ES2752323T3 - Partículas de tipo virus que comprenden proteínas diana fusionadas a proteínas de revestimiento de virus vegetales - Google Patents

Partículas de tipo virus que comprenden proteínas diana fusionadas a proteínas de revestimiento de virus vegetales Download PDF

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Abstract

Una partícula de tipo virus que consiste en una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión comprende (a) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a la de una proteína de revestimiento del virus del mosaico de alfalfa, en la que la proteína de revestimiento tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y (b) una proteína diana, en la que la proteína diana proviene de una proteína de superficie de un organismo patógeno intracelular que es adecuada para su uso en vacunas, y en la que la partícula de tipo virus contiene menos del 10 % en peso de ácido nucleico.

Description

DESCRIPCIÓN
Partículas de tipo virus que comprenden proteínas diana fusionadas a proteínas de revestimiento de virus vegetales
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una partícula de tipo virus que consiste en una proteína de fusión, a una composición inmunogénica que comprende la partícula de tipo virus y la partícula de tipo virus para su uso en la inducción de una respuesta inmune protectora contra un organismo patógeno intracelular en un sujeto.
Antecedentes de la invención
Los virus vegetales pueden ser herramientas eficaces para la producción y la administración. Se ha expresado una variedad de importantes antígenos proteicos en plantas transgénicas, pero el nivel de proteína antigénica producida ha sido relativamente bajo. En un intento por superar este problema, las proteínas de revestimiento de virus vegetales se han diseñado para actuar como moléculas transportadoras de péptidos antigénicos fusionados y se utilizan en sistemas de expresión transitorios. Las proteínas de revestimiento tienen el potencial de autoensamblarse y formar partículas de virus recombinantes que muestran los epítopos antigénicos deseables o polipéptidos extraños en sus superficies. Debido a que los virus recombinantes se replican en el citoplasma, los epítopos antigénicos deseables o los polipéptidos extraños pueden no presentarse adecuadamente debido a modificaciones inadecuadas a nivel postraduccional o plegamiento incorrecto. Se ha demostrado que los antígenos producidos en plantas como resultado de la infección con virus del mosaico del tabaco recombinante (TMV) o virus del mosaico del caupí generan anticuerpos específicos cuando se inyectan en ratones. Sin embargo, en estos sistemas, los virus no pudieron ensamblarse cuando los péptidos de más de 25 aminoácidos de longitud se fusionaron con sus proteínas de revestimiento. En un sistema diferente, La fusión de polipéptidos de hasta 47 aminoácidos de longitud con la proteína de la revestimiento del virus del mosaico de la alfalfa (AIMV) no inhibió el ensamblaje vírico y las partículas víricas resultantes que contenían ácidos nucleicos víricos fueron inmunógenos eficaces. (Yusibov, V., y col., PNAS 94: 5784-5788, 1997). Más recientemente, se ha desarrollado un procedimiento para unir un fragmento funcional de la proteína A (133 aa) al extremo C-terminal de la proteína de revestimiento del TMV utilizando un enlazador peptídico de 15 aa. Las construcciones víricas resultantes pudieron ensamblarse en partículas víricas que fueron capaces de infectar el tejido de la hoja y moverse por todo el tejido. (Werner, S., y col., PNAS 103: 17678-17683, 2006). Sin embargo, todos estos sistemas producen partículas víricas infecciosas que contienen ARN vírico. El uso de tales partículas para provocar una respuesta inmune protectora, es decir, como una vacuna, requeriría inocular al sujeto con ARN vírico así como con el inmunógeno intencionado.
Sigue existiendo la necesidad de procedimientos y materiales para presentar un epítopo antigénico deseable o un polipéptido extraño en la superficie de partículas de tipo virus para la inmunización en donde las partículas de tipo virus están sustancialmente libres de ácido nucleico vírico.
Sumario de la invención
La materia objeto desvelada de la presente invención proporciona partículas de tipo virus, así como procedimientos para su uso y la preparación de partículas de tipo virus.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una partícula de tipo virus. La partícula de tipo virus consiste en una proteína de fusión y está sustancialmente libre de ácido nucleico, en la que la proteína de fusión comprende una proteína de revestimiento de virus vegetal y una proteína diana. La partícula de tipo virus puede producirse en una célula hospedadora seleccionada del grupo que consiste en células bacterianas, fúngicas, vegetales, de insecto, de anfibio y de mamífero. La proteína diana puede fusionarse con el extremo N-terminal de la proteína de revestimiento del virus vegetal.
La proteína de revestimiento del virus vegetal puede provenir de una proteína de revestimiento de un virus vegetal del virus del mosaico de la alfalfa.
La proteína diana puede provenir de un polipéptido de un patógeno intracelular. La proteína diana puede provenir de un polipéptido de la superficie celular de Plasmodium falciparum, o de un polipéptido de hemaglutinina de un virus de la gripe. El virus de la gripe puede ser un virus de la gripe A seleccionado del grupo que consiste en H1N1, H3N2, H5N1 y H7N7. El virus de la gripe también puede ser un virus de la gripe B. La proteína diana puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-11 y 49, y fragmentos antigénicos de las mismas.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición inmunogénica. La composición inmunogénica comprende la partícula de tipo virus. La composición inmunogénica puede comprender además un adyuvante. El adyuvante puede seleccionarse del grupo que consiste en sales de aluminio, emulsiones de aceite y agua, y adyuvantes a base de saponina. En algunas realizaciones, la proteína de revestimiento del virus vegetal proviene de una proteína de revestimiento del virus del mosaico de alfalfa, mientras que la proteína diana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-11 y 49, y fragmentos antigénicos de las mismas.
Se proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmune protectora contra un patógeno intracelular en un sujeto. El procedimiento comprende administrar al sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de una primera composición que comprende una primera partícula de tipo virus, en la que la primera partícula de tipo virus comprende una primera proteína de fusión y está sustancialmente libre de ácido nucleico, y en la que la primera proteína de fusión comprende una proteína de revestimiento de virus vegetal y una primera proteína diana que proviene del primer patógeno intracelular. En algunas realizaciones, la proteína de revestimiento del virus vegetal proviene de una proteína de revestimiento de un virus de mosaico de alfalfa, mientras que la primera proteína diana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-11 y 49, y fragmentos antigénicos de las mismas. En algunas otras realizaciones, la composición comprende además un adyuvante.
El procedimiento puede comprender además administrar al sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de una segunda composición que comprende una segunda partícula de tipo virus antes de administrar la primera composición, en la que la segunda partícula similar al virus comprende una segunda proteína de fusión y está sustancialmente libre de ácido nucleico, y en la que la segunda proteína de fusión comprende la proteína de revestimiento del virus vegetal y una segunda proteína diana. La segunda proteína diana puede provenir de un segundo patógeno intracelular que no es el primer patógeno intracelular. En algunas realizaciones, el primer patógeno intracelular diana puede ser un virus de la gripe, la proteína de revestimiento del virus vegetal proviene de una proteína de revestimiento de un virus de mosaico de alfalfa, la primera proteína diana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-11, y la segunda proteína diana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 5 y 49. En particular, la primera y segunda proteínas diana pueden comprender secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 6 y 4, respectivamente.
También se proporciona un procedimiento para producir una partícula de tipo virus en una célula hospedadora que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión en la que la partícula de tipo virus comprende la proteína de fusión y está sustancialmente libre de ácido nucleico, y la proteína de fusión comprende una proteína de revestimiento de virus vegetal y una proteína diana. El procedimiento comprende expresar la proteína de fusión en la célula hospedadora en condiciones que permitan el ensamblaje de la partícula de tipo virus en la célula hospedadora. El procedimiento puede comprender además purificar la partícula de tipo virus de la célula hospedadora.
En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula seleccionada del grupo que consiste en células bacterianas, fúngicas, vegetales, de insecto, de anfibio y de mamífero. Cuando la célula hospedadora es una célula vegetal, el procedimiento puede comprender además infectar la célula vegetal con una bacteria recombinante capaz de infectar la célula vegetal, en la que la bacteria recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión.
En algunas otras realizaciones, la proteína diana proviene de un patógeno intracelular.
En algunas otras realizaciones más, la proteína de revestimiento del virus vegetal proviene de una proteína de revestimiento de un virus de mosaico de alfalfa y la proteína diana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-11 y 49, y fragmentos antigénicos de las mismas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra esquemáticamente la fusión de una proteína de revestimiento de virus vegetal con una proteína diana y el autoensamblaje de la proteína de fusión en una partícula de tipo virus.
La Figura 2 muestra (A) un ejemplo de construcción génica que comprende una proteína de fusión (construcción de CP-fusión) y una secuencia señal (PR1a); (B) clonar la construcción de CP-fusión en el vector de expresión pGR-D4; y (C) clonar la construcción de CP-fusión en el vector de expresión pB1121. LD y LI representan los límites derecho e izquierdo del área introducida en una célula vegetal por un Agrobacterium recombinante.
La Figura 3 muestra micrografías electrónicas de transmisión de partículas de tipo virus formadas por una proteína de fusión de una proteína de recubrimiento de AIMV a Pfs25 de Plasmodium falciparum (paneles superiores), Pfs28 (paneles centrales), o proteína diana HA3A del virus de la gripe (paneles inferiores). Las partículas de tipo virus se tiñeron negativamente (paneles de la izquierda) y se marcaron con anticuerpos específicos marcados con inmunogold para cada proteína diana respectiva (paneles de la derecha). Barra = 100 nm o 200 nm como se marca. Las Figuras 4A y 4B muestran inmunotransferencias de proteínas de fusión purificadas de proteína de revestimiento de AIMV fusionadas con (A) Pfs25 o (B) HA3A. La mitad derecha de cada transferencia se incubó con un anticuerpo contra AIMV. La mitad izquierda de cada transferencia se incubó con un anticuerpo monoclonal contra (A) Pfs25 o (B) HA3A. La Figura 4C es una inmunotransferencia de extracto crudo de proteínas vegetales que contiene la proteína de revestimiento de AIMV fusionada con la proteína diana de hemaglutinina HAA de longitud completa extraída en diferentes condiciones para evaluar la solubilidad. La transferencia se hizo reaccionar con un anticuerpo monoclonal anti-HAA. PST = proteína soluble total; PST-T = proteína soluble extraída de tritón; PT = proteína total.
La Figura 5A muestra respuestas de IgG anti-A/Anhui/1/05 en muestras de suero de ratones 28 o 56 días después de la inmunización con VLP que contienen HA3A-CPF ("CPF" designa "fusión de proteína de revestimiento") con o sin un adyuvante, QUIL A™ o ALHYDROGEL™ o Ha A 1 con QUIL A™. La Figura 5B muestra las respuestas de anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (HI) en suero en muestras de suero de los mismos ratones que en la Figura 5A.
La Figura 6 muestra los títulos de IgG en sueros recogidos de ratones 56 días después de la inmunización con VLP que contienen Pfs25-CPF o Pfs28-CPF, con o sin adyuvante, QUIL A™ o ALHYDROGEL™.
La Figura 7 muestra títulos de isotipos de IgG anti-A/Indonesia/5/05 en muestras de suero recogidas de ratones 35 días después de la inmunización con VLP de HAI3-CPF o HAI1, con o sin ALHYDROGEL ™, o solo CP. La Figura 8 muestra las respuestas de anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (HI) del suero en muestras de suero de ratones después de la inmunización con VLP de HAI3-CPF o HAI1, con o sin ALHYDROGEL ™, o solo CP.
Las Figuras 9A y 9B muestran respuestas de anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (HI) en suero contra A/Anhui/1/05 en muestras de suero de ratones después de una vacunación primaria con VLP de Pfs25-CPF o PBS, con o sin ALHYDROGEL™, y una vacuna secundaria con PBS o VLP de HA3A-CPF, con o sin ALHYDROGEL™.
Descripción detallada de la invención
La presente invención generalmente se refiere a partículas de tipo virus (VLP, del inglés Virus Like Partióles) que comprenden una proteína de fusión que está sustancialmente libre de ácido nucleico, y a procedimientos para usar y preparar las VLP.
La expresión "partícula de tipo virus" o "VLP" usada en el presente documento se refiere a un armazón vírico no replicativo que proviene de un virus, por ejemplo, un virus vegetal como se analiza a continuación. Las VLP generalmente están compuestas de al menos una proteína vírica (por ejemplo, proteínas de la cápside, de revestimientos, del armazón, de la superficie o de la envoltura), que se pueden formar de manera espontánea tras la expresión de la proteína vírica en una variedad de células hospedadoras adecuadas, por ejemplo, células bacterianas, fúngicas, vegetales, de levadura, de insecto, de anfibio y de mamífero. La presencia de las VLP puede detectarse utilizando técnicas convencionales conocidas en la técnica (por ejemplo, microscopía electrónica, dispersión dinámica de la luz y cromatografía de exclusión por tamaño). Las VLP también pueden aislarse utilizando técnicas convencionales en la materia (por ejemplo, centrifugación por gradiente de densidad, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de afinidad).
Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan en el presente documento de manera intercambiable, y se refieren a un polímero de restos de aminoácidos sin limitación con respecto a la longitud mínima del polímero. La definición incluye proteínas de longitud completa y fragmentos de las mismas, así como sus modificaciones (por ejemplo, glucosilación, fosforilación, deleciones, adiciones y sustituciones).
La expresión "que proviene de" usada en el presente documento se refiere al origen o fuente, y puede incluir moléculas de origen natural, recombinantes, no purificadas o purificadas.
El término "fragmento" de una proteína como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es la misma que una parte, pero no toda, la secuencia de aminoácidos de la proteína.
El término "variante" de una proteína como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de la proteína, excepto que tiene al menos un aminoácido modificado, por ejemplo, delecionado, insertado o sustituido. La variante puede tener una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, el 90 %, el 95 % o el 99 %, preferentemente al menos aproximadamente el 90 %, lo más preferentemente al menos aproximadamente el 95 %, idéntica a la secuencia de aminoácidos de la proteína.
El término "antígeno", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos (lineales y/o conformacionales) que son capaces de estimular el sistema inmunológico de un sujeto para que produzca una respuesta específica de antígeno humoral y/o celular. Una respuesta inmune humoral se refiere a una respuesta inmune mediada por anticuerpos producidos por linfocitos B, o células B, mientras que una respuesta inmune celular se refiere a una respuesta inmune mediada por linfocitos T, o células T, y/u otros glóbulos blancos. En general, un epítopo de células B contiene al menos aproximadamente 5 aminoácidos, pero puede ser de 3-4 aminoácidos, mientras que un epítopo de células T incluye al menos aproximadamente 7-9 aminoácidos y un epítopo de linfocitos T colaboradores incluye al menos 12-20 aminoácidos. Un antígeno puede provenir de una proteína (por ejemplo, una proteína de superficie) de un organismo o patógeno intracelularmente patógeno.
La expresión "composición inmunogénica" tal como se usa en el presente documento se refiere a una composición que comprende una molécula antigénica y es capaz de provocar una respuesta específica de antígeno humoral y/o celular en un sujeto tras la administración de la composición al sujeto.
El término "sujeto", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un mamífero, preferentemente a un ser humano.
El término "aproximadamente" tal como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, un porcentaje y similares, pretenden abarcar variaciones de ± el 20% o ± el 10%, más preferentemente ± el 5 %, incluso más preferentemente ± el 1 % y aún más preferentemente ± el 0,1 % del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los procedimientos desvelados.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una partícula de tipo virus (VLP). La VLP consiste en una proteína de fusión y está sustancialmente libre de ácido nucleico, en la que la proteína de fusión comprende una proteína de revestimiento de virus vegetal y una proteína diana. La Figura 1 demuestra esquemáticamente que la fusión de una proteína diana con una proteína de revestimiento de virus vegetal da como resultado el ensamblaje de una VLP que presenta la proteína diana en la superficie de la VLP.
La proteína de revestimiento del virus vegetal puede provenir de una proteína de revestimiento de cualquier virus que sea capaz de autoensamblarse en partículas sustancialmente libres de ácido nucleico. La proteína de revestimiento del virus vegetal puede ser una proteína de revestimiento de longitud completa, o un fragmento funcional o variante de la misma. Los ejemplos de proteínas de revestimiento del virus vegetal adecuadas incluyen proteínas que provienen de proteínas de revestimiento del virus del mosaico de alfalfa (AIMV-CP, CP o CPF), del virus Y de la patata (Stram, y col., Virus Research 28: 29-35, 2002) y del virus del mosaico John-songrass (Jagadish, y col., J. Gen. Virol. 74: 893­ 896, 1993).
La secuencia de aminoácidos de una proteína de revestimiento puede modificarse genéticamente para mejorar el ensamblaje de partículas o la inmunogenicidad. Los aminoácidos de la proteína de revestimiento se pueden delecionar, insertar o sustituir, siempre que la variante resultante de la proteína de revestimiento conserve la capacidad de ensamblarse en una partícula en ausencia de ácido nucleico cuando se fusiona con una proteína diana. Un fragmento o variante de una proteína de revestimiento es funcional cuando el fragmento o variante es capaz de autoensamblarse en una partícula que está sustancialmente libre de ácido nucleico. Por ejemplo, la proteína representada por la SEQ ID NO: 1 carece de la primera metionina (del codón de inicio) de la secuencia natural de AIMV-CP, y la SEQ ID NO: 2 es un fragmento truncado de la secuencia de AIMV-CP a la que le faltan los primeros 25 aminoácidos de la secuencia proteica natural.
Las proteínas diana pueden provenir de cualquier antígeno o polipéptido deseable de cualquier origen. Pueden tener al menos aproximadamente 6, 10, 50, 100, 200, 300 o 500 aminoácidos. Las proteínas diana preferidas provienen de proteínas de superficie de organismos patógenos intracelulares, por ejemplo, organismos bacterianos, víricos, fúngicos y parásitos que son adecuados para su uso en vacunas. Los ejemplos de organismos víricos incluyen Plasmodium falciparum y los virus de la gripe. Los virus de la gripe incluyen varias cepas de virus de la gripe A (por ejemplo, H1N1, H3N2, H5N1 y H7N7) y los virus de la gripe B. Una proteína diana que proviene de una proteína de superficie puede ser la proteína de superficie de longitud completa o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, la proteína diana puede provenir de un polipéptido de la superficie celular de Plasmodium falciparum, o de un polipéptido de hemaglutinina de un virus de la gripe.
Para su uso en una vacuna, los fragmentos o variantes preferidos son aquellos que son antigénicos, es decir, capaces de inducir una respuesta inmune protectora en un sujeto. Los fragmentos o variantes tienen al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos de longitud. Cualquier proteína, fragmento de proteína, 0 variante de proteína puede usarse como una proteína diana, siempre que las partículas sustancialmente libres de ácido nucleico se autoensamblen cuando se fusionan con una proteína de revestimiento del virus vegetal. Algunos ejemplos de proteínas diana se describen mediante las SEQ ID NO: 4-19 y 23-49 en el Listado de Secuencias.
La proteína diana de fusión puede comprender además una secuencia señal para dirigir la proteína de fusión a un sitio particular en una célula hospedadora (por ejemplo, RE, cloroplasto) o para dirigir la secreción extracelular de la proteína de fusión. La ausencia de un péptido señal da como resultado la traducción de las proteínas en el citoplasma. Se puede utilizar cualquier secuencia de señal apropiada para la célula hospedadora, o se puede omitir la secuencia señal. Se ha descubierto que las secuencias señal se conservan en filos y reinos, y, en general, se puede usar casi cualquier secuencia señal. Bennett y Scheller, PNAS 90: 2559-2563, 1993; Luirink y Sinning, Biochim. Biophys. Acta 1694: 17-35, 2005; Doudna y Batey, Ann. Rev. Biochem. 73: 539-557, 2004; Stern y col., Trends in Cell and Mol. Biol.
2: 1-17, 2007. En una realización para la expresión en un tejido vegetal, una secuencia señal preferida es la proteína 1 relacionada con la patogénesis vegetal (PR-1) de Nicotiana tabacum (SEQ ID NO: 3).
Las proteínas de fusión se pueden preparar utilizando procedimientos convencionales de clonación y biología molecular, por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo 1. Una construcción ejemplar que contiene secuencias codificantes para una proteína de revestimiento de virus vegetal y una proteína diana puede prepararse y subclonarse en un vector de expresión (Figura 2). La proteína diana puede fusionarse con la proteína de revestimiento del virus vegetal directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un enlazador peptídico). Por ejemplo, la proteína diana puede fusionarse al extremo N-terminal de la proteína de revestimiento del virus vegetal colocando la secuencia codificante para la proteína diana en el extremo 5' de la secuencia codificante de la proteína vírica vegetal (Figura 2). La construcción de expresión puede incluir opcionalmente una secuencia señal para dirigir la localización o secreción de la proteína de fusión. El vector de expresión puede introducirse en un sistema de expresión adecuado para la expresión de la proteína de fusión en una célula hospedadora usando técnicas de convención conocidas en la materia (por ejemplo, transfección, transducción, infección y electroporación). Se puede usar cualquier sistema de expresión apropiado para una célula hospedadora seleccionada, incluyendo plásmidos y vectores víricos. Las células hospedadoras adecuadas pueden incluir células bacterianas, de mamífero, vegetales, fúngicas, de anfibio y de insectos. El uso de plásmidos y vectores víricos para la expresión de las proteínas de fusión en células vegetales se describe en los Ejemplos 1-3. También se pueden crear organismos transgénicos para producir las proteínas de fusión. Los vectores y procedimientos de expresión apropiados para producir proteínas recombinantes en estos sistemas hospedadores y para aislar y purificar las proteínas recombinantes son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la serie "Practical Approach" publicada por Oxford University Press, que incluye Protein Expression, a Practical Approach, S.J. Higgins y B.D. Hames, Eds., 1999; Molecular Plant Biology Vol. 1 y 2, P.M. Gilmartin y C. Bowler, Eds., 2002; Protein Purification Techniques, A Practical Approach, S. Roe, Ed., 2001; y la serie "Methods in Molecular Biology/Medicine" publicada por Humana Press, que incluye Transgenic Plants: Methods and Protocols, Leandro Pena, Ed., 2004; Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols, D.W. Murhammer, Ed., 2007; y Adenovirus Methods and Protocols, Vol. 1 y 2, W.S.M. Wold y A.E. Tollefson, Eds., 2007.
La invención también abarca un polinucleótido aislado que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína de revestimiento de virus vegetal y una proteína diana. Los polinucleótidos pueden obtenerse por cualquier medio apropiado conocido en la materia. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de una proteína diana o de un fragmento o variante de la misma, o la secuencia de nucleótidos de una proteína de revestimiento o de un fragmento o variante de la misma ya puede ser conocida o puede determinarse mediante el rastreo de una biblioteca y la secuenciación de una posible proteína diana o de revestimiento. Como alternativa, la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión particular puede retrotraducirse para obtener secuencias de nucleótidos apropiadas y los nucleótidos correspondientes pueden prepararse sintéticamente.
Las VLP de la presente invención son especialmente ventajosas para la presentación de antígenos. Las VLP son altamente inmunógenas. Además, las VLP están sustancialmente libres de ácido nucleico. Por ejemplo, las partículas pueden aparecer vacías tal como se visualizan, por ejemplo, por MET y tinción negativa. Las partículas pueden contener menos de aproximadamente el 10 %, el 5 %, el 1 % o el 0,1 %, preferentemente menos de aproximadamente el 5 %, más preferentemente menos de aproximadamente el 1 %, de ácido nucleico en peso. Por consiguiente, proporcionan vacunas seguras y eficaces contra patógenos víricos, bacterianos y eucarióticos.
Se proporciona una composición inmunogénica que comprende las VLP. La composición inmunogénica es capaz de inducir una respuesta inmune (es decir, una respuesta humoral y/o celular) contra la proteína diana en un sujeto tras la administración de la composición al sujeto. En algunas realizaciones, la proteína diana proviene de un patógeno intracelular, y la composición inmunogénica es capaz de generar una respuesta inmune protectora al patógeno en un sujeto tras la administración de la composición al sujeto.
La composición inmunogénica puede formularse como composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de las VLP, un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de las VLP requerida para presentar un efecto inmunopotenciador detectable. La cantidad eficaz dependerá de la vía de administración, la naturaleza de la formulación y la condición del sujeto. Un intervalo adecuado de "cantidad efectiva" puede ser de 0,001 a 100 |jg de partículas de tipo virus (o partículas de proteínas de fusión) por kg de peso corporal del sujeto. Los vehículos, diluyentes y excipientes adecuados son conocidos en la materia e incluyen, pero sin limitación, solución salina, tampón salino, manitol, L-histidina, polisorbato 80, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La composición puede contener opcionalmente un adyuvante. Los adyuvantes apropiados incluyen sales de aluminio (por ejemplo, Alhydrogel ™), emulsiones de aceite y agua y adyuvantes a base de saponina (Quil A™).
La composición inmunogénica puede formularse para administración oral, anal, transdérmica, nasal, mucosal o parenteral. La administración parenteral incluye la inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal e intravenosa.
También se proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmune protectora contra un primer patógeno intracelular en un sujeto. El procedimiento comprende administrar al sujeto una primera composición inmunogénica que comprende una primera partícula de tipo virus, en la que la primera partícula de tipo virus comprende una primera proteína de fusión y está sustancialmente libre de ácido nucleico, y en la que la primera proteína de fusión comprende una proteína de revestimiento de virus vegetal y una primera proteína diana que proviene del primer patógeno intracelular. La composición puede comprender además un adyuvante.
El procedimiento puede comprender además, antes de administrar la primera composición inmunogénica, administrar al sujeto una segunda composición inmunogénica que comprende una segunda partícula de tipo virus, en la que la segunda partícula similar al virus comprende una segunda proteína de fusión y está sustancialmente libre de ácido nucleico, y en la que la segunda proteína de fusión comprende la proteína de revestimiento del virus vegetal y una segunda proteína diana. La segunda proteína diana puede provenir de un segundo patógeno intracelular que no es el primer patógeno intracelular. En algunas realizaciones, el patógeno intracelular diana es una cepa de un virus de la gripe mientras que la primera proteína diana proviene de un patógeno intracelular diferente (por ejemplo, un parásito de la malaria, Plasmodium falciparum) o una cepa diferente del virus de la gripe. Por ejemplo, el patógeno diana es un virus de la gripe, la proteína de revestimiento del virus vegetal proviene de una proteína de revestimiento de un virus de mosaico de alfalfa, la primera proteína diana comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 u 11, y la segunda proteína diana comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, 5 o 49.
Se proporciona además un procedimiento para producir la VLP en una célula hospedadora. El procedimiento comprende expresar una proteína de fusión, que comprende una proteína del revestimiento del virus vegetal y una proteína diana, en una célula hospedadora que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión en condiciones que permiten el ensamblaje de la partícula de tipo virus (VLP) en la célula hospedadora. Por ejemplo, la VLP puede ensamblarse en un tejido vegetal aproximadamente 3-7 días después de que la planta se infiltre con un vector de expresión que lleva la construcción de fusión correspondiente. La VLP comprende la proteína de fusión y está sustancialmente libre de ácido nucleico. El procedimiento puede comprender además purificar la VLP de la célula hospedadora. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células bacterianas, fúngicas, vegetales, de insecto, de anfibio y de mamífero. La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión puede o no integrarse en el genoma de la célula hospedadora. Cuando la célula hospedadora es una célula vegetal, el procedimiento puede comprender además infectar la célula vegetal con una bacteria recombinante capaz de infectar la célula vegetal (por ejemplo, la cepa GV3101 de A. tumefaciens y otras cepas infecciosas de A. tumefaciens y cepas infecciosas de A. rhizogenes), en la que la bacteria recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión.
La preparación y el ensayo de proteínas de fusión ejemplares que comprenden proteínas diana que provienen de un parásito de la malaria, Plasmodium falciparum, un virus de la gripe A/Anhui/1/2005 (H5N1) y un virus de la gripe A/Indonesia/5/2005 (H5N1) se describen en los ejemplos a continuación. Cuando estas proteínas diana se fusionaron con la proteína de revestimiento del AIMV, las proteínas de fusión resultantes se ensamblaron en VLP aparentemente vacías. Estas partículas se unen a anticuerpos específicos para AIMV y específicos para las proteínas diana. Los sueros de ratones inmunizados con las VLP que contienen las proteínas diana de la malaria produjeron altos títulos de anticuerpos de unión a parásitos y fueron capaces de prevenir la transmisión del parásito en mosquitos (Tablas 2 y 3). Los ratones inmunizados con VLP que contienen las proteínas de la gripe produjeron niveles protectores de títulos de anticuerpos como se describe en los Ejemplos 4 y 8, y se muestra en las Figuras 5, 7 y 8. La inmunidad preexistente contra una proteína de revestimiento de virus vegetal no interfirió con los niveles protectores de los títulos de anticuerpos en ratones inmunizados con VLP que contienen la misma proteína de revestimiento del virus vegetal tal como se describe en el Ejemplo 9 y se muestra en la Figura 9.
Ejemplo 1. Construcción de un vector heterólogo para la expresión de proteínas de fusión AIMV-CP
Los genes diana incluían proteínas de la superficie celular específicas para diferentes etapas sexuales del parásito de la malaria, P. falciparum, (Pfs25 (SEQ ID NO: 4), Pfs28 (SEQ ID NO: 5) y Pfs230 (SEQ ID NO: 49)), el dominio globular de la hemaglutinina (HA) de la cepa Anhui del virus de la gripe (HA3A (SEQ ID NO: 6)), el dominio globular de HA de las cepas de California del virus de la gripe (HA3CO4 (SEQ ID No : 7) y HA3C06 (Se Q ID NO: 8)), el dominio globular de HA de las cepas de Indonesia del virus de la gripe (HA3I (SEQ ID NO: 11)), HA de longitud completa de la cepa Anhui (HAA o HAA1 (SEQ ID NO: 9)) y HA de longitud completa de la cepa de Indonesia (HAI o HAI1 (SEQ ID NO: 10)). Cada gen diana se clonó, utilizando procedimientos convencionales de biología molecular, como una fusión N-terminal a la proteína de revestimiento del AIMV (AIMV-CP, CP o CPF) o la proteína de revestimiento del AIMV optimizada (CPO), que está codificada por una secuencia codificante optimizada para la expresión en plantas, en un vector lanzadera con enzimas de restricción PacI y BsmBI. La Figura 2 muestra una estructura ejemplar de las construcciones de proteínas de fusión. Las secuencias se verificaron por secuenciación automática.
Cada secuencia de diana-CP se subclonó luego en un vector de expresión, que opcionalmente codifica el péptido señal de la proteína 1 relacionada con la patogénesis de la planta (PR-1) (SEQ ID NO: 3). Específicamente, la secuencia se subclonó en los sitios BamHI-SacI de pB1121 (Clontech), o en los sitios PacI-XhoI de pGRD4 (descritos en Shoji, y col., Vaccine 27: 108701092, 2009). La estrategia de clonación se muestra en la Figura 2.
Ejemplo 2. Infiltración de plantas con vectores de expresión que llevan construcciones de fusión
Los vectores de expresión producidos en el Ejemplo 1 se introdujeron luego en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens y las bacterias resultantes se cultivaron durante una noche en medio mínimo. Se determinó la densidad óptica de los cultivos y la cepa de expresión de proteínas se mezcló con una cepa de Agrobacterium que expresa el supresor de la proteína silenciadora, p19, en una proporción de 4:1 a una DO final de 0,5. La solución de Agrobacterium se introdujo por infiltración manual en las partes aéreas de plantas Nicotiana benthamiana de 6 semanas de edad, cultivadas en el suelo, tal como se describió previamente (Green, y col., Biotechnol. J. 4: 1-8, 2009).
Se tomaron muestras de tejido vegetal de 3-7 días después de la infiltración para determinar los niveles de expresión y solubilidad de la proteína de fusión. Las muestras se pesaron y se extrajeron en tres volúmenes de tampón de extracción (Na2 HPO 4 100 mM, pH 7,1; EDTA 2,5 mM, a pH 8,0) para proteína soluble total, tampón de extracción más Triton-X 100 al 0,5 % para proteína soluble total-Triton, o tampón de carga de gel para proteína total. Las proteínas se redisolvieron en geles SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron a membranas PVDF. Los niveles de proteína de fusión se evaluaron mediante análisis de inmunotransferencia con anticuerpo policlonal anti-AIMV en conejo en comparación con un estándar de AIMV o con un anticuerpo específico de la diana y un estándar apropiado. Una inmunotransferencia representativa se muestra en la Figura 4C. Se determinaron los días de pico de expresión y los perfiles de solubilidad. Las construcciones de interés se infiltraron al vacío a mayor escala en N. benthamiana cultivada hidropónicamente para la expresión de las proteínas de fusión.
Ejemplo 3. Aislamiento y purificación de partículas de tipo virus
En el día de máxima expresión, se recolectaron las hojas y se homogeneizaron en una licuadora en tres volúmenes de tampón de extracción a base de fosfato con Triton X-100 al 0,5 %. El homogenado se agitó durante 30 minutos a 4 °C, después se centrifugó durante 30 minutos a 5.000 x g. El sobrenadante se filtró a través de miracloth y se centrifugó a 15.000 x g durante 1 a 1,5 horas. El sobrenadante se precipitó con PEG y luego se centrifugó nuevamente durante 30 minutos a 15.000 x g. El sedimento se resuspendió en un tampón a base de fosfato y se congeló a -20 °C. Después de descongelar, la suspensión se centrifugó 30 minutos a 30.000 x g. Las alícuotas de sobrenadante se analizaron mediante SDS-PAGE para estimar la concentración de proteínas. El sobrenadante se centrifugó durante 2 horas a 60.000 x g en un rotor Ti70. El sedimento se resuspendió en tampón a base de fosfato. El sobrenadante resultante se analizó mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie. La concentración de proteína se determinó colorimétricamente en comparación con los estándares de BSA.
Las partículas purificadas se visualizaron por MET y tinción negativa (Figura 3). Las partículas parecen estar vacías y sustancialmente libres de ácido nucleico. El marcaje con inmunogold con anticuerpos específicos para la diana confirmó la presencia de la proteína diana en la superficie de las partículas. Las partículas purificadas se almacenaron en una solución de tampón de Na2 HPO 4 10 mM, pH 7,1; EDTA 1 mM, a pH 8,0, a -80 °C.
Las proteínas purificadas se sometieron a inmunotransferencia tal como se describe en el Ejemplo 3. En inmunotransferencias que tienen las partículas purificadas, la proteína de fusión fue reconocida tanto por el anticuerpo específico de diana como por el anticuerpo específico de AIMV, que se une a la proteína de revestimiento. (Figura 4a y 4B).
Los resultados de expresión de las proteínas de fusión producidas en las hojas se resumen en la Tabla 1. Las cantidades de expresión y purificación fueron suficientemente altas para permitir la prueba de inmunogenicidad en ratones.
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Ejemplo 4. Inmunización de ratones con partículas de tipo virus
Se inmunizaron grupos de seis ratones Balb/c de 6-8 semanas de vida por vía subcutánea en los días 0 y 28 del estudio con 10 |jg de partículas de tipo virus que contienen Pfs25-CPF o Pfs28-CPF o 1 |jg de partículas de tipo virus que contienen HA3A-CPF. La vacuna se preparó justo antes de su uso. Las alícuotas de partículas de tipo virus purificadas (o partículas de proteína de fusión) se descongelaron en tampón y se inyectaron con o sin un adyuvante. La vacuna se inyectó en PBS solo o en presencia de QUIL A ™ (adyuvante a base de saponina, Brenntag Biosector, Frederikssund Dinamarca) o ALHYDROGEL™ (adyuvante a base de hidróxido de aluminio, Brenntag Biosector, Frederikssund Dinamarca) como adyuvante. La HA soluble de longitud completa de la cepa Anhui del virus de la gripe (HAA1) también se inyectó con QUIL A ™ como control positivo. Se recogieron muestras de suero en el día de estudio 56 y se analizaron las respuestas de IgG específicas de antígeno mediante ELISA. En el ensayo, las placas se recubrieron con 1 pg/ml de las siguientes proteínas: Pfs25 o Pfs28 recombinantes producidos en Pichia pastoris, o recubiertos con el virus reagrupado A/Anhui/1/2005 inactivado obtenido de los CDC a una dilución de 1:128. Las muestras de suero se colocaron en placas en diluciones de 4 veces por la placa. Los títulos de punto final de IgG se determinaron como la dilución a la que los valores de DO correspondientes son mayores que cuatro veces el valor del blanco. Los resultados demostraron que Pfs25-CPF y Pfs28-CPF produjeron altos títulos de anticuerpos (> 10.000) en el día 56 con o sin un adyuvante (Figura 6). HA3A-CPF también generó títulos de anticuerpos específicos de antígeno en presencia o ausencia de un adyuvante (Figura 5A).
Para probar la funcionalidad de los anticuerpos generados por la vacuna de HA3A-CPF, los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HI) se realizaron tal como se describe en Yoko y col. (Vaccine 27: 3467-3470, 2009). Los resultados mostraron que todos los ratones inmunizados con HA3A-CPF en PBS o QUIL A ™ tenían un título HI de> 1:40, un nivel considerado protector en humanos (Figura 5B). Cuatro de cada cinco animales inmunizados con la vacuna HA3A-CPF adsorbidos en ALHYDROGEL ™ tenían un título de HI> 1:40. Según estos resultados, HA3A-CPF parece ser un candidato viable para una vacuna contra la gripe pandémica que puede administrarse en ausencia de un adyuvante.
La eficacia de los anticuerpos generados por las vacunas Pfs25-CPF y Pfs28-CPF se evaluó utilizando un grupo diferente de ensayos. Los títulos de IgG determinados por ELISA en sueros recogidos el día 56 se muestran en la Figura 6. Además, estas muestras de suero se enviaron a la Universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos, para evaluar la presencia de anticuerpos que se unen a los gametocitos. Las pruebas iniciales de suero se realizaron utilizando un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) en gametocitos fijos en el que se determinó un título de anticuerpos de unión a parásitos en cada muestra de suero (Tabla 2). Los sueros positivos del ensayo IFA se analizaron luego en un ensayo de suspensión IFA (SIFA) usando gametocitos vivos a una dilución sérica de 1:50 y 1:250. En la Tabla 2 se muestran los resultados de SIFA.
Tabla 2. Eficacia de las vacunas de CP-Fusión contra la malaria
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Los sueros se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos bloqueadores de la transmisión en un ensayo de alimentación de membrana estándar (SMFA). El ensayo SMFA es el estándar de oro para medir la actividad de bloqueo de transmisión en sueros de prueba. El bioensayo imita la situación de infección natural y, por lo tanto, se considera un ensayo valioso para medir la transmisión entre el hombre y el mosquito. Este ensayo permite que el desarrollo de la vacuna de bloqueo de transmisión (TBV) avance con una confianza que no está disponible para la mayoría de las otras vacunas contra la malaria. En resumen, a los mosquitos Anopheles stephensi criados en laboratorio se les permite ingerir sangre de dispositivos cubiertos de membrana que contienen suero de los ratones inmunizados anteriormente combinado con suspensiones de glóbulos rojos y del complemento infectadas con gametocitos de P. falciparum. Después de una semana, se determina la cantidad de mosquitos infectados (%MosqInf), así como también se determina el número de ooquistes desarrollados por mosquito. La actividad reductora de la transmisión se determina comparando el número de ooquistes en mosquitos alimentados con suero de ensayo frente al control (preinmune). Estos resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Ensa o de alimentación de membrana estándar
Figure imgf000009_0001
continuación
Figure imgf000010_0001
El análisis de las muestras de suero generadas usando el Pfs25-CPF demostró que se detectaron títulos altos (1:6400) de anticuerpos de unión a parásitos en los grupos adyuvantes con títulos moderados (1:800) generados por la vacuna sola. Cuando se analiza en parásitos vivos, las tres composiciones de Pfs25-CPF, QUIL A™, ALHYDROGEL ™, y PBS solo mostraron un título de anticuerpos de 1:250. De manera similar, cuando se evalúa en el ensayo SMFA, las tres formulaciones de Pfs25-CPF produjeron suero que bloqueó completamente la transmisión del parásito en los mosquitos. Estos datos confirman el potencial de este enfoque para generar una vacuna eficaz contra un agente infeccioso sin la necesidad de un adyuvante.
Ejemplo 5. Preparación de construcciones de proteínas de fusión de adenovirus para la transfección de células de mamífero.
Para la expresión de las partículas libres de virus (o partículas de proteínas de fusión) compuestas de proteínas de fusión AIMV-CP en un sistema de mamífero, se usaron técnicas de PCR para fusionar el péptido señal de luciferasa de Gaussia con HA3A-CPF y HA3C04-CPF (dominio globular (3) de HA de Anhui (SEQ ID NO: 6) y California 04 (SEQ ID NO: 7), respectivamente). Los cebadores directos (SEQ ID NO: 20 y 21) contenían la secuencia de integración TOPO (CACC) y la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de luciferasa y el inicio de la proteína diana. El cebador inverso era específico del extremo 3' terminal AIMV-CP (SEQ ID NO: 22). Los amplicones resultantes se clonaron en el vector pENTR-D-TOPO de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen Corporation). Las secuencias fueron confirmadas por secuenciación automática. Después de la verificación de secuencia, los genes diana se recombinaron en el vector pAd/CMV/V5-DEST utilizando la tecnología Gateway de Invitrogen Corporation de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 6. Preparación de adenovirus que contiene un gen de proteína de fusión
El plásmido pAd-HA3A-CPF o pAd-HA3C04-CPF purificado se digirió con Pací para exponer las repeticiones terminales invertidas (ITR) víricas. El pAd-HA3A-CPF o pAd-HA3C04-CPF digerido se transfectó en la línea celular 293, que contiene una copia integrada de E1 de adenovirus, utilizando un reactivo de transfección catiónico a base de lípidos. Cuando se observaron los efectos citopáticos del virus en células transfectadas (10-14 días después de la transfección), se recolectaron células que contenían adenovirus y medio. Las células recolectadas y el medio de cultivo que contenía adenovirus se sometieron a dos rondas de congelación y descongelación (a -80 °C durante 30 minutos y luego a 37 °C durante 15 minutos) para lisar las células y permitir la liberación de partículas víricas intracelulares. Después del segundo ciclo de congelación/descongelación, el lisado celular se centrifugó y el sobrenadante que contenía partículas víricas se recogió y almacenó a -80 °C.
Ejemplo 7. Procedimiento para la transducción de la construcción adenovírica con secuencias HA3A-CPF o HA3C04-CPF y producción de partículas libres de virus
Este es un ejemplo profético. El adenovirus recogido del Ejemplo 6 que contiene el gen HA3A-CPF o HA3C04-CPF se amplificará infectando células 293, después se recolectará de nuevo y se almacenará tal como se describe anteriormente para crear un reservorio de adenovirus. El reservorio de adenovirus se titulará utilizando un ensayo en placa.
Dado que las construcciones adenovíricas pAd-HA3A-CPF y pAd-HA3C04-CPF son incompetentes para la replicación y no se integran en el genoma del hospedador, no se producirá progenie vírica después de su transducción en células de mamífero. Las células hospedadoras serán células de riñón canino Madin-Darby (MDCK). Las células MDCK se adaptarán para crecer en medio sin suero para evitar la posibilidad de contaminación por subproductos animales en la preparación final. Las células MDCK se transducirán con secuencias HA3A-CPF o HA3C04-CPF que contienen adenovirus para determinar una multiplicidad de infección adecuada. Dos o tres días después de la transducción, la expresión de HA3A-CPF o HA3C04-CPF se analizará por microscopía de fluorescencia utilizando anticuerpos anti-HA y anti-AIMV seguidos de anti-IgG de ratón conjugado con FITC. Como alternativa, el sobrenadante del cultivo celular se recogerá y concentrará para la inmunotransferencia y la detección de proteínas de fusión.
Para obtener una plataforma de producción de células de mamífero escalable para HA3A-CPF o HA3C04-CPF, las células MDCK se cultivarán en suspensión utilizando un sistema de microvehículo basado en dextrano reticulado, por ejemplo, CYTODEX™ 1 de GE Healthcare. Después de la transducción de la construcción de adenovirus, las células MDCK se incubarán con el microvehículo y se cultivarán en matraces giratorios. Después de dos a tres días, se recolectarán diariamente muestras de sobrenadantes celulares y se analizarán los niveles de expresión mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo monoclonal anti-HA específico de diana.
Cuando se confirme la presencia de proteínas de fusión, se recogerá el medio de cultivo de MDCK y se centrifugará. Las proteínas de fusión se purificarán del sobrenadante usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 3, comenzando con la precipitación de PEG.
Ejemplo 8. Inmunización de ratones con partículas de tipo virus que contienen el dominio globular de H5 HA (A/Indonesia/5/2005) AMV CP fusión
Se inmunizaron grupos de seis ratones Balb/c de 6-8 semanas de vida por vía subcutánea en los días 0 y 21 del estudio con 5 |jg de partículas de tipo virus (VLP) que contenían el dominio globular de fusión H5 HA (A/Indonesia/5/20o5) AMV CP (HA3I-CPF). El HA soluble de longitud completa de la cepa de Indonesia del virus de la gripe (HAI1) también se inyectó con o sin ALHY-DROGEL™ como comparadores. La CP solo se incluyó como control negativo. La vacuna se preparó justo antes de su uso. Las alícuotas de partículas de tipo virus purificadas (o partículas de proteína de fusión) se descongelaron en tampón y se inyectaron con o sin un adyuvante, ALHYDROGEL™. Se recogieron muestras de suero en el día 35 del estudio y se analizaron las respuestas de isótopos de IgG específicas de antígeno mediante ELISA. En el ensayo, Las placas se recubrieron con virus reagrupado A/Indonesia/5/2005 inactivado obtenido de los CDC a una dilución de 1:128. Las muestras de suero se colocaron en placas en diluciones en serie de 4 veces por la placa. Los títulos de punto final de IgG1, IgG2a e IgG2b se determinaron como la dilución a la que los correspondientes valores de DO son mayores que tres veces el valor de control negativo. Los resultados demostraron que las partículas de tipo virus que contienen HA3I-CPF indujeron una respuesta IgG2a más fuerte en presencia o ausencia de ALHYDROGEL™ que la subunidad soluble sola (HAI1) en presencia o ausencia de ALHYDROGEL™ (Figura 7), lo que sugiere un sesgo de Th1 de respuesta inmune a las VLP. Como se ha demostrado que los ratones infectados con gripe generan respuestas inmunes de Th1, las VLP basadas en AMV en el dominio globular HA de la gripe producidas en plantas son mejores candidatos para la vacuna que la subunidad soluble.
Para probar la funcionalidad de los anticuerpos generados por la vacuna de HA3I-CPF, los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HI) se realizaron tal como se describe en Yoko y col. (Vaccine 27: 3467-3470, 2009). Los resultados mostraron que el 80 % de los ratones 35 días después de haber sido inmunizados con HA3I-CPF en ausencia de ALHYDROGEL™ tenían un título de HI de >1:40, que es significativamente mayor que los ratones inmunizados con HAI1 (p = 0,003) (Figura 8), lo que indica que HA3I-CPF es un mejor candidato para la vacuna contra la gripe que la subunidad soluble para el suministro sin un adyuvante.
Ejemplo 9. Efectos de la inmunidad preexistente contra CP sobre las respuestas de anticuerpos séricos en ratones
Se inmunizaron grupos de seis ratones Balb/c de 6-8 semanas de edad por vía subcutánea (SC) o intramuscular (IM) con PBS o 10 jg de partículas de tipo virus (VLP) que contienen Pfs25-CPF en los días de estudio 0 y 28 con o sin un adyuvante, ALHYDROGEL™ (Alumbre), y posteriormente con PBS o 1 jg de VLP que contienen el dominio globular de fusión H5 HA (A/Anhui/1/2005) AMV CP (HA3I-CPF) por la misma vía de administración en los días de estudio 140 y 168 con o sin ALHYDROGEL™ (Alumbre).
La vacuna se preparó justo antes de su uso. Las alícuotas de partículas de tipo virus purificadas (o partículas de proteína de fusión) se descongelaron en tampón y se inyectaron con o sin un adyuvante, ALHYDROGEL™. Se recogieron muestras de suero antes del estudio (presangrado) y en los días 28, 56, 84, 112, 140, 168 y 216 del estudio, y se analizaron las respuestas de IgG específicas de antígeno mediante ELISA. En el ensayo, las placas se recubrieron con 2 jg/m l de AIMV, 1 jg/m l de Pfs25 recombinante producido en Pichia pastoris, o virus reagrupado A/Anhui/1/2005 inactivado obtenido de los CDC a una dilución de 1:128. Las muestras de suero se colocaron en placas en diluciones de 4 veces por la placa. Los títulos de punto final de IgG se determinaron como la dilución a la que los valores de DO correspondientes son mayores que cuatro veces el valor del blanco.
Dos inmunizaciones con Pfs25-CPF, ya sea con o sin adyuvante, generaron altos títulos de anticuerpos IgG (> 10.000) contra AIMV (CP) y esos títulos se mantuvieron durante el transcurso del estudio. Después de las inmunizaciones con HA3A-CPF, ya sea con o sin adyuvante, los títulos de IgG contra AIMV (CP) en el grupo preinmunizado con Pfs25-CPF aumentaron ligeramente, mientras que los títulos de IgG en los grupos preinmunizados con PBS alcanzaron niveles equivalentes a los de los grupos preinmunizados con Pfs25-CPF.
Dos inmunizaciones con Pfs25-CPF, ya sea con o sin adyuvante, generaron altos títulos de anticuerpos IgG anti-Pfs25 (> 10.000), que se mantuvieron y no cambiaron significativamente después de las inmunizaciones con Pfs25-CPF.
Dos inmunizaciones con Pfs25-CPF, ya sea por la vía SC o IM, generaron respuestas significativas de IgG anti-A/Anhui/1/2005 en sueros de todos los grupos excepto los grupos preinmunizados con PBS en los que los títulos eran uno o dos log inferiores a los de otros grupos (>10.000).
Para probar la funcionalidad de los anticuerpos generados por la vacuna de HA3A-CPF, los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HI) se realizaron tal como se describe en Yoko y col. (Vaccine 27: 3467-3470, 2009). Los resultados mostraron que dos inmunizaciones con HA3A-CPF indujeron respuestas de anticuerpos HI en suero en todos los grupos excepto en el grupo de control negativo (PBS/PBS) (Figuras 9A y 9B). Sin un adyuvante, se observaron diferencias significativas en títulos de HI entre grupos preinmunizados con Pfs25-CPF y PBS, ya sea a través de las vías SC (p = 0,01) o IM (p = 0,08). Con un adyuvante, no se observaron diferencias significativas entre los grupos preinmunizados con Pfs25-CPF y PBS por vía SC (p = 0,5) o IM (p = 0,6). Según estos resultados, sin ALHYDROGEL™ como adyuvante, la preinmunización con VLP que contienen una proteína de fusión de una proteína de revestimiento del virus vegetal y una primera proteína diana no interfiere con las respuestas de anticuerpos HI séricos a una segunda proteína diana en ratones inmunizados con VLP que contienen una proteína de fusión de la misma proteína de revestimiento del virus vegetal y la segunda proteína diana, a través de las vías SC o IM.
Aunque la invención se ilustra y describe en el presente documento con referencia a realizaciones específicas, la invención no pretende limitarse a los detalles mostrados. En su lugar, se pueden hacer varias modificaciones en los detalles dentro del ámbito y rango de equivalentes de las reivindicaciones y sin apartarse de la invención.
<110> Fraunhofer USA Inc.
<120> PARTÍCULAS DE TIPO VIRUS QUE COMPRENDEN PROTEÍNAS DIANA FUSIONADAS A PROTEÍNAS DE REVESTIMIENTO DE VIRUS VEGETALES
<130> FCMB-100WO
<160> 49
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> Virus de mosaico de alfalfa
<220>
<223> Proteína de revestimiento de A1MV
<300>
<308> NP_041195
<400> 1
Ser Ser Ser Gln Lys Lys Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Pro Thr Lys
1 5 10 15
Arg Ser Gln Asn Tyr Ala Ala Leu Arg Lys Ala Gln Leu Pro Lys Pro
20 25 30
Pro Ala Leu Lys Val Pro Val Val Lys Pro Thr Asn Thr lie Leu Pro
35 40 45
Gln Thr Gly Cys Val Trp Gln Ser Leu Gly Thr Pro Leu Ser Leu Ser 50 55 60
Ser Phe Asn Gly Leu Gly Val Arg Phe Leu Tyr Ser Phe Leu Lys Asp
65 70 75 80
Phe Ala Gly Pro Arg lie Leu Glu Glu Asp Leu lie Tyr Arg Met Val 85 90 95
Phe Ser lie Thr Pro Ser Tyr Ala Gly Thr Phe Cys Leu Thr Asp Asp
100 105 110
Val Thr Thr Glu Asp Gly Arg Ala Val Ala His Gly Asn Pro Met Gln
115 120 125
Glu Phe Pro His Gly Ala Phe His Ala Asn Glu Lys Phe Gly Phe Glu 130 135 140
Leu Val Phe Thr Ala Pro Thr His Ala Gly Met Gln Asn Gln Asn Phe
145 150 155 160
Lys His Ser Tyr Ala Val Ala Leu Cys Leu Asp Phe Asp Ala Gln Pro
165 170 175
Glu Gly Ser Lys Asn Pro Ser Tyr Arg Phe Asn Glu Val Trp Val Glu
180 185 190
Arg Lys Ala Phe Pro Arg Ala Gly Pro Leu Arg Ser Leu lie Thr Val
195 200 205
Gly Leu Phe Asp Glu Ala Asp Asp Leu Asp Arg His
210 215 220
<210>2
<211> 196
<212> PRT
<213> Virus de mosaico de alfalfa
<220>
<223> Proteína truncada de revestimiento de A1MV
<400>2
Figure imgf000014_0001
<210>3
<211> 30
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<223> Péptido señal, proteína 1 relacionada con la patogénesis vegetal
<400>3
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val Ser
1 5 10 15
Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val lie Ser His Ser Cys Arg Ala
20 25 30
<210>4
<211> 171
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
<220>
<223> Proteína de la superficie celular de la etapa sexual, Pfs-25
<300>
<308> AAF63684.1
<400> 4
Figure imgf000015_0001
<210> 5
<211> 175
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
<220>
<223> Proteína de la superficie celular de la etapa sexual, Pfs28
<300>
<308> AAT00624.1
<400>5
Arg Val Thr Glu Asn Thr lie Cys Lys Tyr Gly Tyr Leu lie Gln Met
1 5 10 15
Ser Asn His Tyr Glu Cys Lys Cys lie Glu Gly Tyr Val Leu lie Asn
20 25 30
Glu Asp Thr Cys Gly Lys Lys Val Val Cys Asp Lys Val Glu Asn. Ser
35 40 45
Phe Lys Ala Cys Asp Glu Tyr Ala Tyr Cys Phe Asp Leu Gly Asn Lys 50 55 60
Asn Asn Glu Lys Gln lie Lys Cys Met Cys Arg Thr Glu Tyr Thr Leu
65 70 75 80
Thr Ala Gly Val Cys Val Pro Asn Val Cys Arg Asp Lys Val Cys Gly 85 90 95
Lys Gly Lys Cys lie Val Asp Pro Ala Asn Ser Leu Thr His Thr Cys
100 105 110
Ser Cys Asn lie Gly Thr lie Leu Asn Gln Asn Lys Leu Cys Asp lie
115 120 125
Gln Gly Asp Thr Pro Cys Ser Leu Lys Cys Ala Glu Asn Glu Val Cys 130 135 140
Thr Leu Glu Gly Asn Tyr Tyr Thr Cys Lys Glu Asp Pro Ser Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Asn Thr Val Asp Gln Ala Asp Thr Ser Tyr Ser Val 165 170 175 <210>6
<211> 233
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, dominio globular, Anhui/1/2005/H5N1, HA3A
<400> 6
Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu lie Leu Arg Asp Cys Ser Val
1 5 10 15
Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe lie Asn Val
20 25 30
Pro Glu Trp Ser Tyr lie Val Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu
35 40 45
Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu 50 55 60
Ser Arg lie Asn His Phe Glu Lys lie Gln lie lie Pro Lys Ser Ser
65 70 75 80
Trp Ser Asp His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr 85 90 95
Gln Gly Thr Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu lie Lys Lys
100 105 110
Asn Asn Thr Tyr Pro Thr lie Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln
115 120 125
Glu Asp Leu Leu lie Leu Trp Gly lie His His Ser Asn Asp Ala Ala 130 135 140
Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr lie Ser Val Gly
145 150 155 160
Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys lie Ala Thr Arg Ser
165 170 175
Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr lie Leu
180 105 190
Lys Pro Asn Asp Ala lie Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe lie Ala
195 200 205
Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys lie Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala lie Val 210 215 220
Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly Asn Cys
225 230
<210>7
<211> 234
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, dominio globular, Califonia/04/2009/H1N1, HA3C04
<400>7
Figure imgf000018_0001
<210>8
<211> 234
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, dominio globular, Califonia/06/2009/H1N1, HA3C06
<400>8
Figure imgf000019_0001
<210>9
<211> 515
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, Anhui/1/2005/H5N1, HAA
<300>
<308> ABD28180
<400>9
Asp Gln lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
1 5 10 15
Asp Thr lie Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp lie
20 25 30
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
35 40 45
Pro Leu lie Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60
Pro Met Cys Asp Glu Phe lie Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr lie Val
65 70 75 80
Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95
Figure imgf000021_0001
Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu
355 360 365
Ser Thr Gln Lys Ala lie Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser lie 370 375 380
lie Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn
385 390 395 400
Asn Leu Glu Arg Arg lie Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly 405 410 415
Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu
420 425 430
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr
435 440 445
Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn 450 455 460
Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser
465 470 475 480
Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg 485 490 495
Leu Lys Arg Glu Glu lie Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser lie Gly Thr
500 505 510
Tyr Gln lie
515
<210> 10
<211> 516
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, Indonesia/5/2005/H5N1, HAI
<300>
<308>ABP51969
<400> 10
Asp Gln lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
1 5 10 15
Asp Thr lie Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp lie Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
35 40 45
Pro Leu lie Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
50 55 60
Pro Met Cys Asp Glu Phe lie Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr lie Val 65 70 75 80
Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn 85 90 95
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg lie Asn His Phe Glu
100 105 110
Lys lie Gln lie lie Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
115 120 125
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe
130 135 140
Arg Asn Val Val Trp Leu lie Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr lie 145 150 155 160
Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 165 170 175
Gly lie His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln
180 185 190
Asn Pro Thr Thr Tyr lie Ser lie Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
195 200 205
Leu Val Pro Lys lie Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
210 215 220
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr lie Leu Lys Pro Asn Asp Ala lie Asn 225 230 235 240
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe lie Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys lie 245 250 255
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala lie Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
260 265 270
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala lie Asn Ser Ser
275 280 285
Met Pro Phe His Asn lie His Pro Leu Thr lie Gly Glu Cys Pro Lys
Figure imgf000024_0001
<210> 11
<211> 233
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, dominio globular, Indonesia/5/2005/H5N1, HA3I
<400> 11
Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu lie Leu Arg Asp Cys Ser Val
1 5 10 15
Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe lie Asn Val
20 25 30
Pro Glu Trp Ser Tyr lie Val Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu
35 40 45
Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu 50 55 60
Ser Arg lie Asn His Phe Glu Lys lie Gln lie lie Pro Lys Ser Ser
65 70 75 80
Trp Ser Asp His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr 85 90 95
Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu lie Lys Lys
100 105 110
Asn Ser Thr Tyr Pro Thr lie Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln
115 120 125
Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly lie His His Pro Asn Asp Ala Ala 130 135 140
Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr lie Ser lie Gly
145 150 155 160
Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys lie Ala Thr Arg Ser 165 170 175
Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr
180 185 190
Lys Pro Asn Asp Ala lie Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe
Figure imgf000025_0001
195 200 205
Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys lie Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala
Figure imgf000025_0002
210 215 220
Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys
225 230
<210> 12
<211> 227
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, dominio globular, Países Bajos/219/2003/H7N7, HA3NL
<300>
<308> AAR02640
<400> 12
Cys Ser Lys Gly Lys Arg Thr Val Asp Leu Sly Gln Cys Gly Leu Leu
1 5 10 15
Gly Thr lie Thr Gly Pro Pro Gln Cys Asp Gln Phe Leu Glu Phe Ser
20 25 30
Ala Asp Leu lie lie Glu Arg Arg Glu Gly Ser Asp Val Cys Tyr Pro
35 40 45
Gly Lys Phe Val Asn Glu Glu Ala Leu Arg Gln lie Leu Arg Glu Ser 50 55 60
Gly Gly lie Asp Lys Glu Thr Met Gly Phe Thr Tyr Ser Gly lie Arg
65 70 75 80
Thr Asn Gly Thr Thr Ser Ala Cys Arg Arg Ser Gly Ser Ser Phe Tyr
85 90 95
Ala Glu Met Lys Trp Leu Leu Ser Asn Thr Asp Asn Ala Ala Phe Pro
100 105 110
Gln Met Thr Lys Ser Tyr Lys Asn Thr Arg Lys Asp Pro Ala Leu lie
115 120 125
lie Trp Gly lie His His Ser Gly Ser Thr Thr Glu Gln Thr Lys Leu 130 135 140
Tyr Gly Ser Gly Asn Lys Leu lie Thr Val Gly Ser Ser Asn Tyr Gln
145 150 155 160
Gln Ser Phe Val Pro Ser Pro Gly Ala Arg Pro Gln Val Asn Gly Gln 165 170 175
Ser Gly Arg lie Asp Phe His Trp Leu lie Leu Asn Pro Asn Asp Thr
180 185 190
Val Thr Phe Ser Phe Asn Gly Ala Phe lie Ala Pro Asp Arg Ala Ser
195 200 205
Phe Leu Arg Gly Lys Ser Met Gly lie Gln Ser Glu Val Gln Val Asp 210 215 220
Ala Asn Cys
<210> 13
<211> 233
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, dominio globular, Vietnam/1194/2004/H5N1, HA3V
<300>
<308> AAT73273
<400> 13
Figure imgf000027_0001
Lys Pro Asn Asp Ala lia Asn Pha Glu Ser Asn Gly Asn Phe lie Ala
195 200 205
Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys lie Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr lie Met 210 215 220
Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys
225 230
<210> 14
<211> 226
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, dominio globular, Brisbane/10/2007/H3N2, HA3B(H3)
<300>
<308> ABW23353
<400> 14
Cys Asp Ser Pro His Gln lie Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu lie
1 5 10 15
Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys
20 25 30
Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro
35 40 45
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser 50 55 60
Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr
65 70 75 80
Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys lie Arg Arg Ser Asn Asn Ser Phe 85 90 95
Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys Phe Lys Tyr Pro Ala
100 105 110
Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr lie
115 120 125
Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Asn Asp Gln lie Phe Pro Tyr 130 135 140
Ala Gln Ala Ser Gly Arg lie Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln
145 150 155 160
Thr Val lie Pro Asn lie Gly Ser Arg Pro Arg Val Arg Asn lie Pro 165 170 175
Ser Arg lie Ser lie Tyr Trp Thr lie Val Lys Pro Gly Asp lie Leu
180 185 190
Leu lie Asn Ser Thr Gly Asn Leu lie Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys
195 200 205
lie Arg Ser Gly Lys Ser Ser lie Met Arg Ser Asp Ala Pro lie Gly 210 215 220
Lys Cys
225
<210> 15
<211> 239
<212> PRT
<213> Gripe B
<220>
<223> Hemaglutinina, dominio globular, tipo Brisbane, HB3B(B)
<400> 15
Cys Pro Asp Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg
1 5 10 15
Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser lie Leu His
20 25 30
Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro lie Met His Asp Arg
35 40 45
Thr Lys lie Arg Gln Leu Ala Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Asn lie 50 55 60
Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val lie Asp Ala Glu Lys Ala Pro Gly Gly
65 70 75 80
Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn Ala Thr Ser Lys 85 90 95
Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro Lys Asp Asn Asn
100 105 110
Lys Asn Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val Pro Tyr lie Cys Thr
115 120 125
Glu Gly Glu Asp Gln lie Thr Val Trp Gly Phe His Ser Asp Asp Lys
Figure imgf000031_0001
<210> 16
<211> 146
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
<220>
<223> Proteína de la superficie celular de la etapa sexual, Pfs48(6N)/45
<300>
<308> PF13_0247
<400> 16
Asn Asn Asp Phe Cys Lys Pro Ser Ser Leu Asn Ser Glu lie Ser Gly
1 5 10 15
Phe lie Gly Tyr Lys Cys Asn Phe Ser Asn Glu Gly Val His Asn Leu
20 25 30
Lys Pro Asp Met Arg Glu Arg Arg Ser lie Phe Cys Thr lie His Ser
35 40 45
Tyr Phe lie Tyr Asp Lys lie Arg Leu lie lie Pro Lys Lys Ser Ser
50 55 60
Ser Pro Glu Phe Lys lie Leu Pro Glu Lys Cys Phe Gln Lys Val Tyr
65 70 75 80
Thr Asp Tyr Glu Asn Arg Val Glu Thr Asp lie Ser Glu Leu Gly Leu 85 90 95
lie Glu Tyr Glu lie Glu Glu Asn Asp Thr Asn Pro Asn Tyr Asn Glu
100 105 110
Arg Thr lie Thr lie Ser Pro Phe Ser Pro Lys Asp lie Glu Phe Phe
115 120 125
Cys Phe Cys Asp Asn Thr Glu Lys Val lie Ser Ser lie Glu Gly Arg
130 135 140
Ser Ala
145
<210> 17
<211> 255
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
<220>
<223> Proteína de la superficie celular de la etapa sexual, Pfs48-10C
<400> 17
Met Val His Val Arg Val Leu Lys Tyr Pro His Asn lie Leu Phe Thr
1 5 10 15
Asn Leu Thr Asn Asp Leu Phe Thr Tyr Leu Pro Lys Thr Tyr Asn Glu
20 25 30
Ser Asn Phe Val Ser Asn Val Leu Glu Val Glu Leu Asn Asp Gly Glu
35 40 45
Leu Phe Val Leu Ala Cys Glu Leu lie Asn Lys Lys Cys Phe Gln Glu 50 55 60
Gly Lys Glu Lys Ala Leu Tyr Lys Ser Asn Lys lie lie Tyr His Lys
65 70 75 80
Asn Leu Thr lie Phe Lys Ala Pro Phe Tyr Val Thr Ser Lys Asp Val 85 90 95
Asn Thr Glu Cys Thr Cys Lys Phe Lys Asn Asn Asn Tyr Lys lie Val
100 105 110
Leu Lys Pro Lys Tyr Glu Lys Lys Val lie His Gly Cys Asn Phe Ser
115 120 125
Ser Asn Val Ser Ser Lys His Thr Phe Thr Asp Ser Leu Asp lie Ser 130 135 140
Leu Val Asp Asp Ser Ala His lie Ser Cys Asn Val His Leu Ser Glu
145 150 155 160
Pro Lys Tyr Asn His Leu Val Gly Leu Asn Cys Pro Gly Asp lie lie 165 170 175
Pro Asp Cys Phe Phe Gln Val Tyr Gln Pro Glu Ser Glu Glu Leu Glu
180 185 190
Pro Ser Asn lie Val Tyr Leu Asp Ser Gln lie Asn lie Gly Asp H e
195 200 205
Glu Tyr Tyr Glu Asp Ala Glu Gly Asp Asp Lys lie Lys Leu Phe Gly 210 215 220
lie Val Gly Ser lie Pro Lys Thr Thr Ser Phe Thr Cys lie Cys Lys
225 230 235 240
Lys Asp Lys Lys Ser Ala Tyr Met Thr Val Thr lie Asp Ser Ala
245 250 255
<210> 18
<211> 134
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
<220>
<223> Proteína de la superficie celular de la etapa sexual, Pfs48-6C
<400> 18
Figure imgf000034_0001
<210> 19
<211> 3135
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
<220>
<223> Proteína de la superficie celular de la etapa sexual, Pfs230
<300>
<308> AAA29724
<400> 19
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
705 710 715 720
Gly lie Val Glu Val Tyr Val Glu Pro Tyr Gly Asn Lys lie Asn Gly 725 730 735
Cys Ala Phe Leu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Lys Tyr Gly Asn Gln
740 745 750
lie Glu Glu Asp Glu Hls Asn Glu Lys lie Lys Met Lys Thr Phe Phe
755 760 765
Thr Gln Asn lie Tyr Lys Lys Asn Asn lie Tyr Pro Cys Tyr Met Lys 770 775 780
Leu Tyr Ser Gly Asp lie Gly Gly lie Leu Phe Pro Lys Asn lie Lys 785 790 795 800
Ser Thr Thr Cys Phe Glu Glu Met lie Pro Tyr Asn Lys Glu lie Lys 805 810 815
Trp Asn Lys Glu Asn Lys Ser Leu Gly Asn Leu Val Asn Asn Ser Val
820 825 830
Val Tyr Asn Lys Glu Met Asn Ala Lys Tyr Phe Asn Val Gln Tyr Val
835 840 845
His lie Pro Thr Ser Tyr Lys Asp Thr Leu Asn Leu Phe Cys Ser lie 850 855 860
lie Leu Lys Glu Glu Glu Ser Asn Leu lie Ser Thr Ser Tyr Leu Val 865 870 875 880
Tyr Val Ser lie Asn Glu Glu Leu Asn Phe Ser Leu Phe Asp Phe Tyr B85 390 895
Glu Ser Phe Val Pro lie Lys Lys Thr lie Gln Val Ala Gln Lys Asn
900 905 910
Val Asn Asn Lys Glu His Asp Tyr Thr Cys Asp Phe Thr Asp Lys Leu
915 920 925
Asp Lys Thr Val Pro Ser Thr Ala Asn Gly Lys Lys Leu Phe lie Cys 930 935 940
Arg Lys His Leu Lys Glu Phe Asp Thr Phe Thr Leu Lys Cys Asn Val 945 950 955 960
Asn Lys Thr Gln Tyr Pro Asn lie Glu lie Phe Pro Lys Thr Leu Lys 965 970 975 Asp Lys Lys Glu Val Leu Lys Leu Asp Leu Asp lie Gln Tyr Gln Met
980 935 990
Phe Ser Lys Phe Phe Lys Phe Asn Thr Gln Asn Ala Lys Tyr Leu Asn
995 1000 1005
Leu Tyr Pro Tyr Tyr Leu lie Phe Pro Phe Asn His lie Gly Lys
1010 1015 1020
Lys Glu Leu Lys Asn Asn Pro Thr Tyr Lys Asn His Lys Asp Val
1025 1030 1035
Lys Tyr Phe Glu Gln Ser Ser Val Leu Ser Pro Leu Ser Ser Ala
1040 1045 1050
Asp Ser Leu Gly Lys Leu Leu Asn Phe Leu Asp Thr Gln Glu Thr
1055 1060 1065
val Cys Leu Thr Glu Lys H e Arg Tyr Leu Asn Leu Ser H e Asn
1070 1075 1030
Glu Leu Gly Ser Asp Asn Asn Thr Phe Ser Val Thr Phe Gln Val
1085 1090 1095
Pro Pro Tyr lie Asp lie Lys Glu Pro Phe Tyr Phe Met Phe Gly
1100 1105 1110
Cys Asn Asn Asn Lys Gly Glu Gly Asn H e Gly lie Val Glu Leu
1115 1120 1125
Leu lie Ser Lys Gln Glu Glu Lys lie Lys Gly Cys Asn Phe His
1130 1135 1140
Glu Ser Lys Leu Asp Tyr Phe Asn Glu Asn H e Ser Ser Asp Thr
1145 1150 1155
His Glu Cys Thr Leu His Ala Tyr Glu Asn Asp lie lie Gly Phe
1160 1165 1170
Asn Cys Leu Glu Thr Thr His Pro Asn Glu Val Glu Val Glu Val
1175 1180 1185
Glu Asp Ala Glu lie Tyr Leu Gln Pro Glu Asn Cys Phe Asn Asn
1190 1195 1200
Val Tyr Lys Gly Leu Asn Ser Val Asp lie Thr Thr lie Leu Lys
1205 1210 1215
Asn Ala Gln Thr Tyr Asn lie Asn Asn Lys Lys Thr Pro Thr Phe
1220 1225 1230
Leu Lys H e Pro Pro Tyr Asn Leu Leu Glu Asp Val Glu H e Ser
1235 1240 1245
Cys Gln Cys Thr lie Lys Gln Val Val Lys Lys lie Lys Val lie
1250 1255 1260
lie Thr Lys Asn Asp Thr Val Leu Leu Lys Arg Glu Val Gln Ser
1265 1270 1275
Glu Ser Thr Leu Asp Asp Lys lie Tyr Lys Cys Glu His Glu Asn
1280 1285 1290
Phe lie Asn Pro Arg Val Asn Lys Thr Phe Asp Glu Asn Val Glu
1295 1300 1305
Tyr Thr Cys Asn lie Lys lie Glu Asn Phe Phe Asn Tyr lie Gln
1310 1315 1320
lie Phe Cys Pro Ala Lys Asp Leu Gly lie Tyr Lys Asn lie Gln
1325 1330 1335
Met Tyr Tyr Asp lie val Lys Pro Thr Arg val Pro Gln Phe Lys
1340 1345 1350
Lys Phe Asn Asn Glu Glu Leu His Lys Leu lie Pro Asn Ser Glu
1355 1360 1365
Met Leu His Lys Thr Lys Glu Met Leu lie Leu Tyr Asn Glu Glu
1370 1375 1380
Lys Val Asp Leu Leu His Phe Tyr Val Phe Leu Pro lie Tyr lie
1385 1390 1395
Lys Asp lie Tyr Glu Phe Asn lie Val Cys Asp Asn Ser Lys Thr
1400 1405 1410
Met Trp Lys Asn Gln Leu Gly Gly Lys Val lie Tyr His lie Thr
1415 1420 1425
Val Ser Lys Arg Glu Gln Lys Val Lys Gly Cys Ser Phe Asp Asn
1430 1435 1440
Cys lie lie Asp Ala Lys Pro Lys Asp Leu lie Gly Phe Val Cys 1460 1465 1470
Pro Ser Gly Thr Leu Lys Leu Thr Asn Cys Phe Lys Asp Ala lie 1475 1480 1485
Val His Thr Asn Leu Thr Asn lie Asn Gly lie Leu Tyr Leu Lys 1490 1495 1500
Asn Asn Leu Ala Asn Phe Thr Tyr Lys His Gln Phe Asn Tyr Met 1505 1510 1515
Glu lie Pro Ala Leu Het Asp Asn Asp lie Ser Phe Lys Cys lie 1520 1525 1530
Cys Val Asp Leu Lys Lys Lys Lys Tyr Asn Val Lys Ser Pro Leu 1535 1540 1545
Gly Pro Lys Val Leu Arg Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Asn lie Lys 1550 1555 1560
Phe Asp Asn Tyr Val Thr Gly Thr Asp Gln Asn Lys Tyr Leu Met 1565 1570 1575
Thr Tyr Met Asp Leu His Leu Ser His Lys Arg Asn Tyr Leu Lys 1580 1585 1590
Glu Leu Phe His Asp Leu Gly Lys Lys Lys Pro Ala Asp Thr Asp 1595 1600 1605
Ala Asn Pro Glu Ser lie lie Glu Ser Leu Ser lie Asn Glu Ser 1610 1615 1620
Asn Glu Ser Gly Pro Phe Pro Thr Gly Asp Val Asp Ala Glu His 1625 1630 1635
Leu lie Leu Glu Gly Tyr Asp Thr Trp Glu Ser Leu Tyr Asp Glu 1640 1645 1650
Gln Leu Glu Glu Val lie Tyr Asn Asp lie Glu Ser Leu Glu Leu 1655 1660 1665
Lys Asp lie Glu Gln Tyr Val Leu Gln Val Asn Leu Lys Ala Pro 1670 1675 1680
Lys Leu Met Met Ser Ala Gln lie His Asn Asn Arg His Val Cys 1685 1690 1695
Asp Phe Ser Lys Asn Asn Leu lie Val Pro Glu Ser Leu Lys Lys
1700 1705 1710
Lys Glu Glu Leu Gly Gly Asn Pro Val Asn lie His Cys Tyr Ala
1715 1720 1725
Leu Leu Lys Pro Leu Asp Thr Leu Tyr Val Lys Cys Pro Thr Ser
1730 1735 1740
Lys Asp Asn Tyr Glu Ala Ala Lys Val Asn lie Ser Glu Asn Asp
1745 1750 1755
Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Val lie Ser Leu lie Glu Lys Arg Phe
1760 1765 1770
His Asn Phe Glu Thr Leu Glu Ser Lys Lys Pro Gly Asn Gly Asp
1775 1780 1785
Val Val Val His Asn Gly Val Val Asp Thr Gly Pro Val Leu Asp
1790 1795 1800
Asn ser Thr Phe Glu Lys Tyr Phe Lys Asn lie Lys lie Lys Pro
1805 1810 1815
Asp Lys Phe Phe Glu Lys Val lie Asn Glu Tyr Asp Asp Thr Glu
1820 1825 1830
Glu Glu Lys Asp Leu Glu Ser lie Leu Pro Gly Ala lie Val Ser
1835 1840 1845
Pro Met Lys Val Leu Lys Lys Lys Asp Pro Phe Thr Ser Tyr Ala
1850 1855 1860
Ala Phe Val Val Pro Pro lie Val Pro Lys Asp Leu His Phe Lys
1865 1870 1875
Val Glu Cys Asn Asn Thr Glu Tyr Lys Asp Glu Asn Gln Tyr lie
1880 1885 1890
Ser Gly Tyr Asn Gly lie lie His lie Asp lie Ser Asn Ser Asn
1895 1900 1905
Arg Lys lie Asn Gly Cys Asp Phe Ser Thr Asn Asn Ser Ser lie
1910 1915 1920
Leu Thr Ser Ser Val Lys Leu Val Asn Gly Glu Thr Lys Asn Cys
1925 1930 1935
Glu lie Asn lie Asn Asn Asn Glu Val Phe Gly lie lie Cys Asp
1940 1945 1950
Asn Glu Thr Asn Leu Asp Pro Glu Lys Cys Phe His Glu lie Tyr
1955 1960 1965
Ser Lys Asp Asn Lys Thr Val Lys Lys Phe Arg Glu Val lie Pro
1970 1975 1980
Asn lie Asp lie Phe Ser Leu His Asn Ser Asn Lys Lys Lys Val
1985 1990 1995
Ala Tyr Ala Lys Val Pro Leu Asp Tyr lie Asn Lys Leu Leu Phe
2000 2005 2010
Ser Cys Ser Cys Lys Thr Ser His Thr Asn Thr lie Gly Thr Met
2015 2020 2025
Lys Val Thr Leu Asn Lys Asp Glu Lys Glu Glu Glu Asp Phe Lys
2030 2035 2040
Thr Ala Gln Gly lie Lys His Asn Asn Val His Leu Cys Asn Phe
2045 2050 2055
Phe Asp Asn Pro Glu Leu Thr Phe Asp Asn Asn Lys lie Val Leu
2060 2065 2070
Cys Lys lie Asp Ala Glu Leu Phe Ser Glu Val lie lie Gln Leu
2075 2080 2085
Pro lie Phe Gly Thr Lys Asn Val Glu Glu Gly Val Gln Asn Glu
2090 2095 2100
Glu Tyr Lys Lys Phe Ser Leu Lys Pro Ser Leu Val Phe Asp Asp
2105 2110 2115
Asn Asn Asn Asp lie Lys Val lie Gly Lys Glu Lys Asn Glu Val
2120 2125 2130
Ser lie Ser Leu Ala Leu Lys Gly Val Tyr Gly Asn Arg lie Phe
2135 2140 2145
Thr Phe Asp Lys Asn Gly Lys Lys Gly Glu Gly lie Ser Phe Phe
2150 2155 2160
lie Pro Pro lie Lys Gln Asp Thr Asp Leu Lys Phe lie lie Asn
2165 2170 2175
Glu Thr lie Asp Asn Ser Asn lie Lys Gln Arg Gly Leu lie Tyr
2180 2185 2190
lie Phe Val Arg Lys Asn Val Ser Glu Asn Ser Phe Lys Leu Cys
2195 2200 2205
Asp Phe Thr Thr Gly Ser Thr Ser Leu Met Glu Leu Asn Ser Gln
2210 2215 2220
Val Lys Glu Lys Lys Cys Thr Val Lys lie Lys Lys Gly Asp lie
2225 2230 2235
Phe Gly Leu Lys Cys Pro Lys Gly Phe Ala lie Phe Pro Gln Ala
2240 2245 2250
Cys Phe Ser Asn Val Leu Leu Glu Tyr Tyr Lys Ser Asp Tyr Glu
2255 2260 2265
Asp Ser Glu His lie Asn Tyr Tyr lie His Lys Asp Lys Lys Tyr
2270 2275 2280
Asn Leu Lys Pro Lys Asp Val lie Glu Leu Met Asp Glu Asn Phe
2285 2290 2295
Arg Glu Leu Gln Asn lie Gln Gln Tyr Thr Gly lie Ser Asn lie
2300 2305 2310
Thr Asp Val Leu His Phe Lys Asn Phe Asn Leu Gly Asn Leu Pro
2315 2320 2325
Leu Asn Phe Lys Asn His Tyr Ser Thr Ala Tyr Ala Lys Val Pro
2330 2335 2340
Asp Thr Phe Asn Ser H e H e Asn Phe Ser Cys Asn Cys Tyr Asn
2345 2350 2355
Pro Glu Lys His val Tyr Gly Thr Met Gln val Glu Ser Asp Asn
2360 2365 2370
Arg Asn Phe Asp Asn lie Lys Lys Asn Glu Asn Val lie Lys Asn
2375 2380 2385
Phe Leu Leu Pro Asn H e Glu Lys Tyr Ala Leu Leu Leu Asp Asp
2390 2395 2400
Glu Glu Arg Gln Lys Lys lie Lys Gln Gln Gln Glu Glu Glu Gln
2405 2410 2415
Gln Glu Gln lie Leu Lys Asp Gln Asp Asp Arg Leu Ser Arg His
2420 2425 2430
Asp Asp Tyr Asn Lys Asn His Thr Tyr lie Leu Tyr Asp Ser Asn
2435 2440 2445
Glu His lie Cys Asp Tyr Glu Lys Asn Glu Ser Leu lie Ser Thr
2450 2455 2460
Leu Pro Asn Asp Thr Lys Lys lie Gln Lys Ser lie Cys Lys lie
2465 2470 2475
Asn Ale Lys Ala Leu Asp Val Val Thr lie Lys Cys Pro His Thr
2480 2485 2490
Lys Asn Phe Thr Pro Lys Asp Tyr Phe Pro Asn Ser Ser Leu lie
2495 2500 2505
Thr Asn Asp Lys Lys lie Val lie Thr Phe Asp Lys Lys Asn Phe
2510 2515 2520
Val Thr Tyr lie Asp Pro Thr Lys Lys Thr Phe Ser Leu Lys Asp
2525 2530 2535
lie Tyr lie Gln Ser Phe Tyr Gly Val Ser Leu Asp His Leu Asn
2540 2545 2550
Gln lie Lys Lys lie His Glu Glu Trp Asp Asp Val His Leu Phe
2555 2560 2565
Tyr Pro Pro His Asn Val Leu His Asn Val Val Leu Asn Asn His
2570 2575 2580
lie Val Asn Leu Ser Ser Ala Leu Glu Gly Val Leu Phe Met Lys
2585 2590 2595
Ser Lys Val Thr Gly Asp Glu Thr Ala Thr Lys Lys Asn Thr Thr
2600 2605 2610
Leu Pro Thr Asp Gly Val Ser Ser lie Leu lie Pro Pro Tyr Val
2615 2620 2625
Lys Glu Asp lie Thr Phe His Leu Phe Cys Gly Lys Ser Thr Thr
2630 2635 2640
Lys Lys Pro Asn Lys Lys Asn Thr Ser Leu Ala Leu lie His lie
2645 2650 2655
His lie Ser Ser Asn Arg Asn lie lie His Gly Cys Asp Phe Leu
2660 2665 2670
Tyr Leu Glu Asn Gln Thr Asn Asp Ala lie Ser Asn Asn Asn Asn
2675 2680 2685
Asn Ser Tyr Ser lie Phe Thr His Asn Lys Asn Thr Glu Asn Asn
2690 2695 2700
Leu lie Cys Asp lie Ser Leu lie Pro Lys Thr Val lie Gly lie
2705 2710 2715
Lys Cys Pro Asn Lys Lys Leu Asn Pro Gln Thr Cys Phe Asp Glu
2720 2725 2730
Val Tyr Tyr Val Lys Gln Glu Asp Val Pro Ser Lys Thr lie Thr
2735 2740 2745
Ala Asp Lys Tyr Asn Thr Phe Ser Lys Asp Lys lie Gly Asn lie
2750 2755 2760
Leu Lys Asn Ala lie Ser lie Asn Asn Pro Asp Glu Lys Asp Asn
2765 2770 2775
Thr Tyr Thr Tyr Leu lie Leu Pro Glu Lys Phe Glu Glu Glu Leu
2780 2785 2790
lie Asp Thr Lys Lys Val Leu Ala Cys Thr Cys Asp Asn Lys Tyr
2795 2800 2B05
lie lie His Met Lys lie Glu Lys Ser Thr Met Asp Lys lie Lys
2810 2815 2820
lie Asp Glu Lys Lys Thr lie Gly Lys Asp lie Cys Lys Tyr Asp
2825 2330 2835
Val Thr Thr Lys Val Ala Thr Cys Glu lie lie Asp Thr lie Asp
2840 2345 2850
Ser Ser Val Leu Lys Glu His His Thr Val His Tyr Ser lie Thr
2855 2860 2B65
Leu Ser Arg Trp Asp Lys Leu lie lie Lys Tyr Pro Thr Asn Glu
2870 2875 2B80
Lys Thr His Phe Glu Asn Phe Phe Val Asn Pro Phe Asn Leu Lys
2885 2890 2B95
Asp Lys Val Leu Tyr Asn Tyr Asn Lys Pro lie Asn lie Glu His
2900 2905 2910
lie Leu Pro Gly Ala lie Thr Thr Asp lie Tyr Asp Thr Arg Thr
2915 2920 2925
Lys lie Lys Gln Tyr lie Leu Arg lie Pro Pro Tyr Val His Lys
2930 2935 2940
Asp lie His Phe Ser Leu Glu Phe Asn Asn Ser Leu Ser Leu Thr
2945 2950 2955
Lys Gln Asn Gln Asn lie lie Tyr Gly Asn Val Ala Lys lie Phe
2960 2965 2970
lie His lie Asn Gln Gly Tyr Lys Glu lie His Gly Cys Asp Phe
2975 2980 2985
Thr Gly Lys Tyr Ser His Leu Phe Thr Tyr Ser Lys Lys Pro Leu
2990 2995 3000
Pro Asn Asp Asp Asp lie Cys Asn Val Thr lie Gly Asn Asn. Thr
3005 3010 3015
Phe Ser Gly Phe Ala Cys Leu Ser His Phe Glu Leu Lys Pro Asn
3020 3025 3030
Asn Cys Phe Ser Ser Val Tyr Asp Tyr Asn Glu Ala Asn Lys Val
3035 3040 3045
Lys Lys Leu Phe Asp Leu Ser Thr Lys Val Glu Leu Asp His lie
3050 3055 3060
Lys Gln Asn Thr Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Tyr lie lie Phe Asn
3065 3070 3075
Lys Glu Ser Thr Lys Leu Lys Phe Ser Cys Thr Cys Ser Ser Asn
3080 3085 3090
Tyr Ser Asn Tyr Thr lie Arg lie Thr Phe Asp Pro Asn Tyr lie
3095 3100 3105
lie Pro Glu Pro Gln Ser Arg Ala lie lie Lys Tyr Val Asp Leu
3110 3115 3120
Gln Asp Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Leu Arg Lys Leu
3125 3130 3135
<210> 20
<211> 76
<212>ADN
<213> Gripe A
<220>
<223> Cebador directo, Anhui/Indonesia, Vietnam
<400> 20
caccatggga gtgaaagttc tttttgccct tatttgtatt gctgtggccg aggcctgcga 60
tcttgatggt gttaag 76
<210> 21
<211> 75
<212>ADN
<213> Gripe A
<220>
<223> Cebador directo, dominio globular, Califonia
<400> 21
caccatggga gtgaaagttc tttttgccct tatttgtatt gctgtggccg aggcctgtaa 60
gttgaggggt gttge 75
<210> 22
<211> 20
<212> ADN
<213> Virus de mosaico de alfalfa
<220>
<223> Cebador inverso
<400> 22
tcaatgacga tcaagatcgt 20
<210> 23
<211> 22
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Proteína de matriz 2, Califonia/04/2009/H1N1, Péptido M2
<300>
<308> ACP44153
<400> 23
Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Ser Glu Trp Glu Cys Arg Cys
1 5 10 15
Ser Asp Ser Ser Asp Pro
20
<210> 24
<211>498
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Proteína de la nucleocápsida, Califonia/04/2009/H1N1, NP
<300>
<308> ACP41106
<400> 24
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly 1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asp Ala Thr Glu lie Arg Ala Ser Val Gly Arg Met
20 25 30
lie Gly Gly lie Gly Arg Phe Tyr lie Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Asp Gly Arg Leu lie Gln Asn Ser lie Thr lie Glu 50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu 65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro lie
85 90 95
Tyr Arg Arg Val Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu lie Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu lie Arg Arg Val Trp Arg Gln Ala Asn Asn. Gly Glu Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His lie Met lie Trp His Ser Asn Leu Asn 130 135 140
Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser 165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala val Lys Gly val Gly Thr H e Ala Met Glu
180 185 190
Leu lie Arg Met lie Lys Arg Gly lie Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 210 215 220
lie Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp 225 230 235 240
Gln Val A r g Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu lie Glu Asp Leu 245 250 255
Figure imgf000050_0001
<210> 25
<211> 568
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, ganso de cabeza de bar/Qinghai/05/2005/H5N1, HAQ <300>
<308> ABA29447
<400> 25
Thr Thr Tyr lie Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val 210 215 220
Pro Lys lie Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met 225 230 235 240
Glu Phe Phe Trp Thr lie Leu Lys Pro Asn Asp Ala H e Asn Phe Glu 245 250 255
Ser Asn Gly Asn Phe lie Ala Pro Glu Asn Ala Tyr Lys lie Val Lys
260 265 270
Lys Gly Asp Ser Thr lie Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys
275 280 285
Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro lie Gly Ala lie Asn Ser Ser Met Pro 290 295 300
Phe His Asn lie His Pro Leu Thr lie Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val 305 310 315 320
Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln 325 330 335
Gly Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly
340 345 350
Phe lie Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser 370 375 380
Thr Gln Lys Ala lie Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser lie lie 385 390 395 400
Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn 405 410 415
Leu Glu Arg Arg lie Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp 450 455 460
Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly
Figure imgf000053_0001
<210> 26
<211> 449
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Anhui/1/2005/H5N1, NAA
<300>
<308> ABU94738
<400> 26
Figure imgf000054_0001
100 105 110
Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr
115 120 125
Val Lys Asp Arg Ser Pro His Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Val Gly 130 135 140
Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser 145 150 155 160
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr lie Gly lie Ser 165 170 175
Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly lie lie
180 185 190
Thr Asp Thr lie Lys Ser Trp Arg Asn Asn lie Leu Arg Thr Gln Glu
195 200 205
Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val Met Thr Asp 210 215 220
Gly Pro Ser Asn Gly Gln Ala Ser Tyr Lys lie Phe Lys Met Glu Lys 225 230 235 240
Gly Lys Val Val Lys Ser Val Glu Leu Asn Ala Pro Asn Tyr His Tyr 245 250 255
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Gly Ala Gly Glu lie Thr Cys Val Cys
260 265 270
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
275 280 285
Asn Leu Glu Tyr Gln lie Gly Tyr lie Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp 290 295 300
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Pro 305 310 315 320
Asn Gly Ala Tyr Gly lie Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly 325 330 335
Val Trp lie Gly Arg Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ser Gly Phe Glu
340 345 350
Met lie Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Glu Thr Asp Ser Asn Phe Ser
355 360 365
Figure imgf000056_0001
<210> 27
<211> 436
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Indonesia/5/2005/H5N1, NAI
<300>
<308>ABP51965
<400> 27
Figure imgf000057_0001
Val Lys Gln Asp lie Val Ala lie Thr Asp Irp Ser Gly Tyr Ser Gly 370 375 380
Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys lie Arg Pro
385 390 395 400
Cys Phe Trp Val Glu Leu lie Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr lie 405 410 415
Trp Thr Ser Gly Ser Ser lie Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr
420 425 430
Val Ser Trp Ser
435
<210> 28
<211> 471
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Países Bajos/219/2003/H7N7, NANL
<300>
<308> AAR 11367
<400> 28
Met Asn Pro Asn Gln Lys Leu Phe Ala Leu Ser Gly Val Ala lie Ala
1 5 10 15
Leu Ser Val Leu Asn Leu Leu lie Gly lie Ser Asn Val Gly Leu Asn
20 25 30
Val Ser Leu His Leu Lys Glu Lys Gly Pro Lys Gln Glu Glu Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Thr Thr lie Asn Gln Asn Asn Thr Thr Val Val Glu Asn Thr 50 55 60
Tyr Val Asn Asn Thr Thr lie lie Thr Lys Gly Thr Asp Leu Lys Thr
65 70 75 80
Pro Ser Tyr Leu Leu Leu Asn Lys Ser Leu Cys Asn Val Glu Gly Trp 85 90 95
Val Val lie Ala Lys Asp Asn Ala Val Arg Phe Gly Glu Ser Glu Gln
100 105 110
lie lie Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Thr Gly Cys
115 120 125
Figure imgf000059_0001
Asp Pro Asn Ser Arg lie Ala Glu Arg Gln Glu lie Val Asp Asn Asn
385 390 395 400
Asn Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe lie Asp Tyr Trp Asn Asp Asn 405 410 415
Ser Glu Cys Tyr Asn Pro Cys Phe Tyr Val Glu Leu lie Arg Gly Arg
420 425 430
Pro Glu Glu Ala Lys Tyr Val Trp Trp Ala Ser Asn Ser Leu lie Ala
435 440 445
Leu Cys Gly Ser Pro Phe Pro Val Gly Ser Gly Ser Phe Pro Asp Gly 450 455 460
Ala Gln lie Gln Tyr Phe Ser
465 470
<210> 29
<211> 449
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, ganso de cabeza de bar/Qinghai/05/2005/H5N1, NAQ
<300>
<308> ABA29448
<400> 29
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0001
<210> 30
<211> 449
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Vietnam/1194/2004/H5N1, NAV
<300>
<308>ABP52007
<400> 30
115 120 125
Val Lys Asp Arg Ser Pro His Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Val Gly 130 135 140
Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser 145 150 155 160
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr lie Gly lie Ser 165 170 175
Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly lie lie
180 185 190
Thr Asp Thr lie Lys Ser Trp Arg Asn Asn lie Leu Arg Thr Gln Glu
195 200 205
Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val Met Thr Asp 210 215 220
Gly Pro Ser Asn Gly Gln Ala Ser His Lys lie Phe Lys Met Glu Lys 225 230 235 240
Gly Lys Val Val Lys Ser Val Glu Leu Asp Ala Pro Asn Tyr His Tyr 245 250 255
Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ala Gly Glu lie Thr Cys Val Cys
260 265 270
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln
275 280 285
Asn Leu Glu Tyr Gln lie Gly Tyr lie Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp 290 295 300
Asn Pro Arg Pro Asn Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Ser 305 310 315 320
Asn Gly Ala Gly Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly 325 330 335
Val Trp lie Gly Arg Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ser Gly Phe Glu
340 345 350
Met lie Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Glu Thr Asp Ser Ser Phe Ser
355 360 365
Val Lys Gln Asp lie Val Ala lie Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly 370 375 380
Sec Phe Val Gln His Pro Glu Leu Tbr Gly Leu Asp Cys lie Arg Pro
385 390 395 400
Cys Phe Trp Val Glu Leu lie Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr lie 405 410 415
Trp Thr Ser Gly Ser Ser lie Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr
420 425 430
Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr lie Asp
435 440 445
Lys
<210> 31
<211> 469
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Califonia/04/2009/H1N1, NAC04
<300>
<308> ACP41107
<400> 31
Figure imgf000065_0001
Asn Asn Phe Ser H e Lys Gln Asp H e Val Gly H e Asn Glu Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp 405 410 415
Cys lie Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu lie Arg Gly Arg Pro Lys
420 425 430
Glu Asn Thr H e Trp Thr Ser Gly Ser Ser lie Ser Phe Cys Gly Val
435 440 445
Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro 450 455 460
Phe Thr lie ASp Lys
465
<210> 32
<211> 469
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Califonia/06/2009/H1N1, NAC06
<300>
<308> ACP52564
<400> 32
Figure imgf000067_0001
Asn Gly Phe Glu Met lie Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp 370 375 380
Asn Asn Phe Ser lie Lys Gln Asp lie Val Gly lie Asn Glu Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp 405 410 415
Cys lie Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu lie Arg Gly Arg Pro Lys
420 425 430
Glu Asn Thr lie Trp Thr Ser Gly Ser Ser lie Ser Phe Cys Gly Val
435 440 445
Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro 450 455 460
Phe Thr lie Asp Lys
465
<210> 33
<211> 469
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Brisbane/10/2007/H3N2, NAB(N2)
<300>
<308> ABW23407
<400> 33
Met Asn Pro Asn Gln Lys lie lie Thr lie Gly Ser Val Ser Leu Thr
1 5 10 15
lie Ser Thr lie Cys Phe Phe Met Gln lie Ala lie Leu lie Thr Thr
20 25 30
Val Thr Leu His Phe Lys Gln Tyr Glu Phe Asn Ser Pro Pro Asn Asn
35 40 45
Gln Val Met Leu Cys Glu Pro Thr lie lie Glu Arg Asn lie Thr Glu 50 55 60
lie Val Tyr Leu Thr Asn Thr Thr lie Glu Lys Glu lie Cys Pro Lys
65 70 75 80
Leu Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Asp lie Thr Gly 85 90 95
Figure imgf000069_0001
355 360 365
Lys Ser Arg Leu Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val lie Glu Gly Trp Ser 370 375 380
Asn Pro Lys Ser Lys Leu Gln lie Asn Arg Gln Val lie Val Asp Arg
385 390 395 400
Gly Asn Arg Ser Gly Tyr Ser Gly lie Phe Ser val Glu
Figure imgf000070_0001
Lys Ser
405 410 415
Cys lie Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu lie Arg Gly Arg Lys Glu
420 425 430
Glu Thr Glu Val Leu Trp Thr Ser Asn Ser lie Val Val Phe Cys Gly
435 440 445
Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asp lie 450 455 460
Asn Leu Met Pro lie
465
<210> 34
<211> 466
<212> PRT
<213> Gripe B
<220>
<223> Neuraminidasa, secuencia de tipo Brsbane, NAB(B)
<300>
<308> ACN29381
<400> 34
Met Leu Pro Ser Thr lie Gln Thr Leu Thr Leu Phe Leu Thr Ser Gly
1 5 10 15
Gly Val Leu Leu Ser Leu Tyr Val Ser Ala Ser Leu Ser Tyr Leu Leu
20 25 30
Tyr Ser Asp lie Leu Leu Lys Phe Ser Pro Thr Glu lie Thr Ala Pro
35 40 45
Thr Met Pro Leu Asp Cys Ala Asn Ala Ser Asn Val Gln Ala Val Asn 50 55 60
Arg Ser Ala Thr Lys Gly Val Thr Leu Leu Leu Pro Glu Pro Glu Trp
65 70 75 80
Thr Tyr Pro Arg Leu Ser Cys Pro Gly Ser Thr Phe Gln Lys Ala Leu
Figure imgf000071_0001
Val His Gln Arg Met Glu Ser Lys lie Gly Arg Trp Tyr Ser Arg Thr
355 360 365
Met Ser Lys Thr Glu Arg Met Gly Met Gly Leu Tyr Val Lys Tyr Asp 370 375 380
Gly Asp Pro Trp Ala Asp Ser Asp Ala Leu Ala Phe Ser Gly Val Met
385 390 395 400
Val Ser Met Lys Glu Pro Gly Trp Tyr Ser Phe Gly Phe Glu lie Lys 405 410 415
Asp Lys Lys Cys Asp Val Pro Cys lie Gly lie Glu Met Val His Asp
420 425 430
Gly Gly Lys Glu Thr Trp His Ser Ala Ala Thr Ala lie Tyr Cys Leu
435 440 445
Met Gly Ser Gly Gln Leu Leu Trp Asp Thr Val Thr Gly Val Asp Met 450 455 460
Ala Leu
465
<210> 35
<211> 467
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Brisbane/59/2007/H1N1, NAB(N1)
<300>
<308> ACA28847
<400> 35
Met Asn Pro Asn Gln Lys lie lie Thr lie Gly Ser lie Ser lie Ala
1 5 10 15
lie Gly lie lie Ser Leu Met Leu Gln lie Gly Asn lie lie Ser lie
20 25 30
Trp Ala Ser His Ser lie Gln Thr Gly Ser Gln Asn Asn Thr Gly lie
35 40 45
Cys Asn Gln Arg lie lie Thr Tyr Glu Asn Ser Thr Trp Val Asn His 50 55 60
Thr Tyr Val Asn lie Asn Asn Thr Asn Val Val Ala Gly Glu Asp Lys
65 70 75 80
Figure imgf000073_0001
Pro Val Thr Val Asp Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr Lys
340 345 350
Tyr Asp Asn Gly Val Trp lie Gly Arg Thr Lys Ser Asn Arg Leu Arg
355 360 365
Lys Gly Phe Glu Met lie Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Asn Thr Asp 370 375 380
Ser Asp Phe Ser Val Lys Gln Asp Val Val Ala lie Thr Asp Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp 405 410 415
Cys lie Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Val Arg Gly Leu Pro Arg
420 425 430
Glu Asn Thr Thr lie Trp Thr Ser Gly Ser Ser lie Ser Phe Cys Gly
435 440 445
Val Asn Ser Asp Thr Ala Asn Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu 450 455 460
Pro Phe Thr
465
<210> 36
<211> 466
<212> PRT
<213> Gripe B
<220>
<223> Neuraminidasa, Floida/4/2006, NAF
<300>
<308> ACA33351
<400> 36
Met Leu Pro Ser Thr lie Gln Thr Leu Thr Leu Phe Leu Thr Ser Gly
1 5 10 15
Gly Val Leu Leu Ser Leu Tyr Val Ser Ala Ser Leu Ser Tyr Leu Leu
20 25 30
Tyr Ser Asp lie Leu Leu Lys Phe Ser Gln Thr Glu lie Thr Ala Pro
35 40 45
lie Met Pro Leu Asp Cys Ala Asn Ala Ser Asn Val Gln Ala Val Asn 50 55 60
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
<210> 37
<211> 466
<212> PRT
<213> Gripe B
<220>
<223> Neuraminidasa, Malasia/2506/2004, NAM
<400> 37
Met Leu Pro Ser Thr lie Gln Thr Leu Thr Leu Phe Leu Thr Ser Gly
1 5 10 15
Leu Tyr Val Ser Ala Ser Leu Ser Tyr Leu Leu 25 30
Leu Lys Phe Pro Ser Thr Glu lie Thr Ala Pro 40 45
Figure imgf000076_0002
Cys Ala Asn Ala Ser Asn Val Gln Ala Val Asn
55 60
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
<210> 38
<211> 470
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Nueva Caledonia/20/99/H1N1, NANC
<300>
<308> ABQ10080
<400> 38
Figure imgf000079_0001
Ser Phe Asn Gln Asn Leu Asp Tyr Gln lie Gly Tyr lie Cys Ser Gly
305 310 315 320
Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Lys Asp Gly Glu Gly Ser Cys Asn 325 330 335
Pro Val Thr Val Asp Gly Ala Asp Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr Lys
340 345 350
Tyr Gly Asn Gly Val Trp lie Gly Arg Thr Lys Ser Asn Arg Leu Arg
355 360 365
Lys Gly Phe Glu Met lie Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Asp Thr Asp 370 375 380
Ser Asp Phe Ser Val Lys Gln Asp Val Val Ala lie Thr Asp Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln Hls Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp 405 410 415
Cys lie Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Val Arg Gly Leu Pro Arg
420 425 430
Glu Asn Thr Thr lie Trp Thr Ser Gly Ser Ser lie Ser Phe Cys Gly
435 440 445
Val Asn Ser Asp Thr Ala Asn Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu 450 455 460
Pro Phe Thr lie Asp Lys
465 470
<210> 39
<211> 457
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Islas Salomón/3/2006/H1N1, NASI
<300>
<308> ABU99068
<400> 39
Trp Ala Ser His Ser lie Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly lie
35 40 45
Cys Asn Gln Arg lie lie Thr Tyr Glu Asn Ser Thr Trp Val Asn Asn
50 55 60
Thr Tyr Val Asn lie Asn Asn Thr Asn Val Val Ala Glu Lys Asp Lys 65 70 75 80
Thr Ser Val Thr Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Ser lie Ser Gly 85 90 95
Trp Ala lie Tyr Thr Lys Asp Asn Ser lie Arg lie Gly Ser Lys Gly
100 105 110
Asp Val Phe Val lie Arg Glu Pro Phe H e Ser Cys Ser His Leu Glu
115 120 125
Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
130 135 140
Ser Asn Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser 145 150 155 160
Cys Pro Leu Gly Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser 165 170 175
Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Met Gly Trp Leu Thr
180 185 190
lie Gly lie Ser Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr
195 200 205
Asn Gly lie lie Thr Glu Thr lie Lys Ser Trp Lys Lys Arg lie Leu
210 215 220
Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Met Asn Gly Ser Cys Phe Thr 225 230 235 240
lie Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly Ala Ala Ser Tyr Lys lie Phe 245 250 255
Lys lie Glu Lys Gly Lys Val Thr Lys Thr lie Glu Leu Asn Ala Pro
260 265 270
Asn Phe His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Thr Gly Thr Val
275 280 285
Met Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val 290 295 300
Ser Phe Asn Gln Asn Leu Asp Tyr Gln lie Gly Tyr lie Cys Ser Gly
305 310 315 320
Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Lys Asp Gly Glu Gly Ser Cys Asn 325 330 335
Pro Val Thr Val Asp Gly Ala Asp Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr Lys
340 345 350
Tyr Gly Asn Gly Val Trp lie Gly Arg Thr Lys Ser Asn Arg Leu Arg
355 360 365
Lys Gly Phe Glu Met lie Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Asn Thr Asp 370 375 380
Ser Asp Phe Ser Val Lys Gln Asp Val Val Ala lie Thr Asp Trp Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp 405 410 415
Cys lie Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Val Arg Gly Leu Pro Arg
420 425 430
Glu Asn Thr Thr lie Trp Thr Ser Gly Ser Ser lie Ser Phe Cys Gly
435 440 445
Val Asn Ser Gly Thr Ala Asn Trp Ser
450 455
<210> 40
<211> 469
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Wisconsin/67/2005/H3N2, NAWI
<400> 40
Met Asn Pro Asn Gln Lys lie lie Thr lie Gly Ser Val Ser Leu Thr
1 5 10 15
lie Ser Thr lie Cys Phe Phe Met Gln lie Ala lie Leu lie Thr Thr
20 25 30
Val Thr Leu His Phe Lys Gln Tyr Glu Phe Asn Ser Pro Pro Asn Asn
35 40 45
Gln Val Met Leu Cys Glu Pro Thr lio lio Glu Arg Asn lie Thr Glu 50 55 60
lie Val Tyr Leu Thr Asn Thr Thr lie Glu Lys Glu lie Cys Pro Lys 65 70 75 80
Leu Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Asn lie Thr Gly 85 90 95
Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser lie Arg Leu Ser Ala Gly Gly
100 105 110
Asp lie Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Lys
115 120 125
Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Val His 130 135 140
Ser Asn Asp Thr Val His Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met 145 150 155 160
Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys lie 165 170 175
Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val
180 185 190
Cys Val Thr Gly Asp Asp Lys Asn Ala Thr Ala Ser Phe lie Tyr Asn
195 200 205
Gly Arg Leu Val Asp Ser lie Val Ser Trp Ser Lys Glu lie Leu Arg 210 215 220
Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys lie Asn Gly Thr Cys Thr Val Val 225 230 235 240
Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Lys Ala Asp Thr Lys lie Leu Phe 245 250 255
lie Glu Glu Gly Lys lie Val His Thr Ser Thr Leu Ser Gly Ser Ala
260 265 270
Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Leu Gly Val Arg
275 280 285
Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro lie Val Asp 290 295 300
lie Asn lie Lys Asp Tyr Ser lie Val Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly
Figure imgf000084_0001
<210> 41
<211> 469
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Neuraminidasa, Wyoming/3/03/H3N2, NAWY
<300>
<308> AAT08001
<400> 41
35 40 45
Gln Val Met Leu Cys Glu Pro Thr lie lie Glu Arg Asn lie Thr Glu 50 55 60
lie Val Tyr Leu Thr Asn Thr Thr lie Glu Lys Glu lie Cys Pro Lys 65 70 75 80
Leu Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Asn lie Thr Gly 85 90 95
Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser lie Arg Leu Ser Ala Gly Gly
100 105 110
Asp lie Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Lys
115 120 125
Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Val His 130 135 140
Ser Asn Asp Thr Val His Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met 145 150 155 160
Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys lie 165 170 175
Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val
180 185 190
Cys Val Thr Gly Asp Asp Glu Asn Ala Thr Ala Ser Phe lie Tyr Asn
195 200 205
Gly Arg Leu Val Asp Ser lie Val Ser Trp Ser Lys Lys lie Leu Arg 210 215 220
Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys lie Asn Gly Thr Cys Thr Val Val 225 230 235 240
Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Lys Ala Asp Thr Lys lie Leu Phe 245 250 255
lie Glu Glu Gly Lys lie Val His Thr Ser Thr Leu Ser Gly Ser Ala
260 265 270
Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Gly Val Arg
275 280 285
Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro lie Val Asp 290 295 300
lie Asn lie Lys Asp Tyr Ser lie Val Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly
305 310 315 320
Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Lys Asn Asp Ser Ser Ser Ser Ser His 325 330 335
Cys Leu Asp Pro Asn Asn Glu Glu Gly Gly His Gly Val Lys Gly Trp
340 345 350
Ala Phe Asp Asp Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr lie Ser Glu
355 360 365
Lys Leu Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val lie Glu Gly Trp Ser 370 375 380
Asn Pro Asn Ser Lys Leu Gln lie Asn Arg Gln Val lie Val Asp Arg
385 390 395 400
Gly Asn Arg Ser Gly Tyr Ser Gly lie Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser 405 410 415
Cys lie Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu lie Arg Gly Arg Lys Gln
420 425 430
Glu Thr Glu Val Leu Trp Thr Ser Asn Ser lie Val Val Phe Cys Gly
435 440 445
Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asp lie 450 455 460
Asn Leu Met Pro lie
465
<210> 42
<211> 565
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, Brisbane/59/2007/H1N1, HAB(H1)
<300>
<308> ACA28844
<400> 42
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly lie 50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp lie Leu Gly 65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu lie Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr lie 85 90 95
Val Glu Lys Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly His Phe
100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu lie Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr
130 135 140
Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Glu Ser Ser Phe 145 150 155 160
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn 165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu
180 185 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn lie Gly Asp Gln Lys Ala Leu Tyr
195 200 205
His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg
210 215 220
Lys Phe Thr Pro Glu H e Ala Lys Arg Pro Lys val Arg Asp Gln Glu 225 230 235 240
Gly Arg lie Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr lie 245 250 255
lie Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu lie Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Ala
260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly lie lie Asn Ser Asn Ala Pro Met
275 280 285
Figure imgf000088_0001
Ser Leu Gly Ala lie Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln
545 550 555 560
Cys Arg lie Cys lie
565
<210> 43
<211> 584
<212> PRT
<213> Gripe B
<220>
<223> Hemaglutinina, Floida/4/2006, HAF
<300>
<308> aca33493
<400> 43
Met Lys Ala lie lie Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp
1 5 10 15
Arg lie Cys Thr Gly lie Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys
20 25 30
Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val lie Pro Leu Thr
35 40 45
Thr Thr Pro Thr Lys Ser Tyr Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Arg Thr 50 55 60
Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asp Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val
65 70 75 80
Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala 85 90 95
Ser lie Leu His Glu Val Lys Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro lie
100 105 110
Met His Asp Arg Thr Lys lie Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly
115 120 125
Tyr Glu Asn lie Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val lie Asp Ala Glu Lys 130 135 140
Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn
145 150 155 160
Ala Thr Ser Lys Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro 165 170 175 Lys Asp Asn Asn Lys Asn Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val Pro
180 185 190
Tyr lie Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gln lie Thr Val Trp Gly Phe His
195 200 205
Ser Asp Asp Lys Thr Gln Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn Pro
210 215 220
Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser 225 230 235 240
Gln lie Gly Ser Phe Pro Asp Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln 245 250 255
Ser Gly Arg lie Val Val Asp Tyr Met Met Gln Lys Pro Gly Lys Thr
260 265 270
Gly Thr lie Val Tyr Gln Arg Gly Val Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp
275 280 285
Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val lie Lys Gly Ser Leu Pro Leu lie
290 295 300
Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser 305 310 315 320
Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala lie Gly Asn Cys Pro 325 330 335
lie Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg
340 345 350
Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala lie Ala
355 360 365
Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met lie Ala Gly Trp His Gly
370 375 380
Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys 385 390 395 400
Ser Thr Gln Glu Ala lie Asn Lys lie Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu 405 410 415
Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp
420 425 430
Glu Leu His Asn Glu lie Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu
435 440 445
Arg Ala Asp Thr lie Ser Ser Sin lie Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser 450 455 460
Asn Glu Gly lie lie Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu
465 470 475 480
Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Glu lie Gly Asn 485 490 495
Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg
500 505 510
lie Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe
515 520 525
Asp Ser Leu Asn lie Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp 530 535 540
Asn His Thr lie Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala
545 550 555 560
Val Thr Leu Met Leu Ala lie Phe lie Val Tyr Met Val Ser Arg Asp 565 570 575
Asn Val Ser Cys Ser lie Cys Leu
580
<210> 44
<211> 586
<212> PRT
<213> Gripe B
<220>
<223> Hemaglutinina, Malasia/2506/2004, HAM, Secuencia de tipo 2004
<400> 44
Met Lys Ala lie lie Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp 1 5 10 15
Arg lie lie Cys Thr Gly lie Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val
20 25 30
Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val lie Pro Leu
35 40 45
Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu 50 55 60
Figure imgf000092_0001
Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala lie Gly Asn 325 330 335
Cys Pro lie Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys
340 345 350
Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala
355 360 365
lie Ale Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met lie Ala Gly Trp 370 375 380
His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp 385 390 395 400
Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala lie Asn Lys lie Thr Lys Asn Leu Asn 405 410 415
Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala
420 425 430
Met Asp Glu Leu His Asn Glu lie Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp
435 440 445
Asp Leu Arg Ala Asp Thr lie Ser Ser Gln lie Glu Leu Ala Val Leu 450 455 460
Leu Ser Asn Glu Gly lie lie Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala 465 470 475 480
Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Glu lie 485 490 495
Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu
500 505 510
Asp Arg lie Ala Ala Gly Thr Phe Asp Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro
515 520 525
Thr Phe Asp Ser Leu Asn lie Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly 530 535 540
Leu Asp Asn His Thr lie Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser 545 550 555 560
Leu Ala Val Thr Leu Met lie Ala lie Phe Val Val Tyr Met Val Ser 565 570 575
Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser lie Cys Leu
580 585
<210> 45
<211> 565
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, Nueva Caledonia/20/99/H1N1, HANC
<300>
<308> AAP34324
<400> 45
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly lie 50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp lie Leu Gly
65 70 75 SO
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu lie Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr lie 85 90 95
Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe
100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu lie Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140
Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe
145 150 155 160
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn 165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu
180 185 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn lie Gly Asn Gln Arg Ala Leu Tyr
195 200 205
His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg 210 215 220
Arg Phe Thr Pro Glu lie Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu 225 230 235 240
Gly Arg lie Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr lie 245 250 255
lie Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu lie Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala
2S0 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly He lie Thr Ser Asn Ala Pro Met
275 280 285
Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala lie Asn Ser 290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr lie Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320
Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335
lie Pro Ser lie Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly Phe
340 345 350
H e Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His
355 360 365
His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380
Gln Asn Ala lie Asn Gly lie Thr Asn Lys Val Asn Ser Val lie Glu 385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu
420 425 430
Asp lie Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu lie Gly Asn Gly Cys
465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys 485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Lys lie Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln
515 520 525
lie Leu Ala lie Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 530 535 540
Ser Leu Gly Ala lie Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln
545 550 555 560
Cys Arg lie Cys lie
565
<210> 46
<211> 565
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, Islas Salomón/3/2006/H1N1, HASI
<300>
<308> ABU99069
<400> 46
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly lie 50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp lie Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu lie Ser Arg Glu Ser Trp Ser Tyr lie
Figure imgf000097_0001
lie Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyt Gly Tyt His
355 360 365
His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380
Gln Asn Ala lie Asn Gly lie Thr Asn Lys Val Asn Ser Val lie Glu
385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe lie
420 425 430
Asp lie Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu lie Gly Asn Gly Cys
465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys 485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Lys lie Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln
515 520 525
lie Leu Ala lie Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu
Figure imgf000098_0001
530 535 540
Ser Leu Gly Ala lie Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn
Figure imgf000098_0002
545 550 555 560
Cys Arg lie Cys lie
565
<210> 47
<211> 566
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina, Wisconsin/67/2005/H3N2, HAWI
<400> 47
Met Lys rhr lie lie Ala Leu Ser Tyr lie Leu Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr lie Val Lys Thr lie Thr Asn Asp
35 40 45
Gln lie Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 50 55 60
Gly Gly lie Cys Asp Ser Pro His Gln lie Leu Asp Gly Glu Asn Cys 65 70 75 80
Thr Leu lie Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln 85 90 95
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
115 120 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asp Glu Ser Phe Asn Trp Thr 130 135 140
Gly val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ser Cys Lys Arg Arg Ser Asn 145 150 155 160
Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys Phe Lys 165 170 175
Tyr Pro Ala Leu Asn val Thr Met Pro Asn Asa Glu Lys Phe Asp Lys
180 185 190
Leu Tyr lie Trp Gly Val His His Pro Val Thr Asp Asn Asp Gln lie
195 200 205
Phe Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg lie Thr Val Ser Thr Lys Arg 210 215 220
Ser Gln Gln Thr Val lie Pro Asn lie Gly Ser Arg Pro Arg lie Arg 225 230 235 240
Asn lie Pro Ser Arg lie Ser lie Tyr Trp Thr lie Val Lys Pro Gly 245 250 255
Figure imgf000100_0001
Asn Asn Arg Phe Gln lie Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
515 520 525
Asp Trp lie Leu Trp lie Ser Phe Ala lie Ser Cys Phe Leu Leu Cys 530 535 540
Val Ala Leu Leu Gly Phe lie Met Trp Ala Cya Gln Lya Gly Asn lie
545 550 555 560
Arg Cys Asn lie Cys lie
565
<210> 48
<211> 566
<212> PRT
<213> Gripe A
<220>
<223> Hemaglutinina,
Figure imgf000101_0001
<300>
<308> AAT08000
<400> 48
Met Lys Thr H e H e Ala Leu Ser Tyr lie Leu Cys Leu Val Phe Ser
1 5 10 15
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr lie Val Lys Thr lie Thr Asn Asp
35 40 45
Gln H e Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 50 55 60
Gly Gly lie Cys Asp Ser Pro His Gln lie Leu Asp Gly Glu Asn Cys
65 70 75 80
Thr Leu lie Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln 85 90 95
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
115 120 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Ala 130 135 140
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg Ser Asn 145 150 155 160
Lys Ser- Phe Fhe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys Tyr Lys 165 170 175
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe Asp Lys
130 185 190
Leu Tyr lie Trp Gly Val His His Pro Val Thr Asp Ser Asp Gln lie
195 200 205
Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg lie Thr Val Ser Thr Lys Arg
210 215 220
Ser Gln Gln Thr Val lie Pro Asn lie Gly Tyr Arg Pro Arg Val Arg 225 230 235 240
Asp lie Ser Ser Arg lie Ser lie Tyr Trp Thr lie Val Lys Pro Gly 245 250 255
Asp lie Leu Leu lie Asn Ser Thr Gly Asn Leu lie Ala Pro Arg Gly
260 265 270
Tyr Phe Lys lie Arg Ser Gly Lys Ser Ser lie Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
Pro lie Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys lie Thr Pro Asn Gly Ser lie
290 295 300
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg lie Thr Tyr Gly Ala 305 310 315 320
Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 325 330 335
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly lie Phe Gly Ala lie Ala
340 345 350
Gly Phe lie Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
370 375 380
Ser Thr Gln Ala Ala lie Asn Gln lie Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu 385 390 395 400
lie Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln lie Glu Lys Glu Phe Ser
Figure imgf000103_0001
<210> 49
<211> 287
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
<400> 49
Thr lie Ser Arg val Ser Lys Lys His Thr Ala Arg Asp Gly Glu Tyr 65 70 75 80
Gly Glu Tyr Gly Glu Ala Val Glu Asp Gly Glu Asn Val lie Lys lie 85 90 95
lie Arg Ser Val Leu Glu Ser Gly Ala Leu Pro Ser Val Gly Val Asp
100 105 110
Glu Leu Asp Lys lie Asp Leu Ser Tyr Glu Thr Thr Glu Ser Gly Asp
115 120 125
Thr Ala Val Ser Glu Asp Ser Tyr Asp Lys Tyr Ala Ser Gln Asn Thr 130 135 140
Asn Lys Glu Tyr Val Cys Asp Phe Thr Asp Gln Leu Lys Pro Thr Glu 145 150 155 160
Ser Gly Pro Lys Val Lys Lys Cys Glu Val Lys Val Asn Glu Pro Leu 165 170 175
lie Lys Val Lys lie lie Cys Pro Leu Lys Gly Ser Val Glu Lys Leu
180 185 190
Tyr Asp Asn lie Glu Tyr Val Pro Lys Lys Ser Pro Tyr Val Val Leu
195 200 205
Thr Lys Glu Glu Thr Lys Leu Lys Glu Lys Leu Leu Ser Lys Leu lie 210 215 220
Tyr Gly Leu Leu lie Ser Pro Thr Val Asn Glu Lys Glu Asn Asn Phe 225 230 235 240
Lys Glu Gly Val lie Glu Phe Thr Leu Pro Pro Val Val His Lys Ala 245 250 255
Thr Val Phe Tyr Phe lie Cys Asp Asn Ser Lys Thr Glu Asp Asp Asn
260 265 270
Lys Lys Gly Asn Arg Gly lie Val Glu Val Tyr Val Glu Pro Tyr
275 280 285

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una partícula de tipo virus que consiste en una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión comprende (a) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a la de una proteína de revestimiento del virus del mosaico de alfalfa, en la que la proteína de revestimiento tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y (b) una proteína diana, en la que la proteína diana proviene de una proteína de superficie de un organismo patógeno intracelular que es adecuada para su uso en vacunas, y en la que la partícula de tipo virus contiene menos del 10 % en peso de ácido nucleico.
2. La partícula de tipo virus de la reivindicación 1, en la que el organismo patógeno intracelular se selecciona del grupo que consiste en bacterias, virus, hongos y organismos parásitos.
3. La partícula de tipo virus de la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína diana es un polipéptido de la superficie celular de Plasmodium falciparum o un fragmento antigénico del mismo.
4. La partícula de tipo virus de la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína diana es un polipéptido de hemaglutinina de un virus de la gripe o un fragmento antigénico del mismo.
5. La partícula de tipo virus de la reivindicación 4, en la que el virus de la gripe es un virus de la gripe A seleccionado del grupo que consiste en H1N1, H3N2, H5N1 y H7N7.
6. La partícula de tipo virus de la reivindicación 4, la que el virus de la gripe es un virus de la gripe B.
7. La partícula de tipo virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la proteína diana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-11 y 49, y fragmentos antigénicos de las mismas.
8. La partícula de tipo virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la proteína diana está fusionada al extremo N-terminal de la proteína de revestimiento.
9. La partícula de tipo virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la partícula de tipo virus se produce en una célula hospedadora seleccionada del grupo que consiste en células bacterianas, fúngicas, vegetales, de insecto, de anfibio y de mamífero.
10. Una composición inmunogénica que comprende la partícula de tipo virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. La composición inmunogénica de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente un adyuvante.
12. La composición inmunogénica de la reivindicación 11, en la que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en sales de aluminio, emulsiones de aceite y agua, y adyuvantes a base de saponina.
13. Una partícula de tipo virus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en la inducción de una respuesta inmune protectora frente a un organismo patógeno intracelular en un sujeto, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición que comprende la partícula de tipo virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013122262A1 (en) 2012-02-16 2013-08-22 Vlp Therapeutics, Llc Virus like particle composition
EP2827893B1 (en) * 2012-03-22 2017-11-29 Fraunhofer USA, Inc. Virus-like particles comprising a matrix protein from a plant enveloped virus and uses thereof
AP2015008926A0 (en) 2013-06-03 2015-12-31 Vlp Therapeutics Llc Malaria vaccine
US9637532B2 (en) 2013-07-12 2017-05-02 Vlp Therapeutics, Llc Virus like particle comprising PD-1 antigen or PD-1 ligand antigen
US10918712B2 (en) 2014-03-03 2021-02-16 Albert Einstein College Of Medicine Passive transfer of immunity using recombinant herpes simplex virus 2 (HSV-2) vaccine vectors
CN106456805B (zh) 2014-03-03 2020-01-10 阿尔伯特爱因斯坦医学院公司 重组单纯疱疹病毒2(hsv-2)疫苗载体
EP3177720B1 (en) 2014-08-08 2021-09-22 VLP Therapeutics, Inc. Virus like particle comprising modified envelope protein e3
US10385101B2 (en) 2014-08-08 2019-08-20 Vlp Therapeutics, Llc Virus like particle comprising modified envelope protein E3
CA2960102C (en) 2014-09-11 2023-10-24 Vlp Therapeutics, Llc Flavivirus virus like particle
US20180312545A1 (en) * 2015-11-09 2018-11-01 Curevac Ag Optimized nucleic acid molecules
CA3041888A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 Fraunhofer Usa, Inc. Covalently fused viral coat proteins for the display of target molecules
CN106986943B (zh) * 2017-02-28 2020-12-25 国药中生生物技术研究院有限公司 一种包含北极地松鼠肝炎病毒核心蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5977438A (en) * 1988-02-26 1999-11-02 Biosource Technologies, Inc. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
CN1926238A (zh) * 2004-02-27 2007-03-07 陶氏化学公司 植物细胞中的高效肽生产
EP1909829A4 (en) * 2005-07-19 2009-11-11 Dow Global Technologies Inc RECOMBINANT GRIP VACCINES
BRPI0619089A2 (pt) * 2005-12-02 2011-09-13 Dow Global Tecnologies Inc partìculas virais de plantas e métodos para a inativação da mesma
CA2676481A1 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 Folia Biotech Inc. Papaya mosaic virus-based vaccines against salmonella typhi and other enterobacterial pathogens
EP3061462B1 (en) * 2007-07-02 2019-02-27 Etubics Corporation Methods and compositions for producing an adenovirus vector for use with multiple vaccinations
SG187500A1 (en) * 2008-01-21 2013-02-28 Medicago Inc Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin

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