ES2742739T3 - Proteínas de fusión para uso como mejoradores inmunogénicos para inducir respuestas de células T específicas de antígenos - Google Patents

Proteínas de fusión para uso como mejoradores inmunogénicos para inducir respuestas de células T específicas de antígenos Download PDF

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Abstract

Una proteína de fusión que comprende: (a) un dominio de unión a la célula presentadora de antígeno (APC) o un dominio de unión al receptor CD91, ubicado en el terminal N de la proteína de fusión, en el que el dominio de unión a APC o el dominio de unión al receptor CD91 se selecciona del grupo que consiste del dominio III de proteína 1 asociada al receptor (RAP1), proteína asociada al receptor alfa-2-macroglobulina (A2M), VIH-Tat, proteína de choque térmico 70 kDa y dominio la de unión a la exotoxina A de Pseudomonas; (b) un dominio de transducción de proteínas, ubicado en el terminal C del dominio de unión a APC o el dominio de unión al receptor CD91, el dominio de transducción de proteínas es un polipéptido de fusión que comprende un péptido transductor de señales sensibilizadoras de células T, un ligador y un péptido de translocación, en el que: (1) el péptido transductor de señal sensibilizante de células T se encuentra en el terminal N del polipéptido de fusión; (2) el ligador comprende la SEQ ID NO: 15, que enlaza el péptido transductor de señal sensibilizante de células T y el péptido de translocación; y (3) el péptido de translocación tiene una longitud de 34-112 residuos de aminoácidos y comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 3, 20 o 4; y (c) un antígeno de un patógeno, ubicado en el terminal C del dominio de transducción de proteínas; en el que: el péptido transductor de señal sensibilizador de células T tiene una longitud de 28-53 residuos de aminoácidos y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, en la que Xaa8 es I o L; Xaa10 es V, F o A, Xaa11 es M o L, Xaa17 es L o I.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión para uso como mejoradores inmunogénicos para inducir respuestas de células T específicas de antígenos
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a proteínas de fusión y más específicamente a las proteínas de fusión para mejorar la respuesta inmunitaria mediada por células T.
Antecedentes de la invención
La biología molecular ha permitido la producción de vacunas subunitarias, en las cuales el inmunógeno es un fragmento o una subunidad de una proteína o complejo original. Sería deseable el desarrollo de una vacuna estable que pudiera provocar respuestas sensibilizadoras de células T y ser lo suficientemente flexible como para incorporar secuencias de muchas cepas de un agente infeccioso.
El documento US 2009/214570 A1 describe métodos y composiciones para inmunizar contra la infección por Chlamydia. Takemoto et al. divulgan la generación mejorada de linfocitos T citotóxicos mediante proteínas de fusión de la proteína 70 de choque térmico que albergan epítopos de células T CD8(+) y de células T CD4(+). Mol Pharm.
2010 VOL, NO. 5, 1715-1723.
Resumen de la invención
En un aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión que comprende:
(a) un dominio de unión a la célula presentadora de antígeno (APC) o un dominio de unión al receptor CD91, ubicado en el terminal N de la proteína de fusión, en el que el dominio de unión a APC o el dominio de unión al receptor CD91 se selecciona del grupo que consiste en el dominio III de la proteína 1 asociada al receptor (RAP1), proteína asociada al receptor de la macroglobulina alfa-2 (A2M), VIH-Tat, proteína de choque térmico 70 kDa y dominio la de unión a la exotoxina Pseudomonas A;
(b) un dominio de transducción de proteínas, ubicado en el terminal C del dominio de unión a APC o el dominio de unión al receptor CD91, el dominio de transducción de proteínas es un polipéptido de fusión, que comprende un péptido transductor de señales sensibilizadoras de células T, un ligador y un péptido de translocación, en el que:
(1) el péptido transductor de señal sensibilizante de células T se encuentra en el terminal N del polipéptido de fusión; (2) el conector comprende la SEQ ID NO: 15, que enlaza el péptido transductor de señal sensibilizante de células T y el péptido de translocación; y
(3) el péptido de translocación tiene una longitud de 34-112 residuos de aminoácidos y comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 3, 20 o 4; y
(c) un antígeno de un patógeno, ubicado en el terminal C del dominio de transducción de proteínas; en el que: el péptido transductor de señal sensibilizador de células T tiene una longitud de 28-53 residuos de aminoácidos y comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31, en la que Xaa8 es I o L; Xaa10 es V, F o A, Xaa11 es M o L, Xaa17 es L o I.
En una realización de la invención, el dominio de unión a APC o el dominio de unión a receptor CD91 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 9, 6, 7 y 8. Alternativamente, el dominio de unión a APC se selecciona del grupo que consiste en el dominio III de proteína asociada al receptor III (RAP1), proteína asociada al receptor de alfa-2-macroglobulina (A2M), VIH- Tat y proteínas de choque térmico (HSP), y dominio Ia de unión a exotoxina A de Pseudomonas (PE).
En otra realización de la invención, la proteína de fusión está libre de la secuencia de aminoácidos del dominio la de unión a exotoxina A de Pseudomonas (PE).
En otra realización de la invención, la proteína de fusión comprende además una secuencia de retención del retículo endoplásmico localizada en el terminal C de la proteína de fusión.
En otra realización de la invención, la secuencia de retención del retículo endoplásmico comprende la secuencia de aminoácidos de Lys-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 14). La secuencia de retención de ER puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 16-19. Alternativamente, la secuencia de retención de ER puede consistir en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 16-19.
En otra realización de la invención, la proteína de fusión está libre de una secuencia de retención del retículo endoplásmico en el terminal C del mismo si el antígeno contiene 10 o más epítopos.
En otra realización de la invención, el dominio de transducción de proteínas comprende la secuencia de SEQ ID NO: 30.
En otra realización de la invención, el dominio de unión a APC comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 9, 6, 7 y 8 .
En otra realización de la invención, el dominio de unión a APC o el dominio de unión a receptor CD91 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 5, 9, 6, 7 y 8 . En otra realización de la invención, el péptido transductor de señal sensibilizante de células T comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y 2.
En otra realización de la invención, el péptido de translocación comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
En otra realización de la invención, el péptido de translocación tiene una longitud de 34-61 residuos de aminoácidos. En otra realización de la invención, el dominio de transducción de proteínas de la proteína de fusión de la invención posee las siguientes características: (i) el péptido transductor de señal sensibilizador de células T comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2; y (ii) el péptido de translocación comprende la secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 3.
El péptido transductor de señal sensibilizante de células T exhibe una característica de provocar un anticuerpo que reconoce y se une a la secuencia de aminoácidos de K1(X)2E3(X)4(X)5Y6P7P8P9Y10 (SEQ iD NO: 32) del receptor CD28 de células T, en el que (X)2 es I o L; (X)4 es V, F o A, y (x )5 es M o L.
En otro aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión que consiste en:
(a) un dominio de unión a células presentadoras de antígeno (APC) o un dominio de unión a receptor CD91, ubicado en el terminal N de la proteína de fusión, en donde el dominio de unión a APC o el dominio de unión a receptor CD91 se selecciona del grupo que consiste en el dominio III de la proteína 1 asociada al receptor (RAP1), proteína asociada al receptor de la alfa-2-macroglobulina (A2M), VIH-Tat, choque térmico Proteína de 70 kDa y dominio de unión a exotoxina A de Pseudomonas la;
(b) un dominio de transducción de proteínas, ubicado en el terminal C del dominio de unión a APC o el dominio de unión al receptor CD91, el dominio de transducción de proteínas es un polipéptido de fusión, que comprende un péptido transductor de señales sensibilizadoras de células T, un conector y un péptido de translocación , en el que:
(1) el péptido transductor de señal de sensibilización de células T está localizado en el terminal N del polipéptido de fusión;
(2) el conector comprende la SEQ ID NO: 15, que une el péptido transductor de señal sensibilizante de células T y el péptido de translocación; y
(3) el péptido de translocación tiene una longitud de 34-112 residuos de aminoácidos y comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 3, 20 o 4; y
(c) un antígeno de un patógeno, ubicado en el terminal C del dominio de transducción de proteínas;
en el que:
el péptido transductor de señal sensibilizador de células T tiene una longitud de 28-53 residuos de aminoácidos y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, en la que Xaa8 es I o L; Xaa10 es V, F o A, Xaa11 es M o L, Xaa17 es L o I.
La célula presentadora de antígeno (APC) puede seleccionarse del grupo que consiste en células dendríticas, macrófagos, células B y monocitos.
En una realización de la invención, la membrana celular de la APC comprende un receptor CD91.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición de vacuna que comprende: (a) una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la invención; y (b) un adyuvante.
El adyuvante es un agente de suministro de antígeno o un potenciador inmunitario. En una realización de la invención, la composición de vacuna comprende un agente de administración de antígeno y está libre de un potenciador inmunitario.
La invención también se refiere a una proteína de fusión o una composición de vacuna como se mencionó anteriormente, para su uso en la inducción de respuestas mejoradas de células T específicas de antígeno patógeno, o para uso en matar una célula de enfermedad que presenta un antígeno a través de moléculas de MHC de clase I en el membrana celular de la célula de enfermedad, o para su uso en la prevención, el tratamiento de la infección provocada por un patógeno y/o la minimización de los síntomas provocadas por la infección. En una realización de la invención, la célula de enfermedad es una célula cancerosa.
El patógeno puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en Virus del Papiloma Humano (VPH), Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRSV), Virus de la Inmunodeficiente Humana (VIH-1), virus de la gripe, Virus del Dengue, Virus de la Hepatitis C (VHC), Virus de la Hepatitis B (VHB) y Circovirus Porcino 2 (PCV2). En una realización de la invención, la proteína de fusión como se mencionó anteriormente es para uso en potenciar una respuesta de células T citotóxicas antigénicas específicas en un sujeto que lo necesita. La proteína de fusión también puede usarse para mejorar una respuesta de células T CD4+ específica de antígeno, o para usar como un potenciador inmunogénico para inducir una respuesta de título de anticuerpo específico de antígeno específico, en un sujeto que lo necesite.
Estos y otros aspectos serán evidentes a partir de la siguiente descripción de la realización preferida tomada junto con los siguientes dibujos.
Los dibujos adjuntos ilustran una o más realizaciones de la invención y, junto con la descripción escrita, sirven para explicar los principios de la invención. Siempre que sea posible, se utilizan los mismos números de referencia en todos los dibujos para referirse a los mismos elementos o elementos similares de una realización.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un mapa vectorial.
La figura 2 es un dibujo esquemático que ilustra una realización de la invención.
Las figuras 3A-B son un diagrama de flujo para la preparación de proteínas de fusión y una fotografía que muestra el resultado de los análisis SDS-PAGE de proteínas de fusión, respectivamente.
La figura 4 es un dibujo esquemático que ilustra los mecanismos de acción de las proteínas de fusión sensibilizadoras de células T.
La figura 5 muestra alineamientos de secuencia de CD28 de diversas especies: humanos (SEQ ID NO: 33), rata (SEQ ID NO: 34), ratón (SEQ ID NO: 35), conejo (SEQ ID NO: 36), cerdo (SEQ ID NO: 37), bovino (SEQ ID NO: 38), oveja (SEQ ID NO: 39), perro (SEQ ID NO: 40), caballo (SEQ ID n O: 41), pavo (SEQ ID NO: 42), y la secuencia de consenso SEQ ID NO: 43.
La figura 6A muestra los esquemas de inmunización.
Las figuras 6B-C muestran curvas de tamaño tumoral y la tasa de supervivencia en los grupos de animales vacunados con diversas proteínas de fusión o placebo, respectivamente.
La figura 7 es un dibujo esquemático que muestra un vector que contiene RAP1 usado para generar un plásmido que contiene un inserto de ADN a partir de un patógeno.
La figura 8 son dibujos esquemáticos que ilustran construcciones de proteínas de fusión que contienen antígenos de diversos patógenos.
Las figuras 9A-F son fotografías que muestran los resultados de los análisis SDS-PAGE de varias proteínas de fusión. Las figuras 10 A-B muestran grupos de animales, vacunas y dosis utilizadas para inmunizar a los animales y programas de inmunización.
Las figuras 11A-D son tablas que muestran los resultados de análisis de respuesta inmunitaria específica de antígeno ex vivo de esplenocitos CD3+/CD4+ y esplenocitos CD3+/CD8+ de los grupos animales de la figura 10A vacunado con placebo o una proteína de fusión que contiene antígeno E7-ia, E7-ia, HCVcore o HBx.
Las figuras 12A-J muestran recuentos de células IFNy+ en análisis de respuesta inmunitaria específica de antígeno ex vivo de esplenocitos CD3+/CD8+ y esplenocitos CD3+/CD4+ de los grupos animales de la figura 10A vacunado con placebo o una proteína de fusión que contiene un PCV2 (12A-B) o un antígeno PRRSV (12C-J). Las proteínas de fusión que contienen PCV2 o antígeno PRRSV se muestran en la figura 10A.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describe más particularmente en los siguientes ejemplos que pretenden ser solamente ilustrativos.
Definiciones
El término “una célula presentadora de antígeno (APC) o célula accesoria” se refiere a una célula que muestra antígenos extraños complejados con complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en sus superficies. Las células T pueden reconocer estos complejos utilizando sus receptores de células T (TCR). Estas células procesan los antígenos y los presentan a las células T. Principales tipos de células presentadoras de antígenos profesionales: células dendríticas (DC), macrófagos, monocitos y ciertas células B.
El término “un dominio de unión a la célula presentadora de antígeno (APC)” se refiere a un dominio que puede unirse a una célula que presenta antígeno (APC). El dominio de unión a APC puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 y 9. Un dominio de unión a APC es un ligando que reconoce y se une a un receptor.
El grupo de diferenciación 91 (CD91) es una proteína que forma un receptor en la membrana de las células y está implicada en la endocitosis mediada por el receptor.
El término “un dominio de transducción de proteínas” se refiere a un polipéptido o un polipéptido de fusión que tiene una función para sensibilizar a las células T y así mejorar las respuestas de las células T específicas de antígeno, y/o para guiar o dirigir un antígeno hacia (es decir, para apuntar a) la ruta del complejo de histocompatibilidad mayor clase I (MHC-I) (es decir, una ruta de células T citotóxicas) de presentación de antígeno.
El término “sensibilizar las células T” generalmente significa que las células T CD8+ y CD4+ están sensibilizadas y, como resultado, se mejoran las respuestas de las células T CD8+ (CTL) y CD4+ a una exposición de antígeno. La respuesta inmunitaria mediada por células específicas de antígeno se mide cuantificando la producción de interferón y inducido específico de antígeno en respuesta a un antígeno. Por ejemplo, sin una señal de sensibilización (es decir, sin el dominio de transducción de proteínas), un antígeno solo puede inducir una respuesta inmunitaria débil o nula mediada por células, es decir, una producción débil o nula de interferón y específico de antígeno a partir de células T CD8+ y CD4+, mientras que en presencia de una señal de sensibilización (el dominio de transducción de proteínas), el antígeno puede inducir una respuesta mejorada inmunitaria mediada por células. Por lo tanto, la función de una señal de sensibilización (el dominio de transducción de proteínas) es sensibilizar las células T CD4+ y CD8+ en un huésped para que cuando el huésped sea inoculado con un antígeno, el antígeno pueda inducir una respuesta inmunitaria mediada por células específica de antígeno mejoradas debido a la sensibilización previa de células T CD4+ y CD8+.
Un dominio de transducción de proteínas puede ser un polipéptido de fusión, que comprende un péptido transductor de señal de sensibilización de células T, un conector y un péptido de translocación, en el que:
(1) el péptido transductor de señal de sensibilización de células T está ubicado en el terminal N del polipéptido de fusión;
(2) el ligador comprende la SEQ ID NO: 15, que une el péptido transductor de señal sensibilizante de células T y el péptido de translocación; y
(3) el péptido de translocación tiene una longitud de 34-112 residuos de aminoácidos y comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 3, 20 o 4.
Un dominio de transducción de proteínas puede ser “un polipéptido de fusión”, en el que el polipéptido de fusión comprende un péptido transductor de señal sensibilizante de células T, un conector y un péptido de translocación. Por ejemplo, el polipéptido de fusión puede ser el polipéptido “CD28convPEt”.
El término “CD28conv” se refiere a una región conservada de CD28, que es un “péptido transductor de señal sensibilizante de células T”. Es un epítopo para inducir el anticuerpo agonista de CD28.
El término “PEt” o “PEt Núcleo” se refiere a un núcleo de dominio de translocación de PE con 34 residuos de aminoácidos de longitud.
Un ligador está presente entre el “CD28conv” y el “PEt”. La orientación o disposición del polipéptido de fusión “CD28convPEt” es importante porque “CD28conv” (o el péptido transductor de señal de sensibilización de células T) debe estar aguas arriba del PEt (o el péptido de translocación), es decir, PEt debe estar en el terminal C del “CD28conv” para obtener respuestas mejoradas de células T. El “CD28convPEt” puede aumentar el título de IgG mucho más alto (llamado anticuerpo agonista específico de CD28) específico para CD28conv que el péptido de fusión de orientación inversa PEtCD28conv. El anticuerpo agonista específico de CD28 puede sensibilizar a las células T CD4+ y CD8+. El polipéptido de fusión de orientación correcta CD28convPEt contiene un conector (RXRXKR) entre los dominios CD28conv y PEt . El conector contiene un sitio de corte de proteasa específica de la célula presentadora de antígeno (APC) (catepsina L) Lys-Arg (KR). Por lo tanto, la proteína de fusión RAP1-CD28convPEt-Antigen-K3 se puede digerir en los dos fragmentos: RAP1-CD28conv y PEt-Antigen-K3. El fragmento RAP1-CD28conv puede digerirse más en el lisosoma y el epítopo de CD28conv luego se presenta a la superficie celular APC a través de la vía MHC II, que a su vez provoca una respuesta inmunitaria humoral que produce el anticuerpo agonista CD28. Por lo tanto, el anticuerpo agonista CD28 es producido por las células B. Este anticuerpo agonista de CD28 puede unirse a CD28 en la superficie de las células T y preactivar las células T (células T CD4+ y CD8+).
Un “péptido transductor de señal sensibilizador de células T” tiene una longitud de 28-53 residuos de aminoácidos y comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 31, en la que Xaa8 es I o L; Xaa10 es V, F o A, Xaa11 es M o L, Xaa17 es L o I.
El péptido transductor de señal sensibilizador de células T comprende la región crítica K1(I/L)2E3(V/F/A)4(M/L)5Y6P7P8P9Y10 (SEQ ID NO: 32), en donde (X)2 es I o L; (X)4 es V, F o A, (X)5 es M o L.
En los siguientes ejemplos se utilizó un péptido transductor de señal sensibilizante de células T (TDIYFCKIEFMYPPPYLDNEKSNGTIIH; SEQ ID NO: 31, en el que X8 es I, X10 es F, X11 es M) específico para ratones.
La figura 4 es un dibujo esquemático que ilustra los mecanismos de acción de las proteínas de fusión sensibilizadoras de células T usando la proteína de fusión RAP1-CD28convPEt-E7-K3 como ejemplo. RAP1-CD28convPEt-E7-K3 comprende desde el terminal N al terminal C: (1) el dominio III del RAP1 de longitud completa en el extremo N, (2) CD28conv, (3) un ligador, (4) un péptido de translocación modificado de la exotoxina A de Pseudomonas, (5) una proteína E7 de tipo 16 de VPH de longitud completa, y (6) el KDEL triple como una señal de retención de ER en el terminal C. La proteína HPV16 E7 se procesa en epítopos dentro de las células de un sujeto inmunizado con la proteína de fusión. El RAP1-CD28convPEt-E7-K3 puede provocar una mejor respuesta de células T citotóxicas (CTL) que las vacunas tradicionales que contienen solo antígeno. La proteína RAP1-CD28convPEt-E7-K3 fue diseñada para mejorar la eficiencia de absorción de APC (como las células dendríticas) y mejorar el procesamiento del antígeno HPV16 E7 hacia una ruta de proteasoma, luego se presentó a través de los complejos MHC I. El mecanismo de acción de la respuesta inmunitaria CTL específica de proteína HPV16 E7 provocada por la vacuna RAP1-CD28convPEt-E7-K3 se ilustra en la figura 4: (a) la vacuna se une al receptor de superficie APC (como las células dendríticas) (CD91) y se internaliza por endocitosis; (b1) RAP1-CD28convPEt-E7-K3 se somete a hidrólisis proteolítica por digestión con proteasa de catepsina L en el sitio antes del péptido de translocación PEt; (b2) o se recicla a la E.R. y se somete a hidrólisis proteolítica por proteasa de furina en el sitio antes del péptido de translocación PEt; (b3) Mientras tanto, RAP1-CD28conv fue digerido por la proteasa lisosómica y los epítopos de CD28conv luego se presentan a la superficie celular a través de MHC II y provoca la producción de anticuerpos agonistas de CD28, que pueden preactivar las células T; (c) El paso más importante es la translocación transmembrana del PEt-E7-K3 en el compartimento citoplasmático desde el lisosoma mediante el péptido de translocación (PEt); (d) el PEt-E7-K3 se somete a digestión a través de la ruta del proteasoma, luego los epítopos de E7 se presentan por el complejo MHC I y provocan una respuesta inmunitaria mediada por células específicas de E7.
La figura 5 muestra una alineación de secuencia de regiones conservadas de CD28 de diversas especies y la secuencia de consenso. La secuencia subrayada (KIEVMYPPPY; SEQ ID NO: 32, donde X2 es I, X4 es V, X5 es M) dentro de la secuencia consenso es una región crítica para el reconocimiento y unión del anticuerpo agonista de CD28. Esta secuencia de región crítica puede estar representada por K1(I/L)2E3(V/F/A)4(M/L)5Y6P7P8P9Y10, en el que solo el cuarto residuo de aminoácido allí es específico de la especie y debe ser V en humanos, ratas, porcino, bovino, ovino, perro y caballo; F en ratón y V en pavo. La secuencia de la región crítica se puede representar como K1(X)2E3(X)4(X)5Y6P7P8P9Y10 (SEQ ID NO: 32), en el que (X)2 es I o L; (X)4 es V, F o A, (X)5 es M o L.
Un péptido de translocación de PE puede comprender la secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 3 o 20. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de un péptido de translocación de PE puede ser a.a. 280 - a.a. 313 (SEQ ID NO: 3), a.a. 268 - a.a. 313 (SEQ ID NO: 20), a.a. 253 - a.a. 313, o a.a. 253 - a.a. 364 (SEQ ID NO: 4) de PE. Es decir, la secuencia de aminoácidos de un péptido de translocación de PE puede contener cualquier región del dominio II de PE (a.a. 253 a a.a. 364; SEQ ID NO: 4) siempre que comprenda un fragmento esencial a.a. 280-a.a. 313 (SEQ ID NO: 3).
Un antígeno puede ser una proteína, polipéptido o péptido patogénico que es responsable de una enfermedad causada por el patógeno, o es capaz de inducir una respuesta inmunológica en un huésped infectado por el patógeno, o antígeno asociado a tumor (TAA) que es un polipéptido expresado específicamente en células tumorales. El antígeno puede seleccionarse de un patógeno o células cancerosas que incluyen, entre otros, virus del papiloma humano (VPH), PRRSV, VIH-1, virus de la gripe, virus del dengue, virus de la hepatitis C (VHC), virus de la hepatitis B (VHB), Circovirus porcino 2 (PCV2), cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de mama, melanoma, linfomas, carcinoma de colon, carcinoma hepatocelular y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, la proteína E7 del VPH (E7), la proteína central del VHC (núcleo del v Hc ), la proteína X del VHB (HBx) se seleccionaron como antígenos para el desarrollo de la vacuna. El antígeno puede ser un antígeno de fusión de una fusión de dos o más antígenos seleccionados de una o más proteínas patogénicas. Por ejemplo, un antígeno de fusión de los fragmentos PRRSV ORF6 y ORF5, o una fusión de proteínas antigénicas de los patógenos PRRSV y PCV2.
La función de una secuencia de retención del retículo endoplásmico es ayudar a la translocación de un antígeno desde un compartimento endocitótico al ER y lo retiene en el lumen. Comprende la secuencia Lys Asp Glu Leu (KDEL) o RDEL. Una secuencia ER puede comprender, o consiste esencialmente en, o consistir en, la secuencia de KKDLRDELKDEL (SEQ ID NO: 16), KKDELRDELKDEL (SEQ ID NO: 17), KKDELRVELKDEL (SEQ ID NO: 18).
La proteína asociada al receptor (RAP1) con un peso molecular de 39 kDa es una proteína residente en ER y una chaperona molecular para la proteína relacionada con el receptor de LDL. Tiene una alta afinidad de unión a CD91 (Kd~3 nM) y está compuesto por tres dominios funcionales similares.
La invención se refiere al descubrimiento de la inducción y mejora de las respuestas inmunitarias mediadas por células T por proteínas de fusión de acuerdo con la invención. Usando RAP1-CD28convPEt-E7-K3 como ejemplo, la estrategia de la vacuna RAP1-CD28convPEt-E7-K3 se centra principalmente en estimular la producción y activación de células T que pueden reconocer las células infectadas por HPV16 que expresan el antígeno objetivo E7. Al suministrar antígenos a las células dendríticas, puede generar células T CD8+ y células T CD4+ específicas de antígenos. Las células T CD4+ auxiliares de tipo 1 son particularmente capaces de estimular y aumentar eficientemente la respuesta inmunitaria de las células T CD8+ citotóxicas. Juntos, estos dos brazos del sistema inmunitario adaptativo tienen la especificidad y la potencia para matar las células infectadas por HPV16 o las células tumorales asociadas a HPV16 en múltiples sitios en el cuerpo sin infligir un daño significativo en los tejidos normales.
El término “sujeto” se refiere a un humano o un animal no humano.
El término “tratar” o “tratamiento” se refiere a la administración de una cantidad efectiva de la proteína de fusión a un sujeto que lo necesita, que tiene cáncer o infección, o un síntoma o predisposición a dicha enfermedad, con el fin de curar, aliviar, aliviar, remediar, mejorar o prevenir la enfermedad, los síntomas o la predisposición hacia ella. Dicho sujeto puede ser identificado por un profesional de la salud basado en los resultados de cualquier método de diagnóstico adecuado.
El término “una cantidad efectiva” se refiere a la cantidad de un compuesto activo que se requiere para conferir un efecto terapéutico sobre el sujeto tratado. Las dosis efectivas variarán, como reconocen los expertos en la materia, dependiendo de la ruta de administración, el uso de excipientes y la posibilidad de uso conjunto con otro tratamiento terapéutico.
Abreviaturas: CD 28, Grupo de diferenciación 28; PE407, residuos de aminoácidos de la exotoxina A (PE) de Pseudomonas desde la posición 1 a la posición 407.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Construcción de vectores de expresión
La figura 7 muestra el vector de expresión RAP1-K3 para la construcción de diversas proteínas de fusión. El vector comprende un RAP1 dominio 3 (s Eq ID NO: 5) y una secuencia de retención del retículo endoplásmico (K3, o una señal KDEL; SEQ ID NO: 16, 17, 18 o 19). El péptido esencial mínimo de translocación (PE268-313; SEQ ID NO: 20) mostrado en la figura 8 se obtuvo de la región de secuencia de polipéptidos PE (SEQ ID NO: 10) de a.a. 268 a.a. 313.
El plásmido RAP1-K3 (figura 7) se generó de la siguiente manera: se sintetizó un fragmento de ADN que codifica NdeIRAP1-(EcoRI, Xh° I)-K3Xh° I mediante un método de PCR y se ligó en la estructura principal del plásmido pUC18 con gen de resistencia a la kanamicina para obtener el plásmido RAP1-K3 (figura 7). Los fragmentos de ADN que codifican diversos péptidos de fusión se generaron por p Cr (figura 8) y se insertaron, respectivamente, en el plásmido RAP1-K3 (figura 7) para generar vectores de expresión para diversas proteínas de fusión (figuras 8 y 9A-F). La figura 1 ilustra el vector de expresión para la proteína de fusión RAP1-CD28convPEt-E7-K3 (Figura 1).
El fragmento CD28convPEt contiene catepsina L y sitios de corte de proteasa de furina. La figura 3 muestra un mapa de secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión RAP1-CD28convPEt-E7-K3 para ilustrar la importancia del fragmento CD28convPEt . Las dos flechas indican sitios de corte de catepsina L y proteasa de furina, respectivamente. Estos dos sitios de corte no solo sirven como ligadores para ligar CD28conv y PEt-E7 sino que también permiten cortar la proteína de fusión para liberar el fragmento PEt-E7-K3 al citoplasma desde el lisosoma. Cualquier otro antígeno de interés de varios patógenos puede reemplazar E7 para fusionarse con CD28convPEt y el producto de fusión se puede insertar luego en el plásmido de la figura 7 para hacer una variedad de vectores de expresión para proteínas de fusión ilustradas en la figura 8.
La secuencia de PE268-313 es: pletftrhrqprgweqleqcgypvqrlvalylaarlswnqvdqvir (SEQ ID NO: 20). La secuencia completa de CD28convPEt es la siguiente: tdiyfckiefmypppyldneksngtiihraykrgweqleqcgypvqrlvalylaarlswnqvdqvirgs (SEQ ID NO: 30), la secuencia subrayada representa una secuencia enlazadora que contiene sitios de corte de catepsina L y proteasa de furina.
Ejemplo 2
Expresión de proteínas
Se cultivaron células BL21 de E. coli que albergaban un vector de expresión de proteínas en caldo Luria Bertani que contenía kanamicina 25 |ig/ml a 37°C. Cuando el cultivo alcanzó una fase logarítmica temprana (A600=0.1 a 0.4), se añadió isopropil-1-tio-p-D-galactopiranosido (IPTG) a una concentración final de 0.5 a 2 mM para la inducción. Las células se cosecharon después de 4 horas de inducción con IPTG y se interrumpieron por sonicación. Los cuerpos de inclusión que contienen proteínas sobreexpresadas se aislaron y se solubilizaron en tampón de urea/TN 8 M (urea 8 M, Tris 50 mM, NaCl 50 mM, pH 8.0).
Las proteínas de fusión RAP1 se replegaron fácilmente y no se agregaron.
La figura 3A es un diagrama de flujo que ilustra que las proteínas de fusión RAP1-CD28PEt-E7-K3 (con CD28conv de ratón o CD28conv humano) se expresaron y extrajeron de los cuerpos de inclusión de células de E. coli). Los análisis de SDS-PAGE indicaron que las proteínas de fusión se replegaron bien (Figura 3B).
La figura 8 ilustra una lista de proteínas de fusión que se expresaron usando un método similar descrito anteriormente: (1) RAP1-PE268-313-E7-K3; (2) RAP1-CD28convPEt-E7-K3; (3) RAP1-CD28PEt-E718-K3 ; (4) RAP1-HCVcore-K3; (5) RAP1-CD28conv-HCVcore-K3; (6) RAP1-CD28convPEtHCVcore-K3; (7) RAP1-HBx; (8) RAP1-HBx-K3; (9) RAP1-CD28conv-HBx; (10) RAP1-CD28conv-HBx-K3; (11) RAP1-CD28convPEt-HBx; (12) RAP1-CD28convPEt-HBx-K3; (13) RAP1-PCV2o r f 2-K3; (14) RAP1-PE268-313-PCV2o r f 2-K3; (15) RAP1-CD28convPEt-PCV2ORF2-K3; (16) RAP1-PE268-313-DGD-K3; (17) RAP1-PE268-313-M12-K3; (18) RAP1-PE268-313-PQAB-K3; (19) RAP1-PE268-313-RSAB-K3; (20) RAP1-CD28convPEt-DGD-K3; (21) RAP1-CD28convPEt-M12-K3; (22) RAP1-CD28convPEt-PQAB-K3; (23) RAP1-CD28convPEt-RSAB-K3. Estas proteínas de fusión se replegaron utilizando el mismo método descrito anteriormente. Los resultados de los análisis de SDS-PAGE indicaron que estas proteínas de fusión se replegaron bien y, por lo tanto, se usaron para preparar vacunas (Figuras 12A-F). El término “K3” significa la secuencia de aminoácidos KDELKDELKDEL (SEQ ID NO: 19).
Ejemplo 3
RAP1-CD28convPEt-E7-K3 inhibe el crecimiento de tumores inducidos por la proteína E7 del virus del papiloma humano (VPH) tipo 16 y aumenta la tasa de supervivencia
Se examinaron los efectos de las proteínas de fusión PE407-E7-K3 y RAP1-CD28convPEtE7-K3 con o sin un potenciador inmunitario sobre el tamaño del tumor y la tasa de supervivencia. Los ratones fueron inoculados con una dosis más alta de células TC-01 (3x104) a través de inyección s.c. Siete días después de la inoculación, los ratones fueron vacunados por vía s.c. con placebo, PE407-E7-K3 (100 mg/dosis) o RAP1-CD28convPEt-E7-K3 (100 ^g/dosis) con el potenciador inmunitario GPI-0100 o el fosfato de aluminio absorbente de proteínas una vez por semana durante 3 semanas (figura 6A). GPI-0100 es un adyuvante estimulante Th1/CTL (potenciador inmunitario). Se registraron el tamaño de los tumores y la tasa de supervivencia en cada grupo (Figuras 9B-C). Cuando se combinó con el adyuvante GPI-0100, tanto PE407-E7-K3 como RAP1-CD28convPEt-E7-K3 suprimieron el crecimiento tumoral. Inesperadamente, se descubrió que el efecto de RAP1-CD28convPEt-E7-K3 en la inhibición del crecimiento tumoral no dependía del adyuvante. Cuando se combina con el fosfato de aluminio absorbente en lugar de con el adyuvante GPI-0100, RAP1-CD28convPEt-E7-K3 aún podría suprimir significativamente el crecimiento tumoral con la misma potencia que cuando se combina con el potenciador inmunitario GPI-0100 (figura 6B, triángulo sin relleno v. triángulo inverso relleno).
Por el contrario, la potencia de PE407-E7-K3 para suprimir el crecimiento tumoral dependía del adyuvante. Cuando se combina con el fosfato de aluminio absorbente, PE407-E7-K3 se vuelve menos potente que aquel que cuando se combina con el potenciador inmunitario GPI-0100 (figura 6B cuadrado sólido v. círculo sin relleno).
Por otro lado, los ratones administrados con RAP1-CD28convPEt-E7-K3 en combinación con el potenciador inmunitario GPI-0100 o el fosfato de aluminio absorbente tuvieron una mejor tasa de supervivencia que los grupos vacunados con PE407-E7-K3 en combinación con GPI-0100 o fosfato de aluminio (figura 6C). Esto indicó que RAP1-CD28convPEt-E7-K3 podría provocar respuestas inmunitarias Th1/CTL incluso sin el potenciador inmunitario GPI-0100. Los resultados también indicaron que la proteína de fusión RAP1-CD28convPEt-E7-K3 era superior a PE407-E7-K3 como vacuna para aumentar la tasa de supervivencia de los animales.
Ejemplo 4
Ensayos de inmunogenicidad
Se probaron las inmunogenicidades de varias vacunas. Brevemente, los ratones se dividieron en los siguientes grupos: HPV16 E7, HPV 18 E7, núcleo de HCV, HBV HBx, PCV2 ORF2 y PRRSV (Figura 10A). Cada grupo se dividió adicionalmente en subgrupos, y cada subgrupo se inyectó con un placebo o una vacuna diseñada para apuntar a un determinado antígeno, o ciertos antígenos, de un patógeno a través de s.c. una vez por semana durante 3 semanas (FIG. 10B). Excepto las vacunas dirigidas al PRRSV, cada vacuna estaba compuesta de una única proteína de fusión y el fosfato de aluminio absorbente, en el que la proteína de fusión única contenía al menos un antígeno de un patógeno. El antígeno era una proteína de longitud completa de un patógeno, o una proteína de longitud no completa que contenía al menos un epítopo de un antígeno de un patógeno, o era un péptido de fusión de dos o más antígenos, en el que cada uno de los antígenos se seleccionaron de diferentes proteínas de un patógeno.
El esquema de inmunización, las vacunas y la dosis se ilustran en las Figs. 10A-B. Brevemente, los ratones fueron vacunados una vez por semana durante 3 semanas con las vacunas enumeradas en la FIG. 10 A. Todos los ratones fueron sacrificados 7 días después de la última inmunización, y se recogieron los bazos. Los esplenocitos se aislaron y se cultivaron en una placa de 6 pozos (2x107 células/2 ml/pozo) con 10 mg/ml de antígenos recombinantes respectivos de patógenos para estimular los esplenocitos en presencia de GolgiPlug de 1 |ig/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA) a 37°C durante 16 h.
Los esplenocitos estimulados se lavaron con tampón FACScan y los marcadores de superficie celular CD8a, CD4 y CD3 se tiñeron con anticuerpos CD8a anti-ratón de rata monoclonal conjugada con ficoeritrina, CD4 anti-ratón de rata monoclonal conjugada con AF700 y CD3 anti-ratón de rata monoclonal conjugada con AF647. Las células fueron luego permeabilizadas y fijadas por el kit Cytofix/Cytoperm de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Pharmingen). El IFN-y intracelular se tiñó con IFN-y anti-ratón de rata conjugado con AF488 para medir la respuesta inmunitaria y los niveles de citocinas. Los análisis de citometría de flujo se realizaron utilizando la citometría de flujo de Gallios con el software de análisis Kaluza (Beckman Coulter).
Las siguientes vacunas PRRSV se analizaron para determinar su inmunogenicidad: vacuna PE407-PRRSV-K3, RAP1-PE268-313-PRRSVK3 o RAP1-CD28convPEt-PRRSV-K3. Cada vacuna contenía una mezcla de cuatro proteínas de fusión diferentes, y cada proteína de fusión contenía un antígeno diferente que se selecciona del grupo que consiste en DGD, M12, PQAB y RSAB (figura 10A). La vacunación de ratones y la estimulación de esplenocitos se realizaron utilizando un método similar al descrito anteriormente. Brevemente, todos los ratones fueron sacrificados 7 días después de la última inmunización, y se recogieron los bazos. Los esplenocitos se aislaron y se cultivaron en una placa de 6 pozos (2x107 células/2 ml/pozo) con 10 |ig/ml de los antígenos recombinantes DGD, M12, PQAB o RSAB, por separado, para estimular los esplenocitos en presencia de 1 |ig/ml. GolgiPlug (BD Pharmingen, San Diego, CA) a 37
°C durante 16 h.
La secuencia de aminoácidos de “DGD” (SEQ ID NO: 26) es como sigue: RHHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGAGTCILSDSGRISYTVEFSLPTHHTVRLIRVTAPPS A LDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANADVVS LTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVRHHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGA GTCILSDSGRISYTVEFSLPTHHTVRLIRVTAPPSA. DGD representa un antígeno de fusión de PRRSV ORF7 a.a. 64 - a.a. 123 (negrita), ligador (subrayado) y ORF7 a. a. 64- a.a. 123 (negrita).
El término “M12” representa un antígeno de PRRSV ORFlb a.a. 1046 - a.a. 1210. Su secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 27) es la siguiente: NNKECTVAQALGNGDKFRATDKRVVDSLRAICADLEGSSSPLPKVAHNLGFYFSPDLT QFAKLPIELAPHWPVVSTQNNEKWPDRLVASLRPLDKYSRACIGAGYMVGPSVFLGTPGVVSY YLTKFVKGEAQVLPETVFSTGRIEVDCREYLDDREREVAASLPH.
La secuencia de aminoácidos de “PQAB” (SEQ ID NO: 28) es la siguiente: GSSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITYASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA. PQAB representa un antígeno de fusión de la cepa estadounidense PRRSV ORF6 a.a. 2- a.a. 26 y ORF5 a.a. 31- a.a. 63 (subrayado).
La secuencia de aminoácidos de RSAB es MGSLDDFCNDSTAAQKLVLAFSITYTPIFVAGGSSSTYQYIYNLTICELNGTDWLSNHFDWA (SEQ ID NO: 29). El término “RSAB” representa un antígeno de fusión de la cepa europea PRRSV ORF6 a.a. 2-28 y ORF5 a.a. 31-64 (subrayado).
Ejemplo 5
El fragmento del dominio RAP1 3 de la proteína de fusión RAP1-CD28convPEt-E7-K3 se reemplaza por un mínimo de A2M (SEQ ID NO: 6), un mínimo de HIV-Tat (SEQ ID NO: 7) o un mínimo de HSP (SEQ ID No : 8) para generar las proteínas de fusión A2M-CD28convPEt-E7-K3, Tat-CD28convPEt-E7-K3 y HSP-CD28convPEt-E7-K3, respectivamente. La actividad de supresión de tumores TC-1 y las respuestas inmunitarias mediadas por células potenciadas por estas vacunas se examinan usando métodos similares a los descritos anteriormente. La Tabla 1 muestra las SEQ ID NOs. de los componentes de varias proteínas de fusión. La Tabla 2 muestra las proteínas de fusión probadas para los efectos sobre las respuestas inmunitarias mediadas por células T en animales y las secuencias de antígenos.
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Figure imgf000011_0001
Tabla 2
Figure imgf000011_0002
En los ensayos de inmunogenicidad, se evaluaron las respuestas inmunitarias mediadas por células específicas de antígeno inducidas por varias vacunas midiendo los números de células T CD3+/CD4+/IFNy+ y CD3+/CD8+/IFNy+ en los esplenocitos (figuras 11A-D y figuras 12A-J). Los resultados indicaron que la vacuna RAP1-CD28convPEt-antigen-K3 puede inducir fuertes respuestas de células T (figuras 11A-D y figuras 12A-J). La figura 11B muestra que el número de células T CD3+/CD4+/IFNy+ y el número de células T CD3+/CD8+/IFNy+ provocado por CD28convPEt-E718-K3 fueron aproximadamente 50 veces y más de 9 veces de RAP1-K3, respectivamente.
La vacuna RAP1-CD28convPEt-antigen-K3 es superior a PE407-antigen-K3 en la obtención de inmunogenicidad mediada por células T. Por ejemplo, la figura 11A ilustra que el número de células T CD3+/CD4+/IFNy+ y el número de células T CD3+/CD8+/IFNy+ provocados por CD28convPEt-E716-K3 fueron aproximadamente 5 veces y 7 veces de PE407-E716-K3, respectivamente. Esto indica que la vacuna RAP1-CD28convPEt-E7-K3 tenía una mejor inmunogenicidad celular que PE407-E7-K3.
Una proteína de fusión que comprende el dominio III de RAP1, la señal sola de sensibilización CD28conv sin el péptido de translocación PEt, el antígeno y una señal de retención de ER es suficiente para provocar una fuerte respuesta inmunitaria mediada por células T específicas de antígeno cuando el antígeno elegido comprende diez o más de 10 epítopos. La figura 11C ilustra que la vacuna RAP1-CD28conv-HCVcore-K3 provocó respuestas de células T con los números de células T CD3+/CD4+/IFNy+ y CD3+/CD8+/IFNy+ que son 20 veces y 7,6 veces del grupo placebo, respectivamente. El antígeno HCVcore contiene 11 epítopos de MHC I bien conocidos.
Fue inesperado que la señal de retención de ER no sea esencial para que la proteína de fusión de la invención provoque una fuerte inmunogenicidad mediada por células. En otras palabras, sin la secuencia de retención de ER, la proteína de fusión de la invención aún puede provocar fuertes respuestas de células T. La figura 11D ilustra que los números de células T CD3+/CD4+/IFNy+ y CD3+/CD8+/IFNy+ generadas por RAP1-CD28convPEt-HBx (sin la señal de retención de ER K3) fueron 7 veces y 74 veces del grupo placebo.
Por el contrario, los números de patente de EE. UU. 7378100B2 y 7335361 muestran que la señal de retención de ER K3 es indispensable para que las proteínas de fusión relacionadas con PE (antígeno PE407-K3) provoquen respuestas de células T.
Las figuras 12A-B ilustran la vacuna RAP1-CD28convPEt-PCV2-K3 y la figura 12C-J ilustran que la vacuna RAP1-CD28convPEt-PRRSV-K3 produjo el mayor recuento de células T CD3+/CD4+/IFNy+ y CD3+/CD8+/IFNy+ entre las vacunas (figura 10A)

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión que comprende:
(a) un dominio de unión a la célula presentadora de antígeno (APC) o un dominio de unión al receptor CD91, ubicado en el terminal N de la proteína de fusión, en el que el dominio de unión a APC o el dominio de unión al receptor CD91 se selecciona del grupo que consiste del dominio III de proteína 1 asociada al receptor (RAP1), proteína asociada al receptor alfa-2-macroglobulina (A2M), VIH-Tat, proteína de choque térmico 70 kDa y dominio la de unión a la exotoxina A de Pseudomonas;
(b) un dominio de transducción de proteínas, ubicado en el terminal C del dominio de unión a APC o el dominio de unión al receptor CD91, el dominio de transducción de proteínas es un polipéptido de fusión que comprende un péptido transductor de señales sensibilizadoras de células T, un ligador y un péptido de translocación, en el que:
(1) el péptido transductor de señal sensibilizante de células T se encuentra en el terminal N del polipéptido de fusión; (2) el ligador comprende la SEQ ID NO: 15, que enlaza el péptido transductor de señal sensibilizante de células T y el péptido de translocación; y
(3) el péptido de translocación tiene una longitud de 34-112 residuos de aminoácidos y comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 3, 20 o 4; y
(c) un antígeno de un patógeno, ubicado en el terminal C del dominio de transducción de proteínas;
en el que:
el péptido transductor de señal sensibilizador de células T tiene una longitud de 28-53 residuos de aminoácidos y comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, en la que Xaa8 es I o L; Xaa10 es V, F o A, Xaa11 *es M o L, Xaa17 es L o I.
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el dominio de unión a APC o el dominio de unión a receptor CD91 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 9, 6, 7 y 8.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de retención del retículo endoplásmico ubicada en el terminal C de la proteína de fusión.
4. La proteína de fusión de la reivindicación 3, en la que la secuencia de retención del retículo endoplásmico comprende la secuencia de aminoácidos de Lys-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 14).
5. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión está libre de una secuencia de retención del retículo endoplásmico en el terminal C de la misma si el antígeno contiene 10 o más epítopos.
6. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el dominio de transducción de proteínas comprende la secuencia de SEQ ID NO: 30.
7. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el dominio de unión a APC o el dominio de unión a receptor CD91 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 5, 9, 6, 7 y 8.
8. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el péptido transductor de señal sensibilizante de células T comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y 2.
9. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el péptido de translocación comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
10. Una proteína de fusión como se reivindica en la reivindicación 1 para su uso en la inducción de respuestas mejoradas de células T específicas de antígeno patógeno, matando una célula de enfermedad que presenta un antígeno a través de moléculas de MHC de clase I en la membrana celular de la célula de enfermedad, y/o prevenir, tratar la infección provocada por un patógeno y/o minimizar los síntomas causados por la infección.
11. La proteína de fusión para usar según la reivindicación 10, en la que la célula de enfermedad es una célula cancerosa.
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