ES2750564T3 - Synthetic gene for the expression of SM-14 in Pichia pastoris, production and purification procedures for SM-14 and its use as a vaccine and diagnostic medium - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de producción de proteína Sm14 recombinante en Pichia pastoris que consiste en: (a) la síntesis de una secuencia de nucleótidos definida por SEQ ID NO: 3; (b) la clonación de la secuencia de nucleótidos sintetizada obtenida en la etapa (a) anterior en el vector pPIC9K mediante el sitio BamHI y la reconstitución de la secuencia Kozak del gen AOX1 antes del codón de inicio de la proteína Sm14, para la expresión de Sm14 en su forma intracelular; y (c) la transformación de P. pastoris con el plásmido pPIC9K-Sm14-MV y la selección de los clones recombinantes con múltiples copias.A method for the production of recombinant Sm14 protein in Pichia pastoris consisting of: (a) the synthesis of a nucleotide sequence defined by SEQ ID NO: 3; (b) the cloning of the synthesized nucleotide sequence obtained in step (a) above into the vector pPIC9K through the BamHI site and the reconstitution of the Kozak sequence of the AOX1 gene before the start codon of the Sm14 protein, for expression of Sm14 in its intracellular form; and (c) transformation of P. pastoris with plasmid pPIC9K-Sm14-MV and selection of recombinant clones with multiple copies.

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Gen sintético para la expresión de SM-14 en Pichia pastoris, procedimientos de producción y purificación de SM-14 y su uso como vacuna y medio de diagnósticoSynthetic gene for the expression of SM-14 in Pichia pastoris, production and purification procedures for SM-14 and its use as a vaccine and diagnostic medium

Campo de la invenciónField of the Invention

La presente invención está relacionada con el campo de la producción de proteínas recombinantes utilizando un gen sintético asociado con una alta expresión proteica en Pichia pastoris. Más específicamente, la presente invención describe la producción de la proteína recombinante Sm14 de Schistosoma mansoni. Se creó un gen sintético para promover la expresión alta de Sm14 y con este gen los inventores obtuvieron y modificaron una cepa de Pichia pastoris para la producción eficaz de una vacuna. Los inventores también mejoraron los procedimientos de producción y purificación proteica a partir de células de P. pastoris; la producción industrial de dichos procedimientos puede programarse.The present invention is related to the field of recombinant protein production using a synthetic gene associated with high protein expression in Pichia pastoris. More specifically, the present invention describes the production of the recombinant Sm14 protein from Schistosoma mansoni. A synthetic gene was created to promote high Sm14 expression and with this gene the inventors obtained and modified a strain of Pichia pastoris for the efficient production of a vaccine. The inventors also improved protein production and purification procedures from P. pastoris cells; Industrial production of such procedures can be scheduled.

AntecedentesBackground

El peso molecular de la proteína Sm14 es aproximadamente de 14,8 kDa y es significativamente similar a las proteínas que pertenecen a la familia que se une a los ácidos grasos. Esto se ha estudiado y descrito ampliamente por el solicitante en sus previas solicitudes de patente.The molecular weight of the Sm14 protein is approximately 14.8 kDa and is significantly similar to proteins that belong to the fatty acid-binding family. This has been extensively studied and described by the applicant in his previous patent applications.

La estructura tridimensional de la proteína Sm14 se predijo mediante modelado molecular por homología computarizada, así como por cristalografía y resonancia magnética nuclear. La estructura de la proteína Sm14 permitió identificar los epítopos potencialmente protectores e hizo posible utilizar la rSm14 como antígeno vacunal. La estructura de Sm14, así como los modelos construidos por proteínas homólogas de Fasciola hepatica (FABP tipo 3, es la que comparte mayor identidad de secuencia, un 49 %), muestra que estas moléculas adoptan configuraciones tridimensionales que son similares a las moléculas de otras familias de proteínas que se unen a los lípidos (proteínas de unión a ácidos grasos- FABP).The three-dimensional structure of the Sm14 protein was predicted by molecular modeling by computerized homology, as well as by crystallography and nuclear magnetic resonance. The structure of the Sm14 protein allowed the identification of potentially protective epitopes and made it possible to use rSm14 as a vaccine antigen. The structure of Sm14, as well as the models built by homologous proteins of Fasciola hepatica (FABP type 3, is the one that shares the highest sequence identity, 49%), shows that these molecules adopt three-dimensional configurations that are similar to the molecules of other families of proteins that bind to lipids (fatty acid binding proteins - FABP).

Por lo tanto, basándose en los conocimientos completos del estado de la técnica reunidos por los inventores, demostrarán aquí cómo las formas recombinantes de Sm14 pueden proporcionar una protección significativa contra las infecciones causadas por helmintos supuestamente patógenos respecto a los seres humanos y los animales. En las publicaciones que demuestran la actividad protectora de Sm14 por primera vez, se expresaba la proteína recombinante correspondiente con el vector pGEMEX-Sm14 como cuerpos de inclusión. Después de aislar y lavar los anticuerpos, se purificaba la proteína mediante electroforesis de preparación de la banda correspondiente (Tendler et al., A Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein, Sm14, is the potential basis of a dual-purpose antihelminth vaccine. Proc Natl Acad Sci U S A. v. 93, p. 269-273 1996) por electroelución. Sin embargo, esta metodología no era adecuada para la producción de proteínas a gran escala. Más tarde, la Sm14 se comenzó a producir con una fusión de seis histidinas consecutivas (6xHis) en el extremo amino del sistema de expresión de Escherichia coli, como cuerpos de inclusión. Después de obtener y solubilizar los cuerpos, era necesario volver a replegarla con el fin de obtener una proteína funcional e inmunológicamente activa (Ramos et al., r-Sm14 - pRSETA efficacy in experimental analysis. Mem Inst Oswaldo Cruz. v. 96 p. 131-135, 2001). Ramos et al., Stability improvement of the fatty acid binding protein Sm14 from S. mansoni by Cys replacement: structural and functional characterization of a vaccine candidate. El documento Biochim Biophys Acta. v. 1794, p. 655-662, 2009, ser refiere a mutantes 62V de Sm14 que se utilizan en experimentos de desafío en animales. El documento de Varaldo et al (2006) FEMS Immunol Med Microbiol Vol. 48, páginas 132-139 describe la expresión de una Sm14 de Schistosoma mansoni con el codón optimizado para el bacilo de Calmette-Guerin de Mycobacterium bovis. Therefore, based on the complete knowledge of the state of the art gathered by the inventors, they will demonstrate here how the recombinant forms of Sm14 can provide significant protection against infections caused by supposedly pathogenic helminths with respect to humans and animals. In publications demonstrating the protective activity of Sm14 for the first time, the corresponding recombinant protein was expressed with the vector pGEMEX-Sm14 as inclusion bodies. After isolating and washing the antibodies, the protein was purified by corresponding band preparation electrophoresis (Tendler et al., A Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein, Sm14, is the potential basis of a dual-purpose antihelminth vaccine. Proc Natl Acad Sci US A. v. 93, p. 269-273 1996) by electroelution. However, this methodology was not suitable for large-scale protein production. Later, Sm14 began to be produced with a fusion of six consecutive histidines (6xHis) at the amino terminus of the Escherichia coli expression system , as inclusion bodies. After obtaining and solubilizing the bodies, it was necessary to refold it in order to obtain a functional and immunologically active protein (Ramos et al., R-Sm14 - pRSETA efficacy in experimental analysis. Mem Inst Oswaldo Cruz. V. 96 p. 131-135, 2001). Ramos et al., Stability improvement of the fatty acid binding protein Sm14 from S. mansoni by Cys replacement: structural and functional characterization of a vaccine candidate. Biochim Biophys Acta. V. 1794, p. 655-662, 2009, ser refers to 62V Sm14 mutants that are used in animal challenge experiments. Varaldo et al (2006) FEMS Immunol Med Microbiol Vol. 48, pages 132-139 describe the expression of a Sm14 of Schistosoma mansoni with the codon optimized for the Calmette-Guerin bacillus of Mycobacterium bovis.

Por lo tanto, a pesar de todo el conocimiento reunido por los inventores aún hay desventajas que superar con el fin de que se pueda obtener material antigénico con altas prestaciones, a escala industrial y en condiciones GMP, y que no pierdan las características de estabilidad.Therefore, despite all the knowledge gathered by the inventors, there are still disadvantages to overcome in order to obtain antigenic material with high performance, on an industrial scale and under GMP conditions, and that do not lose the stability characteristics.

Sumario de la invenciónSummary of the invention

La presente invención propone una plataforma para la producción de una vacuna recombinante contra helmintos en Pichia pastoris. Mediante la plataforma mencionada anteriormente es posible obtener una vacuna recombinante contra helmintos (en P. pastoris), incluyendo procedimientos de producción y purificación de Sm14 desarrollados en el sistema de Pichia pastoris. The present invention proposes a platform for the production of a recombinant helminth vaccine in Pichia pastoris. By means of the aforementioned platform it is possible to obtain a recombinant helminth vaccine (in P. pastoris), including Sm14 production and purification procedures developed in the Pichia pastoris system.

La solicitud también desvela un gen sintético para la expresión de la proteína Sm14. La transformación genética de Pichia pastoris con este gen sintético bajo el control del promotor AOX1 permite la producción y purificación de Por lo tanto, la invención permite la obtención de Sm14 a partir de un gen sintético que contienen los codones optimizados para la alta expresión en Pichia pastoris, SEQ ID NO: 3 (secuencia final del gen), así como los procedimientos de purificación de Sm14. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de producción de proteína recombinante Sm14 en Pichia pastoris que consiste en:The application also discloses a synthetic gene for the expression of the Sm14 protein. The genetic transformation of Pichia pastoris with this synthetic gene under the control of the AOX1 promoter allows the production and purification of Therefore, the invention enables Sm14 to be obtained from a synthetic gene containing codons optimized for high expression in Pichia pastoris, SEQ ID NO: 3 (final gene sequence), as well as the Sm14 purification procedures. . In one aspect, the invention provides a method of producing recombinant Sm14 protein in Pichia pastoris consisting of:

(a) la síntesis de una secuencia de nucleótidos definida por SEQ ID NO: 3;(a) the synthesis of a nucleotide sequence defined by SEQ ID NO: 3;

(b) la clonación de la secuencia de nucleótidos sintetizada obtenida en la etapa (a) anterior en el vector pPIC9K mediante el sitio BamHI y la reconstitución de la secuencia Kozak del gen AOX1 antes del codón de inicio de la proteína Sm14, para la expresión de Sm14 en su forma intracelular; y(b) cloning the synthesized nucleotide sequence obtained in step (a) above into the pPIC9K vector using the BamHI site and reconstitution of the Kozak sequence of the AOX1 gene prior to the Sm14 protein start codon, for expression Sm14 in its intracellular form; Y

(c) la transformación de P. pastoris con el plásmido pPIC9K-Sm14-MV y la selección de los clones recombinantes con múltiples copias.(c) transformation of P. pastoris with plasmid pPIC9K-Sm14-MV and selection of recombinant clones with multiple copies.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de purificación de la proteína recombinante expresada en Pichia pastoris obtenida en un procedimiento de producción de acuerdo con el procedimiento de producción inventivo anterior, consistiendo dicho proceso en las siguientes etapas:In another aspect, the invention provides a purification process of the recombinant protein expressed in Pichia pastoris obtained in a production process according to the previous inventive production process, said process consisting of the following steps:

(a) llevar a cabo la lisis de las células de P. pastoris; (a) carrying out the lysis of P. pastoris cells ;

(b) clarificar el lisado obtenido en la etapa (a);(b) clarify the lysate obtained in step (a);

(c) cargar el lisado clarificado en una resina de intercambio aniónico y después de la carga de la proteína, se eluye la proteína mediante cambios de pH en la columna; y(c) loading the clarified lysate into an anion exchange resin and after loading the protein, the protein is eluted by pH changes in the column; Y

(d) separación de las proteínas contaminantes de la proteína recombinante por filtración en gel.(d) separation of the contaminating proteins from the recombinant protein by gel filtration.

Breve descripción de las figurasBrief description of the figures

La Figura 1 muestra la estrategia para la construcción del plásmido pPIC9K-Sm14-MV.Figure 1 shows the strategy for the construction of plasmid pPIC9K-Sm14-MV.

La Figura 2 muestra la clonación del Sm14-MV en el pPIC9K.Figure 2 shows the cloning of Sm14-MV into pPIC9K.

La Figura 3 muestra el análisis de PCR de los clones de P. pastoris. Figure 3 shows the PCR analysis of the P. pastoris clones .

La Figura 4 muestra la inducción de la expresión de Sm14 en los clones de P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV.Figure 4 shows the induction of Sm14 expression in the P. pastoris GS115 / pPIC9K-Sm14-MV clones.

La Figura 5 muestra la inducción de la expresión de Sm14 en P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV.Figure 5 shows the induction of Sm14 expression in P. pastoris GS115 / pPIC9K-Sm14-MV.

La Figura 6 muestra los resultados de la purificación de Sm14.Figure 6 shows the results of the Sm14 purification.

La Figura 7 muestra los resultados del cromatograma de la filtración en gel de la proteína Sm14-MV producida en P. pastoris. Figure 7 shows the results of the chromatogram of the gel filtration of the Sm14-MV protein produced in P. pastoris.

La Figura 8 muestra un análisis de transferencia de Western de la proteína purificada de P. pastoris. Figure 8 shows a Western blot analysis of the purified protein from P. pastoris.

La Figura 9 muestra el espectro del dicroísmo circular de la proteína Sm14 purificada de P. pastoris. Figure 9 shows the spectrum of circular dichroism of the purified Sm14 protein from P. pastoris.

Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

El fin principal de la presente invención es producir una vacuna recombinante contra helmintos. Este objetivo se puede conseguir produciendo proteínas recombinantes utilizando un gen sintético para la alta expresión proteica en Pichia pastoris. De acuerdo con la invención se creó un gen sintético para promover la expresión alta de Sm14 y con este gen los inventores obtuvieron una cepa de Pichia pastoris para la producción eficaz de una vacuna. La presente invención incluye también los procedimientos de producción y purificación de la proteína a partir de células de P. pastoris; dichos procedimientos se pueden programar para la producción industrial.The main purpose of the present invention is to produce a recombinant helminth vaccine. This objective can be achieved by producing recombinant proteins using a synthetic gene for high protein expression in Pichia pastoris. In accordance with the invention a synthetic gene was created to promote the high expression of Sm14 and with this gene the inventors obtained a strain of Pichia pastoris for the efficient production of a vaccine. The present invention also includes the methods of production and purification of the protein from P. pastoris cells ; Such procedures can be programmed for industrial production.

El sistema de expresión en la levadura metilotrófica Pichia pastoris tiene ventajas significativas cuando se compara con los sistemas basados en E. coli para la producción de proteínas recombinantes a escala industrial. Entre dichas ventajas se pueden mencionar, por ejemplo, la estabilidad de las cepas transformadas, la alta expresión, el cultivo de alta densidad, la programación fácil del cultivo, no hay peligro para la salud humana, y no produce endotoxinas (Faber et al., Review: Methylotropic Yeasts as Factories for the Production of Foreign Proteins. Yeast, v. 11, p. 1331­ 1344, 1995). La última ventaja es uno de los factores que tienen influencia en el cambio de microorganismos para la expresión proteica. Esto es debido a que la necesidad de detectar o cuantificar endotoxinas producidas por bacterias gramnegativas en cada lote sería un factor limitante, ya que los productos generados en E. coli que se utilicen posteriormente en seres humanos tienen que estar libres de endotoxinas bacterianas. Este requisito adicional dificultaría los procedimientos de producción en E. coli y esto tendría un impacto negativo en los costes de producción finales.The Pichia pastoris methylotrophic yeast expression system has significant advantages when compared to E. coli based systems for the production of recombinant proteins on an industrial scale. These advantages include, for example, the stability of the transformed strains, the high expression, the high-density culture, the easy programming of the culture, there is no danger to human health, and it does not produce endotoxins (Faber et al. , Review: Methylotropic Yeasts as Factories for the Production of Foreign Proteins. Yeast, v. 11, p. 1331 1344, 1995). The last advantage is one of the factors that influence the change of microorganisms for protein expression. This is because the need to detect or quantify endotoxins produced by gram-negative bacteria in each batch would be a limiting factor, since the products generated in E. coli that are subsequently used in humans have to be free of bacterial endotoxins. This additional requirement would hinder production procedures in E. coli and this would have a negative impact on final production costs.

La invención se describirá ahora mediante su mejor procedimiento de ejecución.The invention will now be described by its best method of execution.

1. OBTENCIÓN DE LA CEPA RECOMBINANTE DE Pichia pastoris 1. OBTAINING THE RECOMBINANT STRAIN OF Pichia pastoris

1.1 Gen sintético para la expresión de Sm14 en P. pastoris: 1.1 Synthetic gene for the expression of Sm14 in P. pastoris:

Primero se diseñó y sintetizó un gen que contenía los codones que estaban optimizados para obtener la máxima expresión de Sm14 en P. pastoris. En este caso los inventores utilizaron Sm14-MV; sin embargo, se puede utilizar cualquier forma de Sm14. First, a gene was designed and synthesized that contained the codons that were optimized to obtain the maximum expression of Sm14 in P. pastoris. In this case the inventors used Sm14-MV; however, any form of Sm14 can be used.

Hay pruebas en la bibliografía sobre el uso diferencial de codones entre proteínas con bajos y altos niveles de expresión en el mismo organismo (Roymondal y Sahoo, Predicting gene expression level from relative codon usage bias: an application Escherichia coli genome. DNA Res. v. 16, p. 13-30, 2009).There is evidence in the literature on the differential use of codons between proteins with low and high levels of expression in the same organism (Roymondal and Sahoo, Predicting gene expression level from relative codon usage bias: an application Escherichia coli genome. DNA Res. V. 16, p. 13-30, 2009).

Sin embargo, las tablas de utilización del codón en las bases de datos (por ejemplo, en: (www.kazusa.or.ip/codon) contienen datos de todas las proteínas del cuerpo y no tienen en cuenta el nivel de expresión genética. Por esta razón, con el fin de diseñar el gen, los inventores inicialmente perfilaron una tabla de uso del codón basándose en los datos de las secuencias que codifican proteínas recombinantes que se expresaban por encima de 1 gramo por litro de cultivo en P. pastoris (véase la Tabla 1), así como la secuencia para la proteína AOX1 (que representa el 30 % de la proteína de P. pastoris, después de la inducción con metanol).However, the codon utilization tables in databases (for example, at: (www.kazusa.or.ip / codon) contain data for all proteins in the body and do not take into account the level of gene expression. For this reason, in order to design the gene, the inventors initially outlined a codon usage table based on data from the sequences encoding recombinant proteins that were expressed above 1 gram per liter of culture in P. pastoris ( see Table 1), as well as the sequence for the AOX1 protein (representing 30% of the P. pastoris protein , after induction with methanol).

Tabla 1: Lista de proteínas recombinantes con alta expresión en P. pastoris. Table 1: List of recombinant proteins with high expression in P. pastoris.

Para el diseño de la secuencia los inventores escogieron la secuencia de la proteína Sm14-MV que tiene un resto de valina en la posición 62 sustituyendo una cisteína, que la hace más estables (Ramos et al., 2009); se representa aquí como SEQ ID NO: 1.For the design of the sequence, the inventors chose the sequence of the Sm14-MV protein that has a valine residue at position 62, replacing a cysteine, which makes it more stable (Ramos et al., 2009); It is represented here as SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 1SEQ ID NO: 1

MSSFLGKWKL SESHNFDAVM SKLGVSWATR QIGNTVTPTV TFTMDGDKMT MLTESTFKNL SVTFKFGEEF DEKTSDGRNV KSVVEKNSES KLTQTQVDPK NTTVIVREVD GDTMKTTVTV GDVTAIRNYK RLSMSSFLGKWKL SESHNFDAVM SKLGVSWATR QIGNTVTPTV TFTMDGDKMT MLTESTFKNL SVTFKFGEEF DEKTSDGRNV KSVVEKNSES KLTQTQVDPK NTTVIVREVD GDTMKTTVTV GDVTAIRNYK RLS

Después de la primera selección de codones de acuerdo con la tabla perfilada con los datos de proteínas de la Tabla 1, los inventores llevaron a cabo las depuraciones de secuencia lo que resultó en los sitios donantes de terminación de la transcripción (ATTTA) y los receptores crípticos de corte y empalme (MAGGTRAGT y YYYNTAGC, respectivamente) y las secuencias repetitivas (sitios de escisión para las enzimas de restricción BamHI y EcoRI). La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia diseñada para expresar la proteína Sm14-MV en Pichia pastoris. After the first codon selection according to the table outlined with the protein data in Table 1, the inventors carried out the sequence clearances resulting in the donor transcription termination sites (ATTTA) and the receptors cut and splice cryptics (MAGGTRAGT and YYYNTAGC, respectively) and the repetitive sequences (cleavage sites for the restriction enzymes BamHI and EcoRI). SEQ ID NO: 2 shows the sequence designed to express the Sm14-MV protein in Pichia pastoris.

SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 2

1 ATGTCTTCTT TCTTGGGTAA GTGGAAGTTG TCTGAATCTC ACAACTTCGA1 ATGTCTTCTT TCTTGGGTAA GTGGAAGTTG TCTGAATCTC ACAACTTCGA

51 CGCTGTTATG TCTAAGTTGG GTGTTTCTTG GGCTACCAGA CAAATTGGTA51 CGCTGTTATG TCTAAGTTGG GTGTTTCTTG GGCTACCAGA CAAATTGGTA

101 ACACCGTTAC TCCAACCGTT ACCTTCACCA TGGACGGTGA CAAGATGACT101 ACACCGTTAC TCCAACCGTT ACCTTCACCA TGGACGGTGA CAAGATGACT

151 ATGTTGACCG AGTCTACCTT CAAGAACTTG TCTGTTACTT TCAAGTTCGG151 ATGTTGACCG AGTCTACCTT CAAGAACTTG TCTGTTACTT TCAAGTTCGG

201 TGAAGAGTTC GACGAAAAGA CTTCTGACGG TAGAAACGTT AAGTCTGTTG201 TGAAGAGTTC GACGAAAAGA CTTCTGACGG TAGAAACGTT AAGTCTGTTG

251 TTGAAAAGAA CTCTGAATCT AAGTTGACTC AAACTCAAGT TGACCCAAAG251 TTGAAAAGAA CTCTGAATCT AAGTTGACTC AAACTCAAGT TGACCCAAAG

301 AACACTACCG TTATCGTTAG AGAAGTTGAC GGTGACACTA TGAAGACTAC301 AACACTACCG TTATCGTTAG AGAAGTTGAC GGTGACACTA TGAAGACTAC

351 TGTTACCGTT GGTGACGTTA CCGCTATCAG AAACTACAAG AGATTGTCTT351 TGTTACCGTT GGTGACGTTA CCGCTATCAG AAACTACAAG AGATTGTCTT

401 AA401 AA

Los inventores añadieron la secuencia Kozak del gen de la proteína AOX1 de P. pastoris (AAACG) al extremo 5' de la secuencia diseñada. Finalmente, los inventores añadieron los sitios de restricción para BamHI (GGATCC) y EcoRI (GAATTC) a los extremos 5' y 3' del gen diseñado, respectivamente.The inventors added the Kozak sequence of the P. pastoris AOX1 protein gene (AAACG) to the 5 'end of the designed sequence. Finally, the inventors added the restriction sites for BamHI (GGATCC) and EcoRI (GAATTC) to the 5 'and 3' ends of the designed gene, respectively.

La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia final del gen sintético para la producción de la proteína Sm14.SEQ ID NO: 3 shows the final sequence of the synthetic gene for the production of the Sm14 protein.

SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 3

1 GGATCCAAAC GATGTCTTCT TTCTTGGGTA AGTGGAAGTT GTCTGAATCT1 GGATCCAAAC GATGTCTTCT TTCTTGGGTA AGTGGAAGTT GTCTGAATCT

51 CACAACTTCG ACGCTGTTAT GTCTAAGTTG GGTGTTTCTT GGGCTACCAG51 CACAACTTCG ACGCTGTTAT GTCTAAGTTG GGTGTTTCTT GGGCTACCAG

101 ACAAATTGGT AACACCGTTA CTCCAACCGT TACCTTCACC ATGGACGGTG101 ACAAATTGGT AACACCGTTA CTCCAACCGT TACCTTCACC ATGGACGGTG

151 ACAAGATGAC TATGTTGACC GAGTCTACCT TCAAGAACTT GTCTGTTACT151 ACAAGATGAC TATGTTGACC GAGTCTACCT TCAAGAACTT GTCTGTTACT

201 TTCAAGTTCG GTGAAGAGTT CGACGAAAAG ACTTCTGACG GTAGAAACGT201 TTCAAGTTCG GTGAAGAGTT CGACGAAAAG ACTTCTGACG GTAGAAACGT

251 TAAGTCTGTT GTTGAAAAGA ACTCTGAATC TAAGTTGACT CAAACTCAAG251 TAAGTCTGTT GTTGAAAAGA ACTCTGAATC TAAGTTGACT CAAACTCAAG

301 TTGACCCAAA GAACACTACC GTTATCGTTA GAGAAGTTGA CGGTGACACT301 TTGACCCAAA GAACACTACC GTTATCGTTA GAGAAGTTGA CGGTGACACT

351 ATGAAGACTA CTGTTACCGT TGGTGACGTT ACCGCTATCA GAAACTACAA351 ATGAAGACTA CTGTTACCGT TGGTGACGTT ACCGCTATCA GAAACTACAA

401 GAGATTGTCT TAAGAATTC401 GAGATTGTCT TAAGAATTC

Después de sintetizar la secuencia diseñada (SEQ ID NO: 3), los inventores llevaron a cabo la clonación y después la secuenciación del gen sintético en el vector pCR2.1 para confirmar que la secuencia sintetizada era fiel a la secuencia diseñada.After synthesizing the designed sequence (SEQ ID NO: 3), the inventors carried out cloning and then sequencing of the synthetic gene in the pCR2.1 vector to confirm that the synthesized sequence was faithful to the designed sequence.

1.2 Construcción del plásmido para la expresión de Sm14 en Pichia pastoris: 1.2 Construction of the plasmid for the expression of Sm14 in Pichia pastoris:

El gen sintetizado se clonó en el vector pPIC9K donde la proteína Sm14 se expresa sin ninguna fusión, haciendo posible su producción intracelular.The synthesized gene was cloned into the vector pPIC9K where the Sm14 protein is expressed without any fusion, making its intracellular production possible.

El vector pPIC9K (Invitrogen) se escogió para la construcción del plásmido de expresión de Sm14 en P. pastoris por las siguientes razones:The vector pPIC9K (Invitrogen) was chosen for the construction of the Sm14 expression plasmid in P. pastoris for the following reasons:

(1) Se puede utilizar para expresar proteínas intracelulares sustituyendo el gen del factor alfa con el gen de elección, mediante el sitio de restricción BamHI del vector, localizado antes de la secuencia Kozak y el inicio de la traducción. Con el fin de hacer esto, era necesario recrear la secuencia Kozak antes de que se expresara el ATG de la ORF, de acuerdo con el diseño del gen sintético de la Sm14.(1) It can be used to express intracellular proteins by replacing the alpha factor gene with the gene of choice, through the vector's BamHI restriction site, located before the Kozak sequence and the start of translation. In order to do this, it was necessary to recreate the Kozak sequence before the ORF ATG was expressed, according to the design of the Sm14 synthetic gene.

(2) Ofrece la ventaja de permitir una selección de clones con múltiples copias integradas en el genoma seleccionando la resistencia al antibiótico G418. No había dicha posibilidad con el pPIC9 utilizado anteriormente. La estrategia de la construcción del plásmido pPIC9K-Sm14 se describe en la Figura 1.(2) It offers the advantage of allowing a selection of clones with multiple copies integrated into the genome by selecting resistance to the antibiotic G418. There was no such possibility with pPIC9 previously used. The construction strategy of plasmid pPIC9K-Sm14 is described in Figure 1.

Con el plásmido pCR21-Sm14-MV, los inventores cambiaron la cepa DH5a de E. coli para su propagación. Después se purificó el pADN con el kit Miniprep Spin Qiaprep (QIAGEN). El plásmido, así como el vector pPIC9K, se digirieron simultáneamente con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI (ambas de New England Biolabs). Después de la digestión, los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa que contenía bromuro de etidio. Los fragmentos correspondientes al vector pPIC9K y a la inserción Sm14-MV se escindieron del gel de agarosa y se purificaron con un kit de Extracción en Gel QIAquick (QIAGEN).With the plasmid pCR21-Sm14-MV, the inventors switched E. coli strain DH5a for propagation. The pDNA was then purified with the Miniprep Spin Qiaprep Kit (QIAGEN). The plasmid, as well as the vector pPIC9K, were digested simultaneously with the restriction enzymes BamHI and EcoRI (both from New England Biolabs). After digestion, the DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide. Fragments corresponding to the vector pPIC9K and the Sm14-MV insert were excised from the agarose gel and purified with a QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN).

Los fragmentos purificados se unieron utilizando una ADN ligasa T4 (New England Biolabs). La cepa DH5a de E. coli se transformó con la reacción de unión y se seleccionaron los clones en medio LB agar que contenía ampicilina. El pADN de uno cuantos clones resistentes a la ampicilina se purificaron y se analizaron por restricción con las enzimas BamHI y EcoRI, como se muestra en la Figura 2. En la Figura 2 se muestran los resultados de la clonación de Sm14-MV en pPIC9K; los clones se seleccionaron como se muestra posteriormente:The purified fragments were ligated using a T4 DNA ligase (New England Biolabs). The E. coli strain DH5a was transformed with the binding reaction and clones were selected on LB agar medium containing ampicillin. The pDNA from a few ampicillin resistant clones were purified and analyzed by restriction with the enzymes BamHI and EcoRI, as shown in Figure 2. The results of the cloning of Sm14-MV in pPIC9K are shown in Figure 2; the clones were selected as shown below:

M .-1 Kb de ADN escalonado phiX174/HaeIIIM.-1 Kb of phiX174 / HaeIII staggered DNA

1. - pPIC9K/BamHI EcoRI1. - pPIC9K / BamHI EcoRI

2. - pCR21-Sm14-MV/BamHI EcoRI2. - pCR21-Sm14-MV / BamHI EcoRI

3 a 11.- Clones pPIC9K-Sm14-MV/ BamHI EcoRI. 3 to 11.- Clones pPIC9K-Sm14-MV / BamHI EcoRI.

En la Figura 2 las flechas marcan la posición de inserción y el vector de clonación.In Figure 2 the arrows mark the insertion position and the cloning vector.

Los clones que presentaban bandas correspondientes a las inserciones se seleccionaron y secuenciaron con el cebador de AOX5 para confirmar la clonación satisfactoria y la fidelidad de la secuencia. Por lo tanto, la secuencia sintética para la expresión de Sm14 se mantuvo bajo el control del promotor fuerte de la alcohol oxidasa 1 (AOX1), que está inducido por metanol (Cregg et al., Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. BioTechnolochy. v. 11, p. 905-910, 1993).Clones displaying bands corresponding to the inserts were selected and sequenced with the AOX5 primer to confirm successful cloning and sequence fidelity. Therefore, the synthetic sequence for the expression of Sm14 was kept under the control of the strong promoter of alcohol oxidase 1 (AOX1), which is induced by methanol (Cregg et al., Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. BioTechnolochy. v. 11, p. 905-910, 1993).

1.3 Transformación de P. pastoris con el plásmido pPIC9K-Sm14-MV y selección de los clones recombinantes con múltiples copias1.3 Transformation of P. pastoris with plasmid pPIC9K-Sm14-MV and selection of recombinant clones with multiple copies

Con el fin de producir la proteína, se transformó la cepa GS115 (his4) de P. pastoris con el plásmido pPIC9K-Sm14-MV. Este último se purificó con el kit Maxiprep (Qiagen). El ADN plasmídico se digirió por separado con las enzimas BgllI y SacI (New England Biolabs), utilizando 20 |jg de ADN para cada reacción. Las reacciones de digestión se separaron por electroforesis en gel de agarosa y las bandas con los fragmentos de ADN que contenían el gen sintético de Sm14-MV se separaron del gel y se purificó el ADN.In order to produce the protein, the P. pastoris strain GS115 ( his4) was transformed with the plasmid pPIC9K-Sm14-MV. The latter was purified with the Maxiprep kit (Qiagen). Plasmid DNA was digested separately with the enzymes BglII and SacI (New England Biolabs), using 20 µg of DNA for each reaction. Digestion reactions were separated by agarose gel electrophoresis and the bands with DNA fragments containing the synthetic Sm14-MV gene were separated from the gel and the DNA was purified.

Se prepararon las células competentes de la cepa GS115 por electroporación y se transformaron por separado con ADN purificado de las reacciones de restricción por BgllI y SacI (10 jg de ADN por transformación). La digestión con la enzima BgllI guía la recombinación del casete de expresión del gen de AOX1, en el genoma de P. pastoris, mientras que la digestión con SacI se puede integrar en otras regiones.Competent cells of the GS115 strain were prepared by electroporation and separately transformed with DNA purified from the BgllI and SacI restriction reactions (10 jg of DNA per transformation). Digestion with the BgllI enzyme guides the recombination of the AOX1 gene expression cassette in the P. pastoris genome , whereas digestion with SacI can be integrated in other regions.

Después de la transformación, las células se dispersaron en medio RD (medio libre de histidina) que contenía: 1 M de sorbitol; un 2 % de dextrosa; un 1,34 % de YNB; 4 x 10-5 % de biotina; y un 0,005 % de cada aminoácido: L-glutamato, L-metionina, L-lisina, L-leucina y L-isoleucina para la selección de cepas transformadas mediante el marcador auxotrófico his4. Los clones que podían crecer en el medio libre de histidina se sometieron a una selección con el antibiótico G418 a concentraciones de: 0,5; 1; 2; y 4 mg/ml en un cultivo YPD (un 1 % de extracto de levadura, un 2 % de peptona; un 2 % de dextrosa) a 30 °C en placas de microcultivo. Solamente los clones transformados con el plásmido pPIC9K-Sm14-MV digeridos con la enzima SacI podían crecer con el G418 a 4 mg/ml; esto caracterizaba la inserción de múltiples copias del casete de expresión en el genoma de P. pastoris. After transformation, cells were dispersed in RD medium (histidine-free medium) containing: 1 M sorbitol; 2% dextrose; 1.34% YNB; 4 x 10-5% biotin; and 0.005% of each amino acid: L-glutamate, L-methionine, L-lysine, L-leucine and L-isoleucine for the selection of strains transformed by the his4 auxotrophic marker. Clones that could grow in histidine-free medium were screened with the antibiotic G418 at concentrations of: 0.5; 1; two; and 4 mg / ml in a YPD culture (1% yeast extract, 2% peptone; 2% dextrose) at 30 ° C in microculture plates. Only clones transformed with the plasmid pPIC9K-Sm14-MV digested with the enzyme SacI could grow with G418 at 4 mg / ml; this characterized the insertion of multiple copies of the expression cassette into the P. pastoris genome .

Con el fin de confirmar si los clones seleccionados tenían el casete de expresión del gen sintético, se purificó el ADN genómico de 17 clones y se utilizó en reacciones de PCR con cebadores AOX5 y AOX3'. Se utilizó el plásmido pPIC9K-Sm14-MV como control positivo. La Figura 3 muestra el análisis de PCR de los clones de P. pastoris GS115 transformados con el pPIC9K-Sm14-MV y seleccionados con 4 mg/ml de G418.In order to confirm whether the selected clones had the synthetic gene expression cassette, the genomic DNA of 17 clones was purified and used in PCR reactions with AOX5 and AOX3 'primers. Plasmid pPIC9K-Sm14-MV was used as a positive control. Figure 3 shows the PCR analysis of the P. pastoris GS115 clones transformed with pPIC9K-Sm14-MV and selected with 4 mg / ml G418.

M. - phiX174/HaeIIIM. - phiX174 / HaeIII

1 a 17. - Clones GS115/pPIC9K-Sm14-MV1 to 17. - Clones GS115 / pPIC9K-Sm14-MV

18. - Control positivo: plásmido pPIC9K-Sm14-MV.18. - Positive control: plasmid pPIC9K-Sm14-MV.

Como se muestra en la Figura 3, todos los clones seleccionados con 4 mg/ml de G418 presentaban la secuencia sintética de Sm14-MV.As shown in Figure 3, all selected clones containing 4 mg / ml G418 had the synthetic Sm14-MV sequence.

Con el fin de ensayar la expresión de la proteína Sm14, los clones se cultivaron en medio BMG (medio tamponado de glicerol mínimo) que contenía: Un 1,34 % de YNB; un 0,04 % de biotina, 0,1 M de fosfato potásico pH 6,0; y un 1 % de glicerol) durante 48 horas y luego se transfirieron a un medio BMM (medio tamponado de metanol mínimo, que contenía los mismos componentes que el medio BMG, excepto que el glicerol se sustituyó con un 0,5% de metanol y EDTA adicional para una concentración final de 1 mM), para la inducción de la expresión de la proteína recombinante. Después de 72 horas, se añadió un 0,5% de metanol cada 24 horas, y se analizaron las proteínas totales de cada clon mediante SDS-PAGE (Figura 4). La Figura 4 muestra los resultados de la inducción de la expresión de Sm14 en los clones de P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV.In order to test the expression of the Sm14 protein, the clones were cultured in BMG medium (minimal glycerol buffered medium) containing: 1.34% YNB; 0.04% biotin, 0.1 M potassium phosphate pH 6.0; and 1% glycerol) for 48 hours and then transferred to a BMM medium (minimal methanol buffered medium, containing the same components as the BMG medium, except that the glycerol was replaced with 0.5% methanol and Additional EDTA for a final concentration of 1 mM), for the induction of the expression of the recombinant protein. After 72 hours, 0.5% methanol was added every 24 hours, and the total proteins of each clone were analyzed by SDS-PAGE (Figure 4). Figure 4 shows the results of the induction of Sm14 expression in the P. pastoris GS115 / pPIC9K-Sm14-MV clones.

M.- marcador de bajo peso molecularM.- low molecular weight marker

1. - Control positivo, proteína Sm14 de E. coli purificada sin fusionar1. - Positive control, purified E. coli Sm14 protein without fusion

2 a 18 - Proteína total de los clones 1-17 GS115/pPIC9K-Sm14-MV después de la inducción con metanol.2 to 18 - Total protein of clones 1-17 GS115 / pPIC9K-Sm14-MV after induction with methanol.

1.4 Inducción de la expresión de Sm14 recombinante en P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV1.4 Induction of Recombinant Sm14 Expression in P. pastoris GS115 / pPIC9K-Sm14-MV

La Figura 5 muestra la inducción de la expresión de Sm14 en P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV, donde:Figure 5 shows the induction of Sm14 expression in P. pastoris GS115 / pPIC9K-Sm14-MV, where:

M.- Marcador de bajo peso molecularM.- Low molecular weight marker

1.- Muestra no inducida en medio BMG1.- Sample not induced in BMG medium

2 a 7.- Inducción de la expresión durante 0, 24, 48, 72 y 91 horas, respectivamente, en medio BMM2 to 7.- Induction of expression during 0, 24, 48, 72 and 91 hours, respectively, in BMM medium

8.- Control positivo, proteína Sm14 de E. coli purificada sin fusionar 8.- Positive control, purified E. coli Sm14 protein without fusion

Era posible observar una banda mayoritaria en todos los clones seleccionados que coincidía con el tamaño de la proteína Sm14 de E. coli purificada sin fusionar.It was possible to observe a majority band in all the selected clones that matched the size of the purified E. coli Sm14 protein without fusion.

Con el fin de confirmar si la proteína se inducía por el metanol, el clon n° 1 cultivado en un medio BMG durante 48 horas (Figura 5, carril 1) a 250 rpm, a 30 °C; se transfirió más tarde a un medio BMM (con un 0,5 % de metanol). Los inventores recolectaron muestras en diferentes intervalos de tiempo (Figura 5, carriles 2 a 7). Se añadió metanol al cultivo cada 24 horas, para alcanzar una concentración final del 0,5 %.In order to confirm whether the protein was induced by methanol, clone # 1 cultivated in a BMG medium for 48 hours (Figure 5, lane 1) at 250 rpm, at 30 ° C; it was later transferred to a BMM medium (containing 0.5% methanol). The inventors collected samples at different time intervals (Figure 5, lanes 2 to 7). Methanol was added to the culture every 24 hours, to reach a final concentration of 0.5%.

Como se muestra en la Figura 5, en el medio BMG los inventores no obtuvieron expresión proteica inducida por metanol (Figura 5, carril 1), y tampoco en el momento cero del medio de inducción BMM (Figura 5, carril 2). La inducción era visible tras las 24 horas de cultivo en medio BMM y se mantenía estable durante el cultivo celular, hasta las 91 horas que era el marco temporal del experimento.As shown in Figure 5, in the BMG medium the inventors did not obtain methanol-induced protein expression (Figure 5, lane 1), nor at time zero of the BMM induction medium (Figure 5, lane 2). The induction was visible after 24 hours of culture in BMM medium and remained stable during cell culture, until 91 hours, which was the time frame of the experiment.

Por lo tanto, los inventores han verificado la inducción específica de proteína recombinante correspondiente a Sm14 en P. pastoris. Therefore, the inventors have verified the specific induction of recombinant protein corresponding to Sm14 in P. pastoris.

En el experimento, utilizando solo el medio BMM y el metanol al 0,5 %, era posible alcanzar 26 gramos de peso celular húmedo por litro de cultivo, manteniendo un buen nivel de expresión de proteína Sm14, que es la proteína principal de las células después de la inducción con metanol. Además de utilizar un fermentador y medios más adecuados para la producción de proteínas recombinantes en P. pastoris, es posible obtener tanto una mayor masa celular como una mayor expresión de Sm14.In the experiment, using only the BMM medium and 0.5% methanol, it was possible to achieve 26 grams of wet cell weight per liter of culture, maintaining a good level of expression of the Sm14 protein, which is the main protein of cells after induction with methanol. In addition to using a fermenter and more suitable means for the production of recombinant proteins in P. pastoris, it is possible to obtain both a greater cell mass and a greater expression of Sm14.

2. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNA SM14 RECOMBINANTE EXPRESADA EN LA CEPA GS115/pPIC9K-Sm14-MV DE 2. PURIFICATION OF RECOMBINANT SM14 PROTEIN EXPRESSED IN THE GS115 / pPIC9K-Sm14-MV STRAIN OF P. pastorisP. pastoris

El protocolo de purificación para la Sm14 recombinante del citoplasma de P. pastoris se basaba en la metodología desarrollada en el Laboratorio de Esquistosomiasis experimental del Instituto Oswaldo Cruz (IOC) para la purificación de Sm14 sin fusión en el sistema de E. coli. The purification protocol for recombinant Sm14 from the P. pastoris cytoplasm was based on the methodology developed in the Oswaldo Cruz Institute (IOC) Experimental Schistosomiasis Laboratory for the purification of Sm14 without fusion in the E. coli system.

Lisis: La purificación de las proteínas recombinantes comienza con la lisis de las células de P. pastoris. En este punto, las células se resuspendieron en 30 mM de Tris-HCl 3,0 mM pH 9,5 y se lisaron en una prensa de French. El lisado se clarificó por centrifugación (Figura 6, carril 2). Lysis: The purification of the recombinant proteins begins with the lysis of P. pastoris cells . At this point, the cells were resuspended in 30mM 3.0mM Tris-HCl pH 9.5 and lysed in a French press. The lysate was clarified by centrifugation (Figure 6, lane 2).

Captura: El lisado clarificado se cargó en una resina Q-Sepharose XL (GE Healthcare), se equilibró con tampón A (30 mM de Tris-HCl pH 9,5). Toda la proteína Sm14 del lisado se absorbe por la resina, ya que no había proteína Sm14 en el material que no se absorbiera en la resina (Figura 6, carril 3). Después de cargarse la proteína, se lavó la columna con el tampón a. La proteína se eluyó con el tampón B (30 mM de Tris-HCl pH 8,0) en el sistema AKTA-fplc (GE Healthcare) (Figura 6, carriles 4-6). Capture: The clarified lysate was loaded on a Q-Sepharose XL resin (GE Healthcare), equilibrated with buffer A (30mM Tris-HCl pH 9.5). All Sm14 protein in the lysate is absorbed by the resin, since there was no Sm14 protein in the material that was not absorbed in the resin (Figure 6, lane 3). After loading the protein, the column was washed with buffer a. Protein was eluted with Buffer B (30mM Tris-HCl pH 8.0) in the AKTA-fplc system (GE Healthcare) (Figure 6, lanes 4-6).

Acabado: La proteína eluída de la resina Q-sepharose XL presenta pocas proteínas contaminantes. Con el fin de separar estas proteínas de la Sm14 los inventores utilizaron filtración en gel. Para llevarlo a cabo, se reunieron las fracciones de la cromatografía de intercambio iónico que contenían Sm14 y se concentraron en una membrana Centripep YM-10 (Millipore) y el material se aplicó en una columna Sephacryl S100 HR 26/60 (GE Healthcare) utilizando PBS a pH 7,4 como fase móvil. El pico cromatográfico (Figura 6, carril 8) presentaba el mismo volumen de retención que las proteínas sin fusionar producidas en E. coli (Figura 7). Finish: The protein eluted from the Q-sepharose XL resin has few contaminating proteins. In order to separate these proteins from Sm14 the inventors used gel filtration. To do this, the ion exchange chromatography fractions containing Sm14 were pooled and concentrated on a Centripep YM-10 membrane (Millipore) and the material was applied on a Sephacryl S100 HR 26/60 column (GE Healthcare) using PBS at pH 7.4 as the mobile phase. The chromatographic peak (Figure 6, lane 8) had the same retention volume as the unbound proteins produced in E. coli (Figure 7).

La Figura 6 muestra los resultados de la purificación de Sm14, dondeFigure 6 shows the results of the purification of Sm14, where

M.- marcador de bajo peso molecular M.- low molecular weight marker

1. - Control positivo, proteína Sm14 de E. coli purificada sin fusionar 1. - Positive control, purified E. coli Sm14 protein without fusion

2. - lisado clarificado, 2.- Proteínas no absorbidas en la resina Q-sepharose XL 2. - clarified lysate, 2.- Proteins not absorbed in the Q-sepharose XL resin

3-6.- Fracciones eluídas de la resina Q-sepharose XL 3-6.- Fractions eluted from the Q-sepharose XL resin

7. - Agrupamiento de las fracciones de la cromatografía de intercambio iónico 7. - Grouping of fractions from ion exchange chromatography

8. - Pico de la filtración en gel en la columna sephacryl S-100 HR 26/60 8. - Peak of gel filtration on the sephacryl S-100 HR 26/60 column

La Figura 7 muestra los resultados del cromatograma de la proteína Sm14-MV producida en P. pastoris. Figure 7 shows the results of the chromatogram of the Sm14-MV protein produced in P. pastoris.

4 - ANÁLISIS DE Sm14 RECOMBINANTE PRODUCIDA EN Pichia pastoris 4 - ANALYSIS OF Sm14 RECOMBINANT PRODUCED IN Pichia pastoris

La proteína recombinante de P. pastoris se purificó utilizando las mismas características fisicoquímicas que las de la proteína Sm14-MV sin fusionar expresada en E. coli. La proteína purificada de esta forma de P. pastoris se corresponde en tamaño con la proteína inducida específicamente por el metanol. Como los inventores tienen el gen sintético de Sm14-MV bajo el control del promotor AOX1 en el casete de expresión, dedujeron que la proteína expresada y purificada de P. pastoris es la Sm14-MV.The recombinant P. pastoris protein was purified using the same physicochemical characteristics as that of the unbound Sm14-MV protein expressed in E. coli. The protein purified from this form of P. pastoris corresponds in size to the protein specifically induced by methanol. Since the inventors have the synthetic Sm14-MV gene under the control of the AOX1 promoter in the expression cassette, they deduced that the expressed and purified protein from P. pastoris is Sm14-MV.

Con el fin de confirmar esta afirmación, se analizó la proteína purificada de P. pastoris mediante transferencia de In order to confirm this claim, the purified protein from P. pastoris was analyzed by transfer of

Claims (2)

REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento de producción de proteína Sm14 recombinante en Pichia pastoris que consiste en:1. A method of production of recombinant Sm14 protein in Pichia pastoris consisting of: (a) la síntesis de una secuencia de nucleótidos definida por SEQ ID NO: 3;(a) the synthesis of a nucleotide sequence defined by SEQ ID NO: 3; (b) la clonación de la secuencia de nucleótidos sintetizada obtenida en la etapa (a) anterior en el vector pPIC9K mediante el sitio BamHI y la reconstitución de la secuencia Kozak del gen AOX1 antes del codón de inicio de la proteína Sm14, para la expresión de Sm14 en su forma intracelular; y(b) cloning the synthesized nucleotide sequence obtained in step (a) above into the pPIC9K vector using the BamHI site and reconstitution of the Kozak sequence of the AOX1 gene prior to the Sm14 protein start codon, for expression Sm14 in its intracellular form; Y (c) la transformación de P. pastoris con el plásmido pPIC9K-Sm14-MV y la selección de los clones recombinantes con múltiples copias.(c) transformation of P. pastoris with plasmid pPIC9K-Sm14-MV and selection of recombinant clones with multiple copies. 2. Un procedimiento de purificación de la proteína recombinante expresada en Pichia pastoris obtenida en un procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 1, consistiendo dicho proceso en las siguientes etapas:2. A purification process of the recombinant protein expressed in Pichia pastoris obtained in a production process according to claim 1, said process consisting of the following steps: (a) llevar a cabo la lisis de las células de P. pastoris; (a) carrying out the lysis of P. pastoris cells ; (b) clarificar el lisado obtenido en la etapa (a);(b) clarify the lysate obtained in step (a); (c) cargar el lisado clarificado en una resina de intercambio aniónico y después de la carga de la proteína, se eluye la proteína mediante cambios de pH en la columna; y(c) loading the clarified lysate into an anion exchange resin and after loading the protein, the protein is eluted by pH changes in the column; Y (d) separación de las proteínas contaminantes de la proteína recombinante por filtración en gel. (d) separation of the contaminating proteins from the recombinant protein by gel filtration.