ES2797726T3 - Automated HIV-1 Viral Load Test Procedure for Dry Drops - Google Patents

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Abstract

Un método automatizado para detectar ácidos nucleicos del VIH-1 en una muestra de sangre, comprendiendo el método: a) proporcionar: i) una muestra de sangre que se sospecha infectada con VIH secada en un soporte sólido, ii) un tampón de elución, iii) un instrumento de preparación de las muestras automatizado, programable, iv) un instrumento de PCR automatizado, programable, v) ADNasa y vi) reactivos de PCR adecuados para la detección de ácidos nucleicos del VIH-1; b) eluir la muestra de sangre del soporte sólido con el tampón de elución para crear una muestra eluida; c) cargar automáticamente la muestra eluida en el instrumento de preparación de las muestras automatizado, programable para la extracción y purificación posterior de ácidos nucleicos para crear una muestra procesada; d) cargar los reactivos de PCR en el instrumento de PCR automatizado, programable; e) iniciar un programa automatizado para dispensar alícuotas de los reactivos de PCR en la muestra procesada; f) llevar a cabo la PCR en los ácidos nucleicos extraídos en la muestra procesada con el instrumento de PCR automatizado, programable; g) analizar los resultados de la PCR generados por el instrumento de PCR automatizado, programable para determinar si alguna muestra comprende ácidos nucleicos del VIH-1; h) en donde, dicho tampón de elución comprende aproximadamente GITC 3,5 M, aproximadamente polisorbato 20 5 %, aproximadamente KOAc 50 mM a aproximadamente pH 6,0; i) en donde, opcionalmente, la ADNasa se añade a una o más de las muestras procesadas, los reactivos de PCR, o la reacción de PCR completa después de la adición de los reactivos de PCR a la muestra procesada.An automated method for detecting HIV-1 nucleic acids in a blood sample, the method comprising: a) providing: i) a blood sample suspected of being infected with HIV dried on a solid support, ii) an elution buffer, iii) an automated, programmable sample preparation instrument, iv) an automated, programmable PCR instrument, v) DNase and vi) PCR reagents suitable for the detection of HIV-1 nucleic acids; b) eluting the blood sample from the solid support with the elution buffer to create an eluted sample; c) automatically loading the eluted sample into the automated, programmable sample preparation instrument for subsequent extraction and purification of nucleic acids to create a processed sample; d) loading the PCR reagents into the automated, programmable PCR instrument; e) initiating an automated program to dispense aliquots of the PCR reagents into the processed sample; f) carrying out the PCR on the nucleic acids extracted in the sample processed with the automated, programmable PCR instrument; g) analyzing the PCR results generated by the automated, programmable PCR instrument to determine if any sample comprises HIV-1 nucleic acids; h) wherein said elution buffer comprises approximately 3.5 M GITC, approximately 5% polysorbate 20, approximately 50 mM KOAc at approximately pH 6.0; i) wherein, optionally, DNase is added to one or more of the processed samples, the PCR reagents, or the entire PCR reaction after the addition of the PCR reagents to the processed sample.

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Procedimiento de prueba de la carga viral del VIH-1 automatizada para gotas secasAutomated HIV-1 Viral Load Test Procedure for Dry Drops

AntecedentesBackground

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es el agente etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). (Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983, 220:868-71; Popovic M, Sarngadharan MG, Read E, et al. Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-I) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 1984, 224:497-500; Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-I) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 1984, 224:500-3). Puede transmitirse mediante contacto sexual, exposición a sangre o hemoderivados infectados o de una madre infectada hacia el feto. (Curran JW, Jaffe HW, Hardy AM, et al. Epidemiology of HIV infection and AIDS in the United States. Science 1988, 239:610-16). El síndrome agudo del VIH, caracterizado por síntomas pseudogripales, se desarrolla entre 3 y 5 semanas después de la infección inicial y está asociado con altos niveles de viremia. (Daar ES, Moudgil T, Meyer RD, Ho DD. Transient high levels of viremia in patients with primary human immunodeficiency virus type 1 infection. New Engl J Med 1991,324:961-4; Clark SJ, Saag MS, Decker WD. High titers of cytopathic virus in plasma of patients with symptomatic primary HIV-1 infection. New Engl J Med 1991, 324:954-60). De 4 a 6 semanas después de la presentación de los síntomas, se puede detectar la respuesta inmunitaria específica contra el VIH. (Albert J, Abrahamsson B, Nagy K, et al. Rapid development of isolate-specific neutralizing antibodies after primary HIV-1 infection and consequent emergence of virus variants which resist neutralization by autologous sera. AIDS 1990, 4:107-12; Horsburgh CR Jr, Ou CY, Jason J, et al. Duration of human immunodeficiency virus infection before detection of antibody. Lancet 1989, 334:637-40). Tras la seroconversión, la carga viral en la sangre periférica disminuye y la mayoría de los pacientes entran en una fase asintomática que puede durar varios años. (Pantaleo G, Graziosi C, Fauci AS. New concepts in the immunopathogenesis of human immunodeficiency virus (HIV) infection. New Engl J Med 1993, 328:327-35). Quantitative measurement of HIV levels in peripheral blood has greatly contributed to the understanding of the pathogenesis of HIV infection (Ho DD, Neumann AU, Perelson AS, et al. Rapid turnover of plasma virions and c D4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature 1995, 373:123-6; Wei X, Ghosh SK, Taylor ME, et al. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection. Nature 1995, 373:117-22) and has been shown to be an essential parameter in prognosis and management of HIV infected individuals. (Mellors JW, Rinaldo CR JR, Gupta P, et al. Prognosis in HIV-1 infection predicted by the quantity of virus in plasma. Science 1996, 272:1167-70; Mellors JW, Munoz A, Giorgi JV, et al. Plasma viral load and Cd4+ lymphocytes as prognostic markers of HIV-1 infection. Ann Intern Med 1997, 126(12):946-54; Chene G, Sterne JA, May M, et al. Prognostic importance of initial response in HIV-1 infected patients starting potent antiretroviral therapy: analysis of prospective studies. Lancet 2003, 362:679-86; Egger M, May M, Chene G, et al. Prognosis of HIV-1 infected drug patients starting highly active antiretroviral therapy: a collaborative analysis of prospective studies. Lancet 2002, 360:119-29; Wood E, Hogg RS, Yip B, et al. Higher baseline levels of plasma human immunodeficiency virus type 1 RNA are associated with increased mortality after initiation of triple-drug antiretroviral therapy. J Infect Dis 2003, 188:1421-5; Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos. 2004 Directrices para el uso de agentes antirretrovirales en adultos y adolescentes infectados por el VIH-1. Disponible en Internet en: AIDSinfo.nih.gov/guidelines). Las decisiones relativas al inicio o cambios en la terapia antirretroviral vienen determinadas por el control de los niveles de ARN del VIH (carga viral) en plasma, el recuento de linfocitos T CD4+ y el estado clínico del paciente. (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos. 2004 Directrices para el uso de agentes antirretrovirales en adultos y adolescentes infectados por el VIH-1. Disponible en Internet en: AIDSinfo.nih.gov/guidelines; Yeni PG, Hammer SM, Hirsch MS, et al. Treatment for Adult HIV Infection. 2004 Recommendations of the International AIDS Society-USA Panel. JAMA 2004, 292:251-65). El objetivo del tratamiento antirretroviral es reducir el virus VIH en plasma hasta niveles por debajo de lo detectable de las pruebas de carga viral disponibles. (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos. 2004 Directrices para el uso de agentes antirretrovirales en adultos y adolescentes infectados por el VIH-1. Disponible en Internet en: AIDSinfo.nih.gov/guidelines; AS, Essunger P, Cao Y, et al. Decay characteristics of HIV-1 infected compartments during combination therapy. Nature 1997, 387(6629):188-91). HIV RNA levels in plasma can be quantitated by prior art procedures by nucleic acid amplification or signal amplification technologies. (Mulder J, McKinney N, Christopher C, et al. Rapid and simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: application to acute retroviral infection. J Clin Microbiol 1994, 32:292-300; Dewar RL, Highbarger HC, Sarmiento MD, et al. Application of branched DNA signal amplification to monitor human immunodeficiency virus type 1 burden in human plasma. J Inf Diseases 1994, 170:1172-9; Van Gemen B, Kievits T, Schukkink R, et al. Quantification of HIV-1 RNA in plasma using NASBA™ during HIV-1 primary infection. J Virol Methods 1993, 43:177-87).The human immunodeficiency virus (HIV) is the etiological agent of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). (Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983, 220: 868-71; Popovic M, Sarngadharan MG , Read E, et al. Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-I) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 1984, 224: 497-500; Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-I) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 1984, 224: 500-3). It can be transmitted through sexual contact, exposure to infected blood or blood products, or from an infected mother to the fetus. (Curran JW, Jaffe HW, Hardy AM, et al. Epidemiology of HIV infection and AIDS in the United States. Science 1988, 239: 610-16). Acute HIV syndrome, characterized by flu-like symptoms, develops 3 to 5 weeks after initial infection and is associated with high levels of viremia. (Daar ES, Moudgil T, Meyer RD, Ho DD. Transient high levels of viremia in patients with primary human immunodeficiency virus type 1 infection. New Engl J Med 1991,324: 961-4; Clark SJ, Saag MS, Decker WD. High titers of cytopathic virus in plasma of patients with symptomatic primary HIV-1 infection. New Engl J Med 1991, 324: 954-60). 4 to 6 weeks after symptoms appear, the specific immune response against HIV can be detected. (Albert J, Abrahamsson B, Nagy K, et al. Rapid development of isolate-specific neutralizing antibodies after primary HIV-1 infection and consequent emergence of virus variants which resist neutralization by autologous sera. AIDS 1990, 4: 107-12; Horsburgh CR Jr, Ou CY, Jason J, et al. Duration of human immunodeficiency virus infection before detection of antibody. Lancet 1989, 334: 637-40). After seroconversion, the viral load in the peripheral blood decreases and most patients enter an asymptomatic phase that can last for several years. (Pantaleo G, Graziosi C, Fauci AS. New concepts in the immunopathogenesis of human immunodeficiency virus (HIV) infection. New Engl J Med 1993, 328: 327-35). Quantitative measurement of HIV levels in peripheral blood has greatly contributed to the understanding of the pathogenesis of HIV infection (Ho DD, Neumann AU, Perelson AS, et al. Rapid turnover of plasma virions and c D4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature 1995 , 373: 123-6; Wei X, Ghosh SK, Taylor ME, et al. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection. Nature 1995, 373: 117-22) and has been shown to be an essential parameter in prognosis and management of HIV infected individuals. (Mellors JW, Rinaldo CR JR, Gupta P, et al. Prognosis in HIV-1 infection predicted by the quantity of virus in plasma. Science 1996, 272: 1167-70; Mellors JW, Munoz A, Giorgi JV, et al. Plasma viral load and C d 4+ lymphocytes as prognostic markers of HIV-1 infection. Ann Intern Med 1997, 126 (12): 946-54; Chene G, Sterne JA, May M, et al. Prognostic importance of initial response in HIV-1 infected patients starting potent antiretroviral therapy: analysis of prospective studies. Lancet 2003, 362: 679-86; Egger M, May M, Chene G, et al. Prognosis of HIV-1 infected drug patients starting highly active antiretroviral therapy: a collaborative analysis of prospective studies. Lancet 2002, 360: 119-29; Wood E, Hogg RS, Yip B, et al. Higher baseline levels of plasma human immunodeficiency virus type 1 RNA are associated with increased mortality after initiation of triple-drug antiretroviral therapy. J Infect Dis 2003, 188: 1421-5; United States Department of Health and Human Services. 200 4 Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and adolescents. Available online at: AIDSinfo.nih.gov/guidelines). Decisions regarding the initiation or changes of antiretroviral therapy are determined by monitoring plasma levels of HIV RNA (viral load), CD4 + T lymphocyte count, and the patient's clinical status. (US Department of Health and Human Services. 2004 Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1 Infected Adults and Adolescents. Available on the Internet at: AIDSinfo.nih.gov/guidelines; Yeni PG, Hammer SM, Hirsch MS, et al. Treatment for Adult HIV Infection. 2004 Recommendations of the International AIDS Society-USA Panel. JAMA 2004, 292: 251-65). The goal of antiretroviral treatment is to reduce the HIV virus in plasma to levels below the detectable level of available viral load tests. (US Department of Health and Human Services. 2004 Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1 Infected Adults and Adolescents. Available online at: AIDSinfo.nih.gov/guidelines; AS, Essunger P, Cao Y, et al. Decay characteristics of HIV-1 infected compartments during combination therapy. Nature 1997, 387 (6629): 188-91). HIV RNA levels in plasma can be quantitated by prior art procedures by nucleic acid amplification or signal amplification technologies. (Mulder J, McKinney N, Christopher C, et al. Rapid and simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: application to acute retroviral infection. J Clin Microbiol 1994, 32: 292-300; Dewar RL, Highbarger HC, Sarmiento MD, et al. Application of branched DNA signal amplification to monitor human immunodeficiency virus type 1 burden in human plasma. J Inf Diseases 1994, 170: 1172-9; Van Gemen B, Kievits T, Schukkink R, et al Quantification of HIV-1 RNA in plasma using NASBA ™ during HIV-1 primary infection. J Virol Methods 1993, 43: 177-87).

Sumario de la invenciónSummary of the invention

La medición cuantitativa de los niveles de VIH-1 en la sangre periférica es un parámetro esencial para determinar el pronóstico de la enfermedad y el ciclo del tratamiento antirretroviral para los pacientes infectados. Debido a la estabilidad limitada del ARN viral, las pruebas convencionales de carga viral (CV) del VIH-1 en plasma imponen requisitos restrictivos para la recogida, manipulación y transporte de muestras, lo cual puede dificultar la expansión de las pruebas de CV en entornos de recursos limitados. Las gotas secas (GS), incluyendo las gotas de sangre seca (GSS), representan una opción factible que supera estas limitaciones logísticas y técnicas. Otras GS además de las GSS pueden ser de, por ejemplo, plasma, saliva, suero, etc. Esta invención proporciona métodos y procedimientos novedosos y no obvios de un ensayo nuevo de la CV del VIH-1 en GS/GSS.Quantitative measurement of HIV-1 levels in peripheral blood is an essential parameter to determine the prognosis of the disease and the course of antiretroviral treatment for infected patients. Due to the limited stability of viral RNA, conventional plasma HIV-1 viral load (VC) tests impose restrictive requirements for specimen collection, handling, and transport, which can make it difficult to expand VC testing in environments limited resources. Dry drops (GS), including dried blood drops (GSS), represent a feasible option that overcomes these logistical and technical limitations. Other GSs in addition to GSS can be from, for example, plasma, saliva, serum, etc. This invention provides novel and non-obvious methods and procedures of a novel HIV-1 CV assay in GS / GSS.

El desarrollo de ensayos de GSS para la cuantificación del ARN del VIH-1 y del ADN proviral (un genoma viral, o parte del mismo, que se incorpora en el ADN de una célula hospedadora) se encuentra en sus inicios. Los ensayos desarrollados en la técnica hasta ahora tienen muchas desventajas relacionadas con el costo y la eficiencia. Por ejemplo, muchos de los procedimientos actuales requieren la transferencia manual de eluatos de GS o GSS para los procedimientos de extracción del ácido nucleico, lo cual representa una oportunidad para que ocurra un error o contaminación en el ensayo. Si se desea o requiere un tratamiento con ADNasa en los ensayos de la técnica anterior, los procedimientos a menudo implican el uso de reactivos adicionales (tampones de reacción específicos de ADNasa y tampones de desactivación), equipo (dispositivos de calentamiento), tiempo (para que se completen las etapas del procedimiento de la ADNasa) y manipulación manual adicional.The development of GSS assays for the quantification of HIV-1 RNA and proviral DNA (a viral genome, or part thereof, that is incorporated into the DNA of a host cell) is in its infancy. The tests developed in the art so far have many disadvantages related to cost and efficiency. For example, many of the current procedures require manual transfer of GS or GSS eluates for nucleic acid extraction procedures, which presents an opportunity for assay error or contamination. If DNase treatment is desired or required in prior art assays, procedures often involve the use of additional reagents (DNase-specific reaction buffers and inactivation buffers), equipment (heating devices), time (for complete the DNase procedure steps) and additional manual manipulation.

El procedimiento de la presente invención reduce y elimina estas desventajas de la técnica anterior. El ensayo de CV del VIH-1 en GS/GSS de la presente invención utiliza un flujo de trabajo novedoso y un sistema de tampones de elución/reacción innovador. Estas mejoras en comparación con la técnica anterior tienen como resultado un ensayo que puede ser casi completamente automatizado con una precisión y eficiencia mayores, en comparación con la técnica anterior. Además, estas mejoras en comparación con la técnica anterior permiten el uso de ADNasa sin el tiempo añadido y la incomodidad inherente a los procedimientos de la técnica anterior donde se utiliza ADNasa. La presente invención contempla un método automatizado para detectar ácidos nucleicos del VIH-1 en una muestra de sangre, comprendiendo el método: a) proporcionar: i) una muestra de sangre que se sospecha infectada con VIH secada en un soporte sólido, ii) un tampón de elución, iii) un instrumento de preparación de las muestras automatizado, programable, iv) un instrumento de PCR automatizado, programable, v) ADNasa y vi) reactivos de PCR adecuados para la detección de ácidos nucleicos del VIH-1; b) eluir la muestra de sangre del soporte sólido con el tampón de elución para crear una muestra eluida; c) cargar automáticamente la muestra eluida en el instrumento de preparación de las muestras automatizado, programable para la extracción y purificación posterior de ácidos nucleicos para crear una muestra procesada; d) cargar los reactivos de PCR en el instrumento de PCR automatizado, programable; e) iniciar un programa automatizado para dispensar alícuotas de los reactivos de PCR en la muestra procesada; f) llevar a cabo la PCR en los ácidos nucleicos extraídos en la muestra procesada con el instrumento de PCR automatizado, programable; g) analizar los resultados de la PCR generados por el instrumento de PCR automatizado, programable para determinar si alguna muestra comprende ácidos nucleicos del VIH-1; h) en donde, dicho tampón de elución comprende aproximadamente GITC 3,5 M, aproximadamente Tween® 20 5 % (nombre comercial del polisorbato 20; también denominado monolaurato de polioxietilen (20) sorbitano), aproximadamente KOAc (acetato de potasio) 50 mM a aproximadamente pH 6,0; i) en donde, opcionalmente, la ADNasa se añade a una o más de las muestras procesadas, los reactivos de PCR, o la reacción de PCR completa después de la adición de los reactivos de PCR a la muestra procesada.The process of the present invention reduces and eliminates these disadvantages of the prior art. The HIV-1 CV assay in GS / GSS of the present invention utilizes a novel workflow and an innovative reaction / elution buffer system. These improvements compared to the prior art result in an assay that can be almost completely automated with greater precision and efficiency, compared to the prior art. Furthermore, these improvements compared to the prior art allow the use of DNase without the added time and inconvenience inherent in prior art procedures where DNase is used. The present invention contemplates an automated method for detecting HIV-1 nucleic acids in a blood sample, the method comprising: a) providing: i) a blood sample suspected of being infected with HIV dried on a solid support, ii) a elution buffer, iii) a programmable, automated sample preparation instrument, iv) a programmable, automated PCR instrument, v) DNase and vi) PCR reagents suitable for the detection of HIV-1 nucleic acids; b) eluting the blood sample from the solid support with the elution buffer to create an eluted sample; c) automatically loading the eluted sample into the automated, programmable sample preparation instrument for subsequent extraction and purification of nucleic acids to create a processed sample; d) loading the PCR reagents into the automated, programmable PCR instrument; e) initiating an automated program to dispense aliquots of the PCR reagents into the processed sample; f) carrying out the PCR on the nucleic acids extracted in the sample processed with the automated, programmable PCR instrument; g) analyzing the PCR results generated by the automated, programmable PCR instrument to determine if any sample comprises HIV-1 nucleic acids; h) wherein, said elution buffer comprises approximately 3.5 M GITC, approximately 5% Tween® 20 (trade name of polysorbate 20; also called polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate), approximately 50 mM KOAc (potassium acetate) at about pH 6.0; i) wherein, optionally, DNase is added to one or more of the processed samples, the PCR reagents, or the entire PCR reaction after the addition of the PCR reagents to the processed sample.

La invención además contempla que el método adicionalmente incluya controles negativos y positivos.The invention further contemplates that the method additionally includes negative and positive controls.

La invención además contempla que la etapa b) sea de alrededor de 20 minutos a temperatura ambiente con mezclado intermitente suave o a 55 grados C durante 30 minutos con mezclado intermitente suave.The invention further contemplates that step b) is for about 20 minutes at room temperature with light intermittent mixing or at 55 degrees C for 30 minutes with light intermittent mixing.

La invención además contempla que el procedimiento automatizado se programe mediante comandos de software. La invención además contempla que la etapa i) se lleve a cabo y que dicha ADNasa no requiera tampones de reacción específicos de ADNasa, sea efectiva a temperatura ambiente o a las temperaturas utilizadas durante las etapas cíclicas de la PCR, degrade eficazmente el ADN en el periodo de tiempo de 30 minutos, no necesite inactivarse después de degradar eficazmente el ADN y no impacte negativamente en la detección de secuencias de ARN.The invention further contemplates that the automated procedure is programmed through software commands. The invention also contemplates that step i) is carried out and that said DNase does not require specific DNase reaction buffers, is effective at room temperature or at the temperatures used during the cyclic stages of PCR, effectively degrades DNA in the period 30 minute time period, does not need to be inactivated after effectively degrading DNA, and does not negatively impact RNA sequence detection.

La invención además contempla que el soporte sólido sea papel de filtro.The invention further contemplates that the solid support is filter paper.

La invención además contempla que el ácido nucleico sea ARN.The invention further contemplates that the nucleic acid is RNA.

La invención además contempla que el ácido nucleico sea ADN proviral.The invention further contemplates that the nucleic acid is proviral DNA.

Breve descripción de las figurasBrief description of the figures

La Figura 1 muestra ADNasa (Ambion DNase 1 (libre de ARNasa) (N.° Cat. AM2222) o equivalente) que elimina ADN de manera efectiva y no impacta negativamente en las señales de ARN. La ADNasa se utilizó para tratar directamente ácidos nucleicos extraídos antes de llevar a cabo una reacción de PCR.Figure 1 shows DNase (Ambion DNase 1 (RNase-free) (Cat. # AM2222) or equivalent) that removes DNA effectively and does not negatively impact RNA signals. DNase was used to directly treat extracted nucleic acids before carrying out a PCR reaction.

La Figura 2 muestra ADNasa (New England Biolabs Dnase I (libre de ARNasa) (N.° Cat. MO303S) o equivalente) que no elimina ADN de manera efectiva y no impacta negativamente en las señales de ARN. La ADNasa se utilizó para tratar directamente ácidos nucleicos extraídos antes de llevar a cabo una reacción de PCR.Figure 2 shows DNase (New England Biolabs Dnase I (RNase-free) (Cat # MO303S) or equivalent) that does not remove DNA effectively and does not negatively impact RNA signals. DNase is used to directly treat extracted nucleic acids before carrying out a PCR reaction.

La Figura 3 muestra ADNasa (Sigma Aldrich DNase 1 (calidad amplificación) (N.° Cat. AMPD1) o equivalente) que elimina ADN de manera efectiva e impacta negativamente en las señales de ARN. La ADNasa se utilizó para tratar directamente ácidos nucleicos extraídos antes de llevar a cabo una reacción de PCR.Figure 3 shows DNase (Sigma Aldrich DNase 1 (amplification grade) (Cat. # AMPD1) or equivalent) that removes DNA effectively and negatively impacts RNA signals. DNase was used to directly treat extracted nucleic acids before carrying out a PCR reaction.

La Figura 4 muestra ADNasa (Promega RQ1 RNase-Free DNase) (N.° Cat. M6101) o equivalente) que elimina ADN de manera efectiva y no impacta negativamente en las señales de ARN. La ADNasa se utilizó para tratar directamente ácidos nucleicos extraídos antes de llevar a cabo una reacción de PCR.Figure 4 shows DNase (Promega RQ1 RNase-Free DNase) (Cat. # M6101) or equivalent) that removes DNA effectively and does not negatively impact RNA signals. DNase was used to directly treat extracted nucleic acids before carrying out a PCR reaction.

La Figura 5 muestra una comparación de las condiciones de elución de las GSS de 55 °C durante 30 minutos frente a temperatura ambiente durante 20 minutos a 1000 copias/ml del VIH-1. Se utilizaron setenta y un replicados por condición. El umbral de ciclo (Ct) a 55 °C durante 30 min fue anterior al Ct a temperatura ambiente durante 20 minutos. La relación máxima (MR; una medición de la fuerza de la señal) a 55 °C durante 30 minutos fue mayor que la MR a temperatura ambiente durante 20 minutos.Figure 5 shows a comparison of GSS elution conditions of 55 ° C for 30 minutes versus room temperature for 20 minutes at 1000 copies / ml HIV-1. Seventy-one replicates were used per condition. Cycle threshold (Ct) at 55 ° C for 30 min was earlier than Ct at room temperature for 20 min. The maximum ratio (MR; a measurement of signal strength) at 55 ° C for 30 minutes was greater than the MR at room temperature for 20 minutes.

La figura 6 muestra la elución de la GSS a temperaturas que van de 52 a 65 °C de 25 a 45 minutos. Mientras que los valores de Ct fueron comparables en todas las condiciones, la condición con el valor de MR más alto fue 55 °C durante 30 minutos.Figure 6 shows the elution of GSS at temperatures ranging from 52 to 65 ° C for 25 to 45 minutes. While the Ct values were comparable in all conditions, the condition with the highest MR value was 55 ° C for 30 minutes.

La Figura 7 muestra la elución de la GSS a 55 °C durante 10, 20 y 30 minutos. Al aumentar el tiempo de elución, se observó una tendencia a mejorar el Ct y aumentar la MR aunque las diferencias entre cada punto temporal no fueron significativas. Después de la incubación a 55 °C durante 30 minutos, una incubación extra a temperatura ambiente hasta 24 horas no afectó a los resultados de la PCR.Figure 7 shows the elution of GSS at 55 ° C for 10, 20 and 30 minutes. As the elution time increased, a tendency to improve Ct and increase MR was observed, although the differences between each time point were not significant. After incubation at 55 ° C for 30 minutes, an extra incubation at room temperature up to 24 hours did not affect the PCR results.

Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

Hasta la fecha, las pruebas en muestras de plasma es el método de referencia para la evaluación de la carga viral (CV) en individuos infectados con VIH en el tratamiento antirretroviral (TAR). En escenarios con recursos limitados, el uso de gotas de sangre seca (GSS) es un tipo prometedor de tipos de muestra alternativa para las pruebas de CV y genotipificación. El método de la GSS junto con un procesamiento de las muestras automatizado y sistemas basados en PCR en tiempo real, permitirían realizar una medición de la CV o la genotipificación en laboratorios centrales.To date, testing of plasma samples is the gold standard for assessing viral load (CV) in HIV-infected individuals on antiretroviral therapy (ART). In resource-limited settings, the use of dried blood spots (GSS) is a promising type of alternative sample type for CV testing and genotyping. The GSS method, together with automated sample processing and real-time PCR-based systems, would allow for CV measurement or genotyping in central laboratories.

Para adaptar los ensayos de carga viral del VIH a la GSS, los aspectos técnicos más importantes son la sensibilidad y la especificidad del ensayo. La sensibilidad clínica y la especificidad del ensayo de la carga viral de GSS se definen mediante el uso de un umbral de 1000 copias/ml en las directrices de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de 2013 para el tratamiento antirretroviral. La proporción de pacientes con CV en plasma <1000 copias/ml durante 12 meses o más después del inicio del TAR es un resultado clave como parte de las evaluaciones de resistencia a los fármacos adquirida. Los pacientes con CV por debajo de este nivel se categorizan como pacientes con éxito del tratamiento farmacológico (Parkin, 2014 AIDS Rev.)To tailor HIV viral load assays to GSS, the most important technical aspects are the sensitivity and specificity of the assay. The clinical sensitivity and specificity of the GSS viral load assay is defined by using a threshold of 1000 copies / ml in the 2013 World Health Organization (WHO) guidelines for antiretroviral therapy. The proportion of patients with plasma VLs <1000 copies / ml for 12 months or more after ART initiation is a key finding as part of acquired drug resistance assessments. Patients with CV below this level are categorized as successful drug treatment patients (Parkin, 2014 AIDS Rev.)

La especificidad del ensayo se refiere al aislamiento/amplificación del ARN libre de células frente al ADN o ARN asociado a células. Si un ensayo recoge tanto el ARN libre de células como el ADN o ARN asociado a células, se observará una sobrecuantificación significativa a concentraciones bajas de CV en plasma, ya que el ADN celular es la fuente predominante de ácido nucleico derivado de virus no plasmático en gotas de sangre seca. (Parkin, 2014 AIDS Rev.). El sistema Abbott RealTime HIV-1 m2000 incorpora reactivos y métodos que son específicos o al menos selectivos para el ARN (Parkin, 2014 AIDS Rev.). También se ha descrito una correlación aceptable entre las cargas virales en plasma y las muestras de GSS usando el ensayo Abbott RealTime HIV-1 (Marconi, A., et al., 2009 Clin Microbiol Infect; Arredondo et al., 2012 J Clin Micro).The specificity of the assay refers to the isolation / amplification of cell-free RNA from cell-associated DNA or RNA. If an assay collects both cell-free RNA and cell-associated DNA or RNA, significant overquantification will be observed at low plasma CV concentrations, as cellular DNA is the predominant source of non-plasmatic virus-derived nucleic acid in drops of dried blood. (Parkin, 2014 AIDS Rev.). The Abbott RealTime HIV-1 m2000 System incorporates reagents and methods that are specific or at least selective for RNA (Parkin, 2014 AIDS Rev.). An acceptable correlation between viral loads in plasma and GSS samples has also been described using the Abbott RealTime HIV-1 assay (Marconi, A., et al., 2009 Clin Microbiol Infect; Arredondo et al., 2012 J Clin Micro ).

La sensibilidad del ensayo se representa normalmente mediante el límite de detección (LOD) del ensayo. La principal dificultad en cuanto a la sensibilidad de la GSS es que las limitaciones de volumen restringen los números de copias de entrada (revisado por Nell T. Parkin, 2014). Se desarrolló una versión modificada del ensayo Abbott RealTime HIV-1 DBS (ensayo Abbott RealTime HIV-1 DBS en modo abierto), el cual implica el uso de una muestra de GSS perforada de 70 pl que no requiere escisión. Además, no se requiere transferencia de la muestra entre tubos. Una GSS se eluye en 1300 pl de tampón, usándose 1000 pl como entrada para el procesamiento. Por lo tanto, la cantidad real de sangre completa que se transfiere para la extracción es de aproximadamente 53,8 pl. Una tasa de recuperación de la elución de la GSS determinada experimentalmente (en comparación con el plasma) utilizando la condición de elución a temperatura ambiente actual (indicada en el protocolo en modo abierto de GSS inicial) variaba del 24 % al 43 % (en comparación con el plasma), con un promedio del 35 %, lo que conduce a un intervalo del LOD calculado de 1080 copias/ml a 1934 copias/ml. (En estos experimentos, tanto la sangre completa como el plasma se enriquecieron con la misma concentración del VIH; no se incluyó el efecto del hematocrito). Dado que el umbral propuesto por la OMS para la determinación con éxito de un tratamiento TAR es una CV de < 1000 copias/ml (Consideraciones técnicas y operativas para implementación de las pruebas de carga viral del VIH 2014), el ensayo de CV del VIH de GSS tiene que tener un límite de detección (LOD) < 1000 copias/ml. Para lograr esta sensibilidad utilizando una GSS de 70 pl, la eficiencia de elución de la GSS necesita ser mejorada en un 10 % o más para disminuir el LOD a menos de 1000 copias/ml.The sensitivity of the assay is typically represented by the assay's limit of detection (LOD). The main difficulty regarding the sensitivity of the GSS is that volume limitations restrict input copy numbers (reviewed by Nell T. Parkin, 2014). A modified version of the Abbott RealTime HIV-1 DBS assay (Abbott RealTime HIV-1 DBS assay in open mode) was developed, which involves the use of a 70 µl perforated GSS sample that does not require cleavage. Also, no sample transfer is required between tubes. A GSS is eluted in 1300 µl of buffer, with 1000 µl being used as input for processing. Therefore, the actual amount of whole blood that is transferred for collection is approximately 53.8 µl. An experimentally determined GSS elution recovery rate (compared to plasma) using the current room temperature elution condition (indicated in the initial GSS open mode protocol) ranged from 24% to 43% (compared with plasma), averaging 35%, leading to a calculated LOD range of 1080 copies / ml to 1934 copies / ml. (In these experiments, both whole blood and plasma were spiked with the same concentration of HIV; the effect of hematocrit was not included.) Given that the threshold proposed by the WHO for the successful determination of an ART treatment is a CV of <1000 copies / ml (Technical and operational considerations for the implementation of HIV viral load tests 2014), the HIV CV test GSS must have a limit of detection (LOD) <1000 copies / ml. To achieve this Sensitivity Using a GSS of 70 µl, the elution efficiency of the GSS needs to be improved by 10 % or more to lower the LOD to less than 1000 copies / ml.

El ensayo de CV del VIH-1 de GS/GSS de la presente invención se diseñó para llevarse a cabo en un aparato automatizado que pueda programarse para los parámetros de extracción de ácidos nucleicos y amplificación de la presente invención. Los instrumentos Abbott RealTime m2000sp y m2000rt (dispositivo; Abbott Molecular, Abbott Park, IL) son ejemplos de dispositivos automatizados y programables adecuados para el ensayo de CV del VIH-1 de GSS de la presente invención. Los parámetros/instrucciones de operación de los instrumentos Abbott Realtime m2000sp y m2000rt (e instrumentos adecuados disponibles en otras fuentes) son conocidas por un experto con conocimientos normales en la técnica. La presente invención no está limitada al uso de este dispositivo y otros dispositivos similares eran conocidos por un experto con conocimientos normales en la técnica en el momento de esta invención. El ensayo del VIH-1 de la presente invención utiliza preferentemente la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con detección homogénea de fluorescencia en tiempo real. Un diseño de sonda fluorescente de doble cadena parcial permite la detección de diversas variantes del VIH-1, incluyendo los grupos M, O y N. El ensayo puede estandarizarse contra un patrón viral del Laboratorio de Garantía de la Calidad en Virología (VQA) del AIDS Clinical Trial Group u otro patrón (Yen-Lieberman B, Brambilla D, Jackson B, et al. Evaluation of a quality assurance program for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma by the AIDS clinical trials group virology laboratories, J Clin Microbiol, 1996, 34:2695-701), y contra los patrones internacionales de la Organización Mundial de la Salud para el ARN del VIH-1 (NIBSC; Holmes H, Davis C, Heath A, et al. An international collaborative study to establish the 1st international standard for HIV-1 RNA for use in nucleic acidbased techniques, J Virol Methods, 2001, 92:141-50; Davis C, Heath A, Best S, et al. Calibration of HIV-1 working reagents for nucleic acid amplification techniques against the 1st international standard for HIV-1 RNA, J Virol Meth, 2003, 107:37-44). Los resultados del ensayo se expresan en copias/ml, Log de copias/ml, Unidades internacionales/ml (UI/ml) o Log UI/ml.The GS / GSS HIV-1 CV assay of the present invention was designed to be performed on an automated apparatus that can be programmed for the nucleic acid extraction and amplification parameters of the present invention. The Abbott RealTime m2000sp and m2000rt instruments (device; Abbott Molecular, Abbott Park, IL) are examples of automated and programmable devices suitable for the GSS HIV-1 CV assay of the present invention. The parameters / operating instructions for the Abbott Realtime m2000sp and m2000rt instruments (and suitable instruments available from other sources) are known to one of ordinary skill in the art. The present invention is not limited to the use of this device and other similar devices were known to one of ordinary skill in the art at the time of this invention. The HIV-1 assay of the present invention preferably uses polymerase chain reaction (PCR) technology with homogeneous real-time fluorescence detection. A partial double-stranded fluorescent probe design allows detection of various HIV-1 variants, including groups M, O, and N. The assay can be standardized against a viral standard from the Virology Quality Assurance Laboratory (VQA) of the AIDS Clinical Trial Group or other pattern (Yen-Lieberman B, Brambilla D, Jackson B, et al. Evaluation of a quality assurance program for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma by the AIDS clinical trials group virology laboratories, J Clin Microbiol, 1996, 34: 2695-701), and against the international standards of the World Health Organization for HIV-1 RNA (NIBSC; Holmes H, Davis C, Heath A, et al. An international collaborative study to establish the 1st international standard for HIV-1 RNA for use in nucleic acid-based techniques, J Virol Methods, 2001, 92: 141-50; Davis C, Heath A, Best S, et al. Calibration of HIV-1 working reagents for nucleic acid amplification techniques against the 1st in ternational standard for HIV-1 RNA, J Virol Meth, 2003, 107: 37-44). Assay results are expressed in copies / ml, Log copies / ml, International Units / ml (IU / ml) or Log IU / ml.

Como se indica en el WHO Early Infant Diagnosis of HIV - Global HIV Web Study (depts.washington.edu/ghivaids/reslimited/case7/discussion.html), las pruebas en gota de sangre seca es un medio aceptable para recoger muestras para el análisis y representa un riesgo biológico menor que las muestras líquidas. Además, los artículos revisados por expertos han mostrado que el uso de muestras de GSS es factible cuando se comparan con las muestras de plasma en cuanto a sensibilidad y confianza (J. Clin Microbiol, 2011, 50(3):569-572). La eficacia, eficiencia y exactitud de la preparación de la muestra automatizada y los sistemas de análisis, tales como el Abbott Sample Preparation System (m2000sp) y el analizador Abbott Real-Time PCR (m2000rt) se han confirmado en artículos de revistas revisadas por expertos (Marconi, et al., Evaluation of the Abbott Real-Time HIV-1 quantitative assay with dried blood spot specimens, Clin. Microbiol. Infect, 2009, 15:93-97). Además, se han publicado comparaciones de varios artículos para la recogida de GSS (Rottinghaus, et al., J. Clin. Microbiol., 2012, 51(1):55-60).As stated in the WHO Early Infant Diagnosis of HIV - Global HIV Web Study (depts.washington.edu/ghivaids/reslimited/case7/discussion.html), dried blood drop testing is an acceptable means of collecting specimens for testing. analysis and represents a lower biohazard than liquid samples. Additionally, peer-reviewed articles have shown that the use of GSS samples is feasible when compared to plasma samples for sensitivity and confidence (J. Clin Microbiol, 2011, 50 (3): 569-572). The effectiveness, efficiency and accuracy of automated sample preparation and analysis systems, such as the Abbott Sample Preparation System (m2000sp) and the Abbott Real-Time PCR Analyzer ( m2000rt) have been confirmed in peer-reviewed journal articles. (Marconi, et al., Evaluation of the Abbott Real-Time HIV-1 quantitative assay with dried blood spot specimens, Clin. Microbiol. Infect, 2009, 15: 93-97). In addition, comparisons of several articles have been published for the collection of GSS (Rottinghaus, et al., J. Clin. Microbiol., 2012, 51 (1): 55-60).

Aunque una gran cantidad de trabajos han investigado el uso de la GSS en preparaciones automatizadas y sistemas de ensayo, aún se necesitan mejoras en el flujo de trabajo y la química de reactivos para proporcionar una mayor capacidad de utilización y una mayor sensibilidad. La presente invención proporciona una mayor eficiencia, flujo de trabajo y rendimiento respecto a los procedimientos de ensayo de CV del VIH-1 de GSS de la técnica anterior que utilizan sistemas automatizados.Although a large body of work has investigated the use of GSS in automated preparations and assay systems, improvements in workflow and reagent chemistry are still needed to provide greater usability and sensitivity. The present invention provides greater efficiency, workflow, and throughput over prior art GSS HIV-1 CV assay procedures using automated systems.

Ventajas de la recogida de muestras de GSSAdvantages of GSS Sample Collection

Las ventajas de la recogida de GSS respecto a las muestras de sangre líquida son numerosas. Las GSS son fáciles de recoger; solo se necesita una punción en el dedo o en el talón, evitando así la necesidad de venopunción. No se requieren habilidades de flebotomía. El equipo para la recogida es mínimo. Las tarjetas de muestra normalmente tienen un indicador del tamaño de la gota (diámetro) para asegurar un tamaño de muestra adecuado. Un volumen de muestra de alrededor de 70 pl es habitualmente el adecuado. Las muestras se secan al aire en condiciones ambientales. La GSS no necesita refrigeración para su almacenamiento. La GSS se puede almacenar o transportar en un recipiente cerrado (tal como Tupper Wear® o en un sobre cerrado). Las muestras son fáciles de transportar y son estables durante largos periodos de tiempo en condiciones ambientales (entre semanas y meses). Por lo tanto, las muestras pueden recogerse en sitios externos y transportarse a un centro de análisis centralizado. Debido al bajo riesgo biológico asociado con las muestras de GS/GSS, las muestras apropiadamente envasadas pueden enviarse por correo hasta el centro de análisis (Shipping Guidelines for Dried-Blood Spot Specimens, CDC, www.cdc.gov/labstandards/pdf/nsqap/Bloodspot_Transportation_Guidelines.pdf, y las referencias contenidas en el documento; Clinical Laboratory and Standards Institute. Blood collection on filter paper for newborn screening programs; Approved standard-Fifth edition. CLSI document LA4-A6. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2012). Una vez en el centro de análisis las muestras se pueden extraer usando sistemas automatizados o procedimientos manuales si se desea.The advantages of collecting GSS over liquid blood samples are numerous. GSS are easy to collect; only a finger or heel stick is needed, thus avoiding the need for venipuncture. Phlebotomy skills are not required. Equipment for collection is minimal. Sample cards usually have a droplet size (diameter) indicator to ensure an adequate sample size. A sample volume of around 70 µl is usually adequate. Samples are air dried under ambient conditions. The GSS does not need refrigeration for storage. The GSS can be stored or transported in a closed container (such as Tupper Wear® or in a sealed envelope). The samples are easy to transport and are stable for long periods of time under ambient conditions (between weeks and months). Therefore, samples can be collected off-site and transported to a centralized testing center. Due to the low biohazard associated with GS / GSS samples, properly packaged samples can be mailed to the testing center (Shipping Guidelines for Dried-Blood Spot Specimens, CDC, www.cdc.gov/labstandards/pdf/nsqap /Bloodspot_Transportation_Guidelines.pdf, and the references contained in the document; Clinical Laboratory and Standards Institute. Blood collection on filter paper for newborn screening programs; Approved standard-Fifth edition. CLSI document LA4-A6. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute ; 2012). Once at the testing center, samples can be drawn using automated systems or manual procedures if desired.

DefinicionesDefinitions

Las siguientes definiciones son relevantes para la presente divulgación: The following definitions are relevant to this disclosure:

El término "alrededor de" y "aproximadamente", a menos que se indique de otro modo, se refiere a una variación de /-10% respecto al valor indicado. Se ha de entender que una variación de este tipo está siempre incluida en cualquier valor dado proporcionado en el presente documento, se haga o no referencia específica él. Además, todos los intervalos mencionados incluyen todos los valores que se encuentran entre dicho intervalo se mencione o no realmente el valor específico. Por lo tanto, el intervalo de 1 -10 incluye, por ejemplo, los valores 2, 3,6, 9,015, etc. La expresión "reacción en cadena de la polimerasa (PCR)" se refiere a un método para producir copias de una secuencia de ADN. El método emplea ciclos térmicos (es decir, ciclos de calentamiento y enfriamiento para la desnaturalización (o fusión) y replicación del ADN, respectivamente). Los cebadores, que son fragmentos cortos de ADN que contienen secuencias complementarias a la secuencia de ADN que ha de copiarse, y una ADN polimerasa termoestable, tal como una de Thermus aquaticus, denominada Taq polimerasa, se utilizan para seleccionar la secuencia de ADN y copiarla (véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Números 4.683.195; 4.800.195, y 4.965.188). Mediante los ciclos repetidos, las copias que se han hecho, se usan como plantillas para generar más copias (es decir, una reacción en cadena). Las técnicas de PCR incluyen, pero sin limitación, PCR estándar, PCR específica de alelo, PCR de ensamblaje, PCR asimétrica, PCR digital, PCR de arranque en caliente, PCR específica de intersecuencia, PCR inversa, PCR mediada por ligamiento, PCR específica de metilación, PCR de minicebador, PCR anidada, PCR de extensión superpuesta, PCR en tiempo real, PCR de transcripción inversa, PCR en fase sólida, PCR térmica de entrelazado asimétrico y PCR con rampa descendente de temperaturas.The term "about" and "about", unless otherwise indicated, refers to a variation of / -10% from the indicated value. It is to be understood that such a variation is always included in any given value provided herein, whether or not there is specific reference to it. Furthermore, all the mentioned ranges include all the values that fall between that range whether or not the specific value is actually mentioned. Therefore, the range 1-10 includes, for example, the values 2, 3.6, 9,015, and so on. The term "polymerase chain reaction (PCR)" refers to a method of producing copies of a DNA sequence. The method employs thermal cycling (that is, heating and cooling cycles for denaturation (or melting) and DNA replication, respectively). The primers, which are short DNA fragments that contain sequences complementary to the DNA sequence to be copied, and a thermostable DNA polymerase, such as one from Thermus aquaticus, called Taq polymerase, are used to select the DNA sequence and copy it. (See, for example, US Patent Numbers 4,683,195; 4,800,195, and 4,965,188). Through repeated cycles, the copies that have been made are used as templates to generate more copies (ie a chain reaction). PCR techniques include, but are not limited to, standard PCR, allele-specific PCR, assembly PCR, asymmetric PCR, digital PCR, hot-start PCR, intersection-specific PCR, reverse PCR, ligation-mediated PCR, methylation, miniprimer PCR, nested PCR, overlapping extension PCR, real-time PCR, reverse transcription PCR, solid phase PCR, asymmetric interleaving thermal PCR, and temperature ramping down PCR.

La expresión reacción en cadena de la polimerasa de transcripción reversa (RT-PCR) se refiere a un método de detección cualitativa de la expresión de un gen mediante la creación de transcritos de ADN complementarios (ADNc) a partir de ARN.The term "reverse transcription polymerase chain reaction" (RT-PCR) refers to a method of qualitative detection of the expression of a gene by creating complementary DNA transcripts (cDNA) from RNA.

La expresión "reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real", "PCR en tiempo real" y "PCR cualitativa (qPCR)" se refiere a un método de medición cuantitativa que mide la amplificación del ADN utilizando sondas fluorescentes. El término "cebador", tal como se usa en el presente documento se refiere a un oligonucleótido que inicia la síntesis de ácido nucleico dependiente de la plantilla. En presencia de una plantilla de ácido nucleico, precursores de nucleósido trifosfato, una polimerasa y cofactores, en condiciones adecuadas de temperatura y pH, el cebador puede extenderse en su extremo 3' mediante la adición de nucleótidos por la polimerasa para dar lugar a un producto de extensión del cebador. El cebador puede variar en longitud dependiendo de las condiciones particulares empleadas y del propósito de la amplificación. Por ejemplo, un cebador para la amplificación para un propósito de diagnóstico tiene normalmente alrededor de entre 15 y alrededor de 35 nucleótidos de longitud. El cebador debe ser suficientemente complementario con la plantilla deseada para iniciar la síntesis del producto de extensión deseado. En otras palabras, el cebador debe ser capaz de hibridar suficientemente con la hebra de la plantilla deseada para proporcionar el resto 3' hidroxilo del cebador en yuxtaposición apropiada para su uso en la iniciación de la síntesis mediante una polimerasa. No es necesario que el cebador sea un complemento exacto de la plantilla deseada. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos no complementaria puede estar presente en el extremo 5' de otro cebador que es complementario. Como alternativa, las bases no complementarias pueden estar dispersas en el cebador de oligonucleótido, siempre que la secuencia del cebador tenga una complementariedad suficiente con la secuencia de la hebra de la plantilla deseada para proporcionar un complejo plantilla-cebador para la síntesis del producto de extensión.The terms "real-time polymerase chain reaction", "real-time PCR" and "qualitative PCR (qPCR)" refer to a quantitative measurement method that measures DNA amplification using fluorescent probes. The term "primer" as used herein refers to an oligonucleotide that initiates template-dependent nucleic acid synthesis. In the presence of a nucleic acid template, nucleoside triphosphate precursors, a polymerase and cofactors, under suitable conditions of temperature and pH, the primer can be extended at its 3 'end by the addition of nucleotides by the polymerase to give rise to a product primer extension. The primer can vary in length depending on the particular conditions employed and the purpose of the amplification. For example, a primer for amplification for diagnostic purposes is typically about 15 to about 35 nucleotides in length. The primer must be sufficiently complementary to the desired template to initiate the synthesis of the desired extension product. In other words, the primer must be capable of sufficiently hybridizing to the desired template strand to provide the 3 'hydroxyl moiety of the primer in appropriate juxtaposition for use in initiating synthesis by a polymerase. The primer need not be an exact complement to the desired template. For example, a non-complementary nucleotide sequence may be present at the 5 'end of another primer that is complementary. Alternatively, the non-complementary bases may be dispersed in the oligonucleotide primer, provided that the primer sequence has sufficient complementarity to the desired template strand sequence to provide a template-primer complex for the synthesis of the extension product. .

PCRPCR

Las secuencias diana se amplifican con técnicas conocidas en la técnica. La técnica de elección es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La amplificación por PCR se puede realizar mediante técnicas de PCR estándar, siguiendo las instrucciones del fabricante. El sistema Abbott m2000 comprende dispositivos que automatizan la preparación de las muestras y las reacciones de PCR basadas en la entrada del usuario.The target sequences are amplified with techniques known in the art. The technique of choice is the polymerase chain reaction (PCR). PCR amplification can be performed using standard PCR techniques, following the manufacturer's instructions. The Abbott m2000 system comprises devices that automate sample preparation and PCR reactions based on user input.

La reacción de amplificación puede comprender, y preferentemente comprende, un ácido nucleico de control interno (CI) y un par de cebadores para amplificar el ácido nucleico de CI. Cuando la reacción de amplificación comprende un ácido nucleico de CI, las condiciones que promueven la amplificación también promueven la amplificación del ácido nucleico de CI. Cualquier sustancia adecuada se puede usar como el CI. Ejemplos de secuencias diana de CI incluyen las usadas en la sección Ejemplos, a continuación.The amplification reaction may comprise, and preferably comprises, an internal control (IC) nucleic acid and a pair of primers for amplifying the IC nucleic acid. When the amplification reaction comprises a CI nucleic acid, the conditions that promote amplification also promote the amplification of the CI nucleic acid. Any suitable substance can be used as the IC. Examples of CI target sequences include those used in the Examples section, below.

Aunque cualquier muestra adecuada de un tejido o fluido corporal puede utilizarse como la fuente de la muestra de ácido nucleico, es decir, ADN o ARN, en la presente invención la muestra se eluye a partir de una GSS. Una proteinasa, tal como una proteinasa K, se puede añadir a la muestra para digerir proteínas no deseadas, si así se requiere o se desea.Although any suitable sample of a body tissue or fluid can be used as the source of the nucleic acid sample, ie, DNA or RNA, in the present invention the sample is eluted from a GSS. A proteinase, such as a proteinase K, can be added to the sample to digest unwanted proteins, if required or desired.

La muestra puede prepararse para ensayo utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Deseablemente, el método extrae y concentra ácidos nucleicos. El método también hace que la secuencia diana sea accesible para su amplificación, y elimina inhibidores potenciales de la amplificación del extracto. En la presente invención, los ácidos nucleicos se eluyen de la GSS con el tampón de elución de la presente invención. The sample can be prepared for testing using any suitable method known in the art. Desirably, the method extracts and concentrates nucleic acids. The method also makes the target sequence accessible for amplification, and removes potential inhibitors of amplification from the extract. In the present invention, nucleic acids are eluted from GSS with the elution buffer of the present invention.

Una vez que se eluye la muestra, el ARN puede aislarse, transcribirse de manera inversa y el ADNc resultante puede amplificarse (p. ej., mediante reacción en cadena de la polimerasa de transcripción reversa (RT-PCR), tal como se describe en las patentes de EE.UU. Números 5.310.652; 5.322.770; 5.561.058; 5.641.864; y 5.693.517, por ejemplo). Además, el ADN puede amplificarse directamente sin el uso de una transcriptasa reversa. El ADN pro-viral puede amplificarse de este modo.Once the sample is eluted, the RNA can be isolated, reverse transcribed, and the resulting cDNA can be amplified (eg, by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), as described in U.S. Patent Numbers 5,310,652; 5,322,770; 5,561,058; 5,641,864; and 5,693,517, for example). Furthermore, DNA can be directly amplified without the use of a reverse transcriptase. Pro-viral DNA can be amplified in this way.

El ácido nucleico diana puede ponerse en contacto con cebadores para obtener la amplificación específica de una secuencia diana, si la secuencia diana está presente en la muestra. "Amplificación específica" significa que los cebadores amplifican una secuencia diana específica y no otras secuencias. Véase, por ejemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Erlich, Editor, Freeman Press, Ny (1992)); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., Editors, Academic Press, San Diego, CA (1990)); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, 1994-1999, including supplemental updates through April 2004); and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3rd ed., 2001) así como los métodos que se describen en la Publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 93/22456 y las patentes de Estados Unidos Números 4.851.331; 5.137.806; 5.595.890; y 5.639.611.The target nucleic acid can be contacted with primers to obtain specific amplification of a target sequence, if the target sequence is present in the sample. "Specific amplification" means that the primers amplify a specific target sequence and not other sequences. See, for example, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Erlich, Editor, Freeman Press, Ny (1992)); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., Editors, Academic Press, San Diego, CA (1990)); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, 1994-1999, including supplemental updates through April 2004); and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3rd ed., 2001) as well as the methods described in International Patent Application Publication No. WO 93/22456 and US Patent Numbers 4,851,331 ; 5,137,806; 5,595,890; and 5,639,611.

Un cebador puede marcarse de forma detectable con un marcador que puede detectarse por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos, por ejemplo (véase, por ejemplo, Sambrook, et al.). Los marcadores útiles incluyen un colorante, tal como un colorante fluorescente, un marcador radiactivo, tal como 32P, un reactivo denso a los electrones, una enzima, tal como peroxidasa o fosfatasa alcalina, biotina o haptenos y proteínas para las cuales se disponen de antisueros o anticuerpos monoclonales. En la presente invención se prefieren los colorantes fluorescentes. En este sentido, se puede marcar un oligonucleótido detectable, tal como con fluoresceína. Si el cebador se marca con un colorante y el oligonucleótido detectable se marca con fluoresceína y se diseña para que se una a la hebra naciente opuesta al colorante, se puede producir la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) a lo largo de la hélice del ADN. Otros oligonucleótidos detectables incluyen una sonda molecular, una sonda TAQMAN®, una sonda de ADN monocatenario, una sonda de ADN bicatenario, y similares.A primer can be detectably labeled with a label that can be detected by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, or chemical means, for example (see, for example, Sambrook, et al.). Useful labels include a dye, such as a fluorescent dye, a radioactive label, such as 32P, an electron-dense reagent, an enzyme, such as peroxidase or alkaline phosphatase, biotin or haptens, and proteins for which antisera are available. or monoclonal antibodies. Fluorescent dyes are preferred in the present invention. In this sense, a detectable oligonucleotide can be labeled, such as with fluorescein. If the primer is labeled with a dye and the detectable oligonucleotide is labeled with fluorescein and designed to bind to the nascent strand opposite the dye, fluorescence resonance energy transfer (FRET) can occur along the length of the dye. DNA helix. Other detectable oligonucleotides include a molecular probe, a TAQMAN® probe, a single-stranded DNA probe, a double-stranded DNA probe, and the like.

Los reactivos de amplificación de ácidos nucleicos (reactivos de PCR) incluyen una enzima que tiene actividad polimerasa (p. ej., AmpliTaq Gold®), uno o más cofactores enzimáticos (p. ej., MgCh), y desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs; por ejemplo, dATP, dGTP, dCTP, y dUTP o dTTP).Nucleic acid amplification reagents (PCR reagents) include an enzyme having polymerase activity (eg, AmpliTaq Gold®), one or more enzymatic cofactors (eg, MgCh), and deoxynucleotide triphosphate (dNTPs; for example, dATP, dGTP, dCTP, and dUTP or dTTP).

Las condiciones que promueven la amplificación son aquellas que promueven la hibridación de cebadores y la extensión de las secuencias de ácido nucleico. La hibridación depende de varios parámetros, tales como temperatura, fuerza iónica, longitud de las secuencias a amplificarse, complementariedad, contenido de G:C de las secuencias a amplificar. Por ejemplo, la disminución de la temperatura promueve la hibridación de secuencias de ácidos nucleicos. Un alto contenido de G:C y una longitud mayor estabilizan la formación del dúplex. En general, los cebadores y los oligonucleótidos detectables de alrededor de 30 pb o menos y con un alto contenido de G:C funcionan bien. Las condiciones de amplificación preferidas, cebadores y oligonucleótidos detectables se ejemplifican en el presente documento.Conditions that promote amplification are those that promote primer hybridization and extension of nucleic acid sequences. Hybridization depends on several parameters, such as temperature, ionic strength, length of the sequences to be amplified, complementarity, G: C content of the sequences to be amplified. For example, lowering the temperature promotes hybridization of nucleic acid sequences. High G: C content and longer length stabilize duplex formation. In general, detectable primers and oligonucleotides of around 30 bp or less and high in G: C work well. Preferred amplification conditions, primers, and detectable oligonucleotides are exemplified herein.

La amplificación puede repetirse un número cualquiera de veces mediante ciclos térmicos de la mezcla de reacción entre alrededor de 10 y alrededor de 100 veces, tal como entre alrededor de 20 y alrededor de 75 veces, tal como entre alrededor de 25 y alrededor de 50 veces.The amplification may be repeated any number of times by thermal cycling the reaction mixture between about 10 and about 100 times, such as between about 20 and about 75 times, such as between about 25 and about 50 times. .

Una vez completadas las reacciones de amplificación, la presencia de un producto amplificado puede detectarse utilizando cualquier método adecuado. Dichos métodos incluyen, sin limitación, aquellos conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel con o sin un colorante fluorescente (dependiendo de si el producto se amplificó con un cebador marcado con colorante), un perfil de fusión con un colorante intercalente (véase, por ejemplo, PCR Technology, Principles, and Applications for DNA Amplification, Erlich, Ed., W. H. Freeman and Co., Nueva York, 1992, Chapter 7), y la hibridación con un oligonucleótido detectable interno. Otros ejemplos de métodos incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), electroquimioluminiscencia, inmunotransferencia de puntos inversa, cromatografía líquida a presión alta (HPLC) (véase, por ejemplo, Lazar, Genome Res. 4: S1-S14 (1994)), y también se puede usar el análisis de polimorfismo de conformación de cadena sencilla de productos de PCR de cadena sencilla (véase, por ejemplo, Orita, et al., PNAS USA 86: 2766-2770 (1989)). En la presente invención, los marcadores fluorescentes se detectan automáticamente con el aparato de reacción de PCR automatizado.After the amplification reactions are complete, the presence of an amplified product can be detected using any suitable method. Such methods include, without limitation, those known in the art, such as gel electrophoresis with or without a fluorescent dye (depending on whether the product was amplified with a dye-labeled primer), a fusion profile with an interheat dye (see , eg, PCR Technology, Principles, and Applications for DNA Amplification, Erlich, Ed., WH Freeman and Co., New York, 1992, Chapter 7), and hybridization with an internal detectable oligonucleotide. Other examples of methods include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), electrochemiluminescence, reverse dot blot, high pressure liquid chromatography (HPLC) (see, for example, Lazar, Genome Res. 4: S1-S14 (1994)) , and single-stranded conformation polymorphism analysis of single-stranded PCR products can also be used (see, eg, Orita, et al., PNAS USA 86: 2766-2770 (1989)). In the present invention, fluorescent markers are automatically detected with the automated PCR reaction apparatus.

Los ácidos nucleicos amplificados pueden detectarse mediante la monitorización de un aumento en la cantidad total de ADN de doble cadena (ADNdc) en la mezcla de reacción (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.994.056 y las publicaciones de patente de Estados Unidos Números 487.218 y 512.334). Se usa un colorante de unión a a Dn , tal como SYBR. El colorante fluoresce cuando se une al ADNdc y se usa la fluorescencia para determinar el aumento del ADNdc.Amplified nucleic acids can be detected by monitoring an increase in the total amount of double-stranded DNA (dsDNA) in the reaction mixture (see, for example, US Patent No. 5,994,056 and publications by U.S. Patent Numbers 487,218 and 512,334). A Dn-binding dye, such as SYBR, is used. The dye fluoresces when bound to dsDNA and fluorescence is used to determine the increase in dsDNA.

Como alternativa o preferentemente, la amplificación y detección pueden combinarse en una prueba de PCR en tiempo real. Cuando se usa la PCR en tiempo real, la mezcla puede comprender además reactivos de detección de ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen colorantes fluorescentes no específicos que se intercalan con cualquier ADN de doble cadena u oligonucleótidos detectables de ADN específico de una secuencia que permiten la detección solo después de que el oligonucleótido detectable hibride con su ADN diana complementario, permitiendo así la amplificación y detección simultáneas. Cuando un oligonucleótido detectable se encuentra presente en la mezcla durante la amplificación, el oligonucleótido detectable debe ser estable en condiciones que promuevan la amplificación, no debe interferir con la amplificación, debe unirse a su secuencia diana en condiciones de amplificación y emitir una señal solo tras la unión a su secuencia diana. Los ejemplos de oligonucleótidos detectables que son particularmente adecuados en este sentido incluyen oligonucleótidos detectables de baliza molecular, oligonucleótidos detectables TAQMAN®, y oligonucleótidos lineales detectables, tales como los descritos por Abravaya, et al. (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2005/0227257). Los oligonucleótidos detectables pueden formar una disposición de bucle y vástago en combinación con una sonda molecular. Los oligonucleótidos detectables también pueden utilizarse como oligonucleótidos detectables lineales con un fluoróforo (por ejemplo, FAM) en un extremo y un inhibidor de la fluorescencia de alta eficiencia, tal como el Black Hole Quencher (BHQ®; BioSearch Technologies, Inc., Novato, CA), en el otro extremo.Alternatively or preferably, the amplification and detection can be combined in a real-time PCR test. When using real-time PCR, the mixture may further comprise nucleic acid detection reagents. Examples include non-specific fluorescent dyes that are interspersed with any Detectable double-stranded DNA or sequence-specific DNA oligonucleotides that allow detection only after the detectable oligonucleotide hybridizes to its complementary target DNA, thus allowing simultaneous amplification and detection. When a detectable oligonucleotide is present in the mixture during amplification, the detectable oligonucleotide must be stable under conditions that promote amplification, must not interfere with amplification, must bind to its target sequence under amplification conditions, and emit a signal only after binding to its target sequence. Examples of detectable oligonucleotides that are particularly suitable in this regard include detectable molecular beacon oligonucleotides, TAQMAN® detectable oligonucleotides, and detectable linear oligonucleotides, such as those described by Abravaya, et al. (United States Patent Application Publication No. 2005/0227257). The detectable oligonucleotides can form a loop and stem arrangement in combination with a molecular probe. The detectable oligonucleotides can also be used as linear detectable oligonucleotides with a fluorophore (e.g., FAM) at one end and a high-efficiency fluorescence inhibitor, such as the Black Hole Quencher (BHQ®; BioSearch Technologies, Inc., Novato, CA), at the other end.

Los términos y expresiones, que se han empleado, se utilizan como términos de descripción y no de limitación. En este sentido, donde ciertos términos se definen, describen o analizan en el presente documento, todas estas definiciones, descripciones y discusiones están previstas a atribuirse a dichos términos. Igualmente, no hay ninguna intención en el uso de dichos términos y expresiones de excluir cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas.The terms and expressions, which have been used, are used as terms of description and not of limitation. In this sense, where certain terms are defined, described or discussed in this document, all these definitions, descriptions and discussions are intended to be attributed to those terms. Likewise, there is no intention in the use of said terms and expressions to exclude any equivalent of the characteristics shown and described or parts of them.

Se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Por lo tanto, se entenderá que, aunque la presente invención se ha divulgado específicamente en el contexto de las realizaciones preferidas y las características opcionales, los expertos en la técnica pueden recurrir a modificaciones y variaciones de los conceptos divulgados en el presente documento. Dichas modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas.It is recognized that various modifications are possible within the scope of the claimed invention. Therefore, it will be understood that while the present invention has been specifically disclosed in the context of preferred embodiments and optional features, modifications and variations of the concepts disclosed herein may be resorted to by those skilled in the art. Such modifications and variations are considered within the scope of the invention as defined by the appended claims.

Todas las patentes, publicaciones de solicitudes de patentes, artículos de periódico, libros de texto y otras publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativos del nivel de conocimiento de los expertos en la técnica a la que pertenece la divulgación.All patents, patent application publications, newspaper articles, textbooks and other publications mentioned in the specification are indicative of the level of knowledge of those skilled in the art to which the disclosure belongs.

La invención descrita de manera ilustrativa en el presente documento se puede poner en práctica de manera adecuada en ausencia de cualquier (cualesquiera) elemento(s) o limitación(es), que no está(n) divulgados de manera específica en el presente documento. Por lo tanto, por ejemplo, cada caso en el presente documento de cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" se pueden reemplazar con cualquiera de los otros dos términos. Del mismo modo, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen las referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, las referencias al "método" incluye uno o más métodos y/o etapas del tipo, que se han descrito en el presente documento y/o que se volverán evidentes para los expertos en la técnica tras la lectura de la divulgación.The invention illustratively described herein may be suitably practiced in the absence of any element (s) or limitation (s), which are not specifically disclosed herein. Thus, for example, each occurrence herein of any of the terms "comprising", "consisting essentially of" and "consisting of" can be replaced with either of the other two terms. Similarly, the singular forms "un", "one" and "the / the" include plural references unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, references to "method" include one or more such methods and / or steps, which have been described herein and / or which will become apparent to those skilled in the art upon reading of disclosure.

EjemplificaciónExemplification

Ejemplo 1Example 1

La presente invención se lleva a cabo preferentemente en aparatos de PCR automatizados, programables, muchos de los cuales son conocidos por un experto con conocimientos normales en la técnica y son adecuados para su utilización con la presente invención con cualesquiera cambios en el procedimiento que puedan ser necesarios para su uso con un sistema específico, siempre que no se desvíe de los conceptos inventivos de la presente invención. En otros casos, la presente invención puede llevarse a cabo de manera manual. Sin embargo, la ejecución manual de la presente invención tiene como resultado una mayor inversión de tiempo y posiblemente una menor precisión debida al error del operador.The present invention is preferably carried out in automated, programmable PCR apparatus, many of which are known to one of ordinary skill in the art and are suitable for use with the present invention with any changes in procedure that may be required. necessary for use with a specific system, provided it does not deviate from the inventive concepts of the present invention. In other cases, the present invention can be carried out manually. However, manual execution of the present invention results in a greater investment of time and possibly less precision due to operator error.

Este ejemplo utiliza el sistema Abbott m2000 que comprende los instrumentos m2000sp (preparación de la muestra) y m2000rt (amplificación de ácido nucleico en tiempo real) y los reactivos Abbott RealTime HIV-1.This example uses the Abbott m2000 system comprising the m2000sp (sample preparation) and m2000rt (real-time nucleic acid amplification) instruments and the Abbott RealTime HIV-1 reagents.

Prueba de la carga viral del VIH-1 de las muestras de gota de sangre seca para su uso conjuntamente con los instrumentos Abbott m2000 (o similar) y los reactivos Abbott RealTime HIV-1 (o similar)HIV-1 Viral Load Test of Dried Blood Drop Samples for Use in Conjunction with Abbott m2000 Instruments (or Similar) and Abbott RealTime HIV-1 Reagents (or Similar)

El procedimiento descrito a continuación se aplica a la prueba de la carga viral del VIH-1 de las muestras de gota de sangre seca (GSS). Este procedimiento descrito a continuación se usa conjuntamente con los instrumentos Abbott m2000sp y m2000rt y los reactivos Abbott RealTime HIV-1. Otros sistemas y aparatos se encuentran disponibles en la técnica y un experto con conocimientos normales en la técnica puede modificar el procedimiento divulgado a continuación para su uso en los otros sistemas y aparatos disponibles basándose en las enseñanzas de la presente memoria descriptiva y sin desviarse de los conceptos inventivos de la presente memoria descriptiva.The procedure described below applies to the HIV-1 viral load test of dried blood drop specimens (GSS). This procedure outlined below is used in conjunction with Abbott m2000sp and m2000rt instruments and Abbott RealTime HIV-1 reagents. Other systems and apparatus are available in the art and one of ordinary skill in the art can modify the procedure disclosed below for use in the other systems and apparatus available based on the teachings of the present specification and without deviating from the principles. inventive concepts of the present specification.

Procedimiento instrumental Instrumental procedure

El archivo de aplicación (es decir, software) para el ensayo de la carga viral del VIH-1 de GSS debe instalarse en los sistemas Abbott m2000sp y Abbott m2000rt antes de realizar el ensayo.The application file (i.e. software) for the GSS HIV-1 Viral Load Assay must be installed on the Abbott m2000sp and Abbott m2000rt systems prior to testing.

Recogida de muestras e instrucciones de manipulaciónSample collection and handling instructions

Las GSS pueden aplicarse en tarjetas de papel Munktell TFN (Suecia) (o tarjetas de papel equivalente, tal como se conocen por los expertos con conocimientos normales en la técnica) mediante las siguientes etapas:GSS can be applied to Munktell TFN (Sweden) paper cards (or equivalent paper cards, as known to those of ordinary skill in the art) by the following steps:

• Echar gotas de sangre completa sobre los círculos de 12 milímetros (media pulgada) de una tarjeta de papel Munktell TFN (o equivalente), asegurándose que todo el círculo esté cubierto. Se recomienda usar al menos• Drop whole blood drops onto the 12-millimeter (half-inch) circles of a Munktell TFN paper card (or equivalent), making sure the entire circle is covered. It is recommended to use at least

70 |jl de sangre (~3-5 gotas; no apretar ni estrujar el dedo) para cada círculo para asegurar una cobertura completa. Si se ha recogido sangre completa en tubo de recogida de sangre, la sangre recién extraída puede mantenerse desde 2-8 °C (temperatura de refrigerador) hasta 15-30 °C (temperatura ambiente) durante 24 horas antes de la aplicación de las gotas. Además, la sangre debe mezclarse antes de la aplicación de las gotas usando una pipeta.70 | jl of blood (~ 3-5 drops; do not squeeze or squeeze your finger) for each circle to ensure complete coverage. If whole blood has been collected in a blood collection tube, the freshly drawn blood can be kept at 2-8 ° C (refrigerator temperature) to 15-30 ° C (room temperature) for 24 hours before application of the drops. . In addition, the blood must be mixed prior to application of the drops using a pipette.

• Secar al aire la tarjeta a temperatura ambiente.• Air dry the card at room temperature.

• Para el transporte o el almacenamiento, envasar cada tarjeta en una bolsa o en otro envase sellable con bolsas desecantes. Las tarjetas se pueden conservar en condiciones ambientales durante 12 semanas. Como alternativa, las tarjetas se pueden conservar a 2-8 °C o -10 °C o a una temperatura inferior durante 24 semanas.• For transport or storage, pack each card in a bag or other sealable container with desiccant bags. Cards can be stored in ambient conditions for 12 weeks. Alternatively, the cards can be stored at 2-8 ° C or -10 ° C or lower for 24 weeks.

• Transporte de muestras, si así se requiere o se desea, de acuerdo con la temperatura de almacenamiento y los tiempos recomendados mencionados anteriormente. Para los transportes nacionales e internacionales, las muestras deben envasarse y etiquetarse en cumplimiento con las regulaciones estatales, federales e internacionales aplicables al transporte de muestras clínicas, diagnósticas o biológicas.• Transport of samples, if required or desired, according to the storage temperature and recommended times mentioned above. For national and international transportation, samples must be packaged and labeled in compliance with state, federal, and international regulations applicable to the transportation of clinical, diagnostic, or biological samples.

Protocolo del ensayoTrial protocol

1. Este ejemplo de protocolo usó el sistema Abbott RealTime. Un experto con conocimientos normales en la técnica será capaz de adaptar este protocolo a otros dispositivos y sistemas similares sin experimentación excesiva. En cada ciclo pueden procesarse un total de 96 muestras. En cada ciclo se incluye un control negativo, un control positivo bajo, y un control positivo alto, permitiendo así procesar un máximo de 93 muestras de GSS por ciclo cuando no se incluyen los calibradores. Estas etapas no se aplican a los controles y calibradores de Abbott, los cuales deberían procesarse como muestras directamente líquidas. Procesar las muestras de GSS mediante las siguientes etapas:1. This sample protocol used the Abbott RealTime system. One of ordinary skill in the art will be able to adapt this protocol to other similar devices and systems without undue experimentation. A total of 96 samples can be processed in each cycle. A negative control, a low positive control, and a high positive control are included in each run, allowing a maximum of 93 GSS samples to be processed per run when calibrators are not included. These steps do not apply to Abbott Controls and Calibrators, which should be processed as direct liquid samples. Process the GSS samples through the following steps:

• Preparar tubos de transporte Abbott con 1,3 ml de tampón de elución de GS/GSS (el tampón de elución comprende aproximadamente GITC 3,5 M(tiocianato de guanidinio), aproximadamente Tween® 20 5 %, aproximadamente KOAc 50 mM (acetato de potasio) a aproximadamente pH 6,0. Tween® es una marca comercial registrada de ICI Americas, Inc., Bridgewater, Nueva Jersey. Tween® 20 es un nombre comercial del polisorbato 20. En los métodos de la presente invención también se pueden utilizar otras marcas de polisorbato 20. [GITC se puede usar desde 1,0-5,5 M, 2,0 - 4,5 M, 3,0 - 4,0 M y alrededor de 3,5 M; Tween20 se puede usar al 0 - 20 %, 2 % - 8 %, 4 % - 6 % y alrededor de 5 %; El acetato de potasio se puede usar a 1 - 500 mM, 20 mM - 300 mM, 30 mM - 200 mM, 40 mM - 100 mM y alrededor

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e 50 mM; y el pH puede se desde 5 -10, 5,2 - 8, 5,6 - 7, 5,8 - 6,5 y alrededor de 6,5.]• Prepare Abbott transport tubes with 1.3 ml of GS / GSS elution buffer (elution buffer comprises approximately 3.5 M GITC (guanidinium thiocyanate), approximately 5% Tween® 20, approximately 50 mM KOAc (acetate potassium) at about pH 6.0.Tween® is a registered trademark of ICI Americas, Inc., Bridgewater, NJ.Tween® 20 is a trade name for polysorbate 20. The methods of the present invention may also be used use other brands of polysorbate 20. [GITC can be used from 1.0-5.5M, 2.0-4.5M, 3.0-4.0M and around 3.5M; Tween20 can be used use 0 - 20%, 2% - 8%, 4% - 6% and around 5%; Potassium acetate can be used at 1 - 500 mM, 20 mM - 300 mM, 30 mM - 200 mM, 40 mM - 100 mM and around
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e 50 mM; and the pH can be from 5-10, 5.2-8, 5.6-7, 5.8-6.5, and about 6.5.]

• Separar una (1) GSS entera para cada muestra de una tarjeta de papel Munktell TFN (o equivalente). Cada• Separate one (1) whole GSS for each sample from a Munktell TFN paper card (or equivalent). Each

GSS debe tener alrededor de 12 milímetros (media pulgada) de diámetro. NOTA: Si es aplicable, evitar el contacto directo de la superficie cortante con las muestras de GSS. Limpiar el instrumento usado para cortar la GSS entre muestras, si fuera necesario, de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. Colocar laGSS should be about a half inch (12 millimeters) in diameter. NOTE: If applicable, avoid direct contact of the cutting surface with GSS samples. Clean the instrument used to cut the GSS between samples, if necessary, according to good laboratory practice. Place the

GSS en el tubo de transporte Abbott que contiene el tampón de elución de GS/GSS. Asegurarse de que laGSS in the Abbott transport tube containing the GS / GSS Elution Buffer. Make sure the

GSS se sumerja completamente en el tampón de elución de GS/GSS. NOTA: Durante esta etapa de transferencia de la GSS, puede colocarse una tarjeta de papel Munktell TFN perforada encima del tubo de transporte Abbott, donde la GSS se libera de la tarjeta y se dirige al interior del tubo utilizando una punta de pipeta limpia.GSS is completely immersed in the GS / GSS Elution Buffer. NOTE: During this stage of transferring the GSS, a perforated Munktell TFN paper card can be placed on top of the Abbott transport tube, where the GSS is released from the card and directed into the tube using a clean pipette tip.

• Incubar a temperatura ambiente durante alrededor de 20 minutos o incubar durante 30 minutos a 55 °C con mezclado intermitente antes de colocar la muestra en un instrumento Abbott m2000sp o en otro sistema robótico (Etapa 7).• Incubate at room temperature for about 20 minutes or incubate for 30 minutes at 55 ° C with intermittent mixing before placing the sample on an Abbott m2000sp instrument or other robotic system (Step 7).

2. Descongelar los controles del ensayo apropiados y el control interno (CI) a una temperatura entre 15 y 30 °C o entre 2 y 8 °C (e intermedias). Descongelar los calibradores a una temperatura entre 15 y 30 °C o entre 2 y 8 °C2. Thaw appropriate Assay Controls and Internal Control (IC) at 15-30 ° C or 2-8 ° C (and in-between). Thaw calibrators at 15-30 ° C or 2-8 ° C

(e intermedias) solo si se realiza un ciclo de calibración.(and intermediate) only if a calibration cycle is performed.

• Una vez descongelados, los controles del ensayo, el CI y los calibradores pueden almacenarse a una temperatura entre 2 y 8 °C durante 24 horas antes de usar.• Once thawed, Assay Controls, ICs and Calibrators can be stored at 2-8 ° C for 24 hours before use.

• Agitar en vórtex (es decir, mezclar de forma extremadamente vigorosa con un mezclador vórtex o equivalente) cada calibrador del ensayo y cada control 3 veces durante 2 a 3 segundos antes de usar.• Vortex (ie mix extremely vigorously with a vortex mixer or equivalent) each assay calibrator and each control 3 times for 2 to 3 seconds before use.

Asegurarse de que el contenido de cada vial se encuentra en el fondo después de la agitación con vórtex golpeando ligeramente los viales sobre la mesa para que el líquido llegue hasta el fondo del vial. Asegurarse Make sure the contents of each vial are at the bottom after vortexing by tapping the vials on the table so that the liquid reaches the bottom of the vial. Make sure

de que no se forman burbujas o espuma; y si están presentes, eliminar las burbujas con una punta de pipeta estéril, usando una nueva punta para cada vial.that no bubbles or foam are formed; and if present, remove bubbles with a sterile pipette tip, using a new tip for each vial.

• Preparar controles internos (CI) según las instrucciones del fabricante, como se conoce en la técnica.• Prepare internal controls (IC) according to manufacturer's instructions, as known in the art.

3. Descongelar los reactivos de amplificación a una temperatura entre 15 y 30 °C o entre 2 y 8 °C (e intermedias) y almacenar a una temperatura entre 2 y 8 °C hasta que se necesiten para el procedimiento de preparación de la mezcla maestra de amplificación.3. Thaw Amplification Reagents at 15-30 ° C or 2-8 ° C (and intermediate) and store at 2-8 ° C until required for the mix preparation procedure. amplification master.

• Una vez descongelados, los reactivos de amplificación se pueden almacenar a 2-8 °C durante 24 horas si no se usan inmediatamente.• Once thawed, Amplification Reagents can be stored at 2-8 ° C for 24 hours if not used immediately.

• Preparar los reactivos de amplificación (reactivos de PCR) según las instrucciones del fabricante, como se conoce en la técnica.• Prepare the amplification reagents (PCR reagents) according to the manufacturer's instructions, as known in the art.

• Colocar los controles positivos bajos y altos, el control negativo, los calibradores, si es aplicable, y las muestras de GSS en los tubos de transporte Abbott en las gradillas de muestras del sistema Abbott m2000sp. NOTA: Asegurarse de que las gradillas de muestras del sistema Abbott m2000sp se han calibrado específicamente para este procedimiento de carga viral del VIH-1 de GSS.• Place the Low and High Positive Controls, Negative Control, Calibrators, if applicable, and GSS samples in the Abbott transport tubes in the Abbott m2000sp System sample racks. NOTE: Ensure that the Abbott m2000sp System sample racks have been specifically calibrated for this GSS HIV-1 Viral Load procedure.

• Cargar las gradillas de muestras cuidadosamente para evitar salpicaduras. Si se utilizan, los códigos de barras de las etiquetas de los tubos deben orientarse hacia la derecha para su lectura. Asegurarse de que todos los tubos están bien asentados en la gradilla de muestras de forma que el fondo de los tubos toque la parte inferior de la gradilla.• Load sample racks carefully to avoid splashing. If used, barcodes on tube labels must be oriented to the right to read. Make sure that all tubes are properly seated in the sample rack so that the bottom of the tubes touches the bottom of the rack.

• Cargar las gradillas de muestras llenas en el sistema Abbott m2000sp en posiciones consecutivas de la gradilla de muestras, con la primera gradilla situada lo más lejos a la derecha de la mesa de trabajo, y cualquier gradilla adicional progresivamente a la izquierda de la primera gradilla.• Load filled sample racks into the Abbott m2000sp system at consecutive positions on the sample rack, with the first rack positioned furthest to the right of the worktable, and any additional racks progressively to the left of the first rack .

5. Colocar los tubos de reacción de 5 ml en el subsistema de soporte de 1 ml del sistema Abbott m2000sp. 5. Place the 5 ml reaction tubes in the 1 ml support subsystem of the Abbott m2000sp.

6. Cargar los reactivos del Sistema de preparación de la muestra Abbott y la placa de 96 pocillos profundos de Abbott en la mesa de trabajo del sistema Abbott m2000sp. 6. Load the Abbott Sample Preparation System reagents and the Abbott 96 Deep Well Plate onto the Abbott m2000sp System bench.

7. En la pantalla del Protocolo, seleccionar el archivo de la aplicación de la carga viral del VIH-1 de GSS. Iniciar el protocolo de extracción de las muestras.7. On the Protocol screen, select the GSS HIV-1 viral load application file. Start the sample extraction protocol.

• Introducir calibrador (necesario si no se ha guardado una curva de calibración en el sistema Abbott m2000rt) y controlar los valores específicos del lote en los campos de extracción de las muestras: Campos configuración de la mesa de trabajo, Calibrador y Controles. Los valores específicos del lote están especificados en cada calibrador de Abbott RealTime HIV-1 y Tarjeta del kit de control.• Enter calibrator (required if a calibration curve has not been saved in the Abbott m2000rt system) and check the lot-specific values in the sample extraction fields: Worktable setup, Calibrator, and Controls fields. Lot-specific values are specified on each Abbott RealTime HIV-1 Calibrator and Control Kit Card.

• El protocolo Adición de la mezcla maestra del sistema Abbott m2000sp (etapa 9) debe iniciarse en el plazo de 1 hora después de haber completado la preparación de la muestra.• The Abbott m2000sp System Master Mix Addition protocol ( Step 9) should be started within 1 hour after sample preparation is completed.

NOTA: Cambiar los guantes antes de manipular los reactivos de amplificación.NOTE: Change gloves before handling Amplification Reagents.

8. Cargar los reactivos de amplificación y el vial de la mezcla maestra en la mesa de trabajo del sistema Abbott m2000sp una vez completada la preparación de la muestra.8. Load the Amplification Reagents and Master Mix vial onto the Abbott m2000sp System Worktable after sample preparation is complete.

9. Seleccionar la placa de pocillos profundos apropiada que coincida con la correspondiente extracción de preparación de la muestra. Iniciar el protocolo de adición de la mezcla maestra del sistema Abbott m2000sp. • Una vez completada la extracción de la muestra, el sistema Abbott m2000sp llena automáticamente cualquier pocillo vacío de la placa de reacción óptica de 96 pocillos de Abbott cuando en un ciclo se procesan más de 48 muestras. El llenado de la placa no se lleva a cabo para ciclos que contienen 48 muestras o menos.9. Select the appropriate deep-well plate that matches the corresponding sample preparation draw. Start the Abbott m2000sp system master mix addition protocol . • After sample extraction is complete, the Abbott m2000sp System automatically fills any empty wells of the Abbott 96- Well Optical Reaction Plate when more than 48 samples are run in one run. Plate fill is not performed for runs containing 48 or fewer samples.

10. Encender e inicializar el instrumento Abbott m2000rt en el Área de amplificación.10. Power on and initialize the Abbott m2000rt instrument in the Amplification Area.

11. Sellar la placa de reacción óptica de 96 pocillos de Abbott una vez completada la adición de las muestras y de la mezcla maestra en el instrumento Abbott m2000sp de acuerdo con lo descrito en el capítulo Instrucciones de funcionamiento del Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000sp. 11. Seal the Abbott 96-Well Optical Reaction Plate upon completion of the addition of samples and master mix to the Abbott m2000sp instrument as described in the Operating Instructions chapter of the Abbott m2000sp System Operation Manual .

12. Colocar la placa de reacción óptica sellada en la base para el soporte libre de salpicaduras para su transferencia al instrumento Abbott m2000rt. 12. Place the sealed optical reaction plate on the splash-free stand base for transfer to the Abbott m2000rt instrument .

13. Colocar la placa de reacción óptica de 96 pocillos de Abbott en el instrumento Abbott m2000rt. En la pantalla del Protocolo, seleccionar el archivo de la aplicación de la carga viral del VIH-1 de GSS. Iniciar el protocolo como se describe en el capítulo Instrucciones de funcionamiento del Manual de funcionamiento del sistema Abbott m2000rt.13. Place the Abbott 96- Well Optical Reaction Plate on the Abbott m2000rt instrument . On the Protocol screen, select the GSS HIV-1 viral load application file. Start the protocol as described in the Operating Instructions chapter of the Abbott m2000rt System Operating Manual.

14. Puede añadirse ADNasa a una o más de las muestras eluidas, los reactivos de PCR y la reacción de PCR completa después de la adición de los reactivos de PCR a la muestra procesada, si se considera necesario por el operador. Los reactivos/tampones de la reacción de la ADNasa y los reactivos/tampones de desactivación no son necesarios.14. DNase can be added to one or more of the eluted samples, the PCR reagents, and the PCR reaction. Complete after the addition of the PCR reagents to the processed sample, if deemed necessary by the operator. DNase reaction reagents / buffers and inactivation reagents / buffers are not required.

ResultadosResults

La concentración del ARN del VIH-1 viral en una muestra o control se calcula a partir de la curva de calibración almacenada. El instrumento Abbott m2000rt ofrece automáticamente los resultados en la estación de trabajo del sistema Abbott m2000rt. Los resultados del ensayo se expresan en copias/ml, log [copias/ml], Unidades internacionales (UI)/ml o log [UI/ml]. Para la interpretación de los resultados véase la Tabla 1 a continuación.The concentration of viral HIV-1 RNA in a sample or control is calculated from the stored calibration curve. The Abbott m2000rt instrument automatically outputs the results to the Abbott m2000rt system workstation. Assay results are expressed in copies / ml, log [copies / ml], International Units (IU) / ml or log [IU / ml]. For interpretation of the results see Table 1 below.

Tabla 1Table 1

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Ejemplo 2Example 2

El ejemplo muestra las características de diseño que permiten trabajar al procedimiento de ensayo automatizado de GSS de la presente invención con eficiencia y sensibilidad mejorada respecto a los métodos de la técnica anterior. Los procedimientos implican las siguientes etapas:The example shows the design features that allow the automated GSS assay procedure of the present invention to operate with improved efficiency and sensitivity over prior art methods. The procedures involve the following stages:

1. La GSS se recorta de la tarjeta de GSS.1. The GSS is cut out of the GSS card.

2. La GSS se incuba en un tampón de tratamiento.2. The GSS is incubated in a treatment buffer.

3. El tubo de reacción que contiene la GSS en el tampón se carga en el sistema robótico automatizado (p. ej. el sistema Abbott m2000sp).3. The reaction tube containing the GSS in the buffer is loaded into the automated robotic system (eg the Abbott m2000sp system).

4. El sistema robótico funciona mediante una secuencia de comandos para procesar la muestra de GSS mediante el proceso de extracción de ácido nucleico manipulando directamente el tubo donde se ha incubado la GSS sin intervención manual.4. The robotic system works through a script to process the GSS sample through the nucleic acid extraction process by directly manipulating the tube where the GSS has been incubated without manual intervention.

5. Después de la extracción del ácido nucleico, el sistema robótico forma la mezcla maestra de PCR (es decir, la reacción completa de PCR sin los ácidos nucleicos diana). Como alternativa, esta etapa puede evitarse si la mezcla maestra de PCR se ha formado y cargado a priori en el sistema.5. After nucleic acid extraction, the robotic system forms the PCR master mix (ie, the complete PCR reaction without the target nucleic acids). Alternatively, this step can be avoided if the PCR master mix has been formed and loaded into the system a priori .

6. El sistema robótico forma la reacción de PCR completa combinando los ácidos nucleicos extraídos al final de la Etapa 4 con la mezcla maestra de PCR obtenida al final de la Etapa 5.6. The robotic system forms the complete PCR reaction by combining the nucleic acids extracted at the end of Step 4 with the PCR master mix obtained at the end of Step 5.

7. Los informes de los ciclos de PCR y de reducción de datos/resultados se realizan en un instrumento analítico (p. ej. un instrumento de PCR en tiempo real, tal como el Abbott m2000rt).7. Reports of PCR cycles and data / result reduction are performed on an analytical instrument (eg a real-time PCR instrument, such as the Abbott m2000rt).

8. Si se desea por la aplicación específica, se añade ADNasa y se incuba con los ácidos nucleicos extraídos obtenidos de la etapa 4 para eliminar/reducir el contenido de ADN. En tal caso, los ácidos nucleicos tratados con ADNasa se procesarán adicionalmente partiendo de la Etapa 6. Como alternativa, puede añadirse ADNAsa a los reactivos de PCR antes o durante la formación de la mezcla maestra de PCR. Además, de forma alternativa, la ADNasa puede formularse en el reactivo o reactivos de PCR. En tal caso, la mezcla maestra de PCR que contiene la ADNasa se procesará adicionalmente partiendo de la Etapa 6. Durante la Etapa 6, la ADNasa se distribuye a cada muestra mediante el sistema robótico, evitando la distribución manual de la ADNasa. Además, puede requerirse una incubación de tratamiento de la ADNasa después de la Etapa 6 y antes de la Etapa 7. Nota: Una aplicación específica donde se pueda desear el uso de ADNasa es una PCR específica de ARN del VIH, donde puede eliminarse/reducirse la interferencia del ADN proviral.8. If desired for the specific application, add DNase and incubate with the extracted nucleic acids obtained from step 4 to eliminate / reduce the DNA content. In such a case, the DNase-treated nucleic acids will be further processed starting from Step 6. Alternatively, ADNAse can be added to the PCR reagents before or during formation of the PCR master mix. In addition, alternatively, DNase can be formulated in the PCR reagent (s). In such a case, the PCR master mix containing DNase will be further processed starting from Step 6. During Step 6, DNase is distributed to each sample by the robotic system, avoiding manual distribution of DNase. In addition, an incubation of DNase treatment may be required after Step 6 and before Step 7. Note: A specific application where the use of DNase may be desired is HIV RNA-specific PCR, where it can be removed / reduced proviral DNA interference.

Las tecnologías que permiten los procedimientos de ensayo y el rendimiento del ensayo anteriores incluyen:Technologies that enable the above test procedures and test performance include:

1. El tampón de tratamiento que eluye el ácido nucleico de la GS/GSS con alta eficiencia. Esta divulgación incluye el uso del tampón mWash 1 de Abbott (GITC 3,5M; Tween 20 5 %; KOAc 50 mM, pH 6,0) como el tampón de tratamiento/elución de la GSS. Nota: Abbott ha proporcionado previamente un protocolo de CV del VIH de GSS comercial y un ensayo de GSS cualitativo del VIH CE-IVD que utiliza el tampón de mLysis de Abbott como tampón de tratamiento (GITC 4,66M; Tween 20 10%; Trizma 100 mM, pH 7,8). Más adelante se proporciona una comparación de estos dos procedimientos donde se muestra la inesperada superioridad del procedimiento de la presente invención.1. The treatment buffer that elutes nucleic acid from GS / GSS with high efficiency. This disclosure includes the use of Abbott's mWash 1 buffer (3.5M GITC; 5% Tween 20; 50mM KOAc, pH 6.0) as the GSS treatment / elution buffer. Note: Abbott has previously provided a commercial GSS HIV CV protocol and a qualitative HIV GSS CE-IVD assay using Abbott's mLysis buffer as the treatment buffer (GITC 4.66M; Tween 20 10%; Trizma 100 mM, pH 7.8). A comparison of these two methods is provided below, showing the unexpected superiority of the method of the present invention.

2. Los parámetros de la secuencia de comandos que permiten al sistema robótico de pipetas transferir el líquido directamente desde el tubo que contiene el material sólido de la GSS para el posterior procesamiento de forma robusta y precisa dejando un volumen muerto de <300 ul en el tubo después de la transferencia de líquidos. 3. El uso de ADNasa que degrada eficazmente ADN en los ácidos nucleicos extraídos sin incluir tampones de reacción de ADNasa específicos.2. The script parameters that allow the robotic pipette system to transfer the liquid directly from the tube containing the solid material of the GSS for further robust and accurate processing leaving a dead volume of <300 ul in the tube after liquid transfer. 3. The use of DNase that efficiently degrades DNA in the extracted nucleic acids without including specific DNase reaction buffers.

4. El uso de ADNasa con la propiedad descrita en el apartado 3 que degrada eficazmente el ADN a temperatura ambiente.4. The use of DNase with the property described in section 3 that efficiently degrades DNA at room temperature.

5. El uso de ADNasa con las propiedades descritas en los apartados 3 y 4 que degrada eficazmente el ADN en un período de tiempo de 30 minutos.5. The use of DNase with the properties described in sections 3 and 4 that efficiently degrades DNA in a period of 30 minutes.

6. El uso de ADNasa con las propiedades descritas en los apartados 3-5 que no necesita inactivarse ni con la introducción de reactivos ni de temperaturas elevadas.6. The use of DNase with the properties described in sections 3-5 that does not need to be inactivated either with the introduction of reagents or high temperatures.

7. El uso de ADNasa que degrada eficazmente el ADN en la reacción de PCR cuando la ADNasa se ha introducido en los reactivos de PCR antes de la exposición a los ácidos nucleicos extraídos o cuando se introduce durante la formación de la reacción de PCR.7. The use of DNase that efficiently degrades DNA in the PCR reaction when DNase has been introduced into the PCR reagents prior to exposure to the extracted nucleic acids or when it is introduced during the formation of the PCR reaction.

8. El uso de ADNasa con la propiedad descrita en el apartado 7 sin incluir un tampón de reacción de ADNasa específico.8. The use of DNase with the property described in section 7 without including a specific DNase reaction buffer.

9. El uso de ADNasa con las propiedades descritas en los apartados 7 y 8 que degrada eficazmente el ADN a temperatura ambiente o a temperaturas durante varias fases de los ciclos de la PCR.9. The use of DNase with the properties described in sections 7 and 8 that efficiently degrades DNA at room temperature or at temperatures during various phases of the PCR cycles.

10. El uso de ADNasa con las propiedades descritas en los apartados 7-9 que degrada eficazmente el ADN en un período de tiempo de 10 minutos. Preferentemente, en el caso donde las temperaturas durante las distintas etapas de los ciclos de PCR pueden apoyar la función de la ADNasa, el tratamiento con ADNasa no requiere tiempo adicional o etapas de ciclos más allá de las incluidas en los ciclos de PCR.10. The use of DNase with the properties described in sections 7-9 that efficiently degrades DNA in a period of 10 minutes. Preferably, in the case where temperatures during the various stages of the PCR cycles can support DNase function, the DNase treatment does not require additional time or cycle steps beyond those included in the PCR cycles.

11. El uso de ADNasa con las propiedades descritas en los apartados 7-10 que no necesita inactivarse ni con la introducción de reactivos ni de temperaturas elevadas antes y durante la PCR.11. The use of DNase with the properties described in sections 7-10 that does not need to be inactivated either with the introduction of reagents or high temperatures before and during PCR.

12. El uso de ADNasa y las condiciones de tratamiento con ADNasa asociadas de los elementos 3-11 que no impacta negativamente a la detección de las secuencias de ARN.12. The use of DNase and associated DNase treatment conditions of items 3-11 that do not negatively impact the detection of RNA sequences.

13. El uso del ajuste "volumen de PCR" (como parámetro de los ciclos térmicos) en un valor inferior al volumen de PCR real. Este ajuste elimina el efecto de "límite" observado en una placa de PCR llena que impacta negativamente en la sensibilidad cuando se compara con un ciclo en una placa de PCR parcial. El efecto de "límite", tal como se ha observado con algunas etapas de la técnica de cicladores de PCR de tiempo real, es causado por el exceso de temperatura de la unidad térmica de control. El enfoque de menor volumen de PCR conduce a un control térmico más lento y más preciso, mejorando así la mayoría del exceso de temperatura. 14. El corte de la reacción de PCR es determinado por el experto en la técnica de modo que sea apropiado para la muestra diana de GS/GSS específica.13. Using the "CRP volume" setting (as a parameter for thermal cycling) to a value lower than the actual CRP volume. This setting eliminates the "cutoff" effect seen in a full PCR plate that negatively impacts sensitivity when compared to one cycle in a partial PCR plate. The "edge" effect, as seen with some steps in the real-time PCR cycler technique, is caused by the overheating of the thermal control unit. The smaller volume approach to PCR leads to slower and more precise thermal control, thus improving most of the over-temperature. 14. The cutoff of the PCR reaction is determined by one of skill in the art to be appropriate for the specific GS / GSS target sample.

Detalles de un ejemplo de las tecnologías de la presente invención:Details of an example of the technologies of the present invention:

1. La transferencia robótica del líquido desde los tubos que contienen la GSS consiste en las siguientes etapas:1. The robotic transfer of liquid from the tubes containing the GSS consists of the following steps:

• Se empuja la GSS al fondo del tubo de muestra mediante una punta de pipeta desechable utilizando un algoritmo "Detectar fondo del tubo".• The GSS is pushed to the bottom of the sample tube by a disposable pipette tip using a "Detect bottom of tube" algorithm.

• La punta desechable se retrae lentamente una corta distancia (p. ej., 3 mm) del fondo del tubo de muestra y se lleva a cabo una pequeña aspiración de volumen (p. ej., 50 jl) para verificar que la GSS no interfiere con la punta desechable. Después de completar la pequeña aspiración de volumen, la punta desechable se retira hasta un punto por encima de la superficie del líquido.• The disposable tip is slowly retracted a short distance (eg, 3 mm) from the bottom of the sample tube and a small volume aspiration (eg, 50 jl) is performed to verify that the GSS does not interferes with the disposable tip. After completing the small volume aspiration, the disposable tip is withdrawn to a point above the surface of the liquid.

• Usando la misma punta desechable, se detecta la superficie del líquido y se lleva a cabo una aspiración de seguimiento parcial de volumen (p. ej., 450 j l para lograr 1 ml) de esa localización. Después de completar la primera aspiración de volumen parcial, el líquido contenido en la punta desechable se transfiere a un tubo de reacción para las etapas siguientes de extracción de ácido nucleico.• Using the same disposable tip, the surface of the liquid is detected and a partial volume follow-up aspiration (eg, 450 µl to achieve 1 ml) is performed from that location. After completion of the first partial volume aspiration, the liquid contained in the disposable tip is transferred to a reaction tube for subsequent nucleic acid extraction steps.

• Estas etapas se repiten para obtener el volumen total de transferencia de la muestra.• These steps are repeated to obtain the total transfer volume of the sample.

2. Los ejemplos de ADNasas que degradan eficazmente ADN cuando se utilizan junto con los métodos y composiciones de la presente invención cuando se añaden a los ácidos nucleicos extraídos (sin impactar negativamente en la detección de ARN) en ausencia de tampones de reacción de ADNasa específicos y que no necesitan inactivarse ni con la introducción de reactivos ni con temperaturas elevadas son: •2. Examples of DNases that efficiently degrade DNA when used in conjunction with the methods and compositions of the present invention when added to extracted nucleic acids (without negatively impacting RNA detection) in the absence of specific DNase reaction buffers and that do not need to be inactivated either with the introduction of reagents or at high temperatures are: •

• Promega (Madison, WI) RQ1 ADNasa libre de ARNasa (N.° Cat M6101); 2U/reacción; Temperatura ambiente; 30 minutos.• Promega (Madison, WI) RQ1 DNase free RNase (Cat # M6101); 2U / reaction; Room temperature; 30 minutes.

• Ambion (Grand Island, NY) ADNasa I (libre de ARNasa) (N.° Cat AM2222); 2U/reacción; Temperatura ambiente; 30 minutos.• Ambion (Grand Island, NY) DNase I (RNase free) (Cat # AM2222); 2U / reaction; Room temperature; 30 minutes.

• Roche (Basilea, Suiza) ADNasa I recombinante, libre de ARNasa (N.° Cat 04716728001); 20U/reacción; Temperatura ambiente; 30 minutos.• Roche (Basel, Switzerland) RNase-free, recombinant DNase I (Cat # 04716728001); 20U / reaction; Room temperature; 30 minutes.

• Otras ADNasas adecuadas pueden ser conocidas y ser identificadas por un experto con conocimientos normales en la técnica utilizando los métodos descritos en el presente documento sin experimentación excesiva. La presente invención no se limita a cualquier ADNasa específica siempre que cumpla con los estándares mencionados en esta memoria descriptiva. Los ensayos descritos en las figuras a continuación son solo ejemplos y no tienen el objetivo de limitar la invención a cualquier ADNasa en particular o a cualquier método de detección.• Other suitable DNases can be known and identified by one of ordinary skill in the art using the methods described herein without undue experimentation. The present invention is not limited to any specific DNase as long as it meets the standards mentioned in this specification. The assays described in the figures below are only examples and are not intended to limit the invention to any particular DNase or any detection method.

Véase en la Figura 1 una ADNasa que elimina eficazmente el ADN y no impacta negativamente en las señales de ARN. La Figura 1 muestra los ácidos nucleicos eluidos extraídos de gotas de sangre seca positivas para VIH tratadas con ADNasa antes de combinarse con los reactivos de PCR (líneas discontinuas) en comparación con el control (sin tratamiento de ADNasa, líneas discontinuas). Los ácidos nucleicos fueron sometidos a un ensayo de PCR en tiempo real de beta globina para obtener la señal de ADN de beta globina y una RT-PCR en tiempo real del VIH-1 para las señales de ARN del VIH y del CI. a) Señal de ADN de beta globina, para demostrar la eficacia del tratamiento con ADNasa; b) señal de ARN del VIH, para demostrar el impacto del tratamiento con ADNasa, c) señal de ARN del CI, para demostrar el impacto del tratamiento con ADNasa. Condiciones usadas para el tratamiento con ADNasa: Ambion ADNasa 1 (libre de ARNasa) (N.° Cat AM2222); 2U/reacción; temperatura ambiente; 30 minutos.See Figure 1 for a DNase that efficiently removes DNA and does not negatively impact RNA signals. Figure 1 shows the eluted nucleic acids extracted from DNAse-treated HIV-positive dried blood drops before combining with the PCR reagents (dashed lines) compared to the control (no DNase treatment, dashed lines). The nucleic acids were subjected to a beta globin real-time PCR assay for the beta globin DNA signal and a HIV-1 real-time RT-PCR for the HIV and IC RNA signals. a) Beta globin DNA signal, to demonstrate the efficacy of DNase treatment; b) HIV RNA signal, to demonstrate the impact of DNase treatment, c) IC RNA signal, to demonstrate the impact of DNase treatment. Conditions used for DNase treatment: Ambion DNase 1 (RNase free) (Cat # AM2222); 2U / reaction; room temperature; 30 minutes.

Véase en la Figura 2 una ADNasa que no elimina eficazmente el ADN y no impacta negativamente en las señales de ARN. La Figura 2 muestra los ácidos nucleicos eluidos extraídos de gotas de sangre seca positivas para VIH tratadas con ADNasa antes de combinarse con los reactivos de PCR (líneas discontinuas) en comparación con el control (sin tratamiento de ADNasa, líneas discontinuas). Los ácidos nucleicos fueron sometidos a un ensayo de PCR en tiempo real de beta globina para obtener la señal de ADN de beta globina y una RT-PCR en tiempo real del VIH-1 para las señales de ARN del VIH y del CI. a) Señal de ADN de beta globina, para demostrar la eficacia del tratamiento con ADNasa; b) señal de ARN del VIH, para demostrar el impacto del tratamiento con ADNasa, c) señal de ARN del CI, para demostrar el impacto del tratamiento con ADNasa. Condiciones usadas para el tratamiento con ADNasa: New England Biolabs ADNasa I (libre de ARNasa) (N.° Cat MO303S); 2U/reacción; temperatura ambiente; 30 minutos.See Figure 2 for a DNase that does not efficiently remove DNA and does not negatively impact RNA signals. Figure 2 shows the eluted nucleic acids extracted from DNAse-treated HIV-positive dried blood spots before being combined with the PCR reagents (dashed lines) compared to the control (no DNase treatment, dashed lines). The nucleic acids were subjected to a beta globin real-time PCR assay for the beta globin DNA signal and a HIV-1 real-time RT-PCR for the HIV and IC RNA signals. a) Beta globin DNA signal, to demonstrate the efficacy of DNase treatment; b) HIV RNA signal, to demonstrate the impact of DNase treatment, c) IC RNA signal, to demonstrate the impact of DNase treatment. Conditions used for DNase treatment: New England Biolabs DNase I (RNase free) (Cat # MO303S); 2U / reaction; room temperature; 30 minutes.

Véase en la Figura 3 una ADNasa que elimina eficazmente el ADN e impacta negativamente en las señales de ARN. La Figura 3 muestra los ácidos nucleicos eluidos extraídos de gotas de sangre seca positivas para VIH tratadas con ADNasa antes de combinarse con los reactivos de PCR (líneas discontinuas) en comparación con el control (sin tratamiento de ADNasa, líneas discontinuas). Los ácidos nucleicos fueron sometidos a un ensayo de PCR en tiempo real de beta globina para obtener la señal de ADN de beta globina y una RT-PCR en tiempo real del VIH-1 para las señales de ARN del VIH y del CI. a) Señal de ADN de beta globina, para demostrar la eficacia del tratamiento con ADNasa; b) señal de ARN del VIH, para demostrar el impacto del tratamiento con ADNasa, c) señal de ARN del CI, para demostrar el impacto del tratamiento con ADNasa. Condiciones usadas para el tratamiento con ADNasa: Sigma-Aldrich ADNasa 1 (calidad de amplificación) (N.° Cat AMPD1); 2U/reacción; temperatura ambiente; 30 minutos.See Figure 3 for a DNase that efficiently removes DNA and negatively impacts RNA signals. Figure 3 shows the eluted nucleic acids extracted from DNAse-treated HIV-positive dried blood spots before being combined with the PCR reagents (dashed lines) compared to the control (no DNase treatment, dashed lines). The nucleic acids were subjected to a beta globin real-time PCR assay for the beta globin DNA signal and a HIV-1 real-time RT-PCR for the HIV and IC RNA signals. a) Beta globin DNA signal, to demonstrate the efficacy of DNase treatment; b) HIV RNA signal, to demonstrate the impact of DNase treatment, c) IC RNA signal, to demonstrate the impact of DNase treatment. Conditions used for DNase treatment: Sigma-Aldrich DNase 1 (amplification quality) (Cat # AMPD1); 2U / reaction; room temperature; 30 minutes.

3. Los ejemplos de ADNasas que degradan eficazmente el ADN en la reacción de PCR (sin impactar negativamente en la detección del ARN) cuando la ADNasa se ha introducido en los reactivos de PCR antes de la exposición a los ácidos nucleicos extraídos o cuando se introduce durante la formación de la reacción de PCR son:3. Examples of DNases that efficiently degrade DNA in PCR reaction (without negatively impacting RNA detection) when DNase has been introduced into PCR reagents prior to exposure to extracted nucleic acids or when introduced during the formation of the PCR reaction are:

• Promega RQ1 ADNasa libre de ARNasa (N.° Cat M6101); 2U/reacción; Temperatura ambiente; 10 minutos • Ambion ADNasa I (libre de ARNasa) (N.° Cat AM2222); 2U/reacción; Temperatura ambiente; 30 minutos • Otras ADNasas pueden ser conocidas por un experto con conocimientos normales en la técnica y pueden identificarse utilizando los métodos descritos en el presente documento sin experimentación excesiva. La presente invención no se limita a cualquier ADNasa específica siempre que cumpla con los estándares mencionados en esta memoria descriptiva. Los ensayos descritos en las figuras a continuación son solo ejemplos y no tienen el objetivo de limitar la invención a cualquier ADNasa en particular.• Promega RQ1 RNase-free DNase (Cat # M6101); 2U / reaction; Room temperature; 10 minutes • Ambion DNase I (RNase free) (Cat # AM2222); 2U / reaction; Room temperature; 30 minutes • Other DNases may be known to one of ordinary skill in the art and can be identified using the methods described herein without undue experimentation. The present invention is not limited to any specific DNase as long as it meets the standards mentioned in this specification. The assays described in the figures below are only examples and are not intended to limit the invention to any particular DNase.

Véase en la Figura 4 una ADNasa que elimina eficazmente el ADN y no impacta negativamente en las señales de ARN. En la Figura 4, la ADNasa se añadió a los reactivos de PCR que posteriormente se combinaron con la mezcla maestra de PCR (línea discontinua). Como el control, no se añadió ADNasa a los reactivos de PCR (línea continua). Los ácidos nucleicos extraídos se sometieron a ensayo con la mezcla maestra de PCR, donde la señal de ADN de beta globina y se detectaron las señales de ARN del VIH y del CI. a) Señal de ADN de beta globina, para demostrar la eficacia del tratamiento con ADNasa; b) señal de ARN del VIH, para demostrar el impacto del tratamiento con ADNasa, c) señal de ARN del CI, para demostrar el impacto del tratamiento con ADNasa. Condiciones usadas para el tratamiento con ADNasa: Promega RQ1 ADNasa libre de ARNasa (N.° Cat M6101); 2U/reacción; temperatura ambiente; 10 minutos.See Figure 4 for a DNase that efficiently removes DNA and does not negatively impact RNA signals. In Figure 4, DNase was added to the PCR reagents which were subsequently combined with the PCR master mix (dashed line). As the control, DNase was not added to the PCR reagents (solid line). The extracted nucleic acids were assayed with the PCR master mix, where the beta globin DNA signal and the HIV and IC RNA signals were detected. a) Beta globin DNA signal, to demonstrate the efficacy of DNase treatment; b) HIV RNA signal, to demonstrate the impact of DNase treatment, c) IC RNA signal, to demonstrate the impact of DNase treatment. Conditions used for DNase treatment: Promega RQ1 RNase-free DNase (Cat # M6101); 2U / reaction; room temperature; 10 minutes.

Abbott ha proporcionado un protocolo de la técnica anterior. Este protocolo se optimizó para el modo abierto inicial de CV del VIH-1 de GSS. El protocolo de modo abierto inicial se optimizó al modo abierto actual y para el desarrollo del producto CE. La Tabla 2, presentada a continuación, muestra las diferencias entre el protocolo de la técnica anterior, el protocolo de modo abierto inicial y el protocolo mejorado. Las letras "CE" son la abreviatura de la frase francesa "Conformité Européene", que literalmente significa "Conformidad Europea".Abbott has provided a prior art protocol. This protocol was optimized for the initial open VC mode of GSS HIV-1. The initial open mode protocol was optimized to the current open mode and for CE product development. Table 2, presented below, shows the differences between the prior art protocol, the initial open mode protocol, and the enhanced protocol. The letters "CE" are the abbreviation for the French phrase "Conformité Européene", which literally means "European Conformity".

Tabla 2 Diferencias entre el protocolo de la técnica anterior, el protocolo de modo abierto inicial y el protocolo mejorado. Table 2 Differences between the prior art protocol, the initial open mode protocol, and the enhanced protocol.

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Los cambios en el ensayo tal como se detalla en la Tabla 2, tienen como resultado una enorme, inesperada y sorprendente mejora en comparación con el método de la técnica anterior. La Tabla 3 muestra la mayor sensibilidad lograda por el método de la presente invención. El nivel diana asociado con el 100 % de detección disminuyó desde 10.000 copias por ml en el ensayo de la técnica anterior hasta 2.000 copias por ml cuando se usan los métodos de la presente invención.Changes to the assay as detailed in Table 2 result in a huge, unexpected and surprising improvement compared to the prior art method. Table 3 shows the highest sensitivity achieved by the method of the present invention. The target level associated with 100% detection decreased from 10,000 copies per ml in the prior art assay to 2,000 copies per ml when using the methods of the present invention.

Tabla 3 Véase en la tabla siguiente la comparación del protocolo de modo abierto (condición de elución de GSS TA 20 minutos de la invención con el rotocolo de la técnica anterior en cuanto a la sensibilidad de detección. Table 3 See the table below for the comparison of the open mode protocol (GSS TA 20 minute elution condition of the invention with the prior art rotocol for detection sensitivity.

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Ejemplo 3Example 3

Estudios realizados para mejorar la sensibilidad y robustez del ensayoStudies conducted to improve the sensitivity and robustness of the assay

Con el ensayo en modo abierto inicial, aproximadamente 2-3 % de las muestras internas del estudio y > 5 % de las muestras externas del estudio presentaron los errores 4450 o 4442 del sistema m2000rty, por tanto, eran inválidas. Se determinó que la guanidina residual estaba asociada con una mayor frecuencia de inhibición y con los errores 4450 y 4442. El archivo de especificación de la aplicación de GSS del VIH-1 se modificó para reducir la cantidad y frecuencia del arrastre de guanidina. La reducción de la velocidad de retracción durante la eliminación de los desechos reduce la dispersión de cualquier gota que quede en las puntas de pipeta. Dado que la muestra de GSS está presente en el tampón Wash 1 (tampón de elución de GSS) con 1 ml como entrada de muestra, el volumen del tampón de lisis en la reacción pudo reducirse desde 2400 hasta 1600 pl, reduciendo la cantidad de GITC presente en cada reacción. La eficacia del lavado se incrementó al incrementar el volumen de Wash 2 desde 700 hasta 750 pl. Al implementar estos cambios, se reduce la frecuencia de errores 4450 y 4442 hasta aproximadamente 0,2 % (datos no mostrados). Esta optimización mejoró significativamente la robustez del ensayo.With the initial open-mode assay, approximately 2-3 % of the internal study samples and> 5% of the external study samples exhibited the m2000rt errors 4450 or 4442 , and therefore were invalid. Residual guanidine was found to be associated with higher frequency of inhibition and errors 4450 and 4442. The HIV-1 GSS application specification file was modified to reduce the amount and frequency of guanidine carryover. Reducing the retraction rate during debris removal reduces the scattering of any droplets left on the pipette tips. Since the GSS sample is present in Wash 1 buffer (GSS elution buffer) with 1 ml as sample input, the volume of the lysis buffer in the reaction could be reduced from 2400 to 1600 µl, reducing the amount of GITC present in every reaction. The washing efficiency increased by increasing the volume of Wash 2 from 700 to 750 µl. Implementing these changes reduces the frequency of 4450 and 4442 errors to approximately 0.2% (data not shown). This optimization significantly improved the robustness of the trial.

La sensibilidad del ensayo puede mejorarse aumentando la entrada de la muestra usando dos GSS (gota de sangre seca) de 70 pl por paciente para la prueba. Los datos de evaluación (datos no mostrados) sugirieron que, a una elución a temperatura ambiente, dos GSS comparadas con una GSS mejoraba la tasa de detección del VIH en el extremo inferior. En la condición de elución de 55 °C durante 30 minutos, la mejora de la tasa de detección de concentración baja del VIH de dos GSS comparada con una GSS no fue tan distinta.The sensitivity of the assay can be improved by increasing the sample input by using two 70 pl GSS (dried blood drop) per patient for testing. The evaluation data (data not shown) suggested that, at room temperature elution, two GSS compared to one GSS improved the HIV detection rate at the low end. In the elution condition of 55 ° C for 30 minutes, the improvement in the low concentration HIV detection rate of two GSS compared to one GSS was not that different.

La sensibilidad del ensayo también puede mejorar aumentando la eficiencia de la elución. Se llevó a cabo una comparación directa de una elución a temperatura ambiente durante 20 minutos y una elución a 55 °C durante 30 minutos. Los resultados (Figura 5) sugirieron que el Ct (umbral de ciclo) y la MR (relación máxima) mejoraron significativamente al aumentar la temperatura hasta 55 °C durante 30 minutos. La temperatura de 55 °C y el tiempo se mantuvieron con una banda de guarda (Figuras 6 y 7 respectivamente). Los resultados (Figura 6) mostraron que las temperaturas por encima de 60 °C tienen como resultado valores de MR menores. En general, la MR más alta fue a 55 °C. La Figura 7 mostró que se requerían treinta minutos a 55 °C para una elución de la GSS más eficiente. Después de la incubación a 55 °C durante 30 minutos, una incubación extra a temperatura ambiente hasta 24 horas no afectó a los resultados de la PCR. Además, se realizó una comparación del material de ARN recuperado de la GSS con sangre completa directamente enriquecida con el tampón de muestra entre la temperatura ambiente durante 20 minutos y a 55 °C durante 30 minutos. Los resultados mostraron que la condición de elución a 55 °C aumentó la recuperación en aproximadamente el 10% al compararse con la condición de elución a temperatura ambiente (Tabla 4). La agitación continua de la muestra de GSS en el tampón se combinó con la condición de elución de 55 °C. Los resultados mostraron una ligera mejora en la recuperación del VIH bajo a partir de la GSS; la mejora no fue estadísticamente significativa (datos no mostrados).Assay sensitivity can also be improved by increasing elution efficiency. A direct comparison of an elution at room temperature for 20 minutes and an elution at 55 ° C for 30 minutes was carried out. The results (Figure 5) suggested that Ct (cycle threshold) and MR (maximum ratio) improved significantly with increasing temperature to 55 ° C for 30 minutes. The temperature of 55 ° C and the time were maintained with a guard band (Figures 6 and 7 respectively). The results (Figure 6) showed that temperatures above 60 ° C result in lower MR values. In general, the highest MR was at 55 ° C. Figure 7 showed that thirty minutes at 55 ° C were required for more efficient GSS elution. After incubation at 55 ° C for 30 minutes, an extra incubation at room temperature up to 24 hours did not affect the PCR results. Furthermore, a comparison of the RNA material recovered from the GSS with whole blood directly enriched with the sample buffer was performed between room temperature for 20 minutes and at 55 ° C for 30 minutes. The results showed that the elution condition at 55 ° C increased the recovery by approximately 10% when compared to the elution condition at room temperature (Table 4). Continuous agitation of the GSS sample in the buffer was combined with the 55 ° C elution condition. The results showed a slight improvement in the recovery of low HIV from the GSS; the improvement was not statistically significant (data not shown).

Tabla 4. Cálculo del % de recu eración en com aración con la san re com leta Table 4. Calculation of the% of recovery in comparison with the complete blood

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Se llevó a cabo una evaluación preliminar de la sensibilidad analítica para estimar la sensibilidad utilizando un panel de dilución del VIH-1 (panel lote N.° 2) a 55 °C durante 30 minutos de Garantía de la Calidad en Virología (VQA). También se probó usando VIH-1 inactivado de SeraCare que se cuantificó usando 3 lotes de calibradores. Los calibradores utilizados para la cuantificación se cuantificaron utilizando un panel de dilución del VIH-1 de VQA (panel lote N.° 1). Los resultados se muestran en la Tabla 5. El LOD estimado es aproximadamente de 800 copias/ml.A preliminary analysis of analytical sensitivity was carried out to estimate sensitivity using an HIV-1 dilution panel (panel lot # 2) at 55 ° C for 30 minutes of Virology Quality Assurance (VQA). It was also tested using inactivated HIV-1 from SeraCare which was quantified using 3 lots of calibrators. The calibrators used for quantitation were quantified using a VQA HIV-1 dilution panel (panel lot # 1). The results are shown in Table 5. The estimated LOD is approximately 800 copies / ml.

Tabla 5. Estimación de la sensibilidadTable 5. Sensitivity estimation

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continuacióncontinuation

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Actualmente hay múltiples tarjetas de papel comercialmente disponibles para GSS. Es importante demostrar que los rendimientos son comparables. Se llevó a cabo un estudio para realizar una comparación entre sí de las tarjetas de papel de GSS de 3 proveedores diferentes. Se utilizaron múltiples lotes de tarjetas de papel de las disponibles. Los resultados se resumen en la Tabla 6. El rendimiento basado en un Ct de concentración del VIH baja, la MR y la tasa de detección fueron similares. Las diferencias no fueron estadísticamente significativas.There are currently multiple paper cards commercially available for GSS. It is important to show that the returns are comparable. A study was carried out to compare the GSS paper cards from 3 different suppliers with each other. Multiple lots of paper cards were used from those available. The results are summarized in Table 6. The performance based on low HIV concentration Ct, MR, and detection rate were similar. The differences were not statistically significant.

T l . m r i n l l if rn r v rT l. m r i n l l if rn r v r

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Claims (11)

REIVINDICACIONES 1. Un método automatizado para detectar ácidos nucleicos del VIH-1 en una muestra de sangre, comprendiendo el método:1. An automated method for detecting HIV-1 nucleic acids in a blood sample, the method comprising: a) proporcionar: i) una muestra de sangre que se sospecha infectada con VIH secada en un soporte sólido, ii) un tampón de elución, iii) un instrumento de preparación de las muestras automatizado, programable, iv) un instrumento de PCR automatizado, programable, v) ADNasa y vi) reactivos de PCR adecuados para la detección de ácidos nucleicos del VIH-1;a) provide: i) a blood sample suspected of being infected with HIV dried on a solid support, ii) an elution buffer, iii) an automated, programmable sample preparation instrument, iv) an automated PCR instrument, programmable, v) DNase and vi) PCR reagents suitable for the detection of HIV-1 nucleic acids; b) eluir la muestra de sangre del soporte sólido con el tampón de elución para crear una muestra eluida;b) eluting the blood sample from the solid support with the elution buffer to create an eluted sample; c) cargar automáticamente la muestra eluida en el instrumento de preparación de las muestras automatizado, programable para la extracción y purificación posterior de ácidos nucleicos para crear una muestra procesada; d) cargar los reactivos de PCR en el instrumento de PCR automatizado, programable;c) automatically loading the eluted sample into the automated, programmable sample preparation instrument for subsequent extraction and purification of nucleic acids to create a processed sample; d) loading the PCR reagents into the automated, programmable PCR instrument; e) iniciar un programa automatizado para dispensar alícuotas de los reactivos de PCR en la muestra procesada; f) llevar a cabo la PCR en los ácidos nucleicos extraídos en la muestra procesada con el instrumento de PCR automatizado, programable;e) initiating an automated program to dispense aliquots of the PCR reagents into the processed sample; f) carrying out the PCR on the nucleic acids extracted in the sample processed with the automated, programmable PCR instrument; g) analizar los resultados de la PCR generados por el instrumento de PCR automatizado, programable para determinar si alguna muestra comprende ácidos nucleicos del VIH-1;g) analyzing the PCR results generated by the automated, programmable PCR instrument to determine if any sample comprises HIV-1 nucleic acids; h) en donde, dicho tampón de elución comprende aproximadamente GITC 3,5 M, aproximadamente polisorbato 205 %, aproximadamente KOAc 50 mM a aproximadamente pH 6,0;h) wherein said elution buffer comprises about 3.5M GITC, about 205% polysorbate, about 50mM KOAc at about pH 6.0; i) en donde, opcionalmente, la ADNasa se añade a una o más de las muestras procesadas, los reactivos de PCR, o la reacción de PCR completa después de la adición de los reactivos de PCR a la muestra procesada. i) wherein, optionally, DNase is added to one or more of the processed samples, the PCR reagents, or the entire PCR reaction after the addition of the PCR reagents to the processed sample. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende adicionalmente controles negativos y positivos.2. The method of claim 1, wherein the method further comprises negative and positive controls. 3. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa b) dura alrededor de 20 minutos a temperatura ambiente. 3. The method of claim 1, wherein step b) lasts for about 20 minutes at room temperature. 4. El método de la reivindicación 3, en donde la etapa b) se realiza con mezclado intermitente suave.The method of claim 3, wherein step b) is performed with gentle intermittent mixing. 5. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa b) dura alrededor de 30 minutos a alrededor de 55 °C.5. The method of claim 1, wherein step b) lasts for about 30 minutes at about 55 ° C. 6. El método de la reivindicación 5, en donde la etapa b) se realiza con mezclado intermitente suave.The method of claim 5, wherein step b) is performed with gentle intermittent mixing. 7. El método de la reivindicación 1, en donde dicho procedimiento automatizado está programado por comandos de software.The method of claim 1, wherein said automated procedure is programmed by software commands. 8. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa i) se lleva a cabo y dicha ADNasa no requiere tampones de reacción de ADNasa específicos, es efectiva a temperatura ambiente o a las temperaturas utilizadas durante las etapas cíclicas de la PCR, degrada eficazmente el ADN en el periodo de tiempo de 30 minutos, no necesita inactivarse después de degradar eficazmente el ADN y no impacta negativamente en la detección de secuencias de ARN.The method of claim 1, wherein step i) is carried out and said DNase does not require specific DNase reaction buffers, is effective at room temperature or at the temperatures used during cyclic PCR steps, degrades efficiently DNA in the 30 minute time period, does not need to be inactivated after effectively degrading DNA, and does not negatively impact the detection of RNA sequences. 9. El método de la reivindicación 1, en donde dicho soporte sólido es papel de filtro.9. The method of claim 1, wherein said solid support is filter paper. 10. El método de la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico es ARN.10. The method of claim 1, wherein said nucleic acid is RNA. 11. El método de la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico es ADN pro-viral. The method of claim 1, wherein said nucleic acid is pro-viral DNA.
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