ES2791627T3 - Métodos y kits para el pronóstico del cáncer colorrectal - Google Patents

Métodos y kits para el pronóstico del cáncer colorrectal Download PDF

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Abstract

Un método para predecir el desenlace de un paciente que padece cáncer colorrectal, para seleccionar un tratamiento adecuado en un paciente que padece cáncer colorrectal o para seleccionar un paciente que es probable que se beneficie de terapia adyuvante después de la resección quirúrgica del cáncer colorrectal que comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 en una muestra de dicho paciente, donde niveles de expresión aumentados de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo del paciente, de que el paciente es candidato para recibir terapia después de un tratamiento quirúrgico o de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico, o donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a valores de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo del paciente, de que el paciente no es candidato para recibir terapia después de un tratamiento quirúrgico o de que es improbable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y kits para el pronóstico del cáncer colorrectal
Campo de la invención
La invención se refiere al campo del diagnóstico y, más en particular, a métodos para predecir el riesgo de recaída de los pacientes con cáncer, así como a métodos para proporcionar medicina personalizada a dichos pacientes. La invención se refiere también a kits para llevar a cabo los métodos diagnósticos y de medicina predictiva.
Antecedentes de la invención
El cáncer colorrectal (CCR) es una de las neoplasias más frecuentes en el mundo occidental, es la tercera causa de muerte en los hombres, después del cáncer de pulmón y cáncer de próstata y es el segundo en frecuencia entre las mujeres, después del cáncer de mama. El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común en los hombres (663.000 casos, el 10,0% del total) y el segundo en mujeres (571.000 casos, el 9,4% del total) en todo el mundo. Se estiman unas 608.000 muertes por cáncer colorrectal en todo el mundo, lo que representa el 8% de las muertes por cáncer, por lo que es la cuarta causa más común de muerte por cáncer. (GLOBOCAN.iarc.fr)
La principal opción de tratamiento para el cáncer colorrectal es la cirugía, con o sin quimioterapia y/o radioterapia adyuvante, dependiendo del estadio individual en que se encuentre el paciente y otros factores médicos.
La selección de un tratamiento adecuado es fundamental tanto para el paciente como por razones económicas. Para la supervivencia del paciente, es esencial saber cuándo utilizar de inmediato un protocolo de tratamiento pesado y agresivo para prevenir la extensión de un cáncer colorrectal maligno. De otra manera, la supervivencia del paciente puede verse comprometida. Por el contrario, realizar un tratamiento pesado y agresivo cuando no es necesario es altamente perjudicial para el paciente. Estos tratamientos someten a los pacientes a un grado de molestias e inconvenientes derivados de la toxicidad adversa que puedan afectar significativamente a la calidad de vida del paciente. Cabe destacar que cada paciente incurre en una posibilidad de uno en 400 de que el tratamiento se traduzca en toxicidad letal. Además, los tratamientos pesados y agresivos suelen ser muy costosos y, por tanto, se deben realizar sólo cuando sea necesario.
En la actualidad, la selección del tratamiento se basa en el estadio del tumor, que se realiza generalmente usando la prueba de Tumor/Ganglios/Metástasis (TNM, por sus siglas en inglés) del American Joint Committee on Cancer (AJCC). El sistema TNM asigna un número en base a tres categorías. “T” indica el grado de invasión de la pared intestinal, “N” el grado de implicación del ganglio linfático, y “M” el grado de metástasis. El estadio de un cáncer se suele citar como un número I, II, III, IV derivado del valor de TNM agrupado por pronóstico; un número más alto indica un cáncer más avanzado y probablemente un peor desenlace.
Aunque la clasificación del AJCC proporciona información valiosa sobre el estadio en que se ha diagnosticado el cáncer colorrectal, no da información sobre la agresividad del tumor y su utilidad para el pronóstico es limitada. Mientras que está claro que los pacientes en estadio IV tienen mal pronóstico, el diagnóstico de cáncer colorrectal en un estadio temprano no excluye la posibilidad de que el tumor se pueda desarrollar muy rápidamente. En particular, se desconocen las causas por las que de un 20 a un 40 por ciento de los pacientes con cáncer colorrectal en estadio II (es decir, cáncer temprano ni con metástasis ni con invasión de los ganglios linfáticos en el diagnóstico) empeoran rápidamente y mueren. Algunos estudios sugieren que un subgrupo de pacientes con alto riesgo de cáncer de colon en estadio II se podrían beneficiar de la terapia adyuvante (grupo colaborador de Quasar et al, Lancet 2007; 370:2020-2029). Sin embargo, las variables histopatológicas, tales como las características de alto riesgo en la enfermedad en estadio II, son sólo directrices en la terapia de estratificación. Cuando los ganglios linfáticos son invadidos por las células tumorales, los resultados de las pruebas TNM predicen un mal pronóstico y el paciente suele ser sometido a cirugía seguida de quimioterapia pesada. Los estudios clínicos muestran que por cada 25 pacientes identificados como de alto riesgo en CCR en estadio II, 20 se curan, independientemente de si reciben o no tratamiento (grupo colaborador de Quasar et al, Lancet 2007;. 370:2020-2029). Del mismo modo, un subgrupo de pacientes con cáncer de colon en estadio III tratados sólo con cirugía no recaen en 5 años, incluso sin tratamiento adyuvante (Ranghammar et al, Acta Oncologica 2001; 40: 282-308). La quimioterapia adyuvante es la recomendación estándar para CCR en estadio III, sin embargo, la identificación prospectiva de este subgrupo de pacientes con cáncer de colon en estadio III podría hacer que se prescindiera de la terapia. Por tanto, un método exacto y fiable que identificara a los pacientes en mayor y menor riesgo (por ejemplo, cáncer de colon en estadio II de “alto riesgo” y en estadio III de “bajo riesgo”) podría mejorar la selección de la terapia individualizada dentro de estos grupos.
Por esta razón, se han descrito varios métodos para predecir el resultado de los pacientes que padecen cáncer colorrectal en base a los niveles de expresión de marcadores moleculares.
Sin embargo, a pesar de las investigaciones realizadas sobre este tema, hoy en día hay muy pocos marcadores tumorales que sean útiles desde el punto de vista clínico, tanto para el diagnóstico del CCR como para determinar el estadio de un carcinoma CCR. Una prueba capaz de cuantificar la probabilidad del paciente de beneficiarse de la quimioterapia para identificar de forma más precisa pacientes en estadio III sería de gran utilidad. Un paciente con un bajo riesgo de recidiva similar al de un paciente en estadio II y una baja probabilidad de beneficiarse de la quimioterapia podría optar por renunciar a la quimioterapia. Un paciente con un riesgo alto de recidiva y una baja probabilidad de beneficiarse de quimioterapia con 5-FU podría elegir un tratamiento alternativo.
Por tanto, hay una necesidad en la técnica para marcadores o paneles de marcadores que permitan el diagnóstico de CCR y la clasificación del estadio de los carcinomas colorrectales con una alta fiabilidad.
Eschrich, S. et al. (Journal of Clinical Oncology, 2005, vol. 23 (15): 3526-3535) y Frederiksen, C. M. et al. (Journal of Cancer Research, 2003, vol. 129 (5): 263-271) proporcionan microarrays para el análisis de la expresión del genoma completo de genes para la predicción de la supervivencia en pacientes con cáncer colorrectal y para clasificar los cánceres colorrectales B y C de Dukes, respectivamente. Además, Zhang, B. et al. (Cancer Letters, 2009, vol. 277 (1): 114-120) revelan que un nuevo inhibidor de la quinasa dual de los receptores de TGF-beta tipo I y tipo II, LY2109761, inhibe la activación mediada por TGF-beta de las vías Smad y no Smad en células CT26 de adenocarcinoma de colon que tienen mutación K-Ras (ver documento, figuras 4, 5). El inhibidor atenúa los efectos oncogénicos de TGF-beta sobre la migración celular, la invasión y la tumorigenicidad de las células CT26. Además, LY2109761 disminuye las metástasis hepáticas y prolonga la supervivencia en un modelo de metástasis experimental. Por otro lado, Korpal, M. et al. (European Journal of Cancer, 2010, vol. 46 (7): 1232-1240) enseñan que los tumores en estadio avanzado producen niveles excesivos de TGF-beta con efectos pro-metastásicos. La Tabla 1 de este documento resume las estrategias para inhibir la vía del TGF-beta como tratamiento para los cánceres metastásicos utilizando inhibidores de moléculas pequeñas, anticuerpos, trampas ligando de receptor soluble.
Por tanto, un método exacto y fiable que identifique a los pacientes en mayor y menor riesgo (por ejemplo, cáncer de colon en estadio II de “alto riesgo” y en estadio III de “bajo riesgo”) podría mejorar la selección de la terapia individualizada dentro de estos grupos.
Compendio de la invención
En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para predecir el desenlace de un paciente que padece cáncer colorrectal, para seleccionar un tratamiento adecuado para un paciente que padece cáncer colorrectal o para la selección de un paciente que es probable que se beneficie de la terapia adyuvante después de la resección quirúrgica de cáncer colorrectal que comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 en una muestra de dicho paciente, en donde un nivel de expresión aumentada de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo del paciente, de que el paciente es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a valores de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo del paciente, de que el paciente no es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es improbable que el paciente se beneficie de terapia después del tratamiento quirúrgico.
En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 y, opcionalmente, reactivos para la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes de mantenimiento.
En aún otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de un kit según la invención para predecir el desenlace de un paciente que padece cáncer colorrectal o para determinar si un paciente que padece cáncer colorrectal es candidato para quimioterapia o radioterapia después de la cirugía.
En otro aspecto, la invención se refiere a un inhibidor de TGF-beta para su uso en el tratamiento o la prevención de una metástasis de cáncer colorrectal.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Muestra que hay un incremento en la señalización de TGF-p en la transición adenoma-carcinoma durante la evolución del CCR. Los niveles de ARNm de TGFB1, 2 y 3 están aumentados en muestras de CCR (•) en comparación con adenomas (o). Cada punto representa una muestra de un paciente en una escala log2 (***: p<0,001, prueba de Student).
Figura 2: Muestra que la señalización de TGF-beta actúa preferentemente sobre el componente estromal de CCR. A. Clasificación de muestras de adenoma (n = 25) y CCR (n = 30) analizadas según la distribución e intensidad de la reactividad de p-SMAD3 nuclear en células epiteliales y estromales. Mientras que el estroma de la mayoría de los adenomas contenía pocas células altamente positivas para p-SMAD3 y se teñían débilmente en general, se caracterizaron una gran cantidad de CCR (63%) por una abundancia de células estromales con tinción con p-SMAD3 nuclear fuerte, indicativa de señalización de TGF-beta activa en estas células. B Positividad de p-SMAD3 relativa en células estromales frente a epiteliales de la figura 2. Los puntos representan muestras. Valor de p calculado usando la prueba exacta de Fisher.
Figura 3: Muestra análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA, “gene set enrichment analyses") de las firmas de respuesta a TGF-beta (TBRS, “TGF-beta response signatures") de fibroblastos (F-TBRS), células T (T-TBRS), macrófagos (Ma-TBRS) o células endoteliales (End-TBRS) en muestras de carcinoma frente a adenoma. ES: puntuación de enriquecimiento, NES: puntuación de enriquecimiento normalizado, FDR: índice de falso descubrimiento. Todas las TBRS estromales están altamente enriquecidas en muestras de CCR en comparación con adenomas.
Figura 4: Genes que predicen recidiva entre las firmas de respuesta a TGF-beta de fibroblastos (F-TBRS), células T (T-TBRS), macrófagos (Ma-TBRS) o células endoteliales (End-TBRS) se expresan altamente en fibroblastos asociados a cáncer estromal, y en células endoteliales purificadas de muestras de pacientes de CCR. Los bigotes representan valores mínimos y máximos, truncados a 1,5 veces el intervalo intercuartílico. (log2; *: p<0,05, **: p<0,01, prueba de la t de Student).
Figura 5: Se obtuvieron genes inducidos por TGF-beta mediante análisis de micromatrices de fibroblastos de colon humano normales CCD-co-18, fibroblastos asociados a adenoma (AAF) y fibroflastos asociados a carcinoma colorrectal (CAF) tratados o no con TGF-beta. Se indentificaron firmas de respuesta a TGF-beta individuales para cada población seleccionando genes con valor de p de limma < 0,05 y regulación por incremento de al menos dos veces en fibroblastos tratados con TGF-beta. Se perfeccionó adicionalmente el clasificador analizando su expresión diferencial en poblaciones de células purificadas mediante FACS de pacientes de CCR (conjuntos de datos GEO GSE39396 y GSE39395). Se definieron genes expresados específicamente en fibroblastos asociados a cáncer (FAP+) como los regulados por incremento con valor de p de limma < 0,05 (Smyth et al., 2004, Linear Models for Microarray, User's Guide) en las tres comparaciones de poblaciones de células fAp + frente a CD31+ (endoteliales), FAP+ frente a CD45+ (leucocitos) y FAP+ frente a EPCAM+ (epiteliales). Se definieron genes específicos para células endoteliales (CD31+) de manera análoga. Además, se restó del clasificador cualquier gen que aparecía en la publicación Calon et al., Cancer Cell 2012, 22: 1-14). Este análisis produjo una firma de 73 genes anotados (134 sondas; TBRS de esta invención) de los que se derivaron factores pronósticos específicos.
Figura 6: Muestra que la expresión de la firma comprendida por FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 presenta un efecto incremental sobre el riesgo de recidiva. Para cada incremento en la expresión global (+1 desviación estándar) de los cuatro genes, el riesgo de recidiva del cáncer aumentó en un 93% (p<0,0001, HR por 1 desviación estándar = 1,93).
Figura 7: Curvas de Kaplan Meier que muestran la supervivencia dependiendo de la expresión media de los 4 factores pronósticos, FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 para todos los pacientes, o para pacientes en estadio II o estadio III.
Figura 8: Curvas de Kaplan Meier que muestran la supervivencia dependiendo de la expresión media de los 5 factores pronósticos FAM46A, FHL2, FOXC2, COL4A1 y FRMD6 para pacientes en estadio II. B. Correlación incremental y aproximadamente lineal entre la expresión de los 5 factores pronósticos FAM46A, FHL2, FOXC2, COL4A1 y FRMD6 y el riesgo de recidiva en todos los pacientes. Para cada incremento en la expresión global (+1 desviación estándar) de los cinco genes, el riesgo de recidiva del cáncer aumentó en un 103% (p<0,0001, HR por 1 desviación estándar = 2,03).
Figura 9: A. Curvas de Kaplan Meier que muestran la supervivencia dependiendo de la expresión media de los 6 factores pronósticos FAM46a , FHL2, fOx C2, COL4A, Sp Ry 4 y DACT3 para pacientes en estadio III. B. Correlación incremental y aproximadamente lineal entre la expresión de los 6 factores pronósticos FAM46A, FHL2, FOXC2, COL4A1 SPRY4 y DACT3 y el riesgo de recidiva en todos los pacientes. Para cada incremento en la expresión global (+1 desviación estándar) de los cinco genes, el riesgo de recidiva del cáncer aumentó en un 110% (p<0,0001, HR por 1 desviación estándar = 2,03).
Figura 10: Validación in silico. A.- Curvas de Kaplan Meier que muestran la probabilidad de permanecer sin enfermedad después de la terapia dependiendo de la expresión media de los 5 factores pronósticos FAM46A, FHL2, FOXC2, COL4A1 y FRMD6 para pacientes en estadio II de una cohorte completamente independiente de pacientes de CCR en estadio II (GSE33113). B. Muestra que la expresión de los 5 factores pronósticos FAM46A, FHL2, FOXC2, COL4A1 y FRMD6 presenta un efecto incremental sobre el riesgo de recidiva en esta cohorte. Para cada incremento en la expresión global (+1 desviación estándar) de los cinco genes, el riesgo de recidiva del cáncer aumentó en un 104% (p=0,0008, HR por 1 desviación estándar = 2,04).
Figura 11: Validación in silico en una tercera cohorte independiente. A.- Diagramas de cajas que muestran expresión de firma media superior de genes FAM46A, FHL2, FOXC2, COL4A1 y FRMD6 en pacientes que experimentan metástasis después del tratamiento curativo en pacientes de CCR en estado II del conjunto de datos GSE26906. Los bigotes representan valores mínimos y máximos (log2; p<0,05), truncados a 1,5 veces el intervalo intercuartílico. Figura 12: Muestra que la inhibición farmacológica de la señalización de TGF-beta estromal bloquea el inicio de la metástasis. A. Curvas de Kaplan Meier que muestran la supervivencia sin tumor a lo largo del tiempo para ratones a los que se les inyectaron por vía subcutánea células madre de cáncer de colon derivadas de un paciente en estadio IV, tratados o no con un inhibidor de TGF beta (LY2157299). Los ratones recibieron LY2157299 o vehículo desde tres días antes de la inoculación hasta el sacrificio (n=12) B. Bioluminiscencia a lo largo del tiempo tras la inoculación intraesplénica de 5 x 105 células madre de cáncer de colon derivadas de un paciente en estadio IV en ratones NSG tratados como en A. Las intensidades se normalizaron al día 0 y se fijaron arbitrariamente a 100. Los valores son la media ±EEM (*: p<0,05).
Descripción detallada de la invención
Métodos de pronóstico de la invención
Los autores de la presente invención han identificado un conjunto de genes que proporcionan un método fiable para la identificación de pacientes con CCR con menor y mayor riesgo de padecer recaída (por ejemplo, cáncer de colon en estadio II de “alto riesgo” y en estadio III de “bajo riesgo”). Por ejemplo, como se muestra en el ejemplo 2 de la solicitud, se derivó un conjunto de genes que se expresan diferencialmente en respuesta a la administración de TGF-beta en o bien fibroblastos de colon normales (CCD), fibroblastos asociados a adenoma (AAF) y/o bien fibroblastos asociados a carcinoma (CAF) y que se expresan específicamente en fibroblastos asociados a cáncer (FAP+) y en células endoteliales tumorales con el fin de encontrar subconjuntos de factores pronósticos. Mediante el perfeccionamiento adicional de la firma anterior, los autores de la presente invención han seleccionado un pequeño subconjunto de genes de la firma de genes inicial que permite predecir el riesgo de recidiva, incluyendo tanto el riesgo de recidiva de los tumores primarios así como el riesgo de padecer metástasis. Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método (en adelante “método pronóstico de la invención”) para predecir el desenlace de un paciente que padece cáncer colorrectal que comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2, y COL4A1 en una muestra de dicho paciente en donde un nivel de expresión aumentado de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo del paciente o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a valores de referencia para dichos genes es un indicador de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo del paciente.
El término “predecir el desenlace”, se utiliza en el presente documento para referirse a la probabilidad de que un paciente tenga un desenlace clínico particular, ya sea positivo o negativo. Los métodos de predicción de la presente invención se pueden usar clínicamente para tomar decisiones sobre la elección del tratamiento más adecuado para cualquier paciente particular. Los métodos de predicción de la presente invención son herramientas valiosas para predecir si es probable que un paciente responda favorablemente a una pauta de tratamiento, tal como quimioterapia. La predicción puede incluir factores pronósticos.
Como comprenderán los expertos en la materia, la predicción, aunque se preferiría, no tiene que ser correcta para el 100% de los sujetos que se van a diagnosticar o evaluar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos puedan ser identificados como que tienen una probabilidad aumentada de tener un desenlace determinado. Si un sujeto es estadísticamente significativo lo puede determinar sin más el experto en la materia, usando diferentes herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, la determinación de los intervalos de confianza, la determinación del valor de p, validación cruzada de índices de clasificación y similares, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, Wiley, John & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95%. Los valores de p son, preferentemente, 0,01, 0,005 o menores.
El término “paciente”, como se usa en el presente documento, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el paciente es un ser humano hombre o mujer de cualquier edad o raza.
El término “cáncer colorrectal” se utiliza en su sentido más amplio y se refiere a (1) todas los estadios y todas las formas de cáncer que se origina de las células epiteliales del intestino grueso y/o el recto y/o (2) todos los estadios y todas las formas de cáncer que afectan al revestimiento del intestino grueso y/o el recto. En los sistemas de determinación de estadios usados para la clasificación del cáncer colorrectal, el colon y el recto se tratan como un solo órgano.
En una forma de realización preferida, el paciente presenta un estadio I, un estadio II, un estadio III o un estadio IV, en el que el estadio I se define como T1 N0 M0 o T2 N0 M0, el estadio II se define como T3 N0 M0 o T4 N0 M0, el estadio III se define como cualquier T, N1-2, M0 y el estadio IV corresponde a cualquier T, cualquier N, M1. Según el sistema de estadios de tumor/ganglio/metástasis (TNM) del American Joint Committee on Cancer (AJCC) (Greene et al. (eds.), AJCC Cancer Staging Manual. 6a ed. Nueva York, NY: Springer, 2002), los distintos estadios del cáncer colorrectal se definen como sigue:
- Tumor: T1: el tumor invade la submucosa, T2: el tumor invade la muscularis propria, - T3: el tumor invade a la muscularis propria en la subserosa, o los tejidos pericólicos o perirrectales; T4: El tumor invade directamente otros órganos o estructuras, y/o perfora.
- Ganglio: N0: No hay metástasis a los ganglios linfáticos regionales; N1: metástasis en 1 a 3 ganglios linfáticos regionales, N2: Metástasis en 4 o más ganglios linfáticos regionales.
- Metástasis: M0: Metástasis distante mp; M1: metástasis distante presente.
En una forma de realización preferida, el paciente cuyo desenlace se predice es un paciente que ha sido diagnosticado con cáncer colorrectal y que ha tenido una resección quirúrgica del cáncer. En una forma de realización preferida, el paciente ha tenido una resección quirúrgica de un tumor en estadio I, de un tumor en estadio II, de un tumor en estadio III o de un tumor en estadio IV.
En la presente invención, el término “muestra” o “muestra biológica”, se refieren el material biológico aislado de un sujeto. La muestra biológica puede contener cualquier material biológico adecuado para detectar el biomarcador deseado y puede comprender células y/o material no celular del sujeto. La muestra se puede aislar de cualquier tejido o fluido biológico adecuado, tal como por ejemplo, tejido de la próstata, sangre, plasma sanguíneo, suero, orina, líquido cefalorraquídeo (LCR) o heces. Las muestras utilizadas para la determinación de los genes marcadores son preferiblemente muestras de tejido colorrectal obtenidas por biopsia.
De forma alternativa, las muestras son muestras de biofluidos. Los términos “fluido biológico” y “biofluido” se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a fluidos acuosos de origen biológico.
El biofluido se puede obtener de cualquier localización (tales como sangre, plasma, suero, orina, bilis, líquido cefalorraquídeo, humor vítreo o acuoso, o cualquier secreción corporal), un exudado (como el líquido obtenido de un absceso o cualquier otro sitio de infección o inflamación), o el líquido obtenido de una articulación (tal como una articulación normal o una articulación afectada por una enfermedad como la artritis reumatoide).
En un primer paso, el primer método de la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 en una muestra de dicho paciente.
El término “FAM46A”, como se usa en el presente documento, se refiere a la familia con similitud de secuencia 46, miembro A, también conocido como marco de lectura abierto 37 encontrado en el cromosoma 6 (C6orf37), también conocido como XTP11, proteína del gen 11 transactivado en el cromosoma X del VHB o FLJ20037. El ARNm de FAM46A humano se representa con el número de acceso NM_017633.2 en la base de datos GenBank.
El término “FHL2”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína 2 de cuatro dominios LIM y medio, también conocida como AAG11, DRAL, FHL-2, SLIM-3 o SLIM3. Las diferentes variantes de transcritos del gen FHL2 humano se representan en la base de datos GenBank con los números de acceso NM_001450.3, NM_201555.1, NM_001252612.1, NM_201557.3, NM_001039492.2.
El término “FOXC2”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína de caja Forkhead C2, también conocida como proteína relacionada con Forkhead FKHL14 (FKHL14), factor de transcripción FKH-14 o proteína 1 Forkhead del mesénquima (MFH1). El ARNm de FOXC2 se representa con el número de acceso NM_005251.2 en la base de datos GenBank.
El término “COL4A1”, como se usa en el presente documento, se refiere a la cadena alfa-1 de colágeno tipo IV, también conocida como arresteno, HANAC o POREN1. El ARNm de COL4A1 humano se representa con el número de acceso NM_001845.4 en la base de datos GenBank.
En una realización preferida, el primer método de la invención comprende además la determinación de los niveles de expresión del gen FRMD6, en donde el paciente es un paciente que padece cáncer colorrectal en estadio II, y en donde niveles de expresión aumentados de FRMD6 con respecto a un valor de referencia para dicho gen es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo o en donde niveles de expresión disminuidos de FRMD6 con respecto a un valor de referencia para dicho gen es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo.
El término “FRMD6”, como se usa en el presente documento, se refiere al dominio FERM que contiene 6, también conocido como EX1, Willin, C14orf31, MGC17921, c14_5320. El ARNm de FRMD6 humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso AL079307.7.
En otra realización preferida, el primer método de la invención comprende además la determinación de los niveles de expresión de los genes SPRY4 y DACT3 y en donde el paciente es un paciente que padece cáncer colorrectal en estadio III, y en donde niveles de expresión aumentados de SPRY4 y DACT3 con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo o en donde niveles de expresión disminuidos de SPRY4 y DACT3 con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo.
El término “SPRY4”, como se usa en el presente documento, se refiere al homólogo 4 de proteína sprouty. Las diferentes variantes de transcritos del gen SPRY4 humano se representan en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_030964.3 y NM_001127496.1.
El término “DACT3”, como se usa en el presente documento, se refiere a dapper, antagonista de beta-catenina, homólogo 3, también conocido como RRR1 o región 1 rica en arginina. El ARNm de MEX3B humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_145056.2.
Por otra parte, además de la determinación de los marcadores mencionados anteriormente, el método según la invención también puede comprender la determinación de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en ACTC1, BOC, CNN1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FILIP1L, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2, y en donde niveles de expresión aumentados de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo o en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo.
El término “ACTC1”, como se usa en el presente documento, se refiere a la actina, de músculo cardiaco alfa 1, también conocida como ACTC, ASD5, CMD1R, CMH11 o LVNC4. El ARNm de ACTC1 humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_005159.4.
El término “BOC”, como se usa en el presente documento, se refiere al homólogo de proteína Brother de CDO. El ARNm de BOC humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_033254.2.
El término “CNN1”, como se usa en el presente documento, se refiere a la calponina 1, básica, de músculo liso, también conocida como Sm-Calp o SMCC. El ARNm de CNN1 humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_001299.4.
El término “COMP”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína de matriz oligomérica de cartílago, también conocida como EDM1, EPD1, MED, PSACH o THBS5. El ARNm de COMP humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_000095.2.
El término “CRISPLD2”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína 2 que contiene dominio LCCL de proteína secretora rica en cisteína, también conocida como CRISP11 o lCr ISP2. El ARNm de CRISPLD2 humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_031476.3.
El término “CRYAB”, como se usa en el presente documento, se refiere a la cadena B de alfa-cristalina, también conocida como KIR o MGC26294. El ARNm de CRYAB se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_001885.1.
El término “FAM101B”, como se usa en el presente documento, se refiere a la familia con similitud de secuencia 101, miembro B, también conocida como IRP o INT1L1. El ARNm de WNT2 humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NC_000007.13 (complemento de las posiciones 116916685 a 116963343). El término “FILIP1L”, como se usa en el presente documento, se refiere al gen similar a proteína 1 de interacción con filamina A, también conocido como DOC-1, DOC1 o GIP90. Las diferentes variantes de transcritos del gen FILIP1LM humano se representan en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_182909.2, NM_014890.2 y NM_001042459.1.
El término “GAS7”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína 7 específica de detención del crecimiento, también conocida como m Ll/GAS7. Las diferentes variantes de transcritos del gen de GAS7 humano se representan en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_003644.2, NM_201432.1, NM_201433.1 y NM_001130831.1.
El término “GFPT2”, como se usa en el presente documento, se refiere a glutamina-fructosa-6-fosfato transaminasa 2, también conocida como glutamina fructosa-6-fosfato aminotransferasa 2, hexosafosfato aminotransferasa 2, D-fructosa-6-fosfato amidotransferasa 2 o glutamina:fructosa 6 fosfato amidotransferasa 2. El ARNm de GFPT2 humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_005110.2.
El término “GLIS3”, como se usa en el presente documento, se refiere al dedo de zinc 3 de familia GLIS, también conocido como ZNF515. Las diferentes variantes de transcritos del gen GLIS3 humano se representan en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_001042413.1 y NM_152629.3.
El término “HS3ST3A1”, como se usa en el presente documento, se refiere a heparán sulfato glucosamina 3-O-sulfotransferasa 3A1, también conocida como 30ST3A1, 3OST3A1, heparina-glucosamina 3-O-sulfotransferasa, 3-OST-3A, h3-OST-3A; heparán sulfato 3-O-sulfotransferasa 3A1 o heparán sulfato D-glucosaminil 3-O-sulfotransferasa 3A1. El ARNm de HS3ST3A1 humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_006042.1.
El término “KIRREL”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína 1 similar a Kin of IRRE, también conocida como NEPH1, proteína 1 similar a nefrina o proteína 1 similar a Kin of Irregular Chiasm. El ARNm de KIRREL humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_018240.5.
El término “LRRC15”, como se usa en el presente documento, se refiere a proteína 15 que contiene repeticiones ricas en leucina, también conocida como LIB, el precursor de la isoterma b está codificado por la variante de transcrito 2, proteína de repeticiones ricas en leucina inducida por beta amiloide, proteína 15 que contiene repeticiones ricas en leucina, hLib y proteína de repeticiones ricas en leucina inducida por homólogo de beta amiloide. Las diferentes variantes de transcritos del ARNm de LRRC15 se representan en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_001135057.2 y NM_130830.4.
El término “LTBP2”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína 2 de unión al factor de crecimiento transformante beta latente, también conocida como C14orf141, GLC3D, LTBP3, MSPKA, MSTP031 y WMS3. El ARNm de NGF se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_000428.2. El término “MFAP2”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína 2 asociada a microfibrillas, también conocida como MAGP, MAGP-1 y MAGP1. Las diferentes variantes de transcritos del gen MFAP2 humano se representan en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_017459.2, NM_002403.3, NM_001135247.1 y NM_001135248.1.
El término “NNMT”, como se usa en el presente documento, se refiere a nicotinamida N-metiltransferasa. El ARNm de NNMT humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_006169.2.
El término “P4HA3”, como se usa en el presente documento, se refiere a prolil 4-hidroxilasa, polipéptido alfa III, también conocida como colágeno prolil 4-hidroxilasa alfa (III), procolágeno-prolina, polipéptido alfa III de 2-oxoglutarato 4-dioxigenasa (prolina 4-hidroxilasa), subunidad alfa-3 de prolil 4-hidroxilasa, C-P4H alfa III, 4-PH alfa-3 o subunidad alfa-3 de procolágeno-prolina 2-oxoglutarato-4-dioxigenasa. El ARNm de P4HA3 humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_182904.3.
El término “PPAPDC1A”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína 1A que contiene dominio de ácido fosfatídico fosfatasa de tipo 2, también denominada DPPL2 o PPAPDC1. El ARNm de PPAPDC1A humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_001030059.1.
El término “PPP1R3C”, como se usa en el presente documento, se refiere a la subunidad 3C reguladora de proteína fosfatasa 1, también conocida como PTG o PPP1R5. El ARNm de PPP1R3C humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_005398.5.
El término “S1PR1”, como se usa en el presente documento, se refiere al receptor 1 de esfingosina-1-fosfato, también conocido como CD363, CHEDG1, D1S3362, ECGF1, EDG-1, S1P1 o EDG1. El ARNm de S1PR1 humano se representa en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_001400.4.
El término “SYNPO2”, como se usa en el presente documento, se refiere a la sinaptopodina-2, también conocida como DKFZp686G051. Las diferentes variantes de transcritos del gen SYNPO2 humano se representan en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_133477.2, NM_001128933.1 y NM_001128934.1.
Se entenderá que el método según la presente invención puede comprender la determinación de cualquier variante polimórfica natural de uno o más de los genes anteriores.
En una forma de realización, el método de la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2, en donde niveles de expresión aumentados de dichos genes con respecto un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo o en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo. El paciente puede ser un paciente de cáncer en estadio II o estadio III.
En una forma de realización, el método de la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, FRMD6, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2, en donde niveles de expresión aumentados de dichos genes con respecto un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo o en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo. El paciente puede ser un paciente de cáncer en estadio II o estadio III.
En otra forma de realización, el método de la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, DACT3, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 SPRY4 y SYNPO2 y en donde niveles de expresión aumentados de dichos genes con respecto un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo o en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo.
El método según la presente invención puede comprender además la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes adicionales que están regulados por incremento mediante TGF beta al menos dos veces en o bien AAF, CAF o bien fibroblastos de mucosa normal y que se expresan específicamente en fibroblastos asociados a cáncer (FAP+; EPCAM- CD45- CD31-) o células endoteliales (CD31+; FAP- EpCAM- CD45-) frente a células epiteliales (EPCAM+; CD45- FAP- CD31-) y leucocitos (CD45+; EPCAM- FAP- CD31-). Por tanto, en otra forma de realización, el método según la invención comprende además la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ADAMTS6, BMP6, CCDC71L, CH25H, CNNM2, CPNE2, CREB3L2, DCBLD1, EFR3B, EGR1, ELN, ENDOD1, FHOD3, FOXC1, FZD8, GBP1, GXYLT2, IGF1, IL4R, ITGA11, JPH2, KIAA1211, KIF26B, LIMK1, LINC00340, LPCAT2, LRRC8A, METTL7A, OLFM2, PID1, PPP1R12B, PRSS23, RASD2, RNF152, SCUBE3, SEC14L2, SERPINE2, SGK1, SH3PXD2A, SHISA2, SMTN, SRGAP1, TRPC6 y UCK2 y de los genes que hibridan específicamente con las sondas que tienen las secuencias SEQ ID NO:1 a 26 en donde niveles de expresión aumentados de dichos genes con respecto a un valor de referencia de dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo o en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo.
La firma de genes que comprende todos los genes que se determinan según los diferentes métodos de la invención se conoce como Str-TBRS y se muestra en la tabla 1. En una realización, la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, ADAMTS6, BMP6, BOC, CCDC71L, CH25H, CNN1, CNNM2, COL4A1, COMP, CPNE2, CREB3L2, CRISPLD2, CRYAB, DACT3, DCBLD1, EFR3B, EGR1, ELN, ENDOD1, FAM101B, FAM46A, FHL2, FHOD3, FILIP1L, FOXC1, FOXC2, FRMD6, FZD8, GAS7, GBP1, GFPT2, GLIS3, GXYLT2, HS3ST3A1, IGF1, IL4R, ITGA11, JPH2, KIAA1211, KIF26B, KIRREL, LIMK1, LINC00340, LPCAT2, LRRC15, LRRC8A, LTBP2, METTL7A, MFAP2, NNMT, OLFM2, P4HA3, PID1, PPAPDC1A, PPP1R12B, PPP1R3C, PRSS23, RASD2, RNF152, S1PR1, SCUBE3, SEC14L2, SERPINE2, SGK1, SH3PXD2A, SHISA2, SMTN, SPRY4, SRGAP1, SYNPO2, TRPC6 UCK2 y de los genes que hibridan específicamente con las sondas que tienen las secuencias SEQ ID NO:1 a 26 en donde niveles de expresión aumentados de dichos genes con respecto a valores de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo del paciente o en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a valores de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo del paciente.
El término “que hibrida específicamente”, como se usa en el presente documento, se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de dos secuencias de polinucleótidos en condiciones muy rigurosas o en condiciones moderadamente rigurosas. Las expresiones “condiciones muy rigurosas” y “condiciones moderadamente rigurosas” se definen posteriormente en relación con el kit de la invención y son igualmente aplicables en el contexto del presente método.
Prácticamente se puede usar cualquier método convencional en el marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de dichos genes marcadores. A modo de ilustración no limitante, los niveles de expresión se determinan mediante la cuantificación de los niveles de ARNm codificado por dichos genes o por medio de la cuantificación de los niveles de proteína.
Los métodos para determinar la cantidad de ARNm son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ácido nucleico contenido en la muestra (por ejemplo, células o tejidos preparados del paciente) se extrae primero según métodos estándar, por ejemplo, usando enzimas líticas o soluciones químicas o extraídas con resinas que se unen a ácidos nucleicos siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARNm extraído se detecta luego por hibridación (por ejemplo, el análisis por transferencia Northern o micromatrices de ADN después convertir el ARNm en un ADNc marcado) y/o amplificación (por ejemplo, RT-PCR). Preferentemente, se prefiere RT-PCR cuantitativa o semi-cuantitativa. RT-PCr en tiempo real cuantitativa o semi-cuantitativa es particularmente ventajosa. Preferiblemente, los pares de cebadores se diseñaron para solapar con un intrón, a fin de distinguir la amplificación de ADNc de la putativa contaminación genómica. El experto puede diseñar fácilmente los cebadores adecuados. Otros métodos de amplificación incluyen reacción en cadena de ligasa (LCR), amplificación mediada por transcripción (TMA), la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) y amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA). Preferiblemente, la cantidad de ARNm se mide por RT-PCR cuantitativa o semi-cuantitativa o RT-PCR en tiempo real cuantitativa o semi-cuantitativa.
De forma alternativa, también es posible determinar los niveles de expresión de los genes marcadores por medio de la determinación de los niveles de expresión de las proteínas codificadas por dichos genes, ya que si la expresión de los genes aumenta, se debe producir un aumento de la cantidad de proteína correspondiente. La determinación de los niveles de expresión de las diferentes proteínas se puede realizar utilizando cualquier método convencional. A modo de ejemplo no limitante, dicha determinación se puede realizar utilizando anticuerpos con capacidad de unirse específicamente a la proteína que se va a determinar (o fragmentos de la misma con los determinantes antigénicos) y posterior cuantificación de los complejos antígeno-anticuerpo resultantes. Los anticuerpos que se van a utilizar en este tipo de ensayo pueden ser, por ejemplo sueros policlonales, sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados. Al mismo tiempo, los anticuerpos pueden estar o no marcados. Ejemplos ilustrativos, pero no exclusivos, de marcadores que se pueden utilizar incluyen isótopos radioactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, cofactores o sustratos de enzimas, inhibidores de enzimas, partículas, colorantes, etc. Hay una amplia variedad de ensayos bien conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, usando anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios); estas técnicas incluyen inmunotransferencia o transferencia Western, ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), RIA (radioinmunoensayo), EIA (inmunoensayo enzimático) competitivo, DAS-ELISA (ELISA sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips o micromatrices de proteínas incluyendo anticuerpos específicos o ensayos basados en la precipitación coloidal en formatos tales como las tiras reactivas. Otras formas de detectar y cuantificar la proteína incluyen las técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligandos, etc.
Una vez que se han determinado los niveles de expresión de los genes anteriores en una muestra de un paciente, los niveles se comparan con valores de referencia para cada uno de dichos genes. Normalmente, los valores de referencia son el nivel de expresión de los genes que se comparan en una muestra de referencia.
Una “muestra de referencia”, como se usa aquí, significa una muestra obtenida de un grupo de sujetos sanos que no tiene un estado de enfermedad o fenotipo particular. Por ejemplo, la muestra de referencia puede incluir muestras de la mucosa del colon de pacientes que no padecen cáncer de colon o que no tienen antecedentes de cáncer de colon. De forma alternativa, la muestra de referencia podría ser una muestra o un conjunto de muestras de cáncer de colon con un bajo riesgo de recidiva. Esta muestra o conjunto de muestras se pueden obtener de pacientes que han tenido una resección quirúrgica del tumor y que no han sufrido una recaída, preferiblemente en ausencia de quimioterapia adyuvante. En otra forma de realización, la muestra de referencia es una muestra de un CCR de tipo I o de un grupo de CCR de tipo I.
Los niveles de expresión de referencia adecuados de los genes se pueden determinar midiendo los niveles de expresión de dichos genes en varios sujetos adecuados, y tales niveles de referencia se pueden ajustar a las poblaciones de sujetos específicas (por ejemplo, un nivel de referencia puede estar relacionado con la edad, por lo que las comparaciones se puede hacer entre los niveles de expresión en las muestras de sujetos de una cierta edad y niveles de referencia para una enfermedad particular, el fenotipo, o falta del mismo en un determinado grupo de edad). En una forma de realización preferida, la muestra de referencia se obtiene de varios sujetos sanos o pacientes sin antecedentes previos de cáncer colorrectal. De forma alternativa, la muestra de referencia es una muestra o un conjunto de muestras de cáncer de colon de pacientes que han tenido una resección quirúrgica del tumor y que no han sufrido una recaída, preferiblemente en ausencia de quimioterapia adyuvante. El experto en la materia apreciará que el tipo de muestra de referencia puede variar dependiendo del método específico que se va a realizar. Así, en el caso de que se lleve a cabo un diagnóstico o pronóstico de la enfermedad, la muestra de referencia puede ser un conjunto de muestras de tejido colorrectal no tumoral, de individuos que no tienen antecedentes de cáncer colorrectal o de un grupo de tejidos distales no tumorales con respecto a los tejidos tumorales respectivos, o una muestra o un conjunto de muestras de cáncer de colon de pacientes que han tenido una resección quirúrgica del tumor y que no han sufrido una recaída, preferiblemente en ausencia de quimioterapia adyuvante. En el caso de que el método de la invención esté dirigido a determinar el efecto de una terapia en un paciente, la muestra de referencia es preferiblemente una muestra obtenida de dicho paciente antes de iniciar el tratamiento.
El perfil de expresión de los genes en la muestra de referencia preferiblemente se puede generar de una población de dos o más individuos. La población, por ejemplo, puede comprender 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más individuos. Además, el perfil de expresión de los genes en la muestra de referencia y en la muestra del individuo que se va a diagnosticar según los métodos de la presente invención se pueden generar del mismo individuo, siempre que los perfiles que se van a ensayar y el perfil de referencia se generen de muestras biológicas tomadas en diferentes momentos y se comparen entre sí. Por ejemplo, se puede obtener una muestra de un individuo en el inicio de un período de estudio. Después se puede comparar un perfil de biomarcador de referencia de esta muestra con los perfiles de biomarcadores generados de muestras posteriores del mismo individuo. En una forma de realización preferida, la muestra de referencia es un conjunto de muestras de varios individuos, y corresponde a porciones de tejido colorrectal que están lejos de la zona del tumor y que se han obtenido preferiblemente en la misma biopsia, pero que no tienen ninguna característica anatomopatológica del tejido tumoral.
Una vez que se han determinado los niveles de expresión de los genes marcadores respecto a los valores de referencia para dichos genes, es necesario identificar si existen alteraciones en la expresión de dichos genes (aumento o disminución de la expresión). La expresión de un gen se considera aumentada en una muestra del sujeto en estudio cuando los niveles aumentan con respecto a la muestra de referencia en al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100%, al menos el 110 %, al menos el 120%, al menos el 130%, al menos el 140%, al menos el 150%, o más. Del mismo modo, la expresión de un gen se considerada disminuida cuando sus niveles disminuyen con respecto a la muestra de referencia en al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100% (es decir, ausente).
Por último, el paciente se clasifica como que tiene riesgo elevado de desenlace negativo, si los genes marcadores muestran niveles de expresión aumentados con respecto a una muestra de referencia y que tiene un bajo riesgo de desenlace negativo, si los genes marcadores muestran niveles de expresión disminuidos con respecto a una muestra de referencia. En una forma de realización preferida, el paciente se clasifica como que tiene riesgo alto de desenlace negativo, si los niveles de expresión del gen es más alto que el nivel de expresión del mismo gen en una muestra o un conjunto de muestras de cáncer de colon de pacientes que han tenido una resección quirúrgica del tumor y que no han sufrido una recaída, preferiblemente en ausencia de quimioterapia adyuvante.
El término “desenlace positivo” en relación a CCR significa una mejora en cualquier medida del estado del paciente, incluyendo esas medidas usadas normalmente en la técnica, tales como un aumento en la duración del intervalo sin recidiva (RFI), un aumento en el tiempo de supervivencia global (SG), un aumento en el tiempo de supervivencia sin enfermedad (DFS), un aumento en la duración del intervalo sin recidiva distante (DRFI), y similares. Un aumento en la probabilidad de un desenlace clínico positivo corresponde a una disminución en la probabilidad de recidiva del cáncer.
El término “desenlace negativo” respecto a CCR significa el empeoramiento en cualquier medida del estado del paciente, incluyendo esas medidas usadas normalmente en la técnica, tales como una disminución en la duración del intervalo sin recidiva (RFI), una disminución en el tiempo de supervivencia global (SG), una disminución en el tiempo de supervivencia sin enfermedad (DFS), una disminución en la duración del intervalo sin recidiva distante (DRFI), y similares. Un aumento en la probabilidad de un desenlace clínico negativo corresponde a un aumento en la probabilidad de recidiva del cáncer.
En una forma de realización preferida, el resultado en un paciente determinado se mide como el riesgo de metástasis o como el riesgo de recidiva.
El término “riesgo de metástasis”, como se usa aquí, se refiere a una evaluación de la posibilidad o probabilidad con respecto a la posibilidad o probabilidad de que un sujeto o individuo pueda desarrollar una enfermedad neoplásica similar o la misma en un lugar anatómicamente distante dentro de un intervalo de tiempo definido, comparable a la que el sujeto o individuo ha sido tratado o diagnosticado.
El término “riesgo de recidiva”, como se usa aquí, se refiere a una evaluación de posibilidad o probabilidad con respecto a la posibilidad o probabilidad de que un sujeto o individuo puede estar afectado o estar desarrollando una enfermedad neoplásica similar o la misma (ya sea en la mismo localización anatómica o un suceso en un lugar anatómicamente distante), dentro de un intervalo de tiempo definido, comparable a la que el sujeto o individuo ha sido tratado o diagnosticado.
El método según la invención además contempla la posibilidad de predecir el desenlace de un paciente combinando los niveles de expresión de los genes marcadores diferentes antes mencionados, con uno o más factores pronósticos clínicos.
Los factores pronósticos son aquellas variables relacionadas con la historia natural del cáncer colorrectal, que influyen en índices de recidiva y desenlace de pacientes una vez que han desarrollado cáncer colorrectal. Los parámetros clínicos que se han asociado con un peor pronóstico incluyen, por ejemplo, implicación de los ganglios linfáticos y tumores de alto grado. Los factores pronósticos se usan frecuentemente para categorizar a los pacientes en subgrupos con diferentes riesgos basales de recaída. En una forma de realización preferida, el factor pronóstico clínico utilizado en el método de la invención es el estadio del tumor, en donde el estadio del tumor aumentado es indicativo de un mayor riesgo de recidiva o en donde el estadio tumoral disminuido es indicativo de que el paciente muestra un riesgo bajo de recidiva.
En una forma de realización preferida, el factor pronóstico clínico es el estadio tumoral según la clasificación del AJCC (Véase, por ejemplo AJCC Cancer Staging Manual, séptima edición (2010) publicado por Springer-Verlag Nueva York, incorporado en el presente documento como referencia) y como se definió anteriormente. El término “estadio del tumor”, como se mencionó anteriormente, es un valor que se determina en base del valor TNM para el tumor. Por tanto, el estadio I corresponde a T1 N0 M0 o T2 N0 M0, el estadio II corresponde a T3 N0 M0 N0 M0 o T4 N0 M0, el estadio III corresponde a cualquier T, N1-2, M0 y el estadio IV corresponde a cualquier T, cualquier N y M1.
Por tanto, en una forma de realización preferida, la invención comprende además la determinación del estadio del tumor en el paciente en donde un estadio tumoral alto es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo del paciente o en donde un estadio del tumor bajo es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo.
El término “estadio tumoral bajo”, como se usa aquí, se refiere a un estadio del AJCC de I o II.
El término “estadio tumoral alto”, como se usa aquí, se refiere a un estadio del AJCC de III o IV.
Los pacientes analizados según la presente invención, pueden haber sido tratados o no con una o más terapias dirigidas a disminuir el tamaño del tumor. Por tanto, en una forma de realización preferida, los pacientes no han sido tratados antes de la determinación de los niveles de expresión de los diferentes genes según la invención. En otra forma de realización, los pacientes son tratados antes de la determinación de los niveles de expresión de los diferentes genes según la invención con una terapia seleccionada del grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia o cirugía.
Los términos “quimioterapia”, “radioterapia” y “cirugía” se definen a continuación en detalle y se usan con el mismo significado en el contexto de la presente invención.
Método para seleccionar un tratamiento adecuado para un paciente que padece cáncer colorrectal
El método pronóstico definido anteriormente también permite ofrecer terapias personalizadas para los pacientes que padecen cáncer colorrectal. En particular, los pacientes que se considera que tienen un alto riesgo de recaída se beneficiarán más probablemente de una terapia adicional después de la cirugía. Por el contrario, los pacientes que muestran un bajo riesgo de recaída pueden renunciar a un tratamiento terapéutico adicional tras la cirugía.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método (a continuación en el presente documento “primer método terapéutico personalizado de la invención”) para seleccionar un tratamiento adecuado para cáncer colorrectal en un paciente que comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 en una muestra de dicho paciente, en donde un nivel de expresión aumentado de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que el paciente es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a valores de referencia para dichos genes es indicativo de que el paciente no es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico.
Como se usa en el presente documento, los términos “tratamiento” o “terapia” pueden usarse indistintamente y se refieren a la intervención clínica en un intento de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de, o mejorar uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno o enfermedad o trastorno recurrentes, o con el fin de prolongar la supervivencia de un paciente más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento.
El término “cáncer colorrectal” se ha descrito en detalle en el contexto de los métodos pronósticos de la invención y se utiliza con el mismo significado en el contexto de los métodos personalizados según la invención.
En un primer paso, el primer método terapéutico personalizado según la invención comprende la determinación del nivel de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 en una muestra de dicho paciente.
Los términos “cáncer colorrectal”, “paciente”, “gen FAM46A”, “gen FHL2”, “gen FOXC2”, “gen COL4A1”, “niveles de expresión” y “muestra” se han descrito en detalle anteriormente y se aplican igualmente a los métodos según el presente método.
En una realización preferida, el primer método terapéutico personalizado de la invención comprende además la determinación de los niveles de expresión del gen FRMD6 gene, y en donde el paciente es un paciente que padece cáncer colorrectal en estadio II, en donde niveles de expresión aumentados de dicho gen con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que el paciente es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico, en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dicho gen es indicativo de que el paciente no es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico.
En otra forma de realización preferida, el primer método terapéutico personalizado de la invención comprende además la determinación de los niveles de expresión de los genes SPRY4 y DACT3 y en donde el paciente es un paciente que padece estadio III, en donde niveles de expresión aumentados de SPRY4 y DACT3 con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que el paciente es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico, en donde niveles de expresión disminuidos de SPRY4 y DACT3 con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que el paciente no es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico.
En aún otra forma de realización preferida, el primer método terapéutico personalizado según la invención comprende además la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ACTC1, BOC, CNN1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FILIP1L, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2 en donde niveles de expresión aumentados de uno o más de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico, en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente no es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico.
Los términos que se refieren a cada uno de estos genes se han descrito en detalle anteriormente y se aplican igualmente a los métodos según el presente método.
En una forma de realización, el método de la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2 en donde niveles de expresión aumentados de uno o más de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico, en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente no es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico. El paciente puede ser un paciente en estadio II o estadio III.
En una realización, el método de la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, FRMD6, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2 en donde niveles de expresión aumentados de uno o más de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico, en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente no es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico. El paciente puede ser un paciente en estadio II o estadio III.
En otra forma de realización , el método de la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, DACT3, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 SPRY4 y SYNPO2 en donde niveles de expresión aumentados de uno o más de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico, en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente no es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico. El paciente puede ser un paciente en estadio II o estadio III.
En aún otra forma de realización, el primer método terapéutico personalizado según la invención comprende además la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes que se regulan por incremento por TGF beta al menos dos veces en o bien AAF, CAF o bien fibroblastos de mucosa normal y que se expresan específicamente en fibroblastos asociados a cáncer (FAP+; EPCAM- CD45- CD31-) o células endoteliales (c D31+; FAP- EpCAM- cd45-) frente a células epiteliales (EPCAM+; FAP- CD45- CD31-) y leucocitos (CD45 ; EPCAM- FAP- CD31-). Por tanto, en otra forma de realización, el método según la invención comprende además la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ADAMTS6, BMP6, CCDC71L, CH25H, CNNM2, CPNE2, CREB3L2, DCBLD1, EFR3B, EGR1, ELN, ENDOD1, FHOD3, FOXC1, FZD8, GBP1, GXYLT2, IGF1, IL4R, ITGA11, JPH2, KIAA1211, KIF26B, LIMK1, LINC00340, LPCAT2, LRRC8A, METTL7A, OLFM2, PID1, PPP1R12B, PRSS23, RASD2, RNF152, SCUBE3, SEC14L2, SERPINE2, SGK1, SH3PXD2A, SHISA2, SMTN, SRGAP1, TRPC6 y UCK2 y de los genes que hibridan específicamente con las sondas que tienen las secuencias SEQ ID NO:1 a 26 en donde niveles de expresión aumentados de uno o más de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico, en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente no es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico.
En una forma de realización, el primer método terapéutico personalizado según la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, ADAMTS6, BMP6, BOC, CCDC71L, CH25H, CNN1, CNNM2, COL4A1, COMP, CPNE2, CREB3L2, CRISPLD2, CRYAB, DACT3, DCBLD1, EFR3B, EGR1, ELN, ENDOD1, FAM101B, FAM46A, FHL2, FHOD3, FILIP1L, FOXC1, FOXC2, FRMD6, FZD8, GAS7, GBP1, GFPT2, GLIS3, GXYLT2, HS3ST3A1, IGF1, IL4R, ITGA11, JPH2, KIAA1211, KIF26B, KIRREL, LIMK1, LINC00340, LPCAT2, LRRC15, LRRC8A, LTBP2, METTL7A, MFAP2, NNMT, OLFM2, P4HA3, PID1, PPAPDC1A, PPP1R12B, PPP1R3C, PRSS23, RASD2, RNF152, S1PR1, SCUBE3, SEC14L2, SERPINE2, SGK1, SH3PXD2A, SHISA2, SMTN, SPRY4, SRGAP1, SYNPO2, TRPC6 y UCK2 y de los genes que hibridan específicamente con las sondas que tienen las secuencias SEQ ID NO:1 a 26 en donde niveles de expresión aumentados de uno o más de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico, en donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de que el paciente no es un candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico. El paciente puede ser un paciente en estadio II o estadio III.
El término “que hibrida específicamente", como se usa aquí, se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de dos secuencias de polinucleótidos en condiciones muy rigurosas o condiciones moderadamente rigurosas. Las expresiones "condiciones muy rigurosas" y "condiciones moderadamente rigurosas" se definen posteriormente en relación con el kit de la invención y son igualmente aplicables en el contexto del presente método.
Los niveles de expresión de los diferentes genes utilizados en el primer método terapéutico personalizado de la invención se pueden determinar mediante la determinación de los niveles de ARNm codificado por dichos genes o mediante la determinación de los niveles del polipéptido codificado por dichos genes.
En un segundo paso, el método terapéutico personalizado según la invención comprende la identificación de aquellos pacientes que presentan niveles de expresión aumentados de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes como candidatos para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de esos pacientes que muestran niveles de expresión disminuidos de los genes con respecto a un valor de referencia como un paciente que no es un candidato para recibir terapia después de la cirugía.
En una realización particular, la terapia después del tratamiento quirúrgico para la que el paciente es o no un candidato es una terapia seleccionada del grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia y/o una terapia que comprende un inhibidor de TGF-beta.
El término “cirugía" o “tratamiento quirúrgico”, como se usa aquí, significa cualquier procedimiento terapéutico que implica una acción metódica de la mano o de la mano con un instrumento, en el cuerpo de un ser humano u otro mamífero, para producir una curación o recuperación.
Como se usa aquí el término "quimioterapia", "fármaco quimioterapéutico" se refiere en sentido amplio a la utilización de un fármaco químico o una combinación de los mismos para el tratamiento del cáncer, tumores o neoplasias malignas, incluyendo fármacos tanto citotóxicos como citostáticos. Ejemplos de agentes de quimioterapia que pueden estar de acuerdo con la presente invención incluyen:
- agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, clorambucil, ciclofosfamida, ifosfamida, estreptozocina, carmustina, lomustina, melfalán, busulfán, dacarbazina, temozolomida, tiotepa o altretamina);
- Fármacos de platino (por ejemplo, cisplatino, carboplatino y oxaliplatino);
- Fármacos antimetabolitos (por ejemplo, 5-fluorouracilo, capecitabina, 6-mercaptopurina, metotrexato, gemcitabina, citarabina, fludarabina o pemetrexed);
- Antibióticos antitumorales (por ejemplo, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, actinomicina D, bleomicina, mitomicina C, o mitoxantrona);
- Inhibidores mitóticos (por ejemplo, paclitaxel, docetaxel, ixabepilona, vinblastina, vincristina, vinorelbina, vindesina o estramustina), e
- Inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, etopósido, tenipósido, topotecano, irinotecano, o diflomotecano o elomotecano).
El término "radioterapia" es un término comúnmente utilizado en la técnica para referirse a varios tipos de terapia de radiación, incluidas las terapias de radiación interna y externa o radioinmunoterapia, y el uso de varios tipos de radiaciones como los rayos X, rayos gamma, partículas alfa, partículas beta, fotones, electrones, neutrones, radioisótopos, y otras formas de radiaciones ionizantes.
La expresión "terapia que comprende un inhibidor de TGF-beta” es una terapia que comprende el uso de uno o más inhibidores de TGF-beta. En la presente invención, "un inhibidor de TGFp” se entiende como cualquier compuesto que pueda prevenir la transmisión de señales provocada por la interacción entre TGFp y su receptor. Los inhibidores de TGFpi que pueden usarse según la presente invención incluyen compuestos que impiden la unión competitiva o alostérica de TGFp a su receptor, compuestos que se unen a TGFp y compuestos que inhiben la señalización intracelular de TGFp. Los ensayos apropiados para determinar la capacidad inhibidora de un inhibidor de TGFp incluyen la inhibición in vitro de la actividad biológica de TGFp usando el inhibidor en ensayos de proliferación de células Mv-1-Lu así como la inhibición in vivo de la actividad biológica de TGFp mediante el inhibidor usando un modelo de daño hepático agudo inducido por CCl4 (dado a conocer en el documento WO200519244). Para más detalles sobre antagonistas de TGF-beta véase también Wojtowicz-Praga (2003).
Inhibidores de TGFp adecuados para su uso en la presente invención incluyen, sin limitación, cualquiera de los inhibidores mencionados en la tabla 1.
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El término “polimorfo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un estado cristalino particular de una sustancia, que tiene propiedades físicas particulares descritas por patrones de difracción de rayos X, espectros de IR, punto de transición de fases, y similares. Los diferentes polimorfos pueden resultar de diferencias en el empaquetamiento de cristal (polimorfismo de empaquetamiento) o diferencias en el empaquetamiento entre diferentes confórmeros de la misma molécula (polimorfismo conformacional).
En una realización preferida, el inhibidor de TGFp es LY2157299 ((2-(6-metil-piridin-2-il) -3-[6-amido-quinolin-4-il) -5,6-dihidro-4H-pirrolo [ 1,2-b] pirazol) inhibidor del receptor de TGF-beta tipo I; Lilly Research), como se describe en la solicitud de patente internacional publicada como WO2004048382-A1, que tiene la estructura
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en forma cristalina o cualquier polimorfo, solvato o hidrato del mismo.
En una realización preferida, el inhibidor de TGFp es un LY2157299 cristalino monohidratado caracterizado por el patrón de difracción de polvo de rayos X (radiación de Cu, X= 1,54056 A) que comprende un pico a 9,05 y uno o más picos seleccionados del grupo que comprende 11,02, 11,95 y 14,84 (20 /■ 0,1°).
En una realización preferida, el inhibidor de TGFp es un LY2157299 cristalino monohidratado caracterizado adicionalmente por el patrón de difracción de polvo de rayos X (radiación de Cu, X= 1,54056 A) que comprende un pico a 9,05 (20 /■ 0,1°).
En otra realización preferida, el inhibidor de TGFp es un LY2157299 cristalino monohidratado caracterizado adicionalmente por la resonancia magnética nuclear de 13C en estado sólido que tiene un desplazamiento químico (ppm) de 108,8, 115,6, 122.6 y 171,0 (+/-0,2) ppm.
Tal como se usa en el presente documento, el término “solvato” significa un compuesto que incluye además una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de disolvente tal como agua, acetona, etanol, metanol, diclorometano, 2-propanol, o similares, unido mediante fuerzas intermoleculares no covalentes. Cuando el disolvente es agua, se usa el término “hidrato” en lugar de solvato.
La presente invención proporciona además anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente con tales polipéptidos. Los anticuerpos a modo de ejemplo incluyen anticuerpos neutralizantes, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales murinos, anticuerpos humanizados derivados de anticuerpos monoclonales murinos y anticuerpos monoclonales humanos. Los fragmentos de anticuerpos ilustrativos incluyen F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv y unidades de reconocimiento mínimo.
En una forma de realización preferida, la terapia es quimioterapia adyuvante o neoadyuvante.
El término “terapia neoadyuvante“, como se usa aquí, se refiere a cualquier tipo de tratamiento del cáncer administrado antes de la resección quirúrgica del tumor primario, en un paciente afectado con un cáncer. La razón más común para la terapia neoadyuvante es reducir el tamaño del tumor con el fin de facilitar una cirugía más eficaz. Terapias neoadyuvante incluyen radioterapia y terapia, preferiblemente terapia sistémica, tal como terapia hormonal, quimioterapia, inmunoterapia y terapia con anticuerpos monoclonales.
El término “terapia adyuvante", como se usa aquí, se refiere a cualquier tipo de tratamiento del cáncer (por ejemplo, quimioterapia o radioterapia) dado como tratamiento adicional, habitualmente después de la resección quirúrgica del tumor primario, en un paciente afectado con un cáncer que tiene riesgo de metástasis y/o es probable que reaparezca. El objetivo de este tipo de tratamiento adyuvante es mejorar el pronóstico. Las terapias adyuvantes comprenden radioterapia y terapia, preferentemente terapia sistémica, tal como terapia hormonal, quimioterapia, inmunoterapia y terapia con anticuerpos monoclonales.
Método para seleccionar un paciente que es probable que se beneficie de la terapia adyuvante después de la resección quirúrgica del cáncer colorrectal
En otro aspecto, la invención se refiere a un método (en adelante "segundo método terapéutico personalizado de la invención") para seleccionar un paciente que es probable que se beneficie de terapia adyuvante después de la resección quirúrgica del cáncer colorrectal que comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2NPR3/C5orf23, CDKN2B y COL4A1 en una muestra de dicho paciente, en donde un nivel de expresión aumentado de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que es improbable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.
Como se usan en el presente documento, los términos "tratamiento" y "terapia" se pueden usar indistintamente y se refieren a una intervención clínica en un intento de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de, o mejorar uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno o enfermedad o trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un paciente más allá de los esperado en ausencia del tal tratamiento.
El término "cáncer colorrectal" se ha descrito en detalle en el contexto de los métodos pronósticos de la invención y se utiliza con el mismo significado en el contexto de los métodos personalizados según la invención.
En un primer paso, el segundo método terapéutico personalizado según la invención comprende la determinación del nivel de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 en una muestra de dicho paciente.
Los términos "cáncer colorrectal", "paciente", "gen FAM46A”, "gen FHL2”, "gen FOXC2”, "gen COL4A1”, "niveles de expresión", "muestra" y "terapia" se han descrito en detalle anteriormente, y se aplican por igual a los métodos según el método presente.
En un método preferido, el segundo método terapéutico personalizado según la invención comprende además la determinación de los niveles de expresión del gen FRMD6 y en donde el paciente es un paciente que padece cáncer colorrectal en estadio II, en donde un nivel de expresión aumentado de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que el paciente es probable que se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivele de expresión disminuido de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que el paciente no es probable que se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.
En otra forma de realización preferida, el segundo método terapéutico personalizado según la invención comprende además la determinación de los niveles de expresión de los genes SPRY4 y DACT3 y en donde el paciente es un paciente que padece cáncer colorrectal en estadio III y en donde una expresión aumentada de dichos genes es indicativa de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que no es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.
Por otra parte, además de la determinación de los marcadores mencionados anteriormente, el método según la invención puede comprender además la determinación de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en ACTC1, BOC, CNN1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FILIP1L, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2 en donde una expresión aumentada de dichos genes es indicativa de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que no es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico. El paciente puede ser un paciente en estadio II o estadio III.
Por tanto, en una forma de realización, el método de la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2 en donde una expresión aumentada de dichos genes es indicativa de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que no es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico. El paciente puede ser un paciente en estadio II o estadio III.
Por tanto, en una forma de realización, el método de la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, FRMD6, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2 en donde una expresión aumentada de dichos genes es indicativa de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que no es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico. El paciente puede ser un paciente en estadio II o estadio III.
En otra forma de realización, el método de la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, DACT3, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 SPRY4 y SYNPO2 en donde una expresión aumentada de dichos genes es indicativa de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que no es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico. El paciente puede ser un paciente en estadio II o estadio III.
Los términos que se refieren a cada uno de estos genes se han descrito en detalle anteriormente y se aplican igualmente a los métodos del presente método.
En aún otra forma de realización, el segundo método terapéutico personalizado según la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes mostrados en la tabla 1 que tienen un valor de cambio en veces superior a 2 en o bien AAF, CAF y CCD en respuesta a TGF-beta y que se expresan específicamente en fibroblastos asociados a cáncer (FAP+; EPCAM- CD45- CD31-) o células endoteliales (c D31+; FAP- EpCAM- cd45-) frente a células epiteliales (EPCAM+) y leucocitos (cd45+) en donde un nivel de expresión aumentado de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que no es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico. Por tanto, en otra forma de realización, el segundo método terapéutico personalizado según la invención comprende además la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ADAMTS6, BMP6, CCDC71L, CH25H, CNNM2, CPNE2, CREB3L2, DCBLD1, EFR3B, EGR1, ELN, ENDOD1, FHOD3, FOXC1, FZD8, GBP1, GXYLT2, IGF1, IL4R, ITGA11, JPH2, KIAA1211, KIF26B, LIMK1, LINC00340, LPCAT2, LRRC8A, METTL7A, OLFM2, PID1, PPP1R12B, PRSS23, RASD2, RNF152, SCUBE3, SEC14L2, SERPINE2, SGK1, SH3PXD2A, SHISA2, SMTN, SRGAP1, TRPC6 y UCK2 y de los genes que hibridan específicamente con las sondas que tienen las secuencias SEQ ID NO:1 a 26 en donde un niveles de expresión aumentados de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a un valor de referencia es indicativo de que no es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.
La firma de genes que comprende todos los genes que se determinan según los diferentes métodos de la invención se conoce como Str-TBRS y se muestra en la tabla 1. En una realización, la invención comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, ADAMTS6, BMP6, BOC, CCDC71L, CH25H, CNN1, CNNM2, COL4A1, COMP, CPNE2, CREB3L2, CRISPLD2, CRYAB, DACT3, DCBLD1, EFR3B, EGR1, ELN, ENDOD1, FAM101B, FAM46A, FHL2, FHOD3, FILIP1L, FOXC1, FOXC2, FRMD6, FZD8, GAS7, GBP1, GFPT2, GLIS3, GXYLT2, HS3ST3A1, IGF1, IL4R, ITGA11, JPH2, KIAA1211, KIF26B, KIRREL, LIMK1, LINC00340, LPCAT2, LRRC15, LRRC8A, LTBP2, METTL7A, MFAP2, NNMT, OLFM2, P4HA3, PID1, PPAPDC1A, PPP1R12B, PPP1R3C, PRSS23, RASD2, RNF152, S1PR1, SCUBE3, SEC14L2, SERPINE2, SGK1, SH3PXD2A, SHISA2, SMTN, SPRY4, SRGAP1, SYNPO2, TRPC6 y UCK2 y de los genes que hibridan específicamente con las sondas que tienen las secuencias SEQ ID NO:1 a 26 en donde un nivel de expresión aumentado de dichos genes con respecto a un valor referencia para dichos genes es indicativo de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico o en donde un nivel de expresión disminuido de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de que no es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.
El término “que hibrida específicamente", como se usa aquí, se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de dos secuencias de polinucleótidos en condiciones muy rigurosas o condiciones moderadamente rigurosas. Las expresiones "condiciones muy rigurosas" y "condiciones moderadamente rigurosas" se definen posteriormente en relación con el kit de la invención y son igualmente aplicables en el contexto del presente método.
Los niveles de expresión de los diferentes genes usados en el segundo método terapéutico personalizado de la invención se pueden determinar determinando los niveles del ARNm codificado por dichos genes o determinando los niveles del polipéptido codificado por dichos genes.
En un segundo paso, el método terapéutico personalizado según la invención comprende la identificación de esos pacientes que muestran niveles de expresión aumentados de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes como pacientes que es probable que se beneficien de terapia después del tratamiento quirúrgico o de esos pacientes que muestran niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes como pacientes que es improbable que se beneficien de terapia después del tratamiento quirúrgico.
El término “beneficio" se refiere a mejorar el estado de enfermedad del paciente. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, reducción de la duración de la enfermedad, estado patológico estabilizado (específicamente no deteriorado), retraso en la evolución de la enfermedad, mejora del estado patológico, prolongación de la supervivencia comparada con la supervivencia esperada sin el tratamiento no se aplica y remisión (tanto parcial como total), tanto detectable como no detectable.
En una forma de realización particular, la terapia después del tratamiento quirúrgico para la que el paciente es o no candidato es una terapia seleccionada del grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia y/o una terapia que comprende un inhibidor de TGF-beta.
Los términos “cirugía" o “tratamiento quirúrgico", “quimioterapia", “fármaco quimioterapéutica", “radioterapia" y “terapia que comprende un inhibidor de TGF-beta“ se han descrito en detalle anteriormente y se aplican igualmente a los métodos según el método presente.
Terapias personalizadas de la invención
El método pronóstico y los métodos terapéuticos personalizados definidos anteriormente también permiten proporcionar terapias personalizadas a pacientes que padecen cáncer colorrectal. En particular, pacientes que se considera que tienen un alto riesgo de recaída es más probable que se beneficien de una terapia adicional después de la cirugía. Por el contrario, los pacientes que muestran bajo riesgo de recaída pueden funcionar son tratamiento terapéutico adicional después de la cirugía.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un compuesto de quimioterapia terapéutica y/o un inhibidor de TGF-beta para su uso en el tratamiento de cáncer colorrectal en un paciente después de la extirpación quirúrgica del cáncer, en donde el paciente se ha seleccionado mediante el método pronóstico de la invención o los métodos terapéuticos personalizados de la invención.
El término "inhibidor de TGF-beta" se ha descrito anteriormente en el contexto del método personalizado de acuerdo con la invención e incluye inhibidores específicos de TGF-p1, TGF-p2 o TGF-p3, así como inhibidores de amplio espectro que inhiben dos o más de las isofomas anteriores.
En una realización preferida, el inhibidor de TGFp es LY2157299 ((2-(6-metil-piridin-2-il) -3-[6-amido-quinolin-4-il) -5,6-dihidro-4H-pirrolo [ 1, 2-b] pirazol) inhibidor del receptor de TGF-beta tipo I; Lilly Research) en forma cristalina o cualquier polimorfo, solvato o hidrato del mismo.
En una realización preferida, el inhibidor de TGF-beta se selecciona del grupo que consiste en cualquier compuesto identificado en la Tabla 1 o cualquier combinación de los mismos. En una realización más preferida, el inhibidor de TFG-beta es un compuesto que tiene la estructura
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o cualquier polimorfo, solvato o hidrato del mismo.
Los términos “terapia”, “tratamiento”, “cáncer colorrectal”, “paciente”, “radioterapia”, “cirugía” o “tratamiento quirúrgico”, “quimioterapia”, “fármaco quimioterapéutico”, “radioterapia” y “terapia que comprende un inhibidor de TGF-beta”, se han descrito anteriormente y se aplican igualmente a las terapias personalizadas de la invención. Kits de la invención
En otra forma de realización, la invención se refiere a un kit que es útil para la determinación de los niveles de expresión de los genes que forman la firma Str-TBRS de la invención o las minifirmas derivadas de la Str-TBRS de la invención. Por tanto, en una forma de realización preferida, el kit de la invención comprende reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1, en donde los reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 comprenden al menos el 10% de la cantidad total de reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes que forman el kit, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos. En otra forma realización, el kit de la invención comprende además reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión del gen FRMD6 o para los genes SPRY4 y DACT3, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos.
En otra forma de realización, el kit según la invención comprende además reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ACTC1, BOC, CNN1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FILIP1L, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos.
En una forma de realización, el kit según la invención comprende reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos.
En una forma de realización, el kit según la invención comprende reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, FRMD6, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos.
En otra forma de realización, el kit según la invención comprende reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, BOC, CNN1, COL4A1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, DACT3, FAM101B, FAM46A, FHL2, FILIP1L, FOXC2, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 SPRY4 y SYNPO2, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos.
En otra forma de realización, el kit según la presente invención comprende además reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes que se expresan específicamente en las poblaciones celulares enriquecidas en fibroblastos asociados a cáncer (FAP+) o células endoteliales (CD31+) y que tienen al menos un aumento de 2 veces en respuesta a TGF-beta en o bien AAF, CAF o bien fibroblastos de mucosa normal (CCD-co-18), en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos. Por tanto, en otra forma de realización, el kit según la presente invención comprende además reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ADAMTS6, BMP6, CCDC71L, CH25H, CNNM2, CPNE2, CREB3L2, DCBLD1, EFR3B, EGR1, ELN, ENDOD1, FHOD3, FOXC1, FZD8, GBP1, GXYLT2, IGF1, IL4R, ITGA11, JPH2, KIAA1211, KIF26B, LIMK1, LINC00340, LPCAT2, LRRC8A, METTL7A, OLFM2, PID1, PPP1R12B, PRSS23, RASD2, RNF152, SCUBE3, SEC14L2, SERPINE2, SGK1, SH3PXD2A, SHISA2, SMTN, SRGAP1, TRPC6 y UCK2 y de los genes que hibridan específicamente con las sondas que tienen las secuencias SEQ ID NO:1 a 26, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos.
En otra forma de realización, el kit según la presente invención comprende además reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes ACTC1, ADAMTS6, BMP6, BOC, CCDC71L, CH25H, CNN1, CNNM2, COMP, COL4A, CPNE2, CRISPLD2, CRYAB, DACT3, CREB3L2, DCBLD1, EFR3B, EGR1, ELN, ENDOD1, FAM101B, FAM46A, FHL2, FHOD3, FILIP1L, FOXC1, FOXC2, FRMD6, FZD8, GAS7, GBP1, GFPT2, GLIS3, GXYLT2, HS3ST3A1, IGF1, IL4R, ITGA11, JPH2, KIAA1211, KIF26B, KIRREL, LIMK1, LINC00340, LPCAT2, LRRC15, LRRC8A, LTBP2, METTL7A, MFAP2, NNMT, OLFM2, P4HA3, PID1, PPAPDC1A, PPP1R12B, PPP1R3C, PRSS23, RASD2, RNF152, S1PR1, SCUBE3, SEC14L2, SERPINE2, SGK1, SH3PXD2A, SHISA2, SMTN, SPRY4, SRGAP1, SYNPO2, TRPC6 y UCK2 y de los genes que hibridan específicamente con las sondas que tienen las secuencias SEQ ID NO:1 a 26, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos.
En una forma de realización preferida, los reactivos adecuados para la determinación de niveles de expresión de uno o más genes comprenden al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 100% de la cantidad total de los reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de genes que forman el kit. Así, en el caso particular de kits que comprenden los reactivos para la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1, los reactivos específicos para dichos genes (por ejemplo, sondas que son capaces de hibridar en condiciones rigurosas con los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1) comprenden al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 100% de las sondas presentes en el kit.
En formas de realización adicionales, los reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes comprenden al menos el 55% al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menso el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de la cantidad total de reactivos que forman el kit.
En el contexto de la presente invención, “kit” se entiende como un producto que contiene los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de la invención empaquetado de forma que permita su transporte y almacenamiento. Los materiales adecuados para el embalaje de los componentes del kit incluyen cristal, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, papel, sobres, y similares. Además, los kits de la invención pueden contener instrucciones para el uso simultáneo, secuencial o separado de los diferentes componentes que están en el kit. Dichas instrucciones pueden estar en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico capaz de almacenar instrucciones de manera que puedan ser leídos por un sujeto, tales como medios electrónicos de almacenamiento (discos magnéticos, cintas y similares), medios ópticos (CD-ROM, DVD) y similares. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de Internet que proporcionan dichas instrucciones.
La expresión “reactivo que permite determinar el nivel de expresión de un gen” significa un compuesto o conjunto de compuestos que permite determinar el nivel de expresión de un gen, tanto por medio de la determinación del nivel de ARNm como por medio de la determinación del nivel de proteína. Por tanto, los reactivos del primer tipo incluyen sondas capaces de hibridar específicamente con el ARNm codificado por dichos genes. Los reactivos del segundo tipo incluyen compuestos que se unen específicamente a las proteínas codificadas por los genes marcadores y, preferentemente, se incluyen anticuerpos, aunque pueden ser aptámeros específicos.
En una forma de realización particular de los kit de la invención, los reactivos del kit son ácidos nucleicos que son capaces de detectar específicamente el nivel de ARNm de los genes mencionados anteriormente y/o el nivel de proteínas codificadas por uno o más de los genes mencionados anteriormente. Los ácidos nucleicos capaces de hibridar específicamente con los genes antes mencionados pueden ser uno o más pares de oligonucleótidos cebadores para la amplificación específica de fragmentos de los ARNm (o de sus correspondientes ADNc) de dichos genes.
En una forma de realización preferida, el primer componente del kit de la invención comprende una sonda que puede hibridar específicamente con los genes mencionados anteriormente.
El término “que hibrida específicamente”, como se usa aquí, se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de dos polinucleótidos en condiciones muy rigurosas o condiciones moderadamente rigurosas.
La “rigurosidad” de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por un experto en la materia, y por lo general es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para la hibridación adecuada, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado de volver a hibridar cuando están presentes hebras complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas más altas tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que las temperaturas más bajas menos. Para obtener detalles y explicaciones adicionales de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
“Las condiciones rigurosas” o “condiciones muy rigurosas”, como se define en el presente documento, por lo general: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0,1% a 50°C, (2) emplean durante la hibridación un agente de desnaturalización, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con seroalbúmina bovina al 0,1%/Ficoll al 0.1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42°C, o (3) emplean formamida al 50%, 5xSSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, solución de Denhardt 5x, ADN sonicado de esperma de salmón (50 mg/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0,2xSsC (cloruro sódico/citrato de sodio) y formamida al 50%, seguido por un lavado de alto rigor que consiste en 0,1xSSC que contiene EDTA a 55°C.
“Las condiciones moderadamente rigurosas” se pueden identificar según lo descrito por Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende: formamida al 20%, 5xSSC (NaCI 150 mM, citrato sódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10%, y 20 mg/ml de ADN desnaturalizado cortado de esperma de salmón, seguido por el lavado de los filtros en IxSSC a unos 37-50°C. El experto en la materia reconocerá la forma de ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para dar cabida a factores como la longitud de la sonda y similares.
En el caso de que los niveles de expresión de varios de los genes identificados en la presente invención se determinen al mismo tiempo, es útil incluir las sondas para todos los genes cuya expresión se va a determinar en una hibridación de micromatrices.
Las micromatrices comprenden una pluralidad de ácidos nucleicos que están espacialmente distribuidos y establemente asociados a un soporte (por ejemplo, un biochip). Los ácidos nucleicos tienen una secuencia complementaria a subsecuencias particulares de genes cuya expresión se va a detectar, por tanto son capaces de hibridar con dichos ácidos nucleicos. En los métodos de la invención, una micromatriz que comprende un conjunto de ácidos nucleicos se pone en contacto con una preparación de los ácidos nucleicos aislados del paciente objeto del estudio. La incubación de la micromatriz con la preparación de ácidos nucleicos se lleva a cabo en las condiciones adecuadas para la hibridación. Posteriormente, tras la eliminación de los ácidos nucleicos que el soporte no ha retenido, el patrón de hibridación se detecta, lo que proporciona información sobre el perfil genético de la muestra analizada. Aunque las micromatrices son capaces de proporcionar información tanto cualitativa como cuantitativa de los ácidos nucleicos presentes en una muestra, la invención requiere el uso de matrices y metodologías capaces de proporcionar información cuantitativa.
La invención contempla una variedad de matrices en relación con el tipo de sondas y en relación con el tipo de soporte utilizado. Las sondas incluidas en las matrices que son capaces de hibridar con los ácidos nucleicos pueden ser ácidos nucleicos o análogos de los mismos que mantienen la capacidad de hibridación, como por ejemplo, ácidos nucleicos en el que el enlace fosfodiéster se ha sustituido con un enlace fosforotioato, metilimina, metilfosfonato, fosforamidato, guanidina y similares, ácidos nucleicos en los que se sustituye la ribosa de los nucleótidos con otra hexosa, ácidos péptido nucleicos (APN). La longitud de las sondas puede ser de 5 a 50 nucleótidos y, preferiblemente, de 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100 nucleótidos y varían en el intervalo de 10 a 1000 nucleótidos, preferiblemente en el intervalo de 15 a 150 nucleótidos, más preferiblemente en el intervalo de 15 a 100 nucleótidos y pueden ser ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios. La matriz puede contener todas las sondas específicas de un determinado ARNm de una cierta longitud o puede contener sondas seleccionadas de diferentes regiones de un ARNm. Cada sonda se ensaya en paralelo con una sonda con una base cambiada, preferiblemente en una zona céntrica de la sonda. La matriz se pone en contacto con una muestra que contiene los ácidos nucleicos con secuencias complementarias a las sondas de la matriz y se determina la señal de hibridación con cada una de las sondas y los controles de hibridación correspondiente. Esas sondas en las que se observa una mayor diferencia entre la señal de hibridación con la sonda y su control de hibridación se seleccionan. El proceso de optimización puede incluir una segunda ronda de optimización en el que se hibrida la matriz de hibridación con una muestra que no contiene secuencias complementarias a las sondas de la matriz. Después de la segunda ronda de selección, las sondas con las señales de hibridación inferior a un umbral se seleccionarán. Por tanto, se seleccionan las sondas que pasan ambos controles, es decir, que muestran un nivel mínimo de hibridación inespecífica y un nivel máximo de hibridación específica con el ácido nucleico diana.
La selección de las sondas específicas para los diferentes genes diana se lleva a cabo de tal manera que se unen específicamente al ácido nucleico diana con un mínimo de hibridación con genes no relacionados. Sin embargo, hay sondas de 20 nucleótidos que no son únicas para un ARNm determinado. Por tanto, las sondas dirigidas a dichas secuencias mostrarán una hibridación cruzada con secuencias idénticas que aparecen en el ARNm de genes no relacionados. Además, hay sondas que no hibridan específicamente con los genes diana en las condiciones utilizadas (debido a las estructuras secundarias o de la interacción con el sustrato de la matriz). Este tipo de sonda no se debe incluir en la matriz. Por tanto, el experto en la materia observará que las sondas que se van a incorporar en una matriz determinada se deben optimizar antes de su incorporación a la matriz. La optimización de las sondas se realiza generalmente mediante la generación de una matriz que contiene una pluralidad de sondas dirigidas a las diferentes regiones de un cierto polinucleótido diana. Esta matriz se pone en contacto primero con una muestra que contiene el ácido nucleico diana en una forma aislada y, en segundo lugar, con una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Las sondas de hibridación que muestran una hibridación muy específica con el ácido nucleico diana, pero poca o ninguna hibridación con la muestra compleja se seleccionan así para su incorporación a las matrices de la invención. Además, es posible incluir en la matriz controles de hibridación para cada una de las sondas que se va a estudiar. En una forma de realización preferida, los controles de hibridación contienen una posición alterada en la región central de la sonda. En el caso de que se observen altos niveles de hibridación entre la sonda estudiada y su control de hibridación, la sonda no se incluye en la matriz.
Las micromatrices de la invención no sólo contienen sondas específicas para los polinucleótidos que indica una determinada situación patofisiológica, sino que también contiene una serie de sondas control, que puede ser de tres tipos: controles de normalización, controles del nivel de expresión y controles de hibridación.
Los controles de normalización son oligonucleótidos que son perfectamente complementarios a las secuencias de referencia marcadas que se añaden a la preparación de los ácidos nucleicos que se va a analizar. Las señales derivadas de los controles de normalización después de la hibridación proporcionan una indicación de las variaciones en las condiciones de hibridación, la intensidad del marcador, eficiencia de la detección y otra serie de factores que pueden dar lugar a una variación de la señal de hibridación entre diferentes micromatrices. Las señales detectadas del resto de las sondas de la matriz preferiblemente se dividen por la señal emitida por las sondas control, normalizando así las medidas. Prácticamente cualquier sonda se puede utilizar como control de normalización. Sin embargo, se sabe que la eficiencia de la hibridación varía en función de la composición de nucleótidos y la longitud de la sonda. Por lo tanto, las sondas de normalización preferidas son las que representan la longitud media de las sondas presentes en la matriz, aunque pueden seleccionarse de forma que incluyan una gama de longitudes que reflejan el resto de las sondas presentes en la matriz. Las sondas de normalización se pueden diseñar de tal forma que reflejen la composición media de los nucleótidos del resto de sondas presentes en la matriz. Un número limitado de sondas de normalización se selecciona preferiblemente de modo que hibriden adecuadamente, es decir, no tienen una estructura secundaria y no presentan similitud de secuencia con cualquiera de las sondas de la matriz se utiliza. Las sondas de normalización pueden ser ubicadas en cualquier posición de la matriz o en varias posiciones de la matriz para un control eficaz de las variaciones en la eficiencia de la hibridación en relación con la estructura de la matriz. Los controles de normalización se localizan preferentemente en las esquinas de la matriz y/o en el centro de la misma.
Los niveles de controles de expresión son sondas que hibridan específicamente con genes que se expresan de forma constitutiva en la muestra que se analiza. Los controles de nivel de expresión están diseñados para controlar el estado fisiológico y la actividad metabólica de la célula. El examen de la covarianza del control del nivel de expresión del ácido nucleico diana indica si las variaciones en los niveles de expresión se deben a cambios en los niveles de expresión o se deben a cambios en la tasa global de transcripción en la célula o en su actividad metabólica general. Así, en el caso de células que tienen deficiencias en un determinado metabolito esencial para la viabilidad celular, se espera la observación de una disminución tanto en los niveles de expresión del gen diana como en los niveles de expresión del control. Por otro lado, si se observa un aumento en la expresión de la expresión del gen diana y de los genes de control, probablemente es debido a un aumento de la actividad metabólica de la célula y no a un aumento diferencial en la expresión del gen diana. Sondas adecuadas para su uso como control de expresión corresponden a genes expresados constitutivamente, como los genes que codifican las proteínas que ejercen funciones esenciales de la célula, tales como p-2-microglobulina ubiquitina, proteína ribosómica de 18S, ciclofilina A, receptor de transferrina, actina, GAPDH, proteína de activación de tirosina 3-monooxigenasa/triptófano 5-monooxigenasa (YWHAZ) y beta-actina.
Se pueden incluir controles de hibridación tanto para las sondas dirigidas a los genes diana como para las sondas dirigidas al nivel de expresión o a los controles de normalización. Controles de error son sondas de oligonucleótidos idénticas a las sondas dirigidas a los genes diana, pero que contienen mutaciones en uno o varios nucleótidos, es decir, que contienen nucleótidos en ciertas posiciones que no hibridan con el nucleótido correspondiente en el gen diana. Los controles de hibridación se seleccionan de manera que, aplicando las condiciones de hibridación adecuadas, el gen diana debe hibridar con la sonda específica, pero no con el control de hibridación o con una eficacia reducida. Los controles de hibridación contienen preferentemente una o varias posiciones modificadas en el centro de la sonda. Los controles de hibridación por tanto, proporcionan una indicación del grado de hibridación inespecífica o de hibridación cruzada con un ácido nucleico en la muestra a una sonda diferente de la que contiene la secuencia exactamente complementaria.
Las matrices de la invención también pueden contener controles de amplificación y de preparación de muestras que son sondas complementarias a subsecuencias de genes control seleccionados porque normalmente no aparecen en la muestra biológica objeto del estudio, tales como sondas para genes bacterianos. La muestra de ARN se suplementa con una cantidad conocida de un ácido nucleico que hibrida con la sonda control seleccionada. La determinación de la hibridación de dicha sonda indica el grado de recuperación de los ácidos nucleicos durante su preparación, así como una estimación de la alteración causada en los ácidos nucleicos durante el procesamiento de la muestra.
Una vez que se proporcionan un conjunto de sondas que muestra la especificidad adecuadas y un conjunto de sondas control, estas últimos están dispuestas en la matriz en una posición conocida de tal manera que, tras los pasos de hibridación y detección, es posible establecer una correlación entre una señal positiva de hibridación y el gen particular a partir de las coordenadas de la matriz en las que se detecta la señal positiva de hibridación.
Las micromatrices pueden ser matrices de alta densidad, con miles de oligonucleótidos por medio de métodos de síntesis in situ fotolitográficos (Fodor et al., 1991, Science, 767-773). Este tipo de sonda suele ser redundante, es decir, incluyen varias sondas para cada ARNm que se va a detectar. En una forma de realización preferida, las matrices son matrices de baja densidad o LDA que contienen menos de 10.000 sondas por centímetro cuadrado. En dichas matrices de baja densidad, las diferentes sondas se aplican manualmente con la ayuda de una pipeta en diferentes lugares de un soporte sólido (por ejemplo, una superficie de cristal, una membrana). Los soportes utilizados para fijar las sondas se pueden obtener de una gran variedad de materiales, como plástico, cerámica, metales, geles, membranas, cristales, y similares. Las micromatrices se pueden obtener usando cualquier metodología conocida por el experto en la materia.
Después de la hibridación, en los casos en que el ácido nucleico no hibridado es capaz de emitir una señal en el paso de detección, es necesaria una etapa de lavado para eliminar dicho ácido nucleico no hibridado. La etapa de lavado se lleva a cabo utilizando métodos y soluciones conocidos por el experto en la materia.
En el caso de que el marcaje en el ácido nucleico no sea directamente detectable, es posible conectar la micromatriz que comprende los ácidos nucleicos diana unidos a la matriz con los otros componentes del sistema necesarios para producir la reacción que da lugar a una señal detectable. Por ejemplo, si los ácidos nucleicos diana se marcan con biotina, la matriz se pone en contacto con estreptavidina conjugada con un reactivo fluorescente en condiciones adecuadas para que la unión entre la biotina y la estreptavidina se produzca. Después de la incubación de la micromatriz con el sistema de generación de la señal detectable, es necesario llevar a cabo una etapa de lavado para eliminar todas las moléculas que se han unido de forma no específica a la matriz. Las condiciones de lavado las determinará el experto en la materia, usando condiciones adecuadas según el sistema de generación de la señal detectable y que son bien conocidos por el experto en la materia.
El patrón de hibridación resultante se puede ver o detectar de diferentes maneras, dicha detección se determina por el tipo de sistema utilizado en la micromatriz. Por tanto, la detección del patrón de hibridación se puede llevar a cabo por medio de recuento de centelleo, autorradiografía, determinación de una señal fluorescente, determinaciones calorimétricas, detección de una señal luminosa, etc.
Después de la hibridación y los posibles procesos de lavado y tratamiento posteriores, el patrón de hibridación se detecta y cuantifica, por lo que la señal correspondiente a cada punto de la hibridación en la matriz se compara con un valor de referencia correspondiente a la señal emitida por un número conocido de ácidos nucleicos terminalmente marcados con el fin de obtener así un valor absoluto del número de copias de cada ácido nucleico que hibrida en un cierto punto de la micromatriz.
En el caso de que los niveles de expresión de los genes según la presente invención se determinen mediante la medida de los niveles del polipéptido o polipéptidos codificados por dicho gen o genes, los kits según la presente invención comprenden reactivos que son capaces de unirse específicamente a dicho polipéptido o polipéptidos. Para ello, las matrices de anticuerpos tales como las descritas por De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Ge et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath y Schreiber (2000) Science 289:1760-1763, documentos WO 01/40803 y WO 99/51773A1 son útiles. Los anticuerpos de la matriz incluyen cualquier agente inmunológico capaz de unirse a un ligando con alta afinidad, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, así como moléculas similares a anticuerpos que tienen un sitio de unión al antígeno, tales como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio único o DABS, Fv, scFv y similares. Las técnicas para preparar dichos anticuerpos las conoce muy el experto en la materia e incluyen los métodos descritos por Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992)).
Los anticuerpos de la matriz se pueden aplicar a gran velocidad, por ejemplo, mediante sistemas robóticos disponibles comercialmente (por ejemplo, los producidos por la Genetics Microsystems o Biorobotics). El sustrato de la matriz puede ser nitrocelulosa, plástico, cristal o puede ser de un material poroso, como por ejemplo, acrilamida, agarosa u otro polímero. En otra forma de realización, es posible utilizar células que producen los anticuerpos específicos para la detección de las proteínas de la invención por medio de su cultivo en filtros matriz. Después de la inducción de la expresión de los anticuerpos, estos últimos se encuentran inmovilizados en el filtro en la posición de la matriz donde se localizó la célula productora. Se puede poner en contacto una matriz de anticuerpos con una diana marcada y se puede determinar el nivel de unión de la diana a los anticuerpos inmovilizados. Si la diana no está marcada, se puede utilizar un ensayo de tipo sándwich en el que se usa un segundo anticuerpo marcado específico para el polipéptido que se une al polipéptido que se inmoviliza en el soporte. La cuantificación de la cantidad de polipéptido presente en la muestra en cada punto de la matriz se puede almacenar en una base de datos como un perfil de expresión. La matriz de anticuerpos se puede producir por duplicado y se puede utilizar para comparar los perfiles de unión de dos muestras diferentes.
En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de un kit de la invención para predecir el desenlace de un paciente que padece cáncer colorrectal o para determinar si un paciente que padece cáncer colorrectal es candidato a quimioterapia o radioterapia después de la cirugía, o para seleccionar un paciente que es probable que se beneficie de la terapia adyuvante después de la resección quirúrgica del cáncer colorrectal. En una forma de realización preferida, el uso de los kits según la invención se lleva a cabo en pacientes que padecen CCR en estadio II o estadio III.
Métodos para el tratamiento de metástasis de cáncer colorrectal
Los autores de la presente invención han observado que la inhibición farmacológica de la señalización de TGF-beta bloquea el inicio de la metástasis de cáncer colorrectal (véase el ejemplo 4). Por tanto, el documento también divulga un inhibidor de TGF-beta para su uso en el tratamiento o la prevención de metástasis de cáncer colorrectal. En otra divulgación, el documento enseña un método para el tratamiento o la prevención de metástasis de cáncer colorrectal en un sujeto que lo necesita que comprende la administración a dicho paciente de un inhibidor de TGF-beta.
El término “metástasis” como se usa en el presente documento se refiere al crecimiento de un tumor canceroso en un órgano o parte del cuerpo, que no está relacionada directamente con el órgano del tumor canceroso original. Se entenderá que metástasis incluye micrometástasis, que es la presencia de una cantidad indetectable de células cancerosas en un órgano o parte del cuerpo que no está relacionada directamente con el órgano del tumor canceroso original. En una forma de realización preferida, la metástasis es metástasis hepática.
En una forma de divulgación particular, la invención se refiere se refiere a un inhibidor de TGF-beta para su uso en el tratamiento o la prevención de metástasis de cáncer colorrectal derivada de un tumor colorrectal que tiene un alto contenido en células madre de cáncer de colon (CoCSC). Los términos “célula madre de cáncer de colon” o “CoCSC”, como se usan en el presente documento, se refieren a una célula que tiene la capacidad para proliferar de manera extensa y formar nuevos tumores de colon, es decir, células con potencial proliferativo indefinido que dirigen la formación y el crecimiento de tumores de colon. Una célula madre de cáncer tiene la capacidad para recrecer un tumor tal como se demuestra por su capacidad para formar tumores en ratones inmunocomprometidos, y normalmente para formar tumores tras el trasplante en serie posterior en ratones inmunocomprometidos. El término “alto contenido” significa que el cáncer colorrectal tiene un porcentaje de CoCSC de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o hasta el 100% de las células del tumor colorrectal. El experto sabe cómo determinar si una célula es una CoCSC así como cómo cuantificar el contenido de CoCSC de un tumor colorrectal usando, por ejemplo, los métodos descritos por Merlos-Suarez et al., (2011, Cell Stem Cell 8, 511-524).
El término “inhibidor de TGF-beta” se ha descrito anteriormente en el contexto del método personalizado según la invención e incluye inhibidores específicos de TGF-P1, TGF-P2 o TGF-P3 así como inhibidores de amplio espectro que inhiben dos o más de las isoformas anteriores.
En una divulgación preferida, el inhibidor de TGFp es LY2157299 ((2-(6-metil-piridin-2-il) -3-[6-amido-quinolin-4-il) -5,6-dihidro-4H-pirrolo [ 1, 2-b] pirazol) inhibidor del receptor de TGF-beta tipo I; Lilly Research) en forma cristalina o cualquier polimorfo, solvato o hidrato del mismo.
En una forma de divulgación particular, el inhibidor de TGF-beta se selecciona del grupo que consiste en cualquier compuesto identificado en la tabla 1 o cualquier combinación de los mismos. En una divulgación más particular, el inhibidor de TFG-beta es un compuesto que tiene la estructura
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o cualquier polimorfo, solvato o hidrato del mismo.
Los métodos de la presente divulgación incluyen la administración de un inhibidor de TGF-beta mediante una vía de administración que incluye, pero no se limita a, oral, rectal, nasal, pulmonar, epidural, ocular, ótica, intraarterial, intracardiaca, intracerebroventricular, intradérmica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraósea, intratecal, intravesical, subcutánea, tópica, transdérmica y transmucosa, tal como mediante las vías de administración sublingual, bucal, vaginal y de inhalación.
Los inhibidores de TGF-beta para su uso según la divulgación pueden formularse en una composición farmacéutica. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma farmacéutica adecuada para su administración a un sujeto, incluyendo de manera ilustrativa formas farmacéuticas sólidas, semisólidas y líquidas tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, supositorios, píldoras, disoluciones, suspensiones, pomadas, lociones, cremas, geles, pastas, pulverizadores y aerosoles. Los liposomas y las emulsiones son tipos bien conocidos de formulaciones farmacéuticas que pueden usarse para administrar un agente farmacéutico, particularmente un agente farmacéutico hidrófobo. Las composiciones farmacéuticas incluyen generalmente un portador farmacéuticamente aceptable tal como un excipiente, diluyente y/o vehículo. Pueden usarse formulaciones de liberación retardada de composiciones y sistemas de liberación retardada, tales como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos.
El término “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un portador que es adecuado para su uso en un sujeto sin toxicidad o irritación excesivas para el sujeto y que es compatible con otros componentes incluidos en una composición farmacéutica. Se conocen bien en la técnica portadores farmacéuticamente aceptables, métodos para preparar composiciones farmacéuticas y diversas formas farmacéuticas, así como modos de administración, por ejemplo tal como se detalla en Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, eds. H. A. Lieberman et al., Nueva York: Marcel Dekker, Inc., 1989; y en L. V. Allen, Jr. et al., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8a Ed., Filadelfia, Pa.: Lippincott, Williams and Wilkins, 2004; A. R. Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams and Wilkins, 21a ed., 2005, particularmente el capítulo 89; y J. G. Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill Professional, 10a ed., 2001. La dosificación del TGF-beta para su uso según el método de la divulgación variará basándose en factores tales como, pero sin limitarse a, la vía de administración; la edad, la salud, el sexo y el peso del sujeto al que va a administrarse la composición; la naturaleza y el grado de los síntomas del sujeto, si existe alguno, y el efecto deseado. La dosificación puede ajustarse dependiendo de si el tratamiento va a ser agudo o continuo. Un experto en la técnica puede determinar una cantidad farmacéuticamente eficaz en vista de estas y otras consideraciones típicas en la práctica médica. Se encuentra información detallada referente a componentes, equipo y procedimientos habituales para preparar formas farmacéuticas en Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, eds. H. A. Lieberman et al., Nueva York: Marcel Dekker, Inc., 1989; y en L. V. Allen, Jr. et al., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8a Ed., Filadelfia, Pa.: Lippincott, Williams and Wilkins, 2004; A. R. Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams and Wilkins, 21a ed., 2005, particularmente el capítulo 89; y J. G. Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill Professional, 10a ed., 2001.
En una divulgación particular, el paciente se ha seleccionado como que probablemente responde a la terapia con un inhibidor de TGF-beta mediante el método pronóstico de la invención o los métodos terapéuticos personalizados de la invención.
La invención se detalla a continuación por medio de los siguientes ejemplos que son únicamente ilustrativos y de ninguna manera limitantes del ámbito de la invención.
Ejemplos
Materiales y métodos
Material clínico
Se obtuvieron muestras de tejidos humanos del Departamento de Patología de1Hospital del Mar u Hospital Clinic (Barcelona, España), con la aprobación del Comité del Banco de Tumores según la normativa ética española. El estudio siguió las directrices de la Declaración de Helsinki y la identidad de los pacientes de las muestras patológicas permaneció en el anonimato en el contexto de este estudio. Se hicieron crecer fibroblastos humanos a partir de explantes nuevos obtenidos de o bien una muestra de adenoma colorrectal (fibroblastos asociados a adenoma o AAF) o bien una muestra de carcinoma colorrectal (fibroblastos asociados a cáncer o CAF) mediante protocolos convencionales (Freshney; Culture of animal cells: a manual of basic techniques, cuarta edición, publicado por Wiley-Liss). Se obtuvieron fibroblastos humanos normales de colon (CCD-18Co) de la ATCC. Se cultivaron todos los fibroblastos durante menos de 10 pases antes de los experimentos.
Clasificación de las muestras de los tumores según la tinción de p-Smad3
Se tiñeron muestras de adenomas (n = 25) y CCR (n = 30) recogidas rutinariamente en e1Hospital del Mar con anticuerpo anti-p-SMAD3. La categorización cualitativa de las muestras según la intensidad o tinción global de p-SMAD3 en células del estroma asociadas al tumor y cancerosas epiteliales la llevó a cabo un patólogo experto (M.I.). Los niveles medios de tinción se resumieron en tres categorías: alta, media y baja. Para el estroma asociado al tumor, se consideraron todos los tipos celulares.
Disgregación y tinción del tumor
Se cortaron tumores recién obtenidos de pacientes con CCR tratados en el Hospital del Mar u Hospital Clinic (Barcelona, España) con una cuchilla estéril y se incubaron con rotación durante 20-30 minutos a 37°C en DMEM/F12 (Gibco), que contenía penicilina/estreptomicina 100X (Gibco), y colagenasa IV (Sigma; 100 U ml-1). Se homogeneizaron luego los trozos pipeteando y se pasaron a través de agujas consecutivas de 18G y 21G. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de SFB al 10% y se recogieron células individuales por filtración secuencial a través de filtros de células de 100 pm ^ 70 pm ^ 40 pm (BD Falcon). Las células se centrifugaron, se resuspendieron en 5 ml de cloruro de amonio (0,15 M, Sigma Aldrich) y se incubaron 3 minutos a temperatura ambiente para lisar los eritrocitos. Después de dos lavados con HBSS (Lonza), se tiñeron las células en tampón de tinción (SB: DMEM/F12 SFB al 5%) con anticuerpo no conjugado con FAP (30 min.; 1/50). Tras dos lavados con HBSS (Lonza), se tiñeron las células en SB con un anticuerpo de mono anti-conejo conjugado con APC (30 min.; 1/400; Jackson); anticuerpo conjugado anti-hEPCAM/TROP1-FITC (30 min.; 1/50; R&D) y anticuerpo conjugado anti-CD31-PE (10 min.; 1/10; Miltenyi Biotec), anticuerpo conjugado anti-CD45-PE-Cy7 (30 min.; 1/50; R&D). Se marcaron las células muertas con yoduro de propidio (Sigma Aldrich). Se usó clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para separar 2000 células de cada población de células tumorales; células de origen hematopoyético [CD45+EPCAM-CD31-FAP-], células epiteliales tumorales [CD45-EPCAM+CD31-FAP-], células endoteliales [CD45-EPCAM-CD31+FAP-] y fibroblastos asociados a cáncer [CD45-EPCAM-CD31-FAP+] de seis muestras de CCR primario. Se procesó el ARN y se amplificó tal como se describió previamente (Gonzalez-Roca et al., 2010, PLoS One 5, e14418). Se hibridó cada muestra (4 poblaciones de células tumorales por 6 muestras de CCR) en matrices HT HG-U133+ PM (conjunto de datos GEO GSE39396). También se aislaron mediante FACS las poblaciones CD45+EPCAM-, CD45-EPCAM+ y CD45-EPCAM- de ocho muestras de CCR adicionales. Este segundo conjunto (3 poblaciones de células tumorales por 8 muestras) se hibridó en la matriz Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 (conjunto de datos GEO GSE39395). El marcaje y la hibridación de muestras en los chips de expresión génica Affymetrix los realizaron la IRB Transcriptomic Core Facility usando metodología convencional. Para el análisis, se pusieron en común 14 matrices CD45+ y EPCAM+ a partir de los dos conjuntos de hibridaciones. Se usó limma para ajustar los efectos de lotes al nivel del conjunto de sondas. Se realizaron los tres contrastes FAP+ frente a CD31+, FAP+ frente a CD45+ y FAP+ frente a EPCAM+, y se definieron genes específicos de FAP como los regulados por incremento con valor de p de limma < 0,05 (Smyth et al., 2004, Linear Models for Microarray, User's Guide) en las tres comparaciones. Se definieron de manera análoga genes específicos de CD31, CD45 y EPCAM..
Generación de firmas de expresión génica TBRS individuales
Se sembraron AAF, CAF y fibroblastos derivados de mucosa de colon normal (CCD_co_18) al 60% de confluencia y se cultivaron en condiciones de baja cantidad de suero (0,2%) antes del tratamiento con TGF-beta 1 (Peprotech; 5 ng ml-1) durante 8 horas. Se midieron los perfiles de expresión génica por duplicado usando HG-U133 plus 2.0. Se usaron corrección de fondo de RMA, normalización de cuantiles y sumarización de RMA (Gautier et al., 2004, Bioinformatics 20, 307-315). Se obtuvo una firma de respuesta a TGF-beta (TBRS) para cada población de fibroblastos seleccionando genes con valor de p de limma < 0,05 y una regulación por incremento de al menos dos veces en fibroblastos tratados con TGF-beta.
Para cada firma de respuesta a TGF-beta individual (TBRS) derivada del experimento anterior (AAF-TBRS; CCR-TBRS y CCD-TBRS), se seleccionaron los genes que se expresaban específicamente en fibroblastos asociados a cáncer (FAP+) y/o células endoteliales (CD31+) a partir de 16 pacientes con cáncer colorrectal (conjuntos de datos GEO g Se39396 y GSE39395) definidos tal como se describió anteriormente y en Calon et al., Cancer Cell 2012, (en prensa). Además, se restaron todos los genes que aparecían en la publicación Calon et al., Cancer Cell 2012, en prensa). Este análisis produjo una firma de 73 genes anotados (134 sondas; TBRS de esta invención) de los que se derivaron factores pronósticos específicos.
Las firmas de respuesta a TGF-beta en células T (Stockis et al., 2009, Eur J Immunology, 2009, 39: 869-82), macrófagos (Gratchev et al., 2008, J. Immunology 2008, 180: 6553-65) y células endoteliales (Wu et al., 2006, Microvascular. Res. 2006, 71: 12-9) se habían descrito anteriormente. Para las T-TBRS se usó el conjunto de datos GEO GSE14330 (Stockis et al., 2009, citado anteriormente) y para los macrófagos (Ma-TBRS) se usó GSE7568 (Gratchev et al., 2008, citado anteriormente). Se definieron las firmas TBRS como genes con valor de p de limma < 0,05 y regulados por incremento al menos dos veces en muestras tratadas con TGF-beta. En el caso de células T, se pusieron en común entre sí conjuntos de datos de expresión génica de clones Th independientes cultivados más o menos la adición de TGF-beta tal como se describe en GSE14330 (Stockis et al., 2009, citado anteriormente). Para el caso de los macrófagos, se compararon datos de micromatrices de macrófagos maduros (tratados con IL4 en combinación con dexametasona durante 5 días), estimulados o no con TGF-beta durante 24 h tal como se detalla en GSE7568 (n = 5 muestras en cada grupo). Para la firma de respuesta a TGF-beta endotelial (End-TBRS), se usó la lista de genes regulados por incremento en células endoteliales de microvasos humanos tras la exposición a TGF-beta tal como se describió previamente (Wu et al., 2006, citado anteriormente), seleccionando de nuevo genes con valor de p < 0,05 y regulados por incremento al menos dos veces. La Str-TBRS se derivó tal como se describió anteriormente a partir de fibroblastos intestinales normales CCD-co-18 cultivados en condiciones de suero al 0,5% antes del tratamiento con TGF-beta 1 (Peprotech; 5 ng ml-1) durante 8 horas.
Conjuntos de datos
Conjuntos de datos que corresponden a adenomas y carcinomas de colon humano se han descrito anteriormente (Sabates-Bellver et al., 2007; Mol. Cancer Res., 5, 1263-1275; van der Flier et al., 2007; Gastroenterology, 132, 628­ 632). Para correlacionar la expresión génica con la evolución de la enfermedad clínica, se combinaron dos conjuntos de perfiles transcriptómicos de Affymetrix (GSE17537 y GSE14333), disponibles en Gen Expression Omnibus, www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, correspondientes a los CCR primarios para los que estaba disponible el seguimiento clínico. GSE1753729 está compuesto por 55 pacientes de cáncer de colon tratados en el Centro Médico Universitario Vanderbilt (Vanderbilt, EE UU). GSE1433330 contiene un conjunto de 290 pacientes con CCR tratados en dos hospitales diferentes, Peter MacCallum Cancer Center (Australia) y H. Lee Moffitt Cancer Center (EE UU). Los datos clínicos anotados disponibles para los conjuntos de datos GSE17537 y GSE14333 incluían el estadio del AJCC, edad, sexo e intervalos de supervivencia sin enfermedad. La representación de las muestras de tumores en diferentes estadios del AJCC en estas cohortes sigue la distribución natural de los pacientes con CCR que reciben tratamiento estándar en los hospitales anteriormente mencionados. Con el fin de eliminar sesgos sistemáticos entre los conjuntos de datos, los niveles de expresión de todos los genes se transformaron en puntuaciones z antes de la puesta en común. Para los estudios de validación in silico se usaron dos cohortes adicionales, los conjuntos de datos GSE33113 y GSE26906. GSE33113 contenía un conjunto de material de 90 pacientes de CCR en estadio II del AJCC recogido en el Academic Medical Centre (AMC) en Ámsterdam, Países Bajos. Se mantuvieron extensas historias clínicas de estos pacientes y el seguimiento clínico a largo plazo estaba disponible para la gran mayoría. Las 90 muestras de CCR en estadio II en la cohorte descrita en GSE26906 (Birnbaum et al. 2012; Transl Oncol 5:72-6) no contenían seguimiento clínico, sólo datos sobre si los pacientes experimentaban metástasis o no.
Asociación de firmas de expresión génica con parámetros clínicos
GSEA (Subramanian et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 15545-15550) se basaba en genes de clasificación según su cambio en veces para las variables indicadas. La salida de GSEA es una puntuación de enriquecimiento (ES), una puntuación de enriquecimiento normalizado (NES) que representa el tamaño del gen que está sometiéndose a prueba, un valor de p y un índice de falso descubrimiento (FDR). Se usó la implementación de GSEA proporcionada en el paquete Bioconductor phenoTest. Se calcularon valores de p usando 10.000 permutaciones para cada firma y se ajustaron con el método de Benjamini-Yekutieli (Benjamini et al., 2001, Behav Brain Res 125, 279-284).
Se ajustó un modelo de regresión logística basado en SCAD (Fan & Li, 1999, Journal of the American Statistical Association, 1999, 96, 1348-60) para predecir hechos recurrentes basándose en la edad, sexo, estadio y expresión génica del paciente, y se seleccionaron las variables con estimaciones de los coeficientes no cero. El parámetro de penalización SCAD se estableció a través de validación cruzada de 10 veces, tal como se aplica en el paquete R ncvreg. Se realizó este análisis para pacientes en el estadio II, III y también para todos los pacientes, que proporcionaron varias firmas génicas cortas y altamente predictiva.
Con el fin de evaluar más a fondo la asociación de cada firma génica y la supervivencia sin enfermedad, se calculó la expresión media de la firma (es decir, a través de todos los genes en la firma) y se ajustó a los modelos de riesgos proporcionales de Cox multifactoriales que incluían el estadio como una variable de ajuste. Para visualizar los resultados se estratificaron los pacientes según su expresión media de la firma y se obtuvieron gráficas de Kaplan-Meier, y se estimó el efecto en el cociente de riesgos como una función continuamente diferenciable usando splines penalizados cuarticos (Eilers et al, 1996, Statistical Science, 11, 89 -121), tal como se aplica en el paquete R pspline. Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó en secciones de parafina utilizando anticuerpos primarios generados contra fosfo-SMAD3 (Rockland). Brevemente, las secciones se esterilizaron en autoclave 10 minutos en tampón citrato pH 6 antes de la incubación con anti fosfo-smad 3 (1/100). Se usaron anticuerpos secundarios biotinilados (Vector Laboratories Inc) a una dilución 1:200 y se detectaron usando el kit Vectastain ABC (Vector Laboratories Inc), según lo recomendado por el proveedor.
Estudios en ratones ortotópicos
Todos los experimentos con modelos de ratón se aprobaron por el comité de uso y cuidado de animales del Parque Científico de Barcelona (CEEA-PCB) y el gobierno catalán. Se inyectaron células por vía subcutánea en ratones NSG o Swiss desnudos de 5 a 6 semanas de edad (Jackson Labs), que se siguieron durante los periodos descritos. Se evaluó la aparición de tumores mediante palpación. Se usaron ratones NSG o Balb/c desnudos de cinco a seis semanas de edad (Jackson Labs) para realizar experimentos de metástasis mediante inyección intraesplénica (Warren et al., 1995, J. Clin.Invest. 95, 1789-1797)
Tratamiento con LY2157299.
Se sintetizo el antagonista de cinasa de receptor I de TGF-beta, LY2157299, desarrollado por Eli Lilly (Beight, 2004, Eli Lilly and Co. Solicitud internacional PCT. En la solicitud internacional PCT WO2004048382A1; Bueno et al., 2008; Eur J Cancer 44, 142-150) siguiendo el procedimiento descrito (Mundla, 2007; Eli Lilly and Company. Solicitud internacional PCT WO2007018818A1. In, (EE.UU)). Se suspendió el inhibidor de receptor de tipo I de TGF-beta LY2157299 en una formulación (vehículo) compuesta por carboximetilcelulosa sódica al 1% (NaCMC), lauril sulfato de sodio al 0,4% (SLS), antiespumante al 0,05% y polivinilpirrolidona al 0,085% (PVP) en una concentración de 6,67 mg ml-1. Se dosificaron los ratones dos veces al día con 2 mg en 300 |il (2 mg) por vía oral comenzando 3 días antes de la inoculación de líneas celulares de CCR. Se usó un tratamiento con una dosificación diez veces superior durante 3 días para mostrar la regulación por disminución del ARNm del gen diana y la señalización de TGF-beta (p-SMAD2) en xenoinjertos preestablecidos.
Obtención de imágenes bioluminiscentes y análisis
Se anestesiaron los ratones, se les inyectó por vía retroorbital D-luciferina (Promega) y se obtuvieron imágenes de la actividad luciferasa tal como se describió anteriormente (Minn et al., 2005; J Clin Invest 115,44-55). Se usó la actividad luciferasa medida inmediatamente tras la inyección de células para excluir cualquier ratón que no tenía xenoinjertos satisfactorios y para normalizar la bioluminiscencia. Para el seguimiento de la bioluminiscencia, se infectaron mediante lentivirus las líneas celulares con un constructo indicador de proteína de fusión que codificaba proteína de fluorescencia roja (cereza) y luciferasa de luciérnaga.
Ejemplo 1
Señalización de TGF-beta en la evolución de CCR
Se exploró la señalización de TGF-beta durante la evolución del CCR. El perfil de la expresión génica de muestras de tumores de colon confirmó los niveles elevados de los ARNm de TGFB1, TGFB2 y TGFB3 en un subconjunto de los CCR, mientras que todos los adenomas mostraron bajos niveles de las tres isoformas de TGF-beta (Fig. 1). Los rasgos característicos de la transición adenoma-CCR incluyen reacción desmoplásica, inflamación y neovascularización aumentadas, todos los cuales implican varias tipos celulares no cancerosas que residen en el estroma tumoral.
Para identificar las poblaciones de células diana de TGF-beta en los adenomas y CCR, se usó la fosforilación de SMAD3 (p-SMAD3) como un marcador de la vía de activación de TGF-beta. El análisis de inmunohistoquímica en el material clínico reveló acumulación nuclear prominente de p-SMAD3 en las células cancerosas epiteliales en el 40% de los adenomas, pero sólo en el 7% de los CCR (Fig. 2). Este hallazgo puede reflejar la adquisición frecuente de mutaciones inactivantes en los componentes de la vía de señalización de TGF-beta durante la evolución del CCR. Además, las células epiteliales de CCR p-SMAD3+ pueden tener respuesta transcripcional deficiente de TGF-beta debido a alteraciones genéticas en SMAD4 (Liu et al, 1997, Genes Dev, 11: 3157-3167 y Alarcón, C., 2009, Cell, 139: 757-769). Al mismo tiempo que la pérdida de señalización epitelial de TGF-beta en los CCR, las células estromales tumorales mostraron altos niveles de p-SMAD3 (Fig. 2. Mientras que el estroma de la mayoría de los adenomas contenía pocas células altamente positivas para p-SMAD3 y se teñían débilmente en conjunto, una gran proporción de los CCR (63%) se caracterizaron por una abundancia de células estromales con una fuerte tinción nuclear de p-SMAD3.
En conjunto, estas observaciones sugieren que un subgrupo de tumores de colon experimenta un aumento en la expresión de TGF-beta en la transición adenoma-carcinoma, y los componentes tumorales del estroma son los principales contribuyentes a este aumento. Los niveles elevados de TGF-beta en los CCR preferiblemente se dirigen a células estromales asociadas al tumor más que a las células cancerosas.
Ejemplo 2
Identificación de genes inducidos por TGF-beta que se asocian con un desenlace negativo en CCR.
Como se muestra en el ejemplo 1, p-SMAD3 se acumulaba en el núcleo de diferentes células tumores asociadas al estroma incluyendo. Se caracterizaron los tipos de células del estroma teñidas por p-SMAD3 en CCR pero no se pudo diferenciar ninguna especificidad de tipo de célula obvia. En su lugar, p-SMAD3 marcaba de manera indiscriminada todos los tipos principales de células del estroma en CCR incluyendo celulas T, macrófagos, células endoteliales y fibroblastos (datos no mostrados).
Se determinaron los genes del estroma activados por TGF-beta asociados con evolución de la enfermedad clínica. Para este fin, se usaron como sustitutos los programas de expresión génica inducidos mediante la adición de TGF-beta (firmas de respuesta a TGF-beta o TBRS) en cultivos de células T derivadas de tejido normal (T-), macrófagos (Ma-), células endoteliales (End-) o fibroblastos (Fib-). Se usó el conjunto completo de genes regulados por incremento mediante la señalización de TGF-beta en estos cultivos de células (>2 veces, p<0,05). Se investigó una cohorte puesta en común representativa de 340 casos de CCR tratados en tres hospitales diferentes para los que los perfiles transcriptómicos de tumores primarios y el seguimiento clínico estaban disponibles públicamente (véanse los métodos). Mediante análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA) (Subramanian et al., 2005, supra.), se determinó que todas las TBRS del estroma estaban altamente enriquecidas en CCR en comparación con adenomas (Fig. 3). Estas firmas eran buenos factores pronósticos de recaída de la enfermedad en pacientes con CCR en estadio I, II y III en la cohorte de pacientes y segregaban un grupo de pacientes con baja expresión sin prácticamente riesgo de cáncer recurrente después de la terapia (no mostrado).
Para analizar adicionalmente la expresión específica del tipo de célula de cada TBRS del estroma in vivo, se purificaron mediante FACS diversas poblaciones de células a partir de muestras de CCR nuevas y se evaluaron sus perfiles de expresión génica (véase Materiales y métodos). Los niveles relativos de genes de marcadores específicos del tipo de célula confirmaron la purificación de células tumorales epiteliales (EPCAM+), leucocitos (CD45+), células endoteliales (CD31+) y fibroblastos (FAP+) (datos no mostrados).
De manera notable, un análisis comparativo reveló una tendencia muy significativa hacia niveles de alta expresión de los genes dentro de las TBRS que se asociaban de manera positiva con recaída del cáncer (HR>1, p<0,05) en CAF y en células endoteliales (Fig. 4). En otras palabras, a partir de todos los genes en la T-TBRS, Ma-TBRS, End-TBRS y Str-TBRS hay una expresión elevada de genes inducidos por TGF-beta asociados a recidiva en fibroblastos asociados a cáncer FAP+ y células endoteliales purificadas a partir de tumores de CCR (Fig. 4). En conjunto, estos datos destacan que la respuesta de las células del estroma a TGF-beta es un factor pronóstico preciso de recaída de la enfermedad en pacientes de CCR. Mientras que altos niveles de TGFB activan programas génicos en una amplia gama de tipos de células del estroma asociadas a tumores, los datos de las poblaciones de células purificadas a partir de pacientes de CCR indican que CAF, y en un menor grado células endoteliales, son los contribuyentes principales a la asociación de programas dirigidos por TGF-beta del estroma con un mal desenlace después de la terapia.
Se identificó a continuación el conjunto de genes regulados por TGF-beta en fibroblastos intestinales. Se cultivaron fibroblastos asociados a cáncer (CAF), fibroblastos asociados a adenoma (AAF) y fibroblastos derivados de mucosa de colon normal (CCD_co_18) en presencia o ausencia de TGF-beta y se midieron los perfiles de expresión génica globales por duplicado usando HG-U133 plus 2.0. Se obtuvo una firma de respuesta a TGF-beta (TBRS) para cada población de fibroblastos seleccionando genes con valor de p de limma < 0,05 y una regulación por incremento de al menos dos veces en fibroblastos tratados con TGF-beta.
A partir de cada firma de respuesta a TGF-beta individual derivada del experimento anterior (AAF-TBRS; CCR-TBRS and CCD-TBRS), se seleccionaron los genes expresados específicamente en fibroblastos asociados a cáncer (FAP+) y/o células endoteliales (CD31+) purificadas de pacientes de cáncer colorrectal (Fig. 3; conjuntos de datos GEO GSE39396 y GSE39395). Se obtuvieron los perfiles de expresión génica descritos en GSE39396 y GSE39395 tal como se describe en Materiales y métodos y en Calon et al., Cancer Cell 2012, (en prensa). Se definieron genes específicos de FAP como los regulados por incremento con valor de p de limma < 0,05 (Smyth, 2004, et al., Linear Models for Microarray, User's Guide 2004) en las tres comparaciones de poblaciones de células FAP+ frente a CD31+ (endoteliales), FAP+ frente a CD45+ (leucocitos) y Fa P+ frente a EPCAM+ (epiteliales) (figura 5 y tabla I). Se definieron de manera análoga genes específicos de CD31 (figura 5 y tabla I). Además, se restaron todos los genes que aparecen en la publicación Calon et al., Cancer Cell 2012, en prensa. Este análisis produjo una firma de 73 genes anotados (figura 5 y tabla I, 134 sondas; TBRS de esta invención) de la que se derivaron factores pronósticos específicos.
Tabla 1: Lista de genes que están regulados al menos dos veces por TGF-beta en o bien fibroblastos asociados a adenoma estimulados (AAF), fibroblastos asociados a carcinoma (CAF) o bien fibroblastos de colon normales (CCD) y que se expresan específicamente en tumores de CCR in vivo en o bien fibroblastos asociados a cáncer (FAP+) o bien células endoteliales (CD31+) frente a las otras poblaciones (EpCAM+ epiteliales y leucocitos CD45+) en donde “FC más TGFbeta en:” se refiere al cambio en veces en el nivel de expresión génica en las células estimuladas por TGF-beta indicadas y en donde “CAF frente al resto” se refiere a la expresión génica específica en la fracción de fibroblastos asociados a cáncer (FAP+) y “End- frente al resto” se refiere a la expresión génica específica en células endoteliales (CD31+) a partir de varios tumores humanos desagregados. NA: No anotado.
FC más TGFbeta en: Aumento de la expresión en:
CAF frente al End. frente al ID de Affy Gen AAF CAF CCD resto resto
205132_at ACTC1 6,8 2,9 17,1 •/ •/
220866_at ADAMTS6 2,0 2,3 7,0 •/
206176_at BMP6 3,2 -1,5 6,1 •/
225990_at BOC 2,2 1,9 1,7 •/
227883_at CCDC71L 1,6 -1,1 2,2 •/
206932_at CH25H 2,1 2,3 4,6 •/
203951_at CNN1 2,1 1,1 2,1 •/
206818_s_at CNNM2 2,2 1,5 2,3 •/
209874_x_at CNNM2 2,0 1,3 2,0 •/
1554523_a_at CNNM2 2,0 1,3 2,2 •/
211980_at COL4A1 1,50 2,07 1,62 •/
205713_s_at COMP 3,4 2,2 2,8 •/
225129_at CPNE2 1,3 1,6 2,7 •/
228759_at CREB3L2 2,3 1,6 2,9 •/
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
FC más TGFbeta en: Aumento de la expresión en:
CAF frente al End. frente al ID de Affy Gen AAF CAF CCD resto resto
204642_at S1PR1 2,3 1,1 -1,2 •/
228407_at SCUBE3 2,2 1,1 1,4 •/
232894_at SEC14L2 2,1 1,1 2,4 •/
212190_at SERPINE2 2,3 1,4 2,6 •/
227487_s_at SERPINE2 2,0 1,2 2,6 •/
201739_at SGK1 3,7 2,9 3,1 •/
207661_s_at SH3PXD2A 2,8 1,8 2,3 •/
213252_at SH3PXD2A 3,3 1,4 3,2 •/
224817_at SH3PXD2A 2,5 1,7 2,2 •/
230493_at SHISA2 1,7 6,1 1,2 •/
207390_s_at SMTN 1,4 -1,0 2,1 •/
209427_at SMTN 1,5 1,1 2,1 •/
221489_s_at SPRY4 -1,1 -1,2 2,6 •/
1555875_at SRGAP1 2,2 1,6 2,3 •/
1569269_s_at SRGAP1 2,5 1,3 2,9 •/
225720_at SYNPO2 1,2 1,3 4,8 •/
225721_at SYNPO2 1,1 1,3 3,3 •/
225894_at SYNPO2 1,4 1,3 4,3 •/
225895_at SYNPO2 1,1 1,3 3,4 •/
244108_at SYNPO2 1,1 1,2 3,3 •/
217287_s_at TRPC6 1,0 1,2 2,8 •/
209825_s_at UCK2 2,0 1,7 2,5 •/
Ejemplo 3
Identificación de minifirmas capaces de predecir el desenlace del CCR
La TBRS de esta invención se analizó adicionalmente como se describe en Materiales y métodos, para identificar el subconjunto mínimo de genes que proporciona buena predicción de la supervivencia sin enfermedad. Se identificó un subconjunto de cuatro genes (minifirma) formado por los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 que se asoció con el tiempo hasta la recidiva de una manera estadísticamente significativa en todos los pacientes analizados, así como en pacientes de los subgrupos en estadio II y estadio III. El análisis multivariante de riesgos proporcionales de Cox (tabla 2) demostró que la expresión de minifirma de 4 genes es un factor pronóstico independiente de recidiva del cáncer a partir del sistema de estadificación de AJCC para la identificación de pacientes de CRC que permanecen sin enfermedad después de la terapia.
Tabla 2. Análisis multivariantes usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox para evaluar la dependencia de la firma de expresión compuesta por FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 y la estadificación de AJCC en la predicción de la recaída del cáncer. Este análisis demostró que la expresión de los cuatro genes mencionados anteriormente es un factor pronóstico independiente de recidiva del cáncer a partir del sistema de estadificación de AJCC en la identificación de pacientes de CCR en riesgo alto o bajo de desarrollar enfermedad recurrente.
Figure imgf000042_0001
Por otra parte, como se muestra en la figura 6, la pendiente de la expresión media de la firma de cuatro genes muestra una relación lineal incremental aproximada con el riesgo de recidiva. Por cada aumento en la expresión global (+1 desviación estándar) de los cuatro genes, el riesgo de recidiva del cáncer aumentaba en un 93% (p<0,0001, HR por 1 desviación estándar = 1,93). La figura 7 muestra curvas de Kaplan Meier en donde la supervivencia de los pacientes se representa gráficamente dependiendo de la expresión media de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 en todos los pacientes (panel A), en pacientes en estadio II (panel B) o en pacientes en estadio III (panel C).
Cuando los pacientes se estratificaron según el estadio del tumor, se identificaron dos firmas adicionales que proporcionan predicción estadísticamente significativa del tiempo hasta la recidiva. En pacientes en estadio II, la firma de expresión formada por FAM46A, FHL2, FOXC2, COL4A1 y FRMD6 permitió la predicción del tiempo hasta la recidiva con una p <0,05 (Fig. 8A). En pacientes en estadio III, la firma de expresión formada por FAM46A, FHL2, FOXC2, COL4A, s PrY4 y Da CT3 permitió la predicción del tiempo hasta la recidiva con una p <0,0001 (Fig. 10A). En ambos casos, la expresión de la firma muestra un efecto incremental y aproximadamente lineal en el riesgo de recidiva (Fig. 9B y 10B).
Puesto que el estadio del tumor es una información disponible para el oncólogo en el momento del diagnóstico, se evaluó el valor pronóstico del factor pronóstico de 4 genes (FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1) o el factor pronóstico de 5 genes específicos para pacientes en estadio II (FAM46A, FHL2, FOXC2, COL4A1 y FRMD6) o el factor pronóstico de 6 genes específicos para pacientes en estadio III (FAM46A, FHL2, FOXC2, COL4A, SPRY4 y DACT3) en combinación con la estadificación. Esto permite la identificación de un grupo de pacientes con un riesgo muy bajo de recidiva de la enfermedad (local o distante) en ambos grupos. Poe ejemplo, usando el factor pronóstico de 6 genes, un coeficiente SCAD por debajo de o igual a -1 identifica un total de 38 pacientes que no experimentarán recidiva mientras que sólo 1 paciente con un coeficiente SCAD por debajo de -1 experimenta recidiva.
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Además se estudió la asociación del factor pronóstico de estadio II de 5 genes en dos cohortes independientes de pacientes en estadio II GSE 33113 (Fig. 10) y GSE 26906 (Fig. 11). La figura 10 muestra curvas de Kaplan Meier en donde la supervivencia de los pacientes se representa gráficamente dependiendo de la expresión media de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2, COL4A1 y FRMD6 en todos los pacientes (Fig. 10A). La pendiente de la expresión media de la firma de cinco genes en esta cohorte de pacientes muestra una relación lineal incremental aproximada con el riesgo de recidiva. Por cada aumento en la expresión global (+1 desviación estándar) de los cuatro genes, el riesgo de recidiva del cáncer aumentaba en un 104% (p=0,0008, HR por 1 desviación estándar = 2,04). La figura 11 muestra diagramas de cajas que ilustran la expresión de firma media en pacientes sin enfermedad y en pacientes que experimentan enfermedad metastásica a partir de la cohorte de pacientes GSE 26906. Esta cohorte no contiene datos sobre el seguimiento clínico.
Ejemplo 4

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un método para predecir el desenlace de un paciente que padece cáncer colorrectal, para seleccionar un tratamiento adecuado en un paciente que padece cáncer colorrectal o para seleccionar un paciente que es probable que se beneficie de terapia adyuvante después de la resección quirúrgica del cáncer colorrectal que comprende la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 en una muestra de dicho paciente,
    donde niveles de expresión aumentados de dichos genes con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo del paciente, de que el paciente es candidato para recibir terapia después de un tratamiento quirúrgico o de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico, o
    donde niveles de expresión disminuidos de dichos genes con respecto a valores de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo del paciente, de que el paciente no es candidato para recibir terapia después de un tratamiento quirúrgico o de que es improbable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, que comprende además la determinación de los niveles de expresión del gen FRMD6, donde el paciente es un paciente que padece cáncer colorrectal en estadio II, y
    en donde niveles de expresión aumentados de FRMD6 con respecto a un valor de referencia para dicho gen es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo, de que el paciente es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico, o
    en donde niveles de expresión disminuidos de FRMD6 con respecto a un valor de referencia para dicho gen es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo, de que el paciente no es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es improbable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.
  3. 3. Método según la reivindicación 1, que comprende además la determinación de los niveles de expresión de los genes SPRY4 y DACT3 y en donde el paciente es un paciente que padece cáncer colorrectal en estadio III y
    en donde niveles de expresión aumentados de SPRY4 y DACT3 con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo, de que el paciente es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico, o
    en donde niveles de expresión disminuidos de SPRY4 y DACT3 con respecto a un valor de referencia para dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo del paciente, de que el paciente no es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es improbable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.
  4. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en los genes ACTC1, BOC, CNN1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FILIP1L, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2
    en donde niveles de expresión aumentados de dichos uno o más genes con respecto a un valor de referencia para dichos uno o más genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo, de que el paciente es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico, o
    en donde niveles de expresión disminuidos de uno o más genes con respecto a un valor de referencia para uno o más genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo, de que el paciente no es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es improbable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.
  5. 5. Método según la reivindicación 4, que comprende además la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ADAMTS6, BMP6, CCDC71L, CH25H, CNNM2, CPNE2, CREB3L2, DCBLD1, EFR3B, EGR1, ELN, ENDOD1, FHOD3, FOXC1, FZD8, GBP1, GXYLT2, IGF1, IL4R, ITGA11, JPH2, KIAA1211, KIF26B, LIMK1, LINC00340, LPCAT2, LRRC8A, METTL7A, OLFM2, PID1, PPP1R12B, PRSS23, RASD2, RNF152, SCUBE3, SEC14L2, SERPINE2, SGK1, SH3PXD2A, SHISA2, SMTN, SRGAP1, TRPC6 y UCK2 y de los genes que hibridan específicamente con las sondas que tienen las secuencias SEQ ID NO:1 a 26
    en donde niveles de expresión aumentados de dichos uno o más genes con respecto a valores de referencia para dichos uno o más genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo, de que el paciente es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico, o
    en donde niveles de expresión disminuidos de uno o más de dichos genes con respecto a valores de referencia para uno o más de dichos genes es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo, de que el paciente no es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es improbable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.
  6. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se determina además el estadio tumoral del paciente y
    en donde un estadio tumoral alto es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace negativo, de que el paciente es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es probable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico, o
    en donde un estadio tumoral bajo es indicativo de una probabilidad aumentada de un desenlace positivo, de que el paciente no es candidato para recibir terapia después del tratamiento quirúrgico o de que es improbable que el paciente se beneficie de la terapia después del tratamiento quirúrgico.
  7. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la terapia se selecciona del grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia y/o una terapia que comprende un inhibidor de TGF-beta.
  8. 8. El método según la reivindicación 7, en donde el inhibidor de TGF-beta es un compuesto tal como se define en la tabla 1, o en donde el inhibidor de TGF-beta es un compuesto que tiene la estructura
    Figure imgf000060_0001
    o cualquier polimorfo, solvato o hidrato del mismo.
  9. 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el desenlace que va a predecirse es o bien recidiva o bien desarrollo de metástasis, preferiblemente metástasis hepática.
  10. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en una biopsia tumoral o un biofluido.
  11. 11. Un compuesto de quimioterapia y/o un inhibidor de TGF-beta para su uso en el tratamiento de cáncer colorrectal en un paciente después del tratamiento quirúrgico del cáncer, en donde el paciente se ha seleccionado mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones a 1 a 10.
  12. 12. El compuesto de quimioterapia y/o el inhibidor de TGF-beta para su uso según la reivindicación 11, en donde el inhibidor de TGF-beta es un compuesto tal como se define en la tabla 1, o en donde el inhibidor de TGF-beta es un compuesto que tiene la estructura
    Figure imgf000061_0001
    o cualquier polimorfo, solvato o hidrato del mismo.
  13. 13. Un kit que comprende reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 y, opcionalmente, reactivos para la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes de mantenimiento, en donde los reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes FAM46A, FHL2, FOXC2 y COL4A1 comprenden al menos el 10% de la cantidad total de reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes que forman el kit, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos.
  14. 14. Un kit según la reivindicación 13, que comprende además reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión del gen FRMD6 o reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de los genes SPRY4 y DACT3, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos.
  15. 15. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, que comprende además reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ACTC1, BOC, CNN1, COMP, CRISPLD2, CRYAB, FAM101B, FILIP1L, GAS7, GFPT2, GLIS3, HS3ST3A1, KIRREL, LRRC15, LTBP2, MFAP2, NNMT, P4HA3, PPAPDC1A, PPP1R3C, S1PR1 y SYNPO2, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos.
  16. 16. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, que comprende además reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ADAMTS6, BMP6, CCDC71L, CH25H, CNNM2, CPNE2, CREB3L2, DCBLD1, EFR3B, EGR1, ELN, ENDOD1, FHOD3, FOXC1, FZD8, GBP1, GXYLT2, IGF1, IL4R, ITGA11, JPH2, KIAA1211, KIF26B, LIMK1, LINC00340, LPCAT2, LRRC8A, METTL7A, OLFM2, PID1, PPP1R12B, PRSS23, RASD2, RNF152, SCUBE3, SEC14L2, SERPINE2, SGK1, SH3PXD2A, SHISA2, SMTN, SRGAP1, TRPC6 y UCK2 y de los genes que hibridan específicamente con las sondas que tienen las secuencias SEQ ID NO:1 a 26, en donde los reactivos son seleccionado del grupo que consiste en cebadores, sondas, aptámeros y anticuerpos.
  17. 17. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 para predecir el desenlace de un paciente que padece cáncer colorrectal, para seleccionar un tratamiento adecuado para un paciente que padece cáncer colorrectal o para seleccionar un paciente que es probable que se beneficie de la terapia adyuvante después de la resección quirúrgica del cáncer colorrectal.
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