ES2769975B2

ES2769975B2 - CASPASE 1 INHIBITORS FOR THE TREATMENT OF ANEMIA

Info

Publication number: ES2769975B2
Application number: ES201831288A
Authority: ES
Inventors: Mendez Victoriano Francisco Mulero; Oliva Ana Belén Perez; Moreno Diana Garcia; Sylwia Dominika Tyrkalska; Ruiz Lola Rodriguez; Fuentes María Luisa Cayuela; Leonard I Zon
Original assignee: Fundacion para la Formacion e Investigacion Sanitarias de la Region de Murcia; Universidad de Murcia; Boston Childrens Hospital
Current assignee: Fundacion para la Formacion e Investigacion Sanitarias de la Region de Murcia; Universidad de Murcia; Boston Childrens Hospital
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: WO2020136298A3; WO2020136298A2; ES2769975A1

Description

DESCRIPCI NDESCRIPTION

Inhibidores de caspasa 1 para el tratamiento de anemiaCaspase 1 inhibitors for treating anemia

Campo de la invenciónField of the invention

La presente invención se refiere al campo de la medicina, en particular al tratamiento de anemia con inhibidores de caspasa-1.The present invention relates to the field of medicine, in particular to the treatment of anemia with caspase-1 inhibitors.

Antecedentes de la invenciónBackground of the invention

La hematopoyesis es el proceso de formación de glóbulos sanguíneos que se produce durante el desarrollo embrionario y la edad adulta para producir el sistema sanguíneo (Jagannathan-Bogdan y Zon, 2013). En vertebrados, el desarrollo sanguíneo implica dos ondas de hematopoyesis: la primitiva durante desarrollo embrionario temprano, y la definitiva, que se produce en estados más tardíos (Gore et al., 2018). La hematopoyesis definitiva emplea células madre hematopoyéticas multipotentes (HSC), que migran en última instancia a la médula ósea, o médula renal en pez cebra, y dan lugar a todos los linajes sanguíneos (Birbrair y Frenette, 2016; Cumano y Godin, 2007). La maduración de HSC implica la diversificación de los linajes de células linfoides (células T, B y NK) y de células mieloides/eritroides (megacariocitos, eritrocitos, granulocitos y macrófagos) (Kondo, 2010; Kondo et al., 2003; Weissman, 2000). La decisión de los destinos de células eritroides y mieloides depende principalmente de dos factores de la transcripción GATA1 y SPI1 (también conocidos como PU.1) que muestran relación inhibidora cruzada que da como resultado interacción física y competición directa entre ellos por los genes diana (Nerlov et al., 2000; Rekhtman et al., 1999). Sin embargo, existen muchas controversias sobre factores responsables de diferenciación de células eritroides y mieloides terminales y muchas rutas desconocidas que están implicadas probablemente en su regulación (Cantor y Orkin, 2002; Hoppe et al., 2016). Estas rutas no identificas pueden tener implicaciones clínicas importantes, puesto que el sesgo de linaje hematopoyético está asociado con una incidencia aumentada de enfermedades con componentes inflamatorios prominentes incluyendo aterosclerosis, autoinmunidad, enfermedad neurodegenerativa y carcinogénesis (Elias et al., 2017). Hematopoiesis is the process of blood cell formation that occurs during embryonic development and adulthood to produce the blood system (Jagannathan-Bogdan and Zon, 2013). In vertebrates, blood development involves two waves of hematopoiesis: the primitive one during early embryonic development, and the definitive one, which occurs in later stages (Gore et al., 2018). Definitive hematopoiesis uses multipotent hematopoietic stem cells (HSCs), which ultimately migrate to the bone marrow, or kidney marrow in zebrafish, and give rise to all blood lines (Birbrair and Frenette, 2016; Cumano and Godin, 2007) . HSC maturation involves the diversification of lymphoid cell lines (T, B, and NK cells) and myeloid / erythroid cells (megakaryocytes, erythrocytes, granulocytes, and macrophages) (Kondo, 2010; Kondo et al., 2003; Weissman, 2000). The decision of the fates of erythroid and myeloid cells depends mainly on two transcription factors GATA1 and SPI1 (also known as PU.1) that show a cross-inhibitory relationship that results in physical interaction and direct competition between them for the target genes ( Nerlov et al., 2000; Rekhtman et al., 1999). However, there are many controversies about factors responsible for the differentiation of terminal erythroid and myeloid cells and many unknown pathways that are probably involved in their regulation (Cantor and Orkin, 2002; Hoppe et al., 2016). These unidentified pathways may have important clinical implications, since hematopoietic lineage bias is associated with an increased incidence of diseases with prominent inflammatory components including atherosclerosis, autoimmunity, neurodegenerative disease, and carcinogenesis (Elias et al., 2017).

Los inflamasomas son parte del sistema inmunitario innato y como receptores y sensores intracelulares regulan la activación de caspasas inflamatorias, concretamente caspasa-1 y caspasa-1 (caspasa-4 y caspasa-5 en seres humanos), que inducen inflamación en respuesta a microbios infecciosos y señales de peligro endógenas (Latz et al., 2013; Martinon et al., 2009). Normalmente, los complejos de multiproteína de inflamasoma contienen proteínas sensoras (receptores de tipo NOD, NLR), proteínas adaptadoras (proteína de tipo mancha relacionada con apoptosis que contiene un CARD, ASC), y caspasas efectoras en una forma de zimógeno, siendo todas capaces de interactuar entre sí mediante interacciones homotípicas (Broz y Monack, 2011; Sharma y Kanneganti, 2016). Recientemente, se ha demostrado que también la familia de proteína GBP forma parte de estos complejos de multiproteína (Pilla et al., 2014; Santos et al., 2018; Tyrkalska et al., 2016; Wallet et al., 2017; Zwack et al., 2017). La oligomerización de pro-caspasas y su maduración autoproteolítica conducen al procesamiento y secreción de las citocinas proinflamatorias interleucina-1p (IL-1P) e IL-18, y la inducción de una forma de muerte celular programada denominada piroptosis (Lamkanfi y Dixit, 2014). Últimamente, resultó que los inflamasomas desempeñan papeles cruciales no sólo en infección e inflamación estéril sino también en el mantenimiento de las funciones celulares básicas y el control de la homeostasis celular (Rathinam y Fitzgerald, 2016). Por tanto, se han demostrado funciones reguladoras recientemente descubiertas para los inflamasomas en el metabolismo celular, proliferación, transcripción génica y oncogénesis (Rathinam y Fitzgerald, 2016; Sharma y Kanneganti, 2016). Aunque hasta la fecha se conoce poco sobre el impacto de los inflamasomas en la hematopoyesis en general, se ha demostrado que el factor de la transcripción eritroide maestro GATA1 podía escindirse in vitro por muchas caspasas e in vivo por caspasa-3 (De Maria et al., 1999).Inflammasomes are part of the innate immune system and as intracellular receptors and sensors regulate the activation of inflammatory caspases, specifically caspase-1 and caspase-1 (caspase-4 and caspase-5 in humans), which induce inflammation in response to infectious microbes and endogenous danger signs (Latz et al., 2013; Martinon et al., 2009). Typically, inflammasome multiprotein complexes contain sensor proteins (NOD-like receptors, NLRs), adapter proteins (apoptosis-related spot-like protein containing a CARD, ASC), and effector caspases in a zymogen form, all of which are capable to interact with each other through homotypic interactions (Broz and Monack, 2011; Sharma and Kanneganti, 2016). Recently, it has also been shown that the GBP protein family is part of these multiprotein complexes (Pilla et al., 2014; Santos et al., 2018; Tyrkalska et al., 2016; Wallet et al., 2017; Zwack et al. al., 2017). The oligomerization of pro-caspases and their autoproteolytic maturation lead to the processing and secretion of the pro-inflammatory cytokines interleukin-1p (IL-1P) and IL-18, and the induction of a form of programmed cell death called piroptosis (Lamkanfi and Dixit, 2014 ). Lately, it turned out that inflammasomes play crucial roles not only in sterile infection and inflammation but also in the maintenance of basic cellular functions and the control of cellular homeostasis (Rathinam and Fitzgerald, 2016). Thus, recently discovered regulatory functions have been demonstrated for inflammasomes in cell metabolism, proliferation, gene transcription, and oncogenesis (Rathinam and Fitzgerald, 2016; Sharma and Kanneganti, 2016). Although little is known to date about the impact of inflammasomes on hematopoiesis in general, it has been shown that the master erythroid transcription factor GATA1 could be cleaved in vitro by many caspases and in vivo by caspase-3 (De Maria et al. ., 1999).

El pez cebra ha surgido recientemente como un modelo potente y útil para estudiar la hematopoyesis (Berman et al., 2012; Ellett y Lieschke, 2010). Además, los programas genéticos que controlan la hematopoyesis en el pez cebra se conservan con mamíferos, incluyendo seres humanos, haciendo que sean sistemas modelo clínicamente relevantes (Jagannathan-Bogdan y Zon, 2013). En este documento se muestra por primera vez el papel crítico desempeñado por el inflamasoma en la regulación de la decisión del destino de células eritroides/mieloides y diferenciación eritroide terminal usando modelos de pez cebra, ratón y ser humano. Además, los resultados también tienen implicaciones clínicas importantes, puesto que la inhibición farmacológica del inflamasoma rescata modelos de enfermedad de pez cebra y ratón de inflamación neutrófila y anemia.The zebrafish has recently emerged as a powerful and useful model for studying hematopoiesis (Berman et al., 2012; Ellett and Lieschke, 2010). Furthermore, the genetic programs that control hematopoiesis in zebrafish are conserved with mammals, including humans, making them clinically relevant model systems (Jagannathan-Bogdan and Zon, 2013). This paper shows for the first time the critical role played by the inflammasome in Regulation of erythroid / myeloid cell fate decision and terminal erythroid differentiation using zebrafish, mouse and human models. Furthermore, the results also have important clinical implications, since pharmacological inhibition of the inflammasome rescues zebrafish and mouse disease models of neutrophilic inflammation and anemia.

Breve descripción de las figurasBrief description of the figures

Figura 1. La inhibición de inflamasomas disminuye el número de neutrófilos en pez cebra. Se inyectaron embriones unicelulares de pez cebra Tg(mpx:eGFP) con control convencional (Std), Asc o MO de Gbp4 (a, b, g, h), y/o con ARNm antisentido (As), Gbp4WT, Gbp4KS/AA, Gbp4ACARD, Gbp4DM, Asc o Caspa (e-h). Alternativamente, a los embriones Tg(mpx:eGFP) que no se inyectaron se les retiró manualmente el corion a 24 o 48 hpf y se trataron mediante inmersión con DMSO o el inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (C1INH) (c, d, i, j). Cada punto representa el número de neutrófilos de una única larva, mientras que también se muestra la media ± EEM para cada grupo (a, c, e, g, i). El tamaño de muestra (n) se indica para cada tratamiento. También se muestran imágenes representativas de canales verdes de larvas completas para los diferentes tratamientos. Barras de escala, 500 ^m. Se determinó la actividad de caspasa-1 en larvas completas para cada tratamiento a 72 hpf (n=30) (b, d, f, h, j). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 según ANOVA seguido por prueba múltiple de amplitud de Tukey. Figure 1. Inhibition of inflammasomes decreases the number of neutrophils in zebrafish. Unicellular Tg zebrafish embryos ( mpx: eGFP) were injected with conventional control (Std), Asc or MO of Gbp4 (a, b, g, h), and / or with antisense mRNA (As), Gbp4WT, Gbp4KS / AA , Gbp4ACARD, Gbp4DM, Asc or Dandruff (eh). Alternatively, Tg ( mpx: eGFP) embryos that were not injected were manually removed the chorion at 24 or 48 hpf and treated by immersion with DMSO or the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK (C1INH) ( c, d, i, j). Each point represents the number of neutrophils from a single larva, while the mean ± SEM for each group (a, c, e, g, i) is also shown. The sample size (n) is indicated for each treatment. Representative images of green carcasses of complete larvae are also shown for the different treatments. Scale bars, 500 ^ m. Caspase-1 activity was determined in whole larvae for each treatment at 72 hpf (n = 30) (b, d, f, h, j). * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001 according to ANOVA followed by Tukey's multiple amplitude test.

Figura 2. La inhibición de inflamasomas aumenta el número de eritrocitos en pez cebra. A los embriones de pez cebra Tg(lcr:eGFP) se les retiró manualmente el corion a 24 hpf y se trataron mediante inmersión con DMSO o el inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (C1INH) durante 48 h (a). Alternativamente, se inyectaron embriones unicelulares Tg(lcr:eGFP) con control convencional (Std) o MO de Asc (b). Cada punto representa el porcentaje de células GFP+ de cada agrupación de 50 larvas, mientras que también se muestra la media ± EEM para cada grupo. Se muestran diagramas de puntos representativos de canales verdes y azules de morfantes de control (b, e), tratados con inhibidor de caspasa-1 (c) y Asc (f). ***p<0,001 según la prueba de la t de Student. Figure 2. Inhibition of inflammasomes increases the number of erythrocytes in zebrafish. Zebrafish Tg ( lcr: eGFP) embryos were manually removed the chorion at 24 hpf and treated by immersion with DMSO or the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK (C1INH) for 48 h (a) . Alternatively, Tg unicellular embryos ( lcr: eGFP) were injected with conventional control (Std) or MO of Asc (b). Each point represents the percentage of GFP + cells in each pool of 50 larvae, while the mean ± SEM for each group is also shown. Representative dot plots of green and blue channels of control morphants (b, e), treated with caspase-1 inhibitor (c) and Asc (f) are shown. *** p <0.001 according to the Student's t test.

Figura 3. El inflamasoma se requiere intrínsecamente para diferenciación de HSC pero es dispensable para su aparición en pez cebra. (a-h) A embriones de pez cebra Tg(runx1:GAL4; UASnfsb-mCherry) se les retiró manualmente el corion a 24 ó 48 hpf y se trataron mediante inmersión con DMSO o el inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (C1INH) durante 24 ó 48 h (a-f). Alternativamente, se inyectaron embriones unicelulares Tg(runx1:GAL4; UASnfsb-mCherry) con control convencional (Std) o MO de Asc (g-h). Cada punto representa el número de HSC de una única larva, mientras que también se muestra la media ± EEM para cada grupo. El tamaño de muestra (n) se indica para cada tratamiento. También se muestran imágenes representativas de canales rojos de larvas completas para los diferentes tratamientos (a, c, e, g). Barras de escala, 500 ^m. Se determinó la actividad de caspasa-1 para cada tratamiento de larvas 48 ó 72 hpf (n=30) (b, d, f, h). (i-l) Se fijaron larvas Tg(runx1:gal4; UAS:Gbp4KS/AA) (i), Tg(mpx:gal4; UAS:Gbp4KS/AA) (j), Tg(runx1:gal4; UAS.AscACARD) (k), Tg(mpx:gal4; UAS.AscACARD) (l) a 72 hpf y se tiñeron con negro de Sudán para la detección de neutrófilos. Cada punto representa el número de neutrófilos de una única larva, mientras que también se muestra la media ± EEM para cada grupo. El tamaño de muestra (n) se indica para cada tratamiento. ns, no significativo; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 según la prueba de la t de Student. Figure 3. The inflammasome is intrinsically required for HSC differentiation but is dispensable for its occurrence in zebrafish. (ah) Tg zebrafish embryos ( runx1: GAL4 ; UASnfsb-mCherry) were manually removed the chorion at 24 or 48 hpf and treated by immersion with DMSO or the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK ( C1INH) for 24 or 48 h (af). Alternatively, Tg unicellular embryos ( runx1: GAL4; UASnfsb-mCherry) were injected with conventional control (Std) or Asc MO (gh). Each point represents the number of HSCs from a single larva, while the mean ± SEM for each group is also shown. The sample size (n) is indicated for each treatment. Representative images of complete larval red carcasses are also shown for the different treatments (a, c, e, g). Scale bars, 500 ^ m. Caspase-1 activity was determined for each treatment of larvae 48 or 72 hpf (n = 30) (b, d, f, h). (il) Tg ( runx1: gal4; UAS: Gbp4KS / AA) (i), Tg ( mpx: gal4; UAS: Gbp4KS / AA) larvae (j), Tg ( runx1: gal4; UAS.AscACARD) (k ), Tg ( mpx: gal4; UAS.AscACARD) (l) at 72 hpf and stained with Sudan black for neutrophil detection. Each point represents the number of neutrophils of a single larva, while the mean ± SEM for each group is also shown. The sample size (n) is indicated for each treatment. ns, not significant; * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001 according to the Student's t test.

Figura 4. La actividad de inflamasoma es indispensable para la mielopoyesis en pez cebra. A larvas de pez cebra Tg(mpx:GAL4; UASnsfb-mCherry) se les retiró manualmente el corion a 48 hpf y se trataron mediante inmersión con metronidazol (Mtz) durante 24 h y luego con DMSO o el inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (C1INH) durante los 4 días siguientes. Se trataron los grupos de control durante 5 días con Mtz (todo el tiempo). (a) Cada punto representa el número de neutrófilos de una única larva, mientras que la media ± EEM para cada grupo también se muestra (n=30). (b) También se muestran imágenes representativas de canales rojos de larvas completas para los diferentes tratamientos y puntos de tiempo. Barras de escala, 500 ^m. ***p<0,001 según ANOVA seguido por prueba múltiple de amplitud de Tukey. Figure 4. Inflammasome activity is essential for myelopoiesis in zebrafish. Zebrafish Tg ( mpx: GAL4; UASnsfb-mCherry) larvae were manually removed the chorion at 48 hpf and treated by immersion with metronidazole (Mtz) for 24 h and then with DMSO or the irreversible caspase-1 inhibitor Ac- YVAD-CMK (C1INH) for the next 4 days. Control groups were treated for 5 days with Mtz (all the time). (a) Each point represents the number of neutrophils from a single larva, while the mean ± SEM for each group is also shown (n = 30). (b) Representative images of complete larval red carcasses are also shown for the different treatments and time points. Scale bars, 500 ^ m. *** p <0.001 according to ANOVA followed by Tukey's multiple amplitude test.

Figura 5. La infección no puede sortear el requisito de inflamasoma para la producción de neutrófilos en pez cebra. (a-h). Se inyectaron embriones unicelulares de pez cebra Tg(mpx:eGFP) con control convencional (Std), Gbp4 o MO de Asc en combinación con ARNm antisentido (As), Gcsfa, Asc, Caspa (c, d, g, h, i, j) o no se inyectaron, se les retiró manualmente el corion a 48 hpf y se trataron mediante inmersión con DMSO o el inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (C1INH) (a, b, e, f). Entonces se infectaron las larvas a 48 hpf con S. typhimurium (S.I.) en la vesícula ótica (a, b) o el saco vitelino (g, h) y se contó el número de neutrófilos en todo el cuerpo a 24 hpi (a, b) o 72 hpf (c-f) y se determinó la supervivencia durante 5 días tras la infección (g, h). Cada punto representa el número de neutrófilos de una única larva, mientras que también se muestra la media ± EEM para cada grupo. El tamaño de muestra (n) se indica para cada tratamiento. Se muestran imágenes representativas de canales verdes de larvas completas para los diferentes tratamientos (a-f). Barras de escala, 500 ^m. Se determinó la actividad de caspasa-1 en larvas completas para cada tratamiento a 72 hpf (n=30) (b, d, f). (ij). Los niveles de ARNm de spi1b, gata1a, mcsf y gcsf en colas larvarias se midieron mediante RT-qPCR a 24 hpf (i), mientras que los niveles de proteína de Gata1a e histona H3 se determinaron usando inmunotransferencia de tipo Western en colas larvarias a 24 hpf (j). Se realizó un análisis de densitometría para comprobar las diferencias entre tratamientos. ns, no significativo; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 según ANOVA seguido por prueba múltiple de amplitud de Tukey (a-f, i, j) o prueba de rango logarítmico con corrección de Bonferroni (g, h). Figure 5. Infection cannot circumvent the inflammasome requirement for neutrophil production in zebrafish . (ah). Unicellular zebrafish Tg (mpx: eGFP) embryos were injected with conventional control (Std), Gbp4 or MO of Asc in combination with antisense mRNA (As), Gcsfa, Asc, Caspa (c, d, g, h, i, j) or not injected, the chorion was manually removed at 48 hpf and treated by immersion with DMSO or the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK (C1INH) (a, b, e, f). The larvae were then infected at 48 hpf with S. typhimurium (SI) in the otic vesicle (a, b) or the yolk sac (g, h) and the number of neutrophils in the whole body was counted at 24 hpi (a, b) or 72 hpf (cf) and survival was determined for 5 days after infection (g, h). Each point represents the number of neutrophils of a single larva, while the mean ± SEM for each group is also shown. The sample size (n) is indicated for each treatment. Representative images of green carcasses of complete larvae are shown for the different treatments (af). Scale bars, 500 ^ m. Caspase-1 activity was determined in whole larvae for each treatment at 72 hpf (n = 30) (b, d, f). (ij). The mRNA levels of spi1b, gata1a, mcsf and gcsf in larval tails were measured by RT-qPCR at 24 hpf (i), while the protein levels of Gata1a and histone H3 were determined using Western blotting in larval tails to 24 hpf (j). A densitometry analysis was performed to check the differences between treatments. ns, not significant; * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001 according to ANOVA followed by Tukey's multiple amplitude test (af, i, j) or logarithmic rank test with Bonferroni correction (g, h).

Figura 6. La inhibición farmacológica de caspasa-1 en HSC CD34+ humanas promueve la diferenciación eritroide. Se incubaron células CD34+ con EPO durante 5 días en presencia de DMSO o el inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (C1INH, 50 ^M). Los niveles de ARNm de los genes que codifican para los componentes de inflamasoma CASP1, PYCARD, NLRP3 y NLRC4 (a) y los marcadores de diferenciación GATA1, GYPA, TFRC y SLC4A1 (c) se midieron mediante RT-qPCR, mientras que la actividad de caspasa-1 se determinó usando el sustrato fluorogénico YVAD-AFC (b). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 según ANOVA seguido por prueba múltiple de amplitud de Tukey. Figure 6. Pharmacological inhibition of caspase-1 in human CD34 + HSCs promotes erythroid differentiation . CD34 + cells were incubated with EPO for 5 days in the presence of DMSO or the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK (C1INH, 50 µM). The mRNA levels of the genes encoding the inflammasome components CASP1, PYCARD, NLRP3 and NLRC4 (a) and the differentiation markers GATA1, GYPA, TFRC and SLC4A1 (c) were measured by RT-qPCR, while the activity Caspase-1 was determined using the fluorogenic substrate YVAD-AFC (b). * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001 according to ANOVA followed by Tukey's multiple amplitude test.

Figura 7. La inhibición farmacológica de caspasa-1 perjudica la diferenciación eritroide de células K562. Se incubaron células K562 con hemina 50 ^M durante el tiempo indicado en presencia o ausencia del inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (C1INH, 50 ^M) y se obtuvieron imágenes de los sedimentos celulares (a, e, g), se lisaron y se resolvieron mediante SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos anti-GATA1 y anti-ACTB (a, e, f), procesados para la cuantificación de actividad de caspasa-1 usando el sustrato fluorogénico YVAD-AFC (b, g) y para inmunofluorescencia usando anticuerpos anti-CASP1 y anti-GATA1 (c, d). Se incluyeron extractos celulares de HEK293T transfectadas con GATA1-FLAG y FLAG vacío como controles de movilidad en a. Se muestra una superposición de inmunofluorescencia de caspasa-1 y núcleos teñidos con DAPI de K562 diferenciados durante 48 h con hemina en d. Barras de escala, 5 ^m. ***p<0,001 según ANOVA seguido por prueba múltiple de amplitud de Tukey. Figure 7. Pharmacological inhibition of caspase-1 impairs erythroid differentiation of K562 cells . K562 cells were incubated with 50 µM hemin for the indicated time in the presence or absence of the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK (C1INH, 50 µM) and images of cell pellets were obtained (a, e, g ), were lysed and resolved by SDS-PAGE and immunoblotted with anti-GATA1 and anti-ACTB antibodies (a, e, f), processed for the quantification of caspase-1 activity using the fluorogenic substrate YVAD-AFC (b, g) and for immunofluorescence using anti-CASP1 and anti-GATA1 antibodies (c, d). Cell extracts of HEK293T transfected with GATA1-FLAG and empty FLAG were included as mobility controls in a. Immunofluorescence overlap of caspase-1 and DAPI stained nuclei of K562 differentiated for 48 h with d hemin are shown. Scale bars, 5 ^ m. *** p <0.001 according to ANOVA followed by Tukey's multiple amplitude test.

Figura 8. La inhibición farmacológica de caspasa-1 libera modelos de pez cebra de inflamación neutrófila y anemia. (a-e) A larvas de tipo natural y mutantes spint1a se les retiró manualmente el corion y se trataron desde 1-3 dpf con el inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (C1INH, 100 ^M). Se determinaron entonces la actividad de caspasa-1 (a), la razón de expresión génica spi1b/gata1a (b), la dispersión de neutrófilos (c) y el número de neutrófilos (d, e). Cada punto representa el número de neutrófilos de una única larva, mientras que también se muestra la media ± EEM para cada grupo. Se muestran imágenes representativas de canales verdes de larvas completas para los diferentes tratamientos (e). Barra de escala, 500 ^m. (f-h) Se inyectaron embriones unicelulares de pez cebra con control convencional (Std) o MO de Gata1a, se les retiró manualmente el corion a 24 hpf y se trataron mediante inmersión con DMSO o el inhibidor de caspasa-1 reversible Ac-YVAD-CHO (C1INH) durante 24-48 hpf. Entonces se eliminó el inhibidor por lavado y se incubaron las larvas hasta 72 hpf. Imágenes representativas de larvas deficientes en Gata1a con anemia leve, moderada y grave (f), cuantificación del fenotipo de larvas tratadas con DMSO o C1INH (g) e inmunotransferencia de extractos larvarios con anticuerpos anti-Gata1a, anti-Spi1b y anti-Actb. (a, b) n=4; (c) n=35, 35, 27 y 22. (d) n=29, 28, 19 y 17. (g) n=116 y 96. ns, no significativo; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 según ANOVA seguido por prueba múltiple de amplitud de Tukey (a-d) y prueba exacta de Fisher (g). Figure 8. Pharmacological inhibition of caspase-1 releases zebrafish models of neutrophilic inflammation and anemia . (ae) Wild-type and spint1a mutant larvae were manually removed the chorion and treated from 1-3 dpf with the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK (C1INH, 100 µM). The caspase-1 activity (a), the spi1b / gata1a gene expression ratio (b), the neutrophil spread (c) and the number of neutrophils (d, e) were then determined. Each point represents the number of neutrophils of a single larva, while the mean ± SEM for each group is also shown. Representative images of green channels of complete larvae are shown for the different treatments (e). Scale bar, 500 ^ m. (fh) Zebrafish unicellular embryos were injected with conventional control (Std) or Gata1a MO, the chorion was manually removed at 24 hpf and treated by immersion with DMSO or the reversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CHO (C1INH) for 24-48 hpf. The inhibitor was then removed by washing and the larvae were incubated up to 72 hpf. Representative images of Gata1a deficient larvae with mild, moderate and severe anemia (f), quantification of the phenotype of larvae treated with DMSO or C1INH (g) and immunoblotting of larval extracts with anti-Gata1a, anti-Spi1b and anti-Actb antibodies. (a, b) n = 4; (c) n = 35, 35, 27 and 22. (d) n = 29, 28, 19 and 17. (g) n = 116 and 96. ns, not significant; * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001 according to ANOVA followed by Tukey's multiple amplitude test (ad) and Fisher's exact test (g).

Figura 9. La inhibición farmacológica de caspasa-1 libera de anemia a ratones tratados con 5-FU. (a) Diseño experimental. Se inyectaron los ratones por vía i.p. con 5-FU en el día 0 y luego con 10 mg/kg del inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (C1INH) en PBS con DMSO al 10% o vehículo sólo en los días 6, 7, 10 y 12. Se recogió sangre a los -1, 6, 10 y 14 d tras la inyección de 5-FU (fuente en rojo) y se analizó en un analizador de hematología ProCyte Dx. (b-f). Se muestran los recuentos de eritrocitos (b), hemoglobina (c), hematocrito (d), plaquetas (e) y glóbulos blancos (f) como la media ± EEM (n=13). *p<0,05 según ANOVA de 2 factores seguido por prueba múltiple de amplitud de Bonferroni. Figure 9. Pharmacological inhibition of caspase-1 frees 5-FU treated mice from anemia . (a) Experimental design. Mice were injected ip with 5-FU on day 0 and then with 10 mg / kg of the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK (C1INH) in PBS with 10% DMSO or vehicle only on days 6, 7, 10, and 12. Blood was collected at -1, 6, 10, and 14 d after 5-FU injection (red source) and analyzed on a ProCyte Dx hematology analyzer. (bf). Erythrocyte (b), hemoglobin (c), hematocrit (d), platelet (e), and white blood cell (f) counts are shown as the mean ± SEM (n = 13). * p <0.05 according to 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple amplitude test.

Figura 10. Modelo propuesto que ilustra la regulación de decisión eritroide/mieloide y diferenciación eritroide terminal por el inflamasoma. (a) En condiciones de homeostasis, la activación del inflamasoma favorece la diferenciación mieloide de CMP promoviendo la escisión de GATA1. Sin embargo, el inflamasoma también se activa durante la diferenciación eritroide terminal para inactivar GATA1. (b) En enfermedades inflamatorias crónicas, la activación de inflamasomas excesiva en CMP da como resultado una degradación desproporcionada de GATA1, que da como resultado sesgo mieloide; es decir, neutrofilia y anemia (ACD). (c) La inhibición farmacológica de caspasa-1 en inflamación crónica restablece una diferenciación mieloide/eritroide normal, reduciendo la neutrofilia y mejorando la anemia. CMP, progenitores mieloides comunes; GMP, progenitores granulocíticos-monocíticos; MEP, progenitores de megacariocitos-eritrocitos; N, neutrófilos, M, monocitos/macrófagos; E, eritrocitos. Figure 10. Proposed model illustrating erythroid / myeloid decision regulation and terminal erythroid differentiation by the inflammasome . (a) Under conditions of homeostasis, the activation of the inflammasome favors the myeloid differentiation of CMP by promoting the cleavage of GATA1. However, the inflammasome is also activated during terminal erythroid differentiation to inactivate GATA1. (b) In chronic inflammatory diseases, excessive inflammasome activation in CMP results in disproportionate degradation of GATA1, resulting in myeloid bias; that is, neutrophilia and anemia (ACD). (c) Pharmacological inhibition of caspase-1 in chronic inflammation restores normal myeloid / erythroid differentiation, reducing neutrophilia and improving anemia. CMP, common myeloid progenitors; GMP, granulocytic-monocytic progenitors; MEP, megakaryocyte-erythrocyte progenitors; N, neutrophils, M, monocytes / macrophages; E, erythrocytes.

Figura 11. La inhibición de inflamasomas disminuyó el número de macrófagos en larvas de pez cebra. Se inyectaron embriones unicelulares de pez cebra Tg(mpeg:eGFP) con control convencional (Std), Asc o MO de Gbp4 (a, b), o con ARNm antisentido (As), Asc o/y Caspa (e-f). Alternativamente, a los embriones Tg(mpeg:eGFP) se les retiró manualmente el corion a 48 hpf y se trataron mediante inmersión con DMSO o el inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (C1INH) (c, d). Cada punto representa el número de macrófagos de una única larva, mientras que también se muestra la media ± EEM para cada grupo (a, c, e). El tamaño de muestra (n) se indica para cada tratamiento. También se muestran imágenes representativas de canales verdes de larvas completas para los diferentes tratamientos. Barras de escala, 500 ^m. Se determinó la actividad de caspasa-1 en larvas completas para cada tratamiento a 72 hpf (n=30) (b, d, f). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 según ANOVA seguido por prueba múltiple de amplitud de Tukey. Figure 11. Inhibition of inflammasomes decreased the number of macrophages in zebrafish larvae. Unicellular Tg zebrafish embryos (mpeg: eGFP) were injected with conventional control (Std), Asc or MO of Gbp4 (a, b), or with antisense mRNA (As), Asc or / and Caspa (ef). Alternatively, Tg (mpeg: eGFP) embryos were manually removed the chorion at 48 hpf and treated by immersion with DMSO or the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK (C1INH) (c, d). Each point represents the number of macrophages in a single larva, while the mean ± SEM for each group (a, c, e) is also shown. The sample size (n) is indicated for each treatment. Representative images of green carcasses of complete larvae are also shown for the different treatments. Scale bars, 500 ^ m. Caspase-1 activity was determined in whole larvae for each treatment at 72 hpf (n = 30) (b, d, f). * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001 according to ANOVA followed by Tukey's multiple amplitude test.

Figura 12. La inhibición de inflamasomas disminuye el número de neutrófilos en larvas de pez cebra. Se inyectaron embriones unicelulares de pez cebra Tg(lyz:dsRED) con control convencional (Std), Asc o MO de Gbp4 (a, b). Alternativamente, a larvas Tg(lyz:dsRED) se les retiró manualmente el corion a 48 hpf y se trataron mediante inmersión con DMSO o el inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (C1INH) (c, d). Cada punto representa el número de neutrófilos de una única larva, mientras que también se muestra la media ± EEM para cada grupo. El tamaño de muestra (n) se indica para cada tratamiento. También se muestran imágenes representativas de canales rojos de larvas completas para los diferentes tratamientos (a, b). Barras de escala, 500 ^m. Se determinó la actividad de caspasa-1 en larvas completas para cada tratamiento a 72 hpf (n=30). (b, d). *p<0,05; ***p<0,001 según ANOVA seguido por prueba múltiple de amplitud de Tukey. Figure 12. Inhibition of inflammasomes decreases the number of neutrophils in zebrafish larvae. Unicellular zebrafish Tg (lyz: dsRED) embryos were injected with Gbp4 (a, b) conventional control (Std), Asc or MO. Alternatively, Tg (lyz: dsRED) larvae were manually removed the chorion at 48 hpf and treated by immersion with DMSO or the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK (C1INH) (c, d). Each point represents the number of neutrophils of a single larva, while the mean ± SEM for each group is also shown. The sample size (n) is indicated for each treatment. Representative images of complete larval red carcasses are also shown for the different treatments (a, b). Scale bars, 500 ^ m. Caspase-1 activity was determined in whole larvae for each treatment at 72 hpf (n = 30). (b, d). * p <0.05; *** p <0.001 according to ANOVA followed by Tukey's multiple amplitude test.

Figura 13. La actividad de inflamasomas regula los niveles de expresión de gata1 en larvas de pez cebra. Se inyectaron embriones unicelulares de pez cebra Casper con control convencional (Std), Asc o MO de Gbp4. En los tiempos indicados, se realizó hibridación in situ de montaje completo (WISH) usando sondas antisentido a los genes gata1a, spi1b, gcsfr, cmyb, runx1 y rag1. Los números en los dibujos representan los animales con el fenotipo mostrado por animales analizados totales. Barra de escala: 500 ^m. Figure 13. Inflammasome activity regulates gata1 expression levels in zebrafish larvae. Unicellular Casper zebrafish embryos were injected with Gbp4 standard control (Std), Asc or MO. At the indicated times, full-length in situ hybridization (WISH) was performed using antisense probes to the gata1a, spi1b, gcsfr, cmyb, runx1 and rag1 genes. The numbers in the drawings represent the animals with the phenotype shown by total tested animals. Scale bar: 500 ^ m.

Figura 14. La expresión de genes que codifican para componentes de inflamasoma claves están estrechamente regulados en células progenitoras y hematopoyéticas humanas. Niveles relativos de expresión de GATA1, CASP1, PYCARD, NLRC4, NLRP3, NLRP1, GBP5, e IL1B en células madre hematopoyéticas humanas (HSC), progenitor multipotente cebado linfoide (LMPP), progenitores mieloides comunes (CMP), progenitores megacariocíticos-eritroides (MEP) y progenitores granulocíticosmonocíticos (GMP) según los datos GSE63270 expuestos de la base de datos GEO. Cada punto representa la expresión génica de un donante, mientras que también se muestra la media ± EEM para cada grupo (n=7). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; según ANOVA seguido por prueba múltiple de amplitud de Tukey. Figure 14. The expression of genes encoding key inflammasome components are tightly regulated in human hematopoietic and progenitor cells. Relative Expression Levels of GATA1, CASP1, PYCARD, NLRC4, NLRP3, NLRP1, GBP5, and IL1B in Human Hematopoietic Stem Cells (HSC), Lymphoid Primed Multipotent Progenitor (LMPP), Common Myeloid Progenitors (CMP), megakaryocytic-erythroid progenitors (MEP) and monocytic granulocytic progenitors (GMP) according to the exposed GSE63270 data from the GEO database. Each point represents the gene expression of a donor, while the mean ± SEM for each group (n = 7) is also shown. * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001; according to ANOVA followed by Tukey's multiple amplitude test.

Figura 15. La expresión de genes que codifican para componentes de inflamasoma está regulada durante la diferenciación eritroide de células K562. Se incubaron células K562 con hemina durante 48 h y luego se determinaron los niveles de ARNm de los genes NLRC4, NLRP3, PYCARD y CASP1 mediante RT-qPCR (n=3). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 según ANOVA seguido por prueba múltiple de amplitud de Tukey. Figure 15. The expression of genes encoding inflammasome components is regulated during erythroid differentiation of K562 cells. K562 cells were incubated with hemin for 48 h and then the mRNA levels of the NLRC4, NLRP3, PYCARD and CASP1 genes were determined by RT-qPCR (n = 3). * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001 according to ANOVA followed by Tukey's multiple amplitude test.

Figura 16. La caspasa-1 escinde GATA1 humana in vitro en residuo D300. (a) Esquema de GATA1 humana que muestra los dominios de dedos de zinc y residuos D276 y D300. (b-d) Se transfectaron células HEK293T con plásmidos de expresión FLAG-vacío o FLAG-GATA1 (b, c) y vacío-FLAG, GATA1-FLAG de tipo natural (WT), GATA1 -FLAG(D276A), GATA1 -FLAG(D300A) o GATA1 -FLAG(D276A/D300A) (DM) (d). Veinticuatro horas después de la transfección, se sacó GATA1 de los extractos celulares con gel de afinidad M2 anti-FLAG y se trató o no durante 2 h a 37°C con 10 UI de caspasa-1 recombinante humana. Se resolvieron GATA1 de longitud completa y los fragmentos proteolíticos generados en SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia con anti-FLAG para visualizar anti-GATAI de longitud completa y N-terminal (b, d) y (C-terminal). Figure 16. Caspase-1 cleaves human GATA1 in vitro at residue D300. (a) Schematic of human GATA1 showing zinc finger domains and residues D276 and D300. (bd) HEK293T cells were transfected with FLAG-void or FLAG-GATA1 (b, c) and void-FLAG expression plasmids, wild-type GATA1-FLAG (WT), GATA1 -FLAG (D276A), GATA1 -FLAG (D300A ) or GATA1 -FLAG (D276A / D300A) (DM) (d). Twenty-four hours after transfection, GATA1 was extracted from the cell extracts with M2 anti-FLAG affinity gel and treated or not for 2 h at 37 ° C with 10 IU of human recombinant caspase-1. Full-length GATA1 and proteolytic fragments generated on SDS-PAGE were resolved and immunoblotted with anti-FLAG to visualize N-terminal (b, d) and (C-terminal) full-length anti-GATAI.

Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

DefinicionesDefinitions

Para facilitar la revisión de los diversos ejemplos de esta divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:To facilitate review of the various examples of this disclosure, the following explanations of specific terms are provided:

El término “acilo” se refiere al grupo de fórmula RC(O)— en la que R es un grupo orgánico. The term "acyl" refers to the group of formula RC (O) - where R is an organic group.

“Administración de” y "administrar un” compuesto debe entenderse que significa proporcionar un compuesto, un profármaco de un compuesto, o una composición farmacéutica tal como se describe en el presente documento. El compuesto o la composición pueden administrarse por otra persona al sujeto (por ejemplo, por vía intravenosa) o puede autoadministrarse por el sujeto (por ejemplo, comprimidos)."Administration of" and "administering" a compound should be understood to mean providing a compound, a prodrug of a compound, or a pharmaceutical composition as described herein. The compound or composition may be administered by another person to the subject ( eg intravenously) or can be self-administered by the subject (eg tablets).

El término “alcoxilo” se refiere a un grupo de fórmula —OR, en la que R es un grupo orgánico tal como un grupo alquilo, opcionalmente sustituido con un grupo alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, cicloalquilo, alquilo halogenado o heterocicloalquilo. Los grupos alcoxilo adecuados incluyen metoxilo, etoxilo, n-propoxilo, i-propoxilo, nbutoxilo, i-butoxilo, sec-butoxilo, terc-butoxiciclopropoxilo, ciclohexiloxilo, y similares.The term "alkoxy" refers to a group of the formula —OR, where R is an organic group such as an alkyl group, optionally substituted with an alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, cycloalkyl, halogenated alkyl, or heterocycloalkyl group. Suitable alkoxy groups include methoxy, ethoxy, n-propoxy, i-propoxy, n-butoxy, i-butoxy, sec-butoxy, tert-butoxycyclopropoxy, cyclohexyloxy, and the like.

El término “alquilo” se refiere a un grupo hidrocarburo saturado ramificado o no ramificado de 1 a 24 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, decilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetracosilo y similares. Un grupo “alquilo inferior” es un hidrocarburo ramificado o no ramificado saturado que tiene desde 1 hasta 10 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden ser alquilos sustituidos en los que uno o más átomos de hidrógeno se sustituyen con un sustituyente tal como halógeno, cicloalquilo, alcoxilo, amino, hidroxilo, arilo o carboxilo.The term "alkyl" refers to a branched or unbranched saturated hydrocarbon group of 1 to 24 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, decyl, tetradecyl, hexadecyl, eicosyl, tetracosyl, and the like. A "lower alkyl" group is a saturated branched or unbranched hydrocarbon having from 1 to 10 carbon atoms. The alkyl groups can be substituted alkyls in which one or more hydrogen atoms are substituted with a substituent such as halogen, cycloalkyl, alkoxy, amino, hydroxy, aryl, or carboxyl.

El término “alquilamino” se refiere a grupos alquilo tal como se definió anteriormente en los que al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza con un grupo amino.The term "alkylamino" refers to alkyl groups as defined above in which at least one hydrogen atom is replaced with an amino group.

El término “alquenilo” se refiere a un grupo hidrocarburo de 2 a 24 átomos de carbono y fórmula estructural que contiene al menos un doble enlace carbonocarbono.The term "alkenyl" refers to a hydrocarbon group of 2 to 24 carbon atoms and a structural formula containing at least one carbon-carbon double bond.

El término “alquinilo” se refiere a un grupo hidrocarburo de 2 a 24 átomos de carbono y una fórmula estructural que contiene al menos un enlace triple carbonocarbono.The term "alkynyl" refers to a hydrocarbon group of 2 to 24 carbon atoms and a structural formula containing at least one carbon-carbon triple bond.

El término “alifático” se define como que incluye grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, alquilo halogenado y cicloalquilo tal como se describió anteriormente. Un grupo “alifático inferior” es un grupo alifático ramificado o no ramificado que tiene desde 1 hasta 10 átomos de carbono. The term "aliphatic" is defined as including alkyl, alkenyl, alkynyl, halogenated alkyl, and cycloalkyl groups as described above. A "lower aliphatic" group is a branched or unbranched aliphatic group having from 1 to 10 carbon atoms.

El término "amina” o "amino” se refiere a un grupo de fórmula —NRR', en la que R y R' pueden ser, independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, cicloalquilo, alquilo halogenado o heterocicloalquilo descrito en el presente documento.The term "amine" or "amino" refers to a group of the formula —NRR ', where R and R' may independently be hydrogen or an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, cycloalkyl, halogenated alkyl group. or heterocycloalkyl described herein.

El término "grupo amida” o "grupo amido” se representa por la fórmula —C(O)NRR', en la que R y R' pueden ser independientemente un grupo hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, cicloalquilo, alquilo halogenado o heterocicloalquilo descrito en el presente documento.The term "amide group" or "amido group" is represented by the formula —C (O) NRR ', where R and R' can independently be a hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, cycloalkyl, group. halogenated alkyl or heterocycloalkyl described herein.

Un "animal” se refiere a organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoría que incluye, por ejemplo, mamíferos y aves. El término mamífero incluye tanto mamíferos humanos como no humanos. De manera similar, el término "sujeto” incluye tanto sujetos humanos como no humanos, incluyendo aves y mamíferos no humanos, tales como primates no humanos, animales de compañía (tales como perros y gatos), ganado (tal como cerdos, ovejas, vacas), así como animales no domesticados, tales como los grandes felinos. El término sujeto se aplica independientemente de la fase en el ciclo de vida del organismo. Por tanto, el término sujeto se aplica a un organismo en el útero o en ovo, según el organismo (es decir, ya sea el organismo un mamífero o un ave, tal como un ave de corral domesticada o salvaje).An "animal" refers to living multicellular vertebrate organisms, a category that includes, for example, mammals and birds. The term mammal includes both human and non-human mammals. Similarly, the term "subject" includes both human and non-human subjects. humans, including birds and non-human mammals, such as non-human primates, companion animals (such as dogs and cats), livestock (such as pigs, sheep, cows), as well as non-domesticated animals, such as big cats. The term subject applies regardless of the phase in the life cycle of the organism. Thus, the term subject is applied to an organism in utero or in ovo, depending on the organism (ie, whether the organism is a mammal or a bird, such as a domesticated or wild poultry).

El término "arilo” se refiere a cualquier grupo aromático a base de carbono que incluye, pero no se limita a, benceno, naftaleno, etc. El término "aromático” también incluye "grupo heteroarilo”, que se define como un grupo aromático que tiene al menos un heteroátomo incorporado dentro del anillo del grupo aromático. Los ejemplos de heteroátomos incluyen, pero no se limitan a, nitrógeno, oxígeno, azufre, y fósforo. El grupo arilo puede sustituirse opcionalmente con uno o más grupos que incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquinilo, alquenilo, arilo, haluro, nitro, amino, éster, cetona, aldehído, hidroxilo, ácido carboxílico, o alcoxilo, o el grupo arilo puede ser no sustituido.The term "aryl" refers to any carbon-based aromatic group including, but not limited to, benzene, naphthalene, etc. The term "aromatic" also includes "heteroaryl group", which is defined as an aromatic group that has at least one heteroatom incorporated within the ring of the aromatic group. Examples of heteroatoms include, but are not limited to, nitrogen, oxygen, sulfur, and phosphorus. The aryl group may optionally be substituted with one or more groups including, but not limited to are limited to, alkyl, alkynyl, alkenyl, aryl, halide, nitro, amino, ester, ketone, aldehyde, hydroxyl, carboxylic acid, or alkoxy, or the aryl group may be unsubstituted.

"Carbonilo” se refiere a un radical de fórmula —C(O)—. Los grupos que contienen carbonilo incluyen cualquier sustituyente que contiene un doble enlace carbonooxígeno (C=O), que incluye grupos acilo, amidas, grupos carboxilo, ésteres, ureas, carbamatos, carbonatos y cetonas y aldehidos, tales como sustituyentes basados en —COR o —RCHO en donde R es un alquilo, heteroalquilo, hidroxilo alifático, heteroalifático, o una amina secundaria, terciaria o cuaternaria."Carbonyl" refers to a radical of formula —C (O) -. Carbonyl-containing groups include any substituent containing a carbon-oxygen (C = O) double bond, including acyl groups, amides, carboxyl groups, esters, ureas , carbamates, carbonates and ketones and aldehydes, such as substituents based on —COR or —RCHO where R is an aliphatic, heteroaliphatic, alkyl, heteroalkyl, hydroxyl, or a secondary, tertiary, or quaternary amine.

Un "resto carboxilo” se refiere a cualquier resto o grupo que incluye —C(O)O—. Los restos carboxilo ilustrativos incluyen ácido carboxílico (—C(O)OH); un éster de carboxilato (—C(O)OR) en donde R es un grupo alifático o heteroalifático); una sal de carboxilato (—C(O)OM) en donde M es un catión tal como Li, Na o K.A "carboxyl moiety" refers to any moiety or group that includes —C (O) O—. Illustrative carboxyl moieties include carboxylic acid (—C (O) OH); a carboxylate ester (—C (O) OR) where R is an aliphatic or heteroaliphatic group), a carboxylate salt (—C (O) OM) where M is a cation such as Li, Na or K.

El término "coadministración” o "que se coadministra” se refiere a la administración del compuesto dado a conocer en el presente documento con al menos otro agente terapéutico dentro del mismo periodo de tiempo general, y no requiere administración en el mismo momento de tiempo (aunque coadministración incluye administrar en el mismo momento de tiempo). Por tanto, la coadministración puede ser en el mismo día o en días diferentes, o en la misma semana o en diferentes semanas.The term "co-administration" or "co-administered" refers to the administration of the compound disclosed herein with at least one other therapeutic agent within the same general time period, and does not require administration at the same point in time ( although co-administration includes administering at the same point in time). Thus, co-administration can be on the same day or on different days, or on the same week or on different weeks.

Un "enlace covalente” se refiere a un enlace interatómico entre dos átomos, caracterizado por compartir uno o más pares de electrones por los átomos. Los términos "unido de manera covalente” o "vinculado de manera covalente” se refieren a convertir dos moléculas diferenciadas en una molécula contigua.A "covalent bond" refers to an interatomic bond between two atoms, characterized by the sharing of one or more pairs of electrons by the atoms. The terms "covalently linked" or "covalently linked" refer to converting two distinct molecules in a contiguous molecule.

El término "cicloalquilo” se refiere a un anillo a base de carbono no aromático que se compone de al menos tres átomos de carbono. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y similares. El término "grupo heterocicloalquilo” es un grupo cicloalquilo tal como se definió anteriormente en el que al menos uno de los átomos de carbono del anillo se sustituye con un heteroátomo tal como, pero sin limitarse a, nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo.The term "cycloalkyl" refers to a non-aromatic carbon-based ring that is composed of at least three carbon atoms. Examples of cycloalkyl groups include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, and the like. The term "heterocycloalkyl group" is a cycloalkyl group as defined above in which at least one of the ring carbon atoms is substituted with a heteroatom such as, but not limited to, nitrogen, oxygen, sulfur or phosphorus.

Los términos "alquilo halogenado” o "grupo haloalquilo” se refieren a un grupo alquilo tal como se definió anteriormente con uno o más átomos de hidrógeno presentes en estos grupos sustituidos con un halógeno (F, Cl, Br, I).The terms "halogenated alkyl" or "haloalkyl group" refer to an alkyl group as defined above with one or more hydrogen atoms present in these groups substituted with a halogen (F, Cl, Br, I).

El término "heteroarilo” se refiere a un sistema de anillo o radical, mono o policíclico (por ejemplo, bi o tricíclico, o más), condensado o no condensado que tiene al menos un anillo aromático, que tiene desde cinco hasta diez átomos de anillo de los cuales un átomo de anillo se selecciona de S, O y N; cero, uno o dos átomos de anillo son heteroátomos adicionales independientemente seleccionados de S, O y N; y los átomos de anillo restantes son carbono. Un heteroarilo incluye, pero no se limita a, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzooxazolilo, quinoxalinilo, y similares.The term "heteroaryl" refers to a mono or polycyclic (eg, bi or tricyclic, or more), fused or non-fused ring or radical system having at minus one aromatic ring, having from five to ten ring atoms of which one ring atom is selected from S, O, and N; zero, one, or two ring atoms are additional heteroatoms independently selected from S, O, and N; and the remaining ring atoms are carbon. A heteroaryl includes, but is not limited to, pyridinyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyrrolyl, pyrazolyl, imidazolyl, thiazolyl, oxazolyl, isooxazolyl, thiadiazolyl, oxadiazolyl, thiophenyl, furanyl, quinolinyl, isoquinolinyl, benzimidazolyl, benzooxazolyl, and the like.

El término "heteroaralquilo” se refiere a un residuo de alquilo unido a un anillo de heteroarilo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, piridinilmetilo, pirimidiniletilo y similares.The term "heteroaralkyl" refers to an alkyl residue attached to a heteroaryl ring. Examples include, but are not limited to, pyridinylmethyl, pyrimidinylethyl, and the like.

El término "heterocicloalquilo” se refiere un anillo de 3, 4, 5, 6 ó 7 miembros no aromático o un sistema condensado o no condensado de grupo bi o tricíclico, en donde (i) cada anillo contiene entre uno y tres heteroátomos seleccionados independientemente de oxígeno, azufre y nitrógeno, (ii) cada anillo de 5 miembros tiene de 0 a 1 dobles enlaces y cada anillo de 6 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces, (iii) los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente, (iv) el heteroátomo de nitrógeno puede cuaternizarse opcionalmente, y (iv) cualquiera de los anillos anteriores pueden condensarse con un anillo de benceno. Los grupos heterocicloalquilo representativos incluyen, pero no se limitan a, [1,3]dioxolano, pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo y tetrahidrofurilo.The term "heterocycloalkyl" refers to a 3, 4, 5, 6 or 7 membered non-aromatic ring or a fused or unfused bi- or tricyclic group system, wherein (i) each ring contains between one and three independently selected heteroatoms oxygen, sulfur and nitrogen, (ii) each 5-membered ring has 0 to 1 double bonds and each 6-membered ring has 0 to 2 double bonds, (iii) nitrogen and sulfur heteroatoms can optionally be oxidized, ( iv) the nitrogen heteroatom can optionally be quaternized, and (iv) any of the above rings can be fused to a benzene ring Representative heterocycloalkyl groups include, but are not limited to, [1,3] dioxolane, pyrrolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolidinyl, imidazolinyl, imidazolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, oxazolidinyl, isoxazolidinyl, morpholinyl, thiazolidinyl, isothiazolidinyl, and tetrahydrofuryl.

El término "hidroxilo” se representa por la fórmula —OH.The term "hydroxyl" is represented by the formula —OH.

El término "hidroxialquilo” se refiere a un grupo alquilo que tiene al menos un átomo de hidrógeno sustituido con un grupo hidroxilo. El término "grupo alcoxialquilo” se define como un grupo alquilo que tiene al menos un átomo de hidrógeno sustituido con un grupo alcoxilo descrito anteriormente.The term "hydroxyalkyl" refers to an alkyl group having at least one hydrogen atom substituted with a hydroxyl group. The term "alkoxyalkyl group" is defined as an alkyl group having at least one hydrogen atom substituted with an alkoxy group. previously described.

"Inhibir” se refiere a inhibir el desarrollo completo de una enfermedad o estado. "Inhibir” también se refiere a cualquier reducción cuantitativa o cualitativa en unión o actividad biológica, en relación con un control. "Inhibit" refers to inhibiting the full development of a disease or condition. "Inhibit" also refers to any quantitative or qualitative reduction in binding or biological activity, relative to a control.

Un “mimético” se refiere a una entidad química que contiene elementos estructurales que pueden imitar la acción bioquímica o biológica de otra entidad química. Por ejemplo, en un peptidomimético la disposición tridimensional de los constituyentes químicos de tal peptidomimético imita la disposición tridimensional de la estructura principal peptídica y cadenas laterales de aminoácidos componentes de otro péptido dando como resultado un agente que es específico y/o selectivo para la inhibición de caspasa diana.A "mimetic" refers to a chemical entity that contains structural elements that can mimic the biochemical or biological action of another chemical entity. For example, in a peptidomimetic the three-dimensional arrangement of the chemical constituents of such a peptidomimetic mimics the three-dimensional arrangement of the peptide backbone and component amino acid side chains of another peptide resulting in an agent that is specific and / or selective for the inhibition of target caspase.

Un “péptido” se refiere a residuos de aminoácido que se unen juntos a través de enlaces de amida. Cuando los aminoácidos son alfa-aminoácidos, puede usarse o bien el isómero óptico L o bien el isómero óptico D. El término “péptido” se pretende específicamente que cubra aminoácidos que se producen de manera natural, así como aquellos que se producen de manera recombinante o sintética. El término “residuo” o “residuo de aminoácido” incluye la referencia a un aminoácido natural, recombinante o sintético que puede incorporarse en una proteína, polipéptido o péptido. Los péptidos pueden modificarse por una variedad de técnicas químicas para producir peptidomiméticos que tienen esencialmente la misma actividad que los péptidos no modificados, y que tienen opcionalmente otras propiedades deseables. Por ejemplo, pueden proporcionarse grupos ácido carboxílico del péptido, ya sean de cadena lateral o de extremo carboxilo, en forma de una sal de un catión farmacéuticamente aceptable o esterificarse para formar un éster C1-C16, o convertirse en una amida de fórmula NR1R2 en la que R1 y R2 son cada uno independientemente H o alquilo C1-C16, o combinarse para formar un anillo heterocíclico, tal como un anillo de 5 ó 6 miembros. Los grupos amino del péptido, ya sean de cadena lateral o de extremo amino, pueden estar en forma de una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable, tal como las sales de ácido HCl, ácido HBr, ácido acético, ácido benzoico, ácido toluenosulfónico, ácido maleico, ácido tartárico y otras sales orgánicas, o pueden modificarse a dialquilamino o alquilo C1-C16 o convertirse adicionalmente en una amida. Los grupos hidroxilo de las cadenas laterales peptídicas pueden convertirse en alcoxilo C1-C16 o en un éster C1-C16 usando técnicas bien reconocidas. Los anillos de fenilo y fenólicos de las cadenas laterales peptídicas pueden sustituirse con uno o más átomos de halógeno, tales como flúor, cloro, bromo o yodo, o con alquilo C1-C16, alcoxilo C1-C16, ácidos carboxílicos y ésteres de los mismos, o amidas de tales ácidos carboxílicos. Los grupos metileno de las cadenas laterales peptídicas pueden prolongarse a alquílenos C2-C4 homólogos. Los tioles pueden protegerse con uno cualquiera de varios grupos protectores bien reconocidos, tales como grupos acetamida. Otras modificaciones peptídicas incluyen adición y/o deleción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácido en la cadena peptídica, y/o reemplazo de uno o más de los enlaces amida por un enlace no amida, y/o reemplazo de una o más cadenas laterales de aminoácidos por un resto químico diferente, y/o protección del extremo N-terminal, el extremo C-terminal, o una o más de las cadenas laterales por un grupo protector, y/o introducción de dobles enlaces y/o ciclación y/o estereoespecificidad en la cadena de aminoácidos para aumentar la rigidez, y/o afinidad de unión y/o potenciar la resistencia a la degradación enzimática de los péptidos.A "peptide" refers to amino acid residues that are linked together through amide bonds. When the amino acids are alpha-amino acids, either the L optical isomer or the D optical isomer can be used. The term "peptide" is specifically intended to cover naturally occurring amino acids as well as those that occur recombinantly. or synthetic. The term "residue" or "amino acid residue" includes reference to a natural, recombinant, or synthetic amino acid that can be incorporated into a protein, polypeptide, or peptide. Peptides can be modified by a variety of chemical techniques to produce peptidomimetics that have essentially the same activity as unmodified peptides, and optionally have other desirable properties. For example, carboxylic acid groups of the peptide, either side chain or carboxyl terminus, can be provided in the form of a salt of a pharmaceutically acceptable cation or esterified to form a C1-C16 ester, or converted to an amide of formula NR1R2 in where R1 and R2 are each independently H or C1-C16 alkyl, or combine to form a heterocyclic ring, such as a 5- or 6-membered ring. The amino groups of the peptide, whether side chain or amino terminal, can be in the form of a pharmaceutically acceptable acid addition salt, such as the salts of HCl acid, HBr acid, acetic acid, benzoic acid, toluenesulfonic acid, Maleic acid, tartaric acid and other organic salts, or they can be modified to dialkylamino or C1-C16 alkyl or further converted to an amide. Hydroxyl groups on peptide side chains can be converted to C1-C16 alkoxy or C1-C16 ester using well recognized techniques. The phenyl and phenolic rings of the peptide side chains can be substituted with one or more halogen atoms, such as fluorine, chlorine, bromine or iodine, or with C1-C16 alkyl, C1-C16 alkoxy, carboxylic acids, and esters thereof. , or amides of such carboxylic acids. The Methylene groups on peptide side chains can be extended to homologous C2-C4 alkylenes. Thiols can be protected with any one of a number of well recognized protecting groups, such as acetamide groups. Other peptide modifications include addition and / or deletion and / or substitution of one or more amino acid residues in the peptide chain, and / or replacement of one or more of the amide bonds with a non-amide bond, and / or replacement of one or more more amino acid side chains by a different chemical residue, and / or protection of the N-terminal end, the C-terminal end, or one or more of the side chains by a protective group, and / or introduction of double bonds and / or cyclization and / or stereospecificity in the amino acid chain to increase the rigidity, and / or binding affinity and / or enhance the resistance to enzymatic degradation of the peptides.

Un “polipéptido” es un polímero en el que los monómeros son residuos de aminoácido que se unen juntos a través de enlaces de amida.A "polypeptide" is a polymer in which the monomers are amino acid residues that are linked together through amide bonds.

El término “sal o éster farmacéuticamente aceptable” se refiere a sales o ésteres preparados mediante medios convencionales que incluyen sales básicas de ácidos inorgánicos y orgánicos, que incluyen pero sin limitarse a, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido málico, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido salicílico, ácido benzoico, ácido fenilacético, ácido mandélico y similares. Las “sales farmacéuticamente aceptables” de los compuestos dados a conocer por la presente también incluyen aquellos formados a partir de cationes tales como sodio, potasio, aluminio, calcio, litio, magnesio, zinc, y de bases tales como amoníaco, etilenodiamina, N-metil-glutamina, lisina, arginina, ornitina, colina, N,N-dibenciletilenodiamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, N-bencilfenetilamina, dietilamina, piperazina, tris(hidroximetil)aminometano e hidróxido de tetrabutilamonio. Estas sales pueden preparase mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, haciendo reaccionar el ácido libre con una base orgánica o inorgánica adecuada. Cualquier compuesto químico indicado en esta memoria descriptiva puede administrarse alternativamente como una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Las “sales farmacéuticamente aceptables” también incluyen las formas de ácido libre, base y zwitteriónicas. Pueden encontrarse descripciones de sales farmacéuticamente aceptables adecuadas en Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use, Wiley VCH (2002). Cuando los compuestos dados a conocer en el presente documento incluyen una función ácida tal como un grupo carboxilo, entonces se conocen bien por los expertos en la técnica pares de cationes farmacéuticamente aceptables adecuados para el grupo carboxilo e incluyen cationes alcalinos, alcalinotérreos, de amonio, de amonio cuaternario y similares. Tales sales las conocen los expertos en la técnica. Para ejemplos adicionales de "sales farmacológicamente aceptables”, véase Berge et al., J. Pharm. Sci. 66:1 (1977). Los "ésteres farmacéuticamente aceptables” incluyen aquellos derivados de compuestos descritos en el presente documento que se modifican para incluir un grupo hidroxilo o carboxilo. Un éster hidrolizable in vivo es un éster, que se hidroliza en el cuerpo humano o animal para producir el ácido o alcohol original. Los ésteres farmacéuticamente aceptables adecuados para carboxilo incluyen ésteres de alcoximetilo C1-6 por ejemplo metoxi-metilo, ésteres de alcanoiloximetilo C1-6 por ejemplo pivaloiloximetilo, ésteres de ftalidilo, ésteres de alquilo C1-6 cicloalcoxicarboniloxilo C3-8 por ejemplo 1-ciclohexilcarbonil-oxietilo; ésteres de 1,3-dioxolen-2-onilmetilo por ejemplo 5-metil-1,3-dioxolen-2-onilmetilo; y ésteres de alcoxicarboniloxietilo C1-6 por ejemplo 1-metoxicarbonil-oxietilo que pueden formarse en cualquier grupo carboxilo en los compuestos.The term "pharmaceutically acceptable salt or ester" refers to salts or esters prepared by conventional means that include basic salts of inorganic and organic acids, including but not limited to, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid. , ethanesulfonic acid, malic acid, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, citric acid, lactic acid, fumaric acid, succinic acid, maleic acid, salicylic acid, benzoic acid, phenylacetic acid, mandelic acid and the like. The "pharmaceutically acceptable salts" of the compounds disclosed herein also include those formed from cations such as sodium, potassium, aluminum, calcium, lithium, magnesium, zinc, and bases such as ammonia, ethylenediamine, N- methyl glutamine, lysine, arginine, ornithine, choline, N, N-dibenzylethylenediamine, chloroprocaine, diethanolamine, procaine, N-benzylphenethylamine, diethylamine, piperazine, tris (hydroxymethyl) aminomethane, and tetrabutylammonium hydroxide. These salts can be prepared by conventional procedures, for example, by reacting the free acid with a suitable organic or inorganic base. Any chemical compound indicated in this specification can alternatively be administered as a pharmaceutically acceptable salt thereof. "Pharmaceutically acceptable salts" also include the free acid, base and zwitterionic forms. May Descriptions of suitable pharmaceutically acceptable salts can be found in Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use, Wiley VCH (2002). When the compounds disclosed herein include an acidic function such as a carboxyl group, then suitable pharmaceutically acceptable cation pairs for the carboxyl group are well known to those skilled in the art and include alkali, alkaline earth, ammonium cations, quaternary ammonium and the like. Such salts are known to those skilled in the art. For additional examples of "pharmacologically acceptable salts," see Berge et al., J. Pharm. Sci. 66: 1 (1977). "Pharmaceutically acceptable esters" include those derived from compounds described herein that are modified to include a hydroxyl or carboxyl group. An in vivo hydrolyzable ester is an ester, which is hydrolyzed in the human or animal body to produce the original acid or alcohol. Suitable pharmaceutically acceptable esters for carboxyl include C 1-6 alkoxymethyl esters for example methoxy-methyl, C 1-6 alkanoyloxymethyl esters for example pivaloyloxymethyl, phthalidyl esters, C 3-8 cycloalkoxycarbonyloxy esters for example 1-cyclohexylcarbonyl- oxyethyl; 1,3-dioxolen-2-onylmethyl esters for example 5-methyl-1,3-dioxolen-2-onylmethyl; and C1-6 alkoxycarbonyloxyethyl esters for example 1-methoxycarbonyl-oxyethyl which can be formed at any carboxyl group in the compounds.

Un éster hidrolizable in vivo que contiene un grupo hidroxilo incluye ésteres inorgánicos tales como ésteres de fosfato y a -aciloxialquil éteres y compuestos relacionados que como resultado de la hidrólisis in vivo de la descomposición del éster dan el grupo hidroxilo original. Los ejemplos de a -aciloxialquil éteres incluyen acetoxi-metoxilo y 2,2-dimetilpropioniloxi-metoxilo. Una selección de grupos formadores de éster hidrolizable in vivo para hidroxilo incluyen alcanoílo, benzoílo, fenilacetilo y benzoílo y fenilacetilo sustituidos, alcoxicarbonilo (para dar ésteres de carbonato de alquilo), dialquilcarbamoílo y N-(dialquilaminoetil)-N-alquilcarbamoílo (para dar carbamatos), dialquilaminoacetilo y carboxiacetilo. Los ejemplos de sustituyentes en benzoílo incluyen morfolino y piperazina unidos desde un átomo de nitrógeno de anillo por medio de un grupo metileno hasta la posición 3 ó 4 del anillo de benzoílo. An in vivo hydrolyzable ester containing a hydroxyl group includes inorganic esters such as phosphate esters and -acyloxyalkyl ethers and related compounds which as a result of in vivo hydrolysis of the decomposition of the ester give the original hydroxyl group. Examples of α-acyloxyalkyl ethers include acetoxy-methoxy and 2,2-dimethylpropionyloxy-methoxy. A selection of in vivo hydrolyzable ester-forming groups for hydroxyl include alkanoyl, benzoyl, phenylacetyl and substituted benzoyl and phenylacetyl, alkoxycarbonyl (to give alkyl carbonate esters), dialkylcarbamoyl, and N- (dialkylaminoethyl) -N-alkylcarbamoyl (to give carbamates ), dialkylaminoacetyl and carboxyacetyl. Examples of substituents on benzoyl include morpholino and piperazine linked from a ring nitrogen atom via a methylene group to the 3- or 4-position of the benzoyl ring.

Pa 'a uso terapéutico, sales de los compuestos son aquellas en las que el contraión es farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, también pueden usarse sales de ácidos y bases que son no aceptables farmacéuticamente, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable.For therapeutic use, salts of the compounds are those in which the counter ion is pharmaceutically acceptable. However, salts of acids and bases that are not pharmaceutically acceptable can also be used, for example, in the preparation or purification of a pharmaceutically acceptable compound.

Las sales de adición de ácido y base farmacéuticamente aceptables tal como se mencionó anteriormente en el presente documento se pretende que comprendan las formas de sal de adición de ácido y base no tóxicas terapéuticamente activas que los compuestos pueden formar. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables pueden obtenerse de manera conveniente tratando la forma de base con tal ácido apropiado. Ácidos apropiados comprenden, por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como hidroácidos, por ejemplo ácido clorhídrico o bromhídrico, ácidos sulfúrico, nítrico, fosfórico y similares; o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácidos acético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico (es decir, etanodioico), malónico, succínico (es decir, ácido butanodioico), maleico, fumárico, málico (es decir, ácido hidroxibutanodioico), tartárico, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, p-toluenosulfónico, ciclámico, salicílico, p-aminosalicílico, pamoico y similares. En cambio, dichas formas de sal pueden convertirse mediante tratamiento con una base apropiada para dar la forma de base libre.The pharmaceutically acceptable acid and base addition salts as mentioned hereinbefore are intended to comprise the therapeutically active non-toxic acid and base addition salt forms that the compounds can form. The pharmaceutically acceptable acid addition salts can be conveniently obtained by treating the base form with such an appropriate acid. Appropriate acids comprise, for example, inorganic acids such as hydro acids, for example hydrochloric or hydrobromic acid, sulfuric, nitric, phosphoric acids and the like; or organic acids such as, for example, acetic, propanoic, hydroxyacetic, lactic, pyruvic, oxalic (i.e. ethanedioic), malonic, succinic (i.e., butanedioic acid), maleic, fumaric, malic (i.e. hydroxybutanedioic acid) acids ), tartaric, citric, methanesulfonic, ethanesulfonic, benzenesulfonic, p-toluenesulfonic, cyclamic, salicylic, p-aminosalicylic, pamoic, and the like. Instead, such salt forms can be converted by treatment with an appropriate base to the free base form.

Los compuestos que contienen un protón ácido también pueden convertirse en sus formas de sal de adición de amina o metálicas no tóxicas mediante tratamiento con bases orgánicas e inorgánicas apropiadas. Las formas de sal de base apropiadas comprenden, por ejemplo, las sales de amonio, las sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, por ejemplo, las sales de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, sales con bases orgánicas, por ejemplo las sales de benzatina, N-metil-D-glucamina, hidrabamina, y sales con aminoácidos tales como, por ejemplo, arginina, lisina y similares.Compounds containing an acidic proton can also be converted to their non-toxic metal or amine addition salt forms by treatment with appropriate organic and inorganic bases. Appropriate base salt forms include, for example, ammonium salts, alkali and alkaline earth metal salts, for example, lithium, sodium, potassium, magnesium, calcium salts and the like, salts with organic bases, for example the salts of benzathine, N-methyl-D-glucamine, hydrabamine, and salts with amino acids such as, for example, arginine, lysine and the like.

El término "sal de adición” tal como se usó anteriormente en el presente documento también comprende los solvatos que los compuestos descritos en el presente documento pueden formar. Tales solvatos son, por ejemplo hidratos, alcoholatos y similares. The term "addition salt" as used hereinbefore also encompasses the solvates that the compounds described herein can form. Such solvates are, for example, hydrates, alcoholates and the like.

El término "amina cuaternaria” tal como se usó antes en el presente documento define las sales de amonio cuaternario que los compuestos pueden formar mediante reacción entre un nitrógeno básico de un compuesto y un agente de cuaternización apropiado, tal como, por ejemplo, un alquilhaluro, arilhaluro o arilalquilhaluro opcionalmente sustituido, por ejemplo metilyoduro o bencilyoduro. También pueden usarse otros reactivos con buenos grupos salientes, tales como trifluorometanosulfonatos de alquilo, metanosulfonatos de alquilo y ptoluenosulfonatos de alquilo. Una amina cuaternaria tiene un nitrógeno cargado positivamente. Los contraiones farmacéuticamente aceptables incluyen cloro, bromo, yodo, trifluoroacetato y acetato. El contraión de elección puede introducirse usando resinas de intercambio iónico.The term "quaternary amine" as used hereinbefore defines the quaternary ammonium salts that compounds can form by reaction between a basic nitrogen of a compound and an appropriate quaternizing agent, such as, for example, an alkylhalide. , optionally substituted arylhalide or arylalkylhalide, for example methyliodide or benzyliodide Other reagents with good leaving groups can also be used, such as alkyl trifluoromethanesulfonates, alkyl methanesulfonates, and alkyl ptoluenesulfonates.A quaternary amine has a positively charged nitrogen. Pharmaceutically acceptable counterions. they include chlorine, bromine, iodine, trifluoroacetate and acetate The counter ion of choice can be introduced using ion exchange resins.

Se apreciará que los compuestos descritos en el presente documento pueden tener propiedades formadoras de complejos, quelantes, de unión a metales y, por tanto, pueden existir como complejos metálicos o quelatos metálicos.It will be appreciated that the compounds described herein may have complexing, chelating, metal-binding properties, and therefore may exist as metal complexes or metal chelates.

El término "profármaco” también se pretende que incluya cualquier portador unido de manera covalente que libera un compuesto dado a conocer o un compuesto original del mismo in vivo cuando el profármaco se administra a un sujeto. Dado que los profármacos tienen a menudo propiedades potenciadas relativas al agente farmacéutico activo, tales como, solubilidad y biodisponibilidad, los compuestos dados a conocer en el presente documento pueden administrarse en forma de profármaco. Por tanto, también se contemplan profármacos de los compuestos dados a conocer por la presente, métodos de administración de profármacos y composiciones que contienen tales profármacos. Los profármacos de los compuestos dados a conocer se preparan normalmente modificando uno o más grupos funcionales presentes en el compuesto de manera tal que las modificaciones se escinden, o bien en manipulación de rutina o bien in vivo, para dar el compuesto original. En particular, se contemplan específicamente profármacos de éster en el presente documento. De manera similar, los profármacos incluyen compuestos que tienen un grupo amino o sulfhidrilo funcionalizado con cualquier grupo que se escinde para dar el grupo sulfhidrilo libre o amino libre correspondiente. Los ejemplos de profármacos incluyen, sin limitación, compuestos que tienen un grupo hidroxilo, amino y/o sulfhidrilo acilado con un grupo acetato, formiato o benzoato. The term "prodrug" is also intended to include any covalently linked carrier that releases a disclosed compound or parent compound thereof in vivo when the prodrug is administered to a subject. Since prodrugs often have relative enhanced properties To the active pharmaceutical agent, such as, solubility and bioavailability, the compounds disclosed herein may be administered in prodrug form. Thus, prodrugs of the compounds disclosed herein are also contemplated, prodrug delivery methods and compositions containing such prodrugs The prodrugs of the disclosed compounds are typically prepared by modifying one or more functional groups present on the compound such that the modifications are cleaved, either on routine manipulation or in vivo , to give parent compound. In particular, prodrugs of ester herein. Similarly, prodrugs include compounds that have an amino or sulfhydryl group functionalized with any group that is cleaved to give the corresponding free sulfhydryl or free amino group. Examples of prodrugs include, without limitation, compounds having a hydroxyl, amino and / or sulfhydryl group acylated with an acetate, formate, or benzoate group.

También se contemplan derivados protegidos de los compuestos dados a conocer. El término "grupo protector” o "grupo de bloqueo” se refiere a cualquier grupo que cuando se une a un grupo funcional evita o reduce la susceptibilidad del grupo a la reacción. "Grupo protector” se refiere generalmente a grupos bien conocidos en la técnica que se usan para evitar que grupos reactivos seleccionados, tales como carboxilo, amino, hidroxilo, mercapto y similares, experimenten reacciones no deseadas, tales como oxidación, reducción, nucleófila, electrófila y similares. Los términos "que desprotege”, "desprotegido” o "desproteger”, tal como se usan en el presente documento, se pretende que se refieran al proceso de retirar un grupo protector de un compuesto.Protected derivatives of the disclosed compounds are also contemplated. The term "protecting group" or "blocking group" refers to any group that when attached to a functional group prevents or reduces the susceptibility of the group to reaction. "Protecting group" generally refers to groups well known in the art that are used to prevent selected reactive groups, such as carboxyl, amino, hydroxyl, mercapto, and the like, from undergoing unwanted reactions, such as oxidation, reduction, nucleophilic, electrophilic and the like The terms "deprotecting," "deprotected," or "deprotecting," as used herein, are intended to refer to the process of removing a protecting group from a compound.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz” o "cantidad eficaz de manera diagnóstica” se refiere a una cantidad de un agente especificado suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto que está tratándose con ese agente. De manera ideal, una cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad eficaz de manera diagnóstica de un agente es una cantidad suficiente para inhibir o tratar la enfermedad sin provocar un efecto citotóxico sustancial en el sujeto. La cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad eficaz de manera diagnóstica de un agente dependerá del sujeto que está tratándose, la gravedad de la afección y la manera de administración de la composición terapéutica.A "therapeutically effective amount" or "diagnostically effective amount" refers to an amount of a specified agent sufficient to achieve a desired effect in a subject being treated with that agent. Ideally, a therapeutically effective amount or diagnostically effective amount of an agent is an amount sufficient to inhibit or treat disease without causing a substantial cytotoxic effect in the subject. The therapeutically effective amount or diagnostically effective amount of an agent will depend on the subject being treated, the severity of the condition, and the manner of administration of the therapeutic composition.

"Tratamiento” se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o estado patológico después de que haya comenzado a desarrollarse. Tal como se usa en el presente documento, el término "mejorar”, con referencia a una enfermedad o estado patológico, se refiere a cualquier efecto beneficioso observable del tratamiento. El efecto beneficioso puede evidenciarse, por ejemplo, por una aparición retardada de los síntomas clínicos de la enfermedad en un sujeto susceptible, una reducción de la gravedad de algunos o todos los síntomas clínicos de la enfermedad, una progresión más lenta de la enfermedad, una mejora de la salud global o bienestar del sujeto, o por otros parámetros bien conocidos en la técnica que son específicos para la enfermedad particular. La expresión "tratar una enfermedad” se refiere a inhibir el desarrollo completo de una enfermedad o estado, por ejemplo, en un sujeto que corre el riesgo de padecer una enfermedad tal como cáncer, particularmente un cáncer metastásico. Un tratamiento "profiláctico” es un tratamiento administrado a un sujeto que no presenta signos de una enfermedad o presenta sólo signos tempranos con el fin de reducir el riesgo de desarrollar una patología."Treatment" refers to a therapeutic intervention that ameliorates a sign or symptom of a disease or condition after it has begun to develop. As used herein, the term "ameliorate", with reference to a disease or condition. disease state, refers to any observable beneficial effects of the treatment. The beneficial effect may be evidenced, for example, by a delayed onset of the clinical symptoms of the disease in a susceptible subject, a reduction in the severity of some or all of the clinical symptoms of the disease, a slower progression of the disease, a improvement of the overall health or well-being of the subject, or by other parameters well known in the art that are specific to the particular disease. The term "treating a disease" refers to inhibiting the full development of a disease or condition, for example, in a subject who is at risk for a disease such as cancer, particularly metastatic cancer. A "prophylactic" treatment is a treatment administered to a subject with no signs of disease or has only early signs in order to reduce the risk of developing a disease.

Los ejemplos particulares de los agentes dados a conocer por la presente incluyen uno o más centros asimétricos; por tanto estos compuestos pueden existir en diferentes formas estereoisoméricas. Por consiguiente, pueden proporcionarse compuestos y composiciones como enantiómeros puros individuales o como mezclas estereoisoméricas, incluyendo mezclas racémicas. En determinadas realizaciones, los compuestos dados a conocer en el presente documento se sintetizan en o se purifican para estar en forma sustancialmente enantiopura, tal como en un exceso enantiomérico del 90%, un exceso enantiomérico del 95%, un exceso enantiomérico del 97% o incluso en más de un exceso enantiomérico del 99%, tal como en forma enantiopura.Particular examples of the agents disclosed herein include one or more asymmetric centers; therefore these compounds can exist in different stereoisomeric forms. Accordingly, compounds and compositions can be provided as individual pure enantiomers or as stereoisomeric mixtures, including racemic mixtures. In certain embodiments, the compounds disclosed herein are synthesized into or purified to be in substantially enantiomeric form, such as in a 90% enantiomeric excess, a 95% enantiomeric excess, a 97% enantiomeric excess, or even in more than 99% enantiomeric excess, such as enantiopure.

Algunos de los compuestos descritos en el presente documento también pueden existir en su forma tautomérica.Some of the compounds described herein may also exist in their tautomeric form.

En el contexto de la presente invención, el término "anemia asociada a enfermedades crónicas” (ADC) se entiende como una forma de anemia observada en infección crónica, activación inmunitaria crónica y cáncer.In the context of the present invention, the term "anemia associated with chronic diseases" (ADC) is understood as a form of anemia observed in chronic infection, chronic immune activation and cancer.

En el contexto de la presente invención, el término "anemia inducida por quimioterapia” se entiende como anemia de pacientes con cáncer que reciben quimioterapia. En el contexto de la presente invención, el término "anemia de Diamond-Blackfan” se entiende como un trastorno genético caracterizado por niveles reducidos de la proteína GATA1 debido a una traducción dañada en el ribosoma de ARNm de GATA1.In the context of the present invention, the term "chemotherapy-induced anemia" is understood as anemia of cancer patients receiving chemotherapy. In the context of the present invention, the term "Diamond-Blackfan anemia" is understood as a disorder gene characterized by reduced levels of the GATA1 protein due to impaired translation in the GATA1 mRNA ribosome.

Tal como se usa en el presente documento, los términos en singular "un”, "una” y "el/la” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, tal como se usa en el presente documento, el término "comprende” significa "incluye.” Se entiende además que todos los tamaños de nucleótido o tamaños de aminoácido, y todos los valores de masa molecular o peso molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos u otros compuestos son aproximados, y se proporcionan para la descripción.As used herein, the singular terms "a", "an" and "the" include plural referents unless the context clearly indicates otherwise. Furthermore, as used herein Document, the term "comprises" means "includes." It is further understood that all nucleotide sizes or amino acid sizes, and all molecular mass or weight values molecular, given for nucleic acids or polypeptides or other compounds are approximate, and are provided for description.

Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o pruebas de la presente divulgación, se describen a continuación métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos sólo y no se pretende que sean limitativos.Although methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present disclosure, suitable methods and materials are described below. Furthermore, the materials, methods, and examples are illustrative only and are not intended to be limiting.

Se notifica en este documento una ruta de señalización conservada evolutivamente que une por primera vez el inflamasoma con diferenciación de HSC. Durante periodos de estrés hematopoyético inducido por quimioterapia o infección viral, la activación de NLRP1a prolonga la citopenia, hipoplasia de médula ósea e inmunosupresión. De manera interesante, este efecto está mediado por la piroptosis dependiente de caspasa-1, pero independiente de ASC de células progenitoras hematopoyéticas. Además, se ha encontrado que el inflamasoma NLRP3 conduce expansión clónica y muerte celular piroptótica en síndromes mielodisplásicos (Basiorka et al., 2016). Los resultados demuestran que aunque el inflamasoma es dispensable para la aparición de HSC en pez cebra, regula intrínsecamente a las células la diferenciación de HSC en condiciones de homeostasis en dos niveles diferentes: decisión del destino de células eritroides/mieloides y diferenciación eritroide terminal (figura 10). Aunque CASP1 puede seleccionar como diana varias proteínas para regular ambos procesos, un posible escenario es la escisión de GATA1 en el residuo D300 por CASP1, que da como resultado la rápida degradación de GATA1, puesto que no pudo detectarse GATA1 procesada en larvas de pez cebra o células K562. Niveles de GATA1 reducidos tras activación de inflamasoma dan como resultado niveles de SPI1 aumentados que conducen de manera concomitante a eritropoyesis reforzada y mielopoyesis reducida, según se inicia la elección de linaje, o al menos se ejecuta y se refuerza, por estos dos factores antagonistas cruzados de la transcripción. De manera similar, pero sin la implicación de SPI1, la diferenciación eritroide terminal requiere escisión de GATA1 por CASP1. Por tanto, se observó que la inhibición farmacológica de CASP1 conduce a acumulación de GATA1 y diferenciación eritroide alterada de tanto HSC CD34+ como células K562 (figura 10), puesto que GATA1 inhibe la diferenciación eritroide terminal in vitro. Aunque sigue quedando elucidar las señales responsables de la activación del inflamasoma en la decisión del destino de células eritroides/mieloides y diferenciación eritroide terminal así como los componentes de inflamasoma implicados, los estudios de genética en pez cebra muestran que Gbp4 y Asc se requieren ambos intrínsecamente in vivo por HSC para regular su diferenciación. Se anticipa una leve activación de CASP1 para evitar la muerte celular piroptótica de células hematopoyéticas. Esto puede lograrse mediante el ensamblaje de pequeñas manchas de ASC y/o la baja abundancia de caspasa-1 en células progenitoras hematopoyéticas y precursores eritroides, según se produce en neutrófilos que presentan liberación mantenida de IL-1 p sin piroptosis en comparación con macrófagos (Boucher et al., 2018; Chen et al., 2014).An evolutionarily conserved signaling pathway linking the inflammasome with HSC differentiation for the first time is reported herein. During periods of hematopoietic stress induced by chemotherapy or viral infection, activation of NLRP1a prolongs cytopenia, bone marrow hypoplasia, and immunosuppression. Interestingly, this effect is mediated by caspase-1-dependent, but ASC-independent, pyroptosis of hematopoietic progenitor cells. Furthermore, the NLRP3 inflammasome has been found to drive clonal expansion and pyroptotic cell death in myelodysplastic syndromes (Basiorka et al., 2016). The results demonstrate that although the inflammasome is dispensable for the appearance of HSC in zebrafish, it intrinsically regulates the differentiation of HSC in the cells under conditions of homeostasis at two different levels: decision of erythroid / myeloid cell fate and terminal erythroid differentiation (Figure 10). Although CASP1 can target multiple proteins to regulate both processes, one possible scenario is the cleavage of GATA1 at residue D300 by CASP1, resulting in rapid degradation of GATA1, since processed GATA1 could not be detected in zebrafish larvae. or K562 cells. Reduced GATA1 levels following inflammasome activation result in increased SPI1 levels leading concomitantly to enhanced erythropoiesis and reduced myelopoiesis, as lineage choice is initiated, or at least executed and reinforced, by these two cross-antagonistic factors of the transcript. Similarly, but without the involvement of SPI1, terminal erythroid differentiation requires cleavage of GATA1 by CASP1. Therefore, it was observed that the pharmacological inhibition of CASP1 leads to accumulation of GATA1 and altered erythroid differentiation of both HSC CD34 + and K562 cells (Figure 10), since GATA1 inhibits differentiation terminal erythroid in vitro. Although the signals responsible for the activation of the inflammasome in the decision of erythroid / myeloid cell fate and terminal erythroid differentiation as well as the involved inflammasome components remain elucidated, genetic studies in zebrafish show that Gbp4 and Asc are both intrinsically required. in vivo by HSC to regulate their differentiation. Mild activation of CASP1 is anticipated to prevent pyroptotic cell death of hematopoietic cells. This can be achieved by the assembly of small spots of ASC and / or the low abundance of caspase-1 in hematopoietic progenitor cells and erythroid precursors, as produced in neutrophils that show sustained IL-1 p release without pyroptosis compared to macrophages ( Boucher et al., 2018; Chen et al., 2014).

El sesgo de linaje hematopoyético se asocia para aumentar la incidencia de enfermedades con componentes inflamatorios prominentes incluyendo aterosclerosis, autoinmunidad, enfermedad neurodegenerativa y carcinogénesis (Elias et al., 2017). En particular, la dermatosis neutrófila se caracteriza por la acumulación de neutrófilos en la piel y lesiones cutáneas (Marzano et al., 2018). Se observó que la neutrofilia robusta de un modelo de pez cebra de inflamación cutánea se invierte por inhibición farmacológica de Caspa, a pesar de que las lesiones cutáneas e infiltración de neutrófilos están en gran medida sin afectar. Hasta donde se conoce, esta es la primera evidencia que muestra que la activación de inflamasoma altera la granulopoyesis a través de desequilibrio de Spi1/Gata1 y, más importante, que su inhibición farmacológica restablece el equilibrio de Spi1/Gata1 y recuento de neutrófilos (figura 10). Además, el papel crítico del inflamasoma en la regulación del Spi1/Gata1 también se destacó por la capacidad de inhibición farmacológica de Caspa para restablecer los niveles de hemoglobina eritroide y Gata1, y reducir los niveles de Spi1, en un modelo de pez cebra de Gata1 reducida, tal como se produce en la anemia de Diamond-Blackfan (Danilova y Gazda, 2015). De manera similar, la inhibición farmacológica de CASP1 acelera la recuperación de anemia en ratones tratados con 5-FU sin afectar a los recuentos de leucocitos y plaquetas. En conjunto, todos estos resultados señalan hacia la capacidad de inhibición de inflamasomas como un enfoque terapéutico para tratar enfermedades humanas con sesgo de linaje hematopoyético asociado, tales como inflamación neutrófila, anemia asociada a enfermedades crónicas, anemia inducida por quimioterapia y anemia de Diamond-Blackfan. La disponibilidad de un inhibidor de CASP1 activo por vía oral, VX-765, con elevada especificidad, excelentes propiedades farmacocinéticas y eficacia en modelos de ratón de artritis reumatoide e inflamación cutánea (Wannamaker et al., 2007), respalda además las pruebas clínicas de inhibidores de CASP1 en trastornos con sesgo de linaje hematopoyético.Hematopoietic lineage bias is associated to increase the incidence of diseases with prominent inflammatory components including atherosclerosis, autoimmunity, neurodegenerative disease, and carcinogenesis (Elias et al., 2017). In particular, neutrophil dermatosis is characterized by the accumulation of neutrophils in the skin and skin lesions (Marzano et al., 2018). It was observed that the robust neutrophilia of a zebrafish model of skin inflammation is reversed by pharmacological inhibition of dandruff, even though the skin lesions and neutrophil infiltration are largely unaffected. To our knowledge, this is the first evidence showing that inflammasome activation alters granulopoiesis through Spi1 / Gata1 imbalance and, more importantly, that its pharmacological inhibition restores the Spi1 / Gata1 balance and neutrophil count (figure 10). Furthermore, the critical role of the inflammasome in the regulation of Spi1 / Gata1 was also highlighted by the pharmacological inhibitory capacity of Dandruff to restore erythroid hemoglobin and Gata1 levels, and reduce Spi1 levels, in a zebrafish model of Gata1. reduced, such as occurs in Diamond-Blackfan anemia (Danilova and Gazda, 2015). Similarly, pharmacological inhibition of CASP1 accelerates recovery from anemia in 5-FU treated mice without affecting leukocyte and platelet counts. Taken together, all these results point towards the ability to inhibit inflammasomes as a therapeutic approach to treat human diseases with associated hematopoietic lineage bias, such as neutrophilic inflammation, anemia associated with chronic diseases, anemia induced by chemotherapy and Diamond-Blackfan anemia. The availability of an orally active CASP1 inhibitor, VX-765, with high specificity, excellent pharmacokinetic properties, and efficacy in mouse models of rheumatoid arthritis and skin inflammation (Wannamaker et al., 2007), further supports clinical evidence of CASP1 inhibitors in disorders with hematopoietic lineage bias.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende al menos un inhibidor de caspasa-1 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad seleccionada de la lista que consiste en anemia asociada a enfermedades crónicas, anemia inducida por quimioterapia y anemia de Diamond-Blackfan.Therefore, a first aspect of the invention refers to a composition comprising at least one caspase-1 inhibitor for use in a method of treating a disease selected from the list consisting of anemia associated with chronic diseases, induced anemia for chemotherapy and Diamond-Blackfan anemia.

La presente invención se limita a la anemia mencionada anteriormente y no a otra anemia tal como anemia hemolítica autoinmunitaria (AHA) o anemia aplásica (AA) debido a los siguientes motivos. La AHA está provocada por la generación de anticuerpos contra glóbulos rojos que acortaron su vida. Este trastorno puede presentarse como primario (idiopático) o secundario a trastornos autoinmunitarios, tumores malignos o infecciones. La anemia aplásica (AA) se caracteriza por pancitopenia y médula ósea hipocelular provocada por la disminución de células madre hematopoyéticas. La combinación de varias alteraciones genéticas con baja penetrancia, junto con factores ambientales, contribuye al desarrollo de AA.The present invention is limited to the anemia mentioned above and not to another anemia such as autoimmune hemolytic anemia (AHA) or aplastic anemia (AA) due to the following reasons. AHA is caused by the generation of antibodies against red blood cells that shortened its life. This disorder can present as primary (idiopathic) or secondary to autoimmune disorders, malignancies, or infections. Aplastic anemia (AA) is characterized by pancytopenia and hypocellular bone marrow caused by a decrease in hematopoietic stem cells. The combination of several low penetrance genetic alterations, together with environmental factors, contributes to the development of AA.

Es muy improbable que el tratamiento de pacientes con AHA y AA con inhibidores de caspasa-1 dé como resultado efectos beneficiosos, puesto que tal tratamiento aunque aumentará los niveles de GATA1 forzando la eritropoyesis, tales glóbulos rojos recién formados se destruirán por autoanticuerpos en AH, y en AA, la deficiencia en células madre hematopoyéticas dará todavía como resultado eritropoyesis dañada a pesar de los niveles aumentados de GATA1.It is highly unlikely that treatment of AHA and AA patients with caspase-1 inhibitors will result in beneficial effects, since such treatment, although it will increase GATA1 levels by forcing erythropoiesis, such newly formed red blood cells will be destroyed by autoantibodies in HA, and in AA, deficiency in hematopoietic stem cells will still result in impaired erythropoiesis despite increased levels of GATA1.

En cambio, el tratamiento de anemia asociada a enfermedades crónicas (ACD) la curará satisfactoriamente mediante la inhibición farmacológica de caspasa-1 como ya se hizo posible a partir de la evidencia experimental proporcionada en los ejemplos, puesto que ACD está asociada a hiperactivación del inflamasoma y caspasa-1. Por tanto, el tratamiento con inhibidores de caspasa-1 restablecerá los niveles de GATA1. De manera similar, la anemia de Diamond-Blackfan es un trastorno genético caracterizado por niveles reducidos de GATA1 debido a traducción dañada en el ribosoma de ARNm de GATA1. Por tanto, el tratamiento con inhibidores de caspasa-1 restablecerá los niveles de GATA1; esto se demuestra en los ejemplos proporcionados en la presente memoria descriptiva. Finalmente, la anemia inducida por quimioterapia está provocada por el agotamiento transitorio del compartimento de células progenitoras hematopoyéticas y niveles crecientes de GATA1 mediante inhibición de caspasa-1 forzarán la eritropoyesis de la célula progenitora restante y recién formada, lo que conduce a la curación de anemia, tal como se demuestra en los ejemplos proporcionados en la presente memoria descriptiva.In contrast, the treatment of anemia associated with chronic diseases (ACD) will cure it satisfactorily through the pharmacological inhibition of caspase-1 as already made possible from the experimental evidence provided in the examples, since ACD is associated with hyperactivation of the inflammasome and caspase-1. Therefore, treatment with caspase-1 inhibitors will restore the GATA1 levels. Similarly, Diamond-Blackfan anemia is a genetic disorder characterized by reduced levels of GATA1 due to impaired translation in the GATA1 mRNA ribosome. Thus, treatment with caspase-1 inhibitors will restore GATA1 levels; this is demonstrated in the examples provided in the present specification. Finally, chemotherapy-induced anemia is caused by transient depletion of the hematopoietic progenitor cell compartment and increasing levels of GATA1 through caspase-1 inhibition will force erythropoiesis of the remaining and newly formed progenitor cell, leading to cure of anemia. , as demonstrated in the examples provided in the present specification.

Los inhibidores de caspasa-1 útiles para el método de tratamiento anterior tienen el motivo: X o X—W, en donde X es una estructura selectiva de caspasa-1 en relación con otras cisteína proteasas. La especificidad y/o selectividad de un sustrato para una caspasa puede determinarse mediante ensayos bioquímicos y basados en células en enzimas relacionadas.The caspase-1 inhibitors useful for the above treatment method have the motif: X or X — W, where X is a selective structure of caspase-1 relative to other cysteine proteases. The specificity and / or selectivity of a substrate for a caspase can be determined by biochemical and cell-based assays on related enzymes.

En determinadas realizaciones, X tiene una estructura que comprende: Ar-A2-A1-, en donde Ar es un arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y A1 y A2 son cada uno individualmente un residuo de aminoácido, o A1 y A2 forman juntos un peptidomimético. La estructura selectiva de caspasa-1 X puede incluir al menos un aminoácido adicional además de A1 y A2. Tal(es) aminoácido(s) adicional(es) puede(n) ser igual(es) o diferente(s) en comparación con los aminoácidos descritos a continuación para A1 y A2. Sin embargo, en determinadas realizaciones X consiste únicamente en A1 y A2. Los aminoácidos para A1 y A2 pueden ser aminoácidos naturales o no naturales (por ejemplo, recombinantes o sintéticos). A1 y A2 pueden ser los mismos aminoácidos o diferentes.In certain embodiments, X has a structure comprising: Ar-A2-A1-, where Ar is an optionally substituted aryl or optionally substituted heteroaryl; and A1 and A2 are each individually an amino acid residue, or A1 and A2 together form a peptidomimetic. The selective caspase-1 X structure may include at least one additional amino acid in addition to A1 and A2. Such additional amino acid (s) may be the same or different (s) compared to the amino acids described below for A1 and A2. However, in certain embodiments X consists solely of A1 and A2. The amino acids for A1 and A2 can be natural or non-natural (eg, recombinant or synthetic) amino acids. A1 and A2 can be the same or different amino acids.

Los aminoácidos ilustrativos para A1 y A2 pueden representarse por —N(R1)— C(R2)(R3)—C(O)— en donde R1 es H; R2 y R3 se seleccionan cada uno individualmente de H, un alquilo opcionalmente sustituido, un cicloalquilo opcionalmente sustituido, un heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, un arilo opcionalmente sustituido, o un heteroarilo opcionalmente sustituido, o R2 y R3 forman juntos una estructura de cicloalquilo; o R1 y R2 forman juntos una estructura azacíclica.Illustrative amino acids for A1 and A2 can be represented by —N (R1) -C (R2) (R3) —C (O) - where R1 is H; R2 and R3 are each individually selected from H, an optionally substituted alkyl, an optionally substituted cycloalkyl, an optionally substituted heterocycloalkyl, an aryl optionally substituted, or optionally substituted heteroaryl, or R2 and R3 together form a cycloalkyl structure; or R1 and R2 together form an azacyclic structure.

Varios aminoácidos específicos para A2 son:Several specific amino acids for A2 are:

Varios aminoácidos específicos para A1 son:Several specific amino acids for A1 are:

Ar puede ser un arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido. El arilo opcionalmente sustituido puede ser un único anillo de 5, 6 ó 7 miembros tal como fenilo o un anillo condensado tal como naftilo o quinolinilo. El heteroarilo opcionalmente sustituido puede incluir un heteroátomo seleccionado de N, O o S. Los grupos heteroarilo ilustrativos incluyen furanilo, piranilo, pirroilo, imidazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirazinilo, isoindolilo, indoilo, quinolinilo, isotiazolilo e isoxazolilo. Un heteroarilo preferido es pirindilo. Los sustituyentes ilustrativos incluyen halógeno, amino, aminoalquilo (por ejemplo, NMe2), aminoacilo (por ejemplo, AcHN), alquilo halogenado, alcoxilo, y tetrazolilo. El grupo Ar puede incluir un radical carbonilo (— C(O)—) que se une a A2. En realizaciones seleccionadas, Ar es benzoílo opcionalmente sustituido lo que significa que X tiene la estructura: Ph(opcionalmente sustituido)—C(O)-A2-A1, en la que Ph es fenilo.Ar can be an optionally substituted aryl or heteroaryl. The optionally substituted aryl can be a single 5-, 6- or 7-membered ring such as phenyl or a fused ring such as naphthyl or quinolinyl. The optionally substituted heteroaryl it can include a heteroatom selected from N, O, or S. Illustrative heteroaryl groups include furanyl, pyranyl, pyrroyl, imidazolyl, pyrazolyl, pyridinyl, pyrazinyl, isoindolyl, indoyl, quinolinyl, isothiazolyl, and isoxazolyl. A preferred heteroaryl is pyrindyl. Illustrative substituents include halogen, amino, aminoalkyl (eg, NMe2), aminoacyl (eg, AcHN), halogenated alkyl, alkoxy, and tetrazolyl. The group Ar can include a carbonyl radical (- C (O) -) that binds A2. In selected embodiments, Ar is optionally substituted benzoyl which means that X has the structure: Ph (optionally substituted) —C (O) -A2-A1, where Ph is phenyl.

Varios ejemplos específicos para Ar son: Several specific examples for Ar are:

W representa una "ojiva” que comprende —NH—CH(Y)(Z). La ojiva electrófila modifica de manera reversible la caspasa de modo que la caspasa no puede interaccionar con ni escindir un sustrato de caspasa. Aunque no se limita por ninguna teoría, se cree que la estructura novedosa de la ojiva dada a conocer en el presente documento permite la unión covalente con un tiol de sitio activo en la caspasa optimizando las interacciones hidrófobas e hidrófilas entre su compuesto inhibidor y la caspasa, unión de hidrógeno intermolecular específica entre el compuesto inhibidor y la caspasa, y alineación adecuada del tiol nucleófilo de la enzima y el modificador covalente en el compuesto inhibidor.W represents a "warhead" comprising —NH — CH (Y) (Z). The electrophilic warhead reversibly modifies caspase such that caspase cannot interact with or cleave a caspase substrate. Although it is not limited by any In theory, the novel warhead structure disclosed herein is believed to allow covalent bonding with an active site thiol on caspase by optimizing hydrophobic and hydrophilic interactions between its inhibitor compound and caspase, specific intermolecular hydrogen bonding. between the inhibitor compound and the caspase, and proper alignment of the nucleophilic thiol of the enzyme and the covalent modifier in the inhibitor compound.

Y es una estructura que permite que el compuesto inhibidor forme un enlace covalente reversible con una caspasa 1. En particular, Y permite la formación de un enlace reversible con un residuo nucleófilo de aminoácido de caspasa 1. Este enlace covalente se considera reversible por el hecho de que el enlace recién formado enzima-inhibidor del tioimidato o tioboronato intermedio puede romperse a través de hidrólisis o inversión simple de la reacción para generar tanto inhibidor libre como enzima libre. Los grupos Y ilustrativos incluyen ciano (—CN), alquilo sustituido por ciano (por ejemplo, —CH2CN), ácido borónico (—B(OH)2), o alquilo sustituido por ácido borónico (por ejemplo, —CH2B(OH)2). Y is a structure that allows the inhibitor compound to form a reversible covalent bond with a caspase 1. In particular, Y allows the formation of a reversible bond with a nucleophilic amino acid residue of caspase 1. This covalent bond is considered reversible by the fact that the newly formed enzyme-inhibitor bond of the intermediate thioimidate or thioboronate can be broken through hydrolysis or simple reversal of the reaction to generate both free inhibitor and free enzyme. Illustrative Y groups include cyano (—CN), cyano-substituted alkyl (eg, —CH2CN), boronic acid (—B (OH) 2), or boronic acid-substituted alkyl (eg, —CH2B (OH) 2 ).

Z es un resto carboxilo o un mimético de ácido carboxílico. Los grupos Z ilustrativos incluyen ciano (—CN), alquilo sustituido por ciano (por ejemplo, —CH2CN), ácido borónico (—B(OH)2), alquilo sustituido por ácido borónico (por ejemplo, — CH2B(OH)2), ácido carboxílico (—CO2H), alquilo sustituido por ácido carboxílico (por ejemplo, —CH2CO2H), éster de carboxilato (por ejemplo, —CO2(alquilo), o — CH2CO2(alquilo)), tetrazolilo, alquilo sustituido por tetrazolilo (por ejemplo, —CH2-tetrazoílo), o un amido (por ejemplo, —CONH, —CH2CONH(OH), — CH2CONH(OMe) o —CH2CONH(CN)). Los miméticos de ácido carboxílico tienen un protón con un pKA en el intervalo de 4 a 9, que está próximo al de ácido carboxílico tal como se muestra a continuación:Z is a carboxyl moiety or a carboxylic acid mimetic. Illustrative Z groups include cyano (—CN), cyano-substituted alkyl (eg, —CH2CN), boronic acid (—B (OH) 2), boronic acid-substituted alkyl (eg, —CH2B (OH) 2) , carboxylic acid (—CO2H), alkyl substituted by carboxylic acid (for example, —CH2CO2H), carboxylate ester (for example, —CO2 (alkyl), or -CH2CO2 (alkyl)), tetrazolyl, alkyl substituted by tetrazolyl (for eg —CH2-tetrazoyl), or an amido (eg —CONH, —CH2CONH (OH), —CH2CONH (OMe), or —CH2CONH (CN)). Carboxylic acid mimetics have a proton with a pKA in the range of 4 to 9, which is close to that of carboxylic acid as shown below:

Según determinadas realizaciones dadas a conocer en el presente documento, A2, A1 y Ar se seleccionan de las estructuras específicas dadas a conocer anteriormente; Y se selecciona de ciano o ácido borónico; y Z se selecciona de —CH2B(OH)2 o — CH2C(O)—O-alquilo inferior.According to certain embodiments disclosed herein, A2, A1, and Ar are selected from the specific structures disclosed above; Y is selected from cyano or boronic acid; and Z is selected from —CH2B (OH) 2 or —CH2C (O) —O-lower alkyl.

Según determinadas realizaciones dadas conocer en el presente documento, A2 se selecciona de: According to certain embodiments disclosed herein, A2 is selected from:

Ar se selecciona de: Ar is selected from:

Y se selecciona de ciano o ácido borónico; y Z se selecciona de —CH2B(OH)2 o — CH2C(O)—O-alquilo inferior.Y is selected from cyano or boronic acid; and Z is selected from —CH2B (OH) 2 or —CH2C (O) —O-lower alkyl.

Según determinadas realizaciones dadas conocer en el presente documento, los agentes de inhibición de caspasa 1 incluyen un resto 3-cianopropanilo incorporado en soportes de inhibidor de caspasa 1.According to certain embodiments disclosed herein, caspase 1 inhibiting agents include a 3-cyanopropanil moiety incorporated into caspase 1 inhibitor supports.

Según realizaciones particulares, los compuestos dados a conocer en el presente documento tienen la estructura de fórmula II:According to particular embodiments, the compounds disclosed in the present document have the structure of formula II:

R2 es H y cada R6 es independientemente —H, una cadena lateral de aminoácido, o —R8; o R2 y R6 junto con los átomos a los que se unen, forman un sistema de anillo cíclico o heterocíclico de 3 a 7 miembros;R2 is H and each R6 is independently —H, an amino acid side chain, or —R8; or R2 and R6 together with the atoms to which they are attached, form a 3- to 7-membered cyclic or heterocyclic ring system;

R22 es —C(R6)²— o —N(R6)—;R22 is —C (R6) ² - or —N (R6) -;

R3 es H y cada R4 es independientemente —H, una cadena lateral de aminoácido, o —R8; o R3 y R4 junto con los átomos a los que se unen, forman un sistema de anillo cíclico o heterocíclico de 3 a 7 miembros;R3 is H and each R4 is independently —H, an amino acid side chain, or —R8; or R3 and R4 together with the atoms to which they are attached, form a 3- to 7-membered cyclic or heterocyclic ring system;

R5 es — H; R5 is -H;

R21 es —CN o —C(O)OR9;R21 is —CN or —C (O) OR9;

R20 es —C(O)OR9, o un heteroarilo;R20 is —C (O) OR9, or a heteroaryl;

R9 es —H, alquilo, o —CN; yR9 is —H, alkyl, or —CN; and

m es 0 ó 1;m is 0 or 1;

siempre que al menos uno de R20 o R21 incluya

provided that at least one of R20 or R21 includes

En ejemplos más específicos, los compuestos tienen una fórmula III:In more specific examples, the compounds have a formula III:

En determinadas realizaciones dadas conocer en el presente documento, la CI50 de inhibición de caspasa de los compuestos dados a conocer es menor de 100 nM. Los compuestos pueden presentar una solubilidad acuosa mayor de 10 ^g/ml, un LogD menor de 5 y un peso molecular de menos de 650 Dalton.In certain embodiments disclosed herein, the caspase inhibition IC50 of the disclosed compounds is less than 100 nM. The compounds can have an aqueous solubility greater than 10 µg / ml, a LogD of less than 5 and a molecular weight of less than 650 Dalton.

A continuación se indican ejemplos ilustrativos de compuestos específicos: Illustrative examples of specific compounds are listed below:

Ċ Ejemplos ilustrativos adicionales de compuestos específicos son: ac-YVAD-CMK,Ċ Additional illustrative examples of specific compounds are: ac-YVAD-CMK,

z-YVAD-FMKz-YVAD-FMK

z-WEHD-FMK z-WEHD-FMK

z-WEHD-CHOz-WEHD-CHO

Ac-YVAD-CHO Ac-YVAD-CHO

Ac-YVAD-FMK Ac-YVAD-FMK

Ac-YVAD-AOMAc-YVAD-AOM

Z-D-CH2-DCB, ZD-CH2-DCB,

VX-765VX-765

Los compuestos dados a conocer en el presente documento pueden sintetizarse generalmente tal como se ilustra en el documento US9365612B2, que se incorpora en el presente documento como referencia.The compounds disclosed herein can be generally synthesized as illustrated in US9365612B2, which is incorporated herein by reference.

Un segundo aspecto de la divulgación incluye composiciones farmacéuticas preparadas para la administración a un sujeto, para su uso tal como se refleja en el primer aspecto de la invención, y que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos dados a conocer en el presente documento. La cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto dado a conocer dependerá de la vía de administración, la especie del sujeto y las características físicas del sujeto que está tratándose. Los factores específicos que pueden considerarse incluyen gravedad y fase de la enfermedad, peso, dieta y medicamentos simultáneos. La relación de estos factores para determinar una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos dados a conocer la entienden los expertos en la técnica.A second aspect of the disclosure includes pharmaceutical compositions prepared for administration to a subject, for use as reflected in the first aspect of the invention, and which includes a therapeutically effective amount of one or more of the compounds disclosed in This document. The Therapeutically effective amount of a disclosed compound will depend on the route of administration, the species of the subject, and the physical characteristics of the subject being treated. Specific factors that can be considered include severity and stage of disease, weight, diet, and concurrent medications. The relationship of these factors in determining a therapeutically effective amount of the disclosed compounds is understood by those of skill in the art.

Las composiciones farmacéuticas para la administración a un sujeto pueden incluir al menos un aditivo farmacéuticamente aceptable adicional tal como portadores, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, tensioactivos y similares además de la molécula de elección. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir también uno o más principios activos adicionales tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos, y similares. Los portadores farmacéuticamente aceptables útiles para estas formulaciones son convencionales. Remington’s Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 19a edición (1995), describen composiciones y formulaciones adecuadas para administración farmacéutica de los compuestos divulgados en el presente documento.Pharmaceutical compositions for administration to a subject may include at least one additional pharmaceutically acceptable additive such as carriers, thickeners, diluents, buffers, preservatives, surfactants, and the like in addition to the molecule of choice. The pharmaceutical compositions can also include one or more additional active ingredients such as antimicrobial agents, anti-inflammatory agents, anesthetics, and the like. The pharmaceutically acceptable carriers useful for these formulations are conventional. Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 19th Edition (1995), describe compositions and formulations suitable for pharmaceutical administration of the compounds disclosed herein.

En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que esté empleándose. Por ejemplo, las formulaciones parenterales contienen habitualmente líquidos inyectables que incluyen líquidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, disoluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, formas de polvo, píldora, comprimido o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas que van a administrarse pueden contener pequeñas cantidades de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes, y agentes de tamponamiento del pH y similares, por ejemplo acetato de sodio o monolaurato de sorbitano. In general, the nature of the carrier will depend on the particular mode of administration being employed. For example, parenteral formulations usually contain injectable liquids including pharmaceutically and physiologically acceptable liquids such as water, physiological saline, balanced salt solutions, aqueous dextrose, glycerol or the like as a carrier. For solid compositions (eg, powder, pill, tablet, or capsule forms), conventional non-toxic solid carriers can include, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, or magnesium stearate. In addition to biologically neutral carriers, the pharmaceutical compositions to be administered may contain small amounts of non-toxic auxiliary substances, such as wetting or emulsifying agents, preservatives, and pH buffering agents and the like, for example sodium acetate or sorbitan monolaurate. .

Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento incluyen aquellas formadas a partir de sales farmacéuticamente aceptables y/o solvatos de los compuestos dados a conocer. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas derivadas de ácidos y bases orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables. Los compuestos dados a conocer particulares poseen al menos un grupo básico que puede formar sales de ácido-base con ácidos. Los ejemplos de grupos básicos incluyen, pero no se limitan a, grupos amino e imino. Los ejemplos de ácidos inorgánicos que pueden formar sales con tales grupos básicos incluyen, pero no se limitan a, ácidos minerales tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico. Los grupos básicos también pueden formar sales con ácidos carboxílicos orgánicos, ácidos sulfónicos, ácidos sulfo o ácidos fosfo o ácido sulfámico N-sustituido, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico o ácido isonicotínico y, además, con aminoácidos, por ejemplo con a-aminoácidos, y también con ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroximetanosulfónico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido bencenodisulfónico, ácido 4-metilbencenosulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, 2- ó 3-fosfoglicerato, glucosa-6-fosfato o ácido N-ciclohexilsulfámico (con formación de los ciclamatos) o con otros compuestos orgánicos ácidos, tales como ácido ascórbico. En particular, las sales adecuadas incluyen aquellas derivadas de metales alcalinos tales como potasio y sodio, metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio, entre otros numerosos ácidos bien conocidos en la técnica farmacéutica.The pharmaceutical compositions disclosed herein include those formed from pharmaceutically acceptable salts and / or solvates of the disclosed compounds. Pharmaceutically acceptable salts include those derived from pharmaceutically acceptable organic or inorganic acids and bases. The particular disclosed compounds possess at least one basic group that can form acid-base salts with acids. Examples of basic groups include, but are not limited to, amino and imino groups. Examples of inorganic acids that can form salts with such basic groups include, but are not limited to, mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, or phosphoric acid. Basic groups can also form salts with organic carboxylic acids, sulfonic acids, sulfo acids or phospho acids, or N-substituted sulfamic acid, for example acetic acid, propionic acid, glycolic acid, succinic acid, maleic acid, hydroxamic acid, methylmaleic acid, Fumaric acid, malic acid, tartaric acid, gluconic acid, glucaric acid, glucuronic acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, salicylic acid, 4-aminosalicylic acid, 2-phenoxybenzoic acid, 2-acetoxybenzoic acid, embonic acid , nicotinic acid or isonicotinic acid and additionally with amino acids, for example with α-amino acids, and also with methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, 2-hydroxymethanesulfonic acid, ethane-1,2-disulfonic acid, benzenedisulfonic acid, 4-methylbenzenesulfonic acid , naphthalene-2-sulfonic acid, 2- or 3-phosphoglycerate, glucose-6-phosphate or N-cyclohexylsulfamic acid (with formation of the cyclamates) or with other compounds organic acids, such as ascorbic acid. In particular, suitable salts include those derived from alkali metals such as potassium and sodium, alkaline earth metals such as calcium and magnesium, among numerous other acids well known in the pharmaceutical art.

Determinados compuestos incluyen al menos un grupo ácido que puede formar una sal de ácido-base con una base inorgánica u orgánica. Los ejemplos de sales formadas a partir de bases inorgánicas incluyen sales de los compuestos dados a conocer por la presente con metales alcalinos tales como potasio y sodio, metales alcalinotérreos, incluyendo calcio y magnesio y similares. De manera similar, se contemplan sales de compuestos ácidos con una base orgánica, tales como una amina (tal como se usa en el presente documento, los términos que se refieren a aminas deben entenderse que incluyen sus ácidos conjugados a menos que el contexto indique claramente que la amina libre está prevista), incluyendo sales formadas con aminoácidos básicos, aminas alifáticas, aminas heterocíclicas, aminas aromáticas, piridinas, guanidinas y amidinas. De las aminas alifáticas, las aminas alifáticas acíclicas, y aminas de di y trialquilo cíclicas y acíclicas son particularmente adecuadas para su uso en los compuestos dados a conocer. Además, también pueden usarse contraiones de amonio cuaternario.Certain compounds include at least one acid group that can form an acid-base salt with an inorganic or organic base. Examples of salts formed from inorganic bases include salts of the compounds disclosed herein with alkali metals such as potassium and sodium, alkaline earth metals, including calcium and magnesium, and the like. Similarly, salts of acidic compounds with an organic base, such as an amine, are contemplated (as used herein, terms referring to amines are to be understood to include their conjugated acids unless the context clearly indicates that the free amine is intended), including salts formed with basic amino acids, aliphatic amines, heterocyclic amines, aromatic amines, pyridines, guanidines, and amidines. Of the aliphatic amines, the acyclic aliphatic amines, and cyclic and acyclic di- and trialkyl amines are particularly suitable for use in the disclosed compounds. In addition, quaternary ammonium counterions can also be used.

Los ejemplos particulares de bases de amina adecuadas (y sus iones de amonio correspondientes) para su uso en los presentes compuestos incluyen, sin limitación, piridina, N,N-dimetilaminopiridina, diazabiciclononano, diazabicicloundeceno, N-metil-N-etilamina, dietilamina, trietilamina, diisopropiletilamina, mono-, bis- o tris-(2-hidroxietil)amina, 2-hidroxi-terc-butilamina, tris(hidroximetil)metilamina, N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amina, tri-(2-hidroxietil)amina y N-metil-D-glucamina. Para ejemplos adicionales de "sales farmacológicamente aceptables”, véase Berge et al., J. Pharm. Sci. 66:1 (1977).Particular examples of suitable amine bases (and their corresponding ammonium ions) for use in the present compounds include, without limitation, pyridine, N, N-dimethylaminopyridine, diazabicyclononane, diazabicycloundecene, N-methyl-N-ethylamine, diethylamine, triethylamine, diisopropylethylamine, mono-, bis- or tris- (2-hydroxyethyl) amine, 2-hydroxy-tert-butylamine, tris (hydroxymethyl) methylamine, N, N-dimethyl-N- (2-hydroxyethyl) amine, tri- (2-hydroxyethyl) amine and N-methyl-D-glucamine. For additional examples of "pharmacologically acceptable salts" see Berge et al., J. Pharm. Sci. 66: 1 (1977).

Los compuestos dados a conocer en el presente documento pueden cristalizarse y pueden proporcionarse en una única forma cristalina o como una combinación de diferentes polimorfos cristalinos. Como tales, los compuestos pueden proporcionarse en una o más formas físicas, tales como diferentes formas cristalinas, formas cristalinas, cristalinas líquidas o no cristalinas (amorfas). Tales formas físicas diferentes de los compuestos pueden prepararse usando, por ejemplo, diferentes disolventes o diferentes mezclas de disolventes para recristalización. Alternativa o adicionalmente, pueden prepararse diferentes polimorfos, por ejemplo, realizando recristalizaciones a diferentes temperaturas y/o alterando las tasas de enfriamiento durante la recristalización. La presencia de polimorfos puede determinarse mediante cristalografía de rayos X, o en algunos casos mediante otra técnica espectroscópica, tal como espectroscopía de RMN de fase sólida, espectroscopía de IR o mediante calorimetría diferencial de barrido.The compounds disclosed herein can be crystallized and can be provided in a single crystalline form or as a combination of different crystalline polymorphs. As such, the compounds can be provided in one or more physical forms, such as various crystalline, crystalline, liquid crystalline, or non-crystalline (amorphous) forms. Such different physical forms of the compounds can be prepared using, for example, different solvents or different solvent mixtures for recrystallization. Alternatively or additionally, different polymorphs can be prepared, for example, by performing recrystallizations at different temperatures and / or by altering cooling rates during recrystallization. The presence of polymorphs can be determined by X-ray crystallography, or in some cases by another spectroscopic technique, such as solid phase NMR spectroscopy, IR spectroscopy, or by differential scanning calorimetry.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse a sujetos por una variedad de modos de administración a la mucosa, incluyendo por administración oral, rectal, intranasal, intrapulmonar o transdérmica, o mediante administración tópica a otras superficies. Opcionalmente, las composiciones pueden administrarse por vías no mucosas, incluyendo por vías intramusculares, subcutáneas, intravenosas, intraarteriales, intraarticulares, intraperitoneales, intratecales, intracerebroventriculares o parenterales. En otras realizaciones alternativas, el compuesto puede administrarse ex vivo por exposición directa a células, tejidos u órganos que se originan de un sujeto.The pharmaceutical compositions can be administered to subjects by a variety of modes of administration to the mucosa, including by oral, rectal, intranasal, intrapulmonary, or transdermal administration, or by topical administration to others. surfaces. Optionally, the compositions can be administered by non-mucosal routes, including intramuscular, subcutaneous, intravenous, intraarterial, intraarticular, intraperitoneal, intrathecal, intracerebroventricular, or parenteral routes. In other alternative embodiments, the compound can be administered ex vivo by direct exposure to cells, tissues, or organs originating from a subject.

Para formular las composiciones farmacéuticas, el compuesto puede combinarse con diversos aditivos farmacéuticamente aceptables, así como una base o vehículo para la dispersión del compuesto. Los aditivos deseados incluyen, pero no se limitan a, agentes de control del pH, tales como arginina, hidróxido de sodio, glicina, ácido clorhídrico, ácido cítrico, y similares. Además, pueden incluirse anestésicos locales (por ejemplo, alcohol bencílico), agentes isotónicos (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol, sorbitol), inhibidores de la absorción (por ejemplo, Tween 80 o Miglyol 812), agentes de potenciación de la solubilidad (por ejemplo, ciclodextrinas y derivados de las mismas), estabilizadores (por ejemplo, albúmina sérica) y agentes reductores (por ejemplo, glutatión). Pueden incluirse en las composiciones adyuvantes, tales como hidróxido de aluminio (por ejemplo, Amphogel, Wyet Laboratories, Madison, N.J.), adyuvante de Freund, MPL™ (monofosforil lípido 3-O-deacilado A; Corixa, Hamilton, Ind.) e IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.), entre muchos otros adyuvantes adecuados bien conocidos en la técnica. Cuando la composición es un líquido, la tonicidad de la formulación, tal como se mide con referencia a la tonicidad de disolución fisiológica salina al 0,9% (p/v) tomada como unidad, se ajusta normalmente hasta un valor en el que no se inducirá daño tisular sustancial e irreversible en el sitio de administración. Generalmente, la tonicidad de la disolución se ajusta hasta un valor de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3,0, tal como de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,0, o de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,7.To formulate pharmaceutical compositions, the compound can be combined with various pharmaceutically acceptable additives, as well as a base or carrier for dispersion of the compound. Desired additives include, but are not limited to, pH control agents, such as arginine, sodium hydroxide, glycine, hydrochloric acid, citric acid, and the like. In addition, local anesthetics (eg, benzyl alcohol), isotonic agents (eg, sodium chloride, mannitol, sorbitol), absorption inhibitors (eg, Tween 80 or Miglyol 812), solubility enhancing agents may be included. (eg cyclodextrins and derivatives thereof), stabilizers (eg serum albumin) and reducing agents (eg glutathione). Adjuvants, such as aluminum hydroxide (eg, Amphogel, Wyet Laboratories, Madison, NJ), Freund's adjuvant, MPL ™ (3-O-deacylated monophosphoryl lipid A; Corixa, Hamilton, Ind.) And IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.), Among many other suitable adjuvants well known in the art. When the composition is a liquid, the tonicity of the formulation, as measured with reference to the tonicity of 0.9% (w / v) physiological saline, taken as a unit, is normally adjusted to a value where no substantial and irreversible tissue damage will be induced at the site of administration. Generally, the tonicity of the solution is adjusted to a value from about 0.3 to about 3.0, such as from about 0.5 to about 2.0, or from about 0.8 to about 1.7.

El compuesto puede dispersarse en una base o vehículo, que puede incluir un compuesto hidrófilo que tiene una capacidad de dispersar el compuesto, y cualquier aditivo deseado. La base puede seleccionarse de una amplia variedad de compuestos adecuados, incluyendo pero sin limitarse a, copolímeros de poliácidos carboxílicos o sales de los mismos, anhídridos carboxílicos (por ejemplo, anhídrido maleico) con otros monómeros (por ejemplo, (met)acrilato de metilo, ácido acrílico y similares), polímeros de vinilo hidrófilos, tales como poli(acetato de vinilo), poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, derivados de celulosa, tales como hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa y similares, y polímeros naturales, tales como quitosán, colágeno, alginato de sodio, gelatina, ácido hialurónico, y sales metálicas no tóxicas de los mismos. A menudo, se selecciona un polímero biodegradable como base o vehículo, por ejemplo, poli(ácido láctico), copolímero de poli(ácido láctico-ácido glicólico), poli(ácido hidroxibutírico), copolímero de poli(ácido hidroxbutírico-ácido glicólico) y mezclas de los mismos. Alternativa o adicionalmente, pueden emplearse ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como ésteres de ácidos grasos de poliglicerina, ésteres de ácidos grasos de sacarosa y similares como vehículos. Pueden usarse polímeros hidrófilos y otros vehículos solos o en combinación, y puede impartirse integridad estructural potenciada al vehículo mediante cristalización parcial, unión iónica, reticulación y similar. El vehículo puede proporcionarse en una variedad de formas, incluyendo disoluciones fluidas o viscosas, geles, pastas, polvos, microesferas y películas para aplicación directa a una superficie mucosa.The compound can be dispersed in a base or carrier, which can include a hydrophilic compound having an ability to disperse the compound, and any desired additives. The base can be selected from a wide variety of suitable compounds, including but not limited to, copolymers of policarboxylic acids or salts thereof, carboxylic anhydrides (eg, anhydride maleic) with other monomers (e.g., methyl (meth) acrylate, acrylic acid, and the like), hydrophilic vinyl polymers, such as polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, cellulose derivatives, such as hydroxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, and the like, and natural polymers, such as chitosan, collagen, sodium alginate, gelatin, hyaluronic acid, and non-toxic metal salts thereof. Often a biodegradable polymer is selected as the base or carrier, for example, poly (lactic acid), poly (lactic acid-glycolic acid) copolymer, poly (hydroxybutyric acid), poly (hydroxybutyric acid-glycolic acid) copolymer and mixtures thereof. Alternatively or additionally, synthetic fatty acid esters such as polyglycerol fatty acid esters, sucrose fatty acid esters and the like may be employed as carriers. Hydrophilic polymers and other carriers can be used alone or in combination, and enhanced structural integrity can be imparted to the carrier by partial crystallization, ionic bonding, cross-linking, and the like. The carrier can be provided in a variety of forms, including fluid or viscous solutions, gels, pastes, powders, microspheres, and films for direct application to a mucosal surface.

El compuesto puede combinarse con la base o el vehículo según una variedad de métodos, y la liberación del compuesto puede hacerse mediante difusión, desintegración del vehículo, o formación asociada de canales de agua. En algunas circunstancias, el compuesto se dispersa en microcápsulas (microesferas) o nanocápsulas (nanoesferas) preparadas a partir de un polímero adecuado, por ejemplo, 2-cianoacrilato de isobutilo (véase, por ejemplo, Michael et al., J. Pharmacy Pharmacol. 43:1-5, 1991), y se dispersa en un medio de dispersión biocompatible, que produce administración mantenida y actividad biológica durante un periodo de tiempo prolongado.The compound can be combined with the base or carrier according to a variety of methods, and release of the compound can be by diffusion, disintegration of the carrier, or associated formation of water channels. In some circumstances, the compound is dispersed in microcapsules (microspheres) or nanocapsules (nanospheres) prepared from a suitable polymer, eg, isobutyl 2-cyanoacrylate (see, eg, Michael et al., J. Pharmacy Pharmacol. 43: 1-5, 1991), and is dispersed in a biocompatible dispersion medium, which produces sustained delivery and biological activity over an extended period of time.

Las composiciones de la divulgación pueden contener alternativamente como vehículos farmacéuticamente aceptables, sustancias según se requiera para aproximar condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tamponamiento, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano y oleato de trietanolamina. Para composiciones sólidas, pueden usarse vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares.The compositions of the disclosure may alternatively contain as pharmaceutically acceptable carriers, substances as required to approximate physiological conditions, such as pH adjusting and buffering agents, tonicity adjusting agents, wetting agents and the like, for example, sodium acetate. , sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sorbitan monolaurate, and triethanolamine oleate. For Solid compositions, conventional non-toxic pharmaceutically acceptable carriers can be used including, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, talc, cellulose, glucose, sucrose, magnesium carbonate, and the like.

Las composiciones farmacéuticas para administrar el compuesto también pueden formularse como una disolución, microemulsión, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de principios activos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse una fluidez adecuada para las disoluciones, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño de partícula deseado en el caso de formulaciones dispersables, y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol y sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada del compuesto puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.The pharmaceutical compositions for administering the compound can also be formulated as a solution, microemulsion, or other ordered structure suitable for a high concentration of active ingredients. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (eg, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, and the like), and suitable mixtures thereof. Adequate fluidity for solutions can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by maintaining a desired particle size in the case of dispersible formulations, and by the use of surfactants. In many cases, it will be desirable to include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols, such as mannitol and sorbitol, or sodium chloride in the composition. Prolonged absorption of the compound can be achieved by including in the composition an agent that delays absorption, for example, monostearate salts and gelatin.

En determinadas realizaciones, el compuesto puede administrarse en una formulación de liberación sostenida, por ejemplo en una composición que incluye un polímero de liberación retardada. Estas composiciones pueden prepararse con vehículos que protegerán contra una rápida liberación, por ejemplo un vehículo de liberación controlada tal como un polímero, sistema de administración microencapsulada o gel bioadhesivo. La administración prolongada en diversas composiciones de la divulgación puede lograrse incluyendo en la composición agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, hidrogeles de monoestearato de aluminio y gelatina. Cuando se desean formulaciones de liberación controlada, los aglutinantes de liberación controlada adecuados para su uso según la divulgación incluyen cualquier material de liberación controlada biocompatible que es inerte para el agente activo y que puede incorporar el compuesto y/u otro agente biológicamente activo. En la técnica se conocen varios de tales materiales. Aglutinantes de liberación controlada útiles son materiales que se metabolizan lentamente en condiciones fisiológicas tras su administración (por ejemplo, a una superficie mucosa, o en presencia de líquidos corporales). Los aglutinantes apropiados incluyen, pero no se limitan a, polímeros biocompatibles y copolímeros bien conocidos en la técnica para su uso en formulaciones de liberación mantenida. Tales compuestos biocompatibles son atóxicos e inertes para los tejidos circundantes, y no desencadenan efectos secundarios adversos significativos, tales como irritación nasal, respuesta inmunitaria, inflamación, o similares. Se metabolizan en productos metabólicos que también son biocompatibles y fácilmente eliminados del cuerpo.In certain embodiments, the compound can be administered in a sustained release formulation, for example in a composition that includes a sustained release polymer. These compositions can be prepared with vehicles that will protect against rapid release, for example a controlled release vehicle such as a polymer, microencapsulated delivery system or bioadhesive gel. Prolonged administration in various compositions of the disclosure can be achieved by including in the composition agents that delay absorption, for example, aluminum monostearate hydrogels and gelatin. When controlled release formulations are desired, controlled release binders suitable for use according to the disclosure include any biocompatible controlled release material that is inert to the active agent and which can incorporate the compound and / or other biologically active agent. A number of such materials are known in the art. Useful controlled release binders are materials that are slowly metabolized under physiological conditions after administration (e.g. to a surface mucosa, or in the presence of body fluids). Suitable binders include, but are not limited to, biocompatible polymers and copolymers well known in the art for use in sustained release formulations. Such biocompatible compounds are non-toxic and inert to the surrounding tissues, and they do not trigger significant adverse side effects, such as nasal irritation, immune response, inflammation, or the like. They are metabolized into metabolic products that are also biocompatible and easily eliminated from the body.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación son normalmente estériles y estables en condiciones de fabricación, almacenamiento y uso. Pueden prepararse disoluciones estériles incorporando el compuesto en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en el presente documento, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto y/u otro agente biológicamente activo en un vehículo estéril que contiene un medio básico de dispersión y los demás ingredientes requeridos de aquellos enumerados en el presente documento. En el caso de polvos estériles, los métodos de preparación incluyen secado a vacío y liofilización que produce un polvo del compuesto más cualquier ingrediente deseado adicional de una disolución estéril filtrada previamente del mismo. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares.The pharmaceutical compositions of the disclosure are normally sterile and stable under conditions of manufacture, storage and use. Sterile solutions can be prepared by incorporating the compound in the required amount in an appropriate solvent with one or a combination of ingredients listed herein, as required, followed by filter sterilization. Generally, dispersions are prepared by incorporating the compound and / or other biologically active agent into a sterile vehicle containing a basic dispersion medium and the required other ingredients from those listed herein. In the case of sterile powders, methods of preparation include vacuum drying and lyophilization which produces a powder of the compound plus any additional desired ingredients from a pre-filtered sterile solution thereof. Prevention of the action of microorganisms can be achieved by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like.

Según los diversos métodos de tratamiento de la divulgación, el compuesto puede administrarse a un sujeto en una manera coherente con metodologías convencionales asociadas con la gestión del trastorno para el que se busca tratamiento o prevención. Según la divulgación en el presente documento, una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz del compuesto y/u otro agente biológicamente activo se administra a un sujeto que necesita de tal tratamiento durante un tiempo y en condiciones suficientes para evitar, inhibir y/o mejorar una enfermedad o estado seleccionado o uno o más síntomas del mismo.According to the various treatment methods of the disclosure, the compound can be administered to a subject in a manner consistent with conventional methodologies associated with the management of the disorder for which treatment or prevention is sought. As disclosed herein, a prophylactically or therapeutically effective amount of the compound and / or other biologically active agent is administered to a subject in need of such treatment for a time and under conditions sufficient to prevent, inhibit, and / or ameliorate a disease. or selected state or one or more symptoms thereof.

La dosificación real del compuesto variará según factores tales como la indicación de enfermedad y estado particular del sujeto (por ejemplo, edad, tamaño, estado fís o , grado de los síntomas, factores de susceptibilidad, y similares, del sujeto), tiempo y vía de administración, otros fármacos o tratamientos que estén administrándose simultáneamente, así como la farmacología específica del compuesto para provocar la actividad o respuesta biológica deseada en el sujeto. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar una respuesta profiláctica o terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que cualquier efecto secundario tóxico o perjudicial del compuesto y/u otro agente biológicamente activo se supera en términos clínicos por efectos terapéuticamente beneficiosos. Un intervalo no limitativo para una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto y/u otro agente biológicamente activo dentro de los métodos y formulaciones de la divulgación es de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, tal como de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal.The actual dosage of the compound will vary depending on factors such as the indication of disease and particular condition of the subject (e.g., age, size, condition physical or, degree of symptoms, susceptibility factors, and the like, of the subject), time and route of administration, other drugs or treatments that are being administered simultaneously, as well as the specific pharmacology of the compound to elicit the activity or biological response desired in the subject. Dosage regimens can be adjusted to provide an optimal prophylactic or therapeutic response. A therapeutically effective amount is also one in which any harmful or toxic side effects of the compound and / or other biologically active agent are clinically outweighed by therapeutically beneficial effects. A non-limiting range for a therapeutically effective amount of a compound and / or other biologically active agent within the methods and formulations of the disclosure is from about 0.01 mg / kg of body weight to about 20 mg / kg of body weight, such as from about 0.05 mg / kg to about 5 mg / kg of body weight, or from about 0.2 mg / kg to about 2 mg / kg of body weight.

La dosificación puede variarla el médico que atiende para mantener una concentración deseada en un sitio diana (por ejemplo, los pulmones o circulación sistémica). Pueden seleccionarse concentraciones superiores o menores basándose en el modo de administración, por ejemplo, administración transepidérmica, rectal, oral, pulmonar o intranasal frente a administración intravenosa o subcutánea. La dosificación también puede ajustarse basándose en la tasa de liberación de la formulación administrada, por ejemplo, de un aerosol intrapulmonar frente a polvo, liberación mantenida oral frente a formulaciones de administración de partículas inyectadas o transdérmica, y así sucesivamente.Dosage can be varied by the attending physician to maintain a desired concentration at a target site (eg, the lungs or systemic circulation). Higher or lower concentrations can be selected based on the mode of administration, for example, transepidermal, rectal, oral, pulmonary or intranasal administration versus intravenous or subcutaneous administration. Dosage can also be adjusted based on the release rate of the administered formulation, eg, from intrapulmonary aerosol versus powder, oral sustained release versus injected or transdermal particulate delivery formulations, and so on.

La presente divulgación también incluye kits, embalajes y unidades de recipiente múltiple que contienen las composiciones farmacéuticas, principios activos y/o medios descritos en el presente documento para administrar los mismos para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades y otros estados en sujetos mamíferos. También se proporcionan kits para uso diagnóstico. En una realización, estos kits incluyen un recipiente o formulación que contiene uno o más de los compuestos descritos en el presente documento. En un ejemplo, este componente se formula en una preparación farmacéutica para administración a un sujeto. El compuesto está contenido opcionalmente en un recipiente de dispersión a granel o forma de dosificación unitaria o de múltiples unidades. Pueden proporcionarse medios de dispersión opcionales, por ejemplo un aplicador de aerosol pulmonar o intranasal. Los materiales de embalaje incluyen opcionalmente una etiqueta o instrucción que indica para qué fines de tratamiento y/o en qué manera puede usarse el agente farmacéutico embalado con los mismos.The present disclosure also includes kits, packages, and multi-container units containing the pharmaceutical compositions, active ingredients, and / or means described herein for administering the same for use in the prevention and treatment of diseases and other conditions in subjects. mammals. Kits are also provided for diagnostic use. In one embodiment, these kits include a container or formulation that contains one or more of the compounds described herein. In one example, this component is formulated into a pharmaceutical preparation for administration to a subject. He The compound is optionally contained in a bulk dispersion container or unit or multi-unit dosage form. Optional means of dispersion may be provided, for example a pulmonary or intranasal aerosol applicator. The packaging materials optionally include a label or instruction indicating for what treatment purposes and / or in what manner the pharmaceutical agent packaged therewith may be used.

EjemplosExamples

Materiales y métodosMaterials and methods

AnimalesAnimals

Se obtuvieron peces cebra (Danio rerio H.) del Zebrafish International Resource Center y se aparearon, se evaluó su fase, se criaron y se procesaron tal como se describe (Westerfield, 2000). Las líneas roya9/a9; nacrew2/w2 (casper) (White et al., 2008), Tg(mpx:eGFP)i114 (Renshaw et al., 2006), Tg(mpeg1:eGFP)gl22, Tg(mpeg1:GAL4)gl25 (Ellett et al., 2011), Tg(lyz:dsRED)nz50 (Hall et al., 2007), Tg(mpx:Gal4.VP16)i222 (Davison et al., 2007), Tg(lcr:eGFP)cz3325 (Ganis et al., 2012), Tg(runx1:GAL4)utn6 (Tamplin et al., 2015), Tg(UAS:nfsB-mCherry)c264 (Davison et al., 2007) y Tg(spint1a)hi2217 (Carney et al., 2007; Mathias et al., 2007) se han descrito previamente. Los experimentos realizados cumplen con las directrices del Consejo de la Unión Europea (Directiva 2010/63/UE) y el Real Decreto español RD 53/2013. Se realizaron experimentos y procedimientos tal como se aprobó por los Comités de Bioética de la Universidad de Murcia (números de aprobación n.° 75/2014, n.° 216/2014 y 395/2017).Zebrafish ( Danio rerio H.) were obtained from the Zebrafish International Resource Center and mated, phase evaluated, reared and processed as described (Westerfield, 2000). The lines roya9 / a9; nacrew2 / w2 ( casper) (White et al., 2008), Tg ( mpx: eGFP) i114 (Renshaw et al., 2006), Tg ( mpeg1: eGFP) gl22, Tg ( mpeg1: GAL4) gl25 (Ellett et al. ., 2011), Tg ( lyz: dsRED) nz50 (Hall et al., 2007), Tg ( mpx: Gal4.VP16) i222 (Davison et al., 2007), Tg ( lcr: eGFP) cz3325 ( Ganis et al. ., 2012), Tg ( runx1: GAL4) utn6 ( Tamplin et al., 2015), Tg ( UAS: nfsB-mCherry) c264 (Davison et al., 2007) and Tg ( spint1a) hi2217 (Carney et al., 2007; Mathias et al., 2007) have been previously described. The experiments carried out comply with the guidelines of the Council of the European Union (Directive 2010/63 / EU) and the Spanish Royal Decree RD 53/2013. Experiments and procedures were carried out as approved by the Bioethics Committees of the University of Murcia (approval numbers No. 75/2014, No. 216/2014 and 395/2017).

Se adquirieron ratones C57BL/6 de Janvier Laboratory. Se realizaron todos los experimentos de acuerdo con las directrices francesas para el manejo de animales y se aprobaron por el Comité de Ética Inserm.C57BL / 6 mice were purchased from Janvier Laboratory. All experiments were performed in accordance with the French guidelines for animal handling and approved by the Inserm Ethics Committee.

Constructo de ADN y generación de transgénicos DNA construct and transgenic generation

Se generó el constructo uas:AscACARD-GFP por ensamblajes MultiSite Gateway usando LR Clonase II Plus (Life Technologies) según protocolos convencionales y usando vectores Tol2kit descritos previamente (Kwan et al., 2007). Se describieron previamente los constructos de expresión Gbp4, Gbp4KS^-AA, Gbp4ACARD, Gbp4KS^-AA/ACARD (mutante doble, DM) y uas:gbp4KS/AA (Tyrkalska et al., 2016); Asc-Myc y Caspa (Masumoto et al., 2003); y Gcsfa (Liongue et al., 2009).The uas: AscACARD-GFP construct was generated by MultiSite Gateway assemblies using LR Clonase II Plus (Life Technologies) according to standard protocols and using previously described Tol2kit vectors (Kwan et al., 2007). The expression constructs Gbp4, Gbp4KS ^ -AA, Gbp4ACARD, Gbp4KS ^ -AA / ACARD (double mutant, DM) and uas: gbp4KS / AA (Tyrkalska et al., 2016); Asc-Myc and Caspa (Masumoto et al., 2003); and Gcsfa (Liongue et al., 2009).

Se describió previamente la línea Tg(UAS:gbp4KS/AA)ums3 (Tyrkalska et al., 2016). Se generó Tg(UAS:ascACARD-GFP)ums4 microinyectando 0,5-1 nl en el saco vitelino de embriones de fase unicelular una disolución que contiene 100ng/|j,l de uas:ascACARD-GFP y constructos uas:gbp4KS^AA, respectivamente, y 50 ng/^l de ARN de Tol2 en tampón de microinyección (tampón Tango *0,5 y disolución de rojo de fenol al 0,05%) usando un microinyector (Narishige).The Tg ( UAS: gbp4KS / AA) ums3 line was previously described (Tyrkalska et al., 2016). Tg ( UAS: ascACARD-GFP) ums4 was generated by microinjecting 0.5-1 nl into the yolk sac of unicellular phase embryos a solution containing 100ng / | j, l of uas: ascACARD-GFP and uas constructs : gbp4KS ^ AA , respectively, and 50 ng / ^ l of Tol2 RNA in microinjection buffer (Tango buffer * 0.5 and 0.05% phenol red solution) using a microinjector (Narishige).

Morfolino, inyección de ARN y tratamientos químicos de larvas de pez cebraMorpholino, RNA injection and chemical treatments of zebrafish larvae

Se resuspendieron morfolinos específicos (Gene Tools) en agua libre de nucleasa a 1 mM (tabla S1). Se obtuvo ARN transcrito in vitro siguiendo las instrucciones del fabricante (kit mMESSAGE mMACHINE, Ambion). Se mezclaron morfolinos y ARN en tampón de microinyección y se microinyectaron en el saco vitelino de embriones de fase unicelular usando un microinyector (Narishige) (0,5-1 nl por embrión). Se usó la misma cantidad de MO y/o ARN en todos los grupos experimentales.Specific morpholinos (Gene Tools) were resuspended in nuclease-free water at 1 mM (Table S1). In vitro transcribed RNA was obtained following the manufacturer's instructions (mMESSAGE mMACHINE kit, Ambion). Morpholinos and RNA were mixed in microinjection buffer and microinjected into the yolk sac of single-cell phase embryos using a microinjector (Narishige) (0.5-1 nl per embryo). The same amount of OM and / or RNA was used in all experimental groups.

En algunos experimentos, a embriones 1-2 dpf se les retiró el corion y se trataron durante 24 h hasta 7 dpf a 28°C mediante inmersión en baño con los inhibidores de caspasa-1 Ac-YVAD-CMK (irreversible) o Ac-YVAD-CHO (reversible) (100 ^M, Peptanova) diluidos en agua con huevo complementada con DMSO al 1% o con metronidazol (Mtz, 5 mM, Sigma-Aldrich).In some experiments, 1-2 dpf embryos were removed the chorion and were treated for 24 h up to 7 dpf at 28 ° C by immersion in bath with the caspase-1 inhibitors Ac-YVAD-CMK (irreversible) or Ac- YVAD-CHO (reversible) (100 ^ M, Peptanova) diluted in egg water supplemented with 1% DMSO or metronidazole (Mtz, 5 mM, Sigma-Aldrich).

Obtención de imágenes en vivo, tinción con negro de Sudán de neutrófilos, ablación de neutrófilos y determinación de eritrocitos en larvas de pez cebraLive imaging, Sudan black staining of neutrophils, neutrophil ablation and erythrocyte determination in zebrafish larvae

A 48 y 72 hpf, se anestesiaron las larvas en tricaína y se montaron en agarosa de bajo punto de fusión al 1% (p/v) (Sigma-Aldrich) disuelta en agua con huevo (de Oliveira et al., 2013). Se capturaron imágenes con un estereomicroscopio de epifluorescencia Lumar V12 equipado con filtros fluorescentes verdes y rojos mientras que los animales se mantuvieron en sus matrices de agar a 28,5°C. Todas las imágenes se adquirieron con la cámara integrada en el estereomicroscopio y se usaron para recuento posterior del número total de neutrófilos, macrófagos o HSC en larvas completas.At 48 and 72 hpf, the larvae were anesthetized in tricaine and mounted on 1% (w / v) low melting point agarose (Sigma-Aldrich) dissolved in egg water (de Oliveira et al., 2013). Images were captured with a stereomicroscope of Lumar V12 epifluorescence fitted with green and red fluorescent filters while the animals were kept on their agar matrices at 28.5 ° C. All images were acquired with the camera integrated into the stereomicroscope and used for subsequent counting of the total number of neutrophils, macrophages or HSCs in whole larvae.

Con el fin de reducir la pigmentación y mejorar la señal de la tinción con negro de Sudán, se incubaron larvas 24 hpf en 1-fenil 2-tiourea 200 ^M (PTU) hasta 72 hpf, cuando se anestesiaron en tricaína tamponada y se fijaron durante la noche a 4°C en formaldehído libre de metanol al 4%. Al día siguiente, todas las larvas se aclararon con PBS tres veces, se incubaron durante 15 min con negro de Sudán (n.° 380B-1KT, Sigma-Aldrich) y se lavaron extensivamente en EtOH al 70% en agua. Después de eso, se realizó una rehidratación progresiva: EtOH al 50% en PBS y Tween 20 al 0,1% (PBT) (Sigma-Aldrich), EtOH al 25% en PBT y PBT solo. Finalmente, las larvas se visualizaron inmediatamente usando un estereomicroscopio Scope.AI equipado con una cámara digital (AxioCam ICc 3, Zeiss) (Le Guyader etal., 2008).In order to reduce pigmentation and improve the signal of Sudan black staining, 24 hpf larvae were incubated in 200 ^ M 1-phenyl 2-thiourea (PTU) up to 72 hpf, when anesthetized in buffered tricaine and fixed overnight at 4 ° C in 4% methanol-free formaldehyde. The next day, all larvae were rinsed with PBS three times, incubated for 15 min with Sudan black (# 380B-1KT, Sigma-Aldrich), and washed extensively in 70% EtOH in water. After that, progressive rehydration was performed: 50% EtOH in PBS and 0.1% Tween 20 (PBT) (Sigma-Aldrich), 25% EtOH in PBT and PBT alone. Finally, the larvae were immediately visualized using a Scope.AI stereomicroscope equipped with a digital camera (AxioCam ICc 3, Zeiss) (Le Guyader et al., 2008).

Para la ablación de neutrófilos, se trataron larvas Tg(mpx:Gal4.VP16; UASnsfbmCherry) a 2 dpf con Mtz 5 mM y se mantuvieron en la oscuridad. A 72 hpf, se retiró el fármaco y se trataron las larvas hasta 7 dpf con DMSO al 1% solo o que contenía Ac-YVAD-CMK (100 ^M). Se refrescó el inhibidor cada 24 h y se obtuvieron imágenes de las larvas una vez al día hasta 7 dpf y se determinó el número de neutrófilos (Davison et al., 2007; Halpern et al., 2008).For neutrophil ablation, Tg larvae ( mpx: Gal4.VP16; UASnsfbmCherry) were treated at 2 dpf with 5 mM Mtz and kept in the dark. At 72 hpf, the drug was withdrawn and the larvae were treated to 7 dpf with 1% DMSO alone or containing Ac-YVAD-CMK (100 µM). The inhibitor was refreshed every 24 h and the larvae were imaged once a day up to 7 dpf and the number of neutrophils was determined (Davison et al., 2007; Halpern et al., 2008).

Se determinaron recuentos de eritrocitos mediante citometría de flujo. A 3 dpf, se anestesiaron grupos de 50 larvas Tg(lcr:eGFP) en tricaína, se trituraron con una cuchilla y se incubaron a 28°C durante 30 min con Liberase 0,077 mg/ml (n.° 05401119001, Roche). Después de eso, se añadió FBS al 10% para inactivar Liberase y la suspensión celular resultante se hizo pasar a través de un filtro celular de 40 ^m. Se usó Sytox Blue (Life Technologies) como colorante vital para excluir células muertas. Se realizaron adquisiciones de citometría de flujo en un FACSCALIBUR (BD). Se realizaron análisis usando software FlowJo (Treestar). Erythrocyte counts were determined by flow cytometry. At 3 dpf, groups of 50 Tg larvae ( lcr: eGFP) were anesthetized in tricaine, minced with a blade and incubated at 28 ° C for 30 min with Liberase 0.077 mg / ml (# 05401119001, Roche). After that, 10% FBS was added to inactivate Liberase and the resulting cell suspension was passed through a 40 µm cell filter. Sytox Blue (Life Technologies) was used as a vital stain to exclude dead cells. Flow cytometry acquisitions were made on a FACSCALIBUR (BD). Analyzes were performed using FlowJo software (Treestar).

Ensayos de infección de larvas de pez cebraZebrafish larval infection tests

Para experimentos de infección, se usó la cepa S. typhimurium 12023 (tipo natural) proporcionada por el Prof. Holden. Durante la noche, se diluyeron los cultivos en medio de Luria-Bertani (LB) 1/5 en LB con NaCl 0,3 M, se incubaron a 37°C hasta que se alcanzó una densidad óptica de 1,5 a 600 nm, y finalmente se diluyeron en PBS estéril. Se anestesiaron larvas de 2 dpf en medio embrionario con tricaína 0,16mg/ml y se inyectaron 10 bacterias en el saco vitelino o vesícula ótica. Se permitió que las larvas se recuperaran en agua con huevo a 28-29°C, y se monitorizaron para determinar signos clínicos de enfermedad o mortalidad a lo largo de 5 días y reclutamiento de neutrófilos hasta 24 hpi (Tyrkalska et al., 2016).For infection experiments, S. typhimurium strain 12023 (wild type) provided by Prof. Holden was used. Overnight, cultures in Luria-Bertani (LB) medium were diluted 1/5 in LB with 0.3 M NaCl, incubated at 37 ° C until an optical density of 1.5 at 600 nm was reached, and finally they were diluted in sterile PBS. 2 dpf larvae were anesthetized in embryonic medium with 0.16mg / ml tricaine and 10 bacteria were injected into the yolk sac or otic vesicle. The larvae were allowed to recover in egg water at 28-29 ° C, and were monitored for clinical signs of disease or mortality over 5 days and neutrophil recruitment up to 24 hpi (Tyrkalska et al., 2016) .

Hibridación in situ de montaje completo (WISH) en larvas de pez cebra Whole mount in situ hybridization ( WISH) in zebrafish larvae

Se usaron embriones Casper transparentes para WISH (Thisse et al., 1993). Se generaron sondas de ARN sentido y antisentido gata1a, spi1b, gcsfr, cmyb, runx1 y rag1 usando el kit de marcaje de ARN DIG (Roche Applied Science) a partir de plásmidos linealizados. Se obtuvieron imágenes de embriones usando un estereomicroscopio Scope.A1 equipado con una cámara digital (AxioCam ICc 3, Zeiss).Clear Casper embryos were used for WISH (Thisse et al., 1993). Gata1a, spi1b, gcsfr, cmyb, runx1 and rag1 sense and antisense RNA probes were generated using the DIG RNA labeling kit (Roche Applied Science) from linearized plasmids. Embryo images were obtained using a Scope.A1 stereomicroscope equipped with a digital camera (AxioCam ICc 3, Zeiss).

Cultivo celular y ensayos de diferenciación eritroideCell culture and erythroid differentiation assays

Se recogieron células CD34+ de sangre periférica de un único donante (R003272, 25/08/2016). Se descongelaron las células rápidamente en un baño de agua a 37°C, después se diluyeron en serie con un tampón de descongelación (FBS al 1% en PBS) hasta 32 ml de volumen total y finalmente se centrifugaron durante 10 min a temperatura ambiente (250xg). Tras desechar el sobrenadante, se resuspendieron las células en 20 ml de medios de expansión que contenían: medio libre de suero para expansión y cultivo de células hematopoyéticas - SFEM (n.° 09650, Stem Cell), el 1% de cóctel de citocinas 100 - CC100 (n.° 02690, Stem Span CC100) y el 2% de mezcla de penicilina-estreptomicina (P/S, n.° 15140122, Thermo Fischer Scientific), y se hicieron crecer en matraces en reposo a 37°C. A las 72 h tras descongelación, se añadieron 30 ml de medios de expansión nuevos. Tras seis días de expansión, se centrifugaron todas las células de nuevo durante 10 min a temperatura ambiente y se resuspendieron en medio eritroide de diferenciación (EDM) que contenía: el 98% de SFEM filtrado, el 2% de P/S, 1 U/ml de EPO, 5 ng/ml de IL-3, 20 ng/ml de SCF (factor de células madre), 2 ^M de dexametasona y 1 ^M de p-estradiol, y se dividieron en 2 matraces T75, de los que uno se trató con DMSO y el otro con Ac-YVAD-CMK (10, 50 y 100 ^M, Peptanova). Al tercer día de diferenciación, se añadió inhibidor nuevo en el EDM y se reemplazó el medio antiguo. Se recogieron células en diferentes puntos de tiempo (0, 2, 3 y 5 días de diferenciación), se centrifugaron, se lavaron dos veces con PBS, se congelaron al instante en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C.CD34 + cells were collected from peripheral blood from a single donor (R003272, 08/25/2016). Cells were rapidly thawed in a 37 ° C water bath, then serially diluted with a thawing buffer (1% FBS in PBS) to 32 ml total volume and finally centrifuged for 10 min at room temperature ( 250xg). After discarding the supernatant, the cells were resuspended in 20 ml of expansion media containing: serum-free medium for expansion and culture of hematopoietic cells - SFEM (# 09650, Stem Cell), 1% 100 cytokine cocktail - CC100 (# 02690, Stem Span CC100) and 2% penicillin-streptomycin mixture (P / S, # 15140122, Thermo Fischer Scientific), and grown in flasks at rest at 37 ° C. At 72 h after thawing, 30 ml of fresh expansion media were added. After six days of expansion, all cells were centrifuged again for 10 min at room temperature and resuspended in erythroid differentiation medium (EDM) containing: 98% filtered SFEM, 2% P / S, 1 U / ml EPO, 5 ng / ml IL-3, 20 ng / ml SCF (stem cell factor), 2 ^ M dexamethasone and 1 ^ M p-estradiol, and were divided into 2 T75 flasks, of which one was treated with DMSO and the other with Ac-YVAD-CMK (10, 50 and 100 ^ M, Peptanova). On the third day of differentiation, new inhibitor was added to the EDM and the old medium was replaced. Cells were harvested at different time points (0, 2, 3 and 5 days of differentiation), centrifuged, washed twice with PBS, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 ° C.

Se mantuvieron células K562 (CRL-3343; Colección americana de cultivos tipo) en RPMI complementado con FCS al 10%, glutamina 2 mM y penicilina-estreptomicina al 1% (Life Technologies). Se mantuvieron las células y se dividieron antes de su confluencia cada 72 h. Para la diferenciación, se trataron células con hemina 50 ^M (n.° 16009-13-5, Sigma-Aldrich), se prepararon tal como se describió previamente (Smith et al., 2000), en presencia de DMSO al 0,1% solo o que contenía Ac-YVAD-CMK 100 ^M. Se recogieron células en diferentes puntos de tiempo (0, 6, 12, 24, 48 horas tras la adición de hemina), se centrifugaron, se lavaron con PBS y se almacenaron a -80C.K562 cells (CRL-3343; American Type Culture Collection) were maintained in RPMI supplemented with 10% FCS, 2 mM glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies). Cells were kept and divided before confluence every 72 h. For differentiation, cells were treated with 50 µM hemin (# 16009-13-5, Sigma-Aldrich), prepared as previously described (Smith et al., 2000), in the presence of 0, DMSO. 1% alone or containing 100 ^ M Ac-YVAD-CMK. Cells were harvested at different time points (0, 6, 12, 24, 48 hours after hemin addition), centrifuged, washed with PBS, and stored at -80C.

Actividad de ensayo de caspasa-1Caspase-1 assay activity

La actividad de caspasa-1 se determinó con el sustrato fluorométrico Z-YVAD-AFC (sustrato VI de caspasa-1, Calbiochem) tal como se describió previamente (Angosto et al., 2012; Lopez-Castejon et al., 2008; Tyrkalska et al., 2016). En resumen, se lisaron larvas de pez cebra, y células CD34+ y K562 en tampón de lisis celular hipotónico [ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) 25 mM, ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) 5 mM, ditiotreitol (DTT) 5 mM, cóctel inhibidor de proteasa 1:20 (Sigma-Aldrich), pH 7,5] en hielo durante 10 min. Para cada reacción, se incubaron 80 ^g de proteína durante 90 min a 23°C con Z-YVAD-AFC 50 ^M y 50 ^l de tampón de reacción [3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS) al 0,2%, HEPES 0,2 M, sacarosa al 20%, DTT 29 mM, pH 7,5]. Después de la incubación, la fluorescencia del AFC liberado del sustrato Z-YVAD-AFC se midió con un espectrofluorímetro FLUOstart (BGM, LabTechnologies) a una longitud de onda de excitación de 405 nm y una longitud de onda de emisión de 492 nm. Una actividad representativa de ensayo de caspasa-1 de los tres llevados a cabo, se muestra acompañando cada recuento celular.Caspase-1 activity was determined with the fluorometric substrate Z-YVAD-AFC (Caspase-1 substrate VI, Calbiochem) as previously described (Angosto et al., 2012; Lopez-Castejon et al., 2008; Tyrkalska et al., 2016). Briefly, zebrafish larvae, and CD34 + and K562 cells were lysed in hypotonic cell lysis buffer [4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) 25 mM, ethylene glycol-bis (2-aminoethyl ether) acid -N, N, N ', N'-tetraacetic acid (EGTA) 5 mM, dithiothreitol (DTT) 5 mM, protease inhibitor cocktail 1:20 (Sigma-Aldrich), pH 7.5] on ice for 10 min. For each reaction, 80 µg of protein was incubated for 90 min at 23 ° C with 50 µM Z-YVAD-AFC and 50 µl of reaction buffer [3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonium] -1-propanesulfonate 0.2% (CHAPS), 0.2 M HEPES, 20% sucrose, 29 mM DTT, pH 7.5]. After incubation, the fluorescence of the AFC released from the Z-YVAD-AFC substrate was measured with a FLUOstart spectrofluorimeter (BGM, LabTechnologies) at an excitation wavelength of 405 nm and an emission wavelength of 492 nm. A representative activity of Caspase-1 assay of the three carried out, is shown accompanying each cell count.

Microscopía láser con focalFocal laser microscopy

Se sembraron células en cubierta de 12 mm Cellware de poli-L-Lys (Corning), se permitió que 50.000 células en 100 ^l se unieran a la cubierta durante 10 min a temperatura ambiente, después se añadieron medio y tratamiento. Después del tratamiento con hemina, se lavaron células con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS 10 min, se incubaron 20 min a temperatura ambiente con glicina 20 mM, se permeabilizaron con NP40 0,5% y se bloquearon durante 1 h con BSA al 2%. Entonces se marcaron las células con anticuerpo primario correspondiente, seguido por anticuerpo secundario conjugado con Alexa 568 (Thermo Fisher Scientific). Se montaron las muestras usando un medio de montaje de Dako y se examinaron con un microscopio de barrido láser confocal AOBS y software de Leica (Leica Microsystems). Se adquirieron las imágenes en un formato de 1.024 * 1.024 píxeles en modo de barrido secuencial entre fotogramas para evitar diafonía. El objetivo usado era HCX PL APO CS * 63 y el valor estenopeico era 1, correspondiente a 114,73 ^m.Cells were seeded in 12 mm Cellware poly-L-Lys cover (Corning), 50,000 cells in 100 µl were allowed to bind to the cover for 10 min at room temperature, then medium and treatment were added. After treatment with hemin, cells were washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 10 min, incubated for 20 min at room temperature with 20 mM glycine, permeabilized with 0.5% NP40 and blocked for 1 h. with 2% BSA. Cells were then labeled with corresponding primary antibody, followed by Alexa 568-conjugated secondary antibody (Thermo Fisher Scientific). Samples were mounted using Dako mounting medium and examined with an AOBS confocal laser scanning microscope and Leica software (Leica Microsystems). Images were acquired in 1,024 * 1,024 pixel format in sequential scan mode between frames to avoid crosstalk. The objective used was HCX PL APO CS * 63 and the pinhole value was 1, corresponding to 114.73 ^ m.

InmunotransferenciaImmunoblot

El tampón de lisis para lisis de células de mamíferos contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NP-40 al 1% (p/v) e inhibidor de proteasa nuevo (1/20, P8340, Sigma-Aldrich), mientras que para la lisis de larvas de pez cebra contenía SDS al 1%. Se realizó la cuantificación de proteínas con el kit BCA usando BSA como patrón. Se sometieron los lisados celulares (40 ^g) en tampón de muestra de SDS a electroforesis en un gel de poliacrilamida y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se incubaron durante 1 h con TTBS que contenía polvo de leche seca desnatada al 5% (p/v) o BSA al 2% (p/v). Las membranas se inmunotransfirieron en el mismo tampón 16 h a 4°C con los anticuerpos primarios indicados. Las inmunotransferencias se lavaron entonces con TTBS y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con HRP diluidos 2.500 veces en leche desnatada al 5% (p/v) en TTBS. Después de lavados repetidos, se detectó la señal con el reactivo de quimioluminiscencia potenciado y ChemiDoc XRS Biorad. Los anticuerpos primarios usados son: anticuerpo policlonal de conejo contra GATA1 humana (1/200, n.° sc1234, Santa Cruz Biotechnology) para ensayo confocal, Acm de conejo contra GATA1 humana (1/200, n.° 3535, Cell Signaling) para inmunotransferencia, anticuerpo policlonal de conejo contra CASP1 (1/200, n.° sc56036 Santa Cruz Biotechnology) para ensayo confocal, anticuerpo policlonal de conejo contra Gatala y Spilb de pez cebra (1/2000, n.° GTX128333 y GTX128266, GeneTex), anticuerpo policlonal de conejo contra histona H3 (1/200, n.° ab1791, Abcam) y anticuerpo monoclonal ANTI-FLAG® M2-Peroxidasa (HRP) producido en ratón (A8592 Sigma-Aldrich). Se ha realizado análisis de densitometría usando software Fiji Image J (Schindelin et al., 2012).The lysis buffer for mammalian cell lysis contained 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40 (w / v), and protease inhibitor new (1/20, P8340, Sigma-Aldrich), while for the lysis of zebrafish larvae it contained 1% SDS. Protein quantification was performed with the BCA kit using BSA as a standard. Cell lysates (40 µg) in SDS sample buffer were electrophoresed on a polyacrylamide gel and transferred to PVDF membranes. The membranes were incubated for 1 h with TTBS containing 5% (w / v) skim dry milk powder or 2% (w / v) BSA. The membranes were immunoblotted in the same buffer 16 h at 4 ° C with the indicated primary antibodies. The immunoblots were then washed with TTBS and incubated for 1 h at room temperature with HRP-conjugated secondary antibodies diluted 2,500 times in 5% (w / v) skim milk in TTBS. After repeated washes, the signal was detected with the enhanced chemiluminescence reagent and ChemiDoc XRS Biorad. Primary antibodies used are: rabbit polyclonal antibody against human GATA1 (1/200, # sc1234, Santa Cruz Biotechnology) for confocal assay, rabbit mAb against human GATA1 (1/200, # 3535, Cell Signaling) for immunoblotting, Rabbit polyclonal antibody against CASP1 (1/200, # sc56036 Santa Cruz Biotechnology) for confocal assay, rabbit polyclonal antibody against Gatala and Zebrafish Spilb (1/2000, # GTX128333 and GTX128266, GeneTex), antibody Rabbit polyclonal against histone H3 (1/200, # ab1791, Abcam) and ANTI-FLAG® M2-Peroxidase (HRP) monoclonal antibody produced in mouse (A8592 Sigma-Aldrich). Densitometry analysis has been performed using Fiji Image J software (Schindelin et al., 2012).

Inmunoprecipitación y ensayo de caspasa-1 recombinanteImmunoprecipitation and Recombinant Caspase-1 Assay

También se realizaron ensayos de co-inmunoprecipitación tal como se describió previamente (Tyrkalska et al., 2017), con pequeñas modificaciones. Se lavaron las células dos veces con PBS, se solubilizaron en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,7, NaCl 150 mM, NP-40 al 1% y cóctel inhibidor de proteasa) durante 30 min en agitación y se centrifugaron (13,000 * g, 10 min). Se incubó el lisado celular (1 mg) durante 2 h a 4°C con agitación suave con 40 ^l de suspensión de ANTIFLAG® M2 (A2220 Sigma-Aldrich). Se lavaron los inmunoprecipitados cuatro veces con tampón de lisis que contenía NaCl 0,15 M, se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con 10 UI de caspasa-1 recombinante (n.° GTX65025, GeneTex) en tampón de reacción (Hepes 50 mM, pH 7,2, NaCl 50 mM, Chaps al 0,1%, EDTA 10 mM, glicerol al 5% y DTT 10 mM) durante 2 h a 37°C. Se hirvió la resina en tampón de muestra de SDS 5 min a 95°C y se resolvieron las proteínas unidas en SDS-PAGE al 4-15% (BioRad TGX n.° 456-1084) y se transfirieron a membranas de PVDF durante 1 h a 300 mA. Se sondaron inmunotransferencias con anticuerpos a FLAG y GATA1 (véase anteriormente).Co-immunoprecipitation assays were also performed as previously described (Tyrkalska et al., 2017), with minor modifications. Cells were washed twice with PBS, solubilized in lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.7, 150 mM NaCl, 1% NP-40, and protease inhibitor cocktail) for 30 min with shaking and centrifuged (13,000 * g, 10 min). The cell lysate (1 mg) was incubated for 2 h at 4 ° C with gentle shaking with 40 µl of ANTIFLAG® M2 suspension (A2220 Sigma-Aldrich). Immunoprecipitates were washed four times with lysis buffer containing 0.15 M NaCl, washed twice with PBS, and incubated with 10 IU recombinant caspase-1 (# GTX65025, GeneTex) in reaction buffer (Hepes 50 mM, pH 7.2, 50 mM NaCl, 0.1% Chaps, 10 mM EDTA, 5% glycerol and 10 mM DTT) for 2 h at 37 ° C. The resin was boiled in SDS sample buffer for 5 min at 95 ° C and the bound proteins were resolved on 4-15% SDS-PAGE (BioRad TGX # 456-1084) and transferred to PVDF membranes for 1 h at 300 mA. Immunoblots were probed with antibodies to FLAG and GATA1 (see above).

Análisis de la expresión génicaGene expression analysis

Se extrajo ARN total de 106 células CD34+ o K562, embriones/larvas completos (60) o colas larvarias (100) con reactivo TRIzol (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante y se trataron con DNasa I, calidad para amplificación (1 U/Dg de ARN; Invitrogen). Se usó transcriptasa inversa SuperScript III RNasa HD (Invitrogen) para sintetizar el ADNc de la primera hebra con cebador de oligo(dT)18 de 1 Dg de ARN total a 50°C durante 50 min. Se realizó PCR en tiempo real con un instrumento ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) usando reactivos SYBR Green PCR Core (Applied Biosystems). Se incubaron las mezclas de reacción durante 10 min a 95°C, seguido por 40 ciclos de 15 s a 95°C, 1 min a 60°C, y finalmente 15 s a 95°C, 1 min a 60°C y 15 s a 95°C. Para cada ARNm, se normalizó la expresión génica a la proteína ribosomal S11 (rps11) para pez cebra o p-actina (ACTB) para el contenido de células humanas en cada muestra siguiendo el método Pfaffl (Pfaffl, 2001). Los cebadores usados se muestran en (tabla S2). En todos los casos, cada PCR se realizó con muestras en triplicado y se repitió con al menos dos muestras independientes.Total RNA was extracted from 106 CD34 + or K562 cells, whole embryos / larvae (60) or larval tails (100) with TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific) following the manufacturer's instructions and treated with DNase I, quality for amplification (1 U / RNA Dg; Invitrogen). SuperScript III RNase HD reverse transcriptase was used (Invitrogen) to synthesize the first strand cDNA with oligo (dT) 18 primer from 1 Dg of total RNA at 50 ° C for 50 min. Real-time PCR was performed with an ABI PRISM 7500 instrument (Applied Biosystems) using SYBR Green PCR Core reagents (Applied Biosystems). The reaction mixtures were incubated for 10 min at 95 ° C, followed by 40 cycles of 15 s at 95 ° C, 1 min at 60 ° C, and finally 15 s at 95 ° C, 1 min at 60 ° C and 15 s at 95 ° C. For each mRNA, gene expression was normalized to the ribosomal protein S11 ( rps11) for zebrafish or p-actin ( ACTB) for the content of human cells in each sample following the Pfaffl method (Pfaffl, 2001). The primers used are shown in (Table S2). In all cases, each PCR was performed with samples in triplicate and was repeated with at least two independent samples.

Análisis de datos de GEOGEO data analysis

Se extrajeron perfiles de expresión génica de microalineamiento del conjunto de datos GSE63270 de Gene Expression Omnibus (GEO) usando el código geo2r en el software R Studio. Los niveles de expresión de GATA1, IL1B, CASP1, PYCARD, NLRP1, NLRP3, NLRC4 y GBP5 se analizaron en diferentes fases de la diferenciación eritroide de siete donantes humanos sanos, incluyendo HSC, CMP, MEP y GMP.Microalignment gene expression profiles were extracted from the Gene Expression Omnibus (GEO) data set GSE63270 using geo2r code in R Studio software. The expression levels of GATA1, IL1B, CASP1, PYCARD, NLRP1, NLRP3, NLRC4, and GBP5 were analyzed at different stages of erythroid differentiation from seven healthy human donors, including HSC, CMP, MEP, and GMP.

Tratamiento de los ratones y muestreo de sangreTreatment of mice and blood sampling

Se inyectaron por vía intraperitoneal 5-FU (120 mg/kg en PBS en el día 0) y Ac-YVAD-CMK (10 mg/kg en PBS que contenía DMSO al 10% en los días 6, 7, 10 y 12). Se recogieron 50 |j,l de muestras de sangres de ratones orbitales a -1,6, 10 y 14 días, y se determinaron los eritrocitos, hemoglobina, hematocrito, plaquetas y glóbulos blancos usando un analizador de hematología ProCyte Dx siguiendo las instrucciones del fabricante.5-FU (120 mg / kg in PBS on day 0) and Ac-YVAD-CMK (10 mg / kg in PBS containing 10% DMSO on days 6, 7, 10 and 12) were injected intraperitoneally . 50 µl of blood samples were collected from orbital mice at -1.6, 10, and 14 days, and erythrocytes, hemoglobin, hematocrit, platelets, and white blood cells were determined using a ProCyte Dx hematology analyzer following the instructions of the maker.

Análisis estadísticoStatistic analysis

Se muestran los datos como media ± EEM y se analizaron mediante análisis de la variancia (ANOVA) y una prueba múltiple de amplitud de Tukey o Bonferroni para determinar las diferencias entre grupos. Las diferencias entre dos muestras se analizaron mediante la prueba de la t de Student. Se usó la prueba exacta de Fisher para el análisis de tablas de contingencia. Se usó una prueba de rango logarítmico con la corrección de Bonferroni para múltiples comparaciones para calcular las diferencias estadísticas en la supervivencia de los diferentes grupos experimentales.Data are shown as mean ± SEM and analyzed by analysis of variance (ANOVA) and a Tukey or Bonferroni multiple-range test to determine differences between groups. Differences between two samples were analyzed using Student's t test. Fisher's exact test was used for the analysis of contingency tables. A logarithmic rank test was used with Bonferroni correction for multiple comparisons to calculate statistical differences in survival of the different experimental groups.

ResultadosResults

La inhibición de inflamasomas disminuye el número de neutrófilos y macrófagos en larvas de pez cebraInhibition of inflammasomes decreases the number of neutrophils and macrophages in zebrafish larvae

Usando líneas transgénicas de pez cebra con neutrófilos fluorescentes verdes Tg(mpx:eGFP)i114 o macrófagos Tg(mpeg1:eGFP)gl22, se cuantificó el número total de ambas poblaciones celulares en larvas completas a 72 hpf. La inhibición genética de varios componentes de inflamasoma, concretamente Gbp4, Asc y Caspa, el homólogo funcional de CASP1 de mamífero (Kuri et al., 2017; Masumoto et al., 2003; Tyrkalska et al., 2016), dio como resultado números reducidos significativos de ambos neutrófilos (figura 1a, 1b) y macrófagos (figura 11a, 11b). De manera similar, la inhibición farmacológica de caspasa-1 con el inhibidor irreversible Ac-YVAD-CMK (Tyrkalska et al., 2016) también dio como resultado números reducidos de células mieloides (figura 1c, 1d, 11c, 11d). Estos resultados se confirmaron usando una línea transgénica independiente Tg(lyz:dsRED)nz50 con neutrófilos marcados (figura 12a-12d). De manera similar, la expresión forzada del mutante deficiente en GTPasa de Gbp4 (KS/AA) así como su mutante doble (DM: KS/AA; ACARD), ambos de los cuales se comportan como negativos dominantes (DN) e inhiben la activación de caspasa-1 dependiente de inflamasomas (Tyrkalska et al., 2016), dio como resultado un número de neutrófilos reducido (figura 1e, 1f). Además, aunque la activación del inflamasoma por la expresión forzada de o bien Gbp4, o bien Asc o bien Caspa no pudo aumentar los números de neutrófilos (figura 1e-1h) o macrófagos (figura 11e-11f), pudo rescatar el número de células mieloides y la actividad de caspasa-1 en peces deficientes en Gbp4 y Asc (figura 1g-1j). De manera notable, sin embargo, la expresión simultánea de Asc y Caspa aumentó significativamente el número de neutrófilos (figura 1i, 1j) y macrófagos (figura 11e, 11f).Using transgenic zebrafish lines with green fluorescent neutrophils Tg ( mpx: eGFP) i114 or macrophages Tg ( mpeg1: eGFP) gl22, the total number of both cell populations in whole larvae was quantified at 72 hpf. Genetic inhibition of various inflammasome components, specifically Gbp4, Asc and Caspa, the functional homologue of mammalian CASP1 (Kuri et al., 2017; Masumoto et al., 2003; Tyrkalska et al., 2016), resulted in numbers Significant reductions of both neutrophils (Figure 1a, 1b) and macrophages (Figure 11a, 11b). Similarly, pharmacological inhibition of caspase-1 with the irreversible inhibitor Ac-YVAD-CMK (Tyrkalska et al., 2016) also resulted in reduced numbers of myeloid cells (Figure 1c, 1d, 11c, 11d). These results were confirmed using an independent Tg ( lyz: dsRED) nz50 transgenic line with labeled neutrophils (Figure 12a-12d). Similarly, forced expression of the Gbp4 GTPase-deficient mutant (KS / AA) as well as its double mutant (DM: KS / AA; ACARD), both of which behave as dominant negative (DN) and inhibit activation of inflammasome-dependent caspase-1 (Tyrkalska et al., 2016), resulted in a reduced number of neutrophils (Figure 1e, 1f). Furthermore, although the activation of the inflammasome by the forced expression of either Gbp4, or Asc or Caspa could not increase the numbers of neutrophils (Figure 1e-1h) or macrophages (Figure 11e-11f), it was able to rescue the number of cells myeloids and caspase-1 activity in fish deficient in Gbp4 and Asc (Figure 1g-1j). Notably, however, the simultaneous expression of Asc and Caspa significantly increased the number of neutrophils (Figure 1i, 1j) and macrophages (Figure 11e, 11f).

El inflamasoma regula la diferenciación de HSC pero es dispensable para su aparición The inflammasome regulates the differentiation of HSC but is dispensable for its appearance

La diferenciación de HSC y células progenitoras para dar diversos tipos de células sanguíneas se controla mediante múltiples factores extrínsecos e intrínsecos y la desregulación en hematopoyesis puede dar como resultado varias anomalías hematológicas (Morrison et al., 1997; Yang et al., 2007). Los trastornos inflamatorios crónicos están asociados habitualmente a neutrofilia y anemia, la denominada anemia de enfermedades crónicas (ACD). Por tanto, se examinó a continuación si el inflamasoma también regulaba la eritropoyesis usando una línea transgénica de pez cebra Tg(lcr:eGFP), que tiene expresión de GFP eritroide específica (Ganis et al., 2012). Los resultados mostraron que la actividad de inflamasoma tuvo el efecto inverso sobre los eritrocitos que sobre las células mieloides; es decir, la abundancia de eritrocitos aumentó tras la inhibición de inflamasoma farmacológica y genética, tal como se sometió a ensayo mediante citometría de flujo (figura 2a-2f). Sin embargo, la expresión de cmyb y runxl, que empieza por 36 hpf y marca células progenitoras y madre hematopoyéticas definitivas emergentes (Burns et al., 2005), no resultó afectada en larvas deficientes en Gbp4 y Asc a 48 hpf, tal como se sometió a ensayo mediante hibridación in situ de montaje completo (WISH) (figura 13a). De manera similar, la expresión de ragl, que se expresa en células T tímicas diferenciadas no resultó afectada aparentemente por 5 dpf en larvas deficientes en inflamasoma (figura 13a). En conjunto, estos resultados sugieren un papel específico del inflamasoma en la regulación del equilibrio entre mielopoyesis y eritropoyesis.The differentiation of HSCs and progenitor cells to various types of blood cells is controlled by multiple intrinsic and extrinsic factors, and dysregulation in hematopoiesis can result in various hematologic abnormalities (Morrison et al., 1997; Yang et al., 2007). Chronic inflammatory disorders are commonly associated with neutrophilia and anemia, the so-called anemia of chronic disease (ACD). Therefore, it was next examined whether the inflammasome also regulated erythropoiesis using a transgenic zebrafish line Tg ( lcr: eGFP), which has specific erythroid GFP expression (Ganis et al., 2012). The results showed that inflammasome activity had the inverse effect on erythrocytes than on myeloid cells; that is, the abundance of erythrocytes increased after pharmacological and genetic inflammasome inhibition, as tested by flow cytometry (Figure 2a-2f). However, the expression of cmyb and runxl, which begins at 36 hpf and marks emerging definitive hematopoietic progenitor and stem cells (Burns et al., 2005), was not affected in larvae deficient in Gbp4 and Asc at 48 hpf, as shown assayed by whole mount in situ hybridization (WISH) (Figure 13a). Similarly, the expression of ragl, which is expressed in differentiated thymic T cells, was apparently unaffected by 5 dpf in inflammasome-deficient larvae (Figure 13a). Taken together, these results suggest a specific role of the inflammasome in regulating the balance between myelopoiesis and erythropoiesis.

Para confirmar además el papel del inflamasoma en la diferenciación de HSC, se cuantificó el número de HSC en la línea transgénica Tg(runx1:GAL4; UASnfsB-mCherry) que ha marcado HSC (Tamplin et al., 2015), tras inhibición farmacológica o genética del inflamasoma en diferentes fases del desarrollo (24 y 48 hpf). La inhibición de caspasa-1 no dio como resultado cambios en el número de HSC en cualquier punto del tratamiento, confirmándose el resultado en larvas deficientes en Asc (figura 3a-h). Además, la inhibición genética del inflamasoma en neutrófilos y HSC mediante la expresión forzada de formas DN de Asc (AscACARD) o Gbp4 (Gbp4KS/AA) (Tyrkalska et al., 2016) usando los promotores específicos mpx y runxl, respectivamente, mostró que el número de neutrófilos disminuía en HSC, pero no en larvas deficientes en inflamasoma de neutrófilos (figura 3i-3l). En conjunto, estos resultados confirman la dispersabilidad del inflamasoma para la aparición y renovación de HSC, pero que se requiere intrínsecamente para la diferenciación de HSC.To further confirm the role of the inflammasome in HSC differentiation, the number of HSCs in the Tg transgenic line ( runx1: GAL4; UASnfsB-mCherry) that has marked HSC (Tamplin et al., 2015) was quantified, after pharmacological inhibition or genetics of the inflammasome at different stages of development (24 and 48 hpf). Caspase-1 inhibition did not result in changes in the number of HSCs at any point in the treatment, confirming the result in Asc-deficient larvae (Figure 3a-h). Furthermore, the genetic inhibition of the inflammasome in neutrophils and HSCs by the forced expression of DN forms of Asc (AscACARD) or Gbp4 (Gbp4KS / AA) (Tyrkalska et al., 2016) using the specific promoters mpx and runxl, respectively, showed that the number of neutrophils was decreased in HSC, but not in larvae deficient in neutrophil inflammasome (Figure 3i-3l). Taken together, these results confirm the dispersibility of the inflammasome for appearance and renewal of HSC, but which is intrinsically required for HSC differentiation.

El pez cebra es un modelo elegante para la ablación celular mediante el uso de las líneas transgénicas específicas que expresan la nitroreductasa bacteriana, codificada por el gen nfsB, bajo el control de promotores específicos (Davison et al., 2007). La enzima nitroreductasa convierte el fármaco metronidazol (Mtz) en un producto citotóxico, que induce muerte celular en células expresoras para logar ablación específica de tejido que no tiene efecto sobre otras poblaciones celulares (Curado et al., 2007; Curado et al., 2008; Prajsnar et al., 2012). Usando este enfoque, se extirparon neutrófilos en Tg(mpx:Gal4; UAS.nfsB-mCherry) aplicando Mtz durante 24 h y después se analizó la recuperación de neutrófilos en presencia o ausencia del inhibidor de caspasa-1 durante 6 días (figura 4a). Mtz redujo de manera robusta el número de neutrófilos, que empezó a recuperarse a los 4 días tras la ablación en larvas de control (figura 5B, 5C). Sin embargo, la inhibición farmacológica del inflamasoma afectó a la recuperación de neutrófilos tras la ablación y disminuyó fuertemente la abundancia de neutrófilos en larvas no extirpadas (figura 4b, 4c). Tal como se esperaba, el tratamiento con Mtz continuo dio como resultado una diminución de neutrófilos drástica pero no mostró ningún efecto tóxico sobre larvas de control que no expresaban la nitroreductasa (figura 4b, 4c). Estos resultados indican que el inflamasoma es indispensable para la diferenciación mieloide de HSC.Zebrafish is an elegant model for cellular ablation through the use of specific transgenic lines that express bacterial nitroreductase, encoded by the nfsB gene , under the control of specific promoters (Davison et al., 2007). The nitroreductase enzyme converts the drug metronidazole (Mtz) into a cytotoxic product, which induces cell death in expressing cells to achieve tissue-specific ablation that has no effect on other cell populations (Curado et al., 2007; Curado et al., 2008 ; Prajsnar et al., 2012). Using this approach, neutrophils were excised in Tg ( mpx: Gal4; UAS.nfsB-mCherry) by applying Mtz for 24 h and then the recovery of neutrophils in the presence or absence of the caspase-1 inhibitor for 6 days was analyzed (Figure 4a). Mtz robustly reduced the number of neutrophils, which began to recover 4 days after ablation in control larvae (Figure 5B, 5C). However, pharmacological inhibition of the inflammasome affected neutrophil recovery after ablation and strongly decreased the abundance of neutrophils in unresected larvae (Figure 4b, 4c). As expected, continuous Mtz treatment resulted in drastic neutrophil depletion but did not show any toxic effect on control larvae that did not express nitroreductase (Figure 4b, 4c). These results indicate that the inflammasome is indispensable for the myeloid differentiation of HSC.

La inhibición de inflamasomas perjudica la mielopoyesis impulsada por la demanda En respuesta a la infección, el tejido hematopoyético potencia la producción y movilización de neutrófilos, que tienen una vida corta y se necesitan en grandes cantidades para luchar contra las infecciones. Este proceso se denomina hematopoyesis impulsada por la demanda o de emergencia (Hall et al., 2012). Para comprobar si sólo la hematopoyesis de estado estable o también la impulsada por la demanda se regulaban por el inflamasoma, se infectó con Salmonella typhimurium en la vesícula ótica de larvas 48 hpf y se contó el número de neutrófilos total a 24 hpi en presencia o ausencia del inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK. Se observó que la inhibición farmacológica del inflamasoma podía anular la mielopoyesis impulsada por infección, que dio como resultado un número aumentado de neutrófilos en larvas infectadas (figura 5a, 5b). De manera notable, la expresión forzada de factor estimulante de colonias de granulocitos (Gcsf), que estimula tanto la granulopoyesis de estado estable como impulsada por la demanda en pez cebra (Hall et al., 2012; Stachura et al., 2013), aumentó drásticamente el número de neutrófilos a niveles similares en larvas de tipo natural y deficientes en Asc, así como en larvas tratadas con el inhibidor de caspasa-1, sin afectar a la actividad de caspasa-1 (figura 5c-5f). No obstante, Gcsf no pudo rescatar la mayor susceptibilidad a infección por S. typhimurium de larvas deficientes en Asc y larvas tratadas con inhibidor de caspasa-1 (figura 5g, 5h), lo que confirma resultados previos en larvas deficientes en Gbp4 (Tyrkalska et al., 2016). Todos estos resultados también sugieren que el inflamasoma regula la decisión de destino mieloide/eritroide además de la función de células mieloides maduras. Inhibition of inflammasomes impairs demand-driven myelopoiesis In response to infection, hematopoietic tissue enhances the production and mobilization of neutrophils, which are short-lived and needed in large quantities to fight infection. This process is called demand-driven or emergency hematopoiesis (Hall et al., 2012). To check whether only steady-state hematopoiesis or also demand-driven hematopoiesis were regulated by the inflammasome, 48 hpf larval otic vesicle was infected with Salmonella typhimurium and the total number of neutrophils was counted at 24 hpi in the presence or absence of the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK. It was observed that pharmacological inhibition of the inflammasome could nullify infection-driven myelopoiesis, resulting in a number of increased neutrophils in infected larvae (Figure 5a, 5b). Notably, the forced expression of granulocyte colony stimulating factor (Gcsf), which stimulates both steady-state and demand-driven granulopoiesis in zebrafish (Hall et al., 2012; Stachura et al., 2013), the number of neutrophils dramatically increased to similar levels in wild-type and Asc-deficient larvae, as well as in larvae treated with the caspase-1 inhibitor, without affecting caspase-1 activity (Figure 5c-5f). However, Gcsf could not rescue the greater susceptibility to infection by S. typhimurium of larvae deficient in Asc and larvae treated with caspase-1 inhibitor (Figure 5g, 5h), which confirms previous results in larvae deficient in Gbp4 (Tyrkalska et al. al., 2016). All of these results also suggest that the inflammasome regulates myeloid / erythroid fate decision in addition to the function of mature myeloid cells.

El inflamasoma desplaza el equilibrio de Spi1/Gata1 favoreciendo la diferenciación mieloideThe inflammasome shifts the balance of Spi1 / Gata1 favoring myeloid differentiation

Se ha demostrado que la regulación de Spi1 y Gata1 es crítica para la diferenciación de células mieloides y eritroides, respectivamente, en todos los vertebrados. Puesto que la inhibición del inflamasoma dio como resultado un sesgo de linaje hematopoyético, es decir, células sanguíneas mieloides reducidas y células sanguíneas eritroides aumentadas, entonces se analizaron los niveles de spi1 y GATA1 por RT-qPCR y WISH. Se observaron niveles de transcrito aumentados de gata1 a 24 hpf en larvas deficientes en Gbp4 y Asc, mientras que los niveles de los genes que codifican para spi1 y factores de crecimiento de macrófagos y neutrófilos pivotales aguas abajo, concretamente factores estimulantes de colonias de macrófagos y granulocitos (genes mcsf y gcsf), no estaban afectados en gran medida (figuras 5i). De manera importante, los niveles de la proteína Gata1 también se ajustaron por el inflamasoma, puesto que la inhibición genética de o bien Asc o bien Gbp4 pudo aumentar Gata1, mientras que la expresión forzada de Asc y Caspa, que dio como resultado un número aumentado de neutrófilos y macrófagos (figura 1i, 1j, 11e, 11f), disminuyó de manera robusta Gata1 (figura 5j). Por tanto, el inflamasoma regula la decisión de destino de células mieloides/eritroides mediante el ajuste de los niveles de GATA1. Regulation of Spi1 and Gata1 has been shown to be critical for the differentiation of myeloid and erythroid cells, respectively, in all vertebrates. Since the inhibition of the inflammasome resulted in a hematopoietic lineage bias, that is, reduced myeloid blood cells and increased erythroid blood cells, then the levels of spi1 and GATA1 were analyzed by RT-qPCR and WISH. Increased transcript levels of gata1 to 24 hpf were observed in Gbp4 and Asc deficient larvae, while levels of genes encoding spi1 and pivotal downstream neutrophil and macrophage growth factors, specifically macrophage colony stimulating factors and granulocytes ( mcsf and gcsf genes ) were largely unaffected (Figures 5i). Importantly, the levels of the Gata1 protein were also adjusted for the inflammasome, since genetic inhibition of either Asc or Gbp4 could increase Gata1, while forced expression of Asc and Caspa, which resulted in increased numbers of neutrophils and macrophages (Figure 1i, 1j, 11e, 11f), Gata1 was robustly decreased (Figure 5j). Thus, the inflammasome regulates myeloid / erythroid cell fate decision by adjusting GATA1 levels.

La regulación de diferenciación de HSC por el inflamasoma se conserva evolutivamenteThe regulation of HSC differentiation by the inflammasome is evolutionarily conserved

A continuación, se buscó determinar si el inflamasoma también regula la hematopoyesis humana. El análisis bioinformático de los perfiles de expresión de genes que codifican para componentes de inflamasoma en células progenitoras y madre hematopoyéticas normales (conjunto de datos de GEO GSE63270) (Jung et al., 2015) reveló los niveles esperados aumentados de GATA1 en progenitor mieloide común (CMP) y progenitores megacariocíticos-eritroides (MEP). En cambio, los niveles de transcrito de CASP1 disminuyeron tanto en CMP como MEP, mientras que PYCARD, que codifica para ASC, NLRP3, NLRP1 y GBP5 sólo se redujo en MEP pero no en CMP. Sin embargo, los niveles de IL1B no mostraron un patrón claro asociado con eritropoyesis o mielopoyesis.Next, we sought to determine if the inflammasome also regulates human hematopoiesis. Bioinformatic analysis of expression profiles of genes encoding inflammasome components in normal hematopoietic progenitor and stem cells (GEO data set GSE63270) (Jung et al., 2015) revealed the expected increased levels of GATA1 in common myeloid progenitor (CMP) and megakaryocytic-erythroid progenitors (MEP). In contrast, the transcript levels of CASP1 decreased in both CMP and MEP, while PYCARD, which codes for ASC, NLRP3, NLRP1 and GBP5, was only decreased in MEP but not in CMP. However, IL1B levels did not show a clear pattern associated with erythropoiesis or myelopoiesis.

Entonces se confirmó una estrecha regulación de CASP1, PYCARD, NLRP3 y NLRC4 durante la diferenciación eritroide de HSC CD34+ inducida in vitro mediante eritropoyetina (EPO). Por tanto, los niveles de transcrito de todas ellas se redujeron en el día 3 ó 5 tras la adición de EPO (figura 6a). De manera más interesante, la actividad de caspasa-1 se redujo tras la adición de EPO y permaneció a niveles indetectables hasta 5 días de diferenciación, el tiempo más largo analizado (figura 6b). Estos datos dieron lugar a analizar el impacto de la inhibición farmacológica de CASP1 en la diferenciación eritroide de HSC CD34+ mediante EPO. Sorprendentemente, la inhibición de CASP1 dio como resultado niveles de transcrito de GATA1 aumentados los 3 días de diferenciación eritroide y aquellos del gen que codifica para los marcadores de diferenciación eritroide glicoforina A (GYPA), receptor de transferrina (TFRC) y proteína de transporte de anión banda 3 (SLC4A1) a los 3 ó 5 días tras la adición de EPO (figura 6c).Tight regulation of CASP1, PYCARD, NLRP3 and NLRC4 was then confirmed during erythroid differentiation from CD34 + HSC induced in vitro by erythropoietin (EPO). Therefore, the transcript levels of all of them were reduced on day 3 or 5 after the addition of EPO (Figure 6a). More interestingly, the caspase-1 activity decreased after the addition of EPO and remained at undetectable levels up to 5 days of differentiation, the longest time analyzed (Figure 6b). These data led to an analysis of the impact of the pharmacological inhibition of CASP1 on erythroid differentiation of CD34 + HSC by EPO. Surprisingly, inhibition of CASP1 resulted in increased GATA1 transcript levels within 3 days of erythroid differentiation and those of the gene encoding the markers of erythroid differentiation glycophorin A (GYPA), transferrin receptor (TFRC) and transport protein of Band 3 anion (SLC4A1) at 3 or 5 days after the addition of EPO (Figure 6c).

Para explorar además la relevancia del inflamasoma en la diferenciación eritroide, se usó entonces la línea de células K562 eritroleucémicas humanas, que pueden diferenciarse en eritrocitos en presencia de hemina (Andersson et al., 1979; Koeffler y Golde, 1980). Se encontró que los niveles y actividad de GATA1 aumentaban en fases tempranas de la eritropoyesis, mientras que se reducían en la última fase para permitir la diferenciación eritroide terminal (Ferreira et al., 2005; Whyatt et al., 2000). To further explore the relevance of the inflammasome to erythroid differentiation, the human erythroleukemic cell line K562 was then used, which can differentiate into erythrocytes in the presence of hemin (Andersson et al., 1979; Koeffler and Golde, 1980). GATA1 levels and activity were found to increase in the early stages of erythropoiesis, while they were reduced in the later stage to allow terminal erythroid differentiation (Ferreira et al., 2005; Whyatt et al., 2000).

Tal como se esperaba, se observó que la hemina promovió una acumulación de hemoglobina gradual y niveles de la proteína GATA1 reducidos desde 0 hasta 48 h (figura 7a, 7c). De manera notable, los niveles de transcrito de NLRC4, NLRP3 y CASP1 aumentaron gradualmente, mientras que aquellos de PYCARD tuvieron un máximo a las 12 h y después se redujeron hasta niveles basales. Además, la actividad de CASP1 (figura 7b) y los niveles de proteína (figura 7c) aumentaron progresivamente durante la diferenciación eritroide. Además, CASP1 se distribuyó de manera uniforme tanto en el citosol como en el núcleo (figura 7d). Sorprendentemente, la inhibición farmacológica de CASP1 en células K562 perjudicó la diferenciación eritroide inducida por hemina, evaluada como acumulación de hemoglobina, e inhibió la reducción de GATA1 tanto a las 24 (figura 7e) como a las 48 h (figura 7f, 7g).As expected, hemin was observed to promote gradual accumulation of hemoglobin and reduced GATA1 protein levels from 0 to 48 h (Figure 7a, 7c). Notably, the transcript levels of NLRC4, NLRP3, and CASP1 increased gradually, while those of PYCARD peaked at 12 h and then decreased to baseline levels. In addition, CASP1 activity (Figure 7b) and protein levels (Figure 7c) progressively increased during erythroid differentiation. Furthermore, CASP1 was uniformly distributed in both the cytosol and the nucleus (Figure 7d). Surprisingly, the pharmacological inhibition of CASP1 in K562 cells impaired hemin-induced erythroid differentiation, evaluated as hemoglobin accumulation, and inhibited the reduction of GATA1 at both 24 (Figure 7e) and 48 h (Figure 7f, 7g).

CASP1 puede seleccionar como diana varias proteínas para regular la diferenciación de HSC. Una posibilidad es que CASP1 escinda directamente GATA1, tal como se ha notificado para CASP3, que regula negativamente la eritropoyesis mediante escisión de GATA1 (De Maria et al., 1999). Por tanto, se estudió si CASP1 humana recombinante podía escindir GATA1 humana in vitro. Los resultados mostraron que CASP1 recombinante escindía GATA1 generando fragmentos proteolíticos N y C-terminales de aproximadamente 30 y 15 kDa, respectivamente. La escisión de CASP1 de GATA1 en los residuos D276 y/o D300 puede generar los fragmentos obtenidos, por lo que se generan mutantes de CASP1 individuales y dobles (D276A y D300A) y se encontró que CASP1 sólo podía escindir GATA1 en el residuo D300. En conjunto, todos estos resultados desvelan un papel novedoso, conservado a nivel evolutivo del inflamasoma en la regulación de la decisión del destino eritroide/mieloide y diferenciación eritroide terminal por medio de escisión de GATA1.CASP1 can target various proteins to regulate HSC differentiation. One possibility is that CASP1 directly cleaves GATA1, as has been reported for CASP3, which negatively regulates erythropoiesis by cleavage of GATA1 (De Maria et al., 1999). Therefore, it was studied whether recombinant human CASP1 could cleave human GATA1 in vitro. The results showed that recombinant CASP1 cleaved GATA1 generating N and C-terminal proteolytic fragments of approximately 30 and 15 kDa, respectively. The cleavage of CASP1 from GATA1 at residues D276 and / or D300 can generate the fragments obtained, thus single and double CASP1 mutants (D276A and D300A) are generated and it was found that CASP1 could only cleave GATA1 at residue D300. Taken together, all these results reveal a novel, evolutionarily conserved role of the inflammasome in the regulation of erythroid / myeloid fate decision and terminal erythroid differentiation through GATA1 cleavage.

La inhibición farmacológica del inflamasoma rescata modelos de pez cebra y ratón de inflamación neutrófila y anemiaPharmacological Inhibition of the Inflammasome Rescues Zebrafish and Mouse Models of Neutrophil Inflammation and Anemia

El sesgo de linaje hematopoyético está asociado a enfermedades inflamatorias crónicas, cáncer y envejecimiento (Elias et al., 2017; Marzano et al., 2018; Wu et al., 2014). La dermatosis neutrófila es un grupo de enfermedades caracterizadas por la acumulación de neutrófilos en la piel (Marzano et al., 2018). Se usó un mutante de pez cebra Spint1a como modelo de dermatosis neutrófila, ya que se caracteriza por fuerte infiltración de neutrófilos en la piel (Carney et al., 2007; Mathias et al., 2007). Se encontró que las larvas deficientes en Spint1a tenían actividad de caspasa-1 aumentada (figura 8a) y razón de spi1/gata1 alterada (figura 8b). De manera notable, aunque la inhibición farmacológica de caspasa-1 no pudo rescatar la infiltración cutánea de neutrófilos de animales deficientes en Spint1a (figura 8c, 8e), pudo rescatar su neutrofilia robusta (figura 8d, 8e).Hematopoietic lineage bias is associated with chronic inflammatory diseases, cancer, and aging (Elias et al., 2017; Marzano et al., 2018; Wu et al., 2014). Neutrophil dermatosis is a group of diseases characterized by the accumulation of neutrophils in the skin (Marzano et al., 2018). A zebrafish mutant Spint1a was used as a model for neutrophil dermatosis, as it is characterized by strong infiltration of neutrophils into the skin (Carney et al., 2007; Mathias et al., 2007). Spint1a-deficient larvae were found to have increased caspase-1 activity (Figure 8a) and altered spi1 / gata1 ratio (Figure 8b). Notably, although the pharmacological inhibition of caspase-1 could not rescue the cutaneous infiltration of neutrophils from animals deficient in Spint1a (Figure 8c, 8e), it was able to rescue their robust neutrophilia (Figure 8d, 8e).

A continuación se realizó el modelo de anemia de Diamond-Blackfan, una ribosomopatía provocada por la traducción ineficaz de GATA1 (Danilova y Gazda, 2015), en larvas de pez cebra reduciendo los niveles de GATA1 usando un morfolino específico. Se valoró en primer lugar el morfolino y se encontró que 1,7 ng/huevo dio como resultado larvas con anemia leve, moderada y grave (figura 8f), mientras que 0,85 ng/huevo y 3,4 ng/huevo tuvieron pocos efectos o drásticos, respectivamente. Por tanto, se examinó si la inhibición farmacológica de caspasa-1 podía rescatar alteraciones de hemoglobina de larvas deficientes en Gata1. Los resultados muestran que el tratamiento de larvas durante 24 h con el inhibidor de caspasa-1 reversible Ac-YVAD-CHO rescató parcialmente los defectos de hemoglobina en larvas deficientes en Gata1 y niveles de proteína de Spi1/Gata1 (figura 8g, 8h). Estos resultados en conjunto demuestran que la inhibición farmacológica de caspasa-1 rescata sesgo de linaje hematopoyético in vivo. Next, the Diamond-Blackfan anemia model, a ribosomopathy caused by ineffective translation of GATA1 (Danilova and Gazda, 2015), was performed in zebrafish larvae by reducing GATA1 levels using a specific morpholino. Morpholino was first assessed and it was found that 1.7 ng / egg resulted in larvae with mild, moderate and severe anemia (Figure 8f), while 0.85 ng / egg and 3.4 ng / egg had few effects or drastic, respectively. Therefore, it was examined whether pharmacological inhibition of caspase-1 could rescue hemoglobin alterations in Gata1-deficient larvae. The results show that the treatment of larvae for 24 h with the reversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CHO partially rescued the hemoglobin defects in larvae deficient in Gata1 and Spi1 / Gata1 protein levels (Figure 8g, 8h). These results together demonstrate that pharmacological inhibition of caspase-1 rescues hematopoietic lineage bias in vivo.

Para confirmar además los resultados anteriores en otro modelo preclínico, se extirpó parcialmente HSC en ratones con 5-fluorouracilo (5-FU) (Coppin et al., 2016) y después se examinaron los efectos de la inhibición farmacológica de caspasa-1 sobre la recuperación de células sanguíneas (figura 9a). Dos únicas inyecciones a los 6 y 7 días tras la inyección de 5-FU del inhibidor de caspasa-1 irreversible Ac-YVAD-CMK (10 mg/Kg) pudieron rescatar la anemia inducida por 5-FU a los 10 días, evaluada como recuento de eritrocitos y niveles de hemoglobina y hematocrito (figura 9b-d). Sin embargo, los ratones tratados con vehículo se recuperaron de la anemia mucho después (14 d tras el tratamiento con 5-FU) (figura 9b-d). De manera notable, los recuentos de plaquetas (figura 9e) y de glóbulos blancos totales (figura 9f) no estaban afectados por la inhibición de CASP1. Estos resultados demuestran que la inhibición farmacológica de caspasa-1 rescata anemia inducida por quimioterapia en modelos de ratón. To further confirm the above results in another preclinical model, HSC was partially excised in mice with 5-fluorouracil (5-FU) (Coppin et al., 2016) and then the effects of pharmacological inhibition of caspase-1 on the recovery of blood cells (figure 9a). Two unique injections at 6 and 7 days after the injection of 5-FU of the irreversible caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-CMK (10 mg / Kg) could rescue the anemia induced by 5-FU at 10 days, evaluated as Erythrocyte count and hemoglobin and hematocrit levels (Figure 9b-d). However, vehicle-treated mice recovered from anemia much later (14 d after 5-FU treatment) (FIG. 9b-d). Notably, platelet (Figure 9e) and total white blood cell (Figure 9f) counts were unaffected by CASP1 inhibition. These results demonstrate that pharmacological inhibition of caspase-1 rescues chemotherapy-induced anemia in mouse models.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende al menos un inhibidor de caspasa-1 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad seleccionada de la lista que consiste en anemia asociada a enfermedades crónicas, anemia inducida por quimioterapia y anemia de Diamond-Blackfan.A composition comprising at least one caspase-1 inhibitor for use in a method of treating a disease selected from the list consisting of anemia associated with chronic diseases, anemia induced by chemotherapy and Diamond-Blackfan anemia.

2. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de caspasa 1 tiene el motivo: X o X—W, en donde X es una estructura selectiva de caspasa-1 en relación con otras cisteína proteasas, en la que la selectividad de un sustrato para una caspasa se determina mediante ensayos bioquímicos y basados en células en enzimas relacionadas, y2. Composition for use according to claim 1, wherein the caspase 1 inhibitor has the motif: X or X — W, wherein X is a selective structure of caspase-1 relative to other cysteine proteases, wherein the selectivity of a substrate for a caspase is determined by biochemical and cell-based assays on related enzymes, and

en la que W representa un resto químico que comprende —NH—CH(Y)(Z), en donde la ojiva electrófila modifica de manera reversible la caspasa de modo que la caspasa no puede interaccionar con ni escindir un sustrato de caspasa, en donde Y es una estructura que permite que el compuesto inhibidor forme un enlace covalente reversible con una caspasa-1, y en donde Z es un resto carboxilo o un mimético de ácido carboxílico.wherein W represents a chemical moiety comprising —NH — CH (Y) (Z), wherein the electrophilic warhead reversibly modifies caspase such that caspase cannot interact with or cleave a caspase substrate, wherein Y is a structure that allows the inhibitor compound to form a reversible covalent bond with a caspase-1, and wherein Z is a carboxyl moiety or a carboxylic acid mimetic.

3. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de caspasa-1 es ac-YVAD-CMK, que comprende la siguiente estructura química:Composition for use according to claim 1, wherein the caspase-1 inhibitor is ac-YVAD-CMK, comprising the following chemical structure:

alquier sal del mismo o cualquier forma estereoisomérica.any salt thereof or any stereoisomeric form.

4. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de caspasa-1 es z-YVAD-FMK, que comprende la siguiente estructura química:Composition for use according to claim 1, in which the caspase-1 inhibitor is z-YVAD-FMK, comprising the following chemical structure:

5. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de caspasa-1 es z-WEHD-FMK, que comprende la siguiente estructura química: Composition for use according to claim 1, in which the caspase-1 inhibitor is z-WEHD-FMK, comprising the following chemical structure:

6. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de caspasa-1 es z-WEHD-CHO, que comprende la siguiente estructura química:Composition for use according to claim 1, in which the caspase-1 inhibitor is z-WEHD-CHO, comprising the following chemical structure:

alquier sal del mismo o cualquier forma estereoisomérica. any salt thereof or any stereoisomeric form.

7. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de caspasa-1 es Ac-YVAD-CHO, que comprende la siguiente estructura química:7. Composition for use according to claim 1, wherein the caspase-1 inhibitor is Ac-YVAD-CHO, comprising the following chemical structure:

8. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de caspasa-1 es ac-YVKD-CHO, que comprende la siguiente estructura química:Composition for use according to claim 1, in which the caspase-1 inhibitor is ac-YVKD-CHO, comprising the following chemical structure:

9. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de caspasa-1 es Ac-YVAD-FMK, que comprende la siguiente estructura química:9. Composition for use according to claim 1, wherein the caspase-1 inhibitor is Ac-YVAD-FMK, comprising the following chemical structure:

10.Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de caspasa-1 es Ac-YVAD-AOM, que comprende la siguiente estructura química:10. Composition for use according to claim 1, wherein the caspase-1 inhibitor is Ac-YVAD-AOM, comprising the following chemical structure:

Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de caspasa-1 es Z-D-CH2-DCB, que comprende la siguiente estructura química:Composition for use according to claim 1, in which the caspase-1 inhibitor is Z-D-CH2-DCB, comprising the following chemical structure:

uier sal del mismo o cualquier forma estereoisomérica.any salt thereof or any stereoisomeric form.

Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de caspasa-1 es VX-765, que comprende la siguiente estructura química: Composition for use according to claim 1, wherein the caspase-1 inhibitor is VX-765, comprising the following chemical structure:

Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que dicha composición es una composición farmacéutica preparada para la administración a un sujeto, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. Composition for use according to claim 1, wherein said composition is a pharmaceutical composition prepared for administration to a subject, comprising a therapeutically effective amount of one or more of the compounds as defined in any one of claims 1 to 12.