ES2807212T3 - Nuevas fitasas y usos de las mismas - Google Patents

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Goutami Banerjee
Khin Oo
Xiyun Zhang
Jie Yang
Yingxin Zhang
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Abstract

Una composición que comprende una variante de enzima fitasa, en la que dicha variante de fitasa comprende una sustitución de aminoácidos Y255D en comparación con la SEQ ID NO: 1, y además en la que la variante de fitasa comprende las sustituciones de aminoácidos I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P y es al menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 5; en la que la variante de enzima fitasa tiene actividad fitasa; y en la que la variante de enzima fitasa es más estable que la fitasa parental correspondiente a la SEQ ID NO: 1 en las mismas condiciones de desafío térmico.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevas fitasas y usos de las mismas
Antecedentes de la invención
El fitato es la forma principal pero no digerible de fósforo que se encuentra en los alimentos de origen vegetal. Se considera como un factor antinutricional (ANF) que debe reducirse o eliminarse de los alimentos y piensos a base de cereales. En condiciones ácidas, el fitato interactúa con proteínas dietéticas cargadas positivamente, lo que conduce a la formación de agregados y precipitados de fitato-proteína, lo que resulta en una menor accesibilidad para las proteasas y, en consecuencia, en una digestión de proteínas ineficiente. El fitato también actúa como un fuerte agente quelante que une diferentes iones metálicos vitales en los alimentos y piensos en el intestino delgado de los organismos monogástricos, lo que conduce a deficiencias nutricionales de muchos minerales importantes tales como el calcio, zinc etc., en los animales.
La fitasa es una fosfatasa que cataliza la hidrólisis de enlaces O-P en fitato y libera fósforo utilizable inorgánico. La fitasa juega un papel versátil en los campos agrícolas y de alimentación. Los animales rumiantes, tales como el ganado bovino y ovino, pueden utilizar el fitato en los granos como fuente de fósforo, ya que tienen bacterias en el intestino que producen fitasas. Los no rumiantes tales como cerdos, aves de corral, peces, perros, pájaros, etc., requieren fitasa extrínseca para liberar fósforo inorgánico. Por lo tanto, la adición de fósforo inorgánico, un mineral no renovable y costoso, a los piensos para animales monogástricos es una práctica común, que incurre en grandes costos para la industria de piensos. En consecuencia, la fitasa producida a partir de diversas fuentes se ha convertido en uno de los suplementos más eficaces y lucrativos para las dietas de estas especies para mejorar el valor nutricional de los piensos para animales y disminuir la excreción de fósforo de los animales que conduce a contaminación ambiental.
La fitasa en los piensos puede ser inactivada por temperatura durante el procesamiento del pienso (granulación), por el bajo pH o la pepsina en la parte superior del tracto gastrointestinal de un animal. Selle y Ravindran establecieron las características de una enzima ideal para piensos, a saber; 1) una alta actividad específica por unidad de proteína, 2) buena termoestabilidad durante el procesamiento del pienso, 3) alta actividad en el intervalo de pH típico del intestino animal, 4) resistencia a las proteasas gástricas y 5) buena estabilidad a temperatura ambiente (SELLE, P.H. y RAVINDRAN, V. (2007) Microbial phytase in poultry nutrition. Animal Feed Science and Technology 135: 1-41).
El tratamiento térmico de los piensos puede implicar calor solo o una combinación de calor y presión. La forma más común de tratamiento térmico en la fabricación de piensos para aves es la granulación. El proceso de granulación implica primero que el pienso de puré pase a través de un acondicionador. En el acondicionador, el pienso en frío se expone al vapor seco que se agrega bajo presión. Este proceso ayuda a mejorar la durabilidad de los gránulos y también aumenta el rendimiento de la molienda y reduce el consumo de energía. En estas condiciones, las células vegetales se trituran, lo que es favorable para el proceso de digestión en los animales. Nissinen descubrió que un acondicionamiento moderado inferior a 85 °C era óptimo para el rendimiento de los pollos de engorde y una temperatura de acondicionamiento elevada a 95 °C resultó en un aumento de peso corporal y un índice de conversión de pienso más pobres (NISSINEN, V. (1994) The Effects and interactions of enzymes and hydrothermal pre-treatments and their contribution to feeding value. International Milling Flour and Feed, mayo: 21-22.). El proceso de granulación a 65-85 °C generalmente mejora la disponibilidad de nutrientes debido a la ruptura de la matriz de la pared celular (PICKFORD, J.R. (1992) Effects of processing on the stability of heat labile nutrients in animal feeds, en: GARNSWORTHY, P.C., HARESIGN, W. & COLE, D.J.A. (Eds) Recent Advances in Animal Nutrition, páginas 177-192 (Butterworth-Heinemann, Oxford, RU.) y la desactivación de inhibidores enzimáticos presentes en cereales (SAUNDERS, R.M. (1975) a-Amylase inhibitors in wheat and other cereals. Cereal Foods World 20: 282-285). El efecto del daño sobre la actividad de la fitasa debido a la alta presión parece ser pequeño; es principalmente la alta temperatura que resulta de la alta entrada de energía que inactiva la enzima. Por lo tanto, el desarrollo de una fitasa termoestable proporciona una solución atractiva para procesos rentables en la industria de piensos.
Las nuevas aplicaciones de la fitasa en los alimentos humanos son igualmente importantes que las de los piensos para animales porque el fitato no digerible quela los minerales esenciales y contribuye a las deficiencias de estos nutrientes en aproximadamente dos a tres mil millones de personas. Las aplicaciones de la fitasa en la salud humana y la medicina representan otras nuevas áreas interesantes. Además, la fitasa tiene un gran potencial para aplicaciones industriales, incluido el procesamiento de alimentos y la producción de biocombustibles. La fitasa termoestable, junto con la xilanasa, se han sugerido como aditivos efectivos en la industria de la pulpa y el papel.
El documento US 2005/281792 describe una secuencia que es 97,1% idéntica a la SEQ ID NO: 1.
Xi, et al., (2015) y el documento WO 2016/078168 describen secuencias que son 96% idénticas a la SEQ ID NO: 1.
Breve resumen de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende una variante de la enzima fitasa, en la que dicha variante de fitasa comprende la sustitución de aminoácidos Y255D en comparación con la SEQ ID NO: 1, y además en la que:
la variante de fitasa comprende las sustituciones de aminoácidos I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P y es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 5;
en la que la variante de enzima fitasa tiene actividad fitasa; y en la que la variante de enzima fitasa es más estable que la fitasa parental correspondiente a la SEQ ID NO: 1 en las mismas condiciones de desafío térmico.
En una realización, la composición comprende además pienso para animales.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica la enzima fitasa como se define en el primer aspecto.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende el ácido nucleico del segundo aspecto.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona una célula huésped que comprende el vector de expresión del tercer aspecto.
En un quinto aspecto, la invención proporciona un método para fabricar una enzima fitasa que comprende cultivar la célula huésped del cuarto aspecto en condiciones en las que se produce dicha enzima fitasa y recuperar dicha enzima.
En este documento se describen variantes de fitasas y métodos para usarlas. En el presente documento se describen composiciones que comprenden una variante de enzima fitasa que comprende al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 1, en la que dicha sustitución de aminoácidos está en un número de posición seleccionado del grupo que consiste en 1, 30, 36, 39, 55, 60, 65, 69, 73, 74, 79, 85, 101, 109, 111, 116, 118, 120, 137, 138, 139, 141, 146, 157, 159, 176, 180, 183, 184, 185, 186, 189, 233, 245, 255, 276, 282, 288, 291, 295, 297, 311, 315, 341, 354, 363, 369, 370, 380, 383, 385 y 402.
En el presente documento se describen composiciones que comprenden una variante de enzima fitasa que comprende al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 1, en la que dicha sustitución de aminoácidos está en un número de posición seleccionado del grupo que consiste en 1, 30, 36, 39, 55, 60, 65, 69, 73, 74, 79, 85, 101, 109, 111, 116, 118, 120, 137, 138, 139, 141, 146, 157, 159, 176, 180, 183, 184, 185, 186, 189, 233, 245, 255, 276, 282, 288, 291, 295, 297, 311, 315, 341, 354, 363, 369, 370, 380, 383, 385 y 402, y en la que dicha variante de la enzima fitasa es al menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1. Adecuadamente, la variante de enzima fitasa es al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la SEQ ID NO: 1, aunque no a la SEQ ID NO: 1.
En el presente documento se describen composiciones que comprenden una variante de enzima fitasa que comprende al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 1, en la que dicha sustitución de aminoácidos está en un número de posición seleccionado del grupo que consiste en 1, 30, 36, 39, 55, 60, 65, 69, 73, 74, 79, 85, 101, 109, 111, 116, 118, 120, 137, 138, 139, 141, 146, 157, 159, 176, 180, 183, 184, 185, 186, 189, 233, 245, 255, 276, 282, 288, 291, 295, 297, 311, 315, 341, 354, 363, 369, 370, 380, 383, 385 y 402, en la que dicha variante de enzima fitasa tiene al menos una actividad 1,1 veces mejor en comparación con la SEQ ID NO: 1 en una condición seleccionada del grupo que consiste en termoestabilidad a 58 °C, termoestabilidad a 66 °C, estabilidad al pH a pH 4,5 y estabilidad al pH a pH 5,5.
En este documento se describen variantes de enzimas fitasas con una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, I55V, H60S, H60Q, R65H, D69N, A73D, A73E, K74D, K74P, K74L, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, S120R, N137S, N137P, A138V, A138H, A138D, A138P, N139P, N139A, N139H, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, G157Q, G157N, G157L, G157R, G157A, R159Y, N176K, N180T, N180E, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V, E186A, S189T, G233A, Y255D, T245E, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, F354Y, K363A, K363L, N369P, T370P, A380R, A380T, A380P, E383S, R385S, R385V, R385T, E402R, E402T, E402D, E402P y E402N.
En este documento se describen variantes de enzimas fitasas con sustituciones de aminoácidos en una de dichas posiciones, dos de dichas posiciones, tres de dichas posiciones, cuatro de dichas posiciones, cinco de dichas posiciones, seis de dichas posiciones, siete de dichas posiciones, ocho de dichas posiciones, nueve de dichas posiciones, diez de dichas posiciones, once de dichas posiciones, doce de dichas posiciones, trece de dichas posiciones, catorce de dichas posiciones, quince de dichas posiciones, dieciséis de dichas posiciones, diecisiete de dichas posiciones, dieciocho de dichas posiciones, diecinueve de dichas posiciones o veinte de dichas posiciones.
En este documento se describen variantes de enzimas fitasas que comprenden las sustituciones de aminoácidos I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P y al menos una sustitución de aminoácidos adicional seleccionada del grupo que consiste en Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, H60S, H60Q, R65H, D69N, A73D, A73E, K74D, K74P, K74L, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, S120R, N137S, N137P, A138V, A138H, A138D, A138P, N139P, N139A, N139H, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, N176K, N180T, N180E, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V, E186A, S189T, G233A, T245E, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, K363A, K363L, N369P, T370P, E383S, R385S, R385V, R385T, E402R, E402T, E402D, E402P y E402N.
En este documento se describen variantes de enzimas fitasas que comprenden las sustituciones de aminoácidos H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P y al menos una sustitución de aminoácidos adicional seleccionada del grupo que consiste en Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, I55V, R65H, A73D, A73E, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, A138V, A138H, A138D, A138P, N139P, N139A, N139H, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, G157Q, G157N, G157L, G157R, G157A, R159Y, N176K, N180T, N180E, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V, E186A, S189T, G233A, Y255D, T245E, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, F354Y, K363A, K363L, N369P, T370P, A380R, A380T, A380P, E383S, R385S, R385V, R385T, E402R, E402T, E402D, E402P y E402N.
En este documento se describen variantes de fitasas que comprenden las sustituciones de aminoácidos I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P y al menos una sustitución de aminoácidos adicional seleccionada del grupo que consiste en Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, R65H, A73D, A73E, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, A138V, A138H, A138D, A138P, N139P, N139A, N139H, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, N176K, N180T, N180E, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V, E186A, S189T, G233A, T245E, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, K363A, K363L, N369P, T370P, E383S, R385S, R385V, R385T, E402R, E402T, E402D, E402P y E402N.
En este documento se describen variantes de fitasas que comprenden las sustituciones de aminoácidos N139A/N176K/D185N/E402D y al menos una sustitución de aminoácidos adicional seleccionada del grupo que consiste en Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, I55V, H60S, H60Q, R65H, D69N, A73D, A73E, K74D, K74P, K74L, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, S120R, N137S, N137P, A138V, A138H, A138D, A138P, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, G157Q, G157N, G157L, G157R, G157A, R159Y, N180T, N180E, K183R, Q184S, E186V, E186A, S189T, G233A, Y255D, T245E, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, F354Y, K363A, K363L, N369P, T370P, A380R, A380T, A380P, E383S, R385S, R385V y R385T.
En este documento se describen variantes de fitasas que comprenden las sustituciones de aminoácidos I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/N176K/D185N/E402D y al menos una sustitución de aminoácido adicional seleccionada del grupo que consiste en Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, R65H, A73D, A73E, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, A138V, A138H, A138D, A138P, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, N180T, N180E, K183R, Q184S, E186V, E186A, S189T, G233A, T245E, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, K363A, K363L, N369P, T370P, E383S, R385S, R385V y R385T.
En este documento se describen variantes de enzimas fitasas que tienen un conjunto de sustitución de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en los representados en las Figuras 5, 6, 7 y 8.
De manera adecuada, las variantes de fitasa pueden tener propiedades térmicas mejoradas, tales como termoestabilidad, estabilidad al calor, estabilidad al vapor, perfil de temperatura y/o estabilidad de granulación, con variantes de enzimas termoestables de uso particular en muchas realizaciones.
Las variantes de fitasa pueden tener una estabilidad de granulación mejorada y/o una estabilidad ácida mejorada.
El método de la invención, por lo tanto, se refiere a variantes de fitasa que tienen un perfil de pH mejorado.
El método de la invención, por lo tanto, se refiere a variantes de fitasa que tienen una estabilidad a la proteasa mejorada, en particular la estabilidad a la pepsina, que se encuentra en los estómagos no rumiantes.
El método de la invención, por lo tanto, se refiere a variantes de fitasa que tienen un rendimiento mejorado en el pienso animal (tal como una liberación y/o degradación mejorada de fitato).
En este documento se describe un polinucleótido que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las variantes de fitasa producidas por el método, constructos de ácido nucleico que comprenden los polinucleótidos unidos operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión, vectores de expresión recombinante que comprenden tales constructos de ácido nucleico y células huésped recombinantes que comprenden un constructo de ácido nucleico y/o un vector de expresión.
Los métodos para producir variantes de fitasa según se proporcionan pueden comprender (a) cultivar una célula huésped para producir un sobrenadante que comprende la fitasa; y (b) recuperar la fitasa.
En este documento se describen métodos para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales, al agregar una variante de fitasa de la invención al pienso, procesos para reducir los niveles de fitato en el estiércol animal al alimentar a un animal con una cantidad efectiva del pienso, métodos para el tratamiento de proteínas vegetales, que comprende la etapa de añadir una variante de fitasa a al menos una proteína vegetal, y el uso de una variante de fitasa de una composición de la invención.
En el presente documento se describe un método para producir un producto de fermentación tal como, por ejemplo, etanol, cerveza, vino, que comprende fermentar un material de carbohidrato en presencia de una variante de fitasa, un método para producir etanol que comprende fermentar un material de carbohidrato en presencia de una variante de fitasa y que produce etanol.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de la EcFitasa G1P madura, así como la secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de la secuencia señal endógena. En la cepa parental de E. coli, la fitasa G1P se produce usando una secuencia señal endógena, que se corta durante la expresión para formar la enzima G1P madura, como se muestra en la Figura 9. Cabe señalar que, en cuanto a las variantes de fitasas, la fitasa se puede producir en algunos organismos utilizando una secuencia señal, ya sea la secuencia señal representada o una secuencia señal exógena a la fitasa (por ejemplo, un péptido señal de una proteína u organismo diferente, o una secuencia sintética (no natural). Es decir, dependiendo del organismo huésped de producción, se puede usar la señal endógena (nativa de la fitasa) o, por ejemplo, una secuencia señal que sea nativa al huésped de producción puede combinarse en forma recombinante y operativa con la secuencia madura. En algunas realizaciones del organismo de producción, la fitasa se produce sin el uso de una secuencia señal. Por lo tanto, para la producción en E. coli, por ejemplo, el ADN que codifica la secuencia señal está unido al ADN que codifica la proteína madura.
La Figura 2 representa las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de EcFitasa G2P. La secuencia G2P tiene las siguientes variantes en comparación con G1P: I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P. Las secuencias de proteínas y ADN son para la enzima madura.
La Figura 3 representa las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de EcFitasa G3P. Además de la I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P de G2P, la variante G3P también tiene H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P, de modo que la G3P tiene las variantes I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P en relación con G1P.
La Figura 4 representa las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de EcFitasa G4P. Además de la I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P de G3P (incluidas las variantes adicionales G2P y G3P), la variante G4P tiene N139A/N176K/D185N/E402/D185N/E402 también (que forma el conjunto total G4P de I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/G157Q/R159Y/N176K/D185N/Y255D/F354Y/ A380P/E402D).
Las Figuras 5A, 5B, 5C y 5D representan una tabla que muestra algunas de la primera generación de variantes de fitasa, y su pH y termoestabilidad. CL0000004 es el progenitor de G1P, cuya secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 1 como se muestra en la Figura 1. La mayoría de las variantes son variantes de aminoácidos individuales, como se muestra en la columna "Mutaciones de AA", que muestra la sustitución de aminoácidos (por ejemplo, de T por E para CL00000605 en la posición 141) en comparación con G1P. Los valores de la tabla se determinaron como se muestra en los Ejemplos 5 y 6.
La Figura 6 representa una tabla que muestra la primera generación adicional de variantes de fitasas, y su pH y termoestabilidad. CL0000004 es el progenitor de G1P, cuya secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 1 como se muestra en la Figura 1. La CL00000430 es la secuencia G2P como se muestra en la Figura 2. Los valores de la tabla se determinaron como se muestra en los Ejemplos 5 y 6.
Las Figuras 7A, 7B y 7C representan una tabla que muestra la segunda generación de variantes de fitasa, y su pH y termoestabilidad. CL00000430 es el progenitor de G2P, cuya secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 5 como se muestra en la Figura 2. Cabe señalar que las mutaciones de aminoácidos enumeradas en la tabla son relativas a la G2P, en lugar de la G1P. Es decir, además de las mutaciones de aminoácidos de la Figura, todas las variantes de fitasas enumeradas en la Figura 7 también contienen las variantes I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P, que son las variantes de G2P. Por lo tanto, la variante G3P (CL00005023) tiene I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P además de H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P de modo que la G3P tiene las variantes I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/ N1P/R13 G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P en relación con G1P. Los valores de la tabla se determinaron como se muestra en los Ejemplos 5 y 6.
La Figura 8 representa una tabla que muestra una tercera generación de variantes de fitasas, y su pH y termoestabilidad. CL00005023 es la G3P, y las mutaciones adicionales enumeradas en la tabla son relativas a la variante G3P, en lugar de la G1P o G2P. Es decir, además de las mutaciones de aminoácidos de la Figura, todas las variantes de fitasas enumeradas en la Figura 8 también contienen las variantes I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/ N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P en relación con G1P. Por lo tanto, el conjunto total de variantes de G4P es I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/G157Q/R159Y/N176K/D185N/Y255D/F354Y/A380P/E402D. Los valores de la tabla se determinaron como se muestra en los Ejemplos 5 y 6.
La Figura 9 representa la alineación de las variantes de fitasas G1P (tipo silvestre), G2P, G3P y G4P. La secuencia señal, que contiene los primeros 22 aminoácidos, está doblemente subrayada. El dominio catalítico está en negrita y subrayado, con los residuos catalíticos en letra cursiva grande y los residuos de unión del sustrato en letra grande en negrita. Téngase en cuenta que el número de la Figura 9 incluye el péptido señal, que no es la numeración de las posiciones variantes descritas en el presente documento; es decir, las posiciones variantes en este documento cuentan el residuo de glutamina (Q) como la posición 1 de la proteína madura. Por lo tanto, el dominio catalítico son los aminoácidos 29-374 en la figura, pero los aminoácidos 7 a 352 en la proteína madura. De manera similar, los residuos catalíticos H39 y D326 de la figura son H17 y D304 en la numeración de la madura, y los residuos de unión al sustrato son R16, R92 y R267.
Las Figuras 10A y B muestran el desafío térmico de secuencias seleccionadas (incluyendo G1P, G2P y G3P). El desafío térmico fue un desafío de 5 minutos a la temperatura indicada como se discutió en el Ejemplo 7.
La Figura 11 representa una tabla de variantes que muestra algunas variantes preferidas descritas en este documento. Como se describe en este documento, estas se pueden combinar en cualquier combinación y con conjuntos de variantes como se describe en este documento.
La Figura 12 muestra el desafío térmico de secuencias seleccionadas (incluyendo G1P, G2P, G3P y G4P). El desafío térmico fue un desafío de 5 minutos a la temperatura indicada como se discutió en el Ejemplo 7. El % de actividad residual se calcula como [(actividad de la variante a cualquier temperatura)/(actividad de la variante a 63,0 °C) * 100%].
Descripción detallada de la invención
I. Introducción
Las fitasas descomponen el fitato (hexakisfosfato de inositol (IP6) o ácido fítico cuando está en forma de sal), que es el almacenamiento primario de fosfato en las plantas. Los animales monogástricos tales como los cerdos, las aves de corral y los peces (así como los humanos) no pueden digerir el fitato, lo que lleva a la excreción de fósforo en el estiércol, lo que plantea una preocupación ambiental en las áreas agrícolas. Además, el fitato puede conducir a la agregación de proteínas, reduciendo la disponibilidad de proteínas, así como a los minerales quelatos y oligoelementos, reduciendo aún más los nutrientes disponibles para los animales.
La adición de fitasa al pienso animal se introdujo hace varias décadas y puede reducir la excreción de fósforo hasta en un 50% al tiempo que permite al animal un mejor acceso a los nutrientes disponibles. Sin embargo, en las condiciones que se utilizan en el procesamiento de muchos alimentos, incluidos los piensos para animales hechos de fuentes vegetales y los alimentos para humanos (cereales, etc.), como temperaturas más altas y pH diferentes, muchas fitasas de tipo silvestre no son muy estables, lo que conduce a una conversión ineficiente del fitato y/o al costo prohibitivo de agregar más enzimas. De manera similar, otros usos de la fitasa, tal como la producción de biocombustibles, también pueden incluir temperaturas más altas y/o diferentes pH. Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención proporcionar composiciones con variantes de fitasas con propiedades mejoradas, que incluyen termoestabilidad y otras propiedades bioquímicas como se describe en el presente documento, que conducen a resultados mejorados tales como menos estrés ambiental debido a la excreción de fósforo disminuida, mejor conversión de pienso con respecto al peso animal y mejor acceso a nutrientes.
II. Definiciones
Por "modificación" en el presente documento se entiende una sustitución, inserción y/o eliminación de aminoácidos en una secuencia de polipéptidos o una alteración a una fracción químicamente unida a una proteína. Por ejemplo, una modificación puede ser una estructura alterada de carbohidratos o PEG unida a una proteína. Por "modificación de aminoácidos" en el presente documento se entiende una sustitución, inserción y/o eliminación de aminoácidos en una secuencia de polipéptidos. Para mayor claridad, a menos que se indique lo contrario, la modificación de aminoácidos es siempre un aminoácido codificado por ADN, por ejemplo, los 20 aminoácidos que tienen codones en el ADN y el ARN.
Por "sustitución de aminoácidos" o "sustitución" en el presente documento se entiende el reemplazo de un aminoácido en una posición particular en una secuencia de polipéptidos parental con un aminoácido diferente. En particular, en algunas realizaciones, la sustitución es por un aminoácido que no se produce naturalmente en la posición particular, o que no se produce naturalmente dentro del organismo o en ningún organismo. Por ejemplo, la sustitución I55V se refiere a una variante de polipéptido, en este caso una fitasa, en la que la isoleucina en la posición 55 se reemplaza con valina. Para mayor claridad, una proteína que ha sido modificada para cambiar la secuencia de codificación de ácido nucleico pero no cambiar el aminoácido inicial (por ejemplo, el intercambio de CGG (que codifica arginina) por CGA (que todavía codifica arginina) para aumentar los niveles de expresión del organismo huésped) no es una "sustitución de aminoácidos"; es decir, a pesar de la creación de un nuevo gen que codifica la misma proteína, si la proteína tiene el mismo aminoácido en la posición particular con la que comenzó, no es una sustitución de aminoácidos.
Por "inserción de aminoácidos" o "inserción" como se usa en el presente documento se entiende la adición de una secuencia de aminoácidos en una posición particular en una secuencia de polipéptidos parental. Por ejemplo, -233E o 233E designa una inserción de ácido glutámico después de la posición 233 y antes de la posición 234. Además, -233ADE o A233ADE designa una inserción de AlaAspGlu después de la posición 233 y antes de la posición 234.
Por "eliminación de aminoácidos" o "eliminación" como se usa en el presente documento se entiende la eliminación de una secuencia de aminoácidos en una posición particular en una secuencia de polipéptidos parental. Por ejemplo, E233- o E233#, E233() o E233del designa una eliminación de ácido glutámico en la posición 233. Además, EDA233-o EDA233# designa una eliminación de la secuencia GluAspAla que comienza en la posición 233.
Por "polipéptido parental", como se usa en el presente documento, se entiende un polipéptido de partida que se modifica posteriormente para generar una variante. El polipéptido parental puede ser un polipéptido natural, o una variante o versión modificada de un polipéptido natural. El polipéptido parental puede referirse al propio polipéptido, las composiciones que comprenden el polipéptido parental o la secuencia de aminoácidos que lo codifica. En el presente caso, algunas realizaciones utilizan G1P, G2P o G3P como polipéptidos parentales, prefiriéndose los primeros.
Por "variante de proteína" o "variante de proteína", o "variante" como se usa en el presente documento se entiende una proteína que difiere de la de una proteína parental en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. La variante de proteína puede referirse a la proteína misma, una composición que comprende la proteína o la secuencia de aminoácidos que la codifica. Preferiblemente, la variante de proteína tiene al menos una modificación de aminoácidos en comparación con la proteína parental, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente setenta modificaciones de aminoácidos, y preferiblemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco modificaciones de aminoácidos en comparación con el progenitor. Como se describe a continuación, el polipéptido parental puede ser una secuencia de tipo silvestre, por ejemplo, la fitasa de E. coli de tipo silvestre denominada "G1P" en el presente documento. Como se discute adicionalmente a continuación, la secuencia de variante de proteína en el presente documento tendrá preferiblemente al menos aproximadamente 80% de identidad con una secuencia de proteína parental, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente 95-98-99% de identidad. La variante de proteína puede referirse a la variante de proteína en sí misma, a las composiciones que comprenden la variante de la proteína o a la secuencia de ADN que la codifica. Por lo tanto, por "variante de fitasa" en el presente documento se entiende una fitasa nueva que tiene al menos una modificación de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos en comparación con una enzima fitasa parental. Como se discute en el presente documento, en algunos casos la fitasa parental es una segunda o generación posterior de la variante; es decir, como se muestra en la Figura 6, la fitasa G2P tiene 6 sustituciones de aminoácidos en comparación con la G1P parental de tipo silvestre. Sin embargo, como se muestra en la Figura 7, la G3P tiene 5 sustituciones de aminoácidos en comparación con la G2P parental, pero un total de 11 sustituciones de aminoácidos en comparación con la G1P. A menos que se indique lo contrario o como será obvio por el contexto, las variantes de fitasas de la invención generalmente se comparan con la secuencia de G1P de tipo silvestre. Además, a menos que se indique lo contrario, las variantes de fitasas son enzimáticamente activas, es decir, hay actividad fitasa detectable usando el ensayo de fitasa descrito en el Ejemplo 5, usando un ensayo sin tratamiento de temperatura.
Como se usa en el presente documento, "proteína" en el presente documento significa al menos dos aminoácidos unidos covalentemente, que incluyen proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. El grupo peptidilo generalmente comprende aminoácidos y enlaces peptídicos de origen natural. Además, los polipéptidos pueden incluir derivatización sintética de una o más cadenas laterales o terminales, glicosilación, PEGilación, permutación circular, ciclación, enlazadores a otras moléculas, fusión a proteínas o dominios de proteínas, y adición de etiquetas o marcadores peptídicos.
Por "residuo" como se usa en el presente documento se entiende una posición en una proteína y su identidad de aminoácidos asociada. Por ejemplo, Histidina 82 (también conocida como His82 o H82) es un residuo en la posición 82 en la enzima parental G1P.
Por "modificación no natural" como se usa en el presente documento se entiende una modificación de aminoácidos que no se encuentra en la enzima parental (por ejemplo, G1P).
Por "aminoácido" e "identidad de aminoácidos", como se usa en el presente documento, se entiende uno de los 20 aminoácidos naturales codificados por ADN y ARN.
Por "posición", como se usa en el presente documento, se entiende una ubicación en la secuencia de una proteína.
En general, el número de posición (que se trata más detalladamente a continuación) es relativo al primer aminoácido de la secuencia de fitasa madura, por ejemplo, excluyendo el péptido señal.
Por "fitasa" en el presente documento se entiende una proteína con actividad fitasa. Por "actividad fitasa" se entiende en el presente documento que la enzima cataliza la hidrólisis de fitato (hexakisfosfato de mioinositol) a (1) mioinositol y/o (2) mono, di, tri, tetra y/o pentafosfatos de los mismos y (3) fosfato inorgánico. Las enzimas que tienen actividad detectable en el ensayo descrito a continuación y en los Ejemplos 5 se consideran fitasas en el presente documento.
Por "identidad" en referencia a dos secuencias en el presente documento se entiende que el mismo aminoácido está en la misma posición considerando la alineación. El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de la invención") y la secuencia de aminoácidos parental a la que se hace referencia en las reivindicaciones (por ejemplo, para G1P, SEQ ID NO: 1) se calcula como el número de coincidencias exactas en una alineación de las dos secuencias, dividida por la longitud de la "secuencia de la invención" o la longitud de la SEQ ID NO: 1, la que sea más corta. El resultado se expresa en porcentaje de identidad como se calcula a continuación.
Para los propósitos de la presente invención, el polipéptido maduro divulgado en la SEQ ID NO: 1 se usa para determinar el residuo de aminoácido correspondiente en otra fitasa descrita en este documento. La secuencia de aminoácidos de otra fitasa está alineada con el polipéptido maduro divulgado en la SEQ ID NO: 1 y, en función de la alineación, el número de posición del aminoácido correspondiente a cualquier residuo de aminoácido en el polipéptido maduro divulgado en la SEQ ID NO: 1 se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOs S (EMBOSS: European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son la penalización por apertura de hueco de 10, la penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62).
La identificación del residuo de aminoácido correspondiente en otra fitasa se puede determinar mediante una alineación de múltiples secuencias de polipéptidos usando varios programas informáticos que incluyen, pero no se limitan a, MUSCLE (comparación de múltiples secuencias por la expectativa logarítmica; versión 3.5 o posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versión 6.857 o posterior; Katoh y Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518 ; Katoh y Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), EMBOSS EMMA empleando ClustalW (1.83 o posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), y EMBL-EBI empleando Clustal Omega (Sievers y Higgins, 2014, Methods Mol Biol. 2014; 1079: 105­ 16), utilizando sus respectivos parámetros predeterminados.
Cuando la otra enzima se ha separado del polipéptido de la SEQ ID NO: 1, de modo que la comparación tradicional basada en la secuencia no puede detectar su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), se pueden utilizar otros algoritmos de comparación de secuencias por pares. Se puede lograr una mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencias utilizando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para buscar bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso iterativo de búsqueda en la base de datos y es capaz de detectar homólogos remotos (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede lograr una sensibilidad aún mayor si la familia o superfamilia del polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de la estructura de la proteína. Programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructural y potenciales de solvatación) como entrada a una red neuronal que predice el pliegue estructural para una secuencia de consulta. De manera similar, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, se puede utilizar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilia presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones a su vez se pueden usar para generar modelos de homología para el polipéptido, y se puede evaluar la precisión de dichos modelos utilizando una variedad de herramientas desarrolladas para ese propósito.
Para las proteínas de estructura conocida, hay varias herramientas y recursos disponibles para recuperar y generar alineamientos estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteínas SCOP se han alineado estructuralmente, y esas alineaciones son accesibles y descargables. Se pueden alinear dos o más estructuras de proteínas utilizando una variedad de algoritmos tales como la matriz de alineación de distancia (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o la extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747 ), y la implementación de estos algoritmos se puede utilizar adicionalmente para consultar bases de datos de estructura con una estructura de interés para descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
En la descripción de las variantes, la nomenclatura descrita a continuación está adaptada para facilitar la referencia. Se utiliza la abreviatura de aminoácidos de una letra o tres letras de la IUPAC estándar aceptada.
Para una sustitución de aminoácidos, se usa la siguiente nomenclatura en el presente documento: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de glutamina en la posición 441 con prolina se designa como "Gln441Pro" o "Q441P". Las mutaciones múltiples están separadas por barras diagonales ("/"), por ejemplo, "I91L/A133G/Y169W", que representan sustituciones en las posiciones 91, 133 y 169, respectivamente.
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Por "aislado" en el contexto de una fitasa en el presente documento se entiende que el polipéptido carece de otras proteínas. Adecuadamente, la fitasa puede aislarse. El término "aislado" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que es al menos 20% puro, preferiblemente al menos 40% puro, más preferiblemente al menos 60% puro, incluso más preferiblemente al menos 80% puro, lo más preferiblemente al menos 90% puro, y aún más preferiblemente al menos 95 a 98% puro, de acuerdo con lo determinado por SDS-PAGE. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación de polipéptidos esté esencialmente libre de otro material de polipéptidos con el que está asociado de forma nativa. Esto se puede lograr, por ejemplo, preparando el polipéptido por medio de métodos recombinantes bien conocidos o por métodos de purificación clásicos.
Por "enzima recombinante" se entiende que la enzima se produce mediante técnicas recombinantes y que el ácido nucleico que codifica la variante de la enzima está operativamente unido a al menos una secuencia exógena (por ejemplo, no nativa de la fitasa parental), que incluye, por ejemplo, promotores, terminadores, secuencias señal, etc., como se detalla más completamente a continuación.
El término "constructo de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea monocatenaria o bicatenaria, que se aísla de un gen natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otro modo no existen en la naturaleza o que es sintética, y que comprende una o más secuencias de control.
El término "unido operativamente" se refiere a una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con respecto a la secuencia de codificación de un polinucleótido de tal manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia de codificación.
III. Fitasas descritas en el presente documento
Las variantes de fitasas con actividad mejorada que se pueden usar en una variedad de aplicaciones, que incluyen productos nutricionales y piensos para animales y humanos y la producción de biocombustibles tales como bioetanol.
En general, las variantes de fitasas tienen propiedades bioquímicas modificadas y mejoradas en comparación con la fitasa parental de tipo silvestre, "EcFitasa G1P" o "G1P" (por ejemplo, "generación 1 parental"), SEQ ID NO: 1 en este documento, como se muestra en la Figura 1. Las propiedades bioquímicas de las variantes de fitasas que pueden mejorarse en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, actividad de pH, estabilidad al pH, termoestabilidad, actividad específica, estabilidad de formulación (incluyendo líquido, sólido y gránulos), rendimiento en animales y/o pienso para animales y estabilidad a la proteasa.
Las variantes de fitasas tienen una o más propiedades mejoradas en comparación con G1P. Por "mejorada" en el presente documento se entiende un cambio deseable de al menos una propiedad bioquímica. La "función mejorada" se puede medir como un aumento o disminución porcentual de una actividad particular, o como las "veces" que cambia, con aumentos de las propiedades deseables (por ejemplo, estabilidad al pH, termoestabilidad) o disminución de las propiedades indeseables (por ejemplo, sensibilidad a la proteasa). Es decir, una variante de fitasa puede tener un aumento del 10% en la termoestabilidad o una disminución del 10% en la sensibilidad a la proteasa, en comparación con G1P. Alternativamente, una variante de fitasa puede tener un aumento de 2 veces en la estabilidad al pH o una disminución de 3 veces en la sensibilidad a la proteasa. En general, los cambios porcentuales se usan para describir cambios en la actividad bioquímica de menos del 100%, y las veces que cambia se usan para describir cambios en la actividad bioquímica de más del 100% (en comparación con la enzima parental, en muchos casos G1P). En la presente invención, pueden lograrse cambios porcentuales (generalmente aumentos) de la actividad bioquímica de al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% y 99%. En la presente invención, se mide las "veces que aumenta" (o disminuye) en comparación con la enzima inicial o parental. Por ejemplo, como se muestra en las Figuras, G2P tiene un aumento de 11,64 veces en la tolerancia a la temperatura en comparación con G1P: esto se calcula por [(actividad de la variante)/(actividad del progenitor)]. En muchas realizaciones, la mejora es al menos una y media veces (1,5 veces), 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces o más.
En general, las mejoras se miden en comparación con la enzima G1P usando un ensayo de actividad de fitasa, en condiciones que desafían la variante de fitasa contra la enzima G1P.
A. Ensayo de fitasa
El ensayo de fitasa se realiza como se muestra en el Ejemplo 5 y de la siguiente manera: después del desafío en las condiciones apropiadas de temperatura, pH, etc., la muestra se agrega a una solución 0,1 M de acetato de sodio que contiene 2 mM del sustrato fitato de sodio (C6H6Na-i2O24P6, PF: 923,81) a pH 4,5 y pH 5,5. La reacción se incuba a 24 °C, 150 rpm durante 30 minutos. La reacción se interrumpe con la mitad del volumen de solución de ácido tricloroacético al 5% p/v. Se agrega un volumen de muestra de reactivo colorante fresco, que se prepara mezclando cuatro volúmenes de solución de molibdato de amonio al 2,5% en ácido sulfúrico al 5,5% y un volumen de solución de sulfato ferroso al 2,7%. La muestra se agita durante 30 segundos y luego se centrifuga a 4000 rpm durante 2 minutos. Se diluye un volumen de sobrenadante con un volumen equivalente de agua y se lee la absorbancia a 700 nm. En algunos casos, es útil usar "Unidades de Fitasa", o UF, definidas como la cantidad de fitasa requerida para liberar 1 |jmol de fosfato inorgánico por minuto. La enzima puede ser una muestra purificada, una muestra de fermentación o una muestra cruda.
Las variantes de fitasas pueden tener una mejora de una o más de varias propiedades bioquímicas, que incluyen, pero no se limitan a, actividad de pH, estabilidad al pH, termoestabilidad, actividad específica, estabilidad de formulación (incluyendo líquido, sólido y gránulos), rendimiento en animales y/o piensos para animales y/o estabilidad a las proteasas.
B. Termoestabilidad
Las variantes de fitasas pueden tener una termoestabilidad incrementada, particularmente en las condiciones usadas para producir piensos para animales, por ejemplo, que frecuentemente usan altas temperaturas durante el proceso de granulación durante períodos de tiempo que tradicionalmente inactivan las fitasas de tipo silvestre. La "termoestabilidad" en este contexto significa que las variantes de enzimas son más estables que la fitasa parental (por ejemplo, G1P) bajo las mismas condiciones de desafío térmico, es decir, la actividad de la variante es mayor que la de la G1P bajo condiciones idénticas (generalmente usando el ensayo de fitasa como se describe en el presente documento y como se muestra en el Ejemplo 6).
Las variantes de fitasas pueden ser más estables que la fitasa parental cuando se exponen a temperaturas de 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 58 °C, 60 °C, 65 °C, 66 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C y/u 85 °C durante un período de tiempo, que generalmente varía de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 minutos o más, dependiendo de las condiciones finales para el uso de la variante de fitasa, con algunas realizaciones que utilizan tiempos de desafío térmico de 5 minutos a 10 minutos, 5 minutos a 15 minutos, 5 minutos a 60 minutos, 10 minutos a 60 minutos, todos encuentran uso en la presente invención. En algunas realizaciones, se usa un desafío de 85 °C y 5 minutos.
Por consiguiente, las variantes de fitasas pueden tener una termoestabilidad incrementada en comparación con una fitasa parental, particularmente G1P, durante al menos 5 minutos a 50 °C, al menos 5-10 minutos a 55 °C, al menos 5-10 minutos a 58 °C, al menos 5-10 minutos a 60 °C, al menos 5-10 minutos a 66 °C y en algunas realizaciones al menos 5-10 minutos a 70 °C.
Además, el pH también puede ser una consideración para la termoestabilidad.
En consecuencia, las variantes de fitasas pueden haber aumentado la termoestabilidad en comparación con una fitasa parental durante al menos 5 minutos a 58 °C a pH 5,5, al menos 5 minutos a 58 °C a pH 4,5, durante al menos 5 minutos a 66 °C a pH 4,5 o al menos 5 minutos a 66 °C a pH 5,5.
Por consiguiente, como se muestra en las Figuras 5, 6, 7 y 8, varias variantes de fitasas exhiben termoestabilidad incrementada.
C. Estabilidad al pH
Las variantes de fitasas pueden tener una estabilidad al pH incrementada a pH más bajos, para abordar el pH más bajo del estómago y el tracto gastrointestinal de animales no rumiantes. Es decir, muchas fitasas tienen perfiles de pH que son subóptimos para el entorno de pH reducido en el que se desea la actividad en el animal. "Mayor estabilidad al pH" en este contexto significa que las variantes de enzimas son más estables que la fitasa parental (por ejemplo, G1P) bajo las mismas condiciones de desafío de pH, es decir, la actividad de la variante es mayor que la de la G1P en condiciones idénticas (generalmente usando el ensayo de fitasa como se describe en el presente documento y como se muestra en el Ejemplo 6).
Por consiguiente, las variantes de fitasas pueden tener una mayor estabilidad al pH en comparación con una fitasa parental, particularmente G1P, durante al menos 5 minutos a aproximadamente pH 4,5 y al menos 5 minutos a aproximadamente pH 5,5.
D. Ensayos de actividad específica
Las variantes de fitasas pueden tener una actividad específica incrementada en comparación con una fitasa parental, particularmente G1P. Por "actividad específica" en el presente documento se entiende la actividad por cantidad de enzima, generalmente determinada dividiendo la actividad enzimática de una muestra (a veces medida en "unidades de fitasa" como se discute en el presente documento) por la cantidad de enzima fitasa, generalmente determinada como se conoce en la técnica.
E. Susceptibilidad a proteasas
Las variantes de fitasas pueden ser menos susceptibles a la degradación de la proteasa que la enzima parental en condiciones idénticas. En algunos casos, la degradación por la proteasa durante la producción de variantes de fitasas en un organismo huésped de producción por enzimas proteasas producidas por el organismo huésped puede ser un problema, lo que resulta en un menor rendimiento de enzima activa. Esto generalmente se determina como se conoce en la técnica, por ejemplo, permitiendo la degradación proteolítica y luego haciendo una secuenciación del terminal N en los fragmentos resultantes para determinar el sitio o los sitios de escisión. En algunos casos, dependiendo de la variante y el organismo de producción del huésped, puede no haber una degradación proteolítica significativa.
Según sea necesario, como apreciarán los expertos en la técnica, las mutaciones específicas que se pueden realizar dependerán de las proteasas endógenas que produce el organismo huésped, y también generalmente ocurre en estructuras de bucle expuestas en la superficie o giros que son por lo tanto accesibles a las proteasas. Por ejemplo, la producción de fitasas en organismos de producción del hongo A. niger puede conducir a la degradación proteolítica; véase Wyss et al., Appl. And Environ. Microbiol., febrero de 1999: 359-366.
IV. Fitasas
Por consiguiente, las variantes de fitasas tienen una o más propiedades mejoradas en comparación con la secuencia G1P de tipo silvestre, en la que la fitasa no es G1P (SEQ ID NO: 1).
En algunos casos, las variantes de fitasas tienen al menos 87% de identidad con G1P, con enzimas que tienen al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad (pero menos del 100% de identidad) que también encuentran uso en la presente invención.
Por consiguiente, algunos casos proporcionan variantes de fitasas con 90% al 99% de identidad con G1P (SEQ ID NO: 1), con otras realizaciones que proporcionan del 95% al 99% de identidad, con la condición de que la fitasa no sea G1P (SEQ ID NO: 1).
En algunos casos, las variantes de fitasas tienen al menos 87% de identidad con G2P, con enzimas que tienen al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y el 99% de identidad también encuentran uso en la presente invención, con la condición de que la fitasa no sea G1P (SEQ ID NO: 1).
En algunos casos, las variantes de fitasas tienen las sustituciones de aminoácidos I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P y son al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la SEQ ID NO: 5)
En algunos casos, las variantes de fitasas tienen al menos 87% de identidad con G3P, con enzimas que tienen al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y el 99% de identidad también encuentran uso en la presente invención, con la condición de que la fitasa no sea G1P (SEQ ID NO: 1).
En algunos casos, las variantes de fitasas tienen las sustituciones de aminoácidos I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P y son al menos 95%, 96%, 97%, 98 % o 99% idénticas a la SEQ ID NO: 7.
En algunos casos, las variantes de fitasas tienen las sustituciones de aminoácidos H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P y son al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 7.
En algunos casos, las variantes de fitasas tienen al menos un 87% de identidad con G4P, con enzimas que tienen al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y el 99% de identidad también encuentran uso en las composiciones descritas en el presente documento, con la condición de que la fitasa no sea G1P (SEQ ID NO: 1).
En algunos casos, las variantes de fitasas tienen las sustituciones de aminoácidos N139A/N176K/D185N/E402D y son al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 9.
En algunas realizaciones, las variantes de fitasas tienen las sustituciones de aminoácidos I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/G157Q/R159Y/N176K/D185N/Y255D/F354Y/A380P/E402D y son al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la SEQ ID NO: 9.
V. Variantes específicas de fitasas
En consecuencia, se describe en el presente documento una serie de variantes específicas de fitasas con actividad mejorada, específicamente estabilidad térmica y/o estabilidad al pH, y en particular estabilidad térmica a pH y temperatura particulares como se describe en el presente documento.
En algunos casos, la variante de fitasa tiene una o más sustituciones de aminoácidos en una posición (en relación con G1P) seleccionada del grupo que consiste en 1, 30, 36, 39, 55, 60, 65, 69, 73, 74, 79, 85, 101, 109, 111, 116, 118, 120, 137, 138, 139, 141, 146, 157, 159, 176, 180, 183, 184, 185, 186, 189, 233, 245, 255, 276, 282, 288, 291, 295, 297, 311, 315, 341, 354, 363, 369, 370, 380, 383, 385 y 402.
En algunos casos, la variante de fitasa tiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, I55V, H60S, H60Q, R65H, D69N, A73D, A73E, K74D, K74P, K74L, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, S120R, N137S, N137P, A138V, A138H, A138D, A138P, N139P, N139A, N139H, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, G157Q, G157N, G157L, G157R, G157A, R159Y, N176K, N180T, N180E, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V, E186A, S189T, G233A, Y255D, T245E, Y255D, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, F354Y, K363A, K363L, N369P, T370P, A380R, A380T, A380P, E383S, R385S, R385V, R385T, E402R, E402T, E402D, E402P y E402N.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la glutamina en la posición 1 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de Q1S, Q1V y Q1N.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la glutamina en la posición 30 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es Q30K.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 36 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es A36K.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la treonina en la posición 39 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es T39D.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la isoleucina en la posición 55 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, treonina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es I55V.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la histidina en la posición 60 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de H60Q y H60S.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos del ácido aspártico en la posición 65 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es R65H.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos del ácido aspártico en la posición 69 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es D69N.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 73 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de A73D y A73E.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la lisina en la posición 74 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de K74D, K74L y K74P.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la glutamina en la posición 79 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de Q79L, Q79A, Q79G, Q79R y Q79F.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 85 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es I85V.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 101 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es A101L.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 109 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de A109D, A109E, A109F, A109P, A109G.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la treonina en la posición 111 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de T111S, T111D y T111Q.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 116 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a los efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de A116Y, A116P, A116R y A116S.
[0117] En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la treonina en la posición 118 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de T118S y T118R.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la serina en la posición 120 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de S120R.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la asparagina en la posición 137 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de N137P y N137S.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 138 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de A138V, A138H, A138P y A138D.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la asparagina en la posición 139 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de N139P, N139A y N139H.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la treonina en la posición 141 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de E (T141E), G (T141G), A (T141A), R (T141R).
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la serina en la posición 146 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de R (S146R).
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la glicina en la posición 157 de la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunos casos, la sustitución de aminoácidos se selecciona de G157Q, G157N, G157L, G157R, G157A.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la arginina en la posición 159 de la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, glutamina, lisina, asparagina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). Adecuadamente, la sustitución de aminoácidos es R159Y.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la asparagina en la posición 176 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es N176K.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la asparagina en la posición 180 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de N180T y N180E.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la lisina en la posición 183 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, alanina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es K183R.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la glutamina en la posición 184 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es Q184S.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos del ácido aspártico en la posición 185 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de D185l y D185N.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos del ácido glutámico en la posición 186 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de E186V y E186A.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la treonina en la posición 189 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es S189T.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la treonina en la posición 233 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es G233A.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la treonina en la posición 245 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es T245E.
En algunos casos, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la tirosina en la posición 255 de la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina., fenilalanina, triptófano, valina y metionina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). Adecuadamente, la sustitución de aminoácidos es Y255D.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la metionina en la posición 276 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es M276V.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la metionina en la posición 282 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de H282n y H282P.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 288 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de A288E, A288R y A288V.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 291 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es V291I.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 295 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es T295I.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 297 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de V297L.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 311 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es G311S.
[0143] En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos del ácido glutámico en la posición 315 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de E315G y E315S.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la leucina en la posición 341 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de L341Y y L341V.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la fenilalanina en la posición 354 de la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, asparagina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunos casos, la sustitución de aminoácidos es F354Y.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la lisina en la posición 363 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de K363A y K363L.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la asparagina en la posición 369 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es N369P.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la treonina en la posición 370 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es T370P.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina en la posición 380 de la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunos casos, la sustitución de aminoácidos se selecciona de A380R, A380T y A380P.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos del ácido glutámico en la posición 383 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos es E383S.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos de la arginina en la posición 385 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de R385V, R385T y R385S.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa tiene una sustitución de aminoácidos del ácido glutámico en la posición 402 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es con cualquiera de los 19 aminoácidos naturales, a saber, serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina, con algunas realizaciones que no utilizan cisteína (debido a la posible formación de disulfuro) o prolina (debido a efectos estéricos). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácidos se selecciona de E402D, E402P, E402N, E402R y E402T.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa comprende las variantes de G2P I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y /A380P y otra sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, H60S, H60Q, R65H, D69N, A73D, A73E, K74D, K74P, K74L, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, S120R, N137S, N137P, A138V, A138H, A138D, A138P, N139P, N139A, N139H, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, N176K, N180T, N180E, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V, E186A, S189T, G233A, T245E, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, K363A, K363L, N369P, T370P, E383S, R385S, R385V, R385T, E402R, E402T, E402D, E402P y E402N.
En algunos casos, la variante de fitasa comprende las variantes de G3P H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P, y al menos una de las variantes adicionales de aminoácidos individuales descritas anteriormente, que incluyen, entre otras,Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, I55V, R65H, A73D, A73E, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, A138V, A138H, A138D, A138P, N139P, N139A, N139H, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, G157Q, G157N, G157L, G157R, G157A, R159Y, N176K, N180T, N180E, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V, E186A, S189T, G233A, Y255D, T245E, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, F354Y, K363A, K363L, N369P, T370P, A380R, A380T, A380P, E383S, R385S, R385V, R385T, E402R, E402T, E402D, E402P y E402N.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa comprende las variantes de G2P y G3P I55V/G157Q/R159Y/Y255D/ F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P, y al menos una de las variantes adicionales de aminoácidos individuales descritas anteriormente, incluyendo, pero no se limita a, Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, R65H, A73D, A73E, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, A138V, A138H, A138D, A138P, N139P, N139A, N139H, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, N176K, N180T, N180E, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V, E186A, S189T, G233A, T245E, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, K363A, K363L, N369P, T370P, E383S, R385S, R385V, R385T, E402R, E402T, E402D, E402P y E402N.
En algunos casos, la variante de fitasa comprende las variantes de G4P N139A/N176K/D185N/E402D, y al menos una de las variantes adicionales de aminoácidos individuales descritas anteriormente, que incluyen, pero no se limitan a, Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, I55V, H60S, H60Q, R65H, D69N, A73D, A73E, K74D, K74P, K74L, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, S120R, N137S, N137P, A138V, A138H, A138D, A138P, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, G157Q, G157N, G157L, G157R, G157A, R159Y, N180T, N180E, K183R, Q184S, E186V, E186A, S189T, G233A, Y255D, T245E, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, F354Y, K363A, K363L, N369P, T370P, A380R, A380T, A380P, E383S, R385S, R385V y R385T.
En algunas realizaciones, la variante de fitasa comprende las variantes de G4P I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/ A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/N176K/D185N/E402D y otra sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Q1S, Q1V, Q1N, Q30K, A36K, T39D, R65H, A73D, A73E, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, I85V, A101L, A109D, A109D, A109E, A109G, A109F, A109P, T111S, T111D, T111Q, A116Y, A116P, A116R, A116S, T118R, T118S, A138V, A138H, A138D, A138P, T141E, T141G, T141A, T141R, S146R, N180T, N180E, K183R, Q184S, E186V, E186A, S189T, G233A, T245E, M276V, H282N, H282P, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297L, G311S, E315G, E315S, L341Y, L341V, K363A, K363L, N369P, T370P, E383S, R385S, R385V y R385T.
En el presente documento se divulgan variantes de fitasa en comparación con la SEQ ID NO: 1 que tiene un conjunto de sustitución de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en N139H/K183R, R159Y/Y255D/V291I/ V297L/G311S, I55V/Y255D/G311S/F354Y, G233A/Y255D/V291I, I85V/G157Q/V291I/V297L/G311S/F354Y, A101L/ Y255D, I55V/I85V/Y255D/V291I, I55V/F354Y, I55V/I85V/Y255D/V291I/F354Y, R159Y/Y255D/V291I, A101L/R159Y /S189T/T295I/F354Y, Q30K/I85V/Y255D/A380P, G157Q/R159Y, I55V/I85V/S189T/G233A/Y255D/ F354Y/A380P, I55V/I85V/S189T/V297L/G311S, F354Y, I55V/I85V/A101L/G157Q/G233A/F354Y, I55V/G157Q/Y255D/V291I/V297L /F354Y, R159Y, I55V, Y255D, I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P, I55V/R159Y/Y255D/V297L/A380P, I55V /I85V/G157Q/G233A/Y255D/ V297L/F354Y, I55V/A101L/G157Q/Y255D/V297L, I55V/A101L/G157Q/Y255D/F354Y, I55V/V291I/V297L, y I55V/I85V/A101L/R159Y/S189T/Y255D/F354Y. De estos, I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y /A380P son particularmente útiles en algunas realizaciones.
En algunos casos, las variantes de fitasas comprenden conjuntos de sustitución de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en T39D/K74D/Q157A, T39D/H60Q/K74D/N137P/T141A, K74D, T39D/D69N/N137P/T141E /Q157A, S120R/N137P/A138V, T39D/H60Q, K74D/T141A, K74P, N137P/A138V, H60Q/D69N, T39D/D69N/K74D, H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P, D69N/N137P/A138V/T141E, T39D/D69N/K74P/T111D/S120R/T141A, N137P /T141A, N137P/A138V/T141E, T39D/K74D, T39D/H60S/T111D/S120R, T39D/H60S/D69N/S120R/N137S/T141A, H60Q/N137P/A138V/T141A, Q157L, S120R/N137P, H60Q, S120R, S120R/N137S/A138V/Q157L, H60S/K74Y /S120R/A138V, T39D/D69N/S120R/T141A, H60S, T39D/S120R, T39D, H60S/K74D, T39D/T111D, T39D/H60S, T39D/K74D/T141E, K74D/T111D/T141E/Q157N, H60S/K74D/T111D/S120R/T141E/Q157N, T39D/K74D/S120R /T141E, T141E, K74D/S120R/Q157N, K74D/S120R, T111D/S120R/T141E, H60S/R65H, H60S/D69N/T111D/N137P, T39D/N137S/T141A, H60Q/D69N/N137P/A138V, T39D/D69N/K74D/N137P/A138V/T141E, K74D/T111D/T141A, N137S/A138V/T141E, H60Q/K74P/N137S/T141E, D69N/K74P, H60Q/K74P, T39D/T111D/S120R, T39D/H60Q/K74D /T111D/S120R, T39D/D69N, D69N/K74D, y T39D/H60Q/D69N/N137S/A138V.
En algunas realizaciones, el conjunto variante de aminoácidos de G2P, I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P, se agrega a un segundo conjunto (el "conjunto G3P", anterior) para proporcionar enzimas variante de fitasas con conjuntos de sustitución de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D/Q157A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q/K74D/N137P/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/N137P/T141E/Q157A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R/N137P/A138V,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74P,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137P/A138V,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/K74D,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/D69N/N137P/A138V/T141E,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/K74P/T111D/S120R/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137P/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137P/A138V/T141E,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60S/T111D/S120R,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60S/D69N/S120R/N137S/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/N137P/A138V/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/Q157L,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R/N137P,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R/N137S/A138V/Q157L,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74Y/S120R/A138V,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/S120R/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/S120R,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D, I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74D,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/T111D,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60S,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D/T141E,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/T111D/T141E/Q157N,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74D/T111D/S120R/T141E/Q157N,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D/S120R/T141E,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T141E,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/S120R/Q157N,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/S120R,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T111D/S120R/T141E,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/R65H,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/D69N/T111D/N137P,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/N137S/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/N137P/A138V,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/K74D/N137P/A138V/T141E,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/T111D/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137S/A138V/T141E,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/K74P/N137S/T141E,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/D69N/K74P/,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/K74P,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/T111D/S120R,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q/K74D/T111D/S120R,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/D69N/K74D, y I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q/D69N/N137S/A138V.
Las variantes de fitasas adecuadas son las listadas en las SEQ ID NOs: 12 a 171, y las representadas en las Figuras.
VI. Ácidos Nucleicos de la Invención
La presente invención adicional proporciona ácidos nucleicos que codifican las variantes de fitasas. Como apreciarán los expertos en la técnica, debido a la degeneración del código genético, se puede producir un número extremadamente grande de ácidos nucleicos, todos los cuales codifican las variantes de fitasas. Por lo tanto, habiendo identificado una secuencia de aminoácidos particular, los expertos en la materia podrían producir cualquier cantidad de ácidos nucleicos diferentes, simplemente modificando la secuencia de uno o más codones de una manera que no cambie la secuencia de aminoácidos de la proteína. Por lo tanto, proporcionar la secuencia de aminoácidos permite la generación de una gran cantidad de secuencias de ácido nucleico diferentes que codifican las proteínas.
En algunos casos, las variantes de fitasas específicas están codificadas por secuencias de ácido nucleico específicas, como se enumeran en las SEQ ID NOs 172 - 332.
Como se conoce en la técnica, los ácidos nucleicos que codifican los componentes de la invención pueden incorporarse en vectores de expresión como se conoce en la técnica, y dependiendo de las células huésped utilizadas para producir los anticuerpos heterodiméricos de la invención. Generalmente, los ácidos nucleicos están operativamente unidos a cualquier número de elementos reguladores (promotores, origen de replicación, marcadores seleccionables, sitios de unión al ribosoma, inductores, etc.). Los vectores de expresión pueden ser vectores extracromosómicos o integradores.
Los ácidos nucleicos y/o los vectores de expresión de la invención se transforman luego en cualquier número de diferentes tipos de células huésped como es bien conocido en la técnica, incluyendo células de mamíferos, bacterias, levaduras, insectos y/o hongos, con bacterias y hongos que encuentran uso en muchas realizaciones.
A. Preparación de variantes
Los ácidos nucleicos que codifican las variantes de fitasas pueden prepararse usando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sitio y la construcción de genes sintéticos como se conocen bien en la técnica.
La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido diseñada para codificar un polipéptido de interés. La síntesis génica se puede realizar utilizando una serie de técnicas, como la tecnología basada en microchips multiplex descrita por Tian et al., (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares en las que los oligonucleótidos se sintetizan y ensamblan sobre chips microfluídicos fotoprogramables. Una técnica preferida es GenScript®.
i. Secuencias reguladoras
La presente invención también se refiere a constructos de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención operativamente unida a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia de codificación en una célula huésped adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control .
El polinucleótido se puede manipular de varias maneras para proporcionar la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.
La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula huésped para la expresión del polinucleótido. El promotor contiene secuencias de control transcripcional que median la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula huésped, incluidos los promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, ya sean homólogos o heterólogos a la célula huésped.
Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa amilasa estable ácida de Aspergillus niger, fitasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amidoglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (Wo 00/56900), quinina de Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta glicosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus en el que el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados de un gen de alfa amilasa neutra de Aspergillus niger en el que el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.
En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldeído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control también puede ser un terminador de transcripción, que es reconocido por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia del terminador está operativamente unida al terminal 3' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede usar cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped.
En algunas realizaciones, se obtienen terminadores para células huésped fúngicas filamentosas a partir de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, fitasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
En algunas realizaciones, los terminadores para células huésped de levadura se obtienen a partir de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, citados más arriba.
La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm secuencia abajo de un promotor y secuencia arriba de la secuencia de codificación de un gen que aumenta la expresión del gen.
Se obtienen ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas a partir de un gen crylllA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465­ 3471).
La secuencia de control también puede ser un líder, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operativamente unida al terminal 5' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede usar cualquier líder que sea funcional en la célula huésped.
En algunas realizaciones, los líderes para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
En algunas realizaciones, se obtienen líderes adecuados para células huésped de levadura a partir de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente unida al terminal 3' de la secuencia que codifica la variante y, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para agregar residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped.
En algunas realizaciones, las secuencias de poliadenilación para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, fitasa de Aspergillus niger, alfa glucosidasa de Aspergillus niger, TACA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
Las secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
La secuencia de control también puede ser una región de codificación de péptido señal que codifica un péptido señal unido al terminal N de una variante y dirige la variante de glucoamilasa que se expresa en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación del polinucleótido puede contener inherentemente una secuencia de codificación de péptido señal naturalmente unida en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia de codificación que codifica la variante de glucoamilasa. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una secuencia de codificación de péptido señal que es foránea a la secuencia de codificación. Puede requerirse una secuencia foránea de codificación del péptido señal en la que la secuencia de codificación no contiene naturalmente una secuencia de codificación del péptido señal. Alternativamente, una secuencia de codificación de péptido señal foráneo puede simplemente reemplazar la secuencia de codificación del péptido señal natural con el fin de mejorar la secreción de la variante de glucoamilasa. Sin embargo, puede usarse cualquier secuencia de codificación de péptido señal que dirija la variante expresada hacia la ruta secretora de una célula huésped.
Las secuencias de codificación de péptidos señal eficaces para las células huésped fúngicas filamentosas son las secuencias de codificación de péptidos señal obtenidas de los genes para la amilasa neutra de Aspergillus niger, la fitasa de Aspergillus niger, la t AkA amilasa de Aspergillus oryzae, la celulasa de Humicola insolens, la endoglucanasa V de Humicola insolens, la lipasa de Humicola lanuginosa y la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.
Los péptidos señal útiles para células huésped de levadura se obtienen de los genes para el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Una secuencia señal particular se muestra en la Figura 1, SEQ ID NO: 2.
Cuando están presentes tanto el péptido señal como las secuencias de propéptido, la secuencia de propéptido se coloca al lado del terminal N de la variante y la secuencia del péptido señal se coloca al lado del terminal N de la secuencia del propéptido.
También puede ser deseable agregar secuencias reguladoras que regulen la expresión de la variante en relación con el crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procariotas incluyen los sistemas del operador lac, tac y trp. En levadura, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, se pueden usar el promotor de fitasa de Aspergillus niger, el promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de fitasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación de genes. En los sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la variante estaría operativamente unido a la secuencia reguladora.
1. Vectores de expresión
La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de fitasa, un promotor y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en dichos sitios. Alternativamente, el polinucleótido puede expresarse insertando el polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia de codificación se ubica en el vector de modo que la secuencia de codificación se une operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se va a introducir el vector. El vector puede ser un plásmido circular lineal o cerrado.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma o cromosomas dentro de los cuales se ha integrado. Además, se puede usar un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón. Los vectores contemplados para su uso con los métodos de la invención incluyen vectores integradores y no integradores.
En algunas realizaciones, el vector contiene uno o más marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.
Los marcadores adecuados para células huésped de levadura incluyen, pero no se limitan a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para usar en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato de adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como sus equivalentes. Los preferidos para su uso en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y un gen bar de Streptomyces hygroscopicus.
En algunas realizaciones, el vector contiene un elemento o elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede confiar en la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una ubicación o ubicaciones precisas en el cromosoma o cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases y 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga con la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificadores. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite que el vector se replique de forma autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de la replicación puede ser cualquier replicador de plásmidos que medie la replicación autónoma que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmidos" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.
Ejemplos de orígenes de replicación para uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.
Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen pueden realizarse de acuerdo con los métodos divulgados en el documento WO 00/24883.
Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula huésped para aumentar la producción de una variante. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador amplificable seleccionable con el polinucleótido en el que las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo tanto, se pueden seleccionar copias adicionales del polinucleótido cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, citado más arriba).
2. Optimización del codón
La optimización del codón puede emplearse con cualquiera de las variantes de polipéptidos de fitasa, para optimizar la expresión en la célula huésped empleada. Tales métodos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO 2007/142954. En los sistemas de expresión heterólogos, las etapas de optimización pueden mejorar la capacidad del huésped para producir la variante deseada de polipéptidos de fitasa. La expresión de proteínas se rige por una serie de factores, incluidos los que afectan la transcripción, el procesamiento de ARNm y la estabilidad y el inicio de la traducción. Las etapas de optimización de polinucleótidos pueden incluir etapas para mejorar la capacidad del huésped para producir la proteína foránea, así como etapas para ayudar al investigador a diseñar eficientemente constructos de expresión. Las estrategias de optimización pueden incluir, por ejemplo, la modificación de las regiones de inicio de la traducción, la alteración de los elementos estructurales del ARNm y el uso de diferentes sesgos de codones. Los siguientes párrafos discuten problemas potenciales que pueden resultar en una expresión reducida de proteínas heterólogas, y técnicas que pueden superar estos problemas.
En algunas realizaciones, la expresión de proteína heteróloga reducida resulta de una pausa traduccional inducida por un codón raro. Una pausa traduccional inducida por codones raros incluye la presencia de codones en el polinucleótido de interés que rara vez se usan en el organismo huésped que puede tener un efecto negativo en la traducción de proteínas debido a su escasez en el conjunto de ARNt disponible. Un método para mejorar la traducción óptima en el organismo huésped incluye la realización de la optimización del codón que puede dar lugar a la modificación de codones raros del huésped en la secuencia sintética de polinucleótidos.
En algunas realizaciones, la expresión de proteína heteróloga reducida resulta de un inicio de traducción alternativo. El inicio de traducción alternativo puede incluir una secuencia de polinucleótidos sintética que contiene inadvertidamente motivos capaces de funcionar como un sitio de unión al ribosoma (RBS). Estos sitios pueden dar como resultado el inicio de la traducción de una proteína truncada desde un sitio interno del gen. Un método para reducir la posibilidad de producir una proteína truncada, que puede ser difícil de eliminar durante la purificación, incluye modificar supuestas secuencias internas de RBS a partir de una secuencia de polinucleótidos optimizada.
En algunas realizaciones, la expresión de proteína heteróloga reducida se produce a través del desplazamiento de la polimerasa inducida por repetición. El desplazamiento de la polimerasa inducido por repetición implica repeticiones de secuencias de nucleótidos que han demostrado causar desplazamiento o perturbación de la ADN polimerasa, lo que puede dar como resultado mutaciones de cambio de marco. Tales repeticiones también pueden causar el desplazamiento de la ARN polimerasa. En un organismo con un alto sesgo de contenido de G C, puede haber un mayor grado de repeticiones compuestas de repeticiones de nucleótidos G o C. Por lo tanto, un método para reducir la posibilidad de inducir el desplazamiento de la ARN polimerasa incluye alterar las repeticiones extendidas de nucleótidos G o C.
En algunas realizaciones, la expresión de proteína heteróloga reducida se produce a través de estructuras secundarias que interfieren. Las estructuras secundarias pueden secuestrar la secuencia RBS o el codón de iniciación y se han correlacionado con una reducción en la expresión de proteínas. Las estructuras del bucle del tallo también pueden estar involucradas en la pausa y atenuación transcripcional. Una secuencia de polinucleótidos optimizada puede contener estructuras secundarias mínimas en las regiones de codificación de genes y RBS de la secuencia de nucleótidos para permitir una transcripción y traducción mejoradas.
En algunas realizaciones, los sitios de restricción pueden afectar la expresión de proteínas heterólogas. Al modificar los sitios de restricción que podrían interferir con la subsiguiente subclonación de unidades de transcripción en vectores de expresión del huésped, se puede optimizar una secuencia de polinucleótidos.
La optimización de una secuencia de ADN puede afectar negativa o positivamente la expresión génica o la producción de proteínas. Por ejemplo, modificar un codón menos común con un codón más común puede afectar la vida media del ARNm o alterar su estructura al introducir una estructura secundaria que interfiere con la traducción del mensaje. Por lo tanto, puede ser necesario, en ciertos casos, alterar el mensaje optimizado.
Se puede optimizar AUG o una porción de un gen. En algunas realizaciones, la modulación de expresión deseada se logra optimizando esencialmente todo el gen. En otras realizaciones, la modulación deseada se logrará optimizando parte pero no todo el gen.
El uso de codones de cualquier secuencia de codificación puede ajustarse para lograr una propiedad deseada, por ejemplo, altos niveles de expresión en un tipo de célula específico. El punto de partida para tal optimización puede ser una secuencia de codificación con codones 100% comunes, o una secuencia de codificación que contiene una mezcla de codones comunes y no comunes.
Se pueden generar y probar dos o más secuencias candidatas que difieren en su uso de codones para determinar si poseen la propiedad deseada. Las secuencias candidatas pueden evaluarse usando un ordenador para buscar la presencia de elementos reguladores, tal como silenciadores o potenciadores, y para buscar la presencia de regiones de secuencia codificante que podrían convertirse en dichos elementos reguladores mediante una alteración en el uso de codones. Los criterios adicionales pueden incluir enriquecimiento para nucleótidos particulares, por ejemplo, A, C, G o U, sesgo de codones para un aminoácido particular, o la presencia o ausencia de una estructura secundaria o terciaria de ARNm particular. El ajuste a la secuencia candidata se puede realizar en función de varios de estos criterios.
Se construyen secuencias candidatas prometedoras y luego se evalúan experimentalmente. Se pueden evaluar múltiples candidatos independientemente uno del otro, o el proceso puede ser iterativo, ya sea utilizando el candidato más prometedor como un nuevo punto de partida, o combinando regiones de dos o más candidatos para producir un nuevo híbrido. Se pueden incluir rondas adicionales de modificación y evaluación.
La modificación del uso de codones de una secuencia candidata puede dar como resultado la creación o destrucción de un elemento positivo o negativo. En general, un elemento positivo se refiere a cualquier elemento cuya alteración o eliminación de la secuencia candidata podría dar como resultado una disminución en la expresión de la proteína terapéutica, o cuya creación podría dar como resultado un aumento en la expresión de una proteína terapéutica. Por ejemplo, un elemento positivo puede incluir un potenciador, un promotor, un elemento promotor secuencia abajo, un sitio de unión de ADN para un regulador positivo (por ejemplo, un activador transcripcional) o una secuencia responsable de impartir o modificar una estructura secundaria o terciaria de ARNm. Un elemento negativo se refiere a cualquier elemento cuya alteración o eliminación de la secuencia candidata podría resultar en un aumento en la expresión de la proteína terapéutica, o cuya creación resultaría en una disminución en la expresión de la proteína terapéutica. Un elemento negativo incluye un silenciador, un sitio de unión de ADN para un regulador negativo (por ejemplo, un represor transcripcional), un sitio de pausa transcripcional o una secuencia que es responsable de impartir o modificar una estructura secundaria o terciaria de ARNm. En general, un elemento negativo surge con más frecuencia que un elemento positivo. Por lo tanto, cualquier cambio en el uso de codones que resulte en un aumento en la expresión de proteínas es más probable que haya surgido de la destrucción de un elemento negativo en lugar de la creación de un elemento positivo. Además, la alteración de la secuencia candidata tiene más probabilidades de destruir un elemento positivo que crear un elemento positivo. En algunas realizaciones, se elige y modifica una secuencia candidata para aumentar la producción de una proteína terapéutica. La secuencia candidata puede modificarse, por ejemplo, alterando secuencialmente los codones o alterando aleatoriamente los codones en la secuencia candidata. Luego se evalúa una secuencia candidata modificada determinando el nivel de expresión de la proteína terapéutica resultante o evaluando otro parámetro, por ejemplo, un parámetro correlacionado con el nivel de expresión. Se elige una secuencia candidata que produce un nivel aumentado de una proteína terapéutica en comparación con una secuencia candidata inalterada.
En algunas realizaciones, se puede modificar uno o un grupo de codones, por ejemplo, sin referencia a la proteína o estructura del mensaje y probarlos. Alternativamente, se pueden elegir uno o más codones en una propiedad a nivel de mensaje, por ejemplo, ubicación en una región de contenido de GC predeterminado, por ejemplo, alto o bajo, ubicación en una región que tiene una estructura tal como un potenciador o silenciador, ubicación en un región que se puede modificar para introducir una estructura tal como un potenciador o silenciador, ubicación en una región que tiene, o se predice que tiene, estructura secundaria o terciaria, por ejemplo, emparejamiento dentro de la cadena, emparejamiento entre cadenas, ubicación en una región que carece, o se predice que carece de estructura secundaria o terciaria, por ejemplo, emparejamiento dentro de la cadena o entre cadenas. Se elige una región modificada particular si produce el resultado deseado.
Los métodos que generan sistemáticamente secuencias candidatas son útiles. Por ejemplo, uno o un grupo, por ejemplo, un bloque contiguo de codones, en varias posiciones de una secuencia de ácido nucleico sintético puede modificarse con codones comunes (o con codones no comunes, si por ejemplo, la secuencia de partida se ha optimizado) y se evaluó la secuencia resultante. Los candidatos pueden generarse optimizando (o desoptimizando) una "ventana" de codones dada en la secuencia para generar un primer candidato, y luego moviendo la ventana a una nueva posición en la secuencia, y optimizando (o desoptimizando) los codones en la nueva posición debajo de la ventana para proporcionar un segundo candidato. Los candidatos se pueden evaluar determinando el nivel de expresión que proporcionan o evaluando otro parámetro, por ejemplo, un parámetro correlacionado con el nivel de expresión. Algunos parámetros pueden evaluarse mediante inspección o mediante ordenador, por ejemplo, la posesión o la carencia de los mismos de alto o bajo contenido de GC; un elemento de secuencia tal como un potenciador o silenciador; una estructura secundaria o terciaria, por ejemplo, emparejamiento dentro de la cadena o entre cadenas.
En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico optimizada puede expresar la variante del polipéptido fitasa de la invención, a un nivel que es al menos 110%, 150%, 200%, 500%, 1.000%, 5.000% o incluso 10.000% de aquel expresado por la secuencia de ácido nucleico que no ha sido optimizada.
Partiendo con la secuencia de aminoácidos de una variante de fitasa, se puede diseñar una secuencia de ADN candidata. Durante el diseño de la secuencia de ADN sintética, la frecuencia del uso de codones se puede comparar con el uso de codones del organismo de expresión del huésped y los codones huésped raros se pueden modificar en la secuencia sintética. Además, la secuencia de ADN candidata sintética puede modificarse para eliminar sitios de restricción de enzimas indeseables y agregar o alterar cualquier secuencia señal deseada, enlazadores o regiones no traducidas. La secuencia de ADN sintética puede analizarse para detectar la presencia de una estructura secundaria que puede interferir con el proceso de traducción, tal como las repeticiones G/C y las estructuras de bucle de tallo. Antes de que se sintetice la secuencia de ADN candidata, se puede verificar el diseño de secuencia optimizado para verificar que la secuencia codifique correctamente la secuencia de aminoácidos deseada. Finalmente, la secuencia de ADN candidata se puede sintetizar usando técnicas de síntesis de ADN, tal como las conocidas en la técnica.
En algunas realizaciones, el uso general de codones en un organismo huésped, como cualquiera de los descritos en el presente documento, puede utilizarse para optimizar la expresión de la secuencia de polinucleótidos heteróloga en el organismo huésped. Se puede evaluar el porcentaje y la distribución de codones que rara vez se considerarían preferidos para un aminoácido particular en el sistema de expresión del huésped. Los valores de uso de 5% y 10% pueden usarse como valores de corte para la determinación de codones raros.
VII. Células huésped y cepas de producción
Como apreciarán los expertos en la materia, existe una amplia variedad de organismos huéspedes de producción para la producción recombinante de las variantes de fitasas, incluidas, entre otras, células bacterianas y células fúngicas, incluida la levadura. Además, mientras que la fitasa parental G1P no está glicosilada, la glicosilación por producción en levaduras y hongos no afecta negativamente la actividad fitasa.
La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de glucoamilasa unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción de una variante.
Un constructo o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula huésped de modo que el constructo o el vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se describió anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula parental que no sea idéntica a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen que codifica la variante y su fuente. En algunas realizaciones, la célula huésped exhibe expresión transitoria de la variante de glucoamilasa. En algunas realizaciones, la célula huésped es un huésped transfectado de manera estable o una célula huésped que expresa establemente (es decir, permanentemente) la variante de fitasa. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula huésped de producción.
La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, por ejemplo, una procariota o una eucariota. Dichas células huésped incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, fúngicas y de levadura. La célula huésped también puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta o fúngica.
La célula huésped puede ser una célula fúngica. "Hongos", como se usa en el presente documento, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como el Oomycota y todos los hongos mitospóricos (de acuerdo a lo definido por Hawksworth et al., En, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).
La célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. "Levadura", como se usa en el presente documento, incluye levadura ascosporógena (Endomycetales), levadura basidiosporógena y levadura que pertenece a los Fungui Imperfecti (Blastomycetes). Dado que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura se definirá como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore y Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia lipolytica.
La célula huésped fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (de acuerdo a lo definido por Hawksworth et al., 1995, citado más arriba). Los hongos filamentosos generalmente se caracterizan por una pared micelar compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo del carbono es obligatoriamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.
La célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma.
Por ejemplo, la célula huésped de hongos filamentosos puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
Las células fúngicas pueden transformarse mediante un proceso que implica formación de protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera ya conocida. Los procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergillus y Trichoderma se describen en los documentos EP 238023, Yelton et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, BiolTechnology 6: 1419-1422. Los métodos adecuados para transformar las especies de Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y en el documento WO 96/00787. La levadura puede transformarse usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, páginas 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.
VIII. Composiciones
La presente invención también proporciona composiciones que comprenden una variante de fitasas. En algunas realizaciones, la composición comprende un vehículo y/o un excipiente. En algunas realizaciones, las composiciones están enriquecidas en dicho polipéptido de la variante de fitasa de la presente invención. El término "enriquecida" indica que la actividad de fitasa de la composición se ha incrementado, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1. En algunas realizaciones, las composiciones se formulan para proporcionar características deseables tales como bajo color, bajo olor y estabilidad aceptable durante el almacenamiento.
La composición comprende un polipéptido de la variante de fitasa como se describe en el presente documento como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición de un solo componente. En algunas realizaciones, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una aminopeptidasa, alfa-amilasa, beta-amilasa, fitasa, isoamilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, fitasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, polifenoloxidasa, pululanasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, y/o xilanasa.
IX. Métodos de producción
La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la variante de fitasa, que comprende: (a) cultivar una célula huésped de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de variante de fitasa; y (b) recuperar el polipéptido de la variante de fitasa.
Las células huésped se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido de la variante de fitasa usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en un matraz con agitación, o fermentación a pequeña o gran escala (incluidas fermentaciones continuas, discontinuas, alimentadas por lotes o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y en condiciones que permitan que la variante se exprese y/o aísle. El cultivo se lleva a cabo en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles a partir de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido de la variante de fitasa se secreta en el medio nutriente, el polipéptido de la variante de fitasa puede recuperarse directamente del medio. Si la variante no se secreta, se puede recuperar de los lisados celulares.
El polipéptido de la variante de fitasa puede detectarse usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para las variantes. Estos métodos de detección incluyen, entre otros, el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede usar un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido de la variante de fitasa.
El polipéptido de la variante de fitasa puede recuperarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido de la variante de fitasa puede recuperarse del medio nutriente mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.
La variante se puede purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.
En un caso alternativo, la variante no se recupera, sino que se usa una célula huésped de la presente invención que expresa la variante como fuente de la variante. En un caso particular, la variante de fitasa no se recupera y la célula huésped es una célula huésped de levadura. En particular, la levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia lipolytica. En algunas realizaciones, la levadura es Saccharomyces cerevisiae.
X. Formulaciones y usos de la fitasa
Como se discute en el presente documento, el uso de la fitasa en piensos para animales tiene una serie de beneficios, que incluyen un ahorro en los costes de los piensos, tales como reducciones en el fosfato inorgánico, la energía y los aminoácidos de la dieta, que incluyen una descomposición rápida y eficiente del fitato en la dieta y una mayor disponibilidad de nutrientes de fitato, así como los beneficios de producción, tales como el aumento de peso corporal para los sujetos no rumiantes, mayor liberación de nutrientes del fitato y un beneficio significativo en la excreción reducida de fósforo para mejorar el impacto ambiental de los animales no rumiantes. Las variantes de fitasas pueden ser formuladas y agregadas al pienso o pueden elaborarse como un componente del pienso. En el primer caso, la adición de fitasa a los piensos se puede hacer formulando la fitasa en un pienso portador tal como harina de trigo. Como apreciarán los expertos en la técnica, la formulación de las variantes de fitasas depende de su uso final y de las condiciones asociadas. Las formulaciones adecuadas para las variantes de fitasas incluyen formulaciones líquidas, formulaciones secas (incluidas las formulaciones secadas por pulverización), formulaciones en polvo, formulaciones granulares y formulaciones granuladas.
En algunas realizaciones, la composición enzimática (es decir, composiciones de polipéptidos) de la presente invención puede estar en cualquier forma adecuada para su uso, tal como, por ejemplo, un caldo de fermentación crudo con o sin células eliminadas, un lisado celular con o sin residuos celulares, una composición enzimática semipurificada o purificada, o una célula huésped, como fuente de las enzimas.
En algunas realizaciones, la composición enzimática puede ser un polvo seco o granulado, un granulado no pulverulento, un líquido, un líquido estabilizado o una enzima protegida estabilizada. Las composiciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, estabilizarse mediante la adición de estabilizadores tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol y/o ácido láctico u otro ácido orgánico de acuerdo con los procesos establecidos.
En algunas realizaciones, la dosificación de la composición de polipéptidos de la invención y otras condiciones bajo las cuales se usa la composición pueden determinarse con base en los métodos conocidos en la técnica.
Las composiciones anteriores son adecuadas para su uso en procesos de licuefacción, sacarificación y/o fermentación, y en algunas realizaciones, en la conversión de almidón. En algunas realizaciones, las composiciones son útiles para producir un producto alimenticio, que incluye un jarabe, así como productos de fermentación, tales como etanol. En algunas realizaciones, las composiciones son útiles para la industria farmacéutica, tales como ayudas digestivas.
En una realización, las composiciones que comprenden las fitasas se añaden al pienso animal y se granulan como se conoce en la técnica, de modo que el pienso se forma con fitasa en él. En otras realizaciones, la composición puede pulverizarse o dosificarse en forma líquida en el pienso para animales.
Ejemplos
XI. Ejemplo 1: Síntesis y clonación de genes
El gen de partida de EcFitasa (G1P) fue sintetizado por GenScript (http://www.genscript.com/). El gen sintetizado se clonó en el vector pET-20b(+) (Novagen EMD Millipore, EE. UU.: catálogo N° 69739).
XII. Ejemplo 2: Diseño y construcción de colecciones de mutantes
En la primera generación de mejora, se usó como gen parental un gen de fitasa nativo (G1P, SEQ ID NO: 1) de una cepa de E. coli. Para mejorar la termoestabilidad y la tolerancia al pH del progenitor de la Generación 1, se diseñaron ocho colecciones de mutantes basadas en la secuencia de proteínas y el análisis estructural de EcFitasa. El diseño incluye una a múltiples mutaciones específicas por variante. Las colecciones de mutantes se construyeron utilizando el kit QuickChange® Lightning (Agilent Technologies, Santa Clara, California) y posteriormente se clonaron en el vector pET-20b(+) (Novagen EMD Millipore, EE. UU.: catálogo # 69739).
En la segunda generación de mejora, la mejor variante de la primera generación se usó como progenitor. Para mejorar aún más la termoestabilidad y la tolerancia al pH del progenitor de la Generación 2, se diseñaron dos colecciones mutantes basadas en las mutaciones favorables identificadas en la primera generación. El diseño incluye una a múltiples mutaciones específicas por variante. Las colecciones de mutantes se construyeron posteriormente utilizando el kit QuickChange® Lightning (Agilent Technologies, Santa Clara, California).
En la tercera generación de mejora, la mejor variante de la segunda generación se usó como progenitor. Para mejorar aún más la termoestabilidad y la tolerancia al pH del progenitor de la Generación 3, se diseñó una colección de mutantes basada en las mutaciones favorables identificadas en la primera y segunda generaciones. El diseño incluye una a múltiples mutaciones específicas por variante. Las colecciones de mutantes se construyeron posteriormente utilizando el kit QuickChange® Lightning (Agilent Technologies, Santa Clara, California).
XIII. Ejemplo 3: Preparación de gránulos de células húmedas que contienen fitasa HTP
Las células BL21(DE3)pLysS de E. coli (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.: Catálogo # C606003) que comprenden genes recombinantes que codifican fitasa de colonias individuales se inocularon en pozos individuales de placas de microtitulación poco profundas de 96 pozos que contienen 180 pL de LB que contiene glucosa al 1% y 100 pg/mL de ampicilina. Los cultivos crecieron durante la noche a 30 °C, 200 rpm y 85% de humedad. Se transfirieron 10 pL del cultivo nocturno de cada pozo a los pozos correspondientes de placas de 96 pozos profundos que contenían 390 mL de caldo Terrific (TB) y 100 pg/mL de ampicilina. Las placas de pozos profundos se incubaron durante 3,5-4 horas (OD600 0,6-0,8) a 37 °C, 250 rpm y 85% de humedad. Los cultivos celulares fueron inducidos por IPTG a una concentración final de 1 mM y se incubaron durante la noche en las mismas condiciones que las utilizadas originalmente. Las células se sedimentaron luego usando centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se descartaron y los sedimentos se congelaron a -80 °C antes de la lisis.
XIV. Ejemplo 4: Lisis de las placas de fitasa HTP
Se añadieron 150 pL de reactivo de extracción de proteína bacteriana B-PER (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.: catálogo N° 78248) a la pasta celular en cada pozo como se describió anteriormente. Las células se lisaron a temperatura ambiente durante 1,5 horas con agitación en un agitador de mesa. La placa se centrifugó luego durante 10 minutos a 4000 rpm y 4 °C. Los sobrenadantes claros se usaron para realizar ensayos bioquímicos para determinar la actividad, la tolerancia al pH y la termoestabilidad.
XV. Ejemplo 5: Ensayo enzimático sin tratamiento de temperatura
El lisado del ejemplo 4 se diluyó 400 veces usando acetato de sodio 0,1 M, pH 4,5 y pH 5,5. En placas de microtitulación poco profundas de 96 pozos, se añadieron 30 pL del lisado diluido a 20 pL de sustrato de fitato de sodio (C6HaNa12O24P6, PF: 923,81) preparado en acetato de sodio 0,1 M, pH 4,5 y pH 5,5. La reacción se incubó a 24 °C, 150 rpm durante 30 minutos. La reacción se interrumpió con 50 pL de ácido tricloroacético al 5% p/v. A cada pozo de las placas de microtitulación poco profundas de 96 pozos, se añadieron 100 pL de reactivo colorante. El reactivo colorante se preparó recientemente mezclando cuatro volúmenes de solución de molibdato de amonio al 2,5% en ácido sulfúrico al 5,5% y un volumen de solución de sulfato ferroso al 2,7%. Después de agitar las placas durante 30 segundos, se sometieron a centrifugación a 4000 rpm durante 2 minutos. Luego se diluyeron 100 pL del sobrenadante de cada pozo de las placas centrifugadas con 100 pL de agua y se leyó la absorbancia a 700 nm. La actividad enzimática de la variante se comparó con la progenitora bajo las mismas condiciones para determinar la mejora de la actividad (Figuras 5 y 6).
XVI. Ejemplo 6: Ensayo enzimático con tratamiento de temperatura
El lisado del ejemplo 4 se diluyó 90 veces usando acetato de sodio 0,1 M, pH 4,5 y pH 5,5. Se transfirieron 50 pL del lisado diluido a placas de Pc R y se calentaron a 58 °C o 66 °C (G1), 66 °C (G2) y 70,2 °C (G3) durante 5 minutos en termocicladores para identificar variantes mejoradas. En placas de microtitulación poco profundas de 96 pozos, se añadieron 30 pL del lisado tratado a 20 pL de sustrato de fitato de sodio (C6H6Na-i2O24P6, PF: 923,81) preparado en acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5. La reacción se incubó a 37 °C, 150 rpm durante 30 minutos. La reacción se interrumpió con 50 pL de ácido tricloroacético al 5% p/v. A cada pozo de las placas de microtitulación poco profundas de 96 pozos, se añadieron 100 pL de reactivo colorante. El reactivo colorante se preparó recientemente mezclando cuatro volúmenes de solución de molibdato de amonio al 2,5% en ácido sulfúrico al 5,5% y un volumen de solución de sulfato ferroso al 2,7%. Después de agitar las placas durante 30 segundos, se sometieron a centrifugación a 4000 rpm durante 2 minutos. Luego se diluyeron 100 pL del sobrenadante de cada pozo de las placas centrifugadas con 100 pL de agua y se leyó la absorbancia a 700 nm. Después del tratamiento de pH/temperatura, la actividad enzimática de la variante se comparó con la progenitora en las mismas condiciones para determinar la mejora en la tolerancia al pH y la termoestabilidad. La mejor variante de la generación 1 G2P mostró una mejora de 12 y 20 veces sobre la generación 1 parental G1P a pH 4,5 y pH 5,5 respectivamente (Figura 6). La mejor variante de la generación 2 G3P mostró una mejora de 2 veces sobre la generación 2 parental G2P a pH 5,5 (Figura 7). La mejor variante de la generación 3 G4P mostró una mejora de 4 veces sobre la generación 3 parental G3P a pH 5,5 (Figura 8).
XVII. Ejemplo 7: Validación de las variantes en el ensayo de gradiente de temperatura.
Las principales variantes de cada generación se seleccionaron con base en la tolerancia y termoestabilidad mejoradas al pH. Las mejores variantes se sometieron a un tratamiento de gradiente de temperatura en el intervalo de 55 °C -75 °C o 63 °C - 75 °C durante 5 minutos a pH 4,5 y/o 5,5 siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 6. Figura 10 muestra el perfil de termoestabilidad de las variantes de G1P, G2P y G3P a pH 4,5 y 5,5 respectivamente. Bajo ambos pH, G1P mantiene una actividad del 100% hasta 57 °C. G2P mantiene una actividad del 100% hasta 64 °C, mientras que G3P es estable hasta 68 °C. La Figura 12 muestra el perfil de termoestabilidad de las variantes de G1P, G2P, G3P y G4P a pH 5,5 respectivamente.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una variante de enzima fitasa,
en la que dicha variante de fitasa comprende una sustitución de aminoácidos Y255D en comparación con la SEQ ID NO: 1, y además en la que la variante de fitasa comprende las sustituciones de aminoácidos I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P y es al menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 5; en la que la variante de enzima fitasa tiene actividad fitasa; y en la que la variante de enzima fitasa es más estable que la fitasa parental correspondiente a la SEQ ID NO: 1 en las mismas condiciones de desafío térmico.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha variante de fitasa comprende las sustituciones de aminoácidos I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P y es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 7)
3. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha variante de fitasa comprende las sustituciones de aminoácidos I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/N176K/D185N/E402D y es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 9.
4. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha variante de enzima fitasa tiene un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/D69N/T111D/N137P,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/N137S/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/N137P/A138V,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/K74D/N137P/A138V/T141E,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/T111D/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137S/A138V/T141E,
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I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/K74P,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/T111D/S120R,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q/K74D/T111D/S120R,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N,
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I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74P,
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I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60S/D69N/S120R/N137S/T141A,
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I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/Q157L,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R/N137P,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R,
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I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74Y/S120R/A138V,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/S120R/T141A,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/S120R,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74D,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/T111D,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60S,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D/T141E,
I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/T111D/T141E/Q157N, I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74D/T111D/S120R/T141E/Q157N, I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D/S120R/T141E, I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T141E, I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/S120R/Q157N, I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/S120R, I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T111D/S120R/T141E, I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/R65H, I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/ N176K/D185N/H282N/R385T, I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/ N176K/D185N/K363A/R385T/E402T, I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/ N139H/N176K/D185N/H282N/A288R/E315G/R385T, I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/ N139A/N176K/A288R/E315G, y I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/ D185N/H282N/A288R/E315G.
5. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que comprende además pienso para animales.
6. Un ácido nucleico que codifica la enzima fitasa de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6.
8. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7.
9. Un método para elaborar una enzima fitasa que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 bajo condiciones en las que se produce dicha enzima fitasa y recuperar dicha enzima.
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