ES2780366T3 - Adenovirus oncolítico que codifica una proteína b7 - Google Patents

Adenovirus oncolítico que codifica una proteína b7 Download PDF

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Abstract

Un adenovirus oncolitico del grupo B, competente para la replicacion, con selectividad para celulas cancerosas, en donde el adenovirus comprende un transgen bajo el control de un promotor endogeno al virus, en donde el transgen comprende una secuencia de ADN que codifica una proteina B7, y dicho transgen esta ubicado entre el sitio de reconocimiento del codon de parada-poliA del gen L5 del adenovirus y el sitio de reconocimiento del codon de parada-poliA del gen E4 del adenovirus, en donde dicho transgen esta bajo el control del promotor tardio principal endogeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Adenovirus oncolítico que codifica una proteína b7
La presente descripción se refiere a un adenovirus oncolítico que comprende un transgén que codifica al menos una proteína B7, tal como CD80 o un fragmento activo de la misma, composiciones que comprenden el mismo y uso del virus y de las composiciones en el tratamiento, particularmente en el tratamiento del cáncer.
Antecedentes
El cáncer sigue siendo una gran carga social para la sociedad en términos de las dificultades y el sufrimiento de los pacientes y sus seres queridos, y también en términos del alto coste financiero de tratar, cuidar y apoyar a los pacientes. Ahora se cree que el sistema inmunitario de las personas sanas elimina las células cancerosas de forma rutinaria. Sin embargo, en aquellos pacientes con cáncer, uno o más de los mecanismos de defensa involucrados en esta eliminación están disminuidos o desactivados por completo.
Ahora se sabe que los tumores cambian su microambiente de manera que permita su crecimiento. Esto ocurre cuando el tumor libera señales extracelulares que, por ejemplo, promueven la angiogénesis tumoral y/o inducen la supresión inmunitaria local o la tolerancia inmunitaria.
De muchos estudios preclínicos y clínicos diferentes queda claro que el microambiente dentro de los tumores puede suprimir el desarrollo y la actividad de las respuestas inmunitarias antitumorales, con una amplia variedad de mecanismos que potencialmente desempeñan un papel. En particular, los mecanismos inmunosupresores en última instancia evitan que las respuestas de las células T medien la destrucción de las células tumorales. Entre los mecanismos supresores puede estar el hecho de evitar la entrada de células T a los tejidos tumorales, inhibir la activación de las células T que ingresan al tumor y la modulación de las proteínas de las células tumorales, lo que reduce la capacidad de las células T para reconocerlas o responder a ellas. La importancia de tales vías inmunosupresoras en el apoyo a la progresión tumoral se ha señalado particularmente por la eficacia clínica que muestran los anticuerpos contra los receptores en dos de tales vías supresoras, CTLA4 y PD-1/PDL1, lo que ha llevado a su aprobación comercial para el tratamiento del melanoma y otros cánceres.
Choi K-J, Gene Therapy vol 13, núm. 13, 1 de julio de 2006, páginas 1010-1020, describe "El suministro simultáneo de GM-CSF y B7-1 mediante el uso de un adenovirus oncolítico".
Jiang W et al, Molecular Therapy, vol. 13, 1 de enero de 2006 (2006-01-01), página S251, describe "La expresión transgénica controlada de vectores adenovirales con un importante promotor tardío para la terapia del cáncer".
El documento WO2005/118825 describe adenovirus quiméricos para usar en el tratamiento del cáncer.
El documento WO00/15823 describe un adenovirus dirigido alternativamente.
B7 es un tipo de proteína de membrana periférica que se encuentra en las células presentadoras de antígeno activadas (APC) que, cuando se combina con una proteína de superficie CD28 o CD152 (Ct La -4) en una célula T, puede producir una señal coestimuladora o una señal coinhibitoria para aumentar o disminuir la actividad de una señal de m HC-TCR entre la célula presentadora de antígeno (APC) y la célula T, respectivamente. Además de estar presente en las APC activadas, B7 también se puede encontrar en las células T mismas.
Hay varios pasos para la activación del sistema inmunitario contra un antígeno. El receptor de células T primero debe interactuar con un complejo de su antígeno peptídico específico (Ag) unido a una proteína de superficie que es el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Las proteínas CD4 o CD8 en la superficie de las células T interactúan con el Mh C para ayudar a estabilizar la interacción MHC/Ag con el complejo del receptor de las células T, que comprende tanto los dímeros de la cadena de unión al antígeno (alfa/beta o gamma/delta) como el complejo de señalización de CD3 (que comprende cadenas gamma, delta, épsilon y zeta). Esto también se conoce como "Señal 1" y su objetivo principal es proporcionar la señalización inicial y garantizar la especificidad antigénica de la activación de las células T.
Sin embargo, la unión a MHC es insuficiente por sí sola para estimular la completa diferenciación y activación de las células T efectoras. De hecho, la falta de señales estimuladoras adicionales puede hacer que las células T se vuelvan anérgicas. Las señales coestimuladoras necesarias para continuar con la respuesta inmunitaria pueden provenir de las interacciones B7-CD28 y CD40-CD40L. Hay otras señales de activación que juegan un papel en las respuestas inmunitarias. Por ejemplo, en la familia de moléculas TNF, la proteína 4-1BB (CD137) en la célula T puede unirse a 4-1BBL en la APC.
La proteína B7 (CD80/B7-1 y/o CD86/B7-2) está presente en la superficie de las APC e interactúa con el receptor CD28 en la superficie de las células T. Esta es una fuente de "Señal 2" (las citocinas también pueden contribuir a la activación de las células T, que puede denominarse "Señal 3"). Esta interacción produce una serie de señales posteriores que promueven la supervivencia, activación y diferenciación de las células T objetivo en una célula efectora que puede mediar aspectos de la respuesta inmunitaria, como la muerte de células infectadas por virus o células tumorales, y el reclutamiento de células inflamatorias.
Por lo general, para iniciar una respuesta de células T, la señal estimuladora y la señal coestimuladora son proporcionadas por una célula presentadora de antígeno para inducir respuestas de células T CD4 y CD8. Pero las células T efectoras CD8 reconocen su Ag asociado con las moléculas de MHC de clase I que están presentes en la mayoría de las células nucleadas, incluidas las células tumorales. Sin embargo, los presentes inventores tienen razones para creer que las señales para activar las células T no necesitan provenir de la misma célula o tipo de célula. Por lo tanto, sería útil proporcionar una o más de estas señales (es decir, la señal estimuladora y/o la señal coestimuladora) al sistema inmunitario, por ejemplo en la superficie de una célula cancerosa.
Actualmente hay mucho interés en inhibir la actividad de PD-1 (proteína de muerte celular programada 1) y/o su ligando PDL1 (también conocido como B7-H1) porque se cree que esta vía desempeña un papel importante en la disminución de la respuesta inmunitaria, por ejemplo en cánceres.
Sin embargo, algunos trabajos realizados sugieren que CD80 (B7-1) no solo actúa como coestimulador de células T al unirse a CD28 en las células T, sino que también puede unirse a PDL1, por ejemplo cuando se expresa en la misma membrana celular y bloquean las interacciones de señalización inhibitoria PDL1-PD1. Por lo tanto, al actuar de dos maneras diferentes, CD80 puede ser una molécula viable y potencialmente más útil para restaurar o mejorar la activación de las células T humanas. Las formas solubles de CD80 también parecen ser capaces de contrarrestar la inhibición de células T mediada por PDL1-PD1, véase, por ejemplo, Haile et al., Soluble CD80 Restores T Cell Activation and Overcomes Tumor Cell Programmed Death Ligand 1-Mediated Immune Suppression J Immunol 2013; 191: 2829-2836. Se ha generado una proteína de fusión CD80-Fc y se está probando su seguridad y eficacia, consulte el Journal of Immunology, 2014, 193: 3835-3841. Choi K-J et al., Gene Therapy vol. 13, núm. 13, 1 de julio de 2006, páginas 1010­ 1020 analiza que "La administración concurrente de GM-CSF y B7-1 mediante el uso de un adenovirus oncolítico provoca un potente efecto antitumoral".
Los presentes inventores creen que las proteínas B7 o un fragmento activo de las mismas, administrados y expresados por un virus oncolítico, por ejemplo en la superficie de una célula cancerosa, serían útiles para activar el propio sistema inmunitario del paciente para combatir el cáncer.
Además, las proteínas B7, como CD80, si simplemente se administran por vía sistémica, tienen el potencial de estimular las respuestas inmunitarias sistémicas de forma no deseada. Los presentes inventores creen que se requiere una administración más sofisticada de estas proteínas para crear una ventana terapéutica adecuada donde se logren los efectos terapéuticos beneficiosos y se minimicen los efectos fuera del objetivo.
Resumen de la descripción
Por lo tanto, se proporciona un adenovirus oncolítico del grupo B, competente para la replicación, con selectividad para células cancerosas, en donde el adenovirus comprende un transgén bajo el control de un promotor endógeno al virus, en donde el transgén comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína B7 y dicho transgén se ubica entre el sitio de reconocimiento del codón de parada-poliA del gen L5 del adenovirus y el sitio de reconocimiento del codón de paradapoliA del gen E4 del adenovirus, en donde dicho transgén está bajo el control del promotor tardío principal endógeno.
Esto es beneficioso porque los virus oncolíticos de acuerdo con la presente descripción infectan preferentemente las células cancerosas y penetran así en el microambiente creado por el cáncer. Una vez en las células cancerosas, las proteínas B7 codificadas por el virus pueden expresarse, por ejemplo, en la superficie celular (es decir, en la superficie de las células cancerosas). Esto es ventajoso porque la proteína B7 se encuentra entonces en el lugar deseado donde puede ser biológicamente activa.
En una forma de realización, la proteína B7 codificada comprende una secuencia capaz de anclar la proteína en la superficie de una célula, por ejemplo, una secuencia de dominio transmembrana, un anclaje a GPI o similar.
Por lo tanto, en una forma de realización, la célula cancerosa se infecta con un virus de la presente descripción que expresa una proteína o molécula B7, en particular en la superficie de la célula cancerosa, en donde la proteína B7 es adecuada para proporcionar al menos la señal coestimuladora es decir, la señal 2 para activar una célula T, y/o puede unirse e inhibir la actividad de PD-L1 expresado en la superficie de la célula cancerosa u otras células en el microambiente local.
En una forma de realización, la secuencia de B7 comprende un elemento de transmembrana de una proteína B7, por ejemplo, un elemento de transmembrana nativo de la proteína B7 particular o un dominio transmembrana de una proteína B7 "diferente" a la que se expresa particularmente.
Las proteínas B7 son proteínas expresadas en la superficie y también pueden emplearse para transportar otras proteínas a la superficie de la célula cancerosa, por ejemplo, cuando al menos el dominio transmembrana de una proteína B7 se une a otra proteína.
Por lo tanto, se proporciona un adenovirus oncolítico competente para la replicación con selectividad para células cancerosas, en donde el adenovirus comprende un transgén bajo el control de un promotor endógeno al virus, en donde el transgén comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína B7 o un fragmento activo de la misma.
También se proporciona un virus oncolítico competente para la replicación de acuerdo con la presente invención, en donde la proteína B7 se selecciona independientemente del grupo que comprende B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5 y B7-H6, en particular en donde la proteína B7 es B7-1 (CD80) o un fragmento activo de la misma. En una forma de realización, el virus oncolítico competente para la replicación es un adenovirus del grupo B.
En una forma de realización, el virus oncolítico competente para la replicación es un virus quimérico.
En una forma de realización, el virus oncolítico competente para la replicación que tiene una cadena principal es enadenotucirev (también denominado EnAd).
En una forma de realización, el virus oncolítico competente para la replicación tiene una fórmula (I):
5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR (I)
B1 comprende: E1A, E1B o E1A-E1B;
Ba es E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;
B2 es un enlace o comprende E3 o un transgén, por ejemplo bajo un promotor endógeno o exógeno;
Bx es un enlace o una secuencia de ADN que comprende: un sitio de restricción, uno o más transgenes o ambos; Bb comprende L5;
By comprende un transgén que codifica una proteína B7 o un fragmento activo de la misma; y
B3 es un enlace o comprende E4.
En una forma de realización, el virus oncolítico competente para la replicación de acuerdo con la presente invención, en donde la proteína B7 comprende una secuencia de transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana de un receptor de PDGF o un anclaje a GPI adecuado para anclar la proteína o fragmento en una membrana celular.
En una forma de realización, el virus oncolítico competente para la replicación comprende además un segundo transgén, por ejemplo, que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que comprende una citocina, una quimiocina, una molécula de anticuerpo antagonista o fragmento de la misma, y una molécula de anticuerpo agonista o fragmento de la misma.
En una forma de realización, el segundo y tercer transgenes, por ejemplo, codifican dos polipéptidos diferentes seleccionados del grupo que comprende una citocina, una quimiocina, un anticuerpo, tal como una molécula de anticuerpo antagonista o fragmento de la misma, o una molécula de anticuerpo agonista o fragmento de la misma.
En una forma de realización, el segundo o tercer transgén codifica una citocina, seleccionada del grupo que comprende IL-2, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, ligando de Flt3, GM-CSF, IL-15 e IL-12.
En una forma de realización, el segundo o tercer transgén codifica una quimiocina, seleccionada del grupo que comprende MIP1a, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 y CCL21. En una forma de realización, el virus codifica una combinación de citocina y quimiocina seleccionadas del grupo que comprende M ipla y ligando de Flt3, y MIP1a e IFNa.
En una forma de realización, el virus codifica una molécula de anticuerpo o fragmento de la misma, por ejemplo, que comprende una secuencia de transmembrana o un anclaje a GPI de manera que es una forma anclada a la membrana celular o un dominio transmembrana, por ejemplo, de un receptor de PDGF.
En una forma de realización, la molécula de anticuerpo o fragmento de unión de la misma comprende un dominio de unión a antígeno anti CD3 humano.
En una forma de realización, la molécula de anticuerpo es un inhibidor, por ejemplo seleccionado del grupo que comprende un inhibidor de un factor de angiogénesis, tal como una molécula de anticuerpo anti-VEGF, e inhibidor de factores de desactivación de células T, tal como una molécula de anticuerpo anti-CTLA-4.
En una forma de realización, la molécula de anticuerpo es un agonista, por ejemplo, uno o más seleccionados del grupo que comprende CD40, GITR, OX40, CD27 y 4-1BB.
En una forma de realización, una proteína o proteínas exógenas codificadas por el virus es/son una forma adecuada para la expresión en una superficie de células cancerosas.
Resumen de las figuras
La figura 1 muestra algunas de las moléculas clave implicadas en el reconocimiento, por parte de las células T, de células presentadoras de antígenos o células tumorales, y algunos de los eventos de señalización inducidos en la célula T respondedora. También se ilustra la estructura de PDL1 y la interacción con el dominio IgV de PD1
La figura 2 muestra algunos de los ligandos de la familia B7 y las parejas de unión de la familia de receptores CD28
La figura 3 muestra esquemas de casetes de transgenes para virus que expresan CD80 humano (Figura 3A), que coexpresan IFNa humano y CD80 humano (Figura 3B), que coexpresan scFv de OKT3 y CD80 humano (Figura 3C), que coexpresan Flt3L humano, MIP1a humano e IFNa humano (Figura 3D), que coexpresan Flt3L humano, MIP1a humano y CD80 humano (Figura 3E), que coexpresan IFNa humano, MIP1a humano y CD80 humano (Figura 3F), y un esquema del marco de lectura abierto (ORF) o el scFv de OKT3 (Figura 3G)
La figura 4 muestra la replicación de EnAd (ColoAdl) y el virus que codifica CD80 humano NG-330 en las células tumorales HT-29 (Figura 4A) y A549 (Figura 4B)
La figura 5 muestra la expresión de CD80 en la membrana de las células tumorales A549 (Figura 5A) o HT-29 (Figura 5B) por inmunotinción fluorescente en diferentes momentos después de la infección con NG-330. No se observó expresión de CD80 en la membrana celular con EnAd o con células tumorales no infectadas (UIC)
La figura 6 muestra las potencias oncolíticas comparables de EnAd y NG-330 en un ensayo de citotoxicidad en HT-29. Por lo tanto, NG-330 conserva sus propiedades oncolíticas al mismo tiempo que porta un transgén
La figura 7 muestra la potencia oncolítica comparable de EnAd y el virus NG-343 que expresa CD80+ IFNa (Figura 7A) y la secreción de IFNa por células tumorales HT-29 y A549 infectadas con NG-343 durante un período de hasta 72 horas
La figura 8 muestra la expresión de CD80 y la muerte de células tumorales a las 48 o 72 horas después de la infección mediante análisis de FACS que usó inmunotinción con anticuerpos anti-CD8 junto con una tinción para la viabilidad celular. Se pudo detectar CD80 en la superficie celular de las células tratadas con NG-343 vivas y muertas, pero no en las células tumorales A549 infectadas con EnAd o las control no infectadas (UIC) (Figura 8A-D). Se observó una expresión similar de CD80 con las células tumorales A549 y HT-29 (Figura 8E).
La figura 9 muestra una replicación viral comparable tanto con EnAd como NG-343 en células tumorales (HT-29) y no tumorales (MRC5, WI38 y células epiteliales bronquiales), donde las últimas mostraron niveles mucho más bajos de replicación (Figura 9A), secreción de IFNa (Figura 9B) y expresión de CD80 (Figura 9C) después de la infección con NG-343 solo detectada en células tumorales HT-29.
La Figura 10 muestra que las células tumorales A549 infectadas con NG-343 pueden inducir un aumento de los niveles superficiales de CD80 y PD-L1 en la superficie de las DC en cocultivos de PBMC en comparación con un cultivo de células tumorales infectadas con EnAd o no infectadas.
La figura 11 muestra la expresión de IFNa y CD80 por células tumorales HT-29 (Figura 11A y C) y A549 (Figura 11B y C) infectadas con virus NG-347
La Figura 12 muestra la expresión de MIP1a (Figura 12A), IFNa (Figura 12B) y Flt3L (Figura 12C) en células tumorales A549 infectadas con el virus NG-345
La figura 13 muestra una potencia oncolítica (Figuras 13A y B) e infectividad (Figura 13C) comparables de los virus EnAd, NG-347 y NG-348 en un ensayo de citotoxicidad en HT-29
La Figura 14 muestra una alta expresión de CD80 hacia las 48 horas en la superficie celular de las células tumorales A549 infectadas con los virus NG-347 o NG-348, pero poca o ninguna expresión de CD80 después de la infección con EnAd
La Figura 15 muestra la alta expresión de CD80 hacia las 48 horas en la superficie celular de las células tumorales DLD-1 infectadas con los virus NG-347 o NG-348, pero poca o ninguna expresión de CD80 después de la infección con EnAd
La figura 16 muestra la expresión de CD80 en células A549 EpCam+ infectadas con NG-348 y cocultivadas con células T CD3+ humanas, pero no cuando la infección fue con EnAd
La figura 17 muestra que CD25 se regula positivamente en células T CD3+ humanas después del cocultivo con células A549 infectadas con NG-348, pero no cuando la infección fue con EnAd (Figura 17A), con aumento tanto del porcentaje de células CD25+ (Figura 17B) como del nivel de expresión de CD25 por célula (Figura 17C).
La figura 18 muestra que CD25 se regula positivamente en los subconjuntos de células T CD3+ humanas (primariamente CD8) tanto CD4+ como CD4- después del cocultivo con células A549 infectadas con NG-348, pero no cuando la infección fue con EnAd.
La Figura 19 muestra un nivel bajo de la expresión de HLA-DR en células T CD3+ humanas después del cocultivo con células A549 infectadas con NG-348 o EnAd
La figura 20 muestra la inducción de la expresión de CD107a en la superficie de células T CD3+ vivas, después del cocultivo con células A549 infectadas con NG-348, pero no cuando la infección fue con EnAd.
La figura 21 muestra la inducción de la expresión de CD107a en la superficie de los subconjuntos de células T CD3+ tanto CD4+ como CD4- tras el cocultivo con células A549 infectadas con NG-348, pero no cuando la infección fue con EnAd.
La Figura 22 muestra la inducción de la producción de IL-2 (Figura 22A) e IFNy (Figura 22B) por las células T CD3+ después del cocultivo con células A549 infectadas con NG-348, pero no se detectó IL-2 y solo niveles bajos de IFNy cuando la infección fue con EnAd.
La Figura 23 muestra la inducción de la producción de IFNy por ambas células T CD3+ CD4+ y CD8+ (Figura 22B) después del cocultivo con células A549 infectadas con NG-348, pero no se detectó IFNy (células CD4+) o hubo una baja detección (células CD8+) cuando la infección fue con EnAd.
La figura 24 muestra que CD69 se regula positivamente en más células T CD3+ humanas después del cocultivo con células A549 infectadas con NG-347 que cuando la infección fue con EnAd
La figura 25 muestra la inducción de la producción de IFNy por parte de las células T CD3+ humanas después del cocultivo con células A549 infectadas con NG-347, pero no cuando la infección fue con EnAd
La figura 26 muestra los esquemas de los casetes de transgenes de NG-348A, NG-420 y NG-420A
La figura 27 muestra la replicación del genoma y la expresión del gen de hexona (niveles de ARNm) para EnAd, NG-347 y NG-348 en células de fibroblastos MRC-5 en comparación con las células tumorales A549
La figura 28 muestra la expresión de ARNm de los transgenes de CD80 y anti-scFv CD3 y la expresión de la proteína transgénica CD80 (citometría de flujo)
para el virus NG-348 en células de fibroblastos MRC-5 en comparación con las células tumorales A549
La Figura 29 muestra el ARNm del transgén de CD80 y la proteína transgénica CD80 para el virus NG-347 en células de fibroblastos MRC-5 en comparación con células tumorales A549.
La figura 30 muestra los niveles de ARNm y proteína secretada de MIP1a e IFNa generados por el virus NG-347 en células de fibroblastos MRC-5 en comparación con células tumorales A549.
La figura 31 muestra la replicación del genoma y la expresión del gen de hexona (niveles de ARNm) para EnAd, NG-347 y NG-348 en cultivos de células T humanas purificadas.
La figura 32 muestra la expresión de ARNm del transgén de CD80 y scFv anti-CD3 y la expresión proteica (citometría de flujo) para el virus NG-348 en células T humanas en comparación con las células tumorales A549
La figura 33 muestra el nivel de ARNm del transgén de CD80 y de la proteína transgénica CD80 para el virus NG-347 en células T humanas purificadas en comparación con las células tumorales A549
La figura 34 muestra el nivel de ARNm de los transgenes IFNa y MIP1a generado por el virus NG-347 en células T en comparación con las células tumorales A549
La figura 35 muestra la replicación del genoma de NG-347 y NG-348 y la expresión génica de hexona por parte de PBMC humanas en comparación con las células tumorales A549
La figura 36 muestra el nivel de ARNm de CD80 y scFv anti-CD3 generado por el virus NG-348 por parte de PBMC en comparación con las células tumorales A549
La Figura 37 muestra el ARNm de CD80, IFNa y MIP1a generado por el virus NG-347 por parte de PBMC en comparación con las células tumorales A549
La figura 38 muestra la activación similar de células dendríticas humanas por partículas virales de EnAd, NG-347 y NG-348, medido por la regulación negativa de la expresión de CD14 y la regulación positiva de CD80 en la superficie celular
La figura 39 muestra una secreción similar de las proteínas MIP1a e IFNa, mediada por partículas, a partir de PBMC cultivadas con NG-348 (A) o NG-347 (B) en comparación con EnAd.
La figura 40 muestra la replicación del genoma de NG-347 o NG-348 en cocultivos o células T o PBMC con células de fibroblastos MRC-5 en comparación con cocultivos de células tumorales A549
La figura 41 muestra el INFy secretado por PBMC o células T cocultivadas con células de fibroblastos MRC-5 en comparación con las células tumorales A549, y tratadas con EnAd o virus NG-348.
La figura 42 muestra MIP1a e IFNa secretados por las células dendríticas humanas tratadas con partículas virales de EnAd, NG-347 o NG-348
La figura 43 muestra la activación del gen reportero de NFKB e IFN en células T reporteras JurkatDual cocultivadas con EnAd, NG-347 o células tumorales A549 infectadas con NG-348
La Figura 44 muestra la actividad del reportero NF-KB-luciferasa generado por las células T reporteras JurkatDual cocultivadas con células tumorales A549 Hc T-116, DLD y HT29 tratadas con EnAd, NG-347, NG-348 o NG-420.
La Figura 45 muestra la actividad del reportero NF-KB-luciferasa generado por células JurkatDual cocultivadas con células tumorales A549 o HT29 infectadas con el virus NG-348 y el virus NG-420 en función de las partículas de virus añadidas.
La figura 46 muestra la farmacocinética de EnAd y el virus NG-348 en sangre; niveles de citocinas en sangre después de la exposición a EnAd o al virus NG-348; biodistribución tisular de los virus EnAd o NG-348, 6 o 24 horas después de la administración IV a ratones CD1
La figura 47 muestra la farmacocinética en sangre de los virus EnAd, NG-347 y NG-348 después de la administración IV a ratones CB17-SCID con un xenoinjerto tumoral subcutáneo de HCT-116.
La figura 48 muestra la distribución tisular de los virus EnAd, NG-347 y NG-348, 6 horas después de la dosificación intravenosa en ratones CB17-SCID portadores de tumores, y los genomas de virus en xenoinjertos de tumor HCT-116 en el día 7 y 14-21 después de la dosificación intravenosa o intratumoral de EnAd, NG-347 y n G-348
La Figura 49 muestra el ARNm de hexona viral generado en xenoinjertos de tumor HCT-116 por los virus EnAd, NG-347 o NG-348 el día 7 o 14-21 después de la dosificación intravenosa o intratumoral
La Figura 50 muestra los niveles de ARNm para el transgén de hexona y CD80 en xenoinjertos de tumor HCT-116 en los días 7 o 21 después de la dosificación intravenosa con el virus NG-348
La figura 51 muestra los niveles de ARNm para transgenes que codifican ScFv anti-CD3 y CD80 en xenoinjertos de tumor HCT-116 de 7 o 14-21 días después de la dosificación IV con el virus NG-348
La figura 52 muestra los niveles de ARNm de los transgenes de MIP1a e IFNa en xenoinjertos de tumor HCT-116 de 7 o 14-21 días después de la dosificación intravenosa con virus NG-347
La figura 53 muestra la expresión de la proteína CD80 en xenoinjertos de tumor HCT-116 de 7 y 21 días después de una dosis intravenosa de virus NG-348; y muestra la expresión de las proteínas MIP1a y CD80 en tumores HCT-116 después de una dosis intravenosa del virus NG-347.
Resumen del listado de secuencias
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Descripción detallada
B7 es una familia de proteínas.
Una proteína B7 codificada en un virus oncolítico de la presente descripción puede ser útil porque el dominio extracelular del miembro de la familia de proteínas generalmente modula una función biológica, por ejemplo, el dominio extracelular de B7-1 puede emplearse para sensibilizar o estimular las células T. La función biológica real es específica del dominio extracelular de cada proteína B7 dada (es decir, generalmente las diferentes proteínas miembros de la familia B7 tienen diferentes funciones). Otras funciones de las proteínas B7, como B7-1 y/o B7-2 pueden incluir la capacidad de unirse a CD28 y/o CTLA-4, y en particular señalizar o activar la cascada o cascadas de señalización relacionadas.
Además, o alternativamente, el dominio transmembrana de las proteínas B7 se puede emplear para dirigir proteínas codificadas por un virus de la presente descripción a la superficie de una célula cancerosa, por ejemplo mediante la fusión del dominio transmembrana al extremo C terminal de la proteína en cuestión.
La proteína B7 como se emplea en la presente memoria, a menos que el contexto indique lo contrario, se refiere a la secuencia de longitud completa de una proteína de la familia B7 o una secuencia al menos 95 % similar o idéntica a la misma (como 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % similar o idéntica a ella a lo largo de la totalidad de la secuencia en cuestión). La familia B7 incluye B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6, B7-H7. Cuando se emplea la proteína de longitud completa, generalmente estará presente al menos una función biológica normal de la proteína.
La proteína de longitud completa, tal como se emplea con respecto a la familia B7, se refiere al menos al dominio extracelular, incluidas las proteínas B7 quiméricas en donde la secuencia de la quimera tiene la estructura y una función de una proteína B7 y en donde las secuencias que constituyen la quimera se seleccionan de proteínas de la familia B7. Los elementos en un fragmento o proteína B7 de longitud completa pueden ser de la misma o diferentes proteínas B7. Por lo tanto, en una forma de realización, el fragmento o proteína B7 es quimérico.
Las proteínas B7 quiméricas que se emplean en la presente memoria se refieren a cuando sustancialmente todas las secuencias que constituyen la quimera son de una proteína B7, por ejemplo, al menos el 98 % de la secuencia de la quimera son fragmentos de proteínas B7 fusionados. Por lo tanto, un fragmento quimérico como se emplea en la presente memoria se refiere a un fragmento que comprende una secuencia de dos o más proteínas B7 diferentes.
En una forma de realización, la proteína B7 de longitud completa comprende el dominio extracelular, por ejemplo, de una única proteína B7, tal como B7-1 y/o B7-2.
En una forma de realización, la proteína B7 de longitud completa comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana, por ejemplo de la misma proteína B7 o, alternativamente, el dominio extracelular de una proteína B7 (como B7-1 y/o B7-2) y un dominio de transmembrana o equivalente, como el anclaje a la membrana lipídica, de una proteína completamente diferente.
En una forma de realización, una proteína B7 quimérica de longitud completa puede comprender un dominio extracelular de una proteína B7 (tal como B7-1 y/o B7-2) y la región transmembrana de una proteína B7 diferente.
En una forma de realización, la proteína B7 de longitud completa comprende el dominio extracelular, el dominio transmembrana y el dominio intracelular, por ejemplo, todos de la misma proteína B7 o de dos o más proteínas B7 diferentes.
El fragmento activo de una proteína B7 tal como se emplea en la presente memoria se refiere a un fragmento que tiene al menos una función de una proteína B7, por ejemplo, para facilitar la expresión en la superficie de una célula cancerosa u otra función biológica de una proteína b 7.
El fragmento puede tener al menos el 50 % de la actividad de la proteína de longitud completa, como 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 % de la actividad de la proteína de longitud completa.
Un fragmento activo puede comprender o consistir en un dominio extracelular B7 o una secuencia al menos 95 % similar o idéntica al mismo, tal como 96, 97, 98, 99 o 100 % similar o idéntica.
Un fragmento de B7 puede comprender o consistir en un dominio transmembrana de una proteína B7 en particular una descrita en la presente memoria, tal como B7-1. Se cree que el empleo de esta última contribuye a la expresión en la superficie celular.
Un fragmento de B7 puede ser parte de un dominio extracelular.
Un fragmento activo, por ejemplo un fragmento transmembrana o un fragmento más grande que comprende más dominios de B7 se puede emplear en una proteína de fusión con una proteína adicional, por ejemplo para facilitar la expresión de la proteína adicional en la superficie de la célula cancerosa.
Un fragmento más grande, como se emplea en la presente memoria, no se refiere al tamaño o peso per se sino a un repertorio más grande de información de secuencia (es decir, el fragmento comprende secuencias de al menos dos dominios de B7) que a su vez pueden proporcionar más funcionalidad.
En una forma de realización, el fragmento más grande comprende alguna actividad biológica de la proteína B7 en cuestión. En una forma de realización, un fragmento de B7 activo es un fragmento que retiene la actividad biológica esencial de la proteína de longitud completa, por ejemplo, la capacidad de sensibilizar o activar células T.
La actividad de un fragmento de proteína dado puede analizarse en un ensayo in vitro adecuado, por ejemplo con el uso de la proteína de longitud completa como comparador, por ejemplo mediante el uso de un ensayo descrito en los Ejemplos de la presente memoria. Cuando el fragmento activo es un dominio transmembrana, la actividad puede evaluarse mediante el análisis de la expresión superficial en las células de la proteína en cuestión a la que se une el dominio transmembrana, por ejemplo, mediante el uso de un ensayo descrito en los Ejemplos de la presente memoria.
Cuando la proteína B7 de longitud completa es parte de una proteína de fusión, entonces la porción B7 puede estar unida a la proteína adicional mediante un enlace amida entre el final de una secuencia y el inicio de la siguiente secuencia de proteína o conectada por un enlazador. A continuación se dan ejemplos de enlazadores.
Se puede emplear una proteína B7 de longitud completa que comprende un dominio transmembrana para presentar el dominio extracelular de la proteína B7 y la proteína o fragmento fusionado o unido a la misma en la superficie de la célula cancerosa infectada. Generalmente, en esta forma de realización, la proteína B7 se unirá a la superficie de la célula cancerosa y la "otra" proteína estará en el extremo N terminal y en el lado extracelular de la superficie de la célula cancerosa.
Dicho esto, las proteínas pueden organizarse como se desee, por ejemplo, con el dominio extracelular B7 en el N-terminal, fusionado o unido en su C-terminal a la siguiente proteína o fragmento, que a su vez se fusiona o une en el C-terminal al dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana de una proteína B7.
Generalmente, cuando se emplea una proteína B7 de longitud completa en una proteína de fusión, tanto la proteína B7 como la proteína adicional tendrán una función biológica.
La proteína de fusión como se usa en la presente memoria se refiere a al menos dos proteínas o fragmentos o una combinación de al menos una proteína y al menos un fragmento fusionado directamente o conectado entre sí, por ejemplo por un enlazador.
Fusionado como se usa en la presente memoria generalmente se refiere a un enlace amida entre el extremo de un polipéptido (o proteína/fragmento) y el inicio del siguiente polipéptido (o proteína/fragmento).
Unido, a menos que el contexto indique lo contrario, se refiere a cuando dos entidades, tal como dos secuencias de polipéptidos, están conectadas a través de un enlazador. Un enlazador es una secuencia que no está presente naturalmente en el polipéptido, o una secuencia que no está presente en esa posición particular con respecto a ambos polipéptidos.
En una forma de realización, la proteína de fusión comprende una proteína B7 o un fragmento activo de la misma. Las proteínas de fusión que comprenden fragmentos B7 o proteínas y proteínas adicionales no se denominan proteínas quiméricas en la presente memoria. Generalmente, la proteína de fusión tal como se emplea en la presente memoria se refiere a una combinación de una proteína B7 o fragmento de la misma y otra proteína/fragmento diferente de B7.
Solo las proteínas que contienen fragmentos de diferentes proteínas B7 se denominan quiméricas en la presente memoria, como se describió anteriormente.
En una forma de realización, las proteínas de fusión de la presente descripción no comprenden una proteína B7 o fragmento activo de la misma y están codificadas por un virus de la presente descripción además de la proteína B7 o fragmento de la misma.
Por lo tanto, los virus de la presente descripción pueden codificar entidades además de la proteína B7, tales entidades incluyen proteínas adicionales.
Familia B7
En una forma de realización, la B7 se selecciona independientemente de B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6, B7-H7, fragmentos activos de las mismas, y combinaciones de las mismas. En una forma de realización, la proteína B7 es B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) o un fragmento activo de cualquiera de las mismas y sus combinaciones, en particular B7-1 o un fragmento activo de la misma.
Las proteínas B7 incluyen B7-1 (también conocida como CD80 número en Uniprot P33681), B7-2 (también conocido como CD86 número en Uniprot P42081). Estas proteínas se unen a CD28 y CTLA-4.
En una forma de realización, CD80 tiene la siguiente secuencia:
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIY WQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKRE HLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETE
LYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDNLLPSWAITLISVNGIFVIC CLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV SEQ ID NO: 11
Otras proteínas B7 incluyen B7-DC (también conocida como PDCD1LG2 y PD-L2 número en Uniprot Q9BQ51), B7-H1 (también conocida como PD-L1 y CD274: número en Uniprot Q9NZQ7). Ambas proteínas se unen a PD-1.
El ligando de muerte programada 1 (PD-L1) es una proteína transmembrana tipo 1 de 40 kDa que se ha especulado que desempeña un papel importante en la supresión del sistema inmunitario. Parece que la regulación positiva de PD-L1 puede permitir que los cánceres evadan el sistema inmunitario del huésped. Un análisis de 196 muestras tumorales de pacientes con carcinoma de células renales encontró que la alta expresión tumoral de PD-L1 se asoció con una mayor agresividad tumoral y un riesgo de muerte 4,5 veces mayor. Las pacientes con cáncer de ovario con mayor expresión de PD-L1 tuvieron un pronóstico significativamente peor que aquellas con menor expresión. La expresión de PD-L1 se correlacionó inversamente con el conteo de linfocitos T CD8+ intraepiteliales, lo que sugiere que PD-L1 en las células tumorales puede suprimir las células T CD8+ antitumorales. El efecto puede depender del tipo de tumor; Un estudio en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas mostró que una mayor expresión de proteína PD-L1 y ARNm se asocia con un mayor infiltrado linfocítico local y una mayor supervivencia. Se ha demostrado que varios anticuerpos anti-PDL1 son de interés para tratar varios tipos de cáncer en ensayos clínicos.
En una forma de realización, la proteína B7-DC y/o B7-H1 o fragmento de la misma empleada en el virus de la presente descripción no estimula la supresión inmunitaria, por ejemplo, está mutada para eliminar la función inmunosupresora.
Alternativamente, un virus que codifica el dominio extracelular de B7-H1 en una forma no mutada puede emplearse para tratar cánceres apropiados, donde la regulación positiva de PD-L1 se asocia con un buen/mejor pronóstico, como el cáncer de pulmón.
En una forma de realización, al menos el dominio citoplásmico (intracelular) de B7-DC y/o B7-H1 está eliminado o no es funcional. Sin desear estar limitados a la teoría, existe evidencia que sugiere que la eliminación del dominio intracelular reduce la resistencia de las células cancerosas a la lisis (Blood 2008, 1 de abril; 111 (7) 3635-3643).
En una forma de realización, solo se emplea el fragmento de dominio transmembrana de B7-DC y/o B7-H1. En una forma de realización, las siguientes proteínas no se proporcionan como proteínas de longitud completa B7-DC y B7-H1 con una actividad biológica de interés.
Otras proteínas B7 incluyen B7-H2 (también conocida como ICOSLG, B7RP1, CD275: número en Uniprot 075144) que se une a ICOS, B7-H3 (también conocida como CD276: número en Uniprot Q5ZPR3), B7-H4 (también conocida como VTCN1: número en Uniprot Q727D3), B7-H5 (también conocida como VISTA, receptor de plaquetas Gi24, SISP1), B7-H6 (también conocida como NCR3LG1, NR3L1) que se une a NKp30, B7-H7 (también conocida como HHLA2) que se une a CD28H.
En una forma de realización, el fragmento solo comprende el dominio transmembrana de cualquiera de B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 y B7-H7.
Las proteínas individuales incluyen proteínas únicas, es decir, proteínas o fragmentos activos de las mismas que no forman parte de una proteína de fusión (incluidas las proteínas quiméricas), y también proteínas de fusión. En una forma de realización, las proteínas individuales son proteínas únicas (que incluyen fragmentos activos de las mismas).
En una forma de realización, el dominio citoplasmático de la proteína B7 está presente. En una forma de realización, el dominio citoplasmático está ausente. La ausencia del dominio citoplasmático puede reducir o eliminar la señalización intracelular a la célula cancerosa, lo cual es de interés para una o más formas de realización que se analizan a continuación.
"Dominios transmembrana"
En una forma de realización, se emplea un dominio transmembrana distinto de uno derivado de una proteína B7 para expresar una proteína (incluida una proteína de fusión) codificada por un virus de la presente descripción en la superficie de una célula cancerosa infectada, por ejemplo, el dominio transmembrana puede emplearse para presentar un fragmento de proteína B7 activa u otra proteína de interés en la superficie de la célula cancerosa infectada. Alternativamente, se puede emplear para presentar una proteína de fusión, que comprende, por ejemplo, una proteína B7 o un fragmento activo de la misma en dicha superficie. En una forma de realización, el dominio transmembrana de un receptor de PDGF o fragmento del mismo se emplea para expresar una proteína B7 y/u otra proteína en la superficie de la célula cancerosa.
En una forma de realización, una secuencia de ligadura o anclaje transmembrana empleada en la presente descripción comprende un dominio TM de PDGFR (por ejemplo, ala513-arg561), tal como AVGQDTQEVIWPHSLPFKVWISAILALWLTMSLNLIMLWQKPR (SEQ ID NO: 2).
En una forma de realización, una secuencia de ligadura o anclaje empleada en la presente descripción comprende una etiqueta unida, por ejemplo, a un receptor de PDGF o fragmento del mismo, tal como el dominio TM de PDGFR, en particular la SEQ ID NO: 2.
Las etiquetas adecuadas incluyen etiquetas His, etiquetas Flag, etiqueta c-myc y similares. Más específicamente, la unión o el anclaje pueden comprender una etiqueta c-myc, por ejemplo, de la SEQ ID NO: 106 EQKLISEEDL seguido de un dominio t M de PDGFR (por ejemplo ala513-arg561), como se muestra en la SEQ ID NO: 2 AVGQDTQEVIWPHSLPFKVWISAILALWLTNSLNLIMLWQKKPR.
En una forma de realización, la etiqueta c-myc comprende un espaciador o aminoácidos espaciadores en el extremo 3' y/o 5', por ejemplo gsEQKLISEEDLn (SEQ ID NO: 107 en donde las letras minúsculas representan los aminoácidos que se agregan a la etiqueta como espaciadores).
En una forma de realización, la secuencia de ligadura o anclaje empleada es gsEQKLISEEDLnAVGQDTQEVIWPHSLPFKV-WISAILALWLTNSLNUMLWQKKPR (SEQ ID NO: 108) en donde las letras minúsculas representan separadores aminoacídicos).
En general, la proteína/polipéptido a la que se une la ligadura o el anclaje no comprende un codón de parada.
Una proteína o proteínas exógenas codificadas por el virus de acuerdo con la presente descripción generalmente comprenderán una secuencia líder (también denominada péptido señal). Una secuencia líder es, por ejemplo, una secuencia de aproximadamente 5 a 30 aminoácidos de longitud ubicada en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido.
En una forma de realización, la secuencia líder para que la proteína se exprese en la superficie de la célula cancerosa es humana, por ejemplo HuVHSS.
En una forma de realización, la estructura del casete ORF es la siguiente:
LS-POLY-TAG-TM_D
en donde
LS es una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder humana;
POLY es un polinucleótido que codifica un polipéptido o proteínas de interés, en particular uno descrito en la presente memoria;
TAG es una etiqueta, por ejemplo, una descrita en la presente memoria, tal como c-myc, en particular SEQ ID NO: 100 o 106;
TM_D es un dominio TM, por ejemplo, un dominio TM de PDGFR, por ejemplo, SEQ ID NO: 2.
Cuando el polipéptido es un scFv, entonces el ORF puede ser el siguiente:
LS-VAR1-LIN K-VAR2-TAG-TM_D
en donde
LS es una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder humana;
VAR1 es un polinucleótido que codifica una región variable tal como la región VH;
LINK es un enlazador, por ejemplo como se describe en la presente memoria, tal como un enlazador basado en las unidades de G4S, en particular Se Q ID NO: 104 GGGGSGGGGSGGGGS;
VAR2 es un polinucleótido que codifica una región variable, como una región VL;
TAG es una etiqueta, por ejemplo una descrita en la presente memoria, tal como c-myc, en particular SEQ ID NO: 100 o 106;
TM_D es un dominio TM, por ejemplo, un dominio TM de PDGFR, por ejemplo, SEQ ID NO: 2.
La descripción también se extiende a formas de realización, en particular las descritas específicamente en la presente memoria, que comprenden una etiqueta en los extremos N o C terminales de las cadenas polipeptídicas, de modo que reside dentro o fuera de la membrana. Por lo tanto, una etiqueta en el extremo C terminal ubicada dentro de la membrana es ventajosa porque no es probable que interfiera con la unión o la función del polipéptido.
Dicho esto, la expresión de la etiqueta en el extremo N terminal de una proteína expresada en la superficie puede ser útil en algunas situaciones porque puede facilitar el aislamiento, la identificación y la purificación de las células que expresan la proteína.
En una forma de realización, se emplea una combinación de un dominio transmembrana y una secuencia señal secretora para expresar una proteína codificada por el virus (por ejemplo, como se describe en la presente memoria) en la superficie de una célula cancerosa infectada. Los presentes inventores han demostrado que las proteínas codificadas se expresan solo en células que son permisivas a la infección por el virus oncolítico, es decir, las células cancerosas.
En una forma de realización, el fragmento empleado para expresar la proteína en la superficie de la célula cancerosa infectada (tal como el fragmento transmembrana) se selecciona de aproximadamente 20 a 25 aminoácidos hidrófobos que forman una hélice alfa transmembrana, por ejemplo de las proteínas que incluyen el receptor de PDGF, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, receptor de IL-6, CD28, glicoforina, receptor de LDL, proteína HA de influenza, receptor de insulina, receptor de Asialoglicoproteína, receptor de transferrina.
En una forma de realización, el fragmento empleado para expresar la proteína en la superficie de la célula cancerosa infectada (tal como el fragmento transmembrana) se selecciona del grupo que comprende secuencias de dominios TM (porciones mínimas) dadas en las SEQ ID NO: 91, 92, 93, 94 o 95:
Figure imgf000014_0001
En una forma de realización, el dominio transmembrana empleado se deriva de un receptor acoplado a proteína G o el antígeno S de hepatitis B.
En una forma de realización, una proteína de fusión que comprende un dominio extracelular de longitud completa de una proteína o fragmento de B7 y también un dominio transmembrana derivado de una proteína distinta de B7 se dispone de modo que la proteína B7 se ubica en el extremo terminal de la proteína de fusión distal de la superficie de la célula cancerosa, es decir en el exterior de la célula cancerosa, frente al espacio extracelular.
Virus
Tener la secuencia de ADN que codifica una proteína B7 o un fragmento activo bajo el control de un promotor endógeno también es ventajoso porque la proteína se expresa de acuerdo con el ciclo de vida del virus en lugar de expresarse constitutivamente. En la situación actual, la expresión continua bajo un promotor exógeno, por ejemplo, un promotor fuerte como el promotor de CMV, puede producir más proteína B7 de la necesaria para un efecto terapéutico y puede producir efectos fuera del objetivo.
Las alternativas a los dominios transmembrana para expresar proteínas en la superficie de la célula cancerosa infectada incluyen enfoques que emplean anclaje a glucofosfolípidos (también denominado anclaje a GPI) unido al aminoácido C-terminal de la proteína o fragmento extracelular (Low et al 1986, Cross 1987, Low y Saltiel 1988, Ferguson y William 1988). Los anclajes a glucofosfolípidos adecuados, para usar en la presente descripción incluyen los de Thy-1, N-CAM y DAF.
En una forma de realización, el virus oncolítico de acuerdo con la presente descripción es un adenovirus, por ejemplo, un adenovirus del grupo B. En una forma de realización, el virus de acuerdo con la presente descripción es un virus quimérico, por ejemplo EnAd. El adenovirus también es competente para la replicación.
La secuencia que codifica la proteína B7 se ubica entre el sitio de reconocimiento del codón de parada y poliA del gen adenoviral L5 y el sitio de reconocimiento del codón de parada y poliA del gen E4.
En una forma de realización, la secuencia que codifica la proteína B7 se ubica entre aproximadamente los pb 29356 y aproximadamente 29357 del genoma de EnAd, por ejemplo, como se muestra en la SEQ ID NO: 21, o una posición equivalente a la misma. La persona experta comprenderá que el valor numérico absoluto de la ubicación puede cambiar en función de cómo se asigna la numeración. Sin embargo, la posición relativa del gen insertado permanece igual independientemente de los valores numéricos absolutos empleados.
En una forma de realización, el adenovirus oncolítico de acuerdo con la presente descripción tiene una fórmula (I): 5'ITR-B1-Ba-B2-Bx-Bb-By-Bs-3'ITR (I)
en donde:
Bi es un enlace o comprende: E1A, E1B o E1A-E1B (en particular E1A, E1B o E1A-E1B);
Ba es E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;
B2 es un enlace o comprende E3 o un transgén, por ejemplo bajo un promotor endógeno o exógeno;
Bx es un enlace o una secuencia de ADN que comprende: un sitio de restricción, uno o más transgenes o ambos; Bb comprende L5;
By comprende un transgén que codifica una proteína B7 o un fragmento activo de la misma; y
B3 enlace o comprende E4.
En una forma de realización, el virus oncolítico tiene una fórmula (la):
5'ITR-Bi -Ba-B2-Bb-By-Bs-3'ITR (la)
en donde:
Bi es un enlace o comprende: E1A, E1B o E1A-E1B (en particular E1A, E1B o E1A-E1B);
Ba es E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;
B2 es un enlace o comprende E3;
Bb comprende L5;
By comprende un transgén que codifica una proteína B7 o un fragmento activo de la misma; y
B3 es un enlace o comprende E4.
En una forma de realización, el genoma viral en las construcciones de fórmula (I) y/o (la) es de Ad11 o EnAd, en particular EnAd.
El transgén que codifica la proteína B7 está bajo el control del promotor endógeno denominado promotor tardío principal. Elementos reguladores
En una forma de realización, By comprende un casete transgénico, dicho casete comprende un transgén que codifica una proteína B7 o fragmento de la misma y un elemento regulador, tal como una combinación de elementos reguladores. En una forma de realización, el elemento regulador es una secuencia aceptora de corte y empalme.
En una forma de realización, el elemento regulador es una secuencia Kozak.
En una forma de realización, por ejemplo, donde el transgén codifica una molécula de ARN policistrónico, el elemento regulador es una secuencia IRES.
En una forma de realización, la secuencia reguladora es una secuencia peptídica autoescindible de alta eficacia tal como P2A, T2A, F2A, E2A.
En una forma de realización, la secuencia reguladora es una cola de poliA.
En una forma de realización, hay al menos dos secuencias reguladoras, por ejemplo, un aceptor de corte y empalme y una secuencia Kozak o un aceptor de corte y empalme y una cola de poliA, o un aceptor de corte y empalme y una secuencia IRES, o un aceptor de corte y empalme y una secuencia DE P2A.
En una forma de realización, hay al menos tres secuencias reguladoras, por ejemplo, una secuencia aceptora de corte y empalme, una secuencia Kozak y una cola de poliA, o una secuencia aceptora de corte y empalme, una secuencia IRES o 2A y una cola de poliA; o una secuencia aceptora de corte y empalme, una secuencia Kozak y una secuencia IRES o 2A.
En una forma de realización, hay al menos cuatro secuencias reguladoras, por ejemplo, una secuencia aceptora de corte y empalme, una secuencia Kozak, una secuencia IRES o 2A y una cola de poliA, en particular ubicada entre L5 y E4 en el orden secuencia aceptora de corte y empalme, secuencia Kozak, secuencia IRES o 2A y una cola de poliA.
En una forma de realización, el transgén codifica una molécula de ARN policistrónico que comprende una secuencia reguladora tanto IRES como 2A.
Proteínas codificadas por el virus
En una forma de realización, el virus de la presente descripción codifica múltiples proteínas para la expresión en la superficie de la célula cancerosa infectada en donde al menos una es una proteína B7 o un fragmento activo de la misma, por ejemplo, se codifican dos, tres, cuatro o más proteínas diferentes, en particular, el virus codifica dos o tres proteínas para la expresión en la superficie de las células cancerosas o la secreción al espacio extracelular. La proteína en este contexto incluye una proteína de fusión. En una forma de realización, el virus de la presente descripción codifica dos proteínas B7 diferentes, fragmentos activos de las mismas o combinaciones de las mismas, por ejemplo, ambas para la expresión en una superficie de célula cancerosa.
En una forma de realización, el virus de acuerdo con la presente descripción codifica una o dos proteínas para la expresión en la superficie celular y una o dos proteínas que no son capaces de anclarse en la superficie celular, por ejemplo, están destinadas a actuar con la célula cancerosa o son para la secreción/liberación de las células.
En una forma de realización, el virus de la presente descripción codifica una proteína B7 o un fragmento activo para la expresión en la superficie de la célula cancerosa, y una forma soluble, que se libera o secreta de la célula, de la misma proteína B7 o una proteína B7 diferente (que incluye fragmentos activos) también es codificada por el virus.
En una forma de realización, al menos dos proteínas B7 diferentes o fragmentos activos están codificados por un virus de la presente descripción.
En una forma de realización, al menos una proteína expresada en la superficie celular es una proteína B7 y al menos una proteína no anclada a la célula (por ejemplo, secretada) es una proteína diferente de B7.
En una forma de realización, las múltiples proteínas pueden codificarse para ser expresadas como proteínas separadas que se procesan y expresan independientemente en la membrana de la célula cancerosa. La independencia de las proteínas en la superficie de la célula cancerosa puede tener una contribución positiva a la activación inmunitaria. Sin desear limitarnos a la teoría, el empaquetamiento de lípidos puede influir en la fluidez (es decir, la viscosidad) de la bicapa lipídica en la membrana de la célula cancerosa. La viscosidad de la membrana puede afectar la rotación y orientación de las proteínas y otras biomoléculas dentro de la membrana, lo que afecta las funciones de estas moléculas. Por lo tanto, cuando las proteínas codificadas por el virus se ubican como proteínas individuales y separadas dentro de la membrana de la célula cancerosa infectada, la fluidez de la bicapa lipídica permite el movimiento independiente de las moléculas que pueden ser un formato particularmente adecuado, por ejemplo, similar a un formato natural que es propicio para la función biológica.
En una forma de realización, las proteínas procesadas y expresadas de forma independiente están ubicadas (ancladas) en diferentes lugares, tales como ubicaciones físicamente separadas, en la membrana de la célula cancerosa.
En una forma de realización, una o más proteínas (por ejemplo, todas las proteínas) codificadas por el virus y expresadas en la superficie de la célula cancerosa infectada no son proteínas de fusión.
Como se describió anteriormente en algunas formas de realización, las proteínas se expresan como una proteína de fusión.
En una forma de realización, el virus de la presente descripción proporciona una o más proteínas independientes separadas para la expresión en la superficie celular y una o más proteínas de fusión para la expresión en la superficie celular.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus de acuerdo con la presente descripción comprende secuencias de ADN que codifican dichas proteínas múltiples para su expresión, por ejemplo en la superficie o en la célula cancerosa infectada.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus de acuerdo con la presente descripción comprende dos o más transgenes, en las mismas o diferentes ubicaciones en el genoma viral. Cuando se encuentran en la misma posición en el genoma viral, las múltiples proteínas aún se expresarán de forma independiente en la superficie de la célula cancerosa.
En una forma de realización, las múltiples proteínas (incluidas las proteínas de fusión) se codifican en diferentes ubicaciones en el genoma del virus, por ejemplo en E3, Bx y/o By, y se expresan por separado en la superficie de la célula cancerosa infectada.
En una forma de realización, las múltiples proteínas (incluidas las proteínas de fusión) están codificadas en la misma ubicación en el genoma viral y se expresan juntas en la superficie de la célula cancerosa infectada, por ejemplo, donde las proteínas codificadas se proporcionan como una proteína de fusión, en particular en donde la proteína de fusión comprende una proteína B7 o un fragmento activo de la misma.
En una forma de realización, la proteína B7 en la proteína de fusión es una proteína de longitud completa, en particular una proteína descrita en la presente memoria, como B7-1 y/o B7-2, fusionada o unida a otra proteína de interés o un fragmento activo de la misma. En una forma de realización, la proteína de fusión comprende una región transmembrana de una proteína B7. En una forma de realización, la B7 es un fragmento activo que excluye el dominio transmembrana. En la última forma de realización, se puede emplear una región de transmembrana distinta de una derivada de una proteína B7 para asegurar que la proteína de fusión se presente en la superficie de la célula cancerosa infectada.
En una forma de realización, las proteínas múltiples se codifican en la misma ubicación en el virus y se expresan como una o más proteínas de fusión juntas en la superficie de la célula cancerosa infectada.
Cuando la ubicación del (de los) gen(es) que codifica(n) una proteína o proteínas de interés en el virus es la misma, entonces los genes pueden, por ejemplo, estar unidos por una secuencia IRES o un péptido 2A.
En una forma de realización, el virus de acuerdo con la presente descripción comprende un "segundo" transgén y opcionalmente un tercer transgén (es decir, una o más de dichas proteínas múltiples, por ejemplo, que codifican un polipéptido seleccionado del grupo que comprende una citocina, una quimiocina, un ligando, y una molécula de anticuerpo, tal como una molécula de anticuerpo antagonista, y una molécula de anticuerpo agonista.
En una forma de realización, la proteína o proteínas adicionales se seleccionan independientemente del grupo que comprende un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o ligando proteico que se une a CD3, CD28, CD80, CD86, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40 y combinaciones de los mismos, por ejemplo en formas adecuadas para la expresión en la superficie de una célula cancerosa.
En una forma de realización, la proteína adicional es un anticuerpo anti-CD3, por ejemplo, seleccionado independientemente de un Muromonab-CD3 (también conocido como OKT3), otelixizumab (también conocido como TRX4), teplizumab (también conocido como hOKT3Yl (Ala-Ala)) o visilizumab.
En una forma de realización, el anticuerpo anti-CD3 está en la forma de un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un scFv que forma parte de una proteína de fusión con la región transmembrana de otra proteína, por ejemplo, el dominio transmembrana del receptor de PDGF o de la forma de la superficie celular de IgG
En una forma de realización, una molécula de anticuerpo es un inhibidor (anticuerpo antagonista) seleccionado independientemente del grupo que comprende un inhibidor de un factor de angiogénesis, tal como una molécula de anticuerpo anti-VEGF, y un inhibidor de factores de desactivación de células T, tal como una molécula de anticuerpo anti-CTLA- 4, anti-PD1 o anti-PDL1. En una forma de realización, la molécula de anticuerpo es un agonista seleccionado independientemente del grupo que comprende anticuerpos contra CD40, GITR, OX40, CD27 y 4-1BB.
En una forma de realización, un transgén adicional codifica una citocina, o una variante soluble de la misma seleccionada del grupo que comprende IL-2, IFNa, IFNp, IFNy, GM-CSF, IL-15, IL-12 y el ligando de tirosina quinasa 3 relacionado con fms (FLT3L). Ventajosamente, una o más de este grupo de proteínas expresadas por el virus, en particular como una proteína libre secretada por la célula cancerosa, puede ser particularmente adecuada para estimular una respuesta inmunitaria in vivo contra la célula cancerosa.
En una forma de realización, un transgén adicional codifica una quimiocina, seleccionada del grupo que comprende MIP1-alfa, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 y CCL21. Ventajosamente, el virus expresa una o más de este grupo de proteínas como una proteína libre que puede ser secretada por la célula cancerosa y puede ser particularmente adecuada para atraer células inmunitarias y estimular una respuesta inmunitaria contra la célula cancerosa in vivo.
En una forma de realización, además de al menos la proteína B7 expresada en la superficie de la célula cancerosa infectada, también se expresan una o más moléculas en la superficie y/o se secretan.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus codifica B7-1, B7-2 o un fragmento activo de cualquiera de las mismas o una combinación de estos.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus codifica B7-1, B7-2 o un fragmento activo de cualquiera de las mismas o una combinación de estos para la expresión en la superficie de la célula cancerosa infectada y un anticuerpo anti-CD3 (agonista) o fragmento de unión de un anticuerpo (como un scFv) también para la expresión en la superficie de la célula cancerosa, en particular cuando las proteínas se expresan como proteínas individuales en la superficie celular.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus codifica B7-1, B7-2 o un fragmento activo de cualquiera de las mismas o una combinación de estos para la expresión en la superficie de la célula cancerosa infectada y un anticuerpo anti-VEGF (antagonista) o un fragmento de unión del mismo también para la expresión en la superficie de la célula cancerosa o para su liberación desde la célula cancerosa, por ejemplo por secreción o después de la lisis/muerte de la célula cancerosa infectada.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus codifica B7-1, B7-2 o un fragmento activo de cualquiera de las mismas o una combinación de estos para la expresión en la superficie de la célula cancerosa infectada y un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o ligando proteico que se une a CD3, CD28, CD80, CD86, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40 también para la expresión en la superficie de la célula cancerosa o para su liberación desde la célula cancerosa, por ejemplo, por secreción o liberación después de la lisis/muerte de la célula cancerosa infectada.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus codifica B7-1, B7-2 o un fragmento activo de cualquiera de las mismas o una combinación de estos para la expresión en la superficie de la célula cancerosa infectada y una citocina seleccionada de IL-2, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, IL-15, IL-12 y FLT3L, por ejemplo para su liberación desde la célula cancerosa, en particular por secreción o liberación después de la lisis celular/muerte de la célula cancerosa infectada.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus codifica B7-1, B7-2 o un fragmento activo de cualquiera de las mismas o una combinación de estos para la expresión en la superficie de la célula cancerosa infectada y una quimiocina seleccionada de MIP1-alfa, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, por ejemplo para su liberación desde la célula cancerosa, en particular por secreción o liberación después de la lisis celular/muerte de la célula cancerosa infectada.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus codifica B7-1, B7-2 o un fragmento activo de cualquiera de las mismas o una combinación de estos para la expresión en la superficie de la célula cancerosa infectada y un anticuerpo anti-CD3 (agonista) o fragmento de unión de un anticuerpo (como un scFv) también para la expresión en la superficie de la célula cancerosa (en particular cuando las proteínas se expresan como proteínas individuales en la superficie celular) y además codifica una citocina o quimiocina seleccionada de IL-2, IFN-alfa, IFN-gamma, GM-CSF, IL-15, IL-12, FLT3L, MIP1-alfa, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, por ejemplo para su liberación desde la célula cancerosa, en particular por secreción o después de la lisis celular/muerte de la célula cancerosa infectada.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus codifica B7-1, B7-2 o un fragmento activo de cualquiera de las mismas o una combinación de estos para la expresión en la superficie de la célula cancerosa infectada y un anticuerpo anti-CD3 (agonista) o fragmento de anticuerpo (como un scFv) también para la expresión en la superficie de la célula cancerosa (en particular cuando las proteínas se expresan como proteínas individuales en la superficie celular) y además codifica un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o ligando proteico que se une a CD28, CD80, CD86, 4-1BB, G iTR, OX40, CD27, CD40 o un anticuerpo anti-VEGF (antagonista) también para la expresión en la superficie de la célula cancerosa o para su liberación desde la célula cancerosa, por ejemplo por secreción o liberación después de la lisis/muerte de la célula cancerosa infectada.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus codifica B7-1, B7-2 o un fragmento activo de cualquiera de las mismas o una combinación de estos para la expresión en la superficie de la célula cancerosa infectada y dos citocinas o quimiocinas diferentes seleccionadas de IL-2, IFNa, IFNP, IFNy, GM-CSF, IL-15 e IL-12, FLT3L, MIP1a, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, por ejemplo, para su liberación desde la célula cancerosa, en particular mediante la secreción después de la lisis celular/muerte de la célula cancerosa infectada.
Por lo tanto, en una forma de realización, el virus codifica B7-1, B7-2 o un fragmento activo de cualquiera de las mismas o una combinación de estos para la expresión en la superficie de la célula cancerosa infectada y un anticuerpo anti-CD3 (agonista) o fragmento de unión de un anticuerpo (como un scFv) también para la expresión en la superficie de la célula cancerosa (en particular cuando las proteínas se expresan como proteínas individuales en la superficie de la célula) y además codifica una citocina seleccionada independientemente de IL-2, IFNa, IFNy, GM-CSF, IL-15 e IL-12, y/o una quimiocina seleccionada de RANTES (CCL5), MIP1a (isoformas LD78a (CCL3) o LD78P (CCL3L1)), MIP1P que puede ser liberada desde la célula cancerosa, en particular por secreción antes y liberación después de la lisis celular/muerte de la célula cancerosa infectada.
En una forma de realización, que en particular se puede combinar con cualquiera de las formas de realización anteriores, el virus codifica además un anticuerpo anti-PD-1 (un antagonista).
En una forma de realización, la proteína o proteínas codificadas en el casete transgénico para la expresión en la membrana celular también pueden comprender un enlazador o espaciador peptídico entre el dominio transmembrana y el dominio extracelular de unión al ligando. Dichos enlazadores o espaciadores pueden agregar flexibilidad a la proteína expresada en la superficie celular que mejora la capacidad de la proteína para interactuar con su molécula objetivo, por ejemplo en una célula adyacente. Dichos enlazadores o espaciadores también pueden diseñarse o seleccionarse para promover la dimerización o trimerización de las proteínas en la superficie celular, a través de la formación de enlaces disulfuro o interacciones proteína-proteína. Por ejemplo, las regiones bisagras de las moléculas de inmunoglobulina o CD8 pueden emplearse para mejorar tanto la flexibilidad como la dimerización
En una forma de realización, la proteína o proteínas codificadas en el casete transgénico también pueden comprender una etiqueta peptídica. La etiqueta peptídica puede incluir etiquetas c-myc, poli-histidina, V5 o FLAG y puede ubicarse en el extremo N o el extremo C terminales del polipéptido, ya sea intracelular o extracelularmente, o puede estar codificada dentro de la proteína, por ejemplo, en un asa extracelular o entre el dominio transmembrana y el dominio extracelular. Las etiquetas peptídicas pueden usarse como espaciadores o enlazadores entre diferentes dominios proteicos, por ejemplo, el dominio transmembrana y el dominio extracelular, y pueden usarse para la detección o purificación de la proteína, o células que expresan la proteína.
En una forma de realización, el uno o más transgenes adicionales (distintos del gen que codifica la proteína B7 o fragmento de la misma) está bajo el control de un promotor exógeno o endógeno, por ejemplo un promotor endógeno. En una forma de realización, un transgén en la región E3 (B2) está bajo control de un promotor exógeno.
En una forma de realización, el uno o más genes transgénicos adicionales están entre la región E3 y el L5 de fibra en el genoma adenoviral, por ejemplo en una posición Bx en la construcción de fórmula (I), en particular bajo el control de un promotor exógeno. Así, en una forma de realización, un transgén en Bx está bajo el control de un exógeno.
En una forma de realización, el uno o más genes transgénicos adicionales están entre la región E4 y el L5 de fibra en el genoma del adenovirus, por ejemplo en una posición By en la construcción de fórmula (I) o (la), en particular bajo el control de un promotor endógeno, como el principal promotor tardío. Esto puede ser adicional a la proteína B7 o fragmento activo de la misma que está codificada en la región By.
En una forma de realización, se proporciona una composición que comprende un adenovirus oncolítico de acuerdo con la presente descripción, por ejemplo una composición farmacéutica, en particular que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como un diluyente o vehículo.
En una forma de realización, se proporciona un adenovirus oncolítico de acuerdo con la presente descripción o una composición que comprende el mismo, para usar como tratamiento, en particular para usar en el tratamiento del cáncer.
En una forma de realización, se proporciona un método para tratar a un paciente que lo necesita que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus oncolítico de acuerdo con la presente descripción o una composición, tal como una composición farmacéutica que comprende el mismo.
En una forma de realización, se proporciona el uso de un adenovirus oncolítico de acuerdo con la presente descripción o una composición que lo comprende para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en particular carcinomas, por ejemplo, colorrectal, pulmonar, de vejiga, renal, pancreático, cáncer de hígado, cabeza y cuello, mama u ovario.
En una forma de realización, se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia genómica de al menos 50 % de un virus de acuerdo con la presente descripción (por ejemplo, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %) y que comprende una secuencia que codifica una proteína B7 o un fragmento activo de la misma, por ejemplo una proteína B7 descrita en la presente memoria, como B7-1 o un fragmento activo de la misma. En una forma de realización, la secuencia polinucleotídica está en la forma de un plásmido.
En una forma de realización, se proporciona una célula huésped, por ejemplo, una célula de mamífero, tal como una célula HEK293 o un derivado de la misma, que comprende un virus oncolítico de acuerdo con la presente descripción o una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la presente descripción.
En una forma de realización, se proporciona un proceso para preparar un adenovirus oncolítico de acuerdo con la presente descripción que comprende una etapa de insertar un polinucleótido que codifica la proteína B7 o un fragmento activo de la misma en un adenovirus oncolítico.
En una forma de realización, se proporciona un proceso de replicación de un virus de acuerdo con la presente descripción que comprende la etapa de cultivar las células huésped en presencia del virus en condiciones adecuadas para la replicación. Generalmente, el método comprenderá una etapa adicional de recolección del virus, por ejemplo del sobrenadante o después de la lisis de las células huésped.
Definiciones
Un virus oncolítico con selectividad para las células cancerosas, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un virus que mata preferentemente a las células cancerosas, por ejemplo porque infecta preferentemente a las células cancerosas y/o el ciclo de vida del virus depende de un gen, como p53 que está desregulado, por ejemplo sobreexpresado en células cancerosas. En una forma de realización, el virus oncolítico infecta preferentemente las células cancerosas y luego replica su genoma y produce proteínas de la cápside para generar nuevas partículas de virus, por ejemplo según EnAd.
La selectividad para las células cancerosas (índice terapéutico) se puede probar como se describe en el documento WO2005/118825.
Un transgén, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un gen que se ha insertado en la secuencia del genoma del adenovirus, en donde el gen no es natural para el virus (exógeno) o no se encuentra normalmente en esa ubicación particular en el virus. Se dan ejemplos de transgenes en la presente memoria. Transgén, como se emplea en la presente memoria, también incluye un fragmento funcional del gen que es una porción del gen que cuando se inserta es adecuado para realizar la función o la mayor parte de la función del gen de longitud completa, por ejemplo, el 50 % de la función o más.
Transgén y secuencia codificante se usan indistintamente en la presente memoria en el contexto de insertos en el genoma viral, a menos que el contexto indique lo contrario. Secuencia codificante, como se emplea en la presente memoria, significa, por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica un ARN, péptido, polipéptido o proteína funcionales.
Típicamente, la secuencia codificante es ADNc para el transgén que codifica el ARN, péptido, polipéptido o proteína funcionales de interés. El ARN, péptidos, polipéptidos y proteínas funcionales de interés se describen a continuación.
En una forma de realización, el transgén tal como se emplea en la presente memoria se refiere a un segmento de ADN que contiene un gen o secuencia de ADNc que se ha aislado de un organismo y se introduce en un organismo diferente, es decir, el virus de la presente descripción. En una forma de realización, este segmento de ADN no nativo generalmente retendrá la capacidad de producir ARN, péptido, polipéptido o proteína funcionales. Los transgenes empleados pueden codificar, por ejemplo, una proteína única o un fragmento activo de la misma, proteína quimérica o una proteína de fusión.
Claramente, el genoma viral contiene secuencias codificantes de ADN. Los genes endógenos (naturales) en la secuencia genómica del virus no se consideran transgenes, dentro del contexto de la presente descripción, a menos que luego haya sido modificado por técnicas recombinantes, como que se encuentran en una ubicación no natural o un ambiente no natural.
Por lo tanto, en una forma de realización, el transgén insertado codifica una proteína, polipéptido o péptido humanos o humanizados.
En una forma de realización, el transgén comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína B7 o un fragmento activo de la misma. La presente descripción proporciona que la proteína B7 o el fragmento activo de la misma se pueden proporcionar en uno o más formatos seleccionados independientemente de una proteína de fusión, una proteína B7 simple o un fragmento activo de la misma.
La proteína B7 simple o un fragmento activo de la misma, como se emplea en la presente memoria, se refiere a proteínas que son esencialmente proteínas de tipo silvestre, por ejemplo, que no son parte de una proteína de fusión y que tienen una secuencia idéntica o similar a la proteína conocida en cuestión, en particular la proteína humana conocida. Un gen simple también incluye en donde el 10 % de los aminoácidos están sustituidos o eliminados en toda la longitud de la proteína en cuestión.
El anclaje a GPI, como se usa en la presente memoria, se refiere a un glicolípido que puede unirse al extremo C terminal de una proteína durante la modificación postraduccional. Está compuesto por un grupo fosfatidilinositol unido a través de un enlazador que contiene carbohidratos (glucosamina y manosa unidos de forma glucosídica al residuo de inositol) y a través de un puente de fosfato de etanolamina (EtNP) al aminoácido C-terminal de una proteína madura. Los dos ácidos grasos dentro del grupo hidrofóbico fosfatidil-inositol anclan la proteína a la membrana celular.
Las proteínas unidas a GPI generalmente contienen un péptido señal, por lo que se dirigen al retículo endoplásmico (RE). El extremo C terminal está compuesto de aminoácidos hidrofóbicos que permanecen insertados en la membrana del RE. Después el extremo hidrofóbico es escindido y reemplazado por el anclaje a GPI. A medida que la proteína progresa a través de la vía secretora, se transfiere a través de vesículas al aparato de Golgi y finalmente al espacio extracelular donde permanece unida al lado exterior de la membrana celular. Dado que la unión a GPI es el único medio de unión de tales proteínas a la membrana, la escisión del grupo por fosfolipasas dará como resultado la liberación controlada de la proteína desde la membrana. El último mecanismo se usa in vitro; es decir, las proteínas de membrana liberadas de las membranas en el ensayo enzimático son proteínas unidas a GPI.
La fosfolipasa C (PLC) es una enzima que se sabe que escinde el enlace fosfo-glicerol que se encuentra en las proteínas ancladas a GPI. El tratamiento con PLC provocará la liberación de proteínas unidas a GPI desde la membrana celular externa. Se sabe que el marcador de células T Thy-1 y la acetilcolinesterasa, así como las fosfatasas alcalinas intestinales y placentarias, están unidas a GPI y se liberan mediante tratamiento con PLC. Se cree que las proteínas unidas a GPI se ubican preferentemente en balsas lipídicas, lo que sugiere un alto nivel de organización dentro de los microdominios de la membrana plasmática.
Una revisión de los anclajes a GPI escrita por Ferguson, Kinoshita y Hart está disponible en el Capítulo 11 de Essentials of Glycobiology, 2da Edición.
Virus
Competente para la replicación, en el contexto de la presente descripción, se refiere a un virus que posee toda la maquinaria necesaria para replicarse en células in vitro e in vivo, es decir, sin la ayuda de una línea celular de empaquetamiento. Un vector viral, por ejemplo, con eliminación en al menos la región E1A, capaz de replicarse en una línea celular de empaquetamiento complementaria no es un virus competente para la replicación en el presente contexto.
Un vector viral es un virus con deficiencia en la replicación, que requiere una línea celular de empaquetamiento (que comprende un transgén) para replicarse.
Un virus capaz de replicarse, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un virus competente para la replicación o un virus cuya replicación depende de un factor en las células cancerosas, por ejemplo, un factor regulado positivamente, tal como p53 o similar.
El adenovirus es un adenovirus humano. "Adenovirus", "serotipo" o "serotipo de adenovirus" tal como se emplea en la presente memoria se refieren a cualquier adenovirus que pueda asignarse a cualquiera de los más de 50 serotipos de adenovirus conocidos actualmente, que se clasifican en los subgrupos A-F, y además se extienden a cualquier serotipo adenoviral, incluso los no identificados o no clasificados. Véase, por ejemplo, Strauss, "Adenovirus infections in humans", en The Adenoviruses, Ginsberg, ea., Plenum Press, Nueva York, n Y, pp. 451-596 (1984) y Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication", en Fields Virology, Vol. 2, Cuarta edición, Knipe, 35ea., Lippincott Williams & Wilkins, pp.
2265-2267 (2001), como se muestra en la Tabla 1.
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Los adenovirus se agrupan según su cápside.
El adenovirus de acuerdo con la presente descripción es un subgrupo B, por ejemplo, seleccionado independientemente del grupo que comprende o que consiste en: Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34 y Ad51, como Ad11, en particular Adllp (la cepa de Slobitski). En una forma de realización, el adenovirus de la invención tiene la cápside, tal como la hexona y/o la fibra de un adenovirus del subgrupo B, como Ad11, en particular Ad11p. En una forma de realización, el adenovirus es Ad11 o tiene la fibra y/o hexona y/o pentona de Ad11, tal como Ad11p.
El virus de la presente descripción no es un virus del grupo A.
En una forma de realización, el virus de la presente descripción no comprende una adenoproteína de muerte (ADP). El virus de la presente descripción no es un virus del grupo C.
En una forma de realización, el virus de la presente descripción no comprende más y un fragmento de parte de un virus Ad5.
Enadenotucirev (EnAd) es un adenovirus oncolítico quimérico, anteriormente conocido como ColoAd1 (WO2005/118825), con fibra, pentona y hexona de Ad11p, por lo tanto, es un virus del subgrupo B. Tiene una región quimérica E2B, que comprende ADN de Adllp y Ad3. Casi toda la región E3 y parte de la región E4 está eliminada en EnAd. Por lo tanto, tiene un espacio importante en el genoma para acomodar material genético adicional sin dejar de ser viable. Además, debido a que EnAd es un adenovirus del subgrupo B, la inmunidad preexistente en humanos es menos común que, por ejemplo, Ad5. Otros ejemplos de virus oncolíticos quiméricos con fibra, pentona y hexona de Ad11 incluyen OvAd1 y OvAd2 (véase el documento WO2006/060314).
EnAd parece infectar preferentemente células tumorales, se replica rápidamente en estas células y provoca la lisis celular. Esto, a su vez, puede generar respuestas inmunitarias inflamatorias, estimulando así al cuerpo a combatir el cáncer. Se supone que parte del éxito de EnAd está relacionado con la rápida replicación del virus in vivo.
Es importante destacar que se ha demostrado clínicamente que EnAd puede administrarse por vía sistémica (por ejemplo, mediante inyección o infusión intravenosa o intraperitoneal) y luego infectar y expresar proteínas selectivamente dentro de las células tumorales. Esta propiedad de EnAd, que puede ser compartida por Adllp y otros adenovirus del grupo B, en particular aquellos que expresan las proteínas de la cápside de Adllp (como los descritos en la presente memoria), hace posible expresar proteínas en la superficie de las células cancerosas sin tener que inyectar directamente los transgenes en el tumor, lo que no es factible para muchos tipos de cáncer.
Mientras que EnAd lisa selectivamente las células tumorales, puede ser posible introducir otras propiedades beneficiosas, por ejemplo, aumentar la actividad terapéutica del virus o reducir los efectos secundarios del virus al armarlo con transgenes, como un transgén que codifica una proteína de señalización celular o un anticuerpo, o un transgén que codifica una entidad que estimula una(s) proteína(s) de señalización celular.
Armar ventajosamente un virus, con ADN que codifica ciertas proteínas que se pueden expresar dentro de la célula cancerosa, puede permitir que las propias defensas del cuerpo se empleen para combatir las células tumorales de manera más efectiva, por ejemplo, al hacer que las células sean más visibles para el sistema inmunitario o mediante la administración de un gen/proteína terapéuticos preferentemente para atacar las células tumorales.
En una forma de realización, el adenovirus oncolítico de la presente descripción estimula el sistema inmunitario del paciente para combatir el tumor, por ejemplo mediante la reducción de la capacidad del cáncer para suprimir las respuestas inmunitarias.
En una forma de realización, el virus oncolítico tiene proteínas de fibra, hexona y pentona del mismo serotipo, por ejemplo Ad11, en particular Ad11p, por ejemplo que se encuentran en las posiciones 30812-31789, 18254-21100 y 13682-15367 de la secuencia genómica de este último, en donde las posiciones de nucleótidos son relativas a Genbank ID 217307399 (número de acceso: GC689208).
En una forma de realización, el adenovirus es enadenotucirev (también conocido como EnAd y anteriormente como ColoAd1). Enadenotucirev, como se emplea en la presente memoria, se refiere al adenovirus quimérico de SEQ ID NO: 21. Es un adenovirus quimérico oncolítico competente para la replicación que tiene propiedades terapéuticas mejoradas en comparación con los adenovirus de tipo silvestre (véase el documento WO2005/118825). EnAd tiene una región E2B quimérica, que presenta ADN de Adllp y Ad3, y deleciones en E3/E4. Los cambios estructurales en enadenotucirev resultan en un genoma que es aproximadamente 3,5kb más pequeño que Adllp, proporcionando así un "espacio" adicional para la inserción de transgenes.
Las moléculas de anticuerpo empleadas pueden comprender una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, formato de anticuerpo biespecífico que comprende anticuerpos de longitud completa o un fragmento de cualquiera de los mismos que incluye, pero no se limita a Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab') 2, Fv, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, VH o VL o VHH), scFv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores (véase, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23 (9): 1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Otros fragmentos de anticuerpos para usar en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab' descritos en las solicitudes de patentes internacionales WO2005/003169, W02005/003170 y WO2005/003171. Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades, por ejemplo, biespecíficos o pueden ser monoespecíficos (véanse, por ejemplo, los documentos WO 92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 y WO2010/035012).
Anticuerpo, como se emplea en la presente memoria, a menos que el contexto lo indique de otra manera, se refiere a un anticuerpo de longitud completa.
Los fragmentos de unión de anticuerpos se refieren a un fragmento que comprende dominios de unión, tales como un VH y/o VL que retiene la especificidad para el antígeno objetivo al que se une y, por ejemplo, Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F (ab')2, Fv, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, V h o V l o VHH), scFv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los mismos.
Enlazadores
Los enlazadores adecuados para usar en proteínas de fusión de la presente descripción incluyen:
Tabla 2. Secuencias de enlazadores de bisagra
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Tabla 3. Secuencias enlazadoras flexibles
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(S) es opcional en las secuencias 37 a 41,
Los ejemplos de enlazadores rígidos incluyen las secuencias peptídicas GAPAPAAPAPA (SEQ ID NO: 75), PPPP (SEQ ID NO: 76) y PPP.
Otros enlazadores se muestran en la Tabla 4:
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Definiciones de interés para la fórmula (I) y (Ia)
Un enlace se refiere a un enlace covalente que conecta una secuencia de ADN a otra secuencia de ADN, por ejemplo, que conecta una sección del genoma viral a otra. Por lo tanto, cuando una variable en la fórmula (I) y (la) en la presente memoria representa un enlace, la característica o elemento representado por el enlace está ausente, es decir, eliminado.
Como la estructura de los adenovirus en general es similar, los elementos a continuación se analizan en términos de los elementos estructurales y la nomenclatura comúnmente utilizada que se refiere a los mismos, que son conocidos por la persona experta. Cuando se hace referencia a un elemento en la presente memoria, nos referimos a la secuencia de ADN que codifica el elemento o una secuencia de ADN que codifica la misma proteína estructural del elemento en un adenovirus. Esto último es relevante debido a la redundancia del código de ADN. Es posible que se deba considerar la preferencia de los virus por el uso de codones para obtener resultados optimizados.
Cualquier elemento estructural de un adenovirus empleado en los virus de la presente descripción puede comprender o consistir en la secuencia natural o puede tener similitud en la longitud dada de al menos 95 %, tal como 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. La secuencia original puede modificarse para omitir el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % del material genético. La persona experta es consciente de que al realizar cambios, los marcos de lectura del virus no deben interrumpirse, de modo que se altere la expresión de proteínas estructurales.
En una forma de realización, el elemento dado es una secuencia de longitud completa, es decir, el gen de longitud completa. El gen de longitud completa tal como se emplea en la presente memoria se refiere al menos a la totalidad de la secuencia codificante de un gen, pero puede incluir cualquier región no codificante asociada, especialmente si está relacionada con la función del gen.
En una forma de realización, el elemento dado es menor que una longitud completa y conserva una función igual o correspondiente a la de la secuencia de longitud completa.
En una forma de realización para un elemento dado que es opcional en las construcciones de la presente descripción, la secuencia de ADN puede ser menor a una longitud completa y no tener funcionalidad, por ejemplo, la región E3 puede eliminarse total o parcialmente. Sin embargo, puede ser útil eliminar esencialmente toda la región E3 ya que esto optimiza el espacio disponible para insertar transgenes.
Los genes estructurales que codifican proteínas estructurales o funcionales del adenovirus generalmente están unidos por regiones no codificantes de ADN. Por lo tanto, existe cierta flexibilidad acerca de dónde "cortar" la secuencia genómica del elemento estructural de interés (especialmente las regiones no codificantes del mismo) con el fin de insertar un transgén en los virus de la presente descripción. Por lo tanto, para los propósitos de la presente descripción, el elemento se considerará un elemento estructural de referencia en la medida en que sea adecuado para su propósito y no codifique material extraño. Por lo tanto, si es apropiado, el gen se asociará con regiones no codificantes adecuadas, por ejemplo, como se encuentra en la estructura natural del virus.
Por lo tanto, en una forma de realización, un inserto, como el ADN que codifica un sitio de restricción y/o transgén, se inserta en una región no codificante del ADN del virus genómico, como un intrón o una secuencia intergénica. Dicho esto, algunas regiones no codificantes del adenovirus pueden tener una función, por ejemplo, en el corte y empalme alternativo, la regulación de la transcripción o la regulación de la traducción, y puede ser necesario que esto se deba tener en cuenta.
Los sitios identificados en la presente memoria, que están asociados con la región L5, son adecuados para acomodar una variedad de secuencias de ADN que codifican entidades complejas tales como ARNi, citocinas, proteínas de cadena única o multiméricas, tales como anticuerpos.
Un gen tal como se emplea en la presente memoria se refiere a cualquier secuencia codificante y no codificante asociada al mismo, por ejemplo intrones y exones asociados. En una forma de realización, un gen comprende o consiste solo en componentes estructurales esenciales, por ejemplo, la región codificante.
A continuación sigue un análisis relacionado con elementos estructurales específicos de los adenovirus.
Las secuencias de repetición terminal invertida (ITR) son comunes a todos los adenovirus conocidos (llamadas así por su simetría) y son los orígenes de replicación de los cromosomas virales. Otra propiedad de estas secuencias es su capacidad para formar una horquilla.
La 5'ITR tal como se emplea en la presente memoria se refiere a parte o la totalidad de una ITR del extremo 5' de un adenovirus, que retiene la función de la ITR cuando se incorpora a un adenovirus en una ubicación apropiada. En una forma de realización, la 5'ITR comprende o consiste en la secuencia de aproximadamente 1 pb a 138 pb de la SEQ ID NO: 21 o una secuencia 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a ella a lo largo de toda su longitud, en particular la secuencia que consiste en aproximadamente 1 pb a 138 pb de la SEQ ID NO: 21.
La 3'ITR tal como se emplea en la presente memoria se refiere a parte o la totalidad de una ITR del extremo 3' de un adenovirus que retiene la función de la ITR cuando se incorpora a un adenovirus en una ubicación apropiada. En una forma de realización, la 3'ITR comprende o consiste en la secuencia de aproximadamente 32189 pb a 32326 pb de la SEQ ID NO: 21 o una secuencia 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a ella a lo largo de toda su longitud, en particular la secuencia que consiste en aproximadamente 32189 pb a 32326 pb de la SEQ ID NO: 21.
B1, como se emplea en la presente memoria, se refiere a la secuencia de ADN que codifica: parte o la totalidad de un E1A de un adenovirus, parte o la totalidad de la región E1B de un adenovirus, e independientemente parte o la totalidad de la región E1A y E1B de un adenovirus.
E1A como se emplea en la presente memoria se refiere a la secuencia de ADN que codifica parte o la totalidad de una región E1A de adenovirus. El último en la presente memoria se refiere al polipéptido/proteína E1A. Se puede mutar de tal manera que la proteína codificada por el gen E1A tenga cambios de aminoácidos conservativos o no conservativos (por ejemplo, 1,2, 3, 4 o 5 cambios, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en toda la longitud) de modo que tiene: la misma función que el tipo silvestre (es decir, la proteína no mutada correspondiente); un aumento de la función en comparación con la proteína de tipo silvestre; una disminución de la función, tal como ausencia de función en comparación con la proteína de tipo silvestre; o tiene una nueva función en comparación con la proteína de tipo silvestre o una combinación de las mismas según corresponda. E1B, como se emplea en la presente memoria, se refiere a la secuencia de ADN que codifica parte o la totalidad de una región E1B de adenovirus (es decir, polipéptido o proteína), puede estar mutada de modo que la proteína codificada por el gen/región E1B tenga cambios de aminoácidos conservativos o no conservativos (por ejemplo, 1,2, 3, 4 o 5 cambios, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en toda la longitud) de modo que tenga: la misma función que el tipo silvestre (es decir, la proteína no mutada correspondiente); un aumento de la función en comparación con la proteína de tipo silvestre; una disminución de la función, tal como ausencia de función en comparación con la proteína de tipo silvestre; o tiene una nueva función en comparación con la proteína de tipo silvestre o una combinación de las mismas según corresponda.
Por lo tanto, B1 puede modificarse o no en relación con una región E1 de tipo silvestre, tal como un E1A y/o E1B de tipo silvestre. El experto en la técnica puede identificar fácilmente si E1A y/o E1B están presentes o (parcialmente) eliminados o mutados.
El tipo silvestre como se emplea en la presente memoria se refiere a un adenovirus conocido o una secuencia de un adenovirus conocido. Un adenovirus conocido es uno que ha sido identificado y nombrado, independientemente de si la información de secuencia está disponible.
En una forma de realización, B1 tiene la secuencia de 139 pb a 3932 pb de la SEQ ID NO: 21.
Ba, como se emplea en la presente memoria, se refiere a la secuencia de ADN que codifica las regiones E2B-L1-L2-L3-E2A-L4, incluidas las secuencias no codificantes, según corresponda (en particular, correspondientes a la secuencia natural de un adenovirus). Generalmente, esta secuencia no comprenderá un transgén. En una forma de realización, la secuencia es sustancialmente similar o idéntica a una secuencia contigua de un adenovirus conocido, por ejemplo, un serotipo mostrado en la Tabla 1, en particular un virus del grupo B, por ejemplo Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 o una combinación de los mismos, como Ad3, Ad11 o una combinación de estos. En una forma de realización, E2B-L1-L2-L3-E2A-L4 se refiere a que comprende estos elementos y otros elementos estructurales asociados con la región, por ejemplo Ba generalmente incluirá la secuencia que codifica la proteína IV2a, por ejemplo como sigue: IV2A IV2a-E2B-L1 -L2-L3-E2A-L4.
En una forma de realización, la región E2B es quimérica. Es decir, comprende secuencias de ADN de dos o más serotipos adenovirales diferentes, por ejemplo de Ad3 y Ad11, como Ad11p. En una forma de realización, la región E2B tiene la secuencia de 5068 pb a 10355 pb de la SEQ ID NO: 21 o una secuencia 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a ella a lo largo de toda la longitud.
En una forma de realización, el E2B en el componente Ba comprende las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 22 (que corresponde a la SEQ ID NO: 3 descrita en el documento WO2005/118825).
En una forma de realización, Ba tiene la secuencia de 3933 pb a 27184 pb de la SEQ ID NO: 21.
E3, como se emplea en la presente memoria, se refiere a la secuencia de ADN que codifica parte o la totalidad de una región E3 de adenovirus (es decir, proteína/polipéptido), puede mutar de tal manera que la proteína codificada por el gen E3 tenga cambios de aminoácidos conservativos o no conservativos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 cambios, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en toda la longitud), de modo que tenga la misma función que el tipo silvestre (la proteína no mutada correspondiente); aumento de la función en comparación con la proteína de tipo silvestre; disminución de la función, como la ausencia de función en comparación con la proteína de tipo silvestre o tiene una nueva función en comparación con la proteína de tipo silvestre o una combinación de las mismas, según corresponda.
En una forma de realización, la región E3 es de un serotipo de adenovirus dado en la Tabla 1 o una combinación de los mismos, en particular un serotipo del grupo B, por ejemplo Ad3, Ad7, Ad11 (en particular Ad11p), Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 o una combinación de los mismos, como Ad3, Ad11 (en particular Ad11p) o una combinación de los mismos. En una forma de realización, la región E3 tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 23.
En una forma de realización, la región E3 se elimina parcialmente, por ejemplo se elimina un 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %.
En una forma de realización, B2 es un enlace, en donde el ADN que codifica la región E3 está ausente.
En una forma de realización, el ADN que codifica la región E3 puede ser reemplazado o interrumpido por un transgén. Tal como se emplea en la presente memoria ", la región E3 reemplazada por un transgén como se emplea en la presente memoria incluye parte o la totalidad de la región E3 se reemplaza con un transgén.
En una forma de realización, la región B2 comprende la secuencia de 27185 pb a 28165 pb de la SEQ ID NO: 24.
En una forma de realización, B2 consiste en la secuencia de 27185 pb a 28165 pb de la SEQ ID NO: 24.
Bx, como se emplea en la presente memoria, se refiere a la secuencia de ADN en la vecindad del extremo 5' del gen L5 en BB. En la vecindad o proximal al extremo 5' del gen L5, como se emplea en la presente memoria, se refiere a: adyacente (contiguo) al extremo 5' del gen L5 o una región no codificante asociada inherentemente al mismo, es decir, colindante o contiguo al extremo cebador en 5' del gen L5 o una región no codificante asociada inherentemente al mismo. Alternativamente, en la vecindad o proximal a, puede referirse a estar cerca del gen L5, de modo que no hay secuencias codificantes entre la región Bx y el extremo 5' del gen L5.
Por lo tanto, en una forma de realización, Bx se une directamente a una base de L5 que representa, por ejemplo, el comienzo de una secuencia codificante del gen L5.
Por lo tanto, en una forma de realización, Bx se une directamente a una base de L5 que representa, por ejemplo, el comienzo de una secuencia no codificante, o se une directamente a una región no codificante asociada naturalmente con L5. Una región no codificante asociada naturalmente con L5 como se emplea en la presente memoria se refiere a parte o la totalidad de las regiones no codificantes que es parte del gen L5 o es contigua al mismo pero no parte de otro gen.
En una forma de realización, Bx comprende la secuencia de SEQ ID NO: 24. Esta secuencia es una secuencia artificial no codificante en donde se puede insertar una secuencia de ADN, por ejemplo que comprende un transgén (o casete transgénico), un sitio de restricción o una combinación de los mismos. Esta secuencia es ventajosa porque actúa como un amortiguador que permite cierta flexibilidad en la ubicación exacta del transgén a la vez que minimiza los efectos perjudiciales sobre la estabilidad y la viabilidad del virus.
El (los) inserto(s) puede(n) ocurrir en cualquier lugar dentro de la SEQ ID NO: 24 desde el extremo 5', el extremo 3' o en cualquier punto entre el pb 1 a 201, por ejemplo, entre los pares de bases 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34, 34/35, 35/36, 36/37, 37/38, 38/39, 39/40, 40/41, 41/42, 42/43, 43/44, 44/45, 45/46, 46/47, 47/48, 48/49, 49/50, 50/51, 51/52, 52/53, 53/54, 54/55, 55/56, 56/57, 57/58, 58/59, 59/60, 60/61, 61/62, 62/63, 63/64, 64/65, 65/66, 66/67, 67/68, 68/69, 69/70, 70/71, 71/72, 72/73, 73/74, 74/75, 75/76, 76/77, 77/78, 78/79, 79/80, 80/81, 81/82, 82/83, 83/84, 84/85, 85/86, 86/87, 87/88, 88/89, 89/90, 90/91, 91/92, 92/93, 93/94, 94/95, 95/96, 96/97, 97/98, 98/99, 99/100, 100/101, 101/102, 102/103, 103/104, 104/105, 105/106, 106/107, 107/108, 108/109, 109/110, 110/111, 111/112, 112/113, 113/114, 114/115, 115/116, 116/117, 117/118, 118/119, 119/120, 120/121, 121/122, 122/123, 123/124, 124/125, 125/126, 126/127, 127/128, 128/129, 129/130, 130/131, 131/132, 132/133, 133/134, 134/135, 135/136, 136/137, 137/138, 138/139, 139/140, 140/141, 141/142, 142/143, 143/144, 144/145, 145/146, 146/147, 147/148, 148/149, 150/151, 151/152, 152/153, 153/154, 154/155, 155/156, 156/157, 157/158, 158/159, 159/160, 160/161, 161/162, 162/163, 163/164, 164/165, 165/166, 166/167, 167/168, 168/169, 169/170, 170/171, 171/172, 172/173, 173/174, 174/175, 175/176, 176/177, 177/178, 178/179, 179/180, 180/181, 181/182, 182/183, 183/184, 184/185, 185/186, 186/187, 187/188, 189/190, 190/191, 191/192, 192/193, 193/194, 194/195, 195/196, 196/197, 197/198, 198/199, 199/200 o 200/201.
En una forma de realización, Bx comprende la SEQ ID NO: 24 con una secuencia de ADN insertada entre pb 27 y pb 28 o un lugar correspondiente entre las posiciones 28192 pb y 28193 pb de la SEQ ID NO: 24.
En una forma de realización, Bx tiene la secuencia de 28166 pb a 28366 pb de la SEQ ID NO: 21. En una forma de realización, Bx es un enlace.
Bb, como se emplea en la presente memoria, se refiere a la secuencia de ADN que codifica la región L5. Como se emplea en la presente memoria, la región L5 se refiere a la secuencia de ADN que contiene el gen que codifica el polipéptido/proteína de la fibra, según sea apropiado en el contexto. El gen/región de la fibra codifica la proteína de la fibra, que es un componente principal de la cápside de los adenovirus. La fibra funciona en el reconocimiento del receptor y contribuye a la capacidad del adenovirus para unirse e infectar selectivamente las células.
En los virus de la presente descripción, la fibra puede ser de cualquier serotipo de adenovirus y los adenovirus que son quiméricos como resultado de cambiar la fibra por una de un serotipo diferente también se incluyen en la presente descripción. En una forma de realización, la fibra es de un virus del grupo B, en particular Ad11, tal como Ad11p.
En una forma de realización, Bb tiene la secuencia de 28367 pb a 29344 pb de la SEQ ID NO: 21.
La secuencia de ADN en relación con By tal como se emplea en la presente memoria se refiere a la secuencia de ADN en la vecindad del extremo 3' del gen L5 de Bb. En la vecindad o proximal al extremo 3' del gen L5, como se emplea en la presente memoria, se refiere a: adyacente (contiguo) al extremo 3' del gen L5 o una región no codificante asociada inherentemente al mismo, es decir, colindante o contigua al extremo cebador 3' del gen L5 o una región no codificante asociada inherentemente al mismo (es decir, todo o parte de una secuencia no codificante endógena a L5). Alternativamente, en la vecindad o proximal a, puede referirse a estar cerca del gen L5, de modo que no hay secuencias codificantes entre la región By y el extremo 3' del gen L5.
Por lo tanto, en una forma de realización, By se une directamente a una base de L5 que representa el "extremo" de una secuencia codificante.
Por lo tanto, en una forma de realización, By se une directamente a una base de L5 que representa el "extremo" de una secuencia no codificante, o se une directamente a una región no codificante asociada naturalmente con L5.
Inherentemente y naturalmente se usan indistintamente en la presente memoria. En una forma de realización, By comprende la secuencia de SEQ ID NO: 25. Esta secuencia es una secuencia no codificante en donde se puede insertar una secuencia de ADN, que comprende, por ejemplo, un transgén (o casete transgénico), un sitio de restricción o una combinación de los mismos. Esta secuencia es ventajosa porque actúa como un amortiguador que permite cierta flexibilidad en la ubicación exacta del transgén a la vez que minimiza los efectos perjudiciales sobre la estabilidad y viabilidad del virus.
El (los) inserto(s) puede(n) ocurrir en cualquier lugar dentro de la SEQ ID NO: 22 desde el extremo 5', el extremo 3' o en cualquier punto entre los puntos 1 a 35, por ejemplo entre los pares de bases 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34 o 34/35.
En una forma de realización, By comprende la SEQ ID NO: 25 con una secuencia de ADN insertada entre las posiciones pb 12 y 13 o un lugar correspondiente a 29356 pb y 29357 pb en la SEQ ID NO: 21. En una forma de realización, el inserto es una inserción de sitio de restricción. En una forma de realización, la inserción de sitio de restricción comprende uno o dos sitios de restricción. En una forma de realización, el sitio de restricción es una inserción de sitio de restricción de 19 pb que comprende 2 sitios de restricción. En una forma de realización, la inserción de sitio de restricción es una inserción de sitio de restricción de 9 pb que comprende 1 sitio de restricción. En una forma de realización, la inserción de sitio de restricción comprende uno o dos sitios de restricción y al menos un transgén, por ejemplo uno o dos o tres transgenes, tales como uno o dos transgenes. En una forma de realización, el sitio de restricción es una inserción de sitio de restricción de 19 pb que comprende 2 sitios de restricción y al menos un transgén, por ejemplo uno o dos transgenes. En una forma de realización, la inserción de sitio de restricción es una inserción de sitio de restricción de 9 pb que comprende 1 sitio de restricción y al menos un transgén, por ejemplo uno o dos transgenes. En una forma de realización, dos sitios de restricción intercalan uno o más, tal como dos transgenes (por ejemplo, en un casete transgénico). En una forma de realización, cuando By comprende dos sitios de restricción, dichos sitios de restricción son diferentes entre sí. En una forma de realización, dichos uno o más sitios de restricción en By son de origen no natural (como únicos) en el genoma de adenovirus particular en el que se han insertado. En una forma de realización, dichos uno o más sitios de restricción en By son diferentes a otros sitios de restricción ubicados en otras partes del genoma de adenovirus, por ejemplo, diferentes a sitios de restricción de origen natural o sitios de restricción introducidos en otras partes del genoma, tales como Bx. Por lo tanto, en una forma de realización, el sitio o sitios de restricción permiten que el ADN en la sección se corte específicamente.
En una forma de realización, By tiene la secuencia de 29345 pb a 29379 pb de la SEQ ID NO: 21.
En una forma de realización, el inserto está después del par de bases 12 en la SEQ ID NO: 25.
En una forma de realización, el inserto está aproximadamente en la posición 29356 pb de la SEQ ID NO: 21.
En una forma de realización, el inserto es un casete transgénico que comprende uno o más transgenes, por ejemplo 1, 2 o 3, tales como 1 o 2.
E4, como se emplea en la presente memoria, se refiere a la secuencia de ADN que codifica parte o la totalidad de una región E4 de adenovirus (es decir, región de polipéptido/proteína), que puede mutar de modo que la proteína codificada por el gen E4 tenga cambios de aminoácidos conservativos o no conservativos (por ejemplo 1, 2, 3, 4 o 5 cambios, adiciones y/o deleciones de aminoácidos), y tiene la misma función que el tipo silvestre (la proteína no mutada correspondiente); aumento de la función en comparación con la proteína de tipo silvestre; disminución de la función, tal como la ausencia de función en comparación con la proteína de tipo silvestre o tiene una nueva función en comparación con la proteína de tipo silvestre o una combinación de las mismas según corresponda.
En una forma de realización, la región E4 se elimina parcialmente, por ejemplo, se elimina un 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 %. En una forma de realización, la región E4 tiene la secuencia de 32188 pb a 29380 pb de la SEQ ID NO: 21.
En una forma de realización, E4 está presente excepto por la región E4orf4 que se elimina.
En una forma de realización B3 es un enlace, es decir, en donde E4 está ausente.
En una forma de realización B3 tiene la secuencia que consiste en de 32188 pb a 29380 pb de la SEQ ID NO: 21.
Como se emplea en la presente memoria, los rangos numéricos incluyen los números extremos.
El experto apreciará que los elementos en las fórmulas en la presente memoria, como la fórmula (I), (la) son contiguos y pueden incorporar secuencias de ADN no codificantes, así como los genes y secuencias de ADN codificantes (características estructurales) mencionados en la presente memoria. En una o más formas de realización, las fórmulas de la presente descripción intentan describir una secuencia natural en el genoma de adenovirus. En este contexto, será claro para la persona experta que la fórmula se refiere a los elementos principales que caracterizan la sección de interés del genoma y no pretende ser una descripción exhaustiva del tramo genómico del ADN.
E1A, E1B, E3 y E4, tal como se emplean en la presente memoria, se refieren cada uno independientemente al tipo silvestre y sus equivalentes, formas mutadas o parcialmente eliminadas de cada región como se describe en la presente memoria, en particular una secuencia de tipo silvestre de un adenovirus conocido.
"Inserto", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una secuencia de ADN que se incorpora en el extremo 5', el extremo 3' o dentro de un segmento de referencia de secuencia de ADN dado de modo que interrumpe la secuencia de referencia. Una secuencia de referencia se emplea como un punto de referencia con respecto a la cual se ubica el inserto. En el contexto de la presente descripción, las inserciones generalmente ocurren dentro de la SEQ ID NO: 24 o de la SEQ ID NO: 25. Un inserto puede ser una inserción de sitio de restricción, un casete transgénico o ambos. Cuando se interrumpe la secuencia, el virus todavía comprenderá la secuencia original, pero generalmente será como dos fragmentos que intercalan el inserto.
En una forma de realización, el transgén o casete transgénico no comprende un transposón de inserción no sesgado, tal como un transposón TN7 o parte del mismo. El transposón Tn7 tal como se emplea en la presente memoria se refiere a un transposón de inserción no sesgado como se describe en el documento WO2008/080003.
En una forma de realización, el transgén o casete transgénico comprende además una secuencia o elemento regulador.
Otras secuencias reguladoras
"Regulador de la expresión génica" (o elemento regulador/regulatorio) como se emplea en la presente memoria se refiere a un elemento genético, tal como un promotor, potenciador o una secuencia aceptora de corte y empalme que desempeña un papel en la expresión génica, típicamente iniciando o potenciando la transcripción o traducción.
La "secuencia aceptora de corte y empalme", el "aceptor de corte y empalme" o el "sitio de corte y empalme", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una secuencia reguladora que determina cuándo una molécula de ARNm será reconocida por pequeñas ribonucleoproteínas nucleares del complejo denominado espliceosoma. Una vez ensamblados, el espliceosoma cataliza el corte y empalme entre el sitio aceptor de corte y empalme de la molécula de ARNm a un sitio donador de corte y empalme que produce una molécula de ARNm madura que puede traducirse para producir un único polipéptido o proteína.
Se pueden emplear secuencias aceptoras de corte y empalme de diferentes tamaños en la presente invención y estas se pueden describir como aceptor de corte y empalme corto (pequeño), aceptor de corte y empalme (mediano) y aceptor de corte y empalme ramificado (grande).
SSA, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un aceptor de corte y empalme corto, que típicamente comprende solo el sitio de corte y empalme, por ejemplo 4 pb. SA, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un aceptor de corte y empalme, que comprende típicamente el aceptor de corte y empalme corto y el tracto de polipirimidina, por ejemplo 16 pb. bSA, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un aceptor de corte y empalme ramificado, que comprende típicamente el aceptor de corte y empalme corto, el tracto de polipirimidina y el punto de ramificación, por ejemplo 26 pb.
En una forma de realización, el aceptor de corte y empalme empleado en las construcciones de la descripción son CAGG o SEQ ID NO: 3 o 4. En una forma de realización, el SSA tiene la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: CAGG. En una forma de realización, el SA tiene la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 23. En una forma de realización, el bSA tiene la secuencia nucleotídica de cagg. En una forma de realización, la secuencia aceptora de corte y empalme se selecciona independientemente del grupo que comprende: tgctaatctt cctttctctc ttcagg (SEQ ID NO: 4), tttctctctt cagg (SEQ ID NO: 3) y cagg.
En una forma de realización, al sitio de corte y empalme le prosigue inmediatamente (es decir, es seguido en una dirección de 5' a 3' por) una secuencia Kozak consenso que comprende CCACC. En una forma de realización, el sitio de corte y empalme y la secuencia Kozak están intercalados (separados) por hasta 100 o menos pb. En una forma de realización, la secuencia Kozak tiene la secuencia nucleotídica de CCACC.
Típicamente, cuando está bajo el control de un promotor endógeno o exógeno (como un promotor endógeno), la secuencia codificante estará precedida inmediatamente por una secuencia Kozak. El inicio de la región codificante se indica mediante el codón de inicio (AUG), por ejemplo, en el contexto de la secuencia (gcc)gccRccAUGg [SEQ ID NO: 105] el inicio de las secuencias codificantes se indica por las bases en negritas. Una letra minúscula denota bases comunes en esta posición (que, sin embargo, pueden variar) y las letras mayúsculas indican bases muy conservadas, es decir, la secuencia 'AUGG' es constante o rara vez cambia, si alguna vez lo hace; 'R' indica que generalmente se observa una purina (adenina o guanina) en esta posición, y no se conoce la función de la secuencia entre paréntesis (gcc). Por lo tanto, en una forma de realización, el codón de inicio AUG se incorpora en una secuencia Kozak.
La secuencia de ADN interna de entrada al ribosoma, como se emplea en la presente memoria, se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia interna de entrada al ribosoma (IRES). IRES, como se emplea en la presente memoria, significa una secuencia nucleotídica que permite el inicio de la traducción de una secuencia de ARN mensajero (ARNm), que incluye el inicio que comienza dentro de una secuencia de ARNm. Esto es particularmente útil cuando el casete codifica un ARNm policistrónico. El uso de una IRES da como resultado un ARNm policistrónico que se traduce en múltiples proteínas o péptidos individuales. En una forma de realización, la secuencia de ADN interna de entrada al ribosoma tiene la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 6. En una forma de realización, una IRES particular solo se usa una vez en el genoma. Esto puede tener beneficios con respecto a la estabilidad del genoma.
"Péptido 2A de autoescisión con alta eficiencia" o "péptido 2A" como se emplea en la presente memoria se refiere a un péptido que se escinde eficientemente después de la traducción. Los péptidos 2A adecuados incluyen P2A, F2A, E2A y T2A. Los presentes inventores han observado que una vez que una secuencia de ADN específica que codifica un péptido 2A dado se usa una vez, la misma secuencia de ADN específica no puede usarse una segunda vez. Sin embargo, la redundancia en el código de ADN puede utilizarse para generar una secuencia de ADN que se traduce en el mismo péptido 2A. El uso de péptidos 2A es particularmente útil cuando el casete codifica un ARNm policistrónico. El uso de péptidos 2A da como resultado que la traducción de una cadena polipeptídica única, la cual se modifica después de la traducción, genere múltiples proteínas o péptidos individuales.
En una forma de realización, el péptido P2A codificado que se emplea tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En una forma de realización, el péptido F2A codificado que se emplea tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En una forma de realización, el péptido E2A codificado que se emplea tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. En una forma de realización, el péptido T2A codificado que se emplea tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
En una forma de realización, un ARNm o cada ARNm codificado por un transgén está/n compuesto/s por una secuencia señal de poliadenilación, tal como típicamente en el extremo de una secuencia de ARNm, por ejemplo, como se muestra en la SEQ ID NO: 5. Así, en una forma de realización, el transgén o el casete transgénico comprende al menos una secuencia que codifica una secuencia señal de poliadenilación.
"PoliA", "señal de poliadenilación" o "secuencia de poliadenilación", como se emplea en la presente memoria, significa una secuencia de ADN, que generalmente contiene un sitio AATAAA, que una vez transcrita puede ser reconocida por un complejo multiproteico que escinde y poliadenila la molécula de ARNm naciente.
En una forma de realización, la secuencia de poliadenilación tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 5.
En una forma de realización, la construcción no incluye una secuencia de poliadenilación. En una forma de realización, el regulador de la expresión génica es una secuencia aceptora de corte y empalme.
En una forma de realización, la secuencia que codifica una proteína/polipéptido/péptido, tal como un anticuerpo o fragmento de unión del anticuerpo, comprende además una señal de poliadenilación.
En una forma de realización, se proporciona un virus o construcción con una secuencia descrita en la presente memoria, por ejemplo, un virus seleccionado NG-330 (SEQ ID NO: 16); NG-334 (SEQ ID NO: 17); NG-345 (SEQ ID NO: 18); NG-346 (SEQ ID NO: 19); NG-347 (SEQ ID NO: 20) y NG-348 (SEQ ID NO: 96).
En una forma de realización, el virus es NG-347 (SEQ ID NO: 20) o NG-348 (SEQ ID NO: 96).
Formulaciones
La presente descripción también se refiere a una formulación farmacéutica de un virus como se describe en la presente memoria.
En una forma de realización, se proporciona una formulación parenteral líquida, por ejemplo para infusión o inyección, de un oncolítico capaz de replicarse de acuerdo con la presente descripción en donde la formulación proporciona una dosis en el intervalo de 1x1010 a 1x1014 partículas virales por volumen de dosis.
Una formulación parenteral se refiere a una formulación diseñada para no administrarse a través del sistema gastrointestinal. Las vías de administración parenteral típicas incluyen inyección, implantación o infusión. En una forma de realización, la formulación se proporciona en una forma para administración en bolo.
En una forma de realización, la formulación parenteral está en la forma de una inyección. La inyección incluye inyección intravenosa, subcutánea, intratumoral o intramuscular. Inyección, como se emplea en la presente memoria significa la inserción de líquido en el cuerpo a través de una jeringa. En una forma de realización, el método de la presente descripción no implica inyección intratumoral.
En una forma de realización, la formulación parenteral está en la forma de una infusión.
Infusión, como se emplea en la presente memoria, significa la administración de fluidos a una velocidad más lenta por goteo, bomba de infusión, controlador de jeringa o dispositivo equivalente. En una forma de realización, la infusión se administra durante un período en el intervalo de 1,5 minutos a 120 minutos, tal como aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 65, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 o 115 minutos.
En una forma de realización, una dosis de la formulación inferior a 100 ml, por ejemplo 30 ml, tal como la administrada por un controlador de jeringa.
En una forma de realización, la inyección se administra como una inyección lenta, por ejemplo, durante un período de 1,5 a 30 minutos.
En una forma de realización, la formulación es para vía administración intravenosa (i.v. ). Esta vía es particularmente efectiva para la administración del virus oncolítico porque permite un acceso rápido a la mayoría de los órganos y tejidos y es particularmente útil para el tratamiento de metástasis, por ejemplo, metástasis establecidas, especialmente las localizadas en regiones altamente vascularizadas como el hígado y los pulmones.
Las formulaciones terapéuticas típicamente serán estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra formulación parenteral adecuada para la administración a un ser humano y puede formularse como un dispositivo precargado, como una jeringa o frasco, en particular como una dosis única.
La formulación generalmente comprenderá un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un vehículo isotónico no tóxico que sea compatible con el virus y en el que el virus sea estable durante el período de tiempo requerido.
El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un dispersante o tensioactivo como la lecitina o un tensioactivo no iónico como el polisorbato 80 o 40. En dispersiones, la presencia de un tensioactivo puede ayudar al mantenimiento del tamaño de partícula requerido. Los ejemplos de agentes isotónicos incluyen azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición.
En una forma de realización, las formulaciones parenterales empleadas pueden comprender uno o más de los siguientes: un tampón, por ejemplo ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico, un tampón fosfato y/o un tampón T ris, un azúcar, por ejemplo, dextrosa, manosa, sacarosa o similar, una sal como cloruro de sodio, cloruro de magnesio o cloruro de potasio, un detergente como un tensioactivo no iónico como brij, PS-80, PS-40 o similar. La formulación también puede comprender un conservante tal como EDTA o etanol o una combinación de EDTA y etanol, que se cree que evitan una o más vías de posible degradación.
En una forma de realización, la formulación comprenderá virus oncolíticos purificados de acuerdo con la presente descripción, por ejemplo 1x1010 a 1x1014 partículas virales por dosis, tales como 1 x1010 a 1x1012 partículas virales por dosis. En una forma de realización, la concentración de virus en la formulación está en el intervalo de 2x108 a 2x1014 vp/ml, tal como 2 x 1012 vp/ml.
En una forma de realización, la formulación parenteral comprende glicerol.
En una forma de realización, la formulación comprende adenovirus oncolítico como se describe en la presente memoria, HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico), glicerol y tampón.
En una forma de realización, la formulación parenteral consiste en un virus de la descripción, HEPES, por ejemplo, 5 mM, glicerol, por ejemplo, 5-20 % (v/v), ácido clorhídrico, por ejemplo, para ajustar el pH en el rango de 7-8 y agua para inyección.
En una forma de realización, se formulan 0,7 ml de virus de la descripción a una concentración de 2 x 1012 vp/ml en HEPES 5 mM, glicerol al 20 % con un pH final de 7,8.
Un análisis exhaustivo de los vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
En una forma de realización, la formulación se proporciona como una formulación para administraciones tópicas que incluyen inhalación.
Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles dosificadores que contienen gases propulsores o soluciones inhalables libres de gases propulsores. Los polvos inhalables de acuerdo con la descripción generalmente contendrán un virus como se describe en la presente memoria con un excipiente fisiológicamente aceptable.
Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (por ejemplo, glucosa o arabinosa), disacáridos (por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa), oligo y polisacáridos (por ejemplo, dextranos), polialcoholes (por ejemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sales (por ejemplo, cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sí. Los mono o disacáridos se usan adecuadamente, tales como lactosa o glucosa, particularmente pero no exclusivamente en forma de sus hidratos.
Las partículas para la deposición en el pulmón requieren un tamaño de partícula inferior a 10 micras, tal como 1-9 micras, por ejemplo de 0,1 a 5 |_im, en particular de 1 a 5 |_im. El tamaño de la partícula que porta el virus es de importancia primordial y, por lo tanto, en una forma de realización, el virus de acuerdo con la presente descripción puede adsorberse o absorberse sobre una partícula, tal como una partícula de lactosa del tamaño dado.
Los gases propulsores que pueden usarse para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la técnica. Los gases propulsores adecuados se seleccionan entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano y halohidrocarburos tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propulsores mencionados anteriormente pueden usarse solos o en mezclas de los mismos.
Los gases propulsores particularmente adecuados son los derivados de alcanos halogenados seleccionados entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y sus mezclas son particularmente adecuados.
Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor también pueden contener otros ingredientes, como codisolventes, estabilizadores, agentes tensioactivos (surfactantes), antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la técnica.
Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor de acuerdo con la invención pueden contener hasta 5 % en peso de sustancia activa. Los aerosoles de acuerdo con la invención contienen, por ejemplo, 0,002 a 5 % en peso, 0,01 a 3 % en peso, 0,015 a 2 % en peso, 0,1 a 2 % en peso, 0,5 a 2 % en peso o 0,5 a 1 % en peso del ingrediente activo.
Alternativamente, las administraciones tópicas al pulmón también pueden ser mediante la administración de una solución líquida o formulación en suspensión, por ejemplo con el empleo de un dispositivo como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (por ejemplo, el nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a un compresor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Virginia).
El virus de la invención puede administrarse disperso en un disolvente, por ejemplo, en forma de una solución o una suspensión, por ejemplo, como ya se describió anteriormente para las formulaciones parenterales. Se puede suspender en una solución fisiológica apropiada, por ejemplo, solución salina u otro solvente farmacológicamente aceptable o una solución tamponada. Las soluciones tamponadas conocidas en la técnica pueden contener 0,05 mg a 0,15 mg de edetato disódico, 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anhidro y 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 ml de agua para alcanzar un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0.
Las suspensiones o formulaciones en solución terapéuticas también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen tampones (por ejemplo, tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato y tampón bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (por ejemplo, Albúmina sérica), EDTA, cloruro de sodio., liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las soluciones o suspensiones pueden encapsularse en liposomas o microesferas biodegradables. La formulación generalmente se proporcionará en una forma sustancialmente estéril mediante el empleo de procesos de fabricación estériles.
Esto puede incluir la producción y esterilización por filtración del disolvente/solución tamponada utilizada para la formulación, la suspensión aséptica del anticuerpo en la solución de disolvente tamponado estéril y la dispensación de la formulación en recipientes estériles por métodos familiares para los expertos en la técnica.
La formulación nebulizable de acuerdo con la presente descripción puede proporcionarse, por ejemplo, como unidades de dosis única (por ejemplo, envases o frascos de plástico sellados) empaquetados en envolturas de papel de aluminio. Cada frasco contiene una dosis unitaria en un volumen, por ejemplo, 2 ml, de tampón disolvente/solución.
La presente descripción también se extiende a soluciones o suspensiones líquidas administradas por vía intranasal, por ejemplo, mediante el empleo de un dispositivo como se describe en los documentos WO2009/068877 y US2004/0153033. Tratamiento
En otro aspecto, la presente descripción se extiende a un virus o una formulación del mismo como se describe en la presente memoria para su uso en el tratamiento, en particular para el tratamiento del cáncer.
En una forma de realización, el método de tratamiento es para usar en el tratamiento de un tumor.
Tumor, tal como se emplea en la presente memoria, pretende referirse a una masa anormal de tejido que resulta de una división celular excesiva que es incontrolada y progresiva, también llamada neoplasia. Los tumores pueden ser benignos (no cancerosos) o malignos. El tumor abarca todas las formas de cáncer y metástasis. En una forma de realización, el tumor es canceroso.
En una forma de realización, el tumor es un tumor sólido. El tumor sólido puede estar localizado o en metástasis.
En una forma de realización, el tumor es de origen epitelial.
En una forma de realización, el tumor es un tumor maligno, tal como cáncer colorrectal, hepatoma, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de tiroides, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello o cáncer de pulmón.
En una forma de realización, el tumor es una neoplasia maligna colorrectal.
Malignidad como se emplea en la presente memoria se refiere a células cancerosas.
En una forma de realización, el adenovirus oncolítico se emplea en el tratamiento o prevención de metástasis.
En una forma de realización, el método o formulación de la presente memoria se emplea en el tratamiento de cánceres resistentes a medicamentos.
En una forma de realización, el virus se administra en combinación con la administración de un tratamiento o terapia adicional contra el cáncer.
En una forma de realización, se proporciona un virus o formulación de acuerdo con la presente descripción para usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, por ejemplo, un cáncer descrito anteriormente.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar un cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus o formulación de acuerdo con la presente descripción a un paciente que lo necesite, por ejemplo, un paciente humano.
En una forma de realización, el virus oncolítico o formulación de la presente memoria se administra en combinación con otra terapia.
"En combinación", como se emplea en la presente memoria, pretende abarcar cuando el virus oncolítico se administra antes, simultáneamente y/o después del tratamiento o terapia contra el cáncer.
La terapia contra el cáncer incluye cirugía, radioterapia, terapia dirigida y/o quimioterapia.
Tratamiento contra el cáncer, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un tratamiento con un compuesto terapéutico o agente biológico, por ejemplo, un anticuerpo destinado a tratar el cáncer y/o una terapia de mantenimiento del mismo.
En una forma de realización, el tratamiento del cáncer se selecciona de cualquier otra terapia anticancerosa que incluye un agente quimioterapéutico; un agente anticanceroso dirigido, tal como un conjugado de fármaco y anticuerpo; radioterapia, terapia con radioisótopos o cualquier combinación de los mismos.
En una forma de realización, el virus de la presente descripción, tal como un adenovirus oncolítico, puede usarse como un pretratamiento a la terapia, tal como una cirugía (terapia neoadyuvante), para reducir el tumor, tratar metástasis y/o prevenir metástasis o metástasis adicionales. El adenovirus oncolítico puede usarse después de la terapia, como una cirugía (terapia adyuvante), para tratar metástasis y/o prevenir metástasis o metástasis adicionales.
En una forma de realización, un virus o formulación de la presente descripción se emplea en una terapia de mantenimiento.
Simultáneamente, como se emplea en la presente memoria, es la administración del tratamiento adicional contra el cáncer al mismo tiempo o aproximadamente al mismo tiempo que la formulación de adenovirus oncolítico. El tratamiento puede estar contenido dentro de la misma formulación o administrarse como una formulación separada.
En una forma de realización, el virus se administra en combinación con la administración de un agente quimioterapéutico.
Agente quimioterapéutico, como se emplea en la presente memoria, pretende referirse a agentes químicos antineoplásicos específicos o fármacos que son selectivamente destructivos para las células y tejidos malignos. Por ejemplo, agentes alquilantes, antimetabolitos, antraciclinas, alcaloides vegetales, inhibidores de topoisomerasas y otros agentes antitumorales. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos específicos incluyen doxorrubicina, 5-fluorouracilo (5-FU), paclitaxel, capecitabina, irinotecán y platinos como cisplatino y oxaliplatino. El profesional puede elegir la dosis en función de la naturaleza del cáncer que se está tratando.
En una forma de realización, el agente terapéutico es ganciclovir, que puede ayudar a controlar las respuestas inmunitarias y/o la vascularización tumoral.
En una forma de realización, una o más terapias empleadas en el método de la presente memoria son metronómicas, es decir, un tratamiento continuo o frecuente con dosis bajas de fármacos contra el cáncer, a menudo administrados concomitantemente con otros métodos de terapia.
Los adenovirus oncolíticos del subgrupo B, en particular Ad11 y los derivados de ellos, como EnAd, pueden ser particularmente sinérgicos con la quimioterapia porque parecen tener un mecanismo de acción que es en gran medida independiente de la apoptosis, al destruir las células cancerosas mediante un mecanismo predominantemente necrolítico. Además, la inmunosupresión que ocurre durante la quimioterapia puede permitir que el virus oncolítico funcione con mayor eficiencia.
La dosis terapéutica como se emplea en la presente memoria se refiere a la cantidad de virus, como el adenovirus oncolítico, que es adecuado para lograr el efecto terapéutico deseado cuando se emplea en un régimen de tratamiento adecuado, por ejemplo, mejora los síntomas o afecciones de una enfermedad, en particular sin provocar efectos secundarios limitantes de la dosis. Una dosis puede considerarse una dosis terapéutica en el tratamiento del cáncer o metástasis cuando el número de partículas virales puede ser suficiente para producir lo siguiente: el crecimiento tumoral o metastásico se ralentiza o se detiene, o se descubre que el tumor o la metástasis disminuyen de tamaño, y/o se extiende el tiempo de vida del paciente. Las dosis terapéuticas adecuadas son generalmente un equilibrio entre el efecto terapéutico y la toxicidad tolerable, por ejemplo, donde el efecto secundario y la toxicidad son tolerables dado el beneficio logrado por la terapia.
En una forma de realización, se proporciona una administración sistémica de múltiples dosis de una formulación parenteral de un adenovirus oncolítico de acuerdo con la presente descripción en un único ciclo de tratamiento, por ejemplo, en donde la dosis total administrada en cada administración está en el rango de 1x1010 a 1x1014 partículas virales por dosis.
En una forma de realización, se administran una o más dosis (por ejemplo, cada dosis) de virus o composición que comprende el mismo de manera que la velocidad de suministro de partículas virales esté en el intervalo de 2x1010 partículas por minuto a 2x1012 partículas por minuto.
En una forma de realización, un virus o construcción terapéutica de acuerdo con la presente descripción (incluida una formulación que comprende los mismos) se administra semanalmente, por ejemplo, una semana 1, la dosis se administra en el día 1, 3, 5, seguido de una dosis cada semana posterior.
En una forma de realización, un virus o construcción terapéutica de acuerdo con la presente descripción (incluida una formulación que comprende los mismos) se administra dos veces por semana o tres veces por semana, por ejemplo, se administra en la semana 1 uno en los días 1, 3 y 5, y en la semana 2 o 3 también se administra los días 1, 3 y 5 de las mismas. Este régimen de dosificación puede repetirse tantas veces como sea apropiado.
En una forma de realización, un virus o construcción terapéutica de acuerdo con la presente descripción (incluida una formulación que comprende los mismos) se administra mensualmente, por ejemplo en un ciclo de tratamiento o como terapia de mantenimiento.
En una forma de realización, los virus y las construcciones de la presente descripción se preparan mediante técnicas recombinantes. El experto apreciará que el genoma del adenovirus armado puede fabricarse por otros medios técnicos, incluida la síntesis completa del genoma o un plásmido que comprende parte de todo el genoma. El experto apreciará que en el caso de sintetizar el genoma, la región de inserción puede no comprender los nucleótidos del sitio de restricción, ya que estos últimos son artefactos después de la inserción de genes mediante el uso de métodos de clonación.
En una forma de realización, el genoma de adenovirus armado se fabrica completamente de manera sintética, por ejemplo, de acuerdo con la SEQ ID NO: 109, que se empleó con casetes transgénicos en las SEQ ID Nos: 18, 20, 96, 101, 102, 103.
La descripción en la presente memoria se extiende además a un adenovirus de fórmula (I) o una subfórmula de la misma, que se obtiene o puede obtenerse mediante la inserción de un transgén o casete transgénico.
"Es" como se emplea en la presente memoria significa que comprende.
En el contexto de esta descripción, "que comprende" debe interpretarse como "que incluye".
Las formas de realización de la invención que comprenden ciertas características/elementos también pretenden extenderse a formas de realización alternativas que "consisten" o "consisten esencialmente" en los elementos/características de interés.
Cuando sea técnicamente apropiado, se pueden combinar formas de realización de la invención.
Cualquier forma de realización específica y explícitamente mencionada en la presente memoria puede formar la base de una exención de responsabilidad ya sea sola o en combinación con una o más formas de realización adicionales.
Los encabezados en la presente memoria se emplean para dividir el documento en secciones y no están destinados a ser utilizados para interpretar el significado de la descripción proporcionada en la presente memoria.
La presente invención se describe adicionalmente solo a modo de ilustración en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Producción de virus EnAd que expresa el antígeno activador de células T CD80
El plásmido pEnAd2.4 se usó para generar el plásmido pNG-330 mediante la inserción directa de un casete que codifica el antígeno activador de células T humanas CD80 (SEq ID NO: 11). El casete de pNG-330 contiene una secuencia aceptora de corte y empalme corta en 5' CAGG, una secuencia de ADNc de CD80 humano y una secuencia de poliadenilación en 3' (SEq ID NO: 5). En la figura 3A se muestra un esquema del casete transgénico insertado. La construcción del plásmido se confirmó por secuenciación de ADN.
Producción de virus y caracterización
Las referencias en la presente memoria a virus tales como NG-330-00 son simplemente referencias a "00" en lotes particulares del virus NG-330. Se puede usar una nomenclatura similar para otros virus.
El plásmido pNG-330 se linealizó mediante digestión de restricción con la enzima AscI para producir el genoma del virus NG-330 (SEQ ID NO: 16). El ADN digerido se purificó por extracción con fenol/cloroformo y se precipitó durante 16 horas, -20 °C en 300 |_il de etanol de > 95 % de grado de biología molecular y 10 |_il de acetato de sodio 3 M. El ADN precipitado se sedimentó por centrifugación a 14000 rpm, 5 minutos y se lavó en 500 |_il de etanol al 70 %, antes de centrifugar nuevamente, 14000 rpm, 5 minutos. El sedimento de ADN limpio se secó al aire, se resuspendió en 500 |_il de OptiMEM que contenía 15 |_il de reactivo de transfección de lipofectamina y se incubó durante 30 minutos, RT. Después la mezcla de transfección se añadió gota a gota a un matraz T-25 que contenía células 293 cultivadas hasta un 70 % de confluencia. Después de la incubación de las células con la mezcla de transfección durante 2 horas a 37 °C, CO2 al 5 %, se añadieron 4 ml de medio celular (DMEM alto en glucosa con glutamina suplementada con FBS al 2 %) a las células y los matraces se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2.
Las células 293 transfectadas se monitorearon cada 24 horas y se complementaron con medio adicional cada 48-72 horas. La producción de virus se controló mediante la observación de un efecto citopático significativo (CPE) en la monocapa celular. Una vez que se observó extenso CPE, el virus se cosechó a partir de las células 293 mediante tres ciclos de congelación-descongelación. Los virus cosechados se usaron para reinfectar células 293 con el fin de amplificar las reservas de virus. La producción de virus viables durante la amplificación se confirmó por observación de CPE significativo en la monocapa celular. Una vez que se observó CPE, el virus se cosechó a partir de las células 293 mediante tres ciclos de congelación-descongelación. La reserva amplificada se usó para una amplificación adicional antes de que el virus se purificara mediante doble banda de cloruro de cesio para producir una reserva de virus NG-330.
Ejemplo 2: Caracterización de la actividad del virus NG-330 en comparación con EnAd en líneas celulares de carcinoma La replicación del virus NG-330 o EnAd (evaluada por qPCR) y la expresión de CD80 en membrana (evaluada por citometría de flujo (Figuras 4 y 5) se compararon en la línea celular de carcinoma de colon HT-29 y la línea celular de carcinoma de pulmón A549. NG-330 es un virus derivado de EnAd que contiene un casete transgénico que codifica el antígeno activador de células T humanas, CD80 después del gen tardío de EnAd, L5 (Fibra). En la Figura 3a se muestra un esquema del casete insertado. La producción del virus NG-330 se detalla en el Ejemplo 1. Se sembraron líneas celulares de carcinoma A549 o HT-29 en placas de 6 pocillos a densidades celulares de 7,5e5 células/pocillo para las células A549 o 2,e6 células/pocillo para las células HT-29. Las placas se incubaron durante 18 horas, a 37 °C, 5 % de CO2, antes de que las células se infectaran con 100 partículas de virus EnAd o NG-330 por célula (ppc) o se dejaran sin infectar. Los ensayos se llevaron a cabo 24, 48 o 72 horas después de la infección.
Replicación de virus evaluada por qPCR
Se utilizaron las líneas celulares HT-29 y A549 infectadas durante 24, 48 o 72 horas con 100 ppc de EnAd o NG-330 o no infectadas para la cuantificación del ADN viral mediante qPCR. Los sobrenadantes celulares se recogieron y se clarificaron por centrifugación durante 5 minutos, 1200 rpm. Se extrajo el ADN de 10 |_il de sobrenadante mediante el uso del kit de extracción de ADN GenElute de Sigma, de acuerdo con el protocolo del fabricante. También se preparó una curva patrón con partículas de virus EnAd (2,5e10-2,5e5vp) y se extrajo con el kit Genelute de Sigma. Cada muestra o patrón extraído se analizó por qPCR mediante el uso de un conjunto de sonda-cebador específico para el gen E3 de EnAd.
La cuantificación de la cantidad de genomas virales detectados por célula demostró que la replicación de los virus NG-330 y EnAd era comparable en las líneas celulares HT-29 (Figura 4A) y A549 (Figura 4B). No se pudieron detectar genomas virales en células no infectadas (datos no mostrados).
Expresión de CD80 en la superficie celular evaluada por citometría de flujo
Las líneas celulares HT-29 y A549 infectadas durante 24, 48 o 72 horas con 100 ppc de EnAd o NG-330 o sin infectar se usaron para el análisis de la expresión del transgén CD80 en la superficie celular. Las células tumorales se retiraron de la superficie de la placa mediante tratamiento con tripsina, se centrifugaron y luego se resuspendieron en BSA/PBS al 1 %. Luego, las muestras se incubaron a 5 °C durante 1 hora con tampón, anticuerpo de control de isotipo de ratón conjugado con Cy5 o anticuerpo anti-CD80 humano conjugado con Cy5 (clon 2D10). Todas las muestras también se tiñeron conjuntamente con la tinción para células vivas/muertas de Zombie Aqua para diferenciar las células viables. Las muestras se lavaron 3 veces con BSA/PBS al 1 % antes del análisis por citometría de flujo (FACS, Attune) para determinar la viabilidad celular y la expresión de la proteína CD80 en la superficie celular. El análisis mostró que CD80 podía detectarse en la superficie celular tanto en células A549 (Figura 5A) como HT-29 (Figura 5B) tratadas con NG-330 pero no en las tratadas con EnAd o no tratadas.
Comparación de la potencia oncolítica del virus
Las células de carcinoma de colon HT-29 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad celular de 2,5e4 células/pocillo. Las placas se incubaron durante 4 horas, a 37 °C, 5 % de CO2, antes de que las células se infectaran con partículas de virus EnAd o NG-330 en un rango de densidad de infección de 100-0,39 partículas por célula (ppc). La viabilidad de las células HT-29 se evaluó mediante el uso del reactivo Cell Titre 96 MTS (Promega: G3581) 72 horas después de la infección. La cuantificación del % de supervivencia celular en cada densidad de infección demostró que la potencia oncolítica de NG-330 era comparable a EnAd en células HT29 (Figura 6).
Ejemplo 3: Producción de virus EnAd que expresan el antígeno activador de células T CD80 y la citocina IFNa
El plásmido pEnAd2.4 se utilizó para generar el plásmido pNG-343 mediante la inserción directa de un casete que codifica el antígeno activador de células T humanas CD80 (SEQ ID NO 11) y la citocina humana interferón a (IFNa, SEQ ID NO: 12). El casete de pNG-343 contiene: una secuencia aceptora de corte y empalme corta en 5' CAGG; ADNc de IFNa humano; una secuencia del péptido P2A autoescindible de alta eficiencia (SEQ ID NO: 7); secuencia de ADNc de CD80 humano y una secuencia de poliadenilación en 3' (SEQ ID NO: 5). En la figura 3B se muestra un esquema del casete transgénico insertado. La construcción del plásmido se confirmó por secuenciación de ADN.
Producción de virus y caracterización
El plásmido pNG-343 se linealizó mediante digestión de restricción con la enzima AscI para producir el genoma del virus NG-343 (SEQ ID NO: 17). El virus NG-343 se amplifica y purifica de acuerdo con los métodos detallados en el Ejemplo 1.
Virus de referencia 4: Producción de virus EnAd que expresan el dominio extracelular del ligando de tirosina quinasa 3 similar a FMS, la quimiocina MIP1a y la citocina IFNa
El plásmido pEnAd2.4 se usa para generar el plásmido pNG-345 mediante la inserción directa de un casete que codifica una variante soluble del ligando de tirosina quinasa-3 similar a FMS (Flt3L, SEQ ID NO: 13), MIP1a (isoforma LD78P, SEQ ID NO: 14) e IFNa (SEQ ID NO: 12). El casete de pNG-345 contiene: una secuencia aceptora de corte y empalme corta en 5' CAGG; ADNc de Flt3L humano; una secuencia del péptido P2A autoescindible de alta eficiencia (SEQ ID NO: 7); ADNc de MIP1a humano; una secuencia del péptido T2A autoescindible de alta eficiencia (SEQ ID NO: 10); ADNc de IFNa humano y una secuencia de poliadenilación en 3' (SEQ ID NO: 5). En la figura 3D se muestra un esquema del casete transgénico insertado. La construcción del plásmido se confirma mediante secuenciación de ADN.
Producción de virus y caracterización
El plásmido pNG-345 se linealiza mediante digestión de restricción con la enzima AscI para producir el genoma del virus NG-345 (SEQ ID NO: 18). El virus NG-345 se amplifica y purifica de acuerdo con los métodos detallados en el Ejemplo 1.
Ejemplo 5: Producción de virus EnAd que expresan el antígeno activador de células T CD80, la quimiocina MIP1a y el ligando de Flt3
El plásmido pEnAd2.4 se utilizó para generar los plásmidos pNG-346 mediante la inserción directa de un casete que codifica el antígeno activador de células T humanas CD80 (SEQ ID NO 11), la proteína inflamatoria de macrófagos humana 1a (MIP1a, SEQ ID NO. 14) y el ligando de Flt3 humano (SEQ ID NO: 13). El casete de pNG-346 contiene: una secuencia aceptora de corte y empalme corta en 5' CAGG; ADNc de IFNa humano; una secuencia del péptido P2A autoescindible de alta eficiencia (SEq ID NO: 7); ADNc de MIP1a humano (isoforma LD78 P); una secuencia del péptido T2A autoescindible de alta eficiencia (SEQ ID NO: 10); secuencia de ADNc del ligando de Flt3 humano y una secuencia de poliadenilación en 3' (SEQ ID NO: 5). En la Figura 3E se muestra un esquema del casete transgénico insertado. La construcción del plásmido se confirma mediante secuenciación de ADN.
Producción de virus y caracterización
El plásmido pNG-346 se linealiza mediante digestión de restricción con la enzima AscI para producir el genoma del virus NG-346 (SEQ ID NO: 19). El virus NG-346 se amplifica y purifica de acuerdo con los métodos detallados en el Ejemplo 1
Ejemplo 6: Producción de virus EnAd que expresan el antígeno activador de células T CD80, la quimiocina MIP1a y la citocina IFNa
El plásmido pEnAd2.4 se utilizó para generar los plásmidos pNG-347 mediante la inserción directa de un casete que codifica el antígeno activador de células T humanas CD80 (SEQ ID NO: 11), la proteína inflamatoria de macrófagos humana 1a (MIP1a, SEQ ID NO. 14) y la citocina humana interferón a (IFNa, Se Q ID NO: 12). El casete de pNG-347 contiene: una secuencia aceptora de corte y empalme corta en 5' CAGG; ADNc de IFNa humano; una secuencia del péptido P2A autoescindible de alta eficiencia (Se Q ID NO: 7); ADNc de MIP1a humano (isoforma LD78 P); una secuencia del péptido T2A autoescindible de alta eficiencia (SEQ ID NO: 10); secuencia de ADNc de CD80 humano y una secuencia de poliadenilación en 3' (SEQ ID NO: 5). En la figura 3F se muestra un esquema del casete transgénico insertado. La construcción del plásmido se confirma mediante secuenciación de ADN.
Producción de virus y caracterización
El plásmido pNG-347 se linealiza mediante digestión de restricción con la enzima AscI para producir el genoma del virus NG-347 (SEQ ID NO: 20). El virus NG-347 se amplifica y purifica de acuerdo con los métodos detallados en el Ejemplo 1.
Ejemplo 7: Producción de virus EnAd que expresan el antígeno activador de células T CD80 y un fragmento de anticuerpo Fv de cadena sencilla anclado a la membrana, contra la cadena £ del complejo CD3 humano (CD3e)
El plásmido pEnAd2.4 se usó para generar los plásmidos pNG-348 mediante la inserción directa de un casete que codifica el antígeno activador de células T humanas CD80 (SEQ ID NO: 11) y una forma quimérica anclada a la membrana del Fv de cadena sencilla anti-CD3e humano (SEQ ID NO: 15). El casete de pNG-348 contiene: una secuencia aceptora de corte y empalme corta en 5' CAGG; ADNc de scFv anti-CD3e humano anclado a membrana; una secuencia del péptido P2A autoescindible de alta eficiencia (SEQ ID NO: 7); secuencia de ADNc de CD80 humano y una secuencia de poliadenilación en 3' (SEQ ID NO: 5). En la figura 3C se muestra un esquema del casete transgénico insertado. La construcción del plásmido se confirma mediante secuenciación de ADN.
Producción de virus y caracterización
El plásmido pNG-348 se linealiza por digestión de restricción con la enzima AscI para producir el genoma del virus NG-348 (SEQ ID NO: 96). El virus NG-348 se amplifica y purifica de acuerdo con los métodos detallados en el Ejemplo 1.
Ejemplo 8: Actividad del virus EnAd, NG-343, que expresa dos transgenes; el antígeno activador de células T CD80 y la citocina IFNa Caracterización de la actividad del virus NG-343 en comparación con EnAd en líneas celulares de carcinoma
La replicación del virus NG-343 o EnAd (evaluada por qPCR), la expresión del transgén CD80 (evaluada por citometría de flujo) o la expresión del transgén IFNa (evaluada por ELISA) se compararon en la línea celular de carcinoma de colon, HT-29 o en la línea celular de carcinoma de pulmón, A549. NG-343 es un virus derivado de EnAd que contiene un casete transgénico que codifica el antígeno activador de células T humanas, CD80, así como la citocina humana Interferón alfa 2b ubicada después del gen tardío de EnAd, L5 (Fibra). Un esquema del casete insertado se muestra en la Figura 3B. La producción del virus NG-343 se detalla en el Ejemplo 3. Las líneas celulares de carcinoma A549 o HT-29 se sembraron en placas de 12 pocillos a densidades celulares de 7,5x105 células/pocillo para las células A549 o 1,4x106 células/pocillo para las células HT-29. Las placas se incubaron durante 18 horas, a 37 °C, 5 % de CO2, antes de que las células se infectaran con EnAd o NG-343 a 100 partículas de virus por célula (ppc) o se dejaran sin infectar. Los ensayos se llevaron a cabo 24, 48 o 72 horas después de la infección.
Replicación de virus evaluada por qPCR
Las células HT-29 infectadas durante 24, 48 o 72 horas con 100 ppc de EnAd o NG-343 o no infectadas se usaron para cuantificar el ADN viral mediante qPCR. Los sobrenadantes celulares se recogieron y se clarificaron por centrifugación durante 5 minutos, 1200 rpm. Se extrajo el ADN de 10 |_il de sobrenadante mediante el uso del kit de extracción de ADN GenElute de Sigma, de acuerdo con el protocolo del fabricante. También se preparó una curva patrón mediante el uso de partículas de virus EnAd (2,5x1010 a 2,5 x105 vp) y se extrajo mediante el uso del kit Genelute de Sigma. Cada muestra o patrón extraído se analizó por qPCR mediante el uso de un conjunto de sonda-cebador específico para el gen E3 de EnAd.
La cuantificación de la cantidad de genomas virales detectados por célula demostró que la replicación del virus NG-343 y EnAd era comparable en todos los puntos de tiempo analizados (Figura 7A). No se pudieron detectar genomas virales en células no infectadas (datos no mostrados).
Análisis de la expresión de IFNa por ELISA
Los sobrenadantes de las líneas celulares HT-29 o A549 infectadas durante 24, 48 o 72 horas con 10 ppc de EnAd o NG-343 o sin infectar se analizaron para determinar la expresión de IFNa secretado por ELISA.
Los sobrenadantes de cultivo se retiraron de cada pocillo y se centrifugaron durante 5 minutos, 1200 rpm para eliminar los restos celulares. Los sobrenadantes se diluyeron en tampón de ensayo BSA/PBS al 5 % (1:2 o 1:50 o 1:100) y el ELISA se llevó a cabo con el uso del kit para IFN alfa humano Verikine (Pbl assay science) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las concentraciones de IFNa secretado se determinaron mediante interpolación de las curvas patrón. La expresión de IFNa que aumentó en los sobrenadantes celulares durante el curso de la infección se detectó en las líneas celulares HT-29 y A549 (Figura 7B)
Expresión de CD80 en la superficie celular evaluada por citometría de flujo
Las líneas celulares A549 infectadas durante 48 o 72 horas con 10 ppc de EnAd o NG-343 o no infectadas se usaron para el análisis de la expresión del transgén CD80 en la superficie celular. En el punto de tiempo adecuado después de la infección, las células A549 se retiraron de la superficie de la placa mediante tratamiento con tripsina, se centrifugaron y luego se resuspendieron en BSA/PBS al 1 %. Luego, las muestras se incubaron a 5 °C durante 1 hora con tampón, anticuerpo de control de isotipo de ratón conjugado con Cy5 o anticuerpo anti-CD80 humano conjugado con Cy5 (clon 2D10). Todas las muestras también se tiñeron conjuntamente con la tinción para células vivas/muertas de Zombie Aqua para diferenciar las células viables. Las muestras se lavaron 3 veces con BSA/PBS al 1 % antes del análisis por citometría de flujo (FACS, Attune) para determinar la viabilidad celular y la expresión de la proteína CD80 en la superficie celular. El análisis de la expresión de CD80 frente a la tinción de células vivas/muertas mostró que tanto a las 48 como a las 72 horas después de la infección, se pudo detectar CD80 en la superficie celular de las células tratadas con NG-343 pero no en las células con EnAd o de control no infectadas (UIC) (Figura 8). La viabilidad celular a las 72 horas después del tratamiento con virus no fue suficiente para llevar a cabo un análisis exhaustivo de la expresión de CD80, sin embargo, se pudieron detectar altos niveles de CD80 en células vivas y moribundas tratadas con NG-343 en este punto de tiempo (Figura 8D, panel inferior).
La expresión de la proteína CD80 se comparó luego en células HT-29 y A549 a las 48 horas después de la infección con 100 ppc. Las muestras se cosecharon y se tiñeron como se describió anteriormente antes del análisis de la viabilidad celular y la expresión de la proteína CD80 en la superficie celular. El análisis de la expresión de CD80 en este punto de tiempo solo en células teñidas como células vivas mostró que CD80 podía detectarse en la superficie de ~91 % de las células HT-29 tratadas con NG-343 y ~98 % de las células A549 tratadas con NG-343 pero no en los controles tratados con EnAd.
Ejemplo 9: Selectividad de la actividad del virus NG-343 y expresión transgénica en líneas celulares de carcinoma, de fibroblastos estromales y epiteliales.
Para demostrar que los transgenes IFNa y CD80 codificados en el virus NG-343 se expresan selectivamente solo en células permisivas a la infección por NG-343 o EnAd, se midió la replicación del virus (evaluada por qPCR), la expresión de IFNa (evaluada por ELISA) y la expresión de CD80 (evaluada por citometría de flujo) en células cancerosas (HT-29) que se sabe que son permisivas a la infección por EnAd, líneas celulares de fibroblastos (WI-38 y MRC-5) previamente caracterizadas como no permisivas y una línea de células bronquiales epiteliales (BE) que muestra solo una permisividad limitada a la infección por EnAd. Brevemente, las células se sembraron en placas de 12 pocillos y se infectaron 18 horas después de la siembra con 100 ppc de virus NG-343 o EnAd para las células WI38, MRC5 o b E o 10 ppc de virus NG-343 o EnAd para las células HT-29. Las células se incubaron con partículas virales durante 4 horas antes de que el medio de infección se retirara de las células y se reemplazara con medio de cultivo fresco. A 1 hora o 72 horas después del período de infección de 4 horas, se recogieron los sobrenadantes celulares para su análisis por qPCR o ELISA y las células se trataron con tripsina para retirarlas de las placas para su análisis por citometría de flujo.
Replicación viral selectiva de nG-343 y EnAd
Para el análisis por qPCR, los sobrenadantes celulares se recogieron y se clarificaron por centrifugación durante 5 minutos, 1200 rpm. Se extrajo el ADN de 10 |_il de sobrenadante mediante el uso del kit de extracción de ADN GenElute de Sigma, de acuerdo con el protocolo del fabricante. También se preparó una curva patrón con el uso de partículas de virus EnAd (2,5x1010 a 2,5x105 vp) y se extrajo mediante el uso del kit Genelute de Sigma. Cada muestra o patrón extraído se analizó por qPCR mediante el uso de un conjunto de sonda-cebador específico para el gen E3 de EnAd.
La cuantificación de la cantidad de genomas virales detectados por célula demostró que la replicación del virus NG-343 y EnAd era comparable en todas las líneas celulares analizadas (Figura 9A).
Expresión transgénica selectiva con NG-343
Para la detección de la expresión de IFNa, los sobrenadantes celulares se recogieron y se clarificaron mediante centrifugación durante 5 minutos, 1200 rpm. Los sobrenadantes se diluyeron en tampón de ensayo BSA/PBS al 5 % (1:2 o 1:50 o 1:100) y el ELISA se llevó a cabo con el uso del kit para IFN alfa humano Verikine (Pbl assay science) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las concentraciones de IFNa secretado se determinaron mediante interpolación a partir de la curva patrón. La expresión de IFNa solo se pudo detectar en los sobrenadantes de las células h T-29 infectadas con NG-343 y no fue detectable (menos del límite inferior de cuantificación [<LLOQ]) en ninguna de las líneas celulares de fibroblastos o la línea celular de epitelio bronquial (Figura 9B).
Para la expresión de CD80 en la superficie celular, luego las células se incubaron a 5 °C durante 1 hora con tampón, anticuerpo de control de isotipo de ratón conjugado con Cy5 o anticuerpo anti-CD80 humano conjugado con Cy5 (clon 2D10). Todas las muestras también se tiñeron conjuntamente con la tinción para células vivas/muertas de Zombie Aqua para diferenciar las células viables. Las muestras se lavaron 3 veces con BSA/PBS al 1 % antes del análisis por citometría de flujo (FACS, Attune) para determinar la viabilidad celular y la expresión de la proteína CD80 en la superficie celular. De acuerdo con los datos de expresión de IFNa, la expresión de CD80 solo se pudo detectar en células HT-29, sin expresión detectable en las líneas celulares de fibroblastos o de epitelio bronquial (Figura 9C).
En conjunto, estos datos demostraron que tanto los transgenes de IFNa como CD80 se expresan selectivamente en células permisivas a la infección por el virus EnAd, es decir, células de carcinoma, y la codificación de los transgenes no altera la selectividad del virus NG-343 en comparación con el virus EnAd parental.
Ejemplo 10: Actividad de la expresión transgénica con NG-343 en la activación de células inmunitarias
Para determinar si el tratamiento de las células tumorales con el virus NG-343 podría conducir a una potenciación de las respuestas inmunitarias innatas en comparación con ausencia de tratamiento o con tratamiento basado en EnAd, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién aisladas se cultivaron conjuntamente con células tumorales infectadas con NG- 343 o EnAd o no se infectaron. La activación de las células inmunitarias se evaluó mediante análisis de citometría de flujo de las poblaciones celulares de la inmunidad innata o análisis por ELISA de los sobrenadantes de cocultivos. Brevemente, las células A549 de carcinoma de pulmón se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 4x105 células/pocillo. Después de 20 hrs las células se infectaron con 10 ppc de EnAd o virus n G-343 o no se infectaron y después se incubaron durante 24 horas, a 37 grados, 5 % de CO2. Las PBMC aisladas de un donante humano sano mediante centrifugación en gradiente de densidad se agregaron después a los pocillos de cultivo de A549 en una proporción de 5 PBMC a 1 célula A549. A las 48 horas después de la adición de las PBMC, se recogieron los sobrenadantes del cocultivo de las placas. Para analizar la activación de las células dendríticas en este punto, las células se incubaron a 5 °C durante 1 hora con tampón, anticuerpos de control de isotipo de ratón conjugados con Alexa Fluor 488, PE, PerCP/Cy5.5, BV605 o BV412, anticuerpo anti-CD14 conjugado con Alexa Fluor 488, anticuerpo anti-CD80 conjugado con PE, anti-HLA-DR conjugado con PerCP. Cy5.5, anti-CD3 conjugado con BV605 o anticuerpo anti-PD-Ll conjugado con BV421. Todas las muestras también se tiñeron conjuntamente con la tinción para células vivas/muertas de Zombie Aqua para diferenciar las células viables. Las muestras se lavaron 3 veces con BSA/PBS al 1 % antes del análisis por citometría de flujo (FACS, Attune). Las células viables que se tiñeron negativas tanto para CD14 como para CD3 pero positivas para HLA-DR se definieron como la población de células dendríticas. La expresión del marcador de activación de las d C, CD80 y PD-L1 se comparó en esta población (Figura 10). Estos análisis revelaron que las células tumorales infectadas con NG-343 pudieron inducir un aumento de los niveles superficiales de CD80 y PD-L1 en la superficie de las DC en comparación con el cultivo de células tumorales infectadas por EnAd o no infectadas.
Ejemplo 11: Actividad del virus EnAd, NG-347, que expresa tres transgenes; el antígeno activador de células T CD80, la quimiocina MIP1a y la citocina IFNa Caracterización de la actividad del virus NG-347 en comparación con EnAd en líneas celulares de carcinoma
La expresión del transgén CD80 (evaluada por citometría de flujo) y la expresión del transgén IFNa o MIP1a (CCL3) (evaluada por ELISA) se compararon en la línea celular de carcinoma de colon, HT-29 o en la línea celular de carcinoma de pulmón, A549, tratadas con NG-347 y EnAd. NG-347 es un virus derivado de EnAd que contiene un casete transgénico que codifica el antígeno activador de células T humanas, CD80, la citocina humana Interferón alfa 2b y la quimiocina humana MIP1a (isoforma LD78P). La expresión transgénica está bajo el control del promotor tardío principal endógeno del virus. Un esquema del casete insertado se muestra en la Figura 3F. La producción del virus NG-347 se detalla en el Ejemplo 6. Las líneas celulares de carcinoma A549 o HT-29 se sembraron en placas de 12 pocillos a densidades celulares de 7,5x105 células/pocillo para las células A549 o 1,4x106 células/pocillo para las células Ht -29. Las placas se incubaron durante 18 horas, a 37 °C, 5 % de CO2, antes de que las células se infectaran con 100 partículas de virus EnAd o NG-347 por célula (ppc) o se dejaran sin infectar. Los ensayos se llevaron a cabo 24, 48 o 72 horas después de la infección.
Análisis de la expresión de IFNa o MIP1a por ELISA
Los sobrenadantes de las líneas celulares HT-29 o A549 infectadas durante 24, 48 o 72 horas con 100 ppc de EnAd o NG-347 o no infectadas se analizaron para determinar la expresión de IFNa secretado o MIP1a secretada mediante ELISA.
Los sobrenadantes de cultivo se prepararon de acuerdo con los métodos detallados en el Ejemplo 9. El ELISA para IFNa se llevó a cabo mediante el uso del kit para IFN alfa Verikine Human (Pbl assay science) y el ELISA para MIP1a se llevó a cabo con el uso del kit de ELISA para CCL3 humano Quantikine (R & D systems). Ambos ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las concentraciones de IFNa o MIP a secretadas se determinaron mediante interpolación de las curvas patrón. La expresión de IFNa y MIP1a aumentó en los sobrenadantes celulares durante el curso de la infección y se detectó para las líneas celulares HT-29 y A549 (Figura 11A y Figura 11B).
Análisis de la expresión de CD80 mediante citometría de flujo
La expresión de la proteína CD80 se comparó en la superficie de las células HT-29 y A549 a las 48 horas después de la infección. Las células fueron cosechadas y teñidas de acuerdo con los métodos detallados en el ejemplo 9. Las células se analizaron para determinar la viabilidad celular y la expresión de la proteína CD80 en la superficie celular mediante citometría de flujo. El análisis de la expresión de CD80 en este punto de tiempo en las células vivas mostró que CD80 puede detectarse en la superficie de ~96 % de las células HT-29 tratadas con NG-347 y ~99 % de las células A549 tratadas con NG-347 pero no se detectó tinción en los controles tratados con EnAd (Fig. 11C).
Datos de referencia 12: Actividad del virus EnAd, NG-345, que expresa tres transgenes; la citocina Ligando de Flt3, la quimiocina Mip1a y la citocina IFNa. Caracterización de la actividad del virus NG-345 en comparación con EnAd en líneas celulares de carcinoma
Se comparó la expresión transgénica del Ligando de Flt3, IFNa y MIP1a (evaluada por ELISA) en la línea celular de carcinoma de colon, HT-29 o la línea celular de carcinoma de pulmón, A549, tratadas con NG-345 y EnAd. NG-345 es un virus derivado de EnAd que contiene un casete transgénico que codifica una variante soluble del ligando de Flt-3 humano, la citocina humana Interferón alfa 2b y la quimiocina humana MIP1a (isoforma LD78P). La expresión transgénica está bajo el control del promotor tardío principal endógeno del virus. En la figura 3D se muestra un esquema del casete insertado. La producción del virus NG-345 se detalla en el Ejemplo 4. Las líneas celulares de carcinoma A549 o HT-29 se sembraron en placas de 12 pocillos a densidades celulares de 7,5x105 células/pocillo para las células A549 o 1,4x106 células/pocillo para las células HT-29. Las placas se incubaron durante 18 horas, a 37 °C, 5 % de CO2, antes de que las células se infectaran con 100 partículas de virus EnAd o NG-345 por célula (ppc) o se dejaran sin infectar. Los ensayos se llevaron a cabo 24, 48 o 72 horas después de la infección.
Análisis de la expresión del ligando de FLt-3, IFNa o MIP1a mediante ELISA
Los sobrenadantes de las líneas celulares HT-29 o A549 infectadas durante 24, 48 o 72 horas con 100 ppc de EnAd o NG-345 o sin infectar se analizaron para determinar la expresión del ligando de Flt3 secretado, IFNa secretado o MIP1a secretado por ELISA.
Los sobrenadantes de cultivo se prepararon de acuerdo con los métodos detallados en el Ejemplo 9. El ELISA para IFNa se llevó a cabo mediante el uso del kit para IFN alfa Verikine Human (Pbl assay science), el ELISA para MIP1a se llevó a cabo con el uso del kit de ELISA para CCL3 humano Quantikine (R & D systems) y el ELISA para Flt3L mediante el uso del Kit de ELISA para Flt3L humano (Abcam). Todos los ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las concentraciones de IFNa, MIPa o FLt3L secretadas se determinaron mediante interpolación de las curvas patrón. La expresión de IFNa, MIP1a y Flt3 L aumentó en los sobrenadantes celulares durante el curso de la infección y se detectó en las líneas celulares HT-29 y A549 (Figura 12A-C).
Ejemplo 13. Actividad oncolítica e infectividad de los virus NG-347 y NG-348 en células de carcinoma de colon
Potencia oncolítica viral
Las células de carcinoma de colon HT-29 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad celular de 2,5e4 células/pocillo. Las placas se incubaron durante 4 horas, a 37 °C, 5 % de CO2, antes de que las células se infectaran con partículas de virus EnAd, NG-347 o NG-348 en un rango de densidad de infección de 100-0,39 partículas por célula (ppc). La viabilidad de las células HT-29 se evaluó mediante el uso del reactivo Cell Titre 96 MTS (Promega: G3581) 72 horas después de la infección. La cuantificación del % de supervivencia celular en cada densidad de infección demostró que la potencia oncolítica de NG-347 y NG-348 era comparable a EnAd (Figura 13A y 13B).
Infectividad de partículas virales
Se sembraron células de carcinoma de colon HT-29 en placas de 12 pocillos a una densidad celular de 4e5 células/pocillo. Las placas se incubaron durante 24 horas, a 37 °C, 5 % de CO2, antes de que las células se infectaran con partículas de virus EnAd, NG-347 o NG-348 en un rango de densidad de infección de 1,6e7-2e6 vp/ml. La infección de las células HT-29 se detectó mediante la tinción con anticuerpos de la proteína viral hexona. Las células teñidas se cuantificaron mediante conteo manual de 6 campos de visión por pocillo, en 6 pocillos replicados para cada dilución analizada. La relación de partícula a infectividad (P: I) se calculó para cada virus a partir del título viral y demostró que tanto NG-347 como NG-348 tienen relaciones de infectividad similares a los controles de referencia de EnAd (Figura 13C).
Ejemplo 14. Expresión en la superficie celular del antígeno activador de células T, CD80, en líneas celulares de carcinoma infectadas con NG-347 y NG-348
La expresión transgénica de CD80 (evaluada por citometría de flujo) se comparó en la línea celular de carcinoma de colon, DLD-1 o la línea celular de carcinoma de pulmón, A549, tratadas con NG-347, NG-348 y EnAd. Las líneas celulares de carcinoma A549 o DLD-1 se sembraron en placas de 12 pocillos a densidades celulares de 7,5 e5 células/pocillo. Las placas se incubaron durante 18 horas, a 37 °C, 5 % de CO2, antes de que las células se infectaran con 10 partículas de virus EnAd, NG-348 o NG-347 por célula (ppc) o se dejaran sin infectar. La expresión de la proteína CD80 se comparó en la superficie de las células A549 o DLD-1 a las 24, 48, 72 o 96 horas después de la infección. En cada punto de tiempo, las células se cosecharon y se tiñeron de acuerdo con los métodos detallados en el ejemplo 9. Las células se analizaron para determinar la viabilidad celular y la expresión de la proteína CD80 en la superficie celular mediante citometría de flujo. El análisis de la expresión de CD80 a las 72 horas después de la infección en células A549 mostró que CD80 puede detectarse en la superficie de > 95 % de las células tratadas con NG-347 o NG-348 (Figura 14A y 14B). A las 96 horas después de la infección, los tratamientos con virus habían lisado la mayoría de las células A549, por lo que no se realizó el análisis FAC. Para las células DLD-1, se pudo detectar la expresión en > 50 % de las células hacia las 96 horas después del tratamiento con NG-348 y en > 70 % de las células después del tratamiento con NG-347 (Figura 15A y 15B). No se detectó tinción con EnAd o en los controles no tratados.
Ejemplo 15. Activación y desgranulación de células T mediada por líneas celulares de carcinoma infectado con NG-348
Las células de carcinoma de pulmón A549, infectadas con partículas de virus NG-348 o EnAd o no infectadas, se cultivaron conjuntamente con células T aisladas de donantes de PBMC humanos. La selectividad de la expresión del CD80 codificado por el virus NG-348 se evaluó en la superficie de las células A549 y T mediante citometría de flujo. La activación de las células T se evaluó mediante el análisis de los marcadores de activación de la superficie celular (por citometría de flujo), la expresión de CD107a en la superficie celular como un marcador de desgranulación (mediante citometría de flujo) y la secreción de citocinas estimuladoras, IL-2 e IFNy (mediante ELISA).
Las células A549 se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 5e5 células/pocillo. Las placas se incubaron durante 18 horas, a 37 °C, 5 % de CO2, antes de que las células se infectaran con 10 partículas de virus EnAd o NG-348 por célula (ppc) o se dejaran sin infectar. A las 48 horas después de la infección, se añadieron células T CD3+, aisladas por selección negativa de PBMC (MAC), a las monocapas de células A549 en una proporción de 8 células T: 1 célula tumoral. El cocultivo se llevó a cabo durante 16 horas, después de lo cual se recogieron los sobrenadantes celulares para el análisis mediante ELISA y las células tumorales y las células T se cosecharon para el análisis por citometría de flujo.
Los medios de cultivo que contenían células no adherentes se retiraron de los pocillos de cocultivo y se centrifugaron (300xg). El sobrenadante se retiró cuidadosamente, se diluyó 1 en 2 con PBS al 5 % de BSA y se almacenó para su análisis mediante ELISA. Las monocapas de células adherentes se lavaron una vez con PBS y luego se separaron mediante el uso de tripsina. La tripsina se inactivó mediante el uso de medios completos y las células se agregaron a los sedimentos celulares que se habían recogido de los sobrenadantes de cultivo. Las células se centrifugaron (300xg), se descartó el sobrenadante y el sedimento celular se lavó en 200 |_il de LBS. Después las células se centrifugaron de nuevo, se resuspendieron en 50 |_il de tampón de FAC (5 % de BSA PBS) que contenía colorante Aqua para células Vivas/Muertas (Life tech) durante 15 minutos a RT. Las células se lavaron una vez en tampón de FAC antes de teñirlas con paneles de anticuerpos directamente conjugados: anti-CD3 conjugado con BV605; anti-CD25 conjugado con BV421; anti-CD107a conjugado con FITC; anti-EpCam conjugado con PE o anti-CD4 conjugado con PE; y anti-CD80 conjugado con PE/Cy5 o anti-HLA-DR conjugado con PE/Cy5. Una muestra de células de cada condición de cocultivo también se tiñó con anticuerpos de control de isotipo adecuados. Todas las tinciones se llevaron a cabo en tampón de FAC en un volumen total de 50 pl/pocillo durante l5 minutos, a 4 °C. Después, las células se lavaron con tampón de FAC (200 pl) antes de la resuspensión en 200 pl de tampón de FAC y se analizaron por citometría de flujo (Attune).
Expresión selectiva de CD80
Similar a los resultados mostrados en el ejemplo 14, la expresión de CD80 pudo detectarse en la superficie de > 80 % de las células A549 EpCam+ infectadas con NG-348 pero no en células de control infectadas o no con EnAd (Figura 16). En contraste, las células T CD3+ no mostraron expresión detectable de CD80 en la superficie celular, lo que indica, al menos en estas condiciones experimentales, que la expresión transgénica es selectiva para las células tumorales en el cocultivo.
Regulación positiva de marcadores de activación de células T
El análisis por citometría de flujo de la activación de células T se evaluó mediante la expresión de los marcadores de activación de células T CD25 y HLA-DR en células CD3+, vivas e individuales. Estos datos demostraron que tanto la cantidad de células T que expresan CD25 (Figura 17A y 17B) como el nivel promedio de expresión de CD25 en la superficie de las células T (Figura 17C) fueron significativamente mayores para las células T cultivadas con células A549 infectadas con NG-348 que con EnAd o en controles no infectados. Específicamente, no hubo diferencia en el estado de activación de las células T cuando los controles no tratados se compararon con EnAd (26,9 % ± 3,4 % y 25,3 ± 3,5 % de las células T que expresan CD25, respectivamente) mientras que CD25 estaba regulado positivamente en la mayoría de las células cocultivadas con NG-348 (83,2 ± 1,5 %). La expresión de CD25 también se analizó en subconjuntos de células T CD4 y CD8 mediante la clasificación de las células T CD3+ sobre la base de su expresión de CD4. Estos análisis mostraron que la expresión de CD25 está regulada positivamente de manera significativa en los subconjuntos de células T CD4+ y T CD4- en cocultivos tratados con NG-348 en comparación con EnAd y controles no infectados (Figura 18).
En contraste con CD25, la cantidad de células que expresan HLA-DR fue bajo, <5 %, para todas las condiciones analizadas (Figura 19A). Esto probablemente se deba al punto de tiempo temprano después del cocultivo en el que se realizó el análisis de citometría de flujo. Sin embargo, hubo un aumento leve pero significativo en la intensidad de la fluorescencia media de las células CD3+HLA-DR+ que se tiñeron para HLA-DR de los cocultivos tratados con NG-348 en comparación con los controles (Figura 19B).
Estimulación de la desgranulación de células T
El análisis de la expresión de CD107a en la superficie de las células T CD3+ vivas mostró un aumento significativo en la cantidad de células T que se habían desgranulado y, por lo tanto, se tiñeron con CD107a, cuando las células A549 se infectaron con NG-348 (8,3 % ± 1,7 % de células) en comparación con EnAd (0,6 % ± 0,2 % de células) o con los controles no tratados (0,1 % ± 0,02 % de células) (Figura 20). Similar a la regulación positiva de CD25, los subconjuntos de células T CD4+ y CD4- mostraron una expresión de CD107a significativamente mayor en comparación con EnAd o los controles A549 (Figura 21).
Secreción de las citocinas estimuladoras IL-2 e IFNy
Para la detección de la expresión de IL-2 o IFNy, los sobrenadantes de los cocultivo se diluyeron en tampón de ensayo BSA/PBS al 5 % (en un rango de 1:100 a 1:1000) y se realizó un ELISA con el uso de un kit para IL 2 humana Ready Set go (Affymetrix) o un kit para IFN gamma humano Ready set go (Affymetrix) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las concentraciones de IL-2 o IFNy secretadas se determinaron mediante interpolación de las curvas patrón. La expresión de IL-2 solo pudo detectarse en los sobrenadantes de cocultivos que usaron células A549 infectadas con NG-348 y no fue detectable en EnAd ni en los controles no tratados (Figura 22A). También se pudo detectar la expresión de IFNy, a niveles muy altos (> 300 ng/ml) en los sobrenadantes de cocultivos de células A549 infectadas con NG-348, que fue significativamente mayor que EnAd o controles no tratados (Figura 22B).
Ejemplo 16. La activación de las células T CD4 y CD8 puede estar mediada independientemente por líneas celulares de carcinoma infectado con NG-348
Las células de carcinoma de pulmón A549 infectadas con partículas de virus NG-348 o EnAd o sin infectar, se cultivaron conjuntamente con células T CD4+ o células T CD8+ aisladas de donantes humanos de PBMC. La activación de las células T se evaluó mediante la secreción de la citocina estimuladora IFNy en los sobrenadantes del cultivo.
Las células A549 se sembraron y se infectaron con partículas de virus NG-348 o EnAd o no se infectaron de acuerdo con los métodos detallados en el Ejemplo 14. A las 48 hrs después de la infección las células T CD4+ o las células T CD8+ aisladas por selección negativa de un donante de PBMC se añadieron a la monocapa de células A549 en una proporción de 8 células T a 1 célula tumoral. Después de 16 horas de cocultivo, los sobrenadantes se recogieron y se evaluaron en cuanto a IFNy de acuerdo con los métodos detallados en el Ejemplo 14.
Para las células T CD4+, la expresión de IFNy solo se detectó en sobrenadantes de cocultivos de células A549 infectadas con NG-348 y no fue detectable con EnAd ni en los controles no tratados (Figura 23A). Para las células T CD8+, la expresión de IFNy se detectó a niveles significativamente más altos para las células A549 infectadas con NG-348 que para EnAd o los controles no tratados (Figura 23B), lo que demuestra que tanto las células CD8 como las CD4 pueden activarse para secretar IFNy mediante la actividad del virus NG-348 en las líneas celulares tumorales.
Ejemplo 17. Activación de células T mediada por líneas celulares de carcinoma infectadas con NG-347
Las células de carcinoma de pulmón A549, infectadas con partículas de virus NG-347 o EnAd o no infectadas, se cultivaron conjuntamente con células T aisladas de donantes de PBMC humanos. La activación de las células T se evaluó mediante el análisis de los marcadores de activación de la superficie celular (mediante citometría de flujo) y la secreción de la citocina estimuladora, IFNy (mediante análisis ELISA de los sobrenadantes celulares).
Las células A549 se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 5e5 células/pocillo. Las placas se incubaron durante 18 horas, a 37 °C, 5 % de CO2, antes de que las células se infectaran con 10 partículas de virus EnAd o NG-347 por célula (ppc) o se dejaran sin infectar. A las 24 horas después de la infección, se añadieron células T CD3+, aisladas por selección negativa de PBMC (MAC) a las monocapas de células A549 en una proporción de 5 células T: 1 célula tumoral. El cocultivo se llevó a cabo durante 48 horas, antes de que los sobrenadantes celulares se recogieran para el análisis de ELISA y las células tumorales y las células T se cosecharan para el análisis de citometría de flujo de acuerdo con los métodos detallados en el ejemplo 15. Las células cosechadas se tiñeron con anticuerpos directamente conjugados: anti-CD3 conjugado con BV605 y anti-CD69 conjugado con BV421. Una muestra de células de cada condición de cocultivo también se tiñó con anticuerpos de control de isotipo adecuados. Todas las tinciones se llevaron a cabo en tampón de FAC en un volumen total de 50 pl/pocillo durante 15 minutos, a 4 °C. Después, las células se lavaron con tampón de FAC (200 pl) antes de la resuspensión en 200 pl de tampón de FAC y se analizaron por citometría de flujo (Attune).
Regulación positiva del marcador de activación de células T, CD69
El análisis de citometría de flujo de la activación de las células T se evaluó mediante la expresión del marcador de activación de células T CD69 en células vivas, CD3+ e individuales. Estos datos mostraron que la cantidad de células T que expresan CD69 fue significativamente mayor para las células T cultivadas con células A549 infectadas con NG-347 que con EnAd o los controles no infectados (Figura 24).
Secreción de la citocina estimulante IFNy
Para la detección de la expresión de IL-2 o IFNy, los sobrenadantes de cocultivos se diluyeron en tampón de ensayo BSA/PBS al 5 % (en un rango de 1:100 a 1:1000) y se realizó un ELISA mediante el uso del kit para IFN gamma humano Ready set go (Affymetrix) según el protocolo del fabricante.
La concentración de IFNy secretado se determinó mediante interpolación de la curva patrón. La expresión de IFNy solo pudo detectarse en los sobrenadantes de cocultivos que usaron células A549 infectadas con NG-347 y no fue detectable ni con EnAd ni en los controles no tratados (Figura 25).
Ejemplo 18: Producción de virus EnAd que expresan el antígeno activador de células T CD80 y un fragmento de anticuerpo Fv de cadena sencilla anclado a membrana, contra la cadena £ del complejo CD3 humano (CD3£)
El plásmido pEnAd2.4 se usó para generar los plásmidos pNG-348A mediante la inserción directa de un casete que codifica el antígeno activador de células T humanas CD80 (SEQ ID NO 11) y una forma quimérica anclada a membrana del Fv de cadena sencilla anti CD3e humano con una etiqueta V5 C-terminal (SEQ ID NO: 99). El casete de pNG-348 contiene: una secuencia aceptora de corte y empalme corta en 5' (SEQ ID NO. 2); ADNc de ScFv anti-CD3e humano anclado a la membrana; una etiqueta V5 C-terminal (SEQ ID NO: 100); una secuencia del péptido P2A autoescindible de alta eficiencia (SEQ ID NO: 7); secuencia de ADNc de CD80 humano y una secuencia de poliadenilación en 3' (SEQ ID NO: 5). En la Figura 26A se muestra un esquema de los casetes transgénicos de NG-348A. La construcción del plásmido se confirma mediante secuenciación de ADN.
Producción de virus y caracterización
El plásmido pNG-348A se linealiza mediante digestión de restricción con la enzima AscI para producir el genoma del virus NG-348A (SEQ ID NO: 101). El virus NG-348A se amplifica y purifica de acuerdo con los métodos detallados en el Ejemplo 1.
Virus de referencia 19: Producción de virus EnAd, un fragmento de anticuerpo Fv de cadena sencilla anclado a membrana contra la cadena £ del complejo CD3 humano (CD3£)
El plásmido pEnAd2.4 se usó para generar los plásmidos pNG-420 y pNG-420A mediante la inserción directa de un casete que codifica una forma quimérica anclada a la membrana del Fv de cadena sencilla anti-CD3e humano con una etiqueta V5 C-terminal (SEQ ID NO: 99) o sin una etiqueta V5 (SEQ ID NO: 15). El casete de pNG-420 contiene: una secuencia aceptora de corte y empalme corta en 5' CAGG; ADNc de scFv anti-CD3e humano anclado a membrana y una secuencia de poliadenilación en 3' (SEQ ID NO: 5). El casete de pNG-420A contiene: una secuencia aceptora de corte y empalme corta en 5' cagg; ADNc de ScFv anti-CD3e humano anclado a membrana; una etiqueta V5 C-terminal (SEQ iD NO: 100) y una secuencia de poliadenilación en 3' (SEQ ID NO: 5). En las Figuras 26B y 26C se muestran esquemas de los casetes transgénicos de NG-420 y NG-420A. La construcción de cada plásmido se confirma mediante secuenciación de ADN.
Producción de virus y caracterización
Los plásmidos pNG-420 y pNG-420A se linealizan por digestión de restricción con la enzima AscI para producir los genomas del virus NG-420 (SEQ ID NO: 102) y NG-420A (SEQ ID NO: 103). Los virus NG-420 y NG-420A se amplifican y purifican de acuerdo con los métodos detallados en el Ejemplo 1.
Ejemplo 20
Las células de carcinoma de pulmón humano A549 y las células de fibroblastos humanos MRC5 se cultivaron con virus EnAd, NG-347 o NG-348 (a 10 ppc) para comparar la replicación del genoma viral, la expresión de la hexona viral y el transgén por parte de estos tipos de células. Después de 72 horas de cultivo, las células se tiñeron para análisis FACS de los marcadores de superficie o los sobrenadantes y los lisados celulares se prepararon para los análisis de replicación del genoma viral (qPCR) o del ARNm (RT-qPCR) para la expresión de la hexona o el transgén.
La replicación del genoma viral y la expresión de ARNm de hexona para los dos virus portadores de transgenes, NG-347 y NG-348 fueron equivalentes a los del virus parental, EnAd (Figura 27). Para NG-348 (Figura 28), los niveles de expresión de ARNm de los transgenes CD80 y scFv anti-CD3 humano fueron altos con las células tumorales A549, y solo una señal de bajo nivel en las células MRC5 no tumorales. La expresión de la proteína CD80 en la superficie de las células evaluadas por FACS se detectó en la mayoría de las células A549 tratadas con NG-348 pero no fue detectable en las células MRC5, y no hubo detección de CD80 en ninguno de los tipos de células sin tratar o tratadas con EnAd. De forma similar, el ARN del transgén y la expresión de la proteína CD80 después del tratamiento con NG-347 se detectaron selectivamente en células tumorales A549, no en células MRC5 (Figura 29).
Para los cultivos celulares tratados con EnAd y NG-347, los niveles de ARNm de MIP1a e IFNa en los lisados celulares y las proteínas secretadas en los sobrenadantes se midieron por RT-qPCR y ELISA específicos, respectivamente. Los datos (Figura 30) muestran la expresión selectiva de ambos transgenes por las células tumorales A549, sin quimiocina MIP1a o citocina IFNa detectables en los sobrenadantes de MRC5.
Ejemplo 21
La selectividad/actividad de los virus EnAd, NG-347 y NG-348 con las células T humanas se evaluó mediante el cultivo de células T CD3+ aisladas durante 3 días con 500 ppc o 5000 ppc de cada virus. La selectividad/actividad se evaluó mediante a) análisis de citometría de flujo de células T teñidas con anticuerpos dirigidos a CD69, CD4, CD80, CD25 y CD3, b) análisis de ELISA de la secreción de proteínas MIP1a, IFNa e iFNy humanas, c) análisis por qPCR de la replicación viral yd) análisis por RT-qPCR de la expresión génica.
Como se muestra en la Figura 31, las células T no eran compatibles con la replicación del genoma viral para ninguno de los virus analizados, solo se detectaron señales de fondo en el ensayo RT-qPCR para la hexona viral. Las células tumorales A549 admitieron altos niveles de expresión del ARNm de hexona. Los análisis de RT-qPCR para la expresión de ARNm transgénico por parte de las células T mostraron solo señales de fondo (<1 copia/célula) para CD80 tanto para NG-347 como para n G-348, y una similar falta de expresión significativa del ARNm de ScFv anti-CD3 para NG-348, a pesar de la alta exposición al virus (5000 ppc). Se detectaron altos niveles de expresión de ambos transgenes con las células tumorales A549 tratadas (10 ppc) (Figuras 32 y 33). La expresión de ARNm transgénico de IFNa y MIP1a también se detectó selectivamente por las células tumorales A549 tratadas con NG-347 (no EnAd) (a 10 ppc) y no por las células T tratadas con 5000 ppc (Figura 34). Además, la expresión de la proteína CD80 en la superficie celular solo fue detectable en células A549, no en células T, tanto para NG-347 como para NG-348 (Figuras 32 y 33). El tratamiento con EnAd no condujo a la expresión de CD80 por ninguno de los dos tipos de células, y la muerte de células A549 (según lo evaluado por la captación de colorante) fue similarmente alta para los tres virus; todos los virus indujeron un bajo nivel de muerte inespecífica de células T debido a los niveles muy altos de partículas virales utilizadas en el experimento (Figuras 32 y 33). Se obtuvieron datos de expresión de proteínas y ARNm transgénicos similares cuando los virus se usaron a 500 ppc (datos no mostrados).
En ausencia de células tumorales, las células T humanas purificadas no se activaron para regular positivamente los marcadores de activación CD25 o CD69 cuando se cultivaron con cualquiera de los virus (Tabla 5).
Tabla 5. Ausencia de expresión de los marcadores de activación CD25 y CD69 en las células T CD3+ humanas purificadas y tratadas con 5000 ppc de diferentes virus
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Ejemplo 22
Se llevó a cabo un experimento de selectividad de virus similar al descrito en el Ejemplo 21 mediante el uso de PBMC humanas no sin separar en lugar de células T purificadas, incluida la realización de las mismas evaluaciones de actividad. Al igual que con las células T humanas en el ejemplo 21, los datos de este estudio demuestran colectivamente la falta de replicación viral y de expresión transgénica por parte de las PBMC humanas. Las Figuras 35-37 muestran datos con el uso de 5000 ppc de EnAd, NG-347 o NG-348, pero se generaron datos similares con el uso de 500 ppc (no mostrados). La Figura 35 muestra la replicación del genoma viral y la expresión de ARNm de hexona y las Figuras 36 y 37 muestran la expresión de ARNm transgénicos. Los fondos del ensayo se establecieron de acuerdo con las señales generadas en el ensayo con el virus respectivo agregado a los medios de cultivo y luego procesados de la misma manera que para las muestras de lisado celular. No hubo expresión detectable del transgén CD80 en las células T CD3+ o células CD40 (principalmente células B) en estos cultivos de PBMC con ninguno de los virus (no mostrado).
La activación mediada por partículas de virus NG-347 y NG-348 de las células de la inmunidad innata (monocitos, DC) en los cultivos de PBMC fue similar a la de EnAd, como se muestra en las Figuras 38 y 39 para la regulación negativa de la expresión de CD14 y la regulación positiva de HLA-DR y CD80 endógeno en la superficie celular, así como la secreción de MIP1a e IFNa (tenga en cuenta que a pesar de que NG-347 codifica ambas moléculas en su genoma, no hubo un aumento en los niveles de producción sobre los de EnAd y NG-348 que no codifican los transgenes).
Ejemplo 23
Este ejemplo tiene un diseño similar a los experimentos en los ejemplos 15-17, 21 y 22, pero en estos estudios, las PBMC humanas o las células T purificadas se cultivaron conjuntamente con células tumorales A549 o fibroblastos MRC5, pretratados con virus (48 horas). Las células A549 o m RC5 se trataron con 10 ppc de EnAd, NG-347, NG-348 o no se trataron (UTC) y se cultivaron durante 48 horas para permitir suficiente tiempo para la replicación viral y cualquier expresión transgénica. A continuación, se agregaron PBMC o células T a los cultivos y se dejaron durante 24 o 48 horas para evaluar la capacidad de las células tratadas con virus para activar las células T.
La Figura 40 muestra los datos de replicación del genoma viral que muestran una replicación comparable de los tres virus en cocultivos de PBMC o células T con ambos tipos de células, donde los niveles de replicación fueron altos con las células tumorales A549 y bajos con los fibroblastos MRC5.
La activación de las células T según se midió por la regulación positiva de la expresión de CD25 en la superficie y la desgranulación de las células T efectoras CD8, según se midió por la regulación positiva de CD107a en la superficie celular, y la producción de IFNy según se midió por tinción intracelular de citocinas fueron estimuladas selectivamente por células A549 tratadas con NG-348 en comparación con EnAd, y no hubo estimulación mediada con cocultivos de MRC (Tabla 6).
Tabla 6. Análisis por citometría de flujo de la activación de células T CD3+ humanas en cocultivos de células T y PBMC con virus
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La secreción de IFNy en los sobrenadantes del cocultivo también se cuantificó mediante ELISA. Los datos (Figura 41) demuestran de manera similar la activación selectiva de células T cocultivadas con células tumorales A549 tratadas con NG-348, no con fibroblastos MRC5, ya sea con células T purificadas o PBMC utilizadas en los ensayos.
La capacidad de NG-347 para activar las células T también se evaluó mediante la medición de los niveles de CD69 en las células T de los cocultivos de células T purificadas o PBMC con células tumorales A549 o fibroblastos MRC5. Como se muestra en la Tabla Z, se observó una pequeña mejora en las células T positivas para CD69 con el tratamiento con NG-347 de las células tumorales A549 en comparación con EnAd, lo que a su vez conduce a la regulación positiva de este marcador de activación temprano. Estos efectos no se observaron en los cocultivos con MRC5. No se detectó expresión de CD80 en las células T (no mostrado).
Tabla 7. Expresión de CD69 en células T a partir de cocultivos tratados con NG-347 o EnAd
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En un experimento separado, las células A549 tratadas con NG-347 y cocultivadas con células T CD3+ humanas condujeron a la regulación positiva del marcador de activación CD69 en las células T y a la secreción de IFNy (ver las Figuras 24 y 25).
Ejemplo 24
Las células monocíticas CD14+ se aislaron de las PBMC mediante separación de perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo y se cultivaron con IL-4 humana y GM-CSF para diferenciarlas en células dendríticas. Después de 3 días de cultivo, las células se trataron con EnAd, NG-347 o n G-348 a 5000 ppc o no se trataron. Como control de activación positivo, algunas células fueron estimuladas con LPS. Dos días después, se tomaron sobrenadantes para un ELISA de citocinas y las células se tiñeron para la expresión de marcadores de activación de superficie y se analizaron por citometría de flujo. Como se muestra en la tabla 8, todos los virus indujeron la regulación positiva de las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86, lo que indica que este efecto de activación de células de la inmunidad innata mediada por partículas que se identificó previamente no fue alterado por la incorporación de transgenes en los genomas de NG-347 y NG-348. Todos los virus también estimularon la secreción de niveles similares de MIP1a e IFNa (Figura 42).
Tabla 8. Activación de células dendríticas humanas mediada por partículas de EnAd, NG-347 y NG-348
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Ejemplo 25
En un conjunto de experimentos, las células JurkatDual se usaron en cocultivos con células tumorales como un ensayo reportero de la activación de células T para evaluar la funcionalidad de la expresión transgénica por los virus NG-347, n G-348 y NG-420, con EnAd como un control negativo. Las células JurkatDual expresan de manera estable dos genes reporteros diferentes: un gen reportero de NFkB que produce una forma secretada de luciferasa que responde a la señalización a través del complejo receptor de células T y un gen reportero de la fosfatasa alcalina secretada sensible a IFNa (SEAP). Las células A549 se cultivaron previamente con virus a '10 ppc durante dos días, y luego se agregaron células JurkatDual para el cocultivo durante la noche (18-24 h) y después se recogieron los sobrenadantes para el análisis de las actividades de luciferasa y SEAP. Como se muestra en la Figura 43, las células A549 infectadas con NG-347 indujeron selectivamente la producción de SEAP, que se alinea con su producción de IFNa (ver la Figura 11) pero no indujeron actividad de luciferasa. Por el contrario, NG-348 que expresa el ScFv anti-CD3 de membrana para activar el complejo receptor de células T indujo luciferasa pero no SEAP.
En otro experimento, las células de carcinoma de pulmón A549 y las células de carcinoma de colon HCT-116, HT-29 y DLD se cultivaron previamente durante 48 horas con 10 ppc de virus EnAd, NG-347, NG-348 o NG-420 antes de cocultivar con células JurkatDual durante la noche, donde los sobrenadantes se analizaron para determinar los niveles de luciferasa para indicar el nivel de activación inducida. Como se muestra en la Figura 44, los cuatro tipos de células tumorales cultivadas con los virus NG-348 o NG-420, que codifican ScFv anti-CD3 en la superficie celular, activaron las células JurkatDual, mientras que EnAd y NG-347 no lo hicieron, con niveles de luciferasa similares a los de los controles de células tumorales no infectadas (UIC).
En otro experimento, las células tumorales A549 o HT-29 se cultivaron previamente con diferentes cantidades de NG-348 o NG-420 antes de agregar las células JurkatDual y medir su secreción de luciferasa. Los datos en la Figura 45 muestran que la activación de la actividad de NFkB en las células JurkatDual depende de la dosis de virus utilizada para tratar las células tumorales.
Ejemplo 26
Se compararon la farmacocinética in vivo, la biodistribución y las actividades de inducción de citocinas sistémicas mediadas por partículas de EnAd y NG-348 después de la dosificación IV en ratones CD1 inmunocompetentes. Los ratones se dosificaron por vía intravenosa con 5x109 partículas de EnAd o NG-348 y se desangraron a los 2, 10, 30, 60 y 120 minutos después de la dosificación. Se extrajo ADN de la sangre completa, que se analizó mediante qPCR para determinar los niveles del genoma viral (Figura 46). La eliminación de ambos virus de la sangre siguió una cinética similar. De manera similar, la inducción de la respuesta de citocina MCP-1 (una medida de la activación, mediada por partículas, de la inmunidad innata, como las células de Kupffer hepáticas) también fue similar para ambos virus, al igual que los patrones de biodistribución tisular (Figura 46).
Ejemplo 27
Los ratones SCID CB17 se implantaron por vía subcutánea con células HCT116 y se inyectaron por vía intratumoral (IT) o intravenosa (IV) con virus EnAd, NG-347 o NG-348 (5x109 partículas virales), o control, una vez que los tumores eran mayores de 70 mm3. Para los ratones con dosis IV, se tomaron muestras de sangre de tres ratones de cada grupo a los 3, 15 y 30 minutos después de la dosis IV, se extrajo el ADN y se evaluó el nivel de genomas virales en la sangre mediante qPCR (análisis farmacocinético [PK]). Los datos (Figura 47) muestran que NG-347 y NG-348 tienen una PK similar a EnAd (y entre sí). Después de 6 horas, se resecaron los tumores, hígados, pulmones y bazos de 3 ratones de cada grupo. Se extrajo el ADN de los tejidos homogeneizados y se analizó para determinar el nivel de genomas de virus mediante qPCR (análisis de biodistribución). Los datos (Figura 48A) muestran una biodistribución tisular similar para los tres virus. Después de 7 días o 14-21 días, se extirparon los tumores de tres ratones de cada grupo y se homogeneizaron para producir un lisado tumoral que se usó para preparar tanto ADN como ARN. El nivel de genomas virales en los tumores en los dos puntos temporales se midió mediante análisis de qPCR del ADN extraído. Los datos (Figura 48B) muestran que los tumores de ratones con dosis IV e IT tienen niveles de genomas virales más altos que la cantidad de virus administrada, lo que indica la replicación del virus en el tejido, y la dosis IT proporciona niveles de genoma más altos que IV en el día 7, pero ambos son similarmente altos en el período de 14-21 días. Los tres virus se replicaron a niveles similares.
De manera similar, los niveles de ARNm de hexona viral en los lisados tumorales detectados por RT-qPCR fueron comparables entre EnAd, NG-347 y NG-348 en ambos puntos de tiempo analizados (Figuras 49 y 50). Se detectaron niveles similares de ARNm de ScFv anti-CD3 y CD80 en ambos puntos de tiempo y con ambas vías de dosificación para el tratamiento con NG-348, mientras que la dosificación de EnAd solo registró lecturas de fondo del ensayo (Figura 50 y 51). Los niveles de ARNm de MIP1a e IFNa también se detectaron selectivamente después de la administración de NG-347, ya sea IT o IV (Figura 52).
Los niveles de la proteína CD80 codificada por NG-347 y NG-348, y la proteína MIP1a codificada por NG-347 se midieron en lisados tumorales mediante el uso de ELISA específicos. Los datos en la Figura 53 muestran que después de la dosis única IV de virus, ambas proteínas también pueden detectarse selectivamente en extractos tumorales. Ninguna de las proteínas se detectó en muestras de sangre de los mismos ratones.
Ejemplo 28
Para evaluar la actividad y la dependencia de las células tumorales del virus NG-348 in vivo, se inyectaron diferentes combinaciones de PBMC humanas (5x107 células), células tumorales humanas A549 (5x106) y EnAd o NG-348 (a 5x109 ppc) en el peritoneo de ratones SCID-beige inmunodeficientes, y la dosificación de los virus o el control (solución salina) se realizó en los 15 minutos posteriores a la inyección de las células. Después de 3 días, la cavidad peritoneal se lavó con 5 ml de solución salina y las células recuperadas se analizaron mediante análisis de citometría de flujo con un panel de marcadores de activación de células T (CD25, CD69 y HLA-DR) para evaluar los niveles de activación de células T, después de clasificar la población de células T CD3+. Los datos de dos experimentos separados (Tabla 9) demuestran que NG-348 conduce selectivamente a la activación de células T humanas in vivo de una manera dependiente de las células tumorales.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un adenovirus oncolítico del grupo B, competente para la replicación, con selectividad para células cancerosas, en donde el adenovirus comprende un transgén bajo el control de un promotor endógeno al virus, en donde el transgén comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína B7, y
dicho transgén está ubicado entre el sitio de reconocimiento del codón de parada-poliA del gen L5 del adenovirus y el sitio de reconocimiento del codón de parada-poliA del gen E4 del adenovirus,
en donde dicho transgén está bajo el control del promotor tardío principal endógeno.
2. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con la reivindicación 1, en donde la proteína B7 se selecciona independientemente del grupo que comprende B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5 y B7-H6.
3. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con la reivindicación 2, en donde la proteína B7 es B7-1.
4. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el virus es un virus quimérico.
5. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con la reivindicación 4, en donde la cadena principal del virus es enadenotucirev.
6. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el virus tiene una fórmula (I):
5'ITR-B1-Ba-B2-Bx-Bb-By-Bs-3'ITR (I)
B1 comprende: E1A, E1B o E1A-E1B;
Ba es E2B-L1-L2-L3-E2A-L4;
B2 es un enlace o comprende E3 o un transgén;
Bx es un enlace o una secuencia de ADN que comprende: un sitio de restricción, uno o más transgenes o ambos; Bb comprende L5;
By comprende un transgén que codifica una proteína B7; y
B3 es un enlace o comprende E4.
7. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la proteína B7 comprende una secuencia transmembrana.
8. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además un segundo transgén.
9. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con la reivindicación 8, en donde el segundo transgén codifica un polipéptido seleccionado del grupo que comprende una citocina, una quimiocina, una molécula de anticuerpo antagonista o fragmento de la misma, y una molécula de anticuerpo agonista o fragmento de la misma.
10. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende un segundo y tercer transgén.
11. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con la reivindicación 9 o 10, en donde el segundo o tercer transgén codifica una citocina, seleccionada del grupo que comprende IL-2, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, ligando de Flt3, GM -CSF, IL-15 e IL-12.
12. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con las reivindicaciones 9 a 11, en donde el segundo o tercer transgén codifica una quimiocina, seleccionada del grupo que comprende MIP-1 alfa, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 y CCL21.
13. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con la reivindicación 9 o 12, donde el virus codifica una combinación de citocinas y quimiocinas seleccionada del grupo que comprende M ipla y ligando de Flt3, y M ipla e IFNa.
14. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el virus codifica una molécula de anticuerpo o fragmento de la misma.
15. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con la reivindicación 14, en donde la molécula de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende un dominio transmembrana o un anclaje a GPI de manera que es una forma anclada a la membrana celular.
16. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con la reivindicación 14 o 15, en donde la molécula de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende un dominio de unión al antígeno anti-CD3 humano.
17. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con las reivindicaciones 14 a 16, en donde la molécula de anticuerpo es un inhibidor.
18. Un virus oncolítico competente para la replicación de conformidad con las reivindicaciones 14 a 17, en donde la molécula de anticuerpo es un agonista.
19. Una composición farmacéutica que comprende un adenovirus oncolítico competente para la replicación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, y un diluyente o vehículo.
20. Un adenovirus competente para la replicación de conformidad con las reivindicaciones 1 a 18 o una composición de conformidad con la reivindicación 19 para su uso en el tratamiento.
21. Un adenovirus competente para la replicación de conformidad con las reivindicaciones 1 a 18 o una composición de conformidad con la reivindicación 19 para su uso en el tratamiento del cáncer.
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