ES2809508T3 - Estructuras artificiales de poliepítopos para uso en inmunoterapia - Google Patents

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Abstract

Un vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN que codifica al menos dos epítopos de CD4 de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) y al menos un epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario; en donde dichos al menos dos epítopos de CD4 de TERT son idénticos y están repetidos.

Description

DESCRIPCIÓN
Estructuras artificiales de poliepítopos para uso en inmunoterapia
La presente invención pertenece al campo de la inmunoterapia y la vacunación.
Antecedentes de la invención
La inmunoterapia basada en linfocitos T eficaz contra el cáncer debe incluir respuestas tanto de linfocitos T CD8 como CD4 reactivos frente a tumores que reconocen antígenos específicos de tumores. Los linfocitos T CD8 citotóxicos (CTLs) se consideran que son los principales actores de la respuesta inmune mediada por células, ya que muestran actividad citotóxica contra células tumorales que expresan antígenos asociados a tumores (TAAs). Sin embargo, esa respuesta inmune es eficaz solo si los linfocitos T CD4 cooperadores 1 (Th1) se estimulan de forma concomitante. Estos linfocitos CD4 son decisivos para la inducción y el mantenimiento de los linfocitos T CD8 contra tumores, al proporcionar ayuda a través de múltiples interacciones y dirigir la respuesta antitumoral general (Shedlock y Shen, 2003). En consecuencia, cada vez se ha enfocado más la atención en identificar epítopos del MHC de clase I y II a partir de múltiples TAAs (Cheever MA, et al., 2009). Durante los últimos años, la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT) se ha convertido en el primer antígeno tumoral común y se investiga activamente como una diana universal para la inmunoterapia contra el cáncer. La transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT) es la subunidad catalítica de la enzima telomerasa que sintetiza ADN telomérico en los extremos cromosómicos. La hTERT se sobreexpresa en más del 85% de los tumores humanos procedentes de diversos fenotipos de cáncer, con poca o ninguna expresión en las células somáticas normales (Shay y Bacchetti, 1997).
Los ensayos clínicos con formulaciones de vacunas contra péptidos de la hTERT dirigidas principalmente a epítopos de CD8 han ilustrado que una respuesta inmune específica contra hTERT se puede inducir de manera segura en pacientes con cáncer y tener un impacto notable en los resultados clínicos a corto plazo (Bernhardt et al., 2006; Bolonaki et al., 2007). Sin embargo, este enfoque terapéutico no logró inducir beneficios clínicos a largo plazo debi­ do a la ausencia de una respuesta inmune sostenida. La respuesta de memoria obtenida con las vacunas de pépti­ dos de hTERT dirigidas a epítopos de CD8 y especialmente con péptidos cortos, era muy baja y no era constante. Esos resultados subóptimos se pueden explicar en parte por un bajo nivel o la ausencia de ayuda de linfocitos T CD4.
Todavía existe la necesidad de vacunas terapéuticas efectivas contra agentes infecciosos o tumores, especialmente aquellos que expresan antígenos débilmente inmunogénicos.
Compendio de la invención
Los inventores han desarrollado ahora una estrategia de vacuna de ADN que no muestra los inconvenientes de la vacunación con péptidos (incluso péptidos largos), restringida a ciertos epítopos de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT). En particular, la vacunación con ADN evita procedimientos costosos y complicados para la pro­ ducción y purificación de proteínas. Las estructuras artificiales de la invención inducen tanto linfocitos T CTLs como cooperadores CD4, independientemente de la restricción del HLA del paciente, a la vez que son seguras e inducen una mejor respuesta inmune cuantitativa y cualitativa.
Un objeto de la invención es un vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN que codifica al menos dos epítopos de CD4 de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) y al menos un epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario.
De acuerdo con una primera realización, se proporciona una mezcla de vectores de expresión de ADN que comprende i) al menos un vector de expresión de ADN que codifica dichos al menos dos epítopos de CD4 de TERT y ii) al menos un vector de expresión de ADN que codifica dicho al menos un epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario.
De acuerdo con otra realización, se proporciona un vector de expresión de ADN, que codifica dichos al menos dos epítopos de CD4 de TERT y dicho al menos un epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario.
Otro objeto de la invención es un kit que comprende
a. un primer recipiente que contiene al menos un vector de expresión de ADN que codifica dichos al menos dos epítopos de CD4 de TERT y
b. un segundo recipiente que contiene al menos un vector de expresión de ADN que codifica dicho epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario.
Dichos vector de expresión de ADN, mezcla de vectores de expresión de ADN o kit, son útiles para tratar un tumor o una infección en un paciente.
Leyendas de las Figuras
Figura 1: Mapa del plásmido pUCPbasic
La Tabla 1 a continuación muestra las leyendas detalladas.
Figure imgf000003_0001
Figura 2: Mapa del plásmido pUCP2(4x)
La Tabla 2 a continuación muestra las leyendas detalladas.
Figure imgf000003_0002
Figure imgf000004_0001
Figura 3: Mapa del plásmido pDE7
La Tabla 3 a continuación muestra las leyendas detalladas.
Figure imgf000004_0002
Figura 4: Validación de las estructuras artificiales de ADN mediante cartografiado por restricción
Los vectores de expresión se verificaron mediante cartografiado por restricción. Sus modelos se corresponden con el mapa de restricción esperado.
Pista M: Escala de 1 kb (Eurogentec)
Pista 1: pUCPbasic (369, 5348 pb)
Pista 2: pUCP2(4x) (363, 5354 pb)
Pista 3: pDE7 (354, 5354 pb)
Figura 5: Expresión de polipéptidos/proteínas de UCPbasic, UCP2(4x) y DE7 in vitro en la línea celular HEK293T, determinada por transferencia Western
La expresión de proteínas se controló 48 h después de la transfección en células HEK293T.
(a) Ensayo directo de transferencia Western: polipéptidos/proteínas de pUCPbasic, pUCP2(4x), pDE7 y pcD-NA3.1 detectados después de 20 segundos de absorción; la p-actina se utilizó como control de carga.
(b) Ensayo de transferencia Western después de la inmunoprecipitación de la proteína E7: los extractos de célu­ las completas preparados a partir de células transfectadas con pDE7 y pcDNA3.1 se inmunoprecipitaron con perlas de agarosa anti-V5. La proteína E7 se detectó después de 4 minutos de absorción.
Los marcadores del peso molecular (MW) se indican (kDa).
Figura 6: Los epítopos cooperadores de hTERT aumentan la respuesta de los linfocitos T CD8 contra el antígeno E7 de HPV16
Los ratones se inmunizaron conjuntamente con ADN que codificaba el antígeno E7 no oncogénico y con un plásmido de control vacío (pcDNA3.1), pUCP2(4x) o pUCPbasic, el día 0 y el día 21. Diez días después de la segunda inmunización (D31), se extirparon los bazos y se analizaron mediante un ensayo ELISpot con IFN-y.
Mediana de la frecuencia de linfocitos T IFN-Y+ restringidos a hTERT y HLA-DR1 de E7 (a, b, respectivamente) y HLA-A2 de E7 (c) en el bazo. 5-13: número de ratón. (d) Resultados sumados de ELISpot con IFN-y de HLA-DR1 y HLA-A2. Las barras muestran medianas con un intervalo de manchas de IFN-y.
Las líneas discontinuas horizontales negras indican el umbral de positividad del ELISpot. Un valor de p <0,05 se consideró significativo (prueba de t no emparejada).
Correlación entre las respuestas de linfocitos T HLA-DR1 para hTERT y linfocitos T HLA-A2 para E7 para las estruc­ turas artificiales pUCP2(4x) pDE7 (e) y pUCPbasic pDE7 (f) determinada por la prueba del coeficiente de corre­ lación de Pearson. Un valor de p <0,05 se consideró significativo.
Este estudio experimental se repitió en las mismas condiciones y se obtuvieron resultados similares.
Figura 7: Detección de producciones de citocinas Th1, Th2 y Th17 mediante un ensayo de unión a citocinas (CBA) en el material sobrenadante de cultivos de esplenocitos después de 24 horas de cultivo, en presencia de los cuatro péptidos HLA-DR1 de hTERT del grupo 1. Las concentraciones de citocinas en pg/mL se representan como media ± DE. Análisis estadístico: prueba no paramétrica de Mann-Whitney frente al grupo de control pDE7 pcDNA3.1. Un valor de p <0,05 se consideró significativo (*).
Figura 8: Muestra la secuencia de inserción de pUCPbasic.
Un transgén que codifica el polipéptido UCPbasic. Cuatro epítopos de la transcriptasa inversa de la telomerasa hu­ mana CD4+ (hTERT; número de orden NM_198253), a saber, UCP1, UCP2, uCp3 y UCP4, con secuencias flan­ queantes naturales de 5 AA, se unen entre sí. Los 14 aminoácidos en la secuencia C-terminal codifican el marcador del epítopo V5. La primera línea es la secuencia de nucleótidos; la segunda línea es la secuencia de aminoácidos correspondiente. Las anotaciones se realizan arriba o debajo de las secuencias. □: codón de parada.
La secuencia se tradujo con el programa de traducción SHOWORF (EMBOSS Explorer).
1-6 sitio de restricción de HindIII para la subclonación
13-315 UCPbasic: UCP1, UCP2, UCP3 y UCP4 (en negrita)
316-357 marcador del epítopo V5
358-363 dos codones de parada
364-369 sitio de restricción de XhoI para la subclonación
La secuencia de nucleótidos se muestra como SEQ ID NO: 21, la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra como SEQ ID NO: 22.
La Figura 9 muestra la secuencia de inserción de pUCP2(4x).
La secuencia transgénica pUCP2(4x) incluye el epítopo dominante UCP2 repetido cuatro veces KSVWSKLQSI-GIRQH (SEQ ID NO: 2, t ErT 578-592, n° de orden Nm_198253) con secuencias flanqueantes de 5 AA en cada lado. Los 14 aminoácidos en la secuencia C-terminal codifican el marcador del epítopo V5. La primera línea es la secuencia de nucleótidos; la segunda línea es la secuencia de aminoácidos correspondiente. Las anotaciones se realizan arriba o debajo de las secuencias. □: codón de parada.
La secuencia se tradujo con el programa de traducción SHOWORF (EMBOSS Explorer).
1-6 sitio de restricción de HindIII para la subclonación
13-315 UCP2(4x) - Unidad UCP2 (en negrita)
316-357 marcador del epítopo V5
358-363 dos codones de parada
364-369 sitio de restricción de Xho\ para la subclonación
La secuencia de nucleótidos se muestra como SEQ \D NO: 23, la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra como SEQ \D NO: 24.
La Figura 10 muestra la secuencia de inserción de pDE7.
Transgén que codifica la proteína DE7. Se introdujeron cuatro mutaciones en el gen E7 de tipo silvestre del virus del papiloma humano tipo 16 (número de orden EU869317). Los 14 aminoácidos en la secuencia C-terminal codifican el marcador del epítopo V5. La primera línea es la secuencia de nucleótidos; la segunda línea es la secuencia de ami­ noácidos correspondiente. Las anotaciones se realizan arriba o debajo de las secuencias. □: codón de parada. Las bases cambiadas/mutadas se resaltan en negrita.
La secuencia se tradujo con el programa de traducción SHOWORF (EMBOSS Explorer).
1-6 sitio de restricción de Hind\\ \ para la subclonación
13-306 DE7
307-348 marcador del epítopo V5
349-354 dos codones de parada
355-360 sitio de restricción de Xho\ para la subclonación
La secuencia de nucleótidos se muestra como SEQ \D NO: 25, la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra como SEQ \D NO: 26.
Descripción detallada de la invención
Los inventores proponen usar estructuras artificiales de ADN que codifican múltiples epítopos promiscuos (indiscri­ minados) de linfocitos T CD4 cooperadores procedentes de TERT, como potenciadores universales para inducir una respuesta inmune sostenida contra antígenos poco inmunogénicos.
Los inventores diseñaron dos estructuras artificiales de ADN sintético de poliepítopos de CD4 obtenidas a partir de hTERT, pUCPbasic y pUCP2(4x), que codificaban cuatro epítopos de Cd4 diferentes (UCP1, UCP2, UCP3 y UCP4, respectivamente SEQ \D NO: 1 a 4) y el epítopo promiscuo inmunodominante UCP2 repetido cuatro veces, respecti­ vamente, con el fin de investigar si se puede proporcionar una ayuda para mejorar las respuestas de linfocitos T CD8 frente a E7. Una administración intradérmica (\D) seguida de electroporación de estas dos estructuras artificia­ les de ADN en ratones transgénicos HLA-A2/DR1, daba como resultado una fuerte respuesta de los linfocitos T CD4 específicos de hTERT que estaba polarizada preferentemente a Th1. Cuando se inyectaban junto con un ADN plasmídico que codificaba el antígeno E7 poco inmunogénico, la magnitud de la respuesta de los linfocitos T CD8 específicos de E7 aumentó drásticamente.
En base a esos resultados, los inventores llegaron a la conclusión de que (i) los epítopos de linfocitos T cooperado­ res CD4 codificados mediante estructuras artificiales de ADN sintético obtenidas a partir de hTERT, se procesan de manera eficaz y se presentan en un contexto de HLA-DR1 en un modelo de ratón transgénico HLA-A2/DR1 y que (ii) esta respuesta polarizada a Th1 CD4 para hTERT puede mejorar en gran medida las respuestas de CTLs contra diversos antígenos cancerígenos/oncovirales poco inmunogénicos o poliepítopos de la clase \ anticancerígenos. Definiciones
El complejo de la telomerasa consiste en un molde de ARN y componentes proteicos que incluyen una transcriptasa inversa, denominada "Transcriptasa inversa de la telomerasa" (TERT), que es el principal determinante de la activi­ dad telomerasa. Se conoce la telomerasa humana de tipo silvestre (o hTERT) (número de orden de GeneBank NM_198253).
Dos secuencias de aminoácidos son "homólogas", "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando uno o varios residuos de aminoácidos se reemplazan por un residuo biológicamente similar o cuando más del 80% de los aminoácidos son idénticos, o más del 90%, preferiblemente más del 95%, son similares (funcional­ mente idénticos). Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas se identifican mediante alineación usando, por ejemplo, el programa de apilamiento GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Versión 7, Madison, Wisconsin), o cualquiera de los programas conocidos en la técnica (BLAST, FASTA, etc.). Con "sustituido" o "modificado", la presente invención incluye aquellos aminoácidos que han sido alterados o modificados a partir de aminoácidos naturales.
La expresión "sustitución conservadora" tal y como se usa en el presente documento, indica el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro, sin alterar la conformación y función general del péptido, que incluye, pero no se limita a, el reemplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares (como, por ejemplo, polaridad, potencial de enlace de hidrógeno, acidez, basicidad, forma, hidrofobicidad, aromaticidad y similares). Los aminoáci­ dos con propiedades similares son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la arginina, la histidina y la lisina son aminoácidos hidrófilos básicos y se pueden intercambiar. De manera similar, la isoleucina, un aminoácido hidrófobo, se puede reemplazar por leucina, metionina o valina. Los aminoácidos hidrófilos neutros, que se pueden sustituir entre sí, incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina.
La expresión "polinucleótido aislado" se define como un polinucleótido retirado del entorno en el que está presente de forma natural. Por ejemplo, una molécula de ADN natural presente en el genoma de una bacteria viva o como parte de una genoteca, no está aislada, pero la misma molécula separada de la parte restante del genoma bacte­ riano, como resultado, por ejemplo, de un evento de clonación (amplificación), está aislada. Típicamente, una molé­ cula de ADN aislada está exenta de regiones de ADN (p. ej., regiones codificantes) a las que sigue de forma conti­ gua en el extremo 5' o 3', en el genoma natural. Los polinucleótidos aislados de ese tipo pueden formar parte de un vector o una composición y aún se pueden definir como aislados en el sentido de que un vector o una composición de ese tipo no forma parte del entorno natural de ese polinucleótido.
El término "inmunogénico" significa que la composición o estructura artificial a la que se refiere, es capaz de inducir una respuesta inmune después de una administración. "Respuesta inmune" en un sujeto se refiere al desarrollo de una respuesta inmune innata y adaptativa, que incluye una respuesta inmune humoral, una respuesta inmune celular o una respuesta inmune humoral y celular, frente a un antígeno. Una "respuesta inmune humoral" se refiere a una que está mediada por anticuerpos. Una "respuesta inmune celular" es una mediada por linfocitos T. Incluye la pro­ ducción de citocinas, quimiocinas y moléculas similares producidas por linfocitos T activados, glóbulos blancos o ambos. Las respuestas inmunes se pueden determinar usando inmunoensayos convencionales y ensayos de neu­ tralización para la detección de la respuesta inmune humoral, los cuales se conocen en la técnica.
En el contexto de la invención, la respuesta inmune preferiblemente incluye una estimulación o proliferación de linfo­ citos T CD8 citotóxicos y/o linfocitos T CD4 y se puede determinar usando inmunoensayos tales como el ensayo ELIspot, el ensayo de citotoxicidad in vivo o el ensayo de unión con secreción de citocinas.
Tal y como se usa en este documento, el término "tratamiento" o "terapia" o "inmunoterapia" se refiere a uno cual­ quiera entre el alivio, mejora y/o eliminación, reducción y/o estabilización (p. ej., fallo en el progreso a estadios más avanzados) de un síntoma, así como un retraso en el progreso de la enfermedad o de un síntoma de la misma. Por lo tanto, el término incluye lograr una respuesta inmune antitumoral eficaz, observada en pacientes con cáncer. Tal y como se usa en este documento, el término "prevención" o "prevenir" se refiere al alivio, mejora y/o elimina­ ción, reducción y/o estabilización (p. ej., fallo en el progreso a estadios más avanzados) de un pródromo, es decir, cualquier alteración o síntoma temprano (o conjunto de síntomas) que puede indicar el inicio de una enfermedad antes de que aparezcan síntomas específicos.
Una célula que "sobreexpresa la telomerasa" se refiere a una célula en un sujeto, que expresa telomerasa, p. ej., después de una mutación o infección, especialmente una infección con un oncovirus, aunque generalmente no lo hace en condiciones normales, o a una célula en un sujeto que expresa un mayor nivel de telomerasa (por ejemplo, después de una mutación o infección), en comparación con las condiciones normales. Preferiblemente, la célula que sobreexpresa la telomerasa muestra un aumento de la expresión de al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más.
El "paciente" o "sujeto" es típicamente un sujeto mamífero, preferiblemente un sujeto humano, de cualquier edad, sexo o gravedad de la afección. Se incluyen mamíferos no humanos, incluidos gatos, perros, caballos, etc.
Las estructuras artificiales de ácido nucleico
En este documento se proporcionan estructuras artificiales de ácido nucleico que están diseñadas para permitir la vacunación en pacientes. En una primera realización, una mezcla de vectores de expresión de ADN codifica al me­ nos dos, preferiblemente al menos tres, epítopos de CD4 de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) y al menos un epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario. En consecuencia, la mezcla puede comprender al menos un vector de expresión de ADN que codifica al menos dos epítopos de CD4 de TERT (también denominada "estructura artificial de poliepítopos"), junto con al menos un vector de expresión de ADN que codifica al menos un epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario.
En otra realización, un único vector de expresión de ADN codifica al menos dos epítopos de CD4 de TERT y al me­ nos un epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario.
Las estructuras artificiales de ADN de la invención, que son preferiblemente ADN bicatenario, están en forma aisla­ da. Las estructuras artificiales de ácido nucleico no son un ácido nucleico genómico natural, en particular, no com­ prenden intrones.
Los epítopos de CD4
El vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN, codifica al menos 2, preferiblemente al menos 3, aún más preferiblemente al menos 4 epítopos de CD4 de TERT.
TERT es preferiblemente TERT humana, o TERT de otra especie, tal como TERT de gato o TERT de perro, cuando el sujeto que se va a tratar es un gato o un perro.
Sin embargo, ninguna de las estructuras artificiales de poliepítopos de la invención coincide con la secuencia que codifica la TERT de longitud completa, ni con las estructuras artificiales "aleatorias" descritas en el documento de solicitud de patente internacional WO2015/063117. Los epítopos de CD4 de TERT y las estructuras artificiales care­ cen de actividad catalítica telomerasa. Las estructuras artificiales de la invención codifican menos del 70% de los epítopos de CD4 de TERT, aún más preferiblemente, menos del 60%, menos del 50%, menos del 40%.
En una realización particular, la estructura artificial de poliepítopos codifica un polipéptido de menos de 160 aminoá­ cidos, preferiblemente menos de 120, cuya secuencia comprende al menos dos, preferiblemente tres, aún más pre­ feriblemente al menos cuatro epítopos de CD4 de TERT diferentes, en donde dichos epítopos están opcionalmente separados por un espaciador de aminoácidos.
El vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN, codifica entre 2 y 30 epítopos de CD4 de TERT, preferiblemente entre 2 y 20, 3 y 18, 3 y 15, 3 y 12, 4 y 10, o aún más preferiblemente entre 4 y 8, epítopos de CD4 de TERT.
La expresión "epítopo de TERT" se refiere a cualquier fragmento de aminoácido de TERT que es un determinante antigénico, es decir, es reconocido por las células del sistema inmune y es inmunogénico, es decir, puede provocar una respuesta inmune.
La expresión "epítopo de CD4 de TERT" se refiere a un fragmento de TERT que es capaz de unirse a moléculas del HLA de clase II y presentarse a los linfocitos T CD4. Los epítopos de CD4 más útiles de TERT también se denomi­ nan "UCPs" o "péptidos universales contra el cáncer", lo que significa que se expresan en la mayoría de los tumores. Los UCPs codificados por las estructuras artificiales de la invención se pueden unir a una amplia gama de alelos del HLA de clase II, más particularmente a un alelo del HLA-DR pero también a alelos de1HLA-DQ y HLA-DP. Los pép­ tidos también se denominan "péptidos del HLA de clase II". Preferiblemente, puede ser reconocido específicamente por linfocitos T anti-TERT. Se han descrito diversas secuencias de epítopos inmunogénicos de TERT. Véase, por ejemplo, el documento de solicitud de patente internacional WO2013/135553.
Las secuencias de epítopos de CD4 codificadas por la estructura artificial de la invención son secuencias peptídicas de 15 a 20 aminoácidos que se obtienen a partir de TERT. Preferiblemente, los péptidos son péptidos de 15 a 17 aminoácidos que se obtienen a partir de TERT.
Los péptidos tal y como se definen en el presente documento se pueden presentar como un complejo con una plura­ lidad de moléculas del HLA de clase II en la superficie de células tumorales o de células presentadoras de antígeno, por lo que son útiles en una mayoría de los pacientes.
Los péptidos son capaces de generar una respuesta de linfocitos Th CD4, preferiblemente una respuesta de linfocitos Th1, dirigida contra la proteína telomerasa, y tienen un efecto cooperador sobre la actividad citotóxica de los linfocitos T CD8.
Cuatro epítopos de CD4 son de particular interés: UCP1, UCP2, UCP3 y UCP4. Las secuencias de aminoácidos se presentan en la Tabla a continuación.
Tabla 4: Secuencias de UCPs
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Otros epítopos de CD4 incluyen péptidos sustancialmente homólogos que se obtienen a partir de SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4 a través de una o varias sustituciones. Preferiblemente, las sustituciones son conservadoras y/o mejoran la inmunogenicidad del péptido.
Ventajosamente, al menos uno de dichos epítopos de CD4 de TERT se selecciona a partir del grupo que consiste en UCP1, UCP2, UCP3 y UCP4.
En una realización particular, al menos dos epítopos de CD4 codificados por el vector de expresión de ADN o la mezcla de vectores de expresión de ADN, son distintos entre sí. Por ejemplo, el vector o la mezcla de vectores, puede codificar una secuencia de poliepítopos que comprende UCP1, UCP2, UCP3 y UCP4.
En otra realización particular, al menos dos epítopos de CD4 de TERT codificados por el vector de expresión de ADN o la mezcla de vectores de expresión de ADN, son idénticos y se repiten. Por ejemplo, el vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN, puede codificar una repetición de al menos dos, preferi­ blemente al menos tres, preferiblemente al menos cuatro, epítopos UCP2.
Las unidades polinucleotídicas que codifican los epítopos múltiples se pueden organizar en cualquier orden, conse­ cutivamente, es decir, el extremo 3' de la primera unidad polinucleotídica está directamente unido al extremo 5' de la segunda unidad polinucleotídica (y así sucesivamente), dando como resultado un polinucleótido que codifica una secuencia peptídica compuesta exclusivamente por epítopos consecutivos. Los epítopos múltiples alternativamente pueden estar separados por un espaciador de un aminoácido o un espaciador peptídico, es decir, lo que significa que las diferentes unidades polinucleotídicas están separadas por uno o varios codones que codifican respectiva­ mente uno o varios aminoácidos. Típicamente, los epítopos de CD4 de TERT pueden estar separados por aproxi­ madamente cuatro a seis aminoácidos de Gly.
Un experto en la materia puede determinar el orden en que se organizan los epítopos, de acuerdo con los siguientes criterios: algunos órdenes pueden facilitar la transcripción y/o la traducción del polinucleótido, pueden facilitar el transporte del poliepítopo expresado resultante al retículo endoplásmico (RE), especialmente si la conformación tridimensional afecta a las propiedades, y pueden facilitar el procesamiento del poliepítopo en varios epítopos o análogos y evitar el procesamiento de epítopos solapantes.
La sección experimental ilustra la invención utilizando los poliepítopos UCP1, UCP2, UCP3 y UCP4 (pUCPbasic) y UCP2 repetido 4 veces [pUCP2(4x)] como refuerzos. Sin embargo, varios otros epítopos de1HLA-DR (clase II) de hTERT, que fueron identificados a lo largo de la secuencia proteica de hTERT mediante predicción in silico, también son excelentes candidatos para mejorar las respuestas de CTLs (Tabla 5).
Tabla 5: péptidos del HLA-DR de hTERT previstos por el algoritmo NetMHCII
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Los candidatos a epítopo que se unen fuertemente (SB) se predijeron usando el algoritmo NetMHCII versión 2.2 (Nielsen y Lund, 2009). Las secuencias son las de hTERT de tipo silvestre (n° de orden NM_198253). La afinidad de los que se unen fuertemente se proporciona en nM. Umbral de los que se unen fuertemente <50 nM (en negrita).
Umbral de los que se unen débilmente >500 nM.
De acuerdo con la presente invención, la expresión "epítopo de CD4 de TERT" incluye cualquiera de las secuencias anteriores.
Los epítopos de CD8:
El epítopo de CD8 codificado por los vectores de la invención es un péptido que es capaz de activar una respuesta de linfocitos T CD8 contra un antígeno. Preferiblemente, dicho epítopo de CD8 es capaz de activar una respuesta antitumoral de CD8 o una respuesta de CD8 contra un antígeno vírico, bacteriano o parasitario. En una realización particular, el o los vectores codifican todo un antígeno o parte de un antígeno vírico, bacteriano o parasitario que comprende epítopos del MHC de clase I.
El o los vectores que comprenden dicho epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario codifican por tanto preferiblemente un antígeno de CD8 de longitud completa o sustancialmente completa, tumoral, vírico, bacteriano o parasitario, o fragmentos de epítopo de CD8 del mismo. Más ventajosamente, la presente invención hace uso de mutantes no oncogénicos de dichos antígenos de CD8. Ejemplos de péptidos de epítopos de CD8 se obtienen a partir de los siguientes antígenos: tirosinasa, alfafetoproteína, antígeno carcinoembrionario (CEA), CA-125, MUC-1, antígeno tumoral epitelial, antígeno asociado a melanoma, P1A, MART-1/Melan-A y gp 100/pMe1l7, así como la proteína relacionada con tirosinasa pg75 y MUM-1, HER2/neu, proteínas del virus del papiloma humano E6 y E7, survivina, GnT-V, beta-catenina, CDK4, p15, MAGE1, MAGE3, BAGE, GAGE, PSMA, tAr P, STEAP, HTLV-1 Tax y WT1.
Ejemplos de péptidos de epítopos de CD8 incluyen, pero no se limitan a: gp100.154, NA17-A.nt38 y Melan-A/MART-1.27, CEA.571, Tyrosinase.368-N, p53.65, Her2/neu.369-377, gp100.209, gp100.280, gp100.476, Tyrosinase.368-D, MAGE-3.271 y Her2/neu.654, gp100.457, Melan-A/MART-1.32, p53.149, p53.264, Sur1M2 y HPV E7.86.
En una realización particular, dicho epítopo de CD8 es un mutante no oncogénico del antígeno E7 de HPV. Ese antígeno muestra varios epítopos de clase I y carece de epítopos de alta afinidad hacia determinantes de1HLA de MHC de clase II. Por lo tanto, los enfoques de vacunas de ADN dirigidas solo a E7 siempre han dado resultados decepcionantes (Chen et al., 2000). La presente invención mejora la respuesta inmune contra ese antígeno, que es particularmente útil en el tratamiento del cáncer de cuello uterino.
Vectores y administración
Los vectores de expresión usados en la presente invención pueden proporcionar una expresión in vitro y/o in vivo (por ejemplo, en una célula hospedadora adecuada, un organismo hospedador y/o un sistema de expresión). Típi­ camente comprenden una secuencia de polinucleótidos como se ha definido anteriormente, y secuencias regulado­ ras (tales como uno o varios promotores, potenciadores, terminadores adecuados, etc.) que permiten la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) del producto proteico en la célula hospedadora o el organismo hospedador. Los vectores de acuerdo con la invención pueden estar en forma de un vector, tal como, por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un YAC, un vector viral o un transposón.
En un aspecto preferido pero no limitante, un vector de la invención comprende i) al menos un ácido nucleico como se ha descrito anteriormente; conectado funcionalmente a ii) uno o varios elementos reguladores, tales como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado; y opcionalmente también iii) uno o varios elementos adicionales de estructuras artificiales genéticas tales como secuencias 3'-UTR o 5'-UTR, secuencias líderes, marcadores de selección, marcadores de expresión/genes informadores y/o elementos que pueden facilitar o aumentar (la eficacia de) la transformación o integración.
En realizaciones particulares, el o los vectores utilizados en la invención pueden comprender insertos adicionales que codifican adyuvantes moleculares (citocinas, quimiocinas o moléculas coestimuladoras), secuencias cortas de ADN que promueven la presentación del antígeno del MHC, p. ej., IMX313, tecnología IMAXIO (oligomerización del antígeno), complementos que ayudan al antígeno a penetrar en un compartimento celular específico (por ejemplo, LAMP-1) o que pueden actuar como adyuvantes para estimular o dirigir la respuesta inmune.
En una realización particular, la estructura artificial genética se puede preparar digiriendo el polímero de ácido nu­ cleico con una endonucleasa de restricción y clonando en un plásmido que contiene un promotor tal como el promo­ tor de SV40, el promotor de citomegalovirus (CMV) o el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV).
Otros vectores incluyen vectores retrovirales, vectores de lentivirus, vectores de adenovirus, vectores del virus vaccinia, vectores del virus de la viruela, vectores del virus de sarampión y vectores asociados a adenovirus.
En una realización particular, se proporciona un kit que comprende
a. un primer recipiente que contiene al menos un vector de expresión de ADN que codifica dichos al menos dos epítopos de CD4 de TERT y
b. un segundo recipiente que contiene al menos un vector de expresión de ADN que codifica al menos un epíto­ po de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario.
El kit puede proporcionar además al menos un recipiente adicional que contiene al menos otro vector de expresión de ADN que codifica al menos otro epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario. Esos kits pueden ser particularmente útiles en un contexto de vacunación contra una pluralidad de antígenos tumorales, víricos, bacteria­ nos o parasitarios diferentes. Esos antígenos se pueden obtener a partir de la misma proteína, o a partir de diferen­ tes proteínas, pueden ser expresados por el mismo tumor o diferentes tipos de tumor, o por el mismo agente vírico, bacteriano o parasitario o por diferentes tipos.
El vector de expresión de ADN que codifica dichos al menos dos epítopos de CD4 de TERT y el vector de expresión de ADN que codifica al menos un epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario, si se proporcionan en recipientes distintos, se administran preferiblemente de manera simultánea o sustancialmente simultánea. En una realización particular, se inyectan tópicamente uno cerca del otro.
En una realización particular, los recipientes o las especies se pueden mezclar de manera extemporánea o por ade­ lantado antes de la administración al sujeto.
Se pueden preparar composiciones que comprenden dicho(s) vector(es). Las composiciones son inmunogénicas. Pueden comprender un vehículo o excipientes que son adecuados para la administración en seres humanos o ma­ míferos (es decir, no tóxicos y, si es necesario, estériles). Esos excipientes incluyen diluyentes líquidos, semisólidos o sólidos que sirven como vehículos farmacéuticos, agentes isotónicos, estabilizadores o cualquier adyuvante. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizadores incluyen albúmina, entre otros. En la composición de la vacuna se puede usar cualquier adyuvante conocido en la técnica, incluidos adyuvan­ tes a base de aceite tales como el adyuvante completo de Freund y el adyuvante incompleto de Freund, adyuvantes a base de micolato, lipopolisacárido bacteriano (LPS), peptidoglucanos, proteoglicanos, hidróxido de aluminio, saponina, DEAE-dextrano, aceites neutros (como el migliol), aceites vegetales (como el aceite de arachis), polioles de Pluronic®.
Los vectores o la composición se pueden administrar directamente o se pueden incluir en liposomas o recubrir partí­ culas de oro coloidal antes de la administración. Las técnicas para incluir vacunas de ADN en liposomas se conocen en la técnica, por ejemplo, a partir de Murray, 1991. De manera similar, las técnicas para recubrir partículas de oro con ADN desnudo se indican en Yang, 1992, y en Adolph, 1996 se encuentran técnicas para la expresión de proteí­ nas usando vectores víricos.
Las composiciones de vacuna se administran preferiblemente por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular, den­ tro de los tumores o en cualquier tipo de órganos linfoides y se administran en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmune en el organismo hospedador. Está disponible una variedad de técnicas, como la electroporación (p. ej., utilizando Cliniporator, IGEA, BTX, Harvard Apparatus), enfoques sin agujas, como el bombardeo de partículas (p. ej., el dispositivo PMED de Pfizer) y el suministro a alta presión (p. ej., dispositivos Biojector, Bioject Medical Technologies), parches dérmicos (p. ej., DermaVir, Genetic Immunity), formulación de una vacuna de ADN en micropartículas o liposomas (p. ej., la formulación en el compuesto lipídico Vaxfectin, Vical).
En una realización preferida, la administración comprende una etapa de electroporación, también indicada en esta memoria con el término "electrotransferencia", además de la etapa de inyección (como se describe en Mir 2008, Sardesai y Weiner 2011). En una realización más ventajosa, el protocolo de electrotransferencia es como se descri­ be en el documento de solicitud de patente internacional WO2015/063112.
Si bien se entenderá que la cantidad de material necesario dependerá de la inmunogenicidad de cada estructura artificial individual y no se puede predecir a priori, el proceso para determinar la dosificación apropiada para cual­ quier estructura artificial dada, es sencillo. Específicamente, una serie de dosificaciones de tamaño creciente, co­ menzando en aproximadamente 5 a 30 gg, o preferiblemente 20-25 gg, hasta desde aproximadamente 500 gg a aproximadamente 5 mg, preferiblemente hasta 500-1500 gg, 500-1200 gg o 500-1000 gg, por ejemplo, se administra a las especies correspondientes y se observa la respuesta inmune resultante, por ejemplo, mediante la detección de la respuesta inmune celular a través de un ensayo Elispot con IFNy (como se describe en la sección experimental), mediante la detección de respuestas de CTLs utilizando un ensayo de lisis in vivo o un ensayo de liberación de cro­ mo o detectando la respuesta de Ths (linfocito T cooperador) utilizando un ensayo de liberación de citocinas.
En una realización preferida, el régimen de vacunación comprende de una a tres inyecciones, preferiblemente repe­ tidas tres o cuatro semanas después.
En una realización particular, la pauta de vacunación puede estar compuesta por una o dos inyecciones seguidas tres o cuatro semanas después, por al menos un ciclo de tres a cinco inyecciones. En otra realización, una primera dosis consiste en una a tres inyecciones, seguida por al menos una dosis de refuerzo cada año, o cada dos años, por ejemplo.
Estos son solo ejemplos, y cualquier otro régimen de vacunación está incluido en esta memoria.
Usos terapéuticos
Se describe un método para tratar un tumor o una infección en un paciente que lo necesita, cuyo método comprende administrar a dicho paciente los vectores o la mezcla de vectores descritos en este documento.
Los vectores utilizados en la presente invención inducen especialmente linfocitos T CD4 polarizados a Th1 con avi­ dez elevada, que mejoran significativamente las respuestas de CTLs contra antígenos débilmente inmunogénicos.
Los vectores o la mezcla de vectores tal y como se ha descrito anteriormente, es útil en un método para prevenir o tratar un tumor en un paciente.
Se describe un método para prevenir o tratar un tumor en un paciente, cuyo método comprende administrar una cantidad eficaz de dicho ácido nucleico o composición inmunogénica a un paciente que lo necesite. Dicho ácido nucleico o composición inmunogénica se administra en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune en el paciente.
El tumor puede ser cualquier proliferación no deseada de células, en particular un tumor benigno o un tumor ma­ ligno, especialmente un cáncer.
El cáncer puede estar en cualquier estadio de desarrollo, incluido el estadio metastásico. El cáncer puede ser cróni­ co o no crónico (agudo).
En otra realización, la descripción también se refiere a una vacuna útil para prevenir un tumor.
En una realización particular, el tumor es un cáncer sólido o un carcinoma. Los ejemplos incluyen melanoma, tumor cerebral tal como glioblastoma, neuroblastoma y astrocitoma y carcinomas de la vejiga, mama, cuello uterino, colon, pulmón, especialmente cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer de páncreas, próstata, cabeza y cuello o cáncer de estómago.
En otra realización, el tumor puede ser un tumor líquido, p. ej., un tumor hematopoyético o leucemia, tal como una leucemia linfocítica crónica o aguda, leucemia mieloide crónica o aguda, linfoma que incluye la enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple, mieloma maligno. Preferiblemente, el paciente que se va a tratar se ha sometido o está a punto de someterse a una terapia convencional, lo más preferiblemente una terapia convencional de primera línea. En una realización particular, el tratamiento se puede combinar con una terapia convencional, que incluye quimiote­ rapia, radioterapia o cirugía. Las combinaciones con moléculas inmunomoduladoras adyuvantes tales como GM-CSF o una citocina como IL-2 o IL-12, también podrían ser útiles.
En otra realización, el paciente puede estar infectado con un virus, un parásito o una bacteria. Los ejemplos de virus incluyen virus del papiloma, virus del herpes simple, virus de la hepatitis, adenovirus, mixovirus tal como la gripe, paramixovirus, poxvirus tal como la variolovacuna, lentivirus tal como el VIH.
Los Ejemplos y las Figuras ilustran la invención sin limitar su alcance.
Ejemplos
EJEMPLO 1: Inducción de una respuesta contra el antígeno E7 de HPV16 después de una administración conjunta de plásmidos de ADN
Se demostró que los epítopos de CD4 de hTERT universales codificados por diversas estructuras artificiales de ADN desempeñaban un papel cooperador en la inducción de una respuesta de CTLs contra el antígeno E7 de HPV16, después de una administración conjunta de plásmidos de ADN mediante inyección intradérmica combinada con electroporación. Ratones transgénicos HLA-A2/DR1 se inmunizaron con estructuras artificiales de ADN que codifi­ caban epítopos de CD4 obtenidos a partir de hTERT (a saber, UCP por “Universal Cancer Peptides”) en presencia de un plásmido que codificaba un mutante no oncogénico del antígeno E7 de HPV16. Diez días después de una segunda inmunización con plásmidos (refuerzo), se evaluó la frecuencia de las respuestas inmunitarias de los linfocitos T CD4 y CD8 en el bazo de los animales mediante un ensayo ELISpot con IFN-y. Los subconjuntos de linfocitos T funcionalmente polarizados se identificaron en función de sus patrones distintivos de secreción de citocinas, utili­ zando un ensayo CBA.
Abreviaturas
HLA-A2/DR1: ratones HLA-A*0201/HLA-DRB1*0101 transgénicos, H2 de clase I/clase II KO, CBA: matriz de esferas citométricas, CTL: linfocito T citotóxico, ADN: ácido desoxirribonucleico, EP: electroporación, HLA: antígeno leucocitario humano, HPV16: virus del papiloma humano de tipo 16, hTERT: TERT humana, ID: intradérmico, IL: interleucina, IFN-y: interferón gamma, MHC: complejo principal de histocompatibilidad, TAA: antígeno asociado a tumores, TERT: transcriptasa inversa de la telomerasa, TNF-a: factor de necrosis tumoral alfa, RT: temperatura ambiente, wt: tipo silvestre, UCP: péptido universal del cáncer
Materiales y métodos
Vectores de ADN plasmídico
pUCPbasic
pUCPbasic es un vector de expresión plasmídico de 5717 pb que codifica epítopos de la clase II obtenidos a partir de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT), a saber, UCP1, UCP2, UCP3 y UCP4 (101 AA), liga­ dos con un marcador V5 de 14 AA (Figura 1, Figura 8), correspondiente a un polipéptido de aproximadamente 12,7 kDa de peso molecular. La secuencia de inserción de hTERT se compone de cuatro fragmentos: AA 2-26, AA 27-51, AA 52-76, AA 77-101 correspondientes respectivamente a hTERT de tipo silvestre (n° de orden NM_198253): AA 39­ 63 de hTERT, AA 573-597 de hTERT, AA 911-935 de hTERT y AA 1036-1060 de hTERT, que incluye epítopos de UCP-1-4 de clase II y sus secuencias flanqueantes de 5 AA. Estos fragmentos contienen cuatro epítopos bien carac­ terizados CD4+ de hTERT de 15 meros (TERT 44-58 PAAFRALVAQCLVCV (SEQ ID NO: 1), TERT 578-592 KSVWSKLQSIGIRQH (SEQ ID NO: 2), TERT 916-930 GTAFVQMPAHGLFPW (SEQ ID NO:3), TERT 1041-1055 SLCYSILKAKNAGMS (SEQ ID NO: 4) y dos epítopos internos CD8+ de la telomerasa de 9 meros (Godet et al.
2012; Suso et al. 2011).
pUCP2(4x)
pUCP2(4x) es un vector de expresión plasmídico de 5717 pb que codifica el epítopo de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana CD4+ 578-592 (KSVWSKLQSIGIRQH, (SEQ ID NO: 2), n° de orden NM_198253) con secuen­ cias flanqueantes de 5 AA en cada lado. Esta unidad de epítopo de UCP2 se repite cuatro veces y se une con un marcador de epítopo V5 de 14 AA (Figura 2, Figura 9), que se corresponde con un polipéptido de aproximadamente 12,7 kDa de peso molecular.
pDE7
pDE7 es un vector de expresión plasmídico de 5708 pb que codifica una variante no oncogénica de E7 de HPV16 (98 AA) (Wieking et al., 2012) unida con un marcador de epítopo V5 de 14 AA (Figura 3, Figura 10), que se corres­ ponde con una proteína de aproximadamente 14-15 kDa de peso molecular. Para disminuir el riesgo asociado con la entrega del E7 de HPV oncogénico, se mutaron cuatro regiones oncogénicas conocidas dentro de E7 (Munger et al., 2004). Las mutaciones introducidas en E7 evitan su capacidad de unirse/inactivar pRb y para asociarse con Mi2p que potencia el crecimiento celular (Brehm et al., 1999).
Síntesis génica y clonación
Los genes se sintetizaron mediante un procedimiento de ensamblaje de oligonucleótidos de 40 meros solapantes (GeneCust, Luxemburgo) e incluían sitios de restricción únicos flanqueantes HindIII/XhoI. Los genes sintéticos se clonaron entre los sitios de restricción HindIII y XhoI del vector de expresión pcDNA3.1(+) (Life Technologies, Carlsbad, EE.UU.). pcDNA3.1 (+) es un vector de 5,4 kb obtenido a partir de pcDNA3.0 que se había diseñado para tener un nivel elevado de expresiones estables y transitorias en células de mamífero. Ese vector contiene el promotor inmediato-temprano de citomegalovirus humano (CMV-IE) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimien­ to bovina (BHG-poliA) como secuencia de terminación.
Producción de plásmidos exentos de endotoxinas
Los plásmidos fueron transformados y se produjeron en células de E. coli 5-alfa (fhuA2A(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 080 A(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17) (Lucigen Corporation, Middleton, EE.UU., ref.
60602-2) por RD Biotech (Besangon, Francia). Los plásmidos exentos de endotoxinas se resuspendieron en 1x PBS estéril a 4 mg/ml. Las estructuras artificiales se verificaron mediante digestión con enzimas de restricción.
Cultivo celular y transfección transitoria
Las células HEK293T se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternera fetal termoinactivado al 10% (PAA, Velizy-Villacoublay, Francia) y 1% de penicilina/estreptomicina (Life technologies SAS, Saint-Aubin, Francia).
Las células se cultivaron como monocapas en matraces de 75 cm2 a 37°C en una atmósfera humidificada que con­ tenía 5% de CO2. Se sembraron 8x105 células en placas de cultivo de tejidos de seis pocillos y se incubaron durante 24 h. Las células se cultivaron hasta tener un 70-80% de confluencia el día de la transfección.
Las estructuras artificiales pUCPbasic, pUCP2(4x), pDE7 se transfectaron en células diana usando el reactivo de transfección de polímero catiónico jetPrime (Polyplus-transfection Inc., Illkirch, Francia). Se utilizaron células transfectadas con el plásmido pcDNA3.1 como control negativo. Después de 48 horas de transfección, las células se recogieron y se analizaron para estudiar la expresión.
Transferencia Western
Las células HEK293T transfectadas con pUCPbasic, pUCP2(4x), pDE7 y pcDNA3.1 se lisaron sobre hielo durante 20 minutos en tampón RIPA (Sigma Aldrich SARL, Saint-Quentin Fallavier, Francia) complementado con una mezcla de inhibidores de proteasa (Roche Diagnostic, Indianapolis, EE.UU.). Los lisados se eliminaron por centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4°C. Se recogió el material sobrenadante y se midió la concentración de proteína usando el ensayo colorimétrico de Bradford.
La proteína pDE7 se inmunoprecipitó usando perlas de agarosa conjugadas con anti-V5 (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Las células se lisaron con un tampón de lisis celular que contenía NaCl 125 mM, Tris 50 mM pH 8, EDTA 25 mM pH8 y NP40 al 0,5% durante 15 min y se centrifugaron a 1600 rpm durante 5 min, y después se añadieron 20 pl de agarosa anti-V5 (Abcam). Las muestras se sometieron a rotación durante la noche a 4°C y se lavaron tres veces con tampón de lisis celular frío.
Todas las muestras de proteínas se volvieron a suspender en 1x tampón de muestra (Life technologies SAS, Saint-Aubin, Francia), se desnaturalizaron 5 minutos a 90°C, se separaron en geles de Nu-PAGE® Novex con Bis-Tris al 4-12% (Life Technologies) y se sometieron a una electrotransferencia sobre membranas de PVDF (apilamiento para la transferencia iBlot®, Life Technologies) utilizando el dispositivo iBlot® (Life Technologies). Se usó el marcador de proteínas ProSieve™ QuadColor™ (Lonza, Levallois-Perret, Francia) para determinar el peso molecular. Las mem­ branas se cortaron aproximadamente a 40 kDa y se bloquearon con PBS 1X, Tween®20 al 0,05%, leche al 3%. La parte inferior de la membrana se analizó con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-V5 (Life Technologies) diluido 1/5000 y la parte superior se analizó con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-p-actina (Sigma Aldrich SARL, Saint-Quentin Fallavier, Francia) diluido 1/5000. A continuación, las membranas se incubaron con un anticuerpo anti­ ratón unido a HRP (GE Healthcare, Vélizy, Francia) diluido 1/5000 y las proteínas se detectaron mediante un ensayo de quimioluminiscencia mejorado, usando el kit de reactivos de sustrato quimioluminiscente de HRP ECL. Las mem­ branas se visualizaron en un sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, Francia) y se analizaron utili­ zando el programa informático Image Lab 5.2.1 (Bio-Rad).
Ratones
Ratones transgénicos HLA-A*0201/DRB1*0101 (HLA-A2/DR1) (13-16 semanas de edad) fueron suministrados por el Institut Pasteur (París, Francia) o CDTA-TAAM (Orleans, Francia). Esos ratones expresan los dominios a1a2 de HLA-A*0201 humano y el dominio a3 murino de la molécula H2-D, la p2-microglobulina humana y las moléculas HLA-DRB1 *0101 y HlA-DRA*0101. Están desactivados los genes H2-Db, H2-Kb e IAb (Pajot et al., 2004).
Los animales se alojaron en las instalaciones para animales exentas de agentes patógenos del Institut Pasteur. Todos los animales fueron manejados de forma estrictamente conforme con la buena práctica animal y cumpliendo con la experimentación local con animales (Directiva 2010/63/UE).
Inmunización
Antes del tratamiento, los ratones se anestesiaron con una solución mixta de xilacina al 2% (Rompun, Bayer Santé, Loos, Francia) y ketamina al 8% (Imalgen 1000, Merial, Lyon, Francia) en PBS (Life technologies SAS, Saint-Aubin, Francia) a través de la vía intraperitoneal (IP) según el peso de cada animal y la duración de la anestesia. Los plásmidos se inyectaron después por vía intradérmica (ID) en la parte inferior de la espalda el día 0 (cebado) y el día 21 (refuerzo) y se electroporaron. Brevemente, inmediatamente después de la inyección ID, se realizó un pliegue en la piel en el sitio de la inyección, completamente cubierto con un gel conductor y colocado entre las placas de electro­ dos del dispositivo de electroporación (CLINIPORATOR® 2, IGEA, Carpi, Italia). Se aplicaron dos impulsos con volta­ jes (HV-LV) como se describe a continuación. Los grupos experimentales se definieron como se resume en la Tabla 6.
Tabla 6: Distribución de la numeración de ratones y las condiciones de tratamiento
Figure imgf000015_0001
ID = intradérmica;
Péptidos
Para los análisis de la respuesta inmune, los péptidos de hTERT restringidos a HLA-DR y los péptidos de E7 restrin­ gidos a HLA-A*0201 se describieron previamente o se determinaron mediante predicción in silico de epítopos usan­ do los algoritmos SYFPEITHI (www.syfpeithi.de) Rammensee et al., 1999) o NetMHCII 2.2 (Nielsen y Lund, 2009) disponibles en línea. Todos los péptidos sintéticos se compraron liofilizados (>90% de pureza) en Proimmune (Ox­ ford, Reino Unido). Los péptidos liofilizados se disolvieron en agua estéril a 2 mg/ml y se almacenaron a -80°C antes de su uso. Los detalles de las secuencias de los péptidos y las restricciones del MHC se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7: Péptidos de hTERT y E7 con MHC restringido
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000016_0001
Ensayo ELISpot con I FN-y
Diez días después de la vacunación de refuerzo, los ratones fueron sacrificados mediante narcosis con CO2 y se extirparon los bazos. A continuación, los bazos se machacaron y las suspensiones de esplenocitos se filtraron a través de una malla de nailon de 70 pm (Cell Strainer, BD Biosciences, Pont-de-Claix, Francia), se purificaron en ficol (medio de separación de linfocitos, Eurobio, Les Ulis, Francia) y se numeraron usando el contador Cellometer® Auto T4 Plus (Ozyme, Montigny-le-Bretonneux, Francia). Después se añadieron los esplenocitos purificados a microplacas de PVDF de ELISpot (kit de ELISpot con IFN-y, Diaclone, Besangon, Francia) recubiertas con un anticuer­ po anti-IFN-Y de ratón a 2 x 105 células/pocillo por triplicado y estimulados con 5 pg/ml de péptidos (véase la Tabla 7), 10 pg/ml de PMA-ionomicina (Sigma-Aldrich), o estimulados de forma simulada con medio de cultivo exento de suero. Para contar el número de células secretoras de I FN-y específicas del antígeno E7 y hTERT, se usaron tres grupos de péptidos diferentes: CD4+ hTERT (grupo 1), CD4 E7 (grupo 2) o CD8 E7 (grupo 3) (Tabla 7). Después de 19 horas, las manchas se revelaron con un anticuerpo de detección anti-IFNy conjugado con biotina, seguido de estreptavidina-HRP y solución de sustrato BCIP/NBT. Se contaron las manchas y se analizaron utilizando el recuen­ to y el programa informático de ImmunoSpot® ELISpot (Cellular Technology Limited, Bonn, Alemania).
Ensayo de unión a citocinas (CBA)
Esplenocitos (6x105 células) procedentes de ratones HLA-A2/DR1 vacunados, se cultivaron durante 24 h a 37°C con péptidos obtenidos a partir de hTERT con HLA-DR restringido, procedentes del grupo 1, con una concentración final de 5 pg/ml. El material sobrenadante del cultivo de citocinas se recuperó y se mantuvo congelado a -20°C hasta la prueba. Se usó el kit de matriz de perlas citométricas Th1/Th2/Th17 de ratón (CBA, BD Biosciences) para cuantificar, respectivamente, la concentración de IL-2, IFN-y, TNF-a, IL-4, IL-6, IL-10 e IL-17a. El inmunoensayo CBA se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La citometría de flujo se realizó usando el citómetro de flujo FACScan LSRII (BD Biosciences). Se generaron resultados cuantitativos utilizando el programa informático de FCAP Array TM versión 3.0 (Becton Dickinson, Pont-de-Claix, Francia).
Análisis estadístico
Las diferencias entre dos grupos se evaluaron mediante una prueba t no emparejada o una prueba U de Mann y Whitney no paramétrica. La prueba del coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para evaluar la correlación entre las respuestas de hTERT de clase II y E7 de clase I en ratones inmunizados. Todos los análisis informáticos se realizaron con GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc. La Jolla, CA, EE. UU.). Los valores de p <0,05 se consi­ deraron estadísticamente significativos.
Resultados
Caracterización y análisis de la secuencia de estructuras artificiales
Los transgenes de ADN que expresaban las proteínas UCPbasic, UCP2(4x) y DE7 se sintetizaron y clonaron en un vector de expresión pcDNA3.1(+) de Life Technologies, tal y como se muestra mediante digestión con enzimas de restricción y electroforesis (Figura 4). Los insertos y las uniones se secuenciaron usando cebadores de T7 (5' TAATACGACTCACTATAGGG 3' directo, (SEQ ID NO: 36)) y/o de BGH (5' TAGAAGGCACAGTCGAGG 3' inverso (SEQ ID NO: 37) que coincidían con la secuencia del vector que flanqueaba el ADN del inserto (véase la Tabla 8). Los resultados de la secuenciación confirmaron que los transgenes se habían sintetizado y clonado correctamente. Tabla 8: Caracterización de las estructuras artificiales basándose en un cartografiado de restricción y secuenciación de ADN
Figure imgf000017_0001
* Tamaños del producto de la digestión (pb) y fragmentos generados
Expresión transgénica in vitro
La expresión de los polipéptidos pUCPbasic y pUCP2(4x), así como la proteína pDE7 se evaluó mediante un ensayo de transferencia Western. Las estructuras artificiales se transfectaron transitoriamente en la línea celular HEK293T, que se cultivó a continuación durante 48 horas. Los polipéptidos pUCPbasic y pUCP2(4x) se identificaron con un peso molecular de aproximadamente 12,6 y 12,8 kDa, respectivamente. Se observaron dos bandas adicionales para UCP2(4x) (aproximadamente 11 y 9 kDa) que se pueden explicar por la degradación de proteínas (Figura 5a). Por razones desconocidas, era difícil detectar la proteína DE7 directamente por transferencia Western (Figura 5a). Fue necesaria una etapa de inmunoprecipitación usando perlas de agarosa conjugadas con anti-V5 para lograr este objetivo (Figura 5b). La proteína pDE7 se detectó con el peso molecular esperado de aproximadamente 14,5 kDa. Las células transfectadas con pcDNA3.1 se usaron como control negativo. Estos resultados validan in vitro el patrón de expresión y la identidad de las estructuras artificiales de ADN de pUCPbasic, pUCP2(4x) y pDE7.
Los epítopos de hTERT cooperadores aumentan las respuestas inmunes específicas de E7 en ratones transgénicos para el HLA
Para determinar la frecuencia de los linfocitos T específicos de hTERT CD4+ y E7 CD8+/CD4+ en ratones transgé­ nicos HLA-A2/DR1 inmunizados con pUCPbasic, pUCP2(4x) y pDE7, se realizaron análisis ELISpot con I FN-y. Como se muestra en la Figura 6a, la inmunización con pUCPbasic o pUCP2(4x) inducía una fuerte respuesta inmu­ ne celular específica de hTERT CD4+. Como se esperaba, no se detectó ninguna respuesta inmune específica de E7 CD4+ (Figura 6b) ya que la proteína E7 no presenta epítopos de clase II de alta afinidad. Una coinmunización de pUCPbasic o pUCP2(4x) con pDE7 mostraba una respuesta inmune específica de E7 CD8+ significativa (Figura 6c). En comparación con la vacuna de ADN pDE7+pcDNA3.1, pDE7 coinmunizado con pUCPbasic o pUCP2(4x), era potente para dirigir una respuesta inmune específica de E7, lo que sugiere que las estructuras artificiales pUCPbasic y pUCP2(4x) eran capaces de aumentar significativamente la magnitud de las respuestas inmunes celulares CD8+ contra el antígeno E7.
Se observó una correlación positiva entre la intensidad de las respuestas inmunes específicas de hTERT CD4+ de clase II y E7 CD8+ de clase I, tanto individualmente (Figura 6a, c, véanse los puntos numerados correspondientes al número de identificación del animal) como cuando se sumaban (Figura 6d).
Por lo tanto, el mayor nivel de respuesta de los linfocitos T CD4 era directamente proporcional a la magnitud de la expansión de los linfocitos T CD8 para cada animal. Un análisis de los datos utilizando la prueba del coeficiente de correlación de Pearson indicaba que la intensidad de la correlación entre las respuestas CD4+ y CD8+ era muy alta (R2 = 0,95) y estadísticamente significativa (p = 0,005) al menos para pUCP2(4x) (Figura 6e). Ese análisis era menos fiable para pUCPbasic (R2= 0,42, p = 0,35) probablemente debido al bajo número de animales incluidos en este estudio (Figura 6f).
Finalmente, con el fin de evaluar el papel de la respuesta inmune Th1/Th2, se examinaron las diferentes citocinas secretadas por linfocitos T CD4 específicos de hTERT. Con este objetivo, se estimularon esplenocitos de ratones transgénicos vacunados procedentes de un segundo experimento independiente in vitro durante 24 horas, con un grupo de péptidos de hTERT o se dejaron sin estimular. El material sobrenadante se recuperó y se analizó en un ensayo de unión a citocinas (CBA). Se detectaron concentraciones elevadas de citocinas de Th1 IFN-y, TNF-a, IL-2 y de Th2 IL-6, pero no IL-4, IL-10 e IL-17 en el material sobrenadante del cultivo de esplenocitos recuperados a partir de ratones vacunados con pUCPbasic y pUCP2(4x), en comparación con las de los ratones de control (pDE7 pcDNA3.1 y pcDNA3.1) (Figura 7). Ese resultado indica que la inmunización con UCP inducía preferentemente una respuesta inmune polarizada a Th1 in vivo.
Por lo tanto, la vacunación con pUCPbasic o pUCP2(4x) induce una respuesta específica de linfocitos T CD4 polari­ zadas a Th1 y puede promover la expansión de linfocitos T CD8 específicos de E7 in vivo.
Conclusión
Los resultados mostraban que las estructuras artificiales de ADN de poliepítopos CD4 de hTERT se procesaban correctamente y se presentaban a linfocitos T CD4 en ratones transgénicos HLA-A2/DR1 en el contexto de una restricción del HLA de clase II y podían generar linfocitos Th1 CD4 eficientes que producen principalmente IFN-y, TNF-a e IL-2. Además, la respuesta de los linfocitos Th1 CD4 de hTERT está altamente correlacionada con la res­ puesta de los linfocitos T CD8 contra el antígeno E7 y mejora fuertemente la respuesta inmune de los linfocitos T CD8 contra los epítopos restringidos a la clase I de E7 y, por lo tanto, la eficacia de una vacunación con el antígeno E7.
Estos resultados confirman que es posible aumentar la intensidad y la calidad de la respuesta inmune contra antígenos poco inmunogénicos, complementando la formulación de una vacuna con epítopos de Th1 CD4 a través de un enfoque de entrega de ADN.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN que codifica al menos dos epítopos de CD4 de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) y al menos un epítopo de CD8 tumoral, vírico, bac­ teriano o parasitario; en donde dichos al menos dos epítopos de CD4 de TERT son idénticos y están repetidos.
2. La mezcla de vectores de expresión de ADN según la reivindicación 1, que comprende i) al menos un vector de expresión de ADN que codifica dichos al menos dos epítopos de CD4 de TERT y ii) al menos un vector de expresión de ADN que codifica dicho al menos un epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario.
3. El vector de expresión de ADN según la reivindicación 1, que codifica dichos al menos dos epítopos de CD4 de TERT y dicho epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario.
4. El vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN según cualquiera de las reivindi­ caciones 1 a 3, en donde dicha TERT es TERT humana.
5. El vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN según cualquiera de las reivindi­ caciones 1 a 4, que codifica entre 4 y 10, preferiblemente entre 4 y 8, de dichos epítopos de CD4 idénticos de TERT.
6. El vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN según cualquiera de las reivindi­ caciones 1 a 5, en donde al menos uno de dichos epítopos de CD4 de TERT se selecciona a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, preferiblemente en donde el vector o una mezcla de vectores codifica una secuencia poliepitópica que comprende todas las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
7. El vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN según la reivindicación 6, que codifica una repetición de al menos dos, preferiblemente al menos cuatro, epítopos de SEQ ID NO: 2.
8. El vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN según cualquiera de las reivindi­ caciones 1 a 7, que codifican, como dicho epítopo de CD8, todo o parte de un antígeno vírico, bacteriano o parasita­ rio que comprende epítopos del MHC de clase I, preferiblemente un mutante no oncogénico del antígeno E7 del HPV.
9. Un kit que comprende
a. un primer recipiente que contiene al menos un vector de expresión de ADN que codifica dichos al menos dos epítopos de CD4 de TERT; en donde dichos al menos dos epítopos de CD4 de TERT son idénticos y están re­ petidos, y
b. un segundo recipiente que contiene al menos un vector de expresión de ADN que codifica un epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario.
10. El kit según la reivindicación 9, que comprende además al menos un recipiente adicional que contiene al menos un vector de expresión de ADN que codifica otro epítopo de CD8 tumoral, vírico, bacteriano o parasitario distinto.
11. El vector de expresión de ADN o una mezcla de vectores de expresión de ADN según cualquiera de las reivindi­ caciones 1 a 8, o el kit según la reivindicación 9 o 10, para uso en el tratamiento de un tumor o una infección en un paciente.
12. El vector de expresión de ADN, una mezcla de vectores de expresión de ADN o el kit para uso según la reivindi­ cación 11, en donde el tumor es un cáncer, tal como un cáncer seleccionado a partir del grupo que consiste en leu­ cemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, mieloma múltiple, mieloma maligno, enfermedad de Hodgkin, melanoma, tumor cerebral tal como glioblastoma, neuroblastoma y astrocitoma y carcinomas de vejiga, mama, cue­ llo uterino, colon, pulmón, páncreas, próstata, cabeza y cuello o estómago, preferiblemente en donde el tumor es un cáncer inducido por un virus.
13. El vector de expresión de ADN, una mezcla de vectores de expresión de ADN o el kit, para uso según la reivindi­ cación 11 o 12, administrado mediante inyección intradérmica, preferiblemente combinada con electroporación.
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