ES2773692T3 - Nucleic acid isolation - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para aislar un ácido nucleico diana humano a partir de una muestra de heces humanas, comprendiendo el procedimiento: a) eliminar un inhibidor de ensayo de dicha muestra de heces para producir una preparación de muestra clarificada, en el que la eliminación de dicho inhibidor de ensayo a partir de dicha muestra comprende: a1) homogeneizar dicha muestra de heces para producir un homogenado; a2) centrifugar dicho homogenado para producir un sobrenadante. a3) tratar dicho sobrenadante con una polivinilpirrolidona insoluble para unir el inhibidor, si está presente, en un complejo de inhibidor; y a4) asilar dicho comprende de inhibidor a partir de dicho sobrenadante para producir una preparación de muestra clarificada; b) capturar dicho ácido nucleico diana a partir de dicha preparación de muestra clarificada con un reactivo de captura específico de la diana para formar un complejo de captura en el que la captura de dicho ácido nucleico diana comprende: b1) exponer dicha preparación de muestra clarificada a una condición desnaturalizante para producir una muestra desnaturalizada; y b2) unir dicho ácido nucleico diana a un reactivo de captura específico de la diana para formar un complejo de captura, en el que dicho reactivo de captura específico de la diana comprende un oligonucleótido unido a una partícula magnética, el oligonucleótido complementario a al menos una porción de dicho ácido nucleico diana; b3) aislar dicho complejo de captura a partir de dicha preparación de muestra clarificada; y b4) recuperar dicho ácido nucleico diana a partir de dicho complejo de captura en una solución de ácido nucleico.A method of isolating a human target nucleic acid from a human stool sample, the method comprising: a) removing a test inhibitor from said stool sample to produce a clarified sample preparation, wherein removal of said inhibitor testing from said sample comprises: a1) homogenizing said stool sample to produce a homogenate; a2) centrifuging said homogenate to produce a supernatant. a3) treating said supernatant with an insoluble polyvinylpyrrolidone to bind inhibitor, if present, in an inhibitor complex; and a4) isolating said inhibitor comprising from said supernatant to produce a clarified sample preparation; b) capturing said target nucleic acid from said clarified sample preparation with a target-specific capture reagent to form a capture complex, wherein capturing said target nucleic acid comprises: b1) exposing said clarified sample preparation to a denaturing condition to produce a denatured sample; and b2) binding said target nucleic acid to a target-specific capture reagent to form a capture complex, wherein said target-specific capture reagent comprises an oligonucleotide bound to a magnetic particle, the oligonucleotide complementary to at least a portion of said target nucleic acid; b3) isolating said capture complex from said clarified sample preparation; and b4) recovering said target nucleic acid from said capture complex in a nucleic acid solution.

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Aislamiento de ácidos nucleicosNucleic acid isolation

Campo de la invenciónField of the invention

En el presente documento se proporciona tecnología relacionada con el aislamiento de ácidos nucleicos. En particular, la tecnología se refiere a procedimientos y kits para extraer ácidos nucleicos de muestras problemáticas tales como heces.Technology related to nucleic acid isolation is provided herein. In particular, the technology relates to procedures and kits for extracting nucleic acids from problematic samples such as feces.

AntecedentesBackground

El aislamiento de ácidos nucleicos diana específicos de una muestra es una etapa importante en muchos procedimientos de diagnóstico médico. Por ejemplo, algunas mutaciones y estados de metilación en genes conocidos están correlacionados, asociados, y/o son predictivos de enfermedades. El ADN que contiene estos genes se puede recuperar de una muestra, y analizarse para determinar la presencia de mutaciones y estados de metilación particulares.Isolation of specific target nucleic acids from a sample is an important step in many medical diagnostic procedures. For example, some mutations and methylation states in known genes are correlated, associated, and / or predictive of diseases. DNA containing these genes can be recovered from a sample, and analyzed for the presence of particular mutations and methylation states.

En la práctica, dichos ensayos requieren el aislamiento y el análisis de varias dianas genéticas de una muestra. Para muchos procedimientos de detección, la detección de mutaciones raras o eventos de metilación en un solo gen requiere el aislamiento y análisis de una gran cantidad de ADN. Este problema se complica cuando analiza un panel de genes, cada uno de los cuales debe estar presente en gran cantidad para obtener un ensayo diagnóstico sólido. Por lo tanto, para detectar mutaciones raras y eventos de metilación en múltiples genes, el ADN aislado debe estar muy concentrado y comprender una parte considerable del ensayo de detección.In practice, such assays require the isolation and analysis of several genetic targets from a sample. For many detection procedures, the detection of rare mutations or methylation events in a single gene requires the isolation and analysis of a large amount of DNA. This problem is compounded when you analyze a panel of genes, each of which must be present in large numbers to obtain a robust diagnostic test. Therefore, to detect rare mutations and methylation events in multiple genes, isolated DNA must be highly concentrated and comprise a considerable part of the detection assay.

Este requisito impone numerosos problemas, sin embargo. Por ejemplo, la preparación de dichas cantidades y concentraciones de ADN requiere una muestra grande como entrada (por ejemplo, que tenga una masa de varios gramos, por ejemplo, de aproximadamente 2-4 gramos) para proporcionar suficiente ácido nucleico para la detección y, por tanto, requiere un procedimiento que pueda preparar el ADN a partir de una muestra grande. Además, junto con la preparación del ADN, frecuentemente se aíslan y concentran inhibidores del ensayo. En consecuencia, las preparaciones de ADN concentradas producidas por procedimientos convencionales frecuentemente también retienen concentraciones inaceptables de inhibidores, que a continuación se introducen en un ensayo posterior. Por otra parte, si todas las dianas del panel se extrajeran simultáneamente en una preparación conjunta no selectiva del a Dn , la sensibilidad del ensayo se ve negativamente afectada, como la preparación se divide en alícuotas para su ensayo, menos ADN extraído de un solo gen del panel está presente en el ensayo. Si, por otra parte, todos los miembros del panel se extraen y se analizan conjuntamente y por tanto están presentes en la misma mezcla de ensayo, la sensibilidad de detección de una diana individual concreta se ve negativamente afectada por la presencia de las moléculas de ADN no diana.This requirement poses numerous problems, however. For example, the preparation of such amounts and concentrations of DNA requires a large input sample (eg, having a mass of several grams, eg, about 2-4 grams) to provide sufficient nucleic acid for detection and, therefore, it requires a procedure that can prepare DNA from a large sample. In addition, in conjunction with DNA preparation, assay inhibitors are frequently isolated and concentrated. Consequently, concentrated DNA preparations produced by conventional procedures frequently also retain unacceptable concentrations of inhibitors, which are then introduced into a subsequent assay. On the other hand, if all the targets in the panel were extracted simultaneously in a joint non-selective preparation of the a Dn, the sensitivity of the assay is negatively affected, as the preparation is aliquoted for assay, less DNA extracted from a single gene of the panel is present in the test. If, on the other hand, all panel members are drawn and analyzed together and are therefore present in the same assay mix, the sensitivity of detection of a particular individual target is negatively affected by the presence of the DNA molecules. no target.

Además, si una diana diagnóstica particular está presente en una muestra compleja, estará presente en una pequeña cantidad con respecto al resto de materiales -tanto ácidos nucleicos como no ácidos nucleicos- de la muestra, resultando ser por tanto un desafío para los procedimientos analíticos diseñados para detectarlo. Por ejemplo, el análisis de ADN procedente de muestras de heces se complica por el hecho de que las bacterias suponen aproximadamente el 60% de la masa seca de las heces y el resto es, en gran medida, residuos de plantas y animales que el sujeto haya ingerido como alimento. Como tal, las células de un sujeto humano, que son las únicas que se desprenden del revestimiento del tracto digestivo, suponen una fracción muy pequeña de las heces, y están presentes cantidades importantes de ácidos nucleicos de otras fuentes. Por otro lado, en ensayos para detectar modificaciones genéticas indicativas del cáncer de colon, las células derivadas de un tumor que puede estar presente en el colon supondrían solamente una pequeña fracción de las células del intestino del sujeto humano que se han desprendido del revestimiento del tracto digestivo. Por consiguiente, las células cancerosas (y el ADN que contienen) constituye una cantidad mínima de la masa de las heces. Dichas muestras son también muy viscosas, lo que supone problemas de preparación de muestras y aislamiento de ácidos nucleicos.Furthermore, if a particular diagnostic target is present in a complex sample, it will be present in a small amount with respect to the rest of the materials -both nucleic acids and non-nucleic acids- in the sample, thus proving to be a challenge for the designed analytical procedures. to detect it. For example, analysis of DNA from stool samples is complicated by the fact that bacteria account for approximately 60% of the dry mass of stool and the remainder is largely plant and animal residues that the subject ingested as food. As such, the cells of a human subject, which are the only ones shed from the lining of the digestive tract, make up a very small fraction of the stool, and significant amounts of nucleic acids from other sources are present. On the other hand, in assays to detect genetic modifications indicative of colon cancer, cells derived from a tumor that may be present in the colon would account for only a small fraction of the cells in the intestine of the human subject that have shed the lining of the tract. digestive. Therefore, cancer cells (and the DNA they contain) make up a minimal amount of the stool mass. Such samples are also very viscous, posing problems in sample preparation and nucleic acid isolation.

Los procedimientos y kits convencionales para aislar el ADN de muestras preparan, de forma típica, el ADN total (por ejemplo, según un procedimiento de precipitación no específico) a partir de una muestra. Para muestras complejas, tales como muestras de heces, esto resulta ser un inconveniente importante de los procedimientos convencionales, ya que el ADN total aislada de una muestra de heces comprende ADN de las bacterias residentes en el intestino (y de cualquier virus, eucariota y archaea presente) junto con el ADN del sujeto. Por otra parte, los procedimientos y kits convencionales están diseñados principalmente para preparar ADN a partir de muestras pequeñas, por ejemplo, muestras que tengan masas de menos de 1 gramo, por ejemplo, de 50 a 200 miligramos, limitando el rendimiento del ácido nucleico diana de muestras complejas a cantidades muy pequeñas. Inconvenientes adicionales son que la mayoría de tecnologías convencionales no eliminan los inhibidores de forma eficaz, y frecuentemente requieren etapas prolongadas, por ejemplo, incubaciones. Por consiguiente, los procedimientos convencionales no son adecuados para un panel de análisis multigénico de elevada sensibilidad y elevada especificidad de ADN fuertemente concentrado exento de inhibidores procedente de muestras grandes, tales como muestras de heces de varios gramos. Los ensayos que utilizan ADN preparado por procedimientos convencionales no proporcionarán una muestra que se pueda analizar con el umbral de sensibilidad necesario para detectar eventos de mutaciones raras o de metilación. El uso de un procedimiento o kit convencional para alcanzar las cantidades de partida necesarias para conseguir dicha sensibilidad requiere múltiples extracciones de ADN (por ejemplo, el uso de múltiples kits) de múltiples muestras además de etapas de purificación adicionales para eliminar los inhibidores. Por lo tanto, lo que se necesita es un procedimiento para preparar ADN concentrado exento de inhibidores a partir de una muestra para cada miembro de un gen génico para su uso en ensayos diagnósticos.Conventional methods and kits for isolating DNA from samples typically prepare total DNA (eg, according to a non-specific precipitation procedure) from a sample. For complex samples, such as stool samples, this turns out to be a major drawback of conventional procedures, since the total DNA isolated from a stool sample comprises DNA from bacteria resident in the gut (and from any viruses, eukaryotes and archaea present) along with the subject's DNA. On the other hand, conventional procedures and kits are designed primarily to prepare DNA from small samples, for example samples having masses of less than 1 gram, for example 50 to 200 milligrams, limiting the yield of the target nucleic acid. from complex samples to very small quantities. Additional drawbacks are that most conventional technologies do not remove inhibitors effectively, and often require lengthy steps, eg, incubations. Consequently, conventional procedures are not suitable for a high-sensitivity, high-specificity multigen test panel of highly concentrated inhibitor-free DNA from large samples, such as multi-gram stool samples. Assays using DNA prepared by standard procedures will not provide a sample that can be analyzed to the sensitivity threshold necessary to detect rare mutation or methylation events. the use of a Conventional kit or procedure to achieve the starting amounts necessary to achieve such sensitivity requires multiple DNA extractions (eg, the use of multiple kits) from multiple samples plus additional purification steps to remove inhibitors. Therefore, what is needed is a procedure to prepare concentrated inhibitor-free DNA from a sample for each member of a gene gene for use in diagnostic assays.

Da Silva y col., "Fast and reliable extraction of protozoan parasite DNA from fecal specimens", Molecular Diagnosis, 4 (1), 1999, 57-64, se refieren a un procedimiento para la extracción de ADN de especímenes que contienen esporas de Enteocytozoon bieneusi y Cryptosporidium parvum, respectivamente.Da Silva et al., "Fast and reliable extraction of protozoan parasite DNA from fecal specimens", Molecular Diagnosis, 4 (1), 1999, 57-64, refer to a procedure for the extraction of DNA from specimens containing spores of Enteocytozoon bieneusi and Cryptosporidium parvum, respectively.

Stone y col., "Detection of rRNA from four respiratory pathogens using an automated Qp replicase assay", Molecular and cellular probes, 10 (5), 1996, 359-370, divulgan la detección del complejo de Mycobacterium avium (23S), Mycoplasma pneumonia (16S), Pneumocystis carinii (18S) y Legionella pneumophilia (16S) en cuatro ensayos separados en un instrumento de amplificación automatizado Q-beta modelo.Stone et al., "Detection of rRNA from four respiratory pathogens using an automated Qp replicase assay", Molecular and cellular probes, 10 (5), 1996, 359-370, report the detection of the Mycobacterium avium (23S) complex, Mycoplasma pneumonia (16S), Pneumocystis carinii (18S), and Legionella pneumophilia (16S) in four separate assays on a model Q-beta automated amplification instrument.

Morgan y col., "Comparison of PCR and Microscopy for Detection of Cryptosporidium parvum in Human Fecal Specimens: Clinical Trial", Journal of Clinical Microbiology, 36(5), 1998, 995-998 divulgan que mediante la adición de polivinilpirrolidona insoluble pueden eliminarse los inhibidores de los extractos celulares.Morgan et al., "Comparison of PCR and Microscopy for Detection of Cryptosporidium parvum in Human Fecal Specimens: Clinical Trial", Journal of Clinical Microbiology, 36 (5), 1998, 995-998 disclose that by adding insoluble polyvinylpyrrolidone they can be removed inhibitors of cell extracts.

Arnal y col., "Comparison of seven RNA extraction methods on stool and shellfish samples prior to hepatitis A virus amplification", Journal of Virological Methods 77, 1999, 17-26, divulgan un procedimiento de aislamiento de un ácido nucleico del virus de la hepatitis A en muestra de heces humanas. El procedimiento de la presente invención como se define en las reivindicaciones difiere de dicha técnica anterior en que el ácido nucleico diana es un ácido nucleico humano y en que la adición de polivinilpirrolidona es antes de la unión del ácido nucleico.Arnal et al., "Comparison of seven RNA extraction methods on stool and shellfish samples prior to hepatitis A virus amplification", Journal of Virological Methods 77, 1999, 17-26, disclose a procedure for isolating a nucleic acid of the virus hepatitis A in human stool sample. The method of the present invention as defined in the claims differs from said prior art in that the target nucleic acid is a human nucleic acid and in that the addition of polyvinylpyrrolidone is prior to nucleic acid binding.

SumarioSummary

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no caen dentro del ámbito de dichas reivindicaciones se proporcionan solo para fines de ilustración y no forman parte de la presente invención.The invention is set forth in the appended claims. Embodiments of the description that do not fall within the scope of said claims are provided for purposes of illustration only and do not form part of the present invention.

Se proporciona en el presente documento la tecnología relacionada con el aislamiento de ácidos nucleicos. En particular, la tecnología se refiere a procedimientos, sistemas y kits para extraer y purificar ácidos nucleicos a partir de células intestinales exfoliadas en especímenes de heces para su uso en ensayos cuantitativos y sensibles. La tecnología se lleva a cabo según un procedimiento novedoso para purificar ADN específico a partir de heces que utiliza etapas de eliminación de inhibidores y captura directa de ADN a partir de sobrenadante de heces, o una combinación de estas etapas. La tecnología proporciona además dispositivos de filtración adecuados para su uso con muestras complejas y viscosas, tales como muestras de heces. Por consiguiente, se proporciona en el presente documento un procedimiento para aislar un ácido nucleico diana de una muestra, comprendiendo el procedimiento eliminar un inhibidor del ensayo, si está presente, de la muestra para producir una muestra clarificada; capturar el ácido nucleico diana, si está presente, de la muestra clarificada con un reactivo de captura para formar un complejo de captura; aislar el complejo de captura de la muestra clarificada; y recuperar el ácido nucleico diana, si está presente, del complejo de captura en una solución de ácido nucleico. En algunos ejemplos, el procedimiento comprende además retener la muestra clarificada después de la etapa de captura; y repetir las etapas de aislamiento y recuperación usando la muestra clarificada retenida y un segundo reactivo de captura.Technology related to nucleic acid isolation is provided herein. In particular, the technology relates to procedures, systems and kits for extracting and purifying nucleic acids from intestinal cells exfoliated in stool specimens for use in quantitative and sensitive assays. The technology is carried out according to a novel procedure for purifying specific DNA from stool that uses steps of removal of inhibitors and direct capture of DNA from stool supernatant, or a combination of these steps. The technology also provides filtration devices suitable for use with complex and viscous samples, such as stool samples. Accordingly, provided herein is a method of isolating a target nucleic acid from a sample, the method comprising removing an assay inhibitor, if present, from the sample to produce a clarified sample; capturing the target nucleic acid, if present, from the clarified sample with a capture reagent to form a capture complex; isolating the capture complex from the clarified sample; and recovering the target nucleic acid, if present, from the capture complex in a nucleic acid solution. In some examples, the method further comprises retaining the clarified sample after the capture step; and repeating the isolation and recovery steps using the retained clarified sample and a second capture reagent.

En algunos ejemplos, la eliminación del inhibidor comprende homogeneizar la muestra para producir un homogenado; centrifugar el homogenado para producir un sobrenadante; tratar el sobrenadante con una composición adsorbente del inhibidor para enlazar el inhibidor, si está presente, en un complejo de inhibidor; y aislar el complejo de inhibidor del sobrenadante para producir una muestra clarificada. La composición de absorción del inhibidor en algunos ejemplos es una polivinilpirrolidona. En algunos ejemplos, la polivinilpirrolidona es insoluble y, en algunos ejemplos, la polivinilpirrolidona es una polivinilpolipirrolidona. Es útil en algunos ejemplos proporcionar la polivinilpirrolidona en una forma premedida, por ejemplo, la polivinilpirrolidona puede proporcionarse en forma de comprimido. Se usan varias técnicas para separar el complejo de inhibidor de la muestra. Por ejemplo, en algunos ejemplos, el aislamiento del complejo de inhibidor puede comprender centrifugación para separar el complejo de inhibidor del sobrenadante. In some examples, removal of the inhibitor comprises homogenizing the sample to produce a homogenate; centrifuging the homogenate to produce a supernatant; treating the supernatant with an inhibitor adsorbent composition to bind the inhibitor, if present, into an inhibitor complex; and isolating the inhibitor complex from the supernatant to produce a clarified sample. The absorption composition of the inhibitor in some examples is a polyvinylpyrrolidone. In some examples, the polyvinylpyrrolidone is insoluble, and in some examples, the polyvinylpyrrolidone is a polyvinylpolypyrrolidone. It is useful in some examples to provide the polyvinylpyrrolidone in a pre-measured form, for example, the polyvinylpyrrolidone may be provided in the form of a tablet. Various techniques are used to separate the inhibitor complex from the sample. For example, in some examples, isolation of the inhibitor complex may comprise centrifugation to separate the inhibitor complex from the supernatant.

En algunos ejemplos, la centrifugación comprende centrifugar mediante una columna de centrifugación. Por lo tanto, en algunos ejemplos, se proporciona en el presente documento una tecnología relacionada con la filtración y, especialmente, pero no de forma exclusiva, a los filtros y procedimientos para filtrar mediante centrifugación. Específicamente, algunos ejemplos de la tecnología proporcionada en el presente documento resuelven el problema de la colmatación del filtro de centrifugación mediante provisión de una tecnología en la que tanto el extremo inferior como el cuerpo de un filtro de centrifugación estén hechos de un material poroso o permeable. Es decir, las paredes del filtro de centrifugación están hechos del mismo material o de un material similar al utilizado para el medio filtrante en el extremo inferior en los diseños convencionales. Como tal, cuando la parte inferior del filtro se obstruye durante la filtración, las paredes proporcionan superficie adicional a través de la cual la muestra puede filtrarse.In some examples, centrifugation comprises centrifuging through a spin column. Therefore, in some examples, a technology related to filtration and especially, but not exclusively, filters and methods for filtration by centrifugation is provided herein. Specifically, some examples of the technology provided herein solve the problem of centrifugal filter clogging by providing a technology in which both the lower end and the body of a centrifugal filter are made of a porous or permeable material. . That is, the walls of the spin filter are made of the same or similar material as that used for the lower end filter media in conventional designs. As such, when the bottom of the filter becomes clogged during filtration, the walls provide additional surface area through which the sample can filter.

Esta tecnología se proporciona en el presente documento como un filtro de centrifugación que comprende un cuerpo hueco, un extremo inferior y un extremo superior abierto opuesto al extremo inferior, en el que el cuerpo hueco del filtro de centrifugación está hecho de un material filtrante poroso, . En algunos ejemplos el extremo inferior está opcionalmente hecho de un material filtrante poroso. El cuerpo hueco y el extremo inferior del filtro de centrifugación pueden tener cualquier forma apropiada para la filtración a la cual se aplica el filtro. Por ejemplo, el cuerpo hueco puede ser un tubo y, en algunos ejemplos, el extremo inferior es hemisférico. En otros ejemplos, el extremo inferior es un disco, un cono, o una parte de un elipsoide. Por otro lado, el filtro de centrifugación está hecho de cualquier material que sea apropiado para filtrar una muestra. Por lo tanto, en algunos ejemplos, el material filtrante poroso es polietileno. Las muestras comprenden diferentes tamaños de partículas, materiales, precipitados, etc. que se deben eliminar mediante filtración. Por consiguiente, se puede seleccionar el material filtrante para que tenga propiedades físicas que proporcionen la separación deseada. Por ejemplo, en algunos ejemplos, el material poroso filtrante puede tener un tamaño de poro nominal de 20 micrómetros. En algunos ejemplos, el uso del filtro produce un filtrado que el usuario guarda para procesamiento adicional. Como tal, algunos ejemplos proporcionan un conjunto de filtro de centrifugación que comprende un filtro de centrifugación como se ha descrito y un recipiente de recogida adaptado para alojar el filtro de centrifugación y recoger el filtrado.This technology is provided herein as a centrifugal filter comprising a body hollow, a lower end and an open upper end opposite the lower end, in which the hollow body of the centrifugal filter is made of a porous filter material,. In some examples the lower end is optionally made of a porous filter material. The hollow body and the lower end of the centrifugal filter may have any shape suitable for the filtration to which the filter is applied. For example, the hollow body can be a tube, and in some examples the lower end is hemispherical. In other examples, the lower end is a disk, a cone, or a part of an ellipsoid. On the other hand, the centrifugal filter is made of any material that is suitable for filtering a sample. Therefore, in some examples, the porous filter material is polyethylene. The samples comprise different sizes of particles, materials, precipitates, etc. that must be removed by filtration. Accordingly, the filter material can be selected to have physical properties that provide the desired separation. For example, in some examples, the porous filter material may have a nominal pore size of 20 microns. In some examples, using the filter produces a filter that the user saves for further processing. As such, some examples provide a spin filter assembly comprising a spin filter as described and a collection container adapted to house the spin filter and collect the filtrate.

También se proporcionan en el presente documento procedimientos para producir un filtrado a partir de una muestra que comprende introducir una muestra a filtrar dentro del filtro de centrifugación y centrifugar el filtro de centrifugación, en el que, durante la centrifugación, una fracción de la muestra atraviesa el material filtrante poroso de dicho filtro de centrifugación para producir un filtrado.Also provided herein are methods for producing a filtrate from a sample which comprises introducing a sample to be filtered into the centrifugal filter and centrifuging the centrifugal filter, wherein, during centrifugation, a fraction of the sample passes through the porous filter material of said centrifugal filter to produce a filtrate.

La tecnología se puede proporcionar en forma de un kit para su uso en la separación de una muestra. Los ejemplos de dicho kit comprenden un filtro de centrifugación como se describe e instrucciones de uso. En algunos ejemplos, el kit comprende además un recipiente de recogida. En algunos ejemplos, un kit que comprende un filtro de centrifugación comprende además reactivos y materiales adicionales para preparar la muestra, por ejemplo, para la eliminación de inhibidores y/o el aislamiento de ácidos nucleicos.The technology can be provided in the form of a kit for use in separating a sample. Examples of such a kit comprise a centrifugal filter as described and instructions for use. In some examples, the kit further comprises a collection container. In some examples, a kit comprising a spin filter further comprises additional reagents and materials to prepare the sample, for example, for inhibitor removal and / or nucleic acid isolation.

En algunos ejemplos, los procedimientos y sistemas de la tecnología comprenden capturar un ácido nucleico diana. Capturar el ácido nucleico diana, en algunos ejemplos, comprende exponer una muestra, tal como una preparación de muestra clarificada, a condiciones de desnaturalización para producir una muestra desnaturalizada; y unir el ácido nucleico diana a la muestra desnaturalizada para capturar el reactivo para formar un complejo de captura. Muchos tratamientos y condiciones son de utilidad en la desnaturalización de macromoléculas tales como el ADN. Por ejemplo, en algunos ejemplos, la condición de desnaturalización puede comprender calentamiento, por ejemplo, en algunos ejemplos, la condición de desnaturalización comprende calentar a 90°C. Suplementar la muestra a desnaturalizar facilita la desnaturalización; por consiguiente, en algunos ejemplos, la muestra clarificada comprende además un desnaturalizante. En algunos ejemplos preferidos, el desnaturalizante comprende tiocianato de guanidina. Por otro lado, en algunos ejemplos, el reactivo de captura comprende un oligonucleótido complementario de al menos una parte del ácido nucleico diana. En algunos ejemplos preferidos, el reactivo de captura comprende partículas, por ejemplo, una partícula magnética. El oligonucleótido, en algunos ejemplos de la tecnología, se hibrida con al menos una parte del ácido nucleico diana y, de esta forma, en algunos ejemplos, la etapa de unión comprende hibridar el oligonucleótido y el ácido nucleico diana. El aislamiento del reactivo de captura (por ejemplo, el complejo reactivo de captura/ácido nucleico diana) se lleva a cabo en algunos ejemplos exponiendo el reactivo de captura a un campo magnético; es decir, en algunos ejemplos proporcionados en el presente documento, la etapa de aislamiento comprende exponer el reactivo de captura a un campo magnético y, en algunos ejemplos, exponer el complejo de captura al campo magnético localiza el ácido nucleico diana. El campo magnético se produce mediante cualquier imán o dispositivo magnético adecuado para el procedimiento. Por ejemplo, la etapa de aislamiento puede comprender introducir la muestra en un campo magnético producido por un primer imán orientado con su polo norte muy cerca de la muestra y un segundo imán orientado con su polo sur muy cerca de la muestra; y esperar un tiempo suficiente para permitir que el campo magnético desplace las partículas magnéticas hasta la ubicación deseada. Un dispositivo para producir un campo magnético intenso se describe, por ejemplo, en el documento US 2012/0262260 A1.In some examples, the methods and systems of the technology comprise capturing a target nucleic acid. Capturing the target nucleic acid, in some examples, comprises exposing a sample, such as a clarified sample preparation, to denaturing conditions to produce a denatured sample; and binding the target nucleic acid to the denatured sample to capture the reagent to form a capture complex. Many treatments and conditions are useful in the denaturation of macromolecules such as DNA. For example, in some examples, the denaturation condition may comprise heating, for example, in some examples, the denaturation condition comprises heating to 90 ° C. Supplementing the sample to be denatured facilitates denaturation; therefore, in some examples, the clarified sample further comprises a denaturant. In some preferred examples, the denaturant comprises guanidine thiocyanate. On the other hand, in some examples, the capture reagent comprises an oligonucleotide complementary to at least a part of the target nucleic acid. In some preferred examples, the capture reagent comprises particles, for example a magnetic particle. The oligonucleotide, in some examples of the technology, hybridizes to at least a portion of the target nucleic acid, and thus, in some examples, the ligation step comprises hybridizing the oligonucleotide and the target nucleic acid. Isolation of the capture reagent (eg, the capture reagent / target nucleic acid complex) is carried out in some examples by exposing the capture reagent to a magnetic field; that is, in some examples provided herein, the isolation step comprises exposing the capture reagent to a magnetic field and, in some examples, exposing the capture complex to the magnetic field locates the target nucleic acid. The magnetic field is produced by any magnet or magnetic device suitable for the procedure. For example, the isolation step may comprise introducing the sample into a magnetic field produced by a first magnet oriented with its north pole very close to the sample and a second magnet oriented with its south pole very close to the sample; and waiting long enough to allow the magnetic field to move the magnetic particles to the desired location. A device for producing a strong magnetic field is described, for example, in US 2012/0262260 A1.

Las tecnologías proporcionan la recuperación del ácido nucleico diana a partir del reactivo de captura. En algunos ejemplos, la recuperación del ácido nucleico diana comprende eluir el ácido nucleico diana a partir del complejo de captura, por ejemplo, en algunos ejemplos, mediante calentamiento. En algunos ejemplos, la elución del ácido nucleico diana desde el complejo de captura comprende exponer el complejo de captura a un pH elevado, por ejemplo, en algunos ejemplos, añadiendo una solución de hidróxido de sodio.The technologies provide for the recovery of the target nucleic acid from the capture reagent. In some examples, recovery of the target nucleic acid comprises eluting the target nucleic acid from the capture complex, for example, in some examples, by heating. In some examples, elution of the target nucleic acid from the capture complex comprises exposing the capture complex to high pH, for example, in some examples, adding a sodium hydroxide solution.

En algunos ejemplos, la tecnología proporciona procedimientos, sistemas y kits para capturar múltiples ácidos nucleicos de una sola muestra, por ejemplo, una muestra de heces. Por ejemplo, se proporcionan en el presente documento procedimientos para aislar un ácido nucleico de una muestra de heces que comprende poner en contacto una muestra de heces con un reactivo de captura específico de la diana; unir un ácido nucleico diana, cuando está presente, al reactivo de captura específico de la diana para formar un complejo; aislar el complejo que comprende el reactivo de captura específico de la diana y el ácido nucleico diana, cuando está presente, de la muestra de heces; eluir el ácido nucleico diana, cuando está presente, del complejo para producir una solución de ácido nucleico diana que comprende el ácido nucleico diana, cuando está presente; y repetir el procedimiento usando un reactivo de captura específico de la diana diferente. Los procedimientos son adecuados para muestras grandes, por ejemplo, que tengan una masa de al menos 4 gramos. Por otra parte, cada ácido nucleico diana eluido está suficientemente purificado, suficientemente concentrado y suficientemente exento de inhibidores de tal forma que cada ácido nucleico diana eluido, cuando está presente, se detecta mediante PCR cuantitativa cuando la solución de ácido nucleico diana constituye hasta aproximadamente una tercera parte de un volumen de la PCR cuantitativa.In some examples, the technology provides procedures, systems, and kits for capturing multiple nucleic acids from a single sample, eg, a stool sample. For example, provided herein are methods of isolating nucleic acid from a stool sample comprising contacting a stool sample with a target-specific capture reagent; binding a target nucleic acid, when present, to the target-specific capture reagent to form a complex; isolating the complex comprising the target specific capture reagent and the target nucleic acid, when present, from the stool sample; eluting the target nucleic acid, when present, from the complex to produce a target nucleic acid solution comprising the target nucleic acid, when present; and repeating the procedure using a different target specific capture reagent. The procedures are suitable for large samples, for example, having a mass of at least 4 grams. On the other hand, each eluted target nucleic acid is sufficiently purified, sufficiently concentrated, and sufficiently free of inhibitors such that each target nucleic acid Eluted, when present, is detected by quantitative PCR when the target nucleic acid solution constitutes up to about one third of a volume of the quantitative PCR.

En algunos ejemplos de los procedimientos proporcionados, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana humano. En los ejemplos adicionales, el ácido nucleico diana es un ADN. Aunque sin limitación debida al procedimiento por el cual el ácido nucleico se aísla de la muestra de heces, en algunos ejemplos, el reactivo de captura específico de la diana es un reactivo de captura de ácido nucleico específico de secuencia. En algunos ejemplos, el reactivo de captura de ácido nucleico específico de secuencia es un oligonucleótido y, en algunos ejemplos, el oligonucleótido está unido covalentemente a una partícula magnética o paramagnética. Algunos ejemplos proporcionan que se use un imán en la etapa de aislamiento y, en algunos ejemplos, se proporciona el asilamiento simultáneo de más de una diana usando múltiples reactivos de captura específicos de dianas en una única etapa de aislamiento.In some examples of the methods provided, the target nucleic acid is a human target nucleic acid. In additional examples, the target nucleic acid is DNA. Although not limited by the method by which the nucleic acid is isolated from the stool sample, in some examples, the target-specific capture reagent is a sequence-specific nucleic acid capture reagent. In some examples, the sequence-specific nucleic acid capture reagent is an oligonucleotide, and in some examples, the oligonucleotide is covalently attached to a magnetic or paramagnetic particle. Some examples provide that a magnet is used in the isolation step, and in some examples, simultaneous isolation of more than one target is provided using multiple target-specific capture reagents in a single isolation step.

El procedimiento no está limitado a los tipos de muestras que se van a procesar. Por ejemplo, en algunos ejemplos, la muestra puede ser una muestra viscosa, por ejemplo, que tengan una viscosidad de más de diez centipoise en algunos ejemplos, y que tengan una viscosidad de más de veinte centipoise en algunos ejemplos. Además, las muestras tienen una amplia gama de tamaños. Los procedimientos se utilizan para procesar muestras que tienen, en algunos ejemplos, una masa superior a un gramo y, en algunos ejemplos, la muestra tiene una masa superior a cinco gramos.The procedure is not limited to the types of samples to be processed. For example, in some examples, the sample may be a viscous sample, for example, having a viscosity of more than ten centipoise in some examples, and having a viscosity of more than twenty centipoise in some examples. Also, the samples have a wide range of sizes. The procedures are used to process samples that have, in some examples, a mass greater than one gram and, in some examples, the sample has a mass greater than five grams.

La tecnología proporcionada en el presente documento se dirige a la eliminación de inhibidores de las muestras hasta por debajo una cantidad que inhiba un ensayo. Por lo tanto, en algunos ejemplos, el procedimiento proporciona que la solución de ácido nucleico comprenda una primera cantidad de inhibidor del ensayo que sea menor que una segunda cantidad de inhibidor del ensayo, donde la segunda cantidad del inhibidor del ensayo inhiben la PCR cuando cinco microlitros de la solución de ácido nucleico se usan en una PCR que tiene un volumen de veinticinco microlitros. En algunos ejemplos, la solución de ácido nucleico comprende una primera cantidad del inhibidor del ensayo que es menor de una segunda cantidad del inhibidor del ensayo, en el que la segunda cantidad del inhibidor del ensayo inhibe la PCR cuando un microlitros de la solución de ácido nucleico se usa en una PCR que tiene un volumen de veinticinco microlitros.The technology provided herein is aimed at removing inhibitors from samples down to an amount that inhibits an assay. Thus, in some examples, the method provides that the nucleic acid solution comprises a first amount of assay inhibitor that is less than a second amount of assay inhibitor, where the second amount of assay inhibitor inhibits CRP when five microliters of the nucleic acid solution are used in a PCR having a volume of twenty-five microliters. In some examples, the nucleic acid solution comprises a first amount of the assay inhibitor that is less than a second amount of the assay inhibitor, wherein the second amount of the assay inhibitor inhibits CRP when one microliter of the acid solution Nucleic is used in a PCR that has a volume of twenty-five microliters.

La tecnología está relacionada con el diagnóstico médico molecular en el que se interroga el estado, presencia, cantidad, secuencia, etc., de una sustancia biológica (por ejemplo, una molécula) para ayudar en la evaluación médica. Por consiguiente, en algunos ejemplos, el ácido nucleico diana se correlaciona con una patología seleccionada entre el conjunto que consiste en cáncer de colon y adenoma.The technology is related to molecular medical diagnosis in which the state, presence, quantity, sequence, etc., of a biological substance (eg a molecule) is interrogated to aid in medical evaluation. Accordingly, in some examples, the target nucleic acid correlates with a pathology selected from the set consisting of colon cancer and adenoma.

La tecnología descrita en el presente documento se proporciona en una forma de kit en algunos ejemplos -por ejemplo, se proporciona que la tecnología es un kit para aislar un ácido nucleico diana de una muestra que comprende un reactivo de captura que comprende un oligonucleótido unido covalentemente a una partícula magnética, un aparato para producir un campo magnético, polivinilpirrolidona, e instrucciones de uso. En algunos ejemplos, el kit comprende además una solución para homogeneización. En algunos ejemplos, el kit comprende además una solución para elución y, en algunos ejemplos, el kit comprende además tiocianato de guanidina. En algunos ejemplos, es conveniente que la polivinilpirrolidona esté en una forma premedida. Por ejemplo, en algunos ejemplos, la polivinilpirrolidona se proporciona en un comprimido o cápsula. Algunos ejemplos del kit proporcionan un filtro de centrifugación para eliminar la polivinilpirrolidona.The technology described herein is provided in kit form in some examples - for example, the technology is provided to be a kit for isolating a target nucleic acid from a sample comprising a capture reagent comprising a covalently linked oligonucleotide to a magnetic particle, an apparatus for producing a magnetic field, polyvinylpyrrolidone, and instructions for use. In some examples, the kit further comprises a solution for homogenization. In some examples, the kit further comprises an elution solution, and in some examples, the kit further comprises guanidine thiocyanate. In some examples, it is desirable that the polyvinylpyrrolidone is in a pre-measured form. For example, in some examples, the polyvinylpyrrolidone is provided in a tablet or capsule. Some examples of the kit provide a spin filter to remove polyvinylpyrrolidone.

En algunos ejemplos, el ácido nucleico diana se aísla usando un campo magnético. Como tal, los ejemplos de los kits descritos en el presente documento proporcionan un aparato que produce un campo magnético. Un dispositivo que se usa para producir un campo magnético adecuado para su uso con la tecnología proporcionada en el presente documento comprenden dos imanes o conjuntos de imanes, y sitúa el uno o más polos norte del primer imán o conjunto de imanes muy cerca de la muestra y el uno o más polos sur del segundo imán o conjunto de imanes muy cerca de la muestra. En algunos ejemplos, los kits proporcionan además un dispositivo para recoger una muestra, por ejemplo, un dispositivo que tiene un cuerpo y una cápsula de muestra desmontable unida al cuerpo, en la que la cápsula de muestra desmontable comprende un espacio para recogida de muestra adaptado para incluir una muestra (por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos N°. 61/476,707).In some examples, the target nucleic acid is isolated using a magnetic field. As such, the examples of the kits described herein provide an apparatus that produces a magnetic field. A device that is used to produce a suitable magnetic field for use with the technology provided herein comprises two magnets or sets of magnets, and locates the one or more north poles of the first magnet or set of magnets very close to the sample. and the one or more south poles of the second magnet or set of magnets very close to the sample. In some examples, the kits further provide a device for collecting a sample, for example, a device having a body and a removable sample capsule attached to the body, wherein the removable sample capsule comprises an adapted sample collection space. to include a sample (eg, as described in US Patent Application No. 61 / 476,707).

En algunos ejemplos, el kit proporciona recipientes (por ejemplo, un tubo, un vial, un frasco, y similares) usados para procesar muestras y contener diferentes composiciones utilizadas para procesar muestras o que son el resultado del procesamiento de muestras. Por ejemplo, en algunos ejemplos, el kit puede comprender además un recipiente en el que contener la muestra y, en algunos ejemplos, el kit comprende además un recipiente para contener el ácido nucleico diana aislado. El kit, en algunos ejemplos, se utiliza en un lugar diferente al de procesamiento de la muestra y/o donde el analito se analiza. Por consiguiente, en algunos ejemplos, el kit comprende además un recipiente para envío. In some examples, the kit provides containers (eg, a tube, a vial, a bottle, and the like) used to process samples and contain different compositions used to process samples or that are the result of sample processing. For example, in some examples, the kit may further comprise a container in which to contain the sample and, in some examples, the kit further comprises a container to contain the isolated target nucleic acid. The kit, in some examples, is used in a different location than the sample processing location and / or where the analyte is tested. Accordingly, in some examples, the kit further comprises a shipping container.

La tecnología proporcionada en el presente documento encuentra uso en sistemas para preparar un ácido nucleico a partir de una muestra. En algunos ejemplos, el sistema comprende polivinilpirrolidona para eliminar un inhibidor de la muestra, un reactivo para capturar un ácido nucleico diana de la muestra, y una funcionalidad para producir un campo magnético. En algunos ejemplos, el sistema comprende además una funcionalidad para recoger la muestra y en algunos ejemplos el sistema comprende además una funcionalizar para enviar la solución de ácido nucleico. The technology provided herein finds use in systems for preparing nucleic acid from a sample. In some examples, the system comprises polyvinylpyrrolidone to remove an inhibitor from the sample, a reagent to capture a target nucleic acid from the sample, and a functionality to produce a magnetic field. In some examples, the system further comprises a functionality to collect the sample and in some examples the system further comprises a functionalize to deliver the nucleic acid solution.

Otros ejemplos serán evidentes para las personas expertas en la técnica relevante basándose en las enseñanzas contenidas en el presente documento.Other examples will be apparent to those skilled in the relevant art based on the teachings contained herein.

Breve descripción de los dibujosBrief description of the drawings

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente tecnología se entenderán mejor con respecto a los siguientes dibujos:These and other features, aspects, and advantages of the present technology will be better understood with respect to the following drawings:

La Figura 1 proporciona diagramas de aspectos del procedimiento de aislamiento de ácido nucleico. La Figura 1A proporciona un diagrama que muestra las etapas del procedimiento de aislamiento de ácido nucleico. La Figura 1B es un diagrama de flujo que muestra el procedimiento que es útil para la extracción secuencial de múltiples dianas a partir de la muestra como aspecto del procedimiento global de la Figura 1A.Figure 1 provides diagrams of aspects of the nucleic acid isolation procedure. Figure 1A provides a diagram showing the steps of the nucleic acid isolation procedure. Figure 1B is a flow chart showing the procedure that is useful for the sequential extraction of multiple targets from the sample as an aspect of the overall procedure of Figure 1A.

La Figura 2 es una estructura química de la polivinilpirrolidona.Figure 2 is a chemical structure of polyvinylpyrrolidone.

La Figura 3 es un dibujo de un filtro de centrifugación ilustrativo.Figure 3 is a drawing of an exemplary spin filter.

La Figura 4 es un dibujo que muestra una vista en despiece ordenado del filtro de centrifugación mostrado en la Figura 3.Figure 4 is a drawing showing an exploded view of the centrifugal filter shown in Figure 3.

La Figura 5 es una serie de dibujos que muestran los extremos inferiores de un filtro de centrifugación asociados con el filtro de centrifugación de las Figuras 3 y 4.Figure 5 is a series of drawings showing the lower ends of a spin filter associated with the spin filter of Figures 3 and 4.

La Figura 5A es un dibujo de un extremo inferior discoidal sólido (por ejemplo, no poroso o no permeable); La Figura 5B es un dibujo de un extremo inferior discoidal poroso (permeable); La Figura 5C es un dibujo de un extremo inferior cónico poroso.Figure 5A is a drawing of a solid discoidal lower end (eg, non-porous or non-permeable); Figure 5B is a drawing of a porous (permeable) discoidal lower end; Figure 5C is a drawing of a porous conical lower end.

La Figura 6 es un dibujo de un filtro de centrifugación montado con un tubo de recogida.Figure 6 is a drawing of a centrifugal filter mounted with a collection tube.

La Figura 7 es un dibujo en sección del filtro de centrifugación representado en la Figura 6.Figure 7 is a sectional drawing of the centrifugal filter shown in Figure 6.

La Figura 8 es un dibujo de un filtro de centrifugación que comprende un cuerpo de un material poroso y un extremo inferior proporcionado mediante un soporte de filtro. La Figura 8A es una vista montada y la Figura 8B es un vista en despiece ordenado.Figure 8 is a drawing of a centrifugal filter comprising a body of a porous material and a lower end provided by a filter holder. Figure 8A is an assembled view and Figure 8B is an exploded view.

Las Figuras 9A-9D son representaciones gráficas que muestran la eliminación de inhibidores de una muestra de heces.Figures 9A-9D are graphical representations showing removal of inhibitors from a stool sample.

Las Figuras 10A-10D son representaciones gráficas que muestran que la filtración con centrifugación mejora la eliminación de inhibidores.Figures 10A-10D are graphical representations showing that centrifugal filtration improves inhibitor removal.

La Figura 11A es una representación gráfica de datos que comparan la eficacia de localización de la tecnología convencional para muestras que tengan viscosidades de 1 centipoise y 25 centipoise. La Figura 11B es una representación gráfica de datos que comparan la eficacia de localización del dispositivo de localización magnética proporcionado por Light y Miller (documento US 2012/0262260 A1) proporcionado para muestras que tienen viscosidades de 1 centipoise y 25 centipoise.Figure 11A is a graphical representation of data comparing the localization efficiency of conventional technology for samples having viscosities of 1 centipoise and 25 centipoise. Figure 11B is a graphical representation of data comparing the locating efficiency of the magnetic locating device provided by Light and Miller (US 2012/0262260 A1) provided for samples having viscosities of 1 centipoise and 25 centipoise.

La Figura 12A es una representación gráfica que muestra los resultados de una PCR cuantitativa en la que una sola extracción de una muestra de heces recupera la mayoría del ADN diana. La Figura 12B muestra las concentraciones de Gen A y Gen V en soluciones de ácido nucleico procedentes de una primera extracción y una segunda extracción.Figure 12A is a graphical representation showing the results of a quantitative PCR in which a single extraction of a stool sample recovers the majority of the target DNA. Figure 12B shows the concentrations of Gene A and Gene V in nucleic acid solutions from a first extraction and a second extraction.

Las Figuras 13A - 13D muestran gráficas que muestran los resultados de PCR cuantitativas en las que las recuperaciones de cuatro ADN dianas son similares con independencia del orden en el que los cuatro ADN dianas se extrajeron de la muestra de heces.Figures 13A-13D show graphs showing quantitative PCR results in which the recoveries of four DNA targets are similar regardless of the order in which the four DNA targets were extracted from the stool sample.

La Figura 14 proporciona una diagrama que compara el flujo de trabajo de una realización (Proceso A) con un procedimiento ilustrativo para aislar ADN de muestras de heces usando etapas basadas en procedimientos existentes (Proceso B, véase, por ejemplo, el documento WO 2010/028382).Figure 14 provides a diagram comparing the workflow of one embodiment (Process A) with an illustrative procedure for isolating DNA from stool samples using steps based on existing procedures (Process B, see for example WO 2010 / 028382).

Descripción detalladaDetailed description

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de las descripción que no caen dentro del ámbito de dichas reivindicaciones de proporcionan solo para fines de ilustración y no forman parte de la presente invención.The invention is set forth in the appended claims. Embodiments of the description that do not fall within the scope of said claims are provided for purposes of illustration only and do not form part of the present invention.

La presente tecnología está relacionada con la producción de muestras de ADN y, en particular, a procedimientos para producir muestras de ADN que comprenden ácidos nucleicos muy purificados de baja abundancia en un pequeño volumen (por ejemplo, menos de 100, menos de 60 microlitros) y que están prácticamente y/o eficazmente exentos de sustancias que inhiben los ensayos usados para analizar las muestras de ADN (por ejemplo, PCR, INVADER, QuARTS, etc.). Dichas muestras de ADN son de utilidad en ensayos diagnósticos que detectar de forma cualitativa la presencia de, o que miden de forma cuantitativa, la actividad, expresión o cantidad de un gen, una variante genética (por ejemplo, un alelo), o una modificación genética (por ejemplo, metilación) presente en una muestra tomada de un paciente. Por ejemplo, algunos tipos de cáncer se han correlacionado con la presencia de alelos mutantes concretos o estados de metilación concretos y, por tanto, la detección y/o cuantificación de dichos alelos mutantes o estados de metilación tiene valor predictivo en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer.The present technology is related to the production of DNA samples and, in particular, to procedures for producing DNA samples comprising highly purified low abundance nucleic acids in a small volume (eg less than 100, less than 60 microliters) and that they are practically and / or effectively free of substances that inhibit the assays used to analyze DNA samples (eg, PCR, INVADER, QuARTS, etc.). These DNA samples are useful in diagnostic tests that qualitatively detect the presence of, or quantitatively measure, the activity, expression or quantity of a gene, a genetic variant (for example, an allele), or a modification. genetics (eg, methylation) present in a sample taken from a patient. For example, some types of cancer have been correlated with the presence of specific mutant alleles or specific methylation states and, therefore, the detection and / or quantification of these mutant alleles or methylation states has predictive value in diagnosis and treatment cancer.

Muchos marcadores genéticos valiosos están presentes en cantidades extremadamente pequeñas en muestras, y muchos de los eventos que producen dichos marcadores son raros. Por consiguiente, incluso procedimientos de detección sensibles tales como la PCR requieren una gran cantidad de ADN para proporcionar suficiente cantidad de una diana poco abundante para alcanzar o superar el umbral de detección del ensayo. Por otra parte, la presencia de incluso bajas cantidades de sustancias inhibidoras alteran negativamente la exactitud y precisión de estos ensayos dirigidos a detectar dichas cantidades bajas de una diana. Por consiguiente, se proporcionan en el presente documento procedimientos que proporcionan la gestión de volumen y concentración necesaria para producir este tipo de muestras de ADN.Many valuable genetic markers are present in extremely small amounts in samples, and many of the events that produce such markers are rare. Accordingly, even sensitive detection procedures such as PCR require a large quantity of DNA to provide enough of a low abundance target to meet or exceed the detection threshold of the assay. On the other hand, the presence of even low amounts of inhibitory substances negatively alter the accuracy and precision of these assays aimed at detecting such low amounts of a target. Accordingly, procedures are provided herein that provide the volume and concentration management necessary to produce these types of DNA samples.

Algunas muestras biológicas, tales como muestras de heces, contienen una amplia diversidad de diferentes compuestos que son inhibidores de la PCR. Por lo tanto, los procedimientos de extracción de ADN incluyen procedimientos para eliminar y/o Inactivar los inhibidores de la PCR. Como tal, se proporciona en el presente documento una tecnología relacionada con el procesamiento y preparación de las muestras y, en particular, pero no de forma exclusiva, a procedimientos, sistemas y kits para eliminar inhibidores de los ensayos de las muestras que comprenden ácidos nucleicos.Some biological samples, such as stool samples, contain a wide variety of different compounds that are PCR inhibitors. Therefore, DNA extraction procedures include procedures for removing and / or inactivating PCR inhibitors. As such, technology related to sample processing and preparation, and in particular, but not exclusively, to procedures, systems and kits for removing assay inhibitors from samples comprising nucleic acids is provided herein. .

DefinicionesDefinitions

Para facilitar la comprensión de la presente tecnología, se definen a continuación varios términos y frases. Se proporcionan definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.To facilitate understanding of the present technology, several terms and phrases are defined below. Additional definitions are provided throughout the detailed description.

Tal como se usa en el presente documento, las palabras "un" o "uno" o "el" pueden significar uno o más uno. Por ejemplo, "un" artilugio puede significar un artilugio o una pluralidad de artilugios.As used herein, the words "a" or "an" or "the" can mean one or more one. For example, "a" gadget can mean one gadget or a plurality of gadgets.

Tal como se usa en el presente documento, un "inhibidor" significa cualquier compuesto, sustancia o composición, o combinación de los mismos, que actúa para disminuir la actividad, precisión o exactitud de un ensayo, bien directa o indirectamente, con respecto a la actividad, precisión o exactitud del ensayo cuando el inhibidor está ausente. Un inhibidor puede ser una molécula, un átomo, o una combinación de moléculas o átomos sin carácter limitante.As used herein, an "inhibitor" means any compound, substance, or composition, or combination thereof, that acts to decrease the activity, precision, or accuracy of an assay, either directly or indirectly, with respect to the assay activity, precision or accuracy when inhibitor is absent. An inhibitor can be a non-limiting molecule, atom, or combination of molecules or atoms.

Tal como se usa en el presente documento, el procedimiento de hacer pasar una mezcla por un filtro se denominad "filtración". El líquido producido después de filtrar una suspensión de un sólido en un líquido se denomina "filtrado", mientras que el sólido remanente en el filtro se denomina "retentato", "residuo", o "filtrando".As used herein, the process of passing a mixture through a filter is referred to as "filtration." The liquid produced after filtering a suspension of a solid in a liquid is called "filtrate", while the solid remaining on the filter is called "retentate", "residue", or "filtering".

Tal como se usa en el presente documento, "insoluble" se refiere a la propiedad de una sustancia que no se disuelve prácticamente en agua y es esencialmente inmiscible con ella. En la separación de una fase acuosa de una fase no acuosa, una sustancia no insoluble no se reparte en ni se repare junto con la fase acuosa.As used herein, "insoluble" refers to the property of a substance that practically does not dissolve in water and is essentially immiscible with it. In separating an aqueous phase from a non-aqueous phase, an insoluble substance does not partition into or repair together with the aqueous phase.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "sujeto" y "paciente" se refieren a cualquier animal, tal como un perro, gato, ave, ganado, y especialmente a un mamífero, preferentemente un ser humano. En algunos casos, el sujeto es también un "usuario" (y, por tanto, el usuario es también el sujeto o paciente).As used herein, the terms "subject" and "patient" refer to any animal, such as a dog, cat, bird, cattle, and especially a mammal, preferably a human. In some cases, the subject is also a "user" (and thus the user is also the subject or patient).

Tal como se usa en el presente documento, el término "muestras" y "espécimen" se utilizan indistintamente, y en el sentido más amplio. En un sentido, se entiende que muestra incluye un espécimen o cultivo obtenido de cualquier origen, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas se pueden obtener de animales (incluidos los seres humanos) y abarcan fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen hemoderivados, tales como plasma, suero, heces, orina y similares. Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como material de la superficie, suelo, lodo, fango, biopelículas, agua, cristales, y muestras industriales. Sin embargo, dichos ejemplos no deben tomarse como una limitación de los tipos de muestra.As used herein, the terms "samples" and "specimen" are used interchangeably, and in the broadest sense. In one sense, sample is understood to include a specimen or culture obtained from any source, as well as biological and environmental samples. Biological samples can be obtained from animals (including humans) and include fluids, solids, tissues, and gases. Biological samples include blood products, such as plasma, serum, stool, urine, and the like. Environmental samples include environmental material such as surface material, soil, mud, sludge, biofilms, water, crystals, and industrial samples. However, these examples should not be taken as a limitation of the sample types.

El término "diana", cuando se usa en referencia a la captura de un ácido nucleico, la detección o el procedimiento de análisis, se refiere por lo general a un ácido nucleico que tiene un rasgo, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos particular que se debe detectar o analizar, por ejemplo, en una muestra con sospecha de contener el ácido nucleico diana. En algunos ejemplos, una diana es un ácido nucleico que tiene una secuencia particular para la que es deseable determinar un estado de metilación. Cuando se usa en referencia a la reacción en cadena de la polimerasa, "diana" se refiere por lo general a la región de ácido nucleico rodeado por los cebadores usados en la reacción en cadena de la polimerasa. Por lo tanto, se desea separar la "diana" de otras secuencias de ácidos nucleicos que puedan estar presentes en una muestra. Un "segmento" se define como una región de ácido nucleico dentro de la secuencia diana. La expresión "plantilla de ADN" se refiere a un ácido nucleico procedente de una muestra que se ha analizado para determinar la presencia de una diana.The term "target", when used in reference to nucleic acid capture, detection, or analysis procedure, generally refers to a nucleic acid that has a trait, for example, a particular nucleotide sequence that it must be detected or analyzed, for example, in a sample suspected of containing the target nucleic acid. In some examples, a target is a nucleic acid that has a particular sequence for which it is desirable to determine a methylation state. When used in reference to the polymerase chain reaction, "target" generally refers to the region of nucleic acid surrounded by the primers used in the polymerase chain reaction. Therefore, it is desired to separate the "target" from other nucleic acid sequences that may be present in a sample. A "segment" is defined as a nucleic acid region within the target sequence. The term "DNA template" refers to a nucleic acid from a sample that has been analyzed for the presence of a target.

Tal como se usa en el presente documento, el término "locus" se refiere a una posición determinada, por ejemplo, de una mutación, polimorfismo, o resto C en un dinucleótido CpG, dentro de una región o segmento de ácido nucleico definidos, tal como un gen o cualquier otra secuencia caracterizada en un cromosoma o molécula de ARN. Un locus no está limitado a ningún tamaño o longitud concreto, y se puede referir a una porción de un cromosoma, un gen, elemento genético funcional, o un único nucleótido o par de bases. Tal como se usa en el presente documento en referencia a los sitios CpG que pueden estar metilados, un locus se refiere al resto C del dinucleótido CpG.As used herein, the term "locus" refers to a particular position, for example, of a mutation, polymorphism, or C residue in a CpG dinucleotide, within a defined nucleic acid region or segment, such as as a gene or any other sequence characterized in a chromosome or RNA molecule. A locus is not limited to any particular size or length, and can refer to a portion of a chromosome, a gene, a functional genetic element, or a single nucleotide or base pair. As used herein in reference to CpG sites that may be methylated, a locus refers to residue C of the CpG dinucleotide.

Tal como se usa en el presente documento, un "líquido de recogida" es un líquido en el que introducir una muestra para conservar, estabilizar, y mantener de otra forma su integridad como una muestra representativa del espécimen del que se ha tomado la muestra. Aunque no está limitado en lo que respecta a los tipos de composiciones que son útiles como líquidos de recogida, los ejemplos de líquidos de recogida son tampones acuosos que comprenden de forma opcional un conservante y disolventes orgánicos, tales como acetonitrilo. As used herein, a "collection liquid" is a liquid into which a sample is introduced to preserve, stabilize, and otherwise maintain its integrity as a representative sample of the specimen from which the sample was taken. Although not limited as to the types of compositions that are useful as collection liquids, examples of collection liquids are aqueous buffers optionally comprising a preservative and organic solvents, such as acetonitrile.

Tal como se usa en el presente documento, "un reactivo de captura" se refiere a cualquier agente que sea capaz de unirse a un analito (por ejemplo, una diana). Preferentemente, "un reactivo de captura" se refiere a cualquier agente que sea capaz de unirse específicamente a un analito, por ejemplo, que tenga una mayor afinidad de unión y/o especificidad de unión para el analito que para cualquier otro resto. Cualquier resto, tal como una célula, un orgánulo celular, una molécula inorgánica, una molécula orgánica y una mezcla o complejo de los mismos se puede usar como reactivo de captura si tiene la necesaria afinidad de unión y/o especificidad de unión para el analito. Los reactivos de captura pueden ser péptidos, proteínas, por ejemplo, anticuerpos o receptores, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, vitaminas, oligosacáridos, carbohidratos, lípidos, moléculas pequeñas, o un complejo de los mismos. Los reactivos de captura que comprenden ácidos nucleicos, por ejemplo, oligonucleótidos, pueden capturar un ácido nucleico diana mediante hibridación específica de secuencia (por ejemplo, mediante la formación de pares de bases de Watson-Crick convencionales), o mediante otras interacciones de unión. Cuando un oligonucleótido de captura se hibrida con un ácido nucleico diana, la hibridación puede implicar una porción del oligonucleótido, o la secuencia completa del oligonucleótido, y el oligonucleótido se puede unir a una porción o a la totalidad de la secuencia de ácido nucleico diana.As used herein, "a capture reagent" refers to any agent that is capable of binding to an analyte (eg, a target). Preferably, "a capture reagent" refers to any agent that is capable of specifically binding an analyte, for example, that has a higher binding affinity and / or binding specificity for the analyte than for any other moiety. Any residue, such as a cell, a cellular organelle, an inorganic molecule, an organic molecule, and a mixture or complex thereof can be used as a capture reagent if it has the necessary binding affinity and / or binding specificity for the analyte. . Capture reagents can be peptides, proteins, eg, antibodies or receptors, oligonucleotides, nucleic acids, vitamins, oligosaccharides, carbohydrates, lipids, small molecules, or a complex thereof. Capture reagents comprising nucleic acids, eg, oligonucleotides, can capture a target nucleic acid by sequence-specific hybridization (eg, by forming standard Watson-Crick base pairs), or by other binding interactions. When a capture oligonucleotide hybridizes to a target nucleic acid, the hybridization can involve a portion of the oligonucleotide, or the entire sequence of the oligonucleotide, and the oligonucleotide can bind to a portion or all of the target nucleic acid sequence.

Tal como se usa en el presente documento, "PVP" se refiere a polivinilpirrolidona, que es un polímero soluble en agua fabricado a partir del monómero /V-vinilpirrolidona. El término PVP se usa en el presente documento para referirse a la PVP en diferentes estados de polimerización reticulada, incluidas las preparaciones de PVP que también se pueden conocer en la técnica como polivinilpolipirrolidona (PVPP).As used herein, "PVP" refers to polyvinylpyrrolidone, which is a water soluble polymer made from the monomer / V-vinylpyrrolidone. The term PVP is used herein to refer to PVP in different states of cross-linked polymerization, including PVP preparations which may also be known in the art as polyvinylpolypyrrolidone (PVPP).

Tal como se usa en el presente documento, un "imán" es un material u objeto que genera un campo magnético. Un imán puede ser un imán permanente o un electroimán.As used herein, a "magnet" is a material or object that generates a magnetic field. A magnet can be a permanent magnet or an electromagnet.

El término "amplificar' o "amplificación" en el contexto de ácidos nucleicos se refiere a la producción de múltiples copias de un polinucleótido, o de una parte de polinucleótido, de forma típica, partiendo de una pequeña cantidad del polinucleótido (por ejemplo, una única molécula de polinucleótido), donde los productos de la amplificación, o amplicones, se pueden detectar de forma general. La amplificación de los polinucleótidos abarca una variedad de procedimientos químicos y enzimáticos. La generación de múltiples copias de ADN a partir de una o unas pocas copias de una molécula de ADN diana o molde durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o una reacción en cadena de la ligasa (LCR; véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.494.810) son formas de amplificación. Los tipos adicionales de amplificación incluyen, aunque no de forma limitativa, PCR específica de alelo (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.639.611), la PCR con ensamblaje (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.965.408), amplificación dependiente de helicasa (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.662.594), PCR de inicio caliente (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos con números 5.773.258 y 5.338.671), PCR específica de intersecuencia, PCR inversa (véanse, por ejemplo, Triglia, y col. (1988) Nucleic Acids Res., 16:8186), PCR mediada por ligadura (véase, por ejemplo, Guilfoyle, R. y col., Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997); la patente de Estados Unidos n.° 5.508.169), PCR específica de metilación (véase, por ejemplo, Herman, y col., (1996) PNAS 93(13) 9821-9826), PCR con minicebador, amplificación de sonda multiplexada dependiente de la ligadura (véase, por ejemplo, Schouten, y col., (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57), PCR multiplexada (véanse, por ejemplo, Chamberlain, y col., (1988) Nucleic Acids Research 16(23) 11141­ 11156; Ballabio, y col., (1990) Human Genetics 84(6) 571-573; Hayden, y col., (2008) BMC Genetics 9:80), PCR anidada, PCR con extensión por solapamiento (véase, por ejemplo, Higuchi, y col., (1988) Nucleic Acids Research 16(15) 7351-7367), PCR en tiempo real (véanse, por ejemplo, Higuchi, y col., (1992) Biotechnology 10:413-417; Higuchi, y col., (1993) Biotechnology 11:1026-1030), PCR con transcripción inversa (véase, por ejemplo, Bustin, S.A. (2000) J. Molecular Endocrinology 25:169-193, PCR en fase sólida, Pc R entrelazada térmica asimétrica, y la PCR Touchdown (véase, por ejemplo, Don, y col., Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008; Roux, K. (1994) Biotechniques 16(5) 812-814; Hecker, y col., (1996) Biotechniques 20(3) 478-485). La amplificación de los polinucleótidos también se puede llevar a cabo usando PCR digital (véanse, por ejemplo, Kalinina, y col., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997); Vogelstein y Kinzler, Proc Natl Acad Sci EE.Uu . 96; 9236-41, (1999); publicación de patente internacional n.° WO05023091A2; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 20070202525). The term 'amplify' or 'amplification' in the context of nucleic acids refers to the production of multiple copies of a polynucleotide, or part of a polynucleotide, typically starting from a small amount of the polynucleotide (eg, a single polynucleotide molecule), where amplification products, or amplicons, can be generally detected. Amplification of polynucleotides encompasses a variety of chemical and enzymatic procedures. Generation of multiple copies of DNA from one or more Few copies of a target or template DNA molecule during a polymerase chain reaction (PCR) or ligase chain reaction (LCR; see, for example, U.S. Patent No. 5,494,810) are Forms of Amplification Additional types of amplification include, but are not limited to, allele-specific PCR (see, for example, US Patent No. 5,639,611), assembly PCR (see , for example, US Patent No. 5,965,408), helicase-dependent amplification (see, for example, US Patent No. 7,662,594), hot start PCR (see, for example, U.S. Patent Nos. 5,773,258 and 5,338,671), Intersection Specific PCR, Reverse PCR (see, eg, Triglia, et al. (1988) Nucleic Acids Res., 16: 8186), Ligation-mediated PCR (see, for example, Guilfoyle, R. et al., Nucleic Acids Research, 25: 1854-1858 (1997); US Patent No. 5,508,169), methylation-specific PCR (see, for example, Herman, et al., (1996) PNAS 93 (13) 9821-9826), mini-primer PCR, ligation-dependent multiplexed probe amplification (see , eg, Schouten, et al., (2002) Nucleic Acids Research 30 (12): e57), multiplexed PCR (see, eg, Chamberlain, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16 (23) 11141 11156 ; Ballabio, et al., (1990) Human Genetics 84 (6) 571-573; Hayden, et al., (2008) BMC Genetics 9:80), nested PCR, overlap extension PCR (see, for example, Higuchi, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16 (15) 7351-7367), real-time PCR (see, for example, Higuchi, et al., (1992) Biotechnology 10: 413-417; Higuchi, and col., (1993) Biotechnology 11: 1026-1030), reverse transcription PCR (see, for example, Bus tin, SA (2000) J. Molecular Endocrinology 25: 169-193, Solid phase PCR, Asymmetric thermal crosslinked Pc R, and Touchdown PCR (see, for example, Don, et al., Nucleic Acids Research (1991) 19 (14) 4008; Roux, K. (1994) Biotechniques 16 (5) 812-814; Hecker, et al., (1996) Biotechniques 20 (3) 478-485). Amplification of polynucleotides can also be carried out using digital PCR (see, for example, Kalinina, et al., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997); Vogelstein and Kinzler, Proc Natl Acad Sci EE. 96; 9236-41, (1999); International Patent Publication No. WO05023091A2; US Patent Application Publication No. 20070202525).

La expresión "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") se refiere al procedimiento de K.B. Mullis, patentes de Estados Unidos con números 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188, que describen un procedimiento para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico u otro ADN o ARN, sin clonación o purificación. Este procedimiento para amplificar la secuencia diana consiste en introducir un importante exceso de dos oligonucleótidos cebadores en la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido por una secuencia precisa de ciclación térmica en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios de sus respectivas hebras de la secuencia diana bicatenaria. Para realizar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza, y los cebadores se hibridan con sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana. Tras la hibridación, los cebadores se extienden con una polimerasa para formar un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación de cebadores, y extensión con polimerasa se pueden repetir varias veces (es decir, la desnaturalización, la hibridación y la extensión constituyen un "ciclo"; puede haber numerosos "ciclos") para obtener una elevada concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina mediante las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por tanto, su longitud es un parámetro controlable. En virtud de los aspectos repetitivos del procedimiento, el procedimiento se denomina como la "reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"). Puesto que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) de la mezcla, se dice que están "amplificadas mediante PCR" y son "productos de PCR" o "amplicones". Los expertos en la materia entenderán que el término "PCR" abarca muchas variantes del procedimiento originalmente descrito que utilizan, por ejemplo, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR con transcripción inversa (RT-PCR), PCR de un solo cebador y con cebador arbitrario, etc.The term "polymerase chain reaction"("PCR") refers to the method of KB Mullis, US Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,965,188, which describe a procedure for increasing the concentration of a segment of a target sequence in a mixture of genomic DNA or other DNA or RNA, without cloning or purification. This procedure to amplify the target sequence consists of introducing a significant excess of two primer oligonucleotides into the DNA mixture containing the desired target sequence, followed by a precise sequence of thermal cycling in the presence of a DNA polymerase. The two primers are complementary to their respective strands of the double-stranded target sequence. To perform amplification, the mixture is denatured, and the primers hybridize to their complementary sequences within the target molecule. After hybridization, the primers are extended with a polymerase to form a new pair of complementary strands. The steps of denaturation, primer hybridization, and polymerase extension can be repeated several times (ie, denaturation, hybridization, and extension constitute one "cycle"; there may be numerous "cycles") to obtain a high concentration of a amplified segment of the desired target sequence. The length of the amplified segment of the desired target sequence is determined by the relative positions of the primers to each other, and therefore its length is a controllable parameter. By virtue of the repetitive aspects of the procedure, the procedure is referred to as the "polymerase chain reaction (" PCR "). Since the desired amplified segments of the target sequence become the predominant sequences (in terms of concentration) of the mixture are said to be "PCR amplified" and are "PCR products" or "amplicons". Those skilled in the art will understand that the term "PCR" encompasses many variants of the originally described procedure utilizing, for example, real-time PCR, nested PCR, reverse transcription PCR (RT-PCR), single-primer PCR and with arbitrary primer, etc.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "ensayo de detección de ácidos nucleicos" se refiere a cualquier procedimiento para determinar la composición de nucleótidos de un ácido nucleico de interés. El ensayo de detección de ácidos nucleicos incluye, aunque no de forma limitativa, procedimientos de secuenciación de ADN, procedimientos de hibridación de sondas, ensayos de escisión específicos de la estructura (por ejemplo, el ensayo INVADER, (Hologic, Inc.) y se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos números 5.846.717, 5.985.557, 5.994.069, 6.001.567, 6.090.543 y 6.872.816; Lyamichev y col., Nat. Biotech., 17:292 (1999), Hall y col., PNAS, USA, 97:8272 (2000), y en el documento US 2009/0253142); procedimientos de escisión por emparejamiento enzimático incorrecto (por ejemplo, Variagenics, patentes de EE.UU. n.° 6.110.684, 5.958.692, 5.851.770); reacción en cadena de la polimerasa (PCR), anteriormente descrita; procedimientos de hibridación con ramificación (por ejemplo, Chiron, patentes de e E.UU. n.° 5.849.481, 5.710.264, 5.124.246 y 5.624.802 ); replicación con círculo rodante (por ejemplo, patentes de EE.UU. n.° 6.210.884, 6.183.960 y 6.235.502); NASBA (por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 5.409.818); tecnología de baliza molecular (por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 6.150.097); tecnología E-sensor (Motorola, patentes de Estados Unidos con números 6.248.229, 6.221.583, 6.013.170 y 6.063.573 ); tecnología de sonda ciclante (por ejemplo, patentes de EE.UU. n.° 5.403.711, 5.011.769 y 5.660.988 ); procedimientos de amplificación de la señal Dade Behring (por ejemplo, patentes de EE.UU. n.° 6.121.001,6.110.677, 5.914.230, 5.882.867 y 5.792.614 ); reacción en cadena de la ligasa (por ejemplo, Baranay Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 189-93 (1991)); y procedimientos de hibridación en sándwich (por ejemplo, patente de EE.UU. n.° 5.288.609). As used herein, the term "nucleic acid detection assay" refers to any method for determining the nucleotide composition of a nucleic acid of interest. The nucleic acid detection assay includes, but is not limited to, DNA sequencing procedures, probe hybridization procedures, structure-specific cleavage assays ( eg, the INVADER assay, (Hologic, Inc.), and describe, for example, in U.S. Patent Nos. 5,846,717, 5,985,557, 5,994,069, 6,001,567, 6,090,543, and 6,872,816; Lyamichev et al., Nat. Biotech., 17: 292 (1999), Hall et al., PNAS, USA, 97: 8272 (2000), and in US 2009/0253142); enzyme mismatch cleavage procedures (eg, Variagenics, US Patent Nos. 6,110,684, 5,958,692, 5,851,770); polymerase chain reaction (PCR), previously described; branch hybridization procedures (eg, Chiron, US Patent Nos. 5,849,481, 5,710,264, 5,124,246, and 5,624,802); rolling circle replication (eg, US Patent Nos. 6,210,884, 6,183,960, and 6,235,502); NASBA (eg, US Patent No. 5,409,818); molecular beacon technology (eg, US Patent No. 6,150,097); E-sensor technology (Motorola, US Patent Nos. 6,248,229, 6,221,583, 6,013,170, and 6,063,573); cycling probe technology (eg, US Patent Nos. 5,403,711, 5,011,769, and 5,660,988); Dade Behring signal amplification procedures (eg, US Patent Nos. 6,121,001,6,110,677, 5,914,230, 5,882,867, and 5,792,614); ligase chain reaction (eg, Baranay Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 189-93 (1991)); and sandwich hybridization procedures (eg, US Patent No. 5,288,609).

El ácido nucleico diana puede amplificarse (por ejemplo, mediante PCR) y el ácido nucleico amplificado se detecta simultáneamente usando un ensayo de escisión invasivo. Los ensayos configurado para llevar a cabo un ensayo de detección (por ejemplo, ensayo de escisión invasivo) junto con un ensayo de amplificación se describen en la publicación de patente de Estados Unidos US 20090253142 A1 (solicitud con n.° serie 12/404,240). Configuraciones adicionales de amplificación junto con detección invasiva mediante escisión, denominada procedimiento QuARTS, se describen en las solicitudes de patente de Estados Unidos con números de serie 12/946.737; 12/946.745; y 12/946.752.The target nucleic acid can be amplified (eg, by PCR) and the amplified nucleic acid is simultaneously detected using an invasive excision assay. Assays configured to perform a detection assay (eg, invasive cleavage assay) in conjunction with an amplification assay are described in US Patent Publication US 20090253142 A1 (Application Serial No. 12 / 404,240) . Additional configurations of amplification in conjunction with invasive detection by excision, referred to as the QuARTS method, are described in US Patent Application Serial Nos. 12 / 946,737; 12 / 946,745; and 12 / 946,752.

La expresión "estructura de escisión invasiva" como se usa en el presente documento se refiere a una estructura de escisión que comprende i) un ácido nucleico diana, ii) un ácido nucleico en dirección 5' (por ejemplo, un oligonucleótido INVADER), y iii) un ácido nucleico en dirección 3' (por ejemplo, una sonda), donde los ácidos nucleicos en las direcciones 5' y 3' se hibridan a regiones contiguas del ácido nucleico diana, y donde se forma un solapamiento entre la porción 3' del ácido nucleico en dirección 3' y se forma un duplete entre el ácido nucleico en dirección 5' y el ácido nucleico diana. Se produce solapamiento cuando una o más bases de los ácidos nucleicos en las direcciones 5' y 3' ocupan la misma posición con respecto a una base del ácido nucleico diana, tanto si la una o varias bases solapantes son complementarias, o no, del ácido nucleico en dirección 5', y tanto si dichas bases son, o no son, bases naturales o bases no naturales. En La porción en 3' del ácido nucleico en dirección 5' que solapa con el duplete en dirección 3' puede ser un resto químico no base, tal como una estructura de anillo aromático, por ejemplo, según se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 6.090.543. En algunos ejemplos, uno o más de los ácidos nucleicos diana pueden estar unidos entre sí, por ejemplo, mediante un enlace covalente tal como un tallo-bucle de ácido nucleico, o mediante un enlace químico de ácido no nucleico (por ejemplo, una cadena de varios átomos de carbono).The term "invasive cleavage structure" as used herein refers to a cleavage structure comprising i) a target nucleic acid, ii) a 5 'nucleic acid (eg, an INVADER oligonucleotide), and iii) a nucleic acid in the 3 'direction (e.g. a probe), where the nucleic acids in the 5' and 3 'directions hybridize to contiguous regions of the target nucleic acid, and where an overlap is formed between the 3' portion nucleic acid in the 3 'direction and a duplex is formed between the nucleic acid in the 5' direction and the target nucleic acid. Overlap occurs when one or more nucleic acid bases in the 5 'and 3' directions occupy the same position with respect to a target nucleic acid base, whether or not the one or more overlapping bases are complementary to the acid. nucleic in the 5 'direction, and whether these bases are, or are not, natural bases or non-natural bases. The 3 'portion of the nucleic acid in the 5' direction that overlaps the duplet in the 3 'direction may be a non-base chemical moiety, such as an aromatic ring structure, for example, as described, for example, in US Patent No. 6,090,543. In some examples, one or more of the target nucleic acids may be linked to each other, for example, by a covalent bond such as a nucleic acid stem-loop, or by a non-nucleic acid chemical bond (e.g., a chain of several carbon atoms).

Tal como se usa en el presente documento, los términos "complementario" o "complementariedad", usados en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) se refiere a polinucleótidos unidos por reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "5'-A-G-T-3'," es complementaria de la secuencia "3'-T-C-A-5'." La complementariedad puede ser "parcial", en la que solamente parte de las bases de los ácidos nucleicos están emparejadas según las reglas de emparejamiento de bases. O, puede existir una complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las hebras de ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficacia y la intensidad de la hibridación entre las hebras de ácido nucleico. Esto es de especial importancia en las reacciones de amplificación, así como en procedimientos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.As used herein, the terms "complementary" or "complementarity", used in reference to polynucleotides (ie, a sequence of nucleotides) refer to polynucleotides linked by base pairing rules. For example, the sequence "5'-A-G-T-3 '," is complementary to the sequence "3'-T-C-A-5'." Complementarity can be "partial", in which only part of the nucleic acid bases are paired according to base pairing rules. Or, there may be "complete" or "total" complementarity between nucleic acids. The degree of complementarity between nucleic acid strands has significant effects on the efficiency and intensity of hybridization between nucleic acid strands. This is of particular importance in amplification reactions, as well as in detection procedures that depend on the binding between nucleic acids.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cebador” se refiere a un oligonucleótido, tanto de origen natural, como purificado mediante una reacción de digestión, o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario de una hebra de ácido nucleico (por ejemplo, en presencia de nucleótidos y de un agente inductor tal como un biocatalizador (por ejemplo, una ADN polimerasa o similar). De forma típica, el cebador es monocatenario para obtener la mayor eficacia de amplificación, aunque de forma alternativa, puede ser parcial o completamente bicatenario. La porción del cebador que se hibrida con un ácido nucleico molde es lo suficientemente larga como para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerá de muchos factores, entre los que se incluyen la temperatura, origen del cebador y el uso del procedimiento. Los cebadores pueden comprender marcas, etiquetas, resto de captura, etc. As used herein, the term "primer" refers to an oligonucleotide, both naturally occurring, as well as purified by a digestion reaction, or produced synthetically, that is capable of acting as a starting point for synthesis. when placed under conditions that induce the synthesis of a primer extension product that is complementary to a nucleic acid strand (for example, in the presence of nucleotides and of an inducing agent such as a biocatalyst (for example, a DNA polymerase or similar). Typically, the primer is single-stranded for best amplification efficiency, although alternatively, it may be partially or fully double-stranded. The portion of the primer that hybridizes to a template nucleic acid is long enough as to prime the synthesis of the extension products in the presence of the inducing agent.The exact lengths of the primers will depend on many factors, among which s and include temperature, primer origin, and use of the procedure. The primers can comprise tags, labels, capture moiety, etc.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula que contenga ácido nucleico, incluyendo pero no limitado a, ADN o ARN. La expresión abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases de ADN y ARN conocidos, aunque no de forma limitativa, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinicitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N-isopenteniladenina, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metil éster del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y 2,6-diaminopurina.As used herein, the term "nucleic acid molecule" refers to any molecule that contains nucleic acid, including, but not limited to, DNA or RNA. The term encompasses sequences including, but not limited to, any of the known DNA and RNA base analogs, 4-acetylcytosine, 8-hydroxy-N6-methyladenosine, aziridinytosine, pseudoisocytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-fluorouracil , 5-bromouracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-carboxymethyl-aminomethyluracil, dihydrouracil, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methyladenine, 1-methylpseudouracil, 1-methylguanine, 1-methylguanine, 1-methylguanine, 1-methylinosine , 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methyl-cytosine, 5-methylcytosine, N6-methyladenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxy-amino-methyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylkeosine, 5 '-methoxycarbonylmethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid, oxybutoxosine, pseudouracil, cheosine, 2-thiocytosine, 5-thiouracyl-2, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, N-uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, Uracil-5-oxyacetic acid, pseudouracil, cheosin, 2-thiocytosine, and 2,6-diaminopurine.

Tal como se usa en el presente documento, el término "nucleobase" es sinónimo del resto de términos usados en la técnica que incluyen "nucleótido", "desoxinucleótido", "resto de nucleótido", "resto de desoxinucleótido", "trifosfato de nucleótido (NTP)", o trifosfato de desoxinucleótido (dNTP).As used herein, the term "nucleobase" is synonymous with all other terms used in the art including "nucleotide", "deoxynucleotide", "nucleotide residue", "deoxynucleotide residue", "nucleotide triphosphate (NTP) ", or deoxynucleotide triphosphate (dNTP).

Un "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que incluye al menos dos unidades monoméricas de ácido nucleico (por ejemplo, nucleótidos), de forma típica, más de tres unidades monoméricas, y de forma más típica, más de diez unidades monoméricas. El tamaño exacto de un oligonucleótido depende, por lo general, de varios factores, que incluyen la función o uso final del oligonucleótido. Como ilustración adicional, los oligonucleótidos suelen tener, de forma típica, menos de 200 restos de longitud (por ejemplo, entre 15 y 100), sin embargo, como se usa en el presente documento, también está previsto que el término abarque cadenas polinucleotídicas más largas. Los oligonucleótidos frecuentemente se denominar por su longitud. Por ejemplo, un oligonucleótido de 24 restos se denomina como un a "24-mero". Típicamente, los monómeros nucleosídicos están unidas por enlaces fosfodiésteres o análogos de los mismos, que incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, y similares, incluyendo los contraiones asociados, por ejemplo, H+, NH4+, Na+, y similares, si dichos contraiones están presentes. Además, los oligonucleótidos suelen ser monocatenarios. Los oligonucleótidos se preparan, de forma opcional, por cualquier procedimiento adecuado, incluyendo, aunque no de forma limitativa, el aislamiento de una secuencia existente o natural, replicación o amplificación del ADN, transcripción inversa, clonación digestión con restricción de las secuencias apropiadas, o síntesis química directa por un procedimiento tal como el procedimiento del fosfotriéster de Narang y col. (1979) Meth Enzymol. 68: 90-99; el procedimiento del fosfodiéster de Brown y col. (1979) Meth Enzymol. 68: 109-151; el procedimiento de la dietilfosforamidita de Beaucage y col. (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862; el procedimiento del triéster de Matteucci y col. (1981) J Am Chem Soc. 103:3185-3191; procedimientos de síntesis automatizados; o el procedimiento del soporte sólido de la patente de Estados Unidos n.° 4.458.066, titulada "PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES", concedida el 3 de julio de 1984 a Caruthers y col., u otros procedimientos conocidos por los expertos en la materia.An "oligonucleotide" refers to a nucleic acid that includes at least two monomeric nucleic acid units (eg, nucleotides), typically more than three monomer units, and more typically, more than ten monomer units. The exact size of an oligonucleotide generally depends on several factors, including the function or end use of the oligonucleotide. As a further illustration, oligonucleotides are typically less than 200 residues in length (eg, between 15 and 100), however, as used herein, the term is also intended to encompass longer polynucleotide chains. long. Oligonucleotides are often named by their length. For example, a 24 residue oligonucleotide is referred to as a "24-mer". Typically, nucleoside monomers are linked by phosphodiester linkages or analogs thereof, including phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoroselenoate, phosphorodiselenoate, phosphoroanilothioate, phosphoranilidate, phosphoramidate, and the like, including the associated counterions, eg, 4+ , H + , NH Na + , and the like, if said counterions are present. Furthermore, oligonucleotides are usually single stranded. The oligonucleotides are prepared, optionally, by any suitable method, including, but not limited to, isolation of an existing or natural sequence, DNA replication or amplification, reverse transcription, cloning, restriction digestion of the appropriate sequences, or direct chemical synthesis by a procedure such as the phosphotriester procedure of Narang et al. (1979) Meth Enzymol. 68: 90-99; the phosphodiester procedure of Brown et al. (1979) Meth Enzymol. 68: 109-151; the diethylphosphoramidite procedure of Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862; the triester procedure of Matteucci et al. (1981) J Am Chem Soc. 103: 3185-3191; automated synthesis procedures; or the solid support process of US Patent No. 4,458,066, entitled "PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES", issued July 3, 1984 to Caruthers et al., or other procedures known to those of skill in the art .

Una "secuencia" de un biopolímero se refiere al orden y la identidad de las unidades monoméricas (por ejemplo, nucleótidos, aminoácidos, etc.) en el biopolímero. La secuencia (por ejemplo, la secuencia de bases) de un ácido nucleico se lee de forma típica en la dirección 5' a 3'.A "sequence" of a biopolymer refers to the order and identity of the monomeric units (eg, nucleotides, amino acids, etc.) in the biopolymer. The sequence (eg, base sequence) of a nucleic acid is typically read in the 5 'to 3' direction.

La expresión "tipo silvestre" se refiere a un gen o producto génico que tiene las características de dicho gen o producto génico cuando se aísla a partir de una fuente de origen natural. Un gen silvestre es aquel observado con mayor frecuencia en una población y, por tanto, es el que recibe la designación arbitraria de forma "normal" o "silvestre" del gen. Por el contrario, los términos "modificado", "mutante", y "variante" se refieren a un gen o producto génico que presenta modificaciones en la secuencia y/o en las propiedades funcionales (es decir, características alteradas) cuando se compara con el gen o producto génico silvestre o natural. Se resalta que los mutantes de origen natural se pueden aislar; estos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas cuando se comparan con el gen o producto génico silvestre.The term "wild type" refers to a gene or gene product that has the characteristics of said gene or gene product when isolated from a naturally occurring source. A wild-type gene is the one most frequently observed in a population and, therefore, is the one that receives the arbitrary designation of the gene as "normal" or "wild". In contrast, the terms "modified", "mutant", and "variant" refer to a gene or gene product that exhibits modifications in sequence and / or functional properties (ie, altered characteristics) when compared to the wild-type or wild-type gene or gene product. It is emphasized that mutants of natural origin can be isolated; These are identified by the fact that they have altered characteristics when compared to the wild-type gene or gene product.

Tal como se usa en el presente documento, el término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que comprende las secuencias de codificación necesarias para la producción de un polipéptido, precursor, o ARN (por ejemplo, ARNr, ARNt). El polipéptido se puede codificar mediante una secuencia de codificación de longitud completa, o por cualquier porción de la secuencia de codificación siempre que se retenga la actividad deseada o las propiedades funcionales (por ejemplo, actividad enzimática, unión a ligandos, transducción de la señal, inmunogenicidad, etc.) del polipéptido de longitud completa o fragmento. El término también abarca la región de codificación de un gen estructural y las secuencias situado junto a la región de codificación en ambos extremos 5' y 3' para una distancia de aproximadamente 1 Kb o más en cualquiera de los extremos, ya que el gen corresponde a la longitud de la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias situadas en 5' de la región de codificación y presentes en el ARNm se denominan como secuencias 5' no traducidas. Las secuencias situadas en 3' o después de la región de codificación y presentes en el ARNm se denominan secuencias 3' no traducidas. El término "gen" abarca tanto ADNc como las formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región de codificación interrumpida por secuencias no codificantes denominadas "intrones" o "regiones intervinientes" o "secuencias intervinientes". Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en ARN nuclear (por ejemplo, hnARN); los intrones pueden contener elementos reguladores (por ejemplo, potenciadores). Los intrones se eliminan o "retiran por corte y empalme" del transcrito nuclear o primario; por tanto, los intrones están ausentes en el transcrito de ARN mensajero (ARNm). El ARNm actúa durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de los aminoácidos en el polipéptido nascente.As used herein, the term "gene" refers to a nucleic acid sequence (eg, DNA) that comprises the coding sequences necessary for the production of a polypeptide, precursor, or RNA (eg, RRNA, tRNA). The polypeptide can be encoded by a full-length coding sequence, or by any portion of the coding sequence as long as the desired activity or functional properties are retained (e.g., enzymatic activity, ligand binding, signal transduction, immunogenicity, etc.) of the full-length polypeptide or fragment. The term also encompasses the coding region of a structural gene and the sequences located next to the coding region at both the 5 'and 3' ends for a distance of approximately 1 Kb or more at either end, since the gene corresponds to the length of the length of the full-length mRNA. Sequences located 5 'to the coding region and present in the mRNA are referred to as 5' untranslated sequences. The sequences located 3 'or after the coding region and present in the mRNA are called 3' untranslated sequences. The term "gene" encompasses both cDNA and genomic forms of a gene. A genomic form or clone of a gene contains the coding region interrupted by non-coding sequences called "introns" or "intervening regions" or "intervening sequences". Introns are segments of a gene that are transcribed into nuclear RNA (eg, hnRNA); introns can contain regulatory elements (eg enhancers). Introns are removed or "spliced" the nuclear or primary transcript; therefore, introns are absent in the messenger RNA (mRNA) transcript. The mRNA acts during translation to specify the sequence or order of the amino acids in the nascent polypeptide.

Además de contener intrones, las formas genómicas de un gen también pueden incluir secuencias situadas en ambos extremos 5' y 3' de las secuencias que están presentes en el transcrito de ARN. Estas secuencias se denominan como secuencias o regiones "flanqueantes" (estas secuencias flanqueantes están situadas en 5' o 3' respecto a las secuencias no traducidas presentes en el transcrito de ARN). La región flanqueante en 5' puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y potenciadores que controlan o alteran la transcripción del gen. La región flanqueante 3' puede contener las secuencias que dirigir la terminación o la transcripción, la escisión posterior a la transcripción y la poliadenilación.In addition to containing introns, genomic forms of a gene can also include sequences located at both the 5 'and 3' ends of the sequences that are present in the RNA transcript. These sequences are referred to as "flanking" sequences or regions (these flanking sequences are located 5 'or 3' to the untranslated sequences present in the RNA transcript). The 5 'flanking region can contain regulatory sequences such as promoters and enhancers that control or alter the transcription of the gene. The 3 'flanking region can contain sequences that direct termination or transcription, post-transcriptional cleavage, and polyadenylation.

Tal como se usa en el presente documento, el término "kit" se refiere a cualquier sistema de administración para administrar materiales. En el contexto de los sistemas de purificación y ensayos de reacción de ácidos nucleicos, dichos sistemas de administración incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o administración de reactivos y dispositivos (por ejemplo, adsorbentes de inhibidores, partículas, desnaturalizantes, oligonucleótidos, filtros de centrifugación etc. en los recipientes adecuados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, tampones, instrucciones por escrito para llevar a cabo un procedimiento, etc.) de un sitio a otro. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recipientes (por ejemplo, cajas) que contienen los reactivos de reacción y/o materiales de soporte más importantes. Tal como se usa en el presente documento, el término "kit fragmentado" se refiere a un sistema de administración que comprende dos o más recipientes separados, donde cada uno contiene una subparte de la totalidad de los componentes del kit. Los recipientes se pueden suministrar al recipiente previsto juntos o por separado. Por ejemplo, un primer recipiente puede contener los materiales para la recogida de muestras y un tampón, mientras que un segundo recipiente contiene oligonucleótidos de captura y un desnaturalizante. La expresión "kit fragmentado" pretende abarcar kits que contienen reactivos específicos de analito (ASR, por sus siglas en inglés) regulados de conformidad al artículo 520(e) de la ley federal estadounidense de alimentos, fármacos y productos cosméticos [Federal Food, Drug, and Cosmetic Act], pero no está limitada a estos. De hecho, cualquier sistema de administración que comprenda dos o más recipientes separados, donde cada uno contiene una subparte de la totalidad de los componentes del kit, está incluida en la expresión "kit fragmentado". Por el contrario, un "kit combinado" se refiere a un sistema de administración que contiene todos los componentes de un ensayo de reacción en un solo recipiente (por ejemplo, en una sola caja que aloja cada uno de los componentes deseados). El término "kit" incluye tanto kits fragmentados como kits combinados.As used herein, the term "kit" refers to any delivery system for delivering materials. In the context of nucleic acid reaction assay and purification systems, such delivery systems include systems that allow storage, transport, or delivery of reagents and devices (e.g., inhibitor adsorbents, particles, denaturants, oligonucleotides, centrifugation etc. in appropriate containers) and / or support materials (eg buffers, written instructions to carry out a procedure, etc.) from one site to another. For example, kits include one or more containers (eg, boxes) containing the most important reaction reagents and / or support materials. As used herein, the term "fragmented kit" refers to a delivery system comprising two or more separate containers, each containing a subpart of all of the kit components. The containers can be supplied to the intended container together or separately. For example, a first container can contain the sample collection materials and a buffer, while a second container contains capture oligonucleotides and a denaturant. The term "fragmented kit" is intended to encompass kits that contain analyte-specific reagents (ASRs) regulated pursuant to section 520 (e) of the US Federal Food, Drug, and Cosmetic Act [Federal Food, Drug , and Cosmetic Act], but is not limited to these. In fact, any delivery system that comprises two or more separate containers, each containing a subpart of all the components of the kit, is included in the term "fragmented kit". In contrast, a "combination kit" refers to a delivery system that contains all the components of a reaction assay in a single container (eg, in a single box that houses each of the desired components). The term "kit" includes both fragmented kits and combined kits.

El término "sistema" como se usa en el presente documento se refiere a una colección de artículos para su uso con un fin específico. En algunos ejemplos, los artículos comprenden instrucciones de uso, como información facilitada, por ejemplo, sobre un artículo, en soporte papel, o en un medio grabable (por ejemplo, disquete, CD, unidad de memoria flash, etc.). En algunos ejemplos, las instrucciones dirigen a un usuario a una ubicación en línea, por ejemplo, un sitio web.The term "system" as used herein refers to a collection of items for use for a specific purpose. In some examples, the articles comprise instructions for use, such as information provided, for example, about an article, on paper, or on a recordable medium (eg, floppy disk, CD, flash drive, etc.). In some examples, the instructions direct a user to an online location , such as a website.

Tal como se usa en el presente documento, el término "información" se refiere a cualquier colección de hechos o datos. En referencia a la información almacenada o procesada usando uno o varios sistemas informáticos, que incluye pero que no se limeta a internets, el término se refiere a cualquier dato almacenado en cualquier formato (por ejemplo, analógico, digital, óptico, etc.). Tal como se usa en el presente documento, la expresión "información relacionada con un sujeto" se refiere a hechos o datos pertenecientes a un sujeto (por ejemplo, un ser humano, planta o animal). La expresión "información genómica" se refiere a información que pertenece a un genoma que incluye, aunque no de forma limitativa, secuencias de ácidos nucleicos, genes, porcentaje de metilación, frecuencias de alelos, niveles de expresión del ARN, expresión de proteínas, expresión de fenotipos correlacionados con genotipos, etc. "Información sobre frecuencias de alelos" se refiere a hechos o datos que pertenecen a frecuencias alélicas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, identidades de alelos, correlaciones estadísticas entre la presencia de un alelo y una característica de un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), la presencia o ausencia de un alelo en un individuo o población, la posibilidad porcentual de que un alelo esté presente en un individuo que tenga una o más características particulares, etc. As used herein, the term "information" refers to any collection of facts or data. In reference to information stored or processed using one or more computer systems, including but not limited to the Internet, the term refers to any data stored in any format (for example, analog, digital, optical, etc.). As used herein, the term "information related to a subject" refers to facts or data pertaining to a subject (eg, a human, plant, or animal). The term "genomic information" refers to information that pertains to a genome that includes, but is not limited to, nucleic acid sequences, genes, percent methylation, allele frequencies, RNA expression levels, protein expression, expression of phenotypes correlated with genotypes, etc. "Information on allele frequencies" refers to facts or data pertaining to allele frequencies, including, but not limited to, allele identities, statistical correlations between the presence of an allele and a characteristic of a subject (eg, a human subject), the presence or absence of an allele in an individual or population, the percentage chance that an allele is present in an individual having one or more particular characteristics, etc.

Ejemplos de la tecnologíaExamples of technology

Aunque la divulgación del presente documento se refiere a determinados ejemplos ilustrados, se debe entender que estos ejemplos se presentan a modo de ejemplo y no como limitación.Although the disclosure herein refers to certain illustrated examples, it should be understood that these examples are presented by way of example and not by way of limitation.

1. Procedimientos generales1. General procedures

En el presente documento se proporcionan procedimientos para aislar ADN, por ejemplo, a partir de una muestra de heces. Como se resume en la Figura 1, el procedimiento comprende homogeneizar una muestra (por ejemplo, una muestra de heces) en un tampón adecuado y preparar un sobrenadante a partir del homogenado. El sobrenadante se trata con una composición (por ejemplo, una polivinilpirrolidona (PVP) reticulada tal como polivinilpolipirrolidona (PVPP)) para eliminar los inhibidores y producir un sobrenadante clarificado. El ADN del sobrenadante clarificado se desnaturaliza, por ejemplo, añadiendo tiocianato de guanidina (GTC) y/o calentando la muestra. Después, un reactivo de captura de la diana, por ejemplo, una perla magnética a la que está unida un oligonucleótido complementario de la diana, se añade a lo anterior, y la solución se incuba en condiciones (por ejemplo, temperatura ambiente durante una hora) que favorecen la asociación (por ejemplo, mediante hibridación) de la diana con el reactivo de captura para producir un complejo diana:reactivo de captura. Tras aislar y eliminar el complejo diana:reactivo de captura (por ejemplo, mediante la aplicación de un campo magnético), la solución resultante se vuelve a calentar para desnaturalizar el ADN remanente de sobrenadante clarificado y se puede añadir otro reactivo de captura de la diana para aislar otra diana. El procedimiento se puede repetir, por ejemplo, al menos cuatro veces, para aislar tantas dianas como requiera el ensayo (por ejemplo, una extracción secuencial o en serie). Los complejos diana:reactivo de captura aislados en cada etapa de captura y aislamiento se lavan, y los ADN diana se eluyen usando un pequeño volumen de tampón adecuado para el análisis posterior.Provided herein are methods for isolating DNA, for example, from a stool sample. As summarized in Figure 1, the procedure comprises homogenizing a sample (eg, a stool sample) in a suitable buffer and preparing a supernatant from the homogenate. The supernatant is treated with a composition (eg, a cross-linked polyvinylpyrrolidone (PVP) such as polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)) to remove inhibitors and produce a clarified supernatant. The clarified supernatant DNA is denatured, for example, by adding guanidine thiocyanate (GTC) and / or heating the sample. Then, a target capture reagent, for example, a magnetic bead to which an oligonucleotide complementary to the target is attached. target, is added to the above, and the solution is incubated under conditions (eg, room temperature for one hour) that favor association (eg, by hybridization) of the target with the capture reagent to produce a target complex: capture reagent. After isolating and removing the target complex: capture reagent (for example, by applying a magnetic field), the resulting solution is reheated to denature the remaining DNA from clarified supernatant, and another target capture reagent can be added. to isolate another target. The procedure can be repeated, for example, at least four times, to isolate as many targets as the assay requires (eg, a sequential or serial extraction). The target: capture reagent complexes isolated at each capture and isolation step are washed, and the target DNAs are eluted using a small volume of adequate buffer for subsequent analysis.

2. Eliminación de inhibidores2. Elimination of inhibitors

La muestra puede ser una muestra de material que contiene impurezas que descomponen los ácidos nucleicos o inhiben las reacciones enzimáticas. En particular, dichas impurezas inhiben la actividad catalítica de las enzimas que interactúan con ácidos nucleicos, por ejemplo, nucleasas tales como endonucleasas de restricción, transcriptasas inversas, ácido nucleico polimerasas, ligasas, etc., especialmente las enzimas que se utilizan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), LCR (reacción en cadena de la ligasa), TMA (amplificación mediada por transcripción), NASBA (ampliación específica de bases del ácido nucleico), 3SR (replicación de secuencia automantenida), y similares. The sample can be a sample of material that contains impurities that break down nucleic acids or inhibit enzymatic reactions. In particular, said impurities inhibit the catalytic activity of enzymes that interact with nucleic acids, for example nucleases such as restriction endonucleases, reverse transcriptases, nucleic acid polymerases, ligases, etc., especially the enzymes that are used in the reaction in polymerase chain (PCR), LCR (ligase chain reaction), TMA (transcription-mediated amplification), NASBA (specific nucleic acid base amplification), 3SR (self-sustained sequence replication), and the like.

2.1 PVP2.1 PVP

En algunos ejemplos, los inhibidores de una muestra se eliminan por tratamiento con polivinilpirrolidona (véase además, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos N° de serie 61//485,338). La polivinilpirrolidona (PVP) es un polímero soluble en agua fabricado a partir del monómero W-vinilpirrolidona (véase la Figura 2). La polivinilpolipirrolidona (PVPP) es una modificación de la PVP fuertemente reticulada. La extensión de la reticulación varía y no existe umbral definido que establezca una división entre la PVP y la PVPP. Por consiguiente, el término PVP se usa en el presente documento para referirse a la PVP en diferentes estados de polimerización reticulada, incluidas las preparaciones de PVP que también se pueden conocer en la técnica como PVPP. Una propiedad importante, sin embargo, es que a medida que la extensión de la reticulación aumenta, el polímero se vuelve cada vez más insoluble en agua. Las formas reticuladas absorben agua, que da lugar a que el polímero se hinche. La síntesis y las propiedades físicas de la PVP y la PVPP son bien conocidas en la materia (por ejemplo, véase Haaf, Sanner, y Straub. Polymers of N-vinylpyrrolidone: synthesis, characterization, and uses. Polymer J. 17(1): 143(1985)).In some examples, inhibitors from a sample are removed by treatment with polyvinylpyrrolidone (see also, for example, US Patent Application Serial No. 61 // 485,338). Polyvinylpyrrolidone (PVP) is a water soluble polymer made from the monomer W-vinylpyrrolidone (see Figure 2). Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) is a highly cross-linked modification of PVP. The extent of crosslinking varies and there is no defined threshold that establishes a division between the PVP and the PVPP. Accordingly, the term PVP is used herein to refer to PVP in different states of cross-linked polymerization, including PVP preparations which may also be known in the art as PVPP. An important property, however, is that as the extent of crosslinking increases, the polymer becomes more and more insoluble in water. Crosslinked forms absorb water, which causes the polymer to swell. The synthesis and physical properties of PVP and PVPP are well known in the art (for example, see Haaf, Sanner, and Straub. Polymers of N-vinylpyrrolidone: synthesis, characterization, and uses. Polymer J. 17 (1) : 143 (1985)).

La PVP se ha usado en muchas aplicaciones técnicas que incluyen su uso como expansor del plasma; como aglutinante en muchos comprimidos farmacéuticos; como adhesivo en barras de pegamento y comidas calientes; como aditivo para baterías, cerámica, fibra de vidrio, tintas, papel para impresoras de chorro de tinta y en los procedimientos quimicomecánicos de alisamiento de superficies; como emulsionante y disgregante para la polimerización en solución; como fotorresistente; para la producción de membranas, tales como filtros de diálisis y para la purificación de aguas; como agente espesante en geles de blanqueamiento dental, etc.PVP has been used in many technical applications including its use as a plasma expander; as a binder in many pharmaceutical tablets; as an adhesive in glue sticks and hot foods; as an additive for batteries, ceramics, fiberglass, inks, paper for ink jet printers and in chemomechanical surface smoothing procedures; as an emulsifier and disintegrant for solution polymerization; as a photoresist; for the production of membranes, such as dialysis filters and for water purification; as a thickening agent in tooth whitening gels, etc.

La PVP también ha encontrado utilidad en la unión de impurezas y su eliminación de las soluciones, especialmente en la fabricación de vino y de cerveza para eliminar los polifenoles (véase, por ejemplo, Redmanji, Gopal, y Mola. A novel stabilization of beer with Polyclar Brewbrite. MBAA TQ 39(1): 24 (2002)). El uso de formas solubles e insolubles de la PVP se ha descrito con respecto al procesamiento de muestras biológicas, por ejemplo, como forma de neutralizar fenoles (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. N° 7.005.266; Shames, y col. Identification of widespread Helicobacter hepaticus infection in feces in commercial mouse colonies by culture and PCR assay. J. Clin. Microbiol.PVP has also found utility in binding impurities and removing them from solutions, especially in wine and beer making to remove polyphenols (see, for example, Redmanji, Gopal, and Mola. A novel stabilization of beer with Polyclar Brewbrite MBAA TQ 39 (1): 24 (2002)). The use of soluble and insoluble forms of PVP has been described with respect to the processing of biological samples, for example, as a way to neutralize phenols (see, for example, US Patent No. 7,005,266; Shames, and col. Identification of widespread Helicobacter hepaticus infection in feces in commercial mouse colonies by culture and PCR assay. J. Clin. Microbiol.

33(11): 2968 (1995); Morgan y col. Comparison of PCR and microscopy for detection of Cryptosporidium parvum in human fecal specimens: Clinical trial. J. Clin. Microbiol. 36(4): 995 (1998)).33 (11): 2968 (1995); Morgan et al. Comparison of PCR and microscopy for detection of Cryptosporidium parvum in human fecal specimens: Clinical trial. J. Clin. Microbiol. 36 (4): 995 (1998)).

La PVP se proporciona en formas que permitan su introducción en una muestra que se va a procesar, por ejemplo, en forma de polvo, suspensión acuosa, suspensión, en gránulos, y similares. En algunos ejemplos de la tecnología proporcionada en el presente documento, la PVP se proporciona premedida en una forma lista para el uso. Por ejemplo, en algunos ejemplos, la PVP se comprime en un comprimido que comprende la masa de PVP apropiada para tratar una muestra. Se proporcionan diferentes formas y tamaños de comprimidos para diferentes volúmenes y tipos de muestras. Se pueden a los comprimidos aglutinantes inertes, cargas, y otras composiciones, para proporcionar la estabilidad física, térmica, química y biológica, o para proporcionar otras características deseadas tales como la dispersión mejorada dentro de la muestra o la liberación controlada.PVP is provided in forms that allow it to be introduced into a sample to be processed, for example, as a powder, aqueous suspension, suspension, granules, and the like. In some examples of the technology provided herein, PVP is provided pre-measured in a ready-to-use form. For example, in some examples, the PVP is compressed into a tablet comprising the appropriate mass of PVP to treat a sample. Different shapes and sizes of tablets are provided for different volumes and types of samples. Inert binders, fillers, and other compositions can be added to tablets to provide physical, thermal, chemical, and biological stability, or to provide other desired characteristics such as improved dispersion within the sample or controlled release.

Tanto el grado de reticulación como el tamaño de las partículas de PVP son parámetros que afectan a los ensayos posteriores de las preparaciones de ácido nucleico resultantes. Por ejemplo, se ha descubierto que la PVP soluble inhibe algunos ensayos posteriores. Por consiguiente, el procedimiento se beneficie del uso de una PVP que sea suficientemente insoluble (por ejemplo, suficientemente reticulada) para permitir la adecuada eliminación de la PVP en las etapas de procesamiento posteriores (por ejemplo, centrifugación y/o filtración con centrifugación). Además, cuando las partículas de PVP reticulada son demasiado pequeñas, se empaquetan de forma demasiado compacta en la columna de centrifugación y restringen el flujo de efluente desde la muestra al espacio de recogida de la columna de centrifugación. Por ejemplo, los experimentos realizados durante el desarrollo de algunas realizaciones de la presente tecnología demostraron que una PVP que tiene un tamaño promedio de partícula de 100-130 micrómetros produjo resultados satisfactorios, mientras que una PVP que tiene un tamaño promedio de partícula de 30-50 micrómetros produjo restricciones en el flujo y en la filtración. Otra experimentación puede indicar que otros tamaños y solubilidades pueden ser apropiados.Both the degree of crosslinking and the size of the PVP particles are parameters that affect subsequent testing of the resulting nucleic acid preparations. For example, soluble PVP has been found to inhibit some subsequent assays. Accordingly, the process benefits from the use of a PVP that is sufficiently insoluble (eg, sufficiently cross-linked) to allow adequate removal of PVP in subsequent processing steps (eg, centrifugation and / or filtration with centrifugation). Furthermore, when the cross-linked PVP particles are too small, they pack too tightly in the spin column and restrict the flow of effluent from the sample to the collection space of the spin column. For example, experiments conducted during the development of some embodiments of the present technology demonstrated that a PVP having an average particle size of 100-130 microns produced satisfactory results, whereas a PVP having an average particle size of 30-50 microns produced restrictions on flow and filtration. Other experimentation may indicate that other sizes and solubilities may be appropriate.

2.2 Filtro de centrifugación2.2 Centrifugal filter

La tecnología proporcionada en el presente documento abarca el uso de un filtro de centrifugación, por ejemplos, como se proporciona en la solicitud de patente de Estados Unidos N° de serie 61/485,214 para filtrar las muestras tratadas con PVP para eliminar los inhibidores unidos a la PVP. Como se ha analizado anteriormente, durante el desarrollo del procedimiento de tratamiento con PVP, los experimentos demostraron que las columnas de centrifugación convencionales que tienen un filtro de frita en el extremo inferior quedan obturados en algunas condiciones. Por consiguiente, algunos ejemplos de la tecnología comprende el uso de un filtro de centrifugación resistente a obturación. Las Figuras 3-8 representan gráficamente varias configuraciones de un filtro de centrifugación resistente a obturación en vistas ensambladas y en despiece ordenado y asociado a un tubo de recogida. El filtro resistente a obturación está diseñado para que la muestra se filtre a través de las paredes del cuerpo si el extremo inferior queda obturado con residuos de la muestra.The technology provided herein encompasses the use of a centrifugal filter, for example, as provided in U.S. Patent Application Serial No. 61 / 485,214 to filter PVP-treated samples to remove inhibitors attached to the PVP. As discussed above, during the development of the PVP treatment procedure, experiments demonstrated that conventional spin columns having a frit filter at the bottom end become plugged under some conditions. Accordingly, some examples of the technology involve the use of a plug-resistant centrifugal filter. Figures 3-8 graphically depict various configurations of a plug-resistant centrifugal filter in assembled and exploded views and associated with a collection tube. The plug-resistant filter is designed to allow the sample to filter through the body walls if the lower end becomes plugged with sample debris.

Los filtros de centrifugación adecuados para su uso con la tecnología proporcionada en el presente documento están fabricados generalmente a partir de un material que es inerte con respecto a la muestra, -esto es, el material no reacciona ni contamina o modifica la muestra de otra forma, salvo filtrándola, de una forma que afecte a un posterior ensayo (por ejemplo, produzca la degradación de la muestra, cause su descomposición, o similares). Un ejemplo de este tipo de material es polietileno. Otros materiales adecuados son, por ejemplo, nailon, acetato de celulosa, politetrafluoroetileno (PTFE, también conocido como Teflon), poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF), poliéster, y poliétersulfona. La presión de operación, las características físicas y químicas de la composición a filtrar, el tamaño de la entidad a eliminar de la muestra, y las propiedades mecánicas del material (por ejemplo, capacidad para soportar la centrifugación a la velocidad necesaria para la aplicación de filtración) son factores que se consideran al seleccionar un filtro de centrifugación adecuado.Centrifugal filters suitable for use with the technology provided herein are generally manufactured from a material that is inert with respect to the sample, - that is, the material does not react or contaminate or otherwise modify the sample. , except by filtering it, in a way that affects a subsequent test (for example, causes degradation of the sample, causes its decomposition, or the like). An example of this type of material is polyethylene. Other suitable materials are, for example, nylon, cellulose acetate, polytetrafluoroethylene (PTFE, also known as Teflon), polyvinylidene fluoride (PVDF), polyester, and polyethersulfone. The operating pressure, the physical and chemical characteristics of the composition to be filtered, the size of the entity to be removed from the sample, and the mechanical properties of the material (for example, ability to withstand centrifugation at the speed necessary for the application of filtration) are factors that are considered when selecting a suitable centrifugal filter.

Los filtros se fabrican para que tengan diferentes tamaños de poro adecuados para diferentes aplicaciones de filtración. Por ejemplo, se reconoce de forma general que un filtro con un tamaño de poro de 0,2 micrómetros elimina la mayoría de las bacterias mientras que son necesarios tamaños de poro más pequeños para eliminar virus y esporas bacterianas. Para eliminar material en forma de partículas de mayor tamaño, un tamaño de poro más grande. Por ejemplo, aunque un aspecto de la tecnología proporcionada en el presente documento utiliza un filtro de centrifugación que tiene un tamaño de poro de 20 micrómetros, otros tamaños de poro que son de utilidad en las aplicaciones de filtración son 0,22, 0,45, 10, 20, 30, y 45 micrómetros. Por consiguiente, se consideran tamaños de poro mayores y menores, así como los tamaños de poro intermedio comprendidos en los intervalos delimitados por estos valores concretos. En algunas aplicaciones de filtración, el filtro se caracteriza por el peso molecular medio de las moléculas que quedan retenidas en el filtro. Por ejemplo, un filtro con un corte de peso molecular (MWCO) de 5.000 Da está diseñado para retener moléculas y complejos que tengan al menos un peso molecular de aproximadamente 5.000 Da. Los filtros pueden proporcionar MWCO de 10.000 Da; 30.000 Da; 50.000 Da; 100.000 Da, y otros límites necesarios para la tarea de filtración. La presión de funcionamiento y el tamaño de la entidad a eliminar de la muestra son factores a considerar cuando se selecciona un tamaño de poro o un valor de corte.Filters are manufactured to have different pore sizes suitable for different filtration applications. For example, it is generally recognized that a filter with a pore size of 0.2 micron removes most bacteria while smaller pore sizes are necessary to remove viruses and bacterial spores. To remove material in the form of larger particles, a larger pore size. For example, while one aspect of the technology provided herein utilizes a spin filter that has a pore size of 20 microns, other pore sizes that are useful in filtration applications are 0.22, 0.45 , 10, 20, 30, and 45 microns. Consequently, larger and smaller pore sizes are considered, as well as intermediate pore sizes within the ranges delimited by these specific values. In some filtration applications, the filter is characterized by the average molecular weight of the molecules that are retained on the filter. For example, a filter with a molecular weight cutoff (MWCO) of 5,000 Da is designed to retain molecules and complexes that have at least a molecular weight of about 5,000 Da. Filters can provide MWCO of 10,000 Da; 30,000 Da; 50,000 Da; 100,000 Da, and other limits necessary for the filtration task. The operating pressure and the size of the entity to be removed from the sample are factors to consider when selecting a pore size or cut-off value.

3. Captura de ácido nucleico3. Nucleic acid capture

Los ácidos nucleicos diana se capturan usando un reactivo de captura de la diana específico de secuencia, por ejemplo, una perla magnética a la que está unida un oligonucleótido complementario de la diana. Tras añadir el reactivo de captura, la solución se incuba en condiciones que favorecen la asociación (por ejemplo, mediante hibridación) de la diana con el reactivo de captura para producir un complejo diana:reactivo de captura. Tras aislar y eliminar el complejo diana:reactivo de captura (por ejemplo, mediante la aplicación de un campo magnético), la solución resultante se vuelve a calentar para desnaturalizar el ADN remanente de sobrenadante clarificado y se puede añadir otro reactivo de captura de la diana para aislar otra diana (por ejemplo, mediante hibridación y aplicación de un campo magnético). El procedimiento se puede repetir, por ejemplo, al menos cuatro veces, para aislar tantas dianas como requiera el ensayo. Asimismo, se puede aislar más de una diana en una etapa de captura usando un reactivo de captura que comprende múltiples secuencias de captura.Target nucleic acids are captured using a sequence-specific target capture reagent, eg, a magnetic bead to which an oligonucleotide complementary to the target is bound. After adding the capture reagent, the solution is incubated under conditions that favor association (eg, by hybridization) of the target with the capture reagent to produce a target: capture reagent complex. After isolating and removing the target complex: capture reagent (for example, by applying a magnetic field), the resulting solution is reheated to denature the remaining DNA from clarified supernatant, and another target capture reagent can be added. to isolate another target (eg, by hybridization and application of a magnetic field). The procedure can be repeated, for example, at least four times, to isolate as many targets as the assay requires. Likewise, more than one target can be isolated in a capture step using a capture reagent that comprises multiple capture sequences.

3.1 Reactivos de captura3.1 Capture reagents

En un aspecto, los procedimientos proporcionados en el presente documento se refieren al uso de reactivos de captura. Dichos reactivos son moléculas, restos, sustancias o composiciones que preferentemente (por ejemplo, de forma específica y selectiva) interactúan con una diana particular que se desea aislar y purificar. En la presente tecnología se utiliza cualquier reactivo de captura que tenga la afinidad y/o especificidad de unión deseada para el analito diana. Por ejemplo, en algunos ejemplos, el reactivo de captura puede ser una macromolécula tal como un péptido, una proteína (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor), un oligonucleótido, un ácido nucleico, (por ejemplo, ácidos nucleicos capaces de hibridarse con los ácidos nucleicos diana), una vitamina, un oligosacárido, un hidrato de carbono, un lípido, o una molécula pequeña, o un complejo de los mismos. Como ejemplos ilustrativos y no limitativos, se puede usar un reactivo de captura de la diana de avidina para aislar y purificar dianas que comprenden un resto biotina, se puede usar un anticuerpo para aislar y purificar dianas que comprenden el antígeno o epítopo adecuado, y se puede usar un oligonucleótido para aislar y purificar un oligonucleótido complementario (por ejemplo, se puede usar un poli-dT oligonucleótido para aislar y purificar dianas que comprenden una cola poli-A).In one aspect, the procedures provided herein relate to the use of capture reagents. Said reagents are molecules, moieties, substances or compositions that preferentially (for example, specifically and selectively) interact with a particular target that it is desired to isolate and purify. Any capture reagent having the desired binding affinity and / or specificity for the target analyte is used in the present technology. For example, in some examples, the capture reagent may be a macromolecule such as a peptide, a protein (for example, an antibody or a receptor), an oligonucleotide, a nucleic acid, (for example, nucleic acids capable of hybridizing to the target nucleic acids), a vitamin, an oligosaccharide, a carbohydrate, a lipid, or a small molecule, or a complex thereof. As illustrative and non-limiting examples, an avidin target capture reagent can be used to isolate and purify targets that comprise a moiety biotin, an antibody can be used to isolate and purify targets comprising the appropriate antigen or epitope, and an oligonucleotide can be used to isolate and purify a complementary oligonucleotide (for example, a poly-dT oligonucleotide can be used to isolate and purify targets comprising a poly-A tail).

Cualesquiera ácidos nucleicos, incluidos ácidos nucleicos monocatenarios, bicatenarios y de triple cadena, que se pueden unir, o unirse específicamente, a la diana, se usan como el reactivo de captura del presente dispositivo. Los ejemplos de dichos ácidos nucleicos incluyen ADN, tales como las formas de ADN A, B o Z, y ARN tales como ARNm, ARNt y ARNr, aptámeros, ácidos péptidonucleicos, y otras modificaciones en el azúcar, el fosfato o la base nucleosídica. Por lo tanto, existen muchas estrategias para capturar una diana y, por consiguiente, los expertos en la materia conocen muchos reactivos de captura. Aunque sin limitación en lo que respecta a los medios por los que se puede capturar un ácido nucleico diana, los ejemplos de la tecnología proporcionada en el presente documento comprenden el uso de un oligonucleótido que es complementario de la diana y que por tanto captura la diana mediante hibridación específica y selectiva con el ácido nucleico diana.Any nucleic acids, including single-stranded, double-stranded, and triple-stranded nucleic acids, that can bind, or specifically bind, to the target are used as the capture reagent of the present device. Examples of such nucleic acids include DNA, such as A, B, or Z forms of DNA, and RNA such as mRNA, tRNA, and rRNA, aptamers, peptide nucleic acids, and other modifications to the sugar, phosphate, or nucleoside base. Therefore, there are many strategies to capture a target, and therefore many capture reagents are known to those of skill in the art. Although without limitation as to the means by which a target nucleic acid can be captured, examples of the technology provided herein comprise the use of an oligonucleotide that is complementary to the target and therefore captures the target. by specific and selective hybridization with the target nucleic acid.

Además, los reactivos de captura de la diana comprenden una funcionalidad para localizar, concentrar, agregar, etc. el reactivo de captura y proporcionar, de esta forma, una manera de aislar y purificar la diana cuando se captura (por ejemplo, se une, se hibrida, etc.) con el reactivo de captura, por ejemplo, cuando se forma un complejo diana:reactivo de captura. Por ejemplo, en algunos ejemplos, la porción del reactivo de captura de la diana que interactúa con la diana (por ejemplo, el oligonucleótido) puede estar unido a un soporte sólido (por ejemplo, una perla, superficie, resina, columna) que permite la manipulación por el usuario en una escala macroscópica. A menudo, el soporte sólido permite el uso de un medio mecánico para aislar y purificar el complejo diana:reactivo de captura a partir de una solución heterogénea. Por ejemplo, cuando está unido a una perla, la separación se consigue retirando la perla de la solución heterogénea, por ejemplo, mediante el movimiento físico. En ejemplos en los que la perla es magnética o paramagnéticas o magnética, se utiliza un campo eléctrico para conseguir la separación física del reactivo de captura (y, por tanto, de la diana) de la solución heterogénea. Las perlas magnéticas usadas para aislar dianas se han descrito en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.648.124 y en la solicitud de patente europea n.° 87309308.Furthermore, the target capture reagents comprise functionality to locate, concentrate, aggregate, etc. the capture reagent and thus provide a way to isolate and purify the target when it is captured (eg, binds, hybridizes, etc.) with the capture reagent, eg, when a target complex is formed : capture reagent. For example, in some examples, the portion of the target capture reagent that interacts with the target (eg, the oligonucleotide) may be attached to a solid support (eg, a bead, surface, resin, column) that allows manipulation by the user on a macroscopic scale. Often times, the solid support allows the use of a mechanical means to isolate and purify the target complex: capture reagent from a heterogeneous solution. For example, when attached to a bead, separation is achieved by removing the bead from the heterogeneous solution, for example by physical movement. In examples where the bead is magnetic or paramagnetic or magnetic, an electric field is used to achieve physical separation of the capture reagent (and thus the target) from the heterogeneous solution. Magnetic beads used to isolate targets have been described in the art, for example, as described in US Patent No. 5,648,124 and European Patent Application No. 87309308.

En algunos ejemplos, el componente del reactivo de captura que interactúa con la diana (por ejemplo, un oligonucleótido) se une covalentemente al componente del reactivo de captura que proporciona la localización, concentración y/o agregación (por ejemplo, la perla magnética) del complejo diana:reactivo de captura. Los ejemplos de dichos reactivos de captura unirse covalentemente se proporcionan en Stone, y col. ("Detection of rRNA from four respiratory pathogens using an automated QI3 replicase assay", Molecular and Cellular Probes 10: 359-370 (1996)). Estos reactivos de captura unirse covalentemente son de utilidad en el aislamiento secuencial de múltiples dianas específicas a partir de la misma preparación de la muestra. Por otra parte, estos reactivos de captura proporcionan el aislamiento de las dianas de ADN sin muchos de los problemas que están asociados a otros procedimientos. Por ejemplo, el uso de una perla de estreptavidina convencional para capturar una diana biotinilada resulta ser un problema para procesar muestras que comprenden grandes cantidades de biotina libre (por ejemplo, una muestra de heces) porque la biotina libre interfiere con el aislamiento de la diana.In some examples, the component of the capture reagent that interacts with the target (eg, an oligonucleotide) is covalently linked to the component of the capture reagent that provides localization, concentration, and / or aggregation (eg, the magnetic bead) of the target complex: capture reagent. Examples of such covalently bound capture reagents are provided in Stone, et al. ("Detection of rRNA from four respiratory pathogens using an automated QI3 replicase assay", Molecular and Cellular Probes 10: 359-370 (1996)). These covalently bound capture reagents are useful in the sequential isolation of multiple specific targets from the same sample preparation. On the other hand, these capture reagents provide isolation of DNA targets without many of the problems associated with other procedures. For example, the use of a conventional streptavidin bead to capture a biotinylated target turns out to be a problem in processing samples comprising large amounts of free biotin (e.g. a stool sample) because free biotin interferes with the isolation of the target. .

3.2 Localizador de perlas magnéticas3.2 Magnetic bead locator

Los complejos de diana:reactivo de captura se capturan usando un localizador de perlas magnéticas. Sin embargo, la viscosidad de la muestra puede tener un efecto importante sobre la eficacia de localización debido al arrastre viscoso que afecta a las micropartículas magnéticas. Las muestras de heces tienen viscosidades comprendidas entre 20 centipoise y 40 centipoise, mientras que, como referencia, el agua a 20°C tiene una viscosidad de aproximadamente 1 centipoise y la miel a 20°C tiene una viscosidad de aproximadamente 3.000 centipoise. Por lo tanto, en algunas aplicaciones, se pueden preferir campos magnéticos intensos para proporcionar un aislamiento más eficaz.The target: capture reagent complexes are captured using a magnetic bead locator. However, the viscosity of the sample can have a significant effect on localization efficiency due to viscous carry-over that affects magnetic microparticles. Stool samples have viscosities between 20 centipoise and 40 centipoise, while, for reference, water at 20 ° C has a viscosity of approximately 1 centipoise and honey at 20 ° C has a viscosity of approximately 3,000 centipoise. Therefore, in some applications, strong magnetic fields may be preferred to provide more effective isolation.

Se ha descubierto que se obtienen aislamientos especialmente eficaces usando dispositivos magnéticos que tienen disposiciones especiales de los imanes. Por ejemplo, una disposición especialmente eficaz proporciona dos conjuntos de imanes dispuestos de forma circular en capas paralelas planas alrededor de la muestra, donde todos los imanes de una capa están orientados con sus polos norte hacia la muestra y todos los imanes de la otra capa están orientados con sus polos sur hacia la muestra (es decir, la configuración "N-S", en oposición a otras orientaciones tales como la orientación "N-N", en la que todos los polos norte o todos los polos sur de ambas capas están orientados hacia la muestra). Un ejemplo de dicho dispositivo se proporciona en Light y Miller, US 2012/0262260 A1 ("Magnetic Microparticle Localization Device"). En algunas configuraciones, los imanes del dispositivo están dispuestos alrededor de un orificio en el que se introduce un tubo de muestra (por ejemplo, un tubo cónico de 50 mililitros), de forma que producen un flujo magnético en la muestra. El flujo magnético consigue el movimiento de las partículas magnéticas de la solución de forma que se agregan, concentran y/o aíslan en una zona del tubo que facilita su retirada para recuperar el ADN diana (Light, supra). Especially effective isolations have been found to be obtained using magnetic devices having special arrangements of the magnets. For example, a particularly effective arrangement provides two sets of magnets arranged in a circular fashion in flat parallel layers around the sample, where all the magnets in one layer are oriented with their north poles toward the sample and all the magnets in the other layer are facing. oriented with their south poles towards the sample (that is, the "NS" configuration, as opposed to other orientations such as the "NN" orientation, in which all the north poles or all south poles of both layers are oriented toward the shows). An example of such a device is provided in Light and Miller, US 2012/0262260 A1 ("Magnetic Microparticle Localization Device"). In some configurations, the magnets of the device are arranged around a hole into which a sample tube (for example, a 50 milliliter conical tube) is inserted, so that they produce a magnetic flux in the sample. The magnetic flux achieves the movement of the magnetic particles in the solution so that they are added, concentrated and / or isolated in an area of the tube that facilitates their removal to recover the target DNA (Light, supra).

Se ha demostrado que dichos dispositivos son especialmente eficaces para la localización de partículas magnéticas en muestras grandes y viscosas (por ejemplo, muestras de heces) y por tanto son útiles para el aislamiento de ADN a partir de este tipo de muestras (Light, supra). Por ejemplo, las Figuras 11A y 11B muestran el efecto de la viscosidad de la muestra sobre el aclaramiento de las perlas magnéticas de soluciones de 1 o 25 centipoise de viscosidad usando tecnología magnética convencional (11A) o la tecnología de localización magnética de Light y Miller (11B) (Light, supra). En los gráficos mostrados, una disminución en la absorbancia indica una menor concentración de micropartículas suspendidas en una solución. Los datos recogidos de las soluciones de 25 centipoise se muestran con cuadrados (■) y los datos recogidos para la solución de 1 centipoise se muestran con rombos (♦). Estos gráficos muestran que el aumento de viscosidad ralentiza la separación de manera muy importante cuando se utiliza tecnología convencional, mientras que el dispositivo de localización de partículas magnéticas de Light y Miller aclara la solución más viscosa con solamente una pequeña reducción en la velocidad.Such devices have been shown to be especially effective in locating magnetic particles in large, viscous samples (eg stool samples) and are therefore useful for isolating DNA from these types of samples (Light, supra) . For example, Figures 11A and 11B show the effect of sample viscosity on clearance of magnetic beads from solutions of 1 or 25 centipoise viscosity using conventional magnetic technology (11A) or Light and Miller magnetic localization technology. (11B) (Light, supra). In the graphs shown, a decrease in absorbance indicates a lower concentration of microparticles suspended in a solution. Data collected for the 25 centipoise solutions are shown with squares (■) and data collected for the 1 centipoise solution are shown with diamonds (♦). These graphs show that the increase in viscosity slows the separation very significantly when using conventional technology, while the Light and Miller magnetic particle locator clears the more viscous solution with only a small reduction in speed.

Las químicas y procedimientos anteriormente descritos, cuando se usan en combinación, proporcionan un sistema para el aislamiento de ácidos nucleicos de muestras complejas e inhibidoras, tales como muestras de heces, que es significativamente más rápido que los procedimientos utilizados previamente. Por otra parte, el sistema produce preparaciones de ácido nucleico que están sustancialmente más exentas de sustancias inhibidoras y dan como resultado un mayor rendimiento del ácido nucleico diana para, por ejemplo, ensayo diagnóstico. Además, los ejemplos de este sistema se integran fácilmente en el flujo de trabajo del laboratorio para procesar eficazmente las muestras para su uso en cualquier análisis o tecnología de detección posterior. Una comparación del flujos de trabajo, línea de tiempo y rendimientos del procedimiento de un ejemplo del presente sistema y un sistema convencional ilustrativo se muestra en la Figura 14.The chemistries and procedures described above, when used in combination, provide a system for the isolation of nucleic acids from complex and inhibitory samples, such as stool samples, that is significantly faster than previously used procedures. Furthermore, the system produces nucleic acid preparations that are substantially more free of inhibitory substances and result in a higher yield of target nucleic acid for, eg, diagnostic testing. Additionally, examples from this system are easily integrated into the laboratory workflow to efficiently process samples for use in any downstream analysis or detection technology. A comparison of the workflows, timeline, and process performances of an example of the present system and an illustrative conventional system is shown in Figure 14.

4. Kits4. Kits

Los kits se contemplan en la tecnología proporcionada en el presente documento. Los kits comprenden composiciones, dispositivos, aparatos, etc. descritos en el presente documento, e instrucciones para el uso del kit. Dichas instrucciones describen procedimientos adecuados para preparar un analito a partir de una muestra, por ejemplo, para recoger una muestra y preparar un ácido nucleico a partir de la muestra. Los componentes individuales del kit se envasan en recipientes y envases adecuados (por ejemplo, viales, cajas, envases blíster, ampollas, botellas, frascos, tubos y similares) y los componentes se envasan juntos en un envase adecuado (por ejemplo, una caja o cajas) para almacenamiento cómodo, su envío, y/o su uso por el usuario del kit. Se entiende que los componentes líquidos (por ejemplo, un tampón) se pueden proporcionar en forma liofilizada a reconstituir por el usuario. Los kits pueden incluir un control o de referencia para su evaluación, validación y/o garantía del comportamiento del kit. Por ejemplo, un kit para analizar la cantidad de un ácido nucleico presente en una muestra puede incluir un control que comprende una concentración conocida de la misma o de otro ácido nucleico para comparación y, en algunos ejemplos, un agente de detección (por ejemplo, un cebador) específico del ácido nucleico del control. Los kits son adecuados para su uso en un escenario clínico y, en algunos ejemplos, para su uso en el domicilio del usuario. Los componentes de un kit, en algunos ejemplos, proporcionan las funcionalidades de un sistema para preparar una solución de ácido nucleico a partir de una muestra. En algunos ejemplos, el usuario proporciona determinados componentes del sistema.Kits are contemplated within the technology provided herein. The kits comprise compositions, devices, apparatus, etc. described in this document, and instructions for the use of the kit. Such instructions describe suitable procedures for preparing an analyte from a sample, for example, for collecting a sample and preparing a nucleic acid from the sample. The individual components of the kit are packaged in suitable containers and packages (for example, vials, boxes, blister packs, ampoules, bottles, vials, tubes and the like) and the components are packaged together in a suitable container (for example, a box or boxes) for convenient storage, shipping, and / or use by the user of the kit. It is understood that the liquid components (eg, a buffer) can be provided in lyophilized form to be reconstituted by the user. Kits can include a control or reference for evaluation, validation and / or assurance of kit performance. For example, a kit for analyzing the amount of a nucleic acid present in a sample may include a control comprising a known concentration of the same or another nucleic acid for comparison and, in some examples, a detection agent (for example, a primer) specific to the control nucleic acid. The kits are suitable for use in a clinical setting and, in some examples, for use in the user's home. The components of a kit, in some examples, provide the functionalities of a system for preparing a nucleic acid solution from a sample. In some examples, the user provides certain system components.

EjemplosExamples

Ejemplo 1Example 1

Durante el desarrollo de las realizaciones de la tecnología proporcionada en el presente documento, se demostró que la PVP (por ejemplo, PVPP) elimina los inhibidores de la PCR de una muestra de heces (véase la Figura 9). Se tomaron volúmenes de 20 mililitros de los sobrenadantes de dos muestras diferentes de sobrenadantes de heces. Para cada muestra de heces, una alícuota se trató con PVP y la otra se dejó sin tratar. Por otra parte, las muestras se procesaron de forma idéntica para capturar dos ácidos nucleicos diana diferentes (Figura 9, Gen A y Gen V). Tras la captura y elución final, se controlaron las recuperaciones de las dos dianas mediante un ensayo de PCR cuantitativa (qPCR) SYBR Green usando 1 microlitro de eluato en un volumen de reacción de 25 microlitros. Para ambas dianas procedentes de ambos sobrenadantes de heces, las alícuotas tratadas con PVP se amplificaron mientras que las alícuotas no tratadas no produjeron ninguna señal qPCR. Estos resultados demuestran la necesidad y la eficacia de la PVP como tratamiento de eliminación de inhibidores cuando se extrae ADN de muestras de heces para su análisis de un ensayo de PCR cuantitativa.During the development of embodiments of the technology provided herein, it was demonstrated that PVP (eg, PVPP) removes PCR inhibitors from a stool sample (see Figure 9). 20 milliliter volumes of the supernatants were taken from two different stool supernatant samples. For each stool sample, one aliquot was treated with PVP and the other was left untreated. Furthermore, the samples were processed identically to capture two different target nucleic acids (Figure 9, Gen A and Gen V). After capture and final elution, the recoveries of the two targets were monitored by a SYBR Green quantitative PCR (qPCR) assay using 1 microliter of eluate in a reaction volume of 25 microliters. For both targets from both stool supernatants, the PVP-treated aliquots were amplified while the untreated aliquots produced no qPCR signal. These results demonstrate the necessity and efficacy of PVP as an inhibitor clearance treatment when DNA is extracted from stool samples for analysis in a quantitative PCR assay.

Ejemplo 2Example 2

Durante el desarrollo de las realizaciones de la tecnología proporcionada en el presente documento, se recopilaron datos que demuestran que la filtración con centrifugación mejora la eliminación de inhibidores de la p Cr . El experimento comparó PVP (por ejemplo, PVPP) de diferentes tamaños con respecto a su capacidad para eliminar inhibidores de la PCR de muestras de sobrenadantes de heces. Se compararon dos composiciones de PVP comercialmente disponibles: Polyclar® 10 y Polyplasdone® XL, que están compuestas por partículas de PVP que tienen un diámetro medio de 30-50 micrómetros y 100-130 micrómetros, respectivamente. La eliminación de inhibidores mediante las dos composiciones de PVP se evaluó mediante qPCR, en la que 1 microlitro o 5 microlitros de los eluatos de ADN aislado se usaron en un volumen de reacción de 25 microlitros. Primero, ambos tipos de PVP se separaron del sobrenadante de heces por aglomeración (centrifugación). Para ambos tipos de PVP, las muestras mostraron una curva de recuperación y amplificación de igual forma cuando 1 microlitro del ADN eluido se añadió a la qPCR. Sin embargo, el uso de 5 microlitros de eluato no consiguió producir ninguna señal en la qPCR, lo que indica que los inhibidores de la PCR permanecían en la muestra (véanse las Figuras 10A y 10B).During the development of embodiments of the technology provided herein, data was collected demonstrating that centrifugal filtration improves removal of p Cr inhibitors. The experiment compared PVPs (eg, PVPP) of different sizes with respect to their ability to remove PCR inhibitors from stool supernatant samples. Two commercially available PVP compositions were compared: Polyclar® 10 and Polyplasdone® XL, which are composed of PVP particles having a mean diameter of 30-50 microns and 100-130 microns, respectively. The removal of inhibitors by the two PVP compositions was assessed by qPCR, in which 1 microliter or 5 microliters of the isolated DNA eluates were used in a reaction volume of 25 microliters. First, both types of PVP were separated from the stool supernatant by agglomeration (centrifugation). For both types of PVP, the samples showed an equal recovery and amplification curve when 1 microliter of the eluted DNA was added to the qPCR. However, the use of 5 microliters of eluate failed to produce any signal on the qPCR, indicating that the PCR inhibitors remained in the sample (see Figures 10A and 10B).

A continuación, se ensayó la filtración en columna de centrifugación como procedimiento alternativo para separar la PVP del sobrenadante de heces. La PVP de menor tamaño no se pudo procesar de esta manera, porque la PVP aparentemente se empaquetó tan estrechamente en la columna de centrifugación que el líquido sobrenadante de heces no pudo pasar a su través. Sin embargo, la PVP con el tamaño de partículas más grandes no experimentó este mismo problema, y la preparación se pudo filtrar por centrifugación fácilmente. La columna de centrifugación contenía una frita de polietileno (tamaño de poro nominal de 20 micrómetros) para recoger la PVP. Cuando se separó la PVP con el tamaño de partículas más grandes del sobrenadante de heces mediante una columna de filtración con centrifugación provista de una frita de polietileno, el volumen de eluato en la qPCR se puedo incrementar a 5 microlitros o 6 microlitros sin inhibición evidente (véanse las Figuras 10C y 10D). Como se muestra en la Tabla 1, cuando se utilizan 5 o 6 microlitros de eluato, el número de hebras calculado fue aproximadamente cinco o seis veces el número de hebras calculado cuando se utilizó 1 microlitro de eluato. Estos resultados demuestran las ventajas del tratamiento con PVP junto con la filtración en columna con centrifugación para eliminar los inhibidores de la PCR de muestras de heces.Next, spin column filtration was tested as an alternative procedure to separate the PVP of the stool supernatant. The smaller PVP could not be processed in this way, because the PVP apparently packed so tightly in the spin column that the faecal supernatant could not pass through. However, the PVP with the largest particle size did not experience this same problem, and the preparation could be easily centrifugally filtered. The spin column contained a polyethylene frit (20 micron nominal pore size) to collect the PVP. When the PVP with the larger particle size was separated from the stool supernatant by means of a centrifugal filtration column fitted with a polyethylene frit, the volume of eluate in the qPCR can be increased to 5 microliters or 6 microliters with no obvious inhibition ( see Figures 10C and 10D). As shown in Table 1, when using 5 or 6 microliter of eluate, the number of strands calculated was approximately five or six times the number of strands calculated when using 1 microliter of eluate. These results demonstrate the advantages of PVP treatment in conjunction with centrifugal column filtration to remove PCR inhibitors from stool samples.

TABLA 1TABLE 1

Tratamiento Volumen Hebras % Esperado PVPP 30-50 Sin filtro de 1 Ml 950Treatment Volume Strands% Expected PVPP 30-50 Without 1 Ml filter 950

centrifugación 5 Ml Sin señal (inhibición completa) 0 PVPP 100-130 Sin filtro de 1 Ml 907centrifugation 5 ml No signal (complete inhibition) 0 PVPP 100-130 No 1 ml filter 907

centrifugación 5 Ml Sin señal (inhibición completa) 0 PVPP 100-130 Con filtro de 1 Ml 1136centrifugation 5 ml No signal (complete inhibition) 0 PVPP 100-130 With 1 ml filter 1136

centrifugación 5 Ml 6751 119centrifugation 5 ml 6751 119

PVPP 100-130 Con filtro de 1 Ml

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3110PVPP 100-130 With 1 Ml filter
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3110

centrifugación 6 Ml 18600 99,68 centrifugation 6 ml 18 600 99.68

Ejemplo 3Example 3

Durante el desarrollo de las realizaciones de la tecnología proporcionada en el presente documento, se realizaron experimentos para comparar las eficacias de localización de la tecnología convencional (por ejemplo, un Promega PolyA Tract respaldado por un imán de neodimio N52 con 1 pulgada (2,54 cm) de diámetro exterior x 1 pulgada (2,54 cm) de espesor) y el dispositivo localizador de micropartículas magnéticas de Light y Miller (imanes de neodimio calidad N52 en la configuración S-N) para muestras de viscosidad baja (es decir, 1 centipoise) y alta (es decir, 25 centipoise).During the development of embodiments of the technology provided herein, experiments were performed to compare the localization efficiencies of conventional technology (for example, a Promega PolyA Tract backed by a 1-inch (2.54) N52 neodymium magnet cm) OD x 1 inch (2.54 cm) thick) and Light and Miller's Magnetic Microparticle Locator Device (N52 grade neodymium magnets in SN configuration) for low viscosity samples (i.e. 1 centipoise ) and high (i.e. 25 centipoise).

Soluciones de ensayo de viscosidad adecuada (por ejemplo, 1 o 25 centipoise) se introdujeron en un dispositivo convencional o un dispositivo de la tecnología proporcionada en el presente documento para su análisis. Las muestras se expusieron al campo magnético, el líquido se aspiró en los intervalos de tiempo indicados para cada muestra, y las partículas remanentes en suspensión se cuantificaron por espectrometría. Una disminución en la absorbancia indica una menor concentración de micropartículas suspendidas en una solución (es decir, más partículas localizadas y eliminadas de la suspensión mediante separación magnética). Los resultados de la tecnología convencional se proporcionan a continuación en la Figura 11A. Los resultados del dispositivo de localización de micropartículas magnéticas se proporcionan en la Figura 11B. En las Figuras 11A y B, los datos recogidos de la solución de 25 centipoise se muestran con cuadrados (■) y los datos recogidos para la solución de 1 centipoise se muestran con rombos (♦).Test solutions of suitable viscosity (eg, 1 or 25 centipoise) were introduced into a conventional device or a device of the technology provided herein for analysis. The samples were exposed to the magnetic field, the liquid was aspirated at the time intervals indicated for each sample, and the remaining particles in suspension were quantified by spectrometry. A decrease in absorbance indicates a lower concentration of microparticles suspended in a solution (ie, more particles localized and removed from suspension by magnetic separation). Results from conventional technology are provided below in Figure 11A. The results of the magnetic microparticle locator are provided in Figure 11B. In Figures 11A and B, data collected for the 25 centipoise solution is shown with squares (■) and data collected for the 1 centipoise solution is shown with diamonds (♦).

Ejemplo 4Example 4

Durante el desarrollo de las realizaciones de la tecnología proporcionada en el presente documento, se demostró que la mayor parte del ADN de una diana determinada se agota de un sobrenadante de heces en una única extracción. La extracción se llevó a cabo según el diagrama de flujo mostrado en la Figura 1. Tras la elución final, las recuperaciones de las dos dianas (Gen A y Gen V) de las extracciones 1 y 2 se controlaron mediante ensayos de qPCR SYBR Green usando 1 microlitro de eluato en un volumen de reacción de 25 microlitros. Para ambas dianas, la extracción 1 produjo una buena recuperación de la diana, mientras que el eluato de la extracción 2 no consiguió producir ninguna señal en la qPCR procedente de ninguna de las dianas (Figura 12). During the development of embodiments of the technology provided herein, it was demonstrated that most of the DNA for a given target is depleted from a stool supernatant in a single extraction. The extraction was carried out according to the flow chart shown in Figure 1. After the final elution, the recoveries of the two targets (Gen A and Gen V) from extractions 1 and 2 were monitored by SYBR Green qPCR assays using 1 microliter of eluate in a reaction volume of 25 microliters. For both targets, extraction 1 produced a good recovery of the target, while eluate from extraction 2 failed to produce any signal in the qPCR from either target (Figure 12).

Ejemplo 5Example 5

Durante el desarrollo de las realizaciones de la tecnología proporcionada en el presente documento, se demostró que la extracción del ADN se puede llevar a cabo varias veces en una sola muestra mediante un mínimo de cuatro ciclos de desnaturalización/hibridación sin alterar negativamente la integridad del ADN humano contenido en el sobrenadante de las heces. En este ejemplo, cuatro dianas (Genes A, F, V, y W) se capturaron de la muestra, y se varió el orden de su captura. Tras la elución, la recuperación de cada diana se controló mediante qPCR SYBR Green. En la Figura 13, las representaciones gráficas muestran las curvas de amplificación de cada gen cuando se capturó en primer, segundo, tercer y cuarto lugar en la secuencia de extracción. La superposición de las curvas de amplificación demuestra que las recuperaciones fueron aproximadamente iguales independientemente del orden de extracción. La Tabla 3 cuantifica los resultados de la Figura 13.During the development of embodiments of the technology provided herein, it was demonstrated that DNA extraction can be performed multiple times on a single sample by a minimum of four cycles of denaturation / hybridization without adversely altering the integrity of the DNA. contained in the stool supernatant. In this example, four targets (Genes A, F, V, and W) were captured from the sample, and the order of their capture was varied. After elution, the recovery of each target was monitored by SYBR Green qPCR. In Figure 13, the graphs show the amplification curves of each gene when it was captured first, second, third and fourth in the extraction sequence. The overlap of the amplification curves shows that the recoveries were approximately the same regardless of the extraction order. Table 3 quantifies the results of Figure 13.

Tabla 3Table 3

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Figure imgf000017_0001

Para los cuatro genes, el Cp (Punto de cruce - el número de ciclo en el cual la curva de amplificación cruza un umbral fijo) promedio eran prácticamente iguales independientemente del orden de extracción.For the four genes, the average Cp (Crossover point - the cycle number in which the amplification curve crosses a fixed threshold) were practically the same regardless of the extraction order.

Ejemplo 6Example 6

Procedimiento ilustrativo para el aislamiento en serie de una pluralidad de ácidos nucleicos diana:Illustrative procedure for serial isolation of a plurality of target nucleic acids:

Según se representa en la Figura 1:As represented in Figure 1:

1. Una muestra de heces se homogeneiza, por ejemplo, con un tampón, para formar un homogenado de heces. El homogenado se trata para separar los sólidos residuales del fluido, por ejemplo, mediante centrifugación o filtración, para producir un "sobrenadante de heces".1. A stool sample is homogenized, eg with a buffer, to form a stool homogenate. The homogenate is treated to separate residual solids from the fluid, eg, by centrifugation or filtration, to produce a "stool supernatant."

2. El sobrenadante de heces se trata para eliminar los inhibidores del ensayo (por ejemplos, con polivinilpirrolidona, como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos N.° de serie 61/485,338), produciendo un "sobrenadante clarificado".2. The stool supernatant is treated to remove assay inhibitors (eg, with polyvinylpyrrolidone, as described in US Patent Application Serial No. 61 / 485,338), producing a "clarified supernatant".

3. Diez mililitros de sobrenadante clarificado (que representa un equivalente de aproximadamente 4 gramos de heces) se mezcló con tiocianato de guanidina (GTC) hasta una concentración final de 2,4 M;3. Ten milliliters of clarified supernatant (representing an equivalent of approximately 4 grams of feces) was mixed with guanidine thiocyanate (GTC) to a final concentration of 2.4 M;

4. La mezcla se trata a continuación en un baño de agua a 90°C durante 10 minutos para desnaturalizar el ADN (y las proteínas) presentes en las heces.4. The mixture is then treated in a 90 ° C water bath for 10 minutes to denature the DNA (and proteins) present in the faeces.

5. Se añaden a la muestra partículas paramagnéticas que contienen oligonucleótidos unidos covalentemente (acoplados) complementarios de la(s) secuencia(s) diana de interés ("sondas de captura específicas de la diana"). La muestra se incuba a continuación (por ejemplo, a temperatura ambiente, aproximadamente 22 - 25°C) durante una hora para permitir la hibridación del ADN diana para capturar las sondas sobre las partículas magnéticas. 6. La mezcla de sobrenadante clarificado, GTC, y partículas se expone a un campo magnético para separar las partículas (que ahora contienen el ADN hibridado a las sondas de captura) de la mezcla de sobrenadante de heces/GTC, que se transfiere a un tubo nuevo. Véase, por ejemplo, el documento US 2012/0262260 A1.5. Paramagnetic particles containing covalently linked (coupled) oligonucleotides complementary to the target sequence (s) of interest ("target-specific capture probes") are added to the sample. The sample is then incubated (eg, at room temperature, approximately 22-25 ° C) for one hour to allow hybridization of the target DNA to capture the probes on the magnetic particles. 6. The clarified supernatant, GTC, and particle mixture is exposed to a magnetic field to separate the particles (which now contain the DNA hybridized to the capture probes) from the stool / GTC supernatant mixture, which is transferred to a new tube. See, for example, US 2012/0262260 A1.

7. A continuación, las partículas paramagnéticas se lavan y el ADN diana se eluye, listo para su uso en ensayos de detección.7. The paramagnetic particles are then washed and the target DNA is eluted, ready for use in detection assays.

8. La mezcla de sobrenadante/GTC retenida en la etapa 6 se devuelve al baño de agua a 90°C durante 10 minutos para repetir la desnaturalización (etapa 4). A continuación, la Etapa 5 se repite añadiendo partículas magnéticas que contienen sondas de captura complementarias de otros ADN diana diferentes, y las etapas de hibridación, separación de partículas y elución se repiten para producir una muestra purificada de una segunda diana de ADN. 8. The supernatant / GTC mixture retained in step 6 is returned to the 90 ° C water bath for 10 minutes to repeat denaturation (step 4). Step 5 is then repeated by adding magnetic particles containing complementary capture probes from different other target DNAs , and the hybridization, particle separation and elution steps are repeated to produce a purified sample of a second DNA target.

El ciclo de desnaturalización/hibridación/separación (etapas 4 - 6 ) se pueden repetir al menos cuatro o más veces para extraer en serie diferentes ADN diana de la misma muestra de sobrenadante de heces.The denaturation / hybridization / separation cycle (steps 4-6) can be repeated at least four or more times to serially extract different target DNA from the same stool supernatant sample.

Ejemplo 7Example 7

Durante el desarrollo de las realizaciones de la tecnología proporcionada en el presente documento, los procedimientos se sometieron a ensayo en una aplicación clínica. Lo siguiente proporciona un ejemplo de flujo de trabajo que utiliza los sistemas y procedimientos de la presente divulgación.During the development of embodiments of the technology provided herein, the procedures were tested in a clinical application. The following provides an example workflow that uses the systems and procedures of this disclosure.

Diseño del estudioStudy design

Este estudio se basó en heces de archivo bien caracterizadas procedentes de múltiples centros médicos, incluidos centros de referencia y centros médicos públicos de Estados Unidos y Dinamarca. Se obtuvo la aprobación de los comités de revisión de cada centro. Se proporcionaron heces de casos de pacientes con cáncer colorrectal demostrado (CRC), casos con al menos un adenoma colorrectal >1, y pacientes de control de edad y sexo equivalentes sin neoplasia y evaluados mediante colonoscopia. Se reclutaron pacientes en escenarios tanto clínicos como de cribado, y algunos eran sintomáticos. Los que tenían síndromes cancerosos conocidos o enfermedad inflamatoria del intestino se excluyeron. Se analizaron casi 700 muestras, de las que 133 eran adenomas > 1 centímetro y 252 eran pacientes de cáncer.This study was based on well-characterized archival feces from multiple medical centers, including referral centers and public medical centers in the United States and Denmark. The approval of the review committees of each center was obtained. Faeces were provided from cases of patients with proven colorectal cancer (CRC), cases with at least one colorectal adenoma> 1, and age and sex equivalent control patients without neoplasia and evaluated by colonoscopy. Patients were recruited in both clinical and screening settings, and some were symptomatic. Those with known cancerous syndromes or inflammatory bowel disease were excluded. Almost 700 samples were analyzed, of which 133 were adenomas> 1 centimeter and 252 were cancer patients.

Se llevó a cabo un ensayo multimarcador en las heces que incluyó cuatro genes metilados (vimentina, NDRG4, BMP3, y TFPI2), KRAS mutante, un gen de referencia beta-actina (ACTB), y hemoglobina. Para evaluar el comportamiento del ensayo, las heces de caso y de control se distribuyeron de forma equilibrada entre dos sitios de ensayo diferentes; todos los ensayos estaban a cargo de técnicos enmascarados.A stool multimarker assay was conducted that included four methylated genes ( vimentin, NDRG4, BMP3, and TFPI2), mutant KRAS , a beta-actin reference gene ( ACTB), and hemoglobin. To evaluate the performance of the test, the case and control stools were distributed evenly between two different test sites; all rehearsals were conducted by masked technicians.

Recogida y almacenamiento de heces.Collection and storage of feces.

Antes de la colonoscopia, que sirvió como patrón de oro, las heces completas se recogieron en cubetas de plástico. Se añadió un tampón de conservación a las heces, y las heces tamponadas se archivaron a -80°C. Sin embargo, el tiempo de adición de tampón, la duración entre la defecación y la congelación, y si las muestras se homogeneizaban o no antes de la congelación no se normalizaron y variaron entre los centros participantes.Before the colonoscopy, which served as the gold standard, the entire stool was collected in plastic trays. A preservation buffer was added to the stool, and the buffered stool was archived at -80 ° C. However, buffer addition time, duration between defecation and freezing, and whether or not samples were homogenized prior to freezing were not normalized and varied between participating centers.

Selección de marcadores.Selection of markers.

Se identificaron genes candidatos que, de forma individual o combinada (por ejemplo, KRAS + BMP3 + NDRG4 + TFPI2 + vimentina + referencia y/o ACTB hemoglobina) produjeron una separación casi completa de la neoplasia colorrectal de la mucosa normal. Surgieron cuatro marcadores génicos metilados como los más discriminantes -NDRG4, BMP3, vimentina, y TFPI2. La detección de KRAS mutante y hemoglobina complementa los marcadores de genes metilados detectados en las heces y, por consiguiente, también se evaluaron en el panel de marcadores. Finalmente, el ensayo de referencia de la beta-actina (ACTB) se usó para determinar los equivalentes totales de genoma humano en las heces y, puesto que los niveles de ADN humano en las heces aumenta con la neoplasia colorrectal, para servir por sí mismo como marcador candidato.Candidate genes were identified that, individually or in combination (eg, KRAS + BMP3 + NDRG4 + TFPI2 + vimentin + reference and / or ACTB hemoglobin) produced an almost complete separation of colorectal neoplasia from normal mucosa. Four methylated gene markers emerged as the most discriminating - NDRG4, BMP3, vimentin, and TFPI2. The detection of mutant KRAS and hemoglobin complements the methylated gene markers detected in the stool and therefore was also evaluated in the marker panel. Finally, the benchmark beta-actin assay ( ACTB) was used to determine total human genome equivalents in stool and, since human DNA levels in stool increase with colorectal neoplasia, to serve on its own as a candidate marker.

Procesamiento de heces y captura del gen dianaStool Processing and Target Gene Capture

Poco después de la descongelación, las heces tamponadas se homogeneizaron completamente y se centrifugaron. A continuación, una alícuota de 14 mililitros de sobrenadante se trató con polivinilpolipirrolidona a una concentración de 50 miligramos por mililitro. La captura directa de las secuencias génicas diana mediante hibridación de sondas de oligonucleótidos se llevó a cabo sobre el material sobrenadante. Brevemente, 10 mililitros de sobrenadante tratado con PVP insoluble se desnaturalizaron en isotiocianato de guanidina 2,4 M (Sigma, St. Louis MO) a 90°C durante 10 minutos; 300-500 microgramos de perlas Sera-Mag modificadas con carboxilato (ThermoFisher Scientific, Waltham MA) funcionalizadas con cada sonda de oligonucleótidos de captura se añadieron posteriormente al sobrenadante de heces desnaturalizado, y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Las perlas Sera-Mag se recogieron con una gradilla magnética y se lavaron tres veces con tampón de lavado MOPS (MOPS 10 mM; NaCl 150 mM, pH 7,5), y después se eluyeron en 60 microlitros de agua exenta de nucleasa con 20 nanogramos por microlitro de ARNt (Sigma). En este estudio, cuatro marcadores metilados seleccionados, vimentina, NDRG4, BMP3, y TFPI2, y un gen de referencia ACTB, se capturaron conjuntamente en una reacción de hibridación; el marcador de mutación KRAS se capturó posteriormente en otra reacción de hibridación. Las sondas de captura usadas, mostradas aquí con su enlace amino modificado para seis átomos de carbono en 5' (Integrated DNA Technology, Coralville, IA), fueron las siguientes: Shortly after thawing, the buffered stools were completely homogenized and centrifuged. Next, a 14 milliliter aliquot of supernatant was treated with polyvinylpolypyrrolidone at a concentration of 50 milligrams per milliliter. Direct capture of the target gene sequences by oligonucleotide probe hybridization was carried out on the supernatant. Briefly, 10 milliliters of insoluble PVP treated supernatant were denatured in 2.4 M guanidine isothiocyanate (Sigma, St. Louis MO) at 90 ° C for 10 minutes; 300-500 micrograms of carboxylate-modified Sera-Mag beads (ThermoFisher Scientific, Waltham MA) functionalized with each capture oligonucleotide probe were subsequently added to the denatured stool supernatant, and incubated at room temperature for one hour. The Sera-Mag beads were collected with a magnetic rack and washed three times with MOPS wash buffer (10 mM MOPS; 150 mM NaCl, pH 7.5), and then eluted in 60 microliters of nuclease-free water with 20 nanograms per microliter of tRNA (Sigma). In this study, four selected methylated markers, vimentin, NDRG4, BMP3, and TFPI2, and an ACTB reference gene , were captured together in a hybridization reaction; the KRAS mutation marker was subsequently captured in another hybridization reaction. The capture probes used, shown here with their modified amino bond for 5 'six carbon atoms (Integrated DNA Technology, Coralville, IA), were as follows:

para vimentina: for vimentin:

/5AmMC6/CTGTAGGTGCGGGTGGACGTAGTCACGTAGCTCCGGCTGGA-3' (SEQ ID NO: 1);/ 5AmMC6 / CTGTAGGTGCGGGTGGACGTAGTCACGTAGCTCCGGCTGGA-3 '(SEQ ID NO: 1);

para NDRG4:for NDRG4 :

/5AmMC6/TCCCTCGCGCGTGGCTTCCGCCTTCTGCGCGGCTGGGGTGCCCGGTGG-3' (SEQ ID NO: 2); / 5AmMC6 / TCCCTCGCGCGTGGCTTCCGCCTTCTGCGCGGCTGGGGTGCCCGGTGG-3 '(SEQ ID NO: 2);

para BMP3: for BMP3:

/5AmMC6/GCGGGACACTCCGAAGGCGCAAGGAG-3' (SEQ ID NO: 3); / 5AmMC6 / GCGGGACACTCCGAAGGCGCAAGGAG-3 '(SEQ ID NO: 3);

para TFPI2: for TFPI2:

/5AmMC6/CGCCTGGAGCAGAAAGCCGCGCACCT-3' (SEQ ID NO: 4);/ 5AmMC6 / CGCCTGGAGCAGAAAGCCGCGCACCT-3 '(SEQ ID NO: 4);

para ACTB: for ACTB:

/5AmMC6/CCTTGTCACACGAGCCAGTGTTAGTACCTACACC-3' (SEQ ID NO: 5);/ 5AmMC6 / CCTTGTCACACGAGCCAGTGTTAGTACCTACACC-3 '(SEQ ID NO: 5);

para KRAS: for KRAS:

/5AmMC6/GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3' (SEQ ID NO: 6); y /5AmMC6/CTCTATTGTTGGATCATATTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGC-3' (SEQ ID NO: 7) / 5AmMC6 / GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3 '(SEQ ID NO: 6); and / 5AmMC6 / CTCTATTGTTGGATCATATTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGC-3 '(SEQ ID NO: 7)

Ensayos de metilación.Methylation tests.

Los marcadores metilados se cuantificaron por el procedimiento QuARTS, tal como han descrito anteriormente los inventores (véanse, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos con números de serie 12/946.737,; 12/946.745; y 12/946.752,). Este procedimiento combina un procedimiento de amplificación del ADN diana basado en polimerasa con un procedimiento de amplificación de la señal basado en una escisión invasiva. Los inventores trataron 45 microlitros de ADN capturado con bisulfito usando el kit EZ-96 DNA Metilation (Zymo Research, Irvine CA) y eluyeron la muestra con 50 microlitros de Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM pH 8,0 con 20 nanogramos por microlitro de ARNt (Sigma) en una placa de PCR de 96 pocillos; 10 microlitros de ADN tratado con bisulfito se analizaron según el procedimiento QuARTS en volúmenes de reacción de 30 microlitros en una placa de PCR de 96 pocillos. Las placas de PCR se ciclaron en un LightCycler 480 (Roche).Methylated markers were quantified by the QuARTS method, as previously described by the inventors (see, for example, US Patent Application Serial Nos. 12 / 946,737; 12 / 946,745; and 12 / 946,752). This procedure combines a polymerase-based target DNA amplification procedure with a signal amplification procedure based on invasive cleavage. The inventors treated 45 microliters of bisulfite captured DNA using the EZ-96 DNA Metilation Kit (Zymo Research, Irvine CA) and eluted the sample with 50 microliters of 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA pH 8.0 with 20 nanograms per microliter of tRNA (Sigma) in a 96-well PCR plate; 10 microliters of bisulfite-treated DNA was analyzed according to the QuARTS procedure in 30 microliter reaction volumes in a 96-well PCR plate. The PCR plates were cycled on a LightCycler 480 (Roche).

Se diseñaron dos ensayos QuARTS triplete para detectar los marcadores metilados vimentina, NDRG4, BMP3, y TFPI2 usando ACTB como gen de referencia para cada uno de ellos. El primer ensayo triplete contenía ACTB, vimentina, y NDRG4, y el segundo contenía ACTB, BMP3, y TFPI2. Cada reacción QuA r Ts incorporaba 400-600 nM de cebadores y sondas de detección, 100 nM de oligonucleótido invasivo, 600-700 nM de cada casete indicador de transferencia de energía de resonancia (FRET) FAM (Hologic, Madison WI), Yellow (Hologic), y Quasor 670 (BioSearch Technologies, Novato CA), 6,675 nanogramos por microlitro de Cleavase 2.0 (Hologic), 1 unidad de ADN polimerasa GoTaq de inicio caliente (Promega, Madison WI), MOPS 10 mM, MgCh 7,5 mM y 250 pM de cada dNTP. Las condiciones de ciclación QuARTS consistieron en 95°C durante 3 minutos, seguido de 10 ciclos, comprendiendo cada uno 95°C durante 20 segundos, 67°C durante 30 segundos, y 70°C durante 30 segundos, seguido de 45 ciclos, comprendiendo cada uno 95°C durante 20 segundos, 53°C durante 1 minuto, y 70°C durante 30 segundos, y finalmente 30 segundos de mantenimiento en caliente a 40°C. Para cada diana indicada a continuación, los dos cebadores y sondas específicos de metilación (Integrated DNA Technology, Coralville, IA) fueron los siguientes: Two triplet QuARTS assays were designed to detect the methylated markers vimentin, NDRG4, BMP3, and TFPI2 using ACTB as a reference gene for each of them. The first triplet assay contained ACTB, vimentin, and NDRG4, and the second contained ACTB, BMP3, and TFPI2. Each QuA r Ts reaction incorporated 400-600 nM of detection primers and probes, 100 nM of invasive oligonucleotide, 600-700 nM of each FAM Resonance Energy Transfer (FRET) reporter cassette (Hologic, Madison WI), Yellow ( Hologic), and Quasor 670 (BioSearch Technologies, Novato CA), 6.675 nanograms per microliter of Cleavase 2.0 (Hologic), 1 unit of GoTaq hot start DNA polymerase (Promega, Madison WI), MOPS 10 mM, MgCh 7.5 mM and 250 pM of each dNTP. The QuARTS cycling conditions consisted of 95 ° C for 3 minutes, followed by 10 cycles, each comprising 95 ° C for 20 seconds, 67 ° C for 30 seconds, and 70 ° C for 30 seconds, followed by 45 cycles, comprising each 95 ° C for 20 seconds, 53 ° C for 1 minute, and 70 ° C for 30 seconds, and finally 30 seconds of keeping warm at 40 ° C. For each target listed below, the two specific methylation primers and probes (Integrated DNA Technology, Coralville, IA) were as follows:

Para vimentina: For vimentin:

Cebador 5'-GGC GGT TCG GGT ATC G-3' (SEQ ID NO: 8),Primer 5'-GGC GGT TCG GGT ATC G-3 '(SEQ ID NO: 8),

Cebador 5'-CGT AAT CAC GTA ACT CCG AC T-3' (SEQ ID NO: 9),Primer 5'-CGT AAT CAC GTA ACT CCG AC T-3 '(SEQ ID NO: 9),

Sonda 5'-GAC GCG GAG GCG AGT CGG TCG/3'C6/ (SEQ ID NO: 10);Probe 5'-GAC GCG GAG GCG AGT CGG TCG / 3'C6 / (SEQ ID NO: 10);

para NDRG4:for NDRG4 :

Cebador 5'-CGG TTT TCG TTC GTT TTT TCG-3' (SEQ ID NO: 11),Primer 5'-CGG TTT TCG TTC GTT TTT TCG-3 '(SEQ ID NO: 11),

Cebador 5'-GTA ACT TCC GCC TTC TAC GC-3' (SEQ ID NO: 12),Primer 5'-GTA ACT TCC GCC TTC TAC GC-3 '(SEQ ID NO: 12),

Sonda 5'-CGC CGA GGG TTC GTT TAT CG/3'C6/ (SEQ ID NO: 13);Probe 5'-CGC CGA GGG TTC GTT TAT CG / 3'C6 / (SEQ ID NO: 13);

para BMP3: for BMP3:

Cebador 5'-GTT TAA TTT TCG GTT TCG TCG TC-3' (SEQ ID NO: 14),Primer 5'-GTT TAA TTT TCG GTT TCG TCG TC-3 '(SEQ ID NO: 14),

Cebador 5'-CTC CCG ACG TCG CTA CG-3' (SEQ ID NO: 15),Primer 5'-CTC CCG ACG TCG CTA CG-3 '(SEQ ID NO: 15),

Sonda 5'-CGC CGA GGC GGT TTT TTG CG/3'C6/ (SEQ ID NO: 16); yProbe 5'-CGC CGA GGC GGT TTT TTG CG / 3'C6 / (SEQ ID NO: 16); and

para TFPI2:for TFPI2 :

Cebador 5'-TCG TTG GGT AAG GCG TTC-3' (SEQ ID NO: 17),Primer 5'-TCG TTG GGT AAG GCG TTC-3 '(SEQ ID NO: 17),

Cebador 5'-AAA CGA ACA CCC GAA CCG-3' (SEQ ID NO: 18),Primer 5'-AAA CGA ACA CCC GAA CCG-3 '(SEQ ID NO: 18),

Sonda 5'-GAC GCG GAG GCG GTT TTT TGT T/3'C6/ (SEQ ID NO: 19).Probe 5'-GAC GCG GAG GCG GTT TTT TGT T / 3'C6 / (SEQ ID NO: 19).

El ensayo TFPI2 tuvo un oligonucleótido invasivo específico:The TFPI2 assay had a specific invasive oligonucleotide:

5'-GCG GGA GGA GGT GCC-3' (SEQ ID NO: 20).5'-GCG GGA GGA GGT GCC-3 '(SEQ ID NO: 20).

Los cebadores y la sonda para detectar A CTB tratado con bisulfito fueron los siguientes:The primers and probe to detect bisulfite-treated CTB were as follows:

Cebador 5'-TTT GTT TTT TTG ATT AGG TGT TTA AGA-3' (SEQ ID NO: 21),Primer 5'-TTT GTT TTT TTG ATT AGG TGT TTA AGA-3 '(SEQ ID NO: 21),

Cebador 5'-CAC CAA CCT CAT AAC CTT ATC-3' (SEQ ID NO: 22), Primer 5'-CAC CAA CCT CAT AAC CTT ATC-3 '(SEQ ID NO: 22),

Sonda 5'-CCA CGG ACG ATA GTG TTG TGG/3'C6/ (SEQ ID NO: 23).Probe 5'-CCA CGG ACG ATA GTG TTG TGG / 3'C6 / (SEQ ID NO: 23).

Cada placa incluyó muestras de ADN tratadas con bisulfito, muestras de curva patrón, controles positivos y negativos, y blancos de agua. Las curvas patrón se trazaron usando de 300 a 1000 secuencias diana cortadas de plásmidos genomanipulados. El ADN metilado universal CpGenome tratado con bisulfito (Millipore, Billerica, m A) y ADN genómico humano (Merck, Alemania) se usaron como controles positivos y negativos. El número de hebras de ADN se determinó comparando el Cp del gen diana con el de la curva patrón del ensayo correspondiente. La metilación porcentual de cada marcador se determinó dividiendo el número de hebras del gen metilado por el número de hebras de ACTB y multiplicando por 100.Each plate included bisulfite treated DNA samples, standard curve samples, positive and negative controls, and water blanks. Standard curves were drawn using 300 to 1000 target sequences cut from genomanipulated plasmids. Bisulfite treated CpGenome universal methylated DNA (Millipore, Billerica, m A) and human genomic DNA (Merck, Germany) were used as positive and negative controls. The number of DNA strands was determined by comparing the Cp of the target gene with that of the standard curve of the corresponding assay. The percent methylation of each marker was determined by dividing the number of strands of the methylated gene by the number of ACTB strands and multiplying by 100.

Mutación KRAS KRAS mutation

El gen KRAS se amplificó en primer lugar por PCR con cebadores que flanqueaban los codones 12/13 usando 10 microlitros de ADN KRAS capturado como molde. La PCR se llevó a cabo con 1 x LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche, Alemania) y 200 nM de cada cebador. Las condiciones de ciclación fueron 95 °C durante 3 minutos, seguido de 15 ciclos, cada uno a 95°C durante 20 segundos, 62°C durante 30 segundos, y 72°C durante 30 segundos. Las secuencias de los cebadores fueron:The KRAS gene was first amplified by PCR with primers flanking codons 12/13 using 10 microliters of captured KRAS DNA as a template. PCR was carried out with 1 x LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche, Germany) and 200 nM of each primer. Cycling conditions were 95 ° C for 3 minutes, followed by 15 cycles, each at 95 ° C for 20 seconds, 62 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. The sequences of the primers were:

5'-AGG CCT GCT GAA AAT GAC TG-3' (SEQ ID NO: 24), y5'-AGG CCT GCT GAA AAT GAC TG-3 '(SEQ ID NO: 24), and

5'-CTA TTG TTG GAT CAT ATT CG TC-3' (SEQ ID NO: 25).5'-CTA TTG TTG GAT CAT ATT CG TC-3 '(SEQ ID NO: 25).

Cada muestra amplificada se diluyó 500 veces en agua exenta de nucleasa. Una alícuota de 10 microlitros de las diluciones de muestra de 500 veces se añadió a una placa de PCR de 96 pocillos con un manipulador automatizado de líquidos (epMotion, Eppendorf, Hauppauge NY). Los ensayos QuARTS se usaron a continuación para evaluar siete mutaciones en los codones 12/13 del gen KRAS. Cada ensayo de mutación se diseñó como un ensayo singlete. Los cebadores y sondas directos para KRAS específicos de mutación fueron los siguientes:Each amplified sample was diluted 500-fold in nuclease-free water. A 10 microliter aliquot of the 500-fold sample dilutions was added to a 96-well PCR plate with an automated liquid handler (epMotion, Eppendorf, Hauppauge NY). The QuARTS assays were then used to evaluate seven mutations in codons 12/13 of the KRAS gene . Each mutation assay was designed as a singlet assay. Mutation-specific KRAS direct primers and probes were as follows:

para la mutación G12S: for the G12S mutation :

Cebador 5'-CTT GTG GTA GTT GGA GCA A-3' (SEQ ID NO: 26)Primer 5'-CTT GTG GTA GTT GGA GCA A-3 '(SEQ ID NO: 26)

Sonda 5'-GCG CGT CCA GTG GCG TAG GC/3'C6/ (SEQ ID NO: 27);Probe 5'-GCG CGT CCA GTG GCG TAG GC / 3'C6 / (SEQ ID NO: 27);

para la mutación G12C for the G12C mutation

Cebador 5'-AAA CTT GTG GTA GTT GGA CCT T-3' (SEQ ID NO: 28)Primer 5'-AAA CTT GTG GTA GTT GGA CCT T-3 '(SEQ ID NO: 28)

Sonda 5'-GCG CGT CCT GTG GCG TAG GC/3'C6/ (SEQ ID NO: 29);Probe 5'-GCG CGT CCT GTG GCG TAG GC / 3'C6 / (SEQ ID NO: 29);

para la mutación G12R for the G12R mutation

Cebador 5'-TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA CCT C-3' (SEQ ID NO: 30)Primer 5'-TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA CCT C-3 '(SEQ ID NO: 30)

Sonda 5'-GCG CGT CCC GTG GCG TAG GC/3'C6/ (SEQ ID NO: 31);Probe 5'-GCG CGT CCC GTG GCG TAG GC / 3'C6 / (SEQ ID NO: 31);

para la mutación G12D for the G12D mutation

Cebador 5'-ACT TGT GGT AGT TGG AGC TCA-3' (SEQ ID NO: 32)Primer 5'-ACT TGT GGT AGT TGG AGC TCA-3 '(SEQ ID NO: 32)

Sonda 5'-GCG CGT CCA TGG CGT AGG CA/3'C6/ (SEQ ID NO: 33);Probe 5'-GCG CGT CCA TGG CGT AGG CA / 3'C6 / (SEQ ID NO: 33);

para la mutación G12V for the G12V mutation

Cebador 5'-ACT TGT GGT AGT TGG AGC TCT-3' (SEQ ID NO: 34)Primer 5'-ACT TGT GGT AGT TGG AGC TCT-3 '(SEQ ID NO: 34)

Sonda 5'-GCG CGT CCT TGG CGT AGG CA/3'C6/ (SEQ ID NO: 35);Probe 5'-GCG CGT CCT TGG CGT AGG CA / 3'C6 / (SEQ ID NO: 35);

para la mutación G12A for the G12A mutation

Cebador 5'-AAC TTG TGG TAG TTG GAG ATG C-3' (SEQ ID NO: 36)Primer 5'-AAC TTG TGG TAG TTG GAG ATG C-3 '(SEQ ID NO: 36)

Sonda 5'-GCG CGT CCC TGG CGT AGG CA/3'C6/ (SEQ ID NO: 37);Probe 5'-GCG CGT CCC TGG CGT AGG CA / 3'C6 / (SEQ ID NO: 37);

para la mutación G13D for the G13D mutation

Cebador 5'-GGT AGT TGG AGC TGG TCA-3' (SEQ ID NO: 38)Primer 5'-GGT AGT TGG AGC TGG TCA-3 '(SEQ ID NO: 38)

Sonda 5'-GCG CGT CCA CGT AGG CAA GA/3'C6/ (SEQ ID NO: 39).Probe 5'-GCG CGT CCA CGT AGG CAA GA / 3'C6 / (SEQ ID NO: 39).

Para todos los mutantes de KRAS, el cebador inverso utilizado esFor all KRAS mutants, the reverse primer used is

5'-CTA TTG TTG GAT CAT ATT CGT C-3' (SEQ ID NO: 40).5'-CTA TTG TTG GAT CAT ATT CGT C-3 '(SEQ ID NO: 40).

Las condiciones de ciclación QuARTS y las concentraciones de reactivos para KRAS fueron iguales a las utilizadas en los ensayos de metilación. Cada placa contenía patrones fabricados con plásmidos genomanipulados, controles positivos y negativos, y blancos de agua, y se llevaron a cabo en un LightCycler 480 (Roche). El número de hebras de ADN se determinó comparando el Cp del gen diana con el de la curva patrón par dicho ensayo. La concentración de cada marcador de mutación en 50 microlitros de KRAS se calculó basado en el factor de dilución de 500 veces y una eficacia de amplificación de 1,95. Este valor se dividió por la concentración de ACTB en el ensayo de metilación y a continuación se multiplicó por 100 para determinar el porcentaje de mutación.The QuARTS cycling conditions and reagent concentrations for KRAS were the same as those used in the methylation assays. Each plate contained standards made from genomanipulated plasmids, positive and negative controls, and water blanks, and were run on a LightCycler 480 (Roche). The number of DNA strands was determined by comparing the Cp of the target gene with that of the standard curve for said assay. Concentration of Each mutation marker in 50 microliters of KRAS was calculated based on the 500-fold dilution factor and an amplification efficiency of 1.95. This value was divided by the concentration of ACTB in the methylation assay and then multiplied by 100 to determine the percent mutation.

Ensayo de hemoglobina.Hemoglobin assay.

Para cuantificar la hemoglobina en las heces, se llevó a cabo el ensayo HemoQuant semiautomatizado en dos alícuotas de heces tamponadas (cada una normalizada a 16 miligramos de heces) por paciente, como se describe en Ahlquist, y col. ("HemoQuant, a new quantitative assay for fecal hemoglobin. Comparison with Hemoccult". Ann Intern Med 101:297-302 (1984)). Este ensayo permitió la evaluación del valor complementario de hemoglobina fecal. To quantify stool hemoglobin, the semi-automated HemoQuant assay was performed on two aliquots of buffered stool (each normalized to 16 milligrams of stool) per patient, as described in Ahlquist, et al. ("HemoQuant, a new quantitative assay for fecal hemoglobin. Comparison with Hemoccult". Ann Intern Med 101: 297-302 (1984)). This test allowed the assessment of the complementary value of fecal hemoglobin.

Análisis de datosAnalysis of data

Usando la combinación de procedimientos de procesamiento de muestras descritos en el presente documento, que comprenden la eliminación de inhibidores y la purificación de la captura diana, combinada con los marcadores de metilación y mutación descritos, el presente estudio de 678 muestras consiguió los siguientes niveles de sensibilidad: 63,8% de sensibilidad para la detección de adenomas y 85,3% de sensibilidad para cáncer colorrectal a un nivel de especificidad del 90 %. Using the combination of sample processing procedures described herein, comprising removal of inhibitors and purification of target capture, combined with the described methylation and mutation markers, the present study of 678 samples achieved the following levels of sensitivity: 63.8% sensitivity for the detection of adenomas and 85.3% sensitivity for colorectal cancer at a specificity level of 90%.

Claims (13)

REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento para aislar un ácido nucleico diana humano a partir de una muestra de heces humanas, comprendiendo el procedimiento:1. A method for isolating a human target nucleic acid from a human stool sample, the method comprising: a) eliminar un inhibidor de ensayo de dicha muestra de heces para producir una preparación de muestra clarificada, en el que la eliminación de dicho inhibidor de ensayo a partir de dicha muestra comprende:a) removing a test inhibitor from said stool sample to produce a clarified sample preparation, wherein removing said test inhibitor from said sample comprises: a1) homogeneizar dicha muestra de heces para producir un homogenado;a1) homogenizing said stool sample to produce a homogenate; a2) centrifugar dicho homogenado para producir un sobrenadante.a2) centrifuging said homogenate to produce a supernatant. a3) tratar dicho sobrenadante con una polivinilpirrolidona insoluble para unir el inhibidor, si está presente, en un complejo de inhibidor; ya3) treating said supernatant with an insoluble polyvinylpyrrolidone to bind the inhibitor, if present, in an inhibitor complex; and a4) asilar dicho comprende de inhibidor a partir de dicho sobrenadante para producir una preparación de muestra clarificada;a4) isolating said inhibitor comprises from said supernatant to produce a clarified sample preparation; b) capturar dicho ácido nucleico diana a partir de dicha preparación de muestra clarificada con un reactivo de captura específico de la diana para formar un complejo de captura en el que la captura de dicho ácido nucleico diana comprende:b) capturing said target nucleic acid from said clarified sample preparation with a target-specific capture reagent to form a capture complex wherein capture of said target nucleic acid comprises: b1) exponer dicha preparación de muestra clarificada a una condición desnaturalizante para producir una muestra desnaturalizada; yb1) exposing said clarified sample preparation to a denaturing condition to produce a denatured sample; and b2) unir dicho ácido nucleico diana a un reactivo de captura específico de la diana para formar un complejo de captura, en el que dicho reactivo de captura específico de la diana comprende un oligonucleótido unido a una partícula magnética, el oligonucleótido complementario a al menos una porción de dicho ácido nucleico diana; b3) aislar dicho complejo de captura a partir de dicha preparación de muestra clarificada; yb2) binding said target nucleic acid to a target-specific capture reagent to form a capture complex, wherein said target-specific capture reagent comprises an oligonucleotide bound to a magnetic particle, the oligonucleotide complementary to at least one portion of said target nucleic acid; b3) isolating said capture complex from said clarified sample preparation; and b4) recuperar dicho ácido nucleico diana a partir de dicho complejo de captura en una solución de ácido nucleico.b4) recovering said target nucleic acid from said capture complex in a nucleic acid solution. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además:2. The method of claim 1, further comprising: e) retener la preparación de muestra clarificada después de la dicha etapa de asilamiento;e) retaining the clarified sample preparation after said isolation step; f) repetir las etapas de captura, aislamiento y recuperación usando la muestra clarificada residual y un segundo agente de captura.f) repeating the capture, isolation and recovery steps using the residual clarified sample and a second capture agent. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha polivinilpirrolidona se proporciona en una forma premedida, preferiblemente como un comprimido.3. The method of claim 1, wherein said polyvinylpyrrolidone is provided in a pre-measured form, preferably as a tablet. 4. El método de la reivindicación 1, en el que el aislamiento de dicho complejo de inhibidor comprende la centrifugación para separar dicho complejo de inhibidor a partir de dicho sobrenadante.The method of claim 1, wherein isolating said inhibitor complex comprises centrifugation to separate said inhibitor complex from said supernatant. 5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha centrifugación comprende centrifugar mediante un filtro de centrifugación que comprende a) un cuerpo hueco; b) un extremo inferior; y c) un extremo superior abierto opuesto al extremo inferior, en el que el cuerpo hueco y el extremo inferior están hechos de un material de filtración poroso. The method of claim 4, wherein said centrifugation comprises centrifuging through a centrifugal filter comprising a) a hollow body; b) a lower end; and c) an open upper end opposite the lower end, wherein the hollow body and the lower end are made of a porous filter material. 6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha condición desnaturalizante comprende calentamiento. 6. The method of claim 1, wherein said denaturing condition comprises heating. 7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha exposición de dicha preparación de muestra clarificada a una condición desnaturalizante comprende añadir un desnaturalizante a dicha preparación de muestra clarificada.The method of claim 1, wherein said exposing said clarified sample preparation to a denaturing condition comprises adding a denaturant to said clarified sample preparation. 8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho desnaturalizante comprende tiocianato de guanidina. 8. The method of claim 7, wherein said denaturant comprises guanidine thiocyanate. 9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de aislamiento comprende exponer dicho complejo de captura a un campo magnético.The method of claim 1, wherein said isolating step comprises exposing said capture complex to a magnetic field. 10. El método de la reivindicación 1, en el que la recuperación de dicho ácido nucleico diana comprende eluir dicho ácido nucleico diana a partir de dicho complejo de captura.The method of claim 1, wherein recovering said target nucleic acid comprises eluting said target nucleic acid from said capture complex. 11. Un kit de aislamiento de un ADN humano diana a partir de una muestra de heces humanas, comprendiendo el kit: a) un volumen de solución de homogeneización de heces adecuado para el procesamiento de una muestra de heces humanas que tiene una masa de al menos 4 gramos;11. An isolation kit of a target human DNA from a human stool sample, the kit comprising: a) a volume of stool homogenization solution suitable for processing a human stool sample having a mass of at minus 4 grams; b) polivinilpirrolidona insoluble, preferiblemente en forma premedida, preferiblemente proporcionada como un comprimido; b) insoluble polyvinylpyrrolidone, preferably in premeasured form, preferably provided as a tablet; b) un reactivo de captura específico de la diana que comprende un oligonucleótido unido covalentemente a una partícula magnética, en el que dicho oligonucleótido es complementario a al menos una porción de dicho ADN humano diana.b) a target-specific capture reagent comprising an oligonucleotide covalently linked to a magnetic particle, wherein said oligonucleotide is complementary to at least a portion of said target human DNA. 12. El kit de la reivindicación 11 que comprende, además, tiocianato de guanidina.12. The kit of claim 11 further comprising guanidine thiocyanate. 13. El kit de la reivindicación 11 que comprende, además, una solución de elución o lavado. The kit of claim 11 further comprising an elution or wash solution.
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