ES2817925T3

ES2817925T3 - Vacuna de ADN que contiene un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2

Info

Publication number: ES2817925T3
Application number: ES13832772T
Authority: ES
Inventors: Hironori Nakagami; Mariko Kyutoku; Ryuichi Morishita; Hideki Tomioka
Original assignee: Osaka University NUC; Anges MG Inc
Current assignee: Osaka University NUC; Anges Inc
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2021-04-08
Anticipated expiration: 2033-08-28
Also published as: EP2891497A1; US10543261B2; JPWO2014034735A1; KR102205077B1; CN104768575B; EP2891497A4; HK1210433A1; KR20150070116A; HK1210600A1; US20150202271A1; CN104768575A; JP6422022B2; JP2018138573A; EP2891497B1; WO2014034735A1

Abstract

Un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico con una inserción para uso en el tratamiento o la profilaxis del cáncer, en donde la inserción es una secuencia de aminoácidos de hasta 80 aminoácidos de longitud que comprende un epítopo específico de VEGF o de angiopoyetina-2, en donde la secuencia de aminoácidos que comprende el epítopo específico está insertada entre los restos de aminoácidos 80 y 81 del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B, en donde el epítopo específico de VEGF consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 32 o 33, o una secuencia parcial de la misma que tiene 13 o más aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 31, y en donde el epítopo específico de angiopoyetina-2 consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna de ADN que contiene un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2 Campo Técnico

La presente invención se refiere a una vacuna de ADN eficaz para el tratamiento o la profilaxis del cáncer.

Antecedentes de la Técnica

Para que un tumor crezca, es necesario aumentar la cantidad de vasos sanguíneos que transportan nutrientes y oxígeno al tumor en función del crecimiento del tumor. Se considera que las células tumorales inducen la angiogénesis de los vasos sanguíneos del tumor secretando ellos mismos factores de crecimiento vascular que estimulan el crecimiento de las células endoteliales vasculares en los vasos sanguíneos vecinos. Por lo tanto, se han realizado intentos para tratar o prevenir tumores inhibiendo la función de factores de crecimiento vascular y suprimiendo la angiogénesis tumoral. Como uno de los métodos de este tipo ha atraído la atención la terapia con vacuna que fija como objetivo factores relacionados con la angiogénesis tumoral. En la terapia con vacunas, el cáncer se trata o previene administrando un factor relacionado con la angiogénesis tumoral, un epítopo contenido en el factor o un vector de expresión que los codifica a pacientes con cáncer o dianas con riesgo de desarrollar un cáncer para inducir un anticuerpo contra el factor relacionado con la angiogénesis tumoral en el cuerpo de los pacientes, neutralizando con ello la función del factor y suprimiendo la angiogénesis tumoral. Como factor relacionado con la angiogénesis tumoral se conocen diversos factores, tales como VEGF, angiopoyetina, FGF, PDGF, y similares.

Por ejemplo, el documento de patente 1 describe un método de inhibir la proliferación de células endoteliales vasculares en el microentorno de un tumor, previniendo la angiogénesis e inhibiendo el crecimiento y la metástasis del tumor, al administrar una vacuna de ADN que codifica el receptor-1 de VEGF, el receptor-2 de VEGF o Flk-1. El documento de patente 2 describe la supresión de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, particularmente el desarrollo y la metástasis del cáncer, utilizando vacunas de VEGF heterólogas.

Sin embargo, se ha establecido generalmente la tolerancia inmunitaria a factores tales como el VEGF y similares, ya que estos factores son los componentes propios del paciente. Por lo tanto, incluso cuando estos factores o péptidos parciales de los mismos se administren directamente a pacientes, es difícil inducir eficazmente anticuerpos contra estos factores en el cuerpo de los pacientes. Por lo tanto, es necesaria alguna idea técnica para reconocer estos auto-antígenos en el sistema inmunológico del paciente, induciendo con ello la producción de los anticuerpos contra ellos.

La proteína del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B (HBc) constituye partículas del núcleo esféricas mediante el auto-ensamblaje. Las partículas del núcleo tienen una inmunogenicidad muy alta. Cuando se utiliza un polipéptido de fusión, obtenido mediante inserción de un epítopo deseado en un sitio particular de la proteína del antígeno del HBc o conectando un epítopo deseado al extremo de la proteína del antígeno de1HBc, el epítopo se presenta en la superficie de las partículas formadas por auto-ensamblaje. Utilizando el polipéptido de fusión, el epítopo insertado es reconocido fácilmente por el sistema inmunológico y la producción de los anticuerpos que reconocen el epítopo puede inducirse de manera eficiente. Por lo tanto, utilizando la proteína del antígeno de1HBc como una plataforma de la vacuna, se han realizado intentos para inducir la producción del anticuerpo, incluso a pesar de ser difícil de que un antígeno sea reconocido por el sistema inmunológico (documento no patente 1 y documento no patente 2).

El documento de patente 3 describe partículas compuestas por una proteína del antígeno de1HBc quimérico que contiene una secuencia de aminoácidos exógena que tiene un epítopo, en donde la secuencia de aminoácidos exógena está insertada entre los restos de aminoácidos 80-81 del antígeno de1HBc. El documento de patente 4 describe una vacuna contra el cáncer, que comprende la proteína del antígeno de1HBc unida de forma no covalente a un plásmido que porta un VEGF mutado.

Sin embargo, la eficacia de las vacunas contra el factor relacionado con la angiogénesis tumoral no es lo suficientemente satisfactoria.

[Lista de Documentos]

[documentos de patente]

documento de patente 1: JP-A-2005-519092

documento de patente 2: Publicación de patente china N° 1406629

documento de patente 3: JP-B-3228737

documento de patente 4: WO 2003/086450

[documentos no patente]

documento no patente 1: D. C. Whitacre et al., Expert Rev.Vaccines, vol. 8, n° 11, págs. 1565-1573, 2009 documento no patente 2: B. E. Clarke et al., Nature, vol. 330, págs. 381-384, 1987

Sumario de la invención

Problemas a resolver por la invención

Tal como se describe en el documento de patente 1, cuando el receptor de VEGF se utiliza como un antígeno de vacuna, dado que la diana a ser atacada por la vacuna es una célula endotelial vascular o una parte de las células cancerosas que expresan el receptor de VEGF, se exhibe un efecto antitumoral al suprimir la angiogénesis en el tumor potenciando la inmunidad citotóxica. Sin embargo, dado que el receptor de VEGF es expresado no solo en células endoteliales neovasculares del tejido tumoral, sino también en células endoteliales vasculares normales, cuando se utiliza el receptor de VEGF como un antígeno de vacuna, se puede ejercer una influencia adversa sobre la función normal de los vasos sanguíneos.

Por consiguiente, la presente invención pretende proporcionar una vacuna superior para el tratamiento o la profilaxis del cáncer, que fija como objetivo un factor relacionado con la angiogénesis tumoral y tiene un riesgo reducido de una influencia adversa sobre la función normal de los vasos sanguíneos.

Medios para Resolver los Problemas

Los autores de la presente invención han realizado intensos estudios y han encontrado que la administración de un vector de expresión del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico, obtenido al insertar un epítopo específico de factores humorales, tales como VEGF o angiopoyetina-2, entre los restos de aminoácidos 80 y 81 del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B, induce predominantemente inmunidad humoral a los factores humorales y permite el tratamiento o la profilaxis del cáncer al suprimir eficazmente la angiogénesis tumoral, al tiempo que evita una influencia adversa sobre la función normal de los vasos sanguíneos debido a la inmunidad mediada por células. Basados en estos hallazgos, realizaron más estudios y completaron la presente invención.

Es decir, la presente invención se refiere a lo siguiente.

[1] Un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico con una inserción para uso en el tratamiento o la profilaxis del cáncer, en donde la inserción es una secuencia de aminoácidos de hasta 80 aminoácidos de longitud que comprende un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2, en donde la secuencia de aminoácidos que comprende el epítopo específico está insertada entre los restos de aminoácidos 80 y 81 del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B, en donde el epítopo específico de VEGF consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 32 o 33, o una secuencia parcial de la misma que tiene 13 o más aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 31, y en donde el epítopo específico de angiopoyetina-2 consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3.

[2] El vector de expresión para uso de acuerdo con [1], en donde el cáncer es un cáncer sólido.

[3] El vector de expresión para uso de acuerdo con [1] o [2], en donde el tumor sólido es de cualquier tipo seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de útero y cáncer de próstata.

[4] El vector de expresión para uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3], en donde la inserción es una secuencia de aminoácidos que comprende el epítopo específico de VEGF definido en [1].

[5] El vector de expresión para uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3], en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o 2.

[6] El vector de expresión para uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3], en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3.

[7] El vector de expresión para uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] - [6], en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende, además, uno o más epítopos específicos.

[8] El vector de expresión para uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] - [7], en donde el vector de expresión se administra varias veces.

[9] El vector de expresión para uso de acuerdo con [8], en donde el vector de expresión se administra 2, 3 o 4 veces.

[10] El vector de expresión para uso de acuerdo con [9], en donde el vector de expresión se administra 3 veces.

[11] El vector de expresión para uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] - [10], en donde el vector de expresión se administra 3 veces a intervalos de medio año.

[12] Un vector de expresión para uso de acuerdo con [1], en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende SEQ ID NO: 1 o 2, y el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de útero o cáncer de próstata.

[13] Un vector de expresión para uso de acuerdo con [1], en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende SEQ ID NO: 3, y el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de útero o cáncer de próstata.

[14] El vector de expresión para uso de acuerdo con [12] o [13], en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende uno o más epítopos específicos.

Efecto de la invención

La presente invención proporciona una vacuna superior para el tratamiento o la profilaxis del cáncer, que fija como objetivo un factor relacionado con la angiogénesis tumoral y tiene un riesgo reducido de una influencia adversa sobre la función normal de los vasos sanguíneos.

Dado que la vacuna de la presente invención induce predominantemente inmunidad humoral contra factores humorales tales como VEGF y angiopoyetina-2, en lugar de la inmunidad mediada por células, se puede reducir el riesgo de una influencia adversa de la inmunidad mediada por células sobre la función normal de los vasos sanguíneos.

Además, dado que el VEGF y la angiopoyetina-2 son proteínas secretadas, la inflamación del tejido no se desarrolla fácilmente, ya que un anticuerpo inducido por la vacunación se une principalmente a las proteínas secretadas en la sangre.

Breve Descripción de los Dibujos

La Fig. 1 muestra el efecto de la vacunación sobre el crecimiento de tejidos tumorales. El eje vertical muestra el volumen de tejidos tumorales y el eje horizontal muestra los días después de la inyección del tumor.

La Fig. 2 muestra el efecto de la vacunación sobre la tasa de supervivencia de ratones a los que se inyectó tumor. El eje vertical muestra la tasa de supervivencia y el eje horizontal muestra el número de días después de la inyección del tumor.

La Fig. 3 muestra restos de estructura en la interfaz VEGF-bevacizumab. Rojo: resto en la superficie de unión con bevacizumab. Amarillo: restos de Rojo de especial importancia. Azul: restos en la superficie de unión con VEGFR-1. Verde: restos en la superficie de unión con VEGFR-2. Cada uno de los restos está representado por códigos de una sola letra.

La Fig. 4 muestra la evolución en el tiempo de la vacunación con ADN. La vacunación se llevó a cabo inicialmente utilizando ratones de 6 semanas de edad (0w), y vacunaciones posteriores se administraron 2, 4 y 8 semanas después de la primera vacunación.

La Fig. 5 muestra títulos de anticuerpos anti-VEGF a las 16 semanas. Se cuantificaron títulos de IgG totales para VEGF en sueros de ratones (dilución de 100) inmunizados con HBc-mVEGF (7 a.a.), HBc-mVEGF (13 a.a.), HBc-mVEGF (17 a.a.) o HBc, respectivamente. Los datos se muestran como media ± EMT.

La Fig. 6 muestra la construcción de ADN plasmídico de la vacuna. (a) Mapas de plásmidos de pcDNA3.1-HBc (vector de control) y pcDNA3.1-HBc-mVEGF (13 a.a.) (vector de vacunación). HBc indica la secuencia completa de HBc, HBc-N indica el extremo N de HBc (1-80 a.a.) y HBc-C indica el extremo C de HBc (81-183 a.a.). mVEGF 13 a.a. indica el antígeno para la proteína VEGF de ratón. (b) Información detallada en relación con el diseño del plásmido de la vacuna de VEGF. Los trece aminoácidos (IMRIKPHQSQHIGE) (SEQ ID NO: 1), que sirvieron como un antígeno para VEGF y los enlazadores (enlazadores dipeptídicos I-T N-terminales y tripéptido GAT C-terminal), se diseñaron condensados en marco a VEGF para permitir la flexibilidad en la conformación del epítopo de VEGF cuando la superficie se expone a la partícula de HBc. El VEGF de 13 a.a. y los enlazadores están representados por códigos de una sola letra.

La Fig. 7 muestra títulos de anticuerpos anti-VEGF a las 8 semanas. Títulos de IgG totales para VEGF se incrementaron solo en sueros de ratones (dilución de 100) del grupo HBc-mVEGF (13 a.a) (panel izquierdo). La distribución de subtipos de IgG (IgG1, IgG2a e IgG2b) se evaluó también utilizando anticuerpos IgG específicos de los subtipos en sueros de ratones (dilución de 100) del grupo HBc-VEGF (13 a.a.) (panel derecho). Los datos eran media ± EMT. *p < 0,05 frente al control (HBc y solución salina).

La Fig. 8 muestra la unión específica de suero inmunizado a VEGF. El suero inmunizado utilizado como anticuerpo primario en la transferencia Western se unió no solo al mVEGF (13 a.a.) conjugado con BSA, sino también al VEGF de ratón recombinante (rmVEGF). Las muestras de carga eran las siguientes. Pista 1: VEGF-A de ratón recombinante. Pista 2: mVEGF (13 a.a.) conjugado con BSA. Pista 3: péptido de angiopoyetina-2 humana conjugado con BSA como proteína negativa. Se utilizó VG-1, anticuerpo disponible comercialmente contra VEGF, como anticuerpo positivo.

La Fig. 9 muestra el análisis de la transferencia Western de lisados celulares de HUVECs estimulados con mVEGF a razón de 5 ng/mL durante 10 min en presencia de suero inmunizado o de control para p-ERK y ERK total.

La Fig. 10 muestra efectos de suero inmunizado sobre la formación de tubos de HUVECs inducida por VEGF. Placas revestidas con matrigel se sembraron con HUVECs a una densidad de 1x105 células/pocillo y se incubaron en presencia de suero de control o suero inmunizado. Después de 7 horas, se fotografió y cuantificó la red capilar. Se muestran tubos endoteliales representativos. Aumento: 50X.

Los datos se muestran como medias ± EMT por triplicado.

Descripción de Realizaciones

La presente invención proporciona un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico con una inserción para uso en el tratamiento o la profilaxis del cáncer, en donde la inserción es una secuencia de aminoácidos de hasta 80 aminoácidos de longitud que comprende un epítopo específico de VEGF o angiopoyetina-2, en donde la secuencia de aminoácidos que comprende el epítopo específico está insertada entre los restos de aminoácidos 80 y 81 del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B, en donde el epítopo específico de VEGF consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 32 o 33, o una secuencia parcial de la misma que tiene 13 o más aminoácidos que contienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 31, y en donde el epítopo específico de angiopoyetina-2 consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 .El vector de expresión es un agente terapéutico o profiláctico para el cáncer.

Cuando se administra un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico insertado con una secuencia de aminoácidos que contiene un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2, se induce una respuesta inmune (preferiblemente una respuesta inmune humoral tal como la producción de anticuerpos y similares) contra el epítopo específico de VEGF y/o el epítopo específico de angiopoyetina-2 en el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico, y se neutraliza la actividad de VEGF y/o de angiopoyetina-2 con el anticuerpo, con lo cual se puede suprimir la angiogénesis alrededor de los tejidos cancerosos y se puede inhibir el crecimiento del tejido canceroso. Por consiguiente, el cáncer a ser el objetivo del agente terapéutico o profiláctico de la presente invención es preferiblemente un tumor sólido. Ejemplos de cánceres sólidos incluyen, pero no se limitan a cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de útero, cáncer de próstata y similares.

Aunque el cáncer a ser el objetivo del agente terapéutico o profiláctico de la presente invención no está limitado, es preferiblemente un cáncer que expresa VEGF y/o angiopoyetina-2. La presencia o ausencia de expresión de VEGF y/o angiopoyetina-2 en el cáncer se puede confirmar mediante métodos inmunológicos (tinción inmunohistoquímica, transferencia Western, etc.) utilizando un anticuerpo específico contra VEGF y/o un anticuerpo específico contra angiopoyetina-2.

Aunque en la presente invención se pretende el uso de VEGF y angiopoyetina-2 derivados de un mamífero del objetivo de aplicación del agente terapéutico o profiláctico de la presente invención, no se limita al mismo. El objetivo de aplicación del agente terapéutico o profiláctico de la presente invención es un mamífero. Ejemplos de mamíferos incluyen roedores, tales como ratones, ratas, hámsteres, cobayas y similares, lagomorfos, tales como conejos y similares, ungulados, tales como cerdos, ganado bovino, cabras, caballos, ovejas y similares, carnívoros, tales como perros, gatos y similares, primates, tales como seres humanos, monos, Macaca mulatta, Macaca fascicularis, titíes, orangutanes, chimpancés y similares, y similares. El mamífero es preferiblemente un roedor (ratón, etc.) o un primate (ser humano, etc.). Por lo tanto, por ejemplo, cuando se aplica el agente terapéutico o profiláctico de la presente invención a seres humanos, se pretende el uso de VEGF y angiopoyetina-2 derivados de los seres humanos, pero no se limita a los mismos. También, el agente terapéutico o profiláctico de la presente invención se aplica a ratones, se pretende el uso de VEGF y angiopoyetina-2 derivados de ratón, pero no se limita a los mismos. En la presente memoria descriptiva, para un factor X particular (polipéptido o polinucleótido), "factor X derivado del organismo Y" o "factor X del organismo Y" significa que la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico del factor X expresada de forma natural en el organismo Y. "Sustancialmente igual" significa que la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico de interés no tiene menos de 70% (preferiblemente no menos de 80%, más preferiblemente no menos de 90%, aún más preferiblemente no menos de 95%, lo más preferiblemente no menos de 99%) de identidad con la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico del factor X expresada de forma natural en el organismo Y, y se mantiene la función del factor X.

El VEGF y la angiopoyetina-2 son factores angiogénicos conocidos, y también se conocen sus secuencias de aminoácidos y secuencias de ADNc. El VEGF contiene 7 subtipos, incluyendo A, B, C, D, E, PLGF-1 y PLGF-2. Secuencias de aminoácidos representativas incluyen las siguientes y similares.

Tabla 1

Secuencias de aminoácidos representativas de angiopoyetina-2 son las siguientes.

Tabla 2

En la presente memoria descriptiva, "epítopo" se refiere a un elemento básico o unidad mínima de reconocimiento para cada uno de los anticuerpos o receptores de células T, que es un dominio, región o estructura molecular particular al que se une el anticuerpo o receptor de células T antes mencionado.

Un epítopo de VEGF y un epítopo de angiopoyetina-2 a utilizar en la presente invención son específicos para dichos VEGF y angiopoyetina-2. El ser "específico" significa que los productos génicos (excluyendo las regiones variables de la inmunoglobulina y el receptor de células T) distintos del VEGF y la angiopoyetina-2 que se expresan de forma natural en un mamífero del que se deriva el VEGF y la angiopoyetina-2, no contienen dicho epítopo.

El epítopo específico de VEGF en el vector de expresión de la invención consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 32 o 33, o una secuencia parcial de la misma que tiene 13 o más aminoácidos que contienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 31, y el epítopo específico de angiopoyetina-2 en el vector de expresión de la presente invención consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3.

Cuando la secuencia de aminoácidos es demasiado corta, se puede perder la antigenicidad del epítopo. Cuando la secuencia de aminoácidos es demasiado larga, el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico no forma fácilmente partículas del núcleo debido al auto-ensamblaje, como resultado de lo cual se puede no producir un anticuerpo que reconozca específicamente el epítopo, y no se puede obtener un tratamiento superior o efecto de mejora del cáncer.

Ejemplos específicos de epítopos preferibles de VEGF y angiopoyetina-2 incluyen los siguientes.

(VEGF)

(i) IMRIKPHQSQHIG (SEQ ID NO: 1)

(ii) IMRIKPHQGQHIG (SEQ ID NO: 2)

El epítopo de angiopoyetina-2) en el vector de expresión de la invención es el siguiente.

(angiopoyetina-2)

(iii) PQRQNTNKFNGIKWYY (SEQ ID NO: 3)

Un ejemplo de otro epítopo de angiopoyetina-2 es el siguiente.

(iv) YYPQRQNTNKE (SEQ ID NO: 4)

En un aspecto adicional, ejemplos específicos preferibles de VEGF incluyen los siguientes

(v) MRIKPHQ (SEQ ID NO: 31)

(vi) MQIMRIKPHQSQHIGEM (SEQ ID NO: 32)

(vii) MQIMRIKPHQGQHIGEM (SEQ ID NO: 33)

(viii) un epítopo que consiste en una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 32, que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o 31

(ix) un epítopo que consiste en una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33, que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o 31

Las SEQ ID NO: 1, 31 y 32 son secuencias de aminoácidos parciales de VEGF-A de ratón. Las SEQ ID NO: 2, 31 y 34 son secuencias de aminoácidos parciales de VEGF-A humano. Las SEQ ID NO: 3 y 4 son secuencias de aminoácidos parciales de la angiopoyetina-2 humana.

En los (viii) y (ix) arriba mencionados, la longitud de la secuencia parcial es de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoácidos.

El polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B utilizado en la presente invención es

(1) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 6, o

(2) un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que no tiene menos de 90% (preferiblemente no menos de 95%, más preferiblemente no menos de 97%, aún más preferiblemente no menos de 99%) de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 6 y que tiene actividad para formar partículas del núcleo por auto-ensamblaje.

Auto-ensamblaje se refiere a un fenómeno en el que moléculas disueltas en una solución se asocian para formar un conjunto. Partícula del núcleo se refiere a una estructura rígida que tiene una constitución repetitiva específica. En la presente memoria descriptiva, la partícula del núcleo puede ser un producto de etapas de síntesis o un producto de etapas biológicas.

Como polipéptido de la realización de (2), se puede mencionar un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 7 descrita en el documento WO2003/031466. También es preferible como el polipéptido de la realización de (2) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 7, excepto que se han eliminado uno o más restos cisteína de las posiciones 48, 61, 107 y 185 o han sido sustituidas por otros restos de aminoácidos (p. ej., resto serina). Como reconocerán los expertos ordinarios en la técnica, en un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos diferente a la de SEQ ID NO: 7, restos cisteína en posiciones similares también se pueden eliminar o sustituir con otros restos de aminoácidos, y polipéptidos obtenidos por deleciones y sustituciones de este tipo también quedan abarcados en el polipéptido de la realización de (2).

El polipéptido de la realización de (2) abarca también un polipéptido variante, en el que el resto isoleucina en la posición correspondiente a la posición 97 de SEQ ID NO: 7 está sustituido con un resto leucina o un resto fenilalanina (Yuan et al., J. Virol. vol. 73, páginas 10122 - 10128 (1999)). Además, las secuencias de aminoácidos de muchas variantes de HBcAg y varios tipos de variantes de precursores del antígeno del núcleo de la hepatitis B, se han descrito en los informes de GenBank AAF121240, AF121239, X85297, X02496, X85305, X85303, AF151735, X85259, X85286, X85260, X85317, X85298, AF043593, M20706, X85295, X80925, X85284, X85275, X72702, X85291, X65258, X85302, M32138, X85293, X85315, U95551, X85256, X85316, X85296, AB033559, X59795, X8529, X85307, X65257, X85311, X85301, X85314, X85287, X85272, X65319, AB010289, X85285, AB010289, AF121242, M90520, P03153, AF110999 y M95589, y polipéptidos que contienen secuencias de aminoácidos de estas variantes quedan también abarcados en el polipéptido de la realización de (2). Las variantes arriba mencionadas tienen secuencias de aminoácidos diferentes en muchas posiciones, incluyendo restos de aminoácidos presentes en las posiciones 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64, 66, 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121, 126, 130, 133, 135, 141, 147, 149, 157, 176, 178, 182 y 183 en SEQ ID NO:7.

Además, también quedan abarcados en el polipéptido de la realización de (2) polipéptidos que contienen las secuencias de aminoácidos de las variantes de HBcAg descritas en los documentos WO 01/98333, WO 01/77158 y WO 02/14478.

En la presente memoria descriptiva, a no ser que se indique particularmente, las posiciones de los restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B se especifican con la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 6 como patrón. Cuando un polipéptido no contiene la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos del polipéptido se alinea con la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 6, y se adopta la posición del resto de aminoácido correspondiente.

El polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B utilizado en la presente invención es preferiblemente un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 6.

En el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico a utilizar en la presente invención, una secuencia de aminoácidos que comprende un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2 se Inserta entre los restos 80 y 81 del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B. Es decir, el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico a utilizar en la presente invención contiene los siguientes elementos (a) -(c):

(a) restos polipeptídicos parciales del extremo N del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B (que consiste en la secuencia de aminoácidos parcial continua del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B desde el extremo N al resto de aminoácido 80),

(b) una secuencia de aminoácidos que consiste en un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2, y

(c) restos polipeptídicos parciales del extremo C del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B (que consiste en la secuencia parcial continua de aminoácidos del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B desde el resto de aminoácido 81 al extremo C) en el orden de (a), (b), (c) desde el lado del extremo N.

El polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico a utilizar en la presente invención que tiene la constitución arriba mencionada forma partículas del núcleo debido al auto-ensamblaje, y un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2 está presente en el exterior de las partículas. La secuencia de aminoácidos insertada entre el elemento constituyente (a) y el elemento constituyente (c) puede contener, además del elemento constituyente (b) (secuencia de aminoácidos que consiste en un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2), uno o más (preferiblemente 1 - 3, más preferiblemente 1) epítopos específicos. El epítopo específico adicional puede insertarse en cualquier posición entre el elemento constituyente (a) y el elemento constituyente (b) o el elemento constituyente (b) y el elemento constituyente (c). La longitud de la secuencia de aminoácidos del epítopo específico adicional es generalmente de 5 - 30 aminoácidos, preferiblemente de 6 - 25 aminoácidos, más preferiblemente de 10 - 18 aminoácidos, más preferiblemente, además, de 11 - 16 aminoácidos.

Cuando se inserta una pluralidad de epítopos específicos entre el elemento constituyente (a) y el elemento constituyente (c), los epítopos específicos pueden enlazarse directamente mediante un enlace covalente o enlazarse mediante una secuencia espaciadora. La secuencia espaciadora significa una secuencia de aminoácidos que contiene uno o más restos de aminoácidos a insertar entre dos elementos constituyentes adyacentes contenidos en el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico. Los epítopos específicos se enlazan preferiblemente a través de una secuencia espaciadora, de modo que una pluralidad de epítopos específicos se pueda presentar de manera estable al tiempo que se mantiene su estructura. La longitud de la secuencia espaciadora no está limitada, siempre que el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico forme partículas del núcleo mediante auto-ensamblaje y todos los epítopos específicos insertados se presenten fuera de las partículas, y es generalmente de 1 - 10 aminoácidos, preferiblemente de 1 - 5 aminoácidos, más preferiblemente de 1 - 3 aminoácidos, lo más preferiblemente de 2 o 3 aminoácidos.

Un epítopo específico en el lado más N-terminal entre el elemento constituyente (a) y el elemento constituyente (c), y el elemento constituyente (a) puede conectarse directamente mediante un enlace covalente o mediante una secuencia espaciadora. El elemento (a) y el epítopo espaciador en el lado más N-terminal están conectados preferiblemente a través de una secuencia espaciadora, de modo que un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2 se presentarán de modo estable en el exterior de las partículas formadas por autoensamblaje de polipéptidos del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico, al tiempo que se mantiene su estructura. Aunque la longitud de la secuencia espaciadora no está limitada, siempre que el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico forme partículas del núcleo por auto-ensamblaje y un epítopo específico de VEGF y un epítopo específico de angiopoyetina-2 se presente en el exterior de las partículas, es generalmente de 1 - 10 aminoácidos, preferiblemente de 1 - 5 aminoácidos, más preferiblemente de 1 - 3 aminoácidos, lo más preferiblemente de 2 o 3 aminoácidos. Tampoco el tipo de secuencia espaciadora está limitado, siempre que el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico forme partículas del núcleo por auto-ensamblaje, y un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2 se presente en el exterior de las partículas. Ejemplos de una secuencia espaciadora preferible incluyen, pero no se limitan a IT, GAT, CGG y similares.

Un epítopo específico en el lado más N-terminal entre el elemento constituyente (a) y el elemento constituyente (c), y el elemento constituyente (c) puede conectarse directamente mediante un enlace covalente o a través de una secuencia espaciadora. El elemento (b) y el elemento (c) están conectados preferiblemente a través de una secuencia espaciadora, de modo que un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2 se presentarán de modo estable en el exterior de las partículas formadas por auto-ensamblaje de polipéptidos del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico, al tiempo que se mantiene su estructura. Aunque la longitud de la secuencia espaciadora no está limitada, siempre que el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico forme partículas del núcleo debido al auto-ensamblaje y un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2 se presente fuera de las partículas, es generalmente de 1 - 10 aminoácidos, preferiblemente de 1 - 5 aminoácidos, más preferiblemente de 1 - 3 aminoácidos, lo más preferiblemente de 2 o 3 aminoácidos. Tampoco el tipo de secuencia espaciadora está limitado, siempre que el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico forme partículas del núcleo por auto-ensamblaje, y un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2 se presente en el exterior de las partículas. Ejemplos de secuencias espaciadoras preferibles incluyen, pero no se limitan a IT, GAT, CGG y similares.

La longitud de la secuencia de aminoácidos insertada entre el elemento constituyente (a) y el elemento constituyente (c) no está particularmente limitada, siempre que el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico forme partículas del núcleo por auto-ensamblaje, y un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2 se presente en el exterior de las partículas, y se puede tratar o prevenir el cáncer, y es de hasta 80 aminoácidos. Cuando la secuencia de aminoácidos insertada es demasiado corta, se puede perder la antigenicidad como un epítopo. Cuando la secuencia de aminoácidos insertada es demasiado larga, se dificulta la formación de partículas del núcleo por parte del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico por auto-ensamblaje y, como resultado, no se produce un anticuerpo que reconozca específicamente el epítopo insertado, y puede no obtenerse un tratamiento eficaz o un efecto de mejora del cáncer.

El vector de expresión utilizado en la presente invención es un vector recombinante que incorpora un polinucleótido que codifica el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico. Cuando el vector de expresión se administra a un mamífero objetivo, el vector de expresión se incorpora de manera intracelular al mamífero objetivo y la célula expresa el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico. Ejemplos del vector de expresión insertado con el polinucleótido que codifica el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico es un plásmido, virus, fago, cósmido y otros vectores utilizados convencionalmente en la técnica. Ejemplos de vectores plasmídicos incluyen, pero no se limitan a pCAGGS (Gene 108: 193 - 199 (1991)), pCR-X8 (Vaccine 24: 4942 - 4950 (2006)), pcDNA3.1 (nombre comercial, Invitrogen), pZeoSV (nombre comercial, Invitrogen), pBK-CMV (nombre comercial, Stratagene) y similares. El vector viral es un virus de ADN o virus de ARN. Ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a retrovirus detoxificados, adenovirus, virus adeno-asociados, virus herpes, virus vaccinia, poxvirus, poliovirus, virus Sindbis, virus hemaglutinante de Japón (HVJ), SV40, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y similares. Además, también se puede utilizar la envoltura del virus hemaglutinante de Japón (HVJ-E) y similares.

En el vector de expresión antes mencionado, el polinucleótido (preferiblemente ADN) que codifica el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico está conectado operativamente a un promotor capaz de exhibir una actividad promotora en las células de un mamífero (preferiblemente ser humano) que será el sujeto de administración.

El promotor a utilizar no está particularmente limitado, siempre que pueda funcionar en la célula de un mamífero (preferiblemente ser humano), que será el sujeto de administración. Ejemplos del promotor incluyen promotor pol I, promotor pol II, promotor pol III y similares. Específicamente, se utilizan promotores de virus, tales como promotor inicial derivado de SV40, citomegalovirus LTR y similares, promotores de genes de proteínas constitutivas de mamíferos, tales como promotor de genes de p-actina y similares, promotores de ARN, tales como el promotor de ARNt y similares, y similares.

El vector de expresión arriba mencionado contiene preferiblemente una señal de terminación de la transcripción, es decir, una región de terminador, aguas abajo del polinucleótido que codifica el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico. Además, puede contener un gen marcador de selección para la selección de una célula transformada (un gen que confiere resistencia a medicamentos, tales como tetraciclina, ampicilina, kanamicina y similares, un gen que complementa una mutación auxotrófica, etc.).

En una realización, el vector de expresión arriba mencionado puede incluir una secuencia inmuno-estimuladora (ISS) (a la que también se alude como CpG) para potenciar el efecto inmunológico. La secuencia inmunoestimuladora es un ADN que contiene un motivo CpG bacteriano no metilado y se sabe que actúa como un ligando de un receptor particular (receptor tipo Toll 9) (véase Biochim. Biophys. Acta 1489, 107-116 (1999) y Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003)). Ejemplos preferibles de la secuencia inmuno-estimuladora incluyen los siguientes. CpG-B101822 pb

5'-tga ctg tga acg ttc gag atg a-3' (SEQ ID NO: 8)

CpG-A D1920 pb (tipo D)

5'-ggt gca tcg atg cag ggg gg-3' (SEQ ID NO: 9)

CpG-CC27421 pb

5'-tcg tcg aac gtt cga gat gat-3' (SEQ ID NO: 10)

CpG-CC69525 pb

5'-tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3' (SEQ ID NO: 11)

Alternativamente, se pueden conectar y utilizar 2, 3 o 4 de estos ISS. Ejemplos preferibles de la secuencia ISS conectada incluyen los siguientes.

5'-ggt gca tcg atg cag ggg gg tga ctg tga acg ttc gag atg a tcg tcg aac gtt cgagat gat tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3' (SEQ ID NO: 12)

Los expertos ordinarios en la técnica pueden construir el vector de expresión antes mencionado de acuerdo con técnicas de ingeniería genética bien conocidas, descritas, por ejemplo, en "edit. Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y." y "edit. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987) John Wiley & Sons”, y similares.

El vector de expresión de la presente invención se puede proporcionar como una composición farmacéutica que contiene, además de una cantidad terapéuticamente eficaz del vector de expresión arriba mencionado, cualquier soporte, por ejemplo, un soporte farmacéuticamente aceptable.

Ejemplos del soporte farmacéuticamente aceptable incluyen, aunque no se limitan a excipientes, tales como sacarosa, almidón, manitol, sorbita, lactosa, glucosa, celulosa, talco, fosfato cálcico, carbonato cálcico y similares, aglutinantes, tales como celulosa, metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, gelatina, goma arábiga, polietilenglicol, sacarosa, almidón y similares, desintegrantes, tales como almidón, carboximetilcelulosa, hidroxipropil-almidón, almidón glicolato sódico, hidrógeno-carbonato sódico, fosfato de calcio, citrato de calcio y similares, lubricantes, tales como estearato de magnesio, Aerosil, talco, lauril sulfato de sodio y similares, compuestos aromáticos, tales como ácido cítrico, mentol, sal de amonio de glicirricina, glicina, polvo de naranja y similares, conservantes, tales como benzoato de sodio, bisulfito de sodio, metilparabeno, propilparabeno y similares, estabilizadores, tales como ácido cítrico, citrato sódico, ácido acético y similares, agentes de suspensión, tales como metilcelulosa, polivinilpirrolidona, estearato de aluminio y similares, agentes dispersantes, tales como tensioactivos y similares, diluyentes, tales como agua, solución salina y similares, ceras base, tales como manteca de cacao, polietilenglicol, queroseno blanco, y similares, y similares.

La composición farmacéutica puede contener, además, un adyuvante para potenciar su efecto. Ejemplos del adyuvante incluyen hidróxido de aluminio, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, adyuvante de pertussis, poli(I:C), CpG-ADN y similares.

Para fomentar la introducción intracelular de un vector de expresión en las células, la composición farmacéutica puede contener, además, un reactivo para la introducción de ácidos nucleicos. Como reactivo para la introducción de ácidos nucleicos se pueden utilizar lípidos catiónicos, tales como lipofectina (nombre comercial, Invitrogen), lipofectamina (nombre comercial, Invitrogen), transfectam (nombre comercial, Promega), DOTAP (nombre comercial, Roche Applied Science), dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS), L-dioleoil fosfatidil-etanolamina (DOPE), bromuro de dimetildioctadecil-amonio (DDAB), bromuro de N,N-di-n-hexadecil-N,N-dihidroxietilamonio (DHDEAB), bromuro de N-n-hexadecil-N,N-dihidroxietilamonio (HDEAB), polibreno, poli(etilenimina) (PEI) y similares. Además, un vector de expresión puede incluirse en cualquier liposoma conocido constituido por una bicapa lipídica, tal como un liposoma electrostático. Un liposoma de este tipo puede condensarse con un virus tal como el virus hemaglutinante de Japón (HVJ) inactivado. El liposoma HVJ tiene una actividad de fusión muy alta con una membrana celular en comparación con los liposomas en general. Cuando se utiliza un retrovirus como un vector de expresión, se puede utilizar retronectina, fibronectina, polibreno y similares como reactivos de transfección.

Si bien el contenido del vector de expresión arriba mencionado en la composición farmacéutica no está particularmente limitado, y se selecciona apropiadamente dentro de un amplio intervalo, generalmente es de aproximadamente 0,00001 a 100% en peso de la composición farmacéutica completa.

Introducir el vector de expresión arriba mencionado en un tejido (o célula) de un mamífero objetivo de aplicación induce la expresión in vivo del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico arriba mencionado, induce la producción de un anticuerpo contra el epítopo de VEGF y/o el epítopo de angiopoyetina-2 contenido en el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico y suprime la angiogénesis alrededor de los tejidos cancerosos e inhibe el crecimiento de tejidos cancerosos mediante la neutralización de la actividad del VEGF y/o la angiopoyetina-2 por parte del anticuerpo inducido. Se conocen diversos métodos para introducir ácidos nucleicos tal como un vector de expresión y similares en el cuerpo (T. Friedman, Science 244: 1275-1281 (1989)), y se puede adoptar cualquier método de introducción, siempre que pueda inducir la expresión in vivo del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico arriba mencionado, inducir la producción de un anticuerpo contra el epítopo de VEGF y/o el epítopo de angiopoyetina-2 contenido en el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico, y tratar o prevenir el cáncer.

Ejemplos del método para introducir un vector de expresión en un tejido (o una célula) de mamífero in vivo incluyen, pero no se limitan al método de liposomas internos, método de liposomas electrostáticos, método de liposomas HVJ, método de liposomas HVJ-AVE, transferencia de genes mediada por receptores, método de pistola de partículas, método de ADN desnudo, método de introducción de polímero de carga eléctrica positiva, método de electroporación, y similares.

Alternativamente, se pueden aislar células tales como células de la sangre, células de la médula ósea y similares del mamífero objetivo de aplicación, y el vector de expresión arriba mencionado se puede introducir en las células ex vivo, después de lo cual las células obtenidas que contienen el vector de expresión arriba mencionado se pueden devolver al mamífero objetivo de aplicación.

Ejemplos del método para introducir un vector de expresión en una célula de mamífero ex vivo incluyen, pero no se limitan a un método de lipofección, un método de co-precipitación de fosfato cálcico, un método de DEAE-dextrano, un método de introducción directa de ADN utilizando un microcapilar de vidrio, un método de electroporación, y similares.

El vector de expresión de la presente invención puede administrarse por cualquier método, siempre que en el mamífero objetivo de administración el agente que induce la expresión in vivo del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico arriba mencionado induzca la producción de un anticuerpo contra el epítopo específico de VEGF y/o el epítopo específico de angiopoyetina-2 contenido en el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico y trate o prevenga el cáncer. Preferiblemente, el vector de expresión de la presente invención se administra por vía parenteral en una cantidad suficiente para inducir la producción de un anticuerpo contra el epítopo específico de VEGF y/o el epítopo específico de angiopoyetina-2 contenido en el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico y trate o prevenga el cáncer. Por ejemplo, inyección por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica, tejido intra-adiposo, tejido de la glándula intramamaria o vía intramuscular; método de bombardeo de partículas inducido por gas (mediante pistola de electrones y similares); un método en forma de colunario y similares a través de la vía de la mucosa y similares se citan como ejemplos de los métodos de administración. En una realización, el vector de expresión de la presente invención se inyecta por vía subcutánea o intramuscular.

En una realización, el vector de expresión de la presente invención se administra por vía subcutánea mediante una jeringa sin aguja. La jeringa sin aguja es preferiblemente una jeringa de presión. Ejemplos de la jeringa sin aguja incluyen, pero no se limitan a ShimaJET (nombre comercial, SHIMADZU CORPORATION), Twinjector EZII (nombre comercial, Japan chemical research), Syrijet (nombre comercial, Keystone), ZENEO (nombre comercial, Crossject), y similares. En este caso, el vector de expresión de la presente invención se puede proporcionar como una preparación de inyección que contiene el vector de expresión arriba mencionado y una jeringa sin aguja, en donde el vector de expresión está encerrado en la jeringa sin aguja.

En una realización, el vector de expresión de la presente invención se administra por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular con una pistola de genes. En este caso, el vector de expresión arriba mencionado se puede aplicar sobre las partículas de soporte tales como partículas de oro coloidal y similares a introducir en el cuerpo y utilizadas para la administración. Se conoce una técnica para revestir partículas de soporte con polinucleótidos (véase, por ejemplo, el documento WO 93/17706). Finalmente, el vector de expresión se puede preparar en una solución acuosa tal como solución salina fisiológica, y similares, adecuada para la administración al cuerpo.

Para inducir una buena respuesta inmune, el vector de expresión de la presente invención se administra preferiblemente múltiples veces a intervalos dados. Si bien la frecuencia se puede determinar apropiadamente vigilando el nivel de respuestas inmunes, generalmente es de 2 - 10 veces, preferiblemente de 2 - 6 veces, más preferiblemente de 2, 3 o 4 veces, lo más preferiblemente de 3 veces.

La frecuencia de administración es generalmente de 1 vez a la semana - 1 vez al año, preferiblemente una vez cada 1 - 6 meses.

En una realización, el vector de expresión de la presente invención se administra a un mamífero objetivo a intervalos de 3 veces a 6 meses.

Mientras que la dosis del vector de expresión de la presente invención depende de la inmunogenicidad del epítopo de VEGF y/o del epítopo de angiopoyetina-2 contenido en el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico codificado por el vector de expresión en un mamífero sujeto de administración, los expertos ordinarios en la técnica pueden determinar la dosis necesaria para una buena respuesta inmune al administrar una cantidad dada de un vector de expresión a un mamífero sujeto de administración, midiendo el título de anticuerpos específico contra el epítopo mediante un método de detección tal como ELISA y similares, y observar la respuesta inmune. Los expertos ordinarios en la técnica apreciarán que la inmunogenicidad del vector de expresión de la presente invención depende de la fuerza de la secuencia reguladora, tal como el promotor utilizado para el vector de expresión como un ingrediente activo. Además, los expertos ordinarios en la técnica pueden también controlar con facilidad la dosis del vector de expresión de la presente invención en función del tipo de vector de expresión a utilizar.

Cuando se administra un vector de expresión que codifica un polipéptido de antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico insertado con una secuencia de aminoácidos que contiene un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2, se induce una respuesta inmune (preferiblemente una respuesta inmune humoral tal como la producción de anticuerpos y similares) al epítopo específico de VEGF y/o al epítopo específico de angiopoyetina-2 en el polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico expresado, y se neutraliza la actividad del VEGF y/o de angiopoyetina-2 con el anticuerpo, con lo cual se puede suprimir la angiogénesis alrededor de los tejidos cancerosos e inhibir el crecimiento de tejido canceroso. Por consiguiente, el sujeto de administración del vector de expresión de la presente invención incluye pacientes con cáncer, aquellos que tienen un historial clínico de cáncer y pacientes no cancerosos que tienen el riesgo de desarrollar cáncer, y similares. El cáncer se trata administrando a pacientes con cáncer un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico en el que se ha insertado una secuencia de aminoácidos que contiene un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2, suprimiendo con ello la angiogénesis alrededor de los tejidos cancerosos de los pacientes con cáncer e inhibiendo el crecimiento de tejidos cancerosos. Además, la metástasis se puede suprimir al suprimir la angiogénesis alrededor de la lesión micrometastásica en los pacientes con cáncer. La recurrencia del cáncer se puede suprimir administrando un vector de expresión que codifica un polipéptido de antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico insertado con una secuencia de aminoácidos que contiene un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2 se administra a aquellos que tienen un historial clínico de cáncer, suprimiendo con ello la angiogénesis alrededor de la lesión micrometastásica que posiblemente se encuentre latente en el cuerpo de aquellos que tienen un historial clínico de cáncer e inhibiendo el crecimiento de los tejidos cancerosos. Además, se puede prevenir la aparición de cáncer en pacientes sin cáncer que tienen un riesgo de desarrollar cáncer mediante la administración de un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico insertado con una secuencia de aminoácidos que contiene un epítopo específico de VEGF y/o un epítopo específico de angiopoyetina-2 en los pacientes no cancerosos.

La presente invención se describirá con mayor detalle en lo que sigue con referencia a Ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de la construcción que expresa HBc-mVEGF (13 aa) y HBc-hAng2 (16 aa)

El plásmido pPLc3 (Número de acceso LMBP 2470) se adquirió de BCCM/LMBP Plasmid Collection. Los fragmentos de ADN que codifican HBc modificado, en donde una secuencia de aminoácido parcial (SEQ ID NO: 1) de VEGF de ratón o una secuencia de aminoácido parcial (SEQ ID NO: 3) de angiopyetina-2 humana está insertada entre los restos de aminoácidos 80 y 81 de HBc, se obtuvieron mediante PCR y ligamiento. Este fragmento de ADN se clonó mediante TA en el kit de expresión de TA pcDNA 3.1/V5-His TOPO (Invitrogen) para dar el vector HBc-AngII ISS(-). De manera similar, la PCR se realizó utilizando un molde (plásmido pPLc3) y un conjunto de cebador (HBcF y HBcR) para preparar un fragmento de ADN que codifica un polipéptido de longitud completa de HBc, y este fragmento de ADN se clonó mediante TA en el vector pcDNA 3.1/V5-His TOPO para dar el vector de expresión HBcmVEGF y el vector de expresión HBc-hAng2. Las secuencias de aminoácidos de HBc-mVEGF y HBc-hAng2 preparados se muestran en SEQ ID NO: 28 y 30, respectivamente, y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácido se muestran en SEQ ID NO: 27 y 29, respectivamente. Las siguientes regiones corresponden a las secuencias insertadas.

Nucleótidos N°s 244 - 297 de SEQ ID NO: 27 (de estos, los nucleótidos N°s 250 - 288 codifican SEQ ID NO: 1) Aminoácidos N°s 81 - 88 de SEQ ID NO: 28 (de estos, los aminoácidos N°s 83 - 85 corresponden a SEQ ID NO: 1) Nucleótidos N°s 244 - 306 de SEQ ID NO: 29 (de estos, los nucleótidos N°s 250 - 297 codifican SEQ ID NO: 3) Aminoácidos N°s 81 - 101 de SEQ ID NO: 30 (de estos, los aminoácidos N°s 83 - 98 corresponden a SEQ ID NO: 3) Ejemplo 2

Cada uno de los vectores de expresión (HBc, HBc-mVEGF, HBc-hAng2) preparados en el Ejemplo 1 se introdujeron en ratones BALB/c (hembras, de 6 semanas de edad) mediante un electroporador. Después de la inmunización durante 3 veces a intervalos de 2 semanas (0, 2, 4 semanas) y de un lapso de 4 semanas, se administró una inmunización adicional (8 semanas). Células Colon26 (CT-26) en la fase de crecimiento bajo cultivo en RPMI (FBS al 10 %, pc/mc) se recuperaron mediante tripsina y se suspendieron en PBS para dar una suspensión celular con una concentración de 1 x 107 células/mL en PBS. Una semana después de la inmunización adicional final (9 semanas), se rasuró el lomo del ratón inmunizado y la suspensión celular (100 mL, 1 x 106 células/ratón) se inyectó por vía subcutánea (Día 0). El diámetro del tumor se midió con un calibrador vernier (volumen del tumor = diámetro largo x diámetro corto x diámetro corto / 2).

En los ratones inmunizados con HBc-mVEGF y HBc-hAng2, se suprimió el crecimiento del tumor (Fig. 1) y aumentó la tasa de supervivencia después del trasplante del tumor (Fig. 2) en comparación con el vector control negativo. Ejemplo 3

(Resultados)

Producción de una vacuna de ADN para VEGF

Para confirmar si este sistema de vacuna de ADN inducía lo suficientemente la producción de anticuerpos anti-VEGF, ratones BALB/c hembras fueron inmunizados con pcDNA3.1-HBc-mVEGF (1 a.a.) [HBc-mVEGF (7 a.a.)], pcDNA3.1-HBc [HBc] o solución salina, respectivamente, mediante administración intramuscular utilizando un electroporador, tres veces cada dos semanas y un refuerzo adicional después de la tercera inmunización (Figs. 3 y 4). Como resultado, se observó un título algo mayor de anticuerpo anti-VEGF en el grupo de HBc-mVEGF (7 a.a.) en comparación con el grupo control (HBc y solución salina) (Fig. 5). Debido a que esta secuencia de 7 a.a. podría no ser suficiente para que el epítopo de células B indujera el anticuerpo anti-VEGF, la secuencia larga también se diseñó como un antígeno candidato que cubría la superficie de unión con bevacizumab, VEGFR-1 o VEGFR-2. 6 o 10 aminoácidos se añadieron a la secuencia del núcleo, creando con ello la secuencia de 13 aminoácidos diana (IMRIKPHQSQHIG; 13 a. a.) (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de 17 aminoácidos (MQIMRIKPHQSQHIGEM; 17 a. a.) (SEQ ID NO: 32), respectivamente (Fig. 3). Después se construyeron de manera similar y se vacunó a ratones con pcDNA3.1-mVEGF (13 a.a.) [HBc-mVEGF (13 a.a.)] y pcDNA3.1-mVEGF (17 a.a.) [HBc-mVEGF (17 a.a.)]. Tal como se muestra en la Fig. 5, ambos antígenos indujeron con éxito la producción de anticuerpo anti-VEGF. Se observó un título relativamente elevado de anti-VEGF en el grupo HBc-mVEGF (13 a.a.) en comparación con los grupos de 17 a.a. y 7 a.a. (Fig. 5). Por lo tanto, se decidió que 13 a.a. (IMRIKPHQSQHIG fuese el antígeno de la vacuna de ADN de VEGF utilizando el sistema HBc (Fig. 6a y b). La funcionalidad del vector de expresión de HBc-mVEGF (13 a. a.) se confirmó en células COS-7 transfectadas. Cada una de las construcciones expresaba ARNm en la longitud esperada y proteína de la masa molecular esperada.

Se confirmó el título de anticuerpos anti-VEGF a la octava semana, cuatro semanas después de la tercera inmunización (Fig. 1d) y se observó un título elevado en el grupo de HBc-mVEGF (13 a.a.) (Fig. 7a y 8). En el análisis de subtipos de IgG, esta inmunización podría conducir a respuestas inmunes sesgadas por Thl con producción predominante de IgG2a e IgG2b (Fig. 7b). Los autores de la presente invención confirmaron, además, si el suero producido mediante inmunización con HBc-mVEGF (13 a.a.) reconocería la proteína VEGF-A de ratón recombinante en el análisis de la transferencia western. La unión específica de suero inmunizado con proteína de VEGF recombinante se confirmó utilizando el anticuerpo comercial contra VEGF, VG-1 (Fig. 8).

Actividad de neutralización de anticuerpo anti-VEGF producido mediante vacunación de ADN de VEGF

Para examinar la actividad neutralizante de suero procedente de ratones vacunados, los autores de la invención purificaron IgG de ratón de suero utilizando la columna de proteína G tal como se describe en la sección de método. El tratamiento de suero inmunizado, pero no de suero control, atenuó de manera significativa la fosforilación de ERK1/2 inducida por VEGF-A en HUVECs (Fig. 9). En la formación en tubo de HUVECs en matrigel, en presencia de EBM-2 con FBS al 0,4 % y complemento al 0,4 %, la adición de suero inmunizado atenuó también de manera significativa la formación en tubo de HUVECs, en comparación con la adición de suero control (Fig. 10).

Método

Medición de anticuerpo anti-mVEGF en suero

Ocho o dieciséis semanas después de la primera inmunización, se recogió suero de los ratones inmunizados de todos los grupos. Los niveles de suero de anticuerpos anti-VEGF en estos ratones se midieron mediante ELISA. Brevemente, placas ELISA se revistieron con 5 gg/mL de BSA conjugado con péptido de VEGF de 13 a.a. en tampón carbonato durante la noche a 4°C. Diluciones en serie (1:100 a 1:312500) de muestras de suero procedentes de los ratones inmunizados se añadieron a los pocillos y se añadió IgG de ratón conjugada con HRP (IgG entera, GE Helthcare, Reino Unido, cada uno de los subtipos; Abcam, Reino Unido). Después de cuatro lavados con PBST, se añadió 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB, Sigma Aldrich, EE.UU.). La producción del producto de reacción azul se detuvo añadiendo 0,5 mol/L de ácido sulfúrico, y el producto final resultante (amarillo) se leyó a 450 nm.

Purificación de IgG

Suero de ratón se purificó utilizando la columna de proteína G de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit MabTrap; GE Healhcare, Reino Unido). Brevemente, muestras de suero se ajustaron a la composición del tampón de unión (fosfato sódico 20 mM, pH 7,0). En la columna de proteína G se separó por lavado el conservante de etanol con agua destilada y se equilibró con tampón de unión. Se aplicó el suero diluido y la columna se lavó con tampón de unión hasta que no aparecía material en el efluente. Después de ello, la fracción de IgG se eluyó mediante tampón de

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector de expresión que codifica un polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B quimérico con una inserción para uso en el tratamiento o la profilaxis del cáncer, en donde la inserción es una secuencia de aminoácidos de hasta 80 aminoácidos de longitud que comprende un epítopo específico de VEGF o de angiopoyetina-2, en donde la secuencia de aminoácidos que comprende el epítopo específico está insertada entre los restos de aminoácidos 80 y 81 del polipéptido del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B, en donde el epítopo específico de VEGF consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 32 o 33, o una secuencia parcial de la misma que tiene 13 o más aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 31, y en donde el epítopo específico de angiopoyetina-2 consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3.

2. El vector de expresión para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer es un cáncer sólido.

3. El vector de expresión para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el tumor sólido es de cualquier tipo seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de útero y cáncer de próstata.

4. El vector de expresión para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la inserción es una secuencia de aminoácidos que comprende el epítopo específico de VEGF definido en la reivindicación 1.

5. El vector de expresión para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o 2.

6. El vector de expresión para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3.

7. El vector de expresión para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende, además, uno o más epítopos específicos.

8. El vector de expresión para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el vector de expresión se administra varias veces.

9. El vector de expresión para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el vector de expresión se administra 2, 3 o 4 veces.

10. El vector de expresión para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el vector de expresión se administra 3 veces.

11. El vector de expresión para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el vector de expresión se administra 3 veces a intervalos de medio año.

12. El vector de expresión para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende SEQ ID NO: 1 o 2, y el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de útero o cáncer de próstata.

13. El vector de expresión para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende SEQ ID NO: 3, y el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de útero o cáncer de próstata.

14. El vector de expresión para uso de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en donde la secuencia de aminoácidos de la inserción comprende uno o más epítopos específicos.