ES2744499T3 - Un proceso para la concentración de un polipéptido - Google Patents

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Abstract

Convertidor de energia undimotriz (WEC) que comprende: un flotador (100) destinado a reposar sobre la superficie de una masa de agua y disenado para moverse en fase con las olas presentes en la masa de agua; un espeque (200) destinado a extenderse verticalmente, generalmente en perpendicular al flotador y a la superficie de la masa de agua, donde dicho espeque se extiende por debajo de la superficie de la masa de agua y esta destinado a moverse verticalmente hacia arriba y hacia abajo generalmente fuera de fase con respecto a las olas; un dispositivo de toma de fuerza (PTO) (300), conectado entre el espeque y el flotador, que responde a su movimiento relativo para convertir su movimiento relativo en energia util; y una placa de arfada (204) conectada centralmente a una parte sumergida del espeque (200), donde dicha placa de arfada se extiende en un plano perpendicular al espeque, y la placa se mueve uniformemente hacia arriba y hacia abajo con el espeque para agregar masa efectivamente al espeque a medida que el espeque tiende a moverse hacia arriba y hacia abajo y hace que el espeque se mueva generalmente fuera de fase con respecto al flotador para aumentar la energia producida por el WEC, caracterizado por el hecho de que al menos una de las varillas y cables (210) estan conectados entre la periferia exterior de la placa de arfada y el espeque para garantizar una conexion estructuralmente firme entre la placa de arfada y el espeque, donde el espeque (200) tiene una parte superior y una parte inferior, donde el flotador se mueve hacia arriba y hacia abajo a lo largo de la parte superior del espeque, y donde la placa de arfada esta unida a traves de al menos una de las varillas y cables a una zona a lo largo del espeque; la zona del espeque a lo largo de la cual se conectan dichas varillas y cables se hace lo suficientemente larga para aumentar la resistencia estructural y reducir cualquier movimiento entre la placa de arfada y el espeque, y por el hecho de que la parte superior (200) y la parte inferior (202) del espeque se forman por separado y se interconectan a traves de un acoplamiento flexible (215) para reducir la magnitud de las fuerzas entre la placa de arfada y la parte superior del espeque transmitidas a traves del acoplamiento flexible.

Description

DESCRIPCIÓN
Un proceso para la concentración de un polipéptido.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para concentrar una composición que comprende una alfa-manosidasa, como se define en las reivindicaciones. También se divulga en el presente documento el uso de una composición que comprende un polipéptido concentrado de interés como medicamento para inyección subcutánea y una composición que comprende al menos 10 mg/ml de polipéptido de interés que no forma parte de la invención.
Antecedentes de la invención
Algunos polipéptidos son útiles como medicamento para la prevención y/o tratamiento de ciertas enfermedades. La capacidad de inyectar un medicamento por vía subcutánea es una ventaja, ya que facilita a los pacientes administrarse el medicamento a sí mismos.
Como existen restricciones fisiológicas sobre el volumen que es posible inyectar por vía subcutánea, es por lo tanto una ventaja para los medicamentos que deben administrarse por vía subcutánea, el que estén disponibles en una alta concentración para garantizar que el paciente reciba una cantidad adecuada del medicamento y/o para evitar múltiples inyecciones subcutáneas.
El documento WO 99/37325 divulga métodos para tratar y prevenir enfermedades causadas por ausencia o deficiencia de la actividad de enzimas que pertenecen a la ruta biosintética del grupo hemo. El documento WO 03/002731 describe un proceso para la purificación de porfobilinógeno desaminasa recombinante a escala industrial y para el uso del producto purificado para la preparación de un medicamento. De manera similar, los documentos WO 02/099092 y WO 2005/094874 proporcionan alfa-manosidasa lisosómica y uso terapéutico de la misma. Finalmente, el documento WO 2005/073367 proporciona un proceso para la purificación de aril sulfatasa A y el uso de la enzima en el tratamiento de la leucodistrofia metacromática.
La presente invención se refiere a un método para concentrar un polipéptido de interés y al uso de una composición que comprende un polipéptido concentrado de interés para la fabricación de un medicamento para inyección subcutánea en mamíferos.
Resumen de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones. Aquí se describe un método para concentrar una composición que comprende un polipéptido de interés que comprende:
a) Centrifugación y/o filtración de una composición que comprende un polipéptido de interés
b) Concentrar el sobrenadante o retenido, respectivamente, obtenido de la etapa a).
En otro aspecto, se describe una composición que comprende al menos 10 mg/ml de polipéptido de interés.
En otro aspecto más, se describe el uso de una composición que comprende un polipéptido de 75-250 mg/ml de interés para la fabricación de un medicamento para inyección subcutánea en un mamífero.
En otro aspecto más, se describe un método para tratar un mamífero para la porfiria intermitente aguda que comprende inyectar por vía subcutánea una composición de 500-300 mg/ml de PGBD.
En otro aspecto más, se describe un método para tratar un mamífero para la leucodistrofia metacromática que comprende la inyección subcutánea de una composición de 50-300 mg/ml de aril sulfatasa A.
En otro aspecto más, se describe un método para tratar un mamífero para la alfa-manosidosis del trastorno de almacenamiento lisosómico que comprende la inyección subcutánea de una composición de 50-300 mg/ml de alfamanosidasa lisosómica.
En otro aspecto más, se describe un método para tratar un mamífero para la enfermedad de Krabbe que comprende la inyección subcutánea de una composición de 50-300 mg/ml de galactosilcerebrosidasa.
Definiciones
Para los propósitos de la presente invención, las alineaciones de secuencias y el cálculo de los puntajes de homología se pueden hacer usando una alineación Smith-Waterman completa, útil tanto para alineaciones de proteínas como de ADN. Las matrices de puntuación predeterminadas BLOSUM50 y la matriz de identidad se utilizan para alineamientos de proteínas y ADN respectivamente. La penalización por el primer residuo en un intervalo es -12 para proteínas y -16 para ADN, mientras que la penalización por residuos adicionales en un intervalo es -2 para proteínas y -4 para ADN.
La alineación se puede hacer con el paquete FASTA versión v20u6 (W.R. Pearson and D.J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448, y W.R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183: 63-98). Se pueden hacer múltiples alineamientos de secuencias de proteínas usando "ClustalW" (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, TJ. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity de progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680). La alineación múltiple de secuencias de ADN se puede hacer usando la alineación de proteínas como plantilla, reemplazando los aminoácidos con el codón correspondiente de la secuencia de ADN.
En el contexto de la presente invención, el término "E.C." (Clase de enzima) se refiere al sistema de clasificación de enzimas reconocido internacionalmente, Recommendations de the Nomenclature Committee de the International Union de Biochemistry and Molecular Biology, Academic Press, Inc.
El término "origen" usado en el contexto de secuencias de aminoácidos, por ejemplo, las proteínas o secuencias de ácidos nucleicos deben entenderse como el organismo del que deriva. Dicha secuencia puede ser expresada por otro organismo utilizando métodos de tecnología genética bien conocidos por un experto en la materia. Esto también abarca secuencias que se han sintetizado químicamente. Además, dichas secuencias pueden comprender cambios menores tales como la optimización de codones, es decir, cambios en las secuencias de ácidos nucleicos que no afectan la secuencia de aminoácidos.
Descripción detallada de la invención
Polipéptido de interés
El polipéptido de la presente invención es la alfa-manosidasa. También se describe en el presente documento, pero sin formar parte de la invención, una hormona o variante hormonal, una enzima, un receptor o una porción del mismo, un anticuerpo o una porción del mismo, un alérgeno o un informador. El polipéptido puede ser en particular una enzima seleccionada de uno de los seis grupos enzimáticos principales, como una oxidorreductasa (E.C. 1), una transferasa (E.C. 2), una hidrolasa (E.C. 3), una liasa (E.C. 4), una isomerasa (E.C. 5), o una ligasa (E.C. 6). En un aspecto más particular, el polipéptido puede ser una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, celobiohidrolasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fosfolipasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, xilanasa o beta-xilosidasa. El polipéptido de interés puede ser en particular un polipéptido que es útil como medicamento.
Un ejemplo de un polipéptido de interés adecuado es la alfa-manosidasa.
En principio, un polipéptido de interés derivable de cualquier fuente puede tratarse según los métodos de la presente invención.
En una realización particular, el polipéptido de interés puede ser de origen humano. Especialmente en el contexto del uso de un polipéptido de interés para la fabricación de un medicamento que se administrará a humanos, el polipéptido puede ser de origen humano ya que esto puede minimizar el riesgo de reacciones alérgicas no deseadas. Variaciones naturales del polipéptido humano debido a, por ejemplo, polimorfismos, se incluyen en el contexto de la presente invención en el término "origen humano".
El polipéptido de interés puede producirse en particular como una proteína recombinante, es decir, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés puede introducirse en una célula para la expresión del polipéptido de interés. La expresión recombinante puede ser homóloga o heteróloga, es decir, el polipéptido de interés puede expresarse en una célula que se expresa naturalmente por (expresión homóloga) o puede expresarse por una célula que no se expresa naturalmente (expresión heteróloga).
El polipéptido recombinante de interés puede ser expresado por cualquier célula adecuada para la producción recombinante del polipéptido particular de interés. Ejemplos de células adecuadas incluyen, pero sin limitación, células procariotas, tales como una célula de E. coli o una célula de Bacillus. Ejemplos de células eucariotas adecuadas incluyen, pero sin limitación, una célula de levadura o una célula de mamífero tal como un ovario de hámster chino (CHO). Alternativamente, puede ser una célula humana.
Las células huésped adecuadas para la expresión del polipéptido glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Sin embargo, la célula huésped también puede ser una célula vertebrada, y la propagación de células vertebradas en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina.
El término "polipéptido recombinante" o "polipéptido recombinante de interés" denota aquí un polipéptido producido recombinante.
La referencia a un polipéptido de interés particular incluye en el contexto de la presente invención también partes o análogos funcionalmente equivalentes del polipéptido de interés. Por ejemplo, si el polipéptido de interés es una enzima, una parte funcionalmente equivalente de la enzima podría ser un dominio o subsecuencia de la enzima que incluye el sitio catalítico necesario para permitir que el dominio o subsecuencia ejerza sustancialmente la misma actividad enzimática que la enzima de longitud completa o, alternativamente, un gen que codifica el catalizador. El término "sustancialmente la misma actividad enzimática" se refiere a una parte equivalente o análogo que tiene al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% y lo más preferiblemente al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de la actividad de la enzima natural. Un ejemplo de un análogo enzimáticamente equivalente de la enzima podría ser una proteína de fusión que incluye el sitio catalítico de la enzima en una forma funcional, pero también puede ser una variante homóloga de la enzima derivada de otra especie. Además, las moléculas completamente sintéticas que imitan la actividad enzimática específica de la enzima relevante también constituirían "análogos enzimáticos equivalentes". En general, la persona experta podrá idear fácilmente ensayos apropiados para la determinación de la actividad enzimática. Sin embargo, para PBGD, se describe un ensayo adecuado en el documento WO 03/002731, en el ejemplo 2, así como en las secciones experimentales de las presentes solicitudes. La arilsulfatasa A, además de sus sustratos naturales, también puede catalizar la hidrólisis del sustrato sintético y cromogénico, el sulfato de para-nitrocatecol (pNCS). El producto, para-nitrocatecol (pNC), absorbe la luz a 515 nm. Un ensayo para la determinación de la actividad de la arilsulfatasa A se describe en detalle en el documento WO 2005/073367 y en Fluharty et al. 1978, Meth. Enzymol 50: 537-47. Para LAMAN, se describe un ensayo de actividad enzimática apropiado en el documento WO 02/099092.
Porfobilinógeno desaminasa
En una realización, el polipéptido de interés puede ser la porfobilinógeno desaminasa, (también conocido como porfobilinógeno amoniaco-liasa (polimerizante)), E.C. 4.3.1.8. (Waldenstrom 1937, J. Acta. Med. Scand. Supl. 8). La porfobilinógeno desaminasa es la tercera enzima en la ruta biosintética del grupo hemo. E.C. 4.3.1.8 se ha transferido a E.C. 2.5.1.61, por lo que la porfobilinógeno desaminasa (PBGD) ahora se sitúa bajo este número de E.C.
La porfobilinógeno desaminasa cataliza la reacción de 4 porfobilinógeno H2O = hidroximetilbilano 4 NH3.
El PBDG es importante en relación con la porfiria intermitente aguda (AIP), que es un trastorno autosómico dominante en el hombre causado por un defecto (reducción del 50% de la actividad) de PBDG (ver WO01/07065 para más detalles en relación con esto).
La porfobilinógeno desaminasa se conoce en resumen como PBGD y, en el contexto de la presente invención, estos dos términos pueden usarse deforma intercambiable entre sí.
Para la expresión recombinante de PBGD, una célula huésped puede ser en particular una célula de levadura o una célula de E. coli.
Para un ejemplo detallado de construcción de una célula recombinante de E. coli, se hace referencia al ejemplo 1 de WO01/07065 y para la construcción de células HeLa y células NIH 3T3 recombinantes capaces de expresar PBGD de ratón, se hace referencia al ejemplo 6 de WO01/07065.
El término "porfobilinógeno desaminasa recombinante (rPBGD)" denota aquí un PBGD producido recombinante. A continuación, esta enzima y la forma recombinante humana se denominarán "PBGD" y "rhPBGD", respectivamente. Dentro de este término también se incluye una parte enzimáticamente equivalente o análogo de PBGD. Un ejemplo de una parte enzimáticamente equivalente de la enzima podría ser un dominio o subsecuencia de la enzima que incluye el sitio catalítico necesario para permitir que el dominio o subsecuencia ejerza sustancialmente la misma actividad enzimática que la enzima de longitud completa o, alternativamente, un gen que codifica el catalizador. El término "sustancialmente la misma actividad enzimática" se refiere a una parte equivalente o enzima análoga que tiene al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% y lo más preferiblemente al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de la actividad de rhPBGD humana natural medida en el ensayo de actividad de rhPBGD descrito en el ejemplo 2 del documento WO 03/002731. Un ejemplo de un análogo enzimáticamente equivalente de la enzima podría ser una proteína de fusión que incluye el sitio catalítico de la enzima en una forma funcional, pero también puede ser una variante homóloga de la enzima derivada de otra especie. Además, las moléculas completamente sintéticas que imitan la actividad enzimática específica de la enzima relevante también constituirían "análogos enzimáticos equivalentes".
Un ejemplo de PBGD que puede usarse en la presente invención incluye cualquiera de los mostrados en la Secuencia 1-10 de la presente solicitud, o en Genebank no. X04217, X04808 o M95623.Aril sulfatasa
En otra realización, el polipéptido de interés puede ser una arilsulfatasa A.
La arilsulfatasa A cataliza la reacción de un cerebrósido 3-sulfato H2O = un cerebrósido sulfato.
La ASA se ha purificado a partir de una variedad de fuentes que incluyen hígado, placenta y orina humanos. Es una glucoproteína ácida con un bajo punto isoeléctrico. Por encima de pH 6.5, la enzima existe como un dímero con un peso molecular de aproximadamente 110 kDa. La ASA se somete a una polimerización dependiente del pH que forma un octámero a pH 4.5. En la orina humana, la enzima consta de dos subunidades no idénticas de 63 y 54 kDa. La ASA purificada a partir de hígado, placenta y fibroblastos humanos también consta de dos subunidades de tamaños ligeramente diferentes que varían entre 55 y 64 kDa. Como en el caso de otras enzimas lisosómicas, la ASA se sintetiza en los ribosomas unidos a la membrana como un precursor glicosilado. Luego pasa a través del retículo endoplásmico y Golgi, donde sus oligosacáridos unidos a N se procesan con la formación de oligosacáridos fosforilados y sulfatados del tipo complejo (Waheed A et al. Biochim Biophys Acta. 1985, 847, 53-61, Braulke T et al., Biochem Biophys Res Commun. 1987, 143, 178-185). En fibroblastos cultivados normales, se produce un polipéptido precursor de 62 kDa, que se transloca a través de la unión al receptor de manosa-6-fosfato (Braulke T et al. J Biol Chem. 1990, 265, 6650-6655) a un endosoma prelisosómico ácido (Kelly BM et al., Eur J Cell Biol. 1989, 48, 71-78).
La arilsulfatasa A puede ser en particular de origen humano. La longitud (18 aminoácidos) del péptido de señalización ASA humano se basa en la secuencia de consenso y un sitio de procesamiento específico para una secuencia de señalización. Por lo tanto, a partir del ADNc de ASA humana deducida (números de acceso EMBL GenBank J04593 y X521151), la escisión del péptido de señalización debe realizarse en todas las células después del residuo número 18 (Ala), dando como resultado la forma madura de la ASA humana. A continuación, la arilsulfatasa A recombinante se abreviará como rASA, la forma madura de arilsulfatasa A, incluida la forma madura de ASA humano, se denominará "mASA" y la ASA recombinante humana madura se denominará "mrhASA".
Se ha identificado una modificación proteica en dos sulfatasas eucariotas (ASA y arilsulfatasa A B (ASB)) y en una de la alga verde Volvox carteri (Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278, Selmer T et al. al. Eur J Biochem. 1996, 238, 341-345). Esta modificación conduce a la conversión de un residuo de cisteína, que se conserva entre las sulfatasas conocidas, en un residuo de ácido 2-amino-3-oxopropiónico (Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278). El nuevo derivado de aminoácidos también se reconoce como C*-formilglicina (FGly). En ASA y ASB derivados de células MSD, se retiene el residuo Cys-69. En consecuencia, se propone que la conversión de Cys-69 en FGly-69 sea necesaria para generar ASA y ASB catalíticamente activos, y que la deficiencia de esta modificación de proteínas es la causa de MSD. Cys-69 se refiere al precursor ASA que tiene un péptido de señalización de 18 residuos. En la mASA, el residuo cisteína mencionado es Cys-51. Investigaciones posteriores han demostrado que una secuencia lineal de 16 residuos que rodean el Cys-51 en la mASA es suficiente para dirigir la conversión y que la modificación de la proteína ocurre después o en una etapa tardía de la translocación de la proteína en cotraducción al retículo endoplásmico cuando el polipéptido aún no está plegado a su estructura nativa (Dierks T et al. Proc Natl Acad Sci. 1997, 94, 11963­ 1196, Wittke, D. et al. (2004), Acta Neuropathol. (Berl.), 108, 261- 271).
Se han demostrado múltiples formas de ASA en la electroforesis y el enfoque isoeléctrico de preparaciones enzimáticas de orina, leucocitos, plaquetas, fibroblastos cultivados e hígado humanos. El tratamiento con endoglicosidasa H, sialidasa y fosfatasa alcalina reduce el tamaño molecular y la complejidad del patrón electroforético, lo que sugiere que gran parte de la heterogeneidad de carga de ASA se debe a variaciones en el contenido de carbohidratos de la enzima.
La arilsulfatasa A puede ser en particular una forma de arilsulfatasa A, que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica y/o una forma de rASA, que posee etiquetas específicas para entrar en las células diana dentro del cerebro. En particular, puede ser una rASA, que se endocita eficazmente in vivo a través de la ruta de la manosa-6-fosfato.
Por lo tanto, la ASA en particular puede unirse covalentemente a una denominada etiqueta, péptidos o proteínas como vehículos o toxinas como vehículos que son capaces de aumentar y/o facilitar el transporte de ASA sobre la barrera hematoencefálica y/o a través de membranas celulares en general (Schwarze et al., Trends Cell Biol. 2000; 10(7): 290-295; Lindgren et al., Trends Pharmacol. Sci. 2000; 21(3): 99-103). Una molécula de ASA que contiene tales secuencias de péptidos puede producirse mediante técnicas de expresión. El proceso de transducción de proteínas no es específico del tipo de célula y el mecanismo por el cual ocurre no está dilucidado completamente, sin embargo, se cree que tiene lugar mediante algún tipo de perturbación de membrana y proceso de penetración que es independiente del receptor. Un estado parcialmente desplegado de la molécula puede facilitar el proceso, pero no es esencial.
Un ejemplo de una etiqueta adecuada incluye, pero no se limita a la etiqueta manosa-6-fosfato.
Ejemplos de péptidos o proteínas como vehículo incluyen, pero sin limitación, los denominados dominios transductores de proteínas. Ejemplos de dominios transductores de proteínas adecuados incluyen, pero no se limitan a, los mencionados en el documento WO 2005/073367, que se incorpora aquí como referencia. Por lo tanto, el dominio transductor de proteínas puede ser el péptido básico de 11 residuos de la proteína TAT del VIH -YGRKKRRQRRR (Schwarze et al., Trends Cell Biol. 2000; 10(7): 290-295), una versión sintética de TAT - YARAAARQARA que confiere más alfa-helicidad y naturaleza anfipática a la secuencia (Ho et al., Cancer Res. 2001; 61(2): 474-477), un péptido líder sintético compuesto de poli-R o una mezcla de residuos -R y -K básicos en combinación con otros aminoácidos y péptidos basados en restos de secuencia de señalización hidrófobos de integrina beta-3 o FGF de sarcoma de Kaposi (Dunican et al. Biopolymers 2001; 60(1): 45-60).
Ejemplos de toxinas adecuadas como vehículos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en el documento WO 2005/073367, que se incorpora aquí como referencia.
La ASA puede comprender en particular una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica:(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en WO 2005/073367;
(b) una porción de la secuencia en (a), que es enzimáticamente equivalente a la arilsulfatasa A recombinante humana
(c) un análogo de secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias en (a) o (b) y que al mismo tiempo comprende una secuencia de aminoácidos, que es enzimáticamente equivalente a la arilsulfatasa A recombinante humana A.
En el presente contexto, una secuencia de aminoácidos o una porción de una secuencia de aminoácidos que es un polipéptido capaz de hidrolizar una cantidad del sustrato de arilsulfatasa A pNCS a 37°C, una velocidad correspondiente a una actividad específica de al menos polipéptido 20 U/mg (preferiblemente polipéptido 50 U/mg) cuando se determina en un ensayo para medir la actividad de la arilsulfatasa A como se describe en el ejemplo 1 del documento WO 2005/073367, y/o un polipéptido, que es capaz de hidrolizar al menos el 40% del marcado sustrato de arilsulfatasa A, fx. palmitoil sulfatida 14C, cargada en fibroblastos MLD, cuando se analiza por incubación a un nivel de dosis de 25 mU/ml en un ensayo como se describe en el ejemplo 2 del documento WO 2005/073367.
La ASA puede en otra realización en particular comprender:
(a) la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 en WO 2005/073367
(b) una porción de la secuencia en (a), que codifica una secuencia de aminoácidos, que es enzimáticamente equivalente a la arilsulfatasa A recombinante humana
(c) un análogo de secuencia de ácido de ácido nucleico que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias en (a) o (b) y al mismo tiempo que codifica una secuencia de aminoácidos, que es enzimáticamente equivalente a arilsulfatasa A recombinante humana.
Se puede preferir que el grado de identidad de secuencia entre la secuencia de ácidos nucleicos mencionada anteriormente y la SEQ ID NO: 1 del documento WO 2005/073367 sea al menos 80%, tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%. Puede ser igualmente preferido que el grado de identidad de secuencia entre la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mencionada anteriormente y la SEQ ID NO: 2 WO 2005/073367 sea al menos 80%, tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%.
Para el propósito de la presente invención, se prefiere que la arilsulfatasa A sea una enzima recombinante, particularmente preferida es la arilsulfatasa A recombinante humana (rhASA).
Se prefiere que rASA se produzca en una célula o línea celular de mamífero y que dicha célula o línea celular de mamífero produzca una glicoforma de rASA, que se endocita de manera eficiente in vivo a través de la vía del receptor manosa-6-fosfato. Específicamente, la glicoforma preferida de rASA comprende una cantidad de manosa-6-fosfato expuesto, que permite la endocitosis eficiente de rASA in vivo a través de la ruta de manosa-6-fosfato.
En una realización particular, al menos una de las glucoformas producidas de rASA es similar a una glucoforma producida en células CHO.
La modificación postraducción del residuo de cisteína en la posición 51 en la arilsulfatasa A humana madura es relevante para la actividad de la enzima. Por consiguiente, en una realización preferida de la presente invención, la producción de la arilsulfatasa A o su equivalente se produce a una velocidad y bajo condiciones, lo que da como resultado un producto que comprende una isoforma de la enzima en la que el aminoácido correspondiente a Cys-69 en la SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/073367 se convierte en formilglicina, correspondiente a Fgly-51 en la SEQ ID NO: 3 del documento WO 2005/073367. La SEQ ID NO: 4 del documento WO 2005/073367 representa la arilsulfatasa A humana madura después de la escisión del péptido de señalización de 18 aminoácidos pero antes de la modificación de C-51.
Por lo tanto, en otra realización de la presente invención, la ASA o su equivalente enzimático puede seleccionarse del grupo que consiste en
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 del documento WO 2005/073367;
(b) una porción de la secuencia en (a), que es enzimáticamente equivalente a la arilsulfatasa A recombinante humana
(c) un análogo de secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias en (a) o (b) y al mismo tiempo es enzimáticamente equivalente a la arilsulfatasa A recombinante humana.
Se puede preferir que el grado de identidad de secuencia entre la enzima producida de acuerdo con la invención y la SEQ ID NO: 3 del documento WO 2005/073367 o SEQ ID NO: 4 del documento WO 2005/073367 sea al menos 80%, tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%.
Para que la actividad biológica y los efectos de la enzima in vivo requieran ser óptimos, es una ventaja si una cantidad adecuada de la enzima ha adquirido un patrón de glicosilación como se describió anteriormente y se ha modificado después de la traducción en la posición 51. Por lo tanto, en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de la ASA de la presente invención puede estar en la glucoforma/isoforma descrita anteriormente.
La ASA de la presente invención puede ser, en términos de su estructura, diferente de la rASA de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 de 2005/073367. Puede ser una ventaja que la secuencia de residuos de aminoácidos que rodea al Cys-51 sea idéntica o tenga un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente en SEQ ID NO: 3. Por lo tanto, puede preferirse que una secuencia lineal de 20 aminoácidos, tales como 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 residuos de aminoácidos que rodean al Cys-51 en la arilsulfatasa A son idénticos o al menos 90% idénticos, tal como 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a la secuencia correspondiente en SEQ ID NO: 3 de 2005/073367. Como la forma activa de rASA dentro de los lisosomas es un octámero, la ASA de la presente invención puede ser en particular una rASA que es un octámero o se ensambla en un octámero bajo condiciones fisiológicas.
La actividad enzimática de ASA, que debe entenderse como la actividad catalítica de la rASA, puede medirse en un ensayo enzimático basado en la hidrólisis mediada por rASA de un sustrato detectable o un sustrato, que conduce a un producto final detectable. En un aspecto preferido, el ensayo se basa en la hidrólisis del sustrato cromogénico sintético, para-nitrocatecol sulfato (pNCS) que tiene un producto final, para-nitrocatecol (pNC) que absorbe la luz a 515 nm.
Alfa-manosidasa lisosómica
El polipéptido de interés según la invención es una alfa-manosidasa lisosómica (LAMAN). La alfa-manosidasa lisosómica pertenece a EC 3.2.1.24 y es una exoglucosidasa que hidroliza los residuos terminales de alfa-D-manosa no reductores en los alfa-D-manósidos del extremo no reductor durante la degradación ordenada de las glucoproteínas unidas a N (Aronson and Kuranda FASEB J 3: 2615-2622. 1989). En el contexto de la presente invención, el término alfa-manosidasa lisosómica puede usarse indistintamente con LAMAN a corto plazo.
La LAMAN de la presente invención puede ser en particular de origen humano. La enzima humana se sintetiza como un polipéptido único de 1011 aminoácidos con un supuesto péptido de señalización de 49 residuos que se procesa en tres glucopéptidos principales de 15, 42 y 70 kD (Nilssen et al. Hum.Mol.Genet. 6, 717-726. 1997).
El gen que codifica LAMAN (MANB) se encuentra en el cromosoma 19 (19cen-q12), (Kaneda et al. Chromosoma 95: 8-12. 1987). MANB consta de 24 exones, que abarcan 21.5 kb (números de acceso de GenBank U60885-U60899; Riise et al. Genomics 42: 200-207. 1997). La transcripción de LAMAN es »3.500 nucleótidos (nts) y contiene un marco de lectura abierto que codifica 1011 aminoácidos (GenBank U60266.1).
La clonación y secuenciación del ADNc humano que codifica LAMAN se ha publicado en tres artículos (Nilssen et al. Hum.Mol.Genet. 6, 717-726. 1997; Liao et al. J.Biol.Chem. 271, 28348-28358. 1996; Nebes et al. Biochem.Biophys.Res.Commun. 200, 239-245. 1994). Curiosamente, las tres secuencias no son idénticas. En comparación con la secuencia de Nilssen et al (número de acceso U60266.1), Liao et al. and Nebes et al encontraron un cambio de TA a AT en las posiciones 1670 y 1671, lo que resultó en una sustitución de valina a ácido aspártico.
En una realización más preferida, la alfa manosidasa lisosómica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 del documento WO 2005/094874.
Por razones prácticas y económicas, se prefiere que el LAMAN de la presente invención se produzca por vía recombinante. Por producción recombinante también puede ser posible obtener una preparación de la enzima en la que una fracción grande contiene manosa-6-fosfato. La producción recombinante se puede lograr después de la transfección de una célula usando una secuencia de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/094874.
La alfa-manosidasa se prepara preferiblemente en un sistema celular de mamífero, ya que esto dará como resultado un perfil de glicosilación, que asegura una absorción mediada por el receptor eficiente en células de, por ejemplo, órganos viscerales del cuerpo. En particular, se ha encontrado que la producción de la enzima en células CHO, COS o BHK asegura una modificación postraducción adecuada de la enzima mediante la adición de residuos de fosfato de manosa-6. Además, se obtiene un perfil de sialilación correcto. Se sabe que la sialilación correcta es importante para evitar la absorción por el hígado, debido a los residuos de galactosa expuestos.
Por lo tanto, en realizaciones aún más preferidas, el sistema de células de mamífero se selecciona del grupo que comprende células CHO, COS o células BHK (Stein et al. J Biol Chem. 1989, 264, 1252-1259). Se puede preferir además que el sistema celular de mamífero sea una línea celular de fibroblastos humanos.
En una realización más preferida, el sistema celular de mamífero es una línea celular CHO.
En otra realización, la alfa-manosidasa lisosómica puede ser una preparación de alfa-manosidasa lisosómica en la que una fracción de dicha preparación consiste en alfa-manosidasa lisosómica que tiene uno o más oligosacáridos unidos a N que llevan grupos manosa-6-fosfato.
Se prefiere además que una fracción de una preparación de dicha alfa-manosidasa lisosómica sea capaz de unirse a los receptores de manosa 6-fosfato.
La capacidad de la enzima para unirse a los receptores de manosa-6-fosfato se puede determinar en un ensayo in vitro como se describe en el ejemplo 1 del documento WO 2005/094874. Aquí, la unión de la enzima a una matriz 300 de afinidad de MPR proporciona una medida de su capacidad para unirse a los receptores de manosa-6-fosfato. En una realización preferida de la invención, la unión de la enzima a los receptores de manosa-6-fosfato se produce in vitro.
En realizaciones más preferidas de la invención, esta fracción corresponde del 1 al 75% de la actividad de una preparación de alfa-manosidasa lisosómica, tal como del 2 al 70%, tal como del 5 al 60%, tal como de 10 al 50%, tal como del 15 al 45%, tal como del 20 al 40%, tal como del 30 al 35%.
Por consiguiente, se prefiere que la alfa-manosidasa lisosómica tenga un contenido de residuos de manosa 6-fosfato que permita la unión dependiente de manosa 6-fosfato de 2 a 100%, 5 a 95%, 10 a 90%, 20 a 80%, 30 a 70% o 40 a 60% de la cantidad de enzima a una matriz del receptor Man-6-P. En la actualidad, el grado de fosforilación se ha analizado en varios lotes de enzimas y, típicamente, del 30 al 45% de la enzima se fosforila y se une a la matriz de afinidad.
Se prefiere además que una fracción constituya entre 2-100%, 5-90%, 10-80%, 20-75%, 30-70%, 35-65% o 40-60% de la cantidad de dicha alfa-manosidasa lisosómica se una al receptor Man-6-P con alta afinidad. Teóricamente, dos grupos manosa 6-fosfato deben colocarse uno cerca del otro para que la enzima se una a un receptor Man-6-P con alta afinidad. Observaciones recientes sugieren que la distancia entre los residuos de manosa fosforilada debe ser de 40 A o menos para obtener una unión de alta afinidad. En la alfa-manosidasa lisosómica humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 del documento WO 2005/094874, los dos residuos de manosa 6-fosfato pueden situarse en los residuos de asparaginas en las posiciones 367 y 766. Por consiguiente, se prefiere que el medicamento de acuerdo con la presente invención comprenda alfa-manosidasa lisosómica, una fracción de la cual transporta grupos manosa-6-fosfato en estos dos residuos de asparagina.
Preferentemente, la alfa-manosidasa se prepara mediante técnicas recombinantes. En una realización adicional, la alfa-manosidasa es de origen humano (hLAMAN) y aún más preferida es una alfa-manosidasa humana madura (mhLAMAN) o un fragmento de la misma. El fragmento puede modificarse, sin embargo, los sitios activos de la enzima deben conservarse.
Es de esperar que, en las preparaciones de alfa-manosidasa según la presente invención, una fracción de la enzima esté representada por su forma precursora, mientras que otras fracciones representan las formas procesadas proteolíticamente de aproximadamente 55 y 70 kDa.
Galactocerebrosidasa
En otra realización, que no es parte de la invención, el polipéptido de interés puede ser una galactocerebrosidasa, que puede acortarse a GALC. La galactocerebrosidasa pertenece a E.C. 3.1.6.46 y son enzimas capaces de catalizar la reacción de D-galactosil-N-acilesfingosina H2O = D-galactosa N-acilesfingosina, por lo que GALC cataliza la degradación de galactolípidos en, por ejemplo, mielina.
La enzima GALC derivada de humanos es una enzima lisosómica glucosilada que comprende 643 aminoácidos y con un peso molecular de 72.8 kDa. La GALC de la presente invención puede ser en particular de origen humano. En una realización adicional, la GALC puede expresarse recombinante en una de las células huésped mencionadas anteriormente. La célula huésped para la expresión recombinante de GALC puede ser en particular una célula CHO.
En la descripción y en las reivindicaciones se hace referencia a las siguientes secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos:
Figure imgf000009_0001
(continuación)
Figure imgf000010_0001
Con referencia a estas secuencias, el polipéptido de interés, según la invención, comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en:
i) una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 21;
ii) una parte funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos como se define en i); y
iii) un análogo funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos como se define en i) o ii), siendo la secuencia de aminoácidos de dicho análogo al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos como se define en i) o ii).
En realizaciones particulares, el análogo en iii) es al menos 80% idéntico a una secuencia como se define en i) o ii), tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o tal como al menos 99.5% idéntico a una secuencia como se define en i) o ii).
Además, el polipéptido de interés puede obtenerse mediante expresión recombinante usando una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
i) una secuencia de ácidos nucleicos como se define por la SEQ ID NO: 22;
ii) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos como se define en i).
Para la producción recombinante del polipéptido, se puede preferir además que la secuencia de ácido en ii) sea al menos 80% idéntica a una secuencia como se define en i), tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o tal como al menos 99.5% idéntico a una secuencia como se define en i).
Composición que comprende un polipéptido de interés
La siguiente descripción de una composición que comprende un polipéptido de interés se refiere tanto a una composición que comprende un polipéptido que se concentra de acuerdo con un método de la presente invención como a una composición que comprende al menos 10 mg/ml de polipéptido de interés.
También se describe en el presente documento, pero no forma parte de la invención, una composición que comprende al menos 10 mg/ml de polipéptido de interés, en donde el polipéptido de interés puede ser cualquier polipéptido, como en particular rhPBGD, aril sulfatasa, alfa-manosidasa o galactocerebrosidasa. Dicha composición puede comprender en particular al menos 25 mg/ml de polipéptido de interés, tal como al menos 50 mg/ml o al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml de polipéptido de interés. Así, dicha composición puede comprender en particular entre 10-1000 mg/ml de polipéptido de interés, tal como entre 10-500 mg/ml o entre 10-300 mg/ml o entre 10-200 mg/ml o entre 25­ 500 mg/ml o entre 25-400 mg/ml o entre 40-400 mg/ml o entre 40-300 mg/ml o entre 50-400 mg/ml o entre 50-300 mg/ml o entre 75-400 mg/ml o entre 75-300 mg/ml o entre 100-200 mg/ml o entre 100-150 mg/ml de polipéptido de interés.
La composición que comprende un polipéptido de interés puede ser en particular una solución acuosa.
Además de comprender una alta concentración de polipéptido de interés, dicha composición en particular puede no comprender además ningún agregado del polipéptido de interés o al menos solo muy pocos agregados. Por lo tanto, la cantidad de polipéptido de interés presente como agregados puede constituir en particular menos del 5% p/p de la cantidad total de polipéptido de interés en la composición. En particular, dichos agregados pueden constituir menos del 4% p/p, como menos del 3% p/p, o menos del 2% p/p, o menos del 1% p/p, o menos del 0.5% p/p , o menos del 0.1% p/p de la cantidad total de polipéptido de interés. En el presente contexto, el término "agregados" significa cualquier forma del polipéptido de interés que no sea monomérica. Por lo tanto, el término abarca cualquier dímero o multímero del polipéptido de interés.
Además, es una ventaja si dicha composición comprende solo el polipéptido de interés o al menos solo trazas menores de otras proteínas, es decir, proteínas diferentes del polipéptido de interés. Por lo tanto, en una realización particular, dicha composición comprende menos del 1% p/p, tal como menos del 0.5% p/p, o menos del 0.1% p/p, o menos del 0.05% p/p, o menos del 0.01% p/p en peso de otras proteínas distintas del polipéptido de interés.
Una variedad de factores afectan la estabilidad y la actividad de los polipéptidos y la composición que comprende un polipéptido de interés, por lo tanto, puede optimizarse en particular para mantener el polipéptido de interés lo más estable posible.
El pH generalmente afecta la estabilidad de un polipéptido de interés, por lo tanto, el pH de una composición que comprende un polipéptido de interés puede estar en particular en el rango de 7.5-8.5, como en particular entre pH 7.7­ 8.2, más particularmente entre pH 7.8-8.0 o entre pH 7.85-7.95, como pH 7.8 o pH 7.9. Este puede ser el caso en particular si el polipéptido de interés es PBGD.
Por lo tanto, la composición que comprende un polipéptido de interés puede comprender en particular un regulador capaz de mantener la composición dentro del intervalo de pH descrito. Ejemplos de tales reguladores incluyen, pero no se limitan a TRIS-HCL, Na-Citrato y Na2HPO4. La concentración de dicho regulador puede depender de la elección del regulador particular y la presencia de otros componentes en la composición. Si el regulador es Na2HPO4, la concentración de Na2HPO4 puede estar en el rango de 0.5-15 mM, como en el rango de 1-10 mM, o en el rango de 1.5- 7.5 mM, como en el rango de 1.83-7.4 mM, o en el rango de 1.5-3 mM, como en el rango de 1.83-3.7 mM, o en el rango de 1.83-2.45 mM, o en el rango de 3.5-7.5 mM, como en el rango de 3.6-7.4 mM, o en el rango de 5.4-7.4 mM, como 1.84 mM, o 2.45 mM, o 3.67 mM o 5.51 mM o 7.34 mM.
Si el regulador es TRIS-HCL, la concentración de TRIS-HCL puede estar en particular en el rango de 2-50 mM, tal como 2-40 mM, o 2-30 mM, o 2-20 mM, o 2-10 mM, o 5-25 mM, o 5-20 mM, u 8-12 mM, o 9-11 mM, por ejemplo, 10 mM.
Los ejemplos de otros compuestos que puede comprender la composición que comprende un polipéptido de interés incluyen, pero sin limitación, aminoácidos, azúcares, alcoholes y detergentes. Ejemplos de tales compuestos adecuados incluyen, pero sin limitación, glicina, manitol, sacarosa, L-serina, Tween 80 o una combinación de uno o más de dichos compuestos. La concentración de estos compuestos depende del compuesto particular, pero para la glicina la concentración puede estar en particular en el rango de 1-200 mM, como en el rango de 5-190 mM, o en el rango de 10-180 mM, o en el rango de 10-170 mM, o en el rango de 20-160 mM, o en el rango de 20-150 mM, o en el rango de 25-125 mM, o en el rango de 5-100 mM, o en el rango de 5-90 mM, o en el rango de 5-80 mM, o en el rango de 5-70 mM, o en el rango de 5-60 mM, o en el rango de 10-100 mM, o en el rango de 10-90 mM, o en el rango de 10­ 80 mM, o en el rango de 10-70 mM, o en el rango de 10-60 mM, o en el rango de 12-60 mM, o en el rango de 12-55 mM, o en el rango de 13.5-54 mM, o en el rango de 10-30 mM, como en el rango de 13.5-27 mM, o en el rango de 13.5- 18 mM , o en el rango de 25-55 mM, como en el rango de 27-54 mM, o en el rango de 40-55, como en el rango de 40.5-54 mM, como 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39.5, 40, 40.5, 41, 41.5 o 53, 53.5, 53, 54.5 o 55 mM.
La concentración de manitol puede estar en particular en el rango de 50-1000 mM, tal como en el rango de 50-900 mM, o en el rango de 50-800 mM, o en el rango de 50-700 mM , o en el rango de 50-600 mM, o en el rango de 100900 mM, o en el rango de 100-800 mM, o en el rango de 100-700 mM, o en el rango de 100-600 mM , o en el rango de 100-500 mM, o en el rango de 120-525 mM, o en el rango de 125-500 mM, o en el rango de 100-300 mM, como en el rango de 120-275 mM, o en el rango de 120-170 mM, o en el rango de 200-600 mM, como en el rango de 225-550 mM, o en el rango de 240-510 mM, o en el rango de 370- 525 mM, como 120, 125, 130, 160, 165, 166.7, 170, 175, 200, 221, 225, 250, 275,300, 365, 370, 375, 380, 385, 490, 495, 500, 505 o 510 mM.
La concentración de sacarosa puede estar en particular en el rango de 1-200 mM, tal como en el rango de 5-190 mM, o en el rango de 10-180 mM, o en el rango de 10-170 mM, o en el rango de 20-160 mM, o en el rango de 20-150 mM, o en el rango de 25-125 mM, o en el rango de 5-100 mM, o en el rango de 5-90 mM, o en el rango de 5-80 mM, o en el rango de 5-70 mM, o en el rango de 5-60 mM, o en el rango de 10-100 mM, o en el rango de 10-90 mM, o en el rango de 10-80 mM, o en el rango de 10-70 mM, o en el rango de 10-60 mM, o en el rango de 12-60 mM, o en el rango de 12-55 mM, o en el rango de 13.5-54 mM, o en el rango de 10-30 mM, como en el rango de 13.5-27 mM, o en el rango de 13.5-18 mM, o en el rango de 25-55 mM , como en el rango de 27-54 mM, o en el rango de 40-55, como en el rango de 40.5-54 mM, como 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39.5, 40, 40.5, 41, 41.5 o 53, 53.5, 53, 54.5 o 55 mM. Si se incluye sacarosa en una composición que también comprende manitol, la concentración de manitol puede reducirse en particular correspondiente a la concentración de sacarosa; es decir, la concentración de manitol y sacarosa juntos puede ser, en particular, la misma que la concentración de manitol si se usara solo.
La concentración de Tween 80 puede estar en particular en el rango de 0.001-1% p/v, tal como en el rango de 0.005-1% p/v, o en el rango de 0.01-1% p/v, o en el rango de 0.001-0.5% p/v, o en el rango de 0.005-0.5% p/v, o en el rango de 0.01-0.5% p/v, o en el rango de 0.05-0.4% p/v, o en el rango de 0.05-0.3% p/v, o en el rango de 0.05-0.2% p/v, o en el rango de 0.075-0.4% p/v, o en el rango de 0.075-0.3% p/v, o en el rango de 0.075-0.2% p/v, o en el rango de 0.09-0.2% p/v, como 0.075, 0.08, 0.09, 0.1, 0.125, 0.15, 0.175 o 0.2% p/v.
La composición que comprende un polipéptido de interés, en donde el polipéptido en particular puede ser un PBGD, una aril sulfatasa, una alfa-manosidasa lisosómica o una galactocerebrosidasa, puede comprender en particular una combinación de uno o más de los compuestos mencionados anteriormente. Un ejemplo adecuado de tal composición puede ser uno que, además del polipéptido de interés, comprenda Na2HPO4, glicina y manitol. El pH de la composición y la concentración de los diferentes compuestos pueden ser como se describió anteriormente. Por lo tanto, dicha composición puede en una realización comprender Na2HPO40.5-15 mM, glicina 1-200 mM, manitol 50-1000 mM y un pH en el intervalo de 7.5-8.5. La presente invención abarca cualquier combinación de las concentraciones mencionadas anteriormente de compuestos y pH. Un ejemplo específico de una combinación adecuada de otros compuestos y pH en la composición que comprende un polipéptido de interés es uno que comprende Na2HPO43.67 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM y tiene un pH en el intervalo de 7.7 a 7.9.
Otros ejemplos de composiciones adecuadas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes:
• Na2HPO41.84 mM, glicina 13.5 mM, manitol 125 mM y pH en el rango de 7.7 a 7.9.
• Na2HPO42.45 mM, glicina 18 mM, manitol 167 mM y pH en el rango de 7.7 a 7.9.
• Na2HPO45.51 mM, glicina 40.5 mM, manitol 375 mM y pH en el rango de 7.7 a 7.9.
• Na2HPO47.34 mM, glicina 54 mM, manitol 500 mM y pH en el rango de 7.7 a 7.9.
• Na2HPO43.67 mM, glicina 27 mM, manitol 220 mM, sacarosa 30 mM y pH en el rango de 7.7 a 7.9.
• Na2HPO43.67 mM, manitol 245 mM, sacarosa 32 mM y pH en el rango de 7.7 a 7,9.
• Na2HPO43.67 mM, L-serina 27 mM, manitol 250 mM y pH en el rango de 7.7 a 7,9.
• TRIS-HCl 10 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM y pH en el rango de 7.7 a 7.9.
• Na-Citrato 3.67 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM y pH en el rango de 7.7 a 7.9.
• Na2HPO43.67 mM, glicina 27 mM, manitol 220 mM, sacarosa 29 mM, Tween 80 al 0.1% (p/v) y pH en el rango de 7.7 a 7.9.
• Na2HPO43.67 mM, glicina 27 mM, manitol 220 mM, sacarosa 29 mM, Tween 80 al 0.1% (p/v) y pH en el rango de 7.7 a 7.9.
La composición que comprende un polipéptido de interés puede usarse en particular para aplicaciones terapéuticas en mamíferos. Por lo tanto, la composición que comprende un polipéptido de interés puede ser en particular isotónica con respecto al tejido de mamíferos, por ejemplo, en particular, puede tener una osmolalidad en el rango de 200-400 mOsm/kg, como en el rango de 250-350 mOsm/kg o en el rango de 275-325 mOsm/kg o en el rango de 295-305 mOsm/kg, como 295 mOsm/kg o 300 mOsm/kg o 305 mOsm/kg.
Método de concentración de un polipéptido de interés.
El método de la presente invención comprende las etapas de a) centrifugación y/o filtración de una composición que comprende un polipéptido de interés y b) concentrar la composición de la etapa a). Los inventores de la presente invención han descubierto que por centrifugación y/o filtración de una composición que comprende un polipéptido de interés antes de concentrar dicha composición, es posible obtener una composición que comprende un polipéptido altamente concentrado de interés sin ninguno o con al menos solo unos pocos agregados del polipéptido de interés. Además, generalmente es una ventaja para las aplicaciones terapéuticas de un polipéptido que se reduzca la cantidad de agregados de polipéptidos, por ejemplo, ya que pueden aumentar el riesgo de provocar una respuesta inmune hacia el polipéptido.
Para la administración de un polipéptido por vía subcutánea, es una ventaja que la composición de polipéptido tenga una alta actividad en un volumen pequeño ya que solo pueden inyectarse pequeños volúmenes por vía subcutánea.
Las proteínas o polipéptidos pueden en general formar agregados cuando se concentran. Por lo tanto, es una ventaja que cuando el método de la presente invención se usa para concentrar un polipéptido de interés, no causa una alta tasa de formación de agregados de polipéptidos. Como se muestra en los ejemplos, la cantidad de agregados de PBGD en la composición obtenida por el método de concentración de la presente invención es similar a la de una composición de PBGD no concentrada.
En una realización particular, el paso a) del método se realiza antes del paso b).
Paso a) centrifugación y/o filtración
Los inventores de la presente invención han descubierto que antes de concentrar una composición que comprende un polipéptido de interés, es una ventaja tratar previamente la composición mediante centrifugación y/o filtración de la composición puesto que, mediante este pretratamiento, se eliminan muchos o la mayoría de los agregados de polipéptidos.
Cuando la concentración de la composición en la etapa b) se realiza mediante un método que se basa en el uso de un filtro o membrana, como la ultrafiltración, la presencia de agregados puede bloquear el filtro o la membrana de modo que las moléculas pequeñas y el líquido no pueden atravesar el filtro o la membrana. Esto puede disminuir la velocidad con la cual se concentra la composición y/o bloquear completamente cualquier concentración adicional.
Por lo tanto, para este tipo de concentración, el pretratamiento según la etapa a) es una ventaja ya que la eliminación de los agregados permite obtener composiciones de un polipéptido de interés que están más concentradas que si dicha composición no hubiera sido tratada previamente.
Cuando la concentración de la composición en la etapa b) se realiza mediante un método que se basa en la eliminación de agua, tal como liofilización o evaporación, el pretratamiento en la etapa a) tiene la ventaja de que reduce la cantidad de agregados presentes en la composición concentrada.
El paso a) puede realizarse mediante una de las siguientes tres alternativas:
• Centrifugación,
• Filtración, o
• Centrifugación y filtración.
Si el paso a) comprende tanto la centrifugación como la filtración, es una ventaja realizar la centrifugación antes de la filtración ya que los inventores de la presente invención han descubierto que la centrifugación elimina la mayoría de los agregados grandes y la filtración posteriormente elimina los agregados más pequeños restantes.
Centrifugación
Para poder eliminar los agregados, la composición que comprende un polipéptido de interés puede centrifugarse a una fuerza en el intervalo de 1500-3000 g, tal como en el intervalo de 1800-2500 g, o en el intervalo de 2000- 2300 g.
Típicamente, la composición puede centrifugarse durante 10-60 minutos, tal como durante 15-50 minutos o durante 20-40 minutos.
Como la temperatura puede afectar la estabilidad del polipéptido de interés, la centrifugación puede realizarse a una temperatura en el intervalo de 2-20°C, tal como de 3-15°C o en el intervalo de 3-10°C, o en el rango de 3-8°C, como a 4°C o 5°C o 6°C.
La centrifugación da como resultado que el polipéptido de interés se agregue como sedimento, es decir, forme un gránulo, mientras que el polipéptido individual de las moléculas de interés permanece en la solución. Por lo tanto, el sobrenadante de la composición centrifugada se usa posteriormente en el método de la presente invención.
Filtración
La composición que comprende un polipéptido de interés puede filtrarse a través de un filtro que tiene un tamaño de poro en el intervalo de 0.20-5 pm, tal como en el intervalo de 0.2-2.5 pm.
Además del tamaño de poro del filtro, también el material del que está hecho el filtro puede afectar la filtración del polipéptido de interés. Ejemplos de filtros de membrana adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietersulfona (PES), acetato de celulosa, celulosa regenerada y fluoruro de polivinilideno (PVDF).
Cuando se filtran moléculas tales como proteínas, generalmente son las moléculas pequeñas las que se eliminan, por lo tanto, después del filtrado, el polipéptido de interés generalmente puede estar presente en el producto retenido. Por lo tanto, generalmente es el retenido de la filtración el que se usa en las etapas posteriores de la presente invención.
Paso b) concentración
En principio, cualquier método para concentrar el polipéptido de la composición de interés puede usarse en la etapa b) de la presente invención.
Ejemplos de tales métodos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ultrafiltración y concentración por eliminación de agua.
Ultrafiltración
La ultrafiltración es un método de separación en donde se usa presión hidráulica para forzar moléculas y solventes a través de una membrana que comprende poros de un tamaño particular, también conocido como el valor de corte del valor. Solo las moléculas que tienen un peso molecular más pequeño que el valor de corte de la membrana pueden atravesar la membrana, mientras que aquellas con un peso molecular más grande no atraviesan la membrana y forman el llamado retenido. Las moléculas presentes en el retenido se concentran así a medida que el disolvente fluye a través de la membrana.
En una realización particular, la concentración de la solución o composición que comprende un polipéptido de interés puede realizarse por filtración de flujo tangencial (TFF). Este método es particularmente útil para la concentración a gran escala, es decir, para la concentración de soluciones con un volumen de un litro a varios cientos de litros. Así, este método es particularmente útil para la producción de soluciones concentradas de un polipéptido de interés a escala industrial.
La técnica TFF se basa en el uso de un aparato particular que hace que la solución que se filtra se filtre a través de una membrana semipermeable; solo las moléculas que son más pequeñas que los poros de la membrana pasarán a través de la membrana, formando el filtrado, dejando que se acumule materia más grande (retenido). Con el método TFF se aplican dos presiones diferentes; uno para bombear la solución al sistema y hacerla circular en el sistema (presión de entrada), y otra presión se aplica sobre la membrana (presión de membrana) para forzar las moléculas pequeñas y el solvente a través de la membrana. La presión de entrada puede estar típicamente en el rango de 1-3 bar, como entre 1.5-2 bar. La presión de la membrana puede ser típicamente mayor de 1 bar.
La composición concentrada de un polipéptido de interés puede recogerse como el retenido cuando se usa TFF para concentrar la composición.
Las membranas útiles para TFF pueden estar hechas típicamente de celulosa regenerada o polietersolufona (PES). El tamaño de poro de la membrana puede tener típicamente un límite de peso molecular que es menor que 10.000 Mw, tal como en el intervalo de 10-10.000 Mw.
En otra realización, la concentración de la composición que comprende un polipéptido de interés puede realizarse mediante el uso de un dispositivo centrífugo. El principio de este método es que la solución se filtra sobre una membrana mediante la aplicación de una fuerza centrífuga sobre la membrana. Dichas membranas con frecuencia se caracterizan por un límite de peso molecular (Mw), es decir, este es el tamaño molecular máximo de los compuestos que pueden atravesar la membrana y el compuesto con un tamaño molecular mayor que este no atravesará la membrana. El límite de Mw de las membranas usadas en la presente invención puede ser en particular menor de 30.000 Mw, tal como entre 10-30.000 Mw.
La membrana puede estar hecha en particular de polietersulfona (PES) o celulosa regenerada.
Ejemplos de tales dispositivos de filtro comerciales adecuados pueden ser Centricon Plus-80 o Centricon Plus-15. La concentración puede realizarse típicamente por centrifugación a 2000-4500 g, tal como entre 2500-4000 g, o entre 2750-3500 g, o entre 3000-3500 g, tal como a 3000 g o 3100 g o 3200 g o 3300 g o 3400 g o 3500 g.
Normalmente, la centrifugación puede realizarse durante varias horas, por ejemplo, por más de una hora, como por 1­ 10 horas.
Para minimizar cualquier efecto negativo sobre la estabilidad del polipéptido de interés, la centrifugación puede realizarse en particular a una temperatura en el intervalo de 2-20°C, tal como en el intervalo de 3-15°C o en el rango de 3-10°C o en el rango de 3-6°C.
Concentración por eliminación de agua.
El principio de concentración mediante la eliminación de agua es generalmente que todo, o la mayor parte, del agua se elimina para obtener un sólido, y luego diluir o disolver este sólido en un volumen de agua que es menor de lo que estaba anteriormente diluido o disuelto. Sin embargo, en principio puede realizarse simplemente eliminando la cantidad necesaria de agua para obtener la concentración deseada sin volver a diluir o disolver posteriormente el compuesto. Ejemplos de métodos adecuados de concentración por eliminación de agua incluyen liofilización y evaporación. Tanto para la liofilización como para la evaporación, los tres parámetros más relevantes son la temperatura, la presión y el tiempo.
El método de liofilización puede comprender los siguientes tres o cuatro pasos; una fase de congelación, una fase de secado primaria y una fase de secado secundaria y opcionalmente un paso de fusión después de la fase de congelación. La liofilización se puede realizar en particular como se describe con respecto a la liofilización incluida como una etapa adicional del método de la presente invención.
Pasos adicionales
El polipéptido de interés puede derivar de una fuente natural, es decir, de células que expresan de forma natural el polipéptido de interés, o en particular puede expresarse por vía recombinante.
Independientemente de dónde se deriva el polipéptido de interés, puede haberse purificado antes de someterse a un método de la presente invención.
Dicha "purificación" puede incluir, en particular, pero sin limitación, la eliminación de restos celulares, la eliminación de otras proteínas que no sean polipéptidos de interés y la eliminación de otros componentes que pueden estar presentes en la fuente de la que se deriva el polipéptido de interés. Por lo tanto, en una realización particular de la presente invención, la composición que comprende un polipéptido de interés comprende menos del 5% p/p, o menos del 1% p/p o menos 0.5% p/p o menos del 0.1% p/p o menos de 0.05% p/p o menos de 0.01% p/p de otras proteínas distintas del polipéptido de interés.
Por lo tanto, otras proteínas que son expresadas, por ejemplo, por una célula huésped, se pueden eliminar de la composición que comprende un polipéptido de interés antes de que se use en un método de la presente invención.
Así, en una realización particular, el método de la presente invención puede comprender uno o más de los siguientes pasos antes del paso a):
i) expresión recombinante de un polipéptido de interés
ii) purificación de la composición de polipéptidos de interés por uno o más pasos de cromatografía
iii) intercambio del regulador de formulación
La expresión recombinante de un polipéptido de interés puede realizarse en particular como se describió previamente con respecto al polipéptido de interés.
Si el polipéptido de interés es PBGD, ejemplos de tipos adecuados de cromatografía incluyen, pero sin limitación, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico (IEC) y cromatografía en una columna de hidroxiapatita. En principio, se puede usar cualquier combinación de estos métodos de cromatografía. Los inventores de la presente invención han encontrado previamente para PBGD que es una ventaja realizar al menos el paso de cromatografía de afinidad y si esto se combina con cualquiera de los otros métodos de cromatografía es una ventaja realizar el paso de cromatografía de afinidad antes de los otros pasos de cromatografía (véase, por ejemplo, el documento WO 03/002731).
Para la realización en la que el polipéptido de interés es PBGD, los ejemplos de columnas de cromatografía de afinidad disponibles comercialmente incluyen el acoplamiento de afinidad, la afinidad específica de grupo y las columnas de afinidad de quelato metálico.
El catálogo de productos 2001 de la compañía Amersham Pharmacia Biotech da ejemplos de columnas de acoplamiento de afinidad tales como columnas que comprenden ligandos inmovilizantes que contienen -NH2 y columnas que comprenden ligandos que contienen grupos amino primarios.
Las columnas de afinidad de quelatos metálicos son especialmente preferidas para purificar proteínas mediante la formación de complejos de iones metálicos con grupos de histidina expuestos. El ejemplo 3 del documento WO01/07065 describe la construcción de una porfobilinógeno desaminasa recombinante humana con una "etiqueta His" (rhPBGD-His). Con el fin de purificar rhPBGD-His, se prefiere usar una columna de afinidad de quelato metálico, tal como una columna que tiene una resina de afinidad de metal cobalto.
Los ejemplos de otros métodos adecuados de cromatografía de afinidad incluyen, pero no se limitan a, columnas que tienen heparina porcina como ligando o columnas que tienen ácido 1-amino-4-[[4-[[4-cloro-6-[[3 (o 4)-sulfofenil]amino]-1,3,5-triazin-2-il]amino]-3-sulfofenil]amino]-9,10-dihidro-9,10-dioxo-2-antracenosulfónico, también conocido como Cibracon Azul 3G, como ligando y usando acoplamiento con triazina como método de acoplamiento de ligando. Un ejemplo comercial de este último es Blue Sepharose 6 Fast Flow (FF) de Amersham Pharmacia Biotech. Por consiguiente, una realización preferida de la invención se refiere al proceso, como se describe en el presente documento, en donde la columna de cromatografía de afinidad de la etapa (i) es una columna que usa un acoplamiento con triazina como método de acoplamiento de ligando, y más preferiblemente en donde el ligando es Cibacron Blue 3G.
El término "cromatografía de intercambio iónico (IEC)" debe entenderse de acuerdo con la técnica como una columna que separa moléculas tales como proteínas sobre la base de su carga neta a un pH determinado mediante unión electrostática a un grupo cargado en la columna. El intercambio iónico denota la absorción de iones de un tipo en una columna a cambio de otros que se pierden en la solución.
Ejemplos de columnas IEC adecuadas son columnas tales como una columna Q Sepharose, una columna Q SP Sepharose o una columna CM Sepharose, en particular puede ser una columna DEAE Sepharose.
Un ejemplo de una columna de hidroxiapatita adecuada es una columna de hidroxiapatita cerámica. La hidroxiapatita (Ca5(PO4)3OH)2 es una forma de fosfato de calcio que puede usarse para la separación y purificación de proteínas, enzimas, ácidos nucleicos, virus y otras macromoléculas. La hidroxiapatita de cerámica es una forma esférica y macroporosa de hidroxiapatita. La CHT Tipo I (Bio-Rad) es un ejemplo de una columna de cromatografía de hidroxiapatita cerámica disponible comercialmente.
T ambién se describe en el presente documento un método que puede comprender los siguientes pasos antes del paso a):
i) expresión recombinante de PBGD
ii) someter la composición de PBGD del paso i) a cromatografía de afinidad
iii) someter la composición de PBGD de la etapa ii) a cromatografía de intercambio iónico
En otra realización, el método puede comprender los siguientes pasos antes del paso a):
i) expresión recombinante de PBGD
ii) someter la composición de PBGD del paso i) a cromatografía de afinidad
iii) someter la composición de PBGD del paso ii) a cromatografía de intercambio iónico
iv) someter la composición de PBGD del paso iii) a una columna de hidroxiapatita.
Ambos métodos pueden incluir opcionalmente un paso adicional de dilución de diafiltración de la composición de PBGD obtenida del paso ii). Por lo tanto, dicho paso debe ser posterior al paso ii) y antes del iii), es decir, un paso iia). El paso iia) tiene el propósito de reducir la concentración de sales a una conductividad adecuada, por ejemplo, <10 mS/cm. Esto puede ser relevante en particular si se utiliza DEAE Sepharose como resina en la etapa de cromatografía de intercambio iónico, es decir, la etapa iii), ya que esto puede facilitar la unión del PBGD capturado a la resina de DEAE Sepharose. La dilución se puede obtener mediante la adición de agua purificada directamente o mediante ultrafiltración contra agua purificada.
La expresión recombinante de PBGD, etapa i) puede realizarse por cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Ejemplos de columnas de cromatografía de afinidad adecuadas en la etapa ii) pueden ser cualquiera de los mencionados anteriormente.
Ejemplos de métodos adecuados para realizar la cromatografía de intercambio iónico en la etapa iii) pueden ser cualquiera de los mencionados anteriormente.
Ejemplos de columnas de cromatografía de hidroxiapatita adecuadas en la etapa iv) pueden ser cualquiera de los mencionados anteriormente.
En una realización particular, la columna de cromatografía de afinidad puede ser una columna que usa un acoplamiento con triazina como método de acoplamiento de ligando, y en particular dicho método en donde el ligando es Cibracon Blue 3G. Esto puede ser en particular una columna Blue Sepharose 6 Fast Flow, y la columna de cromatografía de intercambio iónico puede ser una columna DEAE Sepharose, y en la realización en la que el método también comprende una etapa iv) esta columna puede ser en particular una columna de hidroxiapatita cerámica. El método de la presente invención también puede comprender pasos adicionales después del paso b) del método. Tales pasos uno o más de los siguientes:
• liofilización de la composición que comprende un polipéptido concentrado de interés,
• cambio del regulador de la composición que comprende un polipéptido concentrado de interés,
• filtración estéril de la composición que comprende un polipéptido concentrado de interés
• evaporación.
Se pueden usar diferentes liofilizadores, volumen de soluciones por liofilizar y otros parámetros en el método de la presente invención. Un ejemplo de un liofilizador adecuado incluye, entre otros, un liofilizador Lyostar (sistemas FTM) como se usa en los ejemplos, que no cae dentro del alcance de la invención, donde las soluciones comprenden un polipéptido concentrado de interés, es decir en este caso PBGD, se rellenaron en viales de vidrio de inyección de 2 y 6 ml (tipo 1) y se taponaron con tapones de goma (clorobutilo). La liofilización se puede realizar mediante los siguientes tres pasos;
i) congelación,
ii) secado primario, y
iii) secado secundario.
Paso i) la congelación puede realizarse en particular cargando primero una muestra a temperatura ambiente y enfriándola a 0°C y manteniéndola a 0°C durante 30 minutos, antes de bajar la temperatura en 1°C por minuto a -40°C y manteniéndolo a -40°C durante 30 minutos.
Paso ii) el secado primario puede realizarse en particular estirando la presión de vacío 126 mTorr, elevando la temperatura en 1°C por minuto a 0°C y manteniendo la muestra a 0°C durante 360 minutos.
Paso iii) el secado secundario puede realizarse en particular retirando el vacío completo simultáneamente con elevación de la temperatura en 0.5°C por minuto hasta 30°C y manteniendo la muestra a 30°C durante 360 minutos. Después del secado secundario, la muestra puede cerrarse adicionalmente al vacío o cerrarse después de llenarse con nitrógeno.
Un ejemplo de un método de liofilización adecuado incluye el descrito en los ejemplos de la presente invención. La liofilización puede comprender en una realización adicional una etapa de fusión antes de la fase de secado primario. Los inventores de la presente invención han descubierto que la inclusión de una etapa de fusión en el método de liofilización mejora la apariencia visual, tal como se visualiza con menos grietas, y/o da como resultado un tiempo de reconstitución más corto del producto liofilizado en comparación con la utilización del mismo método de liofilización, pero sin el paso de fusión. Es una ventaja que se reduzca el tiempo para la reconstitución de un producto liofilizado, especialmente si se va a usar como un producto farmacéutico que se administra como una solución. Una apariencia visual mejorada generalmente también se considera una ventaja para la mayoría de los productos.
Así, la liofilización puede comprender los siguientes pasos:
i) congelación
ii) fusión
iii) secado primario
iv) secado secundario.
Los pasos de congelación, secado primario y secado secundario pueden realizarse en particular como se describe anteriormente. El paso de fusión, es decir, el paso ii) puede realizarse en particular después de 30 minutos de congelación, elevando la temperatura a, por ejemplo, una velocidad de 2°C por minuto a -10°C o -20°C y mantener esta temperatura durante 120 o 420 minutos y luego bajar la temperatura, por ejemplo, una velocidad de 2°C por minuto a -40°C, temperatura a la cual la muestra puede mantenerse entre 60 y 90 minutos antes de comenzar la etapa de secado primario.
El cambio del regulador de la composición que comprende un polipéptido concentrado de interés puede realizarse en particular a) diluyendo, por ejemplo, 5-15 veces, la composición comprende un polipéptido concentrado de interés en un regulador o formulación, b) concentrar la composición diluida nuevamente y realizar los pasos a) y b) un número suficiente de veces para que la cantidad de excipientes en el regulador o la formulación presente en la composición antes de estos pasos constituya menos del 5% v/v o menos del 1% v/v de excipientes en el regulador o formulación presente en dicha composición después de realizar dichos pasos.
En particular, la composición que comprende un polipéptido de interés obtenido de la etapa b) de la presente invención puede comprender en particular una etapa de filtración estéril de dicha composición y/o una etapa de liofilización de la composición. La filtración estéril se realiza generalmente por filtración de la composición a través de un filtro con un tamaño de poro de 0.22 pm o 0.20 pm. La liofilización se puede realizar en particular como se describe anteriormente. También se describe en el presente documento una composición liofilizada obtenida por un método de la presente invención.
Inyección subcutánea
También se describe en el presente documento el uso de una composición que comprende en el intervalo de polipéptidos de 50-300 mg/ml de interés para la fabricación de un medicamento para inyección subcutánea en un mamífero.
El polipéptido de interés puede ser cualquier polipéptido de interés de acuerdo con la presente invención, que incluye, pero no se limita a PBGD, arilsulfatasa A, alfa-manosidasa lisosómica y galactocerebrosidasa.
El término “subcutánea” con frecuencia se abrevia a s.c. y los dos términos pueden usarse indistintamente en el contexto de la presente invención.
Cuando la inyección se realiza por vía subcutánea, generalmente no es posible inyectar más de 1.5 ml debido a restricciones fisiológicas.
Como el paciente generalmente necesita una cierta cantidad del polipéptido particular de interés, existe una correlación entre el volumen de la composición que comprende un polipéptido de interés que debe administrarse al paciente y la concentración de polipéptido de interés en dicha composición.
Por lo tanto, es una ventaja que la composición que comprende un polipéptido de interés comprenda una alta concentración del polipéptido de interés y que esta alta concentración del polipéptido de interés se puede obtener sin la formación de grandes cantidades de agregados de polipéptidos. El uso de tales composiciones concentradas de polipéptidos de interés hace posible inyectar un volumen más pequeño de dicha composición y al mismo tiempo asegurar que el paciente reciba una cantidad adecuada del polipéptido de interés; facilitando así la administración subcutánea del polipéptido de interés.
La composición mencionada anteriormente que comprende un polipéptido de interés puede comprender en particular entre 75-250 mg/ml, tal como entre 75-200 mg/ml o entre 75-150 mg/ml o entre 100-150 mg/ml o entre 100-125 mg/ml o entre 125-150 mg/ml de polipéptido de interés.
Como se describió anteriormente, el volumen de composición que comprende un polipéptido de interés que es necesario inyectar en el paciente para asegurar que el paciente reciba una cantidad adecuada del polipéptido de interés se correlaciona con la concentración del polipéptido de interés en dicha composición.
Por lo tanto, el volumen de dicha composición generalmente se ajustará de acuerdo con la concentración del polipéptido de interés en la composición. Sin embargo, el volumen generalmente puede estar en el rango de 0.1-1.5 ml, tal como en el rango de 0.1-1.5 ml o en el rango de 0.5-1.5 ml o en el rango de 0.5-1.5 ml o en el rango de 0.75­ 1.5 ml o en el rango de 0.75-1.5 ml o en el rango de 1-1.5 ml o en el rango de 1-1.5 ml.
La cantidad de polipéptido de interés que es relevante para administrar a un paciente generalmente depende del peso del individuo y del polipéptido particular de interés.
También se describe en el presente documento, pero no forma parte de la invención un método de tratamiento de un mamífero para la porfiria intermitente aguda que comprende la inyección subcutánea de una composición de 50-300 mg/ml de PBGD.
La administración de PBGD puede ser particularmente útil para el tratamiento de la porfiria intermitente aguda. Sin embargo, se contempla que la administración de PBGD también puede ser útil para el tratamiento de otras porfirias, como la coproporfiria hereditaria o la porfiria Variegata. Porfiria es un término utilizado para describir colectivamente una serie de enfermedades causadas por diferentes deficiencias en la vía biosintética del grupo hemo. Por lo tanto, se contempla que la administración de PBGD, por ejemplo, en combinación con otras terapias, para un paciente que sufre cualquier tipo de porfiria puede ayudar a aumentar la rotación general de los diferentes intermedios en la vía. Por ejemplo, Meissner PN et al., 1986, European Journal de Clinical Investigation, vol. 16, 257-261; Hift RJ et al., 1997, S. Afr. Medicina. J., vol. 87, 718-27 y Meissner P et al., 1993, J. Clin. Invest., Vol. 91, 1436-44 describen la acumulación de ALA y PBG en la coproporiria hereditaria y la porfiria Variegata. En estas enfermedades, la acumulación de ALA y PBG resulta de defectos enzimáticos que se encuentran cuatro y cinco pasos corriente abajo de la conversión de ALA a PBG, respectivamente. En los dos artículos más recientes se describe cómo el porfirinógeno que se acumula en pacientes con porfiria Variegata es capaz de inhibir la PBG-desaminasa.
También se describe en el presente documento, pero no forma parte de la invención, un método de tratamiento de un mamífero para leucodistrofia metacromática que comprende la inyección subcutánea de una composición de 50-300 mg/ml de aril sulfatasa A.
La leucodistrofia metacromática (MLD) es causada por un defecto genético autosómico recesivo en la enzima lisosómica Arilsulfatasa A (ASA), lo que da como resultado una ruptura progresiva de las membranas de la vaina de mielina (desmielinización) y la acumulación de sulfato de galactosilo (sulfato de cerebrósido) en la sustancia blanca tanto del sistema nervioso central (SNC) como del sistema nervioso periférico. En las preparaciones histológicas, el sulfato de galactosilo forma masas esféricas granulares que se tiñen metacrómicamente. El sulfato de galactosilo también se acumula dentro del riñón, la vesícula biliar y ciertos otros órganos viscerales y se excreta en cantidades excesivas en la orina.
La galactosil sulfatida se metaboliza normalmente mediante la hidrólisis del enlace 3-O-sulfato para formar galactocerebrosida a través de la acción combinada de la enzima lisosómica arilsulfatasa A (EC 3.1.6.8) (Austin et al. Biochem J. 1964, 93, 15C-17C) y una proteína activadora de esfingolípidos llamada saposina B. Se produce una deficiencia profunda de arilsulfatasa A en todos los tejidos de pacientes con formas tardías de MLD infantil, juvenil y adulta (ver más abajo). A continuación, la proteína arilsulfatasa A se denominará "ASA". Una deficiencia profunda de ASA ocurre en todos los tejidos de pacientes con MLD.
En otra realización más, la presente invención se refiere a un método para tratar un mamífero para el trastorno de almacenamiento lisosómico alfa-manosidosis, que comprende la inyección subcutánea de una composición de 50-300 mg/ml de alfa-manosidasa lisosómica.
La alfa-manosidosis es una enfermedad autosómica recesiva que se produce en todo el mundo con una frecuencia de entre 1/1.000.000 y 1/500.000. La manosidosis se encuentra en todos los grupos étnicos en Europa, América, África y también Asia. Se detecta en todos los países con un buen servicio de diagnóstico para trastornos de almacenamiento lisosómico, con una frecuencia similar. Nacen aparentemente sanos; sin embargo, los síntomas de las enfermedades son progresivos. La alfa-manosidosis muestra heterogeneidad clínica, que va desde formas muy graves hasta formas muy leves. Los síntomas clínicos típicos son: retraso mental, cambios esqueléticos, sistema inmunitario deteriorado que resulta en infecciones recurrentes, discapacidad auditiva y, con frecuencia, la enfermedad se asocia con características faciales típicas, como cara gruesa, frente prominente, puente nasal aplanado, nariz pequeña y boca ancha. En los casos más graves (manonosidosis tipo I), los niños sufren de hepatoesplenomegalia y mueren durante los primeros años de vida. Posiblemente esta muerte temprana es causada por infecciones graves debido a la inmunodeficiencia causada por la enfermedad. En casos más leves (manosidosis tipo 2) los pacientes generalmente alcanzan la edad adulta. Las debilidades esqueléticas de los pacientes provocan la necesidad de sillas de ruedas entre los 20 y los 40 años. La enfermedad causa una disfunción difusa del cerebro que con frecuencia resulta en un rendimiento mental débil que excluye cualquier cosa que no sean las habilidades más básicas de la simple lectura y escritura. Estos problemas asociados con la discapacidad auditiva y otras manifestaciones clínicas impiden que el paciente tenga una vida independiente, por lo que se necesita cuidados de por vida.
Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no forma parte de la invención, un método para tratar un mamífero para la enfermedad de Krabbe, que comprende la inyección subcutánea de una composición de 50-300 mg/ml de galactosilcerebrosidasa.
En los humanos, una deficiencia en la enzima GALC da como resultado una enfermedad de almacenamiento lisosómico, genética, heredada autosómica, conocida como enfermedad de Krabbe o leucodistrofia de células globoides. La enzima generalmente se expresa en los testículos, los riñones, la placenta, el hígado y el cerebro de los seres humanos y una deficiencia en la enzima GALC generalmente produce un trastorno en el metabolismo de la mielina y en el sistema nervioso central y periférico (SNC y SNP, respectivamente).
La enfermedad de Krabbe se ha observado en humanos de cualquier edad, nacionalidad y sexo.
Debe observarse que las realizaciones y características descritas en el contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se aplican a los otros aspectos de la invención. En particular, todas las realizaciones descritas para la composición que comprende un polipéptido de interés, tal como la presencia de compuestos adicionales, reguladores y pH también se aplican a la composición que comprende un polipéptido de interés utilizado en las presentes aplicaciones.
Cuando un objeto de acuerdo con la presente invención o uno de sus rasgos o características se menciona en singular, esto también se refiere al objeto o sus rasgos o características en plural. Como ejemplo, cuando se hace referencia a "un polipéptido" se debe entender que se refiere a uno o más polipéptidos.
A lo largo de la presente especificación, se entenderá que la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos establecidos, pero no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.
Se describen detalles adicionales en las siguientes secciones Experimentales.
Parte experimental (no cae dentro del alcance de la invención reivindicada)
Materiales
rhPBGD
El rhPBGD usado en los siguientes experimentos se obtuvo de acuerdo con el proceso 2 en el ejemplo 1 del documento WO 03/002731, donde el proceso 2 es el proceso que incluye la etapa IV, es decir, la etapa de cromatografía de hidroxiapatita cerámica.
Regulador de formulación
El rhPBGD recombinante y purificado estaba presente en el siguiente regulador de formulación acuosa:
Na2HPO43.67 mM
Glicina 27 mM
Manitol 250 mM
y un pH de 7.9
El regulador de formulación se filtró luego para esterilidad a través de un filtro de 0.22 pm.
Métodos
Liofilización
La liofilización de las soluciones de rhPBGD purificadas se realizó en un liofilizador Lyostar (FTM-systems) de acuerdo con el siguiente programa:
Figure imgf000021_0001
Observación visual (claridad y color)
El líquido se estudió visualmente con respecto al color, la claridad y precipitados de acuerdo con el siguiente esquema. Color: 1: sin color; 2: ligeramente amarillo; 3: amarillo
Claridad: 1: Claro; 2: ligeramente turbio; 3: turbio
Otras observaciones: en algunos casos se incluyeron otras observaciones del operador (por ejemplo, precipitados, material no disuelto, etc.)
Medición de pH
El medidor de pH (Metrohm 691 pH Meter) y el electrodo (electrodo combinado de pH LL) se calibraron con 3 soluciones de referencia estándar (Merck) en el rango de 4.00 a 9.00. El líquido finalmente se analizó.
Concentración de proteínas
La concentración de proteína en extracto, muestras en proceso, sustancia farmacológica a granel y producto final se determinó mediante un método que utiliza principios de reducción de Cu2+ a Cu+ por proteína en un medio alcalino (la reacción de Biuret). Los iones Cu+ se hicieron reaccionar luego con un reactivo que contenía ácido bicinconínico, dando como resultado una detección colorimétrica altamente sensible y selectiva.
Pureza
Las variantes recombinantes de porfobilinógeno desaminasa humana (rhPBGD) y rhPBGD se separaron de acuerdo con su capacidad para adsorber y desorber en medios estacionarios basados en sílice dependiendo del porcentaje de modificador orgánico (acetonitrilo) en la fase móvil.
Actividad de rhPBGD
La porfobilinógeno desaminasa (PBGD) cataliza la adición de 4 moléculas de porfobilinógeno (PBG) para formar un tetrámero lineal, preuroporfirinógeno, el cual se libera de la enzima y se circulariza in vivo en uroporfirinógeno III por la acción de la uroporfirinógeno sintasa III. El preuroporfirinógeno se puede oxidar químicamente con benzoquinona para formar uroporfirina, que absorbe la luz a 405 nm.
Los análisis se realizaron en un solo vial en cada ocasión de prueba. Para la determinación de la actividad de rhPBGD y la concentración de proteínas, las pruebas se realizaron por duplicado y por triplicado, respectivamente, para cada vial.
Osmolalidad
Se resuspendió un vial de rhPBGD liofilizado en 1.00 ml de agua MilliQ. El vial de solución acuosa congelada de rhPBGD fue descongelado. El osmómetro (osmómetro Vapro) se calibró con 3 soluciones estándar en el rango de 100-1000 mOsm/kg (100, 290, 1000 mOsm/kg). Luego se analizó el líquido.
Ejemplo 1
Concentración con dispositivos de filtro centrífugo.
La solución de PBGD a granel congelada (7 mg/ml de rhPBGD, Na2HPO43.67 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM, pH 7.9) fue descongelada en un baño de agua a 20°C, se centrifugó a 3200 g durante 10 minutos y posteriormente se esterilizó por filtración con filtros de 0.20 pm-PES (filtros de polietersulfona Nalgene). La solución a granel de PBGD se concentró a 100 mg/ml utilizando los dispositivos de filtración centrífugos Centricon Plus-80 (Mw corte 30000) y Centricon Plus-15 (Mw corte 30000) a 3200 g durante varias horas. La solución concentrada, es decir, el retenido, se esterilizó por filtración filtros de 0.22 pm (Millex GV) y finalmente una parte de esta solución se diluyó con regulador de formulación estéril para obtener 50 mg/ml. La solución de 5 mg/ml se preparó diluyendo directamente la hPBGD recombinante y se purificó con regulador de formulación estéril.
Los 5 mg/ml, 50 mg/ml y 100 mg/ml de rhPBGD se liofilizaron como se describió anteriormente. Se almacenaron varios viales de cada una de las soluciones de rhPBGD liofilizadas con 5, 50 y 100 mg/ml de rhPBGD y de la solución acuosa de 5 mg/ml de rhPBGD a 40°C±2°C, 75%±5% humedad relativa (RH). Los viales se almacenaron protegidos de la luz en un paquete secundario bien sellado (caja de papel).
En los puntos de tiempo indicados (es decir, tiempo de almacenamiento) un vial de cada muestra liofilizada se resuspendió en 1.00 ml de agua Millipore.
Cada uno de los viales resuspendidos y el vial acuoso de rhPBGd se observaron visualmente con respecto al color, la claridad y los precipitados, y el pH, la concentración de proteínas, la pureza y la actividad de rhPBGD se midieron como se describió anteriormente.
Los resultados se dan en las siguientes tablas 1-4:
Tabla 1: Producto liofilizado, 5 mg/ml.
Figure imgf000023_0001
Tabla 2; Producto liofilizado; 50 mg/ml
Figure imgf000023_0002
Tabla 3: Producto liofilizado; 100 m /ml
Figure imgf000023_0003
Tabla 4: Producto acuoso; 5 mg/ml
Figure imgf000024_0001
Ejemplo 2
Concentrar una composición de rhPBGD mediante dispositivos de filtro centrífugo
Una solución de PBGD a granel congelada (7 mg/ml de rhPBGD, 3.67 mM Na2HPO4, glicina 27 mM, manitol 250 mM, pH 7.9) fue descongelada en un baño de agua a 20°C, se centrifugó a 3200 g durante 10 minutos y posteriormente se esterilizó por filtración con filtros de 0.20 pm-PES (filtros de polietersulfona Nalgene). La solución a granel de PBGD se concentró a 100 mg/ml utilizando los dispositivos de filtro centrífugo Centricon Plus-80 (Mw corte 30000) y Centricon Plus-15 (Mw corte 30000) a 3200 g durante varias horas. La solución concentrada, es decir, el retenido, se filtró estéril mediante filtros de 0.22 pm (Millex GV) y se diluyó con regulador de formulación filtrado estéril (véase más arriba) para obtener soluciones de concentraciones más bajas. Una fracción en volumen de cada concentración se liofilizó como se describió anteriormente.
Las diferentes concentraciones de rhPBGD liofilizado y solución acuosa de rhPBGD se almacenaron a 5°C±3°C o -20°C±5°C (humedad relativa ambiental (HR)). Todos los viales se almacenaron protegidos de la luz en un paquete secundario bien sellado (caja de papel).
En los puntos de tiempo indicados (es decir, tiempo de almacenamiento), un vial de cada muestra liofilizada se resuspendió en 1.00 ml de agua Millipore y luego se analizó junto con la solución acuosa de rhPBGD observando visualmente el color, la claridad y los precipitados, y midiendo el pH, la concentración de proteínas, la pureza, la osmolalidad y la actividad de rhPBGD.
Los resultados se dan en las siguientes tablas 5-19:
Tabla 5: Producto acuoso; 11 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: 5°C
Figure imgf000024_0002
(continuación)
Figure imgf000025_0001
Tabla 6: Producto acuoso: 11 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: -20°C
Figure imgf000025_0002
(continuación)
Figure imgf000026_0001
Tabla 7: Producto liofilizado, 11 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: 5°C
Figure imgf000026_0002
Tabla 8: Producto acuoso, 17 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: 5°C
Figure imgf000027_0001
Tabla 9: Producto acuoso, 17 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: -20°C
Figure imgf000027_0002
(continuación)
Figure imgf000028_0001
Tabla 10: Producto liofilizado, 17 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: 5°C
Figure imgf000028_0002
(continuación)
Figure imgf000029_0001
Tabla 11: Producto acuoso; 36 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: 5°C
Figure imgf000029_0002
Tabla 12: Producto acuoso, 36 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: -20°C
Figure imgf000030_0001
Tabla 13: Producto liofilizado, 36 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: 5°C
Figure imgf000030_0002
(continuación)
Figure imgf000031_0001
Tabla 14: Producto acuoso, 50 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: 5°C
Figure imgf000031_0002
(continuación)
Figure imgf000032_0001
Tabla 15: Producto acuoso, 50 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: -20°C
Figure imgf000032_0002
(continuación)
Figure imgf000033_0001
Tabla 16: Producto liofilizado, 50 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: 5°C
Figure imgf000033_0002
(continuación)
Figure imgf000034_0001
Tabla 17: Producto acuoso, 100 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: 5°C
Figure imgf000034_0002
(continuación)
Figure imgf000035_0001
(continuación)
Figure imgf000036_0001
Tabla 18: Producto acuoso, 100 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: -20°C
Figure imgf000036_0002
(continuación)
Figure imgf000037_0001
(continuación)
Figure imgf000038_0001
Tabla 19: Producto liofilizado, 100 mg/ml; Temperatura de almacenamiento: 5°C
Figure imgf000038_0002
(continuación)
Figure imgf000039_0001
Ejemplo 3
Concentración de una composición de rhPBGD por filtración de flujo tangencial (TFF)
La solución a granel de rhPBGD fue descongelada luego durante un mínimo de tres días a 5°C y en la oscuridad. La solución descongelada se centrifugó luego con tubos de centrífuga cónicos de 200 ml durante aproximadamente 10 minutos a 2200 g.
La solución se filtró luego a través de una serie de filtros con los siguientes tamaños de poro: 5.0 pm; 0.65 pm; 0.45 |jm y 0.20 pm antes de que se concentrara por filtración de flujo tangencial (TFF).
La concentración por TFF se realizó con un sistema Millipore Labscale TFF y un filtro Millipore Pellicon® XL con una presión de entrada de la bomba de aproximadamente 20-25 psi y una presión sobre el filtro Pellicon® XL de aproximadamente 4-6 psi. El rhPBGD se protegió de la luz durante el procedimiento cubriendo el recipiente de muestra del sistema TFF con láminas de papel de aluminio.
La solución concentrada de rhPBGD obtenida del procedimiento TFF se cambió entonces en regulador contra un regulador de formulación que contenía Na2HPO4 x 2 H2O 3.67 mM, glicina 27 mM y manitol 220 mM preparado en agua estéril. Esto se realizó agregando continuamente dicho regulador al sistema TFF y presionándolo a través de la membrana hasta que dicho regulador hubiera reemplazado el regulador anterior.
La solución de rhPBGD concentrada y cambiada con regulador se filtró luego estéril haciéndola pasar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0.22 |jm. Esta filtración estéril se realizó dos veces con un filtro nuevo cada vez. La solución concentrada estéril de rhPBGD se colocó luego en viales antes de liofilizar como se describe en la sección del método.
Ejemplo 4
El efecto de diferentes modos de liofilización y/o la cantidad de excipientes en el tiempo de reconstitución PBGD se concentró como se describe en el ejemplo 3 y después del intercambio del regulador se determinó la concentración de PBGD.
La solución de PBGD concentrada se liofilizó en un liofilizador Lyostar (sistemas FTM). Las soluciones se llenaron en viales de vidrio de inyección de 2 y 6 ml (tipo 1) y se taparon con tapones de goma (clorobutilo).
Ciclo de liofilización original:
Las muestras se cargaron a temperatura ambiente y los estantes se enfriaron a 0°C durante 30 minutos. La temperatura se redujo a -40°C (1°C por minuto) y se mantuvo allí durante 30 minutos y luego la presión de vacío se redujo a 126 mTorr y el secado primario comenzó elevando la temperatura a 0°C (1°C por minuto). Después de 360 minutos de secado primario, la temperatura se elevó a 30°C (0.5°C por minuto) y se extrajo el vacío completo simultáneamente (inicio del secado secundario). La temperatura se mantuvo a 30°C durante 360 minutos y los viales se taparon al vacío.
Liofilización con inclusión de un paso de fusión:
Después de 30 minutos a -40°C, la temperatura se elevó con una velocidad de 2°C por minuto a -10°C o -20°C , temperatura a la cual se mantuvieron durante 120 o 420 minutos antes de que la temperatura bajara nuevamente con 2°C por minuto a -40°C donde las muestras se mantuvieron durante 60-90 minutos antes del inicio del secado primario. Los resultados se muestran en la Tabla 20 donde los términos cortos utilizados con respecto a los excipientes y el ciclo de liofilización significan lo siguiente:
1x cantidad de excipientes se refiere a que la solución de PBGD comprende Na2HPO43.67 mM x 2 H2O, glicina 27 mM y manitol 220 mM preparado en agua estéril.
Una cantidad de excipientes de 1.5x se refiere a que la solución de PBGD comprende Na2HPO4 5.51 mM x 2 H2O, glicina 40.5 mM y manitol 375 mM preparados en agua estéril, es decir, 1.5x de cada uno de los componentes presentes en el regulador 1x.
Los excipientes 2x se refieren a que la solución de PBGD comprende Na2HPO47.34 mM x 2 H2O, glicina 54 mM y manitol 500 mM preparados en agua estéril, es decir, 2x de cada uno de los componentes presentes en el regulador 1x.
El ciclo de liofilización original es como se describió anteriormente.
El ciclo de liofilización de fusión es como se describió anteriormente, donde el paso de fusión comprende elevar la temperatura a -10°C manteniendo la muestra a esta temperatura durante 120 minutos antes de bajarla nuevamente a -40°C.
El ciclo de liofilización de fusión extendido es como se describió anteriormente, donde el paso de fusión comprende elevar la temperatura a -20°C manteniendo la muestra a esta temperatura durante 420 minutos antes de bajarla nuevamente a -40°C.
Tabla 20:
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Ejemplo 5
El efecto de diferentes modos de liofilización y/o la cantidad de excipientes en la apariencia del producto liofilizado Se prepararon soluciones concentradas y liofilizadas de PBGD como se describe en el ejemplo 4 y las referencias a la cantidad de excipientes y el tipo de ciclo de liofilización tienen el mismo significado que en el ejemplo 4.
Los siguientes resultados se obtuvieron mediante inspección visual de los productos liofilizados:
A: La comparación de tres productos preparados a partir de soluciones que comprenden respectivamente 4.6 mg/ml 66.6 mg/ml y 109.4 mg/ml de rhPBGD mostró que el número de grietas en el producto liofilizado aumentó a medida que aumentaba la concentración de rhPBGD.
B: La comparación de dos productos, preparados a partir de una solución que contiene 150 mg/ml de rhPBGD, y que comprende una cantidad de excipientes 1x y 1.5x, mostró que el número de grietas en el producto liofilizado fue menor para el producto que comprendió 1.5x cantidad de excipientes que el producto que comprende 1x cantidad de excipientes.
C: La comparación de dos productos liofilizados preparados a partir de una solución de rhPBGD de 150 mg/ml, que comprende una cantidad de excipientes 1x y 2x, mostró que el número de grietas en el producto liofilizado con una cantidad de excipientes 2x fue menor que el producto que comprende la cantidad 1x de excipientes.
D: La comparación de tres productos liofilizados preparados a partir de una solución de rhPBGD de 150 mg/ml utilizando el ciclo de liofilización original, la fusión y la fusión prolongada mostró que el número de grietas en el producto liofilizado fue menor en el producto que se preparó de acuerdo con el ciclo de liofilización de fusión que el producto preparado de acuerdo con el ciclo de liofilización original. Además, el número de grietas en el producto preparado de acuerdo con el ciclo de liofilización de fusión extendido fue menor que en el producto preparado de acuerdo con el ciclo de liofilización de fusión.
E: Se prepararon tres productos liofilizados a partir de una solución de rhPBGD de 150, 175 y 200 mg/ml, respectivamente. Los productos liofilizados comprendían cada uno 1.5x la cantidad de excipientes y se liofilizaron con el ciclo de fusión. Ninguno de los productos liofilizados tenía grietas.
F: Se prepararon dos productos de rhPBGD liofilizados a partir de una solución de rhPBGD de 150 mg/ml. Uno de ellos comprendía 1x cantidad de excipientes y se preparó de acuerdo con el ciclo de liofilización original, mientras que el otro comprendía 1.5x cantidad de excipientes y se preparó de acuerdo con el ciclo de secado libre de fusión extendido. El producto que comprende una cantidad 1.5x de excipientes y preparado de acuerdo con el ciclo extendido de liofilización de fusión comprende menos grietas que el producto que comprende una cantidad 1x de excipientes y preparado de acuerdo con el ciclo original de liofilización.
G: Se prepararon dos productos de rhPBGD liofilizados a partir de una solución de rhPBGD de 150 mg/ml. Uno de ellos comprendía 1x cantidad de excipientes y se preparó de acuerdo con el ciclo original de liofilización, mientras que el otro comprendía 0.1% de Tween 80 en combinación con la cantidad 1x de excipientes y se preparó de acuerdo con el ciclo de liofilización de fusión extendido. El producto que comprende el Tween 80 al 0.1% en combinación con la cantidad 1x de excipientes y que se preparó de acuerdo con el ciclo de liofilización de fusión extendido comprendió menos grietas que el producto que comprendió la cantidad 1x de excipientes y que se preparó de acuerdo con el ciclo de liofilización original.
Ejemplo 6
El efecto del volumen de recuperación, la cantidad de excipientes y el modo de liofilización sobre la estabilidad de la rhPBGD liofilizada
Se prepararon soluciones concentradas de rhPBGD para muestras liofilizadas como se describe en el ejemplo 4. La "solución a granel" es una solución concentrada de PBGD antes de la liofilización.
La Tabla 21 muestra los resultados de las soluciones de rhPBGD que tienen las siguientes características con respecto a la concentración de rhPBGD, la cantidad de excipientes (se usaron las mismas definiciones que en el ejemplo 4), el modo de liofilización (fueron las mismas definiciones como en el ejemplo 4) y la relación del volumen de llenado (Volumen de llenado es el volumen de la composición antes de liofilizarla) frente al volumen de recuperación (Volumen de recuperación es el volumen en el cual se resuspende el producto liofilizado):
Solución 1: • Aproximadamente 5 mg/ml de rhPBGD
• 1x cantidad de excipiente
• Ciclo de liofilización original.
• Volumen de llenado = Volumen de recuperación
Solución 2:
• Aproximadamente 70 mg/ml de rhPBGD
• 1x cantidad de excipiente
• Ciclo de liofilización original.
• Volumen de llenado = 2 x Volumen de recuperación
Solución 3:
• Aproximadamente 110 mg/ml de rhPBGD
• 1x cantidad de excipiente
• Ciclo de liofilización original.
• Volumen de llenado = Volumen de recuperación
Solución 4:
• Aproximadamente 70 mg/ml de rhPBGD
• 1x cantidad de excipiente
• Ciclo de liofilización original.
• Volumen de llenado = 1.5 x Volumen de recuperación Solución 5:
• Aproximadamente 90 mg/ml de rhPBGD
• 2/3x cantidad de excipiente
• Ciclo de liofilización original.
• Volumen de llenado = 1.5 x Volumen de recuperación Solución 6:
• Aproximadamente 60 mg/ml de rhPBGD
• 1/2x cantidad de excipiente
• Ciclo de liofilización original.
• Volumen de llenado = 2 x Volumen de recuperación Solución 7:
• Aproximadamente 110 mg/ml de rhPBGD
• 1x cantidad de excipiente
• Ciclo de liofilización de fusión.
• Volumen de llenado = Volumen de recuperación Solución 8:
• Aproximadamente 60 mg/ml de rhPBGD
• 1x cantidad de excipiente
• Ciclo de liofilización de fusión.
• Volumen de llenado = 2 x Volumen de recuperación Solución 9:
• Aproximadamente 150 mg/ml de rhPBGD
• 1x cantidad de excipiente
• Ciclo de liofilización de fusión.
• Volumen de llenado = Volumen de recuperación Solución 10:
• Aproximadamente 150 mg/ml de rhPBGD
• 1x cantidad de excipiente
• Ciclo de liofilización de fusión.
• Volumen de llenado = 1 Volumen de recuperación
Aunque no se muestra en la Tabla 21, la pureza también se probó para cada punto de tiempo puesto que se encontró al 100% en todos los casos.
Para la solución 2 en el punto de tiempo de la semana 4 y 9 y para la solución 4 el punto de tiempo de la semana 9 se usó un volumen de recuperación incorrecto.
Tabla 21:
Figure imgf000044_0001
(continuación)
Figure imgf000045_0001
Ejemplo 7
Efecto de diferentes excipientes sobre la estabilidad de rhPBGD Se concentró rhPBGD como se describe en el ejemplo 4 y luego el regulador se cambió a uno de los cuatro reguladores descritos a continuación. Los productos se liofilizaron como se describe en el ejemplo 4 con una etapa de fusión original incluida y la estabilidad de las muestras se ensayó como se describe en el ejemplo 6.
Se probó el efecto de las siguientes cuatro formulaciones sobre la estabilidad de rhPBGD:
Formulación A (corresponde a la solución 9 en el ejemplo 6): manitol 250 mM, glicina 27 mM y Na2HPO43.67 mM. Formulación B: manitol 250 mM, glicina 27 mM y TRIS-HCL 10 mM.
Formulación C: manitol 250 mM, glicina 27 mM, Na2HPO43.67 mM y Tween 80 al 0.1%.
Formulación D: manitol 221 mM, sacarosa 29 mM, glicina 27 mM, Na2HPO43.67 mM y Tween 80 al 0.1%.
Los resultados se muestran en la Tabla 22.
Tabla 22
Figure imgf000046_0001

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método para concentrar una composición que comprende alfa-manosidasa y partes y análogos funcionalmente equivalentes del mismo, comprendiendo dicho método:
a) Eliminar los agregados de dicha alfa-manosidasa por centrifugación y/o filtración de una composición que comprende dicha alfa-manosidasa
b) concentrar el sobrenadante o filtrado, respectivamente, obtenido de la etapa a);
c) obtener una composición en la que la cantidad de alfa-manosidasa presente como agregados constituye menos del 5% p/p de la cantidad total de alfa-manosidasa en la composición y en la que las partes y análogos funcionalmente equivalentes ejercen sustancialmente la misma actividad enzimática que la enzima de longitud completa y en donde dicha composición es una solución isotónica;
d) formular dicha solución isotónica para inyección, y en donde la alfa-manosidasa y sus partes y análogos funcionalmente equivalentes comprenden un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en:
i) una secuencia de aminoácidos como se define en la SEQ ID NO: 21;
ii) una parte funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos como se define en i); y
iii) un análogo funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos como se define en i) o ii), la secuencia de aminoácidos de dicho análogo es al menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos como se define en i) o ii).
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa b) se realiza por liofilización o evaporación.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa b) se realiza por ultrafiltración.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la etapa b) se realiza por filtración de flujo tangencial.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la etapa b) se realiza con un dispositivo centrífugo.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición que comprende una alfa-manosidasa comprende además uno o más de los componentes seleccionados del grupo que consiste en: glicina, L-serina, sacarosa y manitol.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición que comprende una alfa-manosidasa comprende además uno o más reguladores seleccionados del grupo que consiste en: TRIS-HCL, Na-citrato y Na2HPO4.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho método comprende además una etapa de esterilización de la composición concentrada que comprende alfa-manosidasa obtenida de la etapa b).
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho método comprende además una etapa de liofilización de la composición concentrada que comprende una alfa-manosidasa obtenida de la etapa b).
10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la centrifugación en la etapa a) se realiza a 1800-2500 g.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el filtro utilizado para la filtración en la etapa a) tiene un tamaño de poro en el intervalo de 0.20 a 5.0 micrómetros.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho método comprende además uno o más de los siguientes pasos antes del paso a):
i) expresión recombinante de una alfa-manosidasa de interés en una célula procariota o en células de vertebrados en cultivo;
ii) purificación de una alfa-manosidasa de interés por uno o más pasos de cromatografía; y
iii) intercambio del regulador de formulación.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la cromatografía en la etapa ii) se selecciona del grupo que consiste en: cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de hidroxiapatita.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho método comprende los siguientes pasos antes del paso a):
i) expresión recombinante de alfa-manosidasa
ii) someter la composición que comprende alfa-manosidasa de la etapa i) a cromatografía de afinidad; y iii) someter la composición que comprende alfa-manosidasa de la etapa ii) a cromatografía de intercambio iónico.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho método comprende los siguientes pasos antes del paso a):
i) expresión recombinante de alfa-manosidasa
ii) someter la composición que comprende alfa-manosidasa de la etapa i) a cromatografía de afinidad;
iii) someter la composición que comprende alfa-manosidasa de la etapa ii) a cromatografía de intercambio iónico; y iv) someter la composición que comprende alfa-manosidasa de la etapa iii) a una columna de hidroxiapatita.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho método comprende la expresión recombinante usando una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: i) una secuencia de ácidos nucleicos como se define por la SEQ ID NO: 22;
ii) una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos como se define en i).
17. El método de acuerdo con las reivindicaciones 14 o 15, en donde dicho método comprende además una etapa de dilución o diafiltración de la composición que comprende alfa-manosidasa obtenida de la etapa ii).
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