ES2759065T3 - Medicamento y método para tratar enfermedades de respuestas inmunes innatas - Google Patents

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Abstract

Un complemento dietético o una composición farmacéutica que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger, una prolil-endopeptidasa y excipientes farmacéutica o dietéticamente aceptables.

Description

DESCRIPCIÓN
Medicamento y método para tratar enfermedades de respuestas inmunes innatas
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a un medicamento o un complemento dietético que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger que es capaz de hidrolizar alérgenos alimentarios vegetales y, más en particular, inhibidores de alfa-amilasa/tripsina, tratando con ello enfermedades debidas a una respuesta inmune innata en seres humanos, y/o permitiendo retrasar la aparición de dichas enfermedades. La presente invención se refiere al descubrimiento de que la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger es capaz de hidrolizar inhibidores de alfa-amilasa/tripsina que están presentes en el trigo y en cereales relacionados, siendo dichos inhibidores fuertes inductores de la respuesta inmune innata. Además, la presente invención se refiere a un método para hidrolizar inhibidores de alfa-amilasa/tripsina, que comprende incubar una composición para consumo alimentario que comprende inhibidores de alfa-amilasa/tripsina con la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger, en donde los inhibidores se hidrolizan. También se refiere a una composición enzimática que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger y una enzima adicional, y a alimentos que comprenden la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los alérgenos alimentarios vegetales son un grupo extendido de proteínas vegetales que comprenden superfamilias de cupina y prolamina, así como moléculas proteicas del sistema de defensa de las plantas. La superfamilia de prolamina incluye varios tipos importantes de alérgenos de legumbres, nueces de árbol, cereales, frutas y verduras, y los inhibidores de alfa-amilasa y proteasa de cereales. Las prolaminas de cereales son principales proteínas de almacenamiento del endospermo de los cereales y se denominan gluteninas y gliadinas en el trigo, secalinas en el centeno y hordeinas en la cebada. Los inhibidores proteicos de alfa-amilasa son proteínas sin gluten. En base a la similitud estructural, los inhibidores proteicos de la alfa-amilasa de origen vegetal se clasifican habitualmente en seis familias, incluidas las proteínas de tipo lectina, de tipo knottin, de CM, de tipo Kunitz, de tipo c-purotionina y de tipo taumatina (Richardson, 1990). Las proteínas CM (cloroformo-metanol) son una gran familia de proteínas de semillas de cereales que contienen de 120 a 160 residuos aminoácidos y cinco enlaces disulfuro. Muestran un dominio típico de alfa-amilasa/tripsina de doble cabeza. Esta característica hace posible que inhiban la actividad de alfa-amilasa y enzimas similares a tripsina. El inhibidor de alfa-amilasa 0.19 es uno de los inhibidores más estudiados de esta familia; Tiene una amplia especificidad e inhibe las alfa-amilasas de insectos, aves y mamíferos.
Además, las proteínas de defensa de las plantas también comprenden inhibidores de proteasa. La mayoría de los órganos de almacenamiento de plantas, tales como semillas y tubérculos, contienen 1-10% de sus proteínas totales como inhibidores de proteasas con diferentes propiedades bioquímicas y estructurales que inhiben diferentes tipos de proteasas. Los inhibidores de proteínas se clasifican según el tipo de enzima que inhiben: inhibidores de serina proteasa, inhibidores de cisteína proteasa, inhibidores de proteasa aspártica o inhibidores de metalocarboxiproteasa.
El documento WO 2011/137322 describió recientemente que miembros de la familia de inhibidores de alfaamilasa/tripsina sin gluten contenidos en el trigo y cereales relacionados son inductores fuertes de la respuesta inmune innata en el intestino humano, contribuyendo así a enfermedades tales como la enfermedad celíaca. Además, los inhibidores de alfa-amilasa/tripsina también son factores clave que contribuyen a enfermedades o afecciones tales como la sensibilidad al gluten, el síndrome del intestino irritable, la enfermedad inflamatoria intestinal, pero también la inflamación no intestinal.
El documento WO 95/02044 describe dos proteasas con genes de proteasas que tienen una homología del 74,7% y del 75,5% con un gen de aspergopepsina O de Aspergillus oryzae.
La enfermedad celíaca, también conocida como esprúe celíaco, enteropatía sensible al gluten o intolerancia al gluten es una de las más frecuentes intolerancias a los alimentos en todo el mundo, con mayor prevalencia en Europa, América del Norte y del Sur y Australia. La enfermedad celíaca es una enfermedad inflamatoria del intestino delgado superior en personas genéticamente predispuestas, desencadenada por la ingestión de trigo, cebada, centeno y sus variedades relacionadas entre sí que conduce a un síndrome de mala absorción.
El gluten es una proteína de la dieta común presente en el trigo, la cebada, el centeno y sus variedadesrelacionadas entre sí. El gluten es una mezcla compleja de moléculas de glutenina y prolamina ricas en glutamina y prolina, que se cree que es el factor responsable de la inducción de la enfermedad celíaca en individuos humanos sensibles. Debido a su estructura inusual, con un alto contenido de prolina y glutamina, las proteínas del gluten son parcialmente resistentes a las enzimas intestinales, lo que conduce a varios péptidos inmunogénicos no degradados que pueden ser detectados por el sistema inmunitario intestinal. La ingestión de este tipo de proteínas por individuos sensibles produce el aplanamiento del revestimiento epitelial normalmente lujoso, similar a un tapete, del intestino delgado que se sabe que es el responsable de la digestión terminal eficiente y extensa de péptidos y otros nutrientes. Los síntomas clínicos del esprúe celíaco incluyen fatiga, diarrea crónica, mala absorción de nutrientes, pérdida de peso, distensión abdominal, anemia, así como un riesgo sustancialmente potenciado de desarrollar osteoporosis y neoplasias intestinales (linfoma y carcinoma). La enfermedad tiene una incidencia de aproximadamente 1 de cada 200 en las poblaciones europeas y norteamericanas.
El tratamiento esencial actual de la intolerancia al gluten es una eliminación estricta permanente de forma gluten de la dieta, que es difícil de mantener. Sin embargo, es importante definir dos categorías de intolerancia al gluten para comprender cómo la enfermedad se ve afectada por la acción enzimática en el intestino. El esprúe celíaco es una afección autoinmune, un trastorno genético inflamatorio del intestino delgado. Cuando las proteínas del gluten se descomponen durante la digestión, se fragmentan. Estos fragmentos de proteínas se denominan péptidos. En los enfermos celíacos, un tipo de péptido inicia una respuesta inapropiada del sistema inmunitario en el intestino delgado, y las células intestinales están dañadas.
Un segundo tipo intolerancia al gluten resulta cuando el intestino está lesionado por algo distinto de la enfermedad celíaca - el efecto negativo de una infección por bacterias o levaduras, por ejemplo, que resulta en la pérdida de las enzimas intestinales que, a su vez, conduce a una mala digestión del gluten. Si bien complementar a las personas con enzimas puede ser beneficioso para los enfermos celíacos, estos deben seguir una dieta estrictamente libre de gluten debido a la posible fuerza de la reacción autoinmune cuando no se digieren los rastros de gluten.
El uso de enzimas específicas como complemento puede ser efectivo para minimizar la necesidad de una dieta exenta de gluten para aquellos individuos en riesgo de desarrollar intolerancia al gluten, para individuos sensibles al gluten o en los que la intolerancia al gluten se debe a una lesión intestinal.
El uso de enzimas proteolíticas exógenas para la desintoxicación de gluten ha sido una de las estrategias más prometedoras para la gestión de la enfermedad celíaca. Enzimas de este tipo se han utilizado tanto en el pretratamiento de harinas que contienen gluten como en complementos. Las prolil-endopeptidasas son enzimas digestivas del gluten conocidas que han demostrado digerir péptidos de gliadina (documentos WO 2002/45524 y WO 2002/46381).
El documento WO 2011/137322 describió el uso de anticuerpos contra la alfa-amilasa CM 3 con el fin de tratar pacientes celíacos o composiciones alimenticias, y considera el uso de proteasa como una alternativa. Sin embargo, es silencioso con respecto a un tratamiento enzimático específico para hidrolizar eficientemente los inhibidores de alfa-amilasa/tripsina en el tracto gastrointestinal o en el pretratamiento de alimentos derivados de trigo, cebada, centeno y sus variedades relacionadas.
Las indolinas y purotioninas comprenden un grupo de proteínas de bajo peso molecular ricas en azufre y básicas que están presentes en el endosperma de varias gramíneas. Por ejemplo, la identidad de secuencia de alfapurotioninas de trigo, centeno y cebada es más del 80%. Purotionina es un miembro de una familia de alergias designada por la Organización Mundial de la Salud-Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas como "Tri a 37" y podría representar un marcador de diagnóstico para un riesgo incrementado de anafilaxia inducida por trigo (Pahr etal., J Allergy Cin Immunol., 132 (4), págs. 1000-1003).
Sería deseable proporcionar una manera segura, eficaz y rentablemente competitiva para degradar los inhibidores de alfa-amilasa/tripsina en el tracto gastro intestinal, así como en composiciones alimentarias que comprenden este tipo de inhibidores con el fin de tratar la enfermedad celíaca, mejorar el confort gastrointestinal en individuos celíacos o no celíacos sensibles al gluten, o para retrasar la aparición de molestias gastrointestinales en individuos sanos no celíacos sensibles al gluten al reducir la exposición del intestino a los alérgenos vegetales y más específicamente a inhibidores de alfa-amilasa/tripsina, tales como CM 3 y 0.19. El uso de acuerdo con la presente invención no solo resuelve el problema de la sensibilidad / alergia al gluten, sino que también permite estabilizar la espuma cuando se utiliza para degradar los inhibidores de la amilasa y la tripsina en la cerveza.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Sorprendentemente, los autores de la presente invención han encontrado que una enzima: la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger tiene un gran potencial para hidrolizar alérgenos vegetales tales como inhibidores de alfa-amilasa/tripsina en el sistema gastrointestinal de un individuo, así como en matrices de alimentos que contienen dichos inhibidores y, por lo tanto, puede utilizarse como medicamento, complemento dietético, en el pre-tratamiento de alimentos o en un proceso para preparar un producto horneado.
La presente invención se refiere, por lo tanto, a un complemento dietético o una composición farmacéutica que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger, una prolilendopeptidasa, y excipientes farmacéutica o dietéticos aceptables. La peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger (AGP), anteriormente denominada aspergilopepsina II aislada de Aspergillus niger var. macrosporus (EC 3.4.23.19) es una proteasa única que pertenece a la familia de peptidasas A4. Esta enzima no es homóloga a las proteasas aspárticas que pertenecen a las peptidasas de la familia A1, que son las proteasas ácidas típicas de tipo pepsina, por lo que son insensibles a sus inhibidores específicos tales como pepstatina A. Por lo tanto, esta enzima también se clasificó como proteinasa ácida 'insensible a la pepstatina'. Entre las peptidasas glutámicas conocidas hasta ahora, la AGP es característica, porque es la única enzima de dos cadenas. La secuencia de aminoácidos de la enzima no tiene homología con las de las proteinasas aspárticas típicas.
La expresión peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger de acuerdo con la presente invención incluye enzimas que tienen al menos un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger (identificador UniProtKB/Swiss-Prot P24665), por ejemplo una enzima que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad con P24665. Las enzimas homólogas más preferidas de acuerdo con la presente invención son la peptidasa scytalidoglutamis de Scytalidium lignicolum, las peptidasas ácidas B y C de Crypphonectria parasítica y una proteasa ácida de Sclerotina sclerotiorum.
La peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger en el complemento dietético o la composición farmacéutica tal como se describe en esta memoria puede estar presente en una forma pura, o como una preparación que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger, en donde al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad de la proteasa se deriva de la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger, en donde la actividad se expresa en HPU (unidades de histidina proteasa); una HPU es la cantidad de enzima que hidroliza una cantidad de hemoglobina por minuto, dando una solución con una densidad óptica a 275 nm igual a la densidad óptica de una solución que contiene 1 gg de L-tirosina por mL en una solución 0,1 mol/L de HCl. Las condiciones del ensayo son: pH 1,75, temperatura 40 °C, concentración de hemoglobina durante la incubación 16,7 g/L.
Actividad (HPU/mL) = DOmuestra-DOblanco / S) X 11/30
en donde
DOmuestra: Densidad óptica del filtrado de muestra (275 nm)
DOblanco: Densidad óptica del filtrado de muestra en blanco (275 nm)
S: DO de una solución estándar de L-tirosina de 1,1 gg/mL (mL/gg)
30: tiempo de incubación (minutos)
11: volumen total de la mezcla de reacción (mL).
La peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger de acuerdo con la presente invención se puede preparar tal como se describe en Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barret, N.D. Rawlings y J.F. Woessner eds.; Academic Press; o en el documento PCT/EP2013/066899.
La expresión "composición farmacéutica" se refiere a un medicamento o un fármaco, mientras que la expresión "complemento dietético" se refiere a una pequeña cantidad de un principio activo para la complementación de una dieta humana envasada en unidades individuales o multidosis. Los complementos dietéticos generalmente no proporcionan cantidades significativas de calorías, pero pueden contener otros micronutrientes, tales como minerales o vitaminas.
El complemento dietético o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención comprende, además, excipientes farmacéuticamente aceptables. "Excipientes" significa excipientes, soportes o diluyentes, que incluyen, pero no se limitan a agua, gelatina de cualquier origen, gomas vegetales, ligninsulfonato, talco, azúcares, almidón, celulosa, celulosa microcristalina, goma arábiga, aceites vegetales, polialquilenglicoles, agentes aromatizantes, conservantes, estabilizadores, agentes emulsionantes, tampones, lubricantes, colorantes, agentes humectantes, cargas y similares. El material de soporte puede ser material de soporte orgánico o inorgánico inerte, adecuado para la administración oral/parenteral/inyectable.
En la presente invención, el complemento dietético o la composición farmacéutica de peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger proporciona de 1 a 100 unidades de HPU de peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger, preferiblemente de 10 a 50 HPU por porción.
Además, el complemento dietético o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención comprende, además, una prolil-endopeptidasa. La prolil-endopeptidasa de mamíferos es una enzima citosólica grande que pertenece a una clase distinta de serina peptidasas. Primero se describió en el citosol del cerebro de conejo como una oligopeptidasa, que degrada la bradiquinina nonapeptídica en el enlace Pro-Phe. La enzima está implicada en la maduración y degradación de las hormonas peptídicas y los neuropéptidos, tales como la hormona estimulante de alfa-melanocitos, la hormona liberadora de hormona luteinizante (LH-RH), la hormona liberadora de tirotropina, angiotensina, neurotensina, oxitocina, sustancia P y vasopresina. Una prolil-oligopeptidasa escinde los enlaces peptídicos en el lado C-terminal de los residuos prolina. Su actividad se confina a la acción sobre oligopéptidos de menos de 10 kD y tiene un requisito absoluto para la configuración trans del enlace peptídico que precede a la prolina.
La prolil-endopeptidasa más preferida de acuerdo con la presente invención es la enzima fúngica prolilendopeptidasa Aspergillus niger (AN-PEP). AN-PEP puede obtenerse de DSM Food Specialties (Delft, Países Bajos). La combinación de AN-PEP y AGP permite abordar en un solo complemento dietético o composición farmacéutica ambos aspectos de la intolerancia/sensibilidad al gluten al proporcionar enzimas para la hidrólisis tanto de inhibidores de alfa-amilasa/tripsina como de los epítopos de gluten en el tracto gastrointestinal. En tal caso, el complemento dietético o la composición farmacéutica proporciona de 10.000 a 100.000 Picomoles de Proteasa Internacionales de la enzima prolil-endopeptidasa. La Unidad de Proteasa de Prolina (PPU) se define como la cantidad de enzima que libera 1 gmol de p-nitroanilida por minuto a 37°C en un tampón citrato/fosfato disódico (pH 4,6) utilizando Z-Gly-Pro-pNA 0,37 mM (Bachem, Bubendorf, Suiza) como sustrato.
El complemento dietético o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también pueden comprender, además, una aspergilopepsina I. Aspergilopepsina I (EC 3.4.23.18), también denominada proteasa ácida de Aspergillus, cataliza la hidrólisis de proteínas con una amplia especificidad. En general, favorece los residuos hidrofóbicos en P1 y P1', pero también acepta Lys en P1, lo que conduce a la activación de tripsinógeno. La aspergilopepsina I adecuada para todas las realizaciones de la presente invención puede aislarse de Aspergillus niger, Aspergillus saitoi y Trichoderma reesei. Preferiblemente, la aspergilopepsina I de acuerdo con la presente invención se aísla de Aspergillus niger. En tal caso, el complemento dietético o la composición farmacéutica proporciona de 1 a 1000 unidades HPU de la enzima aspergilopepsina I, más preferiblemente, de 1 a 100 unidades HPU por porción.
El complemento dietético o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención pueden estar en cualquier forma galénica que sea adecuada para la administración a seres humanos, pero se prefieren las formas orales sólidas o líquidas, p. ej., en forma sólida, tales como aditivos/complementos para alimentos, comprimidos, píldoras, gránulos, grageas, cápsulas, formulaciones gomosas y formulaciones efervescentes, tales como polvos y comprimidos. Las composiciones dietéticas y farmacéuticas pueden estar en forma de formulaciones de liberación controlada (retardada).
En todas las realizaciones de la presente invención, el complemento dietético o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención está preferiblemente en forma de un comprimido, una cápsula, una bolsita, o cualquier otra forma de dosificación que incluye formulación líquida. Más preferiblemente, está en forma de un comprimido o una cápsula. Las cápsulas, los comprimidos o las bolsitas u otras formas de dosificación pueden estar en un recipiente que puede adoptar cualquier forma convencional. Por ejemplo, las formas de dosificación se pueden vender en un frasco, botella, caja de lata, bote, dispensador, bolsita o similar que contiene las formas de dosificación en una cantidad predeterminada, tal como un suministro de 30 días, un suministro de 60 días, un suministro de 90 días o en la cantidad que se desee. Adicional y opcionalmente, las cápsulas pueden estar en un envase blíster, en el que cada blíster contiene un número predeterminado de cápsulas, habitualmente una dosis única (típicamente 1-4 cápsulas). La disposición del número de cápsulas en un blíster, el número de blisters en una sola tira de blíster y el número de tiras de blíster que se venden en un grupo puede ser cualquier cantidad o configuración conveniente.
Las composiciones dietéticas o farmacéuticas de acuerdo con la presente invención puede contener, además, hidrocoloides protectores (tales como gomas, proteínas, almidones modificados), aglutinantes, agentes formadores de película, agentes/materiales encapsulantes, materiales de pared/envuelta, compuestos de matriz, recubrimientos, emulsionantes, agentes tensioactivos, agentes solubilizantes (aceites, grasas, ceras, lecitinas, etc.), adsorbentes, soportes, cargas, co-compuestos, agentes dispersantes, agentes humectantes, coadyuvantes de procesamiento (disolventes), agentes de flujo, agentes para enmascarar el sabor, agentes de ponderación, agentes gelificantes, agentes formadores de gel, antioxidantes y agentes antimicrobianos.
En el contexto de la presente invención, una composición farmacéutica se vende con o sin receta, mientras que un complemento dietético es para ser vendido en el mostrador sin receta médica y se ha de considerar como alimento.
En otra realización, la presente invención también se refiere a un complemento dietético o una composición farmacéutica que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger para su uso como un medicamento. Así, la presente invención se refiere al uso de un suplemento dietético o una composición farmacéutica que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger como un medicamento para el tratamiento de enfermedades. Preferiblemente, el medicamento es para el tratamiento de un paciente que padece de respuesta inmune innata en el intestino. Incluso más preferiblemente, el medicamento es para el tratamiento de la enfermedad celíaca, intolerancia al gluten no celíaca, sensibilidad al gluten, síndrome del intestino irritable o enfermedad inflamatoria del intestino. Lo más preferiblemente, el medicamento es un complemento dietético para mantener o potenciar la comodidad gastrointestinal en individuos sensibles al gluten, o para retrasar la aparición de molestias gastrointestinales en individuos celíacos o no celíacos sensibles al gluten, así como para disminuir la exposición al inhibidor de alfa-amilasa/tripsina en individuos sanos, favoreciendo con ello la digestión. Los inhibidores de alfa-amilasa/tripsina que son degradados por la presente composición son los alérgenos vegetales: CM 2, CM 3, CM 16 y 0.19, más preferiblemente CM 3 y 0.19, sobre la base de su rápida degradación por la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger. El identificador de secuencia de aminoácidos CM 3 es SwissProt P01083, mientras que el identificador de secuencia de aminoácidos 0.19 es Swiss Prot P01085.
El medicamento o complemento dietético de acuerdo con la presente invención es para su uso por individuos que están deseosos de reducir su riesgo de desarrollar alergias a los alimentos a la proteína vegetal y experimentar un malestar gastrointestinal correlacionado con el esprúe celíaco, así como intolerancia no celíaca al gluten.
En una realización preferida el medicamento se administra por vía oral en el espacio de 1 hora antes o después de la ingesta de una comida.
"Comodidad gastrointestinal" - es fundamental para la calidad de vida. Fomentar la comodidad digestiva gastrointestinal incluye regular el tiempo de tránsito a través del tracto gastrointestinal y aliviar el dolor asociado con la digestión y trastornos asociados.
"Sensible al gluten no celíaca" - la sensibilidad al gluten no celíaca se ha acuñado para describir aquellos individuos que no pueden tolerar los síntomas del gluten y experimentan síntomas similares a aquellos con enfermedad celíaca, pero que, sin embargo, carecen de los mismos anticuerpos y lesión intestinal como se ven en la enfermedad celíaca. La sensibilidad al gluten no celíaca es otra forma de intolerancia al gluten, en donde la respuesta inmune se caracteriza menos. La sensibilidad al gluten no celíaca comparte muchos síntomas con la enfermedad celíaca. Sin embargo, de acuerdo con Sapone et al. (2012), los individuos con sensibilidad al gluten no celiaca tienen una prevalencia de síntomas extra-intestinales o no gastrointestinales adicionales, tales como dolor de cabeza, "mente nublada", dolor en las articulaciones y entumecimiento en las piernas, brazos o dedos. Los síntomas generalmente aparecen horas o días después de que se ha ingerido gluten, una respuesta típica para afecciones inmunes innatas tales como la sensibilidad al gluten no celíaca.
"Individuo sano" - cuando se utiliza en el contexto de esta invención, el individuo sano no ha sido diagnosticado con una enfermedad celíaca.
"Retrasar el inicio" pretende incluir la mejora de la afección, disminuir la gravedad de los síntomas, intervención temprana y alargar la duración del tiempo antes del inicio de la enfermedad, y no pretende limitarse a una situación en la que el paciente es incapaz de experimentar síntoma alguno de molestias gastrointestinales.
Para el uso de acuerdo con la presente invención, el medicamento o complemento dietético se administra oralmente dentro de 1 hora antes o después de una comida.
En otra realización, la presente invención se refiere a un método para degradar alérgenos vegetales en una composición alimenticia, que comprende incubar una composición alimenticia que contiene alérgenos vegetales con la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger durante un tiempo suficiente para hidrolizar los alérgenos vegetales. La persona experta en la técnica estimará la cantidad de enzima a añadir al alimento, y el tiempo requerido para degradar los alérgenos alimentarios dependiendo de la composición alimenticia que se esté tratando. La detección de alérgenos alimentarios puede realizarse eficazmente mediante el uso de anticuerpos específicos o mediante espectrometría de masas de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Para las matrices de cerveza, la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger se añade a razón de 50 a 2000 HPU/hectolitro de cerveza, preferiblemente 100 a 1000 HPU/hl de cerveza. Para las matrices de composición de horneado, la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger se puede añadir a razón de 10 a 5000 HPU/kg de composición. Matrices de composiciones para hornear adecuadas incluyen, sin limitación, una composición para hornear.
Sorprendentemente, cuando se utiliza la peptidasa aspergiloglutámica en el procesamiento de la cerveza a baja concentración comprendida entre 0,5 y 500 mg/hl, preferentemente entre 1 y 50 mg/hl, más preferiblemente entre 10 y 20 mg/hl, se produce una estabilización de la espuma de la cerveza.
Los alérgenos vegetales degradados por la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger son preferiblemente aquellos encontrados específicamente en trigo, cebada, centeno, avena y sus variedades relacionadas entre sí, tales como inhibidores de alfa-amilasa/tripsina, más preferiblemente, los alérgenos vegetales son CM 2, CM 3, CM 16 y 0.19, e incluso más preferiblemente CM 3 y 0.19, sobre la base de su rápida degradación por la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger. El identificador de secuencia de aminoácidos CM 3 es SwissProt P01083, mientras que el identificador de secuencia de aminoácidos 0.19 es Swiss Prot P01085.
En la presente realización, la composición alimenticia es un alimento que comprende trigo, cebada, centeno, avena y/o sus variedades relacionadas. Composiciones alimenticias preferidas son la cerveza, las diversas etapas del proceso implicadas en la producción de cerveza, una composición para hornear, una masa, una masa agria o un producto horneado tal como el pan.
En el presente método, la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger puede complementarse ventajosamente con una prolil-endopeptidasa, preferiblemente, la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger con el fin de degradar también epítopos de gluten y, opcionalmente, también con una enzima aspergilopepsina I.
La cantidad preferida de enzima a añadir a la composición alimenticia en el método anterior depende de la matriz alimenticia y la cantidad estimada de gluten e inhibidor de alfa-amilasa/tripsina.
En aún otra realización, la presente invención se refiere a un producto alimenticio preparado mediante el método anterior para degradar alérgenos vegetales en un producto alimenticio, que comprende incubar una composición alimenticia que contiene alérgenos vegetales con peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger, durante un tiempo suficiente para hidrolizar los alérgenos vegetales, comprendiendo dicha composición alimenticia inhibidores de alfa-amilasa/tripsina degradados. El alimento preferido es un producto horneado tal como pan, una masa, una cerveza.
En otra realización, la presente invención también se refiere a una composición de hornear y la composición enzimática o una masa que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger. Se refiere, además, a un método para preparar una masa que comprende la etapa de añadir una peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger a al menos un ingrediente de la masa.
Los productos horneados se hacen a menudo utilizando harinas que contienen gluten. Por lo tanto, los productos horneados presentan un producto alimenticio que podría ser relevante para los individuos sensibles al gluten. La composición para hornear de acuerdo con la invención comprende trigo, cebada, centeno, avena y/o sus variedades relacionadas, preferiblemente en forma de harina y la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger. La composición para hornear puede comprender 10 a 5000 HPU de peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger/kg de harina.
En un aspecto, la composición para hornear comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger en una cantidad de 20 a 3000 HPU / kg de harina, en un aspecto en una cantidad de 30 a 1000 HPU / kg de harina, en una cantidad de 40 a 500 HPU / kg de harina, en una cantidad de 50 a 250 HPU / kg de harina. En un aspecto, la composición para hornear comprende 1 ppm - 2000 ppm de peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger que tiene una actividad en un intervalo de aproximadamente 1000 a 50000 HPU/g.
En un aspecto, la composición para hornear comprende 10 - 200 ppm de peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger que tiene una actividad en un intervalo de aproximadamente 1000 a 50000 HPU/g.
La composición para hornear de acuerdo con la invención puede comprender al menos una enzima adicional tal como se describe en esta memoria.
"Enzima adicional" - La expresión enzima adicional en esta memoria y de aquí en adelante incluye, sin limitación, una amilasa, tal como una alfa-amilasa, beta-amilasa, una amilasa maltogénica; una ciclodextrina glucanotransferasa; una proteasa, una peptidasa, tal como una prolil-endopeptidasa preferiblemente, la prolilendopeptidasa de Aspergillus niger con el fin de degradar también epítopos de gluten y, opcionalmente, también con una enzima aspergilopepsina I; una transglutaminasa; una lipasa tal como una triacilglicerol lipasa, una galactolipasa, una fosfolipasa; celulosa; hemicelulasa, en particular una pentosanasa tal como xilanasa; proteína disulfuro isomerasa, p. ej., una proteína disulfuro isomerasa tal como se describe en el documento WO 95/00636; glicosiltransferasa, peroxidasa; lacasa u oxidasa, tal como una hexosa oxidasa, una glucosa oxidasa, aldosa oxidasa, piranosa oxidasa, lipoxigenasa o L-aminoácido oxidasa; o una amilasa formadora de G4.
En una realización de la composición enzimática de acuerdo con la invención, la enzima adicional es una enzima lipolítica, preferiblemente una fosfolipasa, una galactolipasa o una enzima que tiene tanto actividad de fosfolipasa como de galactolipasa.
En una realización de la composición enzimática de acuerdo con la invención, la enzima adicional es Panamore® de DSM, tal como se describe en el documento WO2009/106575. Una enzima lipolítica adecuada puede incluir Lipopan® F, Lipopan® 50 y Lipopan® de Novozymes.
En una realización de la composición enzimática de la invención, la enzima adicional es una enzima tal como se describe en el documento WO9826057, o como se describe en el documento US RE38,507, o como se describe en el documento WO 9943794 , en particular en el documento EP1058724B1.
En un aspecto de la composición enzimática de acuerdo con la invención, la enzima adicional es una amilasa, tal como se describe en el documento US8426182.
La enzima adicional puede incluir una amilasa formadora de G4. Una amilasa formadora de G4 es una enzima que es capaz, entre otras cosas, de catalizar la degradación de almidón. En particular, es capaz de escindir enlaces a-D-(I-> 4) O-glucosídicos en almidón. Se la puede aludir como una glucano 1,4-alfa-maltotetraohidrolasa (EC 3.2.1.60). También se la puede aludir como una maltotetraohidrolasa. Amilasas formadoras de G4 adecuadas pueden ser amilasas formadoras de G4 descritas en uno cualquiera de los documentos WO9950399, WO2005007818, WO2004111217, WO2005003339, WO2005007818, WO2005007867, WO2006003461, WO2007007053, WO2007148224, WO2009083592, WO2009088465.
Un ejemplo de un producto alimenticio es un producto horneado.
“Producto horneado" - La expresión producto horneado se refiere a un producto alimenticio horneado preparado a partir de una masa. Ejemplos de productos horneados, ya sean del tipo blanco, pardo o integral, que pueden ser producidos ventajosamente por la presente invención incluyen pan (en particular pan blanco, integral o de centeno), típicamente en forma de hogazas o panecillos, Pan tipo baguette francesa, pasteles, cruasanes, bollos de leche, panetone, pasta, fideos (hervidos o (fritos)), pan de pita y otros panes planos, tortillas, tacos, pasteles, panqueques, galletas, en particular galletas, rosquillas, incluidas rosquillas con levadura, bagels, masas de tarta, pan al vapor, pan crujiente, brownies, tartas de forma rectangular planas, alimentos de aperitivo (p. ej., pretzels, chips de tortilla, snacks fabricados, patatas fritas fabricadas). La expresión producto horneado incluye pan que contiene de 2 a 30% en peso de azúcar, pan con contenido en fruta, cereales para el desayuno, barritas de cereales, pastel sin huevo, panecillos blandos y pan sin gluten. El pan sin gluten en esta memoria y de aquí en adelante es pan que contiene como máximo 20 ppm de gluten. Varios granos y fuentes de almidón se consideran aceptables para una dieta libre de gluten. Las fuentes de uso frecuente son patatas, arroz y la tapioca (derivada de la yuca). El producto horneado incluye, sin limitación, pan de molde, hogazas de pan, panes retorcidos, bollos, tales como panes de hamburguesa o bollos al vapor, chapati, biscote duro, rebanadas de pan seco al vapor, pan rallado, matzos, focaccia, tostadas de melba, biscote, crutones, pretzels blandos, pan blando y duro, palitos de pan, pan fermentado con levadura y fermentado químicamente, productos de masa laminada como pastelería danesa, cruasán o productos de pastelería de hojaldre, muffins, pan danés, bagels, recubrimientos de confitería, galletas saladas, obleas, cortezas de pizza, tortillas, productos de pasta, crepes, gofres, productos horneados y productos de masa refrigerados y congelados. Tartas en esta memoria incluyen, sin limitaciones, tartas de mantequilla, tales como, por ejemplo, el bizcocho y el pastel de mantequilla, e incluye pasteles esponjosos, tales como, por ejemplo, merengues, bizcocho, tarta de galletas, brazo de gitano, genovesa y chifón.
Un ejemplo de un producto semi-cocido incluye, sin limitación, pan parcialmente horneado que se ha completado en el punto de venta o consumo con un proceso corto de segundo horneado. El pan puede ser pan blanco o negro; dicho pan puede fabricarse, por ejemplo, utilizando un método llamado el método de esponja y masa de estilo americano o un método directo de estilo americano.
"Masa" - El término masa se define en esta memoria como una mezcla de harina y otros ingredientes, en particular los ingredientes de la masa. En un aspecto, la masa es lo suficientemente firme como para ser amasada o enrollada. La masa puede ser fresca, congelada, preparada o semi-cocida. La preparación de masa congelada se describe por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters. El término masa en esta memoria incluye una pasta. Una pasta es una mezcla semi-líquida, lo suficientemente delgada como para caer o ser vertida de una cuchara, de una o más harinas combinadas con líquidos tales como agua, leche o huevos utilizados para preparar diversos alimentos, incluida la tarta.
"Ingrediente de la masa" - Un ingrediente de la masa incluye cualquier componente seleccionado de harina, huevo, agua, sal, azúcar, aromas, grasa (incluyendo mantequilla, margarina, aceite y manteca), levadura de panadero, un sistema de fermentación química, leche, oxidantes (incluyendo ácido ascórbico, bromato y azodicarbonamida (ADA)), agentes reductores (incluida L-cisteína), emulsionantes (incluidos mono-/di-glicéridos, monoglicéridos tales como monoestearato de glicerol (GMS), estearoil lactilato de sodio (SSL), estearoil lactilato de calcio (CSL), ésteres de poliglicerol de ácidos grasos (PGE) y ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- y di-glicéridos (DATEM), gomas (incluyendo goma guar y goma xantano), ácidos (incluyendo ácido cítrico, ácido propiónico), almidón, almidón modificado, gluten, humectantes (incluyendo glicerol) y conservantes.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a una composición enzimática que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger y al menos una enzima adicional. La composición enzimática puede comprender de 10 a 5000 HPU de peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger/ kg de composición.
En un aspecto, la composición enzimática comprende 1 ppm - 2000 ppm de peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus nigerque tiene una actividad en un intervalo de aproximadamente 1000 a 50000 HPU/g. En un aspecto, la composición enzimática comprende 10 - 200 ppm de peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger que tiene una actividad en un intervalo de aproximadamente 1000 a 50000 HPU/g.
En una realización, la composición enzimática de acuerdo con la invención se proporciona en una forma seca, para permitir la fácil adición a la masa o al al menos un ingrediente de la masa, pero también son posibles formas líquidas.
El método de acuerdo con la invención para preparar una masa comprende la etapa de añadir una peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger a al menos un ingrediente de la masa. La peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger se puede añadir en cualquier etapa de la preparación de la masa y se puede añadir en una, dos o más etapas.
Si han de ser una o más enzimas adicionales, estas enzimas se pueden añadir por separado o junto con la peptidasa aspergilloglutámica de Aspergillus niger de acuerdo con la invención, por ejemplo, como la composición enzimática de acuerdo con la invención.
La invención se refiere, además, a un procedimiento para la producción de un producto horneado, método que comprende hornear la masa de acuerdo con la invención. En una realización del procedimiento para la producción de producto horneado, el producto horneado es pan o tarta.
La persona experta en la técnica sabe cómo preparar una masa o un producto horneado a partir de ingredientes de la masa. La invención se refiere, además, a un producto horneado obtenible por el procedimiento para la producción de un producto horneado de acuerdo con la invención.
La invención se refiere, además, al uso de una peptidasa aspergilloglutámica de Aspergillus niger en la producción de un producto horneado.
LEYENDAS DE LAS FIGURAS
Figura 1: Análisis de SDS-PAGE al 4-12% (gel de Bis-Tris al 4 a 12%) de diversas incubaciones de inhibidores de alfa amilasa de trigo con diferentes proteasas más pepsina en condiciones estomacales simuladas. Se incluyen dos controles con tratamiento con pepsina sin enzima adicional. La flecha indica la posición de los tres principales productos proteicos presentes en la preparación de alfa amilasa.
- Marcadores de peso molecular: pistas 1,2 y 15
- Tratamiento con endoproteasa específica para prolina de A. niger a: t = 0, pista 3; t = 90 minutos, pista 4
- Peptidasa aspergiloglutámica de A. niger a: t = 0, pista 5; t = 90 minutos, pista 6
- Pepsina a: t = 0, pista 7; t = 90 minutos, pista 8
- Papaína a: t = 0, pista 9; t = 90 minutos, pista 10 - Multifect PR 15 L a: t = 0, pista 11; t = 90 minutos, pista 12 - Aspergilopepsina I a: t = 0, pista 13; t = 90 minutos, pista 14 - Pepsina a: t = 0, pista 16; t = 90 minutos, pista 17.
Figura 2: SDS-PAGE preparativa de inhibidores de alfa amilasa de trigo para identificar la naturaleza de las proteínas más abundantes presentes en las bandas B1 a G1.
Figura 3: Análisis de SDS-PAGE al 4-12% (gel de Bis-Tris al 4 a 12%) de diversas incubaciones de una cantidad estandarizada de gluten de trigo con concentraciones crecientes de peptidasa aspergiloglutámica (AGP) de A. niger en condiciones estomacales simuladas. La flecha indica la posición de los inhibidores de alfa amilasa de trigo 0.19, CM2 y CM16 (véase el Ejemplo 1).
- Marcadores de peso molecular (Mark 12™ Patrón No teñido, Life Technologies): pista 13.
- Inhibidores de alfa amilasa/proteasa purificados: pista 14.
- Sin adición de peptidasa aspergiloglutámica de A. niger: pista 1 = 0, pista 2 = 60 minutos
- 0,09 mg/ml de peptidasa aspergiloglutámica de A. niger añadida: pista 3 = 0, pista 4 = 60 minutos
- 0,19 mg/ml de peptidasa aspergiloglutámica de A. niger añadida: pista 5 = 0, pista 6 = 60 minutos
- 0.28 mg/ml de peptidasa aspergiloglutamica de A. niger añadida: pista 7 = 0, pista 8 = 60 minutos
- 0,37 mg/ml de peptidasa aspergiloglutámica de A. niger añadida: pista 9 = 0, pista 10 = 60 minutos
- 0,47 mg/ml de peptidasa aspergiloglutamica de A. niger añadida: pista 11 = 0, pista 12 = 60 minutos
Figura 4: Análisis de SDS-PAGE al 4-12% (gel de Bis-Tris al 4 a 12%) de diversas incubaciones de purotioninas derivadas de trigo con diferentes proteasas más pepsina en condiciones estomacales simuladas. La flecha indica la posición de las purotioninas purificadas.
- Marcadores de peso molecular: pistas 1,2, 9 y 10
- Peptidasa aspergiloglutamica de A. nigera: t = 0, pista 3; t = 90 minutos, pista 4
- Endoproteasa específica para prolina de A. niger a: t = 0, pista 5; t = 90 minutos, pista 6
- Multifect PR 15 L (proteasa similar a la aspergilopepsina l de Trichoderma reesei) a: t = 0, pista 7; y t = 90 minutos, pista 8.
Figura 5: Análisis de SDS-PAGE al 4-12% (gel de Bis-Tris al 4 a 12%) de diversas incubaciones de purotioninas derivadas de trigo con diferentes proteasas más pepsina en condiciones estomacales simuladas. La flecha indica la posición de las purotioninas purificadas.
- Marcadores de peso molecular: pista 1
- Purotioninas de trigo purificadas: pista 2
- Multifect PR 15 L (proteasa similar a aspergilopepsina l de Trichoderma reesei; http//biosciences.dupont.com) a: t = 0, pista 3; t = 90 minutos, pista 4
- Mezcla de 90% (p/p proteína enzimática presente) Multifect PR 15 L y 10% de peptidasa aspergiloglutámica de A. niger a: t = 0, pista 5; t = 90 minutos, pista 6
- Proctasa (mezcla de proteasas no GMO secretada por A. niger que incorpora aprox. 85% de aspergilopepsina I) a: t = 0, pista 7; t = 90 minutos, pista 8.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: La peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger escinde eficazmente los inhibidores de alfa amilasa/tripsina derivados del trigo en condiciones estomacales simuladas, mientras que otras endoproteasas ácidas no son eficaces.
Materiales y Métodos
Producción de aspergilopepsina I a partir de Aspergillus niger
El gen de la aspergilopepsina I de Aspergillus niger (pepA; An14g04710) se sobre-expresó en un huésped de A. niger utilizando métodos tales como los descritos en el documento WO 98/46772. El documento WO 98/46772 describe cómo seleccionar transformantes en placas de agar que contienen acetamida y seleccionar integrantes multicopia fijados como objetivo. Transformantes de A. niger que contienen múltiples copias del casete de expresión se seleccionaron para la generación adicional de material de muestra. La cepa transformada de A. niger se fermentó en un medio de fermentación CSM modificado, pH 6,2 (40 g/l de maltosa, 30 g/l de bacto-soytone, 70 g/l de citrato de sodio dihidrato tribásico, 15 g/l de (NH4)2s O4, 1 g/l de NaH2PO4 * 2H2O, 1 g/l de MgSO4 * 7H2O, 1 g/l de L-Arg, 0,25 ml/l de antiespumante Clerol). El caldo de cultivo obtenido se filtró, se filtró en condiciones estériles y luego se concentró por ultrafiltración. La cromatografía se llevó a cabo aplicando la enzima a una columna de Q-sepharose XK 26/10 en 50 mmol/l de acetato de Na, pH 5,6, seguido de elución con un gradiente de sal. La presencia de la proteína aspergilopepsina I en las diversas fracciones se cuantificó juzgando la intensidad de las bandas de proteínas coloreadas después de SDS-PAGE al 4-12% (NuPAGE Gel de Bis-Tris, Invitrogen).
Ensayo enzimático
Las incubaciones se llevaron a cabo en 50 mmol/l de citrato de Na a pH 4,0 durante 90 minutos a 37 °C. En todas las incubaciones relevantes, la pepsina estaba presente en una concentración de proteína enzimática de 0,2 mg/ml. La endoproteinasa específica para prolina se testó en una concentración de 0,5 mg de proteína enzimática/ml, las otras endoproteinasas ácidas en una concentración de 0,05 mg de proteína enzimática/ml. El inhibidor de amilasa se añadió por último y estaba presente en una concentración de 2 mg/ml.
A t = 0, 100 microlitros de la mezcla de reacción se transfirieron a 400 microlitros de TCA al 25%. Después de 90 minutos de incubación a 37 °C, se transfirieron otros 100 microlitros a 400 microlitros de solución de TCA de reciente aportación. Después de 2 horas a 4 °C, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 14.000 rpm. Después de la centrifugación, se añadieron 65 microlitros de tampón fosfato pH 7, 25 microlitros de dodecilsulfato de litio (LiDS) y 10 microlitros de agente reductor de muestra. Las muestras se almacenaron a 4 °C durante la noche y luego se prepararon para SDS-PAGE siguiendo el protocolo de Invitrogen (Invitrogen, www.lifetechnologies.com).
Determinación de la actividad de la peptidasa aspergiloglutámica (HPU) de A. niaer
20,0 g de hemoglobina de sangre bovina (Sigma producto H2625) se suspendieron en aproximadamente 700 mL de agua agitando durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la adición de 3,73 g de cloruro de potasio (KCI), el pH se ajustó a 1,75 con 0,5 mol/L de ácido clorhídrico. El volumen de la suspensión de hemoglobina se ajustó a 1 L con agua. El pH se verificó nuevamente y se ajustó a pH 1,75.
Las soluciones enzimáticas se prepararon disolviendo peptidasa aspergiloglutámica purificada, producida tal como se describe arriba en un tampón de KCI/HCI que contiene 3,73 g/l de KCI ajustado a pH 1,75 con 2,0 mol/L de HCl. Para testar la actividad de la peptidasa aspergiloglutámica, se calentaron 5 ml de la solución de hemoglobina a 40 °C y posteriormente se añadió 1 mL de solución enzimática con una actividad entre 5 y 25 Unidades de Histidina Proteasa (HPU/ml) para comenzar la reacción. Después de 30 minutos, la reacción se detuvo añadiendo 5 mL de solución de ácido tricloroacético (140 g/L) para precipitar fragmentos peptídicos más grandes. Se realizó una medición en blanco añadiendo 1,0 mL de muestra de enzima a una mezcla de 5 mL de solución de hemoglobina y 5 mL de solución de ácido tricloroacético. Los tubos se incubaron a 40 °C durante 30 minutos para completar la precipitación. Después de la centrifugación, se midió la densidad óptica del sobrenadante transparente que contenía péptidos pequeños a 275 nm. El resultado se comparó con una solución de L-tirosina de 1 Mg/mL.
Una HPU es la cantidad de enzima que hidroliza una cantidad de hemoglobina por minuto, dando una solución con una densidad óptica a 275 nm igual a la densidad óptica de una solución que contiene 1 Mg de L-tirosina por mL en 0,1 mol/L de solución de HCI. Las condiciones del ensayo son: pH 1,75, temperatura 40 °C, concentración de hemoglobina durante la incubación 16,7 g/L.
Actividad (HPU/mL) = (DOmuestra-DOblanco / S) X 11/30
en donde
DOmuestra: Densidad óptica del filtrado de muestra (275 nm)
DOblanco: Densidad óptica del filtrado de muestra en blanco (275 nm)
S: DO de una solución estándar de L-tirosina de 1,1 Mg/mL (mL/^g)
30: tiempo de incubación (minutos)
11: volumen total de la mezcla de reacción (mL).
Análisis LC-MS / MS
Digestión in vitro
La muestra se disolvió a 1 mg/ml en agua MilliQ. La solución se diluyó 10 veces en NH4HCO3100 mM (pH 7,8). La muestra se redujo mediante la adición de DTT, 5 mM, 30 minutos de incubación a temperatura ambiente y se alquiló mediante la adición de yodoacetamida (IAA), 5,5 mM, 30 minutos de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad. La digestión con tripsina se realizó a 37°C durante la noche.
Digestión en gel
Bandas de gel se cortaron del gel utilizando el cortador de puntos ExQuest (Biorad, Hercules, CA, EE.UU.) y se transfirieron a MTP de unión a proteína lo (Eppendorf, Hamburg Alemania). Los trozos de gel se lavaron añadiendo 75 Ml de NH4HCO350 mM para expandir y 75 mI de acetronitrilo para encoger, total 3 lavados. Los trozos de gel lavados se digirieron con tripsina, la digestión se realizó por incubación a 37 °C durante la noche. Las muestras se trataron por ultrasonidos durante 1 minuto y el sobrenadante se recogió en un vial de inyección.
Análisis LC-MS / MS
Las muestras se acidificaron a ácido fórmico al 1% y se analizaron en el aparato Accela-LTQ-Velos (Thermo Scientific, San Diego, CA, EE.UU.). La separación cromatográfica se logró con un tamaño de partícula de 2,1 x 100 mm y 1.8 micrómetros, tamaño de poro 80Á, columna Zorbax Eclipse XDB C-18 (Agilent Santa Clara, CA, EE. UU.), utilizando una elución en gradiente con (A) agua de calidad LC-MS que contiene ácido fórmico al 0,1% B) acetonitrilo de calidad LC-MS que contiene solución de ácido fórmico al 0,1% (Biosolve BV, Países Bajos) como fases móviles. El gradiente fue de 5 a 40% de B en 83 minutos. El caudal se mantuvo a 0,4 ml/min, utilizando un volumen de inyección de 25 mI y la temperatura de la columna se ajustó a 50 °C. La adquisición de datos de MS se realizó utilizando una de las 10 adquisiciones principales dependientes de datos con un intervalo de masas de 400-2000 m/z, utilizando exclusión dinámica e incluyendo solo los estados de carga 2 y 3. Los experimentos de MS/MS se realizaron con una anchura de aislamiento establecido en 3,0, y la energía de colisión normalizada se estableció en 35. Las búsquedas en la base de datos se realizaron utilizando el motor de búsqueda Sorcerer 2 (Sorcerer™-SEQUEST®) y el Trans Proteome Pipeline (TPP), usando tripsina como enzima preferida. Solo se consideraron las proteínas identificadas con una confianza > 90%. Los datos se buscaron en la base de datos Swissprot.
Resultados
En el presente Ejemplo los autores de la invención demuestran (véase la Figura 1) que, en condiciones gástricas simuladas, solamente la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger entre un cierto número de endoproteinasas de carácter ácido es capaz de degradar eficazmente una preparación purificada que incorpora diversos inhibidores de alfa amilasa de trigo (inhibidor de alfa amilasa de semilla de trigo, Tipo 1, Sigma). En el experimento, se compararon las eficacias de las siguientes enzimas en presencia de pepsina (control):
- pepsina (mucosa gástrica porcina, Sigma),
- endoproteinasa específica para prolina de Aspergillus niger (MaxiPro PSP, DSM Food Specialties, Delft, Países Bajos)
- papaína (Collupuline, DSM Food Specialties, Delft, Países Bajos),
- peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger también denominada aspergilopepsina II (MaxiPro HSP, DSM Food Specialties, Delft, Países Bajos),
- aspergilopepsina I (véase Materiales y Métodos),
- Multifect PR 15 L (proteasa similar a aspergilopepsina L de Trichoderma reesei; http//biosciences.dupont.com).
Los resultados (véase la Figura 1) demuestran que la preparación de gluten de trigo purificado inhibidor de alfa amilasa incorpora tres principales bandas de proteínas con un tamaño de aproximadamente 12 kDa (véase la flecha). Estos datos también demuestran que, en condiciones estomacales simuladas y en presencia de pepsina y cantidades iguales de las diversas proteinasas, la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger es más efectiva para degradar estas tres bandas principales presentes en una preparación purificada de inhibidores de alfa amilasa.
Para confirmar la naturaleza de las diferentes proteínas presentes en cada una de estas bandas, muestras de bandas de gel se cortaron, se extrajeron y las proteínas presentes se identificaron utilizando el análisis de LC-MS/MS tal como se describe en Materiales y Métodos arriba.
En este caso los 10 mg/ml de la solución de inhibidor de alfa amilasa Sigma se diluyeron 10 veces con agua. Luego se mezclaron 65 microlitros de esta solución con 25 microlitros de tampón de muestra LiDS y 10 microlitros del agente reductor de la muestra, se calentaron durante 10 minutos a 70°C, después de lo cual las proteínas se separaron por SDS-PAGE de acuerdo con el protocolo de Invitrogen. Luego, el gel se fijó durante 1 hora con metanol al 50%/ácido acético al 7%, se enjuagó dos veces con agua desmineralizada y se tiñó con Sypro Ruby durante la noche. Se obtuvieron muestras de gel de las tres bandas, presumiblemente inhibidoras de alfa amilasa, tal como se ilustra en la Figura 2. De acuerdo con los datos de LC-MS/MS obtenidos de las proteínas extraídas, las proteínas más abundantes presentes en las bandas C1 y B1 son inhibidores de alfa amilasa de trigo con los números de acceso SwissProt P17314 (CM 3) y P16159 (CM 16), en las bandas E1 y D1, los inhibidores de alfa amilasa de trigo P01085 (0.19), P16851 (CM 2) y P16159 (CM 16) y en las bandas G1 y F1 P01083 (CM 3).
Estos datos demuestran que la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger es sorprendentemente más eficaz en degradar los inhibidores de alfa amilasa derivados de trigo en condiciones estomacales y más notablemente, los inhibidores de alfa amilasa de trigo: CM 2, CM 3, CM 16 y 0,19.
Ejemplo 2: La peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger escinde los inhibidores de alfa amilasa/tripsina en la cerveza y estabiliza la espuma
De acuerdo con sus secuencias de aminoácidos, la cebada incorpora inhibidores de alfa amilasa que son muy similares a inhibidores de alfa amilasa presentes en el trigo. Por lo tanto, la cerveza presenta un producto alimenticio que podría ser relevante para los individuos sensibles al gluten. En la cerveza, como en otros productos alimenticios, los inhibidores de alfa amilasa están presentes como una molécula intacta o como péptidos lo suficientemente grandes como para provocar una respuesta inmune. Por ejemplo, en un análisis LC-MS/MS de 16 cervezas diferentes, los autores de la invención identificaron aproximadamente 3300 péptidos diferentes de más de 9 aminoácidos con secuencias atribuidas a los inhibidores de alfa amilasa. Este hallazgo ilustra la relevancia potencial de los inhibidores de alfa amilasa para individuos sensibles al gluten y, por lo tanto, la relevancia de la peptidasa aspergiloglutámica para la producción de cerveza.
El uso de proteasas durante la fase de fermentación de la cerveza o más allá es bastante común para la prevención de la denominada neblina de enfriamiento. Históricamente se utilizaron proteasas ácidas con una amplia especificidad, tal como Proctasa o papaína para este propósito, pero hoy en día una endoproteasa específica para prolina denominada Brewers Clarex presenta la opción preferida. La razón principal para cambiar de enzimas de especificidad tan amplia al producto Brewers Clarex altamente específico es que la aplicación de las enzimas de especificidad amplia tiende a dar lugar a cervezas con poca capacidad de formación de espuma. Por lo tanto, cualquier impacto negativo sobre la espuma de cerveza es un requisito previo para la aceptabilidad de un tratamiento proteolítico durante la producción de cerveza. Para testar el efecto de la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger sobre la formación de espuma en la cerveza, se llevó a cabo el siguiente experimento.
Cervezas embotelladas de una gran marca internacional se obtuvieron de un supermercado local. Las botellas se abrieron cuidadosamente, se añadieron las enzimas relevantes e inmediatamente las botellas se cerraron nuevamente utilizando un nuevo tapón corona. Después de mezclar cuidadosamente, las botellas se almacenaron a 20 grados °C. Los datos presentados en el Ejemplo 1 anterior demuestran que la concentración de peptidasa aspergiloglutámica requerida para destruir los inhibidores de alfa amilasa es al menos diez veces menor que la concentración de la endoproteasa específica para prolina. El nivel de uso industrial típico del producto comercial Brewers Clarex específico para prolina es de 3 gramos/hl de cerveza, que se corresponde con 150 mg de proteína enzimática pura por hl de cerveza. En el presente experimento, la endoproteasa específica para prolina también se añadió en esta concentración, pero las otras dos proteasas se añadieron en concentraciones de solo 15 mg de proteína enzimática pura por hl de cerveza. Después de la incubación durante una semana, se midió la estabilidad de la espuma de todas las cervezas de acuerdo con el método Analytica-EBC 9.42 utilizando el equipo Haffmans (Inpack 2000 Sampler en combinación con el Aparato de ensayo de la estabilidad de espuma Nibem TPH, Haffmans BV, Venlo, Países Bajos). Los valores promedio de espuma de dos duplicados por incubación se muestran en la Tabla 1.
Como era de esperar, la estabilidad de la espuma de las cervezas incubadas con la endoproteasa específica para prolina añadida en concentraciones adecuadas para la prevención de la neblina de enfriamiento (es decir, 150 mg/hl) son equiparables a los datos obtenidos para el producto de referencia (cerveza comercial sin proteasa añadida). La observación sorprendente es que tras la adición de una baja concentración de la peptidasa aspergiloglutámica o de una enzima similar a la aspergilopepsina l, la estabilidad de la espuma de cerveza aumenta significativamente, incluso si se aplica en combinación con niveles de la endoproteasa específica para prolina utilizados industrialmente. Este resultado sugiere que la adición de la peptidasa aspergiloglutamica, por ejemplo con la intención de destruir péptidos grandes de inhibidores de alfa amilasa, tiene la estabilización de la espuma de cerveza como un efecto secundario deseable.
Tabla 1: Estabilidad de la espuma de la cerveza incubada con diversas enzimas
Figure imgf000013_0001
Ejemplo 3: La peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger escinde inhibidores de alfa amilasa/tripsina de una manera dependiente de la dosis.
En el presente Ejemplo. Los autores de la invención determinaron la cantidad de proteína enzimática peptidasa aspergiloglutámica de A. niger requerida para hidrolizar en condiciones estomacales simuladas los inhibidores de alfa amilasa/proteasa presentes en 1 gramo de gluten de trigo. Para ello, el gluten del trigo (Sigma) se solubilizó en 50 mmol/l de ácido cítrico pH 4,0 en una concentración de 9,35 mg/ml. A esta mezcla agitada a fondo se añadió proteína de enzima pepsina para alcanzar una concentración final de 0,2 mg/ml y luego se tomaron seis muestras de un ml. A estas seis muestras se añadieron cantidades crecientes de enzima peptidasa aspergiloglutámica de A. niger pura. A la muestra 1: no se añadió AGP, a la muestra 2: 0,09 mg, a la muestra 3: 0,19 mg, a la muestra 4: 0,28 mg, a la muestra 5: 0,37 mg y a la última muestra: 0,47 mg. Las diferentes muestras se incubaron luego durante 60 minutos a 37 grados Celsius y de cada una de las muestras se tomaron partes alícuotas para el análisis SDS-PAGE a t = 0 minutos y t = 60 minutos. El análisis de SDS-PAGE se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo de Invitrogen. Los resultados (véase la Figura 3) demuestran que mediante la adición de 0,28 mg de peptidasa aspergiloglutámica de A. niger pura los inhibidores de alfa amilasa/proteasa presentes en 9,35 mg de gluten de trigo se pueden hidrolizar dentro de un período de una hora. Esto implica que 30 mg de peptidasa aspergiloglutámica de A. niger pura (correspondiente a 15000 HPU) pueden hacer frente a 1 gramo de gluten de trigo en condiciones gástricas simuladas de este tipo. Por lo tanto, después de la fragmentación parcial de los inhibidores de alfa amilasa/proteasa mediante una preparación oral de peptidasa aspergiloglutámica de A. niger, los péptidos inhibidores recién generados se degradarán aún más a oligopéptidos no inmunogénicos mediante la pepsina durante el paso por el estómago y, después de ingresar al duodeno, por proteasas pancreáticas, tales como tripsina y quimotripsina.
Ejemplo 4: El homólogo de aspergilopepsina I de T. reesei puede escindir purotioninas derivadas de trigo en condiciones gástricas.
Materiales y Métodos
Se aislaron purotioninas según se describe por Ohtani et al (J. Biochem. 82,753-767 (1977)) con algunas modificaciones. El sobrenadante de trigo se cromatografió en SP Sepharose 6 FF (Amersham) equilibrado con 20 milimol/l de fosfato de sodio, pH 7,2 y se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 1,0 mol/l de NaCl en el mismo tampón. La presencia de purotionina pura con un peso molecular de aproximadamente 5 kDa en las diversas fracciones fue seguida por SDS-PAGE. Las fracciones que muestran una única banda de proteínas se agruparon, se concentraron utilizando una membrana Amicon de 3 kDa y luego se liofilizaron. La identidad y la pureza de la proteína aislada se confirmó mediante análisis LC-MS/MS esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 utilizando la base de datos Uniprot/Swissprot.
Ensayo enzimático
Incubaciones de las purotioninas purificadas con las diversas proteasas se llevaron a cabo en 50 mmol/l de citrato de Na a pH 4.0 durante 90 minutos a 37°C, de manera similar a las condiciones especificadas en el Ejemplo 1 de la presente solicitud. En todas las incubaciones relevantes, la pepsina estaba presente en una concentración de proteína enzimática de 0,2 mg/ml. La peptidasa aspergiloglutámica, la endoproteinasa específica para prolina y el Multifect PR 15 L se analizaron en una concentración de 0,11 mg de proteína enzimática/ml. La purotionina de trigo se añadió por último y estaba presente en una concentración de 0,44 mg/ml.
Resultados
En el experimento, las eficacias de las siguientes enzimas se compararon en presencia de pepsina:
- peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger, también denominada aspergilopepsina II (MaxiPro HSP, DSM Food Specialties, Delft, Países Bajos),
- endoproteinasa específica para prolina de Aspergillus niger (MaxiPro PSP, DSM Food Specialties, Delft, Países Bajos)
- Multifect PR 15 L (proteasa similar a la aspergilopepsina I de Trichoderma reesei; http//biosciences.dupont.com).
Los resultados obtenidos (véase la Figura 4) demuestran que bajo condiciones del estómago simuladas y cantidades iguales de las diversas proteinasas, la proteasa similar a aspergilopepsina l de Trichoderma reesei degrada eficazmente purotionina derivada de trigo.
Ejemplo 5: Escisión de purotioninas derivadas de trigo en condiciones gástricas.
Materiales y métodos
Purotioninas fueron aisladas de trigo tal como se describe en el Ejemplo 4. Proctasa se obtuvo de Meiji (Tokio, Japón).
Resultados
Tal como se ilustra por los productos de digestión de purotioninas de trigo en la Figura 5, los productos enzimáticos que incorporan aspergilopepsina I de Aspergillus niger o su homólogo de Trichoderma reesei pueden hidrolizar purotioninas de trigo en condiciones estomacales simuladas.
Ejemplo 6: A sus dosis efectivas, peptidasa aspergiloglutámica y enzimas similares a aspergilopepsina I no tienen efecto perjudicial sobre la espuma de cerveza.
La cerveza incorpora los inhibidores de alfa-amilasa/tripsina derivados de la cebada que se sabe que son altamente homólogos a los inhibidores alergénicos de alfa-amilasa/tripsina presentes en el trigo (Okada et al., J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 1458-1464). Los resultados mostrados en el Ejemplo 1 de la presente solicitud muestran que la peptidasa aspergiloglutámica puede hidrolizar eficazmente diversos inhibidores de alfa-amilasa/tripsina. Por lo tanto, tras la adición de la peptidasa aspergiloglutámica a la cerveza, se puede esperar que también se inhiban los inhibidores de alfa-amilasa/tripsina de la cebada. En el Ejemplo 2, los autores de la invención demostraron que añadir las proteasas ácidas relevantes no tiene un efecto negativo sobre la calidad de la espuma de cerveza. En el presente Ejemplo, los autores de la invención demuestran que las dosis de enzimas de la peptidasa aspergiloglutamica, la aspergilopepsina I y el homólogo de aspergilopepsina I de Trichoderma reesei, requeridas para hidrolizar alérgenos de cerveza conocidos, tales como los inhibidores de alfa-amilasa/tripsina y la Proteína Z (García-Casado et al., J Allergy Clin Immunol, 108(4), págs. 647-649) no tienen efectos perjudiciales sobre la estabilidad de la espuma de cerveza, ni siquiera en combinación con las cantidades de endoproteasa específica para prolina (MaxiPro PSP, DSM Food Specialties, Delft, Países Bajos) requeridas para evitar la neblina helada.
Cervezas embotelladas de una gran marca internacional se obtuvieron de un supermercado local. Las botellas se abrieron cuidadosamente, se añadieron las enzimas relevantes e inmediatamente las botellas se cerraron nuevamente utilizando un nuevo tapón corona. Después de mezclar cuidadosamente, las botellas se almacenaron a 20 grados C durante una semana. Las estabilidades de las espumas se midieron tal como se describe en el Ejemplo 2 y los valores promedio de espuma de dos duplicados por incubación se muestran en la Tabla 2. Los datos obtenidos demuestran claramente que las altas dosis de las diversas proteasas ácidas añadidas no tienen un efecto perjudicial sobre las espumas formadas.
Tabla 2: estabilidad de la espuma de la cerveza incubada con diversas enzimas proteolíticas
Figure imgf000015_0001

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un complemento dietético o una composición farmacéutica que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger, una prolil-endopeptidasa y excipientes farmacéutica o dietéticamente aceptables.
2. Un complemento dietético o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende, además, una aspergilopepsina I.
3. Un complemento dietético o una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el complemento está en forma de un comprimido, una cápsula o una formulación líquida.
4. Un complemento dietético o una composición farmacéutica que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger para su uso como un medicamento.
5. Un complemento dietético o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 para uso como un medicamento, en donde la composición comprende, además, una prolil-endopeptidasa y excipientes farmacéutica o dietéticamente aceptables.
6. Un complemento dietético o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en donde la composición comprende, además, una aspergilopepsina I.
7. Un complemento dietético o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el medicamento es para el tratamiento de un paciente que padece de respuesta inmune innata en el intestino.
8. Un complemento dietético o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde el medicamento es para el tratamiento de la enfermedad celíaca, intolerancia al gluten no celíaca, sensibilidad al gluten, síndrome del intestino irritable o enfermedad inflamatoria del intestino.
9. Un complemento dietético o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde el medicamento es un complemento dietético para mantener o potenciar la comodidad gastrointestinal en individuos sensibles al gluten, o para retrasar la aparición de molestias gastrointestinales en individuos celíacos o no celíacos sensibles al gluten, así como para disminuir la exposición al inhibidor de alfa-amilasa/tripsina en individuos sanos.
10. Un complemento dietético o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en donde el medicamento se administra por vía oral en el espacio de 1 hora antes o después de una comida.
11. Método para degradar alérgenos vegetales en una composición alimenticia, que comprende incubar una composición alimenticia que contiene alérgenos vegetales con peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger, durante un tiempo suficiente para hidrolizar alérgenos vegetales.
12. Un producto alimenticio, preparado incubando primero un producto alimenticio que contiene alérgenos vegetales con peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger, durante un tiempo suficiente para hidrolizar alérgenos vegetales, comprendiendo dicho producto alimenticio inhibidores degradados de alfa-amilasa/tripsina.
13. Una composición para hornear o una masa que comprende la peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger y una prolil-endopeptidasa.
14. Un método para preparar una masa, que comprende la etapa de añadir una peptidasa aspergiloglutámica de Aspergillus niger a al menos un ingrediente de la masa.
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