ES2757930T3 - Targeting of clotting factors to TLT-1 in activated platelets - Google Patents
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Abstract
Una proteína procoagulante que comprende (i) al menos un factor de coagulación, que es un polipéptido de FVII o un polipéptido de FIX, unido covalentemente a (ii) un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de este, que es un fragmento Fab, que es capaz de unirse específicamente al (iii) transcrito 1 similar a TREM (TLT-1).A procoagulant protein comprising (i) at least one clotting factor, which is a FVII polypeptide or a FIX polypeptide, covalently linked to (ii) a monoclonal antibody, or a fragment thereof, which is a Fab fragment, which is capable of specifically binding to (iii) TREM-like transcript 1 (TLT-1).
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Direccionamiento de factores de coagulación al TLT-1 en plaquetas activadasTargeting of clotting factors to TLT-1 in activated platelets
Campo de la invenciónField of the Invention
En la presente descripción se describen proteínas procoagulantes, polinucleótidos que codifican proteínas de fusión procoagulantes, células que expresan proteínas de fusión procoagulantes, un proceso para preparar proteínas procoagulantes y usos de dichas proteínas procoagulantes.Procoagulant proteins, polynucleotides encoding procoagulant fusion proteins, cells expressing procoagulant fusion proteins, a process for preparing procoagulant proteins, and uses of such procoagulant proteins are described herein.
Antecedentes de la invenciónBackground of the Invention
Las plaquetas normales en reposo fluyen libremente a lo largo de la circulación sanguínea cuando el endotelio está intacto. Cuando la barrera endotelial de una sola capa se daña, las plaquetas en reposo se adhieren a las estructuras subendoteliales por medio de receptores de glicoproteína (GP). Por ejemplo, GPIaIIa y GP-VI se unen al colágeno; GPIcIIa se une a la fibronectina; GPIcIIa se une a la laminina y GPIb-V-IX se une a polímeros del Factor von Willebrand (vWF). La adhesión a los componentes del tejido extravascular expuesto después de una lesión en los vasos, junto con la influencia de factores producidos localmente en el sitio de la lesión, por ejemplo, la serina proteasa trombina, conduce a la activación de las plaquetas. En el proceso complejo de activación, las plaquetas cambian de forma y exponen determinados fosfolípidos en su superficie. Además, los receptores ya presentes en la superficie de la plaqueta en estado de reposo se activan después de la activación de las plaquetas. Adicionalmente, la activación plaquetaria conduce a la liberación y exposición en la superficie de moléculas que en el estado de reposo se almacenan intracelularmente en gránulos alfa y gránulos densos y por lo tanto no se presentan en la superficie de plaquetas en el estado de reposo. El GPIIbIIIa es un ejemplo de un receptor plaquetario presente en la superficie de plaquetas tanto en reposo como activadas. El GPIIbIIIa existe en plaquetas en reposo en una conformación cerrada e inactiva y durante la activación plaquetaria asume una conformación abierta y activa capaz de unir sus ligandos, lo que incluye fibrinógeno y fibrina. Un ejemplo de un receptor almacenado intracelularmente en los gránulos alfa en plaquetas en reposo, pero liberado y expuesto en la superficie de la plaqueta activada, es el transcripto 1 similar a Tr Em (TLT-1) (Washington y otros, Blood, 104, 1042-1047 (2004), Gattis y otros, Journal of Biological Chemistry, 281, 13396-13403 (2006)) al cual se refiere la presente solicitud.Normal resting platelets flow freely throughout the bloodstream when the endothelium is intact. When the single-layer endothelial barrier is damaged, resting platelets adhere to subendothelial structures through glycoprotein (GP) receptors. For example, GPIaIIa and GP-VI bind to collagen; GPIcIIa binds to fibronectin; GPIcIIa binds to laminin and GPIb-V-IX binds to von Willebrand Factor (vWF) polymers. Adhesion to exposed extravascular tissue components after vessel injury, together with the influence of locally produced factors at the site of injury, eg, serine protease thrombin, leads to platelet activation. In the complex activation process, platelets change shape and expose certain phospholipids on their surface. In addition, receptors already present on the platelet surface in the resting state are activated after platelet activation. Additionally, platelet activation leads to surface release and exposure of molecules that are stored intracellularly in alpha granules and dense granules in the resting state and therefore do not occur on the surface of platelets in the resting state. GPIIbIIIa is an example of a platelet receptor present on the surface of both resting and activated platelets. GPIIbIIIa exists in resting platelets in a closed and inactive conformation and during platelet activation it assumes an open and active conformation capable of binding its ligands, including fibrinogen and fibrin. An example of a receptor stored intracellularly in alpha granules in resting platelets, but released and exposed on the activated platelet surface, is Tr Em-like transcript 1 (TLT-1) (Washington et al., Blood, 104, 1042-1047 (2004), Gattis et al., Journal of Biological Chemistry, 281, 13396-13403 (2006)) to which the present application refers.
La cascada de la coagulación sanguínea se inicia cuando las células que portan el factor tisular (TF) en el subendotelio se exponen a componentes que circulan en la sangre. La exposición del TF al factor de coagulación circulante VIIa (FVIIa) desencadena la formación de pequeñas cantidades de trombina, que sirve como una señal procoagulante que conduce al reclutamiento y activación posterior de las plaquetas adheridas al sitio de la lesión. La coagulación se propaga y se amplifica posteriormente en la superficie de las plaquetas activadas, lo que conduce eventualmente a una explosión de la generación de trombina, que a su vez conduce a la activación y polimerización del fibrinógeno a fibras de fibrina, la reticulación y la estabilización del coágulo hemostático. Una característica atribuida a varios de los componentes de la cascada de coagulación es su capacidad para asociarse específicamente con la membrana fosfolipídica de las plaquetas activadas. Con este fin, el FVIIa, así como también, por ejemplo, los factores de coagulación IX y X (FIX y FX, respectivamente) y sus formas activadas correspondientes (FVIIa, FIXa y FXa, respectivamente), poseen una región rica en ácido Y-carboxiglutámico (dominio Gla) que les permite dirigirse y unirse a la superficie de plaquetas activadas. El factor de coagulación VIII (FVIII) se asocia con plaquetas activadas mediante la unión a través de su cadena ligera. El mecanismo de unión del factor de coagulación XI (FXI) a las plaquetas es más controvertido, pero evidencia creciente sugiere que las plaquetas afectan al FXI y al FXIa y que la unión del FXI a las plaquetas requiere residuos en el dominio FXI A3 (Emsley y otros, 2010, Blood, Vol. 115, p. 2569).The blood coagulation cascade begins when cells that carry tissue factor (TF) in the subendothelium are exposed to components that circulate in the blood. Exposure of TF to circulating coagulation factor VIIa (FVIIa) triggers the formation of small amounts of thrombin, which serves as a procoagulant signal leading to the recruitment and subsequent activation of platelets attached to the site of injury. Coagulation propagates and subsequently amplifies on the surface of activated platelets, eventually leading to an explosion of thrombin generation, which in turn leads to activation and polymerization of fibrinogen to fibrin fibers, crosslinking, and stabilization of the hemostatic clot. A characteristic attributed to several of the components of the coagulation cascade is its ability to specifically associate with the phospholipid membrane of activated platelets. To this end, FVIIa, as well as, for example, coagulation factors IX and X (FIX and FX, respectively) and their corresponding activated forms (FVIIa, FIXa and FXa, respectively), possess an acid-rich region Y -carboxyglutamic (Gla domain) that allows them to target and bind to the surface of activated platelets. Coagulation factor VIII (FVIII) is associated with platelets activated by binding through its light chain. The mechanism of binding of coagulation factor XI (FXI) to platelets is more controversial, but mounting evidence suggests that platelets affect FXI and FXIa and that binding of FXI to platelets requires residues in the FXI A3 domain (Emsley et al., 2010, Blood, Vol. 115, p. 2569).
La unión a la membrana aumenta fuertemente la actividad de los factores de coagulación tales como FVIIa. Sin embargo, sus interacciones con las membranas plaquetarias son de afinidad variable. Por ejemplo, la constante de unión (Kd) para el FVIIa a la superficie de las plaquetas está en el intervalo micromolar bajo. La mejora de la unión a las plaquetas y la localización de los factores de coagulación en la superficie de las plaquetas activadas puede aumentar su actividad. Por lo tanto, es conveniente un medio para hacerlo.Membrane binding strongly increases the activity of clotting factors such as FVIIa. However, its interactions with platelet membranes are of variable affinity. For example, the binding constant (K d ) for FVIIa to the platelet surface is in the low micromolar range. Improving platelet binding and localizing clotting factors on the surface of activated platelets may increase their activity. Therefore, a means of doing so is desirable.
En sujetos con una coagulopatía, tales como seres humanos con hemofilia A, B o C, diversas etapas de la cascada de coagulación se tornan disfuncionales debido a, por ejemplo, la ausencia o presencia insuficiente de un factor de coagulación funcional. Dicha disfunción de una parte de la coagulación resulta en una coagulación insuficiente de la sangre, lo que conduce a sangrados espontáneos, por ejemplo, en articulaciones y potencialmente un sangrado peligroso para la vida.In subjects with a coagulopathy, such as humans with hemophilia A, B, or C, various stages of the coagulation cascade become dysfunctional due to, for example, the absence or insufficient presence of a functional coagulation factor. Such dysfunction of part of the coagulation results in insufficient blood clotting, leading to spontaneous bleeding, for example, into joints and potentially life-threatening bleeding.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un compuesto que sea adecuado para su uso como un fármaco procoagulante en dichos sujetos. Un segundo objeto de la presente invención es proporcionar moléculas procoagulantes que tengan mayor actividad, en comparación con los factores de coagulación a partir de los que se derivan. Un tercer objeto de la presente invención es proporcionar moléculas que regulen positivamente la coagulación sanguínea en un microambiente adecuado fisiológicamente. Un cuarto objeto de la presente invención es proporcionar moléculas procoagulantes que tengan vidas medias más largas que el factor de coagulación del que se derivan. Un quinto objeto de la presente invención es proporcionar moléculas procoagulantes que no den lugar a una caída en el conteo de plaquetas. Un objeto adicional de la presente invención es dirigir un factor de coagulación a la superficie de plaquetas activadas. Un objeto particular de la invención es aumentar la generación de FIXa y/o FXa en la superficie de la plaqueta activada. Por lo tanto, el objeto es permitir la iniciación de la coagulación de la sangre en la superficie de plaquetas activadas que se localizan intravascular o extravascularmente.An object of the present invention is to provide a compound that is suitable for use as a procoagulant drug in such subjects. A second object of the present invention is to provide procoagulant molecules that have higher activity, compared to the coagulation factors from which they are derived. A third object of the present invention is to provide molecules that positively regulate blood coagulation in a physiologically suitable microenvironment. A fourth object of the present invention is to provide procoagulant molecules that have longer half-lives than the coagulation factor from which they are derived. A fifth object of the present invention is to provide procoagulant molecules that do not result in a drop in the platelet count. A further object of the present invention is to target a clotting factor to the surface of activated platelets. A particular object of the invention is to increase the generation of FIXa and / or FXa on the surface of the activated platelet. Therefore, the object is to allow the initiation of blood coagulation on the surface of activated platelets that are located intravascularly or extravascularly.
El documento WO06/096828 describe proteínas quiméricas que comprenden el factor tisular soluble (sTF) y un dominio de unión a fosfatidil serina (PS), tal como Anexina V. La PS se expone en la superficie de células activadas, tales como monocitos, células endoteliales y células que experimentan apoptosis, así como también en plaquetas activadas y en reposo. Las proteínas quiméricas son tanto procoagulantes como anticoagulantes; esto último debido al hecho de que, en dosis más altas, los constructos compiten con factores de coagulación en la unión al PS en las plaquetas activadas. Por lo tanto, las proteínas quiméricas del documento WO06/096828 tienen un conjunto diferente de propiedades que las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción.WO06 / 096828 describes chimeric proteins comprising soluble tissue factor (sTF) and a phosphatidyl serine (PS) binding domain, such as Annexin V. PS is exposed on the surface of activated cells, such as monocytes, cells endothelial cells and cells undergoing apoptosis, as well as in activated and resting platelets. Chimeric proteins are both procoagulant and anticoagulant; the latter due to the fact that, at higher doses, the constructs compete with clotting factors at PS binding in activated platelets. Therefore, the chimeric proteins of WO06 / 096828 have a different set of properties than the procoagulant proteins described in the present description.
El documento US 2008/0131423 describe anticuerpos para TLT-1 monocatenarios, o fragmentos funcionales o variantes de estos, para modular la actividad plaquetaria en un sujeto. El contexto presentado es una enfermedad o trastorno asociado con la agregación plaquetaria, tal como enfermedades cardiovasculares, enfermedades inflamatorias, cáncer y sepsis; particularmente trombosis, ataque cardíaco, aterosclerosis y accidente cerebrovascular. Los Fv sc anti-TLT-1 que se describen específicamente son capaces de inhibir la agregación plaquetaria mediada por trombina. Por lo tanto, los anticuerpos para TLT-1 de cadena simple descritos en el documento US 2008/0131423 tienen un conjunto de propiedades diferente que los anticuerpos, y fragmentos de estos, comprendidos en las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción.US 2008/0131423 describes antibodies to single-stranded TLT-1, or functional fragments or variants thereof, to modulate platelet activity in a subject. The context presented is a disease or disorder associated with platelet aggregation, such as cardiovascular disease, inflammatory disease, cancer, and sepsis; particularly thrombosis, heart attack, atherosclerosis, and stroke. The specifically described anti-TLT-1 Fv sc are capable of inhibiting thrombin-mediated platelet aggregation. Therefore, the antibodies to single-chain TLT-1 described in US 2008/0131423 have a different set of properties than the antibodies, and fragments thereof, comprised in the procoagulant proteins described in the present disclosure.
Breve descripción de la invenciónBrief description of the invention
Las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción se dirigen específicamente a plaquetas activadas, presentes en los sitios de lesión. Las proteínas descritas se basan en la identificación de receptores particulares y epítopos componentes que aparecen en las membranas plaquetarias cuando las plaquetas ya no están en reposo sino activas o en el proceso de activarse. Se describe por lo tanto, además, un método para aumentar la coagulación en la superficie de plaquetas activadas.The procoagulant proteins described in the present description specifically target activated platelets, present at sites of injury. The proteins described are based on the identification of particular receptors and component epitopes that appear on platelet membranes when platelets are no longer resting but are active or in the process of becoming activated. Therefore, a method for increasing coagulation on the surface of activated platelets is further described.
Las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprenden (i) al menos un factor de coagulación, unido covalentemente a (ii) un anticuerpo o un fragmento de este que es capaz de unirse a (iii) un receptor, y/o un fragmento o variante de este, que se expone en la superficie de plaquetas activadas y se expone en un menor grado (y en algunos ensayos no se expone de manera detectable) en la superficie de plaquetas en reposo. El TLT-1 es un ejemplo de dicho receptor y las proteínas procoagulantes pueden, por ejemplo, unirse, al TLT-1 (16-162), TLT-1 (20 125) o TLT-1 (126-162). El factor de coagulación puede ser una serina proteasa en forma de zimógeno, por ejemplo, FVII, FIX o FX o la forma activada correspondiente FVIIa, FIXa y FXa, o un derivado de una serina proteasa; Fv o un derivado de este, FVIII o un derivado de este o FXI o un derivado de este. El factor de coagulación y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se unen opcionalmente por medio de un enlazador. Las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción pueden ser proteínas de fusión o conjugados químicos. Por lo tanto, la invención se refiere, además, a su fabricación. Un proceso para preparar una composición que comprende al menos una proteína procoagulante descrita en la presente descripción implica conjugar químicamente (i), un anticuerpo para TLT-1 o un fragmento de este, con un grupo reactivo (RS1) de un enlazador y hacer reaccionar (ii), el factor de coagulación, con otro grupo reactivo (RS2) de dicho enlazador.The procoagulant proteins described herein comprise (i) at least one clotting factor, covalently linked to (ii) an antibody or a fragment thereof which is capable of binding to (iii) a receptor, and / or a fragment or A variant of this, which is exposed on the surface of activated platelets and is exposed to a lesser degree (and in some tests is not detectably exposed) on the platelet surface at rest. TLT-1 is an example of such a receptor, and procoagulant proteins can, for example, bind to TLT-1 (16-162), TLT-1 (20 125), or TLT-1 (126-162). The coagulation factor may be a serine protease in the form of a zymogen, eg, FVII, FIX, or FX or the corresponding activated form FVIIa, FIXa, and FXa, or a derivative of a serine protease; Fv or a derivative thereof, FVIII or a derivative thereof, or FXI or a derivative thereof. The coagulation factor and the antibody or antibody fragment are optionally linked by means of a linker. The procoagulant proteins described in the present description can be fusion proteins or chemical conjugates. Therefore, the invention further relates to its manufacture. A process for preparing a composition comprising at least one procoagulant protein described in the present description involves chemically conjugating (i), an antibody to TLT-1 or a fragment thereof, with a reactive group (RS1) of a linker and reacting (ii), the coagulation factor, with another reactive group (RS2) of said linker.
En este caso, dicho enlazador puede ser un polímero, tal como polietilenglicol (PEG).In this case, said linker can be a polymer, such as polyethylene glycol (PEG).
Además, se proporciona: una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una cualquiera de las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción; un vector que comprende una secuencia de nucleótidos aislada que, a su vez, codifica una cualquiera de las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción; una célula aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cualquiera de las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción. Dicha secuencia de nucleótidos puede expresarse, a su vez, mediante un vector intracelular. Dicha célula aislada puede ser una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, tal como una célula BHK o una CHO o una HEK.In addition, there is provided: an isolated nucleotide sequence encoding any one of the procoagulant proteins described in the present disclosure; a vector comprising an isolated nucleotide sequence which, in turn, encodes any one of the procoagulant proteins described in the present disclosure; an isolated cell comprising a nucleotide sequence encoding any one of the procoagulant proteins described in the present disclosure. Said nucleotide sequence can be expressed, in turn, by means of an intracellular vector. Said isolated cell may be a eukaryotic cell, such as a mammalian cell, such as a BHK cell or a CHO or a HEK.
De manera similar, se describe una proteína procoagulante para su uso como un medicamento y para el tratamiento de una coagulopatía. En una modalidad, una cantidad eficaz terapéuticamente de dicha proteína se administra por vía parenteral, tal como administrada por vía intravenosa o subcutánea, a un individuo que lo necesita. Dicho individuo que lo necesita puede tener cualquier coagulopatía congénita, adquirida y/o iatrogénica.Similarly, a procoagulant protein is described for use as a medicine and for the treatment of coagulopathy. In one embodiment, a therapeutically effective amount of said protein is administered parenterally, such as administered intravenously or subcutaneously, to an individual in need. Said individual in need may have any congenital, acquired and / or iatrogenic coagulopathy.
Descripción de los dibujosDescription of the drawings
Figura 1:Secuencias de aminoácidos y nucleótidos del TLT-1 humano. En la Figura 1, se muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos que representan el hTLT-1. Aquí, la secuencia de nucleótidos en la posición 1-45 codifica el péptido señal predicho, la secuencia de nucleótidos en la posición 46-486 codifica el dominio extracelular del hTLT1, la secuencia de nucleótidos en la posición 487-555 codifica la región transmembrana y la secuencia de nucleótidos en la posición 556-933 codifica el dominio intracelular del hTLT-1.Figure 1: Amino acid and nucleotide sequences of human TLT-1. In Figure 1, the amino acid and nucleotide sequences representing hTLT-1 are shown. Here, the nucleotide sequence at position 1-45 encodes the predicted signal peptide, the nucleotide sequence at position 46-486 encodes the extracellular domain of the hTLT1, the nucleotide sequence at position 487-555 encodes the transmembrane region, and the nucleotide sequence at position 556-933 encodes the intracellular domain of hTLT-1.
Figura 2:Secuencias de aminoácidos y nucleótidos que representan el dominio extracelular del TLT-1 humano que contiene una etiqueta His-6 C-terminal. En la Figura 2, se muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos que representan el dominio extracelular del hTLT-1 con una etiqueta His C-terminal. Aquí, la secuencia subrayada (7-15) indica las posiciones de una secuencia kozak, la secuencia de nucleótidos en la posición 16-60 codifica el péptido señal predicho, la secuencia de nucleótidos en la posición 61-501 codifica el dominio extracelular del hTLT-1 y la secuencia de nucleótidos en la posición 502-519 codifica la etiqueta 6xHis (en negritas). Además, se muestran los sitios de enzima de restricción HindIII (secuencia de nucleótidos en la posición 1-6) y EcoRI (secuencia de nucleótidos en la posición 523-528) y el codón de parada se marca con un asterisco (520-522).Figure 2: Amino acid and nucleotide sequences representing the extracellular domain of human TLT-1 containing a C-terminal His-6 tag. In Figure 2, the amino acid and nucleotide sequences representing the extracellular domain of hTLT-1 with a C-terminal His tag are shown. Here, the underlined sequence (7-15) indicates the positions of a kozak sequence, the nucleotide sequence at position 16-60 encodes the predicted signal peptide, the nucleotide sequence at position 61-501 encodes the extracellular domain of hTLT -1 and the nucleotide sequence at position 502-519 encodes the 6xHis tag (in bold). In addition, the restriction enzyme sites HindIII (nucleotide sequence at position 1-6) and EcoRI (nucleotide sequence at position 523-528) are shown and the stop codon is marked with an asterisk (520-522) .
Figura 3A-D:El dominio variable de 0012LC y 0012HC, lo que incluye la numeración de Kabat:3A) El dominio variable de 0012LC; 3B) El dominio variable de 0012LC - numeración de Kabat; 3C) El dominio variable de 0012HC; 3D) El dominio variable de 0012HC - numeración de Kabat.En la Figura 3A, la secuencia de nucleótidos en la posición 1-57 codifica la secuencia del péptido señal LC; las secuencias de nucleótidos en la posición 58-396 codifican el dominio variable de 0012LC. En la Figura 3B, las secuencias en negritas y gris representan las posiciones de las CDR de 0012LC de acuerdo con la numeración de Kabat. En la Figura 3C, la secuencia de nucleótidos en la posición 1-54 codifica el péptido señal 0012HC, la secuencia de nucleótidos en la posición 55-396 codifica el dominio variable de 0012HC. En la Figura 3D, las secuencias en negritas y gris representan las posiciones de las CDR de 0012HC de acuerdo con la numeración de Kabat.Figure 3A-D: The 0012LC and 0012HC variable domain, including Kabat numbering: 3A) The 0012LC variable domain; 3B) The variable domain of 0012LC - Kabat numbering; 3C) The variable domain of 0012HC; 3D) The 0012HC variable domain - Kabat numbering. In Figure 3A, the nucleotide sequence at position 1-57 encodes the sequence of the LC signal peptide; nucleotide sequences at position 58-396 encode the 0012LC variable domain. In Figure 3B, the bold and gray sequences represent the positions of the CDRs of 0012LC according to the Kabat numbering. In Figure 3C, the nucleotide sequence at position 1-54 encodes the 0012HC signal peptide, the nucleotide sequence at position 55-396 encodes the 0012HC variable domain. In Figure 3D, the bold and gray sequences represent the positions of the CDRs of 0012HC according to the Kabat numbering.
Figura 4:El dominio variable de 0012LC junto con la región constante de la LC kappa humana, y una etiqueta HPC4 (codificada por pTT-0012LC.HPC4). En la Figura 4, las secuencias de nucleótidos en la posición 1-57 codifican el péptido señal LC, la secuencia de nucleótidos 58-396 codifica el dominio variable de 0012LC, la secuencia de nucleótidos 397-714 codifica la región constante de la 0012LC kappa humana, y la secuencia de nucleótidos 715-750 codifica una etiqueta HPC4.Figure 4: The 0012LC variable domain along with the constant region of human kappa LC, and an HPC4 tag (encoded by pTT-0012LC.HPC4). In Figure 4, nucleotide sequences at position 1-57 encode the LC signal peptide, nucleotide sequence 58-396 encodes the 0012LC variable domain, nucleotide sequence 397-714 encodes the constant region of 0012LC kappa human, and nucleotide sequence 715-750 encodes an HPC4 tag.
Figura 5:El dominio variable de 0012HC junto con la región constante de la IgG4 humana (pTT-0012HC). En la Figura 5, la secuencia de nucleótidos 1-54 codifica el péptido señal HC, la secuencia de nucleótidos 55-396 codifica el dominio variable de 0012HC y la secuencia de nucleótidos 397-1377 codifica la región constante de la IgG4 humana (en negritas).Figure 5: The 0012HC variable domain along with the constant region of human IgG4 (pTT-0012HC). In Figure 5, nucleotide sequence 1-54 encodes the HC signal peptide, nucleotide sequence 55-396 encodes the 0012HC variable domain, and nucleotide sequence 397-1377 encodes the constant region of human IgG4 (bold). ).
Figura 6:Cobertura de secuencias de péptidos del TLT-1 analizados por HX en presencia y ausencia del mAb0023. La secuencia primaria del hTLT-1 se muestra por encima de los péptidos analizados por HX (se muestra como barras horizontales). Los péptidos que muestran patrones de intercambio similares tanto en presencia como en ausencia de 0023 se muestran en blanco, mientras que los péptidos que muestran una incorporación reducida de deuterio tras la unión de 0023 son de color negro.Figure 6: Coverage of TLT-1 peptide sequences analyzed by HX in the presence and absence of mAb0023. The primary sequence of hTLT-1 is shown above the peptides analyzed by HX (shown as horizontal bars). Peptides showing similar exchange patterns in both the presence and absence of 0023 are shown in white, while peptides showing reduced deuterium incorporation after 0023 binding are black in color.
Figura 7:Cobertura de secuencias de péptidos del TLT-1 analizados por HX en presencia y ausencia del mAb0051. La secuencia primaria del hTLT-1 se muestra por encima de los péptidos analizados por HX (se muestra como barras horizontales). Los péptidos que muestran patrones de intercambio similares tanto en presencia como en ausencia de 0051 se muestran en blanco, mientras que los péptidos que muestran una incorporación reducida de deuterio tras la unión de 0051 son de color negro.Figure 7: Coverage of TLT-1 peptide sequences analyzed by HX in the presence and absence of mAb0051. The primary sequence of hTLT-1 is shown above the peptides analyzed by HX (shown as horizontal bars). Peptides showing similar exchange patterns in both the presence and absence of 0051 are shown in white, while peptides showing reduced deuterium incorporation after 0051 binding are black in color.
Figura 8:Cobertura de secuencias de péptidos del TLT-1 analizados por HX en presencia y ausencia del mAb0062. La secuencia primaria del hTLT-1 se muestra por encima de los péptidos analizados por HX (se muestra como barras horizontales). Los péptidos que muestran patrones de intercambio similares tanto en presencia como en ausencia de 0062 se muestran en blanco, mientras que los péptidos que muestran una incorporación reducida de deuterio tras la unión de 0062 son de color negro.Figure 8: Coverage of TLT-1 peptide sequences analyzed by HX in the presence and absence of mAb0062. The primary sequence of hTLT-1 is shown above the peptides analyzed by HX (shown as horizontal bars). Peptides showing similar exchange patterns in both the presence and absence of 0062 are shown in white, while peptides showing reduced deuterium incorporation after 0062 binding are black.
Figura 9:Cobertura de secuencias de péptidos del TLT-1 analizados por HX en presencia y ausencia del mAb0061 (mAb0012). La secuencia primaria del hTLT-1 se muestra por encima de los péptidos analizados por HX (se muestra como barras horizontales). Los péptidos que muestran patrones de intercambio similares tanto en presencia como en ausencia de 0061 se muestran en blanco, mientras que los péptidos que muestran una incorporación reducida de deuterio tras la unión de 0061 son de color negro.Figure 9: Coverage of peptide sequences of TLT-1 analyzed by HX in the presence and absence of mAb0061 (mAb0012). The primary sequence of hTLT-1 is shown above the peptides analyzed by HX (shown as horizontal bars). Peptides showing similar exchange patterns in both the presence and absence of 0061 are shown in white, while peptides showing reduced deuterium incorporation after 0061 binding are black in color.
Figura 10:Cobertura de secuencia de péptidos de la región 126-162 del TLT-1 analizados por HX.La secuencia primaria del hTLT-1 se muestra por encima de los péptidos analizados por HX (se muestra como barras horizontales). Todos los péptidos mostraron una incorporación reducida de deuterio tras la unión de mAb0061 (mAb0012).Figure 10: Sequence coverage of peptides from region 126-162 of TLT-1 analyzed by HX. The primary sequence of hTLT-1 is shown above the peptides analyzed by HX (shown as horizontal bars). All peptides showed reduced deuterium incorporation upon binding of mAb0061 (mAb0012).
Figura 11A:Efecto del FVIIa-Fab1029 sobre la formación de un coágulo de fibrina inducida por TF en sangre total humana (HWB) a partir de un donante normal medido por tromboelastografía (TEG). La formación del coágulo en HWB recalcificada (curva HWB) se induce mediante TF 0,03 pM (Innovin®). La curva “Hemofilia” muestra la formación de coágulos retrasada e inadecuada cuando la HWB se suplementa con anticuerpo anti-FVIII 10 pg/ml. Otras curvas muestran las curvas obtenidas cuando la condición similar a la hemofilia inducida por el anticuerpo contra el FVIII se revierte mediante diversas concentraciones (0; 0,25; 0,5; 1,0 nM) de ya sea FVIIa-Fab1029 o rFVIIa, como se indica. La actividad de puenteo de FVIII de FVIIa-Fab1029 se muestra más potente que la de rFVIIa.Figure 11A: Effect of FVIIa-Fab1029 on TF-induced fibrin clot formation in human whole blood (HWB) from a normal donor measured by thromboelastography (TEG). Clot formation in recalcified HWB (HWB curve) is induced by 0.03 pM TF (Innovin®). The "Hemophilia" curve shows delayed and inadequate clot formation when HWB is supplemented with 10 pg / ml anti-FVIII antibody. Other curves show the curves obtained when the hemophilia-like condition induced by the FVIII antibody is it reverts by various concentrations (0; 0.25; 0.5; 1.0 nM) of either FVIIa-Fab1029 or rFVIIa, as indicated. The FVIII bridging activity of FVIIa-Fab1029 is shown to be more potent than that of rFVIIa.
Figura 11B:Efecto del FVIIa-Fab1029 sobre la formación de un coágulo de fibrina inducida por TF en sangre total humana (HWB) a partir de un donante normal medido por tromboelastografía (TEG). Tiempo R determinado a partir de los trazos de t Eg del experimento mostrado en la Figura 11A.Figure 11B: Effect of FVIIa-Fab1029 on TF-induced fibrin clot formation in human whole blood (HWB) from a normal donor measured by thromboelastography (TEG). Time R determined from the t Eg traces of the experiment shown in Figure 11A.
La sangre total humana estabilizada con citrato (HWB) se extrae a partir de donantes normales. Las condiciones similares a hemofilia se obtienen mediante la incubación de HWB con anticuerpo anti-FVIII 10 pg/ml (anti-Factor VIII humano de oveja; Hematologic Technologies Inc) durante 30 min a temperatura ambiente. La formación de coágulos se mide mediante tromboelastografía (analizador TEG serie 5000, Haemoscope Corporation, Niles, IL, EE.UU.). Se añaden diversas concentraciones (0; 0,25; 0,5; 1,0 nM) del FVIIa-Fab1029 o rFVIIa a la HWB con citrato similar a hemofilia. La coagulación se inicia cuando se transfieren 340 pl de HWB normal o similar a hemofilia a un recipiente del tromboelastógrafo que contiene 20 pl de CaCb 0,2 M con TF lipidado 0,03 pM (Innovin®, Dade Behring Gmbh (Marburg, Alemania). El trazo de TEG se sigue continuamente por hasta 120 min. Se registran las variables de TEG siguientes: Tiempo R (tiempo de coagulación, es decir, el tiempo desde el inicio de la coagulación hasta que se obtuvo una amplitud de 2 mm), ángulo a (desarrollo de coágulos medido como el ángulo entre el valor de R y el punto de inflexión del trazo de TEG), K (velocidad de la cinética del coágulo para alcanzar un cierto nivel de resistencia del coágulo, amplitud = 20 mm), y MA (amplitud máxima del trazo de TEG que refleja la resistencia mecánica máxima del coágulo).Citrate stabilized human whole blood (HWB) is drawn from normal donors. Hemophilia-like conditions are obtained by incubating HWB with 10 pg / ml anti-FVIII antibody (sheep anti-human Factor VIII; Hematologic Technologies Inc) for 30 min at room temperature. Clot formation is measured by thromboelastography (5000 series TEG analyzer, Haemoscope Corporation, Niles, IL, USA). Various concentrations (0; 0.25; 0.5; 1.0 nM) of FVIIa-Fab1029 or rFVIIa are added to HWB with hemophilia-like citrate. Coagulation is initiated when 340 µl of normal or hemophilia-like HWB is transferred to a thromboelastgraph vessel containing 20 µl of 0.2 M CaCb with 0.03 pM lipidated TF (Innovin®, Dade Behring Gmbh (Marburg, Germany) The TEG trace is continuously followed for up to 120 min The following TEG variables are recorded: Time R (coagulation time, that is, the time from the start of coagulation until an amplitude of 2 mm was obtained), angle a (clot development measured as the angle between the R value and the inflection point of the TEG trace), K (speed of the clot kinetics to reach a certain level of clot resistance, amplitude = 20 mm), and MA (maximum amplitude of the TEG trace that reflects the maximum mechanical resistance of the clot).
Figura 12:Efecto del FIX-Fab0135 en la formación de un coágulo de fibrina inducida por TF en sangre total humana (HWB) a partir de un donante normal medido mediante tromboelastografía (TEG). La formación del coágulo en HWB recalcificada (curva HWB) se induce mediante TF 0,03 pM (Innovin®). La curva “Hemofilia” muestra la formación de coágulos retrasada e inadecuada cuando la HWB se suplementa con anticuerpo anti-FVIII 10 pg/ml. Otras curvas muestran los trazos de TEG obtenidos cuando la condición similar a hemofilia A inducida por el anticuerpo FVIII se revierte mediante diversas concentraciones (0,1; 0,2; 1,0; 5,0; 10 nM) del FIX-Fab0135. Las curvas de TEG obtenidas cuando la proteína de fusión FIX se reemplaza por rFVIIa 1 nM o rFIX 10 nM se muestran para la comparación. Figure 12: Effect of FIX-Fab0135 on the formation of a TF-induced fibrin clot in human whole blood (HWB) from a normal donor measured by thromboelastography (TEG). Clot formation in recalcified HWB (HWB curve) is induced by 0.03 pM TF (Innovin®). The "Hemophilia" curve shows delayed and inadequate clot formation when HWB is supplemented with 10 pg / ml anti-FVIII antibody. Other curves show the TEG traces obtained when the FVIII antibody-induced hemophilia A-like condition is reversed by various concentrations (0.1; 0.2; 1.0; 5.0; 10 nM) of FIX-Fab0135. TEG curves obtained when the FIX fusion protein is replaced by 1 nM rFVIIa or 10 nM rFIX are shown for comparison.
Figura 13: El FIX-Fab0135 dirigido a las vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1 promueve notablemente la activación de FX inducida por FVIIa en ausencia del FVIII. Diversas concentraciones (0,05 - 100 nM) de rFVIIa se incuban durante 15 min en tampón Hepes (o) o en tampón Hepes que contiene FIX 10 nM (□); FIXa 10 nM (■) o FIX-Fab013510 nM (▲). A continuación, esto se mezcla y se incuba durante 3 min con FX 100 nM y vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1 a una dilución de 1:4000 en ausencia o en presencia de FVIII 5 nM, como se indica. La reacción se detiene con EDTA, y la generación del FXa se mide en un ensayo cromogénico.Figure 13: FIX-Fab0135 targeting TLT-1-enriched phospholipid vesicles remarkably promotes FVIIa-induced FX activation in the absence of FVIII. Various concentrations (0.05 - 100 nM) of rFVIIa are incubated for 15 min in Hepes buffer (o) or in Hepes buffer containing 10 nM FIX (□); FIXa 10 nM (■) or FIX-Fab013510 nM (▲). This is then mixed and incubated for 3 min with 100 nM FX and TLT-1 enriched phospholipid vesicles at a dilution of 1: 4000 in the absence or in the presence of 5 nM FVIII, as indicated. The reaction is stopped with EDTA, and the generation of the FXa is measured in a chromogenic assay.
Figura 14:Expresión del TLT-1 en plaquetas humanas. La figura muestra la cantidad de TLT-1 en plaquetas en sangre total dividida en ventanas de análisis en dispersión frontal y lateral en el análisis de citometría de flujo. La fluorescencia media dentro de la ventana de análisis de plaquetas se usó para calcular la cantidad de TLT-1 mediante el uso de una curva estándar obtenida a partir de perlas con un número definido de sitios de unión para el anticuerpo de detección. Las plaquetas se activaron con el péptido activador del receptor activado por proteasas-1 SFLLRN (0,3-30 pM). Para asegurar la expresión máxima del TLT-1 se usó una combinación de SFLLRN (30 pM) y Convulxina (Cvlxn) (100 ng/ml) como control. La expresión del TLT-1 se midió mediante dos anticuerpos anti-TLT-1 diferentes, mAb0136; gráfico de barras izquierdo y mAb0123; gráfico de barras derecho. Los datos se presentan como media±sem con el número de donantes de sangre que varía de 2 a 4 en los diferentes grupos.Figure 14: Expression of TLT-1 in human platelets. The figure shows the amount of platelet TLT-1 in whole blood divided into front and side scatter analysis windows in flow cytometric analysis. The mean fluorescence within the platelet analysis window was used to calculate the amount of TLT-1 by using a standard curve obtained from beads with a defined number of binding sites for the detection antibody. Platelets were activated with the SFLLRN protease activated receptor-1 activator peptide (0.3-30 pM). To ensure maximum expression of TLT-1, a combination of SFLLRN (30 pM) and Convulxin (Cvlxn) (100 ng / ml) was used as a control. TLT-1 expression was measured by two different anti-TLT-1 antibodies, mAb0136; left bar graph and mAb0123; right bar graph. Data are presented as mean ± sem with the number of blood donors ranging from 2 to 4 in the different groups.
Figura 15: Tiempo de sangrado reducido en dependencia de la dosis de FVIIa-Fab9015 (izquierda) y pérdida de sangre (derecha) en ratones KOKI TLT-1 con hemofilia inducida por anticuerpo en comparación con ratones hemofílicos que recibieron vehículo. Una dosis de FVIIa-Fab9015 20 nmol/kg fue significativamente más eficaz en comparación con 20 nmol/kg de rFVIIa.Figure 15: Dose-dependent reduced bleeding time of FVIIa-Fab9015 (left) and blood loss (right) in KOKI TLT-1 mice with antibody-induced hemophilia compared to vehicle-receiving hemophiliac mice. A 20 nmol / kg FVIIa-Fab9015 dose was significantly more effective compared to 20 nmol / kg rFVIIa.
Figura 16: Conteo de plaquetas en ratones KOKI TLT-1 hemofílicos transitorios dosificados con FVIIa-Fab9015 (20 o 4 nmol/kg), rFVIIa (20 nmol/kg) o vehículo. Los ratones se dosificaron a los -5 min, se observó el sangrado de 0 a 30 min, y se observó el conteo de plaquetas durante 120 min después de la inducción del sangrado.Figure 16: Platelet count in KOKI TLT-1 transient hemophiliac mice dosed with FVIIa-Fab9015 (20 or 4 nmol / kg), rFVIIa (20 nmol / kg) or vehicle. Mice were dosed at -5 min, bleeding was observed from 0 to 30 min, and platelet count was observed for 120 min after induction of bleeding.
Figura 17A: El gráfico de barras muestra la cantidad máxima de trombina generada por 25 nM de rFVIIa (barra sin rellenar) o FVIIa-Fab9015 (barra rellena). La generación de trombina se midió en condiciones de hemofilia A inducida (anticuerpos policlonales anti-FVIII humano de oveja) con una concentración de plaquetas establecida de 150 000 plt/pl. La reacción se inició con la activación de plaquetas mediante la adición del péptido activador del PAR-1 SFLLRN (30 pm) y el agonista del GPIV Convulxina (100 ng/ml).Figure 17A: The bar graph shows the maximum amount of thrombin generated by 25 nM of rFVIIa (unfilled bar) or FVIIa-Fab9015 (filled bar). Thrombin generation was measured under conditions of induced hemophilia A (polyclonal antibodies against human sheep FVIII) with an established platelet concentration of 150,000 plt / pl. The reaction was initiated with platelet activation by the addition of the PAR-1 activating peptide SFLLRN (30 pm) and the GPIV agonist Convulxin (100 ng / ml).
Figura 17B: El gráfico de barras muestra la cantidad máxima de trombina generada por 5 nM de rFVIIa (barra sin rellenar) o FVIIa-Fab9015 (barra rellena). La generación de trombina se midió en condiciones de hemofilia A con una concentración de plaquetas establecida de 150000 plt/pl. La reacción se inició con la activación de plaquetas mediante la adición del péptido activador del PAR-1 SFLLRN (30 pM) y el agonista del GPIV Convulxina (100 ng/ml). Figure 17B: The bar graph shows the maximum amount of thrombin generated by 5 nM of rFVIIa (unfilled bar) or FVIIa-Fab9015 (filled bar). Thrombin generation was measured under hemophilia A conditions with an established platelet concentration of 150,000 plt / pl. The reaction was initiated with platelet activation by addition of PAR-1 activating peptide SFLLRN (30 pM) and GPIV agonist Convulxin (100 ng / ml).
Figura 18: La figura muestra que el efecto del FVIIa-Fab9015 dependió de la activación de plaquetas. Se añadió FVIIa-Fab901525 nM a plasma humano rico en plaquetas (150 000 plt/pl) hecho similar a hemofilia A mediante la adición de anticuerpos anti-FVIII humano de oveja. Las muestras con plaquetas no activadas muestran una deficiente generación de trombina (línea punteada), el péptido activador del pAR-1 SFLLRN (10 pM) proporciona algún aumento en la generación de trombina (línea discontinua) y las plaquetas activadas tanto con SFLLRN (30 pM) como con el agonista del GPVI Convulxina (100 ng/ml) proporcionan la mayor generación de trombina (línea sólida).Figure 18: The figure shows that the effect of FVIIa-Fab9015 depended on platelet activation. FVIIa-Fab901525 nM was added to platelet-rich human plasma (150,000 plt / pl) made similar to hemophilia A by adding anti-human sheep FVIII antibodies. Samples with non-activated platelets show poor thrombin generation (dotted line), the pAR-1 activating peptide SFLLRN (10 pM) provides some increase in thrombin generation (dashed line) and platelets activated with both SFLLRN (30 pM) as with the GPVI agonist Convulxin (100 ng / ml) provide the highest generation of thrombin (solid line).
Figura 19: La figura muestra que el aumento en la generación de trombina con FVIIa-Fab9015 en comparación con rFVIIa fue dependiente del TLT-1. Los trazos originales muestran la generación de trombina en plasma humano rico en plaquetas (150 000 plt/pl) hecho similar a hemofilia A mediante la adición de anticuerpos policlonales anti-FVIII humano de oveja. La generación de trombina se inició mediante la adición del péptido activador del PAR-1 SFLLRN (30 pM) y el agonista del GPVI Convulxina (100 ng/ml). Como se muestra por los trazos, el FVIIa-Fab9015 (5 nM) (línea sólida) proporciona un pico de trombina significativamente mayor que el rFVIIa (5 nM) (línea punteada). Al incubar previamente las muestras con TLT-1 soluble (100 nM) la capacidad generadora de trombina del FVIIa-Fab9015 se redujo significativamente (línea discontinua). Esto confirma que el efecto del 9015 depende de la unión al TLT-1 en la plaqueta activada.Figure 19: The figure shows that the increase in thrombin generation with FVIIa-Fab9015 compared to rFVIIa was dependent on TLT-1. The original traces show the generation of thrombin in platelet rich human plasma (150,000 plt / pl) made similar to hemophilia A by the addition of polyclonal antibodies against human sheep FVIII. Thrombin generation was initiated by the addition of the PAR-1 activating peptide SFLLRN (30 pM) and the GPVI agonist Convulxin (100 ng / ml). As shown by the dashes, FVIIa-Fab9015 (5 nM) (solid line) provides a significantly higher thrombin peak than rFVIIa (5 nM) (dotted line). By previously incubating the samples with soluble TLT-1 (100 nM) the thrombin-generating capacity of FVIIa-Fab9015 was significantly reduced (dashed line). This confirms that the effect of 9015 depends on binding to TLT-1 on the activated platelet.
Figura 20: La figura muestra que el aumento en la generación de trombina con FIX-Fab0155 en comparación con rFIX fue dependiente del TLT-1. Los trazos originales muestran la generación de trombina en plasma deficiente en FIX que contiene plaquetas humanas (150 000 plt/pl). La generación de trombina se inició mediante la adición del péptido activador del PAR-1 SFLLRN (30 pM) y el agonista del GPVI Convulxina (100 ng/ml). Como se muestra por los trazos, el FIX-Fab0155 1 nM (línea sólida) proporciona un pico de trombina significativamente mayor que el rFIX (línea gris). La preincubación del TLT-1 soluble (100 nM) redujo significativamente la capacidad generadora de trombina del FIX-Fab0155 (línea discontinua) lo que confirma la dependencia del TLT-1.Figure 20: The figure shows that the increase in thrombin generation with FIX-Fab0155 compared to rFIX was dependent on TLT-1. The original traces show the generation of thrombin in plasma deficient in FIX that contains human platelets (150,000 plt / pl). Thrombin generation was initiated by the addition of the PAR-1 activating peptide SFLLRN (30 pM) and the GPVI agonist Convulxin (100 ng / ml). As shown by the dashes, 1 nM FIX-Fab0155 (solid line) provides a significantly higher thrombin peak than rFIX (gray line). Preincubation of soluble TLT-1 (100 nM) significantly reduced the thrombin-generating capacity of FIX-Fab0155 (dashed line), confirming the dependence of TLT-1.
Figura 21: Autoactivación de la proteína de fusión FVII-Fab5001 en presencia del Factor Tisular soluble (sTF). La actividad proteolítica se midió en presencia de fosfolípidos (PC:PS) y sTF. Los resultados son los promedios de dos mediciones independientes y se dan en valores de kcat/Km relativos en comparación con wtFVIIa.Figure 21: Self-activation of the FVII-Fab5001 fusion protein in the presence of soluble Tissue Factor (sTF). Proteolytic activity was measured in the presence of phospholipids (PC: PS) and sTF. The results are the averages of two independent measurements and are given in relative kcat / Km values compared to wtFVIIa.
Figura 22A:Ninguno de los anticuerpos para TLT-1 (mAb0023, mAb0051, mAb0061, mAb0062) afectan la agregación plaquetaria. La figura muestra trazos originales de mediciones de transmisión de la luz en plasma rico en plaquetas donde las plaquetas se han activado con SFLLRN (1 pM). Las muestras se incubaron previamente con anticuerpo anti-TLT-1 o anticuerpo control irrelevante (10 nM) 3 min antes de la activación de plaquetas.Figure 22A: None of the antibodies to TLT-1 (mAb0023, mAb0051, mAb0061, mAb0062) affect platelet aggregation. The figure shows original traces of light transmission measurements in platelet-rich plasma where platelets have been activated with SFLLRN (1 pM). Samples were previously incubated with anti-TLT-1 antibody or irrelevant control antibody (10 nM) 3 min prior to platelet activation.
Figura 22B:Ninguno de los anticuerpos para TLT-1 (mAb0023, mAb0051, mAb0061, mAb0062) afecta la agregación plaquetaria. La figura muestra trazos originales de mediciones de transmisión de la luz en plasma rico en plaquetas en el que las plaquetas se han activado con SFLLRN (10 pM). Las muestras se han incubado previamente con anticuerpo anti-TLT-1 o anticuerpo control irrelevante (10 nM) 3 min antes de la activación de plaquetasFigure 22B: None of the antibodies to TLT-1 (mAb0023, mAb0051, mAb0061, mAb0062) affect platelet aggregation. The figure shows original traces of light transmission measurements in platelet-rich plasma in which platelets have been activated with SFLLRN (10 pM). Samples have been previously incubated with anti-TLT-1 antibody or irrelevant control antibody (10 nM) 3 min before platelet activation
Figura 23:Efecto del FIX-mAb0145 sobre la formación de coágulos de fibrina inducida por TF en sangre total humana (HWB) a partir de un donante normal medida por tromboelastografía (TEG). Se muestran el tiempo R obtenido a partir de los trazos del TEG con HWB normal y sangre con “hemofilia” suplementada con diversas concentraciones de FIX-mAb0145 o rFIX.Figure 23: Effect of FIX-mAb0145 on TF-induced fibrin clot formation in human whole blood (HWB) from a normal donor measured by thromboelastography (TEG). The time R obtained from the TEG traces with normal HWB and blood with "hemophilia" supplemented with various concentrations of FIX-mAb0145 or rFIX are shown.
Figura 24: El gráfico de barras muestra la cantidad máxima de trombina generada por 25 nM de FVIIa-Fab9015, FVIIa-Fab1029 y FVIIa-Fab1001. Los tres constructos mostraron aumento de potencia en comparación con rFVIIa (25 nM). La generación de trombina se midió en condiciones de hemofilia A inducida (anticuerpos policlonales anti-FVIII humano de oveja) con una concentración de plaquetas establecida de 150000 plt/pl. La reacción se inició con la activación de plaquetas mediante la adición del péptido activador del PAR-1 SFLLRn (30 pM) y el agonista del GPIV Convulxina (100 ng/ml). Las barras muestran la media±SD de la generación de trombina máxima (n=2-5).Figure 24: The bar graph shows the maximum amount of thrombin generated by 25 nM of FVIIa-Fab9015, FVIIa-Fab1029 and FVIIa-Fab1001. All three constructs showed increased potency compared to rFVIIa (25 nM). Thrombin generation was measured under conditions of induced hemophilia A (polyclonal antibodies against human sheep FVIII) with an established platelet concentration of 150,000 plt / pl. The reaction was initiated with platelet activation by addition of PAR-1 activating peptide SFLLRn (30 pM) and GPIV agonist Convulxin (100 ng / ml). The bars show the mean ± SD of the maximum thrombin generation (n = 2-5).
Figura 25: La figura muestra el aumento en potencia del FVIIa-Fab5001 en comparación con el rFVIIa de tipo silvestre. Los trazos originales muestran la generación de trombina en plasma deficiente en Factor VIII que contiene plaquetas humanas lavadas (150 000 plt/pl). En las muestras activadas la generación de trombina se inició por la adición del péptido activador del PAR-1 SFLLRN (30 pM) y el agonista del GPVI Convulxina (100 ng/ml). Como se muestra por los trazos, el FVIIa-Fab5001 (25 nM) (línea sólida) proporciona aproximadamente un pico de trombina cuatro veces mayor que el rFVIIa de tipo silvestre (25 nM) (línea punteada). No hubo aumento de la potencia con las plaquetas inactivadas (línea discontinua).Figure 25: The figure shows the increase in potency of FVIIa-Fab5001 compared to wild type rFVIIa. Original traces show thrombin generation in Factor VIII deficient plasma containing washed human platelets (150,000 plt / pl). In activated samples, thrombin generation was initiated by the addition of the PAR-1 activating peptide SFLLRN (30 pM) and the GPVI agonist Convulxin (100 ng / ml). As shown by the dashes, FVIIa-Fab5001 (25 nM) (solid line) provides approximately a thrombin peak four times greater than wild-type rFVIIa (25 nM) (dotted line). There was no increase in potency with inactivated platelets (dashed line).
SECUENCIASSEQUENCES
Las secuencias son las siguientes:The sequences are as follows:
La SEQ ID NO: 1 proporciona la secuencia de nucleótidos del (h)TLT-1 humano.SEQ ID NO: 1 provides the nucleotide sequence of human (h) TLT-1.
La SEQ ID NO: 2 proporciona la secuencia de aminoácidos del hTLT-1. SEQ ID NO: 2 provides the amino acid sequence of hTLT-1.
La SEQ ID NO: 3 proporciona la secuencia de nucleótidos del dominio extracelular del hTLT-1-His6.SEQ ID NO: 3 provides the nucleotide sequence of the extracellular domain of hTLT-1-His6.
La SEQ ID NO: 4 proporciona la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del hTLT-1-His6.SEQ ID NO: 4 provides the amino acid sequence of the extracellular domain of hTLT-1-His6.
Las SEQ ID NO: 5 a 8 proporcionan las secuencias de aminoácidos de los fragmentos del hTLT-1: hTLT-1.20-125, hTLT-1.16-162, hTLT-1.126-162 y hTLT-1.129-142.SEQ ID NO: 5 to 8 provide the amino acid sequences of the hTLT-1 fragments: hTLT-1.20-125, hTLT-1.16-162, hTLT-1,126-162, and hTLT-1,129-142.
La SEQ ID NO: 9 proporciona la secuencia de nucleótidos del dominio variable de la LC del mAb0012.SEQ ID NO: 9 provides the nucleotide sequence of the mAb0012 LC variable domain.
La SEQ ID NO: 10 proporciona la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la LC del mAb0012.SEQ ID NO: 10 provides the amino acid sequence of the LC variable domain of mAb0012.
La SEQ ID NO: 11 proporciona la secuencia de nucleótidos del dominio variable de la HC del 0012.SEQ ID NO: 11 provides the nucleotide sequence of the 0012 HC variable domain.
La SEQ ID NO: 12 proporciona la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la HC del 0012.SEQ ID NO: 12 provides the amino acid sequence of the 0012 HC variable domain.
La SEQ ID NO: 13 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena 
La SEQ ID NO: 14 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del mAb0012 y el Fab0012. La SEQ ID NO: 15 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena 
La SEQ ID NO: 16 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del mAb0023 y el Fab0023. La SEQ ID NO: 17 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena 
La SEQ ID NO: 18 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del mAb0051 y el Fab0051. La SEQ ID NO: 19 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del mAb0052.SEQ ID NO: 18 provides the light chain nucleotide sequence of mAb0051 and Fab0051. SEQ ID NO: 19 provides the nucleotide sequence of the heavy chain of mAb0052.
La SEQ ID NO: 20 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del mAb0062.SEQ ID NO: 20 provides the nucleotide sequence of the heavy chain of mAb0062.
La SEQ ID NO: 21 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del mAb0052, el Fab0052 y el mAb0062.SEQ ID NO: 21 provides the nucleotide sequence of the light chain of mAb0052, Fab0052, and mAb0062.
La SEQ ID NO: 22 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del mAb0061.SEQ ID NO: 22 provides the nucleotide sequence of the heavy chain of mAb0061.
La SEQ ID NO: 23 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del mAb0082.SEQ ID NO: 23 provides the nucleotide sequence of the heavy chain of mAb0082.
La SEQ ID NO: 24 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del mAb0061, el Fab0061, el mAb0082 y el Fab0082.SEQ ID NO: 24 provides the light chain nucleotide sequence of mAb0061, Fab0061, mAb0082, and Fab0082.
La SEQ ID NO: 25 proporciona la secuencia de nucleótidos de la VH-CH1 del Fab0012.SEQ ID NO: 25 provides the nucleotide sequence of VH-CH1 from Fab0012.
La SEQ ID NO: 26 proporciona la secuencia de nucleótidos de la
La SEQ ID NO: 27 proporciona la secuencia de nucleótidos de la
La SEQ ID NO: 28 proporciona la secuencia de nucleótidos de la
La SEQ ID NO: 29 proporciona la secuencia de nucleótidos de la
La SEQ ID NO: 30 proporciona la secuencia de nucleótidos de la
La SEQ ID NO: 31 proporciona la secuencia de nucleótidos de la bisagra-CH2-CH3 de hlgG4.SEQ ID NO: 31 provides the nucleotide sequence of hinge-CH2-CH3 of hlgG4.
La SEQ ID NO: 32 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0012, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).SEQ ID NO: 32 provides the amino acid sequence of mAb0012, HC (mouse VH-CH1-CH2-CH3 of human IgG4).
La SEQ ID NO: 33 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0012, LC (VL de ratón - CL Kappa humana) y Fab0012, LC (VL de ratón - CL Kappa humana).SEQ ID NO: 33 provides the amino acid sequence of mAb0012, LC (mouse VL-human CL Kappa) and Fab0012, LC (mouse VL-human Kappa CL).
La SEQ ID NO: 34 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0023, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).SEQ ID NO: 34 provides the amino acid sequence of mAb0023, HC (mouse VH-CH1-CH2-CH3 of human IgG4).
La SEQ ID NO: 35 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0023, LC (VL de ratón - CL Kappa humana) y Fab0023, LC (VL de ratón - CL Kappa humana). SEQ ID NO: 35 provides the amino acid sequence of mAb0023, LC (mouse VL-human CL Kappa) and Fab0023, LC (mouse VL-human Kappa CL).
La SEQ ID NO: 36 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0051, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).SEQ ID NO: 36 provides the amino acid sequence of mAb0051, HC (mouse VH-CH1-CH2-CH3 from human IgG4).
La SEQ ID NO: 37 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0051, LC (VL de ratón - CL Kappa humana) y Fab0051, LC (VL de ratón - CL Kappa humana).SEQ ID NO: 37 provides the amino acid sequence of mAb0051, LC (mouse VL-human CL Kappa) and Fab0051, LC (mouse VL-human Kappa CL).
La SEQ ID NO: 38 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0052, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).SEQ ID NO: 38 provides the amino acid sequence of mAb0052, HC (mouse VH-CH1-CH2-CH3 of human IgG4).
La SEQ ID NO: 39 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0052, LC (VL de ratón - CL Kappa humana); Fab0052, LC (VL de ratón - CL Kappa humana); mAb0062, LC (VL de ratón - CL Kappa humana).SEQ ID NO: 39 provides the amino acid sequence of mAb0052, LC (mouse VL-human CL Kappa); Fab0052, LC (mouse VL-human Kappa CL); mAb0062, LC (mouse VL-human Kappa CL).
La SEQ ID NO: 40 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0061, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).SEQ ID NO: 40 provides the amino acid sequence of mAb0061, HC (mouse VH-CH1-CH2-CH3 of human IgG4).
La SEQ ID NO: 41 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0061, LC (VL de ratón - CL Kappa humana); Fab0061, LC (VL de ratón - CL Kappa humana) y mAb0082, LC (VL de ratón - CL Kappa humana); Fab0082, LC (VL de ratón - CL Kappa humana).SEQ ID NO: 41 provides the amino acid sequence of mAb0061, LC (mouse VL-human CL Kappa); Fab0061, LC (mouse VL - human CL Kappa) and mAb0082, LC (mouse VL - human Kappa CL); Fab0082, LC (mouse VL-human Kappa CL).
La SEQ ID NO: 42 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0062, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).SEQ ID NO: 42 provides the amino acid sequence of mAb0062, HC (mouse VH-CH1-CH2-CH3 from human IgG4).
La SEQ ID NO: 43 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb0082, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).SEQ ID NO: 43 provides the amino acid sequence of mAb0082, HC (mouse VH-CH1-CH2-CH3 from human IgG4).
La SEQ ID NO: 44 proporciona la secuencia de aminoácidos del Fab0012, VH de ratón - CH1 
La SEQ ID NO: 59 proporciona la secuencia de aminoácidos de la etiqueta de purificación HPC4.SEQ ID NO: 59 provides the amino acid sequence of the HPC4 purification tag.
Las SEQ ID NO: 60-145 proporcionan las secuencias de ácidos nucleicos de los cebadores usados durante el desarrollo de los constructos de expresión descritos en los ejemplos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 24, 25.SEQ ID NO: 60-145 provide the nucleic acid sequences of the primers used during the development of the expression constructs described in Examples 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 24, 25.
La SEQ ID NO: 146 proporciona la secuencia de aminoácidos de VH-CH1 del Fab0061.SEQ ID NO: 146 provides the amino acid sequence of VH-CH1 from Fab0061.
La SEQ ID NO: 147 proporciona la secuencia de aminoácidos de la bisagra-CH2-CH3 del hIgG4.SEQ ID NO: 147 provides the amino acid sequence of hinge-CH2-CH3 of hIgG4.
La SEQ ID NO: 148 proporciona la secuencia de aminoácidos de una etiqueta His6.SEQ ID NO: 148 provides the amino acid sequence of a His6 tag.
La SEQ ID NO: 149 proporciona la secuencia de aminoácidos del hTLT-1.18-188.SEQ ID NO: 149 provides the amino acid sequence of hTLT-1.18-188.
La SEQ ID NO: 150 proporciona la secuencia de ácidos nucleicos del cebador núm. 1004.SEQ ID NO: 150 provides the nucleic acid sequence of primer no. 1004.
La SEQ ID NO: 151 proporciona la secuencia de ácidos nucleicos del cebador núm. 1005.SEQ ID NO: 151 provides the nucleic acid sequence of primer no. 1005.
La SEQ ID NO: 152 proporciona la secuencia de aminoácidos de la HC del Fab0100.SEQ ID NO: 152 provides the amino acid sequence of the Fab0100 HC.
La SEQ ID NO: 153 proporciona la secuencia de aminoácidos de la LC del Fab0100.SEQ ID NO: 153 provides the amino acid sequence of the Fab0100 LC.
La SEQ ID NO: 154 proporciona la secuencia de ácidos nucleicos del Factor FV humano de tipo silvestre.SEQ ID NO: 154 provides the nucleic acid sequence of wild-type human FV Factor.
La SEQ ID NO: 155 proporciona la secuencia de aminoácidos del Factor FV humano de tipo silvestre.SEQ ID NO: 155 provides the amino acid sequence of wild-type human FV Factor.
La SEQ ID NO: 156 proporciona la secuencia de ácidos nucleicos del Factor FVII humano de tipo silvestre. SEQ ID NO: 156 provides the nucleic acid sequence of wild-type human FVII factor.
La SEQ ID NO: 157 proporciona la secuencia de aminoácidos del Factor FVII humano de tipo silvestre.SEQ ID NO: 157 provides the amino acid sequence of wild-type human FVII Factor.
La SEQ ID NO: 158 proporciona la secuencia de ácidos nucleicos del Factor FVIII humano de tipo silvestre.SEQ ID NO: 158 provides the nucleic acid sequence of wild-type human FVIII factor.
La SEQ ID NO: 159 proporciona la secuencia de aminoácidos del Factor FVIII humano de tipo silvestre.SEQ ID NO: 159 provides the amino acid sequence of wild-type human FVIII Factor.
La SEQ ID NO: 160 proporciona la secuencia de ácidos nucleicos del Factor FIX humano de tipo silvestre.SEQ ID NO: 160 provides the nucleic acid sequence of wild-type human FIX Factor.
La SEQ ID NO: 161 proporciona la secuencia de aminoácidos del Factor FIX humano de tipo silvestre.SEQ ID NO: 161 provides the amino acid sequence of wild-type human FIX Factor.
La SEQ ID NO: 162 proporciona la secuencia de ácidos nucleicos del Factor FX humano de tipo silvestre.SEQ ID NO: 162 provides the nucleic acid sequence of wild-type human Factor FX.
La SEQ ID NO: 163 proporciona la secuencia de aminoácidos del Factor FX humano de tipo silvestre.SEQ ID NO: 163 provides the amino acid sequence of wild-type human Factor FX.
La SEQ ID NO: 164 proporciona la secuencia de ácidos nucleicos del Factor FXI humano de tipo silvestre.SEQ ID NO: 164 provides the nucleic acid sequence of wild-type human FXI.
La SEQ ID NO: 165 proporciona la secuencia de aminoácidos del Factor FXI humano de tipo silvestre.SEQ ID NO: 165 provides the amino acid sequence of wild-type human FXI factor.
La SEQ ID NO: 166 proporciona la secuencia de ADN del 0012LC.C36A-HPC4.SEQ ID NO: 166 provides the DNA sequence of 0012LC.C36A-HPC4.
La SEQ ID NO: 167 proporciona la secuencia de aminoácidos del 0012LC.C36A-HPC4.SEQ ID NO: 167 provides the amino acid sequence of 0012LC.C36A-HPC4.
La SEQ ID NO: 168 proporciona la secuencia de ADN del 0012VH-CH1-HPC4.SEQ ID NO: 168 provides the DNA sequence of 0012VH-CH1-HPC4.
La SEQ ID NO: 169 proporciona la secuencia de aminoácidos del 0012VH-CH1-HPC4.SEQ ID NO: 169 provides the amino acid sequence of 0012VH-CH1-HPC4.
La SEQ ID NO: 170 proporciona la secuencia de ADN del 0012VH.T60N-CH1-YGPPC.SEQ ID NO: 170 provides the DNA sequence of 0012VH.T60N-CH1-YGPPC.
La SEQ ID NO: 171 proporciona el 0012VH.T60N-CH1-YGPPC.SEQ ID NO: 171 provides 0012VH.T60N-CH1-YGPPC.
La SEQ ID NO: 172 proporciona la secuencia de ADN del FIX-L4b-0012LC.SEQ ID NO: 172 provides the DNA sequence for FIX-L4b-0012LC.
La SEQ ID NO: 173 proporciona la secuencia de aminoácidos del FIX-L4b-0012LC.SEQ ID NO: 173 provides the amino acid sequence of FIX-L4b-0012LC.
La SEQ ID NO: 174 proporciona la secuencia de aminoácidos del 0003 Fab-LC: 0062Fab-LC-HPC4.SEQ ID NO: 174 provides the amino acid sequence of 0003 Fab-LC: 0062Fab-LC-HPC4.
La SEQ ID NO: 175 proporciona la secuencia de aminoácidos del 0003 Fab-HC: 0062Fab-VH-CH1-YGPPC. La SEQ ID NO: 176 proporciona la secuencia de aminoácidos del 0197-0000-0074 Fab-HC: 0197-0000-0051Fab-VH-CH1-YGPPC.SEQ ID NO: 175 provides the amino acid sequence of 0003 Fab-HC: 0062Fab-VH-CH1-YGPPC. SEQ ID NO: 176 provides the amino acid sequence of the 0197-0000-0074 Fab-HC: 0197-0000-0051Fab-VH-CH1-YGPPC.
La SEQ ID NO: 177 proporciona la secuencia de aminoácidos del 0074 Fab-LC: 0051Fab-LC-HPC4.SEQ ID NO: 177 provides the amino acid sequence of 0074 Fab-LC: 0051Fab-LC-HPC4.
La SEQ ID NO: 178 proporciona la secuencia de aminoácidos del 0004 Fab-HC: 0023Fab-VH-CH1-YGPPC.SEQ ID NO: 178 provides the amino acid sequence of 0004 Fab-HC: 0023Fab-VH-CH1-YGPPC.
La SEQ ID NO: 179 proporciona la secuencia de aminoácidos del 0004Fab-LC: 0023Fab-LC-HPC4.SEQ ID NO: 179 provides the amino acid sequence of 0004Fab-LC: 0023Fab-LC-HPC4.
La SEQ ID NO: 180 proporciona la secuencia de aminoácidos del FVII-L4b-0062VH-CH1-HPC4 humano.SEQ ID NO: 180 provides the amino acid sequence of human FVII-L4b-0062VH-CH1-HPC4.
La SEQ ID NO: 181 proporciona la secuencia de aminoácidos del FVII 407C humano.SEQ ID NO: 181 provides the amino acid sequence of human FVII 407C.
La SEQ ID NO: 182 proporciona la secuencia de aminoácidos del FIX-L4b-0061LC humano.SEQ ID NO: 182 provides the amino acid sequence of human FIX-L4b-0061LC.
Descripción de la invenciónDescription of the Invention
Las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprenden al menos un factor de coagulación, o variante funcional de este y un anticuerpo, o un fragmento de este, que es capaz de unirse a un receptor que solo está presente (en el sentido ubicuo de la palabra) en una plaqueta que experimenta los cambios morfológicos y funcionales asociados con la activación o en una plaqueta activada. Dichos receptores podrían originarse a partir de los gránulos alfa o gránulos densos de las plaquetas en reposo, un ejemplo particular de dicho receptor es el transcripto 1 similar a TREM (TLT-1).The procoagulant proteins described in the present disclosure comprise at least one coagulation factor, or functional variant thereof, and an antibody, or a fragment thereof, that is capable of binding to a receptor that is only present (in the ubiquitous sense of the word) in a platelet experiencing the morphological and functional changes associated with activation or in an activated platelet. Such receptors could originate from the alpha granules or dense granules of resting platelets, a particular example of such a receptor is TREM-like transcript 1 (TLT-1).
Las moléculas procoagulantes pueden ser proteínas de fusión. El término “proteína de fusión”, en la presente descripción, se refiere a proteínas que se crean a través de la unión en marco de dos o más secuencias de ADN, que originalmente codifican proteínas o péptidos separados, o fragmentos de estas. La traducción de la secuencia de ADN de la proteína de fusión resultará en una secuencia de proteínas única, que puede tener propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas o péptidos originales. Las secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión pueden crearse artificialmente mediante métodos de biología molecular estándar tales como PCR solapada o ligadura de ADN y el ensamble se realiza mediante la exclusión del codón de parada en la primera secuencia de ADN de extremo 5' a la vez que se retiene el codón de parada en la secuencia de ADN de extremo 3'. La secuencia de ADN de la proteína de fusión resultante puede insertarse en un vector de expresión apropiado que soporta la expresión de proteína de fusión heteróloga en organismos huésped estándar tales como bacterias, levaduras, hongos, células de insectos o células de mamíferos.Procoagulant molecules can be fusion proteins. The term "fusion protein" in the present description refers to proteins that are created through the in-frame junction of two or more DNA sequences, which originally encode separate proteins or peptides, or fragments thereof. Translation of the DNA sequence of the fusion protein will result in a unique protein sequence, which may have functional properties. derived from each of the original proteins or peptides. DNA sequences encoding fusion proteins can be artificially created by standard molecular biology methods such as overlapping PCR or DNA ligation and assembly is performed by excluding the stop codon in the first 5 'end DNA sequence to the time the stop codon is retained in the 3 'end DNA sequence. The DNA sequence of the resulting fusion protein can be inserted into an appropriate expression vector that supports heterologous fusion protein expression in standard host organisms such as bacteria, yeast, fungi, insect cells, or mammalian cells.
Las proteínas de fusión pueden contener una secuencia del péptido enlazador o separador que separa las partes de proteína o péptido que definen la proteína de fusión. La secuencia del péptido enlazador o separador puede facilitar el plegado correcto de las partes de proteína o péptido individuales y puede hacer más probable que las partes de proteína o péptido individuales retengan sus propiedades funcionales individuales. Las secuencias del péptido enlazador o separador pueden insertarse en secuencias de ADN de la proteína de fusión durante el ensamble en marco de los fragmentos de ADN individuales que constituyen la secuencia de ADN completa de la proteína de fusión, es decir, durante PCR solapada o ligadura de ADN.The fusion proteins may contain a linker or spacer peptide sequence that separates the protein or peptide portions that define the fusion protein. The linker or spacer peptide sequence can facilitate correct folding of the individual protein or peptide parts and can make the individual protein or peptide parts more likely to retain their individual functional properties. The linker or spacer peptide sequences can be inserted into fusion protein DNA sequences during assembly in frame of the individual DNA fragments that make up the complete DNA sequence of the fusion protein, i.e., during overlapping PCR or ligation DNA.
Alternativamente, las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción pueden ser conjugados de su factor de coagulación constituyente y contrapartes de anticuerpo, de manera que el factor de coagulación y el anticuerpo se fabrican independientemente uno de otro y, después, se unen sintéticamente.Alternatively, the procoagulant proteins described in the present disclosure can be conjugated to their constituent coagulation factor and antibody counterparts, such that the coagulation factor and the antibody are manufactured independently of one another and are then synthetically linked.
Como se mencionó anteriormente, las moléculas procoagulantes descritas en la presente descripción pueden unirse específicamente al transcripto 1 similar a TREM (TLT-1). La activación de receptores expresados en células mieloides (TREM) tiene un papel bien establecido en la biología de diversos linajes mieloides, y juegan papeles importantes en la regulación de la inmunidad innata y adaptativa. El TLT-1 pertenece a la misma familia de proteínas, aunque el gen TLT-1 se expresa solo en un linaje único, específicamente en megacariocitos y trombocitos (plaquetas) y se encuentra exclusivamente en los gránulos alfa de los megacariocitos y las plaquetas. El TLT-1 es una proteína transmembrana que se expone en la superficie de plaquetas activadas tras la liberación de gránulos alfa. Hasta la fecha, el TLT-1 no se ha encontrado en la superficie de plaquetas en reposo o en la superficie de cualesquiera otros tipos de células. As mentioned above, the procoagulant molecules described in the present disclosure can specifically bind to TREM-like transcript 1 (TLT-1). Activation of myeloid cell expressed receptors (TREM) has a well-established role in the biology of various myeloid lineages, and they play important roles in the regulation of innate and adaptive immunity. TLT-1 belongs to the same family of proteins, although the TLT-1 gene is expressed only in a single lineage, specifically in megakaryocytes and thrombocytes (platelets) and is found exclusively in the alpha granules of megakaryocytes and platelets. TLT-1 is a transmembrane protein that is exposed on the surface of activated platelets after the release of alpha granules. To date, TLT-1 has not been found on the surface of resting platelets or on the surface of any other cell types.
La porción extracelular del TLT-1 se conoce que se compone de un único dominio similar a inmunoglobulinas (similar a Ig) conectado a la membrana celular de las plaquetas mediante una región enlazadora llamada el tallo (Gattis y otros, Jour Biol Chem, 2006, Vol. 281, Núm. 19, pp. 13396-13403). El dominio similar a Ig del TLT-1 humano (hTLT-1) se compone de 105 residuos y se une a la membrana mediante el tallo de 37 aminoácidos. Por lo tanto, se espera que el dominio similar a Ig del t LT-1 tenga una libertad de movimiento considerable.The extracellular portion of TLT-1 is known to be made up of a single immunoglobulin-like (Ig-like) domain connected to the platelet cell membrane by a linker region called the stem (Gattis et al., Jour Biol Chem, 2006, Vol. 281, No. 19, pp. 13396-13403). The Ig-like domain of human TLT-1 (hTLT-1) is made up of 105 residues and is bound to the membrane by the stem of 37 amino acids. Therefore, the Ig-like domain of t LT-1 is expected to have considerable freedom of movement.
El segmento transmembrana putativo del hTLT-1 es de 20 aminoácidos de longitud. El TLT-1 tiene, además, un motivo de inhibición basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) citoplasmático, que puede funcionar como un motivo de transducción de la señal intracelular.The putative transmembrane segment of hTLT-1 is 20 amino acids long. Furthermore, TLT-1 has a cytoplasmic immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM), which can function as an intracellular signal transduction motif.
El papel del TLT-1 en la biología de las plaquetas todavía no se ha dilucidado completamente; se ha demostrado que el TLT-1 se une al fibrinógeno y se cree que el TLT-1 juega un papel en la regulación de la coagulación e inflamación en el sitio de una lesión. Se ha informado una forma soluble del TLT-1 que contiene el dominio similar a Ig (Gattis y otros, Jour Biol Chem, 2006, Vol. 281, Núm. 19, pp. 13396-13403). Las funciones específicas del TLT-1 soluble frente al unido a plaquetas aún está por establecerse.The role of TLT-1 in platelet biology has not yet been fully elucidated; TLT-1 has been shown to bind fibrinogen, and TLT-1 is believed to play a role in regulating coagulation and inflammation at the site of injury. A soluble form of TLT-1 containing the Ig-like domain has been reported (Gattis et al., Jour Biol Chem, 2006, Vol. 281, No. 19, pp. 13396-13403). The specific functions of soluble TLT-1 versus platelet-bound remains to be established.
Giomerarelli y otros (Thrombosis and Haemostasis (2007) 97, 955-963) informaron la generación de moléculas scFv anti-TLT-1 mediante el uso de técnicas de presentación de fagos. Se encontró que algunas de las moléculas scFv anti-TLT-1 inhibían la agregación plaquetaria humana mediada por trombina. Por lo tanto, las moléculas scFc anti-TLT-1 con dichas características pueden tener propiedades antitrombóticas, similares a las moléculas scFv anti-GPIIb/IIIa descritas por Schwartz y otros (FASEB Journal, (2004), 18, 1704-1706).Giomerarelli et al. (Thrombosis and Haemostasis (2007) 97, 955-963) reported the generation of anti-TLT-1 scFv molecules using phage display techniques. Some of the anti-TLT-1 scFv molecules were found to inhibit thrombin-mediated human platelet aggregation. Therefore, anti-TLT-1 scFc molecules with such characteristics may have antithrombotic properties, similar to the anti-GPIIb / IIIa scFv molecules described by Schwartz et al. (FASEB Journal, (2004), 18, 1704-1706).
En la presente descripción se describen proteínas de fusión o conjugados que comprenden un factor de coagulación unido a un anticuerpo anti-TLT-1, o fragmentos de unión a antígeno de este, lo que incluye las scFv. El anticuerpo anti-TLT-1 o fragmentos de este sirven para dirigir el factor de coagulación unido a la superficie de plaquetas activadas mediante la unión al TLT-1 con el propósito de suministrar una actividad procoagulante en la superficie de plaquetas activadas. En este contexto, la inhibición de la agregación plaquetaria no es una propiedad conveniente del anticuerpo anti-TLT-1. Por lo tanto, se prefiere que los anticuerpos anti-TLT-1 no interfieran con las funciones del TLT-1, y en particular no inhiban la agregación plaquetaria.In the present disclosure, fusion or conjugate proteins are described which comprise a coagulation factor bound to an anti-TLT-1 antibody, or antigen binding fragments thereof, including scFv. Anti-TLT-1 antibody or fragments thereof serve to target coagulation factor bound to the surface of activated platelets by binding to TLT-1 for the purpose of providing procoagulant activity on the surface of activated platelets. In this context, inhibition of platelet aggregation is not a convenient property of the anti-TLT-1 antibody. Therefore, it is preferred that anti-TLT-1 antibodies do not interfere with the functions of TLT-1, and in particular do not inhibit platelet aggregation.
Un receptor tal como el TLT-1 comprende epítopos que son objetivos útiles para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción. Las proteínas procoagulantes pueden unirse a cualquier parte del TLT-1 que esté disponible para la unión in vivo, tal como residuos accesibles de la superficie del dominio similar a Ig, o parte del tallo. Por lo tanto, las proteínas de fusión pueden unirse a uno o más residuos dentro del TLT-1 (20-125), t Lt -1 (16-162), TLT-1 (126-162) y/o TLT-1 (129-142) (los números entre paréntesis se refieren a residuos de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2). A receptor such as TLT-1 comprises epitopes that are useful targets for the procoagulant proteins described in the present disclosure. Procoagulant proteins can bind to any part of TLT-1 that is available for binding in vivo, such as accessible residues from the surface of the Ig-like domain, or part of the stem. Therefore, fusion proteins can bind to one or more residues within TLT-1 (20-125), t Lt -1 (16-162), TLT-1 (126-162), and / or TLT-1. (129-142) (the numbers in parentheses refer to amino acid residues in SEQ ID NO: 2).
En una modalidad preferida, las proteínas procoagulantes se unen al tallo del TLT-1, tal como uno o más residuos del TLT-1 (126-162) o TLT-1 (129-142). Es poco probable que las proteínas procoagulantes que se unen al tallo del TLT-1 interfieran con la función del dominio similar a Ig. En otra modalidad preferida, fusionar el factor de coagulación al C-terminal de un anticuerpo, o fragmento de este, posicionará el factor de coagulación aún más favorablemente en la superficie celular de las plaquetas activadas, con relación a la de FVII y FVIIa.In a preferred embodiment, procoagulant proteins bind to the stem of TLT-1, such as one or more residues of TLT-1 (126-162) or TLT-1 (129-142). Procoagulant proteins that bind to the stem of TLT-1 are unlikely to interfere with the function of the Ig-like domain. In another preferred embodiment, fusing the clotting factor to the C-terminus of an antibody, or fragment thereof, will position the clotting factor even more favorably on the cell surface of activated platelets, relative to that of FVII and FVIIa.
En otra modalidad preferida, las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción se unen al TLT-1 sin interferir en la agregación plaquetaria.In another preferred embodiment, the procoagulant proteins described in the present disclosure bind to TLT-1 without interfering with platelet aggregation.
En otra modalidad, las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción se unen al TLT-1 sin competir con la unión del fibrinógeno al TLT-1.In another embodiment, the procoagulant proteins described in the present disclosure bind to TLT-1 without competing with fibrinogen binding to TLT-1.
El TLT-1 puede ser de cualquier vertebrado, tal como cualquier mamífero, tal como un roedor (tal como un ratón, rata o cobayo), un lagomorfo (tal como un conejo), un artiodáctilo (tal como un cerdo, vaca, oveja o camello) o un primate (tal como un mono o un ser humano). El TLT-1 es, preferentemente, TLT-1 humano. El TLT-1 puede traducirse a partir de cualquier genotipo o alelo de origen natural que da lugar a una proteína TLT-1 funcional. Un ejemplo no limitante de un TLT-1 humano es la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 2 incluye el péptido señal (residuos 1-15 (MGLTLLLLLLLGLEG) de la s Eq ID NO: 2, y el polipéptido TLT-1 maduro corresponde a los residuos 16-311 de la SEQ ID NO: 2.The TLT-1 can be from any vertebrate, such as any mammal, such as a rodent (such as a mouse, rat, or guinea pig), a lagomorph (such as a rabbit), an artiodactyl (such as a pig, cow, sheep or camel) or a primate (such as a monkey or a human). TLT-1 is preferably human TLT-1. TLT-1 can be translated from any naturally occurring genotype or allele that gives rise to a functional TLT-1 protein. A non-limiting example of a human TLT-1 is the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 includes the signal peptide (residues 1-15 (MGLTLLLLLLGLEG) of s Eq ID NO: 2, and the Mature TLT-1 polypeptide corresponds to residues 16-311 of SEQ ID NO: 2.
Las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprenden un anticuerpo, o un fragmento de este, que se ha levantado contra el TLT-1. El anticuerpo o fragmento de este puede o no resultar en un cambio en la estructura conformacional del TLT-1. Además, el anticuerpo o fragmento de este puede o no resultar en señalización intracelular, como resultado de la unión al TLT-1. En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de este es capaz de unirse al tallo del TLT-1. Por lo tanto, el anticuerpo o fragmento de este usa un receptor de origen natural, o porción de este, para lograr el efecto que es único para y proporcionado por las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción.The procoagulant proteins described in the present description comprise an antibody, or a fragment thereof, that has been raised against TLT-1. The antibody or fragment thereof may or may not result in a change in the conformational structure of TLT-1. Furthermore, the antibody or fragment thereof may or may not result in intracellular signaling, as a result of binding to TLT-1. In one embodiment, the antibody or fragment thereof is capable of binding to the stem of TLT-1. Therefore, the antibody or fragment thereof uses a naturally occurring receptor, or portion thereof, to achieve the effect that is unique to and provided by the procoagulant proteins described in the present disclosure.
El término “anticuerpo”, en la presente descripción, se refiere a una proteína, derivada a partir de una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno, que es el TLT-1 o una porción de este. El término incluye anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo (es decir, IgA, IgE, IgG, IgM y/o IgY) y cualquier fragmento o cadena simple de estos.The term "antibody" in the present description refers to a protein, derived from a germline immunoglobulin sequence, that is capable of specifically binding to an antigen, which is TLT-1 or a portion of this. The term includes full-length antibodies of any isotype (i.e., IgA, IgE, IgG, IgM, and / or IgY) and any single fragment or chain thereof.
Los anticuerpos de longitud completa comprenden generalmente al menos cuatro cadenas polipeptídicas: es decir, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que se interconectan mediante enlaces disulfuro. Una subclase de inmunoglobulina de particular interés farmacéutico es la familia IgG, que puede subdividirse en isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las moléculas de IgG consisten en dos cadenas pesadas, interconectadas por dos o más enlaces disulfuro, y dos cadenas ligeras, cada una unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro. Una cadena pesada puede comprender una región variable de cadena pesada (VH) y hasta tres regiones constantes de cadena pesada (CH): CH1, CH2 y CH3. Una cadena ligera puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones VH y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Las regiones VH y VL se componen, típicamente, de tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera forman un dominio que es capaz de interactuar con un antígeno (TLT-1), mientras que la región constante de un anticuerpo puede mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, lo que incluye diversas células del sistema inmunitario (células efectoras), receptores Fc y el primer componente (CIq) del sistema de complemento clásico. Full length antibodies generally comprise at least four polypeptide chains: that is, two heavy chains (H) and two light chains (L) that are interconnected by disulfide bonds. A subclass of immunoglobulin of particular pharmaceutical interest is the IgG family, which can be subdivided into IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 isotypes. IgG molecules consist of two heavy chains, interconnected by two or more disulfide bonds, and two light chains, each linked to a heavy chain by a disulfide bond. A heavy chain can comprise a heavy chain variable region (VH) and up to three heavy chain constant regions (CH): CH1, CH2 and CH3. A light chain can comprise a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL). The VH and Vl regions can be further subdivided into hypervariability regions, termed Complementarity Determining Regions (CDRs), interspersed with regions that are more conserved, termed Framework Regions (FR). The VH and VL regions are typically composed of three CDRs and four FRs, arranged from the amino terminus to the carboxyl terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The hypervariable regions of the heavy and light chains form a domain that is capable of interacting with an antigen (TLT-1), while the constant region of an antibody can mediate the binding of immunoglobulin to host tissues or factors, leading to It includes various cells of the immune system (effector cells), Fc receptors and the first component (CIq) of the classical complement system.
El componente de anticuerpo de las proteínas procoagulantes puede ser un anticuerpo monoclonal. Dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o una porción de unión a antígeno de cualquiera de estos. Para la producción de anticuerpos, el animal experimental es un mamífero adecuado, tal como una cabra, conejo, rata o ratón.The antibody component of the procoagulant proteins can be a monoclonal antibody. Said antibody may be a chimeric antibody, a CDR-grafted antibody, a human antibody, a humanized antibody, or an antigen-binding portion of any of these. For the production of antibodies, the experimental animal is a suitable mammal, such as a goat, rabbit, rat, or mouse.
En términos estructurales, un anticuerpo monoclonal se representa por una especie molecular única que tiene una especificidad de unión y afinidad única por un epítopo en particular. Los anticuerpos monoclonales (mAb) para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción pueden producirse mediante una variedad de técnicas bien conocidas, lo que incluye la metodología de anticuerpos monoclonales convencional, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495, o la transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de los esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica. Además, se conocen las parejas de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión.In structural terms, a monoclonal antibody is represented by a single molecular species that has unique binding specificity and affinity for a particular epitope. Monoclonal antibodies (mAbs) to the procoagulant proteins described in the present description can be produced by a variety of well-known techniques, including standard monoclonal antibody methodology, for example, the standard Kohler and Milstein somatic cell hybridization technique. (1975) Nature 256: 495, or the viral or oncogenic transformation of B lymphocytes. The preferred animal system for preparing hybridomas is the murine system. The production of hybridomas in the mouse is a very well established procedure. Immunization protocols and techniques for the isolation of splenocytes immunized for fusion are known in the art. In addition, fusion partners ( eg, murine myeloma cells) and fusion procedures are known.
Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales adecuados, los esplenocitos y/o células de nódulo linfático de ratones inmunizados pueden aislarse y fusionarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden tamizarse para determinar la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Los hibridomas secretores de anticuerpo pueden volver a colocarse en placas, tamizarse de nuevo, y si aún son positivos para la IgG adecuada, los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse al menos dos veces mediante dilución limitante. A continuación, los subclones estables pueden cultivarse in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo tisular para la caracterización.To generate hybridomas that produce suitable monoclonal antibodies, splenocytes and / or lymph node cells from immunized mice can be isolated and fused to an appropriate immortalized cell line, such as a mouse myeloma cell line. The resulting hybridomas can be screened to determine the production of antigen-specific antibodies. Antibody secreting hybridomas can be plated again, screened again, and if they are still positive for adequate IgG, monoclonal antibodies can be subcloned at least twice by limiting dilution. The stable subclones can then be cultured in vitro to generate small amounts of antibody in tissue culture medium for characterization.
Los anticuerpos para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción pueden prepararse, expresarse, crearse o aislarse por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulinas de interés o un hibridoma preparado a partir de este, (b) anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo de interés, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una biblioteca recombinante y combinatoria de anticuerpos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulinas a otras secuencias de ADN.Antibodies to the procoagulant proteins described in the present disclosure can be prepared, expressed, created, or isolated by recombinant means, such as (a) antibodies isolated from an animal ( eg, a mouse) that is transgenic or transchromosomal to the immunoglobulin genes. of interest or a hybridoma prepared therefrom, (b) antibodies isolated from a transformed host cell to express the antibody of interest, eg, from a transfectoma, (c) antibodies isolated from a recombinant library and combinatorial antibody, and (d) antibodies prepared, expressed, created, or isolated by any other means involving the splicing of immunoglobulin gene sequences to other DNA sequences.
Varios anticuerpos monoclonales adecuados, mostrados en la Tabla 1, se identifican en la presente descripción por medio del prefijo “mAb” junto con un número de 4 dígitos. Por lo tanto, el anticuerpo monoclonal puede ser mAb0012 o una variante de este. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb0023 o una variante de este. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb0051 o una variante de este. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb0061 o una variante de este. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb0062 o una variante de este. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb0082 o una variante de este.Various suitable monoclonal antibodies, shown in Table 1, are identified in the present description by the prefix "mAb" together with a 4-digit number. Therefore, the monoclonal antibody can be mAb0012 or a variant of it. The monoclonal antibody can be mAb0023 or a variant of it. The monoclonal antibody can be mAb0051 or a variant of it. The monoclonal antibody can be mAb0061 or a variant of it. The monoclonal antibody can be mAb0062 or a variant of it. The monoclonal antibody can be mAb0082 or a variant of it.
Tabla 1: Ejemplos no limitantes de anticuerpos monoclonales adecuadosTable 1: Non-limiting examples of suitable monoclonal antibodies
El término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno, tal como TLT-1 u otro receptor objetivo, como se describe en la presente descripción. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. El componente anticuerpo de las proteínas procoagulantes puede ser, por lo tanto, un fragmento de un anticuerpo, tal como un fragmento de un anticuerpo monoclonal. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 , un fragmento Fab', un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento ScFv, un fragmento dAb y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Los anticuerpos monocatenarios tales como scFv y anticuerpos de cadena pesada tales como VHH y anticuerpos de camello también pretenden abarcarse dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse mediante el uso de técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos pueden tamizarse para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.The term "antigen binding portion" of an antibody refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen, such as TLT-1 or another target receptor, as described in the present description . It has been shown that the antigen binding function of an antibody can be performed by fragments of a full length antibody. The antibody component of procoagulant proteins can therefore be a fragment of an antibody, such as a fragment of a monoclonal antibody. Examples of binding fragments encompassed within the term "antigen binding portion" of an antibody include an Fab fragment, an F (ab ') 2 fragment, a Fab' fragment, an Fd fragment, an Fv fragment, a ScFv fragment , a dAb fragment and an isolated Complementarity Determining Region (CDR). Single chain antibodies such as scFv and heavy chain antibodies such as VHH and camel antibodies are also intended to be encompassed within the term "antigen binding portion" of an antibody. These antibody fragments can be obtained using conventional techniques known to those of skill in the art, and the fragments can be screened for utility in the same manner as intact antibodies.
Un fragmento “Fab” incluye un dominio variable y un dominio constante de la cadena ligera y un dominio variable y el primer dominio constante (Ch 1) de la cadena pesada. Un fragmento Fab' incluye uno o más enlaces disulfuro carboxi terminales a las cadenas pesada o ligera. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 comprenden un par de fragmentos Fab que se unen de manera covalente generalmente cerca del carboxi terminal mediante cisteínas bisagra. Además, se conocen en la técnica otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.A "Fab" fragment includes a variable domain and a constant domain of the light chain and a variable domain and the first constant domain (C h 1) of the heavy chain. A Fab 'fragment includes one or more carboxy terminal disulfide bonds to the heavy or light chains. The F (ab ') 2 antibody fragments comprise a pair of Fab fragments that are covalently linked generally near the carboxy terminus by hinge cysteines. In addition, other chemical couplings of antibody fragments are known in the art.
Un fragmento “Fv” es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y de unión al antígeno y comprende generalmente un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en una asociación estrecha que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo, en un fragmento del dominio variable de cadena simple (scFv). Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl. Colectivamente, las seis regiones hipervariables o un subconjunto de estas confieren la especificidad de unión al antígeno para el anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno tiene la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque usualmente a una afinidad menor que la del sitio de unión completo (Cai y Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 93: 6280-6285, 1996). Por ejemplo, los anticuerpos de camélidos de origen natural que sólo tienen un dominio variable de cadena pesada (VHH) pueden unirse al antígeno (Desmyter y otros, J. Biol. Chem., 277: 23645-23650, 2002; Bond y otros, J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655). An "Fv" fragment is an antibody fragment that contains a complete antigen recognition and binding site and generally comprises a dimer of a heavy chain variable domain and a light chain variable domain in close association that may be in nature. covalent, for example, in a fragment of the single-chain variable domain (scFv). It is in this configuration that the three hypervariable regions of each variable domain interact to define an antigen binding site on the surface of the V h -V l dimer. Collectively, the six hypervariable regions or a subset of these confer antigen-binding specificity for the antibody. However, even a single variable domain comprising only three antigen-specific hypervariable regions has the ability to recognize and bind to the antigen, albeit usually at a lower affinity than that of the full binding site (Cai and Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6280-6285, 1996). For example, naturally occurring camelid antibodies that only have one heavy chain variable domain (VHH) can bind to the antigen (Desmyter et al., J. Biol. Chem., 277: 23645-23650, 2002; Bond et al., J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655).
Los fragmentos de anticuerpos “Fv de cadena simple” o “scFv” comprenden los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, donde estos dominios se presentan en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende, además, un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, ver Pluckthun, 1994, En: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Ed. Rosenburg y Moore. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315.The "single chain Fv" or "scFv" antibody fragments comprise the V h and V l domains of an antibody, where these domains are presented on a single polypeptide chain. Generally, the Fv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the V h and V l domains that enables the scFv to form the desired structure for antigen binding. For a review of scFv, see Pluckthun, 1994, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Ed. Rosenburg and Moore. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315.
El término “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígenos, en los que los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptídica (Vh y Vl). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios variables en la misma cadena, los dominios variables se fuerzan a aparearse con dominios complementarios de otra cadena, lo que crea dos sitios de unión a antígenos. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y otros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. EEU U , 90:6444-6448.The term "diabodies" refers to small antibody fragments with two antigen binding sites, in which the fragments comprise a heavy chain variable domain (V h ) connected to a light chain variable domain (V l ) in the same polypeptide chain (V h and V l ). By using a linker that is too short to allow pairing between the two variable domains on the same chain, the variable domains are forced to pair with complementary domains on another chain, creating two antigen binding sites. Diabodies are more fully described, for example, in EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. EEU U, 90: 6444-6448.
La expresión “anticuerpos lineales” se refiere a anticuerpos como se describe en Zapata y otros, 1995, Protein Eng., 8(10):1057-1062. Brevemente, estos anticuerpos contienen un par de segmentos Fd en tándem (Vh-Ch 1-Vh-Ch1) que, junto con los polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.The term "linear antibodies" refers to antibodies as described in Zapata et al., 1995, Protein Eng., 8 (10): 1057-1062. Briefly, these antibodies contain a pair of tandem Fd segments (V h -C h 1-V h -C h 1) which, together with the complementary light chain polypeptides, form a pair of antigen binding regions. Linear antibodies can be bispecific or monospecific.
El término “monocuerpo”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula de unión a antígeno con un dominio variable de cadena pesada y ningún dominio variable de cadena ligera. Un monocuerpo puede unirse a un antígeno en ausencia de cadenas ligeras y tiene típicamente tres regiones hipervariables, por ejemplo, las CDR denominadas CDRH1, CDRH2, y CDRH3. Un monocuerpo de cadena pesada de IgG tiene dos moléculas de unión a antígeno de cadena pesada conectadas mediante un enlace disulfuro. El dominio variable de cadena pesada comprende una o más regiones hipervariables, preferentemente, una región CDRH3 o HVL-H3.The term "monobody", as used in the present description, refers to an antigen binding molecule with a heavy chain variable domain and no light chain variable domain. A monobody can bind to an antigen in the absence of light chains and typically has three hypervariable regions, for example, CDRs called CDRH1, CDRH2, and CDRH3. An IgG heavy chain monobody has two heavy chain antigen binding molecules connected via a disulfide bond. The heavy chain variable domain comprises one or more hypervariable regions, preferably a CDRH3 or HVL-H3 region.
El término "región hipervariable", cuando se usa en la presente descripción, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (definida por secuencia como los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (definido por la estructura y diferente para cada anticuerpo; ver, por ejemplo: Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917). En un ejemplo, los residuos HVL pueden incluir, 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada. The term "hypervariable region", when used in the present description, refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for binding to the antigen. The hypervariable region comprises amino acid residues of a "complementarity determining region" or "CDR" (defined by sequence as residues 24-34 (L1), 50-56 (L2) and 89-97 (L3) in the domain light chain variable and 31-35 (H1), 50-65 (H2) and 95-102 (H3) in the heavy chain variable domain; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service , National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) and / or those residues of a "hypervariable loop" (defined by the structure and different for each antibody; see, for example: Chothia and Lesk, 1987, J. Mol Biol. 196: 901-917). In one example, HVL residues can include, 26-32 (L1), 50-52 (L2), and 91-96 (L3) in the light chain variable domain and 26-32 (H1), 53-55 (H2 ) and 96-101 (H3) in the heavy chain variable domain.
En una modalidad de la invención, la porción de unión al TLT-1 de la proteína procoagulante es un fragmento Fab. Varios fragmentos Fab adecuados, mostrados en la Tabla 2, se identifican en la presente descripción por medio del prefijo “Fab” junto con un número de 4 dígitos. El fragmento Fab puede ser Fab0003 o una variante de este. El fragmento Fab puede ser Fab0004 o una variante de este. El fragmento Fab puede ser Fab0012 o una variante de este. El fragmento Fab puede ser Fab0023 o una variante de este. El fragmento Fab puede ser Fab0051 o una variante de este. El fragmento Fab puede ser Fab0052 o una variante de este. El fragmento Fab puede ser Fab0061 o una variante de este. El fragmento Fab puede ser Fab0062 o una variante de este. El fragmento Fab puede ser Fab0074 o una variante de este. El fragmento Fab puede ser Fab0082 o una variante de este. El fragmento Fab puede ser Fab0084 o una variante de este.In one embodiment of the invention, the TLT-1 binding portion of the procoagulant protein is a Fab fragment. Various suitable Fab fragments, shown in Table 2, are identified in the present description by the prefix "Fab" together with a 4-digit number. The Fab fragment can be Fab0003 or a variant of it. The Fab fragment can be Fab0004 or a variant of it. The Fab fragment can be Fab0012 or a variant of it. The Fab fragment can be Fab0023 or a variant of it. The Fab fragment can be Fab0051 or a variant of it. The Fab fragment can be Fab0052 or a variant of it. The Fab fragment can be Fab0061 or a variant of it. The Fab fragment can be Fab0062 or a variant of it. The Fab fragment can be Fab0074 or a variant of it. The Fab fragment can be Fab0082 or a variant of it. The Fab fragment can be Fab0084 or a variant of it.
Tabla 2: Ejemplos no limitantes de fragmentos Fab adecuadosTable 2: Non-limiting examples of suitable Fab fragments
Como se mencionó anteriormente, un anticuerpo para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. Se pretende que el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripción, incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como las regiones CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos descritos en la presente descripción pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro, o por mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripción, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.As mentioned above, an antibody to the procoagulant proteins described in the present disclosure can be a human antibody or a humanized antibody. The term "human antibody", as used in the present description, is intended to include antibodies that have variable regions in which both framework regions and CDR regions are derived from human germline immunoglobulin sequences. Furthermore, if the antibody contains a constant region, the constant region is also derived from sequences of immunoglobulins from the human germline. The human antibodies described herein may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences ( eg, mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro, or by in vivo somatic mutation ). However, the term "human antibody", as used in the present description, is not intended to include antibodies in which the CDR sequences derived from the germline of another mammalian species, such as a mouse, have been grafted into sequences human framework.
Dicho anticuerpo humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Dicho anticuerpo monoclonal humano puede producirse mediante un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, cuyo genoma comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.Said human antibody can be a human monoclonal antibody. Said human monoclonal antibody can be produced by a hybridoma including a B cell obtained from a transgenic non-human animal, for example, a transgenic mouse, the genome of which comprises a human heavy chain transgene and a light chain transgene fused to a cell. immortalized.
Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la inmunización in vitro de linfocitos humanos seguido de transformación de los linfocitos con el virus Epstein-Barr.Human antibodies can be prepared by in vitro immunization of human lymphocytes followed by transformation of lymphocytes with Epstein-Barr virus.
El término “derivados de anticuerpos humanos” se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.The term "human antibody derivatives" refers to any modified form of the human antibody, for example, a conjugate of the antibody and another agent or antibody.
El término “anticuerpo humanizado”, en la presente descripción, se refiere a anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas. Pueden hacerse modificaciones de la región marco adicionales dentro de las secuencias marco humanas.The term "humanized antibody", in the present description, refers to antibodies in which the CDR sequences derived from the germ line of another mammalian species, such as a mouse, have been grafted into human framework sequences. Additional framework region modifications can be made within human framework sequences.
Los anticuerpos pueden analizarse para determinar la unión a la proteína objetivo mediante, por ejemplo, ELISA o transferencia de Western estándar. Un ensayo ELISA puede usarse, además, para tamizar en busca de hibridomas que muestran reactividad positiva con la proteína objetivo. La especificidad de unión de un anticuerpo puede determinarse, además, mediante el monitoreo de la unión del anticuerpo a células que expresan la proteína objetivo, por ejemplo, mediante citometría de flujo.Antibodies can be analyzed to determine binding to the target protein by, for example, ELISA or standard Western blot. An ELISA assay can also be used to screen for hybridomas that show positive reactivity with the target protein. The binding specificity of an antibody can be further determined by monitoring the binding of the antibody to cells expressing the target protein, eg, by flow cytometry.
La especificidad de un anticuerpo para la proteína objetivo puede estudiarse adicionalmente al determinar si el anticuerpo se une o no a otras proteínas. Por ejemplo, cuando se desea producir un anticuerpo que se une específicamente al TLT-1 o una parte en particular, por ejemplo, un epítopo, del TLT-1, la especificidad del anticuerpo puede evaluarse al determinar si el anticuerpo se une o no, además, a otras moléculas o formas modificadas del TLT-1 que carecen de la parte de interés.The specificity of an antibody for the target protein can be further studied by determining whether or not the antibody binds to other proteins. For example, when it is desired to produce an antibody that specifically binds TLT-1 or a particular part, eg, an epitope, of TLT-1, the specificity of the antibody can be assessed by determining whether the antibody binds or not, in addition, to other molecules or modified forms of TLT-1 that lack the part of interest.
Los "fragmentos" de polipéptidos o anticuerpos de acuerdo con pueden hacerse mediante truncamiento de los anticuerpos monoclonales correspondientes, por ejemplo, mediante la eliminación de uno o más aminoácidos de los extremos N y/o C terminal de un polipéptido. Hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40 o más aminoácidos pueden eliminarse del N y/o C terminal de esta manera. Los fragmentos pueden generarse, además, mediante una o más deleciones internas.The "fragments" of polypeptides or antibodies according to can be made by truncation of the corresponding monoclonal antibodies, for example, by removal of one or more amino acids from the N and / or C-terminus of a polypeptide. Up to 10, up to 20, up to 30, up to 40 or more amino acids can be removed from the N and / or C terminal in this way. Fragments can also be generated by one or more internal deletions.
“Epítopo”, en la presente descripción, se refiere al área o región en un antígeno (Ag), que es una estructura molecular sobre la superficie de una plaqueta activada, a la que la porción del anticuerpo (Ab) de la proteína procoagulante es capaz de unirse específicamente, es decir, el área o región que está en contacto físico con el Ab. Un epítopo de un antígeno puede comprender residuos de aminoácidos en el Ag que se involucran directamente en la unión al Ab (componente inmunodominante del epítopo) y otros residuos de aminoácidos, que no se involucran directamente en la unión, tales como los residuos de aminoácidos del Ag bloqueados eficazmente por el Ab (en otras palabras, el residuo de aminoácido está dentro de la “superficie excluida al solvente” y/o la "huella" del Ab). El término epítopo, en la presente descripción, incluye ambos tipos de sitios de unión dentro de cualquier región particular de un receptor, tal como TLT-1, que se une específicamente a un anticuerpo anti-TLT-1, o fragmento de este, a menos que se indique de cualquier otra manera (por ejemplo, en algunos contextos la invención se refiere a anticuerpos que se unen directamente a residuos de aminoácidos particulares). Los receptores tales como el TLT-1 pueden comprender una cantidad de epítopos diferentes, que pueden incluir, sin limitación, (1) epítopos peptídicos lineales, (2) epítopos conformacionales que incluyen uno o más aminoácidos no contiguos ubicados cerca entre sí en la conformación del receptor maduro; y (3) epítopos postraduccionales que incluyen, ya sea en su totalidad o en parte, estructuras moleculares unidas covalentemente al TLT-1, tales como grupos carbohidrato."Epitope", in the present description, refers to the area or region in an antigen (Ag), which is a molecular structure on the surface of an activated platelet, to which the antibody (Ab) portion of the procoagulant protein is able to specifically bind, that is, the area or region that is in physical contact with the Ab. An epitope of an antigen can comprise amino acid residues in Ag that are directly involved in binding to Ab (immunodominant component of the epitope) and other amino acid residues, which are not directly involved in binding, such as amino acid residues of the Ag effectively blocked by Ab (in other words, the amino acid residue is within the "solvent excluded surface" and / or "footprint" of the Ab). The term epitope, in the present description, includes both types of binding sites within any particular region of a receptor, such as TLT-1, that specifically binds to an anti-TLT-1 antibody, or fragment thereof, to unless otherwise indicated (for example, in some contexts the invention relates to antibodies that bind directly to particular amino acid residues). Receptors such as TLT-1 may comprise a number of different epitopes, which may include, without limitation, (1) linear peptide epitopes, (2) conformational epitopes that include one or more non-contiguous amino acids located close to each other in the conformation of the mature recipient; and (3) post-translational epitopes that include, in whole or in part, molecular structures covalently linked to TLT-1, such as carbohydrate groups.
El epítopo para un par anticuerpo (Ab)/antígeno (Ag) dado puede definirse y caracterizarse a niveles diferentes de detalle mediante el uso de una variedad de métodos experimentales y computacionales de mapeo de epítopos. Los métodos experimentales incluyen mutagénesis, cristalografía de rayos X, espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (n Mr ), Espectrometría de Masa de Intercambio Hidrógeno-Deuterio (HX-MS) y diversos métodos de unión por competencia. Como cada método depende de un principio único, la descripción de un epítopo se une íntimamente al método mediante el cual se ha determinado. Por lo tanto, el epítopo para un par Ab/Ag dado se definirá de manera diferente en dependencia del método de mapeo de epítopos empleado. The epitope for a given antibody (Ab) / antigen (Ag) pair can be defined and characterized at different levels of detail by using a variety of experimental and computational epitope mapping methods. Experimental methods include mutagenesis, X-ray crystallography, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (n Mr), Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HX-MS), and various competition binding methods. Since each method depends on a single principle, the description of an epitope is closely linked to the method by which it has been determined. Therefore, the epitope for a given Ab / Ag pair will be defined differently depending on the epitope mapping method employed.
A su nivel más detallado, el epítopo para la interacción entre el Ag y el Ab puede definirse mediante las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos presentes en la interacción Ag-Ac, así como también la información acerca de sus contribuciones relativas a las termodinámicas de unión. A un nivel menos detallado, el epítopo puede caracterizarse mediante las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos entre el Ag y el Ab. A un nivel aún menos detallado, el epítopo puede caracterizarse mediante los residuos de aminoácidos que comprende como se define por un criterio específico, por ejemplo, la distancia entre átomos en el Ab y el Ag. A un nivel aún menos detallado, el epítopo puede caracterizarse a través de la función, por ejemplo, mediante la unión por competencia con otros Ab. Además, el epítopo puede definirse más genéricamente como que comprende residuos de aminoácidos cuya sustitución por otro aminoácido alterará las características de la interacción entre el Ab y el Ag.At its most detailed level, the epitope for the interaction between Ag and Ab can be defined using the spatial coordinates that define the atomic contacts present in the Ag-Ac interaction, as well as information about their relative contributions to the thermodynamics of Union. At a less detailed level, the epitope can be characterized by the spatial coordinates that define the atomic contacts between Ag and Ab. At an even less detailed level, the epitope can be characterized by the amino acid residues it comprises as defined by a specific criterion, for example, the distance between atoms in Ab and Ag. At an even less detailed level, the epitope can be characterized through function, for example, by competition union with other Ab. Furthermore, the epitope can be defined more generically as comprising amino acid residues whose replacement by another amino acid will alter the characteristics of the interaction between Ab and Ag.
En el contexto de una estructura cristalina derivada por rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ab, por ejemplo, un fragmento Fab, y su Ag, el término epítopo en la presente descripción, a menos que se especifique de cualquier otra manera o se contradiga por el contexto, se define específicamente, como residuos del receptor de plaquetas caracterizado por tener un átomo pesado (es decir, un átomo que no es hidrógeno) dentro de una distancia de 4 A a partir de un átomo pesado en el Ab.In the context of an X-ray derived crystal structure defined by spatial coordinates of a complex between an Ab, eg, a Fab fragment, and its Ag, the term epitope in the present description, unless otherwise specified or contradicted by context, it is specifically defined as platelet receptor residues characterized by having a heavy atom (i.e., a non-hydrogen atom) within a distance of 4 A from a heavy atom in the Ab .
A partir del hecho de que las descripciones y definiciones de epítopos, en dependencia del método de mapeo de epítopos usado, se obtienen a niveles diferentes de detalle, se deduce que la comparación de epítopos para Ab diferentes en el mismo Ag puede conducirse de manera similar en niveles diferentes de detalle.From the fact that descriptions and definitions of epitopes, depending on the epitope mapping method used, are obtained at different levels of detail, it follows that the comparison of epitopes for different Ab in the same Ag can be conducted in a similar way. at different levels of detail.
Se dice que los epítopos descritos en el nivel de aminoácido, por ejemplo, determinados a partir de una estructura por rayos X, son idénticos si contienen el mismo conjunto de residuos de aminoácidos. Se dice que los epítopos se solapan si los epítopos comparten al menos un aminoácido. Se dice que los epítopos son separados (únicos) si los epítopos no comparten ningún residuo de aminoácido.Epitopes described at the amino acid level, eg, determined from an X-ray structure, are said to be identical if they contain the same set of amino acid residues. Epitopes are said to overlap if the epitopes share at least one amino acid. Epitopes are said to be separate (unique) if the epitopes do not share any amino acid residues.
Se dice que los epítopos caracterizados por unión de competencia se solapan si la unión de los Ab correspondientes son mutuamente excluyentes, es decir, si la unión de un Ab excluye la unión simultánea del otro Ab. Se dice que los epítopos son separados (únicos) si el Ag es capaz de acomodar la unión de ambos Ab correspondientes simultáneamente. Además, existen casos en los que uno o más anticuerpos no tienen epítopos solapados pero no pueden unirse simultáneamente. Debido a la estructura terciaria y cuaternaria de un antígeno, un anticuerpo puede no ser capaz de acceder a su epítopo debido a la unión previa de otro anticuerpo.Epitopes characterized by competition binding are said to overlap if the binding of the corresponding Abs are mutually exclusive, that is, if the binding of one Ab excludes the simultaneous binding of the other Ab. Epitopes are said to be separate (unique) if the Ag is able to accommodate the binding of both corresponding Ab simultaneously. Furthermore, there are cases where one or more antibodies do not have overlapping epitopes but cannot bind simultaneously. Due to the tertiary and quaternary structure of an antigen, an antibody may not be able to access its epitope due to prior binding of another antibody.
Las proteínas procoagulantes pueden ser capaces de unirse al mismo epítopo que el mAb0012. Las proteínas procoagulantes pueden ser capaces de unirse al mismo epítopo que el mAb0023. Las proteínas procoagulantes pueden ser capaces de unirse al mismo epítopo que el mAb0051. Las proteínas procoagulantes pueden ser capaces de unirse al mismo epítopo que el mAb0061. Las proteínas procoagulantes pueden ser capaces de unirse al mismo epítopo que el mAb0062. Las proteínas procoagulantes pueden ser capaces de unirse al mismo epítopo que el mAb0082.Procoagulant proteins may be able to bind to the same epitope as mAb0012. Procoagulant proteins may be able to bind to the same epitope as mAb0023. Procoagulant proteins may be able to bind to the same epitope as mAb0051. Procoagulant proteins may be able to bind to the same epitope as mAb0061. Procoagulant proteins may be able to bind to the same epitope as mAb0062. Procoagulant proteins may be able to bind to the same epitope as mAb0082.
El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en K133, I134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de la SEQ ID NO: 4 (que corresponden a K133, I134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de la SEQ ID NO: 2).The epitope can comprise one or more residues selected from the group consisting of K133, I134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 and A146 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to K133, I134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 and A146 of SEQ ID NO: 2).
El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, L63, G64, G65, G66, L67, L68, G89, A90, R91, G92, P93, Q94, I95 y L96 de la SEQ ID NO: 5 (que corresponden a V36, Q37, C38, H39, Y40, R41, L42, Q43, D44, V45, K46, A47, L82, G83, G84, G85, L86, L87, G108, A109, R110, G111, P112, Q113, I114 y L115 de la SEQ ID NO: 2).The epitope can comprise one or more residues selected from the group consisting of V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, L63, G64, G65, G66, L67, L68, G89, A90, R91, G92, P93, Q94, I95 and L96 of SEQ ID NO: 5 (corresponding to V36, Q37, C38, H39, Y40, R41, L42, Q43, D44, V45, K46, A47, L82, G83, G84, G85, L86, L87, G108, A109, R110, G111, P112, Q113, I114 and L115 of SEQ ID NO: 2).
El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en L36, P37, E38, G39, C40, Q41, P42, L43, V44, S45, S46, A47, V73, T74, L75, Q76, E77, E78, D79, A80, G81, E82, Y83, G84, C85, M86, R91, G92, P93, Q94, I95, L96, H97, R98, V99, S100 y L101 de la SEQ ID NO: 5 (que corresponde a L55, P56, E57, G58, C59, Q60, P61, L62, V63, S64, S65, A66, V92, T93, L94, Q95, E96, E97, D98, A99, G100, E101, Y102, G103, C104, M105, R110, G111, P112, Q113, I114, L115, H116, R117, V118, S119 y L120 de la SEQ ID NO: 2).The epitope can comprise one or more residues selected from the group consisting of L36, P37, E38, G39, C40, Q41, P42, L43, V44, S45, S46, A47, V73, T74, L75, Q76, E77, E78, D79, A80, G81, E82, Y83, G84, C85, M86, R91, G92, P93, Q94, I95, L96, H97, R98, V99, S100 and L101 of SEQ ID NO: 5 (corresponding to L55, P56, E57, G58, C59, Q60, P61, L62, V63, S64, S65, A66, V92, T93, L94, Q95, E96, E97, D98, A99, G100, E101, Y102, G103, C104, M105, R110, G111, P112, Q113, I114, L115, H116, R117, V118, S119 and L120 of SEQ ID NO: 2).
El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, R91, G92, P93, Q94, I95, L96, H97, R98, V99, S100 y L101 de la SEQ ID NO: 5 (que corresponde a V36, Q37, C38, H39, Y40, R41, L42, Q43, D44, V45, K46, A47, R110, G111, P112, Q113, I114, L115, H116, R117, V118, S119 y L120 de la SEQ ID NO: 2).The epitope can comprise one or more residues selected from the group consisting of V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, R91, G92, P93, Q94, I95, L96, H97, R98, V99, S100 and L101 of SEQ ID NO: 5 (corresponding to V36, Q37, C38, H39, Y40, R41, L42, Q43, D44, V45, K46, A47, R110, G111, P112, Q113, I114, L115, H116, R117, V118, S119 and L120 of SEQ ID NO: 2).
El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en E5, T6, H7, K8, I9, G10, S11, L12, A13, E14, N15, A16, F17, S18, D19 y P20 de la SEQ ID NO: 7 (que corresponde a E130, T131, H132, K133, I134, G135, S136, L137, A138, E139, N140, A141, F142, S143, D144 y P145 de la SEQ ID NO: 2).The epitope can comprise one or more residues selected from the group consisting of E5, T6, H7, K8, I9, G10, S11, L12, A13, E14, N15, A16, F17, S18, D19 and P20 of SEQ ID NO. : 7 (corresponding to E130, T131, H132, K133, I134, G135, S136, L137, A138, E139, N140, A141, F142, S143, D144 and P145 of SEQ ID NO: 2).
El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en K8, I9, G10, S11, L12, A13, N15, A16, F17, S18, D19, P20 y A21 de la SEQ ID NO: 7 (que corresponden a K133, I134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de la SEQ ID NO: 2). The epitope may comprise one or more residues selected from the group consisting of K8, I9, G10, S11, L12, A13, N15, A16, F17, S18, D19, P20 and A21 of SEQ ID NO: 7 (corresponding to K133, I134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 and A146 of SEQ ID NO: 2).
La definición del término “paratopo” se deriva de la definición anterior de “epítopo” al invertir la perspectiva. Por lo tanto, el término “paratopo” se refiere al área o región en el Ab al que se une específicamente un Ag, es decir, a la que hace contacto físico con el Ag.The definition of the term "paratope" is derived from the previous definition of "epitope" when reversing perspective. Therefore, the term "paratope" refers to the area or region in the Ab to which an Ag specifically binds, that is, to which it makes physical contact with the Ag.
El paratopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en H50, N52, Y56, H58, Y73, F79, S115, T116, V118 y Y120 de la cadena ligera (L) anti-TLT-1 (SEQ ID NO: 33), y residuos V20, F45, R49, Y50, W51, E68, T75, N77, S116, G117, V118 y T120 de la cadena pesada (H) anti-TLT-1 (SEQ ID NO: 32).The paratope may comprise one or more residues selected from the group consisting of H50, N52, Y56, H58, Y73, F79, S115, T116, V118 and Y120 of the anti-TLT-1 (L) light chain (SEQ ID NO: 33), and residues V20, F45, R49, Y50, W51, E68, T75, N77, S116, G117, V118 and T120 of the anti-TLT-1 heavy chain (H) (SEQ ID NO: 32).
En el contexto de una estructura cristalina derivada por rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ab, por ejemplo, un fragmento Fab, y su antígeno, el término paratopo en la presente descripción, a menos que se especifique de cualquier otra manera o se contradiga por el contexto, se define específicamente, como residuos de Ag caracterizados por tener un átomo pesado (es decir, un átomo que no es hidrógeno) dentro de una distancia de 4 A a partir de un átomo pesado en el receptor de plaquetas.In the context of an X-ray derived crystal structure defined by spatial coordinates of a complex between an Ab, eg, a Fab fragment, and its antigen, the term paratope in the present description, unless otherwise specified or contradicted by context, it is specifically defined as Ag residues characterized by having a heavy atom (i.e., a non-hydrogen atom) within a distance of 4 A from a heavy atom at the platelet receptor .
El epítopo y paratopo para un par anticuerpo (Ab)/antígeno (Ag) dado puede identificarse mediante métodos de rutina. Por ejemplo, la ubicación general de un epítopo puede determinarse mediante la evaluación de la capacidad de un anticuerpo para unirse a fragmentos o variantes diferentes del TLT-1. Los aminoácidos específicos dentro del TLT-1 que hacen contacto con un anticuerpo (epítopo) y los aminoácidos específicos en un anticuerpo que hacen contacto con el TLT-1 (paratopo) también pueden determinarse mediante el uso de métodos de rutina, tales como los descritos en los ejemplos. Por ejemplo, el anticuerpo y la molécula objetivo pueden combinarse y el complejo Ab/Ag puede cristalizarse. La estructura cristalina del complejo puede determinarse y usarse para identificar sitios específicos de interacción entre el anticuerpo y su objetivo.The epitope and paratope for a given antibody (Ab) / antigen (Ag) pair can be identified by routine methods. For example, the general location of an epitope can be determined by evaluating the ability of an antibody to bind to different fragments or variants of TLT-1. The specific amino acids within TLT-1 that make contact with an antibody (epitope) and the specific amino acids in an antibody that make contact with TLT-1 (paratope) can also be determined by using routine methods, such as those described in the examples. For example, the antibody and the target molecule can be combined and the Ab / Ag complex can be crystallized. The crystal structure of the complex can be determined and used to identify specific sites of interaction between the antibody and its target.
Las proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo o fragmento de este también pueden definirse en términos de sus regiones determinantes de la complementariedad (CDR). El término “región determinante de la complementariedad” o “región hipervariable”, en la presente descripción, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. Las regiones determinantes de la complementariedad o “CDR” se componen generalmente de residuos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; (Kabat y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación de NIH Núm. 91-3242) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917). Típicamente, la numeración de los residuos de aminoácidos en esta región se realiza mediante el método descrito en Kabat y otros, más arriba. Las frases tales como “posición Kabat”, “residuo Kabat”, y “de acuerdo con Kabat”, en la presente descripción, se refieren a este sistema de numeración para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera. Mediante el uso del sistema de numeración de Kabat, la secuencia de aminoácidos lineal real de un péptido puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento de, o inserción en, una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir inserciones de aminoácidos (residuos 52a, 52b y 52c, de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de CDR H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b, y 82c, etcétera, de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de la FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat.Fusion proteins comprising an antibody or fragment thereof can also be defined in terms of their Complementarity Determining Regions (CDRs). The term "complementarity determining region" or "hypervariable region", in the present description, refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for binding to the antigen. Complementarity determining regions or "CDRs" are generally composed of amino acid residues 24-34 (L1), 50-56 (L2) and 89-97 (L3) in the light chain variable domain and 31-35 (H1 ), 50-65 (H2) and 95-102 (H3) in the heavy chain variable domain; (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242) and / or the residues of a "hypervariable loop" (residues 26-32 (L1), 50-52 (L2) and 91-96 (L3) in the light chain variable domain and 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) in the variable domain of heavy chain; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917). Typically, the numbering of amino acid residues in this region is performed by the method described in Kabat et al., Supra. Phrases such as "Kabat position", "Kabat residue", and "according to Kabat", in the present description, refer to this numbering system for heavy chain variable domains or light chain variable domains. By using the Kabat numbering system, the actual linear amino acid sequence of a peptide may contain fewer additional amino acids or amino acids that correspond to a shortening of, or insertion into, an FR or CDR of the variable domain. For example, a heavy chain variable domain can include amino acid insertions (residues 52a, 52b, and 52c, according to Kabat) after residue 52 of CDR H2 and inserted residues (eg, residues 82a, 82b, and 82c, etc.). , according to Kabat) after residue 82 of the heavy chain FR. The Kabat numbering of the residues can be determined for a given antibody by alignment in regions of homology of the antibody sequence with a "standard" sequence numbered according to Kabat.
Los términos “región marco” o residuos “FR” se refieren a los residuos de aminoácidos VH o VL que no están dentro de las CDR, como se define en la presente descripción.The terms "framework region" or "FR" residues refer to VH or VL amino acid residues that are not within the CDRs, as defined in the present disclosure.
En una modalidad, la cadena pesada de un anticuerpo, o fragmento de este, para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprende:In one embodiment, the heavy chain of an antibody, or fragment thereof, to the procoagulant proteins described in the present disclosure comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (DYFMY) de la SEQ ID NO: 34, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (DYFMY) of SEQ ID NO: 34, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) de la SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) of SEQ ID NO: 34, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 129 (NKNWDDYIDMDY) de la SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 129 (NKNWDDYIDMDY) of SEQ ID NO: 34, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
En otra modalidad, la cadena ligera de un anticuerpo, o fragmento de este, para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprende:In another embodiment, the light chain of an antibody, or fragment thereof, to the procoagulant proteins described in the present disclosure comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) de la SEQ ID NO: 35, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o • a CDR1 sequence of amino acids 44 to 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) of SEQ ID NO: 35, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 76 a 82 (WASTRES) de la SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 76 to 82 (WASTRES) of SEQ ID NO: 35, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 115 a 122 (KQSYNLLT) de la SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 115 to 122 (KQSYNLLT) of SEQ ID NO: 35, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
En otra modalidad, la cadena pesada de un anticuerpo, o fragmento de este, para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprende:In another embodiment, the heavy chain of an antibody, or fragment thereof, to the procoagulant proteins described in the present disclosure comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (DYSMH) de la SEQ ID NO: 36, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (DYSMH) of SEQ ID NO: 36, where one of these amino acid residues can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) de la SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) of SEQ ID NO: 36, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 129 (APMITTGAWFAY) de la SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 129 (APMITTGAWFAY) of SEQ ID NO: 36, wherein one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
En otra modalidad, la cadena ligera de un anticuerpo, o fragmento de este, para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprende:In another embodiment, the light chain of an antibody, or fragment thereof, to the procoagulant proteins described in the present disclosure comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 54 (KASQSVSNDVA) de la SEQ ID NO: 37, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 44 to 54 (KASQSVSNDVA) of SEQ ID NO: 37, wherein one, two or three of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 70 a 76 (YASSRYT) de la SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 70 to 76 (YASSRYT) of SEQ ID NO: 37, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 109 a 117 (QQDYSSPYT) de la SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 109 to 117 (QQDYSSPYT) of SEQ ID NO: 37, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
En otra modalidad, la cadena pesada de un anticuerpo, o fragmento de este, para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprende:In another embodiment, the heavy chain of an antibody, or fragment thereof, to the procoagulant proteins described in the present disclosure comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (SHWIE) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (SHWIE) of SEQ ID NO: 42, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) of SEQ ID NO: 42, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 130 (GYYGLNYDWYFDV) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 130 (GYYGLNYDWYFDV) of SEQ ID NO: 42, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
En otra modalidad, la cadena ligera de un anticuerpo, o fragmento de este, para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprende:In another embodiment, the light chain of an antibody, or fragment thereof, to the procoagulant proteins described in the present disclosure comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 54 (RASQDISNYLN) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 44 to 54 (RASQDISNYLN) of SEQ ID NO: 39, where one, two or three of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 70 a 76 (YTSRLHS) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 70 to 76 (YTSRLHS) of SEQ ID NO: 39, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 109 a 117 (QQDTKLPYT) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 109 to 117 (QQDTKLPYT) of SEQ ID NO: 39, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
En otra modalidad, la cadena pesada de un anticuerpo, o fragmento de este, para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprende:In another embodiment, the heavy chain of an antibody, or fragment thereof, to the procoagulant proteins described in the present disclosure comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 49 to 53 (RYWMT) of SEQ ID NO: 40, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 68 to 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) of SEQ ID NO: 40, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente. • a CDR3 sequence of amino acids 117 to 121 (GVFTS) of SEQ ID NO: 40, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
En otra modalidad, la cadena ligera de un anticuerpo, o fragmento de este, para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprende:In another embodiment, the light chain of an antibody, or fragment thereof, to the procoagulant proteins described in the present disclosure comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 43 to 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) of SEQ ID NO: 41, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 74 to 80 (KVSNRFS) of SEQ ID NO: 41, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 113-121 (SQSTHVPYT) of SEQ ID NO: 41, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
En otra modalidad, la cadena pesada de un anticuerpo, o fragmento de este, para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprende:In another embodiment, the heavy chain of an antibody, or fragment thereof, to the procoagulant proteins described in the present disclosure comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 32, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 49 to 53 (RYWMT) of SEQ ID NO: 32, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYTPSLKD) de la SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 68 to 84 (EINPDSSTINYTPSLKD) of SEQ ID NO: 32, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 117 to 121 (GVFTS) of SEQ ID NO: 32, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
En otra modalidad, la cadena ligera de un anticuerpo, o fragmento de este, para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprende:In another embodiment, the light chain of an antibody, or fragment thereof, to the procoagulant proteins described in the present disclosure comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de la SEQ ID NO: 33, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 43 to 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) of SEQ ID NO: 33, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 74 to 80 (KVSNRFS) of SEQ ID NO: 33, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 113-121 (SQSTHVPYT) of SEQ ID NO: 33, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Los anticuerpos monoclonales, o fragmentos de estos, para las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción pueden ser variantes de glicosilación. Las variantes de glicosilación de anticuerpos son variantes en las que se altera el patrón de glicosilación de un anticuerpo. Por alteración se entiende eliminar uno o más restos de carbohidratos encontrados en el anticuerpo, añadir uno o más restos de carbohidratos al anticuerpo, cambiar la composición de glicosilación (patrón de glicosilación), el grado de glicosilación.Monoclonal antibodies, or fragments thereof, to the procoagulant proteins described in the present disclosure may be glycosylation variants. Antibody glycosylation variants are variants in which the glycosylation pattern of an antibody is altered. By alteration is meant removing one or more carbohydrate residues found in the antibody, adding one or more carbohydrate residues to the antibody, changing the glycosylation composition (glycosylation pattern), the degree of glycosylation.
Los anticuerpos se glicosilan en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, Chem. Immunol. Antibodies are glycosylated at conserved positions in their constant regions (Jefferis and Lund, Chem. Immunol.
1997; 65:111-128; Wright y Morrison, Trends Biotechnol. 1997; 15:26-32). Las cadenas laterales de oligosacárido de las inmunoglobulinas pueden afectar la función de una proteína (Boyd y otros, Mol. Immunol. 1996; 32:1311-1318), y la interacción intramolecular entre porciones de la glicoproteína puede afectar la conformación y la superficie tridimensional presentada de la glicoproteína. Los oligosacáridos pueden servir, además, para dirigir una glicoproteína dada a determinadas moléculas basado en estructuras de reconocimiento específicas. Por ejemplo, se ha informado que en la IgG agalactosilada, el resto de oligosacárido “salta” fuera del espacio inter-CH2 y los residuos de N-acetilglucosamina terminales se vuelven disponibles para unirse a la proteína de unión de la manosa (Malhotra y otros, Nature Med. 1995; 1:237-243). La eliminación por glicopeptidasa de los oligosacáridos de cAm PATH-1h (un anticuerpo IgG1 monoclonal murino recombinante humanizado que reconoce el antígeno CDw52 de los linfocitos humanos) producidos en células de ovario de hámster chino (CHO) resultó en una reducción completa en la lisis mediada por el complemento (CMCL) (Boyd y otros, Mol. Immunol. 1996; 32:1311-1318), mientras que la eliminación selectiva de residuos de ácido siálico mediante el uso de neuraminidasa no produjo pérdida de DMCL. Se ha informado, además, que la glicosilación de anticuerpos afecta la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En particular, las células CHO con expresión regulada por tetraciclina de P(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una formación catalizadora de glicosiltransferasa de GlcNAc de bisección, se informó que tiene una actividad aumentada de ADCC (Umana y otros. Nature Biotech. 1999; 17:176-180).1997; 65: 111-128; Wright and Morrison, Trends Biotechnol. 1997; 15: 26-32). Oligosaccharide side chains of immunoglobulins can affect the function of a protein (Boyd et al., Mol. Immunol. 1996; 32: 1311-1318), and intramolecular interaction between portions of the glycoprotein can affect conformation and three-dimensional surface presented of the glycoprotein. Oligosaccharides can further serve to target a given glycoprotein to certain molecules based on specific recognition structures. For example, in agalactosylated IgG, it has been reported that the oligosaccharide residue "jumps" out of the inter-CH2 space and the terminal N-acetylglucosamine residues become available to bind to the mannose binding protein (Malhotra et al. , Nature Med. 1995; 1: 237-243). Glycopeptidase deletion of cAm PATH-1h oligosaccharides (a humanized recombinant murine monoclonal IgG1 antibody that recognizes the CDw52 antigen from human lymphocytes) produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells resulted in a complete reduction in mediated lysis by complement (CMCL) (Boyd et al., Mol. Immunol. 1996; 32: 1311-1318), while selective removal of sialic acid residues using neuraminidase did not result in loss of DMCL. Furthermore, antibody glycosylation has been reported to affect antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC). In particular, CHO cells with tetracycline-regulated expression of P (1,4) -N-acetylglucosaminyltransferase III (GnTIII), a bisection GlcNAc glycosyltransferase catalyst formation, were reported to have increased ADCC activity (Umana et al. Nature Biotech 1999; 17: 176-180).
La glicosilación de anticuerpos es típicamente ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-aceilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.Antibody glycosylation is typically N-linked or O-linked. N-linked refers to the binding of the carbohydrate moiety to the side chain of an asparagine residue. The asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine tripeptide sequences, where X is any amino acid except proline, are the recognition sequences for the enzymatic binding of the carbohydrate moiety to the asparagine side chain. Therefore, the presence of any of these tripeptide sequences in a polypeptide creates a potential glycosylation site. Glycosylation linked to O refers to the binding of one of the sugars N-aceylgalactosamine, galactose, or xylose to a hydroxyamino acid, more commonly serine or threonine, although 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine can also be used.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación ligados a N). Además, la alteración también puede hacerse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación ligados a O). De manera similar, la eliminación de sitios de glicosilación puede lograrse mediante la alteración de aminoácidos dentro de los sitios de glicosilación naturales del anticuerpo.Addition of glycosylation sites to the antibody is conveniently accomplished by altering the amino acid sequence so that it contains one or more of the tripeptide sequences described above (for N-linked glycosylation sites). In addition, alteration can also be done by adding, or substituting for, one or more serine or threonine residues to the sequence of the original antibody (for O-linked glycosylation sites). Similarly, removal of glycosylation sites can be accomplished by altering amino acids within the natural glycosylation sites of the antibody.
La secuencia de aminoácidos se altera generalmente mediante la alteración de la secuencia de ácidos nucleicos subyacente. Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo TLT-1 se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a un sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis por casete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo TLT-1.The amino acid sequence is generally altered by altering the underlying nucleic acid sequence. Nucleic acid molecules encoding amino acid sequence variants of a TLT-1 antibody are prepared by a variety of methods known in the art. These methods include isolation from a natural source (in the case of naturally occurring amino acid sequence variants) or preparation by oligonucleotide-mediated (or site-directed) mutagenesis, PCR mutagenesis, and cassette mutagenesis of a previously prepared variant or a non-variant version of the TLT-1 antibody.
La glicosilación (lo que incluye el patrón de glicosilación) de anticuerpos puede alterarse, además, sin alterar la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos subyacente. La glicosilación depende en gran medida de la célula huésped usada para expresar el anticuerpo. Dado que el tipo de célula usada para la expresión de glicoproteínas recombinantes, por ejemplo, anticuerpos, como productos terapéuticos potenciales rara vez es la célula natural, pueden esperarse variaciones significativas en el patrón de glicosilación de los anticuerpos (ver, por ejemplo, Hse y otros, J. Biol. Chem. 1997; 272:9062-9070). Además de la elección de las células huésped, los factores que afectan la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, la formulación de los medios, la densidad de cultivo, la oxigenación, el pH y los esquemas de purificación. Se han propuesto diversos métodos para alterar el patrón de glicosilación logrado en un organismo huésped particular, lo que incluye introducir o sobreexpresar determinadas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (patentes de los Estados Unidos Núms. 5,047,335; 5,510,261 y 5,278,299). La glicosilación, o determinados tipos de glicosilación, puede eliminarse enzimáticamente de la glicoproteína, por ejemplo, mediante el uso de endoglicosidasa H (Endo H). Además, la célula huésped recombinante puede modificarse por ingeniería genética, por ejemplo, hacerla defectuosa en el procesamiento de determinados tipos de polisacáridos. Estas y técnicas similares se conocen bien en la técnica. The glycosylation (including the glycosylation pattern) of antibodies can be further altered without altering the amino acid sequence or the underlying nucleotide sequence. Glycosylation is highly dependent on the host cell used to express the antibody. Since the cell type used for the expression of recombinant glycoproteins, eg, antibodies, is rarely the natural cell as potential therapeutics, significant variations in the glycosylation pattern of the antibodies can be expected (see, eg, Hse and others, J. Biol. Chem. 1997; 272: 9062-9070). In addition to the choice of host cells, factors that affect glycosylation during recombinant antibody production include growth mode, media formulation, culture density, oxygenation, pH, and purification schedules. Various methods have been proposed to alter the glycosylation pattern achieved in a particular host organism, including introducing or overexpressing certain enzymes involved in the production of oligosaccharides (US Patent Nos. 5,047,335; 5,510,261 and 5,278,299). Glycosylation, or certain types of glycosylation, can be removed enzymatically from the glycoprotein, for example, by using endoglycosidase H (Endo H). Furthermore, the recombinant host cell can be genetically engineered, for example, making it defective in the processing of certain types of polysaccharides. These and similar techniques are well known in the art.
La estructura de glicosilación de anticuerpos puede analizarse fácilmente mediante técnicas convencionales de análisis de carbohidratos, lo que incluye cromatografía de lectina, NMR, espectrometría de masas, HPLC, GPC, análisis composicional de monosacárido, digestión enzimática secuencial y HPAEC-PAD, que usa cromatografía de intercambio aniónico a pH elevado para separar oligosacáridos en base a la carga. Los métodos para liberar oligosacáridos para propósitos analíticos también se conocen, e incluyen, sin limitación, tratamiento enzimático, eliminación mediante el uso de un ambiente alcalino duro para liberar principalmente estructuras ligadas a O, y métodos químicos mediante el uso de hidrazina anhidra para liberar oligosacáridos ligados a N y a O.Antibody glycosylation structure can be easily analyzed by conventional carbohydrate analysis techniques, including lectin chromatography, NMR, mass spectrometry, HPLC, GPC, monosaccharide compositional analysis, sequential enzymatic digestion, and HPAEC-PAD, using chromatography. anion exchange at high pH to separate oligosaccharides based on charge. Methods for releasing oligosaccharides for analytical purposes are also known, and include, without limitation, enzymatic treatment, removal using a harsh alkaline environment to primarily release O-linked structures, and chemical methods using anhydrous hydrazine to release oligosaccharides. linked to N and O.
Además de su porción de unión al TLT-1, que implica un anticuerpo monoclonal o fragmento de este, las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprenden además un componente del factor de coagulación, cuya función es regular positivamente la coagulación de la sangre en los alrededores de la plaqueta activada.In addition to their TLT-1 binding portion, which involves a monoclonal antibody or fragment thereof, the procoagulant proteins described in the present description further comprise a component of the coagulation factor, the function of which is to positively regulate the coagulation of blood in the surroundings of the activated platelet.
Los factores de coagulación de las proteínas de fusión procoagulantes o los conjugados descritos en la presente descripción pueden estar en su forma inactiva o en su forma activada. El factor de coagulación puede ser una serina proteasa, en cuyo caso la forma inactiva del factor de coagulación corresponde a la forma zymógena y la forma activada corresponde a la forma activa catalíticamente. El factor de coagulación puede ser un polipéptido del FVII (FVII o FVIIa), un polipéptido del FVIII (es decir, FVIII o FVIIIa), un polipéptido del FIX (FIX o FIXa), un polipéptido del FX (FX o FXa) o un polipéptido del FXI (FXI o FXIa). Los polipéptidos del FVII, FVIII, FIX, FX y FXI de la presente invención incluyen, además, variantes, tales como variantes truncadas, y derivados de dichos factores de coagulación. Las variantes de FVII, FIX, FX y FXI incluirán variantes des-Gla truncadas, es decir, variantes de dichos factores de coagulación que carecen del dominio Gla responsable de la interacción con las membranas fosfolipídicas de dichos factores de coagulación.The coagulation factors of the procoagulant fusion proteins or the conjugates described in the present description can be in their inactive form or in their activated form. The coagulation factor may be a serine protease, in which case the inactive form of the coagulation factor corresponds to the zymogenic form and the activated form corresponds to the catalytically active form. The clotting factor may be an FVII polypeptide (FVII or FVIIa), a FVIII polypeptide (i.e., FVIII or FVIIIa), a FIX polypeptide (FIX or FIXa), an FX polypeptide (FX or FXa), or a FXI polypeptide (FXI or FXIa). The FVII, FVIII, FIX, FX and FXI polypeptides of the present invention further include variants, such as truncated variants, and derivatives of such coagulation factors. FVII, FIX, FX and FXI variants will include truncated de-Gla variants, i.e. variants of said coagulation factors lacking the Gla domain responsible for interaction with the phospholipid membranes of said coagulation factors.
Si el factor de coagulación es un polipéptido de FVII, el componente FVII puede ser capaz de unirse al factor tisular y es, preferentemente, capaz de escindir FIX o FX. Si el factor de coagulación es un polipéptido de FVIII, el componente FVIII es, preferentemente, capaz de unirse a FIXa y apoyer la escisión de FX. Si el factor de coagulación es un polipéptido de FIXa, es, preferentemente, capaz de escindir FX. Si el factor de coagulación es FXa, entonces es, preferentemente, capaz de escindir protrombina (FII). Si el factor de coagulación es un polipéptido de FXIa entonces es, preferentemente, capaz de escindir FIX.If the clotting factor is an FVII polypeptide, the FVII component may be capable of binding to tissue factor and is preferably capable of cleaving FIX or FX. If the clotting factor is an FVIII polypeptide, the FVIII component is preferably capable of binding to FIXa and supporting FX cleavage. If the clotting factor is a FIXa polypeptide, it is preferably capable of cleaving FX. If the clotting factor is FXa, then it is preferably capable of cleaving prothrombin (FII). If the clotting factor is an FXIa polypeptide then it is preferably capable of cleaving FIX.
En una modalidad particular, el factor de coagulación es un polipéptido de FV. El factor V se sintetiza por el hígado y el Factor V secretado circula en plasma como un polipéptido de cadena única de 330 kDa que es el procoagulante inactivo (Huang y otros (2008) Haemophilia 14: 1164-9). FV se compone de 2196 aminoácidos, lo que incluye un péptido señal de 28 aminoácidos. Se compone de seis dominios A1 (Aa 30-329), A2 (Aa 348-684), B (Aa 692-1573), A3 (Aa 1578-1907), C1 (Aa 1907-2061), y C2 (Aa 2066-2221). Los dominios A y C de las dos proteínas son aproximadamente 40 % homólogos con los dominios equivalentes del FVIII, pero los dominios B no se conservan. Como es el caso con el FVIII, la actividad del FV se regula estrechamente a través de proteólisis específica del sitio. La trombina, y en menor medida el Factor Xa (FXa), es responsable primariamente de la activación del FV a través de escisiones proteolíticas en las posiciones Arg709-Ser710, Arg1018-Thr1019 y Arg1545-Ser1546. Estas escisiones liberan el dominio B y crean una molécula dimérica compuesta de una cadena pesada de 105 kDa que contiene los dominios A1 y A2 y una cadena ligera de 71 a 74 kDa que contiene los dominios A3, C1 y C2. Estas dos cadenas se mantienen juntas por calcio en los residuos Asp139 y Asp140 y por interacciones hidrófobas. La cadena pesada proporciona los contactos tanto para FXa como para la protrombina, mientras que los dos dominios C en la cadena ligera son necesarios para la interacción del FVa con la superficie fosfolipídica. Por lo tanto, el Factor V es activo como un cofactor para el FXa del complejo de la trombinasa y la enzima FXa activada requiere calcio y FVa para convertir la protrombina a trombina en la membrana de la superficie celular. El dominio A3 en la cadena ligera se implica tanto en interacciones FXa como fosfolipídicas. En conjunto, las dos cadenas FVa unen al FXa con la superficie fosfolipídica formada por el tapón de plaquetas en el sitio de lesión y permiten que FXa se una de manera eficiente y escinda la protrombina para generar trombina. El Factor V es capaz de unirse a plaquetas activadas. Aunque el FV se encuentra predominantemente como un componente soluble en el plasma sanguíneo, una fracción del FV está presente, además, en el gránulo a de plaquetas, lo que es importante para la hemostasia normal como se evidencia por la deficiencia del Factor V específico de plaquetas (Janeway y otros (1996) Blood 87: 3571-8).In a particular embodiment, the clotting factor is an FV polypeptide. Factor V is synthesized by the liver, and secreted Factor V circulates in plasma as a 330 kDa single chain polypeptide that is the inactive procoagulant (Huang et al. (2008) Haemophilia 14: 1164-9). FV is made up of 2196 amino acids, which includes a 28 amino acid signal peptide. It is made up of six domains A1 (Aa 30-329), A2 (Aa 348-684), B (Aa 692-1573), A3 (Aa 1578-1907), C1 (Aa 1907-2061), and C2 (Aa 2066-2221). The A and C domains of the two proteins are approximately 40% homologous with the equivalent FVIII domains, but the B domains are not conserved. As is the case with FVIII, FV activity is tightly regulated through site-specific proteolysis. Thrombin, and to a lesser extent Factor Xa (FXa), is primarily responsible for FV activation through proteolytic cleavages at positions Arg709-Ser710, Arg1018-Thr1019 and Arg1545-Ser1546. These cleavages release domain B and create a dimeric molecule composed of a 105 kDa heavy chain containing domains A1 and A2 and a 71 to 74 kDa light chain containing domains A3, C1, and C2. These two chains are held together by calcium in the Asp139 and Asp140 residues and by hydrophobic interactions. The heavy chain provides the contacts for both FXa and prothrombin, whereas the two C domains in the light chain are necessary for the interaction of FVa with the phospholipid surface. Therefore, Factor V is active as a cofactor for the FXa of the thrombinase complex and the activated FXa enzyme requires calcium and FVa to convert prothrombin to thrombin in the cell surface membrane. The A3 domain in the light chain is involved in both FXa and phospholipid interactions. Together, the two FVa chains bind FXa to the phospholipid surface formed by the platelet plug at the site of injury and allow FXa to efficiently bind and cleave prothrombin to generate thrombin. Factor V is capable of binding to activated platelets. Although VF is predominantly found as a soluble component in blood plasma, a fraction of VF is also present in platelet granule a, which is important for normal hemostasis as evidenced by deficiency of specific Factor V platelets (Janeway et al. (1996) Blood 87: 3571-8).
Una secuencia del Factor V humano de tipo silvestre se proporciona en la SEQ ID NO: 155. El término “polipéptido del Factor V”, en la presente descripción, se refiere a moléculas del Factor V de tipo silvestre así como también a variantes del FV, derivados del FV y conjugados del FV. Dichas variantes, derivados y conjugados pueden exhibir sustancialmente la misma actividad biológica, o mejorada, con relación al Factor V humano de tipo silvestre.A wild type human Factor V sequence is provided in SEQ ID NO: 155. The term "Factor V polypeptide", in the present description, refers to wild type Factor V molecules as well as FV variants , derivatives of the FV and conjugates of the FV. Such variants, derivatives, and conjugates can exhibit substantially the same, or improved, biological activity relative to wild-type human Factor V.
El Factor V puede derivarse de plasma o producirse de manera recombinante, mediante el uso de métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, gammacarboxilación y otras modificaciones postraduccionales puede variar en dependencia de la célula huésped elegida y sus condiciones de crecimiento.Factor V can be derived from plasma or produced recombinantly, using well-known production and purification methods. The degree and location of glycosylation, gammacarboxylation, and other post-translational modifications can vary depending on the chosen host cell and its growth conditions.
Los polipéptidos del Factor V pueden analizarse mediante el uso de ensayos de coagulación disponibles comercialmente, tales como el ensayo in vitro Hemoclot Factor V Reagent (Aniara, Ohio, EE.UU.: Núm. de Cat. ACK071K).Factor V polypeptides can be analyzed using commercially available coagulation assays, such as the Hemoclot Factor V Reagent in vitro assay (Aniara, Ohio, USA: Cat. No. ACK071K).
En una modalidad particular, el factor de coagulación es un polipéptido FVIIa. El Factor VII (FVII) es una glicoproteína producida principalmente en el hígado. La proteína madura se compone de 406 residuos de aminoácidos y se compone de cuatro dominios según se definió por homología. Existe un dominio Gla N-terminal seguido de dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF) y un dominio de serina proteasa C-terminal. El FVII circula en plasma como una molécula de cadena simple. Tras activarse hacia FVII activado (FVIIa), la molécula es hendida entre los residuos Arg152 e Ile153, lo que resulta en una proteína bicatenaria mantenida unida por un enlace disulfuro. La cadena ligera contiene los dominios Gla y similares a EGF, mientras que la cadena pesada es el dominio de proteasa. El FVIIa requiere la unión a su factor tisular cofactor de superficie celular para volverse completamente activo biológicamente.In a particular embodiment, the clotting factor is an FVIIa polypeptide. Factor VII (FVII) is a glycoprotein produced mainly in the liver. The mature protein is made up of 406 amino acid residues and is made up of four domains as defined by homology. There is an N-terminal Gla domain followed by two epidermal growth factor (EGF) -like domains and a C-terminal serine protease domain. FVII circulates in plasma as a single chain molecule. Upon activation to activated FVII (FVIIa), the molecule is cleaved between residues Arg152 and Ile153, resulting in a double-stranded protein held together by a disulfide bond. The light chain contains Gla and EGF-like domains, while the heavy chain is the protease domain. FVIIa requires binding to its cell surface cofactor tissue factor to become fully biologically active.
El término “Factor VII(a)”, en la presente descripción, abarca el zimógeno no hendido, el Factor VII, así como también la proteasa hendida y por lo tanto activada, el Factor VIIa. El “Factor VII(a)” incluye variantes alélicas naturales del FVII(a) que pueden existir y producirse de un individuo a otro. Una secuencia del Factor VIIa humano de tipo silvestre se proporciona en la SEQ ID NO: 157, así como también en Proc Natl Acad Sci EE.UU. 1986; 83:2412-2416.The term "Factor VII (a)", in the present description, encompasses the non-cleaved zymogen, Factor VII, as well as the cleaved and therefore activated protease, Factor VIIa. "Factor VII (a)" includes natural allelic variants of FVII (a) that can exist and be produced from one individual to another. A wild type human Factor VIIa sequence is provided in SEQ ID NO: 157, as well as in Proc Natl Acad Sci USA. 1986; 83: 2412-2416.
El término “polipéptido del Factor VII(a)”, en la presente descripción, se refiere a moléculas del Factor VIIa de tipo silvestre, así como también a variantes del FVII(a), derivados del FVII(a) y conjugados del FVII(a). Dichas variantes, derivados y conjugados pueden exhibir sustancialmente la misma actividad biológica, o mejorada, con relación al Factor VIIa humano de tipo silvestre.The term "Factor VII (a) polypeptide", in the present description, refers to wild-type Factor VIIa molecules, as well as FVII (a) variants, FVII (a) derivatives and FVII conjugates ( to). Such variants, derivatives, and conjugates can exhibit substantially the same, or improved, biological activity relative to wild-type human Factor VIIa.
El término “variante del FVII(a)”, como se usa en la presente descripción, pretende designar el Factor FVII que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 157, en donde uno o más aminoácidos de la proteína parental se han sustituido por otro aminoácido y/o en donde uno o más aminoácidos de la proteína parental se han eliminado y/o en donde uno o más aminoácidos se han insertado en la proteína y/o en donde uno o más aminoácidos se han añadido a la proteína parental. Dicha adición puede tener lugar ya sea en el extremo N terminal o en el extremo C terminal de la proteína parental o en ambos. El “análogo” o “análogos” dentro de esta definición todavía tiene actividad FVII en su forma activada. En una modalidad, una variante es al menos 90 % idéntica con la secuencia de la SEQ ID NO: 157. En otra modalidad, una variante es al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % idéntica con la secuencia de la SEQ ID NO: 157. Como se usa en la presente descripción, cualquier referencia a una posición específica se refiere a la posición correspondiente en la SEQ ID NO: 157.The term "FVII variant (a)", as used herein, is intended to designate FVII Factor having the sequence of SEQ ID NO: 157, wherein one or more amino acids of the parent protein have been replaced by other amino acid and / or where one or more amino acids have been removed from the parent protein and / or where one or more amino acids have been inserted into the protein and / or where one or more amino acids have been added to the parent protein. Such addition can take place either at the N-terminus or at the C-terminus of the parent protein, or both. The "analog" or "analogs" within this definition still has FVII activity in its activated form. In one embodiment, a variant is at least 90% identical with the sequence of SEQ ID NO: 157. In another embodiment, a variant is at least 95%, such as at least 96%, such as at least 97%, such as at least 98%, such as at least 99% identical with the sequence of SEQ ID NO: 157. As used in the present description, any reference to a specific position refers to the corresponding position in SEQ ID NO: 157.
Los ejemplos no limitantes de variantes del FVII(a) que tienen sustancialmente la misma o mayor actividad proteolítica en comparación con el Factor VII(a) humano de tipo silvestre recombinante incluyen los descritos en los documentos WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077147, WO 03/037932, WO 04/029090, WO 05/024006, WO 07/031559 y EP 05108713.8, US 7173000 B2 y JP4451514 B2.Non-limiting examples of FVII (a) variants that have substantially the same or increased proteolytic activity compared to recombinant wild-type human Factor VII (a) include those described in the documents. WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077147, WO 03/037932, WO 04/029090, WO 05/024006, WO 07/031559 and EP 05108713.8, US 7173000 B2 and JP4451514 B2.
El término “actividad biológica mejorada” se refiere a polipéptidos del FVII(a) que muestran i) sustancialmente la misma o mayor actividad proteolítica en comparación con el Factor VIIa humano de tipo silvestre recombinante en presencia y/o ausencia del factor tisular o ii) a polipéptidos del FVII(a) con sustancialmente la misma o mayor afinidad por TF en comparación con el Factor VIIa humano de tipo silvestre recombinante o iii) a polipéptidos del FVII(a) con sustancialmente la misma o mayor vida media en plasma en comparación con el Factor VIIa humano de tipo silvestre recombinante, o iv) a polipéptidos del FVII(a) con sustancialmente la misma o mayor afinidad por la plaqueta activada. La actividad biológica de un polipéptido FVIIa puede medirse mediante el uso de una variedad de ensayos conocidos por el experto en la técnica, tales como los ensayos de hidrólisis in vitro y proteólisis in vitro descritos en los ejemplos 26 y 27.The term "enhanced biological activity" refers to FVII (a) polypeptides that show i) substantially the same or increased proteolytic activity compared to recombinant wild-type human Factor VIIa in the presence and / or absence of tissue factor or ii) to FVII (a) polypeptides with substantially the same or greater affinity for TF compared to recombinant wild-type human Factor VIIa or iii) to FVII (a) polypeptides with substantially the same or longer plasma half-life compared to recombinant wild-type human Factor VIIa, or iv) to FVII (a) polypeptides with substantially the same or greater affinity for activated platelet. The biological activity of an FVIIa polypeptide can be measured using a variety of assays known to the person skilled in the art, such as the in vitro hydrolysis and in vitro proteolysis assays described in Examples 26 and 27.
El FVII(a) puede derivarse de plasma o producirse de manera recombinante, mediante el uso de métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, gammacarboxilación y otras modificaciones postraduccionales puede variar en dependencia de la célula huésped elegida y sus condiciones de crecimiento.FVII (a) can be derived from plasma or produced recombinantly, using well-known production and purification methods. The degree and location of glycosylation, gammacarboxylation, and other post-translational modifications can vary depending on the chosen host cell and its growth conditions.
Los residuos gammacarboxilados en la secuencia FVII más abajo se representan por ”y”.The gammacarboxylated residues in the FVII sequence below are represented by "and".
SEQ ID NO: 157: Factor VII de coagulación humano de tipo silvestreSEQ ID NO: 157: Wild-type human coagulation factor VII
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En otra modalidad particular, el factor de coagulación es un polipéptido FVIII. El Factor VIII (FVIII) es una glicoproteína grande y compleja que se produce principalmente por los hepatocitos. El FVIII se compone de 2351 aminoácidos, lo que incluye un péptido de señalización, y contiene varios dominios distintos según se define por homología. Existen tres dominios A, un dominio B único y dos dominios C. El orden de dominio puede enumerarse como NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. El FVIII circula en el plasma como dos cadenas, separado en el borde B-A3. Las cadenas se conectan mediante enlaces iónicos de metal bivalente. La cadena A1-A2-B se denomina la cadena pesada (HC) mientras que la A3-C1-C2 se denomina cadena ligera (LC). Las regiones ácidas pequeñas C-terminal del A1 (la región a1) y A2 (la región a2) y N-terminal del dominio A3 (la región a3) juegan papeles importantes en su interacción con otras proteínas de coagulación, lo que incluye la trombina y el factor de von Willebrand (vWF o VWF), la proteína portadora para el FVIII, in vivo. In another particular embodiment, the clotting factor is an FVIII polypeptide. Factor VIII (FVIII) is a large and complex glycoprotein that is mainly produced by hepatocytes. FVIII is made up of 2351 amino acids, which includes a signaling peptide, and contains several different domains as defined by homology. There are three A domains, a single B domain, and two C domains. The domain order can be listed as NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. The FVIII circulates in the plasma as two chains, separated at the B-A3 border. The chains are connected by bivalent metal ionic bonds. The A1-A2-B chain is called the heavy chain (HC) while the A3-C1-C2 is called the light chain (LC). The small C-terminal acidic regions of A1 (region a 1 ) and A2 (region a 2 ) and N-terminal of domain A3 (region a3) play important roles in their interaction with other coagulation proteins, including thrombin and von Willebrand factor (vWF or VWF), the carrier protein for FVIII, in vivo.
Las moléculas de FVIII endógeno circulan in vivo como un agrupamiento de moléculas con dominios B de varios tamaños, el más corto tiene el C-terminal en la posición 740, es decir, en el C-terminal de A2-a2. Estas moléculas de FVIII con dominios B de longitud diferente tienen todas actividad procoagulante total. Tras la activación con la trombina, el FVIII es hendido en el C-terminal de A1-a1 en la posición 372, el C-terminal de A2-a2 en la posición 740, y entre a3 y A3 en la posición 1689, la última escisión libera la región a3, con pérdida concomitante de afinidad por vWF. La molécula del FVIII activado se denomina FVIIIa. La activación permite la interacción de FVIIIa con superficies fosfolipídicas como plaquetas activadas y el Factor IX activado (FIXa): se forma el complejo tenasa, lo que permite la activación eficiente del Factor X (FX).Endogenous FVIII molecules circulate in vivo as a cluster of molecules with B domains of various sizes, the shortest having the C-terminus at position 740, that is, at the C-terminus of A2-a2. These FVIII molecules with B domains of different length all have full procoagulant activity. Upon activation with thrombin, FVIII is cleaved at the C-terminus of A1-a1 at position 372, the C-terminus of A2-a2 at position 740, and between a3 and A3 at position 1689, the last cleavage releases the a3 region, with concomitant loss of affinity for vWF. The activated FVIII molecule is called FVIIIa. Activation allows the interaction of FVIIIa with phospholipid surfaces such as activated platelets and activated Factor IX (FIXa): the tenase complex is formed, allowing efficient activation of Factor X (FX).
Los términos “Factor VIII(a)” y “FVIII(a)” incluyen tanto FVIII como FVIIIa. El “Factor VIII” o “FVIII”, en la presente descripción, se refiere a una glicoproteína plasmática humana que es un miembro de la vía de coagulación intrínseca y es esencial para la coagulación de la sangre. El “FVIII natural” es la molécula FVIII humana derivada de la secuencia de longitud completa como se muestra en la SEQ ID NO: 159 (aminoácidos 1-2332). El “FVIII(a)” incluye variantes alélicas naturales del FVIII(a) que pueden existir y producirse de un individuo a otro.The terms "Factor VIII (a)" and "FVIII (a)" include both FVIII and FVIIIa. "Factor VIII" or "FVIII", in the present description, refers to a human plasma glycoprotein that is a member of the intrinsic coagulation pathway and is essential for blood coagulation. "Natural FVIII" is the human FVIII molecule derived from the full-length sequence as shown in SEQ ID NO: 159 (amino acids 1-2332). "FVIII (a)" includes natural allelic variants of FVIII (a) that can exist and be produced from one individual to another.
Las moléculas/variantes del FVIII pueden ser moléculas de FVIII truncadas en el dominio B, en donde los dominios restantes corresponden estrechamente a las secuencias como se expone en los números de aminoácidos 1-740 y 1649-2332 de la SEQ ID NO: 159. En dichas variantes, así como también en el FVIII derivado de la secuencia de longitud completa, las mutaciones pueden introducirse para, por ejemplo, reducir la capacidad de unión a vWF. Las modificaciones de aminoácidos, tales como sustituciones y deleciones, pueden introducirse en la molécula para modificar la capacidad de unión del FVIII con diversos otros componentes tales como LRP, diversos receptores, otros factores de coagulación, superficies celulares, introducción y/o supresión de sitios de glicosilación. Otras mutaciones que no suprimen la actividad del FVIII también pueden acomodarse en una molécula/variante del FVIII que puede usarse para los propósitos de la presente invención.The FVIII molecules / variants can be truncated FVIII molecules in domain B, where the remaining domains closely correspond to the sequences as set forth in amino acid numbers 1-740 and 1649-2332 of SEQ ID NO: 159. In such variants, as well as in FVIII derived from the full-length sequence, mutations can be introduced to, for example, reduce vWF binding capacity. Amino acid modifications, such as substitutions and deletions, can be introduced into the molecule to modify the binding capacity of FVIII with various other components such as LRP, various receptors, others coagulation factors, cell surfaces, introduction and / or suppression of glycosylation sites. Other mutations that do not suppress FVIII activity can also be accommodated in a FVIII molecule / variant that can be used for the purposes of the present invention.
El dominio B del FVIII se extiende de los aminoácidos 741-1648 de la SEQ ID NO: 159. El dominio B es hendido en varios sitios diferentes, lo que genera gran heterogeneidad en las moléculas de FVIII en plasma circulante. Se desconoce la función exacta del dominio B fuertemente glicosilado. Lo que se conoce es que el dominio B es indispensable para la actividad del FVIII en la cascada de coagulación. De esta forma, el FVIII recombinante se produce frecuentemente en forma de variantes eliminadas/truncadas del dominio B.FVIII domain B extends from amino acids 741-1648 of SEQ ID NO: 159. Domain B is cleaved at several different sites, generating great heterogeneity in FVIII molecules in circulating plasma. The exact function of the strongly glycosylated domain B is unknown. What is known is that domain B is essential for FVIII activity in the coagulation cascade. Thus, recombinant FVIII is frequently produced as deleted / truncated variants of domain B.
El FVIII endógeno de longitud completa se sintetiza como una molécula precursora de cadena simple. Antes de la secreción, el precursor es hendido en la cadena pesada y la cadena ligera. El FVIII recombinante con dominio B eliminado puede producirse por medio de dos estrategias diferentes. Ya sea la cadena pesada sin el dominio B y la cadena ligera se sintetizan individualmente como dos cadenas polipeptídicas diferentes (estrategia de dos cadenas) o el FVIII con dominio B eliminado se sintetiza como una cadena polipeptídica precursora única (estrategia de cadena simple) que se escinde en las cadenas pesada y ligera de la misma manera que el precursor de FVIII de longitud completa.Full-length endogenous FVIII is synthesized as a single chain precursor molecule. Before secretion, the precursor is cleaved into the heavy and light chains. Recombinant FVIII with domain B removed can be produced by two different strategies. Either the heavy chain without the B domain and the light chain are synthesized individually as two different polypeptide chains (two-chain strategy) or the FVIII with the deleted B domain is synthesized as a single precursor polypeptide chain (single chain strategy) that is cleaves the heavy and light chains in the same manner as the full-length FVIII precursor.
En un polipéptido precursor de FVIII con dominio B eliminado, producido por la estrategia de cadena simple, los restos de cadena pesada y ligera se separan frecuentemente por un enlazador. Para minimizar el riesgo de introducir epítopos inmunogénicos en el FVIII con dominio B eliminado, la secuencia del enlazador se deriva, preferentemente, del dominio B del FVIII. Como mínimo, el enlazador debe comprender un sitio de reconocimiento para la proteasa que escinde el polipéptido precursor de FVIII con dominio B eliminado en las cadenas pesada y ligera. En el dominio B del FVIII de longitud completa, los aminoácidos 1644-1648 constituyen este sitio de reconocimiento. El sitio de escisión de trombina que conduce a la eliminación del enlazador en la activación del FVIII con dominio B eliminado se ubica en la cadena pesada. Por lo tanto, es poco probable que el tamaño y la secuencia de aminoácidos del enlazador influyan en su eliminación de la molécula FVIII restante por la activación de la trombina. La deleción/truncamiento del dominio B es una ventaja para la producción del FVIII. No obstante, las partes del dominio B pueden incluirse en el enlazador sin reducir la productividad. El efecto negativo del dominio B sobre la productividad no se ha atribuido a ningún tamaño o secuencia específica del dominio B.In a B domain deleted FVIII precursor polypeptide produced by the single chain strategy, heavy and light chain residues are frequently separated by a linker. To minimize the risk of introducing immunogenic epitopes into FVIII with domain B removed, the linker sequence is preferably derived from domain B of FVIII. At a minimum, the linker should comprise a recognition site for the protease that cleaves the deleted B domain FVIII precursor polypeptide in the heavy and light chains. In domain B of full-length FVIII, amino acids 1644-1648 constitute this recognition site. The thrombin cleavage site leading to linker deletion in FVIII activation with deleted B domain is located in the heavy chain. Therefore, the size and amino acid sequence of the linker are unlikely to influence its removal from the remaining FVIII molecule by activation of thrombin. Deletion / truncation of domain B is an advantage for FVIII production. However, parts of domain B can be included in the linker without reducing productivity. The negative effect of domain B on productivity has not been attributed to any specific size or sequence of domain B.
Las moléculas de FVIII para la presente invención son capaces de funcionar en la cascada de coagulación de una manera que es funcionalmente similar, o equivalente, al FVIII, lo que induce la formación de FXa mediante la interacción con FIXa en una plaqueta activada y respalda la formación de un coágulo de sangre. La actividad del FVIII puede evaluarse in vitro mediante el uso de técnicas bien conocidas en la técnica. Los análisis de coágulos, los ensayos de activación de FX (frecuentemente denominados ensayos cromogénicos), los ensayos de generación de trombina y la tromboelastografía de sangre total son ejemplos de dichas técnicas in vitro, dos de las cuales se describen en los ejemplos 28 y 29. Las moléculas de FVIII de acuerdo con la presente invención, tienen actividad de FVIII que es al menos la misma de un FVIII humano natural.The FVIII molecules for the present invention are capable of functioning in the coagulation cascade in a way that is functionally similar, or equivalent, to FVIII, inducing the formation of FXa by interacting with FIXa on an activated platelet and supporting the formation of a blood clot. FVIII activity can be evaluated in vitro using techniques well known in the art. Clot analysis, FX activation assays (often called chromogenic assays), thrombin generation assays, and whole blood thromboelastography are examples of such in vitro techniques , two of which are described in Examples 28 and 29. The FVIII molecules according to the present invention have FVIII activity that is at least the same as that of a natural human FVIII.
El término “variante de FVIII”, como se usa en la presente descripción, pretende designar el Factor FVIII que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 159, en donde uno o más aminoácidos de la proteína parental se han sustituido por otro aminoácido y/o en donde uno o más aminoácidos de la proteína parental se han eliminado y/o en donde uno o más aminoácidos de la proteína parental se han insertado en la proteína y/o en donde uno o más aminoácidos se han añadido a la proteína parental. Dicha adición puede tener lugar ya sea en el extremo N terminal o en el extremo C terminal de la proteína parental o en ambos. El “análogo” o “análogos” dentro de esta definición todavía tiene actividad de FVIII en su forma activada. En una modalidad, una variante es al menos 90 % idéntica con la secuencia de la SEQ ID NO: 159. En otra modalidad, una variante es al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % idéntica con la secuencia de la SEQ ID NO: 159. Como se usa en la presente descripción, cualquier referencia a una posición específica se refiere a la posición correspondiente en la SEQ ID NO: 159.The term "variant of FVIII", as used in the present description, is intended to designate Factor FVIII having the sequence of SEQ ID NO: 159, wherein one or more amino acids of the parent protein have been replaced by another amino acid and / or where one or more amino acids from the parent protein have been removed and / or where one or more amino acids from the parent protein have been inserted into the protein and / or where one or more amino acids have been added to the parent protein . Such addition can take place either at the N-terminus or at the C-terminus of the parent protein, or both. The "analog" or "analogs" within this definition still have FVIII activity in its activated form. In one embodiment, a variant is at least 90% identical with the sequence of SEQ ID NO: 159. In another embodiment, a variant is at least 95%, such as at least 96%, such as at least 97%, such as at least 98%, such as at least 99% identical with the sequence of SEQ ID NO: 159. As used in the present description, any reference to a specific position refers to the corresponding position in SEQ ID NO: 159.
El FVIII puede derivarse de plasma o producirse de manera recombinante, mediante el uso de métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, gammacarboxilación y otras modificaciones postraduccionales puede variar en dependencia de la célula huésped elegida y sus condiciones de crecimiento. FVIII can be derived from plasma or produced recombinantly, using well known production and purification methods. The degree and location of glycosylation, gammacarboxylation, and other post-translational modifications can vary depending on the chosen host cell and its growth conditions.
En otra modalidad particular, el factor de coagulación es un polipéptido del Factor IX. El Factor IX (FIX) es, en su forma activa FIXa, una serina proteasa similar a tripsina que cumple un papel clave en la hemostasia mediante la generación, como parte del complejo de tenasa, de la mayoría del Factor Xa requerido para respaldar una formación de trombina adecuada durante la coagulación (revisado en (Hoffman y Monroe, III 2001)).In another particular embodiment, the clotting factor is a Factor IX polypeptide. Factor IX (FIX) is, in its active form FIXa, a trypsin-like serine protease that plays a key role in hemostasis by generating, as part of the tenase complex, the majority of Factor Xa required to support formation of adequate thrombin during coagulation (reviewed in (Hoffman and Monroe, III 2001)).
El Factor IX (FIX) es un factor de coagulación dependiente de vitamina K con similitudes estructurales al Factor VII, protrombina, Factor X, y proteína C. La forma de zimógeno circulante se compone de 415 aminoácidos divididos en cuatro dominios distintos que comprenden un dominio N-terminal rico en ácido Y-carboxiglutámico (Gla), dos dominios EGF y un dominio C-terminal serina proteasa similar a tripsina. La activación del FIX se produce por proteólisis limitada en Arg145-Ala146 y Arg180-Val181 lo que libera un fragmento de 35 aa, el denominado péptido de activación (Schmidt y Bajaj 2003). El péptido de activación es fuertemente glicosilado, y contiene dos glicanos ligados a N y hasta cuatro glicanos ligados a O.Factor IX (FIX) is a vitamin K-dependent clotting factor with structural similarities to Factor VII, prothrombin, Factor X, and protein C. The circulating zymogen form is made up of 415 amino acids divided into four distinct domains that comprise one domain. N-terminal rich in Y-carboxyglutamic acid (Gla), two EGF domains and one C-terminal domain serine protease similar to trypsin. FIX activation occurs by limited proteolysis in Arg145-Ala146 and Arg180-Val181, which releases a 35 aa fragment, the so-called activation peptide (Schmidt and Bajaj 2003). The activation peptide is strongly glycosylated, and contains two N-linked glycans and up to four O-linked glycans.
El “Factor IX” o “FIX”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una glicoproteína del Factor IX plasmático humano que es un miembro de la vía de coagulación intrínseca y es esencial para la coagulación de la sangre. El “Factor IX(a)” incluye variantes alélicas naturales de FIX(a) que pueden existir y producirse de un individuo a otro. El Factor IX(a) puede derivarse de plasma o producirse de manera recombinante mediante el uso de métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, gammacarboxilación y otras modificaciones postraduccionales puede variar en dependencia de la célula huésped elegida y sus condiciones de crecimiento. A menos que se especifique o se indique de cualquier otra manera, Factor IX significa cualquier molécula de proteína Factor IX humano funcional en su papel normal en la coagulación, lo que incluye cualquier fragmento, análogo y derivado de esta."Factor IX" or "FIX", as used herein, refers to a human plasma Factor IX glycoprotein that is a member of the intrinsic coagulation pathway and is essential for blood coagulation. "Factor IX (a)" includes natural allelic variants of FIX (a) that can exist and be produced from one individual to another. Factor IX (a) can be derived from plasma or produced recombinantly using well-known production and purification methods. The degree and location of glycosylation, gammacarboxylation, and other post-translational modifications can vary depending on the chosen host cell and its growth conditions. Unless otherwise specified or indicated, Factor IX means any functional human Factor IX protein molecule in its normal role in coagulation, including any fragment, analog and derivative thereof.
Un ejemplo de un “FIX de tipo silvestre” es la molécula FIX humana de longitud completa, como se muestra en la SEQ ID NO: 161.An example of a "wild-type FIX" is the full-length human FIX molecule, as shown in SEQ ID NO: 161.
Se pretende que los términos “análogos de FIX”, como se usa en la presente descripción, designen el Factor FIX que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 161, en donde uno o más aminoácidos de la proteína parental se han sustituido por otro aminoácido y/o en donde uno o más aminoácidos de la proteína parental se han eliminado y/o en donde uno o más aminoácidos se han insertado en la proteína y/o en donde uno o más aminoácidos se han añadido a la proteína parental. Dicha adición puede tener lugar ya sea en el extremo N terminal o en el extremo C terminal de la proteína parental o en ambos. El “análogo” o “análogos” dentro de esta definición todavía tiene actividad FIX en su forma activada. En una modalidad, una variante es al menos 90 % idéntica con la secuencia de la SEQ ID NO: 161. En una modalidad adicional, una variante es al menos 95 % idéntica con la secuencia de la SEQ ID NO: 161. Como se usa en la presente descripción, cualquier referencia a posiciones específicas se refiere a la posición correspondiente en la SEQ ID NO: 161. Los ejemplos no limitantes de variantes FIX(a) que tienen sustancialmente la misma actividad, actividad de puenteo del FVIII o actividad proteolítica aumentada en comparación con el Factor IX(a) humano de tipo silvestre recombinante incluyen los descritos en Milanov P, Ivanciu L, Abriss D, Quade-Lyssy P, Miesbach W, Alesci S, Tonn T, Grez M, Seifried E, Schüttrumpf (2012) J.Blood 119: 602-11 y el documento US 2011/0217284 A1. A menos que se especifique de cualquier otra manera, los dominios del Factor IX incluyen los residuos de aminoácidos siguientes: El dominio Gla es la región desde el residuo Tyr1 hasta el residuo Lys43; el EGF1 es la región desde el residuo Gln44 hasta el residuo Leu84; el EGF2 es la región desde el residuo Asp85 hasta el residuo Arg145; el péptido de activación es la región desde el residuo Ala146 hasta el residuo Arg180; y el dominio de proteasa es la región desde el residuo Val181 hasta el residuo Thr414. La cadena ligera se refiere a la región que abarca el dominio Gla, EGF1 y EGF2, mientras que la cadena pesada se refiere al dominio de proteasa.The terms "FIX analogs", as used herein, are intended to designate FIX Factor having the sequence of SEQ ID NO: 161, wherein one or more amino acids of the parent protein have been replaced by another amino acid and / or where one or more amino acids from the parent protein have been removed and / or where one or more amino acids have been inserted into the protein and / or where one or more amino acids have been added to the parent protein. Such addition can take place either at the N-terminus or at the C-terminus of the parent protein, or both. The "analog" or "analogs" within this definition still have FIX activity in its activated form. In one embodiment, a variant is at least 90% identical with the sequence of SEQ ID NO: 161. In a further embodiment, a variant is at least 95% identical with the sequence of SEQ ID NO: 161. As used In the present description, any reference to specific positions refers to the corresponding position in SEQ ID NO: 161. Non-limiting examples of FIX (a) variants that have substantially the same activity, FVIII bridging activity or increased proteolytic activity Compared with recombinant wild type human Factor IX (a) include those described in Milanov P, Ivanciu L, Abriss D, Quade-Lyssy P, Miesbach W, Alesci S, Tonn T, Grez M, Seifried E, Schüttrumpf (2012 ) J.Blood 119: 602-11 and US 2011/0217284 A1. Unless otherwise specified, Factor IX domains include the following amino acid residues: The Gla domain is the region from residue Tyr1 to residue Lys43; EGF1 is the region from residue Gln44 to residue Leu84; EGF2 is the region from residue Asp85 to residue Arg145; the activation peptide is the region from residue Ala146 to residue Arg180; and the protease domain is the region from the Val181 residue to the Thr414 residue. The light chain refers to the region encompassing the Gla domain, EGF1 and EGF2, while the heavy chain refers to the protease domain.
El Factor IX puede derivarse de plasma o producirse de manera recombinante, mediante el uso de métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, gammacarboxilación y otras modificaciones postraduccionales puede variar en dependencia de la célula huésped elegida y sus condiciones de crecimiento.Factor IX can be derived from plasma or produced recombinantly, using well-known production and purification methods. The degree and location of glycosylation, gammacarboxylation, and other post-translational modifications can vary depending on the chosen host cell and its growth conditions.
Un kit de ensayo disponible comercialmente conocido como kit 'Hyphen BioMed Chromogenic Factor IX (Aniara)' puede usarse para evaluar el nivel de actividad del polipéptido FIX. En este ensayo, el Factor XIa activa el Factor IX en Factor IXa, que junto con el Factor VIII:C activado, fosfolípidos y Ca2+, activa el Factor X en Factor Xa. La cantidad de Factor Xa generado se midió a 405 nm por la cantidad de pNA liberada del sustrato cromogénico específico para el Factor Xa SXa-11.A commercially available assay kit known as the 'Hyphen BioMed Chromogenic Factor IX (Aniara)' kit can be used to assess the level of activity of the FIX polypeptide. In this test, Factor XIa activates Factor IX in Factor IXa, which, together with activated Factor VIII: C, phospholipids and Ca2 +, activates Factor X in Factor Xa. The amount of Factor Xa generated was measured at 405 nm by the amount of pNA released from the Factor Xa SXa-11 specific chromogenic substrate.
Los residuos gammacarboxilados en la secuencia FVII más abajo se representan por ”y”.The gammacarboxylated residues in the FVII sequence below are represented by "and".
SEQ ID NO: 161: Factor IX de coagulación humano de tipo silvestre SEQ ID NO: 161: Wild-type human coagulation factor IX
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En otra modalidad particular, el factor de coagulación es un polipéptido FX. El Factor X (FX) de coagulación es un factor de coagulación dependiente de la vitamina K con similitudes estructurales al Factor VII, protrombina, Factor IX (FIX) y proteína C. Se sintetiza con una pre-pro-secuencia de 40 residuos que contiene una secuencia señal hidrófoba (Aa 1-31) que se dirige a la proteína para la secreción. El propéptido es importante para dirigir la Y-carboxilación a la cadena ligera del Factor X. El zimógeno de FX humano circulante se compone de 445 aminoácidos divididos en cuatro dominios distintos que comprenden un dominio N-terminal rico en ácido gamma-carboxiglutámico (Gla), dos dominios EGF, y un dominio C-terminal de serina proteasa similar a tripsina. La forma de dos cadenas maduras del FX se compone de una cadena ligera (Aa41-179) y una cadena pesada (Aa183-488) que se mantienen juntas mediante un puente disulfuro (Cys172 - Cys342). La cadena ligera contiene 11 residuos Gla, que son importantes para la unión dependiente de Ca2+ del FX a membranas fosfolipídicas cargadas negativamente. El Factor X de coagulación humano de tipo silvestre tiene dos sitios de N-glicosilación (Asn221 y Asn231) y dos sitios de O-glicosilación (Thr199 y Thr211) en el péptido de activación. La p-hidroxilación se produce en Asp103 en el primer dominio EGF, lo que resulta en ácido phidroxiaspártico (Hya). La activación del FX se produce por proteólisis limitada en Arg234-Ile235 lo que libera un péptido de activación de 52 aminoácidos (Aa 183-234). En la vía extrínseca, esto se produce tras la exposición del factor tisular (TF) en la membrana de células subendoteliales al plasma y la activación posterior del FVIIa. La activación a través de la vía intrínseca se produce con la interacción del Factor IXa, el Factor Villa, el calcio y las superficies fosfolipídicas ácidas. La protrombina es el sustrato más importante del Factor Xa, pero la activación requiere del Factor Va cofactor de FXa, calcio y superficie fosfolípica ácida. La deficiencia de FX es un trastorno de sangrado autosómico recesivo raro con una incidencia de 1:1 000000 en la población general (Dewerchin y otros (2000) Thromb Haemost 83: 185 190). Aunque produce una tendencia de sangrado variable, los pacientes con una deficiencia de FX grave tienden a ser los más seriamente afectados entre los pacientes con defectos de coagulación raros. La prevalencia de la deficiencia de FX heterocigótica es de aproximadamente 1:500, pero usualmente es asintomática clínicamente. In another particular embodiment, the clotting factor is an FX polypeptide. Coagulation Factor X (FX) is a vitamin K-dependent coagulation factor with structural similarities to Factor VII, prothrombin, Factor IX (FIX) and protein C. It is synthesized with a 40 residue pre-pro-sequence containing a hydrophobic signal sequence (Aa 1-31) that targets the protein for secretion. The propeptide is important in directing Y-carboxylation to the Factor X light chain. The circulating human FX zymogen is composed of 445 amino acids divided into four distinct domains that comprise an N-terminal domain rich in gamma-carboxyglutamic acid (Gla) , two EGF domains, and a C-terminal domain of trypsin-like serine protease. The mature two-chain form of the FX consists of a light chain (Aa41-179) and a heavy chain (Aa183-488) that are held together by a disulfide bridge (Cys172-Cys342). The light chain contains 11 Gla residues, which are important for Ca2 + -dependent binding of FX to negatively charged phospholipid membranes. Wild-type human coagulation factor X has two N-glycosylation sites (Asn221 and Asn231) and two O-glycosylation sites (Thr199 and Thr211) in the activation peptide. P-Hydroxylation occurs in Asp103 in the first EGF domain, resulting in phidroxiaspartic acid (Hya). FX activation occurs by limited proteolysis in Arg234-Ile235 which releases an 52 amino acid activation peptide (Aa 183-234). In the extrinsic pathway, this occurs after exposure of tissue factor (TF) in the subendothelial cell membrane to plasma and subsequent activation of FVIIa. Activation through the intrinsic pathway occurs with the interaction of Factor IXa, Factor Villa, calcium and acid phospholipid surfaces. Prothrombin is the most important substrate of Factor Xa, but activation requires Factor Va cofactor of FXa, calcium and acid phospholipic surface. FX deficiency is a rare autosomal recessive bleeding disorder with an incidence of 1: 1,000,000 in the general population (Dewerchin et al. (2000) Thromb Haemost 83: 185 190). Although it produces a variable bleeding tendency, patients with severe FX deficiency tend to be the most seriously affected among patients with rare coagulation defects. The prevalence of heterozygous FX deficiency is approximately 1: 500, but it is usually clinically asymptomatic.
Un ejemplo de un “FX de tipo silvestre” es la molécula FX humana de longitud completa, como se muestra en la SEQ ID NO: 163.An example of a "wild-type FX" is the full-length human FX molecule, as shown in SEQ ID NO: 163.
“Polipéptido Factor X”, en la presente descripción, se refiere a cualquier molécula de proteína Factor X funcional capaz de activar la trombina, lo que incluye fragmentos, análogos y derivados de la SEQ ID NO: 163."Factor X polypeptide", in the present description, refers to any functional Factor X protein molecule capable of activating thrombin, including fragments, analogs and derivatives of SEQ ID NO: 163.
El término “análogo de FX”, como se usa en la presente descripción, pretende designar el Factor FX que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 163, en donde uno o más aminoácidos de la proteína parental se han sustituido por otro aminoácido y/o en donde uno o más aminoácidos de la proteína parental se han eliminado y/o en donde uno o más aminoácidos se han insertado en la proteína y/o en donde uno o más aminoácidos se han añadido a la proteína parental. Dicha adición puede tener lugar ya sea en el extremo N terminal o en el extremo C terminal de la proteína parental o en ambos. El “análogo” o “análogos” dentro de esta definición todavía tiene actividad FX en su forma activada. En una modalidad, una variante es al menos 90 % idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 163. En una modalidad adicional, una variante es al menos 95 % idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 163. Como se usa en la presente descripción, cualquier referencia a posiciones específicas se refiere a la posición correspondiente en la SEQ ID NO: 163.The term "FX analog," as used herein, is intended to designate FX Factor having the sequence of SEQ ID NO: 163, wherein one or more amino acids of the parent protein have been replaced by another amino acid and / or where one or more amino acids have been removed from the parent protein and / or where one or more amino acids have been inserted into the protein and / or where one or more amino acids have been added to the parent protein. Such addition can take place either at the N-terminus or at the C-terminus of the parent protein, or both. The "analog" or "analogs" within this definition still have FX activity in its activated form. In one embodiment, a variant is at least 90% identical with the sequence of SEQ ID NO: 163. In a further embodiment, a variant is at least 95% identical with the sequence of SEQ ID NO: 163. As used in In this description, any reference to specific positions refers to the corresponding position in SEQ ID NO: 163.
El FX puede derivarse de plasma o producirse de manera recombinante, mediante el uso de métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, gammacarboxilación y otras modificaciones postraduccionales puede variar en dependencia de la célula huésped elegida y sus condiciones de crecimiento. FX can be derived from plasma or produced recombinantly, using well-known production and purification methods. The degree and location of glycosylation, gammacarboxylation, and other post-translational modifications can vary depending on the chosen host cell and its growth conditions.
En otra modalidad particular, el factor de coagulación es un polipéptido del Factor XI. El Factor XI (FXI) es el zimógeno de una proteasa de coagulación sanguínea, el Factor XIa (FXIa), que contribuye a la hemostasia mediante la activación del Factor IX. El factor se produce por el hígado (Emsley y otros (2010) Blood 115:2569-77). La proteína es un dímero unido por enlaces disulfuro de 160 kDa de 607 subunidades de aminoácidos idénticas, donde cada una contiene 4 repeticiones de 90 o 91 aminoácidos denominadas dominios manzana (desde el N terminal: A1: Aa 20-103, A2: Aa 110-193, A3: Aa 200-283, A4: Aa 291-374) y un dominio C terminal catalítico similar a tripsina. La proteína se expresa con un péptido señal Aa1-18. La estructura es diferente a las de las proteasas de coagulación dependientes de vitamina K bien caracterizadas. El FXI circula en sangre como un complejo con el kininógeno de alto peso molecular (HK). La precalicreína (PK), el zimógeno de la proteasa calicreína, es un homólogo monomérico del fX i con la misma estructura de dominio que también circula en complejo con el HK. El factor zimógeno se activa en Factor XIa por el Factor Xlla (FXIIa), la trombina, y también es autocatalítico. La activación de la escisión se produce en el bucle de activación que contiene el sitio de escisión Arg369-lle370. Dado que la deficiencia en FXI provoca un sangrado relativamente leve, el FXI tiene un papel especulativo en la generación temprana de fibrina. Se postula que el FXIa es parte de un bucle de retroalimentación que mantiene la generación de trombina a través de la activación del FIX para consolidar la coagulación. Determinados tejidos con actividad fibrinolítica sólida parecen importantes para la actividad de FXIa, lo que incluye orofaringe y tracto urinario, ya que estos son sitios comunes de sangrado en pacientes deficientes en FXI. La deficiencia de FXI congénita se asocia con un trastorno de sangrado leve a moderado. Se han informado más de 180 otras mutaciones génicas de FXI asociadas con la deficiencia de FXI (http://www.factorxi.org, http://www.isth.org), lo que incluye más de 100 sustituciones de aminoácidos simples (sin sentido). La deficiencia grave prevalece en las personas de ascendencia judía (Seligsohn y otros (2007) Thromb Haemost. 98:84-89). La tasa de portador es de aproximadamente 5 % en judíos Ashkenazi, con deficiencia grave (homocigota) encontrada en 1 de cada 450 personas. Como un ejemplo, una mutación severa en Glu117Stop resulta en una proteína truncada y los homocigotos carecen completamente de antígeno FXI plasmático.In another particular embodiment, the clotting factor is a Factor XI polypeptide. Factor XI (FXI) is the zymogen of a blood coagulation protease, Factor XIa (FXIa), which contributes to hemostasis by activating Factor IX. The factor is produced by the liver (Emsley et al. (2010) Blood 115: 2569-77). The protein is a 160 kDa disulfide bond-linked dimer of 607 identical amino acid subunits, where each contains 4 repeats of 90 or 91 amino acids called apple domains (from terminal N: A1: Aa 20-103, A2: Aa 110 -193, A3: Aa 200-283, A4: Aa 291-374) and a trypsin-like catalytic C-terminal domain. The protein is expressed with a signal peptide Aa1-18. The structure is different from that of well-characterized vitamin K-dependent coagulation proteases. FXI circulates in the blood as a complex with high molecular weight kininogen (HK). Precalicrein (PK), the zymogen of kallikrein protease, is a monomeric homolog of fX i with the same domain structure that also circulates in complex with HK. The zymogen factor is activated in Factor XIa by Factor Xlla (FXIIa), thrombin, and is also autocatalytic. Cleavage activation occurs in the activation loop that contains the Arg369-lle370 cleavage site. Since FXI deficiency causes relatively slight bleeding, FXI has a speculative role in the early generation of fibrin. FXIa is postulated to be part of a feedback loop that maintains thrombin generation through FIX activation to consolidate coagulation. Certain tissues with solid fibrinolytic activity appear important for FXIa activity, including the oropharynx and urinary tract, as these are common sites of bleeding in FXI-deficient patients. Congenital FXI deficiency is associated with a mild to moderate bleeding disorder. More than 180 other FXI gene mutations associated with FXI deficiency have been reported (http://www.factorxi.org, http://www.isth.org), including more than 100 simple amino acid substitutions ( without sense). Severe deficiency prevails in people of Jewish descent (Seligsohn et al. (2007) Thromb Haemost. 98: 84-89). The carrier rate is approximately 5% in Ashkenazi Jews, with severe (homozygous) deficiency found in 1 of every 450 people. As an example, a severe mutation in Glu117Stop results in a truncated protein and homozygotes are completely lacking in plasma FXI antigen.
El Factor XIa activa el Factor IX mediante la escisión selectiva de Arg145-Ala146 y Arg180-Val181.Factor XIa activates Factor IX by selective cleavage of Arg145-Ala146 and Arg180-Val181.
El término “análogo de FXI”, como se usa en la presente descripción, pretende designar el Factor XI que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 165, en donde uno o más aminoácidos de la proteína parental se han sustituido por otro aminoácido y/o en donde uno o más aminoácidos de la proteína parental se han eliminado y/o en donde uno o más aminoácidos se han insertado en la proteína y/o en donde uno o más aminoácidos se han añadido a la proteína parental. Dicha adición puede tener lugar ya sea en el extremo N terminal o en el extremo C terminal de la proteína parental o en ambos. El “análogo” o “análogos” dentro de esta definición todavía tiene actividad FX en su forma activada. En una modalidad, una variante es al menos 90 % idéntica con la secuencia de la SEQ ID NO: 165. En una modalidad adicional, una variante es al menos 95 % idéntica con la secuencia de SEQ ID NO: 165. Como se usa en la presente descripción, cualquier referencia a una posición específica se refiere a la posición correspondiente en la SEQ ID NO: 165.The term "FXI analog", as used in the present description, is intended to designate Factor XI having the sequence of SEQ ID NO: 165, wherein one or more amino acids of the parent protein have been replaced by another amino acid and / or where one or more amino acids have been removed from the parent protein and / or where one or more amino acids have been inserted into the protein and / or where one or more amino acids have been added to the parent protein. Such addition can take place either at the N-terminus or at the C-terminus of the parent protein, or both. The "analog" or "analogs" within this definition still have FX activity in its activated form. In one embodiment, a variant is at least 90% identical with the sequence of SEQ ID NO: 165. In a further embodiment, a variant is at least 95% identical with the sequence of SEQ ID NO: 165. As used in In the present description, any reference to a specific position refers to the corresponding position in SEQ ID NO: 165.
El FXI puede derivarse de plasma o producirse de manera recombinante, mediante el uso de métodos de producción y purificación bien conocidos. El grado y ubicación de la glicosilación, y otras modificaciones postraduccionales puede variar en dependencia de la célula huésped elegida y sus condiciones de crecimiento.FXI can be derived from plasma or produced recombinantly, using well known production and purification methods. The degree and location of glycosylation, and other post-translational modifications can vary depending on the chosen host cell and its growth conditions.
El término "identidad", como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más proteínas, según se determina mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" significa, además, el grado de relación de las secuencias entre las polipéptidos, según se determina por la cantidad de coincidencias entre las cadenas de dos o más residuos de aminoácidos. La "identidad" mide el por ciento de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con los alineamientos de huecos (en caso de existir) dirigidos por un modelo matemático en particular o un programa de computadora (es decir, "algoritmos"). La identidad de polipéptidos relacionados puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos. Dichos métodos incluyen los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo y otros, SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988). The term "identity", as known in the art, refers to a relationship between the sequences of two or more proteins, as determined by comparing the sequences. In the art, "identity" further means the degree of sequence relationship between the polypeptides, as determined by the number of matches between the chains of two or more amino acid residues. "Identity" measures the percent of identical matches between the smallest of two or more sequences with gap alignments (if any) driven by a particular mathematical model or computer program (ie, "algorithms" ). The identity of related polypeptides can be easily calculated by known methods. Such methods include those described in Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).
Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas de computadora disponibles públicamente. Los métodos de programas de computadora preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, lo que incluye GAP (Devereux y otros, Nucl. Acid. Res., 12, 387, (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul y otros, NCB/NLM/NIH Bethesda, Md.The preferred methods for determining identity are designed to give the greatest match between the analyzed sequences. The methods for determining identity are described in publicly available computer programs. Preferred computer program methods of determining identity between two sequences include the GCG program package, including GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12, 387, (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)). The BLASTX program is publicly available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Manual, Altschul et al., NCB / NLM / NIH Bethesda, Md.
20894; Altschul y otros, más arriba). También puede usarse el bien conocido algoritmo de Smith Waterman para determinar la identidad.20894; Altschul et al., Above). The well-known Smith Waterman algorithm can also be used to determine identity.
Por ejemplo, mediante el uso del algoritmo informático GAP (Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), dos polipéptidos, para los cuales se va a determinar el por ciento de identidad de secuencia, se alinean para una coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (el "rango coincidente", según se determina por el algoritmo). Una penalización por abertura de hueco (que se calcula como 3 veces la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación en particular) y una penalización por extensión del hueco (que es usualmente {la fracción (1/10)} veces la penalización por abertura de hueco), así como también una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan junto con el algoritmo. El algoritmo también usa una matriz de comparación estándar (ver Dayhoff y otros, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup.3 (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff y otros, Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU., 89, 10915-10919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62).For example, using the GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.) Algorithm, two polypeptides, for which percent sequence identity is to be determined, are aligned for optimal match of their respective amino acids (the "matching range", as determined by the algorithm). A gap opening penalty (calculated as 3 times the average diagonal; the "average diagonal" is the average of the diagonal of the comparison matrix used; the "diagonal" is the score or number assigned to each match perfect amino acid for the particular comparison matrix) and a gap extension penalty (which is usually {fraction (1/10)} times the gap opening penalty), as well as a comparison matrix such as PAM 250 or BLOSUM 62 are used in conjunction with the algorithm. The algorithm also uses a standard comparison matrix (see Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup. 3 (1978) for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89, 10915-10919 (1992) for BLOSUM comparison matrix 62).
Los parámetros preferidos para una comparación de secuencias de péptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y otros, J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970); Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff y otros, PNAS EE.UU. 89, 10915-10919 (1992); Penalización por hueco: 12, Penalización por longitud del hueco: 4, Umbral de similitud: 0.Preferred parameters for a peptide sequence comparison include the following: Algorithm: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970); Comparison matrix: BLOSUM 62 by Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915-10919 (1992); Gap penalty: 12, Gap length penalty: 4, Similarity threshold: 0.
El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros predeterminados para las comparaciones de proteínas (junto con sin penalización por huecos en los extremos) mediante el uso del algoritmo GAP.The GAP program is useful with the above parameters. The parameters mentioned above are the default parameters for protein comparisons (along with no penalty for end gaps) using the GAP algorithm.
Por lo tanto, las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción comprenden (i) al menos un componente del factor de coagulación y (ii) un anticuerpo o fragmento de este capaz de unirse a un receptor, y/o un fragmento de este, en donde el receptor se presenta solamente (en el sentido no ubicuo de la palabra) en la superficie de plaquetas activadas. En una modalidad preferida, dicho receptor es el TLT-1. Las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción se modifican, preferentemente, de manera que sus partes constituyentes pueden funcionar independientemente una de otra. Por ejemplo, dicho componente del factor de coagulación es capaz de regular positivamente la coagulación de la sangre. Igualmente, dicho componente de “anticuerpo” es, preferentemente, capaz de unirse a un receptor tal como el TLT-1, sin impedimento por la presencia de dicho componente del factor de coagulación. El extremo carboxi del componente del factor de coagulación puede unirse covalentemente al extremo amino del componente de anticuerpo del constructo, o viceversa. Dicho componente de anticuerpo del constructo, preferentemente, no se unirá o demostrará poca afinidad por cualquier otro receptor desencadenante expresado en células mieloides (TREM). El constructo puede o no comprender un enlazador entre dicho factor de coagulación y dichos constituyentes de anticuerpos. Dicho enlazador opcional puede ser uno cualquiera de los enlazadores descritos en la Tabla 3, o puede ser cualquier otro enlazador que se une tanto al factor de coagulación como a las partes constituyentes del anticuerpo del constructo, de manera que ambos sean funcionales. En una modalidad, el factor de coagulación y los componentes anti-TLT-1 se expresan como proteínas de fusión. En una modalidad, el factor de coagulación y los componentes anti-TLT-1 se conjugan químicamente.Therefore, the procoagulant proteins described in the present description comprise (i) at least one component of the coagulation factor and (ii) an antibody or fragment thereof capable of binding to a receptor, and / or a fragment of this, where the receptor appears only (in the non-ubiquitous sense of the word) on the surface of activated platelets. In a preferred embodiment, said receptor is TLT-1. The procoagulant proteins described in the present description are preferably modified so that their constituent parts can function independently of each other. For example, said coagulation factor component is capable of positively regulating blood clotting. Likewise, said "antibody" component is preferably capable of binding to a receptor such as TLT-1, without hindrance by the presence of said coagulation factor component. The carboxy terminus of the coagulation factor component may be covalently attached to the amino terminus of the antibody component of the construct, or vice versa. Said antibody component of the construct preferably will not bind or demonstrate low affinity for any other myeloid cell expressed trigger receptor (TREM). The construct may or may not comprise a linker between said coagulation factor and said antibody constituents. Said optional linker can be any one of the linkers described in Table 3, or it can be any other linker that binds both the coagulation factor and the constituent parts of the antibody of the construct, so that both are functional. In one embodiment, the clotting factor and anti-TLT-1 components are expressed as fusion proteins. In one embodiment, the clotting factor and the anti-TLT-1 components are chemically conjugated.
Las proteínas procoagulantes en donde la parte (ii) es un mAb pueden comprender dos polipéptidos del factor de coagulación (parte (i)). El factor de coagulación puede fusionarse a una HC del mAb; el factor de coagulación puede fusionarse a una LC del mAb. El factor de coagulación puede fusionarse a un anticuerpo, o fragmento de este, que, a su vez, se fusiona a una HC del mAb o a una LC del mAb.Procoagulant proteins where part (ii) is a mAb can comprise two clotting factor polypeptides (part (i)). The clotting factor can be fused to an HC in the mAb; the clotting factor can be fused to an LC of the mAb. The clotting factor can be fused to an antibody, or fragment thereof, which, in turn, fuses to an HC of the mAb or to an LC of the mAb.
Por lo tanto, una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido FV y (ii) un anticuerpo, o fragmento de este, que es capaz de unirse al TLT-1.Therefore, a procoagulant protein of the present invention may comprise (i) at least one FV polypeptide and (ii) an antibody, or fragment thereof, that is capable of binding to TLT-1.
Una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido FVII y (ii) un anticuerpo, o fragmento de este, que es capaz de unirse al TLT-1.A procoagulant protein of the present invention may comprise (i) at least one FVII polypeptide and (ii) an antibody, or fragment thereof, that is capable of binding to TLT-1.
Una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido FVIII y (ii) un anticuerpo, o fragmento de este, que es capaz de unirse al TLT-1.A procoagulant protein of the present invention may comprise (i) at least one FVIII polypeptide and (ii) an antibody, or fragment thereof, that is capable of binding to TLT-1.
Una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido FIX y (ii) un anticuerpo, o fragmento de este, que es capaz de unirse al TLT-1.A procoagulant protein of the present invention may comprise (i) at least one FIX polypeptide and (ii) an antibody, or fragment thereof, that is capable of binding to TLT-1.
Una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido FX y (ii) un anticuerpo, o fragmento de este, que es capaz de unirse al TLT-1.A procoagulant protein of the present invention may comprise (i) at least one FX polypeptide and (ii) an antibody, or fragment thereof, that is capable of binding to TLT-1.
Una proteína procoagulante de la presente invención puede comprender (i) al menos un polipéptido FXI y (ii) un anticuerpo, o fragmento de este, que es capaz de unirse al TLT-1.A procoagulant protein of the present invention may comprise (i) at least one FXI polypeptide and (ii) an antibody, or fragment thereof, that is capable of binding to TLT-1.
Las proteínas procoagulantes pueden comprender, además, un enlazador. Ejemplos no limitantes de secuencias de aminoácidos enlazadoras, que pueden usarse cuando las proteínas procoagulantes se fabrican como proteínas de fusión, se muestran en la Tabla 3. Por lo tanto, dicho enlazador puede ser L1. El enlazador puede ser L2. El enlazador puede ser L3. El enlazador puede ser L4. El enlazador puede ser L5. El enlazador puede ser L6. El enlazador puede ser L7. El enlazador puede ser L8. El enlazador puede ser L9. El enlazador puede ser L10.Procoagulant proteins may further comprise a linker. Non-limiting examples of linker amino acid sequences, which can be used when procoagulant proteins are made as fusion proteins, are shown in Table 3. Therefore, said linker may be L1. The linker can be L2. The linker can be L3. The linker can be L4. The linker can be L5. The linker can be L6. The linker can be L7. The linker can be L8. The linker can be L9. The linker can be L10.
Tabla 3: Ejemplos no limitantes de enlazadores opcionalesTable 3: Non-limiting examples of optional linkers
Como se mencionó anteriormente, la parte extracelular del TLT-1 se compone de un dominio similar a inmunoglobulina y un tallo. Las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción pueden ser capaces de unirse a cualquiera de estos. Cuando la parte (ii) de la proteína procoagulante es capaz de unirse al dominio similar a inmunoglobulina, un enlazador más largo puede permitir a la parte (i) de dicha proteína de fusión adoptar una posición y orientación relevante funcionalmente sobre la superficie de la plaqueta activada, lo que facilita de esta manera su función.As mentioned above, the extracellular part of TLT-1 is made up of an immunoglobulin-like domain and a stem. The procoagulant proteins described in the present description may be capable of binding to any of these. When part (ii) of the procoagulant protein is capable of binding to the immunoglobulin-like domain, a longer linker may allow part (i) of said fusion protein to adopt a functionally relevant position and orientation on the platelet surface activated, thus facilitating its function.
Una proteína procoagulante que es capaz de unirse al tallo del TLT-1 está adyacente a la membrana de plaquetas. Una proteína procoagulante que es capaz de unirse al tallo puede comprender un enlazador, pero la inclusión de un enlazador no afecta necesariamente la función de la parte del factor de coagulación de la proteína de fusión.A procoagulant protein that is capable of binding to the stem of TLT-1 is adjacent to the platelet membrane. A procoagulant protein that is capable of binding to the stem may comprise a linker, but the inclusion of a linker does not necessarily affect the function of the coagulation factor portion of the fusion protein.
Como se describió anteriormente, las proteínas procoagulantes descritas en la presente descripción son capaces de unirse a un receptor que se presenta en plaquetas que experimentan activación o que están completamente activas, tal como el TLT-1. El término "afinidad de unión" pretende referirse a la propiedad de las proteínas procoagulantes, o el componente de anticuerpo de las proteínas procoagulantes, de unirse o no a su objetivo. La afinidad de unión puede cuantificarse mediante la determinación de la constante de unión (Kd) para un componente de anticuerpo y su objetivo. De manera similar, la especificidad de unión de un componente de anticuerpo a su objetivo puede definirse en términos de las constantes de unión comparativas (Kd) del anticuerpo para su objetivo en comparación con la constante de unión con respecto al anticuerpo y otra molécula no objetivo.As described above, the procoagulant proteins described in the present disclosure are capable of binding to a receptor that occurs on platelets that undergo activation or are fully active, such as TLT-1. The term "binding affinity" is intended to refer to the property of procoagulant proteins, or the antibody component of procoagulant proteins, whether or not to bind to their target. Binding affinity can be quantified by determining the binding constant (K d ) for an antibody component and its target. Similarly, the binding specificity of an antibody component to its target can be defined in terms of the comparative binding constants (K d ) of the antibody for its target compared to the binding constant with respect to the antibody and another non-molecule. objective.
Típicamente, la Kd para el anticuerpo con respecto al objetivo será de 2 veces, preferentemente, 5 veces, con mayor preferencia, 10 veces menor que la Kd con respecto a la otra molécula no objetivo, tal como material no relacionado o material acompañante en el ambiente. Con mayor preferencia, la Kd será 50 veces menor, aún con mayor preferencia, 100 veces menor, y aún con mayor preferencia, 200 veces menos.Typically, the K d for the antibody relative to the target will be 2 times, preferably 5 times, more preferably, 10 times less than the K d relative to the other non-target molecule, such as unrelated material or companion material in the environment. More preferably, the K d will be 50 times less, even more preferably 100 times less, and even more preferably 200 times less.
El valor de esta constante de unión puede determinarse directamente mediante métodos bien conocidos, y puede calcularse incluso para mezclas complejas mediante métodos tales como aquellos, por ejemplo, expuestos en Caceci y otros (Byte 9:340-362, 1984). Por ejemplo, la Kd puede establecerse mediante el uso de un ensayo de unión a filtro de nitrocelulosa de doble filtro tal como el descrito por Wong y Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90, 5428-5432, 1993). Otros ensayos estándar para evaluar la capacidad de unión de anticuerpos hacia los objetivos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISA, transferencias de Western, RIA y análisis de citometría de flujo. La cinética de unión (por ejemplo, las constantes de tasa de asociación y de tasa de disociación) y la afinidad de unión del anticuerpo pueden evaluarse, además, mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como análisis de resonancia de plasmón de superficie (SPR).The value of this binding constant can be directly determined by well-known methods, and can be calculated even for complex mixtures by methods such as those, for example, set forth in Caceci et al. (Byte 9: 340-362, 1984). For example, K d can be established by using a double filter nitrocellulose filter binding assay such as that described by Wong and Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993). Other standard assays for evaluating antibody binding capacity to targets are known in the art and include, for example, ELISA, Western blots, RIA, and flow cytometric analysis. The binding kinetics (eg, association rate and dissociation rate constants) and binding affinity of the antibody can be further assessed by standard assays known in the art, such as surface plasmon resonance analysis ( SPR).
Puede realizarse un ensayo de unión competitiva en el que la unión del anticuerpo al objetivo se compara con la unión del objetivo por otro ligando conocido del objetivo, u otro anticuerpo.A competitive binding assay may be performed in which the binding of the antibody to the target is compared to the binding of the target to another known ligand to the target, or to another antibody.
Los valores de Kd para el anticuerpo, o fragmento de este, también pueden ser al menos 1 x 10'15 M, tal como al menos 1 x 10'14 M, tal como al menos 1 x 10'13 M, tal como al menos 1 x 10'12 M, tal como al menos 1 x 10'11 M, tal como al menos 1 x 10'10 M, tal como aproximadamente 3 x 10'9 M, tal como al menos 1 x 10'9 M, o al menos 1 x 10'8 M. Un anticuerpo puede tener una Kd (o Ki) por su objetivo de 1 x 10'7 M o menos, 1 x 10'8 M o menos o 1 x 10'9 M o menos. The K d values for the antibody, or fragment thereof, can also be at least 1 x 10'15 M, such as at least 1 x 10'14 M, such as at least 1 x 10'13 M, such as at least 1 x 10'12 M, such as at least 1 x 10'11 M, such as at least 1 x 10'10 M, such as approximately 3 x 10'9 M, such as at least 1 x 10'9 M, or at least 1 x 10'8 M. An antibody can have a Kd (or Ki) for its target of 1 x 10'7 M or less, 1 x 10'8 M or less, or 1 x 10'9 M or less.
Los valores de Kd preferidos para el anticuerpo, o fragmento de este, pueden ser 1 x 10'15 M a 1 x 10'14 M, tal como 1 x 10-14 M a 1 x 10-13 M 1 x 10'13 M a 1 x 10'12 M, tal como 1 x 10'12 M a 1 x 10'11 M, tal como 1 x 10'11 M a 1 x 10'10 M, tal como 1 x 10'10 M a 1 x 10'9 M tal como aproximadamente 3 x 10'9 M, tal como 1 x 10'9 M a 2 x 10'8 M.Preferred K d values for the antibody, or fragment thereof, may be 1 x 10'15 M to 1 x 10'14 M, such as 1 x 10-14 M to 1 x 10-13 M 1 x 10 ' 13 M to 1 x 10'12 M, such as 1 x 10'12 M to 1 x 10'11 M, such as 1 x 10'11 M to 1 x 10'10 M, such as 1 x 10'10 M at 1 x 10.9 M such as about 3 x 10.9 M, such as 1 x 10.9 M at 2 x 10.8 M.
Un anticuerpo o fragmento de este que se une específicamente a su objetivo puede unirse a su objetivo con una alta afinidad, tal como una Kd como se discutió anteriormente, y puede unirse a otras moléculas no objetivo con una menor afinidad. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a moléculas no objetivo con una Kd de 1 x 10'6 M o más, con mayor preferencia, 1 x 10'5 M o más, con mayor preferencia, 1 x 10'4 M o más, con mayor preferencia, 1 x 10'3 M o más, aún con mayor preferencia, 1 x 10'2 M o más. Una proteína procoagulante descrita en la presente descripción es, preferentemente, capaz de unirse a su objetivo con una afinidad que es al menos dos veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces o 10 000 veces o mayor que su afinidad por unirse a otra molécula no objetivo, tal como otras TREM diferentes de TLT-1.An antibody or fragment thereof that specifically binds to its target can bind to its target with high affinity, such as a K d as discussed above, and can bind to other non-target molecules with lower affinity. For example, the antibody can bind non-target molecules with a K d of 1 x 10.6 M or more, more preferably 1 x 10.5 M or more, more preferably 1 x 10.4 M or more , most preferably, 1 x 10'3 M or more, even more preferably, 1 x 10'2 M or more. A procoagulant protein described in the present disclosure is preferably capable of binding its target with an affinity that is at least twice, 10 times, 50 times, 100 times, 200 times, 500 times, 1000 times, or 10,000 times or greater than its affinity for binding to another non-target molecule, such as other TREMs other than TLT-1.
Los efectos funcionales de las proteínas procoagulantes de la invención pueden evaluarse por medio de diversos experimentos in vitro e in vivo. Los experimentos in vitro pueden diseñarse para evaluar la función de las proteínas de fusión como un todo, así como también sus partes de componente (i) de factor de coagulación y (ii) de anticuerpo. In vivo, las proteínas de fusión pueden analizarse en un modelo de sangrado de cola en ratones hemofílicos que se transfunden con plaquetas humanas. Además, in vivo, las proteínas de fusión pueden analizarse en un modelo de sangrado de cola en ratones hemofílicos con el gen TLT-1 humano insertado (“humanizado” con respecto al TLT-1). The functional effects of the procoagulant proteins of the invention can be evaluated by means of various in vitro and in vivo experiments . In vitro experiments can be designed to assess the function of fusion proteins as a whole, as well as their component parts (i) of coagulation factor and (ii) of antibody. In vivo, the fusion proteins can be analyzed in a tail bleed model in hemophiliac mice that are transfused with human platelets. In addition, in vivo, fusion proteins can be analyzed in a tail bleed model in hemophiliac mice with the inserted human TLT-1 gene ("humanized" to TLT-1).
Como se mencionó anteriormente, las proteínas procoagulantes pueden proporcionarse en forma de proteínas de fusión o conjugados químicos. En el caso anterior, la invención se refiere, además, a polinucleótidos que codifican las proteínas procoagulantes de la invención. Por lo tanto, un polinucleótido puede codificar cualquier proteína procoagulante como se describe en la presente descripción. Los términos “molécula de ácido nucleico” y “polinudeótido” se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de estos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento génico, ARN mensajero (ARNm), ADNc, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. Un polinucleótido puede proporcionarse en forma aislada o purificada.As mentioned above, procoagulant proteins can be provided in the form of fusion proteins or chemical conjugates. In the above case, the invention further relates to polynucleotides encoding the procoagulant proteins of the invention. Therefore, a polynucleotide can encode any protein. procoagulant as described in the present description. The terms "nucleic acid molecule" and "polynudeotide" are used interchangeably in the present description and refer to a polymeric form of nucleotides of any length, either deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or analogs thereof. Non-limiting examples of polynucleotides include a gene, a gene fragment, messenger RNA (mRNA), cDNA, recombinant polynucleotides, plasmids, vectors, DNA isolated from any sequence, RNA isolated from any sequence, nucleic acid probes, and primers. A polynucleotide can be provided in isolated or purified form.
Una secuencia de ácido nucleico que “codifica” un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vivo, cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de detención de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Para los propósitos de la invención, dichas secuencias de ácido nucleico pueden incluir ADNc a partir de ARNm viral, procariota o eucariota, secuencias genómicas de ADN o ARN viral o procariota, e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de terminación de la transcripción puede ubicarse en dirección 3' a la secuencia codificante.A nucleic acid sequence that "encodes" a selected polypeptide is a nucleic acid molecule that is transcribed (in the case of DNA) and translated (in the case of mRNA) into a polypeptide in vivo, when placed under control of appropriate regulatory sequences. The limits of the coding sequence are determined by an initiation codon at the 5 'end (amino) and a translation stop codon at the 3' end (carboxy). For the purposes of the invention, such nucleic acid sequences can include cDNA from viral, prokaryotic or eukaryotic mRNA, genomic viral or prokaryotic DNA or RNA sequences, and even synthetic DNA sequences. A transcription termination sequence can be located 3 'to the coding sequence.
Los polinucleótidos pueden sintetizarse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, como se describe a manera de ejemplo en Sambrook y otros (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press). Polynucleotides can be synthesized according to methods well known in the art, as described by way of example in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning-a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).
Las moléculas de ácido nucleico pueden proporcionarse en forma de un casete de expresión que incluye secuencias control unidas operativamente a la secuencia insertada, lo que permite de esta forma la expresión del anticuerpo in vivo. Estos casetes de expresión, a su vez, se proporcionan típicamente dentro de vectores (por ejemplo, plásmidos o vectores virales recombinantes). Dicho casete de expresión puede administrarse directamente a un sujeto huésped. Alternativamente, un vector que comprende un polinucleótido puede administrarse a un sujeto huésped. Preferentemente, el polinucleótido se prepara y/o se administra mediante el uso de un vector genético. Un vector adecuado puede ser cualquier vector que sea capaz de portar una cantidad suficiente de información genética, y permitir la expresión de un polipéptido de la invención.Nucleic acid molecules can be provided in the form of an expression cassette that includes control sequences operably linked to the inserted sequence, thereby allowing expression of the antibody in vivo. These expression cassettes, in turn, are typically provided within vectors (eg, plasmids or recombinant viral vectors). Said expression cassette can be administered directly to a host subject. Alternatively, a vector comprising a polynucleotide can be administered to a host subject. Preferably, the polynucleotide is prepared and / or administered through the use of a genetic vector. A suitable vector can be any vector that is capable of carrying a sufficient amount of genetic information, and allowing expression of a polypeptide of the invention.
La presente invención incluye, por lo tanto, vectores de expresión que comprenden dichas secuencias de polinucleótidos. Dichos vectores de expresión se construyen rutinariamente en la técnica de biología molecular y pueden implicar, por ejemplo, el uso de ADN plasmídico e iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados, tales como, por ejemplo, señales de poliadenilación que pueden ser necesarias, y que se ubican en la orientación correcta, para permitir la expresión de un péptido de la invención. Otros vectores adecuados serían evidentes para los expertos en la técnica. A manera de un ejemplo adicional con respecto a esto, nos referimos a Sambrook y otros.Therefore, the present invention includes expression vectors that comprise said polynucleotide sequences. Such expression vectors are routinely constructed in the molecular biology technique and may involve, for example, the use of plasmid DNA and initiators, promoters, enhancers, and other appropriate elements, such as, for example, polyadenylation signals that may be required, and that they are located in the correct orientation, to allow the expression of a peptide of the invention. Other suitable vectors would be apparent to those skilled in the art. By way of a further example regarding this, we refer to Sambrook and others.
La invención incluye, además, células aisladas que se han modificado para expresar proteínas de fusión de acuerdo con la invención. DichasThe invention further includes isolated cells that have been modified to express fusion proteins according to the invention. Said
células incluyen líneas celulares eucariotas superiores, transitorias, o preferentemente, estables, tales como células de mamíferos o células de insectos; células eucariotas inferiores, tales como levadura; o células procariotas tales como células bacterianas. Los ejemplos particulares de células que pueden modificarse mediante la inserción de vectores o casetes de expresión que codifican un constructo de la invención incluyen células HEK293T, CHO, HeLa y COS de mamíferos. Preferentemente, la línea celular seleccionada será una que no sólo es estable, sino que permite además la glicosilación madura y la expresión en la superficie celular de un polipéptido.cells include transient, or preferably stable, higher eukaryotic cell lines, such as mammalian cells or insect cells; lower eukaryotic cells, such as yeast; or prokaryotic cells such as bacterial cells. Particular examples of cells that can be modified by insertion of expression vectors or cassettes encoding a construct of the invention include mammalian HEK293T, CHO, HeLa and COS cells. Preferably, the selected cell line will be one that is not only stable, but also allows for mature glycosylation and expression on the cell surface of a polypeptide.
Dichas líneas celulares pueden cultivarse mediante el uso de métodos de rutina para producir una proteína de fusión o constructo como se describe en la presente descripción. Alternativamente, los polinucleótidos, casetes de expresión o vectores pueden administrarse a una célula a partir de un sujeto ex vivo y regresar después la célula al cuerpo del sujeto.Such cell lines can be cultured by using routine methods to produce a fusion protein or construct as described in the present disclosure. Alternatively, the polynucleotides, expression cassettes, or vectors can be administered to a cell from an ex vivo subject and then return the cell to the subject's body.
Alternativamente, las proteínas procoagulantes pueden obtenerse mediante conjugación química del anticuerpo (tal como un mAb), o un fragmento de este, y el factor de coagulación. En este caso, un enlazador entre las dos proteínas puede contener uno o más restos químicos que no se presentan en aquellos aminoácidos que se codifican por el ADN. Alternatively, the procoagulant proteins can be obtained by chemical conjugation of the antibody (such as a mAb), or a fragment thereof, and the coagulation factor. In this case, a linker between the two proteins may contain one or more chemical residues that are not present in those amino acids that are encoded by DNA.
En una modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende la estructura birradical con la estructuraIn one embodiment, a chemical moiety used in the linker comprises the bi-radical structure with the structure
en donde * muestra las posiciones de conexión de este birradical.where * shows the connection positions of this biradical.
El término “birradical” se refiere a un compuesto químico con electrones pares con dos centros radicales libres que actúan independientemente uno de otro. The term "biradical" refers to a chemical compound with even electrons with two free radical centers that act independently of each other.
En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende un polímero: una macromolécula compuesta de unidades estructurales repetidas que se conectan típicamente mediante enlaces químicos covalentes. Dicho polímero puede ser hidrófilo.In another embodiment, a chemical moiety used in the linker comprises a polymer: a macromolecule composed of repeating backbone units that are typically connected by covalent chemical bonds. Said polymer can be hydrophilic.
El término hidrófilo o "soluble en agua" se refiere a restos que tienen algún grado detectable de solubilidad en agua. Los métodos para detectar y/o cuantificar la solubilidad en agua se conocen bien en la técnica.The term hydrophilic or "water soluble" refers to moieties that have some detectable degree of water solubility. Methods for detecting and / or quantifying water solubility are well known in the art.
Los polímeros solubles en agua ilustrativos de acuerdo con la invención incluyen péptidos, sacáridos, (poli)éteres, (poli)aminas y ácidos (poli)carboxílicos. Los péptidos pueden tener secuencias mezcladas y componerse de un único aminoácido, por ejemplo, (poli)lisina. Un polisacárido ilustrativo es el ácido (poli)siálico. Un (poli)éter ilustrativo es el (poli)etilenglicol. La (poli)etilenimina es una poliamina ilustrativa, y el ácido (poli)acrílico es un ácido (poli)carboxílico representativo.Illustrative water soluble polymers in accordance with the invention include peptides, saccharides, (poly) ethers, (poly) amines, and (poly) carboxylic acids. Peptides can have mixed sequences and be composed of a single amino acid, eg, (poly) lysine. An illustrative polysaccharide is (poly) sialic acid. An illustrative (poly) ether is (poly) ethylene glycol. (Poly) ethyleneimine is an illustrative polyamine, and (poly) acrylic acid is a representative (poly) carboxylic acid.
El polímero hidrófilo de acuerdo con la presente invención es, preferentemente, de origen no natural. En un ejemplo, el grupo modificador de origen no natural es un grupo modificador polimérico, en el que al menos un resto polimérico no es de origen natural. En otro ejemplo, el grupo modificador de origen no natural es un carbohidrato modificado. El locus de funcionalización con el grupo modificador se selecciona de manera que no evita que el "azúcar modificado" se añada enzimáticamente a un polipéptido. "Azúcar modificado" se refiere, además, a cualquier resto glicosilo mimético que se funcionaliza con un grupo de modificación y que es un sustrato para una enzima natural o modificada, tal como una glicosiltransferasa.The hydrophilic polymer according to the present invention is preferably of non-natural origin. In one example, the unnatural origin modifier group is a polymeric modifier group, in which at least one polymeric moiety is not of natural origin. In another example, the modifier group of unnatural origin is a modified carbohydrate. The locus of functionalization with the modifier group is selected so that it does not prevent the "modified sugar" from being enzymatically added to a polypeptide. "Modified sugar" further refers to any mimetic glycosyl moiety that is functionalized with a modifying group and that is a substrate for a natural or modified enzyme, such as a glycosyltransferase.
Muchos otros polímeros también son adecuados para la invención. Las cadenas principales poliméricas que son no peptídicas y solubles en agua, son particularmente útiles en la invención. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen otros poli(alquilenglicoles), tales como poli(propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, poli(poliol oxietilado), poli(alcohol oléfmico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxipropilmetacrilamida), poli([alfa]-hidroxi ácido), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 5,629,384, la cual se incorpora como referencia en su totalidad, en la presente descripción, así como también, copolímeros, terpolímeros, y sus mezclas.Many other polymers are also suitable for the invention. Polymeric backbones that are non-peptidic and water soluble are particularly useful in the invention. Examples of suitable polymers include other poly (alkylene glycols), such as poly (propylene glycol) ("PPG"), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, poly (oxyethylated polyol), poly (olipemic alcohol), poly (vinylpyrrolidone), poly (hydroxypropylmethacrylamide) ), poly ([alpha] -hydroxy acid), poly (vinyl alcohol), polyphosphazene, polyoxazoline, poly (N-acryloylmorpholine), as described in US Patent No. 5,629,384, which is incorporated by reference in in their entirety, in the present description, as well as copolymers, terpolymers, and mixtures thereof.
El enlazador polimérico puede alterar una propiedad de la proteína procoagulante, tal como su biodisponibilidad, su actividad biológica o su vida media en el cuerpo.The polymeric linker can alter a property of the procoagulant protein, such as its bioavailability, its biological activity, or its half-life in the body.
El enlazador polimérico es, preferentemente, lineal.The polymeric linker is preferably linear.
Aunque el peso molecular de cada cadena polimérica individual puede variar, está típicamente en el intervalo de aproximadamente 1000 Da (1 kDa) a aproximadamente 40000 Da (40 kDa), tal como de aproximadamente 1000 Da a aproximadamente 12 000 Da; tal como de aproximadamente 2000 a aproximadamente 11 000 Da; tal como de aproximadamente 2000 a aproximadamente 3000 Da; de aproximadamente 3000 a aproximadamente 4000 Da; de aproximadamente 4000 a aproximadamente 5000 Da; de aproximadamente 5000 a aproximadamente 6000 Da; de aproximadamente 6000 a aproximadamente 7000 Da; de aproximadamente 7000 a aproximadamente 8000 Da; de aproximadamente 8000 a aproximadamente 9000 Da; de aproximadamente 9000 a aproximadamente 10000 Da; o de aproximadamente 10 000 a aproximadamente 11 000 Da. Debe entenderse que estos tamaños representan estimaciones en lugar de medidas exactas. De acuerdo con una modalidad preferida, las moléculas de acuerdo con la invención se conjugan con una población heterogénea de polímeros hidrófilos.Although the molecular weight of each individual polymer chain can vary, it is typically in the range of from about 1,000 Da (1 kDa) to about 40,000 Da (40 kDa), such as from about 1,000 Da to about 12,000 Da; such as from about 2,000 to about 11,000 Da; such as from about 2000 to about 3000 Da; from about 3000 to about 4000 Da; from about 4000 to about 5000 Da; from about 5000 to about 6000 Da; from about 6000 to about 7000 Da; from about 7000 to about 8000 Da; from about 8000 to about 9000 Da; from about 9000 to about 10000 Da; or from about 10,000 to about 11,000 Da. It should be understood that these sizes represent estimates rather than exact measurements. In accordance with a preferred embodiment, the molecules according to the invention are conjugated to a heterogeneous population of hydrophilic polymers.
En una modalidad particular, un resto químico usado en el enlazador comprende polietilenglicol (PEG).In a particular embodiment, a chemical moiety used in the linker comprises polyethylene glycol (PEG).
El término “PEG”, en la presente descripción, se refiere a un birradical que comprende la estructuraThe term "PEG", in the present description, refers to a biradical that comprises the structure
en donde n' es un entero mayor que 1.where n 'is an integer greater than 1.
El PEG se prepara mediante polimerización de óxido de etileno y está disponible comercialmente en un amplio intervalo de pesos moleculares. El PEG para su uso de acuerdo con la presente invención es, preferentemente, lineal. PEG is prepared by polymerization of ethylene oxide and is commercially available in a wide range of molecular weights. The PEG for use in accordance with the present invention is preferably linear.
Además, “PEG” puede referirse a un compuesto de polietilenglicol, o derivado de este, con o sin agentes de acoplamiento, restos de acoplamiento o activadores (por ejemplo, con un resto de ácido carboxílico/éster activo, ceto, alcoxiamina, tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, alquino, azida o maleimida). In addition, "PEG" can refer to or derived from a polyethylene glycol compound, with or without coupling agents, coupling moieties, or activators (eg, with an active carboxylic acid / ester moiety, keto, alkoxyamine, thiol, triflate, tresilate, aziridine, oxirane, alkyne, azide or maleimide).
En una modalidad particular, el PEG para su uso de acuerdo con la invención es monodisperso. En otra modalidad particular, el PEG para su uso de acuerdo con la invención es polidisperso.In a particular embodiment, the PEG for use in accordance with the invention is monodisperse. In another particular embodiment, the PEG for use according to the invention is polydisperse.
El PEG polidisperso se compone de moléculas de PEG que tienen diversos pesos moleculares. La distribución de tamaño puede caracterizarse estadísticamente por su peso molecular promedio ponderal (Mw) y su peso molecular promedio numérico (Mn), cuya relación se denomina índice de polidispersión (Mw/Mn) (ver por ejemplo, “Polymer Synthesis and Characterization”, J. A. Nairn, Universidad de Utah, 2003). El Mw y el Mn pueden medirse mediante espectroscopía de masa.Polydisperse PEG is made up of PEG molecules that have various molecular weights. The size distribution can be statistically characterized by its weight average molecular weight (Mw) and its numerical average molecular weight (Mn), whose relationship is called the polydispersity index (Mw / Mn) (see for example, “Polymer Synthesis and Characterization”, JA Nairn, University of Utah, 2003). Mw and Mn can be measured by mass spectroscopy.
El índice de polidispersión puede ser un número que es mayor o igual a uno y puede estimarse a partir de los datos cromatográficos de permeación en gel. Cuando el índice de polidispersión es 1, el producto es monodisperso y por lo tanto se compone de compuestos con un peso molecular único. Cuando el índice de polidispersión es mayor que 1, el polímero es polidisperso, y el índice de polidispersión indica cuán amplia es la distribución de polímeros con diferentes pesos moleculares. El índice de polidispersión aumenta típicamente con el peso molecular del PEG. En modalidades particulares, el índice de polidispersión del PEG para su uso de acuerdo con la invención es i) inferior a 1,06, ii) inferior a 1,05, iii) inferior a 1,04, iv) inferior a 1,03 o v) entre 1,02 y 1,03.The polydispersity index can be a number that is greater than or equal to one and can be estimated from the gel permeation chromatographic data. When the polydispersity index is 1, the product is monodisperse and therefore consists of compounds with a single molecular weight. When the polydispersity index is greater than 1, the polymer is polydispersed, and the polydispersity index indicates how wide the distribution of polymers with different molecular weights is. The polydispersity index typically increases with the molecular weight of the PEG. In particular embodiments, the polydispersity index of PEG for use according to the invention is i) less than 1.06, ii) less than 1.05, iii) less than 1.04, iv) less than 1.03 or v) between 1.02 and 1.03.
Se dispone de diferentes formas de PEG, en dependencia del iniciador usado para el proceso de polimerización. Different forms of PEG are available, depending on the initiator used for the polymerization process.
Numerosos métodos para la conjugación de sustituyentes de PEG se describen en Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 459 -476, Nature Reviews Drug Discovery, 2003, 2, 214-221 DOI:10.1038/nrd1033, Adv Polym Sci, 2006, 192, 95-134, DOI 10.1007/12_022, Springer-Verlag, Berlín Heidelberg, 2005, y referencias en ellas. Alternativamente, la conjugación del sustituyente polimérico hidrófilo podría llevarse a cabo mediante el uso de métodos enzimáticos. Dichos métodos son, por ejemplo, el uso de glicosiltransferasas como se describe en el documento WO2003/031464 o el uso de transglutaminasas como se describe en el documento WO2006134148.Numerous methods for conjugating PEG substituents are described in Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 459-476, Nature Reviews Drug Discovery, 2003, 2, 214-221 DOI: 10.1038 / nrd1033, Adv Polym Sci, 2006, 192 , 95-134, DOI 10.1007 / 12_022, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 2005, and references therein. Alternatively, the conjugation of the hydrophilic polymeric substituent could be carried out by using enzymatic methods. Such methods are, for example, the use of glycosyltransferases as described in WO2003 / 031464 or the use of transglutaminases as described in WO2006134148.
Para efectuar la unión covalente de la(s) molécula(s) polimérica(s) al polipéptido, los grupos hidroxilo terminales de la molécula polimérica se proporcionan en forma activada, es decir, con grupos funcionales reactivos. Las moléculas poliméricas activadas adecuadas se disponen comercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, EE.UU., Rapp Polymere GmbH, Tübingen, Alemania, o de PolyMASC Pharmaceuticals plc, Reino Unido. Alternativamente, las moléculas poliméricas pueden activarse por métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en el documento WO 90/13540. Los ejemplos específicos de polímeros de PEG activados se describen en la Patente de Estados Unidos Núm. 5,932,462 y la Patente de Estados Unidos Núm.To effect covalent attachment of the polymeric molecule (s) to the polypeptide, the terminal hydroxyl groups of the polymeric molecule are provided in activated form, i.e. with reactive functional groups. Suitable activated polymeric molecules are commercially available, for example, from Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA, Rapp Polymere GmbH, Tübingen, Germany, or PolyMASC Pharmaceuticals plc, UK. Alternatively, the polymeric molecules can be activated by conventional methods known in the art, for example, as described in WO 90/13540. Specific examples of activated PEG polymers are described in US Patent No. 5,932,462 and United States Patent No.
5,643,575. Además, las publicaciones siguientes describen moléculas de polímero útiles y/o productos químicos por PEGilación: WO2003/031464, WO2004/099231.5,643,575. In addition, the following publications describe useful polymer molecules and / or chemicals by PEGylation: WO2003 / 031464, WO2004 / 099231.
La conjugación del anticuerpo monoclonal, fragmento de este o factor de coagulación con las moléculas poliméricas activadas puede realizarse mediante el uso de cualquier método convencional, por ejemplo, como se describe en las referencias siguientes (que describen, además, los métodos adecuados para la activación de moléculas poliméricas): R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson y otros, (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y., 'Bioconjugate Techniques, Segunda Edición, Greg T. Hermanson, 2008, Amsterdam, Elsevier). El experto estará al tanto de que el método de activación y/o la química de conjugación a usarse depende del(de los) grupo(s) de unión del polipéptido (ejemplos de los cuales se proporcionaron adicionalmente anteriormente), así como también de los grupos funcionales del polímero (por ejemplo, que sean amina, hidroxilo, carboxilo, aldehído, sulfhidrilo, succinimidilo, maleimida, vinilsulfona o haloacetato). La PEGilación puede dirigirse hacia la conjugación a todos los grupos de unión disponibles en el polipéptido (es decir, dichos grupos de unión que se exponen en la superficie del polipéptido) o pueden dirigirse hacia uno o más grupos de unión específicos, por ejemplo, el grupo amino N-terminal. Además, la conjugación puede lograrse en una etapa o de manera escalonada.Conjugation of the monoclonal antibody, fragment thereof, or coagulation factor with the activated polymeric molecules can be carried out by using any conventional method, for example, as described in the following references (which further describe suitable methods for activation of polymeric molecules): RF Taylor, (1991), "Protein immobilization. Fundamental and applications", Marcel Dekker, NY; S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y., 'Bioconjugate Techniques, Second Edition, Greg T. Hermanson, 2008, Amsterdam, Elsevier). The skilled person will be aware that the activation method and / or conjugation chemistry to be used depends on the binding group (s) of the polypeptide (examples of which were provided further above), as well as on Functional groups of the polymer (eg, being amine, hydroxyl, carboxyl, aldehyde, sulfhydryl, succinimidyl, maleimide, vinylsulfone or haloacetate). PEGylation can be directed towards conjugation to all available binding groups on the polypeptide (i.e., those binding groups that are exposed on the surface of the polypeptide) or can be directed towards one or more specific binding groups, for example, the N-terminal amino group. In addition, conjugation can be accomplished in one step or in a staggered manner.
En otra modalidad, un resto químico usado como enlazador es el almidón de hidroxietilo. El término “almidón de hidroxietilo” (HES/HAES), como se usa en la presente descripción, se refiere a un derivado de almidón no iónico. Los diferentes tipos de almidones de hidroxietilo se describen típicamente por su peso molecular promedio, típicamente alrededor de 130 a 200 kDa.In another embodiment, a chemical moiety used as a linker is hydroxyethyl starch. The term "hydroxyethyl starch" (HES / HAES), as used herein, refers to a nonionic starch derivative. The different types of hydroxyethyl starches are typically described by their average molecular weight, typically around 130 to 200 kDa.
En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende ácido polisiálico.In another embodiment, a chemical moiety used in the linker comprises polysalic acid.
En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador se une a al menos una de las proteínas de un glicano: un polisacárido o un oligosacárido que se une a una proteína.In another embodiment, a chemical moiety used in the linker binds to at least one of the proteins in a glycan: a polysaccharide or an oligosaccharide that binds to a protein.
En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador se une a al menos una de las proteínas de un glicano ligado a O .In another embodiment, a chemical moiety used in the linker binds to at least one of the proteins in an O- linked glycan.
En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador se une a al menos una de las proteínas de un glicano ligado a N. In another embodiment, a chemical moiety used in the linker joins to the least one of the proteins of an N - linked glycan.
Tanto los N-glicanos como los O-glicanos se unen a proteínas tales como mAb y factores de coagulación mediante las células que producen estas proteínas. La maquinaria de N-glicosilación celular reconoce y glicosila señales de N-glicosilación (motivos N-X-S/T) en la cadena de aminoácidos, a medida que la proteína naciente se transloca desde el ribosoma al retículo endoplásmico (Kiely y otros 1976; Glabe y otros 1980). Igualmente, los O-glicanos se unen a sitios de O-glicosilación específicos en la cadena de aminoácidos, pero los motivos que desencadenan la O-glicosilación son mucho más heterogéneos que las señales de N-glicosilación, y nuestra capacidad para predecir sitios de O-glicosilación en las secuencias de aminoácidos todavía es inadecuada (Julenius y otros 2004). Los métodos de conjugación de polipéptidos con varios grupos poliméricos laterales se describen, por ejemplo, en el documento WO0331464.Both N-glycans and O-glycans bind to proteins such as mAbs and clotting factors through the cells that make these proteins. The cellular N-glycosylation machinery recognizes and glycosylates N-glycosylation signals (NXS / T motifs) in the amino acid chain, as the nascent protein translocates from the ribosome to the endoplasmic reticulum (Kiely et al. 1976; Glabe et al. 1980). Likewise, O-glycans bind to specific O-glycosylation sites in the amino acid chain, but the motives that trigger O-glycosylation are much more heterogeneous than N-glycosylation signals, and our ability to predict O sites Glycosylation in amino acid sequences is still inadequate (Julenius et al 2004). Conjugation methods of polypeptides with various side polymer groups are described, for example, in WO0331464.
En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende un resto químico, que se usa para unir dicho enlazador a al menos una de las proteínas con una estructura seleccionada de los birradicales:In another embodiment, a chemical moiety used in the linker comprises a chemical moiety, which is used to bind said linker to at least one of the proteins with a structure selected from the biradicals:
En una modalidad, el enlazador comprende la estructura birradical deIn one embodiment, the linker comprises the bi-radical structure of
en donde * muestra las posiciones de conexión de este birradical.where * shows the connection positions of this biradical.
En otra modalidad, el enlazador comprende la estructuraIn another embodiment, the linker comprises the structure
en donde * muestra las posiciones de conexión de este birradical.where * shows the connection positions of this biradical.
Un compuesto de la fórmula generalA compound of the general formula
en donde “mAb anti-TLT-1 (fragmento)” puede ser un mAb de tamaño completo contra TLT-1 o un fragmento o un análogo derivado de este intelectualmente, tal como un fragmento FAB o un sc-FAB con ninguna, una o más mutaciones puntuales, el enlazador puede ser un polímero soluble en agua tal como PEG, ácido polisiálico, o un almidón de hidroxietilo, y la proteína es cualquier proteína que se cree tiene una o más propiedades mejoradas cuando se une al mAb anti-TLT-1 (fragmento), puede prepararse, por ejemplo, en un procedimiento en dos etapas.wherein "anti-TLT-1 mAb (fragment)" can be a full-size mAb against TLT-1 or a fragment or an analogue derived from it intellectually, such as a FAB fragment or a sc-FAB with none, one or plus point mutations, the linker can be a water soluble polymer such as PEG, polysialic acid, or a hydroxyethyl starch, and the protein is any protein believed to have one or more enhanced properties when bound to the anti-TLT-1 mAb (fragment), can be prepared, for example, in a two-step procedure.
Durante la primera etapa, un enlazador, con dos grupos reactivos diferentes RS1 y RS2, puede unirse al mAb anti-TLT-1 (fragmento). La reacción puede ejecutarse con selectividad de sitio baja o de forma selectiva, de manera que RS1 solo reacciona en una o pocas posiciones del mAb anti-TLT-1 (fragmento). Como un ejemplo no exclusivo, RS1 podría ser un aldehído y reaccionar por aminación reductora solamente con el N-terminal del mAb anti-TLT-1 (fragmento) mediante aminación reductora, conocida por un experto en la técnica. En otro ejemplo no exclusivo, RS1 podría ser un grupo maleimida, que puede reaccionar con un tiol libre en el mAb anti-TLT-1 (fragmento).During the first stage, a linker, with two different reactive groups RS1 and RS2, can bind to the anti-TLT-1 mAb (fragment). The reaction can be run with low site selectivity or selectively, so that RS1 only reacts at one or a few positions of the anti-TLT-1 mAb (fragment). As a non-exclusive example, RS1 could be an aldehyde and react by reductive amination only with the N-terminus of the anti-TLT-1 mAb (fragment) by reductive amination, known to one skilled in the art. In another non-exclusive example, RS1 could be a maleimide group, which can react with a free thiol in the anti-TLT-1 mAb (fragment).
Durante la segunda etapa, el grupo reactivo RS2 puede hacerse reaccionar con baja selectividad de sitio o selectividad de sitio con una molécula FVIIa. Como un ejemplo no exclusivo, una reacción selectiva de sitio en FVIIa puede obtenerse cuando RS2 es un derivado de ácido siálico, que puede reaccionar en presencia de una enzima adecuada tal como ST3Gal-III con glicanos ligados a N, que no terminan exclusivamente con ácidos siálicos.During the second stage, the RS2 reactive group can be reacted with low site selectivity or site selectivity with an FVIIa molecule. As a non-exclusive example, a site selective reaction in FVIIa can be obtained when RS2 is a sialic acid derivative, which can react in the presence of a suitable enzyme such as ST3Gal-III with N-linked glycans, which do not exclusively terminate with acids sialics.
El orden de unión del enlazador a las dos proteínas, específicamente el mAb anti-TLT-1 (fragmento) y la proteína pueden cambiarse, lo que une de esta manera la molécula RS1-Enlazador-RS2 primero a la molécula de proteína y luego al mAb anti-TLT-1 (fragmento).The binding order of the linker to the two proteins, specifically the anti-TLT-1 mAb (fragment) and the protein, can be changed, thus binding the RS1-Linker-RS2 molecule first to the protein molecule and then to the anti-TLT-1 mAb (fragment).
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones y formulaciones que comprenden moléculas de la invención, tales como las proteínas de fusión, polinucleótidos, vectores y células descritos en la presente descripción. Por ejemplo, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas de fusión de la invención, formuladas junto con un portador aceptable farmacéuticamente.In another aspect, the present invention provides compositions and formulations comprising molecules of the invention, such as the fusion proteins, polynucleotides, vectors, and cells described in the present disclosure. For example, the invention provides a pharmaceutical composition comprising one or more fusion proteins of the invention, formulated together with a pharmaceutically acceptable carrier.
En consecuencia, un objetivo es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende dicho anticuerpo que se presenta en una concentración de 0,25 mg/ml a 250 mg/ml, y en donde dicha formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0. La formulación puede comprender, además, un sistema tampón, conservante(s), agente(s) de tonicidad, agente(s) quelante(s), estabilizantes y tensioactivos. El uso de conservantes, agentes isotónicos, agentes quelantes, estabilizantes y tensioactivos en las composiciones farmacéuticas se conoce bien por el experto. Puede hacerse referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19na edición, 1995.Accordingly, an objective is to provide a pharmaceutical formulation comprising said antibody that is presented in a concentration of 0.25 mg / ml to 250 mg / ml, and wherein said formulation has a pH of 2.0 to 10.0. The formulation may further comprise a buffer system, preservative (s), tonicity agent (s), chelating agent (s), stabilizers and surfactants. The use of preservatives, isotonic agents, chelating agents, stabilizers and surfactants in pharmaceutical compositions is well known to the person skilled in the art. Reference may be made to Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
En una modalidad, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa. Dicha formulación es típicamente una solución o una suspensión. El término “formulación acuosa” se define como una formulación que comprende al menos 50 % p/p de agua. Igualmente, el término “solución acuosa” se define como una solución que comprende al menos 50 % p/p de agua, y el término “suspensión acuosa” se define como una suspensión que comprende al menos 50 % p/p de agua.In one embodiment, the pharmaceutical formulation is an aqueous formulation. Said formulation is typically a solution or a suspension. The term "aqueous formulation" is defined as a formulation that comprises at least 50% w / w of water. Likewise, the term "aqueous solution" is defined as a solution comprising at least 50% w / w of water, and the term "aqueous suspension" is defined as a suspension comprising at least 50% w / w of water.
En otro aspecto, la composición farmacéutica es una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añaden solventes y/o diluyentes antes de su uso.In another aspect, the pharmaceutical composition is a lyophilized formulation, to which the doctor or patient adds solvents and / or diluents before use.
En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica comprende una solución acuosa de dicho anticuerpo, y un tampón, en donde el anticuerpo se presenta en una concentración de 1 mg/ml o más, y en donde dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.In a further aspect, the pharmaceutical formulation comprises an aqueous solution of said antibody, and a buffer, where the antibody is presented in a concentration of 1 mg / ml or more, and where said formulation has a pH of approximately 2.0 to about 10.0.
El término “tratamiento”, como se usa en la presente descripción, se refiere a la terapia médica de cualquier sujeto humano u otro animal que necesita de esto. Se espera que dicho sujeto se haya sometido a un examen físico por parte de un médico, o un profesional médico veterinario, quien ha dado un diagnóstico presuntivo o definitivo que indicaría que el uso de dicho tratamiento específico es beneficioso para la salud de dicho sujeto humano u otro animal. El tiempo y el propósito de dicho tratamiento pueden variar de un individuo a otro, de acuerdo con el status quo de la salud del sujeto. Además, se contempla la administración preventiva o profiláctica de anticuerpos, donde la prevención se define como retrasar o evitar el agravamiento de la manifestación de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno. Por lo tanto, dicho tratamiento puede ser profiláctico, paliativo, sintomático y/o curativo.The term "treatment", as used in the present description, refers to the medical therapy of any human or other animal subject in need of this. It is expected that said subject has undergone a physical examination by a doctor, or a veterinary medical professional, who has given a presumptive or definitive diagnosis that would indicate that the use of said specific treatment is beneficial to the health of said human subject. or another animal. The time and purpose of such treatment may vary from one individual to another, according to the status quo of the subject's health. In addition, preventive or prophylactic administration of antibodies is contemplated, where prevention is defined as delaying or preventing aggravation of the manifestation of one or more symptoms of a disease or disorder. Therefore, said treatment can be prophylactic, palliative, symptomatic and / or curative.
En términos de la presente invención, los tratamientos profilácticos, paliativos, sintomáticos y/o curativos pueden representar aspectos separados de la invención. In terms of the present invention, prophylactic, palliative, symptomatic and / or curative treatments may represent separate aspects of the invention.
Una coagulopatía que resulta en una tendencia hemorrágica aumentada puede provocarse por cualquier deficiencia cualitativa o cuantitativa de cualquier componente procoagulativo de la cascada de coagulación normal, o por cualquier regulación positiva de la fibrinólisis. Tales coagulopatías pueden ser congénitas y/o adquiridas y/o iatrogénicas y se identifican por un experto en la técnica.A coagulopathy resulting in an increased bleeding tendency can be caused by any qualitative or quantitative deficiency of any procoagulative component of the normal coagulation cascade, or by any positive regulation of fibrinolysis. Such coagulopathies can be congenital and / or acquired and / or iatrogenic and are identified by one skilled in the art.
Los ejemplos no limitantes de hipocoagulopatías congénitas son la hemofilia A, la hemofilia B, la deficiencia del Factor VII, la deficiencia del Factor X, la deficiencia del Factor XI, la enfermedad de von Willebrand y las trombocitopenias tales como la trombobastenia de Glanzmann y el síndrome de Bernard-Soulier.Non-limiting examples of congenital hypocoagulopathies are hemophilia A, hemophilia B, Factor VII deficiency, Factor X deficiency, Factor XI deficiency, von Willebrand disease, and thrombocytopenias such as Glanzmann's thrombobastenia and Bernard-Soulier syndrome.
Un ejemplo no limitante de una coagulopatía adquirida es la deficiencia de serina proteasa causada por la deficiencia de la vitamina K; tal deficiencia de la vitamina K puede provocarse por la administración de un antagonista de vitamina K, tal como la warfarina. La coagulopatía adquirida puede producirse, además, después de un trauma extenso. En este caso, conocido de cualquier otra manera como el “ciclo vicioso de sangramiento”, se caracteriza por hemodilución (trombocitopenia por dilución y dilución de factores de coagulación), hipotermia, consumo de factores de coagulación y trastornos metabólicos (acidosis). La terapia con fluidos y el aumento de la fibrinólisis pueden exacerbar esta situación. Dicha hemorragia puede ser de cualquier parte del cuerpo.A non-limiting example of acquired coagulopathy is serine protease deficiency caused by vitamin K deficiency; Such vitamin K deficiency can be caused by administration of a vitamin K antagonist, such as warfarin. Acquired coagulopathy can also occur after extensive trauma. In this case, otherwise known as the "vicious bleeding cycle", it is characterized by hemodilution (thrombocytopenia due to dilution and dilution of clotting factors), hypothermia, consumption of clotting factors and metabolic disorders (acidosis). Fluid therapy and increased fibrinolysis may exacerbate this situation. This bleeding can be from any part of the body.
La hemofilia A con “inhibidores” (es decir, aloanticuerpos contra el Factor VIII) y la hemofilia B con “inhibidores” (es decir, aloanticuerpos contra el Factor IX) son ejemplos no limitantes de coagulopatías que son parcialmente congénitas y parcialmente adquiridas.Hemophilia A with "inhibitors" (ie, alloantibodies against Factor VIII) and hemophilia B with "inhibitors" (ie, alloantibodies against Factor IX) are non-limiting examples of coagulopathies that are partially congenital and partially acquired.
Un ejemplo no limitante de una coagulopatía iatrogénica es una sobredosis de medicación anticoagulante - tal como heparina, aspirina, warfarina y otros inhibidores de la agregación plaquetaria - que pueden prescribirse para tratar la enfermedad tromboembólica. Un segundo ejemplo no limitante de coagulopatía iatrogénica es la que se induce por una terapia de fluido excesiva y/o inapropiada, tal como la que puede inducirse mediante una transfusión de sangre.A non-limiting example of iatrogenic coagulopathy is an overdose of anticoagulant medication - such as heparin, aspirin, warfarin, and other platelet aggregation inhibitors - that may be prescribed to treat thromboembolic disease. A second, non-limiting example of iatrogenic coagulopathy is that induced by excessive and / or inappropriate fluid therapy, such as that which can be induced by a blood transfusion.
En una modalidad, la hemorragia se asocia con la hemofilia A o B. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con la hemofilia A o B con inhibidores adquiridos. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con la enfermedad de von Willebrand. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con graves daños tisulares. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con trauma grave. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con cirugía. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con gastritis y/o enteritis hemorrágica. En otra modalidad, la hemorragia es un sangrado uterino profuso, tal como en el desprendimiento de la placenta. En otra modalidad, la hemorragia se produce en órganos con una posibilidad limitada de hemostasia mecánica, tal como intracraneal, intraauricular o intraocularmente. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con terapia anticoagulante.In one embodiment, bleeding is associated with hemophilia A or B. In another embodiment, bleeding is associated with hemophilia A or B with acquired inhibitors. In another modality, bleeding is associated with von Willebrand disease. In another modality, bleeding is associated with severe tissue damage. In another modality, bleeding is associated with severe trauma. In another modality, bleeding is associated with surgery. In another embodiment, bleeding is associated with gastritis and / or hemorrhagic enteritis. In another embodiment, the hemorrhage is profuse uterine bleeding, such as in placental abruption. In another embodiment, bleeding occurs in organs with a limited chance of mechanical hemostasis, such as intracranial, intraauricular, or intraocularly. In another modality, bleeding is associated with anticoagulant therapy.
En una modalidad adicional, la hemorragia puede asociarse con trombocitopenia. En individuos con trombocitopenia, los constructos descritos en la presente descripción pueden administrarse conjuntamente con plaquetas.In an additional modality, bleeding can be associated with thrombocytopenia. In individuals with thrombocytopenia, the constructs described in the present description can be co-administered with platelets.
La siguiente es una lista no limitante de modalidades de la presente invención:The following is a non-limiting list of embodiments of the present invention:
Modalidad 1: Una proteína procoagulante que comprende (i) al menos un factor de coagulación, unido covalentemente a (ii) un anticuerpo, o fragmento de este, que es capaz de unirse al (iii) TLT-1, y/o un fragmento o variante de este. Modalidad 2: La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 1, en donde (iii) es TLT-1, o un fragmento o variante de este.Mode 1: A procoagulant protein comprising (i) at least one clotting factor, covalently linked to (ii) an antibody, or fragment thereof, that is capable of binding to (iii) TLT-1, and / or a fragment or variant of this. Mode 2: The procoagulant protein according to mode 1, where (iii) is TLT-1, or a fragment or variant thereof.
Modalidad 3: La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 2, en donde (iii) es TLT-1 (16-162).Modality 3: The procoagulant protein according to modality 2, where (iii) is TLT-1 (16-162).
Modalidad 4:La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 2, en donde (iii) es TLT-1 (20-125).Modality 4: The procoagulant protein according to modality 2, where (iii) is TLT-1 (20-125).
Modalidad 5:La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 2, en donde (iii) es TLT-1 (126-162).Modality 5: The procoagulant protein according to modality 2, where (iii) is TLT-1 (126-162).
Modalidad 6: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-2, en donde (i) es una serina proteasa o un derivado de esta.Modality 6: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-2, wherein (i) is a serine protease or a derivative thereof.
Modalidad 7: La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 3, en donde (i) es un polipéptido del Factor VII. Modalidad 8: La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 3, en donde (i) es un polipéptido del Factor IX. Modalidad 9: La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 3, en donde (i) es un polipéptido del Factor X. Modalidad 10: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-2, en donde (i) es un polipéptido del Factor V.Modality 7: The procoagulant protein according to modality 3, where (i) is a Factor VII polypeptide. Mode 8: The procoagulant protein according to mode 3, wherein (i) is a Factor IX polypeptide. Modality 9: The procoagulant protein according to modality 3, where (i) is a Factor X polypeptide. Modality 10: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-2, where (i) is a Factor V polypeptide.
Modalidad 11: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-2, en donde (i) es un polipéptido del Factor VIII. Modality 11: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-2, wherein (i) is a Factor VIII polypeptide.
Modalidad 12: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-2, en donde (i) es un polipéptido del Factor XI.Mode 12: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-2, wherein (i) is a Factor XI polypeptide.
Modalidad 13: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-6, en donde (ii) es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de este.Modality 13: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-6, wherein (ii) is a monoclonal antibody or a fragment thereof.
Modalidad 14: La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 10, en donde (ii) es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 , un fragmento Fab', un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento ScFv, un fragmento dAb o una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada.Modality 14: The procoagulant protein according to modality 10, where (ii) is a Fab fragment, a F (ab ') 2 fragment, a Fab' fragment, an Fd fragment, an Fv fragment, a ScFv fragment, a dAb fragment or an isolated Complementarity Determining Region (CDR).
Modalidad 15: La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 11, en donde (ii) es un fragmento Fab.Mode 15: The procoagulant protein according to mode 11, where (ii) is a Fab fragment.
Modalidad 16: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15, en donde el epítopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, L63, G64, G65, G66, L67, L68, G89, A90, R91, G92, P93, Q94, I95 y L96 de la SEQ ID NO: 5.Modality 16: The procoagulant protein according to any one of modalities 13-15, wherein the epitope of (ii) comprises one or more residues selected from the group consisting of V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23 , Q24, D25, V26, K27, A28, L63, G64, G65, G66, L67, L68, G89, A90, R91, G92, P93, Q94, I95 and L96 of SEQ ID NO: 5.
Modalidad 17: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15, en donde (ii) es un anticuerpo, o un fragmento de este, que es capaz de unirse al mismo epítopo que el mAb0023.Modality 17: The procoagulant protein according to any one of modalities 13-15, wherein (ii) is an antibody, or a fragment thereof, that is capable of binding to the same epitope as mAb0023.
Modalidad 18: Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16-17, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Mode 18: A procoagulant protein according to any of modalities 16-17, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (DYFMY) de la SEQ ID NO: 34, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (DYFMY) of SEQ ID NO: 34, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) de la SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) of SEQ ID NO: 34, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 129 (NKNWDDYIDMDY) de la SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 129 (NKNWDDYIDMDY) of SEQ ID NO: 34, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
Modalidad 19:Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16-18, en donde la cadena ligera de (ii) comprende:Mode 19: A procoagulant protein according to any of modalities 16-18, wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) de la SEQ ID NO: 35, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 44 to 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) of SEQ ID NO: 35, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 76 a 82 (WASTRES) de la SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 76 to 82 (WASTRES) of SEQ ID NO: 35, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 115 a 122 (KQSYNLLT) de la SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 115 to 122 (KQSYNLLT) of SEQ ID NO: 35, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Modalidad 20:Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 16-17, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Mode 20: A procoagulant protein according to any of modalities 16-17, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (DYFMY) de la SEQ ID NO: 34, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (DYFMY) of SEQ ID NO: 34, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) de la SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) of SEQ ID NO: 34, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 129 (NKNWDDYYDMDY) de la SEQ ID NO: 34, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 129 (NKNWDDYYDMDY) of SEQ ID NO: 34, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende:and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) de la SEQ ID NO: 35, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 44 to 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) of SEQ ID NO: 35, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 76 a 82 (WASTRES) de la SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o • a CDR2 sequence of amino acids 76 to 82 (WASTRES) of SEQ ID NO: 35, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 115 a 122 (KQSYNLLT) de la SEQ ID NO: 35, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 115 to 122 (KQSYNLLT) of SEQ ID NO: 35, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Modalidad 21:Una proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 20, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Mode 21: A procoagulant protein according to mode 20, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (DYFMY) de la SEQ ID NO: 34; y• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (DYFMY) of SEQ ID NO: 34; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) de la SEQ ID NO: 34; y• a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) of SEQ ID NO: 34; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 129 (NKNWDDYYDMDY) de la SEQ ID NO: 34,• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 129 (NKNWDDYYDMDY) of SEQ ID NO: 34,
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende:and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) de la SEQ ID NO: 35; y• a CDR1 sequence of amino acids 44 to 60 (KSSQSLLNSRTRKNYLA) of SEQ ID NO: 35; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 76 a 82 (WASTRES) de la SEQ ID NO: 35; y• a CDR2 sequence of amino acids 76 to 82 (WASTRES) of SEQ ID NO: 35; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 115 a 122 (KQSYNLLT) de la SEQ ID NO: 35.• a CDR3 sequence of amino acids 115 to 122 (KQSYNLLT) of SEQ ID NO: 35.
Modalidad 22: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15, en donde el epítopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en L36, P37, E38, G39, C40, Q41, P42, L43, V44, S45, S46, A47, V73, T74, L75, Q76, E77, E78, D79, A80, G81, E82, Y83, G84, C85, M86, R91, G92, P93, Q94, I95, L96, H97, R98, V99, S100 y L101 de la SEQ ID NO: 5.Modality 22: The procoagulant protein according to any one of modalities 13-15, wherein the epitope of (ii) comprises one or more residues selected from the group consisting of L36, P37, E38, G39, C40, Q41, P42 , L43, V44, S45, S46, A47, V73, T74, L75, Q76, E77, E78, D79, A80, G81, E82, Y83, G84, C85, M86, R91, G92, P93, Q94, I95, L96 , H97, R98, V99, S100 and L101 of SEQ ID NO: 5.
Modalidad 23:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15, en donde (ii) es un anticuerpo, o un fragmento de este, que es capaz de unirse al mismo epítopo que el mAb0051.Modality 23: The procoagulant protein according to any one of modalities 13-15, wherein (ii) is an antibody, or a fragment thereof, that is capable of binding to the same epitope as mAb0051.
Modalidad 24:Una proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 22-23, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Modality 24: A procoagulant protein according to any one of modalities 22-23, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (DYSMH) de la SEQ ID NO: 36, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (DYSMH) of SEQ ID NO: 36, where one of these amino acid residues can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) de la SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) of SEQ ID NO: 36, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 129 (APMITTGAWFAY) de la SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 129 (APMITTGAWFAY) of SEQ ID NO: 36, wherein one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
Modalidad 25:Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 22-24, en donde la cadena ligera de (ii) comprende:Mode 25: A procoagulant protein according to any of modalities 22-24, wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 54 (KASQSVSNDVA) de la SEQ ID NO: 37, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 44 to 54 (KASQSVSNDVA) of SEQ ID NO: 37, wherein one, two or three of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 70 a 76 (YASSRYT) de la SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 70 to 76 (YASSRYT) of SEQ ID NO: 37, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 109 a 117 (QQDYSSPYT) de la SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 109 to 117 (QQDYSSPYT) of SEQ ID NO: 37, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Modalidad 26:Una proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 22-23, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Mode 26: A procoagulant protein according to any one of modalities 22-23, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (DYSMH) de la SEQ ID NO: 36, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (DYSMH) of SEQ ID NO: 36, where one of these amino acid residues can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) de la SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) of SEQ ID NO: 36, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 129 (APMITTGAWFAY) de la SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 129 (APMITTGAWFAY) of SEQ ID NO: 36, wherein one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 54 (KASQSVSNDVA) de la SEQ ID NO: 37, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 44 to 54 (KASQSVSNDVA) of SEQ ID NO: 37, wherein one, two or three of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 70 a 76 (YASSRYT) de la SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 70 to 76 (YASSRYT) of SEQ ID NO: 37, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 109 a 117 (QQDYSSPYT) de la SEQ ID NO: 37, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 109 to 117 (QQDYSSPYT) of SEQ ID NO: 37, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Modalidad 27:Una proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 26, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Modality 27: A procoagulant protein according to modality 26, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (DYSMH) de la SEQ ID NO: 36; y• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (DYSMH) of SEQ ID NO: 36; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) de la SEQ ID NO: 36; y• a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (VISTYYGDVRYNQKFKG) of SEQ ID NO: 36; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 129 (APMITTGAWFAY) de la SEQ ID NO: 36;• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 129 (APMITTGAWFAY) of SEQ ID NO: 36;
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende:and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 54 (KASQSVSNDVA) de la SEQ ID NO: 37; y• a CDR1 sequence of amino acids 44 to 54 (KASQSVSNDVA) of SEQ ID NO: 37; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 70 a 76 (YASSRYT) de la SEQ ID NO: 37; y• a CDR2 sequence of amino acids 70 to 76 (YASSRYT) of SEQ ID NO: 37; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 109 a 117 (QQDISSPYT) de la SEQ ID NO: 37.• a CDR3 sequence of amino acids 109 to 117 (QQDISSPYT) of SEQ ID NO: 37.
Modalidad 28:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15, en donde el epítopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, R91, G92, P93, Q94, I95, L96, H97, R98, V99, S100 y L101 de la SEQ ID NO: 5. Modalidad 29: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15, en donde (ii) es un anticuerpo, o un fragmento de este, que es capaz de unirse al mismo epítopo que el mAb0062.Modality 28: The procoagulant protein according to any one of modalities 13-15, wherein the epitope of (ii) comprises one or more residues selected from the group consisting of V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23 , Q24, D25, V26, K27, A28, R91, G92, P93, Q94, I95, L96, H97, R98, V99, S100 and L101 of SEQ ID NO: 5. Modality 29: The procoagulant protein according to a any one of modalities 13-15, wherein (ii) is an antibody, or a fragment thereof, that is capable of binding to the same epitope as mAb0062.
Modalidad 30:Una proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 28-29, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Mode 30: A procoagulant protein according to any one of modalities 28-29, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (SHWIE) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (SHWIE) of SEQ ID NO: 42, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) of SEQ ID NO: 42, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 130 (GYYGLNYDWYFDV) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 130 (GYYGLNYDWYFDV) of SEQ ID NO: 42, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
Modalidad 31:Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 28-30, en donde la cadena ligera de (ii) comprende:Modality 31: A procoagulant protein according to any of modalities 28-30, wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 54 (RASQDISNYLN) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 44 to 54 (RASQDISNYLN) of SEQ ID NO: 39, where one, two or three of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 70 a 76 (YTSRLHS) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 70 to 76 (YTSRLHS) of SEQ ID NO: 39, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 109 a 117 (QQDTKLPYT) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 109 to 117 (QQDTKLPYT) of SEQ ID NO: 39, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Modalidad 32:Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 28-31, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Mode 32: A procoagulant protein according to any of modalities 28-31, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (SHWIE) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (SHWIE) of SEQ ID NO: 42, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o • a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) of SEQ ID NO: 42, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 130 (GYYGLNYDWYFDV) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 130 (GYYGLNYDWYFDV) of SEQ ID NO: 42, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende:and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 54 (RASQDISNYLN) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 44 to 54 (RASQDISNYLN) of SEQ ID NO: 39, where one, two or three of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 70 a 76 (YTSRLHS) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 70 to 76 (YTSRLHS) of SEQ ID NO: 39, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 109 a 117 (QQDTKLPYT) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 109 to 117 (QQDTKLPYT) of SEQ ID NO: 39, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Modalidad 33:Una proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 32, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Modality 33: A procoagulant protein according to modality 32, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (SHWIE) de la SEQ ID NO: 42; y• a CDR1 sequence of amino acids 50 to 54 (SHWIE) of SEQ ID NO: 42; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) de la SEQ ID NO: 42; y• a CDR2 sequence of amino acids 69 to 85 (EILPGSGNTNYNEKFKG) of SEQ ID NO: 42; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 130 (GYYGLNYDWYFDV) de la SEQ ID NO: 42;• a CDR3 sequence of amino acids 118 to 130 (GYYGLNYDWYFDV) of SEQ ID NO: 42;
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende:and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 54 (RASQDISNYLN) de la SEQ ID NO: 39; y• a CDR1 sequence of amino acids 44 to 54 (RASQDISNYLN) of SEQ ID NO: 39; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 70 a 76 (YTSRLHS) de la SEQ ID NO: 39; y• a CDR2 sequence of amino acids 70 to 76 (YTSRLHS) of SEQ ID NO: 39; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 109 a 117 (QQDTKLPYT) de la SEQ ID NO: 39.• a CDR3 sequence of amino acids 109 to 117 (QQDTKLPYT) of SEQ ID NO: 39.
Modalidad 34:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15, en donde el epítopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en E5, T6, H7, K8, I9, G10, S11, L12, A13, E14, N15, A16, F17, S18, D19, P20 y A21 de la SEQ ID NO: 7.Modality 34: The procoagulant protein according to any one of modalities 13-15, wherein the epitope of (ii) comprises one or more residues selected from the group consisting of E5, T6, H7, K8, I9, G10, S11 , L12, A13, E14, N15, A16, F17, S18, D19, P20 and A21 of SEQ ID NO: 7.
Modalidad 35:La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 34, en donde dichos residuos son K8, I9, G10, S11, L12, A13, N15, A16, F17, S18, D19, P20 y A21.Modality 35: The procoagulant protein according to modality 34, where said residues are K8, I9, G10, S11, L12, A13, N15, A16, F17, S18, D19, P20 and A21.
Modalidad 36:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15, en donde el epítopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en K118, I119, G120, S121, L122, A123, E124, N125, A126, F127 de la SEQ ID NO: 6.Modality 36: The procoagulant protein according to any one of modalities 13-15, wherein the epitope of (ii) comprises one or more residues selected from the group consisting of K118, I119, G120, S121, L122, A123, E124 , N125, A126, F127 of SEQ ID NO: 6.
Modalidad 37:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15, en donde (ii) es un anticuerpo, o un fragmento de este, que es capaz de unirse al mismo epítopo que el mAb0061 o el mAb0082. Modalidad 38: Una proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 34-37, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Modality 37: The procoagulant protein according to any one of modalities 13-15, wherein (ii) is an antibody, or a fragment thereof, that is capable of binding to the same epitope as mAb0061 or mAb0082. Modality 38: A procoagulant protein according to any one of modalities 34-37, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 49 to 53 (RYWMT) of SEQ ID NO: 40, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 68 to 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) of SEQ ID NO: 40, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 117 to 121 (GVFTS) of SEQ ID NO: 40, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
Modalidad 39:Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 34-38, en donde la cadena ligera de (ii) comprende:Modality 39: A procoagulant protein according to any of modalities 34-38, wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 43 to 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) of SEQ ID NO: 41, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o • a CDR2 sequence of amino acids 74 to 80 (KVSNRFS) of SEQ ID NO: 41, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 113-121 (SQSTHVPYT) of SEQ ID NO: 41, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Modalidad 40: Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 34-39, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Modality 40: A procoagulant protein according to any of modalities 34-39, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 49 to 53 (RYWMT) of SEQ ID NO: 40, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 68 to 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) of SEQ ID NO: 40, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 117 to 121 (GVFTS) of SEQ ID NO: 40, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende:and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 43 to 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) of SEQ ID NO: 41, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 74 to 80 (KVSNRFS) of SEQ ID NO: 41, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 113-121 (SQSTHVPYT) of SEQ ID NO: 41, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Modalidad 41: Una proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 40, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Modality 41: A procoagulant protein according to modality 40, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 40; y• a CDR1 sequence of amino acids 49 to 53 (RYWMT) of SEQ ID NO: 40; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) de la SEQ ID NO: 40; y• a CDR2 sequence of amino acids 68 to 84 (EINPDSSTINYNPSLKD) of SEQ ID NO: 40; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 40;• a CDR3 sequence of amino acids 117 to 121 (GVFTS) of SEQ ID NO: 40;
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende:and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de la SEQ ID NO: 41; y• a CDR1 sequence of amino acids 43 to 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) of SEQ ID NO: 41; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 41; y• a CDR2 sequence of amino acids 74 to 80 (KVSNRFS) of SEQ ID NO: 41; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 41.• a CDR3 sequence of amino acids 113-121 (SQSTHVPYT) of SEQ ID NO: 41.
Modalidad 42: Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 34-37, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Mode 42: A procoagulant protein according to any of modalities 34-37, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 50, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 49 to 53 (RYWMT) of SEQ ID NO: 50, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYAPSLKD) de la SEQ ID NO: 50, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 68 to 84 (EINPDSSTINYAPSLKD) of SEQ ID NO: 50, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 50, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente;• a CDR3 sequence of amino acids 117 to 121 (GVFTS) of SEQ ID NO: 50, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid;
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende:and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 43 to 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) of SEQ ID NO: 41, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 74 to 80 (KVSNRFS) of SEQ ID NO: 41, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente. • a CDR3 sequence of amino acids 113-121 (SQSTHVPYT) of SEQ ID NO: 41, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Modalidad 43:Una proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 42, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Modality 43: A procoagulant protein according to modality 42, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 50; y• a CDR1 sequence of amino acids 49 to 53 (RYWMT) of SEQ ID NO: 50; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYAPSLKD) de la SEQ ID NO: 50; y• a CDR2 sequence of amino acids 68 to 84 (EINPDSSTINYAPSLKD) of SEQ ID NO: 50; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 50;• a CDR3 sequence of amino acids 117 to 121 (GVFTS) of SEQ ID NO: 50;
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende:and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de la SEQ ID NO: 41; y• a CDR1 sequence of amino acids 43 to 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) of SEQ ID NO: 41; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 41; y• a CDR2 sequence of amino acids 74 to 80 (KVSNRFS) of SEQ ID NO: 41; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 41.• a CDR3 sequence of amino acids 113-121 (SQSTHVPYT) of SEQ ID NO: 41.
Modalidad 44: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15, en donde el paratopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en H50, N52, Y56, H58, Y73, F79, S115, T116, V118 y Y120 de la cadena ligera (L) anti-TLT-1 (SEQ ID NO: 33), y residuos V20, F45, R49, Y50, W51, E68, T75, N77, S116, G117, V118 y T120 de la cadena pesada (H) anti-TLT-1 (SEQ ID NO: 32)Modality 44: The procoagulant protein according to any one of modalities 13-15, wherein the paratope of (ii) comprises one or more residues selected from the group consisting of H50, N52, Y56, H58, Y73, F79, S115 , T116, V118 and Y120 of the anti-TLT-1 (L) light chain (SEQ ID NO: 33), and residues V20, F45, R49, Y50, W51, E68, T75, N77, S116, G117, V118 and Anti-TLT-1 heavy chain (H) T120 (SEQ ID NO: 32)
Modalidad 45:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15 y 44, en donde el epítopo de (ii) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en K133, I134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de la SEQ ID NO: 4.Modality 45: The procoagulant protein according to any one of modalities 13-15 and 44, wherein the epitope of (ii) comprises one or more residues selected from the group consisting of K133, I134, G135, S136, L137, A138 , N140, A141, F142, S143, D144, P145 and A146 of SEQ ID NO: 4.
Modalidad 46:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 13-15, en donde (ii) es un anticuerpo, o un fragmento de este, que es capaz de unirse al mismo epítopo que el mAb0012.Modality 46: The procoagulant protein according to any one of modalities 13-15, wherein (ii) is an antibody, or a fragment thereof, that is capable of binding to the same epitope as mAb0012.
Modalidad 47: Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 44-46, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Modality 47: A procoagulant protein according to any of modalities 44-46, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 32, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 49 to 53 (RYWMT) of SEQ ID NO: 32, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYTPSLKD) de la SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 68 to 84 (EINPDSSTINYTPSLKD) of SEQ ID NO: 32, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 117 to 121 (GVFTS) of SEQ ID NO: 32, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid.
Modalidad 48:Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 44-47, en donde la cadena ligera de (ii) comprende:Mode 48: A procoagulant protein according to any of modes 44-47, wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFTH) de la SEQ ID NO: 33, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 43 to 58 (RSSQSLVHRNGNTYFTH) of SEQ ID NO: 33, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 74 to 80 (KVSNRFS) of SEQ ID NO: 33, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 113-121 (SQSTHVPYT) of SEQ ID NO: 33, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Modalidad 49:Una proteína procoagulante de acuerdo con cualquiera de las modalidades 44-48, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Modality 49: A procoagulant protein according to any of modalities 44-48, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 32, en donde uno de estos aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 49 to 53 (RYWMT) of SEQ ID NO: 32, where one of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYTPSLKD) de la SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 68 to 84 (EINPDSSTINYTPSLKD) of SEQ ID NO: 32, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced by a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 32, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente• a CDR3 sequence of amino acids 117 to 121 (GVFTS) of SEQ ID NO: 32, where one, two or three of these amino acids can be replaced by a different amino acid
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende: and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFTH) de la SEQ ID NO: 33, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR1 sequence of amino acids 43 to 58 (RSSQSLVHRNGNTYFTH) of SEQ ID NO: 33, where one, two, three or four of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o• a CDR2 sequence of amino acids 74 to 80 (KVSNRFS) of SEQ ID NO: 33, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid; me
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 33, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.• a CDR3 sequence of amino acids 113-121 (SQSTHVPYT) of SEQ ID NO: 33, where one or two of these amino acids can be replaced with a different amino acid.
Modalidad 50:Una proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 49, en donde la cadena pesada de (ii) comprende:Mode 50: A procoagulant protein according to mode 49, wherein the heavy chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 32; y• a CDR1 sequence of amino acids 49 to 53 (RYWMT) of SEQ ID NO: 32; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYTPSLKD) de la SEQ ID NO: 32; y• a CDR2 sequence of amino acids 68 to 84 (EINPDSSTINYTPSLKD) of SEQ ID NO: 32; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 32;• a CDR3 sequence of amino acids 117 to 121 (GVFTS) of SEQ ID NO: 32;
y en donde la cadena ligera de (ii) comprende:and wherein the light chain of (ii) comprises:
• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFTH) de la SEQ ID NO: 33; y• a CDR1 sequence of amino acids 43 to 58 (RSSQSLVHRNGNTYFTH) of SEQ ID NO: 33; and
• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 33; y• a CDR2 sequence of amino acids 74 to 80 (KVSNRFS) of SEQ ID NO: 33; and
• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 33.• a CDR3 sequence of amino acids 113-121 (SQSTHVPYT) of SEQ ID NO: 33.
Modalidad 51: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-50, en donde (ii) es un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento de este.Modality 51: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-50, wherein (ii) is a human monoclonal antibody or a fragment thereof.
Modalidad 52: La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-50, en donde (ii) es un anticuerpo quimérico o un fragmento de este.Modality 52: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-50, wherein (ii) is a chimeric antibody or a fragment thereof.
Modalidad 53:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-50, en donde (ii) es un anticuerpo humanizado o un fragmento de este.Modality 53: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-50, wherein (ii) is a humanized antibody or a fragment thereof.
Modalidad 54:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 51-53, en donde el isotipo de (ii) es IgG.Modality 54: The procoagulant protein according to any one of modalities 51-53, wherein the isotype of (ii) is IgG.
Modalidad 55:La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 54, en donde el isotipo es IgG1, IgG2 o IgG4. Modalidad 56:La proteína procoagulante de acuerdo con la modalidad 55, en donde el isotipo es IgG4.Mode 55: The procoagulant protein according to mode 54, where the isotype is IgG1, IgG2 or IgG4. Modality 56: The procoagulant protein according to modality 55, where the isotype is IgG4.
Modalidad 57:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-56, que comprende, además, un enlazador entre (i) e (ii).Modality 57: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-56, further comprising a linker between (i) and (ii).
Modalidad 58:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-57, que es una proteína de fusión.Mode 58: The procoagulant protein according to any one of modes 1-57, which is a fusion protein.
Modalidad 59:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-57, que es un conjugado de (i) e (ii).Modality 59: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-57, which is a conjugate of (i) and (ii).
Modalidad 60:El conjugado de acuerdo con la modalidad 59, en donde (i) y (ii) se unen covalentemente mediante un enlazador que comprende polietilenglicol (PEG).Mode 60: The conjugate according to mode 59, wherein (i) and (ii) are covalently linked by a linker comprising polyethylene glycol (PEG).
Modalidad 61:El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 59-60, en donde (i) y (ii) se conjugan covalentemente mediante un glicano de al menos una de dichas proteínas.Mode 61: The conjugate according to any one of modalities 59-60, where (i) and (ii) are covalently conjugated by a glycan of at least one of said proteins.
Modalidad 62:Un proceso para preparar una composición que comprende al menos un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 59-61, que comprende conjugar químicamente (i) el anticuerpo para TLT-1 o fragmento de este con un grupo reactivo (RS1) de un enlazador y hacer reaccionar (ii) el factor de coagulación con otro grupo reactivo (RS2) de dicho enlazador.Mode 62: A process for preparing a composition comprising at least one conjugate according to any one of modalities 59-61, comprising chemically conjugating (i) the antibody to TLT-1 or fragment thereof with a reactive group (RS1 ) of a linker and react (ii) the coagulation factor with another reactive group (RS2) of said linker.
Modalidad 63:El proceso como se definió en la modalidad 62, en donde (i) es un anticuerpo monoclonal. Mode 63: The process as defined in mode 62, where (i) is a monoclonal antibody.
Modalidad 64:El proceso como se definió en la modalidad 62, en donde (i) es un fragmento de un anticuerpo monoclonal.Mode 64: The process as defined in mode 62, where (i) is a fragment of a monoclonal antibody.
Modalidad 65:El proceso como se definió en la modalidad 64, en donde (i) es un fragmento Fab.Mode 65: The process as defined in mode 64, where (i) is a Fab fragment.
Modalidad 66: El proceso como se definió en la modalidad 65, en donde dicho fragmento Fab contiene una mutación de Cys en la región constante.Mode 66: The process as defined in mode 65, wherein said Fab fragment contains a Cys mutation in the constant region.
Modalidad 67:El proceso como se definió en la modalidad 62, en donde (i) es un fragmento sc-Fab.Mode 67: The process as defined in mode 62, where (i) is a sc-Fab fragment.
Modalidad 68:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido de FV.Modality 68: The process as defined in any one of modalities 62-67, where (ii) is an FV polypeptide.
Modalidad 69:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido de FVIIa.Modality 69: The process as defined in any one of modalities 62-67, where (ii) is an FVIIa polypeptide.
Modalidad 70:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido de FVIII.Mode 70: The process as defined in any one of modalities 62-67, where (ii) is an FVIII polypeptide.
Modalidad 71:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido de FIX.Modality 71: The process as defined in any one of modalities 62-67, wherein (ii) is a FIX polypeptide.
Modalidad 72:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido de FX.Mode 72: The process as defined in any one of modalities 62-67, where (ii) is an FX polypeptide.
Modalidad 73:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-67, en donde (ii) es un polipéptido de FXI.Modality 73: The process as defined in any one of modalities 62-67, wherein (ii) is an FXI polypeptide.
Modalidad 74:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-73, en donde dicho enlazador es uno soluble en agua.Modality 74: The process as defined in any one of modalities 62-73, wherein said linker is a water soluble one.
Modalidad 75:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-74, en donde dicho enlazador es un polímero.Mode 75: The process as defined in any one of modalities 62-74, wherein said linker is a polymer.
Modalidad 76:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 74-75, en donde (ii) es polietilenglicol (PEG).Modality 76: The process as defined in any one of modalities 74-75, where (ii) is polyethylene glycol (PEG).
Modalidad 77:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 74-75, en donde (ii) es ácido polisiálico.Modality 77: The process as defined in any one of modalities 74-75, where (ii) is polysialic acid.
Modalidad 78:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 74-75, en donde (ii) es almidón de hidroxietilo.Modality 78: The process as defined in any one of modalities 74-75, where (ii) is hydroxyethyl starch.
Modalidad 79:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-78, en donde RS1 es un aldehído. Modalidad 80:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-78, en donde RS1 es un grupo maleimida.Modality 79: The process as defined in any one of modalities 62-78, where RS1 is an aldehyde. Modality 80: The process as defined in any one of modalities 62-78, where RS1 is a maleimide group.
Modalidad 81:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-78, en donde RS1 es un derivado de carbohidrato activado capaz de reaccionar en una reacción catalizada por enzima.Modality 81: The process as defined in any one of modalities 62-78, where RS1 is an activated carbohydrate derivative capable of reacting in an enzyme catalyzed reaction.
Modalidad 82:El proceso como se definió en la modalidad 81, en donde RS1 es un derivado de ácido siálico activado capaz de reaccionar en una reacción catalizada por enzima.Mode 82: The process as defined in mode 81, where RS1 is an activated sialic acid derivative capable of reacting in an enzyme-catalyzed reaction.
Modalidad 83:El proceso como se definió en la modalidad 82, en donde RS1 es ácido O2-[5']citidilil-^-neuramínico. Modalidad 84:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-83, en donde RS2 es un aldehído. Modalidad 85:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-83, en donde RS2 es un grupo maleimida.Modality 83: The process as defined in modality 82, where RS1 is O2- [5 '] citidylyl - ^ - neuraminic acid. Modality 84: The process as defined in any one of modalities 62-83, where RS2 is an aldehyde. Modality 85: The process as defined in any one of modalities 62-83, where RS2 is a maleimide group.
Modalidad 86:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-83, en donde RS2 es un derivado de carbohidrato activado capaz de reaccionar en una reacción catalizada por enzima.Modality 86: The process as defined in any one of modalities 62-83, where RS2 is an activated carbohydrate derivative capable of reacting in an enzyme catalyzed reaction.
Modalidad 87:El proceso como se definió en una cualquiera de las modalidades 62-83, en donde RS2 es un derivado de ácido siálico. Modality 87: The process as defined in any one of modalities 62-83, where RS2 is a sialic acid derivative.
Modalidad 88:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-61, en la que (ii) tiene una Kd inferior a 100 nM, tal como inferior a 10 nM.Modality 88: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-61, wherein (ii) has a K d of less than 100 nM, such as less than 10 nM.
Modalidad 89: Un método para dirigir un factor de coagulación, o un fragmento funcional de este, a la superficie de plaquetas activadas, dicho método comprende el contacto de las plaquetas activadas con una proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-61.Mode 89: A method of directing a coagulation factor, or a functional fragment thereof, to the surface of activated platelets, said method comprising contacting activated platelets with a procoagulant protein according to any one of modes 1-61 .
Modalidad 90:Una proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-61 para su uso como un medicamento.Mode 90: A procoagulant protein according to any one of modes 1-61 for use as a medicament.
Modalidad 91:La proteína procoagulante de la modalidad 87 para su uso como un procoagulante.Mode 91: The procoagulant protein of modality 87 for use as a procoagulant.
Modalidad 92:Una formulación farmacéutica que comprende la proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-61.Mode 92: A pharmaceutical formulation comprising the procoagulant protein according to any one of modalities 1-61.
Modalidad 93:La proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-61 o la formulación farmacéutica de acuerdo con la modalidad 92 para su uso en el tratamiento de una coagulopatía.Modality 93: The procoagulant protein according to any one of modalities 1-61 or the pharmaceutical formulation according to modality 92 for use in the treatment of coagulopathy.
Modalidad 94:El uso de la proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-61 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una coagulopatía.Modality 94: The use of the procoagulant protein according to any one of modalities 1-61 for the manufacture of a medicament for the treatment of coagulopathy.
Modalidad 95:El uso de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 93 o 94, en donde dicha coagulopatía es la hemofilia A, con o sin inhibidores, o la hemofilia B, con o sin inhibidores.Modality 95: Use according to any one of modalities 93 or 94, wherein said coagulopathy is hemophilia A, with or without inhibitors, or hemophilia B, with or without inhibitors.
Modalidad 96:Un método para tratar la coagulopatía, que comprende administrar una cantidad eficaz de la proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-61 o la formulación de la modalidad 93 a un individuo que lo necesita.Mode 96: A method of treating coagulopathy, comprising administering an effective amount of the procoagulant protein according to any one of Modes 1-61 or the formulation of Mode 93 to an individual in need.
Modalidad 97:El método de acuerdo con la modalidad 95, en donde dicha coagulopatía es la hemofilia A, con o sin inhibidores, y la hemofilia B, con o sin inhibidores.Mode 97: The method according to mode 95, where said coagulopathy is hemophilia A, with or without inhibitors, and hemophilia B, with or without inhibitors.
Modalidad 98:Un polinucleótido que codifica la proteína procoagulante de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-61.Modality 98: A polynucleotide encoding the procoagulant protein according to any one of modalities 1-61.
Modalidad 99:Una célula aislada que comprende la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las modalidades 1-61 y/o el polinucleótido de acuerdo con la modalidad 97.Mode 99: An isolated cell comprising the fusion protein according to any one of modes 1-61 and / or the polynucleotide according to mode 97.
Modalidad 100:Una proteína procoagulante de una cualquiera de las modalidades 1-61, en donde (ii) se une al TLT-1 sin competir con la unión del fibrinógeno al TLT-1.Mode 100: A procoagulant protein of any one of modalities 1-61, wherein (ii) binds to TLT-1 without competing with fibrinogen binding to TLT-1.
Modalidad 101:Una proteína procoagulante de una cualquiera de las modalidades 1-61, en donde (ii) no inhibe la agregación plaquetaria.Modality 101: A procoagulant protein of any one of modalities 1-61, wherein (ii) does not inhibit platelet aggregation.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos siguientes que no deben interpretarse como limitantes adicionales.The present invention is further illustrated by the following examples which are not to be construed as additional limitations.
EJEMPLOSEXAMPLES
En los ejemplos, los anticuerpos anti-TLT-1 y fragmentos de estos, por ejemplo, fragmentos Fab, se usaron para dirigir los factores de coagulación a las plaquetas activadas. Para facilitar la interpretación de los datos presentados en los ejemplos, la Tabla 3a resume la información con respecto a algunos de los anticuerpos anti-TLT-1 y fragmentos de estos que se describen en más detalle más abajo. En la Tabla 3A, los anticuerpos parentales, variantes, fragmentos, fusiones y conjugados de estos se enumeran con referencia al mAb parental y el tipo de proteína. Nombre se refiere al nombre de la proteína, Parental se refiere al anticuerpo a partir del cual se deriva el mAb, Fab o fusión/conjugado anti-TLT-1 y Tipo define si la proteína es un mAb, un Fab, una fusión por ADN (fusión) con un factor de coagulación o un conjugado químico con un factor de coagulación (conjugado).In the examples, anti-TLT-1 antibodies and fragments thereof, eg, Fab fragments, were used to target clotting factors to activated platelets. To facilitate the interpretation of the data presented in the examples, Table 3a summarizes the information regarding some of the anti-TLT-1 antibodies and fragments thereof described in more detail below. In Table 3A, the parental antibodies, variants, fragments, fusions, and conjugates thereof are listed with reference to the parental mAb and protein type. Name refers to the name of the protein, Parental refers to the antibody from which the mAb is derived, Fab or anti-TLT-1 fusion / conjugate, and Type defines whether the protein is a mAb, a Fab, a DNA fusion (fusion) with a coagulation factor or a chemical conjugate with a coagulation factor (conjugate).
Tabla 3A:Visión general de anticuerpos (mAb), fragmentos de anticuerpos (Fab) y proteínas de fusiónTable 3A: Overview of Antibodies (mAb), Antibody Fragments (Fab), and Fusion Proteins
Ejemplo 1: Clonación y expresión del antígeno hTLT-1 ECD-His.Example 1: Cloning and expression of the hTLT-1 ECD-His antigen.
Las secuencias nucleotídicas que codifican el dominio extracelular del TLT-1 humano (hTLT-1) (Figura 1) junto con una etiqueta His-6 en el C-terminal se amplificaron por PCR con un cebador directo que contiene un sitio de reconocimiento HindIII junto con una secuencia de kozak, y un cebador inverso que contiene un codón de parada y un sitio de reconocimiento EcoRI (Figura 2). El fragmento PCR digerido con HindIII y EcoRI se insertó en los sitios HindIII y EcoRI de un vector de expresión basado en pTT. El vector pTT se describe esencialmente en Durocher, Y. y otros, (2002) Nucleic Acid Res, 30: E9. El plásmido de expresión resultante se designó pTT-hTLT-1 ECD-His. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para hTLT-1 ECD-His se muestran en las SEQ ID NO: 3 y 4. El pTT-hTLT-1 ECD-His se transfectó en células en suspensión HEK293-6E para expresar transitoriamente el hTLT-1 ECD-His. Las células HEK293-6E se cultivaron en medio Freestyle HEK293 (GIBCO, núm. de cat. 12338-018) suplementado con P/S al 1 % (GIBCO, núm. de cat. 15140-122), plurónico al 0,1 % (GIBCO, núm. de cat. 24040-032) y Geneticin 25 ug/ml (GIBCO, núm. de cat. 10131-019 ) y las células se transfectaron a una densidad celular de 1 mill/ml mediante el uso de 293fectin (Invitrogen, núm. de cat. 12347-019). Para cada litro de células HEK293-6E, la transfección se realizó mediante la dilución de 1 mg de ADN de pTT-hTLT-1 ECD-His en 30 ml de Optimen (dilución A) y mediante la dilución de 1 ml de 293fectina en 30 ml de Optimem (GIBCO, núm. de cat. 51985-026, dilución B). Las diluciones A y B se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de transfección se añadió posteriormente a las células HEK293-6E y las células se incubaron a 37°C en una incubadora humidificada con rotación orbital (125 rpm). Cinco a siete días después de la transfección, las células se eliminaron mediante centrifugación y los sobrenadantes resultantes que contenían el hTLT-1 ECD-His se esterilizaron por filtración antes de la purificación.Nucleotide sequences encoding the extracellular domain of human TLT-1 (hTLT-1) (Figure 1) together with a His-6 tag at the C-terminus were amplified by PCR with a forward primer containing a HindIII recognition site together with a kozak sequence, and a reverse primer containing a stop codon and an EcoRI recognition site (Figure 2). The HindIII and EcoRI digested PCR fragment was inserted into the HindIII and EcoRI sites of a pTT-based expression vector. The pTT vector is essentially described in Durocher, Y. et al., (2002) Nucleic Acid Res, 30: E9. The resulting expression plasmid was designated pTT-hTLT-1 ECD-His. Nucleotide and amino acid sequences for hTLT-1 ECD-His are shown in SEQ ID NO: 3 and 4. pTT-hTLT-1 ECD-His was transfected into HEK293-6E suspension cells to transiently express hTLT-1 ECD-His. HEK293-6E cells were grown in Freestyle HEK293 medium (GIBCO, cat. No. 12338-018) supplemented with 1% P / S (GIBCO, cat. No. 15140-122), 0.1% pluronic (GIBCO, cat. No. 24040-032) and Geneticin 25 ug / ml (GIBCO, cat. No. 10131-019) and the cells were transfected at a cell density of 1 mill / ml using 293fectin ( Invitrogen, Cat. No. 12347-019). For each liter of HEK293-6E cells, transfection was performed by diluting 1 mg of pTT-hTLT-1 ECD-His DNA in 30 ml of Optimen (dilution A) and by diluting 1 ml of 293fectin in 30 ml Optimem (GIBCO, cat. no. 51985-026, dilution B). Dilutions A and B were mixed and incubated at room temperature for 30 minutes. The transfection mixture was subsequently added to HEK293-6E cells and the cells were incubated at 37 ° C in a humidified incubator with orbital rotation (125 rpm). Five to seven days after transfection, cells were removed by centrifugation and the resulting supernatants containing hTLT-1 ECD-His were filter sterilized prior to purification.
Ejemplo 2: Purificación y caracterización de la proteína hTLT-1 ECD-His.Example 2: Purification and characterization of hTLT-1 ECD-His protein.
La purificación de la proteína hTLT-1 ECD-His se llevó a cabo como un proceso en 2 etapas compuesto de 1) cromatografía de afinidad a His mediante el uso de la resina cargada con cobalto TALON (Clontech, núm. de cat.Purification of the hTLT-1 ECD-His protein was carried out as a 2-step process consisting of 1) His affinity chromatography using the TALON cobalt-loaded resin (Clontech, cat.
635506) y 2) cromatografía de intercambio aniónico mediante el uso de la resina de partículas finas Source 15Q (GE Healthcare, núm. de cat. 17-0947). Las purificaciones se llevaron a cabo mediante el uso de un sistema de cromatografía ÁktaExplorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112-41). Los sistemas tampón usados para la primera etapa de purificación fueron un tampón de equilibrado compuesto de Hepes 20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM, un tampón de lavado compuesto de Hepes 20 mM, pH 7,0, NaCl 0,5 M y un tampón de elución compuesto de Hepes 20 mM, pH 7,0, imidazol 150 mM. El sobrenadante celular se aplicó directamente sin ningún ajuste en una columna TALON equilibrada previamente. La columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón de equilibrado, 20 volúmenes de columna de tampón de lavado y por último con 20 volúmenes de columna de tampón de equilibrado. La proteína se eluyó isocráticamente en aproximadamente 5 volúmenes de columna de tampón de elución. La masa molecular de la proteína eluida se analizó mediante el uso de SDS-PAGE/Coomassie NuPage 4-12 % de geles Bis-Tris (Invitrogen, núm. de cat. NP0321BOX) y la configuración de espectroscopía de masas de desorcion/ionizacion laser asistida por matriz con analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) en un sistema Micro-flex (Bruker Daltonics). Aquí, se observaron dos masas de proteínas distintas de aproximadamente 16,7 y 33,4 kDa de cantidades casi iguales. Las masas observadas correspondieron a formas de monómero y dímero del hTLT-1 ECD-His. La reducción de la proteína resultó en la eliminación completa de la proteína de 33,4 kDa, a la vez que se intensificó la proteína de 16,7 kDa según lo juzgado a partir de un análisis de SDS-PAGE/Coomassie. Por lo tanto, la proteína hTLT-1 ECD-His contenía un dímero de C-C interligado. Para separar el monómero del dímero, se empleó una segunda etapa de purificación. Los sistemas tampón usados para esta etapa de purificación fueron un tampón de equilibrado compuesto de Hepes 50 mM, pH 8,0 y un tampón de elución compuesto de Hepes 50 mM, pH 8,0, NaCl 1 M. La muestra se ajustó a un pH de 8,0 mediante el uso de NaOH 1 M y después se diluyó hasta una conductividad de aproximadamente 10 mS/cm. La proteína se aplicó a una columna Source 15Q equilibrada previamente, se lavó con 5 volúmenes de columna de equilibrado y se eluyó mediante el uso de 0 - 100 % de tampón de elución sobre 20 volúmenes de columna. En base al monitoreo UV280, se evidenciaron dos picos con casi separación de la línea base. El análisis de las fracciones sobre los dos picos mediante el uso de análisis de SDS-PAGE/Coomassie, MS MALDI-TOF y Dynamic Light-Dispersión (DLS) mediante el uso de un instrumento Dynapro (Wyatt Technology) mostró la presencia del monómero proteína hTLT-1 ECD-His en el pico que eluyó primero y Cys-Cys en el pico que eluyó segundo. Se preparó un agrupamiento que contiene la proteína monómero hTLT-1 ECD-His solamente. La integridad de la proteína final se analizó basado en una configuración del método de cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) en un sistema Agilent LC 1100/1200 y mediante el uso de una columna BIOSep-SEC-S3000 de 300x7,8 mm (Phenomenex, núm. de cat. 00H-2146-K0) y un tampón de corrida compuesto de NaFosfato 200 mM pH 6,9, NaCl 300 mM e isopropanol al 10 %. La proteína eluyó como un pico simétrico único a un tiempo de retención de aproximadamente 9,9 min a una tasa de flujo de 1 ml/min.635506) and 2) anion exchange chromatography using Source 15Q fine particle resin (GE Healthcare, cat. No. 17-0947). Purifications were carried out using an ÁktaExplorer chromatography system (GE Healthcare, cat. No. 18-1112-41). The buffer systems used for the first purification step were a balancing buffer composed of 20mM Hepes, pH 7.0, 150mM NaCl, a wash buffer composed of 20mM Hepes, pH 7.0, 0.5M NaCl and an elution buffer composed of 20 mM Hepes, pH 7.0, 150 mM imidazole. The cell supernatant was applied directly without adjustment on a previously balanced TALON column. The column was washed with 20 column volumes of equilibration buffer, 20 column volumes of washing buffer and finally with 20 column volumes of equilibration buffer. Protein was eluted isocratically in approximately 5 column volumes of elution buffer. The molecular mass of the eluted protein was analyzed using SDS-PAGE / Coomassie NuPage 4-12% Bis-Tris gels (Invitrogen, cat. No. NP0321BOX) and laser desorption / ionization mass spectroscopy settings. matrix-assisted with time-of-flight analyzer (MALDI-TOF MS) in a Micro-flex system (Bruker Daltonics). Here, two distinct protein masses of approximately 16.7 and 33.4 kDa of nearly equal amounts were observed. The observed masses corresponded to monomer and dimer forms of hTLT-1 ECD-His. Reduction of the protein resulted in complete removal of the 33.4 kDa protein, while the 16.7 kDa protein was enhanced according to judged from SDS-PAGE / Coomassie analysis. Therefore, the hTLT-1 ECD-His protein contained an interlinked CC dimer. To separate the monomer from the dimer, a second purification step was employed. The buffer systems used for this purification step were a balancing buffer composed of 50 mM Hepes, pH 8.0 and an elution buffer composed of 50 mM Hepes, pH 8.0, 1M NaCl. The sample was adjusted to a pH of 8.0 using 1M NaOH and then diluted to a conductivity of approximately 10mS / cm. Protein was applied to a pre-equilibrated Source 15Q column, washed with 5 equilibration column volumes and eluted using 0-100% elution buffer over 20 column volumes. Based on UV280 monitoring, two peaks with almost separation from the baseline were evident. Analysis of the fractions on the two peaks using SDS-PAGE / Coomassie, MS MALDI-TOF and Dynamic Light-Dispersion (DLS) analysis using a Dynapro instrument (Wyatt Technology) showed the presence of the protein monomer hTLT-1 ECD-His in the peak that eluted first and Cys-Cys in the peak that eluted second. A pool containing the hTLT-1 ECD-His monomer protein only was prepared. The integrity of the final protein was analyzed based on a size exclusion high resolution liquid chromatography method (SEC-HPLC) setup on an Agilent LC 1100/1200 system and using a BIOSep-SEC-S3000 column from 300x7.8 mm (Phenomenex, cat. No. 00H-2146-K0) and a run buffer composed of 200 mM Naphosphate pH 6.9, 300 mM NaCl and 10% isopropanol. The protein eluted as a single symmetric peak at a retention time of approximately 9.9 min at a flow rate of 1 ml / min.
Se preparó un lote del hTLT-1 ECD-His para un estudio de inmunización para la producción de anticuerpos monoclonales anti-TLT-1. De esta forma, la proteína se dializó en un tampón de PBS isotónico mediante el uso de un casete de diálisis Slide-A-Lyzer de 10 kDa MWCO (Pierce, núm. de cat. 66453). Para medir la concentración de proteína final, se usó un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con un coeficiente de extinción de 0,55. A batch of hTLT-1 ECD-His was prepared for an immunization study for the production of anti-TLT-1 monoclonal antibodies. Thus, the protein was dialyzed in an isotonic PBS buffer using a 10 kDa MWCO Slide-A-Lyzer dialysis cassette (Pierce, Cat. No. 66453). To measure the final protein concentration, a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific) was used together with an extinction coefficient of 0.55.
Ejemplo 3: Preparación de anticuerpos monoclonales para TLT-1.Example 3: Preparation of monoclonal antibodies to TLT-1.
Ratones RBF se inmunizaron mediante la inyección de 50 |jg del hTLT-1 ECD-His. FCA por vía subcutánea seguido de dos inyecciones con 20 jg del hTLT-1 ECD-His en FIA. Los ratones con respuesta alta se reforzaron por vía intravenosa con 25 jg de hTLT-1 ECD-His y los bazos se cosecharon después de 3 días. Las células del bazo se fusionaron con la línea celular Fox de mieloma. Los sobrenadantes se tamizaron para la producción de anticuerpos específicos para hTLT-1 en un ELISA específico y en un ensayo FACS mediante el uso de células CHO transfectadas con hTLT-1 o falsamente transfectadas como células objetivo positivas y negativas, respectivamente. Se realizó un tamizaje secundario en plaquetas en reposo frente a plaquetas activadas con agonistas dobles de origen humano, de monos cynomolgus, de perros, de conejos o de ratón.RBF mice were immunized by injecting 50 µg of the hTLT-1 ECD-His. FCA subcutaneously followed by two injections with 20 jg of hTLT-1 ECD-His in FIA. High response mice were boosted intravenously with 25 jg hTLT-1 ECD-His and spleens were harvested after 3 days. Spleen cells were fused with the Fox myeloma cell line. Supernatants were screened for the production of hTLT-1 specific antibodies in a specific ELISA and in a FACS assay using either hTLT-1 transfected or falsely transfected CHO cells as positive and negative target cells, respectively. Secondary screening was performed on resting platelets against activated platelets with double agonists of human, cynomolgus monkey, dog, rabbit or mouse.
Ejemplo 4: Clonación y secuenciación de ADNc de LC y HC de mAb anti-TLT-1 a partir de hibridoma.Example 4: Cloning and sequencing of LC and HC cDNA from anti-TLT-1 mAb from hybridoma.
El ARN total se extrajo a partir de cuatro hibridomas diferentes que expresan mAb anti-TLT-1 denominados: 0012Hyb, 0023Hyb, 0051 Hyb y 0052Hyb. El ARN se extrajo a partir de células de hibridomas mediante el uso del mini kit RNeasy (Qiagen, núm. de cat. 74106) y una alícuota del a Rn resultante se usó como plantilla para la síntesis de la primera cadena de ADNc mediante el uso del kit de amplificación SMART RACE cDNA (Clontech, núm. de cat. 634914) según las instrucciones del fabricante para 5' RACE y mediante el uso del cebador A 5' RACE CDS junto con un oligonucleótido de ARN SMART II A. Los ADNc de región de codificación de cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) de cada uno de los cuatro hibridomas anti-TLT-1 se amplificaron posteriormente por PCR mediante el uso de una mezcla de cebador directo de UPM junto con o bien un cebador inverso específico de LC,kappa de ratón (número de cebador inverso 339, 348 o 610) o junto con un cebador inverso que reconoce las secuencias de IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 de ratón (número de cebador inverso 341, 347, 613, 614, 615 o 616, las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 4 y las SEQ ID NO 60-145). Las reacciones de PCR se realizaron mediante el uso de Phusion PCR mix (FinnZymes, cat núm.: F-531L). Los fragmentos de PCR resultantes se clonaron mediante el uso del kit de clonación Zero Blunt TOPO PCR para secuenciación (Invitrogen, núm. de cat. K287540) y se secuenciaron. Las secuencias de dominio variable para 0012LC y HC se muestran en la Figura 3.Total RNA was extracted from four different hybridomas expressing anti-TLT-1 mAbs named: 0012Hyb, 0023Hyb, 0051 Hyb and 0052Hyb. RNA was extracted from hybridoma cells using the RNeasy mini kit (Qiagen, cat no. 74106) and an aliquot of the resulting Rn was used as a template for synthesis of the first strand of cDNA using from the SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Cat. No. 634914) according to the manufacturer's instructions for 5 'RACE and by using the A 5' RACE CDS primer along with a SMART II A RNA oligonucleotide. The light chain (LC) and heavy chain (HC) coding region of each of the four anti-TLT-1 hybridomas were subsequently amplified by PCR using either a UPM forward primer mix together with either a reverse primer LC-specific, mouse kappa (reverse primer number 339, 348, or 610) or together with a reverse primer that recognizes the mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, or IgG3 sequences (reverse primer number 341, 347, 613, 614 , 615 or 616, the primer sequences are shown in Table 4 and SEQ ID NO 60-145). PCR reactions were performed using the Phusion PCR mix (FinnZymes, cat no .: F-531L). The resulting PCR fragments were cloned using the Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for sequencing (Invitrogen, Cat # K287540) and sequenced. Variable domain sequences for 0012LC and HC are shown in Figure 3.
Ejemplo 5: Desarrollo de constructos de expresión pTT-0012HC, pTT-0023HC, pTT-0051HC y pTT-0052HC.Example 5: Development of expression constructs pTT-0012HC, pTT-0023HC, pTT-0051HC and pTT-0052HC.
Las secuencias de ADN que codifican el dominio variable de la HC (Vh ) aisladas a partir de cada uno de los cuatro hibridomas anti-TLT-1 diferentes se amplificaron por PCR con cebadores directos que contienen un sitio de enzima de restricción HindIII y cebadores inversos que contienen un sitio de enzima de restricción NheI para propósitos de clonación. Las secuencias de ADN 0012Vh , 0023Vh , 0051Vh y 0052Vh se amplificaron por PCR mediante el uso de Phusion PCR mix (FinnZymes, cat núm. F-531L) con los siguientes pares de números de cebadores: 490 (directo) 491 (inverso), 546 (directo) 547 (inverso), 627 (directo) 628 (inverso) y 617 (directo) 618 (inverso), las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 4 y las SEQ ID NO 60-145), respectivamente, y se insertaron en los sitios de enzimas de restricción HindIII y Nhel de un vector basado en pTT denominado pTT-hIgG4, que contiene las secuencias que codifican la región constante para la HC de IgG4 (es decir, CH1-bisagra-CH2-CH3). El vector pTT se describe esencialmente en Durocher, Y. y otros, (2002) Nucleic Acid Res, 30: E9 (Figura 22). Los vectores resultantes se denominaron pTT-0012HC (Figura 5), pTT-0023HC, pTT-0051HC y pTT-0052HC. Las secuencias de aminoácidos de HC anti-TLT-1 codificadas por los vectores de expresión se muestran en (SEQ ID NO: 0012HC: 32, 0023HC: 34, 0051HC: 36, 0052HC: 38). DNA sequences encoding the HC variable domain (V h ) isolated from each of the four different anti-TLT-1 hybridomas were amplified by PCR with forward primers containing a HindIII restriction enzyme site and primers inverses containing a NheI restriction enzyme site for cloning purposes. The DNA sequences 0012V h , 0023V h , 0051V h and 0052V h were amplified by PCR using the Phusion PCR mix (FinnZymes, cat no. F-531L) with the following primer number pairs: 490 (direct) 491 (reverse), 546 (forward) 547 (reverse), 627 (forward) 628 (reverse), and 617 (forward) 618 (reverse), the primer sequences are shown in Table 4 and SEQ ID NO 60-145) , respectively, and inserted into the restriction enzyme sites HindIII and Nhel of a pTT-based vector called pTT-hIgG4, which contains the sequences encoding the constant region for IgG4 HC (i.e., CH1-hinge-CH2 -CH3). The pTT vector is essentially described in Durocher, Y. et al., (2002) Nucleic Acid Res, 30: E9 (Figure 22). The resulting vectors were named pTT-0012HC (Figure 5), pTT-0023HC, pTT-0051HC, and pTT-0052HC. The amino acid sequences of anti-TLT-1 HC encoded by the expression vectors are shown in (SEQ ID NO: 0012HC: 32, 0023HC: 34, 0051HC: 36, 0052HC: 38).
Ejemplo 6: Desarrollo de constructos de expresión pTT-0012LC, pTT-0023LC, pTT-0051LC y pTT-0052LC.Example 6: Development of expression constructs pTT-0012LC, pTT-0023LC, pTT-0051LC and pTT-0052LC.
Las secuencias de ADN que codifican el dominio variable de la LC (Vl ) aisladas a partir de cada uno de los cuatro hibridomas anti-TLT-1 diferentes se amplificaron por PCR con cebadores directos que contienen un sitio de enzima de restricción HindIII y cebadores inversos que contienen un sitio de enzima de restricción BsiWI para propósitos de clonación. Las secuencias de ADN 0012Vl , 0023Vl , 0051Vl y 0052Vl se amplificaron por PCR con los siguientes pares de números de cebadores: 493 (directo) 495 (inverso), 548 (directo) 549 (inverso), 492 (directo) 494 (inverso) y 619 (directo) 620 (inverso), las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 4 y las SEQ ID NO 60 145), respectivamente, y se insertaron en los sitios de enzimas de restricción HindIII y BsiWI de un vector basado en pTT denominado pTT-hLC Kappa, que contiene las secuencias que codifican la región constante para LC kappa humana. Los vectores resultantes se denominaron pTT-0012LC, pTT-0023LC, pTT-0051LC y pTT-0052LC. La secuencia de aminoácidos de LC anti-TLT-1 codificada por los vectores de expresión se muestra en (SEQ ID NO: 0012LC: 33, 0023LC: 35, 0051LC: 37, 0052LC: 39).DNA sequences encoding the LC variable domain ( Vl ) isolated from each of the four different anti-TLT-1 hybridomas were amplified by PCR with forward primers containing a HindIII restriction enzyme site and primers inverses containing a BsiWI restriction enzyme site for cloning purposes. The DNA sequences 0012V l , 0023V l , 0051V l and 0052V l were amplified by PCR with the following primer number pairs: 493 (forward) 495 (reverse), 548 (forward) 549 (reverse), 492 (forward) 494 (reverse) and 619 (forward) 620 (reverse), the primer sequences are shown in Table 4 and SEQ ID NO 60 145), respectively, and inserted into the restriction enzyme sites HindIII and BsiWI of a pTT-based vector called pTT-hLC Kappa, which contains the sequences encoding the constant region for human LC kappa. The resulting vectors were named pTT-0012LC, pTT-0023LC, pTT-0051LC, and pTT-0052LC. The amino acid sequence of anti-TLT-1 LC encoded by the expression vectors is shown in (SEQ ID NO: 0012LC: 33, 0023LC: 35, 0051LC: 37, 0052LC: 39).
Ejemplo 7: Desarrollo de pTT-0012HC.T60N, pTT-0012HC.T60A, pTT-0012LC.C36A y pTT-0052HC.C91Y.Example 7: Development of pTT-0012HC.T60N, pTT-0012HC.T60A, pTT-0012LC.C36A and pTT-0052HC.C91Y.
La secuencia de aminoácidos 0012Vh contiene un sitio de glicosilación ligado a N potencial (T60, numeración de kabat) y las secuencias de aminoácidos 0012Vl y 0052Vh contienen cada una, una Cys no pareada (C36 y C91, respectivamente, numeración de kabat). Los vectores de expresión que codifican 0012HC.T60N o 0012HC.T60A o 0012LC.C36A o 0052HC.C91Y se desarrollaron mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio (Quickchange II, Stratagene, número de catálogo 20523-5) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de mutagénesis dirigida al sitio se realizaron mediante el uso de a) ADN de pTT-0012HC como plantilla y números de cebadores 682 (directo) 683 (inverso) para pTT-0012HC.T60N, b) ADN de pTT-0012HC como plantilla y los números de cebadores 688 (directo) 689 (inverso) para pTT-0012HC.T60A, c) Ad N de pTT-0012LC como plantilla y los números de cebadores 598 (directo) 599 (inverso) para pTT-0012LC.C36A, d) ADN de pTT-0052HC como plantilla y los números de cebadores siguientes 684 (directo) 685 (inverso), las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 4 y las SEQ ID NO 60-145 para pTT-0052HC.C91Y. Los vectores de expresión resultantes se secuenciaron para verificar las secuencias de ADN. Las secuencias de aminoácidos de HC y LC anti-TLT-1 codificadas por los vectores de expresión pTT-0012HC.T60N, pTT-0012HC.T60A y pTT-0012LC.C36A se muestran en (SEQ ID NO: 0012HC.T60N (también denominada 0061HC): 40, 0012HC.T60A (también denominada 0082HC): 43, 0012LC.C36A (también denominada 0061LC): 41). La secuencia de aminoácidos 0012LC.C36A se muestra además sin la secuencia del péptido señal N terminal en la SEQ ID NO: 153.The 0012V h amino acid sequence contains a potential N-linked glycosylation site (T60, kabat numbering) and the 0012V l and 0052V h amino acid sequences each contain an unpaired Cys (C36 and C91, respectively, kabat numbering ). Expression vectors encoding 0012HC.T60N or 0012HC.T60A or 0012LC.C36A or 0052HC.C91Y were developed using site-directed mutagenesis (Quickchange II, Stratagene, catalog number 20523-5) according to the manufacturer's instructions. Site-directed mutagenesis reactions were performed using a) pTT-0012HC DNA as a template and primer numbers 682 (forward) 683 (reverse) for pTT-0012HC.T60N, b) pTT-0012HC DNA as a template and primer numbers 688 (forward) 689 (reverse) for pTT-0012HC.T60A, c) Ad N of pTT-0012LC as a template, and primer numbers 598 (forward) 599 (reverse) for pTT-0012LC.C36A, d) DNA from pTT-0052HC as a template and the following primer numbers 684 (forward) 685 (reverse), the primer sequences are shown in Table 4 and SEQ ID NO 60-145 for pTT-0052HC.C91Y. The resulting expression vectors were sequenced to verify DNA sequences. The anti-TLT-1 HC and LC amino acid sequences encoded by the expression vectors pTT-0012HC.T60N, pTT-0012HC.T60A and pTT-0012LC.C36A are shown in (SEQ ID NO: 0012HC.T60N (also called 0061HC): 40, 0012HC.T60A (also called 0082HC): 43, 0012LC.C36A (also called 0061LC): 41). The amino acid sequence 0012LC.C36A is further shown without the N-terminal signal peptide sequence in SEQ ID NO: 153.
Ejemplo 8: Desarrollo de constructos de expresión pTT-0012LC-HPC4, pTT-0012LC.C36A-HPC4, pTT-0023LC-HPC4, pTT-0051LC-HPC4 y pTT-0052LC-HPC4.Example 8: Development of expression constructs pTT-0012LC-HPC4, pTT-0012LC.C36A-HPC4, pTT-0023LC-HPC4, pTT-0051LC-HPC4 and pTT-0052LC-HPC4.
Las secuencias de ADN que codifican el Vl aisladas a partir de cada uno de los cuatro hibridomas anti-TLT-1 diferentes se amplificaron por PCR con cebadores directos que contienen un sitio de enzima de restricción HindIII y cebadores inversos que contienen un sitio de enzima de restricción BsiWI para propósitos de clonación. Las secuencias de ADN 0012Vl , 0012Vl .C36A, 0023Vl , 0051 Vl y 0052Vl se amplificaron por p Cr con los números de cebadores siguientes: 493 (directo) 495 (inverso), 493 (directo) 495 (inverso), 548 (directo) 549 (inverso), 492 (directo) 494 (inverso), y 619 (directo) 620 (inverso), las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 4 y las SEQ ID NO: 60-145, respectivamente, mediante el uso de Phusion PCR mix (FinnZymes, núm. de cat. F-531L). La secuencia que codifica la Cl kappa humana se amplificó por PCR con el número de cebador directo 486 y el número de cebador inverso 485. El número de cebador directo 486 contiene un sitio de enzima de restricción BsiWI y el cebador inverso 485 codifica una etiqueta HPC4 seguida de un codón de parada y contiene un sitio EcoRI flanqueante 3' para propósitos de clonación. La reacción PCR se realizó mediante el uso de Phusion PCR mix (FinnZymes, cat núm. F-531L). El fragmento de PCR de 0012Vl digerido por HindIII+BsiWI se mezcló con el fragmento de PCR de CL ,kappa-HPC4 humana digerido por BsiWI+EcoRI e insertado en los sitios HindIII EcoRI de un vector de expresión basado en pTT que resulta en pTT-0012LC-HPC4 (Figura 4). Para desarrollar vectores de expresión correspondientes que codifican la versión LC-HPC4 de las cuatro secuencias LC anti-TLT-1 restantes, la secuencia 0012Vl en pTT-0012LC-HPC4 se escindió con HindIII+ BsiWI y se remplazó con fragmentos de PCR 0023Vl , 0051Vl , 0052Vl y 0012Vl .C36A digeridos con HindIII+BsiWI. Los cuatro vectores de expresión resultantes se denominaron: pTT-0023LC-HPC4, pTT-0051LC-HPC4, pTT-0052LC-HPC4 y pTT-0012LC.C36A.HPC4 (Figura 4B). Las secuencias de aminoácidos codificadas por pTT-0012LC.C36A-HPC4, pTT-0023LC-HPC4, pTT-0051LC-HPC4 y pTT-0052LC-HPC4 se muestran en la SEQ ID NO: 0012LC.C36A-HPC4 (también denominada 0061LC-HPC4): 167, 0023LC-HPC4: 179, 0051LC-HPC4: 177, 0052LC-HPC4 (también denominada 0062LC-HPC4): 174.DNA sequences encoding Vl isolated from each of the four different anti-TLT-1 hybridomas were amplified by PCR with forward primers containing a HindIII restriction enzyme site and reverse primers containing an enzyme site BsiWI restriction for cloning purposes. The DNA sequences 0012V l , 0012V l .C36A, 0023V l , 0051 V l and 0052V l were amplified by p Cr with the following primer numbers: 493 (forward) 495 (reverse), 493 (forward) 495 (reverse) , 548 (forward) 549 (reverse), 492 (forward) 494 (reverse), and 619 (forward) 620 (reverse), the primer sequences are shown in Table 4 and SEQ ID NO: 60-145, respectively , using Phusion PCR mix (FinnZymes, cat. no. F-531L). The sequence encoding human C l kappa was amplified by PCR with forward primer number 486 and reverse primer number 485. Forward primer number 486 contains a restriction enzyme site BsiWI and reverse primer 485 encodes a tag HPC4 followed by a stop codon and contains a 3 'flanking EcoRI site for cloning purposes. The PCR reaction was performed using the Phusion PCR mix (FinnZymes, cat no. F-531L). The 0012V l PCR fragment digested by HindIII + BsiWI was mixed with the PCR fragment of human C l , kappa-HPC4 digested by BsiWI + EcoRI and inserted into the HindIII EcoRI sites of a pTT-based expression vector resulting in pTT-0012LC-HPC4 (Figure 4). To develop corresponding expression vectors encoding the LC-HPC4 version of the remaining four anti-TLT-1 LC sequences, sequence 0012V l in pTT-0012LC-HPC4 was excised with HindIII + BsiWI and replaced with 0023V l PCR fragments, 0051V l , 0052V l and 0012V l .C36A digested with HindIII + BsiWI. The four resulting expression vectors were named: pTT-0023LC-HPC4, pTT-0051LC-HPC4, pTT-0052LC-HPC4, and pTT-0012LC.C36A.HPC4 (Figure 4B). Amino acid sequences encoded by pTT-0012LC.C36A-HPC4, pTT-0023LC-HPC4, pTT-0051LC-HPC4, and pTT-0052LC-HPC4 are shown in SEQ ID NO: 0012LC.C36A-HPC4 (also called 0061LC-HPC4 ): 167, 0023LC-HPC4: 179, 0051LC-HPC4: 177, 0052LC-HPC4 (also called 0062LC-HPC4): 174.
Ejemplo 9: Desarrollo de los constructos de expresión pTT-0012Vh .T60N-CH1-YGPPC, pTT-0023Vh -CH1-YGPPC, pTT-0051VH -CH1-YGPPC, y pTT-0052Vh .C91Y-CH1-YGPPC.Example 9: Development of the expression constructs pTT-0012V h .T60N-CH1-YGPPC, pTT-0023V h -CH1-YGPPC, pTT-0051V H -CH1-YGPPC, and pTT-0052V h .C91Y-CH1-YGPPC.
Las secuencias de 0012Vh .T60N-CH1-YGPPC, 0023Vh -CH1-YGPPC, 0051Vh -CH1-YGPPC y 0052Vh .C91Y-CH1-YGPPC (YGPPC es una secuencia de aminoácidos bisagra de IgG4 humana parcial) se amplificaron por PCR a partir de pTT-0012HC.T60N, pTT-0023HC, pTT-0051HC y pTT-0052HC.C91Y, respectivamente, mediante el uso de pares de cebadores directos e inversos: 572 (directo) 698 (inverso), 576 (directo) 698 (inverso), 627 (directo)+698 (inverso) y 617 (directo)+698 (inverso), respectivamente. Los cebadores directos contienen un sitio de enzima de restricción HindlII y el cebador inverso 698 contiene un codón de parada y un sitio EcoRI para propósitos de clonación. El fragmento de PCR resultante se digirió con HindIII+EcoRI y se insertó en los sitios HindIII+EcoRI de un vector basado en pTT. Los vectores de expresión resultantes se denominaron pTT-0012Vh .T60N-CH1-YGPPC (Figura 4A), pTT-0023VH -CH1-YGPPC, pTT-0051Vh -CH1-YGPPC y pTT-0052Vh .C91Y-CH1-YGPPC. El secuencias de aminoácidos codificadas por pTT-0012Vh .T60N-CH1-YGPPC (Figura 4A), pTT-0023Vh -CH1-YGPPC, pTT-0051Vh -CH1-YGPPC y pTT-0052Vh .C91Y-CH1-YGPPC se muestran en la SEQ ID NO: 0012Vh .T60N-CH1-YGPPC (también denominada 0061VH-CH1-YGPPC): 171, 0023Vh -CH1-YGPPC: 178, 0051Vh -CH1-YGPPC 176, 0052Vh .C91Y-CH1-YGPPC (también denominada 0062VH-CH1-YGPPC): 175.The sequences of 0012V h .T60N-CH1-YGPPC, 0023V h -CH1-YGPPC, 0051V h -CH1-YGPPC and 0052V h .C91Y-CH1-YGPPC (YGPPC is a hinge amino acid sequence of partial human IgG4) were amplified by PCR from pTT-0012HC.T60N, pTT-0023HC, pTT-0051HC and pTT-0052HC.C91Y, respectively, using the pairs of forward and reverse primers: 572 (forward) 698 (reverse), 576 (forward) 698 (reverse), 627 (direct) +698 (reverse), and 617 (direct) +698 (reverse), respectively. Direct primers contain an enzyme site of HindlII restriction and reverse primer 698 contain a stop codon and an EcoRI site for cloning purposes. The resulting PCR fragment was digested with HindIII + EcoRI and inserted into the HindIII + EcoRI sites of a pTT based vector. The resulting expression vectors were named pTT-0012V h .T60N-CH1-YGPPC (Figure 4A), pTT-0023V H -CH1-YGPPC, pTT-0051V h -CH1-YGPPC, and pTT-0052V h .C91Y-CH1-YGPPC . The amino acid sequences encoded by pTT-0012V h .T60N-CH1-YGPPC (Figure 4A), pTT-0023V h -CH1-YGPPC, pTT-0051V h -CH1-YGPPC and pTT-0052V h .C91Y-CH1-YGPPC were show in SEQ ID NO: 0012V h .T60N-CH1-YGPPC (also called 0061VH-CH1-YGPPC): 171, 0023V h -CH1-YGPPC: 178, 0051V h -CH1-YGPPC 176, 0052V h .C91Y-CH1 -YGPPC (also called 0062VH-CH1-YGPPC): 175.
Ejemplo 10: Desarrollo de los constructos de expresión pTT-0012Vh -CH1, pTT-0012Vh -CH1-HPC4, pTT-0023Vh -CH1, pTT-0023VH -CH1-HPC4, pTT-0051Vh -CH1, pTT-0051Vh -CH1-HPC4, pTT-0052Vh -CH1 y pTT-0052Vh -CH1-HPC4. Example 10: Development of the expression constructs pTT-0012V h -CH1, pTT-0012V h -CH1-HPC4, pTT-0023V h -CH1, pTT-0023V H -CH1-HPC4, pTT-0051V h -CH1, pTT- 0051V h -CH1-HPC4, pTT-0052V h -CH1 and pTT-0052V h -CH1-HPC4.
Las secuencias 0012Vh , 0023Vh , 0051Vh y 0052Vh aisladas a partir de 0012Hyb, 0023Hyb, 0051Hyb, 0052Hyb se amplificaron por PCR con los números de cebadores: 490 (directo) 491 (inverso), 546 (directo) 547 (inverso), 627 (directo) 628 (inverso), 617 (directo) 618 (inverso), las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 4 y las SEQ ID NO 60-145, respectivamente, mediante el uso de Phusion PCR mix (FinnZymes, núm. de cat. F-531L). Todos los cebadores directos (490, 546, 627 y 617) contenían un sitio HindIII y todos los cebadores inversos (491, 547, 628 y 618) contenían un sitio NheI para propósitos de clonación. La región CH1 de IgG4 humana se amplificó por PCR con los números de cebadores: 489 (directo) 488 (inverso), o los números de cebadores 489 (directo) 487 (inverso). El número de cebador directo 489 contenía un sitio NheI, el número de cebador inverso 488 contenía un codón de parada y un sitio EcoRI, y el número de cebador inverso 487 contenía una secuencia de codificación de la etiqueta HPC4, un codón de parada seguido por un sitio EcoRI para propósitos de clonación. El fragmento de PCR 0012Vh digerido por HindIII+NheI, se combinó con el fragmento de PCR CH1 de IgG4 humana digerida por NheI+EcoRI o con el fragmento de PCR CH1-HPC4 de IgG4 humana digerida por NheI+EcoRI y se clonó en los sitios HindIII+EcoRI para un vector basado en pTT. Los vectores resultantes se denominaron pTT-0012Vh -CH1 y pTT-0012Vh -CH1-HPC4, respectivamente. El vector pTT-0012Vh -CH1-HPC4 se muestra en la Figura 5B. Las secuencias de aminoácidos y de ADN de 0012Vh -CH1-HPC4 se muestran en las SEQ ID NO 168-169. Los dominios Vh de pTT-0012Vh -CH1 y pTT-0012Vh -CH1-HPC4 se escindieron por digestión con HindIII+NheI y se insertaron los fragmentos de PCR 0197-0000-0023Vh , 0197-0000-0051Vh y 0197-0000-0052Vh digeridos por HindIII+NheI. Los vectores de expresión resultantes se denominaron: pTT-0023Vh -CH1, pTT-0023Vh -CH1-HPC4, pTT-0051Vh -CH1, pTT-0051Vh -CH1-HPC4, pTT-0052Vh -CH1 y pTT-0052Vh -CH1-HPC4.Sequences 0012V h , 0023V h , 0051V h and 0052V h isolated from 0012Hyb, 0023Hyb, 0051Hyb, 0052Hyb were amplified by PCR with the numbers of primers: 490 (forward) 491 (reverse), 546 (forward) 547 (reverse) ), 627 (forward) 628 (reverse), 617 (forward) 618 (reverse), the primer sequences are shown in Table 4 and SEQ ID NO 60-145, respectively, using the Phusion PCR mix (FinnZymes , Cat. No. F-531L). All forward primers (490, 546, 627, and 617) contained a HindIII site, and all reverse primers (491, 547, 628, and 618) contained a NheI site for cloning purposes. The CH1 region of human IgG 4 was amplified by PCR with primer numbers: 489 (forward) 488 (reverse), or primer numbers 489 (forward) 487 (reverse). Forward primer number 489 contained an NheI site, reverse primer number 488 contained a stop codon and an EcoRI site, and reverse primer number 487 contained a coding sequence for the HPC4 tag, a stop codon followed by an EcoRI site for cloning purposes. The PCR fragment 0012V h digested by HindIII + NheI, combined with the PCR fragment CH1 IgG4 human digested by NheI + EcoRI or with the PCR fragment CH1-HPC4 of IgG4 human digested by NheI + EcoRI and cloned at the HindIII + EcoRI sites for a pTT-based vector. The resulting vectors were named pTT-0012V h -CH1 and pTT-0012V h -CH1-HPC4, respectively. The vector pTT-0012V h -CH1-HPC4 is shown in Figure 5B. The amino acid and DNA sequences of 0012V h -CH1-HPC4 are shown in SEQ ID NO 168-169. The V h domains of pTT-0012V h -CH1 and pTT-0012V h -CH1-HPC4 were cleaved by digestion with HindIII + NheI and the PCR fragments 0197-0000-0023V h , 0197-0000-0051V h and 0197 were inserted. -0000-0052V h digested by HindIII + NheI. The resulting expression vectors were named: pTT-0023V h -CH1, pTT-0023V h -CH1-HPC4, pTT-0051V h -CH1, pTT-0051V h -CH1-HPC4, pTT-0052V h -CH1 and pTT-0052V h -CH1-HPC4.
Ejemplo 11: Desarrollo de los constructos de expresión pTT-0012Vh .T60N-CH1, pTT-0012Vh .T60N-CH1-HPC4, pTT-0052Vh .C91Y-CH1 y pTT-0052Vh .C91Y-CH1-HPC4.Example 11: Development of the expression constructs pTT-0012V h .T60N-CH1, pTT-0012V h .T60N-CH1-HPC4, pTT-0052V h .C91Y-CH1 and pTT-0052V h .C91Y-CH1-HPC4.
Las secuencias 0012Vh .T60N-CH1 y 0052Vh .C91Y-CH1 (lo que incluye la secuencia que codifica el péptido señal) se amplificaron por PCR a partir de pTT-0012HC.T60N y pTT-0052HC.C91Y, respectivamente, mediante el uso de mezcla de Phusion PCR mix (FinnZymes, núm. de cat. F-531L). Para el fragmento de PCR 0012Vh .T60N-CH1, se emplearon el número de cebador directo 572 que contiene un sitio de enzima de restricción HindIII y el número de cebador inverso 488 que contiene un sitio EcoRI para propósitos de clonación o un cebador inverso 487 que contiene una secuencia que codifica una etiqueta HPC4 junto con un sitio EcoRI para propósitos de clonación. Para el fragmento de PCR 0052Vh .C91Y-CH1 se emplearon el número de cebador directo 617 junto con el número de cebador inverso 488 o 487 (las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 4 y las SEQ ID NO 60-145). Los fragmentos de PCR resultantes se digirieron con HindIII+ EcoRI y se insertaron en los sitios HindIII EcoRI de un vector basado en pTT. Los vectores de expresión resultantes se denominaron pTT-0012Vh .T60N-CH1, pTT-0012Vh .T60N-CH1-HPC4, pTT-0052Vh .C91Y-CH1 y pTT-0052Vh .C91Y-CH1-HPC4. La secuencia de aminoácidos codificada por pTT-0012Vh .t 60N-CH1 se muestra en la SEQ ID NO: 0012Vh .T60N-CH1 (también denominada 0061VH-CH1): 146 mientras que la secuencia de aminoácidos correspondiente sin la secuencia del péptido señal N terminal se muestra en la s Eq ID NO: 152.Sequences 0012V h .T60N-CH1 and 0052V h .C91Y-CH1 (including the sequence encoding the signal peptide) were amplified by PCR from pTT-0012HC.T60N and pTT-0052HC.C91Y, respectively, by the use of Phusion PCR mix (FinnZymes, cat. no. F-531L). For the PCR fragment 0012V h .T60N-CH1, forward primer number 572 containing a restriction enzyme site HindIII and reverse primer number 488 containing an EcoRI site for cloning purposes or a 487 reverse primer were used. containing a sequence encoding an HPC4 tag along with an EcoRI site for cloning purposes. For the PCR fragment 0052V h .C91Y-CH1 forward primer number 617 was used together with reverse primer number 488 or 487 (the primer sequences are shown in Table 4 and SEQ ID NO 60-145). The resulting PCR fragments were digested with HindIII + EcoRI and inserted into the HindIII EcoRI sites of a pTT based vector. The resulting expression vectors were named pTT-0012V h .T60N-CH1, pTT-0012V h .T60N-CH1-HPC4, pTT-0052V h .C91Y-CH1, and pTT-0052V h .C91Y-CH1-HPC4. The amino acid sequence encoded by pTT-0012V h .t 60N-CH1 is shown in SEQ ID NO: 0012V h .T60N-CH1 (also called 0061VH-CH1): 146 while the corresponding amino acid sequence without the peptide sequence N-terminal signal is shown in s Eq ID NO: 152.
Ejemplo 12: Desarrollo de los constructos de expresión pTT-FIX-L4b-0012LC y pTT-FIX-L4b-0012LC.C36A.Example 12: Development of the expression constructs pTT-FIX-L4b-0012LC and pTT-FIX-L4b-0012LC.C36A.
La secuencia de ADN del FIX (lo que incluye la secuencia que codifica el péptido señal) se amplificó por PCR a partir de secuencias de ADN de FIX humano mediante el uso del cebador directo 753 y el cebador inverso 754. El cebador directo 753 inserta un sitio de enzima de restricción HindIII de extremo 5' y el cebador inverso 754 inserta un enlazador de glicina-serina de 17 aminoácidos de longitud (L4b: GGGGSGGGGSGGGGSGS) que contiene un sitio de enzima de restricción BamHI de extremo 3' para propósitos de clonación. El fragmento de PCR FIX-L4b se insertó en los sitios HindIII BamHI de pTT-hTF.1-219-L4b-0012LC, es decir, se reemplazó la secuencia de ADN de hTF.1-219 y resultó en el constructo de expresión FIX-L4b-0012LC denominado pTT-FIX-L4b-0012LC (Figura 5A). Las secuencias de aminoácidos y ADN de FIX-L4b-0012LC se muestran en la SEQ ID NO: 172-173.The FIX DNA sequence (including the sequence encoding the signal peptide) was amplified by PCR from human FIX DNA sequences using the 753 forward primer and 754 reverse primer. The 753 forward primer inserts a 5 'end HindIII restriction enzyme site and reverse primer 754 insert a 17 amino acid long glycine-serine linker (L4b: GGGGSGGGGSGGGGSGS) containing a 3' end BamHI restriction enzyme site for cloning purposes. The FIX-L4b PCR fragment was inserted into the HindIII BamHI sites of pTT-hTF.1-219-L4b-0012LC, i.e. the hTF.1-219 DNA sequence was replaced and resulted in the FIX expression construct -L4b-0012LC called pTT-FIX-L4b-0012LC (Figure 5A). The amino acid and DNA sequences of FIX-L4b-0012LC are shown in SEQ ID NO: 172-173.
Para desarrollar un plásmido de expresión que codifica pTT-FIX-L4b-0012LC.C36A la región de codificación 0012LC.C36A, con exclusión de la secuencia de péptido señal, se amplificó por PCR mediante el uso de pTT-0012LC.C36A como plantilla y mediante el uso del cebador directo 1055 que contiene un sitio BamHI de extremo 5' y el cebador inverso 1056 que contiene un codón de parada y un sitio EcoRI para propósitos de clonación (Tabla 4). El fragmento de PCR resultante se insertó en los sitios BamHI y EcoRI de pTT-FIX-L4b-0012LC, es decir, se reemplazó la secuencia de ADN 0012LC con la secuencia de ADN 0012LC.C36A. El vector de expresión resultante se denominó pTT-FIX-L4b-0012LC.C36A y codifica las secuencias de aminoácidos que se muestran en la SEQ ID NO: FIX-L4b-0012LC.C36A (también denominada FIX-L4b-0061LC): 182.To develop an expression plasmid encoding pTT-FIX-L4b-0012LC.C36A the coding region 0012LC.C36A, excluding the signal peptide sequence, was amplified by PCR using pTT-0012LC.C36A as a template and using direct primer 1055 containing a 5 'end BamHI site and reverse primer 1056 containing a stop codon and an EcoRI site for cloning purposes (Table 4). The resulting PCR fragment was inserted into the BamHI and EcoRI sites of pTT-FIX-L4b-0012LC, i.e. replaced DNA sequence 0012LC with DNA sequence 0012LC.C36A. The resulting expression vector was named pTT-FIX-L4b-0012LC.C36A and encodes the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: FIX-L4b-0012LC.C36A (also called FIX-L4b-0061LC): 182.
Ejemplo 13: Desarrollo del constructo de expresión pTT-FVII-L4b-0052VH .C91Y-CH1-HPC4.Example 13: Development of the expression construct pTT-FVII-L4b-0052V H .C91Y-CH1-HPC4.
La secuencia de ADN del FVII humano (lo que incluye la secuencia que codifica el péptido señal) se amplificó por PCR a partir de secuencias de ADN de FVII humano mediante el uso del cebador directo 751 y el cebador inverso 752. El cebador directo 751 inserta un sitio de enzima de restricción HindIII de extremo 5' y el cebador inverso 752 inserta un enlazador de glicina-serina de 17 aminoácidos de longitud (L4b: GGGGSGGGGSGGGGSGS) que contiene un sitio de enzima de restricción BamHI de extremo 3' para propósitos de clonación. El fragmento de PCR FVII-L4b se insertó en los sitios HindIII BamHI de pTT-hTF.1-219-L4b-0012LC, es decir, se sustituyeron las secuencias de ADN de hTF.1-219 y resultó en el constructo de expresión de FVII-L4b-0012LC denominado pTT-FVII-L4b-0012LC. La secuencia de ADN que codifica el 0052Vh C91Y-CH1-HPC4 se amplificó por PCR mediante el uso del vector pTT-0052Vh .C91Y-CH1-Hp C4 como plantilla y mediante el uso del cebador directo 1236 que contiene un sitio de enzima de restricción BamHI de extremo 5' y mediante el uso del cebador inverso 1095 que contiene un codón de parada y un sitio EcoRI para propósitos de clonación. El fragmento de PCR resultante se insertó en el sitio BamHI EcoRI de pTT-FVII-L4b-0012LC, es decir, se reemplazó la secuencia 0012LC y resultó en el vector de expresión denominado pTT-FVII-L4b-0052VH .C91Y-CH1-HPC4. El aminoácido FVII-L4b-0052VH .C91Y-CH1-HPC4 se muestra en la SEQ ID NO: FVII-L4b-0052VH.C91Y-CH1-HPC4 (también denominada FVII-L4b-0062VH-CH1-HPC4): 180.The human FVII DNA sequence (including the sequence encoding the signal peptide) was amplified by PCR from human FVII DNA sequences using the 751 forward primer and 752 reverse primer. The 751 forward primer inserts a 5 'end HindIII restriction enzyme site and reverse primer 752 insert a 17 amino acid long glycine-serine linker (L4b: GGGGSGGGGSGGGGSGS) containing a 3' end BamHI restriction enzyme site for cloning purposes . The FVII-L4b PCR fragment was inserted into the HindIII BamHI sites of pTT-hTF.1-219-L4b-0012LC, i.e. the hTF.1-219 DNA sequences were replaced and resulted in the expression construct of FVII-L4b-0012LC called pTT-FVII-L4b-0012LC. The DNA sequence encoding 0052V h C91Y-CH1-HPC4 was amplified by PCR using the pTT-0052V h .C91Y-CH1-Hp C4 vector as a template and using the 1236 forward primer containing an enzyme site 5'end BamHI restriction restriction and by use of reverse primer 1095 containing a stop codon and an EcoRI site for cloning purposes. The resulting PCR fragment was inserted into the BamHI EcoRI site of pTT-FVII-L4b-0012LC, that is, the sequence 0012LC was replaced and resulted in the expression vector named pTT-FVII-L4b-0052V H .C91Y-CH1- HPC4. The amino acid FVII-L4b-0052V H .C91Y-CH1-HPC4 is shown in SEQ ID NO: FVII-L4b-0052VH.C91Y-CH1-HPC4 (also called FVII-L4b-0062VH-CH1-HPC4): 180.
Ejemplo 14: Transfección transitoria de células HEK293-6E.Example 14: Transient transfection of HEK293-6E cells.
Todos los mAb, Fab y proteínas de fusión se expresaron en células en suspensión HEK293-6E mediante la transfección transitoria de plásmidos de expresión en las células. Las combinaciones de plásmidos individuales subyacentes a los compuestos proteicos específicos resultantes se muestran en la Tabla 5. Las células HEK293-6E se cultivaron en medio Freestyle HEK293 (G iBCO, núm. de cat. 12338-018) suplementado con P/S al 1 % (GIBCO núm. de cat. 15140-122), plurónico al 0,1 % (GIBCO, núm. de cat. 24040-032) y Geneticina (GIBCO, núm. de cat.All mAb, Fab and fusion proteins were expressed in HEK293-6E suspension cells by transient transfection of expression plasmids into the cells. The combinations of individual plasmids underlying the resulting specific protein compounds are shown in Table 5. HEK293-6E cells were grown in HEK293 Freestyle medium (G iBCO, cat # 12338-018) supplemented with P / S at 1 % (GIBCO cat. No. 15140-122), 0.1% pluronic (GIBCO, cat. No. 24040-032) and Geneticin (GIBCO, cat. No.
10131-019) y las células se transfectaron a una densidad celular de aproximadamente 1 mill/ml mediante el uso de 293fectin (GIBCO, núm. de cat. 10040-019) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, para cada litro de células HEK293-6E, la transfección se realizó mediante la dilución de un total de 1 mg de ADN en 30 ml de Optimem (dilución A) y mediante la dilución de 1 ml de 293fectin en 30 ml de Optimem (GIBCO, núm. de cat. 51985 026, dilución B). Las diluciones A y B se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de transfección se añadió posteriormente a las células HEK293-6E y las células se incubaron a 37°C en una incubadora humidificada con rotación orbital (125 rpm). Cinco a siete días después de la tranfección, las células se eliminaron por centrifugación y los sobrenadantes resultantes del cultivo celular se esterilizaron por filtración antes de la purificación. Para todos los experimentos de transfección transitoria mediante el uso de cotransfección de 2 plásmidos de expresión, los plásmidos se cotransfectaron en una relación de plásmido 1:1 (ug:ug) mediante el uso de una cantidad de ADN total de 1 mg por cada litro de células HEK293-6E que se transfectaron.10131-019) and the cells were transfected at a cell density of approximately 1 mill / ml using 293fectin (GIBCO, cat no. 10040-019) according to the manufacturer's instructions. In summary, for each liter of HEK293-6E cells, transfection was performed by diluting a total of 1 mg of DNA in 30 ml of Optimem (dilution A) and by diluting 1 ml of 293fectin in 30 ml of Optimem (GIBCO, cat. No. 51985 026, dilution B). Dilutions A and B were mixed and incubated at room temperature for 30 minutes. The transfection mixture was subsequently added to HEK293-6E cells and the cells were incubated at 37 ° C in a humidified incubator with orbital rotation (125 rpm). Five to seven days after transfection, the cells were removed by centrifugation and the supernatants resulting from the cell culture were filter sterilized before purification. For all transient transfection experiments using cotransfection of 2 expression plasmids, plasmids were cotransfected at a 1: 1 plasmid ratio (ug: ug) using a total DNA amount of 1 mg per liter of HEK293-6E cells that were transfected.
Tabla 4: Números y secuencias de los cebadores.Table 4: Numbers and sequences of the primers.
Tabla 5: Resumen de la combinación de plásmidos subyacente a la expresión de la proteína ID 0061 (SEQ40+41), 0023 (SEQ34+35), 0051 (SEQ36+37), 0062 (SEQ42+39), 0084 (SEQ171+SEQ167), 0074 (SEQ176+177), 0003 (SEQ175+174), 0004 (SEQ178+179), 0135 (SEQ169+SEQ173), 0145 (SEQ32+173) y la proteína ID 5001Table 5: Summary of the combination of plasmids underlying the expression of protein ID 0061 (SEQ40 + 41), 0023 (SEQ34 + 35), 0051 (SEQ36 + 37), 0062 (SEQ42 + 39), 0084 (SEQ171 + SEQ167 ), 0074 (SEQ176 + 177), 0003 (SEQ175 + 174), 0004 (SEQ178 + 179), 0135 (SEQ169 + SEQ173), 0145 (SEQ32 + 173) and protein ID 5001
(SEQ180+39).(SEQ180 + 39).
Ejemplo 15: Purificación y caracterización de los Fab anti-TLT-1 expresados de manera recombinante (Fab0084, Fab0074, Fab0003 y Fab0004).Example 15: Purification and characterization of the recombinantly expressed anti-TLT-1 Fabs (Fab0084, Fab0074, Fab0003 and Fab0004).
La purificación de los Fab anti-TLT-1 (0084, 0074, 0003 y 0004) se realizó mediante el uso de cromatografía de afinidad basada en la resina KappaSelect (GE Healthcare, núm. de cat. 17-5458-01). Los cuatro Fab contienen un único residuo de cisteína libre, cada uno incluido en la secuencia. La purificación se realizó mediante el uso de un sistema de cromatografía ÁktaExplorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112-41). Los sistemas tampón usados para la etapa de purificación fueron un tampón de equilibrado/lavado compuesto de Nafosfato 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y un tampón de elución compuesto de ácido fórmico 20 mM, pH 3,0. No se realizaron ajustes del sobrenadante celular clarificado antes de la aplicación en una columna equilibrada previamente empacada con la resina Kappaselect. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrado/lavado. La proteína se eluyó isocráticamente en aproximadamente 4 volúmenes de columna de tampón de elución. El eluato se ajustó a pH 7 mediante el uso de NaFosfato 0,5 M, pH 9,0. La masa molecular de la proteína eluida se analizó mediante el uso de de geles Bis-Tris al 4-12 % para SDS-PAGE/Coomassie NuPage (Invitrogen, núm. de cat. NP0321BOX) y cromatografía líquida de ionización electropulverización con analizador de tiempo de vuelo en un instrumento Agilent 6210 y una columna de desalinización MassPREP (Waters, núm. de cat. USRM10008656). Se observó una proteína pura y homogénea con una masa molecular esperada. Se realizó además una configuración de análisis de cromatografía líquida de alto resolución de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) en un sistema Agilent LC 1100/1200 y mediante el uso de una columna BIOSep-SEC-S3000 300x7,8 mm (Phenomenex, núm. de cat. 00H-2146-K0) y un tampón de corrida compuesto de NaFosfato 200 mM, pH 6,9, NaCl 300 mM e isopropanol al 10 %. Aquí, la proteína eluyó como un único pico simétrico a un tiempo de retención de aproximadamente 9,1 min a una tasa de flujo de 1 ml/min. Para medir la concentración de proteína final, se usó un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con un coeficiente de extinción de 1,29.Purification of the anti-TLT-1 Fabs (0084, 0074, 0003, and 0004) was performed using the KappaSelect resin-based affinity chromatography (GE Healthcare, Cat. No. 17-5458-01). All four Fabs contain a single free cysteine residue, each included in the sequence. Purification was performed using an ÁktaExplorer chromatography system (GE Healthcare, cat. No. 18-1112-41). The buffer systems used for the purification step were an equilibration / wash buffer composed of 10 mM Naphosphate, pH 7.5, 150 mM NaCl and an elution buffer composed of 20 mM formic acid, pH 3.0. No adjustments were made to the clarified cell supernatant prior to application on a balanced column pre-packed with Kappaselect resin. The column was washed with 5 column volumes of equilibration / wash buffer. Protein was eluted isocratically in approximately 4 column volumes of elution buffer. The eluate was adjusted to pH 7 using 0.5M Naphosphate, pH 9.0. The molecular mass of the eluted protein was analyzed using 4-12% Bis-Tris gels for SDS-PAGE / Coomassie NuPage (Invitrogen, cat. No. NP0321BOX) and time-controlled electrospray ionization liquid chromatography with time analyzer. flight on an Agilent 6210 instrument and a MassPREP desalination column (Waters, cat. no. USRM10008656). A pure and homogeneous protein with an expected molecular mass was observed. A size exclusion high resolution liquid chromatography (SEC-HPLC) analysis setup was also performed on an Agilent LC 1100/1200 system and using a BIOSep-SEC-S3000 300x7.8mm column (Phenomenex, no. Cat. 00H-2146-K0) and a run buffer composed of 200 mM Naphosphate, pH 6.9, 300 mM NaCl and 10% isopropanol. Here, the protein eluted as a single symmetric peak at a retention time of approximately 9.1 min at a flow rate of 1 ml / min. To measure the final protein concentration, a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific) was used together with an extinction coefficient of 1.29.
Ejemplo 16: Purificación y caracterización de la proteína de fusión Fab FIX-anti-TLT-1 expresada de manera recombinante (FIX-Fab0135).Example 16: Purification and characterization of the recombinantly expressed FIX-anti-TLT-1 Fab fusion protein (FIX-Fab0135).
La purificación de FIX-Fab0135 se realizó mediante el uso de un método de cromatografía de afinidad basado en una resina anti-HPC4 (Roche, núm. de cat. 11815024001). La purificación se realizó mediante el uso de un sistema de cromatografía ÁktaExplorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112-41). Los sistemas tampón usados para la etapa de purificación fueron un tampón de equilibrado compuesto de Hepes 20 mM, pH 7,5, CaCb 1,0 mM, NaCl 100 mM y Tween-80 al 0,005 % (v/v), un tampón de lavado compuesto de Hepes 20 mM, pH 7,5, CaCb 1,0 mM, NaCl 1,0 M y Tween-80 al 0,005 % (v/v) y un tampón de elución compuesto de Hepes 20 mM, pH 7,5, EDTA 5,0 mM y NaCl 100 mM. Los sobrenadantes celulares se ajustaron con CaCb 1 mM de concentración final y un pH de 7,5 y se aplicaron sobre una columna anti-HPC4 equilibrada previamente. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrado, 5 volúmenes de columna de tampón de lavado y por último con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrado. La proteína se eluyó isocráticamente en aproximadamente 4 volúmenes de columna de tampón de elución. La proteína se analizó mediante el uso de SDS-PAGE/Coomassie y configuración de espectrometría de masa de desorción ionización por láser asistida por matriz con analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) en un sistema Micro-flex (Bruker Daltonics), lo que muestra que se obtuvo una proteína pura y homogénea con una masa molecular de 106 kDa. Debido a que la masa teórica de la secuencia de aminoácidos para el constructo FIX-Fab0135 fue de 95,9 kDa, la proteína expresada contenía modificaciones postraduccionales. Para medir las concentraciones de proteína finales, se usó un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con un coeficiente de extinción de 1,29.The purification of FIX-Fab0135 was performed using an affinity chromatography method based on an anti-HPC4 resin (Roche, cat. No. 11815024001). Purification was performed using an ÁktaExplorer chromatography system (GE Healthcare, cat. No. 18-1112-41). The buffer systems used for the purification step were a balancing buffer composed of 20mM Hepes, pH 7.5, 1.0mM CaCb, 100mM NaCl and 0.005% (v / v) Tween-80, a buffer of wash composed of 20 mM Hepes, pH 7.5, 1.0 mM CaCb, 1.0 M NaCl and 0.005% (v / v) Tween-80 and an elution buffer composed of 20 mM Hepes, pH 7.5 , 5.0 mM EDTA and 100 mM NaCl. Cell supernatants were adjusted with 1 mM CaCb of final concentration and a pH of 7.5 and applied on a previously equilibrated anti-HPC4 column. The column was washed with 5 column volumes of equilibration buffer, 5 column volumes of washing buffer and finally with 5 column volumes of equilibration buffer. Protein was eluted isocratically in approximately 4 column volumes of elution buffer. The protein was analyzed using SDS-PAGE / Coomassie and matrix-assisted laser ionization desorption mass spectrometry with time-of-flight analyzer (MALDI-TOF MS) in a Micro-flex system (Bruker Daltonics), which shows that a pure and homogeneous protein with a molecular mass of 106 kDa was obtained. Because the theoretical mass of the amino acid sequence for the FIX-Fab0135 construct was 95.9 kDa, the expressed protein contained post-translational modifications. To measure concentrations of final protein, a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific) was used together with an extinction coefficient of 1.29.
Ejemplo 17: Plásmidos mutantes pcDNA3.1(+)-hTLT-1 ECD-HPC4 ala.Example 17: pcDNA3.1 (+) - hTLT-1 ECD-HPC4 ala mutant plasmids.
Cuarenta constructos de expresión mutantes hTLT-1 ECD-HPC4 Ala se diseñaron de acuerdo con la Tabla 6. Los constructos de expresión se desarrollaron por el contratista externo GENEART AG (Im Gewerbepark B35, 93059 Regensburg, Alemania) y todos los 40 constructos de expresión se fabricaron en base al vector de expresión denominado pcDNA3.1(+). Las alícuotas de ADN para cada uno de los 40 constructos de expresión hTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1(+) se transfectaron en células en suspensión HEK293-6E para expresar transitoriamente cada proteína mutante del hTLT-1 ECD-HPC4 Ala (Tabla 6). La transfección transitoria y el cultivo de las células HEK293-6E se realizaron como se describió en el ejemplo 14.Forty hTLT-1 ECD-HPC4 Ala mutant expression constructs were designed according to Table 6. The expression constructs were developed by the external contractor GENEART AG (Im Gewerbepark B35, 93059 Regensburg, Germany) and all 40 expression constructs were made based on the expression vector called pcDNA3.1 (+). DNA aliquots for each of the 40 hTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1 (+) expression constructs were transfected into HEK293-6E suspension cells to transiently express each mutant protein of hTLT-1 ECD-HPC4 Ala (Table 6). Transient transfection and culture of HEK293-6E cells were performed as described in Example 14.
wt Tipo silvestrewt wild type
1 L22A1 L22A
2 V25A2 V25A
3 Q27A3 Q27A
4 V30A4 V30A
5 L35A5 L35A
6 H39A6 H39A
7 R41A7 R41A
8 L42A8 L42A
9 Q43A9 Q43A
10 K46A10 K46A
11 Q48A11 Q48A
12 F54A12 F54A
13 L55A13 L55A
14 P56A14 P56A
15 E57A15 E57A
16 Q60A16 Q60A
17 D68A17 D68A
18 R69A18 R69A
19 R70A19 R70A
20 R75A20 R75A
21 L82A21 L82A
22 L86A22 L86A
23 E90A23 E90A
24 M91A24 M91A
25 T93A25 T93A
26 Q95A26 Q95A
27 E96A27 E96A
28 E97A28 E97A
29 D107A29 D107A
30 R110A30 R110A
31 H116A31 H116A
32 R117A32 R117A
33 S119A33 S119A
34 P125A34 P125A
35 E126A35 E126A
36 E128A36 E128A
37 E130A37 E130A
38 S136A38 S136A
39 N140A39 N140A
40 K159A 40 K159A
Ejemplo 18: Purificación y caracterización de anticuerpos monoclonales anti-TLT-1 (mAb0012, mAb0023, mAb0051, mAb0061, mAb0062).Example 18: Purification and characterization of monoclonal anti-TLT-1 antibodies (mAb0012, mAb0023, mAb0051, mAb0061, mAb0062).
La purificación de los anticuerpos monoclonales anti-TLT-1 monoclonales expresados de manera recombinante descritos en la Tabla 5 se realizó mediante un proceso en 2 etapas compuesto por cromatografía de afinidad mediante el uso de una resina MabSelect SuRe de proteína A (GE Healthcare, núm. de cat. 17-5438-01) y cromatografía de filtración en gel mediante el uso de una columna Superdex 200 PrepGrade 26/60 (GE Healthcare, núm. de cat. 17 1071-01). Las purificaciones se realizaron mediante el uso de un sistema de cromatografía ÁktaExplorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112-41). Los sistemas tampón usados para la etapa de purificación por afinidad fueron un tampón de equilibrado compuesto de NaFosfato 20 mM pH 7,2, NaCl 150 mM, un tampón de elución compuesto de ácido fórmico 10 mM pH 3,5 y un tampón de ajuste del pH compuesto de NaFosfato 0,5 M pH 9,0. Los sobrenadantes celulares se aplicaron directamente sin ningún ajuste sobre una columna MabSelect SuRe equilibrada previamente. La columna se lavó con 15 volúmenes de columna de tampón de equilibrado y los anticuerpos monoclonales se eluyeron isocráticamente en aproximadamente 2-5 volúmenes de columna de tampón de elución. Las fracciones agrupadas se ajustaron a pH neutro mediante el uso del tampón de ajuste del pH descrito, inmediatamente después de la elución. La proteína se purificó posteriormente y el tampón se intercambió mediante el uso de dicha columna de filtración en gel. El tampón de corrida usado para la cromatografía de exclusión por tamaño fue His 25 mM pH 6,5, NaCl 135 mM. La tasa de flujo usada fue 2,5 ml/min y los anticuerpos monoclonales anti-TLT-1 eluyeron como picos únicos en aproximadamente 0,4 volúmenes de columna. Basado en el análisis de fracciones en todo el pico mediante el uso del método de SEC-HPLC descrito anteriormente (como se describió en el ejemplo 2), se prepararon agrupaciones que contenían una proteína del anticuerpo puro que eluye como picos simétricos a aproximadamente 8,5 min y con un contenido mínimo de proteína de alto peso molecular de elución temprana. Purification of the recombinantly expressed monoclonal anti-TLT-1 monoclonal antibodies described in Table 5 was performed by a 2-step process consisting of affinity chromatography using a MabSelect SuRe protein A resin (GE Healthcare, no. Cat. 17-5438-01) and gel filtration chromatography using a Superdex 200 PrepGrade 26/60 column (GE Healthcare, Cat. No. 17 1071-01). Purifications were performed using an AktaExplorer chromatography system (GE Healthcare, cat. No. 18-1112-41). The buffer systems used for the affinity purification step were a balancing buffer composed of 20 mM Naphosphate pH 7.2, 150 mM NaCl, an elution buffer composed of 10 mM formic acid pH 3.5 and an adjustment buffer of the Composite pH of 0.5M Naphosphate pH 9.0. Cell supernatants were applied directly without any adjustment on a previously balanced MabSelect SuRe column. The column was washed with 15 column volumes of equilibration buffer and the monoclonal antibodies were eluted isocratically in approximately 2-5 column volumes of elution buffer. The pooled fractions were adjusted to neutral pH using the described pH adjustment buffer immediately after elution. The protein was subsequently purified and the buffer was exchanged by using said gel filtration column. The run buffer used for size exclusion chromatography was His 25mM pH 6.5, 135mM NaCl. The flow rate used was 2.5 ml / min and the anti-TLT-1 monoclonal antibodies eluted as single peaks at approximately 0.4 column volumes. Based on analysis of fractions in the entire peak using the SEC-HPLC method described above (as described in Example 2), pools were prepared containing a pure antibody protein that elutes as symmetric peaks at approximately 8, 5 min and with a minimum content of high molecular weight protein of early elution.
Los anticuerpos purificados se caracterizaron mediante el uso de los métodos de SDS-PAGE/Coomassie descritos anteriormente (como se describió en el ejemplo 2) y los métodos de SEC-HPLC, lo que muestra que todas las preparaciones de proteínas del anticuerpo producidas fueron altamente homogéneas. Todos los anticuerpos mostraron los componentes de cadena pesada de aproximadamente 50 kDa y componentes de cadena ligera de aproximadamente 25 kDa esperados cuando se usaron condiciones de reducción antes de ejecutar los análisis de SDS-PAGE/Coomassie. Las determinaciones de masa molecular intacta se realizaron mediante el uso de una configuración del método de espectrometría de masa de electropulverización ionización con análisis de tiempo de vuelo cromatografía líquida en un instrumento Agilent 6210 y una columna de desalinización MassPREP (Waters, núm. de cat. USRM10008656). El sistema tampón usado fue un tampón de equilibrado compuesto de ácido fórmico al 0,1 % en H2O grado LC-MS y un tampón de elución compuesto de ácido fórmico al 0,1 % en ACN de grado LC-MS. Todos los anticuerpos mostraron masas moleculares intactas de 147,2 - 148,6 kDa, que es aproximadamente 2,7 -3,1 kDa por encima de las masas teóricas de las secuencias de aminoácidos para cada uno de los anticuerpos. Por lo tanto, todos los anticuerpos anti-TLT-1 expresados de manera recombinante mostraron modificaciones postraduccionales correspondientes a las N-glicosilaciones esperadas de HC. Se obtuvieron para los seis anticuerpos purezas finales del 95 - 99 %. Para verificar la secuencia N terminal de los anticuerpos anti-TLT-1 clonados y purificados, se realizaron degradaciones EDMAN mediante el uso de un sistema secuenciador automatizado (Secuenciador de Proteínas 494 de Applied Biosystems). Se realizaron 10-20 ciclos de degradación para cada anticuerpo. Aquí, las secuencias de cadena ligera y pesada esperadas se confirmaron para los seis anticuerpos anti-TLT-1 clonados. Para medir las concentraciones de proteína finales, se usó un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con coeficientes de extinción específicos para cada uno de los seis anticuerpos que variaron de 1,34 1,51.The purified antibodies were characterized by using the SDS-PAGE / Coomassie methods described above (as described in Example 2) and the SEC-HPLC methods, showing that all of the antibody protein preparations produced were highly homogeneous. All antibodies exhibited the approximately 50 kDa heavy chain components and approximately 25 kDa light chain components expected when reduction conditions were used prior to running the SDS-PAGE / Coomassie analyzes. Intact molecular mass determinations were made using an ionization electrospray mass spectrometry method setup with liquid chromatography time-of-flight analysis on an Agilent 6210 instrument and a MassPREP desalination column (Waters, cat. USRM10008656). The buffer system used was an equilibration buffer composed of formic acid at 0.1% in H 2 O grade LCMS and an elution buffer composed of formic acid in ACN 0.1% grade LCMS. All the antibodies showed intact molecular masses of 147.2-148.6 kDa, which is approximately 2.7-3.1 kDa above the theoretical masses of the amino acid sequences for each of the antibodies. Therefore, all recombinantly expressed anti-TLT-1 antibodies showed post-translational modifications corresponding to the expected N-glycosylations of HC. Final purities of 95-99% were obtained for the six antibodies. To verify the N-terminal sequence of cloned and purified anti-TLT-1 antibodies, EDMAN degradations were performed using an automated sequencing system (Applied Biosystems Protein Sequencer 494). 10-20 degradation cycles were performed for each antibody. Here, the expected light and heavy chain sequences were confirmed for the six cloned anti-TLT-1 antibodies. To measure the final protein concentrations, a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific) was used together with specific extinction coefficients for each of the six antibodies ranging from 1.34 1.51.
Ejemplo 19: Unión al mAb y competencia de diferentes mAb para la unión al TLT-1.Example 19: Binding to mAb and competition of different mAb for binding to TLT-1.
Materiales:Materials:
Tabla 7: ReactivosTable 7: Reagents
Método: Los mAb de interés se inmovilizaron ya sea directamente a un chip CM5 o mediante captura a través de un mAb de captura de Fc humano inmovilizado a un chip CM5, mientras que TLT-1-His se inmovilizó mediante captura a través de un chip CM5 de mAb anti-His para el análisis de Fab. Los reactivos que se usaron se muestran en la Tabla 7.Method: mAbs of interest were immobilized either directly to a CM5 chip or by capture via a human Fc capture mAb immobilized to a CM5 chip, while TLT-1-His was immobilized by capture through a chip Anti-His mAb CM5 for Fab analysis. The reagents that were used are shown in Table 7.
Captura directa del mAb: Los mAb para TLT-1 se inmovilizaron a un nivel de aprox. 500-1000 RU en un chip CM5 (50 |jg/ml diluido en Na-acetato, pH 4,0) mediante el uso del procedimiento estándar recomendado por el proveedor. Se analizaron diluciones de dos veces del TLT-1 desde 200 nM hasta 0,2 nM por su unión a los mAb. Tampón de corrida y de dilución: HEPES 10 mM, 150 mM, p20 al 0,005 %, pH 7,4. La regeneración se obtuvo mediante glicina 10 mM, pH 1,7.Direct capture of the mAb: The mAbs for TLT-1 were immobilized at a level of approx. 500-1000 RU on a CM5 chip (50 | jg / ml diluted in Na-acetate, pH 4.0) using the standard procedure recommended by the supplier. Two-fold dilutions of TLT-1 from 200 nM to 0.2 nM were analyzed for its binding to mAbs. Run and dilution buffer: 10mM, 150mM HEPES, 0.005% p20, pH 7.4. Regeneration was obtained by 10 mM glycine, pH 1.7.
Captura del mAb a través del mAb Fc humano: El mAb Fc humano se inmovilizó a aprox. 10000 RU. Se añadió el mAb de interés (aprox. 100 nM). Se analizaron diluciones de dos veces del TLT-1 desde 200 nM hasta 0,2 Nm. Tampón de corrida y de dilución: HEPES 10 mM, 150 mM, p20 al 0,005 %, pH 7,4. La regeneración se obtuvo en MgCb 3 M. Capture of the mAb through the human Fc mAb: The human Fc mAb was immobilized at approx. 10,000 RU. The mAb of interest (approx. 100 nM) was added. Two-fold dilutions of TLT-1 from 200 nM to 0.2 Nm were analyzed. Run and dilution buffer: 10mM, 150mM HEPES, 0.005% p20, pH 7.4. Regeneration was obtained in 3M MgCb.
Captura del TLT-1-His mediante el mAb anti-His (I+D núm. MAB050): El mAb anti-His se inmovilizó a aprox. 9000 RU. El TLT-1-His se añadió a un nivel de aprox. 30-40 RU (10 jg/m l diluido en Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween-20 al 0,005 %) mediante el uso del procedimiento estándar recomendado por el proveedor. Se evaluaron diluciones de 8 veces de Fab desde 3 hasta 0,047 jg/m l por su unión al TLT-1-His. Tampón de corrida y de dilución: Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween-20 al 0,005 %. La regeneración se obtuvo mediante MgCb 3 M. Capture of the TLT-1-His by the anti-His mAb (R&D No. MAB050): The anti-His mAb was immobilized at approx. 9000 RU. TLT-1-His was added at a level of approx. 30-40 RU (10 jg / ml diluted in 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Tween-20) using the standard procedure recommended by the supplier. 8-fold dilutions of Fab from 3 to 0.047 jg / µl were evaluated for their binding to TLT-1-His. Run and dilution buffer: 10mM Hepes, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% Tween-20. Regeneration was obtained by 3M MgCb.
La determinación de constantes cinéticas y de unión (ko n , ko f f, Kd ) se obtuvo al asumir una interacción 1:1 del TLT-1 y fibrinógeno mediante el uso del programa informático de evaluación Biacore T100.The determination of kinetic and binding constants (k on , k off , K d ) was obtained by assuming a 1: 1 interaction of TLT-1 and fibrinogen using the Biacore T100 evaluation software.
Competencia.El análisis de interacción de unión por competencia se obtuvo por Resonancia de Plasmón de Superficie en un Biacore T-100 que analizó la unión de diversos mAb para TLT-1 al TLT-1 cuando se une al mAb0012 inmovilizado (o un mAb alternativo). Se logró la inmovilización directa a un chip CM5 de los mAb a un nivel de 5000 10 000 RU en acetato de sodio 10 mM pH 4,5-5,0. Esto se siguió por la unión del TLT-1 50 nM y después de 2 min de disociación seguido por la unión de otros tres mAb a evaluar en cuanto a la competencia. Tampón de corrida y de dilución: HEPES 10 mM, 150 mM, p20 al 0,005 %, pH 7,4. La regeneración se obtuvo mediante glicina 10 mM, pH 1,7. Competition. Competition binding interaction analysis was obtained by Surface Plasmon Resonance on a Biacore T-100 that analyzed the binding of various mAbs for TLT-1 to TLT-1 when bound to immobilized mAb0012 (or an alternative mAb ). Direct immobilization to a CM5 chip of the mAbs was achieved at a level of 5000 10,000 RU in 10 mM sodium acetate pH 4.5-5.0. This was followed by binding of the 50 nM TLT-1 and after 2 min of dissociation followed by binding of three other mAbs to be assessed for competition. Run and dilution buffer: 10mM, 150mM HEPES, 0.005% p20, pH 7.4. Regeneration was obtained by 10 mM glycine, pH 1.7.
Resultados:Results:
Tabla 8Table 8
Tabla 9: Análisis de SPR. Constante de unión para la unión al TLT-1. Competencia con mAb0012Table 9: Analysis of SPR. Binding constant for binding to the TLT-1. Competition with mAb0012
Conclusión:, Las constantes de unión para mAb0061, mAb0023, mAb0051 y mAb0062 y Fab0074, Fab0084, Fab0003 y Fab0004 se estimaron mediante análisis de Biacore (ver la Tabla 8). El mAb0061 y el mAb0051 no compiten con ninguno de los otros mAb por la unión (ver la Tabla 9). El mAb0023 y el mAb0062 compiten entre sí (ver la Tabla 9). Conclusion :, The binding constants for mAb0061, mAb0023, mAb0051 and mAb0062 and Fab0074, Fab0084, Fab0003 and Fab0004 were estimated by Biacore analysis (see Table 8). MAb0061 and mAb0051 do not compete with any of the other mAbs for binding (see Table 9). MAb0023 and mAb0062 compete with each other (see Table 9).
Ejemplo 20: Preparación de vesículas PS:PC 20:80 y clonación, expresión, replegamiento y relipidación de TLT-1. Example 20: Preparation of PS: PC 20:80 vesicles and cloning, expression, refolding and re-replication of TLT-1.
El TLT-1 relipidado en vesículas PS:PC 20:80 se preparó mediante el uso de Triton X-100 como detergente como se describe en Smith y Morrissey (2005) J. Thromb. Haemost., 2, 1155-1162 excepto que se usó TLT-1 en lugar de TF. The 20: 80 PS: PC relipidated TLT-1 was prepared by using Triton X-100 as a detergent as described in Smith and Morrissey (2005) J. Thromb. Haemost., 2, 1155-1162 except that TLT-1 was used instead of TF.
Materiales materials
Medio LB con Kanamicina (50 mg/ml). Kanamicina Sigma K-0254LB medium with Kanamycin (50 mg / ml). Kanamycin Sigma K-0254
IPTG 1000 mM (IPTG Sigma I-6758)1000 mM IPTG (IPTG Sigma I-6758)
Tampón de lisis: Bugbuster 1x (Novagen) en Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0. Añadir lisozima 0,5 mg/ml DNAseI. Añadir Coctel Inhibidor Completo 1x (Roche)Lysis Buffer: Bugbuster 1x (Novagen) in 50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 2mM EDTA, pH 8.0. Add lysozyme 0.5 mg / ml DNAseI. Add Complete Inhibitor Cocktail 1x (Roche)
Tampón de lavado-IB 1: bugbuster en tampón-IB 1:10. Añadir lisozima 50 pg/ml Coctel Inhibidor Completo 0,5x (Roche)Wash Buffer-IB 1: Bugbuster in Buffer-IB 1:10. Add lysozyme 50 pg / ml Complete Inhibitor Cocktail 0.5x (Roche)
Tampón de lavado-IB 2: Bugbuster en tampón-IB 1:10Wash Buffer-IB 2: Bugbuster in Buffer-IB 1:10
Tampón-IB: Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0Buffer-IB: 50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 2mM EDTA, pH 8.0
Tampón GndHCl: Guanidinio HCl 6 M, Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM, Triton X-100 red. al 0,1 %, pH 8,0 GndHCl buffer: 6M Guanidinium HCl, 50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, Triton X-100 red. 0.1%, pH 8.0
Tampón de replegado: Tris-HCl 50 mM, Arginina 800 mM, Triton X-100 al 0,1 %, glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado 0,5 mM pH 8,5Refolding buffer: 50mM Tris-HCl, 800mM Arginine, 0.1% Triton X-100, 5mM reduced glutathione, 0.5mM oxidized glutathione pH 8.5
Tampón de diálisis: Tris-HCl 20 mM, Triton X-100 al 0,1 %, pH 8,0Dialysis buffer: 20mM Tris-HCl, 0.1% Triton X-100, pH 8.0
DTT:Glutatión reducido (Sigma G4251) Glutatión oxidado Sigma G4376DTT: Reduced Glutathione (Sigma G4251) Oxidized Glutathione Sigma G4376
PC: 10 mg/ml de L-D-fosfatidilcolina (Huevo, pollo) en cloroformo (Avanti Polar Lipids Inc.) Núm. Cat. 840051C. Mw 760,09PC: 10 mg / ml L-D-phosphatidylcholine (Egg, chicken) in chloroform (Avanti Polar Lipids Inc.) Cat. No. 840051C. MW 760.09
PS: 10 mg/ml de sal sódica de L-D-fosfatidilserina (cerebro, porcino) en cloroformo. (Avanti Polar Lipids Inc.) Núm. Cat. 840032C. Mw 812,05PS: 10 mg / ml of L-D-phosphatidylserine sodium salt (brain, pig) in chloroform. (Avanti Polar Lipids Inc.) Cat. No. 840032C. MW 812.05
Triton X-100: Triton X-100 al 10 %, hidrogenado, detergente de grado proteico, filtrado estéril. Calbiochem. Núm. Cat.Triton X-100: 10% Triton X-100, hydrogenated, protein grade detergent, sterile filtered. Calbiochem. Cat.
648464 Concentración 159 mM (PM 628)648464 159 mM concentration (PM 628)
Tampón HBS: HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4HBS Buffer: 50mM HEPES, 100mM NaCl, pH 7.4
Bioperlas: Bio-Beads SM2 Adsorbent, malla 20-50 BioRad Laboratories, Núm. Cat. 152-3920.Biobeads: Bio-Beads SM2 Adsorbent, 20-50 mesh BioRad Laboratories, Cat. No. 152-3920.
MétodoMethod
Expresión: El TLT-1 (hTLT-1.18-188; SEQ ID NO: 149), lo que incluye dominio extracelular, enlazador y dominio transmembrana, se clonó en pET24a mediante el uso de los cebadores 1004 (SEQ ID NO: 150) y 1005 (SEQ ID NO: 151) y pTT-hTLT-1 como plantilla. Se emplearon técnicas estándar para la preparación del ADN. La transformación se realizó en BL21 (DE3). Cultivo durante toda la noche: se mezclaron 1 x 50 ml de medio LB en matraces de 250 ml (plásticos) y 50 pl de Kanamicina 50 mg/ml 1 colonia (transformación) a partir de la placa de BL21. El cultivo se incubó ON a 37 oC, 220 rpm. Cultuivo iniciador: se añadieron 2 x 500 ml de medio LB en matraces de 2 l (plásticos) con 300 pl de Kanamicina 50 mg/ml. Se añadieron 10 ml del cultivo ON del TLT-1/Pet24a en BL21 (DE3) y se siguió a OD600. Se incubó a 37 oC, 220 rpm.Expression: TLT-1 (hTLT-1.18-188; SEQ ID NO: 149), including extracellular domain, linker, and transmembrane domain, was cloned into pET24a using primers 1004 (SEQ ID NO: 150) and 1005 (SEQ ID NO: 151) and pTT-hTLT-1 as a template. Standard techniques were used for DNA preparation. The transformation was carried out in BL21 (DE3). Overnight culture: 1 x 50 ml of LB medium was mixed in 250 ml flasks (plastics) and 50 µl of Kanamycin 50 mg / ml 1 colony (transformation) from the BL21 plate. The culture was incubated ON at 37 oC, 220 rpm. Starter culture: 2 x 500 ml of LB medium were added in 2 l flasks (plastics) with 300 µl of Kanamycin 50 mg / ml. 10 ml of the ON culture of TLT-1 / Pet24a in BL21 (DE3) was added and OD600 was followed. Incubated at 37 oC, 220 rpm.
Inducción: 2 x 500 ml con TLT-1 lip/pET24a ~ BL21 (DE3) en LB. Se añadió ~ 0,2 mM de IPTG (100 pl de 1 M) a 25 °C al cultivo celular cuando la OD600 alcanzó entre 0,6 - 0,8. Esto se incubó durante 3 h a 25 °C, 220 rpm. El cultivo se cosechó después de 3 h y se centrifugó durante 30 min a 4600 rpm. El sobrenadante se desechó. El sedimento se almacenó a -20 °C. Lisis de cuerpos de inclusión: El sedimento de E. coli se resuspendió en 5 ml de tampón de lisis/g de sedimento. Se añadió MgSO4 hasta 5 mM para respaldar la actividad ADNseI. La suspensión celular se incubó en plataforma de agitación durante 20 min a temperatura ambiente. El lisado se aclaró mediante centrifugación a 20.000 g (8500 rpm) durante 20 min a 4 °C. El sedimento se resuspendió en 100 ml de tampón de lavado IB. La suspensión se mezcló mediante agitación en vórtice suave y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. La suspensión se centrifugó a 20 000 g durante 20 min a 4 °C para colectar los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se resuspendieron en 100 ml de tampón de lavado-IB 2. La muestra se centrifugó a 20000 g durante 20 min a 4 °C para colectar los cuerpos de inclusión. El sedimento se resuspendió en 100 ml de agua y se centrifugó a 20000 g durante 20 min a 4 °C para colectar los cuerpos de inclusión. Replegado:El sedimento se solubilizó nuevamente en x ml de tampón GdnHCl (20 ml). La concentración final del TLT-1 (se midió A280) fue de 1-2 mg/ml. Se añadió DTT (400 pl) hasta una concentración final de 20 mM. La solubilización completa se aseguró mediante agitación magnética durante ~ 1-2,5 hr (1,5 h) a temperatura ambiente. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 20000 g durante 20 min. Se usó una bomba peristáltica lentamente (durante toda la noche) para transferir la solución de GdnHCl/proteína (20 ml) al tampón de replegado >20x (400 ml) a 4 °C. El tampón de replegado se agitó rápidamente para asegurar la dilución rápida. La corrida de la bomba se obtuvo a la tasa de flujo 1x, velocidad 2,5, 4 °C y se dejó durante toda la noche a 4 °C. La proteína precipitada se eliminó mediante centrifugación a 20 000 g (8500 rpm) en tubos de 50 ml durante 30 min. El lip de TLT-1 se concentró desde 400 ml hasta 120 ml en un filtro Amico de 76 mm de diámetro, 10000 MWCO a 4,5 bar. La proteína se analizó en un SDS-Page mediante precipitación con EtOH debido al GdnHCl en la muestra. Se concentraron 2x 500 j l y 2x 25 j l en tubos de 0,5 ml con 10000 MWCO. Se mezcló 50 |jl de la muestra 9 vol. de EtOH helado al 99 % (450 j l) y se colocó a -20 °C durante 10 min. La muestra se centrifugó a una velocidad total de 13000 rpm durante 5 min. El sedimento se lavó con 450 j l de EtOH frío al 96 % 50 j l de MQ. Centrifugar nuevamente. Dejar secar (el EtOH debe eliminarse antes del SDS-PAGE). Se resuspendieron 100 j l con tampón de muestra 1xInduction: 2 x 500 ml with TLT-1 lip / pET24a ~ BL21 (DE3) in LB. ~ 0.2mM IPTG (100 µl 1M) was added at 25 ° C to the cell culture when the OD 600 reached between 0.6-0.8. This was incubated for 3 hr at 25 ° C, 220 rpm. The culture was harvested after 3 hr and centrifuged for 30 min at 4600 rpm. The supernatant was discarded. The sediment was stored at -20 ° C. Lysis of inclusion bodies: The E. coli pellet was resuspended in 5 ml of lysis buffer / g of pellet. Up to 5mM MgSO4 was added to support DNAseI activity. The cell suspension was incubated on a shaking platform for 20 min at room temperature. The lysate was cleared by centrifugation at 20,000 g (8,500 rpm) for 20 min at 4 ° C. The pellet was resuspended in 100 ml of IB wash buffer. The suspension was mixed by shaking in a soft vortex and incubated at room temperature for 5 min. The suspension was centrifuged at 20,000 g for 20 min at 4 ° C to collect the inclusion bodies. The inclusion bodies were resuspended in 100 ml of IB-2 wash buffer. The sample was centrifuged at 20,000 g for 20 min at 4 ° C to collect the inclusion bodies. The pellet was resuspended in 100 ml of water and centrifuged at 20,000 g for 20 min at 4 ° C to collect the inclusion bodies. Refolded: The pellet was re-solubilized in x ml of GdnHCl buffer (20 ml). The final concentration of TLT-1 (A280 was measured) was 1-2 mg / ml. DTT (400 pl) was added to a final concentration of 20mM. Complete solubilization was ensured by magnetic stirring for ~ 1-2.5 hr (1.5 h) at room temperature. Insoluble material was removed by centrifugation at 20,000 g for 20 min. A peristaltic pump was used slowly (overnight) to transfer the GdnHCl / protein solution (20 ml) to the refolding buffer> 20x (400 ml) at 4 ° C. The refolding buffer was rapidly shaken to ensure rapid dilution. The pump run was obtained at the 1x flow rate, speed 2.5, 4 ° C and was left overnight at 4 ° C. The precipitated protein was removed by centrifugation at 20,000 g (8,500 rpm) in 50 ml tubes for 30 min. The TLT-1 lip was concentrated from 400 ml to 120 ml on a 76 mm diameter Amico filter, 10,000 MWCO at 4.5 bar. Protein was analyzed on SDS-Page by EtOH precipitation due to GdnHCl in the sample. 2x 500 jl and 2x 25 jl were concentrated in 0.5 ml tubes with 10,000 MWCO. 50 | jl of sample 9 vol. of 99% frozen EtOH (450 jl) and placed at -20 ° C for 10 min. The sample was centrifuged at a total speed of 13000 rpm for 5 min. The pellet was washed with 450 ml of cold 96% EtOH 50 ml of MQ. Centrifuge again. Let dry (EtOH must be removed before SDS-PAGE). 100 jl were resuspended with 1x sample buffer
Preparación de PS:PC y relipidación: Se siguió el protocolo exacto descrito en Smith SA y Morrissey JH (2004) “Rapid and efficient incorporación of tissue factor into liposomes”. J. Thromb. Haemost. 2:1155-1162 para la relipidación del TLT-1.Preparation of PS: PC and relipidation: The exact protocol described in Smith SA and Morrissey JH (2004) "Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes" was followed. J. Thromb. Haemost. 2: 1155-1162 for relipidation of the TLT-1.
Ejemplo 21: Análisis de la unión de fibrinógeno al TLT-1 y competencia de unión entre los mAb para TLT-1 y el fibrinógeno.Example 21: Analysis of fibrinogen binding to TLT-1 and binding competition between mAbs for TLT-1 and fibrinogen.
El TLT-1 se une al fibrinógeno mediante análisis de SPR. Además, se analizó la unión simultánea de fibrinógeno y cada uno de los cuatro mAb: mAb0012, mAb0023, mAb0051 y mAb0062 mediante análisis de SPR en un instrumento Biacore T100.TLT-1 binds to fibrinogen by SPR analysis. In addition, simultaneous binding of fibrinogen and each of the four mAbs: mAb0012, mAb0023, mAb0051, and mAb0062 was analyzed by SPR analysis on a Biacore T100 instrument.
Los materiales usados se muestran en la Tabla 10.The materials used are shown in Table 10.
Tabla 10Table 10
Método:Method:
El TLT-1 humano se inmovilizó a un nivel de aprox. 1000 RU en un chip CM5 (50 jg/m l diluido en acetato de Na, pH 4,0) mediante el uso del procedimiento estándar recomendado por el proveedor. Se analizaron diluciones de cuatro veces del fibrinógeno humano desde 200 nM a 0,2 nM para la unión al TLT-1 inmovilizado. Tampón de corrida y de dilución: HEPES 10 mM, 150 mM, p20 al 0,005 %, pH 7,4. La regeneración se obtuvo mediante glicina 10 mM, pH 1,7. La determinación de las constantes cinéticas y de unión (ko n , ko f f, Kd ) se obtuvo al asumir una interacción 1:1 del TLT-1 y fibrinógeno mediante el uso del programa informático de evaluación Biacore T100 (Tabla 11).Human TLT-1 was immobilized at a level of approx. 1000 RU on a CM5 chip (50 jg / ml diluted in Na acetate, pH 4.0) using the standard procedure recommended by the supplier. Four-fold dilutions of human fibrinogen from 200 nM to 0.2 nM were analyzed for binding to immobilized TLT-1. Run and dilution buffer: 10mM, 150mM HEPES, 0.005% p20, pH 7.4. Regeneration was obtained by 10 mM glycine, pH 1.7. The determination of the kinetic and binding constants (k on , k off , K d ) was obtained by assuming a 1: 1 interaction of TLT-1 and fibrinogen using the Biacore T100 evaluation software (Table 11).
La competencia de los diferentes mAb por la unión al TLT-1 y a fibrinógeno simultáneamente se analizó mediante la inmovilización de cada uno de los mAb a aproximadamente 10000-15 000 RU en un chip CM5 seguido de la unión del TLT-1 50 nM seguido de una disociación de 2-3 min mediante la variación de las concentraciones de los mAb a analizar para la competencia. La regeneración del chip se obtuvo mediante glicina 10 mM, pH 1,7.(Tabla 12).The competence of the different mAbs for binding to TLT-1 and fibrinogen simultaneously was analyzed by immobilizing each of the mAbs at approximately 10,000-15,000 RU on a CM5 chip followed by binding of 50 nM TLT-1 followed by a 2-3 min dissociation by varying the concentrations of the mAb to be analyzed for competition. The regeneration of the chip was obtained by means of 10 mM glycine, pH 1.7 (Table 12).
Resultados:Results:
Tabla 11: Unión del TLT-1 al fibrinógenoTable 11: Binding of TLT-1 to fibrinogen
Tabla 12: Competencia con fibrinógeno.El mAb de interés se inmovilizó en un chip. La adición del TLT-1 se siguió de fibrinógeno (un emparedado).Table 12: Competition with fibrinogen. The mAb of interest was immobilized on a chip. The addition of TLT-1 was followed by fibrinogen (a sandwich).
Conclusión:, Conclusion:,
El TLT-1 (HCI-0150R) se une el fibrinógeno. mAb0023 y mAb0062 compiten con este sitio de unión. mAb0012 y mAb0051 no compiten.TLT-1 (HCI-0150R) binds fibrinogen. mAb0023 and mAb0062 compete with this binding site. mAb0012 and mAb0051 do not compete.
Ejemplo 22: Mapeo de epítopos por espectrometría de masa de intercambio de hidrógeno (HX-MS).Example 22: Mapping of epitopes by hydrogen exchange mass spectrometry (HX-MS).
La técnica HX-MS se ha empleado para identificar los epítopos de unión al TLT-1 cubiertos por los cuatro anticuerpos monoclonales mAb0023, mAb0051, mAb0062 y mAb0061.The HX-MS technique has been used to identify the TLT-1 binding epitopes covered by the four monoclonal antibodies mAb0023, mAb0051, mAb0062, and mAb0061.
Para los experimentos de mapeo se usaron hTLT-1.20-125, hTLT-1.16-162 y hTLT-1.126-162 correspondientes a las SEQ ID NO 5, 6 y 7, respectivamente. Todas las proteínas se intercambiaron en tampón a PBS pH 7,4 antes de los experimentos.For mapping experiments hTLT-1.20-125, hTLT-1.16-162 and hTLT-1,126-162 corresponding to SEQ ID NOs 5, 6 and 7 were used, respectively. All proteins were exchanged in buffer to PBS pH 7.4 before the experiments.
Método: Experimentos HX-MS.Method: HX-MS experiments.
Instrumentación y registro de datos.Los experimentos HX se automatizaron mediante un robot Leap (H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.) operado por el programa informático LeapShell (Leap Technologies Inc.), que realizó la iniciación de la reacción de intercambio de deuterio, control del tiempo de reacción, reacción de inactivación, inyección en el sistema UPLC y control del tiempo de digestión. El robot Leap se equipó con dos estantes con temperatura controlada mantenidos a 20 °C para el almacenamiento del tampón y reacciones de HX y mantenidas a 2 °C para el almacenamiento de la proteína y la solución de inactivación, respectivamente. El robot Leap contenía además una unidad Trio VS enfriada (Leap Technologies Inc.) que contenía las columnas analítica, preparativa y de pepsina, y la tubería de LC y las válvulas de conmutación a 1 °C. Las válvulas de conmutación se han mejorado de HPLc a válvulas de conmutación UHPLC Microbore (Cheminert, VICI AG). Para la digestión en pepsina en línea, 100 pl de la muestra inactivada que contiene 200 pmol del TLT-1 se cargó y pasó sobre un Cartucho de Pepsina Inmovilizada Poroszyme® (2,1 x 30 mm (Applied Biosystems)) mediante el uso de una tasa de flujo isocrático de 200 pl/min (ácido fórmico 0,1 %:CH3CN 95:5). Los péptidos resultantes se atraparon y se desalinizaron en una precolumna VanGuard BEH C181,7 pm (2,1 x 5 mm (Waters Inc.)). Subsecuentemente, las válvulas se conmutaron para colocar la precolumna en línea con la columna analítica, UPLC-BEH C18 1,7 pm (2,1 x 100 mm (Waters Inc.)), y los péptidos se separaron mediante el uso de un gradiente de 9 min de 15-40 % B suministrado a 150 pl/min de un sistema AQUITY UPLC (Waters Inc.). Las fases móviles consisten en A: ácido fórmico al 0,1 % y B: ácido fórmico al 0,1 % en CH3CN. Los datos de ESI MS, y las adquisiciones de MS/MS dependientes de datos separadas (CID) y experimentos de energía elevada (MSE) se adquirieron en modo ion positivo mediante el uso de MS Q-Tof Premier (Waters Inc.). La leucina-encefalina se usó como la masa de bloqueo (iones [M+H]+ a m/z 556.2771) y los datos se colectaron en modo continuo.Instrumentation and data recording: HX experiments were automated by a Leap robot (H / Dx PAL; Leap Technologies Inc.) operated by the LeapShell software (Leap Technologies Inc.), which initiated the deuterium exchange reaction , control of reaction time, inactivation reaction, injection into the UPLC system and control of digestion time. The Leap robot was equipped with two temperature controlled racks maintained at 20 ° C for buffer storage and HX reactions and maintained at 2 ° C for storage of protein and inactivation solution, respectively. The Leap robot also contained a cooled Trio VS unit (Leap Technologies Inc.) containing the analytical, preparative, and pepsin columns, and the LC tubing and switch valves at 1 ° C. The switching valves have been upgraded from HPLc to Microbore UHPLC switching valves (Cheminert, VICI AG). For online pepsin digestion, 100 µl of the inactivated sample containing 200 pmol of TLT-1 was loaded and passed onto a Poroszyme® Immobilized Pepsin Cartridge (2.1 x 30 mm (Applied Biosystems)) using an isocratic flow rate of 200 pl / min (0.1% formic acid: CH3CN 95: 5). The resulting peptides were trapped and desalinated in a VanGuard BEH C181.7 pm (2.1 x 5 mm (Waters Inc.)) pre-column. Subsequently, the valves were switched to bring the precolumn in line with the analytical column, UPLC-BEH C18 1.7 pm (2.1 x 100 mm (Waters Inc.)), and the peptides were separated using a gradient 9 min 15-40% B supplied at 150 pl / min from an AQUITY UPLC system (Waters Inc.). The mobile phases consist of A: 0.1% formic acid and B: 0.1% formic acid in CH 3 CN. ESI MS data, and separate data dependent MS / MS acquisitions (CID) and high energy experiments (MSE) were acquired in positive ion mode using MS Q-Tof Premier (Waters Inc.). Leucine-enkephalin was used as the blocking mass ([M + H] + ions at m / z 556.2771) and data was collected continuously.
Análisis de datos.Los péptidos pépticos se identificaron en experimentos separados mediante el uso de los métodos estándar CID MS/MS o Ms e (Waters Inc.). Los datos de MSE se procesaron mediante el uso de BiopharmaLynx 1.2 (versión 017). La adquisición de MS/MS dependiente de datos CID se analizó mediante el uso del programa informático MassLynx y la base de datos MASCOT producida internamente.Data analysis. Peptic peptides were identified in separate experiments using standard CID MS / MS or Ms e methods (Waters Inc.). The MSE data was processed using BiopharmaLynx 1.2 (version 017). CID data dependent MS / MS acquisition was analyzed using MassLynx software and internally produced MASCOT database.
Los archivos de datos primarios de HX-MS se sometieron a corrección continua mediante estándar. El análisis de datos, es decir, la determinación de los centroides de péptidos deuterados y la graficación de las curvas de intercambio, se realizó mediante el uso de HX-Express ((Versión Beta); Weis y otros, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 1700 (2006)). HX-MS primary data files underwent continuous correction using standard. Data analysis, i.e. determination of deuterated peptide centroids and graphing of exchange curves, was performed using HX-Express ((Beta Version); Weis et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 1700 (2006)).
Mapeo de epítopos de mAb0023: El intercambio de hidrógeno/deuterio (HX) de amida se inició mediante una dilución de 30 veces del hTLT-1.20-125 en presencia o ausencia del mAb0023 en el tampón deuterado correspondiente (es decir. PBS preparado en D2O, 96 % de D2O final, pH 7,4 (valor no corregido)). Todas las reacciones HX se llevaron a cabo a 20 °C y contenían hTLT-1.20-125 4 pM en ausencia o presencia de mAb0023 2,4 pM lo que proporcionó de esta forma un exceso molar de 1,2 veces de sitios de unión a mAb. En intervalos de tiempo adecuados que varían de 10 seg a 8 horas, las alícuotas de la reacción HX se inactivaron por un volumen igual de tampón de inactivación helado (TCEP 1,35 M) lo que resulta en un pH final de 2,6 (valor no corregido).Mapping epitopes of mAb0023: Hydrogen / deuterium (HX) exchange of amide was initiated by a 30-fold dilution of hTLT-1.20-125 in the presence or absence of mAb0023 in the corresponding deuterated buffer (ie PBS prepared in D 2 O, 96% final D 2 O, pH 7.4 (uncorrected value)). All HX reactions were carried out at 20 ° C and contained 4 pM hTLT-1.20-125 in the absence or presence of 2.4 pM mAb0023 thus providing a 1.2-fold molar excess of binding sites to mAb. At suitable time intervals ranging from 10 sec to 8 hours, aliquots of the HX reaction were quenched by an equal volume of ice cold quench buffer (1.35M TCEP) resulting in a final pH of 2.6 ( uncorrected value).
Mapeo de epítopos de los mAb 0051 y 0062: El mapeo de epítopos de mAb0051 y mAb0062 se realizó en un experimento separado mediante el uso del hTLT-1.20-125 y se llevó a cabo de manera similar al mapeo de mAb0023 como se describió anteriormente.Epitope mapping of mAbs 0051 and 0062: Epitope mapping of mAb0051 and mAb0062 was performed in a separate experiment using hTLT-1.20-125 and was carried out in a similar way to mapping mAb0023 as described above.
Mapeo de epítopos de mAb0061: El mapeo de epítopos de mAb0061 se realizó en dos experimentos separados mediante el uso ya sea de la proteína hTLT-1.16-162 o el péptido hTLT-1.126-162.Mapping epitopes from mAb0061: Mapping epitopes from mAb0061 was performed in two separate experiments using either the hTLT-1.16-162 protein or the hTLT-1,126-162 peptide.
Los experimentos se realizaron de manera similar como se describió anteriormente para el mAb0023. No obstante, la columna de pepsina se colocó a temperatura ambiente para los experimentos mediante el uso del hTLT-1.126-162. Esto resulta en un aumento de la eficacia de digestión de pepsina con una pérdida de intercambio adicional mínima. The experiments were carried out in a similar way as described above for mAb0023. However, the pepsin column was placed at room temperature for the experiments using hTLT-1,126-162. This results in increased pepsin digestion efficiency with minimal additional exchange loss.
ResultadosResults
Mapeo de epítopos de mAb0023 Epitope mapping of mAb0023
El curso de tiempo de HX de 20 péptidos, que cubre 100 % de la secuencia primaria del TLT-1, se monitoreó en presencia y ausencia de mAb0023 durante 10 segundos hasta 8 horas.The 20-peptide HX time course, covering 100 % of the primary sequence of TLT-1, was monitored in the presence and absence of mAb0023 for 10 seconds to 8 hours.
El patrón de intercambio observado en presencia o ausencia de mAb0023 puede dividirse en dos grupos diferentes: Un grupo de péptidos TLT-1 muestra un patrón de intercambio que no se afecta por la unión de mAb0023 y otro grupo de péptidos TLT-1 que muestra protección a partir del intercambio tras la unión a mAb0023. Las regiones que muestran protección tras la unión a mAb0023 abarcan péptidos que cubren los residuos del TLT-1 36-51, 79-91 y 105-120. Al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido el epítopo para mAb0023 puede estrecharse para los residuos 36-47, VQCHYRLQDVKA (50 %), 82-87, LGGGLL (30 %), 108-115, GARGPQIL (20 %) con la protección de intercambio relativo para cada segmento señalado en paréntesis. Una visión general del mapa del péptido para el epítopo 0023 se muestra en la Figura 6.The exchange pattern observed in the presence or absence of mAb0023 can be divided into two different groups: One group of TLT-1 peptides shows an exchange pattern that is not affected by binding of mAb0023 and another group of TLT-1 peptides shows protection. from the exchange after binding to mAb0023. The regions that show protection after binding to mAb0023 encompass peptides that cover TLT-1 residues 36-51, 79-91, and 105-120. By comparing the relative amounts of exchange protection within each peptide the epitope for mAb0023 can be narrowed for residues 36-47, VQCHYRLQDVKA (50%), 82-87, LGGGLL (30%), 108-115, GARGPQIL (20% ) with the relative exchange protection for each segment indicated in parentheses. An overview of the peptide map for epitope 0023 is shown in Figure 6.
Mapeo de epítopos de mAb0051Epitope mapping of mAb0051
El curso de tiempo de HX de 22 péptidos, que cubre 100 % de la secuencia primaria del TLT-1, se monitoreó en presencia y ausencia de mAb0051 durante 10 segundos hasta 1000 segundos.The 22-peptide HX time course, which covers 100% of the primary sequence of TLT-1, was monitored in the presence and absence of mAb0051 for 10 seconds to 1000 seconds.
El patrón de intercambio observado en presencia o ausencia de mAb0051 puede dividirse en dos grupos diferentes: un grupo de péptidos TLT-1 muestra un patrón de intercambio que no se afecta por la unión de mAb0051 y un grupo que se afecta. Las regiones que muestran protección después de la unión a mAb0051 abarcan péptidos que cubren los residuos 52-66, 92-120. Al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido el epítopo para mAb0051 puede estrecharse para los residuos 55-66, LPEGCQPLVSSA (75 %) y 110-120, RGPQILHRVSL (25 %), así como también, una interacción débil en el tramo 92-105. Una visión general del mapa del péptido para el epítopo 0051 se muestra en la Figura 7.The exchange pattern observed in the presence or absence of mAb0051 can be divided into two different groups: a group of TLT-1 peptides shows an exchange pattern that is not affected by binding of mAb0051 and a group that is affected. The regions that show protection after binding to mAb0051 encompass peptides that cover residues 52-66, 92-120. By comparing the relative amounts of exchange protection within each peptide the epitope for mAb0051 can be narrowed for residues 55-66, LPEGCQPLVSSA (75%) and 110-120, RGPQILHRVSL (25%), as well as a weak interaction in section 92-105. An overview of the peptide map for epitope 0051 is shown in Figure 7.
Mapeo de epítopos de mAb0062Epitope mapping of mAb0062
El curso de tiempo de HX de 22 péptidos, que cubre 100 % de la secuencia primaria del TLT-1, se monitoreó en presencia y ausencia de mAb0062 durante 10 segundos hasta 1000 segundos.The 22-peptide HX time course, covering 100% of the primary sequence of TLT-1, was monitored in the presence and absence of mAb0062 for 10 seconds to 1000 seconds.
El patrón de intercambio observado en presencia o ausencia de mAb0062 puede dividirse en dos grupos diferentes: Un grupo de péptidos TLT-1 muestra un patrón de intercambio que no se afecta por la unión de mAb0062 y otro grupo de péptidos TlT-1 que muestran protección. Las regiones que muestran protección después de la unión a mAb0062 abarcan péptidos que cubren los residuos 36-51 y 105-120. Al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido el epítopo para mAb0062 puede estrecharse para 36-47, VQCHYRLQDVKA (60 %) y 110-120, RGPQILHRVSL (40 %). Una visión general del mapa del péptido para el epítopo 0062 se muestra en la Figura 8.The exchange pattern observed in the presence or absence of mAb0062 can be divided into two different groups: One group of TLT-1 peptides shows an exchange pattern that is not affected by binding of mAb0062 and another group of TlT-1 peptides that show protection. . The regions that show protection after binding to mAb0062 encompass peptides that cover residues 36-51 and 105-120. By comparing the relative amounts of exchange protection within each peptide the epitope for mAb0062 can be narrowed to 36-47, VQCHYRLQDVKA (60%) and 110-120, RGPQILHRVSL (40%). An overview of the peptide map for epitope 0062 is shown in Figure 8.
Mapeo de epítopos de mAb0061Epitope mapping of mAb0061
El epítopo para mAb0061 se mapeó en dos experimentos separados mediante el uso de la proteína hTLT-1.16-162 o el hTLT-1.126-162.The epitope for mAb0061 was mapped in two separate experiments using either the hTLT-1.16-162 protein or the hTLT-1,126-162.
Para hTLT-1.16-162 los transcursos del tiempo de HX de 19 péptidos, que cubre el 85 % de la secuencia primaria del TLT-1, se monitorearon en presencia y ausencia de mAb0061 durante 10 segundos hasta 8 horas. Debido a una O-glicosilación en el residuo S148, no pudo registrarse la información más allá del residuo 141.For hTLT-1.16-162 the HX time courses of 19 peptides, covering 85% of the primary sequence of TLT-1, were monitored in the presence and absence of mAb0061 for 10 seconds to 8 hours. Due to O-glycosylation at residue S148, information beyond residue 141 could not be recorded.
El patrón de intercambio observado en presencia o ausencia de mAb0061 puede dividirse en dos grupos diferentes: Un grupo de péptidos TLT-1 muestra un patrón de intercambio que no se afecta por la unión de mAb0061 y otro grupo de péptidos TLT-1 que muestra protección a partir del intercambio tras la unión a mAb0061. Las regiones que muestran protección después de la unión a mAb0061 abarcan los péptidos que cubren los residuos 121-141. Sin embargo, es importante observar que no se proporciona información en este experimento para el residuo 142 y más allá. Al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido el epítopo para mAb0061 puede estrecharse para comenzar en el residuo 130.The exchange pattern observed in the presence or absence of mAb0061 can be divided into two different groups: One group of TLT-1 peptides shows an exchange pattern that is not affected by binding of mAb0061 and another group of TLT-1 peptides shows protection. from the exchange after binding to mAb0061. The regions that show protection after binding to mAb0061 encompass the peptides that cover residues 121-141. However, it is important to note that no information is provided in this experiment for residue 142 and beyond. By comparing the relative amounts of exchange protection within each peptide the epitope for mAb0061 can be narrowed to start at residue 130.
Para obtener información completa sobre el epítopo mAb0061, el experimento de mapeo se repitió mediante el uso del péptido hTLT-1.126-162. Este péptido se une al mAb0061 con alta afinidad y no se modifica por glicosilación. Por lo tanto, debería ser capaz de proporcionar información de HX-MS para toda la región.To obtain complete information on the mAb0061 epitope, the mapping experiment was repeated using the hTLT-1,126-162 peptide. This peptide binds mAb0061 with high affinity and is not modified by glycosylation. Therefore, it should be able to provide HX-MS information for the entire region.
Los transcursos de tiempo de HX de 12 péptidos, que cubren toda la región 126-162 del TLT-1 se monitorearon en presencia y ausencia de mAb0061 durante 10 seg hasta 3000 seg.The 12-peptide HX time courses, covering the entire 126-162 region of TLT-1, were monitored in the presence and absence of mAb0061 for 10 sec to 3000 sec.
Todos los péptidos en esta región 126-162 desarrollaron protección para el intercambio a partir de la unión a mAb0061. Al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido el epítopo para mAb0061 puede estrecharse para estar dentro de los residuos 130-145, ETHKIGSLAENAFSDP. Una visión general del mapa del péptido para el epítopo 0061 se muestra en la Figura 9 y la 10. All peptides in this region 126-162 developed protection for exchange from binding to mAb0061. By comparing the relative amounts of exchange protection within each peptide the epitope for mAb0061 can be narrowed to be within residues 130-145, ETHKIGSLAENAFSDP. An overview of the peptide map for epitope 0061 is shown in Figures 9 and 10.
Ejemplo 23: Análisis de la producción, caracterización y unión de mutantes de hTLT-1 ECD-HPC4 Ala.Example 23: Analysis of the production, characterization and binding of hTLT-1 ECD-HPC4 Ala mutants.
Los constructos mutantes del hTLT-1 ECD-HPC4 Alanina se diseñaron de acuerdo con la Tabla 6. Los constructos de expresión se desarrollaron por el contratista externo GENEART AG (Im Gewerbepark B35, 93059 Regensburg, Alemania) y todos los constructos de expresión se realizaron en base al vector de expresión denominado pcDNA3.1(+). Las alícuotas de ADN para cada uno de los 40 constructos de expresión del hTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1(+) se transfectaron en células en suspensión HEK293-6E con el fin de expresar transitoriamente cada proteína mutante hTLT-1 ECD-HPC4 Ala (Tabla 6). La transfección transitoria y el cultivo de células HEK2936e se realizaron como se describió en el Ejemplo A.The mutant constructs of hTLT-1 ECD-HPC4 Alanine were designed according to Table 6. The expression constructs were developed by the external contractor GENEART AG (Im Gewerbepark B35, 93059 Regensburg, Germany) and all expression constructs were made. based on the expression vector named pcDNA3.1 (+). DNA aliquots for each of the 40 hTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1 (+) expression constructs were transfected into HEK293-6E suspension cells in order to transiently express each hTLT-1 ECD-HPC4 mutant protein Ala (Table 6). Transient transfection and culture of HEK2936e cells were performed as described in Example A.
Siete días después de la transfección, las células se eliminaron mediante centrifugación y la proteína mutante hTLT-1 ECD-HPC4 A la resultante que contiene sobrenadantes se esterilizó por filtración antes de los análisis. La concentración de proteína mutante con hTLT-1 ECD-HPC4 A la expresada en el sobrenadante de células clarificado se determinó mediante el uso de una combinación de RP-HPLC y análisis de SDS-PAGE/Coomassie. Estos variaron de 4 - 40 |jg/ml y contienen un grado variable de formación de dímeros. Como se describió anteriormente para la producción de la proteína hTLT usada para los experimentos de inmunización, se observaron formas de monómero/dímero de la proteína expresada para todos los constructos de mutantes hTLT ECD-HPC4 Ala. La concentración relativa de la proteína monómero/dímero hTLT-1 ECD-HPC4 se estimó mediante SDS-PAGE/Coomassie y se calculó un Mw promedio para cada preparación del mutante.Seven days after transfection, cells were removed by centrifugation and the resulting hTLT-1 ECD-HPC4 A mutant protein containing supernatants was filter sterilized prior to analysis. The concentration of mutant protein with hTLT-1 ECD-HPC4 A expressed in the clarified cell supernatant was determined using a combination of RP-HPLC and SDS-PAGE / Coomassie analysis. These ranged from 4-40 | jg / ml and contain a varying degree of dimer formation. As described above for the production of the hTLT protein used for immunization experiments, monomer / dimer forms of the expressed protein were observed for all hTLT ECD-HPC4 Ala mutant constructs. The relative concentration of the hTLT-1 ECD-HPC4 monomer / dimer protein was estimated by SDS-PAGE / Coomassie and an average Mw was calculated for each mutant preparation.
Todos los estudios de unión se corrieron a 25 °C, y las muestras se almacenaron a 15 °C en el compartimento de muestras en un analizador ProteOn (Biorad) que mide las interacciones moleculares en tiempo real mediante resonancia de plasmón de superficie. La señal (RU, unidades de respuesta) informada por el ProteOn se correlaciona directamente con la masa en los puntos de la superficie del chip del sensor individual.All binding studies were run at 25 ° C, and samples were stored at 15 ° C in the sample compartment on a ProteOn analyzer (Biorad) that measures molecular interactions in real time by surface plasmon resonance. The signal (RU, response units) reported by the ProteOn is directly correlated to the mass at the points on the surface of the individual sensor chip.
El anticuerpo policlonal anti-hFc se inmovilizó en células de flujo separadas de un chip sensor GLM mediante el uso de una mezcla 1:1 de EDAC 0,4 M [hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida] y Sulfo-NHS [N-hidroxisulfosuccinimida] 0,1 M. Cada anticuerpo se diluyó en acetato de sodio 10 mM pH 5,0 a una concentración de 50 |jg/ml, y se inmovilizó en una célula de flujo individual a 30 jl/m in durante 240 s. Los anticuerpos se inmovilizaron en células de flujo A1-A6 (dirección horizontal). Después de la inmovilización, los sitios activos en la célula de flujo se bloquearon con etanolamina 1 M. El nivel de inmovilización final del anticuerpo de captura varió típicamente de aproximadamente 9000 a 10 000 RU en un experimento. La captura de los anticuerpos anti-TLT-1 mAb0023, mAb0051, mAb0061 y mAb0062 se realizó mediante la dilución hasta 0,5 jg/m l en tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) e inyectado a 30 jl/m in durante 60 s en dirección vertical, lo que crea puntos de referencia interbandas con sólo anticuerpos anti-Fc humano. El nivel de captura final de los anticuerpos de análisis varió típicamente de aproximadamente 200 a 300 RU en un experimento. La unión de la proteína hTLT-1 ECD-HPC4 wt o mutante Ala se realizó mediante la inyección sobre las células de flujo paralelas en dirección horizontal para permitir el análisis comparativo de la unión a diferentes anticuerpos anti-TLT-1 capturados con relación a la unión a las referencias de interbanda. Cada proteína hTLT-1 ECD-HPC4 se diluyó hasta 100 nM, basado en el Mw promedio calculado, en tampón HBS-EP y se inyecta a 30 jl/m in durante 240 s. El chip GLM se regeneró después de cada ciclo de inyección de analito a través de una inyección de 18 s de ácido fórmico 1 M seguido por una inyección de 18 s de NaOH 50 mM a 100 jl/min. Esta etapa de regeneración eliminó el anticuerpo anti-TLT-1 y cualquier TLT-1 unido a partir de la superficie de anticuerpo de captura inmovilizado, y permitió la unión posterior del siguiente par de muestras de análisis. El procedimiento de regeneración no eliminó el anticuerpo de captura anti-Fc humano inmovilizado directamente de la superficie del chip.The anti-hFc polyclonal antibody was immobilized in separate flow cells from a GLM sensor chip using a 1: 1 mixture of 0.4M EDAC [1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride] and Sulfo-NHS [N-hydroxysulfosuccinimide] 0.1 M. Each antibody was diluted in 10 mM sodium acetate pH 5.0 to a concentration of 50 | jg / ml, and immobilized in a single flow cell at 30 jl / min for 240 s. Antibodies were immobilized on A1-A6 flow cells (horizontal direction). After immobilization, the active sites in the flow cell were blocked with 1M ethanolamine. The final level of immobilization of the capture antibody typically ranged from about 9000 to 10 000 RU in one experiment. Capture of the anti-TLT-1 antibodies mAb0023, mAb0051, mAb0061 and mAb0062 was performed by dilution to 0.5 jg / ml in HBS-EP buffer (10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, P20 surfactant at 0.05%, pH 7.4) and injected at 30 jl / m in for 60 s in the vertical direction, creating interband reference points with only anti-human Fc antibodies. The final capture level of the assay antibodies typically ranged from approximately 200 to 300 RU in one experiment. Binding of hTLT-1 ECD-HPC4 wt protein or Ala mutant was performed by injection into parallel flow cells in the horizontal direction to allow comparative analysis of binding to different anti-TLT-1 antibodies captured relative to binding to interbank references. Each hTLT-1 ECD-HPC4 protein was diluted to 100 nM, based on the calculated average Mw, in HBS-EP buffer and injected at 30 jl / m in for 240 s. The GLM chip was regenerated after each cycle of analyte injection through an 18 s injection of 1 M formic acid followed by an 18 s injection of 50 mM NaOH at 100 jl / min. This regeneration step removed the anti-TLT-1 antibody and any bound TLT-1 from the surface of immobilized capture antibody, and allowed subsequent binding of the next pair of test samples. The regeneration procedure did not remove the immobilized anti-human Fc capture antibody directly from the chip surface.
El análisis de datos se realizó mediante el uso del programa informático ProteOn ManagerTM. No se observó una unión no específica significativa a las superficies de control interbandas. Las curvas de unión se procesaron mediante referenciación doble (sustracción de señales de superficie de control de intersección, así como también, inyecciones de tampón blanco sobre los anticuerpos capturados anti-TLT-1). Esto permitió corregir el ruido de instrumentos, el cambio de volumen y la deriva durante las inyecciones de muestra. La señal de unión a los 10 s después de la detención de la inyección del analito se normalizó al nivel del anticuerpo anti-TLT-1 capturado y se presentó como unión con relación a la proteína hTLT-1 ECD-HPC4 wt.Data analysis was performed using the ProteOn ManagerTM software. No significant nonspecific binding to the interband control surfaces was observed. Binding curves were processed by double referencing (subtraction of intersection control surface signals, as well as injections of white buffer over captured anti-TLT-1 antibodies). This allowed correction of instrument noise, volume change, and drift during sample injections. The binding signal 10 s after stopping injection of the analyte was normalized to the level of the captured anti-TLT-1 antibody and presented as binding relative to the hTLT-1 ECD-HPC4 wt protein.
Las mutaciones de Ala siguientes mostraron una disminución significativa de la unión a los respectivos anti-TLT-1 en comparación con la proteína hTLT-1 ECD-HPC4 wt. mAb0051: F54A < 0,4 wt; M91A < 0,2 wt; R117A < 0,2 wt; S119A < 0,6 wt. mAb0062: R41A < 0,2 wt; L42A < 0,6 wt; Q43A < 0,4 wt; F54A < 0,6 wt; M91A < 0,4 wt; R110A < 0,2 wt; H116A < 0,6 wt. mAb0023: L42A < 0,2 wt; Q43A < 0,2 wt; K46A < 0,2 wt; M91A < 0,4 wt; R110A < 0,2 wt. Dado que se pudo observar una disminución de la unión para el mutante M91A de HPC4 con hTLT-1 para los 4 anticuerpos anti-TLT-1, el residuo probablemente tiene una influencia importante sobre la estabilidad de las proteínas en lugar de ser parte de un epítopo real. mAb0061 no mostró una disminución de la unión a cualquiera de las variantes del TLT-1 mutadas analizadas, lo que indica que el epítopo no está cubierto por los mutantes introducidos en el estudio de unión. The following Ala mutations showed a significant decrease in binding to the respective anti-TLT-1 compared to the hTLT-1 ECD-HPC4 wt protein. mAb0051: F54A <0.4 wt; M91A <0.2 wt; R117A <0.2 wt; S119A <0.6 wt. mAb0062: R41A <0.2 wt; L42A <0.6 wt; Q43A <0.4 wt; F54A <0.6 wt; M91A <0.4 wt; R110A <0.2 wt; H116A <0.6 wt. mAb0023: L42A <0.2 wt; Q43A <0.2 wt; K46A <0.2 wt; M91A <0.4 wt; R110A <0.2 wt. Since a decrease in binding could be observed for the HPC4 M91A mutant with hTLT-1 for all 4 anti-TLT-1 antibodies, the residue probably has a major influence on protein stability rather than being part of a real epitope. mAb0061 did not show decreased binding to any of the mutated TLT-1 variants analyzed, indicating that the epitope is not covered by mutants introduced into the binding study.
Ejemplo 24: Complejos de estructura cristalina entre péptidos de tallo de TLT-1 y el Fab anti-TLT-1. Example 24: Crystal structure complexes between stem peptides of TLT-1 and the anti-TLT-1 Fab.
Expresión del Fab anti-TLT-1, Fab0100 (idéntico a Fab0061), para la cristalización: El fragmento Fab anti-TLT-1, Fab0100, que comprende la cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 152 y la cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 153, se expresó transitoriamente en células HEK293 de acuerdo con el procedimiento generalizado. Expression of the anti-TLT-1 Fab, Fab0100 (identical to Fab0061), for crystallization: The anti-TLT-1 Fab fragment, Fab0100, comprising the heavy chain corresponding to SEQ ID NO: 152 and the light chain that corresponds to SEQ ID NO: 153, it was transiently expressed in HEK293 cells according to the generalized procedure.
Purificación del Fab anti-TLT-1, Fab0100, para la cristalización: La purificación de dicho Fab se realizó mediante un proceso en dos etapas compuesto por cromatografía de afinidad mediante el uso de la resina kappaSelect (GE Healthcare, núm. de cat. 17-5458-01) y cromatografía de exclusión por tamaño. La purificación se realizó mediante el uso de un sistema de cromatografía ÁktaExplorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112-41). Los sistemas tampón usados para la etapa de purificación fueron un tampón de equilibrado compuesto de NaFosfato 10 mM, pH 7,5 y NaCl 150 mM y un tampón de elución compuesto de ácido fórmico 20 mM, pH 3,0. El sobrenadante se ajustó con NaOH 1 M a un pH de 7,5 y se aplicó sobre una columna kappaSelect equilibrada previamente. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrado y la proteína Fab se eluyó isocráticamente mediante el uso de aproximadamente 5 volúmenes de columna de tampón de elución. La proteína Fab se analizó mediante el uso de análisis de SDS-PAGE/Coomassie y LC-MS, lo que muestra que se obtuvo una proteína pura y homogénea con un peso molecular esperado de 46,9 kDa. Para medir la concentración de proteína, se usó un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con un coeficiente de extinción de 1,31. El acabado final de la proteína Fab se llevó a cabo mediante el uso de una columna de exclusión por tamaño (Superdex200).Purification of the anti-TLT-1 Fab, Fab0100, for crystallization: The purification of said Fab was carried out by a two-step process composed of affinity chromatography using the kappaSelect resin (GE Healthcare, cat. No. 17 -5458-01) and size exclusion chromatography. Purification was performed using an ÁktaExplorer chromatography system (GE Healthcare, cat. No. 18-1112-41). The buffer systems used for the purification step were an equilibration buffer composed of 10 mM Naphosphate, pH 7.5 and 150 mM NaCl and an elution buffer composed of 20 mM formic acid, pH 3.0. The supernatant was adjusted with 1M NaOH to a pH of 7.5 and applied on a previously equilibrated kappaSelect column. The column was washed with 5 column volumes of equilibration buffer and the Fab protein was eluted isocratically by using approximately 5 column volumes of elution buffer. The Fab protein was analyzed using SDS-PAGE / Coomassie and LC-MS analysis, showing that a pure and homogeneous protein with an expected molecular weight of 46.9 kDa was obtained. To measure protein concentration, a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific) was used along with an extinction coefficient of 1.31. Final finishing of the Fab protein was carried out using a size exclusion column (Superdex200).
Preparación de péptidos para la cristalización: El péptido del tallo de TLT-1 hTLT-1.126-162 (SEQ ID NO: 7) se preparó mediante síntesis de péptido de fase sólida. Igualmente, se preparó una versión más corta hTLT-1.129-142 del péptido del tallo que corresponde a la SEQ ID NO: 8.Preparation of peptides for crystallization: The stem peptide from TLT-1 hTLT-1,126-162 (SEQ ID NO: 7) was prepared by solid phase peptide synthesis. Likewise, a shorter version hTLT-1,129-142 of the stem peptide corresponding to SEQ ID NO: 8 was prepared.
Preparación, cristalización y determinación de la estructura de los complejos Fab0100:TLT-1: Preparación de Fab0100:hTLT-1.126-162: El complejo entre Fab0100 y hTLT-1.126-162 se preparó por adición de dos veces de exceso molar del hTLT-1.126-162 a una solución de Fab0100 seguido por aislamiento del complejo mediante la separación del exceso del hTLT-1.126-162 mediante el uso de cromatografía de exclusión por tamaño preparativa. Por lo tanto, el complejo Fab0100: hTLT-1.126-162 se preparó mediante la mezcla de Fab (1100 ml, 98 mM) y hTLT-1.126-162 (155 ml, 1391 mM), ambos en tampón PBS (pH 7,4). El complejo se sometió a filtración en gel mediante el uso de una columna Superdex 200 HighLoad 26/60 (GE Healthcare) eluida con tampón PBS (pH 7,4) a una tasa de flujo de 1 ml/min. Se colectaron fracciones correspondientes a un volumen de 3 ml. Las fracciones que contenían el complejo Fab0100: hTLT-1.126-162 deseado se agruparon y después se concentraron mediante el uso de un dispositivo de filtro de centrífuga (Amicon, valor límite de 10 kDa) hasta una concentración de proteína de 8,6 mg/ml. Esta preparación se usó para la cristalización del complejo Fab0100:hTLT-1.126-162.Preparation, crystallization and structure determination of Fab0100: TLT-1 complexes: Preparation of Fab0100: hTLT-1,126-162: The complex between Fab0100 and hTLT-1,126-162 was prepared by adding twice the molar excess of hTLT- 1,126-162 to a Fab0100 solution followed by isolation of the complex by separating excess hTLT-1,126-162 using preparative size exclusion chromatography. Therefore, Fab0100: hTLT-1,126-162 complex was prepared by mixing Fab (1100 ml, 98 mM) and hTLT-1,126-162 (155 ml, 1391 mM), both in PBS buffer (pH 7.4 ). The complex was subjected to gel filtration using a Superdex 200 HighLoad 26/60 column (GE Healthcare) eluted with PBS buffer (pH 7.4) at a flow rate of 1 ml / min. Fractions corresponding to a volume of 3 ml were collected. Fractions containing the desired Fab0100: hTLT-1,126-162 complex were pooled and then concentrated using a centrifuge filter device (Amicon, 10 kDa limit value) to a protein concentration of 8.6 mg / ml. This preparation was used for the crystallization of the Fab0100: hTLT-1,126-162 complex.
Preparación de Fab0100:hTLT-1.129-142: El complejo entre Fab0100 y el péptido del tallo más corto (hTLT-1.129-142) se preparó de manera similar con las excepciones de que la relación molar entre hTLT-1.129-142 y Fab fue 1,5:1 y que el tope de filtración en gel se omitió debido a la unión más débil del hTLT-1.129-142 en comparación con la del péptido del tallo más largo (hTLT-1.126-162).Preparation of Fab0100: hTLT-1,129-142: The complex between Fab0100 and the shorter stem peptide (hTLT-1,129-142) was prepared in a similar manner with the exceptions that the molar ratio between hTLT-1,129-142 and Fab was 1.5: 1 and that the gel filtration cap was omitted due to the weaker binding of hTLT-1,129-142 compared to that of the longer stem peptide (hTLT-1,126-162).
Cristalización y recogida de datos de los complejos Fab0100:hTLT-1.129-142 y Fab0100:hTLT-1.126-162: Los complejos Fab0100:hTLT-1.129-142 y Fab0100:hTLT-1.126-162 a temperatura ambiente se cristalizaron a temperatura ambiente por el método de gota sentada. El Fab0100:hTLT-1.129-142 se cristalizó mediante la adición a la solución de proteína, en una relación de volumen de 1:2 (precipitante:proteína), de una solución de precipitación que contiene dihidrógeno fosfato de potasio 0,04 M, PEG 8000 al 16 % p/v y glicerol al 20 %, mientras que el complejo Fab0100:hTLT-1.126-162 se cristalizó mediante la adición a la solución de proteína, en una relación de volumen de 1:1 (precipitante:proteína), de una solución de precipitación que contiene PEG 10000 al 20 % p/v y Hepes 0,10 M pH 7,5. Un cristal del complejo Fab0100:hTLT-1.129-142 se congeló inmediatamente en N2 líquido y durante la recogida de datos se mantuvo a 100 K mediante una corriente de gas N2 criogénica. Los datos cristalográficos se recogieron posteriormente a una resolución de 2,14 A mediante el uso de un ánodo giratorio Rigaku MicroMax-007 HF y un detector de rayos X marCCD 165. La determinación del grupo separador, la integración y el escalado de los datos se realizaron mediante el paquete del programa informático XDS (Kabsch,W. (1993) J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800). Los parámetros de celda del cristal se determinaron ser 82,10, 64,99, 107,73 A, 90°, 95,12° y 90° para a, b, c, a, p y y respectivamente, y el grupo separador se determinó ser C2. El Rsym para las intensidades del conjunto de datos se calculó ser 6,5 %. Las coordenadas de un modelo del Fab de la estructura del 1NGZ (Yin,J. y otros PNAS EE.UU. Crystallization and data collection of Fab0100: hTLT-1,129-142 and Fab0100: hTLT-1,126-162 complexes: Fab0100: hTLT-1,129-142 and Fab0100: hTLT-1,126-162 complexes were crystallized at room temperature by the seated drop method. Fab0100: hTLT-1,129-142 was crystallized by addition to the protein solution, in a volume ratio of 1: 2 (precipitant: protein), of a precipitation solution containing 0.04M potassium dihydrogen phosphate, 16% w / v PEG 8000 and 20% glycerol, while the Fab0100: hTLT-1,126-162 complex was crystallized by addition to the protein solution, in a volume ratio of 1: 1 (precipitant: protein), of a precipitation solution containing 20% w / v PEG 10000 and 0.10 M Hepes pH 7.5. A crystal of the Fab0100: hTLT-1,129-142 complex was immediately frozen in liquid N 2 and during data collection was kept at 100 K by a cryogenic N 2 gas stream. Crystallographic data was subsequently collected at 2.14 A resolution using a Rigaku MicroMax-007 HF rotary anode and a marCCD 165 X-ray detector. Separation group determination, integration, and data scaling were performed using the XDS software package (Kabsch, W. (1993) J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800). The crystal cell parameters were determined to be 82.10, 64.99, 107.73 A, 90 °, 95.12 ° and 90 ° for a, b, c, a, p and y respectively, and the spacer group was determined be C2. The Rsym for the dataset intensities was calculated to be 6.5%. The coordinates of a Fab model of the 1NGZ structure (Yin, J. And other US PNAS
100, 856-861) depositada en la PDB (Berman, H.M. y otros (2000) Nucleic Acids Res. 28, 235-242) se usó para la determinación de la estructura de la molécula Fab anti-TLT-1. El modelo Fab 1NGZ se dividió en dos dominios, los dominios variable y constante, que después se usaron como modelos de búsqueda independientes en un reempbucle molecular ejecutado por el programa informático PHASER (Mccoy,A.J. y otros Acta Crystalographica Sección D Biological Crystallography61,458-464; Mccoy,A.J. y otros J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674) de la suite CCP4 (Bailey,S. (1994) Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50, 760-763). El paquete de programa informático a Rp -wARP (Evrard,G.X. y otros Acta Crystallographica Sección D 63, 108-117) se usó posteriormente para la construcción y sincronización de modelos automatizados. Se aplicaron refinamientos cristalográficos adicionales, mediante el uso del programa informático REFMAC5 (Murshudov,G.N. y otros Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallog. 53, 240-255), seguido por inspección gráfica computarizada de los mapas de densidad electrónica, corrección y construcción de modelos, mediante el uso del programa informático Coot (Emsley,P. y otros Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 100, 856-861) deposited in the PDB (Berman, HM et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28, 235-242) was used for the determination of the structure of the Fab anti-TLT-1 molecule. The Fab 1NGZ model was divided into two domains, the variable and constant domains, which were then used as independent search models in a molecular re-loop executed by the PHASER computer program (Mccoy, AJ et al. Acta Crystalographica Section D Biological Crystallography 61,458-464 ; Mccoy, AJ et al. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674) of the CCP4 suite (Bailey, S. (1994) Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50, 760-763). The software package to Rp -wARP (Evrard, GX and others Acta Crystallographica Section D 63, 108-117) was subsequently used for the construction and synchronization of automated models. Additional crystallographic refinements were applied, using the REFMAC5 computer program (Murshudov, GN and others Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallog. 53, 240-255), followed by computerized graphical inspection of the electronic density maps, correction and model building, using the Coot software (Emsley, P. and others Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr.
60, 2126-2132). El procedimiento se sometió a un ciclo hasta que no se pudieran hacer más mejoras significativas al modelo. Los resultados finales de R y R libre calculados después de 3 ciclos de intervención manual y después de los refinamientos fueron 0,185 y 0,245, respectivamente, y el modelo mostró una desviación cuadrática media (RMSD) de las longitudes de unión ideales de 0,022 A.60, 2126-2132). The procedure was cycled until no further significant improvements could be made to the model. The final results of free R and R calculated after 3 cycles of manual intervention and after refinements were 0.185 and 0.245, respectively, and the model showed a mean square deviation (RMSD) of the ideal bond lengths of 0.022 A.
Un cristal del complejo Fab0100:hTLT-1.126-162 se transfirió a una criosolución que contenía 75 % de la solución precipitante y 25 % de glicerol. El cristal se dejó en remojo durante unos 15 segundos, se congeló inmediatamente en N2 líquido y durante la recogida de datos se mantuvo a una temperatura de 100 K mediante una corriente de gas N2 criogénico. Los datos cristalográficos se recogieron posteriormente a una resolución de 1,85 A en la línea de haz BL911-3 (Ursby,T. y otros (2004) AIP Conference Proceedings 705, 1241-1246) en MAX-lab, Lund, Suecia. La determinación del grupo separador, la integración y el escalado de los datos se realizaron en el paquete del programa informático xds. Los parámetros de celda para los datos del sincotrón se determinaron ser 82,54, 65,32, 108,05 A, 90°, 95,15° y 90° para a, b, c, a, p y y respectivamente, y el grupo separador se determinó ser C2. El Rsym para las intensidades del conjunto de datos se calculó ser 6,7 %. El cristal fue isomórfico con los cristales de Fab0100:hTLT-1.129-142 y, por lo tanto, el refinamiento corporal rígido del complejo Fab0100:hTLT-1.129-142 se usó para la sincronización original del Fab0100:hTLT-1.126-162 seguido por la construcción y sincronización de modelos automatizados mediante el uso del paquete del programa informático ARP-wARP. Se aplicaron refinamientos cristalográficos adicionales, mediante el uso del programa informático REFMAC5, seguido por inspección gráfica computarizada de los mapas de densidad electrónica, corrección y construcción de modelos, mediante el uso del programa informático COOt . El procedimiento se sometió a un ciclo hasta que no se pudieran hacer más mejoras significativas al modelo. Los resultados finales de R y R libre calculados después de 13 ciclos de intervención manual y los refinamientos siguientes fueron 0,171 y 0,223, respectivamente, y el modelo mostró una RMSD de longitudes de unión ideales de 0,027 A (Tabla 11).A crystal of the Fab0100: hTLT-1,126-162 complex was transferred to a cryosolution containing 75% of the precipitating solution and 25% of glycerol. The crystal was left to soak for about 15 seconds, immediately frozen in liquid N 2 and during the data collection was kept at a temperature of 100 K by means of a stream of cryogenic N 2 gas. Crystallographic data was subsequently collected at 1.85 A resolution on beam line BL911-3 (Ursby, T. et al. (2004) AIP Conference Proceedings 705, 1241-1246) at MAX-lab, Lund, Sweden. The determination of the separator group, the integration and the scaling of the data were carried out in the xds software package. The cell parameters for the synchrotron data were determined to be 82.54, 65.32, 108.05 A, 90 °, 95.15 °, and 90 ° for a, b, c, a, p, and y respectively, and the group Separator was determined to be C2. The Rsym for the intensities of the data set was calculated to be 6.7%. The crystal was isomorphic with the Fab0100: hTLT-1,129-142 crystals, and therefore the rigid body refinement of the Fab0100: hTLT-1,129-142 complex was used for the original synchronization of Fab0100: hTLT-1,126-162 followed by the construction and synchronization of automated models through the use of the ARP-wARP software package. Additional crystallographic refinements were applied, through the use of the REFMAC5 computer program, followed by computerized graphic inspection of the electronic density maps, correction and model construction, through the use of the COOt computer program. The procedure was cycled until no further significant improvements could be made to the model. The final free R and R results calculated after 13 cycles of manual intervention and the following refinements were 0.171 and 0.223, respectively, and the model showed an RMSD of ideal binding lengths of 0.027 A (Table 11).
ResultadosResults
Como se muestra en las Tablas 14 y 15, el anti-TLT-1 se une eficazmente al tallo del TLT-1. Mediante el uso del programa informático AREAIMOL, del paquete de programas CCP4, el área promedio excluida en una interacción por pares entre Fab0100 y TLT-1 se calculó ser 764 A2. Las áreas promedio excluidas en interacciones por pares para el complejo Fab0100:hTLT-1.126-162, dieron 656 y 871 A2, para anti-TLT-1 y TLT-1, respectivamente.As shown in Tables 14 and 15, anti-TLT-1 effectively binds to the stem of TLT-1. Using the AREAIMOL computer program, from the CCP4 program package, the average area excluded in a pairwise interaction between Fab0100 and TLT-1 was calculated to be 764 A2. The average areas excluded in pair interactions for the Fab0100 complex: hTLT-1,126-162, gave 656 and 871 A2, for anti-TLT-1 and TLT-1, respectively.
Los residuos en el péptido TLT-1 (hTLT-1.126-162) que hacen contactos directos con el Fab anti-TLT-1 en el complejo Fab0100: hTLT-1.126-162 se definen como el epítopo y los residuos en Fab0100 que realizan contactos directos con el hTLT-1.126-162 en el complejo Fab0100: hTLT-1.126-162 se definen como paratopo. Los residuos de epítopos y paratopos se identificaron al ejecutar el programa informático contacts del conjunto de programas CCP4 mediante el uso de una distancia límite de 4,0 A entre el Fab anti-TLT-1 y la molécula TLT-1. Los resultados de los cálculos de contacto para el complejo Fab0100:hTLT-1.126-162 de las estructuras cristalinas se muestran en las Tablas 14 y 15. Se encontró que el epítopo TLT-1 resultante para Fab0100 comprende los siguientes residuos de la SEQ ID NO: 7): Lys 8 (133), Ile 9 (134), Gly 10 (135), Ser 11 (136), Leu 12 (137), Ala 13 (138), Asn 15 (140), Ala 16 (141), Phe 17 (142), Ser 18 (143), Asp 19 (144), Pro 20 (145), Ala 21 (146) donde los números entre paréntesis se refieren a los residuos correspondientes en la SEQ ID NO: 2 (Tablas 12 y 13).Residues in the TLT-1 peptide (hTLT-1,126-162) that make direct contacts with the anti-TLT-1 Fab in the Fab0100: hTLT-1,126-162 complex are defined as the epitope and residues in Fab0100 that make contacts Direct hTLT-1,126-162 in the Fab0100: hTLT-1,126-162 complex are defined as paratopes. Epitope and paratope residues were identified by running the contacts software from the CCP4 suite using a 4.0 A limit distance between the anti-TLT-1 Fab and the TLT-1 molecule. The results of contact calculations for the Fab0100: hTLT-1,126-162 complex of the crystal structures are shown in Tables 14 and 15. The resulting TLT-1 epitope for Fab0100 was found to comprise the following residues of SEQ ID NO : 7): Lys 8 (133), Ile 9 (134), Gly 10 (135), Ser 11 (136), Leu 12 (137), Ala 13 (138), Asn 15 (140), Ala 16 (141 ), Phe 17 (142), Ser 18 (143), Asp 19 (144), Pro 20 (145), Ala 21 (146) where the numbers in parentheses refer to the corresponding residues in SEQ ID NO: 2 ( Tables 12 and 13).
El paratopo resultante incluyó los residuos His 31, Asn 33, Tyr 37, His 39, Tyr 54, Phe 60, Ser 96, Thr 97, Val 99 y Tyr 101 de la cadena ligera de Fab0100 que corresponden a la SEQ ID NO: 153 (Tabla 12), y los residuos Val 2, Phe 27, Arg 31, Tyr 32, Trp 33, Glu 50, Thr 57, Asn 59, Ser 98, Gly 99, Val 100 y Thr 102 de la cadena pesada Fab0100 correspondiente a la SEQ ID NO: 152 (Tabla 13). Los residuos de epítopos del TLT-1 implicados en la unión al hidrógeno también se indican en las Tablas 12 y 13.The resulting paratope included residues His 31, Asn 33, Tyr 37, His 39, Tyr 54, Phe 60, Ser 96, Thr 97, Val 99 and Tyr 101 of the Fab0100 light chain corresponding to SEQ ID NO: 153 (Table 12), and the residues Val 2, Phe 27, Arg 31, Tyr 32, Trp 33, Glu 50, Thr 57, Asn 59, Ser 98, Gly 99, Val 100 and Thr 102 of the Fab0100 heavy chain corresponding to SEQ ID NO: 152 (Table 13). The TLT-1 epitope residues involved in hydrogen binding are also indicated in Tables 12 and 13.
Tabla 13: Resultados del refinamiento del modelo de rayos X de los datos observados del complejo Fab0100:hTLT-1.126-162 mediante el programa informático refmac5.Table 13: Results of the refinement of the X-ray model of the observed data of the Fab0100: hTLT-1,126-162 complex using the refmac5 computer program.
OBSERVACION 3 REFINAMIENTO.OBSERVATION 3 REFINEMENT.
OBSERVACIÓN 3 PROGRAMA: REFMAC 5.5.0109OBSERVATION 3 PROGRAM: REFMAC 5.5.0109
OBSERVACIÓN 3 AUTORES: MURSHUDOV,VAGIN,DODSONOBSERVATION 3 AUTHORS: MURSHUDOV, VAGIN, DODSON
OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 OBJETIVO DEL REFINAMIENTO: PROBABILIDAD MÁXIMAOBSERVATION 3 OBJECTIVE OF REFINEMENT: MAXIMUM PROBABILITY
OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 DATOS USADOS EN EL REFINAMIENTO.OBSERVATION 3 DATA USED IN THE REFINING.
OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN ALTO (ANGSTROMS): 1,85OBSERVATION 3 HIGH RESOLUTION INTERVAL (ANGSTROMS): 1.85
OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN BAJO (ANGSTROMS): 34,18OBSERVATION 3 LOW RESOLUTION INTERVAL (ANGSTROMS): 34.18
OBSERVACIÓN 3 VALOR LÍMITE DE DATOS (SIGMA(F)): NINGUNOOBSERVATION 3 LIMIT DATA VALUE (SIGMA (F)): NONE
OBSERVACIÓN 3 COMPLETAMIENTO PARA EL INTERVALO (%): 99,89 OBSERVATION 3 COMPLETE FOR THE INTERVAL (%): 99.89
OBSERVACIÓN 3 NUMERO DE REFLEXIONES: 46512 OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3 NUMBER OF REFLECTIONS: 46512 OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 AJUSTE A LOS DATOS USADOS EN EL REFINAMIENTO.OBSERVATION 3 ADJUSTMENT TO THE DATA USED IN THE REFINING.
OBSERVACIÓN 3 MÉTODO DE VALIDACIÓN CRUZADA: A TODO LO LARGO OBSERVACIÓN 3 SELECCIÓN DE CONJUNTO DE PRUEBA DE VALOR DE R LIBRE: ALEATORIO OBSERVACIÓN 3 VALOR DE R (DE TRABAJO CONJUNTO DE PRUEBA): 0,17330 OBSERVACIÓN 3 VALOR DE R (CONJUNTO DE TRABAJO): 0,17070 OBSERVACIÓN 3 VALOR DE R LIBRE: 0,22260 OBSERVACIÓN 3 TAMAÑO DE CONJUNTO DE PRUEBA DE VALOR DE R LIBRE (%): 5,0 OBSERVACIÓN 3 CONTEO DE CONJUNTO DE PRUEBA DE VALOR DE R LIBRE: 2463 OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3 CROSS VALIDATION METHOD: FULL LENGTH OBSERVATION 3 SELECTION OF FREE R VALUE TEST SET: RANDOM OBSERVATION 3 R VALUE (WORKING TEST SET): 0.17330 OBSERVATION 3 R WORK VALUE (SET ): 0.17070 OBSERVATION 3 FREE R VALUE: 0.22260 OBSERVATION 3 SIZE OF FREE R VALUE TEST SET (%): 5.0 OBSERVATION 3 FREE R VALUE TEST SET COUNT: 2463 OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 AJUSTE EN EL RANGO DE NÚMEROS DE MAYOR RESOLUCIÓN.OBSERVATION 3 ADJUSTMENT IN THE RANGE OF HIGHER RESOLUTION NUMBERS.
OBSERVACIÓN 3 NÚMERO TOTAL DE RANGOS DE NÚMEROS USADOS: 20 OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN DE RANGOS DE NÚMEROS ALTO: 1,850 OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN DE RANGOS DE NÚMEROS BAJO: 1,898 OBSERVACIÓN 3 REFLECCIÓN EN RANGOS DE NÚMEROS (CONJUNTO DE 3409OBSERVATION 3 TOTAL NUMBER OF RANKS OF NUMBERS USED: 20 OBSERVATION 3 RESOLUTION INTERVAL OF RANKS OF HIGH NUMBERS: 1,850 OBSERVATION 3 RESOLUTION INTERVAL OF RANKS OF NUMBER RANKS: 1,898 OBSERVATION 3 RANGE OF NOS
TRABAJO):JOB):
OBSERVACIÓN 3 COMPLETAMIENTO DEL RANGOS DE NÚMEROS 99,81OBSERVATION 3 COMPLETING THE RANKS OF NUMBERS 99.81
(TRABAJO+PRUEBA) (%):(WORK + TEST) (%):
OBSERVACIÓN 3 VALOR DE R DEL RANGOS DE NÚMEROS (CONJUNTO DE 0,266OBSERVATION 3 R VALUE OF NUMBER RANGES (SET OF 0.266
TRABAJO):JOB):
OBSERVACIÓN 3 CONTEO DE CONJUNTO DE VALOR DE R LIBRE DEL RANGOS DE 195OBSERVATION 3 SET OF VALUE SET OF R FREE OF THE RANGES OF 195
NÚMEROS:NUMBERS:
OBSERVACIÓN 3 VALOR DE R LIBRE DEL RANGOS DE NÚMEROS: 0,309 OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3 FREE R VALUE OF NUMBER RANGES: 0.309 OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 NÚMERO DE ÁTOMOS DISTINTOS DE HIDRÓGENO USADOS EN EL REFINAMIENTO. OBSERVACIÓN 3 TODOS LOS ÁTOMOS: 3993 OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3 NUMBER OF OTHER ATOMS OF HYDROGEN USED IN THE REFINING. OBSERVATION 3 ALL ATOMS: 3993 OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 VALORES DE B.OBSERVATION 3 VALUES OF B.
OBSERVACIÓN 3 DEL GRÁFICO DE WILSON (A**2): NULOWILSON FIGURE OBSERVATION 3 (A ** 2): NULL
OBSERVACIÓN 3 VALOR DE B MEDIO (TOTAL, A**2): 14,967 OBSERVACIÓN 3 VALOR DE B ANISOTRÓPICO TOTAL.OBSERVATION 3 AVERAGE B VALUE (TOTAL, A ** 2): 14,967 OBSERVATION 3 TOTAL ANISOTROPIC B VALUE.
OBSERVACIÓN 3 B11 (A**2): -0,06 OBSERVACIÓN 3 B22 (A**2): 0,23 OBSERVACIÓN 3 B33 (A**2): -0,24 OBSERVACIÓN 3 B12 (A**2): 0,00 OBSERVACIÓN 3 B13 (A**2): -0,36 OBSERVACIÓN 3 B23 (A**2): 0,00 OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3 B11 (A ** 2): -0.06 OBSERVATION 3 B22 (A ** 2): 0.23 OBSERVATION 3 B33 (A ** 2): -0.24 OBSERVATION 3 B12 (A ** 2) : 0.00 OBSERVATION 3 B13 (A ** 2): -0.36 OBSERVATION 3 B23 (A ** 2): 0.00 OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 ERROR DE COORDENADA TOTAL ESTIMADO.OBSERVATION 3 ESTIMATED TOTAL COORDINATE ERROR.
OBSERVACIÓN 3 ESU BASADO EN VALOR DE R (A): 0,116 OBSERVACIÓN 3 ESU BASADO EN VALOR DE R LIBRE (A): 0,123 OBSERVACIÓN 3 ESU BASADO EN LA PROBABILIDAD MÁXIMA (A): 0,084 OBSERVACIÓN 3 ESU PARA VALORES DE B BASADO EN LA PROBABILIDAD 6,165OBSERVATION 3 ESU BASED ON VALUE OF R (A): 0.116 OBSERVATION 3 ESU BASED ON VALUE OF FREE R (A): 0.123 OBSERVATION 3 ESU BASED ON MAXIMUM PROBABILITY (A): 0.084 OBSERVATION 3 ESU FOR B VALUES BASED ON PROBABILITY 6,165
MÁXIMA (A**2):MAXIMUM (A ** 2):
OBSERVACIÓN 3 COEFICIENTES DE CORRELACIÓN.OBSERVATION 3 CORRELATION COEFFICIENTS.
OBSERVACIÓN 3 COEFICIENTE DE CORRELACIÓN FO-FC: 0,963 OBSERVACIÓN 3 COEFFICIENT DE CORRELACIÓN FO-FC FREE: 0,939 OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3 FO-FC CORRELATION COEFFICIENT: 0.963 OBSERVATION 3 FO-FC FREE CORRELATION COEFFICIENT: 0.939 OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 DESVIACIONES DE RMS A PARTIR DE VALORES IDEALES CONTEO DEL PESO RMS OBSERVACIÓN 3 LONGITUDES DE UNIÓN DE ÁTOMOS REFINADOS (A): 3538 ; 0,027 ; 0,022 OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE UNIÓN DE ÁTOMOS REFINADOS (GRADOS): 4833 ; 2,132; 1,958 OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERÍODO 1 (GRADOS): 473 ; 6,972 ; 5,000 OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERÍODO 2 (GRADOS): 137 ;35,607 ;24,453 OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERÍODO3 (GRADOS): 583 ;14,216 ;15,000 OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERÍODO 4 (GRADOS): 14 ;23,096 ;15,000 OBSERVACIÓN 3 RESTRICCIONES DE CENTROS QUIRALES (A**3): 552 ; 0,180 ; 0,200 OBSERVACIÓN 3 PLANOS GENERALES REFINADOS DE ÁTOMOS (A): 2664 ; 0,013 ; 0,021 OBSERVACIÓN 3 RESTRICCIONES DE FACTOR TÉRMICO ISOTRÓPICO. CONTEOOBSERVATION 3 RMS DEVIATIONS FROM IDEAL VALUES RMS WEIGHT COUNT OBSERVATION 3 REFINED ATOMS UNION LENGTHS (A): 3538; 0.027; 0.022 OBSERVATION 3 UNION ANGLES OF REFINED ATOMS (DEGREES): 4833; 2,132; 1,958 OBSERVATION 3 TORQUE ANGLE, PERIOD 1 (DEGREES): 473; 6,972; 5,000 OBSERVATION 3 TORQUE ANGLE, PERIOD 2 (DEGREES): 137; 35,607; 24,453 OBSERVATION 3 TORQUE ANGLE, PERIOD 3 (DEGREE): 583; 14,216; 15,000 OBSERVATION 3 TORQUE ANGLE, PERIOD 4 (23.096): 14 15,000 OBSERVATION 3 RESTRICTIONS OF CHIRAL CENTERS (A ** 3): 552; 0.180; 0.200 OBSERVATION 3 REFINED GENERAL PLANS OF ATOMS (A): 2664; 0.013; 0.021 OBSERVATION 3 ISOTROPIC THERMAL FACTOR RESTRICTIONS. COUNT
PESO RMS OBSERVACIÓN 3 ÁTOMOS REFINADOS UNIDOS A CADENA PRINCIPAL (A**2): 2262 ; 1,399 ; 1,500 OBSERVACIÓN 3 ÁTOMOS REFINADOS DE ÁNGULO DE CADENA PRINCIPAL 3679 ; 2,333 ; 2,000RMS WEIGHT OBSERVATION 3 REFINED ATOMS LINKED TO MAIN CHAIN (A ** 2): 2262; 1,399; 1,500 OBSERVATION 3 REFINED ATOMS OF MAIN CHAIN ANGLE 3679; 2,333; 2,000
(A**2):(A ** 2):
OBSERVACIÓN 3 ÁTOMOS REFINADOS UNIDOS A CADENA LATERAL (A**2): 1276 ;3,462 ;3,000 OBSERVACIÓN 3 ÁTOMOS REFINADOS DE ÁNGULO DE CADENA LATERAL 1139 ; 5,231 ; 4,500 (A**2):OBSERVATION 3 REFINED ATOMS LINKED TO SIDE CHAIN (A ** 2): 1276; 3,462; 3,000 OBSERVATION 3 REFINED ATOMS OF SIDE CHAIN ANGLE 1139; 5,231; 4,500 (A ** 2):
OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 ESTADÍSTICAS DE RESTRICCIÓN DE NCSOBSERVATION 3 NCS RESTRICTION STATISTICS
OBSERVACIÓN 3 NÚMEROS DE GRUPOS NCS: NULOREMARK 3 NUMBERS OF NCS GROUPS: NULL
OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 DETALLES GEMELOSOBSERVATION 3 TWIN DETAILS
OBSERVACIÓN 3 NÚMERO DE DOMINIOS GEMELOS: NULOOBSERVATION 3 NUMBER OF TWIN DOMAINS: NULL
OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 DETALLES DE TLSOBSERVATION 3 TLS DETAILS
OBSERVACIÓN 3 NÚMERO DE GRUPOS TLS: 2OBSERVATION 3 NUMBER OF TLS GROUPS: 2
OBSERVACIÓN 3 REGISTRO DEL ATOMO QUE CONTIENE SOLO LOS FACTORES RESIDUALES B OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3 RECORD OF THE ATOM CONTAINING ONLY THE RESIDUAL FACTORS B OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 GRUPO TLS: 1OBSERVATION 3 GROUP TLS: 1
OBSERVACIÓN 3 NÚMERO DEL GRUPO DE COMPONENTES: 3OBSERVATION 3 NUMBER OF THE GROUP OF COMPONENTS: 3
OBSERVACIÓN 3 COMPONENTES C SSSEQI A C SSSEQIOBSERVATION 3 COMPONENTS C SSSEQI A C SSSEQI
OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESIDUO: L 1 L 109 OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESIDUO: H 1 H 113 OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESIDUO: P 7 P 21 OBSERVACIÓN 3 ORIGEN PARA EL GRUPO (A): -4,1790 48,4400 34,3450 OBSERVACIÓN 3 TENSORTOBSERVATION 3 WASTE INTERVAL: L 1 L 109 OBSERVATION 3 WASTE INTERVAL: H 1 H 113 OBSERVATION 3 WASTE INTERVAL: P 7 P 21 OBSERVATION 3 ORIGIN FOR THE GROUP (A): -4,1790 48,4400 34,3450 OBSERVATION 3 TENSORT
OBSERVACIÓN 3 T11: 0,1731 T22: 0,1937 OBSERVACIÓN 3 T33: 0,1093 T12: -0,0155 OBSERVACIÓN 3 T13: -0,0164 T23: -0,0192 OBSERVACIÓN 3 TENSOR LOBSERVATION 3 T11: 0.1731 T22: 0.1937 OBSERVATION 3 T33: 0.1093 T12: -0.0155 OBSERVATION 3 T13: -0.0164 T23: -0.0192 OBSERVATION 3 TENSIONER L
OBSERVACIÓN 3 L11: 1,9367 L22: 0,4840 OBSERVACIÓN 3 L33: 3,8383 L12: -0,1522 OBSERVACIÓN 3 L13: -1,2215 L23: -0,1172 OBSERVACIÓN 3 TENSORSOBSERVATION 3 L11: 1.9367 L22: 0.4840 OBSERVATION 3 L33: 3.8383 L12: -0.1525 OBSERVATION 3 L13: -1.2215 L23: -0.1172 OBSERVATION 3 TENSORS
OBSERVACIÓN 3 S11: 0,0447 S12: -0,2657 S13: 0,0758 OBSERVACIÓN 3 S21: 0,0958 S22: -0,0414 S23: -0,0674 OBSERVACIÓN 3 S31: 0,0036 S32: 0,0098 S33: -0,0032 OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3 S11: 0.0447 S12: -0.2657 S13: 0.0758 OBSERVATION 3 S21: 0.0958 S22: -0.0414 S23: -0.0674 OBSERVATION 3 S31: 0.0036 S32: 0.0098 S33 : -0.0032 OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 GRUPO TLS: 2OBSERVATION 3 GROUP TLS: 2
OBSERVACIÓN 3 NÚMERO DEL GRUPO DE COMPONENTES: 2OBSERVATION 3 NUMBER OF THE GROUP OF COMPONENTS: 2
OBSERVACIÓN 3 COMPONENTES C SSSEQI A C SSSEQIOBSERVATION 3 COMPONENTS C SSSEQI A C SSSEQI
OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESIDUO: L 114 OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESIDUO: H 116 OBSERVACIÓN 3 ORIGEN PARA EL GRUPO (A): -24,4360 51,7710 OBSERVACIÓN 3 TENSORTOBSERVATION 3 WASTE INTERVAL: L 114 OBSERVATION 3 WASTE INTERVAL: H 116 OBSERVATION 3 ORIGIN FOR GROUP (A): -24,4360 51,7710 OBSERVATION 3 TENSORT
OBSERVACIÓN 3 T11: 0,0252 T22: 0,0170 OBSERVACIÓN 3 T33: 0,0735 T12: 0,0161 OBSERVACIÓN 3 T13: 0,0018 T23: 0,0048 OBSERVACIÓN 3 TENSOR LOBSERVATION 3 T11: 0.0252 T22: 0.0170 OBSERVATION 3 T33: 0.0735 T12: 0.0161 OBSERVATION 3 T13: 0.0018 T23: 0.0048 OBSERVATION 3 TENSIONER L
3 L11: 2,0324 L22: 1,69053 L11: 2,0324 L22: 1,6905
OBSERVACIÓN 3 L33: 0,8461 L12: 0,7328 OBSERVACIÓN 3 L13: 0,0695 L23: 0,3337 OBSERVACION 3 TENSORSOBSERVATION 3 L33: 0.8461 L12: 0.7328 OBSERVATION 3 L13: 0.0695 L23: 0.3337 OBSERVATION 3 TENSORS
OBSERVACIÓN 3 S11: -0,0068 S12: 0,0156 S13: 0,0515 OBSERVACIÓN 3 S21: -0,0127 S22: -0,0101 S23: 0,1316 OBSERVACIÓN 3 S31: -0,0077 S32: -0,0763 S33: 0,0168 OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3 S11: -0.0068 S12: 0.0156 S13: 0.0515 OBSERVATION 3 S21: -0.0127 S22: -0.0101 S23: 0.1316 OBSERVATION 3 S31: -0.0077 S32: -0, 0763 S33: 0,0168 OBSERVATION 3
OBSERVACION 3OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 MODELADO DE SOLVENTE VOLUMÉTRICO.OBSERVATION 3 MODELING OF VOLUMETRIC SOLVENT.
OBSERVACIÓN 3 MÉTODO USADO: MÁSCARA OBSERVACIÓN 3 PARÁMETROS PARA EL CÁLCULO DE LA MÁSCARAOBSERVATION 3 METHOD USED: MASK OBSERVATION 3 PARAMETERS FOR THE CALCULATION OF THE MASK
OBSERVACIÓN 3 RADIO DE SONDA VDW: 1,40 OBSERVACIÓN 3 RADIO DE SONDA DE ION: 0,80 OBSERVACIÓN 3 RADIO DE CONTRACCIÓN: 0,80 OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3 VDW PROBE RADIUS: 1.40 OBSERVATION 3 ION PROBE RADIO: 0.80 OBSERVATION 3 CONTRACTION RADIUS: 0.80 OBSERVATION 3
OBSERVACIÓN 3 OTRAS OBSERVACIONES DE REFINAMIENTO:OBSERVATION 3 OTHER REFINING OBSERVATIONS:
OBSERVACIÓN 3 HIDRÓGENOS QUE SE HAN AÑADIDO EN LAS POSICIONES DE MONTAJE OBSERVACIÓN 3 VALORES DE U :SOLO RESIDUAL OBSERVACIÓN 3OBSERVATION 3 HYDROGENS THAT HAVE BEEN ADDED IN THE MOUNTING POSITIONS OBSERVATION 3 U VALUES: ONLY RESIDUAL OBSERVATION 3
LINKR SG CYS L 139 SG ACYS L SS 199LINKR SG CYS L 139 SG ACYS L SS 199
LINKR SG CYS H 22 SG ACYS H 96 SS LINKR SG ACYS H 141 SG ACYS H SS 197LINKR SG CYS H 22 SG ACYS H 96 SS LINKR SG ACYS H 141 SG ACYS H SS 197
CISPEP 1 T H R L 7 PRO L 8 0,00 CISPEP 2 VAL L 99 PRO L 100 0,00 CISPEP 3 TYR L 145 PRO L 146 0,00 CISPEP 4 P H E H 147 PRO H 148 0,00 CISPEP 5 GLU H 149 PRO H 150 0,00CISPEP 1 THRL 7 PRO L 8 0.00 CISPEP 2 VAL L 99 PRO L 100 0.00 CISPEP 3 TYR L 145 PRO L 146 0.00 CISPEP 4 PHEH 147 PRO H 148 0.00 CISPEP 5 GLU H 149 PRO H 150 0.00
Tabla 14Table 14
Tabla 15Table 15
Ejemplo 25: Mapeo de epítopos mediante recorrido del péptido.Example 25: Mapping of epitopes by way of the peptide.
El ELISA de recorrido del péptido define la región de unión mínima del péptido. Esto se estableció mediante el recubrimiento de péptidos biotinilados con el desplazamiento en marco de un residuo en la región del tallo del TLT-1 en placas de estreptavidina seguido por la unión del anticuerpo de interés (mAb0061). Se añadió un anticuerpo secundario para la detección y se midió la unión a 450 nm. Control positivo: unión al TLT-1 biotinilado.The peptide path ELISA defines the minimal binding region of the peptide. This was established by coating biotinylated peptides with in-frame displacement of a residue in the stem region of TLT-1 in streptavidin plates followed by binding of the antibody of interest (mAb0061). Secondary antibody was added for detection and binding was measured at 450nm. Positive control: binding to biotinylated TLT-1.
Materialesmaterials
PBS 10X: GPBS 10X Gibco 14200PBS 10X: GPBS 10X Gibco 14200
Tween20: Aldrich núm. de cat. 27,434-8, núm. lote S30950-315Tween20: Aldrich no. of cat. 27,434-8, no. lot S30950-315
Placa: Placa recubierta con estreptavidina de 96 pocillos Nunc núm. 466014 BSA: A7030-100 g núm. lote 057K0737Plate: 96-well streptavidin coated plate Nunc no. 466014 BSA: A7030-100 g no. lot 057K0737
Tampón de bloqueo/dilución: PBS 1X pH=7,4Blocking / dilution buffer: PBS 1X pH = 7.4
BSA al 2 %2% BSA
Tween20 al 0,5 %Tween20 0.5%
Tampón de lavado: PBS 1x Tween20 al 0,5 %Wash buffer: PBS 1x Tween20 0.5%
Estándar: TLT-1 biotinilado 1 mg/ml 04/09-08Standard: biotinylated TLT-1 1 mg / ml 09-04-08
mAb: 0197-0000-0061-4A - 0,55 mg/mlmAb: 0197-0000-0061-4A - 0.55 mg / ml
Anti-IgG humana de cabra marcada con HRP 1 mg/ml Prod. núm.Goat anti-human IgG labeled with HRP 1 mg / ml Prod. No.
Detección del Ab:Ab detection:
NEF802001EANEF802001EA
Sustrato de TMB: Listo para usar núm. de cat. 4390L núm. lote 70904TMB Substrate: Ready to use no. of cat. 4390L no. lot 70904
Solución de parada: H3PO42 MStop Solution: H 3 PO 4 2 M
Dilución del TLT-1 biotiniladoDilution of biotinylated TLT-1
1 mg/ml -> 6,3 ng/ml (Dilución 158500x)1 mg / ml -> 6.3 ng / ml (Dilution 158500x)
Concentración en pocillo: 0,63 ngConcentration in well: 0.63 ng
Dilución de péptidos biotiniladosDilution of biotinylated peptides
Conc approx 2-5 mg/ml (2,5 mg/ml)Conc approx 2-5 mg / ml (2.5 mg / ml)
2,5 mg/ml -> Dilución 10000x (25 ng/pocillo): 100 pl de cada péptido en cada pocillo.2.5 mg / ml -> Dilution 10000x (25 ng / well): 100 pl of each peptide in each well.
Dilución de mAb0061MAb0061 dilution
0,55 mg/ml ->100 ng/ml (Dilución 5500x)0.55 mg / ml -> 100 ng / ml (5500x dilution)
Concentración en pocillo: 10 ngConcentration in well: 10 ng
Dilución de mAb anti-IgG humana de cabra Dilution of goat anti-human IgG mAb
1 mg/ml -> 0.2 |jg/ml (Dilución 5000x)1 mg / ml -> 0.2 | jg / ml (5000x dilution)
Síntesis de péptidos biotinilados en formato de 96 pociliosSynthesis of biotinylated peptides in 96-well format
Los péptidos biotinilados se sintetizaron mediante el uso de síntesis estándar de péptidos en fase sólida. Las soluciones de aminoácidos protegidos con Fmoc 0,3 M en 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) 0,3 M en N-metilpirrolidinona (NMP) se acoplaron mediante el uso de diisopropilcarbodiimida (DIC) durante 1-4 horas. Como soporte sólido se usó la resina Rink amida LL (Merck) en una placa de filtro de microtitulación de 96 pocillos (Nunc) y se usó aproximadamente 20 mg de resina por pocillo. La síntesis se realizó mediante el uso del sintetizador de péptidos Multipep RS de Intavis, Alemania, y se usó el protocolo de fabricación. La eliminación de Fmoc se realizó mediante el uso de piperidina al 25 % en NMP. Todos los péptidos se acoplaron con biotina en el extremo N-terminal y el ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico se usó como un separador entre la biotina y los péptidos. Este separador también se acopló como un bloque de construcción protegido por Fmoc de acuerdo con el protocolo de síntesis (IRIS biotech, Alemania) Biotinylated peptides were synthesized using standard solid phase peptide synthesis. Amino acid solutions protected with 0.3 M Fmoc in 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) 0.3 M in N-methylpyrrolidinone (NMP) were coupled using diisopropylcarbodiimide (DIC) for 1-4 hours. As a solid support, Rink amide LL resin (Merck) was used in a 96-well microtiter filter plate (Nunc) and approximately 20 mg of resin was used per well. Synthesis was performed using the Multipep RS peptide synthesizer from Intavis, Germany, and the manufacturing protocol was used. Fmoc removal was performed using 25% piperidine in NMP. All peptides were biotin-coupled at the N-terminus and 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid was used as a separator between biotin and peptides. This separator was also coupled as a Fmoc protected building block according to the synthesis protocol (IRIS biotech, Germany)
Desprotección y tratamiento finalCheckout and final treatment
La desprotección final se realizó mediante el uso de 90 % de ácido trifluoracético (TFA), 5 % de triisopropilsilano y 5 % de H2O durante 3 horas. Se usó un total de 1 ml de TFA por pocillo. El TFA se filtró a 96 pocillos profundos (Nunc) y el TFA se redujo en volumen mediante evaporación hasta aproximadamente 100- 200 ul por pocillo y se añadió dietiléter a todos los pocillos para precipitar los péptidos. La suspensión del péptido en dietiléter se transfirió a una placa de filtro de 96 pocillos Solvinert (0,47 um, Millipore) y los péptidos se lavaron dos veces con dietiléter y se secaron. Los péptidos se redisolvieron en 80 % de DMSO y 20 % de agua para dar una solución madre de aproximadamente 1-3 mg/ml.The final deprotection was performed using 90% trifluoroacetic acid (TFA), 5% triisopropylsilane, and 5% H2O for 3 hours. A total of 1 ml of TFA was used per well. TFA was filtered to 96 deep wells (Nunc) and TFA was reduced in volume by evaporation to approximately 100-200 ul per well and diethyl ether was added to all wells to precipitate the peptides. The suspension of the peptide in diethyl ether was transferred to a Solvinert 96-well filter plate (0.47 um, Millipore) and the peptides were washed twice with diethyl ether and dried. The peptides were redissolved in 80% DMSO and 20% water to give a stock solution of approximately 1-3 mg / ml.
Péptidos biotinilados de 20 mer a partir de la región del tallo del TLT-1 (SEQ ID NO 6)20 mer biotinylated peptides from the stem region of TLT-1 (SEQ ID NO 6)
2-5 mg/ml en DMSO/H2O al 75 % (biotinilado en N terminal):2-5 mg / ml in 75% DMSO / H2O (biotinylated at N-terminal):
El número del péptido se muestra a la izquierda:The peptide number is shown on the left:
2 A 2 2619.8 bio-Oeg-L-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E2 A 2 2619.8 bio-Oeg-L-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E
3 A 3 2620.7 bio-Oeg-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N3 A 3 2620.7 bio-Oeg-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N
4 A 4 2577.7 bio-Oeg-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A4 A 4 2577.7 bio-Oeg-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A
5 A 5 2611.7 bio-Oeg-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F5 A 5 2611.7 bio-Oeg-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F
6 A 6 2585.6 bio-Oeg-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S6 A 6 2585.6 bio-Oeg-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S
7 A 7 2603.6 bio-Oeg-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D7 A 7 2603.6 bio-Oeg-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D
8 A 8 2603.6 bio-Oeg-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P8 A 8 2603.6 bio-Oeg-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P
9 A 9 2545.6 bio-Oeg-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A9 A 9 2545.6 bio-Oeg-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A
10 A10 2473.6 bio-Oeg-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G10 A10 2473.6 bio-Oeg-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G
11 A11 2431.6 bio-Oeg-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S11 A11 2431.6 bio-Oeg-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S
12 A12 2373.6 bio-Oeg-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A12 A12 2373.6 bio-Oeg-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A
13 B 1 2358.6 bio-Oeg-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N13 B 1 2358.6 bio-Oeg-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N
14 B 2 2354.6 bio-Oeg-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P14 B 2 2354.6 bio-Oeg-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P
15 B 3 2330.7 bio-Oeg-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L15 B 3 2330.7 bio-Oeg-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L
16 B 4 2331.6 bio-Oeg-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E16 B 4 2331.6 bio-Oeg-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E
17 B 5 2315.5 bio-Oeg-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P17 B 5 2315.5 bio-Oeg-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P
18 B 6 2345.5 bio-Oeg-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S18 B 6 2345.5 bio-Oeg-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S
19 B 7 2386.5 bio-Oeg-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q19 B 7 2386.5 bio-Oeg-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q
20 B 8 2388.4 bio-Oeg-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D20 B 8 2388.4 bio-Oeg-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D
21 B 9 2446.4 bio-Oeg-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E21 B 9 2446.4 bio-Oeg-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E
22 B10 2445.5 bio-Oeg-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K22 B10 2445.5 bio-Oeg-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K
23 B11 2418.5 bio-Oeg-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S23 B11 2418.5 bio-Oeg-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S
24 B12 2460.6 bio-Oeg-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I24 B12 2460.6 bio-Oeg-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I
25 C 1 2410.5 bio-Oeg-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P25 C 1 2410.5 bio-Oeg-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P
26 C 2 2436.6 bio-Oeg-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L26 C 2 2436.6 bio-Oeg-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L
27 C 3 2434.7 bio-Oeg-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L-I27 C 3 2434.7 bio-Oeg-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L-I
Péptidos biotinilados de 16 mer de la región del tallo del hTLT-1 (SEQ ID NO 6)Biotinylated 16 mer peptides from the stem region of hTLT-1 (SEQ ID NO 6)
2-5 mg/ml en DMSO/H2O al 75 %:2-5 mg / ml in DMSO / H2O 75%:
29 C 5 2219.3 bio-Oeg-L-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G29 C 5 2219.3 bio-Oeg-L-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G
30 C 6 2193.2 bio-Oeg-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S30 C 6 2193.2 bio-Oeg-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S
31 C 7 2192.3 bio-Oeg-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L31 C 7 2192.3 bio-Oeg-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L
32 C 8 2150.2 bio-Oeg-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A32 C 8 2150.2 bio-Oeg-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A
33 C 9 2166.1 bio-Oeg-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E 33 C 9 2166.1 bio-Oeg-PPEEEEETHKIGSLAE
34 C10 2183.1 bio-Oeg-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N34 C10 2183.1 bio-Oeg-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N
35 C11 2157.1 bio-Oeg-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A35 C11 2157.1 bio-Oeg-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A
36 C12 2175.2 bio-Oeg-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F36 C12 2175.2 bio-Oeg-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F
37 D 1 2133.2 bio-Oeg-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S37 D 1 2133.2 bio-Oeg-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S
38 D 2 2119.2 bio-Oeg-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D38 D 2 2119.2 bio-Oeg-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D
39 D 3 2087.2 bio-Oeg-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P39 D 3 2087.2 bio-Oeg-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P
40 D 4 2029.2 bio-Oeg-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A40 D 4 2029.2 bio-Oeg-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A
41 D 5 1985.2 bio-Oeg-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G41 D 5 1985.2 bio-Oeg-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G
42 D 6 1935.2 bio-Oeg-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S42 D 6 1935.2 bio-Oeg-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S
43 D 7 1878.1 bio-Oeg-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A43 D 7 1878.1 bio-Oeg-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A
44 D 8 1879 bio-Oeg-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N44 D 8 1879 bio-Oeg-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N
45 D 9 1919 bio-Oeg-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P45 D 9 1919 bio-Oeg-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P
46 D10 1945.1 bio-Oeg-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L46 D10 1945.1 bio-Oeg-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L
47 D11 1961 bio-Oeg-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E47 D11 1961 bio-Oeg-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E
48 D12 1987 bio-Oeg-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P48 D12 1987 bio-Oeg-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P
49 E 1 1945 bio-Oeg-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S49 E 1 1945 bio-Oeg-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S
50 E 2 1959 bio-Oeg-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q50 E 2 1959 bio-Oeg-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q
51 E 3 2003 bio-Oeg-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D51 E 3 2003 bio-Oeg-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D
52 E 4 1984.9 bio-Oeg-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E52 E 4 1984.9 bio-Oeg-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E
53 E 5 2026 bio-Oeg-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K53 E 5 2026 bio-Oeg-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K
54 E 6 1998 bio-Oeg-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S54 E 6 1998 bio-Oeg-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S
55 E 7 2014.1 bio-Oeg-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I55 E 7 2014.1 bio-Oeg-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I
56 E 8 2040.1 bio-Oeg-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P56 E 8 2040.1 bio-Oeg-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P
57 E 9 2096.2 bio-Oeg-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L57 E 9 2096.2 bio-Oeg-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L
58 E10 2122.3 bio-Oeg-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L-I58 E10 2122.3 bio-Oeg-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L-I
MétodoMethod
El mapeo de epítopos implicó la unión del mAb0061 a dos series de péptidos biotinilados de la región del tallo del TLT-1. Los péptidos biotinilados se unieron a placas de estreptavidina.Epitope mapping involved the binding of mAb0061 to two series of biotinylated peptides from the stem region of TLT-1. The biotinylated peptides were attached to streptavidin plates.
Péptido del tallo:Stem peptide:
LNILPPEEEEETHKIGSLAENAFSDPAGSANPLEPSQDEKSIPLLNILPPEEEEETHKIGSLAENAFSDPAGSANPLEPSQDEKSIPL
1) mapeo de péptido de 20 mer con un desplazamiento en marco de un residuo (20,1) (ver materiales)1) mapping of 20 mer peptide with a displacement in frame of a residue (20,1) (see materials)
2) mapeo de péptido de 16 mer con un desplazamiento en marco de un residuo (16,1) (ver materiales)2) Mapping of 16 mer peptide with a displacement in frame of a residue (16,1) (see materials)
1. La placa se lavó previamente 3 veces con 250 pl de tampón de lavado1. The plate was previously washed 3 times with 250 pl of wash buffer
2. Se añadieron 100 pl de solución de péptido biotinilado (de Masterplate diluido X 10000, un péptido por pocillo) 3. Se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora o a 5 °C durante toda la noche2. 100 pl of biotinylated peptide solution (from diluted Masterplate X 10000, one peptide per well) were added 3. Incubated at room temperature for 1 hour or at 5 ° C overnight
4. Se lavó 3 veces con tampón de lavado4. Washed 3 times with wash buffer
5. Se añadieron 100 pl de anticuerpo primario (ver dilución anteriormente)5. 100 pl of primary antibody were added (see dilution above)
6. Se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora6. Incubated at room temperature for 1 hour
7. Se lavó 3 veces con tampón de lavado7. Washed 3 times with wash buffer
8. Se añadieron 100 pl de anticuerpo secundario (ver dilución anteriormente)8. 100 pl of secondary antibody were added (see dilution above)
9. Se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora9. Incubated at room temperature for 1 hour
10. Se lavó 3 veces con tampón de lavado10. Washed 3 times with wash buffer
11. Se añadieron 100 pl de tampón de sustrato/desarrollo (tiempo de reacción 3 min)11. 100 pl of substrate / development buffer were added (reaction time 3 min)
12. Se añadieron 100 pl de H3PO42 M12. 100 pl H3PO42 M were added
13. El punto final se leyó a 450 nm 13. The end point was read at 450nm
La unión al péptido biotinilado en un pocilio se registró como "unión” cuando la absorción a 450 nm estuvo por encima de 3. Se registró ”sin unión” cuando la señal estuvo más abajo de 1. Una señal intermedia se registró como “unión débil”.Binding to the biotinylated peptide in a well was recorded as "binding" when the absorption at 450 nm was above 3. It was recorded "no binding" when the signal was below 1. An intermediate signal was recorded as "weak binding. "
ResultadosResults
Los péptidos biotinilados se colocaron en pocillos de la manera siguiente:The biotinylated peptides were placed in wells as follows:
Fila A: péptido 2-12 (20 mer)Row A: peptide 2-12 (20 mer)
Fila B: péptido 13-24 (20 mer)Row B: peptide 13-24 (20 mer)
Fila C: péptido 25-27 (20 mer)Row C: peptide 25-27 (20 mer)
Fila C: péptido 29-36 (16 mer)Row C: peptide 29-36 (16 mer)
Fila D: péptido 37-48 (16 mer)Row D: peptide 37-48 (16 mer)
Fila E: péptido 49-58 (16 mer)Row E: peptide 49-58 (16 mer)
Resultado de la determinación triple:Result of the triple determination:
En resumen, los péptidos de 20 mer (5-16) dan lugar a señales positivas fuertes (<3) que corresponden a los aminoácidos: IGSLAENAF. Los péptidos de 16 mer 36-42 dan lugar a señales positivas fuertes (<3) que corresponden a KIGSLAENAF.In summary, the 20 mer peptides (5-16) give rise to strong positive signals (<3) that correspond to the amino acids: IGSLAENAF. The 16 mer 36-42 peptides give rise to strong positive signals (<3) that correspond to KIGSLAENAF.
Conclusiónconclusion
El ELISA de recorrido de péptidos ha definido el área de unión mínima del epítopo para unirse al mAb0061 como el tramo siguiente de residuos de aminoácidos: KIGSLAENAF.The peptide path ELISA has defined the minimal binding area of the epitope to bind mAb0061 as the following stretch of amino acid residues: KIGSLAENAF.
Este tramo es parte de hecho del epítopo definido anteriormente por la estructura cristalina: KIGSLA-NAFSDPA. Ejemplo 26: Ensayo de hidrólisis in vitro del polipéptido del Factor VIIa.This section is in fact part of the epitope previously defined by the crystal structure: KIGSLA-NAFSDPA. Example 26: In vitro hydrolysis assay of Factor VIIa polypeptide.
El Factor VIIa natural (de tipo silvestre) y la variante del Factor VIIa (ambos denominados, de aquí en adelante, como “Factor VIIa”) se analizan en paralelo para comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtitulación (Maxisorp, Nunc, Dinamarca). El sustrato cromogénico D-Ile-Pro-Arg-pnitroanilida (S-2288, Cromogenix, Suecia), concentración final 1 mM, se añade al Factor VIIa (concentración final 100 nM) en Hepes 50 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,1 M, CaCl25 mM y albúmina de suero bovino 1 mg/ml. Se mide continuamente la absorbancia a 405 nm en un lector de placas SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, EE.UU.). La absorbancia desarrollada durante una incubación de 2 0 minutos, después de la sustracción de la absorbancia en un pocillo blanco que no contiene enzima, se usa para calcular la relación entre las actividades de la variante y del Factor VIIa de tipo silvestre:Natural (wild-type) Factor VIIa and Factor VIIa variant (both referred to hereafter as "Factor VIIa") are analyzed in parallel to directly compare their specific activities. The test is carried out on a microtiter plate (Maxisorp, Nunc, Denmark). The D-Ile-Pro-Arg-pnitroanilide chromogenic substrate (S-2288, Cromogenix, Sweden), final concentration 1 mM, is added to Factor VIIa (final concentration 100 nM) in 50 mM Hepes, pH 7.4, containing 0.1M NaCl, 5mM CaCl 2 and 1mg / ml bovine serum albumin. Absorbance at 405 nm is continuously measured on a SpectraMax ™ 340 plate reader (Molecular Devices, USA). The absorbance developed during a 2 0 minute incubation, after subtraction of the absorbance in a blank well containing no enzyme, is used to calculate the relationship between the activities of the variant and wild-type Factor VIIa:
Relación = (A405 nm Variante del Factor VIIa)/(A405 nm Factor VIIa de tipo silvestre).Ratio = (A 405 nm Variant of Factor VIIa) / (A405 nm Factor VIIa of wild type).
Ejemplo 27: Ensayo de proteólisis in vitro del polipéptido del Factor VIIa.Example 27: In vitro proteolysis assay of Factor VIIa polypeptide.
El Factor VIIa natural (de tipo silvestre) y la variante del Factor VIIa (ambos denominados, de aquí en adelante, como “Factor VIIa”) se analizan en paralelo para comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El Factor VIIa (10 nM) y el Factor X (0,8 microM) se incuban durante 15 min en 100 pl de Hepes 50 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,1 M, CaCb 5 mM y albúmina de suero bovino 1 mg/ml. La escisión del Factor X se detiene después mediante la adición de 50 pl de Hepes 50 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,1 M, EDTA 20 mM y albúmina de suero bovino 1 mg/ml. La cantidad de Factor Xa generado se mide mediante la adición del sustrato cromogénico Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida (S-2765, Cromogenix, Suecia), concentración final 0,5 mM. Se mide continuamente la absorbancia a 405 nm en un lector de placas SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, EE.UU.). La absorbancia desarrollada durante 10 minutos, después de la sustracción de la absorbancia en un pocillo blanco que no contiene FVIIa, se usa para calcular la relación entre las actividades proteolíticas de la variante y del Factor VIIa de tipo silvestre:Natural (wild-type) Factor VIIa and Factor VIIa variant (both referred to hereafter as "Factor VIIa") are analyzed in parallel to directly compare their specific activities. The assay is carried out on a microtiter plate (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Factor VIIa (10 nM) and Factor X (0.8 microM) are incubated for 15 min in 100 µl of 50 mM Hepes, pH 7.4, containing 0.1 M NaCl, 5 mM CaCb and serum albumin bovine 1 mg / ml. Cleavage of Factor X is then stopped by the addition of 50 µl of 50 mM Hepes, pH 7.4, containing 0.1 M NaCl, 20 mM EDTA and 1 mg / ml bovine serum albumin. The amount of Factor Xa generated is measured by adding the chromogenic substrate ZD-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide (S-2765, Cromogenix, Sweden), final concentration 0.5 mM. Absorbance at 405 nm is continuously measured on a SpectraMax ™ 340 plate reader (Molecular Devices, USA). The absorbance developed for 10 minutes, after the subtraction of the absorbance in a white well that does not contain FVIIa, is used to calculate the relationship between the proteolytic activities of the variant and wild type Factor VIIa:
Relación = (A405 nm Variante del Factor VIIa)/(A405 nm Factor VIIa de tipo silvestre).Ratio = (A 405 nm Variant of Factor VIIa) / (A405 nm Factor VIIa of wild type).
Ejemplo 28: Ensayo de actividad del Factor VIIIa: ensayo cromogénico.Example 28: Factor VIIIa activity assay: chromogenic assay.
La actividad del FVIII (FVIII:C) del compuesto rFVIII se evalúa en un ensayo cromogénico del FVIII mediante el uso de reactivos de Coatest SP (Cromogenix) de la manera siguiente: las muestras de rFVIII y un estándar de FVIII (por ejemplo, rFVIII de tipo silvestre purificado calibrado frente al estándar internacional 7mo de FVIII de NIBSC) se diluyen en tampón de ensayo Coatest (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, BSA al 1 %, pH 7,3, con conservante). Se añaden por duplicado cincuenta pl de las muestras, estándares y control negativo del tampón a placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc). El reactivo del Factor IXa/Factor X, el reactivo fosfolípido y CaCh del kit Coatest SP se mezclan 5:1:3 (vol:vol:vol) y 75 pl de esto se añade a los pocillos. Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente, se añaden 50 pl de la mezcla sustrato del Factor Xa S-2765/inhibidor de trombina I-2581 y los reactivos se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de que se añadan 25 pl de ácido cítrico 1 M, pH 3. La absorbancia a 415 nm se mide en un lector de placas de microtitulación SpectraMax (Molecular Devices) con absorbancia a 620 nm usada como longitud de onda de referencia. El valor para el control negativo se sustrae de todas las muestras y se prepara una curva de calibración mediante regresión lineal de los valores de absorbancia graficados frente a la concentración de FVIII. La actividad específica se calcula al dividir la actividad de las muestras con la concentración de proteína determinada por HPLC. La concentración de la muestra se determina mediante la integración del área bajo el pico en el cromatograma correspondiente a la cadena ligera y mediante comparación con el área del mismo pico en un análisis paralelo de un rFVIII no modificado de tipo silvestre, donde la concentración se determina mediante análisis de aminoácidos.The FVIII (FVIII: C) activity of the rFVIII compound is evaluated in a FVIII chromogenic assay using Coatest SP reagents (Cromogenix) as follows: rFVIII samples and a FVIII standard (eg rFVIII purified wild type calibrated against the 7th FIBII international standard of NIBSC) are diluted in Coatest assay buffer (50mM Tris, 150mM NaCl, 1% BSA, pH 7.3, with preservative). Fifty µl of the samples, standards and negative buffer control are added in duplicate to 96-well microtiter plates (Nunc). Factor IXa / Factor X reagent, phospholipid reagent and CaCh from the Coatest SP kit are mixed 5: 1: 3 (vol: vol: vol) and 75 µl of this is added to the wells. After 15 min incubation at room temperature, 50 µl of the Factor Xa S-2765 substrate / thrombin inhibitor I-2581 mixture is added and the reagents are incubated for 10 minutes at room temperature before 25 µl of 1M citric acid, pH 3. Absorbance at 415 nm is measured on a SpectraMax microtiter plate reader (Molecular Devices) with absorbance at 620 nm used as the reference wavelength. The value for the negative control is subtracted from all samples and a calibration curve is prepared by linear regression of the absorbance values plotted against the FVIII concentration. Specific activity is calculated by dividing the activity of the samples with the protein concentration determined by HPLC. The concentration of the sample is determined by integrating the area under the peak in the chromatogram corresponding to the light chain and by comparing it with the area of the same peak in a parallel analysis of an unmodified wild-type rFVIII, where the concentration is determined by amino acid analysis.
Ejemplo 29: Ensayo de actividad del Factor VIIIa: ensayo de coágulos en una etapa.Example 29: Factor VIIIa Activity Assay: One Step Clot Assay.
La actividad del FVIII (FVIII:C) de los compuestos rFVIII se evalúa adicionalmente en un ensayo de coágulos de FVIII en una etapa de la manera siguiente: las muestras del rFVIII y un estándar del FVIII (por ejemplo, rFVIII de tipo silvestre purificado calibrado contra el 7mo estándar internacional del FVIII de NIBSC) se diluyen en tampón de HBS/BSA (hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 con BSA al 1 %) a aproximadamente 10 U/ml, seguido de dilución de 10 veces en plasma deficiente de FVIII que contiene VWF (Dade Behring). Las muestras se diluyen posteriormente en tampón HBS/BSA. El tiempo del coágulo APTT se mide mediante el uso de un instrumento ACL300R o ACL5000 (Instrumentation Laboratory) mediante el uso del programa de factor único. El plasma deficiente de FVIII con VWF (Dade Behring) se usa como plasma de ensayo y SynthAsil, (HemosIL™, Instrumentation Laboratory) como reactivo aPTT. En el instrumento de coágulo, la muestra o estándar diluido se mezcla con plasma deficiente en FVIII y los reactivos aPTT a 37 oC. Se añade cloruro de calcio y se determina el tiempo hasta la formación de coágulos mediante la medición de la turbidez. El FVIII:C en la muestra se calcula basado en una curva estándar de los tiempos de formación de coágulos de las diluciones del estándar del FVIII.The FVIII (FVIII: C) activity of rFVIII compounds is further evaluated in a one-step FVIII clot assay as follows: samples from rFVIII and a FVIII standard calibrated purified wild-type rFVIII against NIBSC 7th FVIII International Standard) are diluted in HBS / BSA buffer (20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4 with 1% BSA) to approximately 10 U / ml, followed by 10-fold dilution in FVIII-deficient plasma containing VWF (Dade Behring). The samples are subsequently diluted in HBS / BSA buffer. APTT clot time is measured using an ACL300R or ACL5000 (Instrumentation Laboratory) using the single factor program. FVIII deficient plasma with VWF (Dade Behring) is used as assay plasma and SynthAsil, (HemosIL ™, Instrumentation Laboratory) as aPTT reagent. In the clot instrument, the diluted sample or standard is mixed with FVIII-deficient plasma and aPTT reagents at 37 oC. Calcium chloride is added and the time to clot formation is determined by measuring the turbidity. The FVIII: C in the sample is calculated based on a standard curve of clot formation times of the dilutions of the FVIII standard.
Ejemplo 30: Ensayo de proteólisis in vitro del polipéptido del Factor Xa.Example 30: In vitro proteolysis assay of Factor Xa polypeptide.
El Factor Xa natural (de tipo silvestre) preactivado y la variante del Factor Xa preactivado (ambos denominados, de aquí en adelante, como “Factor Xa”) se analizan en paralelo para comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El Factor Xa (10 nM) y la Protrombina (0,8 microM) se incuban durante 15 min en 100 pl de Hepes 50 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,1 M, CaCl2 5 mM y albúmina de suero bovino 1 mg/ml. La escisión de la protrombina se detiene después mediante la adición de 50 pl de Hepes 50 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,1 M, EDTA 20 mM y albúmina de suero bovino 1 mg/ml. La cantidad de Trombina generada se mide mediante la adición del sustrato cromogénico H-D-fenilalanil-L-pipecolil-L-Arg-p-nitroanilida (S-2738, Cromogenix, Suecia), concentración final 0,5 mM. Se mide continuamente la absorbancia a 405 nm en un lector de placas SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, EE.UU.). La absorbancia desarrollada durante 10 minutos, después de la sustracción de la absorbancia en un pocillo blanco que no contiene FXa, se usa para calcular la relación entre las actividades proteolíticas de la variante y del Factor FXa de tipo silvestre: The pre-activated natural (wild-type) Factor Xa and the pre-activated Factor Xa variant (both hereinafter referred to as "Factor Xa") are analyzed in parallel to directly compare their specific activities. The assay is carried out on a microtiter plate (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Factor Xa (10 nM) and Prothrombin (0.8 microM) are incubated for 15 min in 100 µl of 50 mM Hepes, pH 7.4, containing 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl 2 and serum albumin bovine 1 mg / ml. The cleavage of prothrombin is then stopped by the addition of 50 µl of 50 mM Hepes, pH 7.4, containing 0.1 M NaCl, 20 mM EDTA and 1 mg / ml bovine serum albumin. The amount of thrombin generated is measured by adding the HD-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-Arg-p-nitroanilide chromogenic substrate (S-2738, Chromogenix, Sweden), final concentration 0.5 mM. Absorbance at 405 nm is continuously measured on a SpectraMax ™ 340 plate reader (Molecular Devices, USA). The absorbance developed for 10 minutes, after subtraction of the absorbance in a blank well that does not contain FXa, is used to calculate the relationship between the proteolytic activities of the variant and the wild-type Factor FXa:
Relación = (A405 nm Variante de Factor Xa)/(A405 nm Factor Xa de tipo silvestre).Ratio = (A 405 nm Factor Xa variant) / (A405 nm Factor Xa wild type).
Ejemplo 31: Conjugación química de un anticuerpo anti-TLT-1 (fragmento) con un factor de coagulación.Example 31: Chemical conjugation of an anti-TLT-1 antibody (fragment) with a clotting factor.
Un compuesto de la fórmula general A compound of the general formula
en donde “mAb anti-TLT-1 (fragmento)” puede ser un mAb de tamaño completo contra TLT-1 o un fragmento o un análogo derivado intelectualmente de este, tal como un fragmento FAB o un sc-FAB con ninguna, una o más mutaciones puntuales; el enlazador puede ser un polímero soluble en agua, tal como PEG, ácido polisiálico o almidón de hidroxietilo; y FVIIa es cualquier molécula con una similitud de secuencias >50 % con respecto al FVIIa natural con cualquier actividad retenida de FVIIa que puede, por ejemplo, prepararse en un procedimiento en dos etapas.wherein "anti-TLT-1 mAb (fragment)" can be a full-size mAb against TLT-1 or an intellectually derived fragment or analog thereof, such as a FAB fragment or a sc-FAB with none, one or more point mutations; the linker can be a water soluble polymer, such as PEG, polysialic acid, or hydroxyethyl starch; and FVIIa is any molecule with a sequence similarity> 50% with respect to natural FVIIa with any retained FVIIa activity that can, for example, be prepared in a two-step procedure.
Durante la primera etapa, un enlazador, con dos grupos reactivos diferentes RS1 y RS2, puede unirse al mAb anti-TLT-1 (fragmento). La reacción puede ejecutarse con selectividad de sitio baja o de forma selectiva, de manera que RS1 solo reacciona en una o pocas posiciones del mAb anti-TLT-1 (fragmento). Como un ejemplo no exclusivo, RS1 podría ser un aldehído y reaccionar por aminación reductora solamente con el N-terminal del mAb anti-TLT-1 (fragmento) mediante aminación reductora, conocida por un experto en la técnica. En otro ejemplo no exclusivo, RS1 podría ser un grupo maleimida, que puede reaccionar con un tiol libre en el mAb anti- TLT-1 (fragmento).During the first stage, a linker, with two different reactive groups RS1 and RS2, can bind to the anti-TLT-1 mAb (fragment). The reaction can be run with low site selectivity or selectively, so that RS1 only reacts at one or a few positions of the anti-TLT-1 mAb (fragment). As a non-exclusive example, RS1 could be an aldehyde and react by reductive amination only with the N-terminus of the anti-TLT-1 mAb (fragment) by reductive amination, known to one skilled in the art. In another non-exclusive example, RS1 could be a maleimide group, which can react with a free thiol in the anti-TLT-1 mAb (fragment).
Durante la segunda etapa, el grupo reactivo RS2 puede hacerse reaccionar con baja selectividad de sitio o selectividad de sitio con una molécula FVIIa. Como un ejemplo no exclusivo, una reacción selectiva de sitio en FVIIa puede obtenerse cuando RS2 es un derivado de ácido siálico, que puede reaccionar en presencia de una enzima adecuada, tal como ST3Gal-III con glicanos unidos a N, que no terminan exclusivamente con ácidos siálicos.During the second stage, the RS2 reactive group can be reacted with low site selectivity or site selectivity with an FVIIa molecule. As a non-exclusive example, a site selective reaction in FVIIa can be obtained when RS2 is a sialic acid derivative, which can react in the presence of a suitable enzyme, such as ST3Gal-III with N-linked glycans, which do not exclusively terminate with sialic acids.
El orden de unión del enlazador a las dos proteínas, específicamente el mAb anti-TLT-1 (fragmento) y la molécula FVIIa puede cambiarse, lo que une de esta manera la molécula RS1-Enlazador-RS2 primero a la molécula FVIIa y después al mAb anti-TLT-1 (fragmento).The order of binding of the linker to the two proteins, specifically the anti-TLT-1 mAb (fragment) and the FVIIa molecule can be changed, thus binding the RS1-Linker-RS2 molecule first to the FVIIa molecule and then to the anti-TLT-1 mAb (fragment).
Ejemplo 32: Conjugación del fragmento anti TLT-1-FAB (Fab0084) al FVIIa para la producción de FVIIa-Fab1029.Example 32: Conjugation of the anti TLT-1-FAB fragment (Fab0084) to FVIIa for the production of FVIIa-Fab1029.
Etapa 1: Éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo del ácido 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propiónico.Step 1: 3- (2,5-Dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionic acid 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl ester.
Se disolvió ácido 3-maleimidopropiónico (1,0 g, 5,9 mmol) en tetrahidrofurano (20 ml). Se añadió posteriormente 2-succinimido-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TSTU, 2,14 g, 7,1 mmol) y etildiisopropilamina (1,24 ml, 7,1 mmol). Se añadió W,W-Dimetilformamida (5 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente, mientras se volvía inerte. La mezcla se agitó durante 2 min. Se añadió W,W-Dimetilformamida (5 ml). La mezcla se agitó durante 2,5 h a temperatura ambiente. Se diluyó con diclorometano (150 ml) y se lavó posteriormente con una solución acuosa al 10 % de hidrógenosulfato de sodio (150 ml), una solución acuosa saturada de hidrógenocarbonato de sodio (150 ml) y agua (150 ml). Se secó sobre sulfato de magnesio. El solvente se eliminó al vacío. El producto crudo se recristalizó a partir de acetato de etilo para dar 1,20 g de éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo del ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propiónico.3-Maleimidopropionic acid (1.0g, 5.9mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (20ml). 2-Succinimido-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU, 2.14 g, 7.1 mmol) and ethyldiisopropylamine (1.24 ml, 7.1 mmol) were subsequently added. W, W-Dimethylformamide (5 ml) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature, while becoming inert. The mixture was stirred for 2 min. W, W-Dimethylformamide (5 ml) was added. The mixture was stirred for 2.5 h at room temperature. It was diluted with dichloromethane (150 ml) and was subsequently washed with an aqueous solution 10 % sodium hydrogensulfate (150 ml), a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate (150 ml) and water (150 ml). Dried over magnesium sulfate. Solvent was removed in vacuo. The crude product was recrystallized from ethyl acetate to give 1.20 g of 3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionic acid 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl ester .
MS: m/z = 289, requerido para [M+Na]+: 289MS: m / z = 289, required for [M + Na] +: 289
1H-NMR (CDCla) 82,82 (m, 4 H); 3,02 (t, 2 H); 3,94 (t, 2 H), 6,73 (s, 2 H).1H-NMR (CDCla) 82.82 (m, 4H); 3.02 (t, 2H); 3.94 (t, 2H), 6.73 (s, 2H).
Etapa 2:Ácido N-((3-(u>-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 10 kDa)propionilamino)acetil)-O2-[5']citidilil-$-neuramínico (NNC 0129-0000-3259).Step 2: N - ((3- (u> - (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 10 kDa) propionylamino) acetyl) -O2- [5 ' ] citidylil - $ - neuramine (NNC 0129-0000-3259).
Se disolvió el ácido N-((3-(u> -Amino PEGil 10kDa)propionilamino)acetil)-O2-[5']citidilil- ^-neuramínico (100 mg, 0,009 mmol) en una mezcla de tetrahidrofurano (2 ml) y diclorometano (10 ml). Se añadió una solución del éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo del ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propiónico (50 mg, 0,18 mmol) en diclorometano (3 ml). Se añadió etildiisopropilamina (0,005 ml, 0,028 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Se añadieron diclorometano (2 ml) y etildiisopropilamina (0,5 ml). Se añadió resina de poliestireno amionometilado (disponible comercialmente en, por ejemplo, Novabiochem, carga 0,85 mmol/g, 438 mg, 0,372 mmol). La mezcla se agitó lentamente a temperatura ambiente durante 1 h. La resina se eliminó por filtración. El solvente se eliminó al vacío con una temperatura del baño de 25°C. El residuo se disolvió en diclorometano (4 ml). Se añadió éter (200 ml). La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 2 h para dejar que la precipitación formada envejeciera. La precipitación se aisló mediante filtración y se secó al vacío para obtener 38 mg del compuesto del título. El espectro 1H-NMR en DMSO-d6 mostró la presencia de un grupo maleimida.N - ((3- (u> -Amino PEGyl 10kDa) propionylamino) acetyl) -O2- [5 '] cytidylyl- ^ -neuramine (100 mg, 0.009 mmol) was dissolved in a mixture of tetrahydrofuran (2 mL) and dichloromethane (10 ml). A solution of the 3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionic acid 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl ester (50 mg, 0.18 mmol) in dichloromethane (3) was added. ml). Ethyldiisopropylamine (0.005 ml, 0.028 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16h. Dichloromethane (2 ml) and ethyldiisopropylamine (0.5 ml) were added. Amionomethylated polystyrene resin (commercially available from eg Novabiochem, loading 0.85 mmol / g, 438 mg, 0.372 mmol) was added. The mixture was slowly stirred at room temperature for 1 h. The resin was removed by filtration. The solvent was removed in vacuo with a bath temperature of 25 ° C. The residue was dissolved in dichloromethane (4 ml). Ether (200 ml) was added. The mixture was left at room temperature for 2 h to allow the formed precipitation to age. The precipitation was isolated by filtration and dried under vacuum to obtain 38 mg of the title compound. The 1H-NMR spectrum in DMSO-d6 showed the presence of a maleimide group.
Etapa 3:Unión del ácido N-((3-(u>-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 10 kDa)propionilamino)-acetil)-O2-[5']citidilil-^-neuramínico a un FAB anti-TLT-1.Step 3: Binding of N - ((3- (u> - (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 10 kDa) propionylamino) -acetyl) -O2- acid [5 '] cytidylyl - ^ - neuramine to an anti-TLT-1 FAB.
Un análisis de LC-MS de un fragmento FAB anti-TLT-1 con partes de la región de bisagra en donde se incorporó una Cys no pareada indicó que la Cys no pareada estaba tapada con una cisteína. Por lo tanto, antes de la reacción con el ácido N-((3-( u> -(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 10 kDa)propionilamino)acetil)-O2-[5']citidilil-^ -neuramínico tiene que realizarse el destapado de la Cys no pareada mediante reacción con clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina.LC-MS analysis of an anti-TLT-1 FAB fragment with parts of the hinge region where an unpaired Cys was incorporated indicated that the unpaired Cys was covered with a cysteine. Therefore, before reaction with N - ((3- (u> - (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 10 kDa) propionylamino) acetyl acid, ) -O2- [5 '] cytidylyl- ^ -neuramine must be uncapped from unpaired Cys by reaction with tris (2-carboxy ethyl) phosphine hydrochloride.
Una solución de un fragmento de FAB anti-TLT-1 con partes de la región de bisagra en donde se incorporó una Cys no pareada (1 mg) en un tampón de HEPES 20 mM, Ed TA 5,0 mM, NaCl 100 mM, que se había ajustado a pH 7,5, se colocó en un dispositivo de ultrafiltración amicon con un valor límite de 10 kDa. El tampón se cambió a un tampón compuesto de imidazol 20 mM, CaCl210 mM, Tween 80 al 0,02 %, glicerol 1 M, que se había ajustado a pH 7,35 mediante ultracentrifugación repetida a 4000 rpm. Después que se cambió el tampón, se obtuvo una solución de la proteína en el tampón compuesto de imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, glicerol 1 M, que se había ajustado a pH 7,35 (4 ml). Se añadió una solución de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 1 mg/ml (0,40 ml). La mezcla de reacción se agitó a 300 rpm a 20oC durante 1 h. La mezcla de reacción se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación con un valor límite de 10 kDa y se concentró por ultracentrifugación a 4000 rpm durante 7 min, lo que deja una solución de 0,700 ml detrás. Esto se aplicó a una columna PD-10 (Amersham Bioscience), que se había equilibrado con un tampón de HEPES 25 mM, que se había ajustado a pH 7,00. La proteína se eluyó de la columna mediante el uso de un tampón de HEPES 25 mM, que se había ajustado a pH 7,00 (3,2 ml). Esta solución se concentró mediante ultracentrifugación a 4000 rpm en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un valor límite de 10 kDa durante 7 min para rendir una solución de 0,750 ml. La solución se colocó en un vial y se añadió tampón de HEPES 25 mM, que se había ajustado a pH 7,00 (0,360 ml). Se añadió una solución de 1 mg/ml del ácido N-((3-( u> -(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 10 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5’]citidilil- ^-neuramínico (0,89 ml). La mezcla de reacción se agitó suavemente a 300 rpm a 20 oC durante 3,5 h. Se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un valor límite de 10 kDa y se concentró por ultracentrifugación a 4000 rpm durante 10 min a un volumen de 0,120 ml. La solución se sometió a una cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superose 7510/300 GL (GE Healthcare) a un flujo de 0,50 ml/min, mediante el uso de un tampón compuesto de TRIS 25 mM, NaCl 150 mM, que se había ajustado a pH 8,00 como eluyente. Las fracciones se agruparon sobre la base del trazo UV a 280 nm del cromatograma. El agrupamiento (0,148 mg, 1,4 ml), que contiene el compuesto deseado según lo juzgado por SDS-PAGE y que carecía del reactivo de PEG libre según lo juzgado por SDS-PAGE mediante el uso de un método de tinción específico de PEG (descrito en Kurfürst, M. M. Analyt. Biochem. 1992, 200, 244-248) se usó en la etapa siguiente.A solution of an anti-TLT-1 FAB fragment with parts of the hinge region where unpaired Cys (1mg) was incorporated into a 20mM HEPES buffer, 5.0mM Ed TA, 100mM NaCl, which had been adjusted to pH 7.5, was placed in an amicon ultrafiltration device with a limit value of 10 kDa. The buffer was changed to a buffer consisting of 20mM imidazole, 10mM CaCl 2 , 0.02% Tween 80, 1M glycerol, which had been adjusted to pH 7.35 by repeated ultracentrifugation at 4000 rpm. After the buffer was changed, a solution of the protein was obtained in the buffer consisting of 20mM imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 1M glycerol, which had been adjusted to pH 7.35 (4 ml). A solution of tris (2-carboxy ethyl) phosphine hydrochloride 1 mg / ml (0.40 ml) was added. The reaction mixture was stirred at 300 rpm at 20 ° C for 1 hr. The reaction mixture was placed in an ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa and concentrated by ultracentrifugation at 4000 rpm for 7 min, leaving a 0.700 ml solution behind. This was applied to a PD-10 column (Amersham Bioscience), which had been equilibrated with a 25mM HEPES buffer, which had been adjusted to pH 7.00. Protein was eluted from the column using a 25 mM HEPES buffer, which had been adjusted to pH 7.00 (3.2 ml). This solution was concentrated by ultracentrifugation at 4000 rpm in an Amicon ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa for 7 min to yield a 0.750 ml solution. The solution was placed in a vial and 25 mM HEPES buffer was added, which had been adjusted to pH 7.00 (0.360 ml). A 1 mg / ml solution of N - ((3- (u> - (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 10 kDa) propionylamino) acetyl was added ) -02- [5 '] cytidylyl- ^ -neuramine (0.89 ml). The reaction mixture was gently stirred at 300 rpm at 20 oC for 3.5 h. It was placed in an Amicon ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa and concentrated by ultracentrifugation at 4000 rpm for 10 min at a volume of 0.120 ml. The solution was subjected to size exclusion chromatography on a Superose 7510/300 GL column (GE Healthcare) at a flow of 0.50 ml / min, using a buffer composed of 25 mM TRIS, 150 mM NaCl, which had been adjusted to pH 8.00 as the eluent. The fractions were pooled on the basis of the UV trace at 280 nm of the chromatogram. The pool (0.148 mg, 1.4 ml), containing the desired compound as judged by SDS-PAGE and lacking the free PEG reagent as judged by SDS-PAGE using a specific PEG staining method (described in Kurfürst, MM Analyt. Biochem. 1992, 200, 244-248) was used in the next step.
Etapa 4: Sialidasa inmovilizada. (C. Perfingens tipo VI-A inmovilizado en agarosa, Sigma: N-5254, gel 0,6-1,8 U/ml, 0 , 1 80 ml) se lavó con agua (2 x 0,50 ml) y posteriormente con un tampón de MES 25 mM, CaCl220 mM, NaCl 100 mM, que se había ajustado a pH 6,1 (3 x 0,50 ml). Se añadió a la sialidasa inmovilizada una solución del FVIIa (0,50 mg) en un tampón compuesto de Gly-Gly 25 mM, CaCb , 10 mM que se ajustó a pH 6,0. La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente, a la vez que se mezcló cuidadosamente cada 20 min. Después de 3 h, la resina inmovilizada se eliminó por filtración a través de una columna de centrífuga Pierce mediante centrifugación a 2000 rpm durante 2 min.Stage 4: Sialidase immobilized. (C. perfingens Type VI-A immobilized on agarose, Sigma N-5254, 0.6 to 1.8 gel U / ml, 0, 1 80 ml) washed with water (2 x 0.50 ml) and then with a buffer of 25 mM MES, 20 mM CaCl 2 , 100 mM NaCl, which had been adjusted to pH 6.1 (3 x 0.50 ml). To the immobilized sialidase was added a solution of the FVIIa (0.50 mg) in a buffer composed of 25 mM Gly-Gly, CaC b , 10 mM which was adjusted to pH 6.0. The reaction mixture was left at room temperature, while carefully mixing every 20 min. After 3 hr, the immobilized resin was removed by filtration through a Pierce centrifuge column by centrifugation at 2000 rpm for 2 min.
La mezcla de productos de la unión del ácido N-((3-( u> -(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 10 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil- ^ -neuramínico con un FAB anti-TLT-1 como se describió en una etapa anterior se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un valor límite de 10 kDa. El tampón se cambió mediante ultracentrifugación repetida a un tampón compuesto de MES 25 mM, CaCl220 mM, NaCl 100 mM, que se había ajustado a pH 6,1.The N-((3- (u> - (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 10 kDa) propionylamino) acetyl) - 02- [5 '] cytidylyl- ^ -neuramine with an anti-TLT-1 FAB as described in a previous step was placed in an Amicon ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa. The buffer was changed by repeated ultracentrifugation to a buffer consisting of 25mM MES, 20mM CaCl 2 , 100mM NaCl, which had been adjusted to pH 6.1.
A esta solución, se añadió una parte de la solución del derivado de FVIIa (0,092 ml). El tampón se cambió en un tampón compuesto de MES 25 mM, CaCb 20 mM, NaCl 100 mM, que se había ajustado a pH 6,1 y un volumen total de (0,20 ml). Se añadió una solución de ST3-Gal-III (0,015 ml). La mezcla de reacción se agita suavemente a 32 oC durante 25 min y después de eso se deja a 32 oC durante 16 h. Se añadió una solución de 10 mg/ml de ácido CMP-N-acetilneuramínico (CMP NeuNAc, 0,70 mg, 0,070 ml) en un tampón de MES 25 mM, CaCb 20 mM, NaCl 100 mM, que se había ajustado a pH 6,1. La mezcla de reacción se agitó suavemente a 32 oC durante 15 min y después de eso se dejó a 32 oC durante 1 h. La mezcla de reacción se sometió a una cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) con un flujo de 0,5 ml/min mediante el uso de un tampón de Histidina 10 mM, CaCb 20 mM, NaCl 150 mM que se había ajustado a pH 6,1 como eluyente. Se agruparon las fracciones que contenían el producto deseado según lo juzgado por SDS-PAGE en un gel de TRIS-Acetato. Mediante el uso de una absorción molar de 11,22 a 280 nm en un aparato Nandrop®, se encontró un rendimiento de 0,022 mg. El resultado de un análisis de SDS-PAGE estuvo de acuerdo con la expectativa del producto deseado. El producto se denominó FVIIa-Fab1029.To this solution, a part of the FVIIa derivative solution (0.092 ml) was added. The buffer was changed into a buffer consisting of 25mM MES, 20mM CaC b , 100mM NaCl, which had been adjusted to pH 6.1 and a total volume of (0.20ml). ST3-Gal-III solution (0.015 ml) was added. The reaction mixture is gently stirred at 32 oC for 25 min and thereafter left at 32 oC for 16 h. A solution of 10 mg / ml of CMP-N-acetylneuraminic acid (CMP NeuNAc, 0.70 mg, 0.070 ml) was added in a buffer of 25 mM MES, 20 mM CaC b, 100 mM NaCl, which had been adjusted to pH 6.1. The reaction mixture was gently stirred at 32 oC for 15 min and thereafter left at 32 oC for 1 h. The reaction mixture was subjected to size exclusion chromatography on a Superdex 200 10/300 GL column (GE Healthcare) at a flow of 0.5 ml / min using a 10 mM Histidine buffer, CaC b 20 mM, 150 mM NaCl which had been adjusted to pH 6.1 as the eluent. Fractions containing the desired product were pooled as judged by SDS-PAGE on a TRIS-Acetate gel. Using a molar absorption of 11.22 at 280 nm in a Nandrop® apparatus, a yield of 0.022 mg was found. The result of an SDS-PAGE analysis was in accordance with the expectation of the desired product. The product was named FVIIa-Fab1029.
Ejemplo 33: Conjugación de un fragmento anti-TLT-1-FAB (Fab0084) al FVIII, FVIII-Fab3002.Example 33: Conjugation of an anti-TLT-1-FAB fragment (Fab0084) to FVIII, FVIII-Fab3002.
Etapa 1: Unión del ácido N-((3-( u> -(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 10 kDa)propionilamino)-acetil)-02-[5']citidilil- ^-neuramínico a un fragmento FAB anti-TLT-1Step 1: Binding of N - ((3- (u> - (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 10 kDa) propionylamino) -acetyl) -0 2 acid - [5 '] cytidylyl- ^ -neuramine to an anti-TLT-1 FAB fragment
Un análisis de LC-MS de un fragmento FAB anti-TLT-1 con partes de la región de bisagra en donde se incorporó una Cys no pareada indicó que la Cys no pareada puede estar tapada con una cisteína. Por lo tanto, antes de la reacción con el ácido N-((3-( u> -(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 10 kDa)propionilamino)acetil)-02LC-MS analysis of an anti-TLT-1 FAB fragment with parts of the hinge region where an unpaired Cys was incorporated indicated that the unpaired Cys may be covered with a cysteine. Therefore, before reaction with N - ((3- (u> - (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 10 acid, kDa) propionylamino) acetyl) -02
[5']citidilil- ^ -neuramínico, debe realizarse el destapado de la Cys no pareada mediante reacción con clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP).[5 '] Cytidylyl- ^ -neuramine, unpaired Cys should be uncapped by reaction with tris (2-carboxy ethyl) phosphine hydrochloride (TCEP).
Dicho fragmento TLT-1-FAB (1,35 mg, 27,4 nmol) en una solución de 0,27 mg/ml en un tampón compuesto de HEPES 20 mM, EDTA 5 mM, NaCl 100 mM que se había ajustado a pH 7,5 se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un valor límite de 10 kDa. Se sometió a ultracentrifugación a 4000 rpm a 20 oC durante 10 min. Se añadió un tampón compuesto de imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, glicerol 1 M que se había ajustado a pH 7,35 (4 ml). La mezcla se sometió a ultracentrifugación a 4000 rpm a 20 oC durante 8 min. Se añadió un tampón compuesto de imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, glicerol 1 M que se había ajustado a pH 7,35 (4 ml). La mezcla se sometió a ultracentrifugación a 4000 rpm a 20 oC durante 8 min. Se añadió un tampón compuesto de imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, glicerol 1 M que se había ajustado a pH 7,35 (3 ml). La mezcla se sometió a ultracentrifugación a 4000 rpm a 20 oC durante 10 min. La mezcla se colocó en un frasco de reacción. Se añadió un tampón compuesto de imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, glicerol 1 M que se había ajustado a pH 7,35 (4 ml), de manera que el volumen total de la mezcla de reacción en este momento fue de 4,7 ml. Se añadió una solución de TCEP 1 M (0,54 ml) en un tampón de imidazol, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, glicerol 1 M que se había ajustado a pH 7,35. La mezcla de reacción se agitó a 300 rpm durante 1 h. La mezcla se dividió en dos partes, cada una de las cuales se aplicó a una columna PD-10 (GE Healthtech) que se había equilibrado con un tampón de HEPES 25 mM con un pH de 7,0. Los eluatos se combinaron (7 ml en total) y se concentraron a 1 ml mediante ultracentrifugación a 4000 rpm a 20 oC durante 6 - 8 min en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un valor límite de 10 kDa.Said TLT-1-FAB fragment (1.35 mg, 27.4 nmol) in a 0.27 mg / ml solution in a buffer consisting of 20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl that had been adjusted to pH 7.5 was placed in an Amicon ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa. It was ultracentrifuged at 4000 rpm at 20 oC for 10 min. A buffer consisting of 20mM imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 1M glycerol which had been adjusted to pH 7.35 (4ml) was added. The mixture was subjected to ultracentrifugation at 4000 rpm at 20 oC for 8 min. A buffer consisting of 20mM imidazole, 10mM CaCl 2 , 0.02% Tween 80, 1M glycerol which had been adjusted to pH 7.35 (4ml) was added. The mixture was subjected to ultracentrifugation at 4000 rpm at 20 oC for 8 min. A buffer consisting of 20mM imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 1M glycerol which had been adjusted to pH 7.35 (3ml) was added. The mixture was subjected to ultracentrifugation at 4000 rpm at 20 oC for 10 min. The mixture was placed in a reaction bottle. A buffer composed of 20mM imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 1M glycerol which had been adjusted to pH 7.35 (4ml) was added so that the total volume of the reaction mixture at this time it was 4.7 ml. A solution of 1M TCEP (0.54ml) in imidazole buffer, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 1M glycerol which had been adjusted to pH 7.35 was added. The reaction mixture was stirred at 300 rpm for 1 hr. The mixture was divided into two parts, each of which was applied to a PD-10 column (GE Healthtech) that had been equilibrated with a 25 mM HEPES buffer with a pH of 7.0. The eluates were combined (7 ml in total) and concentrated to 1 ml by ultracentrifugation at 4000 rpm at 20 oC for 6-8 min in an Amicon ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa.
La solución se colocó en un frasco de reacción. Se añadió un tampón de HEPES 25 mM que se había ajustado a pH 7,0 (0,50 ml) para obtener un volumen total de 1,5 ml. Se añadió una solución de 1 mg/ml preparada recientemente de ácido N-((3-( w-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 10 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil-^-neuramínico (1,2 ml, 1,2 mg, 109 nmol) en un tampón de HEPES 25 mM que se había ajustado a pH 7,0. La mezcla de reacción se agitó suavemente a 300 rpm a 20 oC durante 3,2 h. Se concentró hasta un volumen de 0,30 ml por ultracentrifugación a 4000 rpm a 19 oC durante 11 min en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un valor límite de 10 kDa. Se aplicó a una cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 7510/300 GL (GE Healthtech) a un flujo de 0,50 ml/min mediante el uso de un tampón de TRIS 25 mM, NaCl 150 mM que se había ajustado a pH 8,0 como eluyente. La fracción que contiene el producto deseado en una pureza aceptable según lo juzgado por análisis de SDS-PAGE en presencia de N-metilmaleimida (NEM) y que carecía del ácido N-((3-( u>-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 10 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil-5-neuramínico sin reaccionar según lo juzgado por SDS-PAGE en combinación con una tinción sensible a PEG ((descrita en Kurfürst, M. M. Analyt. Biochem. 1992, 200, 244-248)) se usó en la etapa siguiente. El análisis de SDS-pAg E bajo condiciones de reducción estuvo en concordancia con el resultado esperado para el producto deseado. El análisis de SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras mostró algún material, en el que una cadena del fragmento anti-TLT-1-FAB se había perdido. Sin embargo, se mantiene sin resolver, si este hallazgo se debía a problemas en el análisis o si una cadena se había perdido realmente durante la reacción descrita o incluso antes. Mediante el uso de una absorbancia molar de 10,44 a 280 nm en un aparato Nanodrop®, se encontró una concentración de 0,1 mg/ml lo que da un rendimiento de 0,287 mg.The solution was placed in a reaction bottle. A 25 mM HEPES buffer that had been adjusted to pH 7.0 (0.50 ml) was added to obtain a total volume of 1.5 ml. A freshly prepared 1 mg / ml solution of N- (( 3- (w- (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 10 kDa) propionylamino) was added. acetyl) -02- [5 '] citidylyl - ^ - neuramine (1.2 ml, 1.2 mg, 109 nmol) in a 25 mM HEPES buffer that had been adjusted to pH 7.0. The reaction mixture was gently stirred at 300 rpm at 20 oC for 3.2 h. It was concentrated to a volume of 0.30 ml by ultracentrifugation at 4000 rpm at 19 oC for 11 min in an Amicon ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa. It was applied to a size exclusion chromatography on a Superdex 7510/300 GL column (GE Healthtech) at a flow of 0.50 ml / min using a 25 mM TRIS buffer, 150 mM NaCl that had been adjusted to pH 8.0 as eluent. The fraction containing the desired product in an acceptable purity as judged by SDS-PAGE analysis in the presence of N-methylmaleimide (NEM) and lacking N - ((3- (u> - (3- (2, Unreacted 5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 10 kDa) propionylamino) acetyl) -02- [5 '] cytidylyl-5-neuramine as judged by SDS-PAGE in combination with a stain sensitive to PEG ((described in Kurfürst, MM Analyt. Biochem. 1992, 200, 244-248)) was used in the next step. Analysis of SDS-pAg E under reduction conditions was in agreement with the expected result for the desired product. SDS-PAGE analysis under non-reducing conditions showed some material, in which one strand of the anti-TLT-1-FAB fragment had been lost. However, it remains unsolved, whether this finding was due to problems in the analysis, or whether a string was actually lost during the described reaction or even earlier. Using a molar absorbance of 10.44 at 280 nm in a Nanodrop® apparatus, a concentration of 0.1 mg / ml was found giving a yield of 0.287 mg.
Etapa 2: La solución del producto de la unión del ácido N-((3-(u>-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 10 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil- ^ -neuramínico a un fragmento FAB anti-TLT-1 como se describió en el ejemplo anterior y una solución del FVIII con dominio B eliminado que tenía una secuencia de dominio B residual de SFSq Ns RHPSQNPPVLKRHQR en el C terminal de la cadena pesada (0,780 mg, 5,64 mmol) en un tampón compuesto de imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, NaCl 150 mM, Tween80 al 0,02 % y glicerol 1 M que se había ajustado a pH 7,35 (0,018 ml) se mezclaron y se colocaron en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un valor límite de 10 kDa. La solución se sometió a un cambio de tampón a histidina 20 mM, CaCb 10 mM, glicerol al 20 %, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 500 mM que se había ajustado a pH 6,05 mediante la repetición de la ultracentrifugación y la adición del tampón. Se obtuvo un volumen total de 0,40 ml. Posteriormente se añadieron una solución de 0,4 mg/ml (242 U/mg, 98 U/ml, 0,0055 ml) de sialidasa a partir de A. Urifaciens y una solución de ST3Gal-III (0,033 ml) a 2,5 mg/ml. La mezcla de reacción se agitó suavemente durante 15 min a 300 rpm a 32 °C, se dejó durante 2 h a 32 °C durante las cuales se agitó cuidadosamente de manera ocasional, y finalmente se dejó a 32 °C durante 18 h. La mezcla de reacción se diluyó con agua (0,030 ml). Esta se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño mediante el uso de una columna Superose 6 10/300 GL (GE Healthcare) y mediante el uso de un tampón de Histidina 10 mM, CaCb 1,7 mM, Tween80 al 0,01 %, NaCl 0,3 M, sacarosa 8 , 8 mM que se había ajustado a pH 7 a un flujo de 0,50 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado según lo juzgado por análisis de s Ds -PAGE se agruparon. La mezcla se sometió a un cambio de tampón mediante el uso de un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un valor límite de 10 kDa a un tampón compuesto de histidina 20 mM, CaCb 10 mM, glicerol 1 M, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 500 mM que se había ajustado a pH 6,07. Se obtuvo un volumen total de 0,250 ml. Mediante el uso de una absorción molar de 14,6 a 280 nm en un aparato Nanodrop, se encontró una concentración de 0,59 mg/ml, lo que corresponde a un rendimiento de 0,148 mg. Se añadió una solución de 10 mg/ml del ácido CMP-N-acetilneuramínico (CMP NeuNAc, 0,26 mg, 0,026 ml) en un tampón de histidina 20 mM, CaCb 10 mM, glicerol al 20 %, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 500 mM que se había ajustado a pH 6,05 y una solución de ST3Gal-III (0,015 ml). La mezcla de reacción se agitó suavemente a 300 rpm a 32 °C durante 15 min y después se dejó a 32 °C durante otros 45 min. La mezcla de reacción se diluyó con agua (0,10 ml). Esta se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño mediante el uso de columna Superóse 6 10/300 GL (GE Healthcare) y mediante el uso de un tampón de Histidina 10 mM, CaCl21,7 mM, Tween80 al 0,01 %, NaCl 0,3 M, sacarosa 8 , 8 mM que se había ajustado a pH 7 a un flujo de 0,50 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado según lo juzgado por análisis de SDS-PAGE se mezclaron y concentraron mediante ultracentrifugación en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon para dar un volumen total de aproximadamente 0,275 ml. Mediante el uso de una absorción molar a 280 nm de 14,6 en un aparato Nanodrop®, se encontró una concentración de 0,180 ml/ml, lo que corresponde a un rendimiento de 0,0495 mg. El análisis de SDS-PAGE del producto bajo condiciones reducidas está de acuerdo con la expectativa para el producto deseado. El análisis de SDS-PAGE bajo condiciones no reducidas muestra cantidades cambiantes de una banda que corresponde a un producto donde el fragmento FAB ha perdido una cadena. La apariencia de una banda que corresponde a puede deberse a la presencia de dicho compuesto en el producto o puede deberse a la descomposición durante la desnaturalización anterior al análisis de SDS-PAGE.Step 2: The solution of the N-acid binding product - ((3- (u> - (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 10 kDa) propionylamino) acetyl) -02- [5 '] cytidylyl- ^ -neuramine to an anti-TLT-1 FAB fragment as described in the previous example and a FVIII solution with deleted B domain that had a residual B domain sequence of SFSq Ns RHPSQNPPVLKRHQR at the C- terminus of the heavy chain (0.780 mg, 5.64 mmol) in a buffer consisting of 20mM imidazole, 10mM CaCb, 150mM NaCl, 0.02% Tween80 and 1M glycerol that had been adjusted to pH 7.35 (0.018 ml) were mixed and placed in an Amicon ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa. The solution was subjected to a buffer change to 20mM histidine, 10mM CaCb, 20% glycerol, 0.02% Tween 80, 500mM NaCl which had been adjusted to pH 6.05 by repeating ultracentrifugation and adding the buffer. A total volume of 0.40 ml was obtained. Subsequently, a solution of 0.4 mg / ml (242 U / mg, 98 U / ml, 0.0055 ml) of sialidase from A. urifaciens and a solution of ST3Gal-III (0.033 ml) were added to 2, 5 mg / ml. The reaction mixture was gently stirred for 15 min at 300 rpm at 32 ° C, left for 2 h at 32 ° C during which it was gently stirred occasionally, and finally left at 32 ° C for 18 h. The reaction mixture was diluted with water (0.030 ml). This was subjected to size exclusion chromatography using a Superose 6 10/300 GL column (GE Healthcare) and using a 10mM Histidine buffer, 1.7mM CaCb, 0.01% Tween80, 0.3 M NaCl, sucrose 8, 8 mM which was adjusted to pH 7 at a flow of 0.50 ml / min. Fractions containing the desired product as judged by s Ds-PAGE analysis were pooled. The mixture was subjected to a buffer change by using an Amicon ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa to a buffer composed of 20mM histidine, 10mM CaCb, 1M glycerol, 0.02% Tween 80, 500 mM NaCl that had been adjusted to pH 6.07. A total volume of 0.250 ml was obtained. Using a molar absorption of 14.6 at 280 nm in a Nanodrop apparatus, a concentration of 0.59 mg / ml was found, corresponding to a yield of 0.148 mg. A 10 mg / ml solution of CMP-N-acetylneuraminic acid (CMP NeuNAc, 0.26 mg, 0.026 ml) was added in a buffer of 20 mM histidine, 10 mM CaCb, 20% glycerol, Tween 80-0, 02%, 500 mM NaCl that had been adjusted to pH 6.05 and a ST3Gal-III solution (0.015 ml). The reaction mixture was gently stirred at 300 rpm at 32 ° C for 15 min and then left at 32 ° C for another 45 min. The reaction mixture was diluted with water (0.10 ml). This was subjected to size exclusion chromatography by using the Superóse 6 10/300 GL column (GE Healthcare) and by using a buffer of 10 mM Histidine, 1.7 mM CaCl 2 , 0.01% Tween80, 0.3 M NaCl, sucrose 8, 8 mM that had been adjusted to pH 7 at a flow of 0.50 ml / min. Fractions containing the desired product as judged by SDS-PAGE analysis were mixed and concentrated by ultracentrifugation in an Amicon ultracentrifugation device to give a total volume of approximately 0.275 ml. Using a 280nm molar absorption of 14.6 in a Nanodrop® apparatus, a concentration of 0.180 ml / ml was found, corresponding to a yield of 0.0495 mg. SDS-PAGE analysis of the product under reduced conditions is in accordance with the expectation for the desired product. SDS-PAGE analysis under unreduced conditions shows changing amounts of a band corresponding to a product where the FAB fragment has lost a chain. The appearance of a corresponding band may be due to the presence of said compound in the product or may be due to decomposition during denaturation prior to SDS-PAGE analysis.
Ejemplo 34: Unión al TLT-1.Example 34: Binding to TLT-1.
Tabla 16: ReactivosTable 16: Reagents
Método:Method:
El TLT-1 se inmovilizó directamente a un chip CM5 a un nivel de aprox. 2000 RU (50 ug/ml diluido en Na-acetato, pH 4,0) mediante el uso del procedimiento estándar recomendado por el proveedor y los reactivos proporcionados en la Tabla 16. Se analizaron diluciones de dos veces de FVIIa-Fab1029 y FIX-Fab0135 desde 20 nM hasta 0,3 nM para la unión al TLT-1. Tampón de corrida y de dilución: HEPES 10 mM, 150 mM, p20 al 0,005 %, pH 7,4. La regeneración se obtuvo mediante glicina 10 mM, pH 1,7. La determinación de constantes cinéticas y de unión (kon, koff, Kd) se obtuvo al asumir una interacción 1:1 del t LT-1 y FVIIa-Fab1029 o FIX-Fab0135 mediante el uso del programa informático de evaluación Biacore T100.The TLT-1 was directly immobilized on a CM5 chip at a level of approx. 2000 RU (50 ug / ml diluted in Na-acetate, pH 4.0) using the standard procedure recommended by the supplier and the reagents provided in Table 16. Two-fold dilutions of FVIIa-Fab1029 and FIX- were analyzed. Fab0135 from 20 nM to 0.3 nM for binding to TLT-1. Run and dilution buffer: 10mM, 150mM HEPES, 0.005% p20, pH 7.4. Regeneration was obtained by 10 mM glycine, pH 1.7. The determination of kinetic and binding constants (kon, koff, Kd) was obtained by assuming a 1: 1 interaction of t LT-1 and FVIIa-Fab1029 or FIX-Fab0135 using the Biacore T100 evaluation software.
Resultado:Outcome:
Tabla 17Table 17
Conclusión:Conclusion:
Se estimaron las constantes de unión para la unión de FVIIa-Fab1029 y FIX-Fab0135 al TLT-1 mediante análisis de biacore y se confirmó la unión al TLT-1 (Tabla 17).Binding constants for binding of FVIIa-Fab1029 and FIX-Fab0135 to TLT-1 were estimated by biacore analysis and binding to TLT-1 was confirmed (Table 17).
Ejemplo 35: El FVIIa-Fab1029 promueve la formación de coágulos de fibrina en sangre total similar a hemofilia. Example 35: FVIIa-Fab1029 promotes hemophilia-like whole blood fibrin clot formation.
Los trazos de TEG obtenidos con HWB normal (NWB), sangre de “hemofilia”, y sangre de “hemofilia” suplementada con (0; 0,25; 0,5; 1,0 nM) de FVIIa-Fab1029 o rFVIIa se muestran en la Figura 11A. En la Figura 11B se muestran los valores de tiempo R obtenidos para los trazos de TEG representados. La Figura 11B, además de los valores de tiempo R para la proteína FVIIa-Fab1029 o rFVIIa, incluye, además, los valores de tiempo R para las concentraciones equivalentes de rFVIIa. Todos los datos se obtienen a partir de un donante representativo. Se observó que el FVIIa-Fab1029 normaliza eficientemente la coagulación de HWB similar a hemofilia. Además, los resultados muestran que el efecto procoagulante conocido del rFVIIa se potenció adicionalmente por conjugación del rFVIIa a un fragmento FAb de un anticuerpo contra TLT-1. Por lo tanto, el ejemplo con la proteína FVIIa-Fab1029 demuestra que el direccionamiento del rFVIIa al TLT-1 en plaquetas potencia adicionalmente la actividad de puenteo de FVIII del rFVIIa. Traces of TEG obtained with normal HWB (NWB), "hemophilia" blood, and "hemophilia" blood supplemented with (0; 0.25; 0.5; 1.0 nM) of FVIIa-Fab1029 or rFVIIa are shown in Figure 11A. Figure 11B shows the time values R obtained for the represented TEG traces. Figure 11B, in addition to the R time values for the FVIIa-Fab1029 or rFVIIa protein, further includes the R time values for the equivalent concentrations of rFVIIa. All data is obtained from a representative donor. FVIIa-Fab1029 was found to efficiently normalize coagulation of HWB similar to hemophilia. Furthermore, the results show that the known procoagulant effect of rFVIIa was further enhanced by conjugation of rFVIIa to an FAb fragment of an antibody against TLT-1. Thus, the example with the FVIIa-Fab1029 protein demonstrates that targeting of rFVIIa to TLT-1 in platelets further enhances the FVIII bridging activity of rFVIIa.
Ejemplo 36: El FIX-Fab0135 tiene actividad de puenteo de FVIII y promueve la formación de coágulos de fibrina en la sangre total similar a hemofilia A.Example 36: FIX-Fab0135 has FVIII bridging activity and promotes the formation of fibrin clots in whole blood similar to hemophilia A.
La sangre total humana estabilizada con citrato (HWB) se extrae a partir de donantes normales. La formación de coágulos se mide mediante tromboelastografía (analizador TEG serie 5000, Haemoscope Corporation, Niles, IL, EE.UU.). Las condiciones similares a hemofilia A se obtienen mediante incubación de sangre total humana normal estabilizada con citrato (HWB) con anticuerpo anti-FVIII 10 pg/ml (anti-Factor VIII humano de oveja; Hematologic Technologies Inc) durante 30 min a temperatura ambiente. Se añaden diversas concentraciones (0,1; 0,2; 1,0; 5,0; 10 nM) de FIX-Fab0135 a HWB con citrato similar a hemofilia A. La coagulación se inicia cuando 340 |jl de HWB normal o premezclada se transfieren a un recipiente del tromboelastógrafo que contiene 20 j l de CaCh 0,2 M con TF lipidado0,03 pM (Innovin®, Dade Behring Gmbh (Marburg, Alemania). El trazo de TEG se sigue continuamente por hasta 120 min. Los trazos de TEG obtenidos con sangre normal HWB (HWB), sangre “hemofílica” y sangre “hemofílica” suplementada con (0,1; 0,2; 1,0; 5,0; 10 nM) de FIX-Fab0135 se muestran en la Figura 12. Además, se muestran para la comparación los trazos de TEG obtenidos cuando FIX-Fab0135 se reemplaza por rFVIIa 1 nM o rFIX 10 nM. Todos los datos se obtienen a partir de un donante representativo.Citrate stabilized human whole blood (HWB) is drawn from normal donors. Clot formation is measured by thromboelastography (5000 series TEG analyzer, Haemoscope Corporation, Niles, IL, USA). Hemophilia A-like conditions are obtained by incubating citrate stabilized normal human whole blood (HWB) with 10 pg / ml anti-FVIII antibody (sheep anti-human Factor VIII; Hematologic Technologies Inc) for 30 min at room temperature. Various concentrations (0.1, 0.2, 1.0, 5.0, 10 nM) of FIX-Fab0135 are added to HWB with hemophilia A-like citrate. Coagulation starts when 340 | jl of normal or premixed HWB transferred to a thromboelastgraph container containing 20 µl of 0.2 M CaCh with 0.03 pM lipidized TF (Innovin®, Dade Behring GmbH (Marburg, Germany). The TEG trace is followed continuously for up to 120 min. of TEG obtained with normal HWB blood (HWB), "hemophilic" blood and "hemophilic" blood supplemented with (0.1; 0.2; 1.0; 5.0; 10 nM) of FIX-Fab0135 are shown in Figure 12. In addition, the TEG traces obtained when FIX-Fab0135 is replaced by 1 nM rFVIIa or 10 nM rFIX are shown for comparison All data is obtained from a representative donor.
Sorprendentemente, los resultados muestran que la fusión de FIX a un fragmento FAb de un anticuerpo contra TLT-1 produce una proteína con actividad de puenteo del FVIII. Se observó que el FIX-Fab0135 normaliza eficientemente el coágulo de HWB similar a hemophilia A. La propagación dependiente de FIX de la coagulación requiere el ensamblaje de un complejo FIXa/FVIIIa en la superficie de plaquetas activadas, y la actividad de activación del FX (tenasa) resultante se impide por anticuerpos inhibidores del FVIII. El presente ejemplo con FIX-Fab0135 demuestra que el direccionamiento de FIX hacia TLT-1 en la superficie de plaquetas genera un complejo que contiene FIX con actividad procoagulante aún cuando el FVIII se bloquea por un anticuerpo inhibidor.Surprisingly, the results show that fusion of FIX to an FAb fragment of an antibody against TLT-1 produces a protein with FVIII bridging activity. FIX-Fab0135 was observed to efficiently normalize the clot of HWB similar to hemophilia A. FIX-dependent propagation of coagulation requires the assembly of a FIXa / FVIIIa complex on the surface of activated platelets, and the activity of FX activation ( resulting tenase) is prevented by FVIII inhibitory antibodies. The present example with FIX-Fab0135 demonstrates that targeting of FIX to TLT-1 on the platelet surface generates a complex containing FIX with procoagulant activity even when FVIII is blocked by an inhibitory antibody.
Ejemplo 37: La proteína de fusión FIX-Fab0135 dirigida a las vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1 promueve notablemente la activación del FX inducida por el FVIIa en ausencia del FVIII.Example 37: FIX-Fab0135 fusion protein targeting TLT-1-enriched phospholipid vesicles remarkably promotes FVIIa-induced FX activation in the absence of FVIII.
Métodos: Las vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1, preparadas como se describió en el Ejemplo 20, se aplican en el experimento mostrado en la Figura 13 para imitar al TLT-1 en la superficie de plaquetas activadas. Diversas concentraciones (0,05 - 100 nM) del rFVIIa se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min i) en tampón Hepes (Hepes 50 mM, NaCl 0,1 M, CaCb 5 mM, BSA 1 mg/ml pH 7,4) o en tampón Hepes con ii) FIX 10 nM, iii) FIXa 10 nM o iv) FIX-Fab0135 10 nM. Esto se mezcla después con FX 100 nM (Enzyme Research Laboratories, Reino Unido) y vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1 a una dilución de 1:4000 en ausencia o en presencia de FVIII 5 nM y se incuban durante 3 min. La reacción se detiene por adición de un tampón de parada de volumen igual (Hepes 50 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 20 mM, BSA 1 mg/ml pH 7,5). La cantidad de FXa generada en las muestras se determina a continuación en un ensayo cromogénico mediante la transferencia de 50 j l de la mezcla a un pocillo de placa de microtitulación y mediante la adición de 25 j l de Cromozima X (0,42 mg/ml final) al pocillo. Se mide continuamente la absorbancia a 405 nm en un fotómetro SpectraMax de microplaca (Molecular Devices, Sunnyvale CA, EE.UU.). Methods: The TLT-1-enriched phospholipid vesicles, prepared as described in Example 20, are applied in the experiment shown in Figure 13 to mimic TLT-1 on the surface of activated platelets. Various concentrations (0.05 - 100 nM) of rFVIIa were incubated at room temperature for 15 min i) in Hepes buffer (50 mM Hepes, 0.1 M NaCl, 5 mM CaCb, 1 mg / ml BSA pH 7.4) or in Hepes buffer with ii) 10 nM FIX, iii) 10 nM FIXa or iv) 10 nM FIX-Fab0135. This is then mixed with 100 nM FX (Enzyme Research Laboratories, UK) and TLT-1 enriched phospholipid vesicles at a dilution of 1: 4000 in the absence or in the presence of 5 nM FVIII and incubated for 3 min. The reaction is stopped by the addition of an equal volume stop buffer (50mM Hepes, 0.1M NaCl, 20mM EDTA, 1mg / ml BSA pH 7.5). The amount of FXa generated in the samples is then determined in a chromogenic assay by transferring 50 jl of the mixture to a well of a microtiter plate and by adding 25 jl of Chromozyme X (0.42 mg / ml final ) to the well. Absorbance at 405nm is continuously measured on a microplate SpectraMax photometer (Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA).
El FVIIa es capaz de activar el FIX (0sterud y Rappaport, 1977) y el FIXa resultante se designa entonces para combinarse con FVIIIa y formar el componente proteolítico del denominado complejo de tenasa. La formación de este complejo tiene lugar en la superficie de plaquetas activadas. El complejo de tenasa es responsable de una activación masiva de FX que desempeña un papel clave en la fase de propagación del proceso de coagulación. La incapacidad para formar un complejo de tenasa activo es la diátesis central en pacientes con hemofilia A y B.FVIIa is capable of activating FIX (0sterud and Rappaport, 1977) and the resulting FIXa is then designated to combine with FVIIIa and form the proteolytic component of the so-called tenase complex. The formation of this complex takes place on the surface of activated platelets. The tenase complex is responsible for a massive activation of FX that plays a key role in the propagation phase of the coagulation process. The inability to form an active tenase complex is the central diathesis in patients with hemophilia A and B.
En el presente ejemplo, se aplican vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1 para imitar la superficie de plaquetas activadas. Este sistema se usa para analizar si el direccionamiento del FIX al TLT-1 en dichas vesículas por medio del FIX-Fab0135 puede promover la activación de FX en analogía con el complejo de tenasa en plaquetas activadas. Además, es de interés examinar si la presencia del FVIII es obligatoria o no para esta actividad.In the present example, TLT-1-enriched phospholipid vesicles are applied to mimic the surface of activated platelets. This system is used to analyze whether targeting of FIX to TLT-1 in such vesicles by FIX-Fab0135 can promote FX activation in analogy with the tenase complex in activated platelets. Furthermore, it is of interest to examine whether the presence of FVIII is mandatory or not for this activity.
La Figura 13 muestra: 1) que se genera muy poco FXa en todas las concentraciones del FVIIa analizadas en ausencia y en presencia del FVIII 5 nM en las condiciones del experimento sin añadir derivados del FIX (o); 2) que este es el caso también cuando el FIX 10 nM se presenta en la mezcla de reacción (□); 3) que se observa una marcada activación del FX cuando se reemplaza el FIX 10 nM por FIXa 10 nM, aunque, solo en presencia del FVIII (■); 4) que el direccionamiento del FIX hacia vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1 por medio del FIX-Fab0135 proporciona un complejo que se activa mediante el FVIIa en una forma dependiente de la concentración; 5) que el complejo similar a tenasa activado resultante promueve de manera significativa la activación del FX tanto en presencia como en ausencia del FVIII.Figure 13 shows: 1) that very little FXa is generated in all the analyzed FVIIa concentrations in the absence and in the presence of 5 nM FVIII under the conditions of the experiment without adding FIX derivatives (o); 2) that this is the case also when FIX 10 nM is present in the reaction mixture (□); 3) that a marked activation of the FX is observed when the 10 nM FIX is replaced by 10 nM FIXa, although, only in the presence of the FVIII (■); 4) that targeting of FIX to TLT-1-enriched phospholipid vesicles via FIX-Fab0135 provides a complex that is activated by FVIIa in a concentration dependent manner; 5) that the resulting activated tenase-like complex significantly promotes FX activation both in the presence and in the absence of FVIII.
Estos resultados, así como también los del ejemplo 36, sugieren que la proteína de fusión FIX-Fab0135 FIX proporciona un agente de puenteo del FVIII que promueve notablemente la activación del FXa mediada por FVIIa mediante un mecanismo que implica la activación del FVIIa del FIX dirigida al TLT-1 y la formación de un complejo con una actividad similar a tenasa considerable independiente del FVIII.These results, as well as those in Example 36, suggest that the FIX-Fab0135 FIX fusion protein provides an FVIII bridging agent that markedly promotes FVIIa-mediated activation of FXa by a mechanism that involves targeted FVIIa activation of FIX to TLT-1 and the formation of a complex with considerable tenase-like activity independent of FVIII.
Ejemplo 38: Expresión del TLT-1 en plaquetas humanas.Example 38: Expression of TLT-1 in human platelets.
Se ha informado que el TLT-1 solo se expresa en plaquetas activadas (Washington y otros (2004) Blood. 2004 Agosto 15;104(4):1042-7). Para verificar esto y estimar la cantidad de copias específicas del TLT-1 en la superficie de plaquetas se usó el “Platelet calibrator kit” de Biocytex (Marsella, Francia) en el que las plaquetas se tiñen mediante inmunofluorescencia indirecta sin lavado con anticuerpos monoclonales específicos y se analizan mediante citometría de flujo cuantitativa. El nivel de expresión del antígeno analizado se determina mediante el uso de perlas de calibración con un número definido de sitios de unión para el anticuerpo de detección. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, las plaquetas en sangre total humana con citrato se activaron por diferentes concentraciones (0,3-30 jM ) de péptido activador del receptor activado por proteasa (PAR)-1 con secuencia de aminoácidos SFLLRN. Las muestras se diluyeron 1:4 en un tampón de solución salina proporcionado en el kit antes de etiquetarse con anticuerpos de unión al TLT-1. Los anticuerpos de unión al TLT-1 usados fueron mAb0123 (subtipo IgG1 del anticuerpo mAb0023) o mAb0136 (subtipo IgG1 del anticuerpo mAb0012). Después de 15 min de incubación con cualquiera de los anticuerpos TLT-1 (10 |jg/ml) seguido de 15 min de incubación con anticuerpo de detección marcado con FlTC (proporcionado por el fabricante) las muestras se diluyeron 1:50 inmediatamente antes del análisis de citometría de flujo. El número absoluto del TLT-1 en la superficie de plaquetas se obtuvo mediante el uso de la curva estándar derivada de perlas. Las plaquetas no activadas no muestran expresión del TLT-1 con ninguno de los dos anticuerpos usados. Sin embargo, cuando las plaquetas se activaron con SFLLRN se observó una mayor expresión del TLT-1 con una expresión máxima de 9685±1696 y 12981±2083 moléculas de superficie detectadas por mAb0123 y mAb0136, respectivamente (Figura 14). La expresión máxima del TLT-1 en plaquetas se logró mediante la estimulación doble por SFLLRN (30 jm ) y Convulxina (100 ng/ml).TLT-1 has been reported to be expressed only in activated platelets (Washington et al. (2004) Blood. 2004 Aug 15; 104 (4): 1042-7). To verify this and estimate the amount of specific copies of TLT-1 on the surface of platelets, the “Platelet calibrator kit” from Biocytex (Marseille, France) was used in which the platelets are stained by indirect immunofluorescence without washing with specific monoclonal antibodies and they are analyzed by quantitative flow cytometry. The level of expression of the analyzed antigen is determined by using calibration beads with a defined number of binding sites for the detection antibody. According to the manufacturer's instructions, platelets in human whole blood with citrate were activated by different concentrations (0.3-30 jM) of protease activated receptor (PAR) -1 activating peptide with amino acid sequence SFLLRN. Samples were diluted 1: 4 in a saline buffer provided in the kit before labeling with TLT-1 binding antibodies. The TLT-1 binding antibodies used were mAb0123 (IgG1 subtype of the mAb0023 antibody) or mAb0136 (IgG1 subtype of the mAb0012 antibody). After 15 min incubation with any of the TLT-1 antibodies (10 | jg / ml) followed by 15 min incubation with FlTC-labeled detection antibody (provided by the manufacturer) the samples were diluted 1:50 immediately before flow cytometric analysis. The absolute number of TLT-1 on the platelet surface was obtained by using the standard curve derived from beads. Non-activated platelets show no expression of TLT-1 with either of the two antibodies used. However, when platelets were activated with SFLLRN, an increased expression of TLT-1 was observed with a maximum expression of 9685 ± 1696 and 12981 ± 2083 surface molecules detected by mAb0123 and mAb0136, respectively (Figure 14). Maximum expression of TLT-1 in platelets was achieved by double stimulation by SFLLRN (30 jm) and Convulxin (100 ng / ml).
Ejemplo 39: Conjugación del fragmento anti TLT-1-FAB (Fab0084) al FVIIa a través de un enlazador de PEG de 3 kDa, FVIIa-Fab1001.Example 39: Conjugation of the anti TLT-1-FAB fragment (Fab0084) to FVIIa through a 3 kDa PEG linker, FVIIa-Fab1001.
Etapa 1: Ácido A/-((3-(u>-(Fluorenilmetoxicarbonilamino)PEGil 3 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil-^-neuramínicoStep 1: A / - ((3- (u> - (Fluorenylmethoxycarbonylamino) PEGyl 3 kDa) propionylamino) acetyl) -02- [5 '] cytidylyl - ^ - neuraminic acid
Se disolvió el éster pirrolidin-2,5-dion-1-ilo del ácido 3-(u>-(Fluorenilmetoxicarbonilamino)PEGil 3 kDa)propiónico (comprado en Rapp Polymere Gmbh, 1 g, 0,292 mmol) en tetrahidrofurano (80 ml). Se añadió una solución de sal disódica de ácido citidin-5'-monofosfo-N-glicilneuramínico (0,276 g, 0,438 mmol) en un tampón (20 ml) compuesto de TRIS 50 mM, que se había ajustado a pH 8,9. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. El THF se eliminó al vacío, con una temperatura del baño de 25 oC. La mezcla restante se diluyó con agua hasta 60 ml y se filtró a través de un filtro de 0,45 pm. La solución se dividió en tres partes cada una de las cuales se sometió a cromatografía por HPLC en una columna C4, mediante el uso de un flujo de 20 ml/min y un gradiente de 0-60 % de acetonitrilo en un tampón acuoso de hidrógenocarbonato de amonio 50 mM durante 50 min después de lavarse con un tampón acuoso de hidrógenocarbonato de amonio 50 mM durante 10 min. Se combinaron las fracciones, que no tenían ácido citidin-5'-monofosfo-N-glicilneuramínico y tenían una absorción a 214 nm mayor que 15-20 % de la absorción máxima. Las fracciones combinadas se secaron por congelación para dar 532 mg del ácido N-((3-(u>-(fluorenilmetoxicarbonilamino)PEGil 3 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil- ^-neuramínico. El espectro de 1H-NMR estuvo de acuerdo con la expectativa.3- (u> - (Fluorenylmethoxycarbonylamino) PEGyl 3 kDa) propionic acid pyrrolidin-2,5-dion-1-yl ester (purchased from Rapp Polymere Gmbh, 1g, 0.292mmol) was dissolved in tetrahydrofuran (80ml) . A solution of cytidin-5'-monophospho-N-glycylneuraminic acid disodium salt (0.276 g, 0.438 mmol) in a buffer (20 ml) composed of 50 mM TRIS, which had been adjusted to pH 8.9, was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16h. THF was removed in vacuo, with a bath temperature of 25 oC. The remaining mixture was diluted with water to 60 ml and filtered through a 0.45 pm filter. The solution was divided into three parts, each of which was chromatographed by HPLC on a C4 column, using a flow of 20 ml / min and a gradient of 0-60% acetonitrile in an aqueous hydrogencarbonate buffer. of 50 mM ammonium for 50 min after washing with a 50 mM ammonium hydrogen carbonate aqueous buffer for 10 min. The fractions were combined, which did not have cytidin-5'-monophospho-N-glycylneuramine and had an absorption at 214 nm greater than 15-20% of the maximum absorption. The combined fractions were freeze-dried to give 532 mg of N - ((3- (u> - (fluorenylmethoxycarbonylamino) PEGyl 3 kDa) propionylamino) acetyl) -02- [5 '] cytidylyl- ^ -neuraminic acid. The 1H-NMR spectrum was in accordance with expectation.
Etapa 2: Ácido N-((3-(u>-AminoPEGil 3 kDa)propionilamino)acetil)-O2-[5']citidilil- ^-neuramínico Step 2: N - ((3- (u> -AminoPEGyl 3 kDa) propionylamino) acetyl) -O2- [5 '] cytidylyl- ^ -neuramine acid
Se disolvió ácido W-((3-(u>-(fluorenilmetoxicarbonilamino)PEGil 3 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil-^-neuramínico (532 mg, 0,135 mmol) en N,N-dimetilformamida (9 ml). Se añadió piperidina (2,25 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 20 min a temperatura ambiente. Se añadió éter (150 ml). La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 1 h. El precipitado formado se aisló mediante decantación y centrifugación. Este se disolvió en diclorometano (10 ml). Se añadió etildiisopropilamina (2,4 ml). La mezcla se agitó durante 2 min. Se añadió éter (150 ml). La mezcla se dejó durante 1,5 h para dejar que el precipitado envejeciera. El precipitado se aisló por decantación y filtración. Este se secó al vacío con una temperatura del baño de 25 oC para dar 343 mg del ácido N-((3-(waminoPEGil 3 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil- ^-neuramínico. El 1H-NMR estuvo de acuerdo con la expectativa.W - ((3- (u> - (fluorenylmethoxycarbonylamino) PEGyl 3 kDa) propionylamino) acetyl) -02- [5 '] citidylyl - ^ - neuraminic acid (532 mg, 0.135 mmol) was dissolved in N, N-dimethylformamide ( 9 ml). Piperidine (2.25 ml) was added. The reaction mixture was stirred for 20 min at room temperature. Ether (150 ml) was added. The mixture was left at room temperature for 1 h. The precipitate formed was isolated by decantation and centrifugation. This was dissolved in dichloromethane (10 ml). Ethyldiisopropylamine (2.4 ml) was added. The mixture was stirred for 2 min. Ether (150 ml) was added. The mixture was left for 1.5 hr to allow the precipitate to age. The precipitate was isolated by decantation and filtration. This was dried in vacuo with a bath temperature of 25 oC to give 343 mg of N - ((3- (waminoPEGil 3 kDa) propionylamino) acetyl) -02- [5 '] cytidylyl- ^ -neuraminic acid. The 1H-NMR agreed with the expectation.
Etapa 3: Ácido W-((3-(u>-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 3 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil- ^-neuramínico (NNC 0129-0000-3259)Step 3: W - ((3- (u> - (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 3 kDa) propionylamino) acetyl) -02- [5 ' ] citidylyl- ^ -neuramine (NNC 0129-0000-3259)
Se disolvió el ácido N-((3-(u>-AminoPEGil 3 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil- ^-neuramínico (343 mg, 0,009 mmol) en una mezcla de diclorometano (15 ml). Se añadió etildiisopropilamina (0,05 ml, 0,028 mmol). Se añadió éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo del ácido 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propiónico (492 mg, 1,85 mmol) como un sólido. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Se añadió diclorometano (140 ml). Se añadió resina de poliestireno amionometilado (disponible comercialmente en, por ejemplo, Novabiochem, carga 0,85 mmol/g, 4,3 g, 3,69 mmol). La mezcla se agitó lentamente a temperatura ambiente durante 1 h. La resina se eliminó por filtración. El solvente se eliminó al vacío con una temperatura del baño de 25 oC. Se añadió resina Amberlyst 15 (2 g). La mezcla de reacción se agitó lentamente durante 20 min. La resina se eliminó por filtración. El solvente se eliminó al vacío con una temperatura del baño de 25 oC. El residuo se disolvió en diclorometano (10 ml). Se añadió éter (200 ml). La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 6 h para dejar que el precipitado formado envejeciera. El precipitado se aisló mediante decantación y centrifugación. Este se secó al vacío para obtener 180 mg del compuesto del título. El espectro 1H-NMR en DMSO-d6 mostró la presencia de un grupo maleimida.N - ((3- (u> -AminoPEGyl 3 kDa) propionylamino) acetyl) -02- [5 '] cytidylyl- ^ -neuraminic acid (343 mg, 0.009 mmol) was dissolved in a mixture of dichloromethane (15 ml) . Ethyldiisopropylamine (0.05 ml, 0.028 mmol) was added. 3- (2,5-Dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionic acid 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl ester (492 mg, 1.85 mmol) was added as a solid. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16h. Dichloromethane (140 ml) was added. Amionomethylated polystyrene resin (commercially available from eg Novabiochem, loading 0.85 mmol / g, 4.3 g, 3.69 mmol) was added. The mixture was slowly stirred at room temperature for 1 h. The resin was removed by filtration. The solvent was removed in vacuo with a bath temperature of 25 oC. Amberlyst 15 resin (2 g) was added. The reaction mixture was slowly stirred for 20 min. The resin was removed by filtration. The solvent was removed in vacuo with a bath temperature of 25 oC. The residue was dissolved in dichloromethane (10 ml). Ether (200 ml) was added. The mixture was left at room temperature for 6 h to allow the formed precipitate to age. The precipitate was isolated by decantation and centrifugation. This was dried under vacuum to obtain 180 mg of the title compound. The 1H-NMR spectrum in DMSO-d6 showed the presence of a maleimide group.
Etapa 4: Unión del ácido W-((3-(w-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 3 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil- ^-neuramínico a un FAB anti-TLT-1Step 4: Binding of W - ((3- (w- (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 3 kDa) propionylamino) acetyl) -02- [5 '] citidylyl- ^ -neuramine to an anti-TLT-1 FAB
Se colocó una solución de un fragmento FAB anti-TLT-1 con partes de la región de bisagra, en donde una Cys no pareada (10 mg) se incorporó en un tampón fosfato, en un dispositivo de ultracentrifugación con un valor límite de 10 kDa. El tampón se cambió a un tampón compuesto de HEPES 100 mM que se había ajustado a pH 7,3, mediante ultracentrifugación repetida a 4000 rpm. Después de cambiar el tampón, se obtuvo una solución de la proteína (36 ml) en el tampón compuesto de HEPES 100 mM que se había ajustado a pH 7,3. Se añadió una solución de 1 mg/ml de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (4 ml). La mezcla de reacción se agitó a 300 rpm a 20 oC durante 15 min y se dejó a 20 oC durante 45 min. La mezcla de reacción se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación con un valor límite de 10 kDa. El tampón se cambió a un tampón compuesto de HEPES 25 mM que se había ajustado a pH 7,0 mediante ultracentrifugación repetida a 4000 rpm para obtener una solución de 13,2 ml. Se añadió una solución de 1 mg/ml del ácido N-((3-(w-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 3 kDa)prop¡onilamino)acetil)-02-[5']citidilil- ^-neuramínico (6,4 ml). La mezcla de reacción se agitó suavemente a 300 rpm a 20 °C durante 15 min y se dejó a 20 oC durante 16 h. Esta se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un valor límite de 10 kDa y se concentró por ultracentrifugación a 4000 rpm durante 10 min hasta un volumen < 5 ml. La solución se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superose 75 16/60 GL (GE Healthcare) a un flujo de 1 ml/min, mediante el uso de un tampón compuesto de TRIS 25 mM, NaCl 150 mM, que se había ajustado a pH 8,00 como eluyente. Las fracciones se agruparon sobre la base del trazo UV a 280 nm del cromatograma. El agrupamiento (9,9 mg, 13,7 ml), que contiene el compuesto deseado según lo juzgado por SDS-PAGE y que carecía del reactivo de PEG libre, según lo juzgado por SDS-PAGE, mediante el uso de un método de tinción específico de PEG (descrito en Kurfürst, M. M. Analyt. Biochem. 1992, 200, 244-248) se usó en la etapa siguiente.A solution of an anti-TLT-1 FAB fragment with parts of the hinge region, where an unpaired Cys (10 mg) was incorporated into a phosphate buffer, was placed in an ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa . The buffer was changed to a buffer composed of 100 mM HEPES that had been adjusted to pH 7.3, by ultracentrifugation repeated at 4000 rpm. After changing the buffer, a solution of the protein (36 ml) was obtained in the buffer composed of 100 mM HEPES that had been adjusted to pH 7.3. A solution of 1 mg / ml tris (2-carboxy ethyl) phosphine hydrochloride (4 ml) was added. The reaction mixture was stirred at 300 rpm at 20 oC for 15 min and left at 20 oC for 45 min. The reaction mixture was placed in an ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa. The buffer was changed to a buffer composed of 25 mM HEPES that had been adjusted to pH 7.0 by repeated ultracentrifugation at 4000 rpm to obtain a 13.2 ml solution. A 1 mg / ml solution of N - ((3- (w- (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 3 kDa) propynylamino) acid was added acetyl) -02- [5 '] cytidylyl- ^ -neuramine (6.4 ml). The reaction mixture was gently stirred at 300 rpm at 20 ° C for 15 min and left at 20 oC for 16 h. This was placed in an Amicon ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa and concentrated by ultracentrifugation at 4000 rpm for 10 min to a volume <5 ml. The solution was subjected to size exclusion chromatography on a Superose 75 16/60 GL column (GE Healthcare) at a flow of 1 ml / min, using a buffer composed of 25 mM TRIS, 150 mM NaCl, which was had adjusted to pH 8.00 as eluent. The fractions were pooled on the basis of the UV trace at 280 nm of the chromatogram. The pool (9.9 mg, 13.7 ml), containing the desired compound as judged by SDS-PAGE and lacking the free PEG reagent, as judged by SDS-PAGE, using a method of Specific PEG staining (described in Kurfürst, MM Analyt. Biochem. 1992, 200, 244-248) was used in the next step.
Etapa 5: Sialidasa inmovilizada. (C. Perfingens tipo VI-A inmovilizado en agarosa, Sigma: N-5254, gel 0,6-1,8 U/ml, 1,52 ml) se lavó con agua (3 x 9 ml) y posteriormente con un tampón de HEPES 20 mM, CaCb 10 mM, Tween80 al 0,005 %, NaCl 100 mM, que se había ajustado a pH 7,5 (3 x 9 ml). Una solución del FVIIa (8,9 mg) en un tampón (6,59 ml) compuesto de Gly-Gly 25 mM, CaCb 10 mM que se había ajustado a pH 6,0 se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un valor límite de 10 kDa. El tampón se cambió a un tampón de HEPES 20 mM, CaCb 10 mM, Tween80 al 0,005 %, NaCl 100 mM, que se había ajustado a pH 7,5, por centrifugación repetida a 4000 rpm para dar un volumen final de 6,5 ml. Esta solución se añadió a la sialidasa inmovilizada. La mezcla de reacción se hizo rotar a temperatura ambiente durante 3,5 h.Stage 5: Sialidase immobilized. ( C. Perfingens type VI-A immobilized on agarose, Sigma: N-5254, gel 0.6-1.8 U / ml, 1.52 ml) washed with water (3 x 9 ml) and subsequently with a buffer of 20mM HEPES, 10mM CaCb, 0.005% Tween80, 100mM NaCl, which had been adjusted to pH 7.5 (3x9ml). A solution of the FVIIa (8.9 mg) in a buffer (6.59 ml) composed of 25 mM Gly-Gly, 10 mM CaCb that had been adjusted to pH 6.0 was placed in an Amicon ultracentrifugation device with a value of 10 kDa limit. The buffer was changed to a buffer of 20 mM HEPES, 10 mM CaCb, 0.005% Tween80, 100 mM NaCl, which had been adjusted to pH 7.5, by repeated centrifugation at 4000 rpm to give a final volume of 6.5 ml. This solution was added to the immobilized sialidase. The reaction mixture was rotated at room temperature for 3.5 h.
El producto de la unión del ácido N-((3-(w-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidropirrol-1-il)propionilamino)PEGil 3 kDa)propionilamino)acetil)-02-[5']citidilil-5-neuramínico a un FAB anti-TLT-1 (10 mg) obtenido como se describió en una etapa anterior en un tampón (13,5 ml) que consite en TRIS 25 mM, NaCl 150 mM, que se había ajustado a pH 8,00, se colocó en un dispositivo de ultracentrifugación Amicon con un valor límite de 10 kDa. Se añadió tampón compuesto de histidina 20 mM, CaCb 10 mM, glicerol al 20 %, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 500 mM que se había ajustado a pH 6,0. Se aplicó una ultracentrifugación a 4000 rpm durante 2 min. Se añadió otra porción de tampón compuesto de histidina 20 mM, CaCb 10 mM, glicerol al 20 %, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 500 mM que se había ajustado a pH 6,0. Se aplicó una ultracentrifugación a 4000 rpm durante 10 min. El producto de reacción de la reacción con la sialidasa inmovilizada se añadió mediante filtración para eliminar la sialidasa inmovilizada. Se añadió otra porción de tampón compuesto de histidina 20 mM, CaCb 10 mM, glicerol al 20 %, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 500 mM que se había ajustado a pH 6,0. Se aplicó una ultracentrifugación a 4000 rpm durante 10 min para obtener un volumen total de 9 ml. Se añadió una solución de ST3Gal-III (500 □!). La mezcla de reacción se agita suavemente a 32 oC durante 15 min y después de eso se dejó a 32 oC durante 16 h. Se añadió una solución de 10 mg/ml del ácido CMP-N-acetilneuramínico (CMP NeuNAc, 0,70 mg, 0,89 ml) en un tampón de histidina 20 mM, CaCb 10 mM, glicerol al 20 %, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 500 mM que se había ajustado a pH 6,0. La mezcla de reacción se agitó suavemente a 32 oC durante 15 min y después de eso se dejó a 32 oC durante 1 h. La mezcla de reacción se sometió a una cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 20026/60 GL (GE Healthcare) con un flujo de 2 ml/min mediante el uso de un tampón de Histidina 10 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,01 %, NaCl 200 mM que se había ajustado a pH 6 como eluyente. Se agruparon las fracciones que contenían el producto deseado según lo juzgado por s DS-PAGE en un gel de TRIS-Acetato. Mediante el uso de una absorción molar de 12,86 a 280 nm en un aparato Nandrop®, se encontró un rendimiento de 3,2 mg. El resultado de un análisis de SDS-PAGE estuvo de acuerdo con la expectativa del producto deseado.The product of N - ((3- (w- (3- (2,5-dioxo-2,5-dihydropyrrol-1-yl) propionylamino) PEGyl 3 kDa) propionylamino) acetyl) -0 2 - acid binding [5 '] Cytidylyl-5-neuramine to an anti-TLT-1 FAB (10mg) obtained as described in a previous step in a buffer (13.5ml) consisting of 25mM TRIS, 150mM NaCl, which adjusted to pH 8.00, placed in an Amicon ultracentrifugation device with a limit value of 10 kDa. Buffer consisting of 20mM histidine, 10mM CaCb, 20% glycerol, 0.02% Tween 80, 500mM NaCl which had been adjusted to pH 6.0 was added. Ultracentrifugation was applied at 4000 rpm for 2 min. Another portion of buffer consisting of 20mM histidine, 10mM CaCb, 20% glycerol, 0.02% Tween 80, 500mM NaCl which had been adjusted to pH 6.0 was added. Ultracentrifugation was applied at 4000 rpm for 10 min. The reaction product of the reaction with the immobilized sialidase was added by filtration to remove the immobilized sialidase. Another portion of buffer consisting of 20mM histidine, 10mM CaCb, 20% glycerol, 0.02% Tween 80, 500mM NaCl which had been adjusted to pH 6.0 was added. Ultracentrifugation was applied at 4000 rpm for 10 min to obtain a total volume of 9 ml. A ST3Gal-III solution (500 □!) Was added. The reaction mixture is gently stirred at 32 oC for 15 min and thereafter left at 32 oC for 16 h. A 10 mg / ml solution of CMP-N-acetylneuraminic acid (CMP NeuNAc, 0.70 mg, 0.89 ml) in 20mM histidine buffer, 10mM CaCb, 20% glycerol, Tween 80 was added to the 0.02%, 500 mM NaCl that had been adjusted to pH 6.0. The reaction mixture was gently stirred at 32 oC for 15 min and thereafter left at 32 oC for 1 h. The reaction mixture was subjected to size exclusion chromatography on a Superdex 20026/60 GL column (GE Healthcare) with a flow of 2 ml / min using a 10mM Histidine buffer, 10mM CaCb, Tween 80 0.01%, 200 mM NaCl which had been adjusted to pH 6 as the eluent. Fractions containing the desired product were pooled as judged by s DS-PAGE on a TRIS-Acetate gel. Using a 12.86 molar absorption at 280 nm in a Nandrop® apparatus, a yield of 3.2 mg was found. The result of an SDS-PAGE analysis was in accordance with the expectation of the desired product.
Ejemplo 40: Conjugación del fragmento anti-TLT-1-FAB (Fab0084) al FVIIa 407C a través de un enlazador de PEG de 3 kDa, FVIIa-Fab9015. Example 40: Conjugation of the anti-TLT-1-FAB fragment (Fab0084) to FVIIa 407C through a 3 kDa PEG linker, FVIIa-Fab9015.
El FVIIa 407C (5 mg, 0,55 mg/ml, 9 ml) en HEPES 20 mM, NaCI 100 mM, CaCl2 10 mM, pH 7.0 se mezcló con soluciones de glutatión (reducido, 40 mM, 125 microlitros, en tampón HEPES), glutatión (oxidado, 1,6 mM, 125 microlitros, en tampón HEPES), para-aminobenzamidina (0,5 M, 500 microlitros, en tampón HEPES), y glutarredoxina (Grx2, EC 1.20.4.1, 96 micromolar, 200 microlitros). El volumen se ajustó a 10,0 ml, el pH fue de 7,0.FVIIa 407C (5mg, 0.55mg / ml, 9ml) in 20mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM CaCl 2 , pH 7.0 was mixed with glutathione solutions (reduced, 40mM, 125 microliters, in buffer HEPES), glutathione (oxidized, 1.6 mM, 125 microliters, in HEPES buffer), para-aminobenzamidine (0.5 M, 500 microliters, in HEPES buffer), and glutarredoxin (Grx2, EC 1.20.4.1, 96 micromolar, 200 microliters). The volume was adjusted to 10.0 ml, the pH was 7.0.
La mezcla resultante se incubó a 32 grados Celsius durante 5 h.The resulting mixture was incubated at 32 degrees Celsius for 5h.
Se añadió EDTA en agua (800 microlitros, 0,25 M, pH 7,0). La solución se diluyó con agua desalinizada hasta que la conductividad se redujo a 8,3 mS/cm (20 ml).EDTA in water (800 microliters, 0.25 M, pH 7.0) was added. The solution was diluted with desalinated water until the conductivity was reduced to 8.3 mS / cm (20 ml).
La solución se inyectó en una columna HiTrap Q FF preacondicionada (preacondicionada en Tampón A, volumen de columna de 5 ml).The solution was injected into a preconditioned HiTrap Q FF column (preconditioned in Buffer A, column volume 5 ml).
Tampón A: HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, Tween-80 al 0,01 %, pH 7,0Buffer A: 50mM HEPES, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 0.01% Tween-80, pH 7.0
Tampón B: HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl210 mM, Tween-80 al 0,01 %, pH 7,0Buffer B: 50mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM CaCl 2 , 0.01% Tween-80, pH 7.0
La proteína inmovilizada se lavó con Tampón A (5 VC) mediante el uso de una estación de cromatografía Ákta purifier 100. La proteína se eluyó con Tampón B (10 VC) a 2 ml/min. La elución de la proteína de interés se realizó mediante el monitoreo de la absorbancia a 280 nm.The immobilized protein was washed with Buffer A (5 VC) using an Ákta purifier 100 chromatography station. The protein was eluted with Buffer B (10 VC) at 2 ml / min. The elution of the protein of interest was performed by monitoring the absorbance at 280 nm.
Se agruparon siete fracciones. Se estimó que la concentración de proteína en el grupo combinado era 0,49 mg/ml (abs. 280 nm), volumen 7,5 ml, 3,8 mg del FVIIa (77,6 nmol).Seven fractions were pooled. The protein concentration in the combined group was estimated to be 0.49 mg / ml (abs. 280 nm), volume 7.5 ml, 3.8 mg of FVIIa (77.6 nmol).
Se añadió una solución del enlazador de polietilenglicol bis-maleimida (3 kDa, Rapp Polymere Gmbh, Tübingen, Alemania, núm. prod. 11300-45, núm. lote 1210.764, 70 mg, 23 micromol) en HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, CaCb 10 mM, pH 7,0 (3,5 ml). La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 1 h.A solution of the bis-maleimide polyethylene glycol linker (3 kDa, Rapp Polymere Gmbh, Tübingen, Germany, Prod No. 11300-45, Lot No. 1210.764, 70 mg, 23 micromol) in 20 mM HEPES, 100 mM NaCl was added , 10 mM CaCb, pH 7.0 (3.5 ml). The resulting mixture was incubated at room temperature for 1 hr.
Se añadió una solución de EDTA en agua (250 mM, 900 microlitros) a la mezcla. El pH se ajustó a 7,0. La mezcla resultante se diluyó con agua hasta que la conductividad fue de 8,3 mS/cm y alcanzó un volumen de 17 ml.A solution of EDTA in water (250mM, 900 microliters) was added to the mixture. The pH was adjusted to 7.0. The resulting mixture was diluted with water until the conductivity was 8.3 mS / cm and reached a volume of 17 ml.
La solución se inyectó en una columna HiTrap Q FF preacondicionada (preacondicionada en Tampón A, volumen de columna de 5 ml).The solution was injected into a preconditioned HiTrap Q FF column (preconditioned in Buffer A, column volume 5 ml).
Tampón A: HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, Tween-80 al 0,01 %, pH 7,0Buffer A: 50mM HEPES, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 0.01% Tween-80, pH 7.0
Tampón B: HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, CaCb 10 mM, Tween-80 al 0,01 %, pH 7,0Buffer B: 50mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM CaCb, 0.01% Tween-80, pH 7.0
La proteína inmovilizada se lavó con Tampón A (5 VC) mediante el uso de una estación de cromatografía Ákta purifier 100. La proteína se eluyó con Tampón B (10 VC) a 2 ml/min. La elución de la proteína de interés se realizó mediante el monitoreo de la absorbancia a 280 nm.The immobilized protein was washed with Buffer A (5 VC) using an Ákta purifier 100 chromatography station. The protein was eluted with Buffer B (10 VC) at 2 ml / min. The elution of the protein of interest was performed by monitoring the absorbance at 280 nm.
Las fracciones de interés se agruparon y resultaron en un volumen total de 12 ml. Se midió la concentración de proteína (Abs. a 280 nm) a 0,30 mg/ml, 3,6 mg de proteína en total.The fractions of interest were pooled and resulted in a total volume of 12 ml. Protein concentration (Abs. At 280 nm) was measured at 0.30 mg / ml, 3.6 mg of protein in total.
Una solución de fragmento de anticuerpo, proteína Fab ID 0084 (6,7 mg, 3,21 mg/ml) en tampón HEPES (HEPES 20 mM, CaCl2 1,0 mM, NaCI 100 mM, Tween-80 al 0,005 % (v/v), pH 7,5) se mezcló con una solución de sal sódica de fns(3-sulfonatofenil)fosfina hidrato (grado técnico 85 % puro, 10 mg/ml, 5 ml, mismo tampón). La mezcla resultante se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla se colocó en un dispositivo de filtro de ultracentrífuga Amicon (Millipore corp., MWCO 10 kDa) y el tampón se intercambió mediante adiciones repetitivas de tampón (HEPES 20 mM, CaCl2 1,0 mM, NaCl 100 mM, Tween-80 al 0,005 % (v/v), pH 7,5) seguido de centrifugación.A solution of the antibody fragment, protein Fab ID 0084 (6.7 mg, 3.21 mg / ml) in HEPES buffer (HEPES 20 mM, 1.0 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 0.005 % Tween-80 (v / v), pH 7.5) was mixed with a solution of sodium salt of fns (3-sulfonatophenyl) phosphine hydrate (technical grade 85 % pure, 10 mg / ml, 5 ml, same buffer). The resulting mixture was incubated for 2 h at room temperature. The mixture was placed in an Amicon ultracentrifuge filter device (Millipore corp., MWCO 10 kDa) and the buffer was exchanged by repetitive additions of buffer (20mM HEPES, 1.0mM CaCl2, 100mM NaCl, Tween-80 al 0.005% (v / v), pH 7.5) followed by centrifugation.
La muestra con tampón intercambiado del fragmento de anticuerpo se mezcló con la muestra del FVIIa conjugado con el enlazador y la solución resultante se intercambió de tampón (HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl 35 mM2 , 50 mM de benzamidina, 0.01 % de Tween-80, pH 7.5) y posteriormente se concentró hasta 7 ml. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla resultante se analizó mediante el uso de electroforesis en gel SDS-PAGE.The sample buffer exchanged antibody fragment was mixed with the sample of the FVIIa conjugate with the linker and the resulting solution was exchanged for (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, CaCl 35 mM 2, 50 mM benzamidine, 0.01% buffer Tween-80, pH 7.5) and subsequently concentrated to 7 ml. The mixture was incubated at room temperature overnight. The resulting mixture was analyzed using SDS-PAGE gel electrophoresis.
Se añadió agua (8,5 ml), solución de EDTA (5,5 ml, 0,25 M) e hidróxido de sodio (1 M) a la mezcla hasta que el pH fue 7,2 y la conductividad se midió a 11,0 mS/cm, volumen total: 21 mlWater (8.5 ml), EDTA solution (5.5 ml, 0.25 M) and sodium hydroxide (1 M) were added to the mixture until the pH was 7.2 and the conductivity was measured at 11 0.0 mS / cm, total volume: 21 ml
La solución se inyectó en una columna HiTrap Q FF preacondicionada (preacondicionada en Tampón A, volumen de columna de 5 ml).The solution was injected into a preconditioned HiTrap Q FF column (preconditioned in Buffer A, column volume 5 ml).
Tampón A: HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, Tween-80 al 0,01 %, pH 7,0Buffer A: 50mM HEPES, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 0.01% Tween-80, pH 7.0
Tampón B: HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 10 mM, Tween-80 al 0,01 %, pH 7,0Buffer B: 50mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM CaCl2, 0.01% Tween-80, pH 7.0
La proteína inmovilizada se lavó con Tampón A (5 VC) mediante el uso de una estación de cromatografía Ákta purifier 100. La proteína se eluyó con Tampón B (10 VC) a 2 ml/min. Las fracciones seleccionadas se concentraron en un dispositivo de filtro de ultracentrífuga Amicon (Millipore corp., MWCO 10 kDa) y el tampón se intercambió mediante adiciones repetitivas de tampón (HEPES 20 mM, CaCl2 1,0 mM, NaCl 100 mM, Tween-80 al 0,005 % (v/v), pH 7,5) seguido de centrifugación. La muestra concentrada (5 ml) se inyectó en una columna Superdex Hiload 16/60 preacondicionada (GE Healthcare, preacondicionada en el tampón aplicado).The immobilized protein was washed with Buffer A (5 VC) using an Ákta purifier 100 chromatography station. The protein was eluted with Buffer B (10 VC) at 2 ml / min. The selected fractions were concentrated in an Amicon ultracentrifuge filter device (Millipore corp., MWCO 10 kDa) and the buffer was exchanged by repetitive additions of buffer (20 mM HEPES, 1.0 mM CaCl2, 100 mM NaCl, Tween-80 0.005% (v / v), pH 7.5) followed by centrifugation. The concentrated sample (5 ml) was injected onto a preconditioned Superdex Hiload 16/60 column (GE Healthcare, preconditioned in the applied buffer).
Tampón: L-Histidina 10 mM, CaCl2 10 mM, NaCl 100 mM, Tween80 al 0,01 %, pH 6,0Buffer: 10mM L-Histidine, 10mM CaCl2, 100mM NaCl, 0.01% Tween80, pH 6.0
La proteína se purificó mediante elución a un flujo de 0,8 ml/min por 2 VC.Protein was purified by elution at a flow of 0.8 ml / min per 2 CV.
Las fracciones se seleccionaron en base al análisis por electroforesis en gel SDS PAGE (acetato Bis-Tris de 4-12 %, tampón de corrida MES).Fractions were selected based on analysis by SDS PAGE gel electrophoresis (4-12% Bis-Tris acetate, MES run buffer).
El grupo de fracciones seleccionadas se concentró mediante el uso de un dispositivo de filtro de ultracentrífuga Amicon (Millipore corp., MWCO 10 kDa) hasta un volumen total: 2,25 ml. La cantidad de proteína se midió (abs. 280 nm) ser 1,2 mg (conjugado de proteína).The group of selected fractions was concentrated using an Amicon ultracentrifuge filter device (Millipore corp., MWCO 10 kDa) to a total volume: 2.25 ml. The amount of protein was measured (abs. 280 nm) to be 1.2 mg (protein conjugate).
Análisis por electroforesis en gel SDS PAGE (acetato Bis-Tris de 4-12 %) y transferencia de Western (HPC4) contra 1. Primario - Anticuerpo con etiqueta de Proteína C (HPC4), pAb, Conejo, núm. de cat.: A00637 (40 ug). Se disolvió en 80 ul de agua milliQ hasta una concentración de 0,5 mg/ml. Se diluyó 1:1000 durante la transferencia. 2. Secundario - Anticuerpo anti-IgG de conejo de cabra (HyL) (HRP), pAb, núm. cat. A00098, Núm. Lote 11B000259. Se diluyó 1:1000 durante la transferencia.Analysis by SDS PAGE gel electrophoresis (4-12% Bis-Tris acetate) and Western blot (HPC4) against 1. Primary - Protein C labeled antibody (HPC4), pAb, Rabbit, no. Cat .: A00637 (40 ug). It was dissolved in 80 ul of milliQ water to a concentration of 0.5 mg / ml. It was diluted 1: 1000 during the transfer. 2. Secondary - Goat Rabbit Anti-IgG Antibody (HyL) (HRP), pAb, no. cat. A00098, Lot No. 11B000259. It was diluted 1: 1000 during the transfer.
Ejemplo 41: Síntesis del ácido 2-[2-[4-[2-(3-hidroxi-6-oxo-xanten-9-il)benzoil]piperazin-1-il]-2-oxo-etoxi]acético.Example 41: Synthesis of 2- [2- [4- [2- (3-hydroxy-6-oxo-xanten-9-yl) benzoyl] piperazin-1-yl] -2-oxo-ethoxy] acetic acid.
Se suspendió 6-hidroxi-9-[2-(piperazin-4-ium-1-carbonil)fenil]xanten-3-ona (preparado como se describe en Chang y otros, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 8400) en una mezcla de bicarbonato de sodio saturado acuoso (50 ml) y tetrahidrofurano (50 ml). La mezcla se agitó durante 10 minutos. Se añade anhidrido diglicólico. Después de 3 h, se añadió anhidrido diglicóclico adicional (500 mg). La mezcla se agitó durante 20 h. La mezcla se acidificó con ácido clorhídrico fumante a pH 1. Se añadieron diclorometano (100 ml) y ácido clorhídrico (1 M, 100 ml). Se añadió salmuera (100 ml) y cloruro de sodio sólido. Se observó una cantidad masiva de sólido. El sólido se aisló mediante filtración, se lavó con agua, y se secó al vacío durante varios días. LC-MS: 517,1641 [M+H]+.6-Hydroxy-9- [2- (piperazin-4-ium-1-carbonyl) phenyl] xanten-3-one (prepared as described in Chang et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, was suspended . 129, 8400) in a mixture of saturated aqueous sodium bicarbonate (50 ml) and tetrahydrofuran (50 ml). The mixture was stirred for 10 minutes. Diglycolic anhydride is added. After 3 hr, additional diglycyclic anhydride (500 mg) was added. The mixture was stirred for 20h. The mixture was acidified with fuming hydrochloric acid to pH 1. Dichloromethane (100 ml) and hydrochloric acid (1M, 100 ml) were added. Brine (100 ml) and solid sodium chloride were added. A massive amount of solid was observed. The solid was isolated by filtration, washed with water, and dried under vacuum for several days. LC-MS: 517.1641 [M + H] +.
Ejemplo 42: Síntesis del derivado del ácido citidil monofosfato neuramínico fluorescente, ácido (2R, 5R, 6R)-2-[[(2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-amino-2-oxo-pirimidin-1-il)-3, 4-dihidroxi-tetrahidrofuran-2-il]metoxi-hidroxi-fosforil]oxi-4-hidroxi-5-[[2-[[5-[2-[2-[[2-[2-[4-[2-(3-hidroxi-6-oxo-xanten-9-il)benzoil]piperazin-1-il]-2-oxo-etoxi]acetil]amino]etildisulfanil]etilamino]-5-oxo-pentanoil]amino]acetil]amino]-6-[(2R)-1,2,3-trihidroxipropil]tetrahidropiran-2-carboxílico.Example 42: Synthesis of fluorescent neuraminic acid cytidyl monophosphate derivative, (2R, 5R, 6R) -2 acid - [[(2R, 3S, 4R, 5R) -5- (4-amino-2-oxo-pyrimidin-1 -yl) -3, 4-dihydroxy-tetrahydrofuran-2-yl] methoxy-hydroxy-phosphoryl] oxy-4-hydroxy-5 - [[2 - [[5- [2- [2 - [[2- [2 - [4- [2- (3-hydroxy-6-oxo-xanten-9-yl) benzoyl] piperazin-1-yl] -2-oxo-ethoxy] acetyl] amino] ethyldisulfanyl] ethylamino] -5-oxo- pentanoyl] amino] acetyl] amino] -6 - [(2R) -1,2,3-trihydroxypropyl] tetrahydropyran-2-carboxylic.
El dihidrocloruro de cistamina se disolvió en NaOH 1 M (ac.), 50 ml. La solución se extrajo con DCM (5x30 ml). Se secaron las fases org. combinadas (Na2SO4), se filtraron y se concentraron al vacío.Cystamine dihydrochloride was dissolved in 1M NaOH (aq), 50 mL. The solution was extracted with DCM (5x30 ml). The org phases were dried. combined (Na 2 SO 4 ), filtered and concentrated in vacuo.
La diamina se disolvió en acetonitrilo (30 ml). Se añadió una solución gota a gota de anhídrido en acetonitrilo (30 ml) a la solución. La mezcla resultante se agitó durante 15 minutos. El sólido formado se dejó sedimentar durante 1 h. El solvente se decantó. The diamine was dissolved in acetonitrile (30 ml). A solution of acetonitrile anhydride (30 ml) was added dropwise to the solution. The resulting mixture was stirred for 15 minutes. The solid formed was allowed to settle for 1 h. The solvent was decanted.
Se mezcló ácido 2-[2-[4-[2-(3-hidroxi-6-oxo-xanten-9-il)benzoil]piperazin-1-il]-2-oxo-etoxi]acético, Oxima y DIC en DMF (25 ml). La mezcla se agitó durante 1 h.2- [2- [4- [2- (3-hydroxy-6-oxo-xanten-9-yl) benzoyl] piperazin-1-yl] -2-oxo-ethoxy] acetic acid, Oxime and DIC were mixed in DMF (25 ml). The mixture was stirred for 1 hr.
El aminoácido formado se disolvió en bicarbonato de sodio saturado acuoso (25 ml). La mezcla resultante se agitó durante toda la noche. Se añadió DCM (50 ml) e hidróxido de sodio acuoso (50 ml). Las fases se separaron. La fase orgánica se extrajo con hidróxido de sodio acuoso (3x50 ml). Los extractos acuosos combinados se acidificaron mediante la adición de ácido clorhídrico (fumante), lo que causó una precipitación extensa. La mezcla se filtró. La suspensión aislada se redisolvió en DMF y se concentró al vacío.The amino acid formed was dissolved in aqueous saturated sodium bicarbonate (25 ml). The resulting mixture was stirred overnight. DCM (50 ml) and aqueous sodium hydroxide (50 ml) were added. The phases were separated. The organic phase was extracted with aqueous sodium hydroxide (3x50 ml). The combined aqueous extracts were acidified by the addition of hydrochloric acid (fuming), which caused extensive precipitation. The mixture was filtered. The isolated suspension was redissolved in DMF and concentrated in vacuo.
El compuesto aislado crudo y la Oxima se disolvieron en DMF (20 ml). Se añadió DIC (1,5 ml). La mezcla se agitó durante 2 h. Se añadió una solución de GSC en bicarbonato de sodio saturado acuoso (10 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Se añadió DCM (50 ml). Las fases se separaron. La fase orgánica se extrajo con bicarbonato de sodio saturado acuoso (2x5 ml). Las fases acuosas combinadas se purificaron mediante el uso de HPLC de fase inversa (MeCN de 0-50 % en agua, NH4HCO3 50 mM, columna 5 cm). LC-MS: 688,6752 [M+H]2+. La HPLC analítica y la LC-MS indicaron que el compuesto no era puro. Sin embargo, se usó como tal. The crude isolated compound and the Oxime were dissolved in DMF (20 ml). DIC (1.5 ml) was added. The mixture was stirred for 2h. A solution of GSC in aqueous saturated sodium bicarbonate (10 ml) was added. The mixture was stirred at room temperature overnight. DCM (50 ml) was added. The phases were separated. The organic phase was extracted with saturated aqueous sodium bicarbonate (2x5 ml). The combined aqueous phases were purified using reverse phase HPLC (0-50% MeCN in water, 50mM NH4HCO3, 5cm column). LC-MS: 688.6752 [M + H] 2+. Analytical HPLC and LC-MS indicated that the compound was not pure. However, it was used as such.
Ejemplo 43: Conjugación del fragmento anti-TLT-1-FAB (Fab0084) al FVIII, FVIII-Fab0247 (0084)Example 43: Conjugation of the anti-TLT-1-FAB fragment (Fab0084) to FVIII, FVIII-Fab0247 (0084)
El Factor VIII con dominio B eliminado (turoctocoq alfa, Novo Nordisk A/S, 1,92 ml, 4,2 mg/ml) en tampón imidazol (Imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 150 mM, glicerol 1 M, pH 7,3) y sialidasa (sialidasa recombinante, Arthrobactor Ureafaciens, 3,2 U) se mezclaron y se dejaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La muestra se diluyó a 25 ml con tampón.Factor VIII with domain B removed (turoctocoq alfa, Novo Nordisk A / S, 1.92 ml, 4.2 mg / ml) in imidazole buffer (20 mM Imidazole, 10 mM CaCb, 0.02% Tween 80, NaCl 150mM, 1M glycerol, pH 7.3) and sialidase (recombinant sialidase, Arthrobactor Ureafaciens, 3.2U ) were mixed and left for 1 hour at room temperature. The sample was diluted to 25 ml with buffer.
La solución se inyectó en una columna monoQ preacondicionada (preacondicionada en Tampón A, volumen de columna de 5 ml).The solution was injected into a preconditioned monoQ column (preconditioned in Buffer A, column volume 5 ml).
Tampón A: Imidazol 20 mM, CaCl210 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 25 mM, glicerol 1 M, pH 7,3Buffer A: 20mM Imidazole, 10mM CaCl 2 , 0.02% Tween 80, 25mM NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3
Tampón B: Imidazol 20 mM, CaCl210 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 1 M, glicerol 1 M, pH 7,3.Buffer B: 20mM Imidazole, 10mM CaCl 2 , 0.02% Tween 80, 1M NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3.
La proteína inmovilizada se lavó con Tampón A (5 VC) mediante el uso de una estación de cromatografía Ákta purifier 100. La proteína se eluyó con un gradiente del tampón B (2 VC eq 5 lavados de la muestra no unida 2 VC de B de 0-20 % 10 VC de B al 20 % 10 VC de B al 100 %) a 1 ml/min. La elución de la proteína de interés se realizó mediante el monitoreo de la absorbancia a 280 nm.The immobilized protein was washed with Buffer A (5 CV) using an Ákta purifier 100 chromatography station. The protein was eluted with a gradient of buffer B (2 CV eq 5 washes of the unbound sample 2 CV of B from 0-20 % 10 CV of 20 % B 10 CV of 100% B) at 1 ml / min. The elution of the protein of interest was performed by monitoring the absorbance at 280 nm.
El N,O-asialo BDD-FVIII aislado (0,98 mg/ml, 5 mg) se mezcló con derivado del ácido citidil monofosfato neuramínico fluorescente y sialiltransferasa recombinante (His-ST3Gal1). La mezcla resultante se incubó durante toda la noche a temperatura ambiente.The isolated N, O-asialo BDD-FVIII (0.98 mg / ml, 5 mg) was mixed with fluorescent neuraminic citidyl monophosphate derivative and recombinant sialyltransferase (His-ST3Gal1). The resulting mixture was incubated overnight at room temperature.
La muestra se diluyó hasta 40 ml con tampón A: Imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 25 mM, glicerol 1 M, pH 7,3.The sample was diluted to 40 ml with Buffer A: 20mM Imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 25mM NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3.
La solución se inyectó en una columna monoQ preacondicionada (preacondicionada en Tampón A, volumen de columna de 5 ml).The solution was injected into a preconditioned monoQ column (preconditioned in Buffer A, column volume 5 ml).
Tampón A: Imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 25 mM, glicerol 1 M, pH 7,3.Buffer A: 20mM Imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 25mM NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3.
Tampón B: Imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 1 M, glicerol 1 M, pH 7,3.Buffer B: 20mM Imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 1M NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3.
La proteína inmovilizada se lavó con Tampón A (5 VC) mediante el uso de una estación de cromatografía Ákta purifier 100. La proteína se eluyó con un gradiente del tampón B (2 VC eq 5 lavados de la muestra no unida 2 VC de B de 0-20 % 10 VC de B al 20 % 10 VC de B al 100 %) a 1 ml/min. La elución de la proteína de interés se realizó mediante el monitoreo de la absorbancia a 280 nm.The immobilized protein was washed with Buffer A (5 CV) using an Ákta purifier 100 chromatography station. The protein was eluted with a gradient of buffer B (2 CV eq 5 washes of the unbound sample 2 CV of B from 0-20% 10 CV of 20% B 10 CV of 100% B) at 1 ml / min. The elution of the protein of interest was performed by monitoring the absorbance at 280 nm.
Las fracciones seleccionadas se agruparon y se incubaron con ácido citidilmonofosfato N-acetilneuramínico y sialiltransferasa (ST3GalIN) durante 30 minutos. La mezcla se diluyó hasta 35 ml con tampón A.The selected fractions were pooled and incubated with N-acetylneuraminic cytidyl monophosphate and sialyltransferase (ST3GalIN) for 30 minutes. The mixture was diluted to 35 ml with buffer A.
La solución se inyectó en una columna monoQ preacondicionada (preacondicionada en Tampón A, volumen de columna de 5 ml).The solution was injected into a preconditioned monoQ column (preconditioned in Buffer A, column volume 5 ml).
Tampón A: Imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 25 mM, glicerol 1 M, pH 7,3.Buffer A: 20mM Imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 25mM NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3.
Tampón B: Imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 1 M, glicerol 1 M, pH 7,3.Buffer B: 20mM Imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 1M NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3.
La proteína inmovilizada se lavó con Tampón A (5 VC) mediante el uso de una estación de cromatografía Ákta purifier 100. La proteína se eluyó con un gradiente del tampón B (2 VC eq 5 lavados de la muestra no unida 2 VC de B de 0-20 % 10 VC de B al 20 % 10 VC de B al 100 %) a 1 ml/min. La elución de la proteína de interés se realizó mediante el monitoreo de la absorbancia a 280 nm.The immobilized protein was washed with Buffer A (5 CV) using an Ákta purifier 100 chromatography station. The protein was eluted with a gradient of buffer B (2 CV eq 5 washes of the unbound sample 2 CV of B from 0-20% 10 CV of 20% B 10 CV of 100% B) at 1 ml / min. The elution of the protein of interest was performed by monitoring the absorbance at 280 nm.
Las fracciones seleccionadas se agruparon y se evaluaron por electroforesis en gel SDS PAGE (acetato de Bis-Tris de 4-12 %, reducido y no reducido).The selected fractions were pooled and evaluated by SDS PAGE gel electrophoresis (4-12% Bis-Tris acetate, reduced and not reduced).
Las fracciones aisladas se mezclaron con tampón (15 ml) que contiene fns(carboxietil)fosfina, TCEP (Imidazol 20 mM, CaCl2 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 25 mM, glicerol 1 M, pH 7,3, TCEP 0,7 mM). La mezcla resultante se incubó durante 20 minutos. La solución se inyectó en una columna monoQ preacondicionada (5/50 GL, preacondicionada en Tampón A con TCEP).The isolated fractions were mixed with buffer (15 ml) containing fns (carboxy ethyl) phosphine, TCEP (20mM Imidazole, 10mM CaCl 2 , 0.02% Tween 80, 25mM NaCl, 1M glycerol, pH 7.3 , 0.7 mM TCEP). The resulting mixture was incubated for 20 minutes. The solution was injected into a preconditioned monoQ column (5/50 GL, preconditioned in Buffer A with TCEP).
Tampón A1: Imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 25 mM, glicerol 1 M, pH 7,3, TCEP 0,7 mM). Tampón A2: Imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 25 mM, glicerol 1 M, pH 7,3).Buffer A1: 20mM Imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 25mM NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3, 0.7mM TCEP). Buffer A2: 20mM Imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 25mM NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3).
Tampón B1: Imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 1 M, glicerol 1 M, pH 7,3).Buffer B1: 20mM Imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 1M NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3).
10 VC eq i A1, 5 lavados de la muestra no unida i A1, 30 VC en A1 al 100 %, 10 VC de A2 al 100 %, 15 VC de B1 al 100 %10 CV eq i A1, 5 washes of the unbound sample i A1, 30 CV in A1 at 100%, 10 CV in A2 at 100%, 15 CV in B1 at 100%
La proteína inmovilizada se lavó con Tampón A1 (45 VC) seguido por Tampón A2 (10 VC) mediante el uso de una estación de cromatografía Ákta purifier 100. La proteína se eluyó con tampón B (15 VC de B al 100 %) a 1 ml/min. La elución de la proteína de interés se realizó mediante el monitoreo de la absorbancia a 280 nm.The immobilized protein was washed with Buffer A1 (45 VC) followed by Buffer A2 (10 VC) using an Ákta purifier 100 chromatography station. The protein was eluted with buffer B (15 VC of 100% B) at 1 ml / min. The elution of the protein of interest was performed by monitoring the absorbance at 280 nm.
Las fracciones seleccionadas se agruparon y se analizaron por SDS-PAGE (Tris-acetato).The selected fractions were pooled and analyzed by SDS-PAGE (Tris-acetate).
El compuesto del Factor VIII aislado se diluyó con Tampón A y se inyectó en una columna monoQ preacondicionada (5/50 GL, preacondicionada en Tampón A).The isolated Factor VIII compound was diluted with Buffer A and injected onto a preconditioned monoQ column (5/50 GL, preconditioned in Buffer A).
Se mantuvo un flujo del Tampón A que contenía BM(PEG)2 4,8 mM (1,8-Bismaleimidodietilenglicol, Pierce/Thermo Scientific) durante 100 minutos. La proteína se lavó y se eluyó mediante el uso del protocolo siguiente: 10 VC de A1, 25 VC en tampón A2 (bismaleimida) a 0,25 ml/min (100 min), 10 VC de tampón A1, 10 VC de B1 al 100 %. A flow of Buffer A containing 4.8 mM BM (PEG) 2 (1.8-Bismaleimidodiethylene glycol, Pierce / Thermo Scientific) was maintained for 100 minutes. Protein was washed and eluted using the following protocol: 10 CV of A1, 25 CV in buffer A2 (bismaleimide) at 0.25 ml / min (100 min), 10 CV of buffer A1, 10 CV of B1 at 100%
El fragmento de anticuerpo anti-TLT-1, 0084, se intercambió de tampón mediante el uso de un dispositivo de filtro de ultracentrífuga Amicon con MWCO 30 kDa en tampón HEPES (HEPES 20 mM CaCb 1 mM, NaCl 100 mM Tween80 al 0,005 %, pH: 7,50). Concentración medida: 3,44 mg/ml, 2 mg): Se añadió sal sódica de hidrato de Tris(3-sulfonatofenil)fosfina (Alfa Aesar, grado técnico 85 %) a una concentración resultante de 12,5 mM. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. El fragmento de anticuerpo se intercambió de tampón mediante el uso de un dispositivo de filtro de ultracentrifugación Amicon con MWCO 30 kDa en tampón imidazol (Imidazol 20 mM, CaCb 10 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 25 mM, glicerol 1 M, pH 7,3).The anti-TLT-1 antibody fragment, 0084, was exchanged for buffer using an Amicon ultracentrifuge filter device with 30 kDa MWCO in HEPES buffer (20mM HEPES 1mM CaCb, 0.005% NaCl 100mM Tween80, pH: 7.50). Measured concentration: 3.44 mg / ml, 2 mg): Tris ( 3- sulfonatophenyl) phosphine sodium hydrate salt (Alpha Aesar, technical grade 85%) was added at a resulting concentration of 12.5 mM. The resulting mixture was incubated at room temperature for 2 h. The antibody fragment was exchanged for buffer by using an Amicon ultracentrifugation filter device with 30 kDa MWCO in imidazole buffer (20mM Imidazole, 10mM CaCb, 0.02% Tween 80, 25mM NaCl, 1M glycerol , pH 7.3).
Las soluciones del Factor VIII y el fragmento de anticuerpo se mezclaron y concentraron hasta 2 ml. La solución resultante se incubó durante toda la noche a temperatura ambiente.Factor VIII solutions and the antibody fragment were mixed and concentrated to 2 ml. The resulting solution was incubated overnight at room temperature.
La solución se inyectó en una columna monoQ preacondicionada (preacondicionada en Tampón A, volumen de columna de 5 ml).The solution was injected into a preconditioned monoQ column (preconditioned in Buffer A, column volume 5 ml).
Tampón A: Imidazol 20 mM, CaCl210 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 25 mM, glicerol 1 M, pH 7,3.Buffer A: 20mM Imidazole, 10mM CaCl 2 , 0.02% Tween 80, 25mM NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3.
Tampón B: Imidazol 20 mM, CaCl210 mM, Tween 80 al 0,02 %, NaCl 1 M, glicerol 1 M, pH 7,3.Buffer B: 20mM Imidazole, 10mM CaCl 2 , 0.02% Tween 80, 1M NaCl, 1M Glycerol, pH 7.3.
La proteína inmovilizada se lavó con Tampón A (5 VC) mediante el uso de una estación de cromatografía Ákta purifier 100. La proteína se eluyó con un gradiente del tampón B (2 VC eq 5 lavados de la muestra no unida 2 VC de B de 0-20 % 10 VC de B al 20 % 10 VC de B al 100 %) a 1 ml/min. La elución de la proteína de interés se realizó mediante el monitoreo de la absorbancia a 280 nm.The immobilized protein was washed with Buffer A (5 CV) using an Ákta purifier 100 chromatography station. The protein was eluted with a gradient of buffer B (2 CV eq 5 washes of the unbound sample 2 CV of B from 0-20% 10 CV of 20% B 10 CV of 100% B) at 1 ml / min. The elution of the protein of interest was performed by monitoring the absorbance at 280 nm.
Las fracciones seleccionadas se agruparon y se concentraron. La proteína se inyectó en una columna preacondicionada Superdex 200 16/60 PG (preacondicionada en Tampón A).The selected fractions were pooled and concentrated. Protein was injected into a Superdex 200 16/60 PG preconditioned column (preconditioned in Buffer A).
Tampón A: Histidina (1,5 g, 1,5 mg/ml), CaCl2 * H2O (376 mg, 0,37 mg/ml), NaCl (18 g, 18 mg/ml), Sacarosa (3 g, 3 mg/ml), Tween 80 (100 mg, 0,1 mg/ml), diluido a 1000 ml con MQ, ajustado a pH 7,0.Buffer A: Histidine (1.5g, 1.5mg / ml), CaCl2 * H2O (376mg, 0.37mg / ml), NaCl (18g, 18mg / ml), Sucrose (3g, 3 mg / ml), Tween 80 (100 mg, 0.1 mg / ml), diluted to 1000 ml with MQ, adjusted to pH 7.0.
Las fracciones se seleccionaron en base al análisis por SDS-PAGE y transferencia Western anti-HPC4.Fractions were selected based on SDS-PAGE analysis and Western anti-HPC4 blot.
Ejemplo 44: Conjugación del fragmento anti TLT-1-FAB (Fab0084) al FIX.Example 44: Conjugation of the anti TLT-1-FAB fragment (Fab0084) to FIX.
Se mezclan el Factor IX (50 microlitros), Sialiltransferasa3 (10 microlitros), y derivado del ácido citidil monofosfato neuramínico fluorescente; punta de una espátula). La mezcla se incuba a 32 grados Celsius durante 24 horas. Las concentraciones finales son: Factor IX: 0,33 mg/ml, ST3Gal3: 0,08 mg/mlFactor IX (50 microliters), Sialyltransferase3 (10 microliters), and fluorescent cytidyl monophosphate acid neuraminic acid derivative are mixed; tip of a spatula). The mixture is incubated at 32 degrees Celsius for 24 hours. The final concentrations are: Factor IX: 0.33 mg / ml, ST3Gal3: 0.08 mg / ml
Analizado por SDS-PAGE (respuesta de fluorescencia y tinción con azul de coomassie).Analyzed by SDS-PAGE (fluorescence response and coomassie blue staining).
El Factor IX y un fragmento de anticuerpo se conjugan mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción, es decir, reducción mediada por una fosfina o glutatión, acoplamiento a una entidad enlazadora, y conjugación seguida de purificación y análisis.Factor IX and an antibody fragment are conjugated using the methods described in the present description, ie, phosphine or glutathione mediated reduction, coupling to a linker entity, and conjugation followed by purification and analysis.
Ejemplo 45: El FVIIa-Fab9015 es superior a rFVIIa en la reducción del sangrado de la cola en ratones hemofílicos transitorios.Example 45: FVIIa-Fab9015 is superior to rFVIIa in reducing tail bleeding in transient hemophiliac mice.
Los ratones knock-out/knock-in (KOKI) TLT-1 humanizados se convirtieron en hemofílicos transitorios mediante la administración de un anticuerpo monoclonal de FVIII. Cinco minutos antes de la inducción del sangrado de cola, los ratones se trataron previamente con 20, 5 o 0,8 nmol/kg de FVIIa-Fab9015 (3,625 ml/kg), 20 nmol/kg de rFVIIa o vehículo. El sangrado de la cola se indujo por transección de 4 mm a partir de la punta de cola, y se observó el sangrado resultante durante 30 minutos. Los conteos de plaquetas se obtuvieron inicialmente y 30, 60 y 120 minutos después de la inducción del sangrado de la cola.Humanized TLT-1 knockout / knock-in (KOKI) mice were converted to transient hemophiliacs by administration of a FVIII monoclonal antibody. Five minutes before induction of tail bleeding, the Mice were pretreated with 20, 5, or 0.8 nmol / kg FVIIa-Fab9015 (3,625 ml / kg), 20 nmol / kg rFVIIa, or vehicle. Tail bleeding was induced by transection of 4 mm from the tail tip, and the resulting bleeding was observed for 30 minutes. Platelet counts were obtained initially and 30, 60, and 120 minutes after induction of tail bleeding.
Para poder mostrar la superioridad del FVIIa-Fab9015, se usó una dosis del rFVIIa (20 nmol/kg ~ 1 mg/kg) que no se esperaba tuviera un efecto significativo sobre el sangrado.In order to show the superiority of FVIIa-Fab9015, a dose of rFVIIa (20 nmol / kg ~ 1 mg / kg) was used which was not expected to have a significant effect on bleeding.
La pérdida de sangre y el tiempo de sangrado se reducen en dependencia de la dosis del TLT-1-FAb-FVIIa, que alcanzó significación estadística a 20 y 5 nmol/kg. Además, 20 nmol/kg del FVIIa-Fab9015 fue significativamente más eficaz en comparación con 20 nmol/kg de rFVIIa (Figura 15).Blood loss and bleeding time are reduced depending on the dose of TLT-1-FAb-FVIIa, which reached statistical significance at 20 and 5 nmol / kg. Furthermore, 20 nmol / kg of FVIIa-Fab9015 was significantly more effective compared to 20 nmol / kg of rFVIIa (Figure 15).
No se observaron cambios significativos en el conteo de plaquetas dentro de las 2 horas de tratamiento en ninguno de los grupos de tratamiento (Figura 16).No significant changes in platelet count were observed within 2 hours of treatment in any of the treatment groups (Figure 16).
En conclusión, el FVIIa-Fab9015 fue superior al rFVIIa en la reducción del sangrado de la cola en ratones KOKI TLT-1. No se observaron signos de efectos adversos, por ejemplo, disminución de los conteos de plaquetas.In conclusion, FVIIa-Fab9015 was superior to rFVIIa in reducing tail bleeding in KOKI TLT-1 mice. No signs of adverse effects, eg decreased platelet counts, were observed.
Ejemplo 46: Aumento de la generación de trombina por localización del rFVIIa en la superficie de plaquetas activadas mediante la unión al TLT-1 expresado en la superficie en condiciones similares a hemofilia A.Example 46: Increased thrombin generation by localizing rFVIIa on the surface of activated platelets by binding to surface-expressed TLT-1 under conditions similar to hemophilia A.
El FVIIa-Fab9015 se analizó en un ensayo de generación de trombina. En resumen, el plasma rico en plaquetas humanas (PRP) se obtiene mediante centrifugación de sangre total humana con citrato a 220 g durante 20 min. Se recogió la fase superior que contiene plaquetas y la muestra restante se centrifugó a 2500 g durante 10 min para obtener el plasma pobre de plaquetas (PPP) usado para ajustar la concentración de plaquetas que se usa en una concentración final de 150000 plt/jl. El PRP se hizo hemofílico mediante incubación durante 30 min con un anticuerpo policlonal anti-FVIII humano de cabra (0,1 mg/ml) (HTI núm. Z0429). Las plaquetas se activaron con péptido de activación del receptor-1 activado por proteasa (SFLLRN; Bachem núm. H-2936) o una combinación del péptido y el veneno de serpiente activador de GpVI Convulxina (Pentapharm núm. 119-02). La trombina generada se midió mediante el uso de un método fluorogénico de Thrombinoscope®. El PRP, el reactivo FluCa y el compuesto se mezclaron y se añadieron a placas de pocillos de fondo redondo Nunc Microwell de 96 pocillos. La reacción se inició por la adición del activador de plaquetas y la señal fluorescente del sustrato se detectó en un lector de placas ThermoFisher Fluoroskan (Fisher Scientific). La concentración de trombina se calculó mediante el uso de un calibrador de trombina proporcionado por Thrombinoscope de acuerdo con sus instrucciones.FVIIa-Fab9015 was analyzed in a thrombin generation assay. In summary, human platelet rich plasma (PRP) is obtained by centrifugation of human whole blood with citrate at 220 g for 20 min. The upper platelet-containing phase was collected and the remaining sample was centrifuged at 2,500 g for 10 min to obtain the platelet poor plasma (PPP) used to adjust the platelet concentration used in a final concentration of 150,000 plt / jl. PRP was made hemophilic by incubation for 30 min with a goat anti-human FVIII polyclonal antibody (0.1 mg / ml) (HTI No. Z0429). Platelets were activated with protease-activated receptor-1 activation peptide (SFLLRN; Bachem No. H-2936) or a combination of the GpVI activator snake venom and convulxin (Pentapharm No. 119-02). The thrombin generated was measured using a Thrombinoscope® fluorogenic method. PRP, FluCa reagent, and compound were mixed and added to Nunc Microwell 96-well round bottom well plates. The reaction was initiated by the addition of platelet activator and the fluorescent signal from the substrate was detected on a ThermoFisher Fluoroskan plate reader (Fisher Scientific). Thrombin concentration was calculated using a thrombin calibrator provided by Thrombinoscope according to its instructions.
Los resultados mostraron una potencia aumentada del FVIIa-Fab9015 en comparación con rFVIIa (Figura 17A). Además los resultados revelaron que este aumento en la potencia dependió del estadio de activación de las plaquetas. La Figura 18 muestra la mayor capacidad generadora de la trombina cuando las plaquetas se activaron con SFLLRN (10 |jM) y se alcanzó el potencial total cuando las plaquetas se activaron con una combinación de SFLLRN (30 j M) y Convulxina (100 ng/ml). Cuando se activan las plaquetas con esta combinación de activadores, FVIIa-Fab9015 mostró una potencia de aproximadamente cuatro veces mayor, medida como generación del pico de trombina, en comparación con rFVIIa en las dos concentraciones analizadas (5 y 25 nM) (Figura 17A y 17B, respectivamente). Este aumento en la capacidad generadora de la trombina dependió completamente de la unión del FVIIa-Fab9015 al TLT-1 en la superficie de la plaqueta activada ya que la incubación previa con TLT-1 soluble revertió completamente la potenciación (Figura 19).The results showed increased potency of FVIIa-Fab9015 compared to rFVIIa (Figure 17A). Furthermore, the results revealed that this increase in potency depended on the platelet activation stage. Figure 18 shows the highest thrombin generating capacity when platelets were activated with SFLLRN (10 | jM) and full potential was reached when platelets were activated with a combination of SFLLRN (30 jM) and Convulxin (100 ng / ml). When platelets are activated with this combination of activators, FVIIa-Fab9015 showed approximately four-fold higher potency, measured as thrombin peak generation, compared to rFVIIa at the two concentrations analyzed (5 and 25 nM) (Figure 17A and 17B, respectively). This increase in thrombin-generating capacity was completely dependent on the binding of FVIIa-Fab9015 to TLT-1 on the activated platelet surface since previous incubation with soluble TLT-1 completely reversed potentiation (Figure 19).
Ejemplo 47: Aumento de la generación de trombina por localización del rFIX en la superficie de plaquetas activadas mediante la unión del TLT-1 expresado en la superficie en condiciones similares a hemofilia B.Example 47: Increased thrombin generation by localization of rFIX on the surface of activated platelets by binding of surface expressed TLT-1 under conditions similar to hemophilia B.
Se analizó el FIX-Fab0155 en un ensayo de generación de trombina y se comparó con rFIX (Benefix®). Las plaquetas humanas se aislaron a partir de sangre total fresca estabilizada con citrato. Una parte de la solución de ACD (citrato trisódico al 2,5 %, ácido cítrico al 1,5 % y D-glucosa al 2 %) se añadió a cinco partes de sangre antes de la centrifugación a 220 g durante 20 min para obtener plasma rico en plaquetas. La fase superior se recogió y transfirió a un nuevo tubo con forma de cono y se centrifugó a 500 g durante 15 min. El plasma se eliminó y el sedimento se disolvió en tampón Hepes (Hepes 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1,7 mM, D-glucosa 5 mM, NaH2PO40,4 mM; pH 6,5) suplementado con prostaglandina E1 (5 jg/ml). Después de una segunda centrifugación a 500 g durante 15 min, el sobrenadante se desechó y las plaquetas lavadas se disolvieron en plasma deficiente del Factor IX (Geroge King Bio-medical, Inc.) y la concentración de plaquetas se ajustó a 300 000 plt/jl. En el ensayo de generación de trombina cuando se añadieron agonistas, variantes del Factor IX y reactivo FluCa (Thrombinoscope®) a placas de pocillo de fondo redondo Nunc Microwell de 96 pocillos junto con el plasma deficiente de Factor IX que contiene plaquetas, la concentración final de plaquetas fue de 150000 plt/jl. Las plaquetas se activaron con una combinación de péptido de activación del receptor-1 activado por proteasa (SFLLRN; Bachem núm. H-2936) y el veneno de serpiente activador de GPVI Convulxina (Pentapharm núm. 119-02). La trombina generada se midió mediante un método fluorogénico de Thrombinoscope® en el cual la señal fluorescente del sustrato escindido de la trombina se detectó en un lector de placas ThermoFisher Fluoroskan (Fisher Scientific). La concentración de trombina se calculó mediante el uso de un calibrador de trombina proporcionado por Thrombinoscope® de acuerdo con sus instrucciones. FIX-Fab0155 was analyzed in a thrombin generation assay and compared with rFIX (Benefix®). Human platelets were isolated from fresh citrate stabilized whole blood. One part of the ACD solution (2.5% trisodium citrate, 1.5% citric acid and 2% D-glucose) was added to five parts of blood before centrifugation at 220 g for 20 min to obtain platelet rich plasma. The upper phase was collected and transferred to a new cone-shaped tube and centrifuged at 500 g for 15 min. Plasma was removed and the pellet was dissolved in Hepes buffer (10mM Hepes, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 1.7mM MgCl2, 5mM D-glucose, 0.4mM NaH 2 PO 4 ; pH 6 , 5) supplemented with prostaglandin E1 (5 jg / ml). After a second centrifugation at 500 g for 15 min, the supernatant was discarded and the washed platelets were dissolved in Factor IX deficient plasma (Geroge King Bio-medical, Inc.) and the platelet concentration was adjusted to 300,000 plt / jl. In the thrombin generation assay when agonists, Factor IX variants, and FluCa reagent (Thrombinoscope®) were added to 96-well Nunc Microwell round-bottom well plates together with platelet-containing Factor IX deficient plasma, the final concentration platelet count was 150,000 plt / jl. Platelets were activated with a combination of protease activated receptor-1 activating peptide (SFLLRN; Bachem No. H-2936) and GPVI activator snake venom Convulxin (Pentapharm No. 119-02). The thrombin generated was measured by a Thrombinoscope® fluorogenic method in which the fluorescent signal from the cleaved thrombin substrate was detected on a ThermoFisher Fluoroskan plate reader (Fisher Scientific). Thrombin concentration was calculated using a thrombin calibrator provided by Thrombinoscope® according to its instructions.
Los resultados mostraron una potencia aumentada a 1 nM del FIX-Fab0155 en comparación con rFIX (Figura 20) cuando las plaquetas se activaron con una combinación de SFLLRN (30 j M) y Convulxina (100 ng/ml). Además, los resultados revelaron que este aumento en la potencia dependió de la expresión del TLT-1 en las plaquetas ya que el TLT- 1 soluble ( 1 00 nM) antagonizó el efecto potenciado.The results showed a 1 nM increased potency of FIX-Fab0155 compared to rFIX (Figure 20) when platelets were activated with a combination of SFLLRN (30 jM) and Convulxin (100 ng / ml). Furthermore, the results revealed that this increase in potency depended on the expression of TLT-1 in platelets since soluble TLT -1 (1 00 nM) antagonized the enhanced effect.
Ejemplo 48: Purificación y de corrida compuesto de Histidina 10 mM, pH 6,0, CaCb 10 mM, NaCl 100 mM y Tween 80 al 0,01 %. Las proteínas FVIIa se colectaron como picos simétricos en aprox. 0,02-0,08 volúmenes de columna. Example 48: Purification and run composed of 10mM Histidine, pH 6.0, 10mM CaCb, 100mM NaCl and 0.01% Tween 80. FVIIa proteins were collected as symmetric peaks at approx. 0.02-0.08 column volumes.
Las activaciones de las preparaciones de FVIIa purificadas se llevaron a cabo mediante el uso de una resina compuesta de FXa derivada de plasma (de Enzyme Research Lab.) acoplada a perla CNBr-Sepharose 4 activada (de GE Healthcare).Activations of the purified FVIIa preparations were carried out using a plasma derived FXa composite resin (from Enzyme Research Lab.) Coupled to activated CNBr-Sepharose 4 bead (from GE Healthcare).
Las proteínas FVIIa se analizaron mediante el uso de SDS-PAGE/Coomassie y las determinaciones de masa molecular intactas se realizaron mediante el uso de una configuración del método de cromatografía líquida espectrometría de masa de electropulverización ionización con analizador de tiempo de vuelo en un instrumento Agilent 6210 y una columna desalinizada MassPREP (de Waters) con un tampón de equilibrado compuesto de ácido fórmico al 0,1 % H2O grado LC-MS y un tampón de elución compuesto de ácido fórmico al 0,1 % en ACN grado LC-MS. Todas las variantes del FVIIa y de tipo silvestre purificadas mostraron masas moleculares intactas de ~50 kDa. Basado en los análisis de SDS-PAGE/Coomassie y de LC-MS de masa intacta mediante el uso de condiciones reductoras, se llevaron a cabo las identificaciones de cadena de la fusión FVIIa-Fab5001.FVIIa proteins were analyzed using SDS-PAGE / Coomassie and intact molecular mass determinations were performed using an Ionization Electrospray Mass Spectrometry Liquid Chromatography method setup with an Agilent instrument 6210 and a MassPREP desalinated column (from Waters) with a balancing buffer consisting of 0.1% formic acid H2O grade LC-MS and an elution buffer consisting of 0.1% formic acid in ACN grade LC-MS. All purified wild-type and FVIIa variants showed intact molecular masses of ~ 50 kDa. Based on SDS-PAGE / Coomassie and intact mass LC-MS analyzes using reducing conditions, chain identifications of the FVIIa-Fab5001 fusion were performed.
Basado en los análisis de SEC-HPLC, todas las preparaciones del FVIIa mostraron una pureza de >90-99 % y parecieron altamente homogéneas.Based on SEC-HPLC analyzes, all FVIIa preparations showed a purity of> 90-99% and appeared highly homogeneous.
Ejemplo 49: Autoactivación del FVII-Fab5001 mediante el uso de un ensayo proteolítico en presencia del Factor Tisular soluble.Example 49: FVII-Fab5001 autoactivation by using a proteolytic assay in the presence of soluble Tissue Factor.
La autoactivación se determinó como la capacidad de activar el FX en presencia del Factor Tisular soluble (sTF). La proteína se diluyó en HEPES 50 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM, CaCb 10 mM, BSA 1 mg/ml y PEG8000 al 0,1 % (p/v). Los parámetros cinéticos para la activación de FX se determinaron mediante la incubación previa de FVII-Fab5001 5 pM (n=2) con sTF 100 nM y fosfolípidos PC:PS 25 j M (Haematologic technologies) durante 10 min. Después se añadió FX 30 nM en un volumen de reacción total de 100 j l en una placa de 96 pocillos y la reacción se dejó incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, la reacción se inactivó mediante la adición de 50 j l de tampón de parada (HEPES 50 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM, EDTA 80 mM) seguido por la adición de 50 j l de S-2765 2 mM. Finalmente, el aumento de la absorbancia se midió continuamente a 405 nM en un lector de microplacas Spectramax 190. Los valores de Kcat/Km se determinaron al ajustar los datos a una forma revisada de la ecuación de Michaelis Menten ([S] < Km) mediante el uso de regresión lineal. La cantidad de FXa generada se estimó a partir de una curva estándar de FXa.Self-activation was determined as the ability to activate FX in the presence of soluble Tissue Factor (sTF). Protein was diluted in 50mM HEPES (pH 7.4), 100mM NaCl, 10mM CaCb, 1mg / ml BSA and 0.1% (w / v) PEG8000. The kinetic parameters for FX activation were determined by previous incubation of 5 pM FVII-Fab5001 (n = 2) with 100 nM sTF and PC: PS 25 jM phospholipids (Haematologic technologies) for 10 min. Then 30 nM FX in a total reaction volume of 100 µl was added to a 96-well plate and the reaction was allowed to incubate for 20 min at room temperature. After incubation, the reaction was quenched by the addition of 50 µl of Stop Buffer (50 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaCl, 80 mM EDTA) followed by the addition of 50 µl of S-2765 2 mM. Finally, the increase in absorbance was continuously measured at 405 nM in a Spectramax 190 microplate reader. Kcat / Km values were determined by fitting the data to a revised form of the Michaelis Menten equation ([S] <Km) by using linear regression. The amount of FXa generated was estimated from a standard FXa curve.
La proteína de fusión zimogéna FVII-Fab5001 mostró actividad proteolítica del 38 % con relación a la del wtFVIIa, que es un resultado de la autoactivación de la proteína en presencia de sTF, ver la Figura 21).The zymogene fusion protein FVII-Fab5001 showed proteolytic activity of 38% relative to that of wtFVIIa, which is a result of the autoactivation of the protein in the presence of sTF, see Figure 21).
Ejemplo 50: Ausencia del efecto antiagregante de los anticuerpos anti-TLT-1, mAb0023, mAb0051, mAb0061 y mAb0062.Example 50: Absence of the antiplatelet effect of the anti-TLT-1 antibodies, mAb0023, mAb0051, mAb0061 and mAb0062.
El efecto antiagregante de los anticuerpos anti-TLT-1 se analizó en plasma rico en plaquetas humanas (PRP). El PRP se obtuvo por centrifugación a 200 g durante 15 min de sangre total humana estabilizada con heparina. La fase superior que contiene plaquetas se colectó y la muestra restante se centrifugó en 1500 g durante 10 min para obtener plasma pobre de plaquetas (PPP) que se usó como una muestra de referencia en las mediciones de agregación. El PRP se incubó 3 min a 37 °C en el instrumento Platelet Aggregation Profiler (PAP-8 ) (Bio/Data Corporation, Horsham, PA). Se registró un valor de referencia estable antes de la adición de anticuerpos anti-TLT-1 (10 nM) o anticuerpo control irrelevante (10 nM) al PRP. Las plaquetas se activaron 3 min después de la adición de los anticuerpos con péptido activador del receptor-1 (PAR-1) activado por proteasa SFLLRN (1 o 10 j M) (Bachem).The antiplatelet effect of anti-TLT-1 antibodies was analyzed in human platelet rich plasma (PRP). PRP was obtained by centrifugation at 200 g for 15 min of heparin-stabilized human whole blood. The upper platelet-containing phase was collected and the remaining sample was centrifuged at 1500 g for 10 min to obtain platelet poor plasma (PPP) which was used as a reference sample in the aggregation measurements. The PRP was incubated 3 min at 37 ° C on the Platelet Aggregation Profiler (PAP- 8 ) instrument (Bio / Data Corporation, Horsham, PA). A stable reference value was recorded before the addition of anti-TLT-1 antibodies (10 nM) or irrelevant control antibody (10 nM) to the PRP. Platelets were activated 3 min after the addition of the antibodies with SFLLRN protease activated receptor-1 (PAR-1) activating peptide (1 or 10 µM) (Bachem).
Los resultados no mostraron efecto inhibidor de los anticuerpos (10 nM) (mAb0023, mAb0051, mAb0061 y mAb0062) en comparación con el anticuerpo control irrelevante. La agregación de plaquetas se inició con una concentración alta (10 j M) o intermedia (1 j M) de SFLLRN. Los datos muestran que los anticuerpos no inhibieron la agregación en ninguna de las concentraciones de SFLLRN. En conclusión, estos datos muestran que los anticuerpos no inducen ni inhiben la función de plaquetas medida como agregación.The results showed no inhibitory effect of the antibodies (10 nM) (mAb0023, mAb0051, mAb0061 and mAb0062) compared to the irrelevant control antibody. Platelet aggregation was initiated with a high (10 jM) or intermediate (1 jM) concentration of SFLLRN. The data shows that the antibodies did not inhibit aggregation at any of the SFLLRN concentrations. In conclusion, these data show that the antibodies do not induce or inhibit platelet function measured as aggregation.
Ejemplo 51. Efecto del FIX-mAb0145 sobre la formación de coágulos de fibrina inducida por TF en sangre total humana (Hw B) a partir de un donante normal medida por tromboelastografía (TEG).Example 51. Effect of FIX-mAb0145 on TF-induced fibrin clot formation in human whole blood (Hw B) from a normal donor measured by thromboelastography (TEG).
La sangre total humana estabilizada con citrato (HWB) se extrae a partir de donantes normales. Las condiciones similares a hemofilia se obtienen mediante la incubación de HWB con anticuerpo anti-FVIII 10 jg/m l (anti-Factor VIII humano de oveja; Hematologic Technologies Inc) durante 30 min a temperatura ambiente. La formación de coágulos se mide mediante tromboelastografía (analizador TEG serie 5000, Haemoscope Corporation, Niles, IL, EE.UU.). Se añadieron diversas concentraciones (0; 0,2; 1,0; 5,0 y 10 nM) de FIX-mAb0145 o (0; 0,2; 5,0 y 10 nM) de rFIX (Novo Nordisk A/S) a HWB con citrato “similar a hemofilia”. La coagulación se inicia cuando se transfieren 340 |jl de HWB normal o “similar a hemofilia” a un recipiente del tromboelastógrafo que contiene 20 j l de CaCb 0,2 M con TF lipidado0,03 pM (Innovin®, Dade Behring Gmbh (Marburg, Alemania). El trazo de TEG se sigue continuamente por hasta 120 min. Se registran las variables de TEG siguientes: Tiempo R (tiempo de coagulación, es decir, el tiempo desde el inicio de la coagulación hasta que se obtuvo una amplitud de 2 mm), ángulo a (desarrollo de coágulos medido como el ángulo entre el valor de R y el punto de inflexión del trazo de TEG), K (velocidad de la cinética del coágulo para alcanzar un cierto nivel de resistencia del coágulo, amplitud = 20 mm), y MA (amplitud máxima del trazo de TEG que refleja la resistencia mecánica máxima del coágulo). La Figura 23 muestra los valores de tiempo R determinados a partir de trazos de TEG individuales.Citrate stabilized human whole blood (HWB) is drawn from normal donors. Hemophilia-like conditions are obtained by incubating HWB with 10 jg / ml anti-FVIII antibody (anti-human sheep Factor VIII; Hematologic Technologies Inc) for 30 min at room temperature. Clot formation it is measured by thromboelastography (5000 series TEG analyzer, Haemoscope Corporation, Niles, IL, USA). Various concentrations (0, 0.2, 1.0, 5.0, and 10 nM) of FIX-mAb0145 or (0, 0.2, 5.0, and 10 nM) of rFIX (Novo Nordisk A / S) were added. HWB with "hemophilia-like" citrate. Coagulation is initiated when 340 | jl of normal or "hemophilia-like" HWB is transferred to a thromboelastgraph vessel containing 20 jl of 0.2M CaCb with lipidized 0.03 pM TF (Innovin®, Dade Behring Gmbh (Marburg, Germany) The TEG trace is continuously followed for up to 120 min The following TEG variables are recorded: R time (coagulation time, that is, the time from the start of coagulation until an amplitude of 2 mm was obtained ), angle a (clot development measured as the angle between the value of R and the inflection point of the TEG trace), K (speed of the clot kinetics to reach a certain level of clot resistance, amplitude = 20 mm ), and MA (maximum amplitude of the TEG trace reflecting the maximum mechanical resistance of the clot.) Figure 23 shows the time values R determined from individual TEG traces.
El tiempo R obtenido a partir de trazos de TEG con HWB normal y sangre “hemofílica” suplementada con diversas concentraciones de FIX-mAb0145 o rFIX se muestra en la Figura 23. La HWB de un donante normal mostró un tiempo R de 980 seg que se prolongó hasta 5475 seg cuando la sangre se preparó “similar a hemofilia” mediante la adición de un anticuerpo de neutralización del FVIII. El FIX-mAb0145 acorta el tiempo R del coágulo en una manera dependiente de la concentración, por el contrario al rFIX, que no tuvo un efecto significativo cuando se añadió como un control a concentraciones equivalentes. Todos los datos se obtienen a partir de un donante representativo.The R time obtained from TEG traces with normal HWB and "hemophilic" blood supplemented with various concentrations of FIX-mAb0145 or rFIX is shown in Figure 23. The HWB of a normal donor showed an R time of 980 sec. it lasted up to 5475 sec when the blood was prepared "hemophilia-like" by the addition of a FVIII neutralizing antibody. FIX-mAb0145 shortens clot time R in a concentration dependent manner, in contrast to rFIX, which had no significant effect when added as a control at equivalent concentrations. All data is obtained from a representative donor.
Se observa que el FIX-mAb0145 normaliza el coágulo de “HWB similar a hemofilia” en una manera dependiente de la concentración. Por lo tanto, sorprendentemente, los resultados muestran que la conjugación del rFIX con un anticuerpo contra TLT-1, que dirige al rFIX a la superficie de plaquetas activadas, proporciona una actividad de puenteo independiente del FVIII que resulta en una actividad procoagulante mejorada.FIX-mAb0145 is observed to normalize the clot of "hemophilia-like HWB" in a concentration dependent manner. Therefore, surprisingly, the results show that conjugation of rFIX with an antibody against TLT-1, which directs rFIX to the activated platelet surface, provides FVIII independent bridging activity resulting in improved procoagulant activity.
Ejemplo 52. Aumento de la generación de trombina por localización del rFVIIa en la superficie de plaquetas activadas mediante la unión al TLT-1 expresado en la superficie en condiciones similares a hemofilia A.Example 52. Increased thrombin generation by localizing rFVIIa on the surface of activated platelets by binding to surface-expressed TLT-1 under conditions similar to hemophilia A.
El FVIIa-Fab9015, FVIIa-Fab1029 y FVIIa-Fab1001 a 25 nM se analizaron en un ensayo de generación de trombina. En resumen, se obtuvo plasma rico en plaquetas humano (PRP) mediante centrifugación de sangre total humana con citrato a 220 g durante 20 min. Se recogió la fase superior que contiene plaquetas y la muestra restante se centrifugó a 2500 g durante 10 min para obtener el plasma pobre en plaquetas (PPP) usado para ajustar la concentración de plaquetas hasta una concentración final de 150000 plt/jl. El PRP se hizo hemofílico mediante incubación durante 30 min con un anticuerpo policlonal anti-FVIII humano de cabra (0,1 mg/ml) (HTI núm. Z0429). Las plaquetas se activaron con una combinación del péptido de activación del receptor-1 (PAR-1) activado por proteasa (SFLLRN; Bachem núm. H-2936) (30 jM ) y el veneno de serpiente activador de GPVI Convulxina (100 ng/ml) (Pentapharm núm. 119-02). La trombina generada se midió mediante el uso de un método fluorogénico de Thrombinoscope® en el cual el PRP, el reactivo de FluCa y el compuesto de prueba se mezclaron y añadieron a placas de pocillo de fondo redondo Nunc Microwell de 96 pocillos (Nunc núm. 268152). La reacción se inició por la adición de activadores de plaquetas y la señal fluorescente del sustrato se detectó en un lector de placas ThermoFisher Fluoroskan (Fisher Scientific). La concentración de trombina se calculó mediante el uso de un calibrador de trombina proporcionado por Thrombinoscope® de acuerdo con sus instrucciones.FVIIa-Fab9015, FVIIa-Fab1029 and FVIIa-Fab1001 at 25 nM were analyzed in a thrombin generation assay. Briefly, human platelet rich plasma (PRP) was obtained by centrifugation of human whole blood with citrate at 220 g for 20 min. The upper platelet-containing phase was collected and the remaining sample was centrifuged at 2,500 g for 10 min to obtain the platelet poor plasma (PPP) used to adjust the platelet concentration to a final concentration of 150,000 plt / jl. PRP was made hemophilic by incubation for 30 min with a goat anti-human FVIII polyclonal antibody (0.1 mg / ml) (HTI No. Z0429). Platelets were activated with a combination of protease-activated receptor-1 (PAR-1) activation peptide (SFLLRN; Bachem # H-2936) (30 jM) and GPVI-activating snake venom Convulxin (100 ng / ml) (Pentapharm No. 119-02). Thrombin generated was measured using a Thrombinoscope® fluorogenic method in which PRP, FluCa reagent and test compound were mixed and added to 96-well Nunc Microwell round bottom well plates (Nunc no. 268152). The reaction was initiated by the addition of platelet activators and the fluorescent signal from the substrate was detected on a ThermoFisher Fluoroskan plate reader (Fisher Scientific). Thrombin concentration was calculated using a thrombin calibrator provided by Thrombinoscope® according to its instructions.
Los resultados mostraron una potencia aumentada de las tres proteínas, FVIIa-Fab9015, FVIIa-Fab1029 y FVIIa-Fab1001, en comparación con rFVIIa. El FVIIa-Fab9015 y FVIIa-Fab1001 (25 nM) mostraron una potencia de aproximadamente cuatro veces mayor mientras que FVIIa-Fab1029 (25 nM) tenía una potencia aproximadamente dos veces mayor medida como pico de generación de trombina, en comparación con rFVIIa (25 nM) (Figura 24).The results showed an increased potency of the three proteins, FVIIa-Fab9015, FVIIa-Fab1029 and FVIIa-Fab1001, compared to rFVIIa. FVIIa-Fab9015 and FVIIa-Fab1001 (25 nM) showed approximately four times greater potency while FVIIa-Fab1029 (25 nM) had approximately two times greater potency measured as thrombin generation peak, compared to rFVIIa (25 nM) (Figure 24).
Ejemplo 53. Purificación y caracterización de las proteinas de fusión FIX expresadas recombinantemente (SEQ ID NO 161), Mab y Fab FIX-anti-TLT-1 (FIX-Fab0155 y FIX-mAb0145).Example 53. Purification and characterization of the recombinantly expressed FIX fusion proteins (SEQ ID NO 161), Mab and Fab FIX-anti-TLT-1 (FIX-Fab0155 and FIX-mAb0145).
La purificación de dichas proteínas FIX se realizó mediante el uso de un método de cromatografía de afinidad de captura basado en la resina anti-FIX A3B6-Sepharose 4 FF, que es una resina (gel de afinidad base de GE Healthcare) con un anticuerpo acoplado, desarrollada en Novo Nordisk, que se une específicamente al dominio FIX Gla (ver referencia 0stergaard y otros (2011), Blood 118: 2333-41). La purificación se realizó mediante el uso de un sistema de cromatografía ÁktaExplorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112-41). Los sistemas tampón usados para la etapa de purificación fueron un tampón de equilibrado compuesto de Tris 20 mM, CaCb 1 mM, NaCl 100 mM, Tween 80 al 0,01 % (v/v) pH 7,5, un tampón de lavado compuesto de Tris 20 mM, CaCb 1 mM, NaCl 2,0 M, Tween 80 al 0,01 % (v/v) pH 7,5 y un tampón de elución compuesto de Tris 20 mM, EDTA 20 mM, NaCl 50 mM, Tween 80 al 0,01 % (v/v) pH 7,5. Los sobrenadantes celulares se ajustaron a concentración final de CaCb 5 mM y se aplicaron sobre una columna A3B6-Seph 4 FF equilibrada previamente. La columna se lavó con 5-10 volúmenes de columna de tampón de equilibrado, 5-10 volúmenes de columna de tampón de lavado y por último con 5-10 volúmenes de columna de tampón de equilibrado. Las proteínas de fusión FIX se eluyeron isocráticamente en aproximadamente 5 volúmenes de columna de tampón de elución.The purification of said FIX proteins was carried out using a capture affinity chromatography method based on the anti-FIX resin A3B6-Sepharose 4 FF, which is a resin (base affinity gel from GE Healthcare) with an antibody coupled , developed in Novo Nordisk, which specifically binds to the FIX Gla domain (see reference 0stergaard et al. (2011), Blood 118: 2333-41). Purification was performed using an ÁktaExplorer chromatography system (GE Healthcare, cat. No. 18-1112-41). The buffer systems used for the purification step were a balancing buffer composed of 20mM Tris, 1mM CaCb, 100mM NaCl, 0.01% (v / v) Tween 80 pH 7.5, a compound wash buffer 20mM Tris, 1mM CaCb, 2.0M NaCl, 0.01% (v / v) Tween 80 pH 7.5 and an elution buffer consisting of 20mM Tris, 20mM EDTA, 50mM NaCl, Tween 80 0.01% (v / v) pH 7.5. Cell supernatants were adjusted to final concentration of 5 mM CaCb and applied on a previously balanced A3B6-Seph 4 FF column. The column was washed with 5-10 column volumes of equilibration buffer, 5-10 column volumes of wash buffer and finally with 5-10 column volumes of equilibration buffer. The FIX fusion proteins were eluted isocratically in approximately 5 column volumes of elution buffer.
Las proteínas FIX se analizaron mediante el uso de SDS-PAGE/Coomassie y las determinaciones de masa molecular intacta se realizaron mediante el uso de una configuración del método de cromatografía líquida espectrometría de masa de electropulverización ionización con analizador de tiempo de vuelo en un instrumento Agilent 6210 y una columna desalinizada MassPREP (de Waters) con un tampón de equilibrado compuesto de ácido fórmico al 0,1 % en H2O grado LC-MS y un tampón de elución compuesto de ácido fórmico al 0,1 % en ACN grado LC-MS. Basado en los análisis de SDS-PAGE/Coomassie y de LC-MS de masa intacta mediante el uso de condiciones reductoras, se llevaron a cabo las identificaciones de cadena de las proteínas FIX. Basado en los análisis de SEC-HPLC, todas las preparaciones de proteína de fusión FIX mostraron una pureza de >85-99 % y parecieron altamente homogéneas. FIX proteins were analyzed using SDS-PAGE / Coomassie and intact molecular mass determinations were performed using a configuration of the liquid chromatography spectrometry method of Ionization electrospray mass with time-of-flight analyzer on an Agilent 6210 instrument and a MassPREP desalinated column (from Waters) with a balancing buffer composed of 0.1% formic acid in H2O grade LC-MS and a compound elution buffer 0.1% formic acid in ACN grade LC-MS. Based on SDS-PAGE / Coomassie and intact mass LC-MS analyzes using reducing conditions, chain identifications of FIX proteins were carried out. Based on SEC-HPLC analyzes, all FIX fusion protein preparations showed a purity of> 85-99% and appeared highly homogeneous.
Ejemplo 54. Producción del FVIIa de tipo silvestre de expresión recombinante (SEQ ID NO: 157) y FVIIa-407C (SEQ ID NO:181).Example 54. Production of recombinant expression wild type FVIIa (SEQ ID NO: 157) and FVIIa-407C (SEQ ID NO: 181).
Dicha variante y tipo silvestre de FVIIa se produjeron como se describe en la patente 02/077218 y Jurlander y otros (2001), Semin Thromb Hemost. 27:373-84. Más específicamente, las moléculas de FVIIa se expresaron en líneas celulares adherentes BHK. El medio de crecimiento empleado fue una variante del medio DMEM/F12 con vitamina K1 5 mg/l y suero bovino fetal al 10 % (2 % durante la producción). En resumen, las células se propagaron en matraces T-175 ventilados, de 2 capas y 10 capas de células incubadas a 37 °C y 5 % de CO2. En confluencia, las células se disociaron mediante el uso de TryPle™ Express (GIBCO núm. de cat. 12604-013) antes de pasar a la etapa siguiente. La fase de producción se realizó como un cultivo de lote repetido en un biorreactor de 15 l con microportadores (5 g/l, Cytodex 3, GE Life Sciences). El pH se controló en un límite superior de 7,2 mediante la adición de CO2 y en un límite inferior de 6 , 8 mediante la adición de Na2CO3. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 50 % de la saturación en el aire mediante rociado con oxígeno. La temperatura se mantuvo a 36,5 °C. La agitación fue de 50-70 rpm. Se realizaron intercambios de cosecha/medio para mantener una concentración de glutamina superior a 1 mM. Una hora antes de un intercambio medio, la agitación se detuvo para permitir que los microportadores (con las células unidas) se asentaran en la parte inferior del reactor. Después, se cosechó aproximadamente el 80 % del volumen antes de llenarlo con medio fresco hast un 100 % de volumen de trabajo. Las cosechas celulares se extrajeron y clarificaron mediante un tren de filtro que consiste de dos filtros de cápsulas desechables (Clarigard 3 pm, Opticap XL10, Millipore, núm. de cat. K030A10HH1; Durapore 0,22 pm, Opticap XL10, Millipore, núm. de cat. KVGLS10HH1) antes de la purificación.Such variant and wild type of FVIIa were produced as described in patent 02/077218 and Jurlander et al. (2001), Semin Thromb Hemost. 27: 373-84. More specifically, FVIIa molecules were expressed in BHK adherent cell lines. The growth medium used was a variant of DMEM / F12 medium with vitamin K1 5 mg / l and 10% fetal bovine serum (2% during production). Briefly, cells were propagated in ventilated 2-layer and 10-layer T-175 flasks of cells incubated at 37 ° C and 5% CO2. At confluence, cells were dissociated using TryPle ™ Express (GIBCO cat # 12604-013) before proceeding to the next step. The production phase was performed as a repeat batch culture in a 15 l bioreactor with microcarriers (5 g / l, Cytodex 3, GE Life Sciences). The pH was controlled at an upper limit of 7.2 by the addition of CO2 and at a lower limit of 6.8 by the addition of Na 2 CO 3 . The dissolved oxygen concentration was maintained above 50% of the saturation in the air by spraying with oxygen. The temperature was maintained at 36.5 ° C. Stirring was 50-70 rpm. Harvest / medium exchanges were made to maintain a glutamine concentration greater than 1 mM. One hour before a medium exchange, stirring was stopped to allow the microcarriers (with the cells attached) to settle at the bottom of the reactor. Thereafter, approximately 80% of the volume was harvested before filling with fresh medium up to 100% working volume. Cell cultures were extracted and clarified by a filter train consisting of two disposable capsule filters (Clarigard 3 pm, Opticap XL10, Millipore, cat. No. K030A10HH1; Durapore 0.22 pm, Opticap XL10, Millipore, no. cat. KVGLS10HH1) before purification.
Ejemplo 55. Aumento de la generación de trombina por localización del rFVIIa en la superficie de plaquetas activadas mediante la unión al TLT-1 expresado en la superficie en condiciones similares a hemofilia A.Example 55. Increased thrombin generation by localizing rFVIIa on the surface of activated platelets by binding to surface-expressed TLT-1 under conditions similar to hemophilia A.
Se analizó un FVIIa-Fab5001 en un ensayo de generación de trombina y se comparó con rFVIIa en plasma deficiente del factor VIII que contiene plaquetas humanas lavadas. Para aislar las plaquetas humanas, se añadió una parte de solución ACD (citrato trisódico al 2,5 %, ácido cítrico al 1,5 % y D-glucosa al 2 %) a cinco partes de sangre antes de la centrifugación a 220 g durante 20 min para obtener plasma rico en plaquetas. La fase superior se recogió y transfirió a un nuevo tubo con forma de cono y se centrifugó a 500 g durante 15 min. El plasma se eliminó y el sedimento se disolvió en tampón Hepes (Hepes 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCh 1,7 mM, D-glucosa 5 mM, NaH2PO40,4 mM; pH 6,5) suplementado con prostaglandina E1 (5 pg/ml). Después de una segunda centrifugación a 500 g durante 15 min el sobrenadante se desechó y las plaquetas lavadas se disolvieron en plasma deficiente del factor VIII (Geroge King Bio-medical, Inc.) y la concentración de plaquetas se ajustó a 300 000 plt/pl. En el ensayo de generación de trombina cuando se añadieron agonistas, variantes del Factor IX y reactivo FluCa (Thrombinoscope®) a placas de pocillo de fondo redondo Nunc Microwell de 96 pocillos junto con el plasma deficiente de Factor IX que contiene plaquetas, la concentración final de plaquetas fue de 150000 plt/pl. Las plaquetas se activaron con una combinación de péptido de activación del receptor-1 activado por proteasa (SFLLRN; Bachem núm. H-2936) y el veneno de serpiente activador de GPVI Convulxina (Pentapharm núm. 119-02). La trombina generada se midió mediante un método fluorogénico de Thrombinoscope® en el cual la señal fluorescente del sustrato escindido de la trombina se detectó en un lector de placas ThermoFisher Fluoroskan (Fisher Scientific). La concentración de trombina se calculó mediante el uso de un calibrador de trombina proporcionado por Thrombinoscope® de acuerdo con sus instrucciones. An FVIIa-Fab5001 was analyzed in a thrombin generation assay and compared to rFVIIa in factor VIII deficient plasma containing washed human platelets. To isolate human platelets, one part of ACD solution (2.5% trisodium citrate, 1.5% citric acid and 2% D-glucose) was added to five parts of blood prior to centrifugation at 220 g for 20 min to obtain platelet rich plasma. The upper phase was collected and transferred to a new cone-shaped tube and centrifuged at 500 g for 15 min. Plasma was removed and the pellet was dissolved in Hepes buffer (10mM Hepes, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 1.7mM MgCh, 5mM D-glucose, 0.4mM NaH 2 PO 4 ; pH 6 , 5) supplemented with prostaglandin E1 (5 pg / ml). After a second centrifugation at 500 g for 15 min the supernatant was discarded and the washed platelets were dissolved in factor VIII deficient plasma (Geroge King Bio-medical, Inc.) and the platelet concentration was adjusted to 300,000 plt / pl . In the thrombin generation assay when agonists, Factor IX variants, and FluCa reagent (Thrombinoscope®) were added to 96-well Nunc Microwell round-bottom well plates together with platelet-containing Factor IX deficient plasma, the final concentration platelet count was 150,000 plt / pl. Platelets were activated with a combination of protease activated receptor-1 activating peptide (SFLLRN; Bachem No. H-2936) and GPVI activator snake venom Convulxin (Pentapharm No. 119-02). The thrombin generated was measured by a Thrombinoscope® fluorogenic method in which the fluorescent signal from the cleaved thrombin substrate was detected on a ThermoFisher Fluoroskan plate reader (Fisher Scientific). Thrombin concentration was calculated using a thrombin calibrator provided by Thrombinoscope® according to its instructions.
Los resultados mostraron una potencia aumentada del FVIIa-Fab5001 en comparación con rFVIIa de tipo silvestre (Figura 25). Además, los resultados revelaron que este aumento en la potencia dependió de la activación de plaquetas. Al activar las plaquetas con una combinación de SFLLRN (30 pM) y Convulxina (100 ng/ml), el FVIIa-Fab5001 (25 nM) mostró una potencia aproximadamente cuatro veces mayor, medida como generación de máximo de trombina, en comparación con rFVIIa de tipo silvestre (25 nM).The results showed increased potency of FVIIa-Fab5001 compared to wild-type rFVIIa (Figure 25). Furthermore, the results revealed that this increase in potency depended on platelet activation. When activating platelets with a combination of SFLLRN (30 pM) and Convulxin (100 ng / ml), FVIIa-Fab5001 (25 nM) showed approximately four times greater potency, measured as thrombin maximum generation, compared to rFVIIa wild type (25 nM).
Ejemplo 56. Análisis de SPR del FVIIa-Fab1001 y unión de FVIIa-Fab5001 al TLT1.Example 56. Analysis of SPR of FVIIa-Fab1001 and binding of FVIIa-Fab5001 to TLT1.
Análisis de SPR de la unión del FVIIa-Fab1001 al TLT1. El FVIIa-Fab1001 se une al TLT-1 como se analiza mediante análisis de SPR en un instrumento Biacore T200.SPR analysis of the binding of FVIIa-Fab1001 to TLT1. FVIIa-Fab1001 binds to TLT-1 as analyzed by SPR analysis on a Biacore T200 instrument.
Los materiales usados se muestran en la Tabla 18. The materials used are shown in Table 18.
Tabla 18Table 18
Método: Un anticuerpo anti 6Xhis se inmovilizó hasta un nivel de aprox. 9000 RU en un chip CM5 (0,5 mg/ml diluido en Na-acetato, pH 5,0) mediante el uso del procedimiento estándar recomendado por el proveedor. Se usó como ligando el TLT-1 etiquetado con his humano en una concentración de 100 ng/ml. Se usó como analito el FVIIa-Fab1001 en diluciones de dos veces de 29,29 nM a 0,45 nM. El tampón de corrida y de dilución se fabricó de: HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, p20 al 0,005 %, pH 7,4. La regeneración se obtuvo mediante MgCb 3 M. El experimento se corrió a 25 grados Celsius. La determinación de constantes cinéticas y de unión (kon, koff, Kd) se obtuvo al asumir una interacción 1:1 del TLT1 y FVIIa-Fab1001 mediante el uso del programa informático de evaluación Biacore T200 (Tabla 19).Method: An anti 6Xhis antibody was immobilized to a level of approx. 9000 RU on a CM5 chip (0.5 mg / ml diluted in Na-acetate, pH 5.0) using the standard procedure recommended by the supplier. Human his tagged TLT-1 at a concentration of 100 ng / ml was used as a ligand. FVIIa-Fab1001 was used as an analyte in two-fold dilutions of 29.29 nM to 0.45 nM. The run and dilution buffer was made from: 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% p20, pH 7.4. Regeneration was obtained by 3M MgCb. The experiment was run at 25 degrees Celsius. The determination of kinetic and binding constants (kon, koff, Kd) was obtained by assuming a 1: 1 interaction of TLT1 and FVIIa-Fab1001 by using the Biacore T200 evaluation software (Table 19).
Tabla 19: Unión del FVIIa-Fab1001 al TLT-1Table 19: Binding of FVIIa-Fab1001 to TLT-1
Conclusión:Se estimaron las constantes de unión para la unión del FVIIa-Fab1001 al TLT-1 mediante análisis de SPR y se confirmó la unión al TLT-1.Conclusion: The binding constants for binding of FVIIa-Fab1001 to TLT-1 were estimated by SPR analysis and binding to TLT-1 was confirmed.
Análisis de SPR de la unión del FVIIa-Fab5001 al TLT1. El FVIIa-Fab5001 se une al TLT-1 como se analiza mediante análisis de SPR en un instrumento Biacore T200.SPR analysis of the binding of FVIIa-Fab5001 to TLT1. The FVIIa-Fab5001 binds to the TLT-1 as analyzed by SPR analysis on a Biacore T200 instrument.
Los materiales usados se muestran en la Tabla 20.The materials used are shown in Table 20.
Tabla 20Table 20
Método: Un anticuerpo anti 6Xhis se inmovilizó hasta un nivel de aprox. 9000 RU en un chip CM5 (0,5 mg/ml diluido en Na-acetato, pH 5,0) mediante el uso del procedimiento estándar recomendado por el proveedor. Se usó como ligando el TLT-1 etiquetado con his humano en una concentración de 100 ng/ml. Se usó como analito el FVIIa-Fab5001 en diluciones de dos veces de 15,77 nM a 0,49 nM. El tampón de corrida y de dilución se fabricó de: HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, p20 al 0,005 %, pH 7,4. La regeneración se obtuvo mediante MgCl23 M. El experimento se corrió a 25 grados Celsius. La determinación de constantes cinéticas y de unión (kon, koff, Kd) se obtuvo al asumir una interacción 1:1 del TLT1 y FVII-fab mediante el uso del programa informático de evaluación Biacore T200 (Tabla 21).Method: An anti 6Xhis antibody was immobilized to a level of approx. 9000 RU on a CM5 chip (0.5 mg / ml diluted in Na-acetate, pH 5.0) using the standard procedure recommended by the supplier. Human his tagged TLT-1 at a concentration of 100 ng / ml was used as a ligand. FVIIa-Fab5001 was used as an analyte in two-fold dilutions of 15.77 nM to 0.49 nM. The run and dilution buffer was made from: 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% p20, pH 7.4. Regeneration was obtained by MgCl23 M. The experiment was run at 25 degrees Celsius. The determination of kinetic and binding constants (kon, koff, Kd) was obtained by assuming a 1: 1 interaction of TLT1 and FVII-fab using the Biacore T200 evaluation software (Table 21).
Tabla 21: Unión del FVIIa-Fab5001 al TLT-1Table 21: Union of the FVIIa-Fab5001 to the TLT-1
Conclusión:Se estimaron las constantes de unión para la unión del FVIIa-Fab5001 al TLT-1 mediante análisis de SPR y se confirmó la unión al TLT-1.Conclusion: The binding constants for binding of FVIIa-Fab5001 to TLT-1 were estimated by SPR analysis and binding to TLT-1 was confirmed.
Ejemplo 57: Producción recombinante del FVIII humano.Example 57: Recombinant production of human FVIII.
La producción de las variantes del Factor VIII humano como se usa en la presente descripción se ha descrito en la patente número WO2009108806, ejemplo 1. The production of variants of human Factor VIII as used in the present description has been described in patent number WO2009108806, example 1.
ResumenSummary
La presente invención se refiere a: proteínas procoagulantes que pueden ser, por ejemplo, proteínas de fusión o conjugados químicos; métodos para producir dichas proteínas procoagulantes; polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión y células que las expresan. Además, la presente invención se refiere a proteínas procoagulantes para su uso como un medicamento. Los individuos que tienen una coagulopatía, tal como la hemofilia A y B con o sin inhibidores, pueden ser tratadas con proteínas procoagulantes de la presente invención. The present invention relates to: procoagulant proteins which may be, for example, fusion proteins or chemical conjugates; methods of producing such procoagulant proteins; polynucleotides that encode said fusion proteins and cells that express them. Furthermore, the present invention relates to procoagulant proteins for use as a medicine. Individuals who have coagulopathy, such as hemophilia A and B with or without inhibitors, can be treated with procoagulant proteins of the present invention.
Claims (15)
Applications Claiming Priority (3)
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