ES2787357T3 - Una nueva cepa bacteriana de Lysobacter capsici y usos de la misma - Google Patents

Abstract

Una cepa bacteriana, seleccionada del grupo que consiste en i) una cepa que se puede obtener del depósito CBS 134400, ii) una cepa que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, que particularmente comprende, para cada miembro del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, al menos una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con dicho miembro.

Description

DESCRIPCIÓN

Una nueva cepa bacteriana de Lysobacter capsici y usos de la misma

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los productos fitosanitarios, particularmente al biocontrol de fitopatógenos, tales como hongos y oomicetos fitopatógenos. La invención también se refiere a una nueva cepa bacteriana de Lysobacter capsici, a usos de la misma y a métodos que emplean la misma. La invención también se refiere al uso combinado de composiciones que comprenden cobre (tales como productos fitosanitarios que contienen cobre) y bacterias Lysobacter capsici en el tratamiento de tales patógenos, así como a métodos relacionados.

Antecedentes de la invención

El mildiu de la vid es una de las enfermedades de la vid (Vitis vinifera) más graves del mundo. Está provocada por el oomiceto biotrófico Plasmopara viticola, que puede atacar todas las partes verdes de la vid (Gessler et al., 2011). Hoy día, el control del mildiu se basa principalmente en aplicaciones frecuentes de fungicidas químicos en la agricultura convencional o de cobre en la producción orgánica (Wong et al., 2001; Gessler et al., 2011). De manera similar, el tizón tardío de la papa y el tizón tardío del tomate son enfermedades vegetales graves provocadas por el oomiceto Phytophthora infestans, que también se tratan de manera rutinaria con, por ejemplo, fungicidas, como se mencionó anteriormente (Fry y Goodwin, 1997; Mizubuti et al., 2007).

Las crecientes inquietudes sobre el impacto negativo de los fungicidas químicos (agentes químicos) y el cobre en los suelos agrícolas están impulsando la búsqueda de nuevos componentes activos de bajo impacto, para, por ejemplo, controlar Plasmopara viticola y Phytophthora infestans. Determinados microorganismos con perfiles toxicológicos y ecotoxicológicos favorables ofrecen soluciones potenciales.

Aunque en los últimos años se han seleccionado varias cepas bacterianas para el control biológico de enfermedades vegetales provocadas por hongos y oomicetos (Lugtenberg y Kamilova, 2009), se han identificado muy pocas para el control de Plasmopara viticola. Se ha demostrado que una cepa de Erwinia herbicola inhibe la germinación de esporangios de Plasmopara viticola in vitro (Tilcher et al., 1994) y algunas cepas bacterianas pertenecientes a Erwinia, Pseudomonas y otros géneros han arrojado resultados prometedores (Tilcher et al., 2002), pero no se han informado estudios de seguimiento sobre estas bacterias a pesar de los enormes esfuerzos realizados para encontrar alternativas a los fungicidas a bese de productos químicos para el control de Plasmopara viticola. Por el contrario, varios trabajos científicos abordaron la evaluación de cepas bacterianas para el control de Phytophthora infestans (De Souza et al., 2003; Lourengo et al., 2006; Zakharchencko et al., 2011) pero, por el momento, son pocos los productos fitosanitarios a base de bacterias que puedan aprovecharse para el biocontrol de este oomiceto fitopatógeno.

Determinadas bacterias del género Lysobacter se han relacionado con, por ejemplo, la supresión en el suelo, la alta producción de enzimas líticas o la producción de antibióticos. Además, el género Lysobacter (Christensen y Cook, 1978) incluye especies bacterianas con potencial para el control biológico de fitopatógenos (Hayward et al., 2010). Por otra parte, ya se ha demostrado que algunas cepas de Lysobacter protegen activamente a las plantas del ataque de los oomicetos del suelo. Por ejemplo, la cepa de Lysobacter enzymogenes 3.1T8, aislada de lana mineral, inhibe el crecimiento miceliar de Phytophthora capsici, Pythium ultimum y Pythium aphanidermatum in vitro. La producción de proteasas extracelulares, de lipasas y de biotensioactivos no identificados, y de moléculas antifúngicas por la cepa de Lysobacter enzymogenes 3.1T8 está implicada en el control de infecciones provocadas por Pythium aphanidermatum en plántulas de pepino (Folman et al., 2003, 2004). La cepa de Lysobacter sp. SB-K88 sintetiza Xanthobaccina A, B y C, lactamas macrocíclicas que son altamente eficaces in vitro contra Aphanomyces cochlioides, Phytophthora vignae f. sp. adzukicola y Pythium ultimum (Nakayama et al., 1999). La aplicación de la cepa SB-K88 y el compuesto Xanthobaccina A a semillas de remolacha azucarera suprimió el marchitamiento en suelos naturales que hospedaban poblaciones de Pythium spp. (Homma et al., 1993; Nakayama et al., 1999). Adicionalmente, Lysobacter sp. SB-K88 antagoniza directamente el micelio de A. cloclioides mediante el ataque directo de la pared celular de este oomiceto (Islam et al., 2005). La cepa YC5194, cepa tipo de la especie Lysobacter capsici, está estrechamente relacionada desde el punto de vista genético con la cepa SB-K88 (Park et al., 2008; Puopolo et al., 2010). Se aisló de la rizosfera de la planta de pimiento (Capsicum annuum) e inhibe el crecimiento in vitro de Pythium ultimum y otros hongos fitopatógenos (Park et al., 2008). Otro miembro de esta especie, la cepa de Lysobacter capsici PG4, reduce el crecimiento miceliar in vitro de varios hongos y oomicetos, y cuando se aplica a semillas de tomate controla la podredumbre del tallo y de la raíz del tomate provocadas por Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Puopolo et al., 2010).

Sin embargo, ha sido difícil encontrar (nuevos) antagonistas bacterianos para ser utilizados como productos fitosanitarios. Las principales razones del fracaso en la selección de nuevos antagonistas bacterianos son la mala tasa de supervivencia de los agentes bacterianos de biocontrol en las hojas y su incompatibilidad con fungicidas a base de cobre, lo que no permite, por ejemplo, integrar a los microorganismos en una estrategia a base de cobre de dosis bajas (Dagostin et al., 2011).

Por consiguiente, y a pesar de la extensa investigación y el progreso realizados hasta el momento, sigue habiendo una necesidad de productos fitosanitarios bacterianos con características ventajosas, tal como la persistencia en las hojas de las plantas. En especial, sigue habiendo una necesidad en la técnica de tratamientos alternativos o mejorados de, respectivamente, enfermedades fúngicas y por oomicetos, tales como enfermedades provocadas por Plasmopara vitícola o Phythophthora infestaos. Esto es particularmente cierto en vista de las diversas ventajas bien conocidas de los productos fitosanitarios que incluyen microorganismos en comparación con los productos fitosanitarios convencionales (químicos), particularmente si se consideran no patógenos y no infecciosos para los seres humanos y los animales. Adicionalmente, sigue habiendo una necesidad de identificar productos fitosanitarios bacterianos que sean compatibles con productos fitosanitarios convencionales (químicos), tal como los productos fitosanitarios a base de cobre, de modo que el uso de tales productos fitosanitarios no biológicos se pueda disminuir, por ejemplo, mediante el empleo de tratamientos combinados.

En vista de lo anterior, los presentes inventores identificaron una nueva cepa de Lysobacter, Lysobactercapsici AZ78, y exploraron la capacidad de Lysobacter capsici AZ78 de persistir en la filosfera de vid y tomate, y de controlar al mismo tiempo, por ejemplo, a Plasmopara viticola y Phytophthora infestaos in vivo. Además, los presentes inventores demuestran que AZ78 es resistente a los iones de cobre y puede aplicarse junto con fungicidas/productos fitosanitarios a base de cobre en dosis bajas para controlar el mildiu de la vid y el tizón tardío del tomate. Los presentes inventores también evaluaron su tolerancia al estrés abiótico asociado con la inanición, las altas temperaturas y la radiación UV. Basándose en estas características, Lysobacter capsici AZ78 puede aprovecharse mediante nuevas estrategias integradas de control de enfermedades. integración, estrategias de manejo de enfermedades.

Por consiguiente, los presentes inventores han logrado encontrar nuevas bacterias ventajosas y eficaces de la especie Lysobacter capsici, que pueden utilizarse para controlar diversas enfermedades vegetales. Por otra parte, con los estudios presentes, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que una nueva cepa de Lysobacter capsici muestra resistencia al cobre y, por otra parte, permite sorprendentemente un tratamiento combinado ventajoso de diversos hongos y oomicetos patógenos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Esta figura representa la resistencia de Lysobacter capsici AZ78 a iones de cobre a distintas concentraciones. La resistencia de Lysobacter capsici AZ78 a iones de cobre se expresa como el valor logarítmico de la relación de supervivencia (log de RS). La RS se calculó como la relación de las UFC de Lysobacter capsici AZ78 desarrolladas en LBA modificado con sulfato de cobre a distintas concentraciones con respecto a las UFC de Lysobacter capsici AZ78 desarrolladas en LBA. Los puntos con las mismas letras no difieren significativamente, de acuerdo con la prueba de Tukey (a = 0,01).

Figura 2: Esta figura ilustra la capacidad de Lysobacter capsici AZ78 para controlar el mildiu en plantas de vid en condiciones controladas de invernadero. También se evaluó en estos experimentos Lysobacter capsici AZ78 en combinación con un producto fitosanitario a base de cobre (Kocide 3000) (nota general: un producto fitosanitario a base de cobre también puede denominarse en el presente documento como fungicida a base de cobre) en dosis bajas. Se aplicaron los siguientes tratamientos: A) sin tratar; B) Kocide 3000 a 2,5 g l^-1; C) Kocide 3000 a 1,25 g l-¹; D) Kocide 3000 a 0,6125 g l^-1; E) Lysobacter capsici AZ78 Kocide 3000 a 1,25 g l^-1; F) Lysobacter capsici AZ78 Kocide 3000 a 0,6125 g l^-1; G) Lysobacter capsici AZ78. La Figura 2 A) muestra la influencia en la gravedad de la enfermedad; La Figura 2 B) muestra la influencia en la incidencia de la enfermedad.

Figura 3: Esta figura muestra imágenes ejemplares de: A) Plantas de vid sin tratar y plantas de vid tratadas con Lysobacter capsici AZ78 para el control de Plasmopara viticola. B) Plantas de tomate con y sin tratamiento contra Phytophthora infestaos utilizando bacterias de Lysobacter capsici AZ78.

Figura 4: Esta figura representa la capacidad de Lysobacter capsici AZ78 sola y en combinación con un fungicida a base de cobre para controlar el tizón tardío del tomate provocado por Phytophthora infestans. Se aplicaron los siguientes tratamientos: 1) sin tratar; 2) Kocide 3000 a 2,5 g l^-1; 3) Kocide 3000 a 0,6125 g l^-1; 4) Lysobacter capsici AZ78 Kocide 3000 a 0,6125 g l^-1; 5) Lysobacter capsici AZ78. La Figura 4 A) muestra la influencia en el porcentaje de área foliar cubierta por síntomas, y la Figura 4 B) muestra la influencia en el porcentaje de hojas que presentan síntomas.

Figura 5: Esta figura representa la persistencia de Lysobacter capsici AZ78 sobre hojas de vid. La línea con triángulos representa la persistencia en plantas mantenidas a 25 °C con una humedad relativa (HR) del 70 ± 10 %; la línea con cuadrados representa la persistencia en plantas mantenidas a 25 °C con una HR del 90 ± 10 %. La densidad de células bacterianas se expresa como log10 de UFC g^-1 de hoja. Los puntos con las mismas letras no difieren significativamente, de acuerdo con la prueba de Tukey (a = 0,01). adpi = días posinoculación.

Figura 6: Esta figura ilustra la capacidad de Lysobacter capsici AZ78 para producir biopelícula en distintos medios de cultivo. A) La densidad de células bacterianas se controló puntuando los valores de A^do600 nm cada doce horas. B) La formación específica de biopelícula (FEB) se calculó como la relación de células adherentes (valor de A^do540 nm) con respecto a la densidad de células bacterianas (valor de A ^do600 nm). Los medios líquidos fueron: KB (triángulos), LB (cuadrados) y NB (círculos). Los puntos con las mismas letras no difieren significativamente, de acuerdo con la prueba de Tukey (a = 0,01).

Figura 7: Esta figura representa la resistencia de Lysobacter capsici AZ78 a estreses abióticos. A) Resistencia a 24 h de exposición a -20 °C. B) Supervivencia de células de Lysobacter capsici AZ78 expuestas a una radiación UV creciente. La capacidad de Lysobacter capsici AZ78 para resistir estreses abióticos se expresa como el valor logarítmico de la relación de supervivencia (Log de RS). La RS se calculó como la relación de las células de Lysobacter capsici AZ78 tratadas con respecto a las células de Lysobacter capsici AZ78 no tratadas. Los puntos con las mismas letras no difieren significativamente, de acuerdo con la prueba de Tukey (a = 0,01).

Figura 8: Esta figura divulga diversas secuencias de ácido nucleico relacionadas con la presente invención. Entre estas, las SEQ ID NO 5-13 se refieren a secuencias de ácido nucleico preferentes de genes (de mantenimiento) de Lysobacter capsici AZ78 (en este orden: ADNr 16S, atpA, atpD, carA, gyrB, recA, rpoA, rpoD y uvrB). Estos son, por ejemplo, adecuados para fines comparativos en contexto con la invención. Entre estas, las SEQ ID NO 6­ 13 son secuencias particularmente preferentes.

Sumario de la invención

La presente invención, entre otras cosas, se refiere a una nueva cepa bacteriana perteneciente a la especie Lysobacter capsici, Lysobacter capsici AZ78, a bacterias de dicha cepa bacteriana y a preparaciones bacterianas relacionadas con la misma.

La presente invención se refiere adicionalmente a usos de lo anterior para preparar un producto fitosanitario - así como a productos fitosanitarios que comprenden cualquiera de los anteriores.

La presente invención también se refiere a usos de las cepas bacterianas, de bacterias o de productos fitosanitarios de la invención para la prevención o el tratamiento de una enfermedad de las plantas - así como los métodos correspondientes para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal.

La presente invención se refiere adicionalmente a kits de partes que comprenden bacterias o cepas de Lysobacter capsici, o similares, junto con una composición que comprende cobre.

La presente invención también se refiere al uso de una composición que comprende cobre en un método para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, en donde dicha composición se utiliza en combinación con bacterias o cepas de Lysobacter capsici, o similares - así como a métodos para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal que comprenden etapas de puesta en contacto de una planta con una composición que comprende cobre y una etapa de puesta en contacto de la planta con bacterias o cepas de Lysobacter capsici o similares.

La presente invención se refiere adicionalmente a determinados polipéptidos aislados que están relacionados con las bacterias de la invención y que están implicados en la resistencia al cobre - así como a los ácidos nucleicos relacionados.

En general, la presente invención se refiere predominantemente a los productos, usos y métodos definidos en las reivindicaciones en el presente documento.

Descripción detallada de la invención

Los presentes inventores han realizado numerosos estudios y han logrado resolver los problemas anteriores.

Por consiguiente, la presente invención, entre otras cosas, proporciona bacterias de Lysobacter capsici nuevas, particularmente las de la cepa Lysobacter capsici AZ78 (también abreviada en el presente documento como "AZ78").

Dichas bacterias de Lysobacter capsici AZ78 nuevas tienen varias características ventajosas. Estas incluyen, pero sin limitación, las siguientes: AZ78 pertenece a un género bacteriano que no abarca especies asociadas con enfermedades humanas. Es el primer caso de un miembro de Lysobacter capaz de controlar a Plasmopara viticola y Phytophthora infestans. La reducción de la gravedad de la enfermedad es mayor que la de otras bacterias Lysobacter. AZ78 persiste bien en la filosfera de plantas de cultivo. Las características fisiológicas hacen que AZ78 sea adecuada para bioformulación.

Por otra parte, no se esperan efectos adversos en los seres humanos o el medio ambiente producto de la aplicación de Lysobacter capsici. Por consiguiente, Lysobacter capsici es un agente de biocontrol microbiano ecológico que no daña el medio ambiente. La designación taxonómica propuesta es Lysobacter capsici AZ78. El microorganismo no está genéticamente modificado.

Se pueden tomar ventajas adicionales, por ejemplo, de una divulgación adicional a continuación en el presente documento, que incluye los Ejemplos en el presente documento, y en particular también de los comentarios en el Ejemplo 8 a continuación en el presente documento.

En concreto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una cepa bacteriana, seleccionada del grupo que consiste en i) Lysobacter capsici AZ78, ii) una cepa que se puede obtener del depósito CBS 134400 y iii) una cepa que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, en especial, que comprende, para cada miembro del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, al menos una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con dicho miembro.

Como se usa en el presente documento, un experto en la materia entenderá fácilmente una cepa "que se puede obtener de" un determinado depósito. Se pretende, en particular, incluir un cultivo de una cepa bacteriana que esté basado en una muestra de dicho depósito. Como se usa en el presente documento, una "cepa que se puede obtener de" dicho depósito preferentemente también incluye una "bacteria que se puede obtener de" dicho depósito y también puede denominarse en el presente documento "Lysobacter capsici que se puede obtener de" dicho depósito, en donde todos los anteriores están incluidos dentro de las bacterias de la presente invención. Para los fines del presente documento, una cepa "que se puede obtener de" un determinado depósito también puede significar una cepa "disponible de" dicho determinado depósito.

En general, los términos "Lysobacter" y "Lysobacter capsici" en el presente documento se utilizan como se conoce en la técnica. En general en el presente documento, las cepas de la presente invención (y, asimismo, las bacterias de la presente invención) incluyen las de Lysobacter capsici AZ78, una cepa que se puede obtener del depósito CBS 134400, y variantes de la misma.

Por consiguiente, una realización del primer aspecto se refiere a Lysobacter capsici AZ78. Asimismo, una realización del primer aspecto se refiere a una cepa que se puede obtener del depósito CBS 134400. En conformidad con la presente invención, la cepa de Lysobacter capsici AZ78 se depositó en virtud del Tratado de Budapest en el CBS (forma siglada de Centraal bureau voor Schimmelcultures: Oficina central para cultivos fúngicos) el 21 de febrero de 2013, y se le asignó el número de referencia del CBS 134400 (véase también los recibos de depósito respectivos presentados en el presente documento).

Además, una realización del primer aspecto se refiere a una cepa que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13. En una realización preferente, dicha cepa comprende, para cada miembro del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, al menos una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con dicho miembro. Como se usa en el presente documento "para cada miembro del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13" significa que hay al menos una secuencia de ácido nucleico correspondiente para cada una de las SEQ ID NO 6 a 13, en donde dicha al menos una secuencia de ácido nucleico correspondiente tiene dicha identidad. En otras palabras, dicha cepa puede comprender, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con la s Eq ID NO: 6, así como una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 7, así como una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 8, así como una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 9, así como una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 10, así como una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 11, así como una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 12, así como y una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 13.

Por tanto, también las variantes de la cepa de Lysobacter capsici AZ78, así como las variantes de una Lysobacter capsici que se puede obtener del depósito CBS 134400, están explícitamente incluidas dentro de la cepa de Lysobacter capsici de la presente invención. Dichas variantes incluyen, pero sin limitación, mutantes de la cepa de Lysobacter capsici AZ78, particularmente mutantes que tienen una o más, o todas las características identificativas de Lysobacter capsici AZ78, tales como una o más de las características ventajosas descritas en el presente documento.

Dichas variantes incluyen preferentemente bacterias Lysobacter capsici que tienen una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % (preferentemente al menos el 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 o 99,9 %) de identidad con una secuencia de ácido nucleico correspondiente de Lysobacter capsici AZ78, en donde dicha secuencia de ácido nucleico es una de las secuencias divulgadas en el presente documento, tal como una de las SEQ ID NO: 6 a 13. En determinadas realizaciones, las variantes incluyen bacterias Lysobacter capsici que comprenden al menos una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con una SEQ ID NO correspondiente para cada una de las SEQ ID NO: 6 a 13.

En general, en determinadas realizaciones en el presente documento, al menos el 99 % puede ser sustituido por al menos el 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 % o al menos el 99,9 %.

De manera similar, en un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una bacteria de una cepa bacteriana de acuerdo con el primer aspecto o que puede proceder de una cepa bacteriana como se define en el primer aspecto.

Como se usa en el presente documento, un experto en la materia entenderá fácilmente una bacteria "que puede proceder de" una determinada cepa bacteriana. Se pretende, en particular, incluir un cultivo de una bacteria que esté basado en una muestra de dicha cepa, por ejemplo, una muestra de dicho depósito. Preferentemente, la expresión "que puede proceder de" también incluye cualquier bacteria obtenida después de cultivar cepas o bacterias de la presente invención. Por consiguiente, preferentemente, "que puede proceder de" también incluye cualquier descendencia de las cepas y bacterias de la presente invención.

En conformidad con lo que se ha divulgado anteriormente, las bacterias del segundo aspecto también incluyen variantes de Lysobacter capsici AZ78, así como las variantes de una Lysobacter capsici que se puede obtener del depósito CBS 134400. Dichas variantes incluyen, pero sin limitación, mutantes de Lysobacter capsici AZ78, particularmente mutantes que tienen una o más, o todas las características identificativas de Lysobacter capsici AZ78, tales como una o más de las características ventajosas descritas en el presente documento. Dichas variantes incluyen preferentemente bacterias Lysobacter capsici que tienen una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % (preferentemente al menos el 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 % o al menos el 99,9 %) de identidad con una secuencia de ácido nucleico correspondiente de bacterias de Lysobacter capsici AZ78, en donde dicha secuencia de ácido nucleico es una de las secuencias divulgadas en el presente documento, tal como una de las SEQ ID NO: 6 a 13. En determinadas realizaciones, las variantes incluyen bacterias Lysobacter capsici que comprenden al menos una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con una SEQ ID NO correspondiente para cada una de las SEQ ID NO: 6 a 13.

En general en el presente documento, la cepa del primer aspecto y las bacterias del segundo aspecto pueden denominarse colectivamente en el presente documento "bacterias de la presente invención". Por consiguiente, como se usa en el presente documento, la expresión "bacterias de la invención" puede comprender las cepas del primer aspecto y las bacterias del segundo aspecto.

Preferentemente, las bacterias de la presente invención tienen una, más de una, cualquier combinación de, o todas las siguientes características: i) no están asociadas con ninguna enfermedad humana, ii) son eficaces contra Plasmopara viticola, iii) son eficaces contra Phytophthora infestans, iv) son más eficaces como un agente de biocontrol que otras bacterias Lysobacter, v) persisten en las plantas, vi) persisten en la filosfera de plantas de cultivo, vii) son capaces de formar biopelículas, viii) no se ven afectadas negativamente por el estrés provocado por la falta de nutrientes (inanición) y no sufren después de la exposición a temperaturas crecientes (choque térmico leve), ix) pueden tolerar la exposición a la radiación UV, x) pueden tolerar temperaturas de congelación (por ejemplo, hasta -20 °C).

Por consiguiente, preferentemente, las bacterias de la presente invención no están asociadas con ninguna enfermedad humana. Preferentemente, las bacterias de la presente invención son eficaces contra Plasmopara viticola. Preferentemente, las bacterias de la presente invención son eficaces contra Phytophthora infestans. Preferentemente, las bacterias de la presente invención son más eficaces como un agente de biocontrol que otras bacterias Lysobacter. Preferentemente, las bacterias de la presente invención persisten en las plantas, preferentemente, en la filosfera de plantas de cultivo. Preferentemente, las bacterias de la presente invención pueden formar biopelículas. Preferentemente, las bacterias de la presente invención no sufren después de la exposición a temperaturas crecientes (choque térmico leve). Preferentemente, las bacterias de la presente invención pueden tolerar la exposición a la radiación UV, particularmente, la radiación UV como se emplea en los ejemplos en el presente documento. Preferentemente, las bacterias de la presente invención pueden tolerar temperaturas de congelación (por ejemplo, hasta -20 °C; por ejemplo, como se emplea en los ejemplos en el presente documento).

En vista de lo anterior, las cepas del primer aspecto pueden tener cualquiera (o cualquier combinación) de las características descritas anteriormente. Asimismo, las bacterias del segundo aspecto pueden tener cualquiera (o cualquier combinación) de estas características.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una preparación bacteriana, seleccionada del grupo que consiste en i) una preparación de Lysobacter capsici AZ78, ii) una preparación de una bacteria que se puede obtener del depósito CBS 134400, iii) una preparación de una bacteria que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, en especial, que comprende, para cada miembro del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, al menos una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con dicho miembro, y iv) una preparación de una bacteria de acuerdo con el segundo aspecto.

Por consiguiente, una realización del tercer aspecto se refiere a una preparación de Lysobacter capsici AZ78. Además, una realización del tercer aspecto se refiere a una preparación de una bacteria que se puede obtener del depósito CBS 134400. Como se usa en el presente documento, un experto en la materia entenderá fácilmente una bacteria "que se puede obtener de" un determinado depósito. Particularmente, pretende incluir una bacteria que está contenida en una muestra de dicho depósito y también incluye cualquier de las bacterias obtenida después de cultivar tal bacteria. Una "bacteria que se puede obtener de" dicho depósito también está incluida dentro de las bacterias de la presente invención. Para los fines del presente documento, una bacteria "que se puede obtener de" un determinado depósito también puede significar una bacteria "disponible de" dicho determinado depósito. Además, una realización del tercer aspecto se refiere a una preparación de una bacteria que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, que particularmente comprende, para cada miembro del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, al menos una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con dicho miembro. Por tanto, las variantes descritas anteriormente de Lysobacter capsici AZ78 también se contemplan en contexto con el tercer aspecto. Por consiguiente, una preparación bacteriana de la presente invención también puede ser una preparación que comprende variantes de bacterias de la presente invención, tal como variantes de la cepa de Lysobacter capsici AZ78, en donde dichas variantes son como se describe anteriormente en el presente documento. Además, una realización adicional del tercer aspecto se refiere a una preparación de una bacteria de acuerdo con el segundo aspecto.

Como se usa en el presente documento, una preparación bacteriana preferentemente se refiere a una preparación que comprende bacterias de la presente invención.

En general en el presente documento, la forma de las bacterias de la presente invención (tal como las bacterias contenidas en una preparación bacteriana de la presente invención) no está particularmente limitada. En determinadas realizaciones, la preparación bacteriana es una preparación líquida. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, las preparaciones bacterianas en el presente documento son suspensiones de las bacterias de la invención o de las respectivas Lysobacter capsici.

Las preparaciones bacterianas en el presente documento pueden comprender preferentemente aditivos. Los ejemplos no limitantes de tales aditivos incluyen uno o más aditivos seleccionados del grupo que consiste en agentes humectantes, adhesivos, estimulantes de alimentación y vehículos, todos los cuales son bien conocidos para el experto en la materia. Un agente humectante ejemplar es Tween 80 y un vehículo ejemplar es la celulosa.

En determinadas realizaciones en el presente documento, las preparaciones bacterianas en el presente documento comprenden adicionalmente o se administran junto con uno o más productos fitosanitarios adicionales, preferentemente productos fitosanitarios que contienen cobre, en especial, seleccionados del grupo que consiste en Kocide 3000, Blue Shield DF, Cupravit, Cupravit Bio Evolution, Airone, Airone Piu, Corvit, Iram, Copranto1HI BIO, Idrorame Flow, Poltiglia bordolese, Cobre Nordox Super 75 WG, y cualquier otro producto fitosanitario adecuado para el tratamiento de una enfermedad vegetal provocada por un hongo o un oomiceto seleccionado del grupo que consiste en Alternaría, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum alternata gioeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola. Los productos citados anteriormente están disponibles en el mercado de los siguientes fabricantes: Kocide 3000 (Du Pont), Blue Shield DF (Bayer), Cupravit (Bayer Cropscience), Cupravit Bio Evolution (Bayer Cropscience), Airone (Isagro), Airone Piu (Isagro), Corvit (New Agri), Iram (Agrimix), Coprantol HI BIO (Syngenta), Idrorame Flow (Chimiberg), Poltiglia bordolese (Agrisystem), Cobre Nordox Super 75 WG, (Comercial Quichimica Massó). En realizaciones particularmente preferentes, el producto fitosanitario que contiene cobre es adecuado para el tratamiento del mildiu de la vid provocado por Plasmopara viticola y/o el tizón tardío, particularmente el tizón tardío del tomate, provocado por Phytophthora infestans. Los productos fitosanitarios particularmente preferentes para su uso junto con los productos fitosanitarios (bacterianos) de la invención, son composiciones que comprenden cobre como se describe en el presente documento. Por tanto, las realizaciones descritas en el último contexto también se contemplan en relación con el presente aspecto, y viceversa.

En determinadas realizaciones en el presente documento, las preparaciones bacterianas en el presente documento comprenden adicionalmente o se administran junto con uno o más acaricidas. En determinadas realizaciones en el presente documento, las preparaciones bacterianas en el presente documento comprenden adicionalmente o se administran junto con uno o más insecticidas. En determinadas realizaciones en el presente documento, las preparaciones bacterianas en el presente documento comprenden adicionalmente o se administran junto con uno o más fortificantes para plantas, fertilizantes foliares e inductores de la resistencia de la planta.

En línea con lo anterior, las preparaciones bacterianas del tercer aspecto pueden tener cualquiera (o cualquier combinación) de las características preferentes de las bacterias de la invención divulgadas anteriormente.

En determinadas realizaciones, dicha preparación bacteriana puede por sí misma calificar como y/o denominarse producto fitosanitario. En determinadas realizaciones, la preparación bacteriana es un producto fitosanitario contra los mildius en plantas, particularmente en plantas de vid, y también puede denominarse en el presente documento una preparación bacteriana para el tratamiento de los mildius en plantas. En determinadas realizaciones, la preparación bacteriana es un producto fitosanitario contra enfermedades provocadas por Phytophthora infestans en plantas, particularmente en patatas y/o tomates, y también puede denominarse en el presente documento preparación bacteriana para el tratamiento del tizón tardío del tomate o el tizón tardío de la patata en plantas.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al uso de una cepa bacteriana de acuerdo con el primer aspecto, una bacteria de acuerdo con el segundo aspecto o una preparación bacteriana de acuerdo con el tercer aspecto, para la preparación de un producto fitosanitario. Por consiguiente, una realización del cuarto aspecto se refiere al uso de una cepa bacteriana de acuerdo con el primer aspecto para la preparación de un producto fitosanitario. Una realización del cuarto aspecto se refiere al uso de una bacteria de acuerdo con el segundo aspecto para la preparación de un producto fitosanitario. Una realización del cuarto aspecto se refiere al uso de una preparación bacteriana de acuerdo con el tercer aspecto para la preparación de un producto fitosanitario.

Como se usa en el presente documento, la expresión "producto fitosanitario", que también puede denominarse en el presente documento "agente de biocontrol", no está particularmente limitado y se usa en general como se conoce en la técnica. En realizaciones preferentes, el producto fitosanitario es un producto fitosanitario bacteriano, tal como un producto fitosanitario que comprende bacterias de la presente invención. Por consiguiente, en realizaciones preferentes, el producto fitosanitario es un agente bacteriano de biocontrol.

Preferentemente en el presente documento, el producto fitosanitario es un producto fitosanitario contra cualquiera de las enfermedades vegetales divulgadas en el presente documento. Por tanto, el producto fitosanitario es preferentemente un producto fitosanitario contra un hongo fitopatógeno y/o un oomiceto fitopatógeno. Preferentemente, el producto fitosanitario es un producto fitosanitario contra los oomicetos divulgados en el presente documento. Los ejemplos preferentes de dichas enfermedades descritas en otra parte del presente documento también se aplican en cuanto al cuarto aspecto. En realizaciones preferentes, el producto fitosanitario es un producto fitosanitario contra los mildius en plantas, particularmente en plantas de vid, y también puede denominarse en el presente documento una preparación bacteriana para el tratamiento de los mildius en plantas. En determinadas realizaciones, el producto fitosanitario es un producto fitosanitario contra enfermedades provocadas por Phytophthora infestans en plantas, particularmente en patatas y/o tomates, y también puede denominarse en el presente documento producto fitosanitario para el tratamiento del tizón tardío del tomate o el tizón tardío de la patata en plantas.

Por otra parte, en un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un producto fitosanitario que comprende una cepa bacteriana de acuerdo con el primer aspecto, al menos una bacteria de acuerdo con el segundo aspecto o una preparación bacteriana de acuerdo con el tercer aspecto. En general, el producto fitosanitario del quinto aspecto puede ser un producto fitosanitario preparado en conformidad con el cuarto aspecto.

Una realización del quinto aspecto se refiere a un producto fitosanitario que comprende una cepa bacteriana de acuerdo con el primer aspecto. Una realización del quinto aspecto se refiere a un producto fitosanitario que comprende al menos una bacteria de acuerdo con el segundo aspecto. Una realización del quinto aspecto se refiere a un producto fitosanitario que comprende una preparación bacteriana de acuerdo con el tercer aspecto.

Como se usa en el presente documento, un producto fitosanitario preparado en conformidad con el cuarto aspecto y/o un producto fitosanitario del quinto aspecto puede denominarse en el presente documento "producto fitosanitario de la invención".

Preferentemente, el producto fitosanitario de la invención es un producto fitosanitario contra un hongo fitopatógeno y/o un oomiceto fitopatógeno. Por consiguiente, el producto fitosanitario de la invención puede ser un producto fitosanitario contra un hongo fitopatógeno. Por consiguiente, el producto fitosanitario de la invención puede ser un producto fitosanitario contra un oomiceto fitopatógeno. Preferentemente, el producto fitosanitario es un producto fitosanitario contra oomicetos divulgados en el presente documento.

Los ejemplos preferentes de un hongo fitopatógeno y/o un oomiceto fitopatógeno en relación con los aspectos cuarto y quinto en el presente documento - y en general los ejemplos preferentes de un hongo fitopatógeno y/o de un oomiceto fitopatógeno en relación con la presente invención - se seleccionan del grupo que consiste en Alternaria alternata, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola.

Por consiguiente, en general, los expertos en la materia apreciarán que las bacterias y las preparaciones bacterianas de la presente invención pueden utilizarse como un producto fitosanitario, particularmente como un producto fitosanitario contra enfermedades vegetales (o, en otras palabras, un producto fitosanitario contra enfermedades vegetales o, en otras palabras, un producto fitosanitario para tratar enfermedades vegetales).

En línea con lo anterior, los productos fitosanitarios de la presente invención, tales como el preparado en conformidad con el cuarto aspecto y los del quinto aspecto, pueden caracterizarse por cualquiera (o cualquier combinación) de las características preferentes de las bacterias y preparaciones bacterianas de la invención divulgadas anteriormente. Por ejemplo, en realizaciones preferentes de los aspectos cuarto y quinto, el producto fitosanitario comprende cualquiera de los agentes adicionales descritos en relación con el tercer aspecto, tales como aditivos, acaricidas, insecticidas, fortificantes para plantas, fertilizantes foliares y/o inductores de la resistencia de la planta. En particular, en determinadas realizaciones en el presente documento, las preparaciones bacterianas en el presente documento comprenden adicionalmente o se administran junto con uno o más productos fitosanitarios adicionales, preferentemente productos fitosanitarios que contienen cobre, particularmente como se define en otra parte en el presente documento, en especial, como se describió anteriormente en contexto con el tercer aspecto.

En realizaciones particularmente preferentes del cuarto y quinto aspectos del presente documento - y en general en contexto con la invención - dicho oomiceto fitopatógeno se selecciona de Plasmopara vitícola y Phytophthora infestaos. Por consiguiente, en realizaciones particularmente preferentes del cuarto y quinto aspectos en el presente documento - y en general en contexto con la invención - dicho oomiceto fitopatógeno es Plasmopara vitícola. Por consiguiente, en realizaciones particularmente preferentes del cuarto y quinto aspectos en el presente documento - y en general en contexto con la invención - dicho oomiceto fitopatógeno es Phytophthora infestaos.

Por tanto, el cuarto aspecto se refiere preferentemente al uso de una cepa bacteriana de acuerdo con el primer aspecto, una bacteria de acuerdo con el segundo aspecto o una preparación bacteriana de acuerdo con el tercer aspecto, para la preparación de un producto fitosanitario contra Plasmopara vitícola y/o Phytophthora infestaos. Asimismo, el quinto aspecto se refiere preferentemente al uso de una cepa bacteriana de acuerdo con el primer aspecto, una bacteria de acuerdo con el segundo aspecto o una preparación bacteriana de acuerdo con el tercer aspecto, para la preparación de un producto fitosanitario contra Plasmopara viticola y/o Phytophthora infestaos.

En determinadas realizaciones, dicho producto fitosanitario es un producto fitosanitario contra los mildius en plantas, particularmente en plantas de vid, y también puede denominarse en el presente documento producto fitosanitario para el tratamiento de los mildius en plantas. En determinadas realizaciones, dicho producto fitosanitario es un producto fitosanitario contra enfermedades provocadas por Phytophthora infestans en plantas, particularmente en patatas y/o tomates, y también puede denominarse en el presente documento producto fitosanitario para el tratamiento del tizón tardío del tomate o el tizón tardío de la patata en plantas.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere al uso de una cepa bacteriana de acuerdo con el primer aspecto, una bacteria de acuerdo el segundo aspecto, una preparación bacteriana de acuerdo el tercer aspecto, un producto fitosanitario de acuerdo con el quinto aspecto o un producto fitosanitario como se define en el cuarto aspecto, para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos. Por consiguiente, una realización del sexto aspecto se refiere al uso de una cepa bacteriana de acuerdo con el primer aspecto para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos. Por consiguiente, una realización del sexto aspecto se refiere a una bacteria de acuerdo con el segundo aspecto para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos. Por consiguiente, una realización del sexto aspecto se refiere a una preparación bacteriana de acuerdo con el tercer aspecto para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos. Por consiguiente, una realización del sexto aspecto se refiere a un producto fitosanitario de acuerdo con el quinto aspecto para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos. Por consiguiente, una realización del sexto aspecto se refiere a un producto fitosanitario como se define en el cuarto aspecto para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos.

Preferentemente, en el sexto aspecto - y en general en contexto con la invención - dicha enfermedad vegetal está provocada por un hongo y/o un oomiceto seleccionado del grupo que consiste en Alternaria alternata, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola.

Preferentemente, en el sexto aspecto - y en general en contexto con la invención - dicha enfermedad vegetal está provocada por un oomiceto seleccionado de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans.

Más preferentemente, en el sexto aspecto - y en general en contexto con la invención - dicha enfermedad vegetal está provocada por Plasmopara viticola. Más en particular, dicha enfermedad es mildiu, particularmente mildiu de la vid. Por consiguiente, en el sexto aspecto - y en general en contexto con la invención - dicha enfermedad vegetal puede ser mildiu, preferentemente mildiu de la vid. También preferentemente, en el sexto aspecto - y en general en contexto con la invención - dicha enfermedad vegetal está provocada por Phytophthora infestans. Más en particular, dicha enfermedad es tizón tardío del tomate o tizón tardío de la patata provocado por Phytophthora infestans, particularmente tizón tardío del tomate. Por consiguiente, en el sexto aspecto - y en general en contexto con la invención - dicha enfermedad vegetal es tizón tardío del tomate o tizón tardío de la patata, preferentemente tizón tardío del tomate.

Como se usa en el presente documento, la expresión "tratar una enfermedad vegetal" y expresiones similares se utilizan de manera equivalente con la expresión "para el tratamiento de plantas contra una enfermedad vegetal". Esta expresión también incluye, preferentemente, la expresión "para el tratamiento de plantas afectadas por una enfermedad vegetal". En cualquier caso, el experto en la materia apreciará que las bacterias, cepas bacterianas, preparaciones bacterianas y los productos fitosanitarios de la invención pueden utilizarse contra enfermedades vegetales (que, por ejemplo, pueden prevenirse, tratarse/controlarse en contexto con la presente invención). Preferentemente, dichas enfermedades vegetales están en conformidad con las realizaciones preferentes de cualquiera de los aspectos particulares en el presente documento.

De manera similar, en un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un método para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos, que comprende una etapa de poner en contacto al menos una planta con una cepa bacteriana, bacteria, composición bacteriana o producto fitosanitario como se define en cualquiera de los aspectos anteriores. Preferentemente, dicha enfermedad vegetal está provocada por un hongo o un oomiceto seleccionado del grupo que consiste en Alternaría alternata, Ascochyta rabíeí, Aspergíllus flavus, Aspergíllus níger, Aspergíllus ochraceus, Botrytís cínerea, Colletotríchum gloeosporíoídes, Fusaríum acumínatum, Fusaríum avenaceum, Fusaríum oxysporum f.sp. asparagí, Fusaríum oxysporum f.sp. lycopersící, Fusaríum oxysporum f.sp. radícís-lycopersící, Fusaríum sambucínum, Fusaríum semítectum, Fusaríum solaní, Penícíllíum sp., Phoma tracheíphíla, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsící, Phytophthora cínnamomí, Phytophthora ínfestans, Plasmopara vitícola, Pythíum ultímum, Rhízoctonía solaní, Sclerotínía maíor, Sclerotínía mínor, Sclerotínía sclerotíorum y Thíelavíopsís basícola.

Más preferentemente, dicha enfermedad vegetal está provocada por un oomiceto seleccionado de Plasmopara vitícola y Phytophthora ínfestans. Particularmente, dicha enfermedad vegetal está provocada por Plasmopara vitícola. Preferentemente, dicha enfermedad es mildiu, particularmente mildiu de la vid. Particularmente, dicha enfermedad vegetal está provocada por Phytophthora ínfestans. Preferentemente, dicha enfermedad es tizón tardío del tomate o tizón tardío de la patata, particularmente tizón tardío del tomate.

En general, las realizaciones preferentes del sexto y séptimo aspectos incluyen las descritas en contexto con el primero, el segundo, el tercero, el cuarto y/o el quinto aspectos.

En determinadas realizaciones preferentes de los usos, los productos fitosanitarios o los métodos de acuerdo con cualquiera del cuarto, el quinto, el sexto y el séptimo aspectos, el producto fitosanitario comprende adicionalmente cobre y/o dicho uso o método comprende adicionalmente una etapa de poner en contacto dicha planta con una composición que comprende cobre. Por tanto, en determinadas realizaciones preferentes de los usos, los productos fitosanitarios o los métodos de acuerdo con cualquiera del cuarto, el quinto, el sexto y el séptimo aspectos, el producto fitosanitario comprende adicionalmente cobre. Por tanto, en determinadas realizaciones preferentes de los usos, los productos fitosanitarios o los métodos de acuerdo con cualquiera del cuarto, el quinto, el sexto y el séptimo aspectos, dicho uso o método comprende adicionalmente una etapa de poner en contacto dicha planta con una composición que comprende cobre.

En general, en realizaciones preferentes, el cuarto, el quinto, el sexto y el séptimo aspectos pueden caracterizarse por cualquiera (o cualquier combinación) de las características preferentes de las bacterias y preparaciones bacterianas de la invención divulgadas anteriormente. Por ejemplo, la composición bacteriana o el producto fitosanitario puede comprender o administrarse junto con cualquiera de los agentes adicionales descritos en relación con el tercer aspecto, tales como aditivos, acaricidas, insecticidas, fortificantes para plantas, fertilizantes foliares y/o inductores de la resistencia de la planta. En particular, en determinadas realizaciones en el presente documento, las composiciones bacterianas o los productos fitosanitarios comprenden adicionalmente o se administran junto con uno o más productos fitosanitarios adicionales, preferentemente productos fitosanitarios que contienen cobre, particularmente como se define en otra parte en el presente documento, en especial, como se describió anteriormente en contexto con el tercer aspecto.

Adicionalmente, en un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un kit de partes que comprende i) una composición que comprende cobre y ii) un miembro del grupo que consiste en una cepa bacteriana que pertenece a Lysobacter capsící, una bacteria que pertenece a Lysobacter capsící, una preparación bacteriana de Lysobacter capsící, una cepa bacteriana de acuerdo el tercer aspecto, una bacteria de acuerdo el segundo aspecto, una preparación bacteriana de acuerdo el tercer aspecto, un producto fitosanitario de acuerdo con el quinto aspecto y un producto fitosanitario como se define en el cuarto aspecto; particularmente, en donde dicha composición que comprende cobre es un producto fitosanitario de cobre, en especial, en donde dicha composición que comprende cobre, comprende al menos un compuesto de cobre seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre, sulfato tribásico de cobre y octanoato de cobre.

En determinadas realizaciones preferentes del octavo aspecto, dicha composición que comprende cobre es un producto fitosanitario de cobre, en especial, en donde dicha composición que comprende cobre, comprende al menos un compuesto de cobre seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre, sulfato tribásico de cobre y octanoato de cobre.

En determinadas realizaciones, la composición que comprende cobre comprende al menos un compuesto de cobre seleccionado del grupo que consiste en acetato de cobre(II), carbonato de cobre(ll), hidróxido de cobre básico, naftenato de cobre, oleato de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre(ll), sulfato de cobre básico y cromato de cobre y zinc.

En realizaciones particularmente preferentes, la composición que comprende cobre comprende hidróxido de cobre. Los productos fitosanitarios de cobre son bien conocidos en la técnica y, en general, están disponibles en el mercado. Los ejemplos particulares incluyen la mezcla Bordeaux y Kocide 3000 (que contiene hidróxido de cobre al 15 %, GD, Du Pont de Nemours, EE.UU.), los cuales se utilizan en los presentes ejemplos. En general en el presente documento, las realizaciones preferentes de la composición que comprende cobre son como se definen en otra parte en el presente documento y, en especial, son productos fitosanitarios que contienen cobre como se definen en contexto con el tercer aspecto.

El experto en la materia puede determinar fácilmente las concentraciones (finales) preferentes de cobre y, por ejemplo, pueden tomarse de los presentes ejemplos. En general, los intervalos preferentes de concentración de cobre a utilizar en el presente documento son de 10 a 500 mg l-1, preferentemente de 50 a 450 mg l-1, preferentemente de 50 a 400 mg l-1, preferentemente de 90 a 400 mg l-1, preferentemente de 90 a 375 mg l-1. Los intervalos de concentración particularmente preferentes son de 10 a 300 mg l-1, preferentemente de 20 a 250 mg l-1, preferentemente de 50 a 190 mg l-1, preferentemente de 90 a 190 mg l-1. Un intervalo de concentración preferente ejemplar es de 100-500 mg l-1.

En general, otras realizaciones preferentes de la composición que comprende cobre corresponden a las descritas en otra parte del presente documento. En general, determinadas realizaciones preferentes del octavo aspecto corresponden a cualquiera de las realizaciones preferentes descritas anteriormente en el presente documento.

En realizaciones preferentes, los kits en el presente documento o cualquiera de sus componentes comprenden cualquiera de los agentes adicionales descritos en relación con el tercer aspecto, tales como aditivos, acaricidas, insecticidas, fortificantes para plantas, fertilizantes foliares y/o inductores de la resistencia de la planta.

Por otra parte, en un noveno aspecto, la invención se refiere al uso de una composición que comprende cobre en un método para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos, caracterizado por que, dicha composición que comprende cobre, se utiliza en combinación con un miembro del grupo que consiste en una cepa bacteriana que pertenece a Lysobacter capsici, una bacteria que pertenece a Lysobacter capsici, una preparación bacteriana de Lysobacter capsici, una cepa bacteriana de acuerdo el tercer aspecto, una bacteria de acuerdo el segundo aspecto, una preparación bacteriana de acuerdo el tercer aspecto, un producto fitosanitario de acuerdo con el quinto aspecto y un producto fitosanitario como se define en el cuarto aspecto, en particular, caracterizado adicionalmente en conformidad con cualquiera de los aspectos anteriores; en especial, en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un hongo o un oomiceto seleccionado del grupo que consiste en Alternaria alternata, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola, particularmente en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un oomiceto seleccionado de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans. Particularmente, dicha enfermedad vegetal está provocada por Plasmopara viticola. Preferentemente, dicha enfermedad es mildiu, en especial, mildiu de la vid. Particularmente, dicha enfermedad vegetal está provocada por Phytophthora infestans. Preferentemente, dicha enfermedad es tizón tardío del tomate o tizón tardío de la patata, particularmente tizón tardío del tomate.

En general, determinadas realizaciones preferentes del noveno aspecto corresponden a cualquiera de las realizaciones preferentes descritas anteriormente en el presente documento. En general, las realizaciones preferentes de la composición que comprende cobre corresponden a las descritas en otra parte del presente documento. Particularmente, en realizaciones preferentes del noveno aspecto, dicha composición que comprende cobre se caracteriza como en las realizaciones descritas para el tercer y/o el octavo aspecto.

Además, por ejemplo, en determinadas realizaciones del noveno aspecto, dicha enfermedad vegetal está provocada por un hongo o un oomiceto seleccionado del grupo que consiste en Alternaria alternata, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola, particularmente en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un oomiceto seleccionado de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans. Particularmente, dicha enfermedad vegetal está provocada por Plasmopara viticola. Preferentemente, dicha enfermedad es mildiu, en especial, mildiu de la vid. Particularmente, dicha enfermedad está provocada por Phytophthora infestans. Preferentemente, dicha enfermedad es tizón tardío del tomate o tizón tardío de la patata, particularmente tizón tardío del tomate.

Por otra parte, en un décimo aspecto, la invención se refiere a un método para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos, que comprende una etapa de poner en contacto al menos una planta con una composición que comprende cobre, caracterizado por que el método comprende adicionalmente una etapa de poner en contacto dicha al menos una planta con un miembro del grupo que consiste en una cepa bacteriana que pertenece a Lysobacter capsici, una bacteria que pertenece a Lysobacter capsici, una preparación bacteriana de Lysobacter capsici, una cepa bacteriana de acuerdo el tercer aspecto, una bacteria de acuerdo el segundo aspecto, una preparación bacteriana de acuerdo el tercer aspecto, un producto fitosanitario de acuerdo con el quinto aspecto y un producto fitosanitario como se define en el cuarto aspecto, en particular, caracterizado adicionalmente en conformidad con cualquiera de los aspectos anteriores; en especial, en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un hongo o un oomiceto seleccionado del grupo que consiste en Alternaría alternata, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola, particularmente en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un oomiceto seleccionado de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans. En particular, dicha enfermedad vegetal está provocada por Plasmopara viticola. Preferentemente, dicha enfermedad es mildiu, en especial, mildiu de la vid. En particular, dicha enfermedad está provocada por Phytophthora infestans. Preferentemente, dicha enfermedad es tizón tardío del tomate o tizón tardío de la patata, particularmente tizón tardío del tomate.

Como se usa en el presente documento, el término "que tratar" o equivalentes gramaticales, particularmente en el contexto de una enfermedad vegetal, puede utilizar de manera equivalente con el término "que controlar" o equivalentes gramaticales.

En general, determinadas realizaciones preferentes del décimo aspecto corresponden a cualquiera de las realizaciones preferentes descritas anteriormente en el presente documento.

En general, en realizaciones preferentes, el octavo, el noveno y el décimo aspectos pueden caracterizarse por cualquiera (o cualquier combinación) de las características preferentes de las bacterias, preparaciones bacterianas y productos fitosanitarios de la invención divulgados anteriormente. Por ejemplo, las preparaciones bacterianas y/o los productos fitosanitarios pueden comprender o administrarse junto con cualquiera de los agentes adicionales descritos en relación con el tercer aspecto, tales como aditivos, acaricidas, insecticidas, fortificantes para plantas, fertilizantes foliares y/o inductores de la resistencia de la planta.

Preferentemente, dichas composiciones que comprenden cobre son productos fitosanitarios que contienen cobre como se define en contexto con los aspectos anteriores, tales como el tercer aspecto. En determinadas realizaciones preferentes del décimo aspecto, dicha composición que comprende cobre es un producto fitosanitario de cobre, en especial, en donde dicha composición que comprende cobre, comprende al menos un compuesto de cobre seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre, sulfato tribásico de cobre y octanoato de cobre. En determinadas realizaciones, la composición que comprende cobre comprende al menos un compuesto de cobre seleccionado del grupo que consiste en acetato de cobre(II), carbonato de cobre(ll), hidróxido de cobre básico, naftenato de cobre, oleato de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre(ll), sulfato de cobre básico y cromato de cobre y zinc. En general, otras realizaciones preferentes de la composición que comprende cobre corresponden a las descritas en otra parte del presente documento.

Las siguientes realizaciones y enseñanzas son aplicables en general en el presente documento:

En general en el presente documento, las realizaciones descritas en relación con cualquier aspecto particular de la invención también se contemplan como realizaciones de los otros aspectos de la invención. En general en el presente documento, las realizaciones similares incluyen realizaciones análogas en el contexto dado.

En general, la manipulación de Lysobacter capsici (que incluye, pero sin limitación, el cultivo, el almacenamiento, la fermentación, la formulación y las aplicaciones) es bien conocida por el experto en la materia. Esto se aplica particularmente en vista de las enseñanzas de los Ejemplos divulgados a continuación en el presente documento. Por consiguiente, por ejemplo, se contempla que un experto en la materia pueda determinar fácilmente las concentraciones adecuadas de Lysobacter capsici para la aplicación a plantas.

Como ejemplo no limitante, las bacterias o preparaciones bacterianas de Lysobacter capsici en el presente documento pueden aplicarse mediante pulverización en el suelo. Las frecuencias de aplicación preferentes ejemplares en el presente documento son de 2 a 15 aplicaciones por temporada, tal como de 2 a 12 o de 5 a 9 aplicaciones por temporada, particularmente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aplicaciones por temporada. El experto en la materia puede determinar fácilmente los números preferentes de aplicación y, por ejemplo, depende de la presión de la enfermedad.

Como ejemplo no limitante, las bacterias o preparaciones bacterianas de Lysobacter capsici en el presente documento pueden aplicarse en dosis de aproximadamente 107 a 109 células bacterianas por ml de preparación bacteriana, preferentemente de aproximadamente 0,2 x 108 a 5 x 108 células bacterianas por ml de preparación bacteriana, preferentemente de aproximadamente 0,5 x 108 a 2x 108 células bacterianas por ml de preparación bacteriana, tal como de aproximadamente 108 células bacterianas por ml de preparación bacteriana como se emplea en los presentes ejemplos.

En general, los intervalos preferentes de concentración de cobre a emplear en los usos y métodos de la invención son de 10 a 500 mg l-1, preferentemente de 50 a 450 mg l-1, preferentemente de 50 a 400 mg l-1, preferentemente de 90 a 400 mg l-1, preferentemente de 90 a 375 mg l-1. Los intervalos de concentración particularmente preferentes son de 10 a 300 mg l-1, preferentemente de 20 a 250 mg l-1, preferentemente de 50 a 190 mg l-1, preferentemente de 90 a 190 mg l-1. Un intervalo de concentración preferente ejemplar es de 100-500 mg l-1.

Como ejemplos no limitantes, las bacterias Lysobacter capsici, las preparaciones bacterianas y los productos fitosanitarios en el presente documento pueden aplicarse al brote, tallo, hojas, semillas y/o propágulos vegetativos de una o más plantas, preferentemente al brote, tallo, hojas y/o propágulos vegetativos de una o más plantas, más preferentemente al tallo y/u hojas, preferentemente a las hojas de al menos una planta.

En general, las preparaciones bacterianas y los productos fitosanitarios de la presente invención pueden comprender adicionalmente aditivos. Los ejemplos no limitantes de tales aditivos incluyen uno o más aditivos seleccionados del grupo que consiste en agentes humectantes, adhesivos, estimulantes de alimentación y vehículos, todos los cuales son bien conocidos para el experto en la materia. Un agente humectante ejemplar es Tween 80 y un vehículo ejemplar es la celulosa.

En general, las preparaciones bacterianas y los productos fitosanitarios en el presente documento pueden comprender adicionalmente o se administran junto con uno o más acaricidas. En determinadas realizaciones en el presente documento, las preparaciones bacterianas y los productos fitosanitarios en el presente documento pueden comprender adicionalmente o se administran junto con uno o más insecticidas. En determinadas realizaciones en el presente documento, las preparaciones bacterianas y los productos fitosanitarios en el presente documento pueden comprender adicionalmente o se administran junto con uno o más fortificantes para plantas, fertilizantes foliares y/o inductores de la resistencia de la planta.

En general, en realizaciones preferentes de los usos y métodos en el presente documento, las bacterias, las preparaciones bacterianas y los productos fitosanitarios en el presente documento se utilizan en una cantidad eficaz contra una enfermedad vegetal. Una cantidad eficaz en el presente documento significa una cantidad eficaz para lograr una inhibición significativa de la enfermedad en al menos una planta, particularmente cuando se compara con un control en ausencia de dichas bacterias, preparaciones bacterianas o productos fitosanitarios.

En realizaciones preferentes en el presente documento, las bacterias o preparaciones bacterianas de la invención tienen eficacia de producto fitosanitario y/o eficacia de biocontrol, preferentemente una eficacia de producto fitosanitario y/o una eficacia de biocontrol como se define anteriormente.

En realizaciones preferentes en el presente documento, las bacterias, la preparación bacteriana y los productos fitosanitarios de la invención se aplican a plantas que muestran síntomas de enfermedad vegetal, tal como al menos una planta que muestra signos visibles de mildiu, particularmente mildiu de la vid y/o tizón tardío de la patata o tizón tardío del tomate, particularmente tizón tardío del tomate. Dichos síntomas y signos son bien conocidos por el experto en la materia y pueden incluir manchas circulares amarillas con un aspecto aceitoso en las hojas de vid y lesiones de color verde pálido a negro parduzco en las hojas de tomate, causadas respectivamente por ataques de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans. Por consiguiente, en realizaciones preferentes, los usos y métodos divulgados en el presente documento son para el tratamiento de plantas que muestran síntomas de enfermedad vegetal, tales como signos visibles de enfermedad vegetal.

En general, se pueden tomar realizaciones adicionales de los Ejemplos divulgados en el presente documento, y también de las consideraciones adicionales en el Ejemplo 8 a continuación en el presente documento.

Las realizaciones y enseñanzas anteriores son aplicables en general en el presente documento.

En un undécimo aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado seleccionado de i) un polipéptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2, ii) un polipéptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4, iii) una ATPasa de tipo P de translocación de cobre que se puede obtener del depósito CBS 134400, iv) una proteína de resistencia al cobre A que se puede obtener del depósito CBS 134400, v) un polipéptido que tiene una secuencia que tiene al menos el 70 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, y/o vi) un polipéptido que tiene una secuencia que tiene al menos el 70 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 4.

En determinadas realizaciones, el polipéptido aislado (en particular el de la alternativa v) anterior) es un polipéptido que tiene una secuencia que tiene al menos el 75 % (en particular al menos el 80 %, en especial, al menos el 90 %, en particular al menos el 95 %) de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 2.

En determinadas realizaciones, el polipéptido aislado es una ATPasa de tipo P de translocación de cobre que tiene una secuencia que tiene al menos el 70 % (en particular al menos el 75 %, 80 %, 90 % o 95 %) de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, y/o que se puede obtener del depósito CBS 134400.

En determinadas realizaciones, el polipéptido aislado (en particular el de la alternativa vi) anterior) es un polipéptido que tiene una secuencia que tiene al menos el 75 % (en particular al menos el 80 %, en especial, al menos el 90 %, en particular al menos el 95 %) de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 4.

En determinadas realizaciones, el polipéptido aislado es una proteína de resistencia al cobre que tiene una secuencia que tiene al menos el 70 % (en particular al menos el 75 %, 80 %, 90 % o 95 %) de identidad con la secuencia de la Se Q ID NO: 4, y/o que se puede obtener del depósito CBS 134400.

En un duodécimo aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado seleccionado de un ácido nucleico i) que codifica un polipéptido de acuerdo con los puntos i), iii) o v) del undécimo aspecto; ii) que codifica un polipéptido de acuerdo con los puntos ii), iv) o vi) del undécimo aspecto; iii) que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 (ctpA); iv) que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3 (copA); v) que tiene una secuencia que tiene al menos el 99 % de identidad con una secuencia como se define en cualquiera de los puntos i) y iii) del duodécimo aspecto anteriores; vi) que tiene una secuencia que tiene al menos el 99 % de identidad con una secuencia como se define en cualquiera de los puntos ii) y iv) del duodécimo aspecto anteriores; vii) que codifica el mismo péptido que una secuencia como se define en uno cualquiera de los puntos i) a vi) del duodécimo aspecto anteriores; y/o viii) capaz de hibridar en condiciones rigurosas con un ácido nucleico como se define en uno cualquiera de los puntos i) a vii) del duodécimo aspecto anteriores.

En una realización particular, el ácido nucleico aislado es capaz de hibridar en condiciones rigurosas con un ácido nucleico, cuya secuencia es la SEQ ID NO: 1.

En una realización particular, el ácido nucleico aislado es capaz de hibridar en condiciones rigurosas con un ácido nucleico, cuya secuencia es la SEQ ID NO: 3.

En realizaciones particulares, el ácido nucleico aislado es capaz de hibridar en condiciones rigurosas con un ácido nucleico, cuya secuencia tiene al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

En realizaciones particulares, el ácido nucleico aislado es capaz de hibridar en condiciones rigurosas con un ácido nucleico, cuya secuencia codifica el mismo péptido que una secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

La materia objeto del undécimo y el duodécimo aspecto está estrechamente relacionada con otros aspectos en el presente documento, dado que se considera que desempeña un papel importante en la resistencia al cobre de, por ejemplo, la cepa bacteriana AZ78. Sin pretender quedar ligados a teoría alguna, los presentes inventores suponen que el producto del gen ctpA está implicado en la desintoxicación de la célula bacteriana y actúa bombeando iones de cobre hacia afuera de la célula bacteriana - y que el gen copA codifica una cobre oxidasa que está implicada en la oxidación de los iones de cobre. Por consiguiente, dichos genes y proteínas pueden emplearse ventajosamente, por ejemplo, en diversas otras bacterias Lysobacter o bacterias Lysobacter capsici. Las bacterias Lysobacter que comprenden una o más de dichas secuencias de nucleótidos y/o polipéptidos se contemplan adicionalmente como realizaciones en el presente documento. Asimismo, en realizaciones preferentes en el presente documento, las bacterias de la invención comprenden un gen ctpA y/o su producto génico. Asimismo, en realizaciones preferentes en el presente documento, las bacterias de la invención comprenden un gen copA y/o su producto génico. Asimismo, en realizaciones preferentes en el presente documento, las bacterias de la invención comprenden un gen copA y un gen ctpA y/o sus productos génicos.

Como se describe anteriormente, la cepa de Lysobacter capsici AZ78 se ha depositado en el CBS y se le ha asignado el número de referencia CBS 134400.

Por consiguiente, en general, en determinadas realizaciones en el presente documento, la referencia a una cepa AZ78, una Lysobacter capsici AZ78, una cepa de Lysobacter capsici AZ78 y expresiones similares, pueden reemplazarse por la referencia a la cepa del CBS 134400, una Lysobacter capsici del CBS 134400, una cepa Lysobacter capsici del CBS 134400 y expresiones similares. Asimismo, en realizaciones particulares de la presente invención, la referencia a una cepa AZ78, una Lysobacter capsici AZ78, una cepa de Lysobacter capsici AZ78 y expresiones similares, pueden reemplazarse por la referencia a una cepa depositada como CBS 134400, una Lysobacter capsici depositada como CBS 134400, una cepa de Lysobacter capsici depositada como CBS 134400 y expresiones similares.

Lo anterior también se aplica de manera explícita a las respectivas bacterias y preparaciones bacterianas en contexto con la presente invención.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar adicionalmente, pero no a limitar, la invención. Los ejemplos comprenden características técnicas, y se apreciará que la invención también se refiere a cualquiera de las combinaciones de las características técnicas presentadas en esta sección de ejemplos.

Ejemplo 1: Materiales y métodos ejemplares

a. Microorganismos y plantas

Lysobacter capsici AZ78 se almacenó a largo plazo en glicerol al 40 % a -80 °C y se cultivó de manera rutinaria en agar Luria Bertani (LBA, forma siglada de Luria Bertani Agar) en placas de Petri (90 mm de diámetro) a 27 °C. En cada experimento, se prepararon suspensiones de células AZ78 de acuerdo con el siguiente procedimiento: se cultivó AZ78 durante 72 h y después se recogieron células bacterianas en 5 ml de solución salina estéril (NaCl al 0,85 %) y se transfirieron a tubos estériles de 15 ml. Las suspensiones de células bacterianas se centrifugaron (10000 rpm, 5 min) y los sedimentos se suspendieron en agua destilada estéril hasta una densidad óptica final a 600 nm (A^do600 nm) de 0­ 1, lo que corresponde a “ 1*10⁸ UFC ml^{' 1}. Esta concentración bacteriana se utilizó en todos los experimentos.

Todos los experimentos en relación con el control biológico de Plasmopara viticola se llevaron a cabo en plantas de dos años del cultivar de vid susceptible Vitis vinifera cv. Pinot Noir injertado en portainjerto Kober 5BB. Las plantas se cultivaron en condiciones controladas de invernadero (20 ± 0,5 °C; humedad relativa (HR) del 70 ± 10 % en macetas de 2,5 l que contenían una mezcla de turba y piedra pómez (3:1) durante dos meses, hasta que las plantas hubieren producido dos brotes con al menos nueve hojas cada uno.

La actividad de biocontrol de Lysobacter capsici AZ78 con respecto a Phytophthora infestans se ha evaluado en experimentos llevados a cabo en plántulas de tomate (Solanum lycopersicum cv. Tondo rosso). En cada experimento, las semillas de tomate se dejaron pregerminar manteniéndolas a temperatura ambiente sobre papel de filtro estéril en placas de Petri, hasta que la raíz se hizo visible (96 h). Después, las semillas pregerminadas se sembraron en macetas estériles de 50 ml que contenían turba estéril y se cultivaron a 25 °C en un invernadero limpio con un fotoperíodo de 16 h. Las plántulas de tomate se emplearon en experimentos de biocontrol de Phytophthora infestans cuando se produjeron cuatro hojas (aproximadamente un mes después de la plantación).

Plasmopara viticola se aisló en 2011 de un viñedo no tratado en S. Michele all'Adige (Italia) y se mantuvo en plantas de vid mediante inoculaciones semanales posteriores. Para obtener esporangios, las plantas con síntomas de manchas de aceite se mantuvieron durante una noche en oscuridad a 20-21 °C y HR del 100 %. Se preparó un inóculo de Plasmopara viticola lavando el lado inferior de las hojas de vid que presentaban lesiones de esporulación recientes con agua destilada fría (4-5 °C). Phytophthora infestans se mantuvo sobre agar guisante (125 g de guisantes congelados, agar al 1,5 % por litro de agua destilada) a 17 °C. Se recogieron esporangios recientes de placas inoculadas añadiendo agua destilada fría a las placas y raspando la superficie miceliar utilizando espátulas estériles. En ambos casos, la suspensión de esporangios se ajustó a una concentración de 2*10⁵ esporangios ml^-1 mediante el recuento con un hemocitómetro en el microscopio óptico.

b) Determinación de la resistencia de AZ78 al cobre

La capacidad de AZ78 para sobrevivir en medio agar modificado con iones de cobre (Cu2+) se evaluó de acuerdo con Ritchie y Dittapongpitch (1991), con algunas modificaciones. Brevemente, se añadieron al LBA volúmenes de una solución de sulfato de cobre esterilizada por filtro (CuSCM, Sigma) y después se vertió en placas de Petri para obtener las siguientes concentraciones finales de CuSO⁴ : 100, 200, 300, 400 y 50o mg ml^-1. Para cada concentración de cobre, se inocularon de forma puntual tres placas de Petri, con tres gotas (30 ml) de una suspensión de células AZ78 (1x10⁸ UFC ml^-1), y las placas se incubaron durante 72 h a 27 °C. El desarrollo de macrocolonias en el medio reflejó la capacidad de AZ78 para tolerar concentraciones crecientes de cobre (Ritchie y Dittapongpitch, 1991). Se obtuvo la confirmación del grado de resistencia al cobre extendiendo 100 ml de una dilución en serie (10^-1 a 10^-7) de la suspensión de células AZ78 sobre el LBA y el LBA modificado con sulfato de cobre a las concentraciones mencionadas anteriormente. Se recontaron las unidades formadoras de colonias después de un período de incubación de cuatro días a 27 °C. Se prepararon tres placas de cada combinación (dilución y concentración de cobre) y el experimento se repitió dos veces. La tasa de supervivencia (RS) se obtuvo dividiendo la población tratada (crecida en LBA modificado con CuSO⁴) por la población sin tratar (cultivada solo en LBA), de acuerdo con Stockwell et al., (2009).

El ADN genómico de AZ78 se extrajo con un kit de aislamiento de ADN genómico (Qiagen) y se utilizó como molde en las reacciones de PCR destinadas a detectar la presencia de genes implicados en la resistencia a los iones de cobre. Se adoptó el método desarrollado por De la Iglesia et al., (2010) y Pavissich et al., (2010) para detectar el gen ctpA que codifica ATPasas de cobre de tipo P^ib-, que están implicadas en la salida de cobre, y se empleó el método desarrollado por Lejon et al. (2007) para la detección del gen copA, que codifica una oxidasa de cobre. En las reacciones de PCR se utilizaron las parejas de cebadores copAUF (5'-GGT GCT GAT CAT CGC CTG-3') / copAUR (5'-GGG CGT CGT TGA TAC CGT-3'), Coprun F2 (5'-GG SA SBTACTGGTRBCAC-3')/Coprun R1 (5'-Tg NGHCATCATSGTRTCRTT-3') (secuencias de los cebadores: véanse las SEQ ID NO 14-17) y la misma composición de la mezcla y ciclos de temperatura que informaron respectivamente Pavissich et al., (2010) y Lejon et al., (2007). Los productos de PCR se purificaron utilizando Exo-Sap (Euroclone Spa, Italia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez purificados, se secuenciaron los amplicones de ADN utilizando BigDye Terminator v 3.1 y las secuencias de nucleótidos resultantes se analizaron mediante búsqueda BLASTN para encontrar homologías con secuencias de ADN ya depositadas en GenBank. Sobre la base de las homologías de ADN se diseñaron nuevas combinaciones de parejas de cebadores, para obtener la secuencia de nucleótidos completa de ctpA y copA en Lysobacter capsici AZ78. Los experimentos se llevaron a cabo dos veces.

c) Experimentos de control biológico

i) Se evaluó la capacidad de AZ78 para controlar el mildiu en plantas de vid en condiciones controladas de invernadero. Además, en estos experimentos se evaluó AZ78 en combinación con un fungicida a base de cobre (Kocide 3000, hidróxido de cobre al 15 % GD, Du Pont de Nemours, EE. UU.) a dosis bajas. Se aplicaron los siguientes tratamientos: A) sin tratar; B) Kocide 3000 a 2,5 g l-1; C) Kocide 3000 a 1,25 g l-1; D) Kocide 3000 a 0,6125 g l-1; E) AZ78 Kocide 3000 a 1,25 g l-1; F) AZ78 Kocide 3000 a 0,6125 g l-1; G) AZ78.

Las superficies de las hojas superior e inferior de las plantas se pulverizaron dos veces con suspensión celular de AZ78, 24 y 6 h antes de la inoculación de Plasmopara viticola, utilizando un dispositivo de pulverización manual (tratamientos E, F y G), y con agua (control sin tratar) y Kocide 3000 (tratamientos B, C, D, E y F) seis horas antes de la aplicación del patógeno, utilizando un pulverizador manual de aire comprimido. Cada planta se pulverizó con 40 ml de cada preparación de tratamiento.

El inóculo de Plasmopara viticola, preparado como se describe anteriormente, se roció sobre la superficie abaxial de cada hoja completamente extendida utilizando un pulverizador manual de aire comprimido. Las plantas inoculadas se incubaron posteriormente a 20 ± 0,5 °C (HR del 80-99 %) en oscuridad durante 24 h, después se mantuvieron a 25 °C (HR del 60-80 %) con un régimen de luz de día/noche de 16/8 h. Siete días después de la inoculación, las plantas se incubaron durante una noche en oscuridad a 20 ± 0,5 °C y HR al 80-99 % para estimular la esporulación.

La gravedad de la enfermedad (porcentaje del área abaxial foliar cubierta con lesiones de esporulación) y la incidencia de la enfermedad (porcentaje de hojas con esporulación visible) se evaluaron al final de los experimentos (véase, por ejemplo, la Figura 3A). La enfermedad se evaluó en términos de variables cuantitativas continuas basadas en la escala convencional de la EPPO (forma siglada European and Mediterranean Plant Protection Organization: Organización Europea y Mediterránea de Protección de Plantas) (EPPO, 2004) y se expresó como porcentajes. Cada tratamiento se llevó a cabo con cinco repeticiones (plantas) y se llevaron a cabo experimentos independientes tres veces.

ii) El control biológico del tizón tardío del tomate mediante la aplicación de AZ78 se evaluó en condiciones controladas de invernadero. También en este caso, AZ78 se empleó en combinación con Kocide 3000. Se aplicaron los siguientes tratamientos: 1) sin tratar; 2) Kocide 3000 a 2,5 g l-1; 3) Kocide 3000 a 0,6125 g l-1; 4) AZ78 Kocide 3000 a 0,6125 g l-1; 5) AZ78. Las superficies de las hojas superior e inferior de plantas de tomate se pulverizaron dos veces con suspensión celular de AZ78, 24 y 6 h antes de la inoculación de Phytophthora infestans, utilizando un dispositivo de pulverización manual (tratamientos 3, 4 y 5) y con agua (1) y Kocide 3000 (tratamientos 2, 3 y 4) seis horas antes de la aplicación del patógeno, utilizando un pulverizador manual de aire comprimido. Cada planta se pulverizó con 20 ml de cada preparación de tratamiento. El inóculo de Phytophthora infestans, preparado como se describe anteriormente, se pulverizó sobre toda la planta de tomate. Las plantas se mantuvieron a una HR del 100 % en oscuridad a 18 °C durante 24 horas, y después se colocaron en una cámara de cultivo a 18 °C. Después de 5 días se puntuaron las hojas de tomate y se evaluaron la gravedad de la enfermedad (porcentaje de área foliar que presenta síntomas) y la incidencia de la enfermedad (porcentaje de hojas sintomáticas) al final de los experimentos (véase, por ejemplo, la Figura 3B). Cada tratamiento se llevó a cabo con cinco repeticiones (plantas) y se llevaron a cabo experimentos independientes tres veces.

Las poblaciones de AZ78 en las hojas de vid y de tomate se controlaron una hora antes de la inoculación de los oomicetos patógenos de las plantas y al final de los experimentos mediante el método de dilución en placas. En estos dos puntos de tiempo, se recogieron muestras de hojas de 5 g de plantas de cada tratamiento. Se cortaron y se pusieron de manera individual en frascos de 100 ml que contenían 45 ml de solución salina estéril, y se agitaron (200 rpm) durante dos horas a temperatura ambiente. Se diluyeron en serie alícuotas de las suspensiones y se extendieron sobre la superficie del LBA modificado con kanamicina (50 mg ml'1), dado que AZ78 es resistente de forma natural a este antibiótico (no publicado). Después, se incubaron las placas durante 72 h a 27 °C y se recontaron las colonias resistentes a la kanamicina con morfología de colonias de AZ78 para determinar la cantidad de células AZ78 g-1 en las hojas de vid y tomate. El experimento se repitió.

d) Persistencia de AZ78 sobre hojas de vid

Se llevaron a cabo experimentos en invernaderos para controlar la persistencia de AZ78 sobre hojas de vid en dos niveles de HR. Se pulverizaron diez plantas de vid una vez con suspensión AZ78 siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Durante los siguientes diez días, la mitad de las plantas tratadas con AZ78 se mantuvieron a 25 °C (HR del 70 ± 10 %) y la otra mitad se mantuvo a la misma temperatura pero a una HR del 90 ± 10 %. A los 1, 3, 6, 8 y 10 días posaplicación, la persistencia de AZ78 en las hojas de vid se evaluó mediante el método de dilución en placa descrito anteriormente. El experimento se repitió.

e) Producción de biopelículas en una placa de microtitulación.

La cepa AZ78 se evaluó en cuanto a su capacidad para formar biopelículas sobre placas de microtitulación de poliestireno, utilizando una versión modificada del procedimiento descrito por Maddula et al., (2006). Se inoculó un volumen de 1,5 ml de suspensión de AZ78 en 150 ml por pocillo de tres medios líquidos, LB, King B (KB) y caldo nutritivo (NB, forma siglada del inglés Nutrient Broth), en placas de poliestireno de 96 pocillos. Como controles negativos se dejaron pocillos adicionales sin inocular con la bacteria. Las placas se incubaron a 27 °C durante 60 h sin agitación y se determinaron las densidades celulares finales (A^do600 nm)- Las células no unidas se eliminaron invirtiendo la placa y golpeándola sobre papel absorbente. Las células bacterianas adherentes restantes se fijaron a las placas durante 2o min a 50 °C y después se tiñeron durante 1 min con 150 ml por pocillo de solución de cristal violeta (al 0,1 % en agua destilada estéril). El exceso de tinción se eliminó invirtiendo la placa y lavando a continuación dos veces con agua destilada (250 ml por pocillo cada lavado). Las células adherentes se decoloraron con una solución de acetona/etanol (20%/80%) (200 ml por pocillo) durante 5 min para liberar el colorante en la solución. Se transfirió un volumen de 100 ml de cada pocillo a otra placa de 96 pocillos y se cuantificó la cantidad de colorante (que es proporcional a la densidad de las células adherentes) (ADO⁵⁴⁰nm). En el experimento de curso del tiempo se utilizó una placa de poliestireno de 96 pocillos para cada punto de tiempo. En cada placa de microtitulación se llenaron veinte pocillos con cada uno de los medios de cultivo analizados. Las células AZ78 se inocularon de manera simultánea en la mitad de los pocillos que contenían los medios de cultivo. La densidad celular y la formación de biopelícula se determinaron en el tiempo cero y en intervalos de 12 h hasta 60 h después de la inoculación (seis puntos de tiempo). Los valores de A^do540 nm (células adherentes) se dividieron por los valores de A^do6oo nm (crecimiento bacteriano) para obtener el valor específico de formación de biopelícula (FEB). El experimento se repitió.

f) Evaluación de la tolerancia de AZ78 a estreses ambientales

Se llevaron a cabo experimentos de respuesta al estrés en suspensiones de AZ78 de acuerdo con Stockwell et al., (2005, 2009) con algunas modificaciones. Brevemente, la tolerancia al estrés por inanición se evaluó inoculando AZ78 en tubos estériles de 15 ml que contenían 5 ml de tampón de fosfato de potasio estéril (1 mM, pH 7) y NaCl al 0,8 % para obtener una concentración final de 1*10⁸ UFC ml^-1. Los tubos inoculados se mantuvieron a 27 °C durante 15 días en un agitador rotatorio a 200 rpm. La densidad de células AZ78 se evaluó mediante el método de dilución en placas a los 0, 3, 6, 9, 12 y 15 días posinoculación. La RS se calculó dividiendo la población en los días 3, 6, 9, 12 y 15 por la población al comienzo del experimento (0 días después de la inoculación). Se inocularon tres tubos por cada día.

La tolerancia al choque térmico leve se midió incubando tubos de microcentrífuga de 1,5 ml estériles que contenían 100 ml de suspensión de células AZ78 durante 20 min a las siguientes temperaturas: 30, 33, 36, 39 y 42 °C. Después de este período, se añadió un volumen de 900 ml de tampón de fosfato de potasio (1 mM, pH 7) y la suspensión se mezcló en un agitador vorticial durante 30 s antes de la dilución en placas. La RS se calculó dividiendo la población de AZ78 después de la exposición a cada temperatura por la población después de la exposición a 27 °C. Se utilizaron tres tubos de microcentrífuga para cada temperatura.

La tolerancia a la congelación se evaluó transfiriendo alícuotas de 100 ml de suspensión de células AZ78 a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml estériles que se mantuvieron a -20 °C durante 24 h. La viabilidad de las células AZ78 se evaluó a las 6, 12, 18 y 24 h. En estos puntos de tiempo, se añadió un volumen de 900 ml de tampón fosfato 10 mM (pH 7) a cada tubo, inmediatamente después de retirarlo del congelador. Las muestras se mezclaron suavemente mediante pipeteo y se diluyeron en serie en SS estéril (10^-1 a 10^-7). Se extendió un volumen de 100 ml de estas diluciones sobre LBA y se recontaron las colonias numerables después de cuatro días de incubación a 27 °C. Se utilizaron tres tubos de microcentrífuga para cada punto de tiempo. La RS se calculó dividiendo la población después de la exposición a -20 °C por la población que no estuvo expuesta a la congelación.

Para evaluar la tolerancia a la radiación ultravioleta, se extendieron diluciones de la suspensión de células AZ78 (10^-1 a 10^-7) sobre LBA e inmediatamente se expusieron a radiación UV (A de 254 nm) a las siguientes dosis: 20, 40, 60, 80 y 100 J m^-2. Después de la exposición, las placas se incubaron a 27 °C en oscuridad durante cuatro días, después de lo cual se recontaron las unidades formadoras de colonias. Se utilizaron tres repeticiones (placas de Petri) para cada dilución. La RS se calculó dividiendo la población después de la exposición a radiación UV por la población de células AZ78 que no estuvieron expuestas a UV.

Todos los experimentos descritos anteriormente se llevaron a cabo al menos dos veces.

g) Análisis estadístico

Se realizó un ANOVA bidireccional sobre los datos de los experimentos llevados a cabo para evaluar la capacidad de formar biopelículas (A^do6oo nm y FEB) y para tolerar iones de cobre y estreses ambientales (RS), para observar si estos datos podían agruparse. Los valores de RS obtenidos de los experimentos que evalúan la tolerancia al estrés abiótico y los iones de cobre se transformaron a log1o de antemano.

Una vez agrupados, se analizaron los datos mediante ANOVA utilizando el programa informático Statistica 7.1 (StatSoft, Tulsa, OK, EE. UU.) y las medias se compararon con una prueba de Tukey (a = 0,01).

Los valores de incidencia de la enfermedad y de gravedad de la enfermedad obtenidos de los ensayos en invernadero se transformaron por arcosina antes del ANOVA bidireccional. Una vez agrupados, los datos se analizaron de acuerdo con el método estadístico mencionado anteriormente.

Ejemplo 2:

Lysobacter capsici AZ78 desarrolló macrocolonias cuando se aplicó de forma puntual en LBA modificado con cobre a concentraciones que variaban de 100 a 500 mg ml-1. Experimentos adicionales demostraron que la modificación con sulfato de cobre del LBA disminuyó la densidad de células AZ78 diez veces solo cuando la concentración final fue de 500 mg ml-1 (Figura 1). Una concentración de 400 mg ml-1 dio como resultado un valor logarítmico de RS de -0,42 ± 0,16, mientras que las concentraciones más bajas no provocaron ninguna disminución particular en la viabilidad de las células AZ78 (Figura 1). Las AZ78 liberaron un pigmento marrón en el medio cuando se cultivaron en LBA modificado con CuSO4 a concentraciones de 400 y 500 mg ml-1 (datos no mostrados).

Ejemplo 3:

La PCR para detectar la región de ADN asociada con la ATPasa de tipo P^ib de translocación de cobre (gen ctpA) dio como resultado la amplificación de un amplicón de 726 pb. El amplicón se secuenció y la región de nucleótidos resultante se analizó mediante BLASTN. El mayor valor de homología se encontró con el gen que codifica una ATPasa de tipo P^ib a partir del genoma completo de Pseudoxanthomonas suwonensis, una especie bacteriana relacionada desde el punto de vista taxonómico con el género Lysobacter. Se amplificó una región de 1107 pb utilizando la pareja de cebadores específicos para el gen copA. Esta secuencia mostró la mayor homología con el gen que codifica una cobre oxidasa a partir del genoma completo de Stenotrophomonas malthophilia cepa JV3. Sobre la base de estas homologías, se diseñaron nuevas parejas de cebadores para obtener la secuencia de nucleótidos completa de ctpA y copA en Lysobacter capsici AZ78.

Ejemplo 4:

En vista de estos resultados, Lysobacter capsici AZ78 se evaluó sola y en combinación con una dosis baja del fungicida a base de cobre Kocide 3000, utilizado para controlar a P. viticola, en condiciones ambientales controladas (invernadero). Se registró una gran reducción de la gravedad del mildiu después de aplicar AZ78 a las hojas de vid. Cuando las plantas se trataron solo con AZ78, el porcentaje medio del área foliar cubierta con lesiones de esporulación fue del 5 %, mientras que la media para las hojas sin tratar fue del 67 % (Tabla 1). Con respecto a la incidencia de la enfermedad, el porcentaje de hojas con esporulación visible fue menor en las plantas tratadas con AZ78 que en las plantas tratadas solo con agua (100 %), pero no fue significativamente distinto de las plantas tratadas con cobre (Tabla 1). Los síntomas fueron evidentes en el 63 % de las hojas de las plantas tratadas con AZ78, mientras que en las plantas tratadas con cobre a las diversas dosis (2,5, 1,25 y 0,6125 g l-1), el 73, 76 y 83 % de las hojas, respectivamente, fueron sintomáticas (Tabla 1). La reducción en la gravedad de la enfermedad resultante de la aplicación de AZ78 no fue significativamente distinta de la reducción efectuada por el cobre (Kocide 3000) a las diversas dosis (Tabla 1). Sin embargo, la combinación de AZ78 y cobre en dosis bajas (1,25 y 0,6125 g l-1) redujo la incidencia de la enfermedad en mayor medida que cuando las diversas concentraciones de cobre o AZ78 se aplicaron solas (Tabla 1). La gravedad de la enfermedad, por otro lado, no se redujo significativamente mediante la combinación, en comparación con las plantas tratadas con AZ78 o cobre solo (Tabla 1). Los resultados ejemplares de estos experimentos se representan adicionalmente en las Figuras 2 y 3A.

Tabla 1

Tratamientos ^{Incidencia de la Gravedad de la} _{enfermedadb enfermedadb} Sin tratara 100 ± 3 a 67 ± 27 a Kocide 3000 (2,5 g l-1) 63 ± 16 b 3 ± 2 b Kocide 3000 (1,25 g l-1) 66 ± 10 b 8 ± 22 b Kocide 3000 (0,6125 g l-1) 73 ± 11 b 5 ± 5 b Lysobacter capsici AZ78 Kocide 3000 (1,25 g l-1) 30 ± 14 c 2 ± 2 b Lysobacter capsici AZ78 Kocide 3000 (0,6125 g l-1) 39 ± 13 c 1 ± 1 b Lysobacter capsici AZ78 63 ± 9 b 5 ± 5 b Biocontrol de Plasmopara vitícola a través de la aplicación profiláctica de Lysobacter capsici AZ78 sobre hojas de vid. La incidencia de la enfermedad se expresa como el porcentaje de hojas sintomáticas, mientras que la gravedad de la enfermedad se expresa como el porcentaje de área foliar cubierta con lesiones de esporulación.

aSin tratar: plantas tratadas solo con agua.

bSe informan para cada tratamiento los valores medios ± desviaciones típicas. Las mismas letras indican valores que no difieren significativamente, de acuerdo con la prueba de Tukey (a =0,01).______________________________

Al mismo tiempo, la combinación de Lysobacter capsici AZ78 con Kocide 3000 se evaluó también para el control de Phytophthora infestaos en plantas de tomate. Se observó una reducción importante en la gravedad del tizón tardío del tomate en plantas de tomate tratadas con AZ78 en comparación con plantas de tomate sin tratar (Tabla 2). La aplicación solo de AZ78 determinó una reducción de la incidencia de la enfermedad y de la gravedad de la enfermedad igual a la reducción lograda mediante el empleo de Kocide 3000 en dosificaciones bajas (0,6125 g l-1) (Figuras 3B y 4). Se registró un aumento en el control de Phytophthora infestaos cuando AZ78 se combinó con Kocide 3000 a dosis bajas, obteniendo una reducción de la incidencia de la enfermedad no estadísticamente distinta de la reducción obtenida con Kocide 3000 a dosis altas (2,5 g l-1) (Figura 4; Tabla 2).

Tabla 2

^{Incidencia de la} Gravedad de la Tratamientos _enfermedadb enfermedadb Sin tratara 96 ± 6 a 100 ± 0 a Kocide 3000 (2,5 g l-1) 0 ± 0 b 0 ± 0 c Kocide 3000 (0,6125 g l-1) 6 ± 4 b 13 ± 5 b Lysobacter capsici AZ78 Kocide 3000 (0,6125 g l-1) 1 1 b 2 ± 1 c Lysobacter capsici AZ78 5 ± 4 b 17 ± 6 b Biocontrol de Phytophthora infestaos a través de la aplicación profiláctica de Lysobacter capsici AZ78 sobre hojas de tomate. La incidencia de la enfermedad se expresa como el porcentaje de hojas sintomáticas, mientras que la gravedad de la enfermedad se expresa como el porcentaje de área foliar que presenta síntomas.

aSin tratar: plantas tratadas solo con agua.

bSe informan para cada tratamiento los valores medios ± desviaciones típicas. Las mismas letras indican valores que no difieren significativamente, de acuerdo con la prueba de Tukey (a = 0,01).__________________________

En ninguno de los dos puntos de tiempo se aislaron células de AZ78 de las hojas de plantas de vid y tomate tratadas con agua o de las hojas de plantas tratadas solo con las distintas dosis de Kocide 3000, pero sí se recuperaron de hojas de plantas tratadas con AZ78. Se recuperó una población de AZ78 de 5,07 ± 0,16 log10 de UFC g-1 de hoja, de hojas de vid recogidas una hora antes de la inoculación de Plasmopara viticola y al final del ensayo se obtuvo un tamaño de población similar (5,22 ± 0,02 log10 de UFC g-1 de hoja). En plantas tratadas tanto con AZ78 como con cobre, se registró una reducción de un orden de magnitud del tamaño de la población de AZ78. Al final de los experimentos, la bacteria se recuperó a 4,36 ± 0,12 y a 4,28 ± 0,14 log10 de UFC g-1 de hoja en las plantas tratadas con cobre a dosis de 1,25 y a 0,6125 g l-1, respectivamente. Se lograron resultados similares en los experimentos de biocontrol para el tizón tardío del tomate.

Ejemplo 5:

En los experimentos que evalúan la persistencia de AZ78 sobre hojas de vid durante diez días, se recuperó AZ78 un día después de la aplicación a 5,41 ± 0,07 y 6,57 ± 0,50 log10 de UFC g-1 de hoja de plantas mantenidas a una humedad relativa normal (60-80 %) y alta (80-99 %), respectivamente (véase la figura 5). AZ78 persistió a una tasa constante durante 10 días en las plantas expuestas a alta humedad (6,47 ± 0,16 log10 de UFC g-1 de hoja después de diez días) mientras que a una humedad normal la población de AZ78 fue constante hasta el 6° día posinoculación y después disminuyó a 2,39 ± 0,04 log10 de UFC g-1 de hoja después de 8 días; AZ78 todavía estaba presente después de diez días, pero en una baja concentración (2,24 ± 0,24 log10 UFC g-1 de hoja).

Ejemplo 6:

Dadas estas altas tasas de supervivencia, los presentes inventores investigaron la capacidad de AZ78 para formar biopelículas en superficies inertes. La cepa AZ78 se cultivó de manera distinta en los tres medios utilizados en el ensayo de producción de biopelículas y se descubrió que KB era el medio que sustentaba la producción más alta de células con un valor de A^do600 nm (Figura 6A). El crecimiento bacteriano en los otros dos medios líquidos, LB y NB, fue casi idéntico, y después de 60 h AZ78 alcanzó la A^do6oo nm (Figura 6A). No obstante, en este momento, el valor de FEB registrado en NB fue mayor que la cantidad alcanzada en LB (Figura 6B). No se produjo biopelícula en LB hasta las 48 h y alcanzó su valor más alto (FEB = 2,62 ± 0,04) después de 60 h; AZ78 comenzó a formar biopelícula entre las 24 y las 36 h en NB (Figura 6B); el valor más alto de FEB en KB se alcanzó a las 12 h y a partir de entonces disminuyó (Figura 6B).

Ejemplo 7:

Los presentes inventores buscaron explicar la alta persistencia sobre las hojas de vid investigando la resistencia de AZ78 a distintos estreses abióticos en una serie de experimentos in vitro. En el primer conjunto de experimentos, dirigido a evaluar la resistencia a la inanición, se incubó AZ78 en tampón fosfato y la concentración se controló durante quince días. La viabilidad de las células AZ78 disminuyó lentamente y al final de los experimentos la reducción total era de 0,70 ± 0,13 log-io de UFC ml^-1. Se indujo un choque térmico leve exponiendo la suspensión de células AZ78 a temperaturas que variaban de 30 a 42 °C durante veinte minutos. La exposición a 30 y 33 °C no dio como resultado ninguna pérdida de viabilidad celular, mientras que la exposición a 36, 39 y 42 °C redujo la viabilidad en logio -0,19 ± 0,06, -0,12 ± 0,08 y -0,35 ± 0,18, respectivamente.

La incubación a -20 °C disminuyó ligeramente la viabilidad de las células AZ78, aunque en menos de un orden de magnitud en todos los puntos de tiempo de este experimento y las diferencias no fueron significativas (Figura 7A). Con respecto a la tolerancia de AZ78 a la radiación de luz UV, la tasa de supervivencia disminuyó drásticamente cuando la cepa se expuso a 60, 80 y 100 J m^-2, siendo la reducción de casi seis veces diez, mientras que la exposición a 20 y 40 J m^-2 redujo la viabilidad en log¹o-1 y log¹o-3, respectivamente (Figura 7B).

Ejemplo 8: Conclusiones y ejemplos y consideraciones adicionales

La identificación de microorganismos novedosos capaces de controlar de manera eficaz a Plasmopara viticola y Phytophthora infestans, puede desempeñar un papel importante en la reducción del impacto perjudicial en el medio ambiente resultante del uso frecuente de fungicidas/productos fitosanitarios para el control del mildiu de la vid y el tizón tardío del tomate o la patata. Según el conocimiento de los inventores, Lysobacter capsici AZ78 es una de las pocas cepas bacterianas que se utilizan como agentes de control biológico para el control del mildiu de la vid (Tilcher et al., 1994, 2002). Sobre la base de este conocimiento, el estudio de los inventores, por ejemplo, proporciona la primera prueba de tolerancia al cobre en un miembro de género Lysobacter. Sin pretender quedar ligados a teoría alguna, esta característica probablemente está asociada con la presencia de dos genes implicados en la resistencia al cobre. Un primer gen en el genoma AZ78 muestra una alta homología de secuencia con un gen que codifica una ATPasa de cobre de tipo P^ib, que está presente en el genoma de Pseudoxanthomonas suwonensis, otro miembro de la familia Xanthomonadaceae. Estas ATPasas pertenecen a las ATPasas transportadoras de metales pesados, proteínas de membrana ubicuas que participan en la salida de iones de cobre en diversos microorganismos (Fu et al., 1995; Ge et al., 1995; Petersen y Moller, 2000; Arguelo et al., 2007). Un segundo gen muestra altas homologías con un gen que codifica una cobre oxidasa presente en el genoma de Stenotrophomonas malthophilia JV3. El gen copA codifica enzimas que están implicadas en los mecanismos de secuestro de cobre y/o transformación de cobre compartidos por varias especies bacterianas (Cooksey, 1994; Rensing y Grass, 2003)

Esta característica es notable ya que el cobre se aplica de rutina en el control de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans, y la existencia de un agente de biocontrol/producto fitosanitario que tolere los iones de cobre abre la posibilidad de combinar este agente con bajas dosis de cobre para reducir el uso de fungicidas a base de cobre en cultivos orgánicos (Dagostin et al., 2011). Los presentes inventores descubrieron que la aplicación simultánea de AZ78 y cobre potenciaba la protección de las plantas contra Plasmopara viticola y Phytophthora infestans en comparación con la aplicación de AZ78 o cobre solos. Por otra parte, la aplicación de cobre a las plantas tratadas con AZ78 redujo la población de células AZ78 en un orden de magnitud, lo que demuestra que la disminución en la viabilidad celular observada in vitro se conservada parcialmente in planta.

La aplicación de células AZ78 a las hojas de vid, por ejemplo, dio como resultado una reducción del porcentaje del área abaxial de la hoja cubierta por lesiones esporulantes de Plasmopara viticola, comparable al que sigue a la aplicación de un fungicida a base de cobre (nota general: la expresión "fungicida a base de cobre" se utiliza de manera equivalente en el presente documento con la expresión "producto fitosanitario a base de cobre"). Aunque esto no se considera de particular importancia en la práctica de la presente invención, puede ser interesante realizar en el futuro investigaciones para investigar los mecanismos subyacentes a la capacidad de Lysobacter capsici AZ78 para controlar, por ejemplo, el mildiu de la vid in planta y si estos mecanismos se modulan cuando la bacteria está en presencia de fungicidas a base de cobre.

Las poblaciones de AZ78 sobre las hojas de vid en condiciones controladas fueron similares al comienzo y al final de los experimentos de biocontrol. En determinados experimentos simultáneos dirigidos a controlar la persistencia de las células AZ78 sobre las hojas de vid, los presentes inventores demostraron que la población de AZ78 permanece constante hasta seis días después de la aplicación a plantas mantenidas a 25 °C con una HR de 60-80 %. Sin embargo, hubo algunas diferencias entre el grado de persistencia medido en los experimentos de biocontrol y el medido en los experimentos diseñados específicamente para evaluar la persistencia de AZ78. En estos últimos experimentos, la población de AZ78 disminuyó a lo largo de 8 días de 105 a 102 células por gramo de hoja, mientras que después del mismo período se recuperaron de las plantas de los experimentos de biocontrol 105 células por gramo de hoja. Esta diferencia puede deberse a las distintas condiciones que la bacteria encontró durante los dos experimentos. Si bien la humedad se mantuvo constante a lo largo de los diez días de los experimentos de persistencia, durante los experimentos de biocontrol la humedad relativa aumentó dos veces, tras la infección y tras la esporulación de Plasmopara vitícola. Esta explicación se confirma por la persistencia constante de AZ78 sobre plantas mantenidas a alta HR durante la duración completa de los experimentos de persistencia. Se sabe que la humedad influye en el crecimiento bacteriano (Leben, 1988; Wilson et al., 1999; Cooley et al., 2003), por lo que la alta humedad contribuye a mantener una gran población de AZ78 en las hojas. En cualquier caso, el experto en la materia podrá explicar fácilmente los aspectos relacionados con la influencia de la humedad según su conocimiento en la técnica.

Además, vale la pena señalar que AZ78 sobrevive bien en la filosfera de la vid, aunque se haya aislado de la rizosfera de plantas de tabaco (no publicado). En la actualidad, la mayoría de las cepas de Lysobacter evaluadas en cuanto al control biológico de enfermedades vegetales se han aislado del suelo o de la rizosfera de plantas cultivadas, con la única excepción de Lysobacter enzymogenes C3, que se obtuvo del filoplano de la poa de los prados (Giesler y Yuen, 1998). Como consecuencia, solo se ha evaluado esta cepa en cuanto al biocontrol de fitopatógenos que atacan las partes de la planta que crecen por encima del suelo (Kilic-Ekici y Yuen, 2003; Kobayashi y Yuen, 2005; Jochum et al., 2006) mientras que la mayoría de las cepas de Lysobacter se han evaluado en cuanto al biocontrol de hongos y oomicetos patógenos del suelo (Nakayama et al., 1999; Rondon et al., 1999; Folman et al., 2003; Postma et al., 2008; Puopolo et al., 2010). Los resultados del estudio de los inventores sugieren que las especies de Lysobacter del suelo también pueden utilizarse para el control biológico de microorganismos patógenos que atacan las partes aéreas de las plantas.

Dada la persistencia sobre la superficie de la hoja, los presentes inventores decidieron investigar el potencial de AZ78 para formar biopelículas, dado que está bien documentado que las bacterias sobreviven en las superficies de las plantas mediante la formación de grandes agregados (biopelícula) (Morris et al., 1997; Dulla y Lindow, 2008). Sin embargo, poco se sabe sobre la formación de biopelículas por cepas de Lysobacter. Islam et al. (2005) demostraron que la cepa SB-K88 forma microcolonias densas en el rizoplano de plántulas de remolacha azucarera cultivadas a partir de semillas recubiertas con esta bacteria, y también informaron que SB-K88 se adhiere a la superficie de la planta mediante la formación de fimbrias. Los presentes inventores investigaron la capacidad de AZ78 para formar biopelículas sobre superficies inertes en el estudio de los inventores, y esta es la primera vez que se demuestra que una cepa de Lysobacter capsici forma biopelícula in vitro. El grado de esta capacidad, sin embargo, dependió de la composición del medio de cultivo, como lo demuestra el hecho de que el medio KB sustentaba el desarrollo de la mayor cantidad de células bacterianas pero sin conducir a la formación de biopelícula. En cualquier caso, un experto en la materia puede establecer fácilmente los medios de cultivo adecuados. Dado que KB contiene bajas cantidades de iones de hierro disponibles (King et al., 1954), es razonable suponer que este metal afecta a la formación de biopelícula por Lysobacter capsici AZ78, como lo hacen otras bacterias gramnegativas tales como Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa, en que la formación de biopelículas está altamente influenciada por la fuente, la concentración y la biodisponibilidad de hierro (Tomaras et al., 2003; Banin et al., 2005). Por otra parte, previamente se ha demostrado que el otro miembro de Lysobacter capsici, la cepa PG4, es incapaz de producir sideróforos y que la complementación del medio KB con FeCb potencia sus propiedades antibacterianas (Puopolo et al., 2010). Dados estos datos, pero sin pretender quedar ligados a teoría alguna, los presentes inventores suponen que la disponibilidad de hierro puede desempeñar un papel importante en la persistencia en el medio ambiente y en el potencial de biocontrol de los miembros de Lysobacter capsici. Cuando las bacterias forman una biopelícula, se vuelven más resistentes a diversos factores ambientales que afectan su persistencia (Ophir y Gutnick 1994; Perrot et al., 1998; Elasri y Miller, 1999). Los factores ambientales limitantes investigados con mayor frecuencia en cuanto a la persistencia bacteriana en la filosfera son la inanición, la temperatura y la exposición a la luz UV (Wilson et al., 1999; Stockwell et al., 2009). Dado que se sabe poco sobre la capacidad de las especies de Lysobacter para sobrevivir después de la exposición a estos factores, los presentes inventores querían investigar cómo AZ78 responde a ellos.

La viabilidad de las células AZ78 no se vio afectada negativamente por el estrés provocado por la falta de nutrientes (inanición), ni sufrieron después de la exposición a temperaturas crecientes (choque térmico leve). De manera interesante, AZ78 fue capaz de tolerar la exposición a la radiación UV y las temperaturas de congelación (-20 °C). La relación de supervivencia de las células AZ78 después de la exposición a estos estreses ambientales fue comparable con la de la cepa epífita de Pseudomonas fluorescens 122 y de la cepa del suelo Pf5 de Pseudomonas fluorescens, como informan Stockwell et al. (2009). La viabilidad de las células AZ78 no se vio afectada negativamente por la dosis de radiación UV más baja probada en este estudio (20 J itt2). Sundin y Jacobs (1999) informaron que la dosis inhibitoria mínima para la cepa sensible a UV Pseudomonas aeruginosa PAO1 era de 5 J m'2, de lo cual, los presentes inventores concluyen que el umbral de sensibilidad de la cepa AZ78 es más alto que el de una cepa bacteriana sensible.

Los resultados presentados por los presentes inventores, por ejemplo, demuestran que la cepa de Lysobacter capsici AZ78 es particularmente adecuada para nuevas estrategias sostenibles para el control de enfermedades vegetales, ya que, por ejemplo, puede establecerse de por sí en la filosfera de la vid y el tomate, puede tolerar estreses ambientales y, lo más importante, reduce drásticamente la gravedad de, por ejemplo, el mildiu de la vid y el tizón tardío del tomate. Por otra parte, la cepa Lysobacter capsici AZ78 es particularmente útil ya que es resistente al cobre. Ejemplo 9:

Para probar las características ventajosas de las bacterias de la presente invención también en otros contextos, se probó la influencia en diversas otras enfermedades vegetales, particularmente en otros hongos y oomicetos fitopatógenos. Los resultados ejemplares se representan a continuación en la Tabla 3:

Tabla 3

Actividad antifúngica in vitro de la cepa de Lysobacter capsici AZ78

^{Reducción del crecimiento} Hongos y oomicetos fitopatógenos _{miceliar (%)}

Alternaria alternata 69 %

Ascochyta rabiei 80 %

Aspergillus flavus 18 %

Aspergillus niger 17 %

Aspergillus ochraceus 17 %

Botrytis cinerea 68 %

Colletotrichum gloeosporioides 79 %

Fusarium acuminatum 55 %

Fusarium avenaceum 27 %

Fusarium oxysporum f.sp. asparagi 45 %

Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici 60 %

Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici 58 %

Fusarium sambucinum 70 %

Fusarium semitectum 47 %

Fusarium solani 70 %

Penicillium sp. 24 %

Phoma tracheiphila 30 %

Phytophthora cactorum 74 %

Phytophthora capsici 63 %

Phytophthora cinnamomi 72 %

Pythium ultimum 55 %

Rhizoctonia solani 81 %

Sclerotinia maior 79 %

Sclerotinia minor 79 %

Sclerotinia sclerotiorum 85 %

Thielaviopsis basicola 58 %

Referencias

Cada cita de la literatura en el presente documento se incorpora de manera explícita por referencia en su totalidad. Arguello JM, Eren E, Gonzalez-Guerrero M. The structure and function of heavy metal transport PIB-ATPases. Biometals 2007; 20:233-248.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una cepa bacteriana, seleccionada del grupo que consiste en

i) una cepa que se puede obtener del depósito CBS 134400,

ii) una cepa que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, que particularmente comprende, para cada miembro del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, al menos una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con dicho miembro.

2. Una bacteria de una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1 o un cultivo de dicha bacteria o una bacteria descendiente de dicha bacteria.

3. Una preparación que contiene una bacteria, seleccionada del grupo que consiste en

i) una preparación que contiene una bacteria, en donde la bacteria se puede obtener del depósito CBS 134400, ii) una preparación que contiene una bacteria, en donde la bacteria comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, que particularmente comprende, para cada miembro del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-13, al menos una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 99 % de identidad con dicho miembro, y

iii) una preparación que contiene una bacteria, en donde la bacteria es la bacteria de acuerdo con la reivindicación 2.

4. Uso de una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1, una bacteria de acuerdo con la reivindicación 2, o una preparación que contiene una bacteria de acuerdo con la reivindicación 3, para la preparación de un producto fitosanitario.

5. Un producto fitosanitario que comprende una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1, al menos una bacteria de acuerdo con la reivindicación 2, o una preparación que contiene una bacteria de acuerdo con la reivindicación 3.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde

I) dicho producto fitosanitario es un producto fitosanitario contra un hongo fitopatógeno y/o un oomiceto fitopatógeno;

particularmente en donde dicho hongo fitopatógeno y/u oomiceto fitopatógeno se selecciona del grupo que consiste en Alternaría alternata, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara vitícola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola, en especial, en donde dicho oomiceto fitopatógeno se selecciona de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans, en particular en donde i) dicho oomiceto fitopatógeno provoca mildiu de la vid, o ii) dicho oomiceto fitopatógeno provoca tizón tardío del tomate; y/o

II) en donde el producto fitosanitario comprende adicionalmente cobre.

7. El producto fitosanitario de acuerdo con la reivindicación 5, en donde

I) dicho producto fitosanitario es un producto fitosanitario contra un hongo fitopatógeno y/o un oomiceto fitopatógeno;

particularmente en donde dicho hongo fitopatógeno y/u oomiceto fitopatógeno se selecciona del grupo que consiste en Alternaria alternata, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola, en especial, en donde dicho oomiceto fitopatógeno se selecciona de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans, en particular en donde i) dicho oomiceto fitopatógeno provoca mildiu de la vid, o ii) dicho oomiceto fitopatógeno provoca tizón tardío del tomate;

y/o

II) en donde el producto fitosanitario comprende adicionalmente cobre.

8. Uso de una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1, una bacteria de acuerdo con la reivindicación 2, una preparación que contiene una bacteria de acuerdo con la reivindicación 3, un producto fitosanitario de acuerdo con la reivindicación 5 o un producto fitosanitario como se define en la reivindicación 4, para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos; en especial, en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un hongo y/o un oomiceto seleccionado del grupo que consiste en Alternaría alternata, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola, particularmente, en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un oomiceto seleccionado de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans,

en particular, en donde i) dicha enfermedad vegetal está provocada por Plasmopara viticola, más en particular, en donde dicha enfermedad es mildiu de la vid, o ii) dicha enfermedad vegetal está provocada por Phytophthora infestans, más en particular, en donde dicha enfermedad es tizón tardío del tomate;

más particularmente, en donde dicho uso comprende adicionalmente una etapa de poner en contacto dicha planta con una composición que comprende cobre y/o en donde el producto fitosanitario comprende adicionalmente cobre.

9. Un método para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos, que comprende una etapa de poner en contacto al menos una planta con una cepa bacteriana, bacteria, composición bacteriana o producto fitosanitario como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;

en especial, en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un hongo o un oomiceto seleccionado del grupo que consiste en Alternaría alternata, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola, particularmente, en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un oomiceto seleccionado de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans,

en particular, en donde i) dicha enfermedad vegetal está provocada por Plasmopara viticola, más en particular, en donde dicha enfermedad es mildiu de la vid, o ii) dicha enfermedad vegetal está provocada por Phytophthora infestans, más en particular, en donde dicha enfermedad es tizón tardío del tomate;

más particularmente, en donde dicho método comprende adicionalmente una etapa de poner en contacto dicha planta con una composición que comprende cobre y/o en donde el producto fitosanitario comprende adicionalmente cobre.

10. Un kit de partes que comprende

i) una composición que comprende cobre

y

ii) un miembro del grupo que consiste en una cepa bacteriana que pertenece a Lysobacter capsici, una bacteria que pertenece a Lysobacter capsici, una preparación que contiene una bacteria de Lysobacter capsici, una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1, una bacteria de acuerdo con la reivindicación 2, una preparación que contiene una bacteria de acuerdo con la reivindicación 3, un producto fitosanitario de acuerdo con la reivindicación 5;

particularmente, en donde dicha composición que comprende cobre es un producto fitosanitario de cobre, en especial, en donde dicha composición que comprende cobre, comprende al menos un compuesto de cobre seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre, sulfato tribásico de cobre y octanoato de cobre.

11. Uso de una composición que comprende cobre, en un método para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos, caracterizado por que, dicha composición que comprende cobre, se utiliza en combinación con un miembro del grupo que consiste en una cepa bacteriana que pertenece a Lysobacter capsici, una bacteria que pertenece a Lysobacter capsici, una preparación que contiene una bacteria de Lysobacter capsici, una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1, una bacteria de acuerdo con la reivindicación 2, una preparación que contiene una bacteria de acuerdo con la reivindicación 3, un producto fitosanitario de acuerdo con la reivindicación 5, en particular, caracterizado adicionalmente en conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores; en especial, en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un hongo o un oomiceto seleccionado del grupo que consiste en Alternaria alternata, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola,

particularmente, en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un oomiceto seleccionado de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans,

en particular, en donde i) dicha enfermedad vegetal está provocada por Plasmopara viticola, más en particular, en donde dicha enfermedad es mildiu de la vid, o ii) dicha enfermedad vegetal está provocada por Phytophthora infestans, más en particular, en donde dicha enfermedad es tizón tardío del tomate.

12. Un método para la prevención o el tratamiento de una enfermedad vegetal, particularmente, una enfermedad fúngica y/o una enfermedad por oomicetos, que comprende una etapa de poner en contacto al menos una planta con una composición que comprende cobre,

caracterizado por que el método comprende adicionalmente una etapa de poner en contacto dicha al menos una planta con un miembro del grupo que consiste en una cepa bacteriana que pertenece a Lysobacter capsici, una bacteria que pertenece a Lysobacter capsici, una preparación que contiene una bacteria de Lysobacter capsici, una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1, una bacteria de acuerdo con la reivindicación 2, una preparación que contiene una bacteria de acuerdo con la reivindicación 3, un producto fitosanitario de acuerdo con la reivindicación 5, en particular, caracterizado adicionalmente en conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores; en especial, en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un hongo o un oomiceto seleccionado del grupo que consiste en Alternaría alternata, Ascochyta rabiei, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium sambucinum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium sp., Phoma tracheiphila, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia maior, Sclerotinia minor, Sclerotinia sclerotiorum y Thielaviopsis basicola,

particularmente, en donde dicha enfermedad vegetal está provocada por un oomiceto seleccionado de Plasmopara viticola y Phytophthora infestans,

en particular, en donde i) dicha enfermedad vegetal está provocada por Plasmopara viticola, más en particular, en donde dicha enfermedad es mildiu de la vid o ii) dicha enfermedad vegetal está provocada por Phytophthora infestans, más en particular, en donde dicha enfermedad es tizón tardío del tomate.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 11 o el método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha composición que comprende cobre es un producto fitosanitario de cobre,

en especial, en donde dicha composición que comprende cobre, comprende al menos un compuesto de cobre seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre, sulfato tribásico de cobre y octanoato de cobre.

14. Un polipéptido aislado seleccionado de

i) un polipéptido, en donde la secuencia del polipéptido es la secuencia de la SEQ ID NO: 2,

ii) un polipéptido, en donde la secuencia del polipéptido es la secuencia de la SEQ ID NO: 4,

iii) un polipéptido, en donde la secuencia del polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 2,

y/o

iv) un polipéptido, en donde la secuencia del polipéptido es una secuencia que tiene al menos el 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 4.

15. Un ácido nucleico aislado seleccionado de un ácido nucleico

i) que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14 i) o iii),

ii) que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14 ii) o iv),

iii) en donde la secuencia del ácido nucleico es la secuencia de la SEQ ID NO: 1,

iv) en donde la secuencia del ácido nucleico es la secuencia de la SEQ ID NO: 3,

v) en donde la secuencia del ácido nucleico es una secuencia que tiene al menos el 99 % de identidad con una secuencia como se define en el i) anterior,

vi) en donde la secuencia del ácido nucleico es una secuencia que tiene al menos el 99 % de identidad con una secuencia como se define en el ii) anterior,

vii) que codifica el mismo péptido que una secuencia como se define en uno cualquiera de los i) a vi) anteriores.