 3b v.
Enviar 96 clones por LC a secuenciación
Identificar las combinaciones únicas de LC/HC y distribuir en placas de 96 pocillos
Almacenar en glicerol y purificar a escala minipreparativa para la expresión
Ejemplo 2. Desarrollo posicional integral
Este ejemplo describe el método para crear cambios específicos de nucleótidos en un constructo de anticuerpo. Reacción de mutagénesis
Preparar las siguientes reacciones en placas de PCR de pared delgada de 96 pocillos o tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml en hielo:
Mezcla de cebadores 1 (2,5 pM) 5 pl
Mezcla de cebadores 2 (2,5 pM) 5 pl
Tampón de ADN polimerasa Pfu turbo 10X 2,5 pl
Plantilla de ADN (5, 10, 25 ng) x pl
dNTP 2 pl
Agua libre de nucleasas QS hasta 24,5 pl
ADN polimerasa Pfu turbo (2,5 U/pl) 0,5 pl
Volumen total de reacción 25 pl
Preparar una reacción de control negativo por una placa de 96 pocillos (reemplazar los cebadores con tampón TE). Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una centrífuga de mesa
Realizar las reacciones en forma cíclica con el uso de los parámetros de ciclo descritos a continuación:
Figure imgf000038_0001
Análisis de control de calidad
Para el análisis de QC de las reacciones de amplificación, preparar las siguientes reacciones en placas de PCR de pared delgada de 96 pocillos o tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml:
Reacción de mutagénesis 5 pl
Agua 4 pl
Tampón de aplicación de muestra 1 ul
Volumen 10 pl
Aplicar 10 pl en un gel de TAE agarosa al 1 % con bromuro de etidio a 0,5 pg/ml. Usar la escalera DNA plus de 1 kb como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón TAE IX.
Digestión de las reacciones de mutagénesis con Dpnl
16. Añadir 0,5 pl de la enzima de restricción Dpnl (10 U/pl) directamente a cada reacción.
17. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una centrífuga de mesa
18. Incubar a 37 °C en máquinas de PCR durante 2 horas.
19. Transformar 6 mezclas de reacción de cada una de las placas de 96 pocillos en células XLI Blue supercompetentes. Almacenar el resto de las reacciones a -20 °C.
20. Enfriar previamente tubos de PCR de 0,2 ml en hielo. Calentar el medio SOC a 42 °C
21. Descongelar las células XLI Blue supercompetentes en hielo. Cuando se descongelen, mezclar suavemente y preparar alícuotas de 50 ml de células en cada uno de los tubos preenfriados.
22. Añadir 0,8 pl de p-mercaptoetanol a cada alícuota de células. Incubar las células en hielo durante 10 minutos, con agitación suave cada 2 minutos.
23. Añadir 2 pl de la mezcla de reacción a una alícuota de células. Golpear los tubos suavemente.
24. Incubar los tubos en bloques fríos durante 30 minutos.
25. Aplicar un pulso de calor a los tubos en un baño de agua a 42 °C durante 45 segundos.
26. Incubar los tubos en hielo durante 2 minutos
27. Añadir 100 pl de medio SOC precalentado e incubar los tubos a 37 °C durante 1 hora con agitación a 225-250 rpm.
28. Sembrar toda la mezcla de transformación en placas de LB agar que contienen carbenicilina.
29. Incubar las placas a 37 °C durante la noche.
30. Contar las colonias en las placas y seleccionar 12 colonias de cada reacción de transformación para purificación minipreparativa y secuenciación.
Transformación a gran escala
13. Descongelar las células XLI Blue supercompetentes en hielo. Descongelar 20 tubos de células competentes para 96 reacciones. Cuando se descongelen, añadir 4 pl de p-mercaptoetanol a cada tubo de 250 ul de células competentes. Incubar las células en hielo durante 10 minutos, con agitación suave cada 2 minutos.
14. Enfriar previamente tubos de PCR de 0,2 ml en hielo. Calentar el medio SOC a 42 °C.
15. Preparar alícuotas de 50 pl de células en cada uno de los tubos preenfriados.
16. Añadir 2 pl de la mezcla de reacción a una alícuota de células. Golpear los tubos suavemente.
17. Incubar los tubos en bloques fríos durante 30 minutos.
18. Aplicar un pulso de calor a los tubos en un baño de agua a 42 °C durante 45 segundos.
19. Incubar los tubos en hielo durante 2 minutos,
20. Añadir 100 pl de medio SOC precalentado e incubar los tubos a 37 °C durante 1 hora con agitación a 225-250 rpm.
21. Sembrar toda la mezcla de transformación en placas de LB agar que contienen carbenicilina.
22. Incubar las placas a 37 °C durante la noche.
Apéndice 1: Recetas de tampones
Tampón TAE 50X
• 242 g de Tris base
• 57,1 ml de ácido acético glacial
• 37,2 g de Na2EDTA-2H2O
• Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Tampón TAE IX
• 20 ml de tampón TAE 50X
• 800 ml de H2 O destilada
Gel de agarosa al 1 % con bromuro de etidio
1 g de agarosa LE
100 ml de tampón TAE IX
Fundir la agarosa en un horno de microondas y agitar para garantizar una mezcla uniforme
Enfriar la agarosa a 55 °C
Añadir 2,5 pl de bromuro de etidio a 20 mg/ml a la agarosa
Verter sobre una plataforma de gel
LB
10 g de NaCl
10 g de triptona
5 g de extracto de levadura
Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 5 N
Esterilizar en autoclave
Agar LB-carbenicilina
10 g de NaCl
10 g de triptona
5 g de extracto de levadura
20 g de agar
Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 5 N
Esterilizar en autoclave
Enfriar a 55 °C
Añadir 10 ml de 10 mg/ml de carbenicilina esterilizada por filtración
Verter en placas Petri (placa de 25 ml/100 mm)
Medio SOC
0,5 g de NaCl
20 g de triptona
0,5 g de extracto de levadura
2 ml de glucosa al 20 % esterilizada por filtración
Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Esterilizar en autoclave
Añadir 10 ml de MgCh 1 M esterilizado por filtración y 10 ml de MgSOs 1 M esterilizado por filtración antes de usar
Ejemplo 3. ELISA funcional
Este ejemplo describe el método para comparar la afinidad de los anticuerpos en el sobrenadante del cultivo celular. Recubrir placas Nunc-Immuno Maxisorp de 96 pocillos con 100 pl de antígeno a 2 pg/ml en solución de recubrimiento. Cubrir las placas con selladores e incubar durante la noche a 4 C.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de bloqueo. Agitar a 200 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir a las placas duplicados de 100 ul/pocillo de anticuerpo de control (2 pg/ml) en solución de bloqueo.
Añadir a las placas duplicados de 100 ul de los sobrenadantes de la transfección.
Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
Repetir 3 veces las etapas 11-12.
Añadir a cada pocillo 100 ul de dilución 1:5000 de anticuerpo antihumano de cabra purificado por afinidad conjugado con HRP en solución de bloqueo.
Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
Añadir 200 ul de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
Repetir 3 veces las etapas 17-18.
Añadir a cada pocillo 100 ul de sustrato TMB de Sigma. Incubar a temperatura ambiente y comprobar cada 2-5 minutos. Añadir 100 ul de HCl 1 N para detener la reacción.
Leer a 450 nm.
Apéndice 1: Recetas de tampones
Solución de lavado
• Tween-20 al 0,05 % en PBS
Solución de bloqueo
• Leche descremada Carnation al 2 % en PBS
Ejemplo 4. Transfección de células CHO-S
Este ejemplo describe el método para transfectar ADN en células CHO-S.
Una semana antes de la transfección, transferir las células CHO-S a un cultivo en monocapa en medio Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM) complementado con suero.
Un día antes de la transfección, sembrar 0,4 x 105 células en 100 pl de D-MEM complementado con suero por muestra de transfección en formatos de 96 pocillos.
Realizar la transfección al final de la jornada laboral.
Para cada muestra de transfección, preparar complejos de ADN-Lipofectamina.
Diluir 0,2 pg de ADN en 25 pl de medio Opti-MEM con suero reducido. Mezclar suavemente.
Diluir 0,5 pl de Lipofectamina en 25 pl de medio Opti-MEM con suero reducido. Mezclar suavemente e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
Combinar el ADN diluido con la Lipofectamina diluida. Mezclar suavemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
Añadir los 50 pl de complejos de ADN-Lipofectamina a cada pocillo que contiene células y medio. Mezclar suavemente mediante balanceo de la placa hacia adelante y hacia atrás.
Incubar las células a 37 °C durante la noche en una incubadora de CO2 al 5 %
Aspirar el medio en cada pocillo. Añadir a cada pocillo 100 pl de D-MEM complementado con suero. Recolectar el sobrenadante para el ensayo ELISA y el lisado celular para el ensayo de beta-galactosidasa.
Apéndice 1: Recetas de tampones
Suero fetal bovino inactivado por calor
• 500 ml de suero fetal bovino inactivado por calor en el frasco original del proveedor
• Calentar durante 30 minutos a 56 °C con mezcla cada 5 minutos
• Preparar alícuotas de 50 ml y almacenar a -20 °C
Medio Eagle modificado de Dulbecco complementado con suero
• 500 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco
• 50 ml de suero fetal bovino inactivado por calor
• 5 ml de aminoácidos no esenciales MEM 10 mM
Ejemplo 5. Síntesis en fase líquida de bibliotecas combinatorias de dominios variables - Cadena ligera
Este ejemplo describe el ensamblaje de una biblioteca de dominios variables de cadena ligera (LC) humanizada. La biblioteca contiene marcos de cadena ligera humana (FW) y regiones determinantes de complementariedad (CDR) no humanas en el orden de: FW1 - CDR1 - FW2 - CDr 2 - fW3 - CDR3. Hay un total de 7 fragmentos FW1, 4 FW2 y 8 FW3. La biblioteca se ensambla con el uso de la ligación gradual en fase líquida de los fragmentos de ADN de FW y CDR.
Ensamblaje de dominio variable de LC
Nota 1: Realizar la Ligación 1 y la Ligación 2 al mismo tiempo.
Nota 2: Realizar la Ligación 3 y la Ligación 4 al m ismo tiempo.
Ligación 1: FW1b ^ FW1a
Preparar las siguientes reacciones de ligación en tubos de microcentrífuga en hielo:
Nota: Hay 7 reacciones de ligación (FW1-1 a FW1-7). Preparar cada reacción de ligación en un tubo de m icrocentrífuga diferente, 7 tubos en total.
Fragmentos FW1a (250 pMol) X j l
Fragmentos FW1b (250 pMol) x j l
Tampón de T4 ligasa 10X 2 j l rATP 10 mM 1 j l
Agua libre de nucleasas QS hasta 19 j l
T4 ligasa 1 j l
Volumen total de reacción 20 pl
Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una microcentrífuga.
Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Preparar las siguientes reacciones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml:
Ligaciones de FW1 20 j l
Tampón de aplicación de muestra 10x 3 ul
Volumen total 23 pl
Aplicar en un gel de TAE agarosa al 4 % con bromuro de etidio a 0,5 jg/ml. Usar una escalera de ADN de 25 pb como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón TAE IX.
Cortar las bandas correspondientes a los tamaños correctos y purificarlas con el uso del kit de extracción de gel QIAquick.
Combinar los fragmentos de gel de las 7 reacciones de ligación en dos tubos de microcentrífuga.
Añadir 3 volúmenes de tampón QG a 1 volumen de gel.
Incubar a 50 °C durante 10 minutos hasta que el pedazo de gel se haya disuelto por completo. Añadir a la muestra isopropanol correspondiente a 1 volumen de gel y mezclar.
Colocar una columna de centrifugación QIAquick en un tubo de recolección de 2 ml que se proporciona.
Aplicar la muestra a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
Desechar el flujo pasante y volver a colocar la columna QIAquick en el mismo tubo de recolección.
Añadir 0,75 ml de tampón PE a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
Desechar el flujo pasante y centrifugar la columna QIAquick durante 1 minuto adicional a 17900 x g (13000 rpm). Colocar la columna QIAquick en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
Añadir 52 j l de tampón EB al centro de la membrana QIAquick y centrifugar la columna durante 1 minuto. Dejar reposar la columna durante 1 minuto y después centrifugar durante 1 minuto.
Combinar el ADN eluido (volumen total de 104 jl) y aplicar 6 j l en un gel de agarosa al 4 % para el QC de los productos de ligación purificados.
Ligación 2: FW3b ^ FW3a
Preparar las siguientes reacciones de ligación en tubos de microcentrífuga en hielo:
Nota: Hay 8 reacciones de ligación (FW3-1 a FW3-8). Preparar cada reacción de ligación en un tubo de m icrocentrífuga diferente, 7 tubos en total.
Fragmentos FW3a (250 pMol) x j l
Fragmentos FW3b (250 pMol) x j l
Tampón de T4 ligasa 10X 2 j l
rATP 10 mM 1 j l
Agua libre de nucleasas QS hasta 19 j l
T4 ligasa 1 j l
Volumen total de reacción 20 pl
Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una microcentrífuga.
Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Preparar las siguientes reacciones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml:
Ligaciones de FW 3 20 |jl
Tampón de aplicación de muestra 10x 3 j l
Volumen total 23 pl
Aplicar en un gel de TAE agarosa al 4 % con bromuro de etidio a 0,5 jg/ml. Usar una escalera de ADN de 25 pb como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón TAE IX.
Cortar las bandas correspondientes a los tamaños correctos y purificarlas con el uso del kit de extracción de gel QIAquick.
Combinar los fragmentos de gel de las 7 reacciones de ligación en dos tubos de microcentrífuga.
Añadir 3 volúmenes de tampón QG a 1 volumen de gel.
Incubar a 50 °C durante 10 minutos hasta que el pedazo de gel se haya disuelto por completo. Añadir a la muestra isopropanol correspondiente a 1 volumen de gel y mezclar.
Colocar una columna de centrifugación QIAquick en un tubo de recolección de 2 ml que se proporciona.
Aplicar la muestra a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
Desechar el flujo pasante y volver a colocar la columna QIAquick en el mismo tubo de recolección.
Añadir 0,75 ml de tampón PE a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
Desechar el flujo pasante y centrifugar la columna QIAquick durante 1 minuto adicional a 17900 x g (13000 rpm). Colocar la columna QIAquick en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
Añadir 52 j l de tampón EB al centro de la membrana QIAquick y centrifugar la columna durante 1 minuto. Dejar reposar la columna durante 1 minuto y después centrifugar durante 1 minuto.
Combinar el ADN eluido (volumen total de 104 j l) y aplicar 6 j l en gel de agarosa al 4 % para QC.
Ligación 3: CDR1 ^ FW1
1. Preparar la reacción de ligación en un tubo de microcentrífuga en hielo:
Fragmentos CDR1 (1 nMol) x j l Fragmentos FW1 combinados purificados a partir de gel 94 j l
Tampón de T4 ligasa 10X 14 j l
rATP 10 mM 1 j l
Agua libre de nucleasas QS hasta 139 j l
T4 ligasa 1 j l
Volumen total de reacción 140 j l
2. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una microcentrífuga.
3. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
4. Preparar las siguientes reacciones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml:
Ligaciones CDR1-FW 1 140 j l
Tampón de aplicación de muestra 10x 15 j l
Volumen total 155 pl
5. Aplicar en un gel de TAE agarosa al 4 % con bromuro de etidio a 0,5 jg/m l. Usar una escalera de ADN de 25 pb como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón t A e IX.
6. Cortar las bandas correspondientes a los tamaños correctos y purificarlas con el uso del kit de extracción de gel QIAquick.
7. Combinar los fragmentos de gel en dos tubos de microcentrífuga.
8. Añadir 3 volúmenes de tampón QG a 1 volumen de gel.
9. Incubar a 50 °C durante 10 minutos hasta que el pedazo de gel se haya disuelto por completo. Añadir a la muestra isopropanol correspondiente a 1 volumen de gel y mezclar.
10. Colocar una columna de centrifugación QIAquick en un tubo de recolección de 2 ml que se proporciona.
11. Aplicar la muestra a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
12. Desechar el flujo pasante y volver a colocar la columna QIAquick en el mismo tubo de recolección.
13. Añadir 0,75 ml de tampón PE a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
14. Desechar el flujo pasante y centrifugar la columna QIAquick durante 1 minuto adicional a 17900 x g (13000 rpm).
15. Colocar la columna QIAquick en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
16. Añadir 52 j l de tampón EB al centro de la membrana QIAquick y centrifugar la columna durante 1 minuto. Dejar reposar la columna durante 1 minuto y después centrifugar durante 1 minuto.
17. Combinar el ADN eluido (volumen total de 104 |jl) y aplicar 6 ul en gel de agarosa al 4 % para QC.
Ligación 4: CDR2 ^ FW3
18. Preparar la reacción de ligación en un tubo de microcentrífuga en hielo:
Fragmentos CDR2 (1 nMol) x j l
Fragmentos FW3 combinados purificados a partir de gel 94 j l
Tampón de T4 ligasa 10X 14 j l
rATP 10 mM 1 j l
Agua libre de nucleasas QS hasta 139 j l
T4 ligasa 1 j l
Volumen total de reacción 140 pl
19. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una microcentrífuga.
20. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
21. Preparar las siguientes reacciones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml:
Ligaciones CDR2-FW3 140 j l
Tampón de aplicación de muestra 10x 15 j l
Volumen total 155 pl
22. Aplicar en un gel de TAE de agarosa al 4 % con bromuro de etidio a 0,5 pg/ml. Usar una escalera de ADN de 25 pb como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón t A e IX.
23. Cortar las bandas correspondientes a los tamaños correctos y purificarlas con el uso del kit de extracción de gel QIAquick.
24. Combinar los fragmentos de gel en dos tubos de microcentrífuga.
25. Añadir 3 volúmenes de tampón QG a 1 volumen de gel.
26. Incubar a 50 °C durante 10 minutos hasta que el pedazo de gel se haya disuelto por completo. Añadir a la muestra isopropanol correspondiente a 1 volumen de gel y mezclar.
27. Colocar una columna de centrifugación QIAquick en un tubo de recolección de 2 ml que se proporciona.
28. Aplicar la muestra a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
29. Desechar el flujo pasante y volver a colocar la columna QIAquick en el mismo tubo de recolección.
30. Añadir 0,75 ml de tampón PE a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
31. Desechar el flujo pasante y centrifugar la columna QIAquick durante 1 minuto adicional a 17900 x g (13000 rpm).
32. Colocar la columna QIAquick en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
33. Añadir 52 j l de tampón EB al centro de la membrana QIAquick y centrifugar la columna durante 1 minuto. Dejar reposar la columna durante 1 minuto y después centrifugar durante 1 minuto.
34. Combinar el ADN eluido (volumen total de 104 j l) y aplicar 6 j l en gel de agarosa al 4 % para QC.
Ensamblaje del dominio variable de LC (cont.)
Nota: Realizar la Ligación 5 y la Ligación 6 al mismo tiempo
Ligación 5: FW2 ^ CDR1-FW1
Preparar la reacción de ligación en un tubo de microcentrífuga en hielo:
Grupo de fragmentos FW2 (450 pMol) x j l
Fragmentos CDR1-FW1 purificados a partir de gel 94 j l
Tampón de T4 ligasa 10X 14 j l rATP 10 mM 1 j l
Agua libre de nucleasas QS hasta 139 j l
T4 ligasa 1 j l
Volumen total de reacción 140 pl
Nota: el grupo de fragmentos FW2 contiene 5 fragmentos FW2, cada uno a 90 pMol
Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una microcentrífuga.
Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Preparar las siguientes reacciones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml:
Ligaciones FW2-CDR-1-FW1 140 |jl
Tampón de aplicación de muestra
15 j l 10x__________________________
Volumen total 155 pl
Aplicar en un gel de TAE agarosa al 4 % con bromuro de etidio a 0,5 jg/ml. Usar una escalera de ADN de 25 pb como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón TAE IX.
Cortar las bandas correspondientes a los tamaños correctos y purificarlas con el uso del kit de extracción de gel QIAquick.
Combinar los fragmentos de gel de las 7 reacciones de ligación en dos tubos de microcentrífuga.
Añadir 3 volúmenes de tampón QG a 1 volumen de gel.
Incubar a 50 °C durante 10 minutos hasta que el pedazo de gel se haya disuelto por completo. Añadir a la muestra isopropanol correspondiente a 1 volumen de gel y mezclar.
Colocar una columna de centrifugación QIAquick en un tubo de recolección de 2 ml que se proporciona.
Aplicar la muestra a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
Desechar el flujo pasante y volver a colocar la columna QIAquick en el mismo tubo de recolección.
Añadir 0,75 ml de tampón PE a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
Desechar el flujo pasante y centrifugar la columna QIAquick durante 1 minuto adicional a 17 900 x g (13 000 rpm). Colocar la columna QIAquick en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
Añadir 30 j l de tampón EB al centro de la membrana QIAquick y centrifugar la columna durante 1 minuto. Dejar reposar la columna durante 1 minuto y después centrifugar durante 1 minuto.
Combinar el ADN eluido (volumen total de 60 j l) y aplicar 3 j l en gel de agarosa al 4 % para QC.
Ligación 6: CDR3 ^ FW3-CDR2
Preparar la reacción de ligación en un tubo de microcentrífuga en hielo:
Grupo de fragmentos CDR3 (500 pMol) x j l
Fragmentos FW3-CDR2 purificados a partir de gel 94 j l
Tampón de T4 ligasa 10X 14 j l
rATP 10 mM 1 j l
Agua libre de nucleasas QS hasta 139 j l
T4 ligasa 1 j l
Volumen total de reacción 140 pl
Nota: el grupo de fragmentos FW2 contiene 4 fragmentos FW2, cada uno a 90 pMol
Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una microcentrífuga.
Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Preparar las siguientes reacciones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml:
Ligaciones CDR3-FW3-CDR2 140 j l
Tampón de aplicación de muestra 10x 15 j l
Volumen total 155 pl
Aplicar en un gel de TAE agarosa al 4 % con bromuro de etidio a 0,5 jg/ml. Usar una escalera de ADN de 25 pb como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón TAE IX.
Cortar las bandas correspondientes a los tamaños correctos y purificarlas con el uso del kit de extracción de gel QIAquick.
Combinar los fragmentos de gel de las 7 reacciones de ligación en dos tubos de microcentrífuga.
Añadir 3 volúmenes de tampón QG a 1 volumen de gel.
Incubar a 50 °C durante 10 minutos hasta que el pedazo de gel se haya disuelto por completo. Añadir a la muestra isopropanol correspondiente a 1 volumen de gel y mezclar.
Colocar una columna de centrifugación QIAquick en un tubo de recolección de 2 ml que se proporciona.
Aplicar la muestra a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
Desechar el flujo pasante y volver a colocar la columna QIAquick en el mismo tubo de recolección.
Añadir 0,75 ml de tampón PE a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
Desechar el flujo pasante y centrifugar la columna QIAquick durante 1 minuto adicional a 17 900 x g (13 000 rpm). Colocar la columna QIAquick en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
Añadir 30 j l de tampón EB al centro de la membrana QIAquick y centrifugar la columna durante 1 minuto. Dejar reposar la columna durante 1 minuto y después centrifugar durante 1 minuto.
Combinar el ADN eluido (volumen total de 60 |jl) y aplicar 3 |jl en gel de agarosa al 4 % para QC.
Ligación 7: Dominio variable de LC de longitud completa
1. Preparar las reacciones de ligación en un tubo de microcentrífuga en hielo:
Fragmentos FW1-CDR1-FW2 49 j l
Fragmentos CDR2-FW3-CDR3 49 j l
Tampón de T4 ligasa 10X 12 j l
rATP 10 mM 5 j l
Agua libre de nucleasas QS hasta 345 j l
T4 ligasa 5 j l
Volumen total de reacción 350 j l
2. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una microcentrífuga.
3. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
4. Preparar las siguientes reacciones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml:
Ligaciones de dominio variable de LC de longitud completa 140 j l
Tampón de aplicación de muestra 10x 15 j l Volumen total 155 j l
5. Aplicar en un gel de TAE agarosa al 3 % con bromuro de etidio de 0,5 jg/ml. Usar una escalera de ADN de 100 pb como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón TAE IX.
6. Cortar las bandas correspondientes a los tamaños correctos y purificarlas con el uso del kit de extracción de gel QIAquick.
7. Combinar los fragmentos de gel en un tubo de microcentrífuga.
8. Añadir 3 volúmenes de tampón QG a 1 volumen de gel.
9. Incubar a 50 °C durante 10 minutos hasta que el pedazo de gel se haya disuelto por completo. Añadir a la muestra isopropanol correspondiente a 1 volumen de gel y mezclar.
10. Colocar una columna de centrifugación QIAquick en un tubo de recolección de 2 ml que se proporciona.
11. Aplicar la muestra a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
12. Desechar el flujo pasante y volver a colocar la columna QIAquick en el mismo tubo de recolección.
13. Añadir 0,75 ml de tampón PE a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
14. Desechar el flujo pasante y centrifugar la columna QIAquick durante 1 minuto adicional a 17900 x g (13000 rpm).
15. Colocar la columna QIAquick en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
16. Añadir 30 j l de tampón EB al centro de la membrana QIAquick y centrifugar la columna durante 1 minuto. Dejar reposar la columna durante 1 minuto y después centrifugar durante 1 minuto.
17. Aplicar 3 j l en un gel de agarosa al 3 % para QC.
Apéndice 1: Recetas de tampones
Tampón TAE 50X
• 242 g de Tris base
• 57,1 ml de ácido acético glacial
• 37,2 g de Na2EDTA-2H2O
• Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Tampón TAE IX
• 20 ml de tampón TAE 50X
• 800 ml de H2 O destilada
Gel de agarosa al 3 % con bromuro de etidio
• 3 g de agarosa LE
• 100 ml de tampón TAE IX
• Fundir la agarosa en un horno de microondas y agitar para garantizar una mezcla uniforme
• Enfriar la agarosa a 55 C
• Añadir 2,5 |jl de bromuro de etidio a 20 mg/ml a la agarosa
• Verter sobre una plataforma de gel
Gel de agarosa al 4 % con bromuro de etidio
4 g de agarosa LE
100 ml de tampón TAE IX
Fundir la agarosa en un horno de microondas y agitar para garantizar una mezcla uniforme
Enfriar la agarosa a 55 C
Añadir 2,5 j l de bromuro de etidio a 20 mg/ml a la agarosa
Verter sobre una plataforma de gel
Determinación de las CDR de cadena ligera
El siguiente conjunto de reglas permite la identificación de las CDR en la mayoría de las secuencias de dominio variable de cadena ligera de anticuerpos.
CDR-L1
Inicio: ~ posición 24, siempre 1 después de un residuo de cisteína
Residuos antes: C
Longitud: 10 -17 aminoácidos
Residuos siempre un W, usualmente W-Y-Q, pero también W-L-Q, W-F-después: Q, W-Y-L
CDR-L2
Inicio: siempre 16 residuos después del final de CDR-L1
Residuos antes: usualmente I-Y, pero también V-Y, I-K, I-F
Longitud: siempre 7 aminoácidos
CDR-L3
siempre 33 residuos después del final de CDR-L2 (siempre 2 después de
Inicio: una cisteína)
Residuos antes: siempre C
Longitud: 7-11 residuos
Residuos F-G-X-G (típicamente F-G-Q-G)
después:
Ejemplo 6. Ensayo de p-galactosidasa
Este ejemplo describe el método para medir cuantitativamente los niveles de expresión de p-galatosidasa en células transfectadas con el uso de ONPG como sustrato.
Aspirar el medio de cultivo de la placa de cultivo. Lavar 1 vez con PBS 1x
Añadir tampón de lisis 1x a la placa de cultivo. Usar la siguiente guía de volumen de solución para diversas placas de cultivo:
Figure imgf000046_0001
Incubar la placa 10-15 minutos a temperatura ambiente agitándola lentamente varias veces para garantizar una lisis completa. Observar las placas de cultivo bajo un microscopio para confirmar que las células se lisan por completo.
Nota: Alternativamente, congelar las células durante al menos una hora a -20 °C y descongelar a temperatura ambiente.
Preparar una dilución en serie de los estándares de p-galactosidasa con el tampón de dilución de estándar por separado. Se transfiere una alícuota de 50 j l de cada punto en la curva estándar a los pocillos de control de la placa de ensayo. La cantidad más alta recomendada de p-galactosidasa es de 200 miliunidades (200000-400000 pg). Diluir los estándares de acuerdo con la guía a continuación: Guía de dilución de estándares de p-gal
Figure imgf000047_0001
Nota 1: A justar la curva estándar para adaptarla a las condiciones experimentales específicas, tales como los tipos de células o el vector plasmídico.
Nota 2: Las diluciones para la curva estándar deben prepararse frescas cada vez que se realiza el ensayo. Añadir 50 j l de cada muestra/pocillo a la placa de ensayo.
Preparar un blanco mediante la adición de 50 j l de tampón de lisis a un pocillo.
Añadir a cada pocillo 100 j l de solución de sustrato ONPG. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta que se desarrolle el color amarillo (de aproximadamente menos de un minuto a 4 horas, en dependencia del tipo de célula). Leer la absorbancia a 405-420 nm con un espectrofotómetro de microtitulación.
Cuantificar la expresión de p-galactosidasa en base a una curva estándar lineal.
Ejemplo 7. Maduración de la afinidad de los anticuerpos
Este protocolo describe el proceso completo para mejorar la afinidad de unión de un anticuerpo al antígeno diana.
Preparación de fragmentos de ADNbc
1. Solicitar oligonucleótidos de IDT (escala 1 jmol, purificados por PAGE, liofilizados y fosforilados en 5 '). 2. Centrifugar los oligos liofilizados en una microcentrífuga a 12000 x g durante 30 segundos antes de abrir los tubos.
3. Resuspender los oligos en H2O libre de nucleasas a 100 pMol/jl de acuerdo con los datos obtenidos de IDT 4. Incubar a 37 °C durante 30 min en un equipo thermomixer a 1000 RPM.
5. Centrifugar los oligos resuspendidos en una microcentrífuga a 12000 x g durante 30 segundos.
6. Combinar 75 j l de cebadores directos e inversos coincidentes en tubos de PCR de pared delgada (o placas de PCR de 96 pocillos)
7. Aparear los oligonucleótidos en un termociclador con el uso del siguiente perfil de temperatura:
5' a 94 °C ^ 5' a 90 °C ^ 5' a 85 °C ^ 5' a 80 °C ^ 5' a 75 °C ^ 5' a 70 °C ^ 5' a 65 °C ^ 5' a 60 °C ^ 5' a 55 °C ^ 5' a 50 °C ^ 5' a 45 °C ^ 5' a 40 °C ^ 5' a 35 °C ^ 5' a 30 °C
8. La concentración final para la concentración de fragmentos de ADN apareados es 50 pMol/jl.
9. Almacenar los fragmentos de ADN apareados a -20 °C.
Análisis de control de calidad
1. Para el análisis de QC de los fragmentos de ADNbc (o grupos de fragmentos), preparar las siguientes reacciones en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml:
fragmentos de ADNbc 1 j l
Agua 20 j l
Tampón de aplicación de muestra 1 j l
Total 22 pl
2. Aplicar 10 j l en un gel de TAE agarosa al 4 % con bromuro de etidio a 0,5 jg/m l. Usar una escalera de ADN de 25 pb como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en el tampón TAE IX (consulte el Apéndice 1).
Apéndice 1: Recetas de tampones
Tampón TAE 50X
• 242 g de Tris base
• 57,1 ml de ácido acético glacial
• 37,2 g de Na2EDTA-2H2O
• Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Tampón TAE IX
• 20 ml de tampón TAE 50X
• 800 ml de H2O destilada
DTT 0,1 M
• 1,54 g de DTT
• 10 ml de H2O destilada
• Almacenar en -20 °C
Glicerol al 80 %
• 20 ml de glicerol
• 80 ml de H2O destilada
• Esterilizar en autoclave
Gel de agarosa al 4 % con bromuro de etidio
4 g de agarosa LE
100 ml de tampón TAE IX
Fundir la agarosa en un horno de microondas y agitar para garantizar una mezcla uniforme
Enfriar la agarosa a 55 C
Añadir 2,5 pl de bromuro de etidio a 20 mg/ml a la agarosa
Verter sobre una plataforma de gel
Ejemplo 8. Tamizaje de bibliotecas de anticuerpos completamente humanos
Este ejemplo describe el método para tamizar una biblioteca de anticuerpos completamente humanos presentados en la superficie celular de mamíferos para aislar anticuerpos completamente humanos con alta actividad de unión específica a un antígeno diana con el uso de la combinación de clasificación por citometría de flujo y ELISA.
Análisis de citometría de flujo
El proceso de tamizaje debe optimizarse para cada proyecto de acuerdo con la disponibilidad de antígenos etiquetados y anticuerpos secundarios. Este ejemplo se optimizó para el tamizaje y aislamiento de anticuerpos anti-BioAtla 001 completamente humanos de alta afinidad.
Generar bibliotecas de anticuerpos completamente humanos integradas de manera estable en células de mamíferos. Expandir los clones estables de la biblioteca de anticuerpos completamente humanos antes del análisis de citometría de flujo.
El día del análisis de citometría de flujo, lavar 1 x 107 células con PBS 1x
Desprender las células con medio de desprendimiento de células Detachin y recolectar las células en PBS 1x Centrifugar las células a 3000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante.
Resuspender el sedimento de células en 1 ml de PBS 1x frío y centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos.
Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 500 pl de 2 pg/ml de proteína 001 humana purificada en PBS 1x frío.
Incubar en hielo durante 1 hora mezclando ocasionalmente de manera manual.
Centrifugar las células a 3000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante.
Resuspender el sedimento de células en 1 ml de PBS 1x frío y centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos.
Repetir las etapas 7 y 8.
Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 500 pl de 1 pg/ml de anticuerpo policlonal de conejo anti-001 humana en PBS 1x frío con suero de cabra al 10 %.
Incubar en hielo durante 30 minutos mezclando ocasionalmente de manera manual.
Centrifugar las células a 3000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante.
Resuspender el sedimento de células en 1 ml de PBS 1x frío y centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos.
Repetir las etapas 7 y 8.
Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 500 |jl de anticuerpo de cabra anticonejo conjugado con FITC y anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado con piroeritrina en PBS 1x frío con suero de cabra al 10 %.
Incubar en hielo durante 30 minutos mezclando ocasionalmente de manera manual.
Centrifugar las células a 3000 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante.
Resuspender el sedimento de células en 1 ml de PBS 1x frío y centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos.
Repetir las etapas 7 y 8.
Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 1 ml de PBS 1x frío con suero de cabra al 2 %. Proceder al análisis de citometría de flujo con el uso de Dako MoFlo.
Establecer una ventana de clasificación de modo que incluya el 0,1 % mejor de las células totales en términos de relación de fluorescencia de PE/FITC. Recolectar las células que caen dentro de la ventana de clasificación en placas de 96 pocillos con 100 ml de medio de cultivo.
Recuperación de secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera
1. Expandir los clones de placas de 96 pocillos a placas de 6 pocillos. Cuando las células alcancen el 80 % de confluencia en las placas de 6 pocillos, proceder al aislamiento del ADN genómico con el uso del kit Qiagen DNeasy Tissue.
2. Aspirar el medio de las células. Añadir 500 ml de PBS 1x a cada uno de los 6 pocillos. Raspar las células de la placa con puntas de pipeta estériles. Transferir las células raspadas en PBS a un tubo de microcentrífuga estéril. 3. Centrifugar las células durante 5 minutos a 3000 rpm.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 200 j l de PBS 1x.
5. Añadir 20 j l de proteinasa K y 200 j l de tampón AL a la muestra, mezclar bien por agitación vorticial e incubar a 56 °C durante 10 minutos.
6. Añadir 200 j l de etanol a la muestra y mezclar bien por agitación vorticial.
7. Pipetear la mezcla de la etapa 6 en una columna de centrifugación. Centrifugar a 8000 rpm durante un minuto. Desechar el flujo pasante.
8. Añadir 500 j l de tampón AW1 y centrifugar durante un minuto a 8000 rpm. Desechar el flujo pasante.
9. Añadir 500 j l de tampón AW2 y centrifugar durante 2 minutos a 14000 rpm. Desechar el flujo pasante. Centrifugar nuevamente durante un minuto a 14000 rpm. Asegurarse de que la membrana esté completamente seca.
10. Colocar la columna de centrifugación en un tubo de microcentrífuga estéril y pipetear 200 j l de tampón AE directamente sobre la membrana.
11. Incubar a temperatura ambiente durante un minuto y centrifugar durante un minuto a 8000 rpm para eluir el ADN genómico.
12. Realizar el QC del ADN genómico mediante la preparación de las siguientes reacciones en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml:
ADNg 5 j l
Tampón de aplicación de muestra
10x__________________________ 5 j l
Volumen total 10 pl
Aplicar en un gel de TAE agarosa al 0,8 % con bromuro de etidio a 0,5 jg/ml. Usar una escalera de ADN de 1 kB como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón TAE IX. Los resultados se muestran en la Figura 12.
13. Preparar las siguientes reacciones de PCR en tubos de PCR estériles:
ADNg 1 j l
Mezcla maestra HotStar Taq 2x 12, 5 j l
Cebador directo de dominio variable 0, 5 j l
Cebador inverso de dominio variable 0, 5 j l
H2O 10, 5 j l
Volumen total 25 pl
14. Colocar los tubos de PCR en el termociclador e iniciar el programa de ciclos.
Etapa de activación inicial: 15 minutos, 95 °C
Ciclo de 3 etapas
Desnaturalización: 40 segundos, 94 °C
Apareamiento: 40 segundos, 55 °C
Extensión: 2 minutos, 72 °C
Número de ciclos: 30
Etapa de extensión final: 10 minutos, 72 °C
15. Realizar el QC de las reacciones de PCR mediante la preparación de las siguientes reacciones en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml:
Reacción de PCR 5 pl
Tampón de aplicación de muestra 10x 5 pl
Volumen total 10 pl
Aplicar en un gel de TAE agarosa al 1 % con bromuro de etidio a 0,5 pg/ml. Usar una escalera de ADN de 1 kB como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón TAE IX.
16. Preparar las siguientes reacciones de clonación en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con el uso del kit TOPO 2.1 de Invitrogen:
Reacción de PCR 4 pl
Solución de sales 1 pl
Vector TOPO 1 pl
Volumen total 6 pl
17. Mezclar las reacciones suavemente e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
18. Añadir 2 pl de la reacción de clonación TOPO de la etapa 17 en un vial de E. coli químicamente competente One Shot y mezclar suavemente.
19. Incubar en hielo durante 30 minutos.
20. Aplicar un choque térmico a las células durante 30 segundos a 42 °C.
21. Transferir los tubos a hielo e incubar durante 2 minutos.
22. Añadir 250 pl de medio S.O.C. a temperatura ambiente.
23. Agitar los tubos horizontalmente a 37 °C durante una hora a 200 rpm.
24. Extender 10 pl de la transformación en una placa de LB-carbenicilina recalentada.
25. Incubar la placa durante la noche a 37 °C.
26. Seleccionar 6 clones de cada transformación para la secuenciación.
27. Analizar las secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera. Proceder a la segunda ronda de tamizaje con el uso del método ELISA.
Digestión del vector pBA y clones de anticuerpos completamente humanos con Nhel y AgeI
Preparar las siguientes reacciones de digestión en un tubo de microcentrífuga en hielo:
pBAk-LacZ (2 pg) x pl
Tampón NEB 10X x 10 pl
Agua libre de nucleasas QS hasta 97 pl
AgeI (10 U/pl) 3 pl
NheI (10 U/pl) 3 pl
Volumen total de reacción 100 pl
Clones de anticuerpos completamente humanos (5 ug) x pl
Tampón NEB 10X x 10 pl
Agua libre de nucleasas QS hasta 97 pl
AgeI (10 U/pl) 3 pl
NheI (10 U/pl) 3 pl
Volumen total de reacción 100 pl
Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una microcentrífuga
Incubar la reacción a 37 °C durante la noche
Tratamiento con CIP del vector pBA digerido con NheI/AgeI y purificación con el kit de purificación de PCR QIAquick Añadir 2 pl de fosfatasa Apex al tubo de microcentrífuga que contiene la reacción de digestión de pBAk-LacZ. Incubar a 37 °C durante 10 minutos
Calentar a 70 °C durante 5 minutos para inactivar la fosfatasa Apex
Añadir 500 |jl de tampón PBI a la microcentrífuga
Mezclar por agitación vorticial y centrifugación rápida
Aplicar 750 j l a la vez en una columna
Centrifugar a 12 000 x g durante 1 minuto y decantar el líquido del tubo de recolección. Repetir hasta que toda la muestra se haya procesado.
Lavar con 750 j l de tampón PE (¡con etanol añadido!)
Centrifugar a 12000 x g durante 1 minuto y decantar el líquido del tubo de recolección
Volver a colocar la columna en el tubo de recolección y centrifugar nuevamente
Colocar la columna en nuevos tubos de microcentrífuga y eluir con 50 j l de tampón EB.
Purificación a partir de gel de los clones de anticuerpos completamente humanos digeridos con Nhel/Agel
1) Preparar las siguientes reacciones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml:
Clones de anticuerpos completamente humanos digeridos con NheI/SacII 100 j l
Tampón de aplicación de muestra 10x 3 j l
Volumen total 103 pl
2) Aplicar en un gel de TAE agarosa al 1 % con bromuro de etidio a 0,5 jg/ml. Usar una escalera de ADN de 1 kB como estándar. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en tampón TAE IX.
3) Cortar las bandas correspondientes a las regiones variables de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) y purificarlas con el uso del kit de extracción de gel QIAquick.
4) Añadir 3 volúmenes de tampón QG a 1 volumen de gel.
5) Incubar a 50 °C durante 10 minutos hasta que el pedazo de gel se haya disuelto por completo. Añadir a la muestra isopropanol correspondiente a 1 volumen de gel y mezclar.
6) Colocar una columna de centrifugación QIAquick en un tubo de recolección de 2 ml que se proporciona.
7) Aplicar la muestra a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
8) Desechar el flujo pasante y volver a colocar la columna QIAquick en el mismo tubo de recolección.
9) Añadir 0,75 ml de tampón PE a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.
10) Desechar el flujo pasante y centrifugar la columna QIAquick durante 1 minuto adicional a 17900 x g (13000 rpm).
11) Colocar la columna QIAquick en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
12) Añadir 52 j l de tampón EB al centro de la membrana QIAquick y centrifugar la columna durante 1 minuto. Dejar reposar la columna durante 1 minuto y después centrifugar durante 1 minuto.
Ligación del dominio variable de HC y LC completamente humano en el vector pBAk-LacZ digerido con NheI/AgeI
Preparar la siguiente reacción de ligación en un tubo de microcentrífuga en hielo:
pBAk-LacZ-NheI/AgeI (100 ng) x pl
Dominio variable de HC y LC completamente humano y pl
Tampón de T4 ligasa 5X 4 pl
Agua libre de nucleasas QS hasta 19 pl
T4 ligasa (2000 U/pl) 1 pl
Volumen total de reacción 20 pl
Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una microcentrífuga
Incubar a temperatura ambiente durante 2 horas o 16 °C durante la noche
Transformar cada una de las mezclas de reacción de ligación en células de E. coli supercompetentes BioAtla Enfriar previamente en hielo tubos de fondo redondo de polipropileno BD Falcon de 14 ml. Preparar el medio SOC a 42 °C
Descongelar las células supercompetentes BioAtla en hielo. Cuando se descongelen, mezclar suavemente y preparar alícuotas de 100 ul de células en cada uno de los tubos preenfriados.
Añadir 1,7 pl de p-mercaptoetanol a cada alícuota de células. Incubar las células en hielo durante 10 minutos, con agitación suave cada 2 minutos.
Añadir 2 j l de la mezcla de reacción de ligación a una alícuota de células. Golpear los tubos suavemente. Incubar los tubos en hielo durante 30 minutos.
Aplicar un pulso de calor a los tubos en un baño de agua a 42 °C durante 45 segundos.
Incubar los tubos en hielo durante 2 minutos
Añadir 900 ul de medio SOC precalentado e incubar los tubos a 37 °C durante 1 hora con agitación a 225-250 rpm. Sembrar 20 pl y 200 pl de la mezcla de transformación en placas de LB agar que contienen carbenicilina.
Incubar las placas a 37 °C durante la noche.
Contar las colonias en las placas y seleccionar 6 colonias para el tamizaje por PCR y la secuenciación.
Seleccionar un clon con la secuencia correcta, preparar el ADN plasmídico y proceder a la transfección en células 293F.
Transfección de células 293F
Una semana antes de la transfección, transferir las células 293F a un cultivo en monocapa en medio Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM) complementado con suero.
Un día antes de la transfección, sembrar 0,1 x 105 células en 100 pl de D-MEM complementado con suero por muestra de transfección en formatos de 96 pocillos.
Para cada muestra de transfección, preparar complejos de ADN-Lipofectamina.
Diluir 0,2 pg de ADN en 50 ml de medio Opti-MEM con suero reducido. Mezclar suavemente.
Diluir 0,125 pl de Lipofectamina en 50 pl de medio Opti-MEM con suero reducido. Mezclar suavemente e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
Combinar el ADN diluido con la Lipofectamina diluida. Mezclar suavemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
Añadir los 100 pl de complejos de ADN-Lipofectamina a cada pocillo que contiene células y medio. Mezclar suavemente mediante balanceo de la placa hacia adelante y hacia atrás.
Incubar las células a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %.
Añadir a cada pocillo 100 pl de D-MEM complementado con suero después de 6 horas. Incubar las células a 37 °C durante la noche en una incubadora de CO2 al 5 %.
Aspirar el medio en cada pocillo. Lavar cada pocillo con 100 pl de 293 SFM II con L-Glutamina 4 mM. Añadir a cada pocillo 100 pl de 293 SFM II con L-Glutamina 4 mM.
Recolectar el sobrenadante para ELISA a las 96 horas después de la transfección.
ELISA funcional
Recubrir placas Nunc-Immuno Maxisorp de 96 pocillos con 100 pl de antígeno a 2 pg/ml en solución de recubrimiento.
Cubrir las placas con selladores e incubar durante la noche a 4 C.
ELISA de cuantificación
2. Recubrir placas Nunc-Immuno Maxisorp de 96 pocillos con 100 pl de anti-IgG humana de cabra específico de Fc a 10 pg/ml purificado por afinidad en solución de recubrimiento.
3. Cubrir las placas con selladores e incubar durante la noche a 4 C.
ELISA funcional
4. Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
5. Añadir 200 pl de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
7. Añadir 200 pl de solución de bloqueo. Agitar a 200 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente.
8. Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
9. Añadir a las placas duplicados de 100 pl/pocillo de anticuerpo de control (2 pg/ml) en solución de bloqueo. 10. Añadir a las placas duplicados de 100 pl de sobrenadante de la transfección.
11. Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
12. Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
13. Añadir 200 pl de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
14. Repetir 3 veces las etapas 11-12.
15. Añadir a cada pocillo 100 pl de dilución 1:5000 de anticuerpo antihumano de cabra purificado por afinidad conjugado con HRp en solución de bloqueo.
16. Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
17. Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
18. Añadir 200 pl de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
19. Repetir 3 veces las etapas 17-18.
20. Añadir a cada pocillo 100 pl de sustrato TMB de Sigma. Incubar a temperatura ambiente y comprobar cada 2­ 5 minutos.
21. Añadir 100 pl de HCl 1 N para detener la reacción.
22. Leer a 450 nm.
ELISA de cuantificación
i. Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
ii. Añadir 200 pl de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
iii. Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
iv. Añadir 200 j l de solución de bloqueo. Agitar a 200 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente.
v. Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
vi. Añadir a las placas duplicados de 100 jl/pocillo de concentración estandarizada de IgG sérica humana purificada en solución de bloqueo.
vii. Añadir a las placas duplicados de 100 j l de sobrenadante de la transfección.
viii. Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
ix. Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
x. Añadir 200 j l de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
xi. Repetir 3 veces las etapas 11-12.
xii. Añadir a cada pocillo 100 j l de dilución 1:5000 de anticuerpo antihumano de cabra purificado por afinidad conjugado con HRP en solución de bloqueo.
xiii. Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.
xiv. Decantar las placas y eliminar el líquido residual por golpeo.
xv. Añadir 200 j l de solución de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
xvi. Repetir 3 veces las etapas 17-18.
xvii. Añadir a cada pocillo 100 j l de sustrato TMB de Sigma. Incubar a temperatura ambiente y comprobar cada 2-5 minutos.
xviii. Añadir 100 j l de HCl 1 N para detener la reacción.
xix. Leer a 450 nm.
Apéndice 1: Recetas de tampones
PBS 1x con suero de cabra al 2 %
• 2 ml de suero de cabra
• 98 ml de PBS 1x
Tampón TAE 50X
• 242 g de Tris base
• 57,1 ml de ácido acético glacial
• 37,2 g de Na2EDTA-2H2O
• Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Tampón TAE IX
• 20 ml de tampón TAE 50X
• 800 ml de H2 O destilada
Gel de agarosa al 0,8 % con bromuro de etidio
0,8 g de agarosa LE
100 ml de tampón TAE IX
Fundir la agarosa en un horno de microondas y agitar para garantizar una mezcla uniforme
Enfriar la agarosa a 55 °C
Añadir 2,5 j l de bromuro de etidio a 20 mg/ml a la agarosa
Verter sobre una plataforma de gel
Gel de agarosa al 1 % con bromuro de etidio
1 g de agarosa LE
100 ml de tampón TAE IX
Fundir la agarosa en un horno de microondas y agitar para garantizar una mezcla uniforme
Enfriar la agarosa a 55 °C
Añadir 2,5 j l de bromuro de etidio a 20 mg/ml a la agarosa
Verter sobre una plataforma de gel
LB
10 g de NaCl
10 g de triptona
5 g de extracto de levadura
Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 5 N
Esterilizar en autoclave
Agar LB-carbenicilina
10 g de NaCI
10 g de triptona
5 g de extracto de levadura
• 20 g de agar
Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 5 N
Esterilizar en autoclave
Enfriar a 55 °C
Añadir 10 ml de 10 mg/ml de carbenicilina esterilizada por filtración
Verter en placas Petri (placa de 25 ml/100 mm)
Medio SOC
0,5 g de NaCl
20 g de triptona
0,5 g de extracto de levadura
2 ml de glucosa al 20 % esterilizada por filtración
Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Esterilizar en autoclave
Añadir 10 ml de MgCh 1 M esterilizado por filtración y 10 ml de MgSOs 1 M esterilizado por filtración antes de usar Solución de lavado
• Tween-20 al 0,05 % en PBS
Solución de bloqueo
• Leche descremada Carnation al 2 % en PBS
Ejemplo 9. Desarrollo de sinergia
Este ejemplo describe el método para crear cambios de aminoácidos específicos en un constructo de expresión de proteínas e identificar posiciones y mutaciones que no afectan el rendimiento/actividad de la proteína diana.
Usar CPE para crear mutaciones de los 19 aminoácidos individuales en la molécula diana en las posiciones 2 - n (n= residuo C-terminal de la molécula) o cualquier otro rango o posiciones definidos.
Seleccionar 96 clones/codón en placas de pocillos profundos que contienen 1200 pl de LB con el antibiótico apropiado (específico del constructo del proyecto/de expresión). Sellar las placas y cultivar durante la noche a 37 °C, con agitación a 225 RPM.
Replicar las placas cultivadas durante la noche en placas de 96 pocillos nuevas, cultivar durante la noche a 37 °C. Purificar a escala minipreparativa el ADN plasmídico de los cultivos nocturnos (kit minipreparativo de Qiagen para 96 pocillos sin endotoxina).
Preparar reservas en glicerol a partir de los cultivos nocturnos (placas de réplica).
Transfectar los clones en células HEK293F.
Recolectar el sobrenadante para el ELISA cuantitativo y el ELISA funcional específico del proyecto.
Apéndice 1: Recetas de tampones
Tampón TAE 50X
242 g de Tris base
• 57,1 ml de ácido acético glacial
37,2 g de Na2EDTA-2H2O
Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Tampón TAE IX
• 20 ml de tampón TAE 50X
• 800 ml de H2O destilada
Gel de agarosa al 1 % con bromuro de etidio
1 g de agarosa LE
100 ml de tampón TAE IX
Fundir la agarosa en un horno de microondas y agitar para garantizar una mezcla uniforme
Enfriar la agarosa a 55 °C
Añadir 2,5 j l de bromuro de etidio a 20 mg/ml a la agarosa
Verter sobre una plataforma de gel
LB
10 g de NaCl
10 g de triptona
5 g de extracto de levadura
Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 5 N
Esterilizar en autoclave
Agar LB-carbenicilina
10 g de NaCl
10 g de triptona
5 g de extracto de levadura
20 g de agar
Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 5 N
Esterilizar en autoclave
Enfriar a 55 °C
Añadir 10 ml de 10 mg/ml de carbenicilina esterilizada por filtración
Verter en placas Petri (placa de 25 ml/100 mm)
Medio SOC
0,5 g de NaCl
20 g de triptona
0,5 g de extracto de levadura
2 ml de glucosa al 20 % esterilizada por filtración
Añadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro
Esterilizar en autoclave
Añadir 10 ml de MgCh 1 M esterilizado por filtración y 10 ml de MgSO41 M esterilizado por filtración antes de usar
Ejemplo 10. Generación y tamizaje de una biblioteca de variantes de codones de Fc para una expresión óptima de anticuerpos
El presente ejemplo proporciona métodos para generar una biblioteca de variantes de codones de Fc y métodos de tamizaje para obtener variantes de Fc optimizadas para la expresión mejorada en las células huésped productoras en comparación con la forma parental del polipéptido de Fc.
A. Diseño y construcción de una biblioteca de variantes de codones de Fc
Para cada codón en el área diana (en este caso, la parte Fc de la molécula de IgG1 humana) se diseña un par de cebadores redundantes (directo e inverso) que incluye el codón diana y 20 bases en cada lado. La 3ra posición del codón diana (posición oscilante) contiene bases mixtas (Tabla 3) que permiten la generación de todas las mutaciones silentes en la posición diana con el uso del mismo codón (ejemplo A). Se diseña un segundo conjunto de cebadores redundantes para la misma posición de codón si el aminoácido correspondiente puede ser codificado por otro codón (ejemplo B). Los cebadores redundantes directos e inversos correspondientes se mezclan 1:1, se aparean a la plantilla y se extienden hasta productos de longitud completa mediante desplazamiento de la cadena con el uso de una ADN polimerasa termoestable. La plantilla se digiere con Dpnl y los productos de extensión de longitud completa se transforman en E. coli. Se secuencian hasta 12 colonias por reacción de mutagénesis. Los mutantes con secuencia confirmada se distribuyen en placas de 96 pocillos y se almacenan en glicerol. Las reservas de glicerol se usan para la purificación a escala minipreparativa del ADN plasmídico para la transfección en células de mamífero y el tamizaje.
Tabla 3: Códigos para bases redundantes en oligos sintéticos
Figure imgf000056_0001
Ejemplo A: codón diana = CCC (prolina)
^ cebador directo: CCD, cebador inverso: HGG
Ejemplo B; codón diana = TCG (serina)
^ cebador directo1: TCH, cebador inverso1: DGA
^ cebador directo2: AGY, cebador inverso2: RCT
No se muestran las 20 bases que flanquean el codón diana. Longitud total del cebador: 43 bases.
B. Expresión y tamizaje basado en ELISA de la biblioteca de variantes de codones de Fc
Los clones de la biblioteca de variantes de codones de Fc se transfectaron en una línea de células de mamífero. Se produjeron IgG de longitud completa y se secretaron al medio. Los sobrenadantes de las variantes de codones de Fc expresadas se tamizaron para detectar un nivel de expresión de IgG más alto que el del clon parental con el uso del ensayo ELISA. Los datos de ELISA se normalizaron con un ensayo de beta-galactosidasa que mide la eficiencia de la transfección. Los mejores éxitos identificados en el tamizaje primario se volvieron a transfectar y se volvieron a tamizar tres veces para confirmar el aumento del nivel de expresión. La Figura 3 muestra el nivel de expresión de IgG de las seis variantes de Fc de mayor éxito (las seis barras a la derecha) que se expresan a un nivel más alto en una línea de células de mamífero en comparación con el constructo de tipo silvestre de Fc parental (la barra a la izquierda).
Ejemplo 11. Desarrollo interespecies
El desarrollo posicional integral (CPE) de acuerdo con el protocolo en los ejemplos anteriores se realizó a las CDR de una plantilla de anticuerpo humanizado BA202. BA202 demostró unirse específicamente a un antígeno humano particular ("HA202"). HA202 tiene un ortólogo de ratón con -79 % de identidad de secuencia. El ortólogo del ratón se denomina "MA202". Después del CPE, se realizaron las siguientes etapas con el uso de los protocolos proporcionados en la presente descripción:
1. Los mutantes de CPE se transfectaron en células CHO;
2. Se recolectó el sobrenadante;
3. Los ELISA de afinidad se realizaron como se describe a continuación con el uso de placas de 96 pocillos recubiertas con MA202;
4. Se identificaron los clones positivos;
5. Los ELISA de afinidad de titulación se realizaron tal como se publicaron con el uso de placas de 96 pocillos recubiertas con HA202 y MA202;
6. Se identificaron los clones que se unen a MA202 y retienen la actividad de unión a HA202.
Ejemplo 12. Generación de anticuerpos cruzados en ratón
En este ejemplo, se mutó un anticuerpo plantilla con el uso del protocolo CPE™ de la presente descripción para generar una biblioteca de anticuerpos mutantes. De la biblioteca, se identificaron 33 anticuerpos mutantes que mostraron actividad de unión en un ortólogo de ratón. Los 33 anticuerpos mutantes de CPE™ y la plantilla (como controles) se transfectaron en células CHO. Los sobrenadantes de los cultivos de células CHO se recolectaron a las 48 horas después de la transfección. La concentración de anticuerpos en los sobrenadantes se determinó por ELISA de cuantificación con el uso de IgG humana como estándar. Para medir la actividad de unión del anticuerpo en una proteína de ratón, los sobrenadantes que contienen los 33 anticuerpos mutantes de CPE™ y el anticuerpo plantilla se diluyeron con un esquema de dilución en serie doble que inicia a 500 ng/ml. Las diluciones en serie se incubaron con 2 |jg/ml de los pocillos recubiertos con proteína de ratón. El anticuerpo unido se detectó con anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Las reacciones se detuvieron con HCl 1 N después de añadir tetrametilbencidina (TMB). El valor de OD 450 nm de las reacciones se midió con el instrumento SPECTRAmax Plus de Molecular Device. Los valores de OD450 nM se representan en el eje y, y los números de ID de los clones se indican en el eje x (Figura 10).
En una prueba independiente, los sobrenadantes que contienen los 33 anticuerpos mutantes de CPE™ y el anticuerpo plantilla se diluyeron de manera similar con un esquema de dilución en serie doble que inicia a 500 ng/ml. Las diluciones en serie se incubaron con 1 ug/ml del ortólogo humano de los pocillos recubiertos con proteína de ratón. El anticuerpo unido se detectó con anti-IgG humana conjugado con HRP. Las reacciones se detuvieron con HCl 1 N después de añadir TMB a los pocillos. El valor de OD 450 nm de las reacciones también se midió con el instrumento SPECTRAmax Plus de Molecular Device (Figura 11).

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar un anticuerpo mutante interespecies a partir de un anticuerpo plantilla de una especie, en donde el anticuerpo plantilla muestra una actividad en una primera diana de la especie y el anticuerpo plantilla tiene seis regiones determinantes de complementariedad que comprenden n residuos de aminoácidos, el método comprende las etapas de:
i. generar una biblioteca de n conjuntos independientes de anticuerpos mutantes a partir del anticuerpo plantilla, cada conjunto comprende anticuerpos mutantes que tienen un número X de residuos de aminoácidos predeterminados diferentes en una única posición predeterminada de una de las seis regiones determinantes de complementariedad; en donde cada conjunto de anticuerpos mutantes difiere en la única posición predeterminada; y el número de anticuerpos mutantes diferentes generados es equivalente a n x X;
ii. seleccionar los anticuerpos mutantes que muestran la actividad en un ortólogo de la primera diana en otra especie; y
iii. tamizar los anticuerpos mutantes seleccionados para detectar un anticuerpo mutante interespecies que muestra la actividad en la primera diana.
2. El método de la reivindicación 1, en donde X es 19 residuos de aminoácidos.
3. El método de la reivindicación 1, en donde cada conjunto de anticuerpos mutantes se genera mediante la incorporación de N,N,N en la posición de codón predeterminada en un polinucleótido que codifica el anticuerpo plantilla.
4. El método de la reivindicación 1, en donde la especie es humana.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la otra especie se selecciona de rata, ratón, conejo, hámster, cobaya, mono, perro, gato y primates no humanos.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la especie es una especie no humana seleccionada de rata, ratón, conejo, hámster, cobaya, mono, perro, gato y primates no humanos.
7. El método de la reivindicación 1, en donde la otra especie es una especie no humana seleccionada de rata, ratón, conejo, hámster, cobaya, mono, perro, gato y primates no humanos.
8. El método de la reivindicación 1, en donde la especie y la otra especie son diferentes y se seleccionan independientemente de rata, ratón, conejo, hámster, cobaya, mono, perro, gato y primates no humanos.
9. El método de la reivindicación 1, en donde la biblioteca de n conjuntos independientes de anticuerpos mutantes se expresa en un huésped de producción celular eucariota.
10. El método de la reivindicación 9, en donde el huésped de producción celular eucariota es un huésped de producción celular mamífero.
11. El método de la reivindicación 10, en donde el huésped de producción celular mamífero se selecciona de células fibroblásticas de ratón 3T3; células fibroblásticas de hámster sirio BHK21; células epiteliales de perro, MDCK; células epiteliales humanas Hela; células epiteliales de rata canguro PtK1; células plasmáticas de ratón SP2/0; y células plasmáticas de ratón NS0; células renales embrionarias humanas HEK 293; células renales de mono COS; células de ovario de hámster chino CHO, CHO-S; células embrionarias de ratón R1; células embrionarias de ratón E14.1; células embrionarias humanas H1; células embrionarias humanas H9; y células embrionarias humanas PER C.6.
12. El método de la reivindicación 10, en donde el huésped de producción celular mamífero es una célula GS-NS0 o una célula GS-CHOK1.
13. El método de la reivindicación 9, en donde la biblioteca de n conjuntos independientes de anticuerpos mutantes se expresa con el uso de presentación en la superficie celular en el huésped de producción celular eucariota.
14. El método de la reivindicación 13, en donde la presentación en la superficie celular es una presentación en la superficie celular de levadura.
15. El método de la reivindicación 13, en donde la presentación en la superficie celular es una presentación en la superficie celular de mamífero.
16. El método de la reivindicación 9, que comprende además una etapa de producción del anticuerpo mutante en el mismo huésped de producción celular eucariota que se usó en la etapa de expresión.
17. El método de la reivindicación 3, en donde la posición de codón predeterminada está en una región determinante de complementariedad.
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