ES2787600T3 - Moduladores del receptor de la hormona del crecimiento - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 18 a 30 nucleósidos enlazados de longitud, en donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende una porción de por lo menos 18 nucleobases contiguas 100% complementarias con una porción de igual longitud de las nucleobases 153921-153940 de un ácido nucleico del receptor de la hormona de crecimiento que tiene la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos un 90% complementaria a la SEQ ID NO: 2, en donde el compuesto reduce la cantidad o actividad del ácido nucleico del receptor de la hormona de crecimiento.

Description

DESCRIPCIÓN
Moduladores del receptor de la hormona del crecimiento
Campo
Las presentes realizaciones proporcionan métodos, compuestos y composiciones para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con un exceso de hormona de crecimiento usando compuestos antisentido u oligonucleótidos dirigidos al receptor de la hormona de crecimiento (GHR).
Antecedentes
La hormona del crecimiento se produce en la hipófisis y se secreta en el torrente sanguíneo, donde se une al receptor de la hormona del crecimiento (GHR) en muchos tipos de células, provocando la producción del factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1). El IGF-1 se produce principalmente en el hígado, pero también en el tejido adiposo y el riñón, y se secreta al torrente sanguíneo. Varios trastornos, como la acromegalia y el gigantismo, están asociados con niveles elevados de hormona del crecimiento y/o niveles elevados de IGF-I en plasma y/o tejidos.
La producción excesiva de hormona del crecimiento puede llevar a enfermedades como la acromegalia o el gigantismo. La acromegalia y el gigantismo están asociados con un exceso de hormona del crecimiento, a menudo provocado por un tumor hipofisario, y afecta a 40-50 por millón de personas en todo el mundo, con aproximadamente 15.000 pacientes en cada uno de los Estados Unidos y Europa y una incidencia anual de aproximadamente 4-5 por millón de personas. La acromegalia y el gigantismo se caracterizan inicialmente por el crecimiento anormal de las manos y los pies y cambios óseos en las características faciales. Muchos de los resultados relacionados con el crecimiento están mediados por niveles elevados de IGF-1 en suero.
La WO 2004/078922 describe compuestos, composiciones y métodos para modular la expresión del receptor de la hormona del crecimiento y/o el factor de crecimiento similar a la insulina-I (IGF-I).
Pellegrini et al. (J Neurosci. 1996 Dic. 15;16(24):8140-8) investigan la implicación de los receptores de hormona de crecimiento de rata expresados centralmente (rGH-R) en el ritmo ultradiano de la secreción de GH de la hipófisis.
Tachas et al. (J Endocrinol. 2006 Abr.; 189(1):147-54) investigan la capacidad de un oligodesoxinucleótido modificado para suprimir el ARNm del receptor de GH in vitro.
Wilkinson-Berka et al. (Mol Vis. 2007 Ago. 29;13:1529-38) investigan si un oligonucleótido antisentido administrado sistémicamente podría inhibir la neovascularización en ratones con retinopatía inducida por oxígeno (OIR).
Ran et al. (Yao Xue Bao. 2013 Mar.; 48(3):435-40) investigan el efecto de la hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) sobre la vía JAK2-STAT3 y el crecimiento de líneas celulares de cáncer gástrico en diferentes estados de expresión de GHR.
Sumario
La invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 18 a 30 nucleósidos enlazados de longitud, en donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende una porción de por lo menos 18 nucleobases contiguas 100% complementaria con una porción de igual longitud de las nucleobases 153921-153940 de un ácido nucleico del receptor de la hormona de crecimiento que tiene la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos un 90% complementaria a la SEQ ID NO: 2, en donde el compuesto reduce la cantidad de actividad del ácido nucleico del receptor de la hormona de crecimiento.
La invención proporciona además una composición que comprende el compuesto de la invención o una sal del mismo y por lo menos uno de un portador o un diluyente farmacéuticamente aceptable.
Las realizaciones proporcionadas en la presente se refieren a métodos, compuestos y composiciones para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con un exceso de hormona de crecimiento. Varias realizaciones proporcionadas en la presente están dirigidas a compuestos antisentido u oligonucleótidos dirigidos al receptor de la hormona del crecimiento (GHR). Varias realizaciones están dirigidas al tratamiento, prevención o mejora de la acromegalia con compuestos antisentido u oligonucleótidos dirigidos al receptor de la hormona del crecimiento (GHR).
Descripción detallada
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. En la presente, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitativa. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Los encabezados de sección usados en la presente son solo con propósitos organizativos y no deben interpretarse como limitativos de la materia descrita.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2'-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación de O-metoxi-etilo en la posición 2' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado. "Nucleósido 2'-MOE" (también nucleósido 2'-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar modificado 2'-MOE.
"Nucleósido 2' sustituido" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo de furanosilo distinto de H u OH. En ciertas realizaciones, los nucleósidos 2' sustituidos en incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcar bicíclicas.
"Sitio objetivo 3 '" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico objetivo que es complementario al nucleótido más 3' de un compuesto antisentido particular.
"Sitio objetivo 5 '" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico objetivo que es complementario al nucleótido más 5' de un compuesto antisentido particular.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" significa dentro del ±10% de un valor. Por ejemplo, si se afirma que "los compuestos efectuaron por lo menos aproximadamente un 70% de inhibición de g Hr", se implica que los niveles de GHR se inhiben dentro de un intervalo del 60% al 80%.
"Administración" o "administrar" se refiere a vías para introducir un compuesto antisentido proporcionado en la presente a un sujeto para realizar su función pretendida. Un ejemplo de una vía de administración que puede usarse incluye, pero no está limitada a, la administración parenteral, como inyección o infusión subcutánea, intravenosa o intramuscular.
"Mejora" se refiere a una disminución de por lo menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociados. En ciertas realizaciones, la mejora incluye un retraso o desaceleración en la progresión de uno o más indicadores de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica. "Animal" se refiere a un animal humano o no humano incluyendo, pero no limitado a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos incluyendo, pero no limitados a, monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína objetivo codificados por dicho ácido nucleico objetivo.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de cadena sencilla y de cadena doble como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNmc y compuestos basados en la ocupación.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo en ausencia del compuesto antisentido.
“Oligonucleótido antisentido” significa un oligonucleótido de cadena sencilla que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo.
"Complementariedad de bases" se refiere a la capacidad para el emparejamiento de bases preciso de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con las nucleobases correspondientes en un ácido nucleico objetivo (es decir, hibridación), y está mediada por la unión de hidrógeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen invertida entre nucleobases correspondientes.
"Fracción de azúcar bicíclico" significa una fracción de azúcar modificado que comprende un anillo de 4 a 7 miembros (incluyendo, pero no limitado a, un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, dando como resultado una estructura bicíclica. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo de azúcar. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En ciertas de tales realizaciones, el puente conecta el carbono 2' y el carbono 4' del furanosilo.
"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" o "nucleósidos de BNA" significa monómeros de ácidos nucleicos que tienen un puente que conecta dos átomos de carbono entre la posición 4' y 2' de la unidad de azúcar de nucleósido, formando de este modo un azúcar bicíclico. Los ejemplos de dicho azúcar bicíclico incluyen, pero no están limitados a A) a-L-Metileneoxi (4'-CH2-O-2') LnA, (B) p-D-Metileneoxi (4'-CH2-O-2') LnA, (C) Etileneoxi (4'-(CH2)2-O-2') LNA, (D) Aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') LNA y (E) Oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') LNA, como se representa a continuación.
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"cEt" o "etilo restringido" significa una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Nucleósido de etilo restringido" (también nucleósido cEt) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente que otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2'-O-metoxietilo.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Comprender", "comprende" y "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Desoxirribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los desoxirribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Diseño" o "Diseñado para" se refiere al proceso de diseño de un compuesto oligomérico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
"Cantidad eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo con necesidad del agente. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
"Expresión" incluye todas las funciones por las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y operativas en una célula. Tales estructuras incluyen, pero no están limitadas a, los productos de transcripción y traducción.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.
"Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "separación" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
"Receptor de la hormona de crecimiento (GHR)" significa cualquier ácido nucleico o proteína de GHR. "Ácido nucleico GHR" significa cualquier ácido nucleico que codifica GHR. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de GHR incluye una secuencia de ADN que codifica GHR, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica GHR (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones), incluyendo una secuencia de ARN que no codifica proteínas (es decir, no codificante), y una secuencia de ARNm que codifica GHR. "ARNm de GHR" significa un ARNm que codifica una proteína GHR.
"Inhibidor específico de GHR" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión o actividad de ARN de GHR y/o proteína de GHR a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de GHR incluyen ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión de ARN de GHR y/o proteína de GHR.
"Hibridación" significa el apareamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un compuesto antisentido y un objetivo de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no están limitadas a, un oligonucleótido antisentido y un objetivo de ácido nucleico.
"Identificar un animal que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno y/o afección" significa identificar a un animal al que se le ha diagnosticado la enfermedad, trastorno y/o afección o identificar un animal predispuesto a desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección. Dicha identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluyendo la evaluación del historial médico de un individuo y pruebas o evaluaciones clínicas estándar.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción, bloqueo de la expresión o actividad y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o actividad.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
"Desoxinucleósido enlazado" significa una base de ácido nucleico (A, G, C, T, U) sustituida por desoxirribosa enlazada por un éster de fosfato para formar un nucleótido.
“Nucleósidos enlazados” significa nucleósidos adyacentes enlazados entre sí por un enlace internucleosídico. "Malapareamiento" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico u objetivo.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleósido de origen natural (es decir, un enlace internucleósido fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
“Nucleósido modificado” significa un nucleósido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
“Nucleótido modificado” significa un nucleótido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado, enlace internucleósido modificado o nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" significa la sustitución y/o cualquier cambio de una fracción de azúcar natural.
"Modular" se refiere a cambiar o ajustar una característica en una célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, modular el ARNm de GHR puede significar aumentar o disminuir el nivel de ARNm de GHR y/o proteína de GHR en una célula, tejido, órgano u organismo. Un "modulador" efectúa el cambio en la célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de GHR puede ser un modulador que disminuye la cantidad de ARNm de GHR y/o proteína de GHR en una célula, tejido, órgano u organismo. "Monómero" se refiere a una unidad individual de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no están limitados a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean de origen natural o modificados.
"Motivo” significa el patrón de nucleósidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido.
"Fracción de azúcar natural" significa una fracción de azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
"Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí o que de otro modo soportan la hibridación.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no está limitado a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de cadena sencilla y ácidos nucleicos de cadena doble.
“Nucleobase” significa una fracción heterocíclica capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico. "Complementariedad de nucleobase" se refiere a una nucleobase que es capaz de emparejar bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En ciertas realizaciones, nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejar bases con una nucleobase de su ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico objetivo, entonces se considera que la posición del enlace de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico objetivo es complementario en ese par de nucleobases.
"Secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier modificación de azúcar, enlace y/o nucleobase.
"Nucleósido" significa una nucleobase enlazada a un azúcar.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Compuesto oligomérico" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazadas que es capaz de hibridar con por lo menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleósido" significa un oligonucleótido en el que los enlaces internucleósidos no contienen un átomo de fósforo.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede modificarse o no modificarse, independientemente unos de los otros.
"Administración parenteral" significa la administración mediante inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados a los mismos.
"Enlace fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos en donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleósido modificado.
“Porción” significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido
"Prevenir" se refiere a retrasar o anticiparse al inicio, desarrollo o progresión de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
"Cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.
"Región" se define como una parte del ácido nucleico objetivo que tiene por lo menos una estructura, función o característica identificable.
"Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Segmentos" se definen como porciones más pequeñas o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico objetivo.
"Efectos secundarios" significa enfermedad y/o afecciones fisiológicas atribuibles a un tratamiento distintos de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen reacciones en el lugar de inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías en el sistema nervioso central, miopatías y malestar general. Por ejemplo, los niveles de aminotransferasa en suero aumentados puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, una bilirrubina aumentada puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática.
"Sitios", como se usan en la presente, se definen como posiciones de nucleobase únicas dentro de un ácido nucleico objetivo.
"Retrasa la progresión" significa disminución en el desarrollo de dicha enfermedad.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto deseado, a la vez que muestra efectos mínimos o nulos sobre los ácidos nucleicos no objetivo en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos. "Condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refieren a condiciones bajo las cuales un compuesto oligomérico se hibridará con su secuencia objetivo, pero con un número mínimo de otras secuencias.
"Sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Objetivo" se refiere a una proteína, de la que se desea la modulación.
"Gen objetivo" se refiere a un gen que codifica un objetivo.
"Dirigir" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico objetivo", "ARN objetivo", "transcrito de ARN objetivo" y "objetivo de ácido nucleico" significan todos un ácido nucleico capaz de ser el objetivo de compuestos antisentido.
"Región objetivo" significa una porción de un ácido nucleico objetivo al que se dirige uno o más compuestos antisentido.
"Segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio objetivo 5' " se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3'" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica a un animal para realizar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección en el animal. En ciertas realizaciones, pueden administrarse una o más composiciones farmacéuticas al animal.
Nucleobases "no modificadas" significan las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases, fracciones de azúcar y enlaces internucleosídicos de origen natural. En ciertos aspectos de la divulgación, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
Ciertas realizaciones y aspectos de la divulgación
Ciertos aspectos de la divulgación proporcionan métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión del receptor de la hormona del crecimiento (GHR).
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de GHR. En ciertos aspectos, el ácido nucleico de GHR tiene la secuencia expuesta en N° de registro GENBANK NM_000163.4 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 1), N° de registro GENBANK NT_006576.16 truncada de los nucleótidos 42411001 a 42714000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 2), N° de registro GENBANK X06562.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 3), N° de registro GENBANK DR006395.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 4), N° de registro GENBANK DB052048.1 (incorporada en la presente como SEQ ID nO: 5), N° de registro GENBANK AF230800.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 6), el complemento del N° de registro GENBANK AA398260.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 7), N° de registro GENBANK BC136496.1 (incorporada en la presente como SEQ iD NO: 8), N° de registro g En BANK NM_001242399.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 9), N° de registro GENBANK NM_001242400.2 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 10), N° de registro GENBANK NM_001242401.3 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 11), N° de registro Ge NbANK NM_001242402.2 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 12), N° de registro g En BANK NM_001242403.2 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 13), N° de registro GENBANK NM_001242404.2 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 14), N° de registro g En BANK NM_001242405.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 15), N° de registro g En BANK NM_001242406.2 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 16), N° de registro Ge NbANK NM_001242460.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 17), N° de registro GENBANK NM_001242461.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 18), o N° de registro g En BANK NM_001242462.1 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 19).
Ciertos aspectos de la divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de las SEQ ID NO: 20-2295.
Ciertos aspectos de la divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados complementarios dentro de los nucleótidos. Ciertos aspectos de la divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados complementarios dentro de los nucleótidos 153831-154112 de la SEQ ID NO: 2, en donde dicho oligonucleótido modificado es por lo menos un 90% complementario a la SEQ ID NO: 2.
Ciertos aspectos de la divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende una porción de por lo menos 8 nucleobases contiguas 100% complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 153831-154112 de la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es complementaria a la SEQ ID NO: 2153831-154112.
En ciertas realizaciones, un compuesto u oligonucleótido antisentido dirigido a un ácido nucleico del receptor de la hormona del crecimiento se dirige a las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2: 153831-154112.
En ciertas realizaciones, los compuestos u oligonucleótidos antisentido se dirigen a una región de un ácido nucleico del receptor de la hormona del crecimiento. En ciertos aspectos de la divulgación, tales compuestos u oligonucleótidos dirigidos a una región de un ácido nucleico de GHR tienen una porción de nucleobase contigua que es complementaria a una porción de nucleobase de igual longitud de la región. Por ejemplo, la porción puede ser por lo menos una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleobases contiguas complementaria a una porción de igual longitud de una región mencionada en la presente. En ciertas realizaciones, tales compuestos u oligonucleótidos se dirigen a las siguientes regiones de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2: 153831-154112.
En ciertas realizaciones, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende por lo menos un azúcar modificado. En ciertos aspectos, por lo menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo. En ciertos aspectos, por lo menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico, como un grupo 4'-CH (CH3)-O-2', un grupo 4'-CH2-O-2' o un grupo 4'-(CH2)2-O-2'. En ciertos aspectos, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, como un enlace internucleósido de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende por lo menos una nucleobase modificada, como 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende:
un segmento de separación que consiste de desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3 'que consiste de nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
Ciertos aspectos de la divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 918, 479, 703, 1800, 1904, 2122, 2127 o 2194.
En ciertos aspectos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia enumerada en las SEQ ID NO: 918, 479 o 703, en donde el oligonucleótido modificado comprende un segmento de separación que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertos aspectos, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia enumerada en las SEQ ID NO: 1800, 1904, 2122, 2127 o 2194, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de 3 nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de 3 nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo o un azúcar de etilo restringido; y en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.
Ciertas realizaciones proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 703. En ciertos aspectos, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un azúcar modificado. En ciertos aspectos, el por lo menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo. En ciertos aspectos, el por lo menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico, como un grupo 4'-CH(CH3)-O-2', un grupo 4'-CH2-O-2' o un grupo 4'-(CH2)2-O-2'. En ciertos aspectos, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, como un enlace internucleósido de fosforotioato. En ciertos aspectos, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos una nucleobase modificada, como una 5-metilcitosina. En ciertos aspectos, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste de desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3 'que consiste de nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
Ciertas realizaciones proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 703, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el compuesto u oligonucleótido puede ser por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98%, por lo menos un 99% o un 100% complementario a un ácido nucleico que codifica el receptor de la hormona de crecimiento.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el ácido nucleico que codifica el receptor de la hormona de crecimiento puede comprender la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-19.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el compuesto u oligonucleótido puede ser de cadena sencilla. Ciertas realizaciones proporcionan una composición que comprende el compuesto de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente o una sal del mismo y por lo menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos, la composición tiene una viscosidad menor de aproximadamente 40 centipose (cP), menor de aproximadamente 30 centipose (cP), menor de aproximadamente 20 centipose (cP), menor de aproximadamente 15 centipose (cP) o menor de aproximadamente 10 centipose (cP). En ciertos aspectos, la composición que tiene cualquiera de las viscosidades anteriormente mencionadas comprende un compuesto proporcionado en la presente a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 125 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 175 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 225 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml, aproximadamente 275 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml. En ciertos aspectos, la composición que tiene cualquiera de las viscosidades y/o concentraciones de compuesto anteriormente mencionadas tiene una temperatura de temperatura ambiente o aproximadamente 20° C, aproximadamente 21° C, aproximadamente 22° C, aproximadamente 23° C, aproximadamente 24° C, aproximadamente 25° C, aproximadamente 26° C, aproximadamente 27° C, aproximadamente 28° C, aproximadamente 29° C o aproximadamente 30° C.
Ciertos aspectos de la divulgación proporcionan un método para tratar una enfermedad asociada con un exceso de hormona de crecimiento en un humano que comprende administrar al humano una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones anteriormente mencionadas, tratando de este modo la enfermedad asociada con un exceso de la hormona de crecimiento. En ciertos aspectos, la enfermedad asociada con el exceso de la hormona del crecimiento es la acromegalia. En ciertos aspectos, el tratamiento reduce los niveles de IGF-1.
Ciertos aspectos de la divulgación proporcionan un método para prevenir una enfermedad asociada con un exceso de hormona de crecimiento en un humano que comprende administrar al humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, evitando de este modo la enfermedad asociada con un exceso de hormona de crecimiento. En ciertos aspectos de la divulgación, la enfermedad asociada con el exceso de hormona del crecimiento es la acromegalia.
Ciertos aspectos de la divulgación proporcionan un método para reducir los niveles del receptor de la hormona del crecimiento (GHR) en un humano que comprende administrar al humano una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o composición de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, reduciendo de este modo los niveles de GHR en el humano. En ciertos aspectos, el humano tiene una enfermedad asociada con un exceso de hormona de crecimiento. En ciertos aspectos, la enfermedad asociada con el exceso de hormona del crecimiento es la acromegalia.
En ciertos aspectos, los métodos anteriores comprenden coadministrar el compuesto o composición y un segundo agente. En ciertos aspectos, el compuesto o composición y el segundo agente se administran concomitantemente.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico objetivo, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que está dirigido. En ciertas de tales realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que está dirigido.
En ciertos aspectos de la divulgación, un compuesto antisentido tiene una longitud de 10 a 30 subunidades.
En ciertos aspectos de la divulgación, un compuesto antisentido tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En ciertos aspectos de la divulgación, un compuesto antisentido tiene una longitud de 12 a 22 subunidades. En ciertos aspectos divulgación, un compuesto antisentido tiene una longitud de 14 a 30 subunidades. En ciertos aspectos divulgación, un compuesto antisentido tiene una longitud de 14 a 20 subunidades. En ciertos aspectos divulgación, un compuesto antisentido tiene una longitud de 15 a 30 subunidades. En ciertos aspectos divulgación, un compuesto antisentido tiene una
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longitud de 15 a 20 subunidades. En ciertos aspectos divulgación, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 a 30 subunidades. En ciertos aspectos
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divulgación, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 21 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 20 a 30 subunidades. En otras palabras, tales compuestos antisentido tienen de 12 a 30 subunidades enlazadas, 14 a 30 subunidades enlazadas, 14 a 20 subunidades, 15 a 30 subunidades, 15 a 20 subunidades, 16 a 30 subunidades, 16 a 20 subunidades, 17 a 30 subunidades, 17 a 20 subunidades, 18 a 30 subunidades, 18 a 20 subunidades, 18 a 21 subunidades, 20 a 30 subunidades o 12 a 22 subunidades enlazadas, respectivamente. En ciertos aspectos de la divulgación, un compuesto antisentido tiene una longitud de 14 subunidades. En ciertos aspectos de la divulgación, un compuesto antisentido tiene una longitud de 16 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 17 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 18 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 19. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una longitud de 20 subunidades. En otros aspectos de la divulgación, el compuesto antisentido tiene de 8 a 80, 12 a 50, 13 a 30, 13 a 50, 14 a 30, 14 a 50, 15 a 30, 15 a 50, 16 a 30, 16 a 50, 17 a 30, 17 a 50, 18 a 22, 18 a 24, 18 a 30, 18 a 50, 19 a 22, 19 a 30, 19 a 50, o 20 a 30 subunidades enlazadas. En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido tienen una longitud de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 subunidades enlazadas, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores. En algunas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, y las subunidades enlazadas son nucleótidos.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, una única subunidad puede eliminarse del extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3' (truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico de GHR puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando hay una sola subunidad adicional en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede estar localizada en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando hay dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3'), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades añadidas pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases malapareadas sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases malapareadas cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm objetivo, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían malapareamientos. De manera similar, se logró la escisión específica del objetivo usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluyendo aquellos con 1 o 3 malapareamientos.
Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 malapareamientos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de tanto bcl-2 como bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358,1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido en tándem de 14 nucleobases, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, para determinar su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Ciertos motivos y mecanismos de compuestos antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada para un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente por lo menos una región modificada para conferir una resistencia a la degradación de nucleasas aumentada, una captación celular aumentada, una afinidad de unión aumentada para el ácido nucleico objetivo y/o una actividad inhibidora aumentada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede conferir otra propiedad deseada, por ejemplo, servir como sustrato para la RNasa H de endonucleasa celular, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
La actividad antisentido puede ser el resultado de cualquier mecanismo que implique la hibridación del compuesto antisentido (por ejemplo, oligonucleótido) con un ácido nucleico objetivo, en donde la hibridación finalmente da como resultado un efecto biológico. En ciertas realizaciones, se modula la cantidad y/o actividad del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, se reduce la cantidad y/o actividad del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo da como resultado en última instancia la degradación del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo no da como resultado la degradación del ácido nucleico objetivo. En ciertas de tales realizaciones, la presencia del compuesto antisentido hibridado con el ácido nucleico objetivo (ocupación) da como resultado una modulación de la actividad antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen un motivo químico particular o patrón de modificaciones químicas son particularmente adecuados para explotar uno o más mecanismos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido funcionan mediante más de un mecanismo y/o mediante mecanismos que no se han dilucidado. Por consiguiente, los compuestos antisentido descritos en la presente no están limitados por un mecanismo particular.
Los mecanismos antisentido incluyen, sin limitación, antisentido mediado por RNasa H; mecanismos de ARNi, que utilizan la vía RISC e incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNip, ARNmc y microARN; y mecanismos basados en la ocupación. Ciertos compuestos antisentido pueden actuar a través de más de uno de estos mecanismos y/o mediante mecanismos adicionales.
Antisentido mediado por RNasa H
En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es el resultado por lo menos en parte de la degradación del ARN objetivo por la ARNasa H. La ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de cadena sencilla que son "similares a ADN" provocan actividad de RNasa H en células de mamífero. Por consiguiente, los compuestos antisentido que comprenden por lo menos una porción de ADN o nucleósidos similares a ADN pueden activar la RNasa H, dando como resultado la escisión del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que utilizan RNasa H comprenden uno o más nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido comprenden por lo menos un bloque de 1-8 nucleósidos modificados. En ciertas de tales realizaciones, los nucleósidos modificados no soportan la actividad de RNasa H. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido son gapmers, como se describe en la presente. En ciertas de tales realizaciones, la separación del gapmer comprende nucleósidos de ADN. En ciertas de tales realizaciones, la separación del gapmer comprende nucleósidos similares a ADN. En ciertas de tales realizaciones, la separación del gapmer comprende nucleósidos de ADN y nucleósidos similares a ADN.
Ciertos compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento de separación generalmente sirve como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de fracciones de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de fracciones de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden incluir en algunas realizaciones p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos 2' modificados (tales nucleósidos 2' modificados pueden incluir 2'-MOE y 2 -O-CH3, entre otros), y nucleósidos modificados en el azúcar bicíclicos (tales nucleósidos modificados en el azúcar bicíclicos pueden incluir los que tienen un acetato restringido). En ciertas realizaciones, los nucleósidos en las alas pueden incluir varias fracciones de azúcar modificado incluyendo, por ejemplo, 2'-MOE y fracciones de azúcar bicíclico como etilo restringido o LNA. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varios fracciones de azúcar modificado y no modificado. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias combinaciones de nucleósidos 2'-MOE, fracciones de azúcar bicíclico como nucleósidos de etilo restringidos o nucleósidos de LNA y 2'-desoxinucleósidos.
Cada región distinta puede comprender fracciones de azúcar uniformes, variantes, o fracciones de azúcar alternas. El motivo ala-separación-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud del ala 5', "Y" representa la longitud de la separación, y "Z" representa la longitud del ala 3'. "X" y "Z" pueden comprender fracciones de azúcar uniformes, variantes o alternativas. En ciertas realizaciones, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleosidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleosidos. Como se usa en la presente, un separador descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que la separación está colocada inmediatamente adyacente a cada una de las alas 5' y 3'. Por tanto, no hay nucleótidos intermedios entre el ala 5' y la separación, o la separación y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente puede tener un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, "X" y "Z" son iguales; en otras realizaciones son diferentes. En ciertas realizaciones, "Y" tiene entre 8 y 15 nucleósidos. X, Y o Z pueden tener cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleósidos.
En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de GHR tiene un motivo gapmer en el que la separación consiste de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido tiene un motivo de azúcar descrito por la Fórmula A como sigue: (J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)zen donde
cada A es independientemente un nucleósido 2' sustituido;
cada B es independientemente un nucleósido bicíclico;
cada J es independientemente un nucleósido 2' sustituido o un 2'-desoxinucleósido;
cada D es un 2'-desoxinucleósido;
m es 0-4; n es 0-2; p es 0-2; r es 0-2; t es 0-2; v es 0-2; w es 0-4; x es 0-2; y es 0-2; z es 0-4; g es 6-14; siempre que:
por lo menos uno de m, n y r sea distinto de 0;
por lo menos uno de w e y sea distinto de 0;
la suma de m, n, p, r y t sea de 2 a 5; y
la suma de v, w, x, y y z sea de 2 a 5.
Compuestos de ARNi
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARN interferente (ARNi), que incluyen compuestos de ARN de cadena doble (también denominados ARN de interferencia corta o ARNip) y compuestos de ARNi de cadena sencilla (o ARNmc). Tales compuestos funcionan por lo menos en parte a través de la vía RISC para degradar y/o secuestrar un ácido nucleico objetivo (por tanto, incluyen compuestos de microARN/que imitan microARN). En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden modificaciones que los hacen particularmente adecuados para tales mecanismos.
i. compuestos de ARNmc
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que incluyen aquellos particularmente adecuados para su uso como compuestos de ARNi de cadena sencilla (ARNmc) comprenden un extremo terminal 5' modificado. En ciertas de tales realizaciones, el extremo terminal 5' comprende una fracción de fosfato modificado. En ciertas realizaciones, dicho fosfato modificado se estabiliza (por ejemplo, resistente a la degradación/escisión en comparación con el 5'-fosfato no modificado). En ciertas realizaciones, dichos nucleósidos 5-terminales estabilizan la fracción de 5'-fósforo. Ciertos nucleósidos 5'-terminales modificados pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo en la WO/2011/139702.
En ciertas realizaciones, el nucleósido 5' de un compuesto de ARNmc tiene la Fórmula IIc:
Figure imgf000014_0001
en donde:
T1 es una fracción de fósforo opcionalmente protegida;
T2 es un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el compuesto de Fórmula IIc con el compuesto oligomérico;
A tiene una de las fórmulas:
Figure imgf000014_0002
Q1 y Q2son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C sustituido 6 o N(Ra)(R4);
Q3 es O, S, N(Ra) o C(R6)(Rt);
cada R3, R4R5, R6y Rzes, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido o alcoxi C1-C6; M3es O, S, NR14, C(R15)(R16), C(R15)(R16)C(R17)(R18), C(R15)=C(R17), OC(R15)(R16) u OC(R15)(BX2);
R14 es H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6o alquinilo C2-C6 sustituido;
R15, R16, R17 y R18 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6o alquinilo C2-C6 sustituido;
Bx1 es una fracción de base heterocíclica;
o si Bx2está presente, entonces Bx2es una fracción de base heterocíclica y Bx1 es H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6o alquinilo C2-C6 sustituido;
J4, J5, J6y J7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
o J4 forma un puente con uno de J5 o J7 en donde dicho puente comprende de 1 a 3 grupos birradicales enlazados seleccionados de O, S, NR19, C(R2ü)(R21), C(R2ü)=C(R21), C[=C(R2ü)(R21)] y C(=O) y los otros dos de J5, J6 y J7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
cada R19, R20y R21 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6o alquinilo C2-C6 sustituido;
G es H, OH, halógeno u O-[C(R8)(R9)]n-[(C=O)m-X1]j-Z;
cada R8y R9es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6o alquilo C1-C6 sustituido;
X1 es O, S o N(E1);
Z es H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido o N(E2)(E3);
E1, E2y E3son cada uno, independientemente, H, alquilo C1-C6o alquilo C1-C6 sustituido;
n es de 1 a aproximadamente 6;
m es 0 o 1;
j es 0 o 1;
cada grupo sustituido comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente de halógeno, DO1, N J1XJ2), =NJ1, SJ1, N3, CN, OC(=X2)J1, OC(=X2)N(J1)(J2) y C(=X2)N(J1)(J2);
X2 es O, S o NJ3;
cada J1, J2y J3es, independientemente, H o alquilo C1-C6;
cuando j es 1, entonces Z es distinto de halógeno o N(E2)(E3); y
en donde dicho compuesto oligomérico comprende de 8 a 40 subunidades monoméricas y puede hibridar con por lo menos una porción de un ácido nucleico objetivo.
En ciertas realizaciones, IV^es O, CH = CH, OCH2u OC(H)(Bx2). En ciertas realizaciones, IV^es O.
En ciertas realizaciones, J4, J5, J6y J7son cada uno H. En ciertas realizaciones, J4 forma un puente con uno de J5 o J7.
En ciertas realizaciones, Atiene una de las fórmulas:
Figure imgf000015_0001
en donde:
Q1 y Q2son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6o alcoxi C1-C6 sustituido. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2son cada uno H. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2son cada uno, independientemente, H o halógeno. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2 es H y el otro de Q1 y Q2 es F, CH3 u OCH3.
En ciertas realizaciones, T1 tiene la fórmula:
Ra
Rb=P-Rc
en donde:
Ra y Rc son cada uno, independientemente hidroxilo, protegido, protegido tiol, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C sustituido 6, amino protegido o amino sustituido; y
RbesOo S. En ciertas realizaciones, Rbes O y Ray Rcson cada uno, independientemente, OCH3, OCH2CH3 o CH(CH3)2.
En ciertas realizaciones, G es halógeno, OCH3, OCH2F, OCHF2, OCF3, OCH2CH3, O(CH2)2F, OCH2CHF2, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3, O(CH2)3-N(R1ü)(Rh ), O(CH2)2-ON(R10)(Rn), O(CH2)2-O(CH2)2-N(R1ü)(Rh ), OCH2C(=0 )-N(R1ü)(Rh ), OCH2C(=O )-N(R12)-(CH2)2-N(R1ü)(R11) o O(CH2)2-N(R12)-C(=NR13)[N(R1ü)(Rh )] en donde R1Ü, R11, R12 y R13 son cada uno, independientemente, H o alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, G es halógeno, OCH3, OCF3, OCH2CH3, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-o Ch3, O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, OCH2C(=O)-N(H)CH3, OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2 o OCH2-N(H)-C(=NH)NH2.En ciertas realizaciones, G es F, OCH3u O (CH2)2-OCH3. En ciertas realizaciones, G es O(CH2)2-OCH3.
En ciertas realizaciones, el nucleósido 5-terminal tiene la Fórmula IIe:
Figure imgf000016_0001
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluyendo los particularmente adecuados para ARNmc, comprenden uno o más tipos de fracciones de azúcar modificado y/o fracciones de azúcar de origen natural dispuestos a lo largo de un oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de azúcar. Tales motivos pueden incluir cualquiera de las modificaciones de azúcar analizadas en la presente y/u otras modificaciones de azúcar conocidas.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden o consisten de una región que tiene modificaciones de azúcar uniformes. En ciertas de tales realizaciones, cada nucleósido de la región comprende la misma modificación de azúcar tipo ARN. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-F. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido cEt. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido LNA. En ciertas realizaciones, la región uniforme constituye todo o esencialmente todo el oligonucleótido. En ciertas realizaciones, la región constituye el oligonucleótido completo, excepto los nucleósidos terminales 1-4.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una o más regiones de modificaciones de azúcar alternas, en donde los nucleósidos alternan entre nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un primer tipo y nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un segundo tipo. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de ambos tipos son nucleósidos de tipo ARN. En ciertas realizaciones, los nucleósidos alternos se seleccionan de: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA y cEt. En ciertas realizaciones, las modificaciones alternas son 2'-F y 2'-OMe. Dichas regiones pueden ser contiguas o pueden estar interrumpidas por nucleósidos modificados de manera diferente o nucleósidos conjugados.
En ciertas realizaciones, la región alterna de modificaciones alternas consiste cada una de un único nucleósido (es decir, el patrón es (AB)xAy donde A es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un primer tipo y B es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un segundo tipo; x es 1-20 e y es 0 o 1). En ciertas realizaciones, una o más regiones alternas en un motivo alterno incluyen más de un nucleósido de un tipo.
Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden incluir una o más regiones de cualquiera de los siguientes motivos de nucleósidos:
AABBAA;
ABBABB;
AABAAB;
ABBABAABB;
ABABAA;
AABABAB;
ABABAA;
ABBAABBABABAA;
BABBAABBABABAA; o
ABABBAABBABABAA;
en donde A es un nucleósido de un primer tipo y B es un nucleósido de un segundo tipo. En ciertas realizaciones, A y B se seleccionan cada uno de 2'-F, 2'-OMe, BNA y MOE.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen dicho motivo alterno también comprenden un nucleósido 5' terminal modificado, como los de fórmula IIc o IIe.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo 2-2-3. Dichas regiones comprenden el siguiente motivo:
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-en donde: A es un primer tipo de nucleósido modificado;
B y C son nucleósidos que se modifican de manera diferente que A, sin embargo, B y C pueden tener las mismas o diferentes modificaciones entre sí;
x e y son de 1 a 15.
En ciertas realizaciones, A es un nucleósido modificado 2'-OMe. En ciertas realizaciones, B y C son ambos nucleósidos modificados 2'-F. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido modificado 2'-OMe y B y C son ambos nucleósidos modificados 2'-F.
En ciertas realizaciones, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q)-(AB)xAy-(D)z
en donde:
Q es un nucleósido que comprende una fracción de fosfato estabilizado. En ciertas realizaciones, Q es un nucleósido que tiene la Fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
B es un segundo tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente del nucleósido adyacente a él. Por tanto, si y es 0, entonces D debe modificarse de manera diferente que B y si y es 1, entonces D debe modificarse de manera diferente que A. En ciertas realizaciones, D difiere de A y B.
X es 5-15;
Y es 0 o 1;
Z es 0-4.
En ciertas realizaciones, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q)-(A)x-(D)z
en donde:
Q es un nucleósido que comprende una fracción de fosfato estabilizado. En ciertas realizaciones, Q es un nucleósido que tiene la Fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente de A.
X es 11-30;
Z es 0-4.
En ciertas realizaciones, A, B, C y D en los motivos anteriores se seleccionan de: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA y cEt. En ciertas realizaciones, D representa nucleósidos terminales. En ciertas realizaciones, tales nucleósidos terminales no están diseñados para hibridar con el ácido nucleico objetivo (aunque uno o más podrían hibridar por casualidad). En ciertas realizaciones, la nucleobase de cada nucleósido D es adenina, independientemente de la identidad de la nucleobase en la posición correspondiente del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la nucleobase de cada nucleósido D es timina.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluyendo los particularmente adecuados para su uso como ARNmc, comprenden enlaces internucleosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de enlace internucleósido modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleósido alterno. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región de enlaces internucleósidos modificados uniformemente. En ciertas de tales realizaciones, el oligonucleótido comprende una región que está enlazada uniformemente por enlaces internucleósidos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido está enlazado uniformemente por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato y por lo menos un enlace internucleósido es fosforotioato.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 6 enlaces internucleósidos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 10 enlaces internucleósidos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 12 enlaces internucleósidos de fosforotioato consecutivos. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de dichos bloques está localizado en el extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de tales bloques está localizado dentro de 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido.
Los oligonucleótidos que tienen cualquiera de los varios motivos de azúcar descritos en la presente, pueden tener cualquier motivo de enlace. Por ejemplo, los oligonucleótidos, que incluyen pero no se limitan a los descritos anteriormente, pueden tener un motivo de enlace seleccionado de la tabla no limitativa siguiente:
Figure imgf000018_0001
ii. compuestos de ARNip
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARNi de cadena doble (ARNip). En tales realizaciones, una o ambas cadenas pueden comprender cualquier motivo de modificación descrito anteriormente para ARNmc. En ciertas realizaciones, los compuestos de ARNmc pueden ser ARN no modificado. En ciertas realizaciones, los compuestos de ARNip pueden comprender nucleósidos de ARN no modificados, pero enlaces internucleósidos modificados.
Varias realizaciones se refieren a composiciones de cadena doble en las que cada cadena comprende un motivo definido por la localización de uno o más nucleósidos modificados o no modificados. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden un primer y un segundo compuestos oligoméricos que hibridan total o por lo menos parcialmente para formar una región dúplex y que además comprenden una región que es complementaria e hibrida con un objetivo de ácido nucleico. Es adecuado que dicha composición comprenda un primer compuesto oligomérico que es una cadena antisentido que tiene complementariedad total o parcial con un objetivo de ácido nucleico y un segundo compuesto oligomérico que es una cadena de sentido que tiene una o más regiones de complementariedad y que forma por lo menos una región dúplex con el primer compuesto oligomérico.
Las composiciones de varias realizaciones modulan la expresión génica hibridando con un objetivo de ácido nucleico que da como resultado la pérdida de su función normal. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo es GHR. En cierta realización, la degradación del GHR objetivo se ve facilitada por un complejo RISC activado que se forma con las composiciones de la invención.
Varias realizaciones están dirigidas a composiciones de cadena doble en las que una de las cadenas es útil, por ejemplo, para influir en la carga preferencial de la cadena opuesta en el complejo RISC (o escisión). Las composiciones son útiles para dirigir moléculas de ácidos nucleicos seleccionadas y modular la expresión de uno o más genes. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención hibridan con una porción de un ARN objetivo dando como resultado la pérdida de la función normal del ARN objetivo.
Ciertas realizaciones se dirigen a composiciones de cadena doble en las que ambas cadenas comprenden un motivo de hemímero, un motivo completamente modificado, un motivo modificado posicionalmente o un motivo alterno. Cada cadena de las composiciones de la presente invención puede modificarse para cumplir una función particular en, por ejemplo, la vía de ARNip. Usar un motivo diferente en cada cadena o el mismo motivo con diferentes modificaciones químicas en cada cadena permite dirigir la cadena antisentido para el complejo RISC a la vez que inhibe la incorporación de la cadena de sentido. Dentro de este modelo, cada hebra puede modificarse independientemente de modo que se mejore para su función particular. La cadena antisentido puede modificarse en el extremo 5 'para mejorar su papel en una región del RISC, mientras que el extremo 3' puede modificarse diferencialmente para mejorar su papel en una región diferente del RISC.
Las moléculas de oligonucleótidos de cadena doble pueden ser una molécula de polinucleótido de cadena doble que comprende regiones sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma y la región de sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma. Las moléculas de oligonucleótidos de cadena doble pueden ensamblarse a partir de dos oligonucleótidos separados, donde una cadena es la cadena sentido y la otra es la cadena antisentido, en donde las cadenas antisentido y sentido son autocomplementarias (es decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en la otra cadena; como donde la cadena antisentido y la cadena sentido forman una estructura dúplex o de cadena doble, por ejemplo en donde la región de cadena doble es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 pares de bases; la cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma y la cadena de sentido comprende la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 o más nucleótidos de la molécula de oligonucleótidos de cadena doble son complementarios al ácido nucleico objetivo o una porción del mismo). Alternativamente, el oligonucleótido de cadena doble se ensambla a partir de un único oligonucleótido, donde las regiones sentido y antisentido autocomplementarias del ARNip están unidas por medio de un conector(es) a base de ácido nucleico o a base de ácido no nucleico.
El oligonucleótido de cadena doble puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria dúplex, dúplex asimétrico, horquilla u horquilla asimétrica, que tiene regiones sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo separada o una porción de la misma y la región de sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma. El oligonucleótido de cadena doble puede ser un polinucleótido circular de cadena sencilla que tiene dos o más estructuras de giro y un tallo que comprende regiones sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma y la región de sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma, y en donde el polinucleótido circular puede procesarse in vivo o in vitro para generar una molécula de ARNip activa capaz de mediar ARNi.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de cadena doble comprende secuencias o regiones de sentido y antisentido separadas, en donde las regiones de sentido y antisentido están enlazadas covalentemente mediante moléculas conectoras nucleotídicas o no nucleotídicas como se conoce en la técnica, o están enlazadas alternativamente de manera no covalente mediante interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de van der waals, interacciones hidrófobas y/o interacciones de apilamiento. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de cadena doble comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de un gen objetivo. En otra realización, el oligonucleótido de cadena doble interactúa con la secuencia de nucleótidos de un gen objetivo de una manera que provoca la inhibición de la expresión del gen objetivo.
Como se usa en la presente, los oligonucleótidos de cadena doble no necesitan estar limitados a aquellas moléculas que contienen solo ARN, sino que además comprenden nucleótidos y no nucleótidos modificados químicamente. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico interferente cortas carecen de nucleótidos que contienen 2'-hidroxi (2'-OH). En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos interferentes cortos opcionalmente no incluyen ningún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH). Sin embargo, tales oligonucleótidos de cadena doble que no requieren la presencia de ribonucleótidos dentro de la molécula para soportar ARNi pueden tener un conector o conectores unidos u otros grupos, fracciones o cadenas unidos o asociados que contienen uno o más nucleótidos con grupos 2'-OH. Opcionalmente, los oligonucleótidos de cadena doble pueden comprender ribonucleótidos en aproximadamente un 5, 10, 20, 30, 40 o 50% de las posiciones de nucleótidos. Como se usa en la presente, se pretende que el término ARNip sea equivalente a otros términos usados para describir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar la secuencia de ARNi específica, por ejemplo ARN interferente corto (ARNip), ARN de cadena doble (ARNdc), micro-RNA (ARNmi), Ar N de horquilla corta (ARNhc), oligonucleótido de interferencia corta, ácido nucleico de interferencia corta, oligonucleótido modificado de interferencia corta, ARNip modificado químicamente, ARN de silenciamiento génico postranscripcional (ARNptgs) y otros. Además, como se usa en la presente, se pretende que el término ARNi sea equivalente a otros términos usados para describir la interferencia de ARN específica de la secuencia, como el silenciamiento génico postranscripcional, la inhibición traduccional o la epigenética. Por ejemplo, los oligonucleótidos de cadena doble pueden usarse para silenciar epigenéticamente genes tanto a nivel postranscripcional como a nivel pretranscripcional. En un ejemplo no limitativo, la regulación epigenética de la expresión génica por las moléculas de ARNip de la invención puede resultar de la modificación mediada por ARNip de la estructura de la cromatina o el patrón de metilación para alterar la expresión génica (ver, por ejemplo, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).
Se contempla que los compuestos y las composiciones de varias realizaciones proporcionadas en la presente pueden dirigirse a GHR mediante un silenciamiento génico mediado por ARNdc o un mecanismo de ARNi, incluyendo, por ejemplo, moléculas efectoras de ARN de cadena doble en forma de "horquilla" o giro de tallo en las que una única cadena de ARN con las secuencias autocomplementarias pueden asumir una conformación de cadena doble o moléculas efectoras de ARNdc dúplex que comprenden dos cadenas separadas de ARN. En diversas realizaciones, el ARNdc consiste completamente de ribonucleótidos o consiste de una mezcla de ribonucleótidos y desoxinucleótidos, como los híbridos de ARN/ADN divulgados, por ejemplo, por la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o la N° de Serie de Estados Unidos 60/130.377, presentada el 21 de abril de 1999. El ARNdc o la molécula efectora de ARNdc puede ser una sola molécula con una región de autocomplementariedad de tal manera que los nucleótidos en un segmento de la base de la molécula se emparejen con los nucleótidos en otro segmento de la molécula. En diversas realizaciones, un ARNdc que consiste de una única molécula consiste completamente de ribonucleótidos o incluye una región de ribonucleótidos que es complementaria a una región de desoxirribonucleótidos. Alternativamente, el ARNdc puede incluir dos cadenas diferentes que tienen una región de complementariedad entre ellas.
En varias realizaciones, ambas cadenas consisten completamente de ribonucleótidos, una cadena consiste completamente de ribonucleótidos y una cadena consiste completamente de desoxirribonucleótidos, o una o ambas cadenas contienen una mezcla de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. En ciertas realizaciones, las regiones de complementariedad son por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% complementarias entre sí y con una secuencia de ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la región del ARNdc que está presente en una conformación de cadena doble incluye por lo menos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75,100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos o incluye todos los nucleótidos en un ADNc u otra secuencia de ácido nucleico objetivo que se representa en el ARNdc. En algunas realizaciones, el ARNdc no contiene ninguna región de cadena sencilla, como los extremos de cadena sencilla, o el ARNdc es una horquilla. En otras realizaciones, el ARNdc tiene una o más regiones o salientes de cadena sencilla. En ciertas realizaciones, los híbridos de ARN/ADN incluyen una cadena o región de ADN que es una cadena o región antisentido (por ejemplo, tiene por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de complementariedad con un ácido nucleico objetivo) y un ARN cadena o región que es una cadena o región sentido (por ejemplo, tiene por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de identidad con un ácido nucleico objetivo), y viceversa.
En varias realizaciones, el híbrido de ARN/ADN se elabora in vitro usando métodos sintéticos químicos o enzimáticos como los descritos en la presente o los descritos en la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o en el N° de Serie de Estados Unidos 60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999. En otras realizaciones, una cadena de ADN sintetizada in vitro se compleja con una cadena de ARN elaborada in vivo o in vitro antes, después o concurrentemente con la transformación de la cadena de ADN en la célula. En otras realizaciones más, el ARNdc es un ácido nucleico circular único que contiene una región sentido y antisentido, o el ARNdc incluye un ácido nucleico circular y un segundo ácido nucleico circular o un ácido nucleico lineal (ver, por ejemplo, WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o la N° de Serie de Estados Unidos 60/130.377, presentada el 21 de abril de 1999). Los ácidos nucleicos circulares ejemplares incluyen estructuras lariat en las que el grupo 5' fosforilo libre de un nucleótido se enlaza al grupo 2' hidroxilo de otro nucleótido de una manera de giro hacia atrás.
En otras realizaciones, el ARNdc incluye uno o más nucleótidos modificados en los que la posición 2' en el azúcar contiene un halógeno (como un grupo flúor) o contiene un grupo alcoxi (como un grupo metoxi) que aumenta la vida media del ARNdc in vitro o in vivo en comparación con el ARNdc correspondiente en el que la posición 2' correspondiente contiene un hidrógeno o un grupo hidroxilo. En otras realizaciones más, el ARNdc incluye uno o más enlaces entre nucleótidos adyacentes distintos de un enlace fosfodiéster natural. Los ejemplos de tales enlaces incluyen enlaces de fosforamida, fosforotioato y fosforoditioato. Los ARNdc también pueden ser moléculas de ácido nucleico químicamente modificadas como se enseña en la Patente de Estados Unidos N° 6.673.661. En otras realizaciones, el ARNdc contiene una o dos cadenas tapadas, como se divulga, por ejemplo, en la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o la N° de Serie de Estados Unidos 60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999.
En otras realizaciones, el ARNdc puede ser cualquiera de las moléculas de ARNdc por lo menos parcialmente divulgadas en la WO 00/63364, así como cualquiera de las moléculas de ARNdc descritas en la solicitud Provisional de Estados Unidos 60/399,998; y la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/419,532, y el PCT/US2003/033466. Cualquiera de los ARNdc puede expresarse in vitro o in vivo usando los métodos descritos en la presente o métodos estándar, como los descritos en la Wo 00/63364.
Ocupación
En ciertas realizaciones, no se espera que los compuestos antisentido den lugar a la escisión o al ácido nucleico objetivo a través de RNasa H o que den como resultado la escisión o secuestro a través de la vía RISC. En ciertas de tales realizaciones, la actividad antisentido puede ser el resultado de la ocupación, en donde la presencia del compuesto antisentido hibridado interrumpe la actividad del ácido nucleico objetivo. En ciertas de tales realizaciones, el compuesto antisentido puede modificarse uniformemente o puede comprender una mezcla de modificaciones y/o nucleósidos modificados y no modificados.
Ácidos nucleicos objetivo, regiones objetivo y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican el receptor de la hormona del crecimiento (GHR) al que se pueden dirigir los compuestos proporcionados en la presente incluyen, sin limitación, las siguientes: N° de registro GENBANK NM_000163.4 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 1), N° de registro GENBANK NT_006576.16 truncada de los nucleótidos 42411001 a 42714000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 2), N° de registro GENBANK X06562.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 3), N° de registro GENBANK DR006395.1 (incorporada en la presente como SEQ ID No : 4), N° de registro GENBANK DB052048.1 (incorporada en la presente como SEQ ID nO: 5), N° de registro GENBANK AF230800.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 6), el complemento del N° de registro GENBANK AA398260.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 7), N° de registro GENBANK BC136496.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 8), N° de registro GENBANK NM_001242399.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 9), N° de registro GENBANK NM_001242400.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 10), N° de registro GENBANK NM_001242401.3 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 11), N° de registro g En BANK NM_001242402.2 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 12), N° de registro Ge NbANK NM_001242403.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 13), N° de registro Ge NbANK NM_001242404.2 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 14), N° de registro g En BANK NM_001242405.2 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 15), N° de registro GENBANK NM_001242406.2 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 16), N° de registro g En BANK NM_001242460.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 17), N° de registro g En BANK NM_001242461.1 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 18), N° de registro Ge NbANK NM_001242462.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 19), o N° de registro GENBANK NW 001120958.1 truncada de los nucleótidos 4410000 a 4720000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 2296).
Hibridación
En algunas realizaciones, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un ácido nucleico de GHR. El mecanismo más común de hibridación implica el enlace de hidrógeno (por ejemplo, enlace de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertido) entre las nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede producirse en condiciones variables. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácidos nucleicos que se hibridarán.
Los métodos para determinar si una secuencia puede hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente pueden hibridar específicamente con un ácido nucleico de GHR.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede enlazarse por hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de tal manera que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de GHR).
Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de GHR pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de GHR de tal manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de giro, malapareamiento o estructura de horquilla).
En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o una porción especificada de los mismos, son, o son por lo menos, un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios con un ácido nucleico de GHR, una región objetivo, un segmento objetivo o una porción específica del mismo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo puede determinarse usando métodos rutinarios.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de las 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias con una región objetivo y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con las nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene cuatro nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico objetivo tendría un 77,8% de complementariedad global con el ácido nucleico objetivo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando la configuración predeterminada, que usa algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482489).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o porciones especificadas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) con un ácido nucleico objetivo, o una porción especificada del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico de GHR, o una región objetivo, o un segmento objetivo o secuencia objetivo del mismo. Como se usa en la presente, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejar bases precisas con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario con una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobase del ácido nucleico objetivo que sea completamente complementaria con el compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobase puede ser "completamente complementaria" con una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobase es completamente complementaria con la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una porción correspondiente de 20 nucleobase en donde cada nucleobase es complementaria con la porción de 20 nucleobase del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede o no ser completamente complementario con la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias con la secuencia objetivo.
La localización de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, estar enlazadas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está localizada en el segmento del ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.
En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud no comprenden más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de GHR, o una porción especificada del mismo.
En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de GHR, o una porción especificada del mismo.
Los compuestos antisentido proporcionados también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico objetivo. Como se usa en la presente, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 8 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 9 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 10 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 11 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 12 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 13 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 14 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 15 nucleobases de un segmento objetivo. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios con por lo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más porciones de nucleobase de un segmento objetivo, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente también pueden tener un porcentaje de identidad definido para una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o una porción del mismo. Como se usa en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en la presente si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en la presente, así como los compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido proporcionados en la presente. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o estar dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un emparejamiento de bases idéntico con respecto a la secuencia con la que se compara.
En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son, o son por lo menos, un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, divulgados en la presente.
En ciertas realizaciones, se compara una porción del compuesto antisentido con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertos aspectos de la divulgación, se compara una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
En ciertas realizaciones, se compara una porción del oligonucleótido antisentido con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertos aspectos de la divulgación, se compara una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de azúcar-base. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente una fracción de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato enlazado covalentemente con la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede unirse a la fracción hidroxilo 2', 3' o 5 'del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura del oligonucleótido, los grupos fosfato son referidos comúnmente como formadores de los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones a los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces intemudeosídicos, fracciones de azúcar o nucleobases. A menudo se prefieren los compuestos antisentido modificados a las formas nativas debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada para el objetivo de ácido nucleico, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora mejorada.
Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado para su ácido nucleico objetivo. En consecuencia, a menudo pueden obtenerse resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces intemudeosídicos modificados
El enlace internucleósido de origen natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. A menudo se seleccionan compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, de origen no natural, sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada para los ácidos nucleicos objetivo y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no están limitados a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no tienen fósforo son bien conocidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de GHR comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleósido de fosforotioato.
Fracciones de azúcar modificado
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Tales nucleósidos modificados en el azúcar pueden impartir una estabilidad de nucleasas mejorada, afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden fracciones de anillo de ribofuranosa químicamente modificado. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa químicamente modificados incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes 5' y 2', formación de puentes de átomos de anillo no geminal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S, N(R) o C(R1)(R2) (R, R1 y R2son cada uno independientemente H, alquilo C-i-C- ô un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares químicamente modificados incluyen nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (ver la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos descritos) o el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, sustitución 5' de un BNA (ver la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 en donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificado incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes de 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2 -OCH3, 2 -OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F y 2 'O-(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede seleccionarse de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), donde cada R1, Rmy Rnes, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Como se usa en la presente, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden una fracción de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Los ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos con puente de 4' a 2' incluyen, pero no están limitados a, una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (también referido como etilo restringido o cEt) y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos, ver la Patente de Estados Unidos 7.399.845, concedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos del mismo ver la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de, 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos del mismo ver la Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de, 2008); 4'-CH2-ON(CH3)-2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de, 2004); 4'-CH2 N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo C1-C12, o un grupo protector (ver la Patente de Estados Unidos 7.427.672, concedida el 23 de septiembre, 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118­ 134...); y 4'CH2-C(=CH2)-2' (y análogos del mismo ver la Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).
Informes adicionales relacionados con nucleósidos bicíclicos también pueden encontrarse en la bibliografía publicada (ver, por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007,129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; and Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patentes de Estados Unidos N° 6.268.490.; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; y 7.696.345; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2008-0039618; US2009-0012281; Patentes de Estados Unidos N° de serie 60/989.574.; 61/026.995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097,787; y 61/099,844; Solicitudes Internacionales de PCT publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (ver la Solicitud Internacional de PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
En ciertas realizaciones, los fracciones de azúcar bicíclico de los nucleósidos de BNA incluyen, pero no están limitadas a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre la posición 4' y 2' de la fracción de azúcar de pentofuranosilo en donde dichos puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, y -N(Ra)-;
en donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ray Rbes, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S (=O)2-J-i), o sulfoxilo (S(=O)-J-i); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En ciertas realizaciones, el puente de una fracción de azúcar bicíclico es [C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(Ch2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2 'metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, las BNA a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') se han incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., NucleiCAcids Research, 2003, 21, 6365-6372).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no están limitados a, (A) a-L-metileneoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metileneoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-ON(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA y (F) metil(metileneoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) metilen-tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metil carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, (J) propileno carbocíclico (4'-(CH2)3-2 ') BNA y (K) vinil BNA como se representa a continuación:
Figure imgf000026_0001
en donde Bx es la fracción de base y R es independientemente H, un grupo protector, alquilo C1-C120 alcoxi C1-C12.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:
Figure imgf000026_0002
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rces alquilo C1-C12o un grupo protector de amino; y
Tay Tbson cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:
Figure imgf000026_0003
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, and NJcC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6, o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJc.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
Figure imgf000027_0001
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Tay Tbson cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:
Figure imgf000027_0002
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
cada qa, qb, qey q des, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C1-C6, alcoxilo C1-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-C6o aminoalquilo C1-C sustituido 6;
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:
Figure imgf000028_0001
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Tay Tbson cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qeyqfson cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2J NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C (= O )N J C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJko N(H)C(=S)NJjJk;
o qey qfjuntos son =C(qg)(qh);
qgy qhson cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12o alquilo C1-C12 sustituido.
Se ha descrito la síntesis y preparación de los monómeros de metileneoxi (4'-CH2-O-2') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y la preparación de los mismos también se describen en las WO 98/39352 y WO 99/14226.
También se han preparado análogos de metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA y 2'-tio-BNA, (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222) También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para polimerasas de ácido nucleico (Wengel et al., WO 99/14226). Además, se ha descrito en la técnica la síntesis de 2'-amino-BNA, un novedoso análogo de oligonucleótidos de alta afinidad restringido conformacionalmente (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino- y 2'-metilamino-BNA y se ha informado anteriormente sobre la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas complementarias de ARN y ADN.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula VI:
Figure imgf000028_0002
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Tay Tbson cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qky qles, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxilo C1-C12, alcoxilo C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y q o qi y qkjuntos son =C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo
C1-C120 alquilo C1-C12 sustituido.
Se ha descrito un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo de alquenilo 4'-CH=CH-CH2- '(Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org.
Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007,129(26), 8362-8379).
Como se usa en la presente, "nucleósido bicíclico 4'-2' " o "nucleósido bicíclico 4' a 2' " se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar modificado que no son fracciones de azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar, o análogo de fracción de azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.
Como se usa en la presente, "azúcar 2' modificado" significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, que incluye, pero no está limitado a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido En ciertas realizaciones, las modificaciones 2' se seleccionan de sustituyentes que incluyen, pero no están limitadas a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyente 2' también pueden seleccionarse de: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalq heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido y otros sustituyentes que tengan propiedades similares.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker et al., J. Biol.
Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, como 2'-0- metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para su uso in vivo (Martin, Helv.
Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans.,
1996, 24, 630-637; y Altmann etal., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en la presente, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no están limitados a, lo que es referido en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (ver Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) o fluoro HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo de tetrahidropirano como se ilustra a continuación:
Figure imgf000029_0001
En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar se seleccionan con la Fórmula VII:
Figure imgf000029_0002
en donde independientemente para cada uno de dicho por lo menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano
de Fórmula VII:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tbson cada uno, independientemente, un grupo de enlace intemucleósido que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleósido que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido y el otro de Tay Tbes H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo 5' o 3-terminal;
q-i, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de Ri y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJi, N3, OC(=X)Ji, OC(=X)NJiJ2, NJ3C(=X)NJiJ2 y CN, en donde X es O, S o NJi y cada Ji, J2y J3es, independientemente, H o alquilo Ci-C6.
En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos de THP modificados de Fórmula VII en donde qi, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de qi, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es diferente de H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de qi, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos de THP de fórmula VII en donde uno de Ri y R2es fluoro. En ciertas realizaciones, Ri es fluoro y R2es H; Ri es metoxi y R2es H, y Ri es metoxietoxi y R2es H.
En ciertas realizaciones, los sustitutos del azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar de morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (ver, por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 4 i, 4503-45i0; y las Patentes de Estados Unidos 5.698.685; 5.i66.3i5; 5.i85.444; y 5.034.506). Como se usa en la presente, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la fórmula siguiente:
Figure imgf000030_0001
En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura morfolino anterior. Tales sustitutos del azúcar son referidos en la presente como "morfolinos modificados".
También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (ver la Solicitud Internacional PCT WO 2008/i0 ii57 publicada el 2i/08/08 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos divulgados) y el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y la sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0i30923, publicada el i6 de junio de 2005) o alternativamente la sustitución 5' de un ácido nucleico bicíclico (ver la Solicitud Internacional de PCT WO 2007/i34i8i, publicada el 22/ii/07 en donde un nucleósido bicíclico 4'-CH2-O-2' se sustituye adicionalmente en la posición 5' con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo). También se han descrito la síntesis y la preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (ver, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, i29 (26), 8362-8379).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentofuranosilo en nucleósidos de origen natural. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no están limitados a, los descritos en la técnica (ver, por ejemplo, la solicitud de PCT publicada de propiedad compartida WO 20i0/036696, publicada el i0 de abril de 20i0, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, i30(6), i979-i984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 362i-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, i29(30), 9340-9348; Gu et al.,, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F6i(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2 iii-2 i23 ; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, i3(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 200i, 29(24), 494i-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 200i, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 200i, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, i22, 8595­ 8602; Solicitud de PCT publicada, WO 06/047842; y Solicitud de PCT publicada WO 0i/049687). Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen Fórmula X.
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en donde independientemente para cada uno de dicho por lo menos un análogo de nucleósido de ciclohexenilo de Fórmula X:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
T3y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de ciclohexenilo con un compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleósido que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado, o un grupo 5'- o 3'-terminal; y
q-i, q2, q3, q4, q5, q6, q7, q8 y qg son cada uno, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
Como se usa en la presente, "2' modificado" o "2' sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' diferente de H u OH. Los nucleósidos 2' modificados, incluyen, pero no están limitados a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2' que no forman puentes, como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), o O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rmy Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos 2' modificados pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en la presente, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "2'-OMe" o "2 -OCH3" o "2'-O-metilo" se refieren cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "MOE" o "2'-MOE" o "2 -OCH2CH2OCH3" o "2'-O-metoxietilo" se refieren cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende grupo un -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
En la técnica también se conocen muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar biciclo y triciclo que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Tales sistemas de anillo pueden someterse a varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Algunas patentes representativas de Estados Unidos que enseñan la preparación de dichos azúcares modificados incluyen, si limitación las U.S.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 y 6.600.032 y la Solicitud Internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
En los nucleótidos que tienen fracciones de azúcar modificado, las fracciones de nucleobases (naturales, modificadas o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un objetivo de ácido nucleico apropiado.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un (4'-CH(CH3)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gapmer.
Nucleobases modificadas
Las modificaciones o sustituciones de nucleobases (o bases) son estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con nucleobases no modificadas de origen natural o sintéticas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Tales modificaciones de nucleobase pueden impartir estabilidad de nucleasas, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobases, incluyendo las sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido para un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad dúplex de ácido nucleico en 0.6-1.20 C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
Nucleobases modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
Las fracciones de bases heterocíclicas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, que incluyen 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilocitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de GHR comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido acortados o ensanchados en la separación dirigidos a un ácido nucleico de GHR comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido pueden enlazarse covalentemente con una o más fracciones o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen fracciones de colesterol y fracciones de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los compuestos antisentido también pueden modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que están generalmente unidos a uno o ambos extremos terminales de compuestos antisentido para mejorar propiedades como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. En los grupos estabilizadores se incluyen las estructuras de tapa. Estas modificaciones terminales protegen al compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de exonucleasas, y pueden ayudar en la administración y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el extremo terminal 5' (tapa 5'), o en el extremo terminal 3' (tapa 3'), o puede estar presente en ambos extremos terminales. Las estructuras de tapa son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tapas desoxi abásicas invertidas. Grupos estabilizadores adicionales 3' y 5' que pueden usarse para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleasas incluyen los divulgados en la WO 03/004602 publicada el 16 de enero de 2003.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluyendo, pero no limitados a aquellos particularmente adecuados para su uso como ARNmc, se modifican mediante la unión de uno o más grupos conjugados. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del oligonucleótido unido, incluyendo pero no limitadas a, farmacodinámica, farmacocinética, estabilidad, unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y depuración. Los grupos conjugados se usan rutinariamente en las técnicas químicas y se enlazan directamente o mediante una fracción de enlace conjugado opcional o un grupo de enlace conjugado a un compuesto original como un oligonucleótido. Los grupos conjugados incluyen, sin limitación, intercaladores, moléculas informadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, tioéteres, poliéteres, colesteroles, tiocolesteroles, fracciones de ácido cólico, folato, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Ciertos grupos conjugados se han descrito anteriormente, por ejemplo: fracción de colesterol (Letsingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, do-decan-diol o residuos de undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991,10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, dihexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una cadena de poliamina o polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido acético de adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), una fracción palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys Acta, 1995, 1264, 229-237), o una fracción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicocolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
Para conjugados adicionales incluyendo aquellos útiles para ARNmc y su colocación dentro de compuestos antisentido, ver, por ejemplo, la Solicitud de Estados Unidos N° 61/583.963.
Pruebas in vitro de oligonudeótidos antisentido
En la presente se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
Las células pueden tratarse con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80% de confluencia en cultivo.
Un reactivo usado comúnmente para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con LIPOFECTINA en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTINA que puede variar de 2 a 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINA en medio sérico reducido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINA que puede variar de 2 a 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Otra técnica más, usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas, incluye la captación libre de los oligonucleótidos por las células.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos rutinarios. Las células pueden recogerse 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el cual los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos objetivo se miden mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como la media de los tratamientos replicados.
La concentración de oligonucleótido antisentido usado varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINA. Los oligonucleótidos antisentido se usan en concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan mediante electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Ciertas indicaciones
Ciertas realizaciones proporcionadas en la presente se refieren a métodos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con un exceso de hormona de crecimiento en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico de GHR, como un compuesto antisentido u oligonucleótido dirigido a GHR. En ciertos aspectos, la enfermedad asociada con el exceso de hormona del crecimiento es la acromegalia. En ciertos aspectos, la enfermedad asociada con el exceso de hormona del crecimiento es el gigantismo.
Ciertas realizaciones proporcionan un método para tratar, prevenir o mejorar la acromegalia en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico de GHR, como un compuesto antisentido u oligonucleótido dirigido a GHR. La acromegalia es una enfermedad asociada con el exceso de hormona del crecimiento (GH). En más del 90 por ciento de los pacientes con acromegalia, la sobreproducción de hormonas de crecimiento está provocada por un tumor benigno de la glándula pituitaria, llamado adenoma, que produce un exceso de hormona de crecimiento y comprime los tejidos del cerebro circundantes. La expansión del adenoma puede provocar dolores de cabeza y discapacidad visual que a menudo acompañan a la acromegalia. En algunos casos, la acromegalia está provocada por tumores del páncreas, los pulmones o las glándulas suprarrenales que llevan a un exceso de GH, ya sea produciendo GH o produciendo la hormona liberadora de la hormona de crecimiento (GHRH), la hormona que estimula la hipófisis para producir GH.
La acromegalia afecta más comúnmente a adultos de edad media y puede provocar desfiguración grave, condiciones de complicaciones y muerte prematura. Debido a su patogénesis y progresión lenta, la acromegalia a menudo no se diagnostica hasta que se las características externas se vuelven perceptibles, como cambios en la cara. La acromegalia a menudo se asocia con gigantismo.
Las características de la acromegalia incluyen hinchazón de los tejidos blandos que da como resultado un agrandamiento de las manos, pies, nariz, labios y orejas, y un engrosamiento general de la piel; hinchazón de los tejidos blandos de los órganos internos, como el corazón y los riñones; hinchazón de las cuerdas vocales que da como resultado una voz baja y habla lenta; expansión del cráneo; protuberancia de las cejas pronunciada, a menudo con distensión ocular; protrusión de la mandíbula inferior pronunciada y agrandamiento de la lengua; espacios entre los dientes; y síndrome del túnel carpiano. En ciertas realizaciones, puede tratarse, prevenirse o mejorarse cualquiera o una combinación de estas características de la acromegalia mediante la administración de un compuesto o composición dirigida a GHR proporcionada en la presente.
EJEMPLOS
Divulgación no limitativa
Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en la presente y no se pretende que los limiten.
Ejemplo 1: inhibición antisentido del receptor de la hormona del crecimiento humano en células Hep3B por gapmers MOE
Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron dirigidos a un ácido nucleico del receptor de la hormona del crecimiento (GHR) y se evaluaron sus efectos sobre el ARNm de GHR in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Se transfectaron células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de GHR por PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebador sonda humano RTS3437_MGB (secuencia directa CGAGTTCAGTGAGGTGCTCTATGT, designada en la presente como SEQ ID NO: 2297; secuencia inversa AAGAGCCATGGAAAGTAGAAATCTTC, designada en la presente como SEQ ID NO: 2298; secuencia de sonda TTCCTCAGATGAGCCAATT, designada en la presente como SEQ ID NO: 2299) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GHR se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de GHR, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién diseñados en las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers 5-10-5 MOE o 3-10-4 MOE. Los gapmers MOE 5-10-5 tienen 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Los gapmers MOE 3-10-4 tienen 17 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres y cuatro nucleósidos respectivamente. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gapmer son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia del gen humano. El "sitio de detención" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer es la secuencia del gen humano. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes está dirigido al ARNm de GHR humana, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de registro GENBANK NM_000163.4) o la secuencia genómica de GHR humana, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de registro GENBANK NT_006576.16 truncado de los nucleótidos 42411001 a 42714000). 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100% de complementariedad. En caso de que no se muestre la alineación de secuencia para un gen objetivo en una tabla particular, se entiende que ninguno de los oligonucleótidos presentados en esa tabla se alinea con un 100% de complementariedad con ese gen objetivo.
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Tabla 5
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Tabla 6
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Tabla 7
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Tabla 8
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Tabla 9
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Tabla 11
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Tabla 12
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Tabla 13
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Tabla 14
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Tabla 15
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Tabla 16
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Tabla 17
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Tabla 18
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Tabla 19
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continuación
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Ejemplo 2: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humana en células Hep3B por gapmers MOE
Los gapmers del Ejemplo 1 que mostraron una inhibición in vitro significativa del ARNm de GHR se seleccionaron y probaron a varias dosis en células Hep3B. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,625 jiM, 1,25 jiM, 2,50 jiM, 5 ,00 |j M y 10 ,00 |j M de o lig o n u c le ó tid o an tisen tido , com o se e sp e c ifica en las T ab las s igu ien tes . D e spu és de un pe río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 horas, se a is ló el A R N de las cé lu la s y se m id ie ro n los n ive les de A R N m de G H R m ed ia n te P C R cu a n tita tiva en t ie m p o real. S e usó el co n ju n to de c e b a d o r so n d a hum ano R T S 3437 _ M G B para m e d ir los n ive les de A R N m . Los n ive les de A R N m de G H R se a ju s ta ro n de acu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed ido po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o po rcen ta je de in h ib ic ión de G H R , con resp ec to a las cé lu las de con tro l no tra tadas .
T a m b ié n se p re sen ta la c o n ce n tra c ió n in h ib id o ra m áx im a (IC 50) m ed ia de cad a o ligo nu c le ó tido . Los n ive les de A R N m de G H R se red u je ron s ig n ifica tiva m e n te de una m an e ra d e p e n d ie n te de la d o s is en cé lu la s tra ta d a s con o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido .
Tabla 20
Figure imgf000092_0001
Tabla 21
Figure imgf000092_0002
Tabla 22
Figure imgf000092_0003
Tabla 23
Figure imgf000093_0001
Tabla 24
Figure imgf000093_0002
Tabla 25
Figure imgf000093_0003
continuación
Figure imgf000094_0001
Tabla 26
Figure imgf000094_0002
Tabla 27
Figure imgf000094_0003
continuación
Figure imgf000095_0001
Tabla 28
Figure imgf000095_0002
Tabla 29
Figure imgf000095_0003
Tabla 30
Figure imgf000096_0003
Tabla 31
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Tabla 32
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co n tin u a c ió n
Figure imgf000097_0001
Tabla 33
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Ejemplo 3: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humana en células Hep3B por los gapmers MOE
Los ga pm e rs de los es tu d io s de sc rito s a n te rio rm e n te que m os tra ro n una in h ib ic ión s ig n ifica tiva in vitro del A R N m de G H R se se le cc io n a ro n y p roba ron a va r ia s d o s is en cé lu la s H ep3B . Los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se p ro ba ron en una se rie de e xp e rim e n to s que te n ía n co n d ic io n e s de cu ltivo s im ila res . Los resu ltad os para cada e x p e rim e n to se p re sen ta n en ta b la s se p a ra d a s m o s tra d a s a con tinu ac ió n . Las cé lu la s se se m b ra ro n a una de ns idad de 20.000 cé lu la s po r poc illo y se tra n s fe c ta ro n usa nd o e le c tro p o ra c ió n con co n ce n tra c io n e s de 0 ,3125 j M, 0 ,625 |j M, 1,25 j M, 2 ,50 j M, 5 ,00 j M y 10 ,00 j M de o lig o n u c le ó tid o an tisen tido , com o se e sp e c ifica en las T ab las s ig u ie n tes . D e spu és de un pe río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 horas, se a is ló el A R N de las cé lu la s y se m id ie ro n los n ive le s de A R N m de G H R m ed ia n te P C R cu a n tita tiva en t ie m p o real. S e usó el co n ju n to de ce b a d o r so n d a hu m an o R T S 3437 _ M G B para m e d ir los n ive les de A R N m . Los n ive les de A R N m de G H R se a ju s ta ro n de acu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed id o po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o p o rce n ta je de in h ib ic ión de G H R , con re sp e c to a las cé lu la s de con tro l no tra tad as .
T a m b ié n se p re sen ta la c o n ce n tra c ió n in h ib id o ra m áx im a (IC 50) m ed ia de cad a o ligo nu c le ó tido . Los n ive les de A R N m de G H R se red u je ron s ig n ifica tiva m e n te de una m an e ra d e p e n d ie n te de la d o s is en cé lu la s tra ta d a s con o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido .
Tabla 34
Figure imgf000098_0001
Tabla 35
Figure imgf000098_0002
Tabla 36
Figure imgf000098_0003
co n tin u a c ió n
Figure imgf000099_0001
Tabla 37
Figure imgf000099_0002
Ejemplo 4: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humana en células Hep3B por gapmers MOE
Los ga pm e rs de los es tu d io s de sc rito s a n te rio rm e n te que m os tra ro n una in h ib ic ión in vitro s ig n ifica tiva del A R N m de G H R se se le cc io n a ro n y p roba ron a va r ia s d o s is en cé lu la s H ep3B . Los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se p ro ba ron en una se rie de e xp e rim e n to s que te n ía n co n d ic io n e s de cu ltivo s im ila res . Los resu ltad os para cada e x p e rim e n to se p re sen ta n en ta b la s se p a ra d a s m o s tra d a s a con tinu ac ió n . Las cé lu la s se se m b ra ro n a una de ns idad de 20.000 cé lu la s po r poc illo y se tra n s fe c ta ro n usando e le c tro p o ra c ió n con co n ce n tra c io n e s de 0 ,625 j M, 1,25 j M, 2 ,50 j M, 5 ,00 j M y 10 ,00 j M de o lig o n u c le ó tid o an tisen tido , com o se e sp e c ifica en las T a b la s s igu ien tes . D espués de un pe río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 horas, se a is ló el A R N de las cé lu la s y se m id ie ron los n ive les de A R N m de G H R m ed ia n te P C R cu a n tita tiva en tie m p o real. S e usó el co n ju n to de c e b a d o r so n d a hu m ano R T S 3437 _ M G B para m e d ir los n ive les de A R N m . Los n ive les de A R N m de G H R se a ju s ta ro n de acu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed ido po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o po rcen ta je de in h ib ic ión de G H R , con resp ec to a las cé lu las de con tro l no tra tadas .
T a m b ié n se p re sen ta la c o n ce n tra c ió n in h ib id o ra m áx im a (IC 50) m ed ia de cad a o ligo nu c le ó tido . Los n ive les de A R N m de G H R se red u je ron s ig n ifica tiva m e n te de una m an e ra d e p e n d ie n te de la d o s is en cé lu la s tra ta d a s con o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido .
Tabla 38
Figure imgf000099_0003
Tabla 39
Figure imgf000100_0001
Tabla 40
Figure imgf000100_0002
Tabla 41
Figure imgf000100_0003
co n tin u a c ió n
Figure imgf000101_0001
Tabla 42
Figure imgf000101_0002
Tabla 43
Figure imgf000101_0003
co n tin u a c ió n
Figure imgf000102_0001
Tabla 44
Figure imgf000102_0002
Tabla 45
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co n tin u a c ió n
Figure imgf000103_0002
Tabla 46
Figure imgf000103_0003
Ejemplo 5: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humana en células Hep3B por gapmers MOE
Los ga pm e rs de los es tu d io s de sc rito s a n te rio rm e n te que m os tra ro n una in h ib ic ión in vitro s ig n ifica tiva del A R N m de G H R se se le cc io n a ro n y p roba ron a va r ia s d o s is en cé lu la s H ep3B . Los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se p ro ba ron en una se rie de e xp e rim e n to s que te n ía n co n d ic io n e s de cu ltivo s im ila res . Los resu ltad os para cada e x p e rim e n to se p re sen ta n en ta b la s s e p a ra d a s que se m uestran a con tinu ac ió n . Las cé lu la s se se m b ra ro n en p lacas a una de n s id a d de 20.000 cé lu la s po r poc illo y se tra n s fe c ta ro n usa nd o e le c tro p o ra c ió n con co n ce n tra c io n e s de 0 ,3125 |j M, 0 ,625 |j M, 1,25 |j M, 2 ,50 |j M, 5 ,00 |j M y 10 ,00 |j M de o lig o n u c le ó tid o an tisen tido , com o se e sp e c ifica en las T a b la s s igu ien tes . D e spu és de un pe río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 horas, se a is ló el A R N de las cé lu la s y se m id ie ro n los n ive les de A R N m de G H R m ed ia n te P C R cu a n tita tiva en t ie m p o real. Se usó el co n ju n to de c e b a d o r so n d a hum ano R T S 3437 _ M G B para m e d ir los n ive les de A R N m . Los n ive le s de A R N m de G H R se a jus ta ro n de a cu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed id o po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o p o rce n ta je de in h ib ic ión de G H R , con resp ec to a las cé lu la s de con tro l no tra tadas .
T a m b ié n se p re sen ta la c o n ce n tra c ió n in h ib id o ra m áx im a (IC 50) m ed ia de cad a o ligo nu c le ó tido . Los n ive les de A R N m de G H R se red u je ron s ig n ifica tiva m e n te de una m an e ra d e p e n d ie n te de la d o s is en cé lu la s tra ta d a s con o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido .
Tabla 47
Figure imgf000103_0001
co n tin u a c ió n
Figure imgf000104_0001
Tabla 48
Figure imgf000104_0002
Tabla 49
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Tabla 50
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Ejemplo 6: inhibición antisentido del receptor de la hormona del crecimiento humano en células Hep3B por gapmers desoxi, MOE y cEt
S e d ise ñ a ro n o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o ad ic io n a le s d irig ido s a un ác ido nu c le ico de l re ce p to r de la ho rm o n a de l c re c im ie n to (G H R ) y se a n a liza ro n sus e fe c to s sob re el A R N m de G H R in v itro . Los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se p ro ba ron en una se rie de e xp e rim e n to s que te n ía n co n d ic io n e s de cu ltivo s im ila res . Los resu ltad os pa ra cada e xp e rim e n to se p resen tan en ta b la s se p a ra d a s que se m ue s tra n a con tinu ac ió n . S e tra n s fe c ta ro n cé lu las H e p3 B cu ltiva d a s a una de ns idad de 20.000 cé lu la s po r poc illo usando e le c tro p o ra c ió n con o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o 5.000 nM. D e spu és de un p e río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 24 horas, se a is ló A R N de las cé lu la s y se m id ie ro n los n ive les de A R N m de G H R po r P C R cu a n tita tiva en t ie m p o real. S e usó el con ju n to de c e b a d o r so n d a hum ano R T S 3437 _ M G B para m e d ir los n ive les de A R N m . Los n ive le s de A R N m de G H R se a jus ta ro n de a cu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed id o po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o p o rce n ta je de in h ib ic ión de G H R , con resp ec to a las cé lu la s de con tro l no tra tadas .
Los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o q u im é rico s de nu evo d iseñ o en las T ab las a co n tin u a c ió n se d iseñ a ron co m o ga pm e rs de desoxi, M O E y cEt. Los o lig o n u c le ó tid o s desox i, M O E y cE t tie n e n una long itud de 16 nu c le ós id os en dond e el nu c le ó s id o t ie n e o una m od ifica c ió n de a z ú c a r M O E , una m od ifica c ió n de a z ú c a r cE t o una m od ifica c ión desox i. La co lum n a 'Q u ím ica ' de sc rib e las m o d ifica c io n e s de a zú ca r de cad a o ligo nu c le ó tido . 'k' ind ica una m o d ifica c ió n de a zú ca r cEt; 'd ' ind ica desox irribo sa ; y 'e' ind ica una m o d ifica c ió n M O E. Los en la ces in te rn u c le o s íd ico s a lo la rgo de cada g a p m e r son en la ces de fo s fo ro tio a to (P =S ). T o d o s los res idu os de c itos ina en cad a g a p m e r son 5 -m e tilc itos ina s . El "s itio de in ic io " ind ica el n u c le ó s id o m ás 5' al que se d irige el g a p m e r en la s e cu e n c ia de l gen hum ano. El "s itio de d e tenc ión " ind ica el n u c le ó s id o m ás 3' al que se d irige el g a p m e r en la s e cu e n c ia de l gen hum ano. C a da g a p m e r en u m e ra d o en las ta b la s s ig u ie n te s está d ir ig ido al A R N m de G H R hum ana , d e s ig n a d o en la p re sen te com o S E Q ID NO: 1 (N ° de reg is tro G E N B A N K NM 000163.4 ) o la secu en c ia g e n ó m ica de G H R hum ana , d e s ig n a d a en la p re sen te com o S E Q ID NO: 2 (N ° de reg is tro G E N B A n K N T _ 006576.16 tru n c a d o de los nu c le ó tid o s 42411001 a 42714000 ). 'n /a ' ind ica que el o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o no se d irige a esa s e cu e n c ia g é n ica p a rticu la r con un 100% de co m p le m e n ta rie d a d . En caso de que no se m ue s tre la a line ac ión de s e cu e n c ia para un gen o b je tivo en una ta b la pa rticu la r, se en tie n d e que n ing uno de los o lig o n u c le ó tid o s p re sen ta do s en esa ta b la se a line a con una c o m p le m e n ta rie d a d del 100% con ese gen ob je tivo .
Figure imgf000106_0001
Figure imgf000107_0001
Ejemplo 7: inhibición antisentido del receptor de la hormona del crecimiento humano en células Hep3B por gapmers desoxi, MOE y cEt
S e d ise ñ a ro n o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o ad ic io n a le s d irig ido s a un ác ido nu c le ico de l re ce p to r de la ho rm o n a de l c re c im ie n to (G H R ) y se a n a liza ro n sus e fe c to s sob re el A R N m de G H R in v itro . Los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se p ro ba ron en una se rie de e xp e rim e n to s que te n ía n co n d ic io n e s de cu ltivo s im ila res . Los resu ltad os pa ra cada e xp e rim e n to se p resen tan en ta b la s se p a ra d a s que se m ue s tra n a con tinu ac ió n . S e tra n s fe c ta ro n cé lu las H e p3 B cu ltiva d a s a una de ns idad de 20.000 cé lu la s po r poc illo usando e le c tro p o ra c ió n con o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o 4.500 nM. D e spu és de un p e río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 24 horas, se a is ló A R N de las cé lu la s y se m id ie ro n los n ive les de A R N m de G H R po r P C R cu a n tita tiva en t ie m p o real. S e usó el con ju n to de c e b a d o r so n d a hum ano R T S 3437 _ M G B para m e d ir los n ive les de A R N m . Los n ive le s de A R N m de G H R se a jus ta ro n de a cu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed id o po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o p o rce n ta je de in h ib ic ión de G H R , con re sp e c to a las cé lu la s de con tro l no tra tadas .
Los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o q u im é rico s de nu evo d iseñ o en las T ab las a co n tin u a c ió n se d iseñ a ron co m o ga pm e rs de desoxi, M O E y cEt. Los o lig o n u c le ó tid o s desox i, M O E y cE t tie n e n una long itud de 16 nu c le ós id os en dond e el n u c le ós id o t ie n e una m od ifica c ió n de a z ú c a r M O E , una m o d ifica c ió n de a z ú c a r cE t o una m od ifica c ión desox i. La co lum n a 'Q u ím ica ' de sc rib e las m o d ifica c io n e s de a zú ca r de cad a o ligo nu c le ó tido . 'k' ind ica una m o d ifica c ió n de a zú ca r cEt; 'd ' ind ica desox irribo sa ; y 'e' ind ica una m o d ifica c ió n M O E. Los en la ces in te rn u c le o s íd ico s a lo la rgo de cada g a p m e r son en la ces de fo s fo ro tio a to (P =S ). T o d o s los res idu os de c itos ina en cad a g a p m e r son 5 -m e tilc itos ina s . El "s itio de in ic io " ind ica el n u c le ó s id o m ás 5' al que se d irige el g a p m e r en la s e cu e n c ia de l gen hum ano. El "s itio de d e tenc ión " ind ica el n u c le ó s id o m ás 3 'a l que se d irige el g a p m e r en la s e cu e n c ia de l gen hum ano. C a da g a p m e r en u m e ra d o en las ta b la s s ig u ie n te s está d ir ig ido al A R N m de G H R hum ana , d e s ig n a d o en la p re sen te com o S E Q ID NO: 1 (N ° de reg is tro G E N B A N K NM 000163.4 ) o la secu en c ia g e n ó m ica de G H R hum ana, d e s ig n a d a en la p re sen te com o S E Q ID NO: 2 (N ° de reg is tro G E N B A N K N T _ 006576.16 tru n c a d o de los nu c le ó tid o s 4241100 l a 42714000 ). 'n /a ' ind ica que el o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o no se d irige a esa se cu e n c ia gén ica p a rticu la r con un 100% de co m p le m e n ta rie d a d . En caso de que no se m ue s tre la a line ac ión de secu en c ia para un gen o b je tivo en una ta b la pa rticu la r, se en tie n d e que n ing uno de los o lig o n u c le ó tid o s p re se n ta d o s en esa ta b la se a line a con una co m p le m e n ta rie d a d de l 100% con ese gen ob je tivo . Los o lig o n u c le ó tid o s de la T ab la 54 no se d irigen a las S E Q ID NO: 1 o 2, s ino que se d irige n a las se cu e n c ia s de genes v a ria n te s de la S E Q ID NO: 4 (N ° de R e g is tro G E N B A N K D R 006395.1 ) o la S E Q ID NO: 7 (el co m p le m e n to de N° de reg is tro G E N B A N K A A 398260.1 ).
Tabla 52
Figure imgf000108_0001
co n tin u a c ió n
Figure imgf000109_0001
co n tin u a c ió n
Figure imgf000110_0001
Figure imgf000111_0001
Figure imgf000112_0001
Figure imgf000113_0001
Tabla 54
Figure imgf000114_0001
Figure imgf000115_0001
Figure imgf000116_0001
Figure imgf000117_0001
Figure imgf000118_0001
Figure imgf000119_0001
Figure imgf000120_0001
Figure imgf000121_0001
Figure imgf000122_0001
Figure imgf000123_0001
Figure imgf000124_0001
Figure imgf000125_0001
Figure imgf000126_0001
Figure imgf000127_0001
Figure imgf000128_0001
Figure imgf000129_0001
Figure imgf000130_0001
Figure imgf000131_0001
Figure imgf000132_0001
Figure imgf000133_0001
Figure imgf000134_0001
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- co o ÍC
3 C
s
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Tabla 62
Figure imgf000142_0001
co n tin u a c ió n
Figure imgf000143_0001
Figure imgf000144_0001
Figure imgf000145_0001
Figure imgf000146_0001
Figure imgf000147_0001
Tabla 64
Figure imgf000148_0001
co n tin u a c ió n
Figure imgf000149_0001
Figure imgf000150_0001
Figure imgf000151_0001
Figure imgf000152_0001
Ejemplo 8: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humana en células Hep3B por gapmers de desoxi, MOE y cEt
Los ga pm e rs de los es tu d io s de sc rito s a n te rio rm e n te que m os tra ro n una in h ib ic ión in vitro s ig n ifica tiva del A R N m de G H R se se le cc io n a ro n y p roba ron a va r ia s d o s is en cé lu la s H ep3B . Los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se p ro ba ron en una se rie de e xp e rim e n to s que te n ía n co n d ic io n e s de cu ltivo s im ila res . Los resu ltad os para cada e x p e rim e n to se p re sen ta n en ta b la s s e p a ra d a s que se m ue s tra n a con tinu ac ió n . Las cé lu la s se se m b ra ro n a una de n s id a d de 20.000 cé lu la s po r poc illo y se tra n s fe c ta ro n usando e le c tro p o ra c ió n con co n ce n tra c io n e s de o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o de 0 ,625 j iM, 1,25 jiM, 2 ,50 jiM, 5 ,00 j iM y 10 ,00 j iM. D e spu és de un pe río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 horas, se a is ló el A R N de las cé lu la s y se m id ie ron los n ive le s de A R N m de G H R m ed ia n te P C R cu a n tita tiva en t ie m p o real. S e usó el co n ju n to de c e b a d o r so n d a h u m an o R T S 3437 _ M G B para m e d ir los n ive les de A R N m . Los n ive les de A R N m de G H R se a jus ta ro n de a cu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed id o po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p resen tan com o po rcen ta je de in h ib ic ión de G H R , con resp ec to a las cé lu la s de con tro l no tra tadas .
T a m b ié n se p re sen ta la c o n ce n tra c ió n in h ib id o ra m áx im a (IC 50) m ed ia de cad a o ligo nu c le ó tido . Los n ive les de A R N m de G H R se red u je ron s ig n ifica tiva m e n te de una m an e ra d e p e n d ie n te de la d o s is en cé lu la s tra ta d a s con o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido .
Tabla 66
Figure imgf000153_0001
Tabla 67
Figure imgf000153_0002
co n tin u a c ió n
Figure imgf000154_0001
Tabla 68
Figure imgf000154_0002
Tabla 69
Figure imgf000154_0003
Tabla 70
Figure imgf000155_0001
Tabla 71
Figure imgf000155_0002
Tabla 72
Figure imgf000155_0003
co n tin u a c ió n
Figure imgf000156_0001
Tabla 73
Figure imgf000156_0002
Tabla 74
Figure imgf000156_0003
co n tin u a c ió n
Figure imgf000157_0001
Tabla 75
Figure imgf000157_0002
Tabla 76
Figure imgf000157_0003
Ejemplo 9: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR humana en células Hep3B por gapmers de desoxi, MOE y cEt
Los ga pm e rs de los es tu d io s de sc rito s a n te rio rm e n te que m os tra ro n una in h ib ic ión in vitro s ig n ifica tiva del A R N m de G H R se se le cc io n a ro n y p roba ron a va r ia s d o s is en cé lu la s H ep3B . Los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se p ro ba ron en una se rie de e xp e rim e n to s que te n ía n co n d ic io n e s de cu ltivo s im ila res . Los resu ltad os para cada e x p e rim e n to se p re sen ta n en ta b la s s e p a ra d a s que se m uestran a con tinu ac ió n . Las cé lu la s se se m b ra ro n en p lacas a una de n s id a d de 20.000 cé lu la s po r poc illo y se tra n s fe c ta ro n usa nd o e le c tro p o ra c ió n con co n ce n tra c io n e s de o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o de 0 ,04 jiM, 0,11 jiM, 0 ,33 jiM, 1,00 jiM y 3 ,00 jiM. D e spu és de un p e río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 horas, se a is ló el a R n de las cé lu las y se m id ie ro n los n ive les de A R N m de G H R m ed ia n te P C R cu a n tita tiva en t ie m p o real. S e usó el co n ju n to de c e b a d o r son da hu m ano R T S 3437 _ M G B para m e d ir los n ive le s de A R N m . Los n ive les de A R N m de G H R se a jus ta ro n de a cu e rd o con el co n ten ido to ta l de a R n , m ed ido por R IB O G R E E N ® . Los resu ltad os se p resen tan com o po rcen ta je de in h ib ic ión de G H R , con resp ec to a las cé lu la s de con tro l no tra tad as .
T a m b ié n se p re sen ta la c o n ce n tra c ió n in h ib id o ra m áx im a (IC 50) m ed ia de cad a o ligo nu c le ó tido . Los n ive les de A R N m de G H R se red u je ron s ig n ifica tiva m e n te de una m an e ra d e p e n d ie n te de la d o s is en cé lu la s tra ta d a s con o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido .
Tabla 77
Figure imgf000158_0001
Tabla 78
Figure imgf000158_0002
co n tin u a c ió n
Figure imgf000159_0001
Tabla 79
Figure imgf000159_0002
Tabla 80
Figure imgf000159_0003
co n tin u a c ió n
Figure imgf000160_0001
Tabla 81
Figure imgf000160_0002
Tabla 82
Figure imgf000160_0003
co n tin u a c ió n
Figure imgf000161_0002
Tabla 83
Figure imgf000161_0003
Ejemplo 10: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR de mono rhesus en células LLC-MK2
Los ga pm e rs de los es tu d io s de sc rito s a n te rio rm e n te que m os tra ro n una in h ib ic ión in vitro s ig n ifica tiva del A R N m de G H R se s e le cc io n a ro n y p roba ron su po tenc ia para el A R N m de G H R rhe sus en cé lu la s LLC -M K 2. Las cé lu la s se se m b ra ro n en p lacas a una de n s id a d de 20.000 cé lu la s po r poc illo y se tra n s fe c ta ro n usando e le c tro p o ra c ió n con c o n ce n tra c io n e s de o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o de 0 ,12 jiM, 0 ,37 jiM, 1,11 jiM, 3 ,33 jiM y 10 ,00 |jM . D e spu és de un pe río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 horas, se a is ló el A R N de las cé lu la s y se m id ie ro n los n ive le s de A R N m de G H R m ed ia n te P C R cu a n tita tiva en t ie m p o real. S e usó el co n ju n to de ce b a d o r so n d a R T S 3437 M G B pa ra m e d ir los n ive le s de A R N m . Los n ive les de A R N m de G H R se a jus ta ro n de a cu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed id o po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o p o rcen ta je de in h ib ic ión de G H R , con respec to a las cé lu las de con tro l no tra tadas .
T a m b ié n se p re sen ta la c o n ce n tra c ió n in h ib id o ra m áx im a (IC 50) m ed ia de cad a o ligo nu c le ó tido . Los n ive les de A R N m de G H R se red u je ron s ig n ifica tiva m e n te de una m an e ra d e p e n d ie n te de la d o s is en cé lu la s tra ta d a s con o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido .
Tabla 84
Figure imgf000161_0001
co n tin u a c ió n
Figure imgf000162_0001
Tabla 85
Figure imgf000162_0002
Ejemplo 11: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR en hepatocitos primarios de cynomolgus
Los ga pm e rs de los es tu d io s de sc rito s a n te rio rm e n te que m os tra ro n una in h ib ic ión in vitro s ig n ifica tiva del A R N m de G H R fue ro n s e le cc io n a d o s y p ro ba dos para d e te rm in a r su po tenc ia para el A R N m de G H R en he pa to c itos p rim a rio s de m on o cyno m o lgus . Las cé lu la s se se m b ra ro n en p lacas a una de n s id a d de 20.000 cé lu las po r poc illo y se tra n s fe c ta ro n usando e le c tro p o ra c ió n con co n ce n tra c io n e s de o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o de 0 ,12 j M, 0 ,37 j M, 1,11 j M, 3 ,33 j M y 10 ,00 j M. D e spu és de un pe río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 horas, se a is ló el A R N de las cé lu la s y se m id ie ro n los n ive les de A R N m de G H R m ed ia n te P C R cu a n tita tiva en tie m p o real. S e usó el co n ju n to de c e b a d o r son da R T S 3437 M G B pa ra m e d ir los n ive le s de A R N m . Los n ive le s de A R N m de G H R se a jus ta ro n de a cu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed id o po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o p o rce n ta je de in h ib ic ión de G H R , con resp ec to a las cé lu la s de con tro l no tra tadas .
T a m b ié n se p re sen ta la c o n ce n tra c ió n in h ib id o ra m áx im a (IC 50) m ed ia de cad a o ligo nu c le ó tido . Los n ive les de A R N m de G H R se red u je ron s ig n ifica tiva m e n te de una m an e ra d e p e n d ie n te de la d o s is en cé lu la s tra ta d a s con o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido .
Tabla 86
Figure imgf000163_0001
Tabla 87
Figure imgf000163_0002
Ejemplo 12: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR en células Hep3B
Los ga pm e rs de los es tu d io s de sc rito s a n te rio rm e n te que m os tra ro n una in h ib ic ión in vitro s ig n ifica tiva del A R N m de G H R fue ro n s e le cc io n a d o s y p ro ba dos pa ra d e te rm in a r su po tenc ia para el A R N m de G H R a va ria s dosis en cé lu la s H ep3B . Las cé lu la s se sem b ra ro n en p laca s a una de ns idad de 20.000 cé lu la s po r poc illo y se tra n s fe c ta ro n usando e le c tro p o ra c ió n con co n ce n tra c io n e s de o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o de 0 ,12 j M, 0 ,37 j M, 1,11 |j M, 3 ,33 j M y 10 ,00 j M. D e spu és de un pe río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 horas, se a is ló el A R N de las cé lu la s y se m id ie ron los n ive les de A R N m de G H R m ed ia n te P C R cu a n tita tiva en t ie m p o real. S e usó el con jun to de c e b a d o r son da hu m ano R T S 3437 _ M G B para m e d ir los n ive les de A R N m . Los n ive les de A R N m de G H R se a jus ta ro n de a cu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed id o po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o p o rce n ta je de in h ib ic ión de G H R , con re sp e c to a las cé lu la s de con tro l no tra tadas .
T a m b ié n se p re sen ta la c o n ce n tra c ió n in h ib id o ra m áx im a (IC 50) m ed ia de cad a o ligo nu c le ó tido . Los n ive les de A R N m de G H R se red u je ron s ig n ifica tiva m e n te de una m an e ra d e p e n d ie n te de la d o s is en cé lu la s tra ta d a s con o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido .
Tabla 88
Figure imgf000164_0001
Tabla 89
Figure imgf000164_0002
Ejemplo 13: inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR en hepatocitos primarios de cynomolgus Los ga pm e rs de los es tu d io s de sc rito s a n te rio rm e n te que m os tra ro n una in h ib ic ión in vitro s ig n ifica tiva del A R N m de G H R se s e le cc io n a ro n y p roba ron a va r ia s dos is en h e p a to c ito s p rim a rio s de m on os cyno m o lgus . Las cé lu la s se se m b ra ro n en p lacas a una de n s id a d de 35.000 cé lu la s po r poc illo y se tra n s fe c ta ro n usando e le c tro p o ra c ió n con co n ce n tra c io n e s de o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o de 0 ,04 jiM, 0 ,12 j iM, 0 ,37 j iM, 1,1 jiM, 3 ,33 jiM y 10 ,00 j iM. D e spu és de un p e río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 horas, se a is ló el A R N de las cé lu la s y se m id ie ro n los n ive les de A R N m de G H R m ed ia n te P C R cu a n tita tiva en t ie m p o real. S e usó el co n ju n to de c e b a d o r so n d a R T S 3437 _ M G B para m e d ir los n ive le s de A R N m . Los n ive les de A R N m de G H R se a ju s ta ro n de a cu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed id o po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o p o rcen ta je de in h ib ic ión de G H R , con resp ec to a las cé lu las de con tro l no tra tadas .
T a m b ié n se p re sen ta la c o n ce n tra c ió n in h ib id o ra m áx im a (IC 50) m ed ia de cad a o ligo nu c le ó tido . Los n ive les de A R N m de G H R se red u je ron s ig n ifica tiva m e n te de una m an e ra d e p e n d ie n te de la d o s is en cé lu la s tra ta d a s con o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido .
Tabla 90
Figure imgf000165_0001
Ejemplo 14: Análisis comparativo de la inhibición antisentido dependiente de la dosis de GHR en células Hep3B
S e co m p a ró IS IS 532401 con o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o e sp e c ífico s d ivu lg a d o s en la US 2006 /0178325 p ro b a n d o a va r ia s d o s is en cé lu la s H ep3B . Los o lig o n u c le ó tid o s se s e le cc io n a ro n en base a la po tenc ia de m o s tra d a en los e s tu d io s d e sc rito s en la so lic itud . Las cé lu la s se co lo ca ro n en p lacas a una de ns idad de 20.000 cé lu la s por poc illo y se tra n s fe c ta ro n u sa nd o e le c tro p o ra c ió n con co n ce n tra c io n e s de o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o de 0,11 j iM, 0 ,33 jiM, 1 ,00 j iM, 1,11 j iM, 3 ,00 j iM y 9 ,00 jiM. D e spu és de un pe río do de tra ta m ie n to de a p ro x im a d a m e n te 16 horas, se a is ló el A R N de las cé lu la s y se m id ie ron los n ive les de A R N m de G H R m ed ia n te P C R cu a n tita tiva en tie m p o real. S e usó el co n ju n to de c e b a d o r son da hu m ano R T S 3437 _ M G B para m e d ir los n ive le s de A R N m . Los n ive le s de A R N m de G H R se a jus ta ro n de a cu e rd o con el co n te n id o to ta l de A R N , m ed id o po r R IB O G R E E N ® . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o p o rcen ta je de in h ib ic ión de G H R , con re sp e c to a las cé lu la s de con tro l no tra tad as .
T a m b ié n se p re sen ta la c o n ce n tra c ió n in h ib id o ra m áx im a (IC 50) m ed ia de cad a o ligo nu c le ó tido . Los re su lta d o s ind ican que IS IS 532401 era m a rca d a m e n te m ás p o ten te que los o lig o n u c le ó tid o s m ás po ten tes de la US 2006 /0178325.
Tabla 91
Figure imgf000165_0002
Ejemplo 15: tolerabilidad de gapmers 5-10-5 MOE dirigidos a GHR humana en ratones CD1
Los ra ton es C D 1 ® (C h a rle s R iver, M A ) son un m od e lo de ra ton es m u ltip rop ós ito , fre cu e n te m e n te usado pa ra p ru eb as de seg u rid a d y e ficac ia . Los ra ton es fue ro n tra ta d o s con o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o IS IS s e le cc io n a d o s de los e s tu d io s d e sc rito s a n te rio rm e n te y se eva lu a ro n para d e te c ta r ca m b io s en los n ive les de va rio s m a rca d o re s de q u ím ica de l p lasm a.
Tratam iento
A g ru po s de ra ton es CD1 m ach o de och o a d iez sem a na s de edad se les in yec ta ro n po r v ía s u b cu tá n e a dos ve ce s po r se m a n a d u ran te 6 sem a na s 50 m g /kg de o lig o n u c le ó tid o s IS IS (do s is de 100 m g /kg /se m ana ). A un g ru p o de ra ton es CD1 m ach o se le in yec tó po r v ía s u b cu tá n e a dos ve ce s po r sem a na d u ran te 6 sem a na s PBS. Los ra ton es se sa c rifica ro n 48 ho ras de spu és de la ú ltim a dosis, y los ó rg a n o s y el p lasm a se reco g ie ron para su an á lis is poste rio r.
M arcadores de quím ica de plasm a
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión he pá tica y renal, se m id ie ro n los n ive les en p lasm a de tra n sa m in a sa s , b ilirrub ina , c re a tin in a y BUN u sa nd o un a n a liza d o r qu ím ico c lín ico a u to m a tiza d o (H ita ch i O lym p u s A U 400 e , M elv ille , NY). Los resu ltad os se p re sen ta n en la T ab la 92. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro vo ca ro n ca m b io s en los n ive les de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s de la fun c ión he pá tica o rena l fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en e s tu d io s poste rio res.
Tabla 92
Figure imgf000166_0002
Ensayos hem atológicos
La san g re ob te n id a de to d o s los g ru po s de ra ton es se env ió a A n te ch D ia g n o s tics pa ra re a liza r m ed ic io n e s y an á lis is de h e m a to c rito (H C T), as í com o m e d ic io n e s de las va r ia s cé lu las san gu ín ea s , com o W B C , R B C y p laque tas , y el co n te n id o to ta l de he m og lob in a . Los resu ltad os se p re sen ta n en la T a b la 93. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro voca ron ca m b io s en los n ive le s de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s he m a to ló g ico s fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en e s tu d io s poste rio res.
Tabla 93
Figure imgf000166_0001
co n tin u a c ió n
Figure imgf000167_0001
Ejemplo 16: tolerabilidad de gapmers 5-10-5 MOE dirigidos a GHR humana en ratones CD1
Los ra ton es C D 1 ® se tra ta ro n con o lig o n u c le ó tid o s a n tisen tido IS IS s e le cc io n a d o s de los es tu d io s desc ritos a n te rio rm e n te y se eva lu a ro n los ca m b io s en los n ive le s de va rio s m a rca d o re s qu ím ico s en p lasm a.
Tratam iento
A g ru po s de ra ton es CD1 m ach o de ocho a d iez se m a n a s de edad se les in yec tó po r v ía s u b cu tá n e a dos ve c e s po r se m a n a d u ra n te 6 se m a n a s 50 m g /kg de o lig o n u c le ó tid o IS IS (do s is de 100 m g /kg /se m ana ). A un g rupo de ra ton es CD1 m ach o se le in yec tó po r v ía su b cu tá n e a dos ve ce s po r se m a n a d u ra n te 6 se m a n a s PBS. Los ra ton es se sa c rifica ro n 48 ho ras de spu és de la ú ltim a dosis, y los ó rg a n o s y el p lasm a se reco g ie ron para su an á lis is poste rio r.
M arcadores de quím ica de plasm a
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión he pá tica y renal, se m id ie ro n los n ive les en p lasm a de tra n sa m in a sa s , b ilirrub ina , c re a tin in a y BUN u sa nd o un a n a liza d o r qu ím ico c lín ico a u to m a tiza d o (H ita ch i O lym p u s A U 400 e , M elv ille , NY). Los resu ltad os se p re sen ta n en la T ab la 94. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro vo ca ro n ca m b io s en los n ive les de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s de la fun c ión he pá tica o rena l fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en e s tu d io s poste rio res.
Tabla 94
Figure imgf000167_0002
Ensayos hem atológicos
La san g re ob te n id a de to d o s los g ru po s de ra ton es se env ió a A n te ch D ia g n o s tics pa ra re a liza r m ed ic io n e s y an á lis is de h e m a to c rito (H C T), as í com o m e d ic io n e s de las va r ia s cé lu la s san gu ín ea s , com o W B ), R B C y p laque tas , y el co n te n id o to ta l de he m og lob in a . Los resu ltad os se p re sen ta n en la T a b la 95. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro voca ron ca m b io s en los n ive le s de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s he m a to ló g ico s fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en e s tu d io s poste rio res.
Tabla 95
Figure imgf000168_0001
Ejemplo 17: tolerabilidad de gapmers 3-10-4 MOE dirigidos a GHR humana en ratones CD1
Los ra ton es C D 1 ® se tra ta ro n con o lig o n u c le ó tid o s a n tisen tido IS IS s e le cc io n a d o s de los es tu d io s desc ritos a n te rio rm e n te y se eva lu a ro n para ca m b io s en los n ive les de va r io s m a rca d o re s q u ím ico s en p lasm a.
Tratam iento
A g ru po s de ra ton es CD1 m ach o de ocho a d iez se m a n a s de edad se les in yec tó po r v ía s u b cu tá n e a dos ve c e s po r se m a n a d u ra n te 6 se m a n a s 50 m g /kg de o lig o n u c le ó tid o IS IS (do s is de 100 m g /kg /se m ana ). A un g rupo de ra ton es CD1 m ach o se le in yec tó po r v ía su b cu tá n e a dos ve ce s po r se m a n a d u ra n te 6 se m a n a s PBS. Los ra ton es se sa c rifica ro n 48 ho ras de spu és de la ú ltim a dosis, y los ó rg a n o s y el p lasm a se reco g ie ron para su aná lis is poste rio r.
M arcadores de quím ica de plasm a
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión he pá tica y renal, se m id ie ro n los n ive les en p lasm a de tra n sa m in a sa s , b ilirrub ina , c re a tin in a y BUN u sa nd o un a n a liza d o r qu ím ico c lín ico a u to m a tiza d o (H ita ch i O lym p u s A U 400 e , M elv ille , NY). Los resu ltad os se p re sen ta n en la T ab la 96. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro voca ron ca m b io s en los n ive le s de c u a lq u ie ra de los m a rca d o re s de fu n c ió n he pá tica o rena l fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en e s tu d io s poste rio res.
Tabla 96
Figure imgf000168_0002
co n tin u a c ió n
Figure imgf000169_0002
Ensayos hem atológicos
La san g re ob te n id a de to d o s los g ru po s de ra ton es se env ió a A n te ch D ia g n o s tics pa ra re a liza r m ed ic io n e s y an á lis is de h e m a to c rito (H C T), as í com o m e d ic io n e s de las va r ia s cé lu las san gu ín ea s , com o W B C , R B C y p laque tas , y el co n te n id o to ta l de he m og lob in a . Los resu ltad os se p re sen ta n en la T a b la 97. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro voca ron ca m b io s en los n ive le s de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s he m a to ló g ico s fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en e s tu d io s poste rio res.
Tabla 97
Figure imgf000169_0001
co n tin u a c ió n
Figure imgf000170_0001
Ejemplo 18: tolerabilidad de gapmers de desoxi, MOE y cEt dirigidos a GHR humana en ratones CD1
Los ra ton es C D 1 ® se tra ta ro n con o lig o n u c le ó tid o s a n tisen tido IS IS s e le cc io n a d o s de los es tu d io s desc ritos a n te rio rm e n te y se eva lu a ro n los ca m b io s en los n ive le s de va rio s m a rca d o re s qu ím ico s en p lasm a.
Tratam iento
A g ru po s de ra ton es CD1 m ach o de och o a d iez sem a na s de edad se les in yec ta ro n po r v ía s u b cu tá n e a dos ve ce s po r se m a n a d u ran te 6 sem a na s 25 m g /kg de o lig o n u c le ó tid o IS IS (d o s is de 50 m g /kg /se m ana ). A un g ru p o de ra ton es CD1 m ach o se le in yec tó po r v ía s u b cu tá n e a dos ve ce s po r sem a na d u ran te 6 sem a na s PBS. Los ra ton es se sa c rifica ro n 48 ho ras de spu és de la ú ltim a dosis, y los ó rg a n o s y el p lasm a se reco g ie ron para su aná lis is poste rio r.
M arcadores de quím ica de plasm a
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión he pá tica y renal, se m id ie ro n los n ive les en p lasm a de tra n sa m in a sa s , b ilirrub ina , c re a tin in a y BUN u sa nd o un a n a liza d o r qu ím ico c lín ico a u to m a tiza d o (H ita ch i O lym p u s A U 400 e , M elv ille , NY). Los resu ltad os se p re sen ta n en la T ab la 98. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro vo ca ro n ca m b io s en los n ive le s de c u a lq u ie ra de los m a rca d o re s de fu n c ió n he pá tica o rena l fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en e s tu d io s poste rio res.
Tabla 98
Figure imgf000170_0002
Ensayos hem atológicos
La san g re ob te n id a de to d o s los g ru po s de ra ton es se env ió a A n te ch D ia g n o s tics pa ra re a liza r m ed ic io n e s y an á lis is de h e m a to c rito (H C T), as í com o m e d ic io n e s de las va r ia s cé lu las san gu ín ea s , com o W B C , R B C y p laque tas , y el co n te n id o to ta l de he m og lob in a . Los resu ltad os se p re sen ta n en la T a b la 99. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro voca ron ca m b io s en los n ive le s de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s he m a to ló g ico s fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en e s tu d io s poste rio res.
Tabla 99
Figure imgf000171_0001
Ejemplo 19: tolerabilidad de separadores de desoxi, MOE y cEt dirigidos a GHR humana en ratones CD1 Los ra ton es C D 1 ® se tra ta ro n con o lig o n u c le ó tid o s a n tisen tido IS IS s e le cc io n a d o s de los es tu d io s desc ritos a n te rio rm e n te y se eva lu a ro n pa ra ca m b io s en los n ive le s de va r io s m a rca d o re s qu ím ico s en p lasm a. El 3 -10 -4 M O E g a p m e r IS IS 539376 ta m b ié n se in c luyó en el estud io .
Tratam iento
A g ru po s de ra ton es CD1 m ach o de och o a d iez sem a na s de edad se les in yec ta ro n po r v ía s u b cu tá n e a dos ve ce s po r se m a n a d u ran te 6 sem a na s 25 m g /kg de o lig o n u c le ó tid o IS IS (d o s is de 50 m g /kg /se m ana ). A un g ru p o de ra ton es CD1 m ach o se le in yec tó po r v ía s u b cu tá n e a dos ve ce s po r sem a na d u ran te 6 sem a na s PBS. Los ra ton es se sa c rifica ro n 48 ho ras de spu és de la ú ltim a dosis, y los ó rg a n o s y el p lasm a se reco g ie ron para su an á lis is poste rio r.
M arcadores de quím ica de plasm a
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión he pá tica y renal, se m id ie ro n los n ive les en p lasm a de tra n sa m in a sa s , b ilirrub ina , c re a tin in a y BUN u sa nd o un a n a liza d o r qu ím ico c lín ico a u to m a tiza d o (H ita ch i O lym p u s A U 400 e , M elv ille , NY). Los resu ltad os se p re sen ta n en la T a b la 100. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro vo ca ro n ca m b io s en los n ive les de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s de la fun c ión he pá tica o rena l fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en e s tu d io s poste rio res.
Tabla 100
Figure imgf000172_0001
Ensayos hem atológicos
La san g re ob te n id a de to d o s los g ru po s de ra ton es se env ió a A n te ch D ia g n o s tics pa ra re a liza r m ed ic io n e s y an á lis is de he m a to c rito (H C T), a s í com o m e d ic io n e s de las va ria s cé lu la s san gu ín ea s , com o W B C , R B C y el co n te n id o to ta l de he m og lob in a . Los re su lta d o s se p re sen ta n en la T a b la 101. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro vo ca ro n ca m b io s en los n ive le s de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s h e m a to ló g ico s fu e ra de l in te rva lo e sp e ra do para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc lu ye ro n en es tu d io s poste rio res.
Tabla 101
Figure imgf000172_0002
co n tin u a c ió n
Figure imgf000173_0002
Ejemplo 20: tolerabilidad de gapmers de desoxi, MOE y cEt dirigidos a GHR humana en ratones CD1
Los ra ton es C D 1 ® se tra ta ro n con o lig o n u c le ó tid o s a n tisen tido IS IS s e le cc io n a d o s de los es tu d io s desc ritos a n te rio rm e n te y se eva lu a ro n para ca m b io s en los n ive les de va r io s m a rca d o re s q u ím ico s en p lasm a.
Tratam iento
A g ru po s de ra ton es CD1 m ach o de och o a d iez sem a na s de edad se les in yec ta ro n po r v ía s u b cu tá n e a dos ve ce s po r se m a n a d u ran te 6 sem a na s 25 m g /kg de o lig o n u c le ó tid o IS IS (d o s is de 50 m g /kg /se m ana ). A un g ru p o de ra ton es CD1 m ach o se le in yec tó po r v ía s u b cu tá n e a dos ve ce s po r sem a na d u ran te 6 sem a na s PBS. Los ra ton es se sa c rifica ro n 48 ho ras de spu és de la ú ltim a dosis, y los ó rg a n o s y el p lasm a se reco g ie ron para su aná lis is poste rio r.
M arcadores de quím ica de plasm a
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión he pá tica y renal, se m id ie ro n los n ive les en p lasm a de tra n sa m in a sa s , b ilirrub ina , c re a tin in a y BUN u sa nd o un a n a liza d o r qu ím ico c lín ico a u to m a tiza d o (H ita ch i O lym p u s A U 400 e , M elv ille , NY). Los resu ltad os se p re sen ta n en la T a b la 102. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro vo ca ro n ca m b io s en los n ive les de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s de la fun c ión he pá tica o rena l fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en e s tu d io s poste rio res.
Tabla 102
Figure imgf000173_0001
co n tin u a c ió n
Figure imgf000174_0002
Ensayos hem atológicos
La san g re ob te n id a de to d o s los g ru po s de ra ton es se env ió a A n te ch D ia g n o s tics pa ra re a liza r m ed ic io n e s y an á lis is de he m a to c rito (H C T), a s í com o m e d ic io n e s de las va ria s cé lu la s san gu ín ea s , com o W B C , R B C y el co n te n id o to ta l de he m og lob in a . Los re su lta d o s se p re sen ta n en la T a b la 103. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro vo ca ro n ca m b io s en los n ive le s de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s h e m a to ló g ico s fu e ra de l in te rva lo e sp e ra do para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc lu ye ro n en es tu d io s poste rio res.
Tabla 103
Figure imgf000174_0001
Ejemplo 21: Tolerabilidad de los gapmers MOE dirigidos a GHR humana en ratas Sprague-Dawley
Las ra tas S p ra g u e -D a w le y son un m od e lo m u ltip ro p ó s ito usado para e v a lu a c io n e s de seg u rid a d y e ficac ia . Las ra tas se tra ta ro n con o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o IS IS de los e s tu d io s d e sc rito s en los e je m p lo s a n te rio re s y se e va lu a ro n para ca m b io s en los n ive les de va rio s m a rca d o re s de q u ím ica de l p lasm a.
Tratam iento
S e m an tu v ie ro n ra tas S p ra g u e -D a w le y m ach o en un c ic lo de lu z /o scu ridad de 12 ho ras y se a lim e n ta ro n ad lib itum con com ida pa ra ra tas no rm a l de P urina , d ie ta 5001. A g ru po s de 4 ra tas S p ra g u e -D a w le y se les inyec ta ron po r v ía su b cu tá n e a dos ve ce s po r se m a n a d u ra n te 6 sem a na s 50 m g /kg de o lig o n u c le ó tid o IS IS (d o s is se m a n a l de 100 m g/kg). C u a re n ta y ocho ho ras de sp u é s de la ú ltim a dosis , se sa c rifica ro n ra tas y se e x tra je ro n ó rg an os y p lasm a para su an á lis is poste rio r.
Función hepática
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión hepá tica , se m id ie ro n los n ive le s en p lasm a de tra n s a m in a s a s usando un a n a liz a d o r qu ím ico c lín ico a u to m a tiza d o (H ita ch i O lym p u s A U 400 e , M elville , NY). S e m id ie ro n los n ive les en p lasm a de A L T (a la n in a tra n s a m in a s a ) y A S T (a sp a rta to tra n s a m in a s a ) y los re su lta d o s se p re sen ta n en la T a b la 104 e xp re sa d a en UI/l. T a m b ié n se m id ie ron los n ive le s en p lasm a de b ilirru b in a u sa nd o el m ism o a n a liz a d o r q u ím ico c lín ico y los resu ltad os ta m b ié n se p re sen ta n en la T a b la 104 e xp re sa d a en m g/d l. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro voca ron ca m b io s en los n ive les de cu a lq u ie r m a rca d o r de la fun c ión h e p á tica fu e ra de l in te rva lo e s p e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en es tu d io s poste rio res.
Tabla 104
Figure imgf000175_0001
Función renal
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión renal, se m id ie ro n los n ive les en p lasm a de n itró ge no u re ico en san g re (B U N ) y c re a tin in a usando un a n a liz a d o r q u ím ico c lín ico a u to m a tiza d o (H ita ch i O lym p u s A U 400 e , M elv ille , NY). Los resu ltad os se p re sen ta n en la T a b la 105, e xp re sa d a en m g/d l. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro voca ron cam b io s en los n ive les de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s de fun c ión rena l fue ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc lu ye ro n en es tu d io s poste rio res.
Tabla 105
Figure imgf000176_0002
Ensayos hem atológicos
La san g re ob te n id a de to d o s los g ru po s de ra tas se env ió a A n te ch D ia g n o s tics para re a liza r m e d ic io n e s y an á lis is de h e m a to c rito (H C T), a s í com o m e d ic io n e s de las va ria s cé lu la s san gu ín ea s , com o W B C , R B C y el co n te n id o to ta l de he m og lob in a . Los re su lta d o s se p re sen ta n en la T a b la 106. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro vo ca ro n ca m b io s en los n ive le s de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s h e m a to ló g ico s fu e ra de l in te rva lo e sp e ra do para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc lu ye ro n en es tu d io s poste rio res.
Tabla 106
Figure imgf000176_0001
co n tin u a c ió n
Figure imgf000177_0001
Pesos de órganos
S e m id ie ro n los pe sos de l h ígado, el co razón , el bazo y los r iñ on es al fina l de l es tud io , y se p re sen ta n en la T a b la 107. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro voca ron cu a lq u ie r cam b io en el peso de los ó rg a n o s fu e ra del in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron de o tros estud ios .
Tabla 107
Figure imgf000177_0002
Ejemplo 22: tolerabilidad de gapmers de desoxi, MOE y cEt dirigidos a GHR humana en ratas Sprague-Dawley
S e tra ta ro n ra tas S p ra g u e -D a w le y con o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o IS IS de los e s tu d io s d e sc rito s en los E je m p lo s a n te rio re s y se eva lu a ro n para ca m b io s en los n ive les de va rio s m a rca d o re s de qu ím ica del p lasm a.
Tratam iento
S e m an tu v ie ro n ra tas S p ra g u e -D a w le y m ach o en un c ic lo de lu z /o scu ridad de 12 ho ras y se a lim e n ta ro n ad lib itum con com ida pa ra ra tas no rm a l de P urina , d ie ta 5001. A g ru po s de 4 ra tas S p ra g u e -D a w le y se les inyec ta ron po r v ía s u b cu tá n e a una v e z po r se m a n a d u ra n te 6 se m a n a s 50 m g /kg de o lig o n u c le ó tid o IS IS (d o s is se m a n a l de 50 m g/kg). A dos g ru po s de ra tas se les inyectó po r v ía s u b cu tá n e a una v e z a la sem a na d u ra n te 6 sem a na s PBS. C u a re n ta y och o ho ras de sp u é s de la ú ltim a dos is , se s a c rifica ro n ra tas y se e x tra je ro n ó rg a n o s y p lasm a para su an á lis is poste rio r.
Función hepática
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión hepá tica , se m id ie ro n los n ive le s en p lasm a de tra n s a m in a s a s usando un a n a liz a d o r qu ím ico c lín ico a u to m a tiza d o (H ita ch i O lym p u s A U 400 e , M elville , NY). Se m id ie ro n los n ive les en p lasm a de A L T y A S T y los re su lta d o s se p re sen ta n en la T a b la 108 e xp re sa d a en U I/l. Los n ive le s en p lasm a de b ilirru b in a ta m b ié n se m id ie ron usando el m ism o a n a liz a d o r q u ím ico c lín ico y los re su lta d o s ta m b ié n se p re sen ta n en la T a b la 108 exp resa da en m g/d l. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro voca ron c a m b io s en los n ive les de cu a lq u ie r m a rca d o r de la fun c ión he pá tica fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron en e s tu d io s poste rio res.
Tabla 108
Figure imgf000178_0001
Función renal
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión renal, se m id ie ro n los n ive les en p lasm a de n itró ge no u re ico en san g re (B U N ) y c re a tin in a usando un a n a liz a d o r q u ím ico c lín ico a u to m a tiza d o (H ita ch i O lym p u s A U 400 e , M elv ille , NY). Los resu ltad os se p re sen ta n en la T a b la 109, e xp re sa d a en m g/d l. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro voca ron cam b io s en los n ive les de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s de fun c ión rena l fue ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc lu ye ro n en es tu d io s poste rio res.
Tabla 109
Figure imgf000179_0002
Ensayos hem atológicos
La san g re ob te n id a de to d o s los g ru po s de ra tas se env ió a A n te ch D ia g n o s tics para re a liza r m e d ic io n e s y an á lis is de h e m a to c rito (H C T), a s í com o m e d ic io n e s de las va ria s cé lu la s san gu ín ea s , com o W B C , R B C y el co n te n id o to ta l de he m og lob in a . Los re su lta d o s se p re sen ta n en la T a b la 110. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro vo ca ro n ca m b io s en los n ive le s de cu a lq u ie ra de los m a rca d o re s h e m a to ló g ico s fu e ra de l in te rva lo e sp e ra do para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc lu ye ro n en es tu d io s poste rio res.
Tabla 110
Figure imgf000179_0001
co n tin u a c ió n
Figure imgf000180_0001
Pesos de órganos
A l fina l de l e s tu d io se m id ie ro n los pesos de l h ígado, el co razón , el bazo y los riñones, y se p re sen ta n en la T a b la 111. Los o lig o n u c le ó tid o s IS IS que p ro voca ron cu a lq u ie r cam b io en el peso de los ó rg a n o s fue ra del in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se e xc luye ron de o tros estud ios .
Tabla 111
Figure imgf000180_0002
Ejemplo 23: Efecto de oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a GHR humana en monos cynomolgus
Los m on os cyn o m o lg u s fu e ro n tra ta d o s con o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o IS IS se le cc io n a d o s de los e s tu d io s d e sc rito s en los e je m p lo s an te rio res . Se eva lu a ro n la e fica c ia y to le ra b ilid a d de los o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido , así co m o su perfil fa rm a c o c in é tic o en el h íg ado y los riñones.
En el m om e n to en que se aco m e tió es te estud io , la secu en c ia g e n ó m ica de l m on o cyn o m o lg u s no es ta ba d isp o n ib le en la base de da tos del C e n tro N a c iona l de In fo rm a c ión B io te cn o ló g ica (N C B I); po r lo tan to , no se pudo c o n firm a r la rea c tiv id ad c ruza da con la se cu e n c ia del gen del m on o cyno m o lgus . En cam b io , las s e cu e n c ia s de los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o IS IS usados en los m on os cyn o m o lg u s se com p a ra ro n con una se cu e n c ia de m ono rhe sus po r hom o log ía . S e e sp e ra que los o lig o n u c le ó tid o s IS IS con h o m o log ía con la se cu e n c ia de l m ono rhesus sean ta m b ié n c o m p le ta m e n te rea c tivos con la se cu e n c ia del m on o cyno m o lgus . Los o lig o n u c le ó tid o s a n tisen tido hu m a n o s p ro ba dos tie n e n rea c tiv id ad c ru za d a con la se cu e n c ia g e n ó m ica de rhe sus (N ° de reg is tro G E N B A N K N W _001120958.1 tru n c a d o de los nu c le ó tid o s 4410000 a 4720000 , d e s ig n a d a en la p re sen te com o S E Q ID NO: 2296). C u an to m a yo r sea la co m p le m e n ta rie d a d e n tre el o lig o n u c le ó tid o hu m ano y la se cu e n c ia de l m on o rhesus, m ás p ro ba b le se rá que el o lig o n u c le ó tid o hu m an o pued a re a cc io n a r de fo rm a c ru za d a con la se cu e n c ia de l m ono rhesus. Los s itio s de in ic io y pa rad a de cad a o lig o n u c le ó tid o pa ra la S E Q ID NO: 2296 se p re sen ta n en la T a b la 112. El "s itio de in ic io " ind ica el nu c le ó tido m ás 5' al que se d irige el g a p m e r en la se cu e n c ia de l gen de l m on o rhesus.
Tabla 112
Figure imgf000181_0001
Estudio 1
A n te s de l es tud io , los m on os se m an tu v ie ro n en cu a re n te n a d u ra n te la cua l los a n im a le s se o b se rva ron d ia ria m e n te para la sa lud genera l. Los m on os te n ía n 2 -4 años y pe saban en tre 2 y 4 kg. S e in yec to a cad a uno de nu eve g ru po s de 5 m on os cyn o m o lg u s m ach o a s ig n a d o s a lea to ria m e n te , po r v ía s u b cu tá n e a o lig o n u c le ó tid o IS IS o P B S usando una agu ja de do s ifica c ió n de ace ro in ox id ab le y una je r in g u illa de ta m a ñ o a p ro p ia d o en la reg ión in tra c a p s u la r y el m us lo e x te rn o de los m onos. Los m on os fu e ro n d o s ifica d o s tre s ve c e s (d ías 1, 4 y 7) d u ra n te la p rim e ra sem ana , y luego una vez po r se m a n a d u ran te 12 se m a n a s con 40 m g /kg de o lig o n u c le ó tid o ISIS. A un g rupo de con tro l de 5 m on os cyn o m o lg u s se le inyectó P B S de m an era s im ila r y s irv ió com o g ru po de con tro l.
D u ran te el pe río do de estud io , los m on os fue ro n ob se rva d o s dos ve ce s al d ía en bu sca de s ig no s de e n fe rm e d a d o angustia . C u a lq u ie r an im a l que e xp e rim e n tó m ás que d o lo r o an g u s tia m o m e n tá n e a o leve d e b ido al tra ta m ie n to , les ión o en fe rm e d a d fue tra ta d o po r el pe rson a l v e te rin a r io con a n a lg é s ico s o ag en te s ap ro b a d o s para a liv ia r el do lo r de sp u é s de co n s u lta r con el D ire c to r de l E stud io . S e id en tificó cu a lq u ie r an im a l con m a la sa lud o en una pos ib le con d ic ió n m o rib u n d a para una m o n ito riza c ió n ad ic io na l y po s ib le eu tanas ia . La e u ta n a s ia p ro g ra m a d a de los an im a le s se rea lizó el d ía 86 po r d e sa n g ra d o de sp u é s de an e s te s ia in du c ida po r k e ta m in a /x ila z in a y la a d m in is tra c ió n de pe n to b a rb ita l de sod io . Los p ro to co los de sc rito s en el E je m p lo fu e ro n ap ro b a d o s po r el C o m ité In s titu c io n a l de C u ida do y U so de A n im a le s (IA C U C ).
R e du cc ión de l O b je tivo
Anális is de A R N
En el d ía 86, se ex tra jo A R N de l h ígado , te jid o ad ip oso b lanco (W A T ) y riñón para el an á lis is po r P C R en tie m p o real de la m ed ic ió n de la e xp res ión de A R N m de G H R . Los re su lta d o s se p re sen ta n com o po rcen ta je de in h ib ic ión de l A R N m , con resp ec to al con tro l de PBS, n o rm a liza d o con R IB O G R E e N®. 'n .d .' ind ica que no se m id ie ro n los da tos pa ra ese o lig o n u c le ó tid o pa rticu la r. C o m o se m u e s tra en la T a b la 113, el tra ta m ie n to con o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o IS IS d io com o resu ltad o una reducc ión s ig n ifica tiva del A R N m de G H R en com p a ra c ió n con el con tro l PBS. E spe c íficam en te , el tra ta m ie n to con IS IS 532401 dio com o resu ltad o una red ucc ión s ig n ifica tiva de la exp res ión de A R N m en to d o s los te jidos.
La e xp res ión de l gen se n s ib le a la h o rm on a de l c rec im ien to , A LS , ta m b ié n se m id ió en hígado, riñón y te jid o ad iposo . El tra ta m ie n to con IS IS 532401 d io com o resu ltad o una red ucc ión de la e xp res ión de A R N de A L S en el h íg ado en un 44 ± 9% , co rre la c io n a n d o con los n ive les de G H R . No se ob se rvó red ucc ión en el te jid o ad iposo . T a m b ié n se m id ió la e xp res ión de IGF1 en el h ígado . El tra ta m ie n to con IS IS 532401 d io com o resu ltad o una red u cc ió n de la exp res ión de A R N de IGF1 en el h íg ado en un 71 ± 10% , co rre la c io n a n d o con los n ive les de G H R .
Tabla 113
Figure imgf000182_0001
Anális is de proteínas
S e recog ió a p ro x im a d a m e n te 1 m l de san g re de to d o s los an im a le s d isp o n ib le s en el d ía 85 y se co locó en tu b o s que con te n ía n la sa l de po tas io de E D TA . Los tu b o s se ce n trifu g a ro n (3000 rpm d u ran te 10 m in u tos a te m p e ra tu ra a m b ie n te ) para o b te n e r p lasm a. S e m id ie ro n los n ive les en p lasm a de IGF-1 y G H en el p lasm a. Los re su lta d o s se p re sen ta n en la T a b la 114. Los re su lta d o s ind ican que el tra ta m ie n to con o lig o n u c le ó tid o s IS IS dio co m o resu ltad o n ive les red uc idos de p ro te ína IGF-1.
T a m b ié n se p resen tan en la T ab la 115 los n ive les en p lasm a de IGF1 de sp u é s de l tra ta m ie n to con IS IS 532401 y de m u e s tra n el e fe c to de la in h ib ic ión a n tise n tid o de G H R en la red ucc ión de los n ive les de IGF1 en el d ía 7 y el d ía 85.
Tabla 114
Figure imgf000182_0002
Tabla 115
Figure imgf000183_0002
E s tu d io s de to le ra b ilid a d
M ediciones de peso corpora l y de órganos
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la sa lud g e ne ra l de los an im a les , se m id ie ro n los pe sos co rp o ra le s y de los ó rganos. Los pesos co rp o ra le s se m id ie ro n el d ía 84 y se p re sen ta n en la T a b la 115. Los pe sos de los ó rg a n o s se m id ie ro n el d ía 86 y los da tos ta m b ié n se p re sen ta n en la T a b la 115. Los re su lta d o s ind ican que el e fe c to de l tra ta m ie n to con o lig o n u c le ó tid o s a n tisen tido sob re el peso co rp o ra l y de los ó rg a n o s es tu vo de n tro de l in te rva lo esp e ra d o para o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido . E spe c íficam en te , el tra ta m ie n to con IS IS 532401 fu e bien to le ra d o en té rm in o s de l peso co rp o ra l y de los ó rg an os de los m onos.
Tabla 115
Figure imgf000183_0001
Función hepática
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión hepá tica , se reco g ie ron m u e s tra s de s a n g re de to d o s los g ru po s de estud io . Las m u e s tra s de san g re se reco g ie ron m ed ia n te v e n o p u n c ió n fem ora l, 48 ho ras de sp u é s de la dos ifica c ión . Los m on os se m an tu v ie ron en a yu na s d u ran te la noche an tes de la e x tracc ión de sangre . La san g re se recog ió en tu b o s que con ten ían a n tico a g u la n te K2-E D T A , que se ce n trifu g a ro n para ob te n e r p lasm a. S e m id ie ron los n ive les de va r io s m a rca d o re s de la fu n c ió n he pá tica usando un a n a liza d o r qu ím ico T osh iba 200 F R N E O (T o sh ib a Co., Japón ). S e m id ie ro n los n ive les en p lasm a de A L T y A S T y b ilirrub ina . Las s ig u ie n tes ta b la s p re sen ta n los resu ltad os para los n ive les de A L T y A S T en va rio s pu n tos te m p o ra le s . Los resu ltad os ind ican que los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o no tu v ie ro n e fe c to sob re la fu n c ió n he pá tica fu e ra de l in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido . E spe c íficam en te , el tra ta m ie n to con IS IS 532401 fu e b ien to le ra d o en té rm in o s de la fu n c ió n he pá tica en m onos.
Tabla 116
Figure imgf000183_0003
co n tin u a c ió n
Figure imgf000184_0001
Tabla 117
Figure imgf000184_0002
Función renal
P ara e va lu a r el e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS sob re la fun c ión renal, se reco g ie ron m u e s tra s de san gre de to d o s los g ru po s de estud io . Las m u e s tra s de san g re se reco g ie ron m ed ia n te v e n o p u n c ió n fem ora l, 48 ho ras d e sp u é s de la dos ifica c ión . Los m on os se m an tu v ie ro n en ayu na s d u ran te la noche an tes de la e x tracc ión de sangre . La san g re se reco g ió en tu b o s que con te n ía n a n tico a g u la n te K2-E D T A , que se ce n trifu g a ro n para o b te n e r p lasm a. Los n ive les de B U N y c rea tin ina se m id ie ro n u sa nd o un a n a liza d o r q u ím ico T o sh ib a 200 F R N E O (T o sh ib a Co., Japón ). Las s ig u ie n te s ta b la s p re sen ta n los resu ltad os de los n ive les de B U N y c re a tin in a en va rio s pun tos te m p o ra le s .
Los da tos de la qu ím ica de l p lasm a ind ican que la m ayo ría de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS no tu v ie ro n n ingún e fe c to sob re la fu n c ió n rena l fue ra de l in te rva lo e sp e ra do para los o lig o n u c le ó tid o s an tisen tido . E spe c íficam en te , el tra ta m ie n to con IS IS 532401 fue bien to le ra d o en té rm in o s de la fu n c ió n rena l de los m onos.
Tabla 118
Figure imgf000184_0003
co n tin u a c ió n
Figure imgf000185_0003
Tabla 119
Figure imgf000185_0002
Hem atología
P ara e va lu a r cu a lq u ie r e fe c to de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS en m on os cyn o m o lg u s sob re los p a rám e tro s h e m a to lóg icos , se reco g ie ron m u e s tra s de san g re de a p ro x im a d a m e n te 1,3 m l de san g re de cada uno de los a n im a le s de e s tu d io d isp o n ib le s en tu b o s que con te n ía n K2-E D T A . Las m u e s tra s se a n a liza ro n pa ra el re cu e n to de g ló b u lo s ro jos (R B C ), recu en to de g ló b u lo s b lancos (W B C ), recu en to s de g lób u lo s b lancos ind iv idua les , com o de m onoc itos , neu tró filos , lin foc itos , as í com o para recu en to de p laque tas , co n te n id o de he m og lob in a y hem atocrito , u sa nd o un a n a liza d o r de he m a to lo g ía A D V IA 120 (B aye r, USA.). La s ig u ie n te ta b la p re sen ta los resu ltad os pa ra el re cu e n to de p laq ue ta s en va rio s pu n tos te m p o ra le s , 'n /a ' ind ica que los da tos para ese pun to te m p o ra l no están d ispo n ib le s .
Los da tos ind ican que los o lig o n u c le ó tid o s no p ro voca ron n ingún cam b io en los p a rám e tro s he m a to ló g ico s fu e ra del in te rva lo e sp e ra d o para los o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o a esta dosis . E spe c íficam en te , el tra ta m ie n to con IS IS 532401 fu e b ien to le ra d o en té rm in o s de los pa rá m e tro s h e m a to ló g ico s de los m onos.
Tabla 120
Figure imgf000185_0001
Anális is de la pro te ína C reactiva y del n ive l de com plem ento C3
P ara e va lu a r cu a lq u ie r e fe c to in fla m a to rio de los o lig o n u c le ó tid o s IS IS en m on os cyno m o lgus , se to m a ro n m u e s tra s de san g re para aná lis is . Los m on os se m an tu v ie ron en a yu na s d u ran te la noche an tes de la e x tracc ión de sangre . S e reco g ie ron a p ro x im a d a m e n te 1,5 m l de san g re de cada an im a l y se co loca ron en tu b o s sin a n tico a g u la n te para la se p a ra c ió n de l suero. Los tu b o s se m an tu v ie ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ran te un m ín im o de 90 m in u tos y luego se ce n trifu g a ro n a 3.000 rpm du ran te 10 m in u tos a te m p e ra tu ra am b ie n te para o b te n e r suero. La p ro te ína C reac tiva (P C R ), que se s in te tiza en el h ígado y que s irve com o m a rca d o r de in flam ac ión , se m id ió u tiliza n d o un a n a liz a d o r q u ím ico T o sh ib a 200 F R N E O (T osh iba Co., Japón ). Las ta b la s s ig u ie n te s p re sen ta n los re su lta d o s pa ra los n ive le s de C R P y C 3 en va rio s pun tos te m p o ra le s . Los resu ltad os ind ican que el tra ta m ie n to con IS IS 532401 no p ro vocó in flam a c ión en los m onos.
Tabla 121
Figure imgf000186_0002
Tabla 122
Figure imgf000186_0001
Medición de la concentración de oligonucleótidos.
S e m id ió la c o n ce n tra c ió n de l o lig o n u c le ó tid o de long itud c o m p le ta en el h íg ado y el riñón de los m onos. El m é tod o usado es una m od ifica c ió n de los m é to d o s p u b licad os a n te rio rm e n te (Le ed s e t al., 1996; G e a ry e t al., 1999) que co n s is te n de una e x tracc ión con fe n o l-c lo ro fo rm o ( líq u id o -líq u id o ) se g u id a de una e x tracc ión en fa se só lida . A n te s de la e x tracc ión se añ ad ió un e s tá n d a r in te rno (IS IS 355868 , un o lig o n u c le ó tid o de fo s fo ro tio a to m od ifica do con 2 '-O -m e to x ie tilo de 27 m er, G C G T T T G C T C T T C T T C T T G C G T T T T T T , d e s ig n a d o en la p re sen te com o S E Q ID NO: 2300). Las c o n ce n tra c io n e s de m u e s tra s de te jid o s se ca lcu la ro n usando cu rva s de ca lib ra c ió n , con un lím ite in fe r io r de cu a n tifica c ió n (LL O Q ) de a p ro x im a d a m e n te 1,14 pg/g. Las v id a s m ed ia s se ca lcu la ron usando el so ftw a re W in N o n lin (P H A R S IG H T ).
Los resu ltad os se p re sen ta n en la T a b la 123, e xp re sa d o s com o pg /g de te jido , as í com o la p ro po rc ión de c o n ce n tra c ió n en riñón fre n te al h ígado.
Tabla 123
Figure imgf000187_0002
Estudio 2
S e in yec tó a un g ru po de 5 m on os cyn o m o lg u s m ach o a s ig n a d o s al a za r po r v ía s u b cu tá n e a IS IS 532401 o P B S usando una agu ja de do s ifica c ió n de ace ro in ox id ab le y una je r in g u illa de ta m a ñ o a p ro p ia d o en la reg ión in tra c a p s u la r y el m us lo e x te rn o de los m onos. Los m on os rec ib ie ron una dos is de ca rg a po r sem a na (d ías 1, 3, 5 y 7) du ran te la p rim e ra sem ana , y luego una v e z po r sem a na (d ías 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84 y 91) con 40 m g/kg de IS IS 532401. A un g ru po de con tro l de 5 m onos cyn o m o lg u s se le inyectó P B S de m an e ra s im ila r y s irv ió com o g ru po de con tro l.
R e du cc ión de ob je tivo
Anális is de A R N
En el d ía 93, se e x tra jo A R N de l hígado, te jid o a d ip oso b lanco (W A T ) y m úscu lo para el an á lis is po r P C R en tie m p o real de la m ed ic ión de la e xp res ión de A R N m de G H R . El tra ta m ie n to con IS IS 532401 d io com o resu ltad o una red ucc ión s ig n ifica tiva de l A R N m de G H R en el h íg ado y el te jid o ad ip oso b lanco.
T a m b ié n se m id ió en el h íg ado la e xp res ión de l gen sen s ib le a la ho rm on a de l c rec im ien to , A LS . El tra ta m ie n to con IS IS 532401 d io com o resu ltad o una red ucc ión de la exp res ión de A R N de A LS en el h íg ado en un 38% , co rre la c io n a n d o con los n ive les de G H R . 'n .d .' ind ica que los n ive le s no se co m p ro b a ro n en ese te jid o en pa rticu la r. T a m b ié n se m id ió la e xp res ión de IGF1 en el h ígado, los m ú scu lo s y los te jid o s grasos. El tra ta m ie n to con IS IS 532401 d io com o resu ltad o una red ucc ión de la e xp res ión de A R N IGF1 en el h íg ado y en el W A T , co rre la c io n a n d o con los n ive les de G HR.
Tabla 124
Figure imgf000187_0001
Anális is de proteínas
S e m id ie ron los n ive les en p lasm a de IGF-1 y G H en el p lasm a. Los re su lta d o s se p re sen ta n en la tab la s ig u ie n te . Los re su lta d o s ind ican que el tra ta m ie n to con IS IS 532401 d io com o resu lta d o n ive le s red uc idos de p ro te ína IG F-1. No hubo au m e n to en los n ive les de la ho rm on a de l c re c im ie n to en p lasm a.
Tabla 125
Figure imgf000188_0002
Tabla 126
Figure imgf000188_0001
Ejemplo 24: Medición de la viscosidad de oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a GHR humana
La v is co s id a d de o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o se le cc io n a d o s de l e s tu d io de sc rito en los e je m p lo s a n te rio res se m id ió con el ob je tivo de d e te c ta r o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o que tie n e n una v is co s id a d de m ás de 40 cP. Los o lig o n u c le ó tid o s que tie n e n una v isco s id a d m a yo r que 40 cP se rían d e m a s ia d o v is co so s para a d m in is tra rse a cu a lq u ie r su je to .
S e pe sa ron o lig o n u c le ó tid o s IS IS (32 -35 m g) en un v ia l de v id rio , se añ ad ie ro n 120 pl de agua y el o lig o n u c le ó tid o a n tise n tid o se d iso lv ió en so luc ión ca le n ta n d o el v ia l a 50° C. P a rte de la m u e s tra p re ca le n ta d a (75 p l) se p ipe teó a un m ic ro -v isco s ím e tro (C a m brid ge ). La te m p e ra tu ra del m ic ro -v isco s ím e tro se a jus tó a 25° C y se m id ió la v is co s id a d de la m uestra . O tra pa rte de la m ue s tra p re ca le n ta d a (20 pl) se p ipe teó en 10 m l de ag ua para le c tu ra U V a 260 nM a 85° C (in s tru m e n to C a ry UV). Los re su lta d o s se p re sen ta n en la T a b la 127 e ind ican que to d a s las so lu c io n e s de o lig o n u c le ó tid o s a n tise n tid o son ó p tim a s en su v is co s id a d ba jo el c rite rio es ta b le c id o a n te rio rm en te .
Tabla 127
Figure imgf000188_0003
Ejemplo 25: efecto de la inhibición antisentido de GHR en ratones
P ara co n firm a r el e fe c to de la in h ib ic ión a n tise n tid o de G H R en el m od e lo de p rim a tes, se e m p le ó un o lig o n u c le ó tid o IS IS d ir ig ido a G H R m urina para re p lica r el resu lta d o en un m ode lo de ratón.
El IS IS 563223 (G A G A C T T T T C C T T G T A C A C A , d e s ig n a d o en la p re sen te com o S E Q ID NO: 2301 ) es un o lig o n u c le ó tid o m urino a n tise n tid o g a p m e r 5 -10 -5 M O E d ir ig ido a g H r m u rino (N ° de reg is tro G E N B A N K ; N M _ 010284.2 , d e s ig n a d o en la p re sen te com o S E Q ID NO: 2302 ) al s itio de in ic io o b je tivo 3230. S e inyectó a un g ru p o de ra ton es CD1 m ach o y he m bra una d o s is de ca rg a (los d ías 1, 3, 5 y 7) en la p rim e ra sem a na y p o s te rio rm e n te una dos is se m a n a l (los d ías 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84 y 91 ) con 40 m g /kg de IS IS 563223. A un g ru po de ra ton es CD1 se le in yec tó de m an e ra s im ila r PBS. Los ra ton es se sa c rifica ro n 48 ho ras d e sp u é s de la ú ltim a dosis, y los ó rg a n o s y el p lasm a se reco g ie ron pa ra su an á lis is poste rio r.
Expresión de ARNm
S e m id ió la exp res ión de A R N m de h íg ado de G H R , G H B P , IGF1 y A LS . Los re su lta d o s se p re sen ta n en la T a b la 128. La in h ib ic ión a n tise n tid o de G H R d io com o resu ltad o la in h ib ic ión de los n ive le s de exp re s ió n de genes G H B P , IGF1 y ALS .
Tabla 128
Figure imgf000189_0002
Expresión de pro te ínas
S e m id ie ro n los n ive les en p lasm a de IGF1 y la ho rm on a de l c rec im ien to . Los re su lta d o s se p re sen ta n en la T a b la 129. La in h ib ic ión a n tise n tid o de G H R d io com o resu lta d o una d ism in u c ió n en los n ive les de IGF1 y no tuvo n ingún e fe c to sob re los n ive les de la ho rm on a de l c rec im ien to .
Tabla 129
Figure imgf000189_0003
Tabla 130
Figure imgf000189_0001

Claims (14)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. Un co m p u e s to que co m p re n d e un o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o que con s is te de 18 a 30 nu c le ó s id o s e n la za d o s de long itud , en do nd e el o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o t ie n e una se cu e n c ia de n u c le o b a se s que c o m p re n d e una po rc ión de po r lo m en os 18 nu c le o b a se s con tigu as 100% co m p le m e n ta ria s con una po rc ión de igua l long itud de las n u c le o b a se s 153921 -153940 de un ác ido nu c le ico del re ce p to r de la ho rm o n a de c re c im ie n to que t ie n e la secu en c ia de nu c le oba ses de la S E Q ID NO: 2, en do nde la secu en c ia de nu c le oba ses de l o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o es po r lo m en os un 90% co m p le m e n ta ria a la S E Q ID NO: 2, en donde el co m p u e s to red uce la can tida d o ac tiv ida d de l ác ido nu c le ico de l re ce p to r de la ho rm on a de crec im ien to .
2. El co m p u e s to de la re iv ind ica c ión 1, en do nd e el o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o es un 100% co m p le m e n ta rio a la S E Q ID NO: 2.
3. El co m p u e s to de cu a lq u ie r re iv ind ica c ión an te rio r, en dond e el o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o t ie n e una secu en c ia de n u c le o b a se s que c o m p re n d e la se cu e n c ia e n u m e ra d a en la S E Q ID NO: 703, o p c io n a lm e n te en dond e el o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o con s is te de 20 nu c le ó s id o s e n la za d o s y t ie n e una se cu e n c ia de nu c le o b a se s que co n s is te de la se cu e n c ia e n u m e ra d a en la S E Q ID NO: 703.
4. El co m p u e s to de c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-3, en do n d e el o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o c o m p re n d e po r lo m en os un a z ú c a r m o d ifica d o y en do n d e el po r lo m en os un a z ú c a r m o d ifica d o c o m p re n d e o p c io n a lm e n te un g rupo 2 '-O -m e to x ie tilo o es un a z ú c a r b ic íc lico , com o un a zú ca r b ic íc lico que c o m p re n d e un g ru po 4 '-C H (C H 3 )-O -2 ' o un a z ú c a r b ic íc lico que c o m p re n d e un g ru po 4 '-C H 2 -O -2 ' o 4 '-(C H 2 )2 -O -2 '.
5. El co m p u e s to de c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-4, en do n d e el o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o c o m p re n d e po r lo m en os un en la ce in te rn u c le o s íd ico m o d ifica d o y en dond e el e n la ce in te rn u c le ó s id o m o d ifica d o es o p c io n a lm e n te un e n la ce in te rn u c le ó s id o de fos fo ro tioa to .
6. El co m p u e s to de c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-5, en do n d e el o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o c o m p re n d e po r lo m en os una nu c le o b a se m o d ifica d a y en dond e la nu c le o b a se m o d ifica d a es o p c io n a lm e n te 5 -m e tilc itos ina .
7. El co m p u e s to de una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-6, en dond e el o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o com prende :
un s e g m e n to de se p a ra c ió n que co n s is te de d e so x in u c le ó s id o s en lazados;
un s e g m e n to de a la 5' que co n s is te de nu c le ó s id o s en lazados ; y
un s e g m e n to de a la 3' que co n s is te de nu c le ó s id o s en lazados;
en do nde el s e g m e n to de se p a ra c ió n está co lo ca d o en tre el se g m e n to de a la 5' y el s e g m e n to de a la 3' y en donde cad a n u c le ós id o de cad a s e g m e n to de a la co m p re n d e un a zú ca r m od ificado .
8. El c o m p u e s to de cu a lq u ie r re iv ind ica c ión an te rio r, en do nd e el o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o co n s is te de 20 n u c le ó s id o s e n la za d o s que tie n e n una se cu e n c ia de n u c le oba ses que co n s is te de la se cu e n c ia e n u m e ra d a en la S E Q ID NO: 703, y en do nd e el o lig o n u c le ó tid o m o d ifica d o com prende :
un s e g m e n to de se p a ra c ió n que co n s is te de d iez d e so x in u c le ó s id o s en lazados;
un s e g m e n to de a la 5' que co n s is te de c in co nu c le ó s id o s en la zado s ; y
un s e g m e n to de a la 3' que co n s is te de c in co nu c le ó s id o s en lazados ;
en dond e el s e g m e n to de sep a ra c ión está co lo ca d o en tre el se g m e n to de a la 5' y el s e g m e n to de a la 3'; en do n d e cad a n u c le ós id o de cad a s e g m e n to de a la co m p re n d e un a zú ca r 2 '-O -m e tox ie tilo ; en do nde po r lo m en os un en lace in te rn u c le o s íd ico es un e n la ce de fo s fo ro tioa to ; y en do nde cad a c itos ina es una 5-m e tilc itos in a .
9. El co m p u e s to de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-8, en do nd e el co m p u e s to es de ca d e n a sencilla .
10. Una com p o s ic ió n que c o m p re n d e el co m p u e s to de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-9 o sa l de l m ism o y po r lo m en os uno de un p o rta d o r o d ilu ye n te fa rm a c é u tic a m e n te acep tab le .
11. El co m p u e s to de c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-9, o la com p o s ic ió n de la re iv in d ica c ió n 10, para su uso en te rap ia .
12. El co m p u e s to o com p o s ic ió n para el uso de la re iv ind ica c ión 11, pa ra su uso en el tra ta m ie n to o p re ven c ión de una e n fe rm e d a d a so c ia d a con un exce so de ho rm on a de c re c im ie n to en un hum ano, en do nd e la e n fe rm ed ad a so c ia d a con un exce so de ho rm on a de c re c im ie n to es o p c io n a lm e n te acrom ega lia .
13. El co m p u e s to o co m p o s ic ió n para el uso de a cu e rd o con la re iv ind ica c ión 12, en do n d e el tra ta m ie n to de la a c ro m e g a lia red uce los n ive les de IGF-1.
14. El co m p u e s to o com p o s ic ió n de c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-10, para su uso en un m é tod o pa ra red uc ir los n ive le s de l re ce p to r de la ho rm on a de l c re c im ie n to (G H R ) en un hum ano, d icho m é tod o co m p re n d ie n d o a d m in is tra r al hu m ano una can tida d te ra p é u tic a m e n te e ficaz del co m p u e s to o com p os ic ión , re d u c ie n d o de este m od o los n ive les de G H R en el hum ano, o p c io n a lm e n te en dond e el h u m an o tie n e una en fe rm e d a d aso c ia d a con un exce so de ho rm on a del c rec im ien to , com o la acro m eg a lia .
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