ES2741400T3

ES2741400T3 - Análisis de patrones de metilación de tejidos en mezcla de ADN

Info

Publication number: ES2741400T3
Application number: ES15821804T
Authority: ES
Inventors: Rossa Wai Kwun Chiu; Kwan Chee Chan; Yuk Ming Dennis Lo; Peiyong Jiang; Kun Sun
Original assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Current assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority date: 2014-07-18
Filing date: 2015-07-20
Publication date: 2020-02-10
Anticipated expiration: 2035-07-20
Also published as: EP3169813B1; WO2016008451A1; TWI703216B; TW202409295A; CN106795562B; TWI813141B; TWI758011B; US11984195B2; US20190050528A1; TWI727156B; TW201617455A; HUE056267T2; PT3543356T; TW201903158A; ES2890136T3; TW202219277A; US20160017419A1; EP3543356A1; EP3543356B1; TW202136521A

Abstract

Un método para analizar una muestra biológica de un organismo, incluyendo la muestra biológica una mezcla de al menos 1.000 moléculas de ADN libre de células de una pluralidad de tipos de tejidos, incluyendo un primer tipo de tejido, comprendiendo el método: analizar, mediante un sistema informático, una pluralidad de moléculas de ADN libre de células de la muestra biológica, siendo la pluralidad de moléculas de ADN libre de células al menos 1.000 moléculas de ADN libre de células, en donde el análisis de una molécula de ADN libre de células incluye: identificar una ubicación de la molécula de ADN libre de células en un genoma de referencia correspondiente al organismo; identificar un primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células que están ubicadas cada una en uno cualquiera de N sitios genómicos de una primera región cromosómica del genoma de referencia correspondiente al organismo, siendo N un número entero mayor o igual a 10; medir N primeros niveles de metilación en los N sitios genómicos usando el primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células; determinar, mediante el sistema informático, una primera contribución fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla utilizando los N primeros niveles de metilación y niveles de metilación conocidos en los N sitios genómicos; identificar un segundo conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células que están ubicadas cada una en uno cualquiera de K sitios genómicos de una segunda región cromosómica del genoma de referencia correspondiente al organismo, siendo K un número entero mayor o igual a 10, en donde la segunda región cromosómica es diferente de la primera región cromosómica; medir K segundos niveles de metilación en los K sitios genómicos usando el segundo conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células; determinar, mediante el sistema informático, una segunda contribución fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla utilizando los K segundos niveles de metilación y niveles de metilación conocidos en los K sitios genómicos; calcular un primer valor de separación entre la primera contribución fraccional y la segunda contribución fraccional; y comparar el primer valor de separación con un valor umbral para determinar una clasificación de si el primer tipo de tejido tiene un desequilibrio de secuencia para la primera región cromosómica.

Description

DESCRIPCIÓN

Análisis de patrones de mutilación de tejidos en mezcla de ADN

Antecedentes

Se ha demostrado que el análisis de ADN libre de células en plasma es útil para diferentes fines de diagnóstico, incluyendo las pruebas prenatales no invasivas y la detección de cáncer. Se cree que la presencia de ADN libre de células en el plasma se debe a la liberación de a Dn de las células apoptóticas (Jahr et al. Cancer Res 2001;61: 1659 1665 y Lo et al. Sci Transl Med. 2010;2:61ra91.). En estudios previos, se ha demostrado que las células hematopoyéticas son la principal fuente de ADN plasmático en sujetos sanos y receptores de trasplantes de órganos (Lui YY et al. Clin Chem 2002;48:421-7 y Zheng YW et al. Clin Chem 2012;58:549-58). En estos estudios previos, se utilizaron modelos de trasplante de órganos para determinar la contribución de diferentes órganos al ADN plasmático. En esos escenarios, la diferencia genética entre el donante de órganos y los receptores de trasplantes se utiliza para calcular la contribución del órgano trasplantado al ADN plasmático del receptor de trasplante. Sin embargo, en este modelo, solo se puede determinar la contribución del órgano trasplantado y no se puede determinar al mismo tiempo la contribución de los otros órganos que sean del receptor. Documentos US2014/0080715 A1, WO2012/071621 A1 y WO2012/103031 A2 describen métodos adicionales para evaluar aberraciones genéticas.

Además, incluso para técnicas que pueden determinar una contribución de otros órganos usando patrones de metilación, la precisión de dichas técnicas no se ha probado exhaustivamente y, por lo tanto, no se han identificado adecuadamente las deficiencias en la precisión. Asimismo, la aplicación de la determinación de contribuciones de otros órganos ha sido limitada.

Breve sumario

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para analizar una muestra biológica de un organismo, incluyendo la muestra biológica una mezcla de al menos 1.000 moléculas de ADN libre de células de una pluralidad de tipos de tejidos, incluyendo un primer tipo de tejido, comprendiendo el método: analizar, mediante un sistema informático, una pluralidad de moléculas de ADN libre de células de la muestra biológica, siendo la pluralidad de moléculas de ADN libre de células al menos 1.000 moléculas de ADN libre de células, en donde el análisis de una molécula de ADN libre de células incluye: identificar una ubicación de la molécula de ADN libre de células en un genoma de referencia correspondiente al organismo; identificar un primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células que están ubicadas cada una en uno cualquiera de N sitios genómicos de una primera región cromosómica del genoma de referencia correspondiente al organismo, siendo N un número entero mayor o igual a 10; medir N primeros niveles de metilación en los N sitios genómicos usando el primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células; determinar, mediante el sistema informático, una primera contribución fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla utilizando los N primeros niveles de metilación y niveles de metilación conocidos en los N sitios genómicos; identificar un segundo conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células que están ubicadas cada una en uno cualquiera de K sitios genómicos de una segunda región cromosómica del genoma de referencia correspondiente al organismo, siendo K un número entero mayor o igual a 10, en donde la segunda región cromosómica es diferente de la primera región cromosómica; medir K segundos niveles de metilación en los K sitios genómicos usando el segundo conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células; determinar, mediante el sistema informático, una segunda contribución fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla utilizando los K segundos niveles de metilación y niveles de metilación conocidos en los K sitios genómicos; calcular un primer valor de separación entre la primera contribución fraccional y la segunda contribución fraccional; y comparar el primer valor de separación con un valor umbral para determinar una clasificación de si el primer tipo de tejido tiene un desequilibrio de secuencia para la primera región cromosómica.

Se describen realizaciones para determinar las contribuciones de diferentes tejidos a una muestra biológica que incluye una mezcla de moléculas de ADN libre de células de varios tipos de tejidos, por ejemplo, como se produce en el plasma y otros fluidos corporales. Las realizaciones pueden analizar los patrones de metilación de la mezcla de ADN (por ejemplo, los niveles de metilación en sitios genómicos particulares) y determinar las contribuciones fraccionales de varios tipos de tejidos a la mezcla de ADN.

Pueden seleccionarse varios tipos de sitios genómicos para que tengan propiedades concretas entre tipos de tejidos y entre individuos, a fin de proporcionar una precisión aumentada en la determinación de las contribuciones de los diversos tipos de tejido. Por ejemplo, pueden usarse sitios genómicos que tengan al menos una cantidad umbral de variabilidad, en contraposición con solo usar sitios genómicos que son específicos para un tipo de tejido.

En algunas realizaciones, pueden determinarse patrones de metilación de los tipos de tejido que contribuyen potencialmente a la mezcla de ADN (tejidos candidatos). Posteriormente, se determina el patrón de metilación de la mezcla de ADN de interés. Por ejemplo, pueden calcularse los niveles de metilación en varios sitios. Ya que la mezcla de ADN está compuesta por ADN de los tejidos candidatos, puede determinarse la composición de la mezcla de ADN comparando los patrones de metilación de la mezcla de ADN y los tipos de tejidos candidatos. Por ejemplo, pueden usarse los niveles de metilación en los N sitios genómicos para calcular una contribución de M tejidos, donde M es menor o igual que N. Pueden calcularse en cada sitio los niveles de metilación para cada tejido. Puede resolverse el sistema lineal de ecuaciones A x = b, donde b es un vector de las densidades de metilación medidas en los N sitios, x es un vector de la contribución de los M tejidos y A es una matriz de M filas y N columnas, proporcionando cada fila las densidades de metilación en los N tejidos en el sitio particular de dicha fila. Si M es menor que N, entonces se puede realizar una optimización de mínimos cuadrados.

En diversas realizaciones, un valor de separación significativo (es decir, una diferencia sustraída o una proporción) en un porcentaje de contribución de un tipo de tejido particular en la mezcla de ADN en relación con un valor de referencia puede indicar una patología. El valor de referencia puede corresponder a un porcentaje de contribución determinado en un individuo sano y un valor de separación mayor que un umbral puede determinar una patología, ya que el tejido enfermo libera más moléculas de ADN libre de células que el tejido sano.

En otras realizaciones, pueden determinarse dos contribuciones fraccionales de un tipo de tejido usando niveles de metilación de dos conjuntos de moléculas de ADN libre de células, siendo cada conjunto para un intervalo de tamaños diferente, para identificar una clasificación de si el tipo de tejido está o no enfermo. Puede compararse un valor de separación entre las dos contribuciones fraccionales con un umbral y puede determinarse una clasificación para determinar si el primer tipo de tejido tiene una patología basándose en la comparación. Por ejemplo, dicha técnica puede identificar tejido enfermo que libera moléculas de ADN libre de células más cortas midiendo una mayor contribución fraccional para moléculas de ADN libre de células más cortas que para moléculas de ADN libre de células más largas.

En otras realizaciones más, pueden determinarse dos contribuciones fraccionales de un tipo de tejido usando niveles de metilación de dos conjuntos de moléculas de ADN libre de células, siendo cada conjunto para una región cromosómica diferente, para identificar una clasificación de si una primera región cromosómica tiene o no un desequilibrio de secuencia. Puede compararse un valor de separación entre las dos contribuciones fraccionales con un umbral y puede determinarse una clasificación de si la primera región cromosómica tiene o no un desequilibrio de secuencia basándose en la comparación. Por ejemplo, las regiones con diferente número de copias corresponderán a diferentes porcentajes de contribución para un tipo de tejido que es el origen de la aberración del número de copias, como puede suceder cuando el tipo de tejido tiene un tumor con una aberración.

Otras realizaciones se refieren a sistemas y medios legibles por ordenador asociados con los métodos descritos en el presente documento. La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

Puede lograrse una mejor comprensión de la naturaleza y las ventajas de las realizaciones de la presente invención por referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama de flujo que ilustra un método para analizar una mezcla de ADN de moléculas de ADN libre de células para determinar contribuciones fraccionales de varios tipos de tejidos a partir de niveles de metilación de acuerdo con las realizaciones de la presente invención.

La FIG. 2 muestra un diagrama esquemático que muestra varias aplicaciones potenciales de la deconvolución de la metilación de ADN (por ejemplo, usando plasma) y sus aplicaciones de acuerdo con las realizaciones de la presente invención.

La FIG. 3A muestra una gráfica de las contribuciones porcentuales de diferentes órganos al ADN plasmático para 15 mujeres gestantes de acuerdo con las realizaciones de la presente invención. La FIG. 3B muestra una gráfica 350 de una correlación entre las fracciones de ADN plasmático aportadas por la placenta deducidas mediante la deconvolución de la metilación del ADN plasmático y las fracciones de ADN fetal deducidas utilizando alelos SNP específicos del feto de acuerdo con las realizaciones de la presente invención.

La FIG. 4 muestra una tabla de contribuciones porcentuales determinadas a partir de un análisis de mapeo en tejidos de ADN plasmático entre mujeres gestantes de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 5 muestra diagramas de las contribuciones porcentuales distintos de la placenta mediante mapeo en tejidos de ADN plasmático y fracciones de ADN fetal basándose en alelos de SNP específicos fetales de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 6 muestra una tabla de contribuciones porcentuales a partir del análisis de mapeo en tejidos de ADN plasmático entre los sujetos de control sanos no gestantes de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 7 muestra una tabla de las contribuciones estimadas de diferentes órganos al ADN plasmático para 11 mujeres gestantes y 4 sujetos sanos no gestantes utilizando el primer conjunto de marcadores (con alta especificidad de órgano) de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 8 muestra una tabla de las contribuciones estimadas de diferentes órganos al ADN plasmático para 11 mujeres gestantes y 4 sujetos sanos no gestantes que utilizan el segundo conjunto de marcadores (con baja especificidad de órganos) de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 9A es una gráfica que muestra la correlación entre la fracción de ADN fetal estimada (contribución de la placenta) y la fracción de a Dn fetal determinada al contar los alelos específicos fetales en las muestras de plasma materno. La FIG. 9B es una gráfica que muestra la diferencia absoluta entre la estimación a partir de marcadores de metilación y la fracción de ADN fetal determinada mediante recuento de alelos específicos fetales.

La FIG. 10 muestra una tabla 1000 de contribuciones de diferentes tejidos al ADN plasmático de pacientes con cáncer y sanos basándose en el patón de metilación específico de órgano de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 11A es una gráfica 1100 que muestra los valores de la fracción de ADN tumoral determinada mediante el análisis del patrón de metilación específico de órgano y se determinó mediante el nivel de metilación por todo el genoma de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG. 11B es una gráfica que muestra una correlación entre las fracciones de ADN plasmático aportadas por el hígado basándose en el análisis de mapeo tisular de ADN plasmático y las fracciones de ADN plasmático procedentes de tumores determinadas mediante el análisis GAAL.

La FIG. 12A es una gráfica que muestra el ADN procedente de tumores estimado en el plasma del paciente de HCC 10 en varios momentos. La FIG. 12B es una gráfica que muestra el ADN procedente de tumores estimado en el plasma del paciente de HCC 9.

La FIG. 13 es una tabla que muestra el análisis de mapeo en tejidos de ADN plasmático entre pacientes de trasplante de órganos de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 14 es una gráfica que muestra una correlación entre las fracciones de ADN plasmático aportadas por el injerto trasplantado deducidas por el mapeo en tejidos de ADN plasmático y las fracciones de ADN del donante determinadas utilizando alelos de SNP específicos del donante.

La FIG. 15A es una gráfica que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 503 marcadores de tipo I, 503 de tipo II y de ambos tipos (503 de cada uno) para la deconvolución de la metilación. La FIG. 15B es una gráfica que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 251 marcadores de tipo I, 251 de tipo II y de ambos tipos (251 de cada uno) para la deconvolución de la metilación.

La FIG. 16A es una gráfica que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 123 marcadores de tipo I, 123 de tipo II y de ambos tipos (123 de cada uno) para la deconvolución de la metilación. La FIG. 16B es una gráfica que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 52 marcadores de tipo I, 52 de tipo II y de ambos tipos (52 de cada uno) para la deconvolución de la metilación.

La FIG. 17A es una gráfica que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 26 marcadores de tipo I, 26 de tipo II y de ambos tipos (26 de cada uno) para la deconvolución de la metilación. La FIG. 17B es una gráfica que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 13 marcadores de tipo I, 13 de tipo II y de ambos tipos (13 de cada uno) para la deconvolución de la metilación.

La FIG. 18A es una gráfica que muestra la contribución placentaria al ADN plasmático deducida utilizando marcadores con diferentes criterios de selección de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG.

18B es una gráfica que muestra la precisión de la deconvolución del ADN plasmático utilizando marcadores con baja variabilidad (categoría i) y alta variabilidad (categoría ii) en el mismo tipo de tejido.

La FIG. 19 es una tabla que muestra las contribuciones de diferentes tejidos al ADN plasmático de pacientes con diversos tipos de cáncer y sujetos sanos basándose en el análisis de patrones de metilación específicos de órganos de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 20 muestra una tabla que muestra las contribuciones de los diferentes órganos para cada paciente con cáncer en comparación con la media de los cuatro sujetos de control de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 21A es una gráfica que muestra las contribuciones del hígado al ADN plasmático estimadas a partir de marcadores de metilación para sujetos con HCC y de control sanos de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG. 21B es una gráfica que muestra el porcentaje de ADN plasmático aportado por el hígado entre los controles sanos y los pacientes con HCC según lo deducido por realizaciones de la presente invención.

Las FIG. 22A y 22B muestran las contribuciones porcentuales de (A) los pulmones y (B) el colon deducidas a partir de las realizaciones de la presente invención con comparaciones entre controles sanos no gestantes y pacientes con cáncer de pulmón o cáncer colorrectal.

La FIG. 23 es una tabla que muestra el análisis de mapeo en tejidos de ADN plasmático entre pacientes con cáncer de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 24 es un diagrama de flujo que ilustra un método para analizar una mezcla de ADN de moléculas de ADN libre de células para identificar una patología en un tejido basándose en la contribución fraccional elevada del tejido a la mezcla de ADN de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 25 es una tabla que muestra la contribución porcentual de diferentes órganos al ADN plasmático mediante deconvolución de la metilación en nueve pacientes con LES de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 26A es una gráfica que muestra las contribuciones placentarias determinadas a partir de moléculas de ADN libre de células de diferentes longitudes para tres mujeres gestantes (M6941p, M7171p y M396p) de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG. 26B es una tabla que muestra las contribuciones de tejidos no hematopoyéticos determinadas a partir de moléculas de ADN libre de células de diferentes longitudes para pacientes de trasplante de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 27A es una gráfica que muestra las contribuciones del hígado determinadas a partir de moléculas de ADN libre de células de diferentes longitudes para pacientes de trasplante de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG. 27B es una gráfica que muestra las contribuciones del hígado determinadas a partir de moléculas de ADN libre de células de diferentes longitudes para pacientes con HCC de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 28 es un diagrama de flujo que ilustra un método para analizar una mezcla de ADN de moléculas de ADN libre de células para identificar una patología en un tejido basándose en la contribución fraccional diferencial del tejido a la mezcla de ADN a partir de moléculas de ADN libre de células de diferentes tamaños de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 29 es un diagrama de flujo que ilustra un método 2900 para determinar el tejido de origen para las aberraciones del número de copias de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 30A muestra una ilustración del análisis de la deconvolución de la metilación del ADN plasmático específico de cromosoma en una mujer gestante que porta una trisomía 21 de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG. 30B es un diagrama 3050 que muestra los valores de separación AM del cromosoma 21 en diferentes tejidos para mujeres gestantes, cada una de las cuales porta un feto con trisomía 21 (T21) de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 31 es un diagrama que muestra los valores de separación AM de otros cromosomas en diferentes tejidos para mujeres gestantes, cada una de las cuales porta un feto con trisomía 21 (T21) de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 32A es una ilustración del análisis de las regiones CNA en el ADN plasmático de pacientes con cáncer de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG. 32B es un diagrama que muestra valores de separación AM entre regiones que muestran ganancias en el número de copias y pérdidas en el número de copias en diferentes tejidos para los pacientes con cáncer de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 33 es un diagrama que muestra los valores de separación AM entre las regiones genómicas elegidas al azar en diferentes tejidos para los pacientes con cáncer de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 34A muestra una ilustración del análisis de la deconvolución de la metilación para la mujer gestante con un linfoma concurrente de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG. 34B es una gráfica que muestra el análisis de secuenciación del ADN de todo el genoma para la detección de la aberración del número de copias entre las muestras tomadas de la mujer gestante a la que se le diagnosticó un linfoma folicular recurrente durante el embarazo temprano.

La FIG. 35A es una tabla 3500 que muestra las contribuciones fraccionales determinadas a partir del mapeo en tejidos de ADN plasmático en la muestra de plasma antes del tratamiento para la mujer gestante con linfoma folicular recurrente. La FIG. 35B es un diagrama que muestra los valores de separación AM para diferentes tejidos de la mujer gestante con linfoma folicular concurrente.

La FIG. 36A es una gráfica que muestra el análisis de aberración del número de copias en el ADN plasmático de un paciente con cáncer colorrectal que metastatiza al hígado. La FIG. 36B es un diagrama que muestra el análisis de deconvolución de metilación de las aberraciones del número de copias del ADN plasmático para el paciente con cáncer colorrectal y metástasis hepática de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

Las FIG. 37 y 38 muestran una tabla de parámetros de secuenciación básicos, incluyendo la profundidad de secuenciación, de varias muestras utilizadas en la identificación de un tejido de origen.

La FIG. 39 es un diagrama de flujo que ilustra un método para analizar una muestra biológica de un organismo para determinar si una región cromosómica muestra un desequilibrio de secuencia utilizando deconvolución de la metilación de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 40A es una gráfica que muestra las distribuciones de tamaño del ADN de la orina de las dos mujeres gestantes de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG. 40B muestra una gráfica de la representación genómica (GR) de diferentes cromosomas en el ADN de la orina de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La FIG. 41 muestra un diagrama de bloques de un ejemplo de sistema informático 10 utilizable con el sistema y los métodos de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

El apéndice A muestra la tabla S1 de los marcadores de tipo I y tipo II.

TÉRMINOS

Un "metiloma" proporciona una medida de una cantidad de metilación del ADN en una pluralidad de sitios o locus en un genoma. El metiloma puede corresponder a todo el genoma, una parte sustancial del genoma o porciones relativamente pequeñas del genoma. Un "metiloma fetal" corresponde a un metiloma de un feto de una mujer gestante. El metiloma fetal puede determinarse usando una variedad de tejidos fetales o fuentes de ADN fetal, Incluyendo tejidos placentarios y ADN fetal libre de células en plasma materno. Un "metiloma tumoral" corresponde a un metiloma de un tumor de un organismo (por ejemplo, un ser humano). El metiloma tumoral puede determinarse utilizando tejido tumoral o ADN tumoral libre de células en plasma materno. El metiloma fetal y el metiloma tumoral son ejemplos de un metiloma de interés. Otros ejemplos de metilomas de interés son los metilomas de órganos (por ejemplo, metilomas de células cerebrales, huesos, los pulmones, el corazón, los músculos y los riñones, etc.) que pueden aportar ADN a un fluido corporal (por ejemplo, plasma, suero, sudor, saliva, orina, secreciones genitales, semen, fluido de las heces, fluido diarreico, fluido cefalorraquídeo, secreciones del tracto gastrointestinal, líquido de ascitis, líquido pleural, fluido intraocular, líquido de un hidrocele (por ejemplo, del testículo), fluido de un quiste, secreciones pancreáticas, secreciones intestinales, esputo, lágrimas, fluidos de aspiración de mama y tiroides, etc.). Los órganos pueden ser órganos trasplantados.

Un "metiloma plasmático" es un metiloma determinado a partir del plasma o suero de un animal (por ejemplo, un ser humano). El metiloma plasmático es un ejemplo de un metiloma libre de células, ya que el plasma y el suero incluyen ADN libre de células. El metiloma plasmático también es un ejemplo de un metiloma mixto, ya que es una mezcla de metiloma fetal/materno o metiloma de tumor/paciente o ADN procedente de diferentes tejidos u órganos. El "metiloma placentario" puede determinarse a partir de una muestra de vello coriónico (CVS) o una muestra de tejido placentario (por ejemplo, obtenida tras el parto). El "metiloma celular" corresponde al metiloma determinado a partir de las células (por ejemplo, células sanguíneas) del paciente. El metiloma de las células sanguíneas se denomina metiloma de células sanguíneas (o metiloma sanguíneo).

Un "sitio" corresponde a un solo sitio, que puede ser una sola posición de bases o un grupo de posiciones de bases correlacionadas, por ejemplo, un sitio de CpG. Un "locus" puede corresponder a una región que incluye múltiples sitios. Un locus puede incluir solo un sitio, que podría hacer que el locus sea equivalente a un sitio en ese contexto.

El "índice de metilación" para cada sitio genómico (por ejemplo, un sitio de CpG) se refiere a la proporción de lecturas de secuencia que muestran metilación en el sitio frente al número total de lecturas que cubren ese sitio. La "densidad de metilación" de una región es el número de lecturas en los sitios dentro de la región que muestra metilación divididas entre el número total de lecturas que cubren los sitios en la región. Los sitios pueden tener características específicas, por ejemplo, ser sitios de CpG. Por lo tanto, la "densidad de metilación de CpG" de una región es el número de lecturas que muestran metilación de CpG divididas entre el número total de lecturas que cubren los sitios de CpG en la región (por ejemplo, un sitio de CpG particular, sitios de CpG dentro de una isla de CpG o una región más grande). Por ejemplo, puede determinarse la densidad de metilación para cada agrupación de 100 kb en el genoma humano a partir del número total de citosinas no cubiertas después del tratamiento con bisulfito (que corresponde a citosina metilada) en los sitios de CpG como una proporción de todos los sitios de CpG cubiertos por las lecturas de secuencia mapeadas en la región de 100 kb. Este análisis también puede efectuarse para otros tamaños de agrupaciones, por ejemplo, 50 kb o 1 Mb, etc. Una región podría ser el genoma completo o un cromosoma o una parte de un cromosoma (por ejemplo, un brazo cromosómico). El índice de metilación de un sitio de CpG es el mismo que la densidad de metilación para una región cuando la región solo incluye ese sitio de CpG. La "proporción de citosinas metiladas" se refiere al número de sitios de citosina, "C", que se demuestra que están metilados (por ejemplo, no convertidos tras la conversión de bisulfito) a lo largo del número total de restos de citosina analizados, es decir, incluyendo citosinas fuera del contexto de CpG, en la región. El índice de metilación, la densidad de metilación y la proporción de citosinas metiladas son ejemplos de "niveles de metilación".

Un "perfil de metilación" (también denominado estado de metilación) incluye información relacionada con la metilación del ADN para una región. La información relacionada con la metilación del ADN puede incluir, pero sin limitación, un índice de mutilación de un sitio de CpG, una densidad de mutilación de los sitios de CpG en una región, una distribución de sitios de CpG en una región contigua, un patrón o nivel de metilación para cada sitio de CpG individual dentro de una región que contiene más de un sitio de CpG y metilación no de CpG. Un perfil de metilación de una parte sustancial del genoma puede considerarse equivalente al metiloma. La "metilación del ADN" en genomas de mamíferos generalmente se refiere a la adición de un grupo metilo al carbono 5' de los restos de citosina (es decir, 5-metilcitosinas) entre los dinucleótidos de CpG. La metilación del ADN puede ocurrir en citosinas en otros contextos, por ejemplo CHG y CHH, donde H es adenina, citosina o timina. La metilación de la citosina también puede estar en forma de 5-hidroximetilcitosina. También se ha informado de metilación no de citosina, tal como de N6-metiladenina.

Un "tejido" corresponde a un grupo de células del mismo tipo. Los diferentes tipos de tejido pueden consistir en diferentes tipos de células (por ejemplo, hepatocitos, células alveolares o células sanguíneas), pero también puede corresponder a tejido de diferentes organismos (madre frente a feto) o a células sanas frente a células tumorales. Los "tejidos de referencia" corresponden a tejidos usados para determinar los niveles de metilación específicos del tejido. Se pueden usar múltiples muestras de un mismo tipo de tejido de diferentes individuos para determinar un nivel de metilación específico de tejido para ese tipo de tejido.

Una "muestra biológica" se refiere a cualquier muestra que se toma de un sujeto (por ejemplo, un ser humano, tal como una mujer gestante, una persona con cáncer o una persona sospechosa de tener cáncer, un receptor de trasplante de órganos o un sujeto con sospecha de tener una patología que implica un órgano (por ejemplo, el corazón en infarto de miocardio o el cerebro en un accidente cerebrovascular) y contiene una o más moléculas de ácido nucleico de interés. La muestra biológica puede ser un fluido corporal, tal como sangre, plasma, suero, orina, fluido vaginal, líquido de un hidrocele (por ejemplo, del testículo) o fluidos de descarga vaginal, líquido pleural, líquido de ascitis, fluido cefalorraquídeo, saliva, sudor, lágrimas, esputo, líquido de lavado broncoalveolar, etc. También se pueden utilizar muestras de heces.

El término "nivel de cáncer" puede referirse a si existe un cáncer, un estadio de un cáncer, un tamaño de tumor, si hay o no metástasis, la carga tumoral total del organismo y/u otra medida de la gravedad de un cáncer. El nivel de cáncer podría ser un número u otros indicios, tales como símbolos, letras del alfabeto y colores. El nivel podría ser cero. El nivel de cáncer también incluye afecciones (estados) premalignos o precancerosos asociados con mutaciones o una serie de mutaciones. El nivel de cáncer se puede utilizar de varias maneras. Por ejemplo, puede efectuarse una exploración en caso de que el cáncer esté presente en alguien de quien no se sabía si tenía cáncer con anterioridad. La evaluación puede investigar a alguien a quien se le ha diagnosticado cáncer para monitorizar el progreso del cáncer con el paso del tiempo, estudiar la eficacia de las terapias o para determinar el pronóstico. En una realización, el pronóstico puede expresarse como la probabilidad de que un paciente muera de cáncer o la probabilidad de que el cáncer progrese después de una duración o tiempo específica o la probabilidad de que el cáncer metastatice. Detección puede significar "exploración" o puede significar comprobar si alguien, con características que sugieren cáncer (por ejemplo, síntomas u otras pruebas positivas), tiene cáncer.

La expresión "desequilibrio de secuencia" de una región cromosómica significa cualquier desviación significativa en una cantidad de moléculas de ADN libre de células de la región cromosómica en relación con un valor esperado, en caso de que el organismo estuviese sano. Por ejemplo, una región cromosómica puede exhibir una amplificación o una eliminación en un tejido determinado, lo que da como resultado un desequilibrio de secuencia para la región cromosómica en una mezcla de ADN que contiene ADN del tejido, mezclado con ADN de otros tejidos. A modo de ejemplo, puede obtenerse el valor esperado de otra muestra o de otra región cromosómica que se asume que es normal (por ejemplo, una cantidad representativa de dos copias para un organismo diploide). Una región cromosómica puede estar compuesta de múltiples subregiones desunidas.

Un "tipo" para un locus (marcador) genómico corresponde a atributos específicos para un locus a través de tipos de tejidos. La descripción se refiere principalmente a los locus de tipo I y los locus de tipo II, cuyas propiedades se proporcionan en detalle a continuación. Un locus de un tipo dado puede tener variación estadística específica en los niveles de metilación entre los tipos de tejido. Una "categoría" para un locus (marcador) genómico corresponde a una variación específica en los niveles de metilación para un locus en diferentes individuos para un mismo tipo de tejido. Un conjunto de locus (marcadores) genómicos puede estar compuesto por cualquier número de locus de varios tipos y/o categorías. Por lo tanto, un conjunto de locus corresponde a los locus seleccionados para una medida particular y no connota ninguna propiedad particular de los locus en el conjunto.

Un "valor de separación" corresponde a una diferencia o una relación que implica dos valores, por ejemplo, dos contribuciones fraccionales o dos niveles de metilación. El valor de separación podría ser una simple diferencia o relación. El valor de separación puede incluir otros factores, por ejemplo, factores multiplicativos. Como otros ejemplo, puede utilizarse una diferencia o relación de funciones de los valores, por ejemplo, una diferencia de los logaritmos naturales (ln) de los dos valores.

El término "clasificación", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier número u otros caracteres que se asocian con una propiedad particular de una muestra. Por ejemplo, un símbolo "+" (o la palabra "positivo") podría significar que se clasifica que una muestra tiene eliminaciones o amplificaciones. La clasificación puede ser binaria (por ejemplo, positiva o negativa) o tener más niveles de clasificación (por ejemplo, una escala de 1 a 10 o de 0 a 1). Los términos "corte" y "umbral" se refieren a un número predeterminado usado en una operación. Por ejemplo, un tamaño de corte puede referirse a un tamaño por encima del cual se excluyen los fragmentos. Un valor umbral puede ser un valor por encima o por debajo del cual se aplica una clasificación particular. Cualquiera de estos términos puede ser usado en cualquiera de estos contextos.

Descripción detallada

Las realizaciones de la presente invención pueden determinar porcentajes de ADN libre de células en plasma (u otra mezcla de ADN) de diversos tipos de tejidos usando niveles de metilación conocidos en ciertos sitios genómicos para los tipos de tejidos específicos. Por ejemplo, pueden medirse los niveles de metilación en los sitios genómicos para una muestra de hígado y pueden usarse estos niveles de metilación específicos de tejido para determinar qué cantidad de ADN sin células en la mezcla procede del hígado. Los niveles de metilación también pueden medirse para los tipos de tejido que proporcionan contribuciones sustanciales a la mezcla de ADN, de tal forma que puede interpretarse una predominancia (por ejemplo, más de un 90 %, 95 % o 99 %) de la mezcla de ADN libre de células. Dichas otras muestras pueden incluir, pero sin limitación, algunos o todos los siguientes: pulmón, colon, intestino delgado, páncreas, glándulas suprarrenales, esófago, tejidos adiposos, corazón y cerebro.

Se puede usar un proceso de deconvolución para determinar las contribuciones fraccionales (por ejemplo, el porcentaje) para cada uno de los tipos de tejido para los cuales se conocen los niveles de metilación específicos del tejido. En algunas realizaciones, se puede crear un sistema de ecuaciones lineales a partir de los niveles de metilación específicos de tejido conocidos y los niveles de metilación de la mezcla en los sitios genómicos especificados ("niveles de metilación de la mezcla") y pueden determinarse las contribuciones fraccionales que mejor se aproximan a los niveles de metilación de la mezcla medidos (por ejemplo, usando mínimos cuadrados).

Se pueden seleccionar sitios genómicos específicos para proporcionar un nivel deseado de precisión. Por ejemplo, pueden usarse sitios genómicos que tengan al menos una cantidad umbral de variabilidad, en contraposición con solo usar sitios genómicos que son específicos para un tipo de tejido. Puede seleccionarse un primer conjunto (por ejemplo, 10) de los sitios genómicos, de tal forma que cada uno tenga un coeficiente de variación de los niveles de metilación de al menos 0,15 a lo largo de los tipos de tejidos y de tal forma que cada uno tiene una diferencia entre un nivel de metilación máximo y mínimo para los M tipos de tejidos que supera 0,1 para una o más muestras distintas. El primer conjunto de sitios genómicos puede no tener una firma de metilación específica para un tipo de tejido específico, por ejemplo, única o predominantemente metilado en el tipo de tejido específico. Dicho primer conjunto se denomina sitios de tipo II. Estos sitios genómicos pueden usarse en combinación con sitios genómicos que tienen una firma específica, que se denominan sitios de tipo I.

El uso de sitios de tipo II puede asegurar que se abarca el espacio completo de niveles de metilación entre los tipos de tejidos mediante los sitios genómicos, proporcionando de este modo una precisión aumentada frente a los sitios de tipo I. El simple uso de más sitios de tipo I proporciona vectores básicos redundantes para el espacio de metilación (es decir, más sitios genómicos que tienen el mismo patrón como otros sitios), mientras que la adición de otros sitios genómicos cuyos niveles de metilación tienen varios valores en diferentes tejidos agrega nuevos vectores básicos para discriminar las contribuciones fraccionales a través del sistema de ecuaciones lineales.

Una vez que se determinan las contribuciones fraccionales (independientemente de los tipos de sitios elegidos), pueden usarse las contribuciones fraccionales para diversos fines. Pueden determinarse las contribuciones fraccionales de referencia para los diversos tipos de tejido para un conjunto de personas particular que se encuentran sanos para estos tipos de tejido (por ejemplo, individuos sanos para todos los tipos de tejido o individuos sanos para ciertos tipos de tejido). Cuando un tipo de tejido (por ejemplo, para el hígado) está enfermo, entonces ese tejido liberaría más moléculas de ADN libre de células, como puede producirse mediante apoptosis. Por ejemplo, un aumento sustancial (es decir, un umbral mayor que los valores de referencia) en la contribución fraccional para el hígado indica que el hígado está enfermo.

Dicho aumento en la contribución fraccional de un tipo de tejido particular puede someterse a un análisis adicional, por ejemplo, un análisis de tamaño del ADN libre de células. El análisis de tamaño también se puede realizar por sí mismo. Pueden determinarse dos contribuciones fraccionales para diferentes intervalos de tamaño (por ejemplo, corto y largo) y las separaciones (es decir, diferencia o proporción) entre las dos contribuciones fraccionales pueden indicar que hay más moléculas de ADN libre de células corto del tipo de tejido particular que moléculas de ADN libre de células largo. Debido a que un tejido enfermo tiene moléculas de ADN libre de células más cortas, una contribución fraccional mayor de las moléculas de ADN libre de células más cortas en relación con las moléculas de ADN libre de células más largas en el tipo de tejido particular indica que el tipo de tejido particular está enfermo.

Pueden usarse las separaciones entre las contribuciones fraccionales para un tipo de tejido usando diferentes regiones cromosómicas para determinar si el tipo de tejido tiene o no un desequilibrio de secuencia. Para un ejemplo de una mujer gestante donde el tipo de tejido es tejido fetal, en caso de que haya tres copias del cromosoma 21, el porcentaje de tejido fetal medido será mayor usando ADN libre de células del cromosoma 21 que para otro cromosoma que tenga dos copias. Una separación significativa (por ejemplo, mayor de un umbral) en la contribución fraccional del tejido fetal indica que el cromosoma 21 tiene un desequilibro de secuencia.

Como otro ejemplo para detectar desequilibrios de secuencia, puede identificarse que una región cromosómica particular tiene una aberración en el número de copias, pero puede desconocerse el origen de la aberración. También puede sospecharse que una región tiene una aberración. Puede determinarse una primera contribución fraccional para un tipo de tejido usando ADN libre de células de la región identificada y puede determinarse una segunda contribución fraccional para el tipo de tejido usando ADN libre de células de otra región. Una separación significativa entre las contribuciones fraccionales indica que el tipo de tejido es el que muestra un desequilibrio de secuencia, por ejemplo, el desequilibrio de secuencia identificado a través de la aberración del número de copias o simplemente un desequilibrio de secuencia que se está probando para la región identificada.

I. COMPOSICIÓN DE LA MEZCLA DE ADN MEDIANTE DECONVOLUCIÓN DE LA METILACIÓN

Los diferentes tejidos pueden tener diferentes niveles de metilación para un sitio genómico. Estas diferencias pueden usarse para determinar las contribuciones fraccionales de ADN de los diversos tipos de tejido en una mezcla. Por lo tanto, puede determinarse la composición de una mezcla de ADN mediante un análisis de patrón de metilación específico de tejido. Los ejemplos más adelante analizan las densidades de metilación, pero pueden usarse otros niveles de metilación.

A. Sitio genómico individual

El principio de la deconvolución de la metilación se puede ilustrar utilizando un solo sitio genómico de metilación (marcador de metilación) para determinar una composición de una mezcla de ADN de un organismo. Supongamos que el tejido A está completamente metilado para el sitio genómico, es decir, densidad de metilación (MD) del 100% y el tejido B está completamente sin metilar, es decir, MD del 0%. En este ejemplo, la densidad de metilación se refiere al porcentaje de restos de citosina en el contexto de dinucleótidos CpG que están metilados en la región de interés.

Si la mezcla de ADN C está compuesta de tejido A y tejido B y la densidad de metilación global de la mezcla de ADN C es del 60%, podemos deducir la contribución proporcional de los tejidos A y B a la mezcla de ADN C de acuerdo con la siguiente fórmula:

MDC = MDa x a x MDb xb ,

donde MD^a, MD^b, MD^c representan la MD de los tejidos A, el tejido B y la mezcla de ADN C, respectivamente; y a y b son las contribuciones proporcionales de los tejidos A y B a la mezcla de ADN C. En este ejemplo particular, se supone que los tejidos A y B son los dos únicos constituyentes de la mezcla de ADN. Por lo tanto, a b = 100 %. Por lo tanto, se calcula que los tejidos A y B aportan el 60 % y el 40 %, respectivamente, a la mezcla de ADN.

Las densidades de metilación en el tejido A y el tejido B se pueden obtener a partir de muestras del organismo o de muestras de otros organismos del mismo tipo (por ejemplo, otros seres humanos, potencialmente de una misma subpoblación). Si se utilizan muestras de otros organismos, puede usarse un análisis estadístico (por ejemplo, promedio, mediana, media geométrica) de las densidades de metilación de las muestras del tejido A para obtener la densidad de metilación MD^a y de manera similar para MD^b.

Puede seleccionarse el sitio genómico para que tenga una variación entre individuos mínima, por ejemplo, menos de una cantidad absoluta específica de variación o estar dentro de la porción más baja de los sitios genómicos evaluados. Por ejemplo, para la porción más baja, las realizaciones pueden seleccionar únicamente sitios genómicos que tengan el 10 % más bajo de variación entre un grupo de sitios genómicos evaluados. Los otros organismos pueden tomarse de personas sanas, así como de aquellas con una fisiología particular (por ejemplo, mujeres gestantes o personas de diferentes edades o personas de un sexo concreto), que pueden corresponder a una subpoblación particular que incluye el organismo concreto que se esté evaluando.

Los otros organismos de una subpoblación también pueden tener otras patologías (por ejemplo, pacientes con hepatitis o diabetes, etc.). Dicha subpoblación puede tener patrones de metilación específicos de tejido alterados para varios tejidos. El patrón de metilación del tejido con dicha patología puede usarse para el análisis de deconvolución además de usar el patrón de metilación del tejido normal. Este análisis de deconvolución puede ser más preciso cuando se evalúa un organismo de una subpoblación de ese tipo con esas condiciones. Por ejemplo, un hígado cirrótico o un riñón fibrótico pueden tener un patrón de metilación diferente en comparación con un hígado normal y un riñón normal, respectivamente. Por lo tanto, si se explora a un paciente con cirrosis hepática para otras enfermedades, puede ser más preciso incluir un hígado cirrótico como uno de los candidatos que aportan ADN al ADN plasmático, junto con los tejidos sanos de otros tipos de tejido.

B. Sitios genómicos múltiples

Se pueden usar más sitios genómicos (por ejemplo, 10 o más) para determinar la constitución de la mezcla de ADN cuando hay más tejidos candidatos potenciales. La precisión de la estimación de la composición proporcional de la mezcla de ADN depende de una serie de factores que incluyen el número de sitios genómicos, la especificidad de los sitios genómicos (también denominados "sitios") para los tejidos específicos y la variabilidad de los sitios entre los diferentes tejidos candidatos y a lo largo de los diferentes individuos usados para determinar los niveles específicos de tejido de referencia. La especificidad de un sitio para un tejido se refiere a la diferencia en la densidad de metilación de los sitios genómicos entre el tejido particular y los otros tipos de tejido.

Cuanto mayor sea la diferencia entre sus densidades de metilación, más específico será el sitio para el tejido particular. Por ejemplo, si un sitio está completamente metilado en el hígado (densidad de metilación = 100%) y está completamente sin metilar en todos los demás tejidos (densidad de metilación = 0%), este sitio sería altamente específico para el hígado. Sin embargo, la variabilidad de un sitio entre los diferentes tejidos puede reflejarse mediante, por ejemplo, pero sin limitación, el intervalo o la desviación típica de densidades de metilación del sitio en diferentes tipos de tejido. Un intervalo mayor o una desviación típica mayor podrían permitir una determinación más precisa y exacta de las contribuciones relativas de los diferentes órganos a la mezcla de ADN desde el punto de vista matemático. Los efectos de estos factores en la precisión de la estimación de la contribución proporcional de los tejidos candidatos a la mezcla de ADN se ilustran en las últimas secciones de la presente solicitud.

En este caso, los presentes inventores usan ecuaciones matemáticas para ilustrar la deducción de la contribución proporcional de diferentes órganos a la mezcla de ADN. La relación matemática entre las densidades de metilación de los diferentes sitios en la mezcla de ADN y las densidades de metilación de los sitios correspondientes en diferentes tejidos puede expresarse como:

M D i — Z k ( j>k x M D l k ) ,

donde MDi representa la densidad de metilación del sitio i en la mezcla de ADN; pk representa la contribución proporcional del tejido k a la mezcla de ADN; MDik representa la densidad de metilación del sitio i en el tejido k. Cuando el número de sitios es igual o superior al número de órganos, pueden determinarse los valores de pk individuales. Las densidades de metilación específicas de tejido pueden obtenerse de otros individuos y los sitios pueden seleccionarse para tener una variación mínima entre individuos, como se ha mencionado anteriormente.

Se pueden incluir criterios adicionales en el algoritmo para mejorar la precisión. Por ejemplo, la contribución agregada de todos los tejidos puede restringirse al 100 %, es decir,

2kpk = 100 %

Además, puede forzarse a que la contribución de todos los órganos sea no negativa:

p k > 0 , V k

Debido a variaciones biológicas, el patrón de metilación general observado puede no ser completamente idéntico al patrón de metilación deducido a partir de la metilación de los tejidos. En dichas circunstancias, será necesario un análisis matemático para determinar la contribución proporcional más probable de los tejidos individuales. En este sentido, la diferencia entre el patrón de metilación observado en el ADN y el patrón de metilación deducido a partir de los tejidos se indica mediante W.

W = 0 - ^ ( p k x M k )

k

donde O es el patrón de metilación observado para la mezcla de ADN y Mk es el patrón de metilación para el tejido individual k. pk es la contribución proporcional del tejido k a la mezcla de ADN. Puede determinarse el valor más probable de cada pk minimizando W, que es la diferencia entre los patrones de metilación observados y deducidos. Puede resolverse esta ecuación usando algoritmos matemáticos, por ejemplo, usando programación cuadrática, regresión lineal/no lineal, algoritmo de expectación-maximización (EM), algoritmo de máxima probabilidad, estimación de máximos a posteriori y el método de mínimos cuadrados.

C. Método de deconvolución de la metilación

Como se ha descrito anteriormente, puede analizarse una muestra biológica que incluye una mezcla de moléculas de ADN libre de células de un organismo para determinar la composición de la mezcla, específicamente, las contribuciones de diferentes tipos de tejido. Por ejemplo, puede determinarse la contribución porcentual de las moléculas de ADN libre de células del hígado. Estas mediciones de las contribuciones porcentuales en la muestra biológica pueden usarse para hacer otras mediciones de la muestra biológica, por ejemplo, identificaciones de donde se localiza un tumor, como se describe en secciones posteriores.

La FIG. 1 es un diagrama de flujo que ilustra un método 100 para analizar una mezcla de ADN de moléculas de ADN libre de células para determinar contribuciones fraccionales de varios tipos de tejidos a partir de niveles de metilación de acuerdo con las realizaciones de la presente invención. Una muestra biológica incluye una mezcla de moléculas de ADN libre de células de M tipos de tejidos. La muestra biológica puede ser uno cualquiera de diversos ejemplos, por ejemplo, como se menciona en el presente documento. El número M de tipos de tejidos es mayor de dos. En diversas realizaciones, M puede ser 3, 7, 10, 20 o más o cualquier número intermedio. Puede llevarse a cabo el método 100 usando un sistema informático.

En el bloque 110, se identifican para su análisis N sitios genómicos. Los N sitios genómicos pueden tener varios atributos, por ejemplo, como se describe con más detalle en la sección II, que describe los sitios genómicos tipo I y tipo II. A modo de ejemplo, los N sitios genómicos pueden incluir únicamente sitios de tipo I o de tipo II o una combinación de ambos. Los sitios genómicos pueden identificarse basándose en análisis de una o más muestras diferentes, por ejemplo, basándose en datos obtenidos de bases de datos de niveles de metilación medidos en varios individuos.

En algunas realizaciones, al menos 10 de los N sitios genómicos son de tipo II y cada uno tiene un coeficiente de variación de los niveles de metilación de al menos 0,15 a lo largo de los M tipos de tejido. Puede usarse un umbral más restrictivo para el coeficiente de variación, por ejemplo, 0,25. Los al menos 10 sitios genómicos también pueden tener cada uno una diferencia entre un nivel de metilación máximo y uno mínimo para los M tipos de tejidos mayor de 0,1. Puede usarse un umbral más restrictivo para el coeficiente de variación, por ejemplo, 0,2. Los N sitios genómicos también pueden incluir sitios de tipo I (por ejemplo, al menos 10).

Estas propiedades de metilación de los locus genómicos pueden medirse para una muestra o un conjunto de muestras. El conjunto de muestras puede ser para una subpoblación de organismos que incluye el presente organismo que se esté evaluando, por ejemplo, una subpoblación que tenga un rasgo particular que es compartido con el presente organismo. Estas otras muestras pueden denominarse tejidos de referencia y pueden usarse diferentes tejidos de referencia de diferentes muestras.

En el bloque 120, los N niveles de metilación específicos de tejido se obtienen en los N sitios genómicos para cada uno de los M tipos de tejido. N es mayor o igual a M, de tal forma que pueden usarse los niveles de metilación específicos de tejido en la deconvolución para determinar los porcentajes fraccionales. Los niveles de metilación específicos de tejido pueden formar una matriz de dimensiones N por M. Cada columna de la matriz A puede corresponder a un patrón de metilación para un tipo de tejido particular, donde el patrón es de niveles de metilación en los N sitios genómicos.

En diversas realizaciones, los patrones de metilación específicos del tejido se pueden recuperar de bases de datos públicas o de estudios previos. En los ejemplos en el presente documento, los datos de metilación para neutrófilos y linfocitos B se descargaron del Gene Expression Omnibus (Hodges et al. Mol Cell 2011;44:17-28). Los patrones de metilación para otros tejidos (hipocampo, hígado, pulmón, páncreas, atrio, colon (incluyendo sus diversas partes, por ejemplo, colon sigmoidal, colon transversal, colon ascendente, colon descendente), glándula suprarrenal, esófago, intestino delgado y linfocitos T CD4) se descargaron del proyecto RoadMap Epigenomics (Ziller et al. Nature 2013;500:477-81). Los datos de patrones de metilación para la capa leucocitaria, placenta, tumor y plasma proceden de informes publicados (Lun et al. Clin Chem. 2013;59:1583-94; Chan et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110:18761-8). Estos patrones de metilación específicos de tejido pueden usarse para identificar N sitios genómicos para su uso en el análisis de deconvolución.

En el bloque 130, se recibe la muestra biológica que incluye una mezcla de moléculas de ADN libre de células de M tipos de tejidos. La muestra biológica puede obtenerse del organismo del paciente de varios modos. El modo de obtener dichas muestras puede ser no invasivo o invasivo. Los ejemplos de muestras obtenidas de manera no invasiva incluyen ciertos tipos de tejido (por ejemplo, plasma, suero u orina) o heces. Por ejemplo, el plasma incluye moléculas de ADN libre de células de muchos tejidos de órganos y por lo tanto, es útil para analizar diversos órganos mediante una muestra.

En el bloque 140, se analizan las moléculas de ADN libre de células para identificar sus ubicaciones en un genoma de referencia correspondiente al organismo. Por ejemplo, pueden secuenciarse las moléculas de ADN libre de células para obtener lecturas de secuencia y pueden mapearse (alinearse) las lecturas de secuencia con el genoma de referencia. En caso de que el organismo fuese un ser humano, el genoma de referencia sería un genoma humano de referencia, potencialmente de una subpoblación particular. Como otro ejemplo, pueden analizarse las moléculas de ADN libre de células con diferentes sondas (por ejemplo, después de la PCR u otra amplificación), correspondiendo cada sonda a un sitio genómico diferente. En algunas realizaciones, el análisis de las moléculas de ADN libre de células puede llevarse a cabo recibiendo lecturas de secuencia u otros datos experimentales correspondientes a las moléculas de ADN libre de células y después analizando los datos experimentales.

Puede analizarse un número estadísticamente significativo de las moléculas de ADN libre de células para proporcionar una deconvolución precisa para determinar las contribuciones fraccionales de los M tipos de tejido. En las realizaciones, se analizan al menos 1.000 moléculas de ADN libres de células. En otras realizaciones, pueden analizarse al menos 10.000, 50.000, 100.000 o 500.000 o 1.000.000 o 5.000.000 de moléculas de ADN libre de células o más. El número total de moléculas a analizar puede depender de M y N y de la precisión deseada (exactitud).

En el bloque 150, se miden los N niveles de mutilación de la mezcla en los N sitios genómicos usando un primer grupo de moléculas de ADN libre de células que están ubicadas cada una en uno cualquiera de N sitios genómicos del genoma de referencia. Los N niveles de metilación de la mezcla se refieren a niveles de metilación en la mezcla de la muestra biológica. Como ejemplo, en caso de que una molécula de ADN libre de células de la mezcla esté ubicada en uno de los N sitios genómicos, puede incluirse un índice de metilación para esa molécula en el sitio en una densidad de metilación general para ese sitio. Los N niveles de metilación de la mezcla pueden proceder de un vector de metilación b de longitud N, donde b corresponde a los valores observados a partir de los cuales pueden determinarse las contribuciones fraccionales de los tipos de tejido.

En una realización, pueden determinarse los niveles de metilación para los sitios genómicos en la mezcla de ADN usando secuenciación con bisulfito de genoma completo. En otras realizaciones, pueden determinarse los niveles de metilación para los sitios genómicos usando análisis de micromatriz de metilación, tal como el sistema Illumina HumanMethylation450 o usando inmunoprecipitación de metilación (por ejemplo, usando un anticuerpo antimetilcitosina) o por tratamiento con una proteína de unión a metilación seguido de análisis de micromatriz o secuenciación de ADN o usando tratamiento con enzima de restricción sensible a la metilación seguido de micromatriz o secuenciación de ADN o usando secuenciación sensible a la metilación, por ejemplo, usando un método de secuenciación de una sola molécula (por ejemplo, mediante secuenciación de nanoporo (Schreiber et al. Proc Natl Acad Sci 2013; 110: 18910-18915) o mediante el análisis en tiempo real de una sola molécula de Pacific Biosciences (Flusberg et al. Nat Methods 2010; 7: 461-465)). Pueden medirse los niveles de metilación específicos de tejido del mismo modo. Como otro ejemplo, puede usarse secuenciación de bisulfito dirigida, PCR específica de metilación, secuenciación sensible a la metilación no basada en bisulfito (por ejemplo, mediante plataformas de secuenciación de una sola molécula (Powers et al. Efficient and accurate whole genome assembly and methylome profiling of E. coli. BMC Genomics. 2013;14:675) para el análisis del nivel de metilación del ADN plasmático para el análisis de deconvolución de metilación de ADN plasmático. Por consiguiente, pueden obtenerse resultados de secuenciación sensibles a la metilación de diversos modos.

En el bloque 160, se determinan M valores de un vector de composición. Cada valor M corresponde a una contribución fraccional de un tipo de tejido particular de los M tipos de tejido a la mezcla de ADN. Los M valores del vector de composición pueden resolverse para proporcionar los N niveles de metilación de la mezcla (por ejemplo, vector de metilación b) dados los NxM niveles de metilación específicos de tejido. Las M contribuciones fraccionales pueden corresponder a un vector x que se determina resolviendo Ax=b. Cuando N es mayor que M, la solución puede implicar una minimización de errores, por ejemplo, usando mínimos cuadrados.

En el bloque 170, se usa el vector de composición para determinar una cantidad de cada uno de los M tipos de tejido en la mezcla. Los M valores del vector de composición pueden tomarse directamente como las contribuciones fraccionales de los M tipos de tejido. En algunas implementaciones, los M valores pueden convertirse en porcentajes. Pueden usarse términos de error para desplazar los M valores a valores mayores o menores. Puede considerarse cada uno de los valores del vector de composición como un componente y un primer componente puede corresponder a un primer tipo de tejido.

D. Aplicaciones

Como se ha mencionado anteriormente, pueden usarse las contribuciones fraccionales en mediciones adicionales de la muestra biológica y otras determinaciones, por ejemplo, de si una región cromosómica particular tiene o no un desequilibrio de secuencia o de si un tipo de tejido particular está o no enfermo.

La FIG. 2 muestra un diagrama esquemático que muestra varias aplicaciones potenciales de la deconvolución de la metilación de ADN (por ejemplo, usando plasma) de acuerdo con las realizaciones de la presente invención. En la FIG. 2, se somete una muestra biológica 205 a secuenciación de bisulfito de todo el genoma en 210. En 230, el mapeo en tejidos de ADN plasmático usa perfiles de metilación específicos de tejido 220 para determinar los porcentajes de contribución de tejido. Se muestran ejemplos de perfiles de metilación específicos de tejido como hígado, células sanguíneas, tejidos adiposos, pulmones, intestino delgado y colon. Pueden determinarse los porcentajes de contribución como se ha descrito anteriormente y en otras partes, por ejemplo, resolviendo Ax=b.

Puede identificarse una lista de marcadores de metilación (sitios genómicos) que son útiles para determinar las contribuciones de diferentes órganos al ADN plasmático comparando los perfiles de metilación (FIG. 2) de diferentes tejidos, incluyendo el hígado, pulmones, esófago, corazón, páncreas, colon sigmoideo, intestino delgado, tejidos adiposos, glándulas suprarrenales, colon, linfocitos T, linfocitos B, neutrófilos, cerebro y placenta. En diversos ejemplos, los datos de secuenciación con bisulfito de todo el genoma para el hígado, pulmones, esófago, corazón, páncreas, colon, intestino delgado, tejidos adiposos, glándulas suprarrenales, cerebro y linfocitos T se recuperaron del Human Epigenome Atlas del Baylor College of Medicine (www.genboree.org/epigenomeatlas/index.rhtml). Los datos de secuenciación con bisulfito para linfocitos B y neutrófilos procedían de la publicación de Hodges et al. (Hodges et al; Directional DNA methylation changes and complex intermediate states accompany lineage specificity in the adult hematopoietic compartment. Mol Cell 2011; 44: 17-28). Los datos de secuenciación con bisulfito para la placenta fueron de Lun et al. (Lun et al. Clin Chem 2013; 59:1583-94). En otras realizaciones, los marcadores pueden identificarse a partir de conjuntos de datos generados utilizando análisis de micromatriz, por ejemplo, usando el Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip Array.

II. SELECCIÓN DE MARCADORES DE METILACIÓN

Anteriormente, se ha descrito el principio del uso de análisis de la metilación para determinar la composición de una mezcla de ADN. En particular, puede determinarse el porcentaje de contribución de diferentes órganos (o tejidos) al ADN plasmático usando análisis de la metilación. En esta sección, se describe adicionalmente el método para la selección de marcadores de la metilación y las aplicaciones clínicas de esta tecnología.

Los resultados de determinar la composición de la mezcla de ADN mediante análisis de la metilación se ven afectados por los marcadores de metilación usados para la deconvolución de la composición de la mezcla de ADN. Por lo tanto, la selección de marcadores de metilación genómicos adecuados puede ser importante para la determinación precisa de la constitución de la mezcla de ADN.

A. Criterios para un marcador de metilación para su deconvolución

Para la selección de marcadores, pueden tomarse en consideración los tres atributos a continuación, (i) Es deseable que un marcador de metilación tenga una baja variabilidad en el nivel de metilación medido en el mismo tipo de tejido entre diferentes individuos. Debido a que la determinación de la composición de la mezcla de ADN depende del reconocimiento de patrones de metilación específicos de tejido, podría ser útil la baja variabilidad en el nivel de metilación en el mismo tipo de tejido entre diferentes individuos para la identificación precisa de los patrones específicos de tejido en la mezcla de ADN. En las realizaciones donde se obtienen los niveles de metilación específicos de tejido a partir de muestras de otros organismos (por ejemplo, de una base de datos), la baja variabilidad significa que los niveles de metilación de las otras muestras son similares a los niveles de metilación específicos de tejido para el presente organismo que se esté evaluando.

(ii) Es deseable que un marcador de metilación tenga una alta variabilidad en los niveles de metilación entre los diferentes tejidos. Para un marcador en particular, una mayor diferencia en los niveles de metilación entre diferentes tejidos puede proporcionar una determinación más precisa de la contribución de diferentes tejidos a la mezcla de ADN. En particular, puede obtenerse una mejora en la precisión usando un conjunto de marcadores que tengan el atributo (ii) y otro conjunto de marcadores que tenga el atributo (iii).

(iii) Es deseable que un marcador de metilación tenga un nivel de metilación particularmente diferente en un tejido particular cuando se compara con aquellos de la mayoría o todos los demás tejidos. A diferencia del punto (ii) anterior, un marcador puede tener baja variabilidad en el nivel de metilación de la mayoría de tejidos pero su nivel de metilación en un tejido particular es diferente al de la mayoría de los demás tejidos. Este marcador podría ser particularmente útil para la determinación de la contribución del tejido que tiene un nivel de metilación diferente al de otros tejidos.

B. Ejemplo

En los siguientes ejemplos hipotéticos en la tabla 1 se ilustra un principio de selección de marcador.

T l 1. D n i m il i n n if r n i r m r r m il i n hi i s

En este ejemplo hipotético, el marcador 2 tiene una variabilidad más baja en la densidad de metilación en el hígado de tres individuos en comparación con el marcador 1. Por lo tanto, el marcador 2 es superior al marcador 1 como una firma para determinar la contribución del hígado en una mezcla de ADN.

En comparación con el marcador 4, el marcador 3 tiene una mayor variabilidad en la densidad de metilación entre los diferentes tipos de tejido. El mismo nivel de cambio en la contribución estimada de los diferentes tejidos proporcionaría un cambio mayor en la densidad de metilación deducida de la mezcla de ADN para el marcador 3 que para el marcador 4 de acuerdo con la relación matemática analizada anteriormente. Por lo tanto, la estimación de la contribución de cada tejido puede ser más precisa con el marcador 3.

El marcador 5 tiene una baja variabilidad en la densidad de metilación entre el hígado, corazón y pulmón. Sus densidades de metilación varían del 10 % al 14 %. Sin embargo, La densidad de metilación del colon es del 80 %. Este marcador sería particularmente útil para determinar la contribución del colon en la mezcla de ADN. De manera similar, el corazón está hipometilado en comparación con los otros tejidos para el marcador 6. Por lo tanto, puede determinarse con precisión la contribución del corazón mediante el marcador 6. Por lo tanto, la combinación de marcadores 5 y 6 podría ser capaz de determinar con precisión las contribuciones del colon y el corazón. Por tanto, la adición de los marcadores 2 y 3 podría ser suficiente para reducir la contribución de cada uno de los cuatro órganos, incluyendo el hígado, corazón, pulmón y colon.

C. Diferentes tipos de marcadores

Puede no ser necesario que un marcador tenga necesariamente los tres atributos anteriores. Un marcador de metilación de tipo I podría tener normalmente el atributo (iii) anterior. Varios de dichos marcadores también tienen el atributo (i). Por otro lado, un marcador de metilación de tipo II podría tener normalmente el atributo (ii) anterior. Varios de dichos marcadores también tienen el atributo (i). También es posible que un marcador particular tenga los tres atributos.

En algunas realizaciones, los marcadores se dividen ampliamente en dos tipos (tipo I y tipo II). Los marcadores de tipo I tienen especificidad de tejido. El nivel de metilación de estos marcadores para un grupo particular de uno o más tejidos es diferente de la mayoría de los demás tejidos. Por ejemplo, un tejido particular puede tener un nivel de metilación significativo en comparación con el nivel de metilación de todos los demás tejidos. En otro ejemplo, dos tejidos (por ejemplo, el tejido A y el tejido B) tienen niveles de metilación similares, pero los niveles de metilación de los tejidos A y B son significativamente diferentes a los de los demás tejidos.

Los marcadores de tipo II tienen una alta variabilidad de metilación entre tejidos. Los niveles de metilación de estos marcadores son altamente variables entre diferentes tejidos. Un solo marcador en esta categoría puede no ser suficiente para determinar la contribución de un tejido particular a la mezcla de ADN. Sin embargo, puede usarse una combinación de marcadores de tipo II o en combinación con uno o más marcadores de tipo I para deducir la contribución de los tejidos individuales. Según la definición anterior, un marcador particular puede ser únicamente un marcador de tipo I, únicamente un marcador de tipo II o ser simultáneamente un marcador tanto de tipo I como de tipo II.

1. Marcadores de tipo I

En una realización, puede identificarse un marcador de tipo I comparando la densidad de metilación del marcador con la media y la desviación típica (DT) de las densidades de metilación de este marcador particular para todos los tejidos candidatos. En una implementación, se define un marcador en caso de que su densidad de metilación en un tejido sea diferente a la media de todos los tejidos por 3 desviaciones típicas (DT).

Se estudiaron los perfiles de metilación de 14 tejidos obtenidos de las fuentes mencionadas anteriormente para seleccionar marcadores. En un análisis, se identificó un total de 1.013 marcadores de tipo I (marcadores marcados como tipo I en la tabla S1 del apéndice A) usando los criterios anteriores. En otras realizaciones, pueden usarse otros cortes entre los tejidos particulares y las densidades de metilación medias, por ejemplo, 1,5 DT, 2 DT, 2,5 DT, 3,5 DT y 4 DT. En otra realización más, puede identificarse un marcador de tipo I mediante la comparación de la densidad de metilación del tejido particular con la mediana de la densidad de metilación de todos los tejidos.

En otras realizaciones, pueden obtenerse los marcadores de tipo I cuando más de un tejido (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco tejidos) muestran densidades de metilación significativamente diferentes a la densidad de metilación media de todos los tejidos candidatos. En una implementación, puede calcularse una densidad de metilación de corte a partir de la media y la DT de las densidades de metilación de todos los tejidos candidatos. A modo ilustrativo, el corte (nivel umbral) puede definirse como 3 DT por encima o por debajo de las densidades de metilación medias. Por lo tanto, puede seleccionarse un marcador cuando las densidades de metilación de un número específico de tejidos son más de 3 DT mayores que la densidad media de metilación o más de 3 DT inferiores que la densidad media de metilación de los tejidos.

2. Marcadores de tipo II

Para la identificación de marcadores de tipo II, se calcularon la media y la DT de las densidades de metilación entre los 14 tejidos candidatos y la relación de d T a la media se indicó como el coeficiente de variación (CV). En este ejemplo ilustrativo, se usó un corte de >0,25 para el CV para identificar los marcadores de tipo II cualificados, así como la diferencia entre las densidades de metilación máximas y mínimas para el grupo de tejidos que supera 0,2. Usando estos criterios, se identificaron 5820 marcadores de tipo II (marcadores marcados de tipo II en la tabla S1 del apéndice A). Otros ejemplos de cortes para el CV incluyen 0,15, 0,2, 0,3 y 0,4. Otros ejemplos de cortes para la diferencia entre las densidades de metilación máximas y mínimas incluyen 0,1, 0,15, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45 y 0,5.

En otras realizaciones, pueden usarse los valores medios entre múltiples muestras del mismo tipo de tejido para medir una variación de los niveles de metilación entre diferentes tejidos. Por ejemplo, pueden promediarse 10 niveles de metilación de un mismo sitio genómico de 10 muestras para obtener un solo nivel de metilación para el sitio genómico. Puede llevarse a cabo un proceso similar para determinar los niveles medios de metilación para otros tipos de tejido para el sitio genómico. Después, pueden usarse los valores medios entre tipos de tejido para determinar si el sitio genómico tiene una variación significativa entre tipos de tejido. Pueden usarse otros valores estadísticos aparte del promedio, por ejemplo, una mediana o una media geométrica. Dichos valores estadísticos pueden usarse para identificar marcadores de tipo I y/o tipo II.

Las diferentes muestras de un mismo tipo de tejido (por ejemplo, de diferentes individuos) pueden usarse para determinar una variación de los niveles de metilación en las diferentes muestras. Por lo tanto, si hay múltiples muestras del mismo tipo de tejido, las realizaciones pueden medir adicionalmente la variación de un marcador particular entre dichas muestras del mismo tipo de tejido. Un marcador con una variación baja entre las muestras sería un marcador más fiable que uno con una variación alta.

Las realizaciones también se refieren a los marcadores en la tabla S1 y al uso de cualquier combinación de los marcadores, por ejemplo, usando 10 marcadores cualesquiera o más de tipo I o de tipo II en la tabla S1, así como cualquier combinación de 10 o más de cada tabla. Por ejemplo, las realizaciones se refieren al uso de 50 (o 100, 250, 500 o 1.000) marcadores de tipo I y 50 (o 100, 250, 500, 1.000, 2.000 o 5.000) marcadores de tipo II de la tabla S1.

D. Diferentes categorías de marcadores

Una "categoría" para un locus (marcador de metilación) genómico corresponde a una variación específica en los niveles de metilación para un locus en diferentes individuos para un mismo tipo de tejido. Las diferentes categorías pueden tener diferentes intervalos de variación entre un tipo de tejido particular entre individuos. Una primera categoría de marcadores de metilación podría tener una diferencia del 10 % en los niveles de metilación o menor entre los individuos evaluados. Una segunda categoría de marcadores de metilación podría tener una diferencia de más del 10 % en los niveles de metilación entre los individuos evaluados. El uso de marcadores de metilación con bajas variaciones entre individuos (marcadores de primera categoría) mejoraría potencialmente la precisión a la hora de determinar la contribución del órgano particular en la mezcla de ADN.

E. Identificación de potenciales marcadores de metilación

En algunas realizaciones, se identificaron marcadores de metilación potenciales del siguiente modo. Posteriormente, pueden someterse dichos marcadores de metilación a los criterios anteriores para identificar marcadores de tipo I y de tipo II. En otras realizaciones, no se necesita una identificación de tipo I o de tipo II. Asimismo, otras realizaciones pueden usar otras técnicas para identificar marcadores de metilación potenciales.

En algunas realizaciones, todas las islas de CpG (CGI) y orillas de CpG en los autosomas se tomaron en consideración para los marcadores de metilación potenciales. Las CGI y las orillas de CpG en los cromosomas sexuales no se utilizaron para minimizar la variación en los niveles de metilación relacionados con la diferencia de la dosis del cromosoma asociado con el sexo en los datos de origen. Los CGI se descargaron de la base de datos de la Universidad de California, Santa Cruz (UCSC) (genome.ucsc.edu/, 27.048 islas de CpG para el genoma humano) (Kent et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 2002;12(6):996-1006) y las orillas de CpG se definieron como ventanas flanqueantes de 2 kb de las islas de CpG (Irizarry et al. The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores. Nat Genet 2009; 41(2):178 - 186). Posteriormente, se subdividieron las islas y orillas de CpG en unidades de 500 pb no solapantes y cada unidad se consideró como un potencial marcador de metilación.

Las densidades de metilación (es decir, el porcentaje de CpG metiladas dentro de una unidad de 500 pb) de todos los locus potenciales se compararon entre los 14 tipos de tejidos. Como se informó anteriormente (Lun et al. Clin Chem.

2013; 59: 1583-94), se observó que la placenta está globalmente hipometilada en comparación con los demás tejidos. Por lo tanto, no se incluyó el perfil de metilación en la fase de identificación de marcadores. Usando los perfiles de metilación de los 13 tipos de tejidos restantes, se identificaron los dos tipos de marcadores de metilación. Por ejemplo, los marcadores de tipo I pueden referirse a cualquier sitio genómico con densidades de metilación que estén 3 DT por debajo o por encima en un tejido cuando se compara con el nivel medio de los 13 tipos de tejidos. Los marcadores de Tipo II pueden considerarse altamente variables cuando (A) la densidad de metilación del tejido más hipermetilado es al menos un 20 % más alta que la del tejido más hipometilado; y (B) la DT de las densidades de metilación en los 13 tipos de tejido cuando se divide entre la densidad de metilación media (es decir, el coeficiente de variación) del grupo es al menos 0,25. Finalmente, a fin de reducir el número de marcadores potencialmente redundantes, puede seleccionarse solo un marcador en un bloque contiguo de dos orillas de CpG que flanquean a una isla de CpG.

F. Selección basada en la aplicación

El conjunto de marcadores de metilación elegidos para aplicaciones particulares puede variar dependiendo de los parámetros de las aplicaciones deseadas. Por ejemplo, para determinar el origen de una aberración genómica (por ejemplo, aberración del número de copias (CNA)), sería ventajoso un gran número de marcadores diseminados por el genoma. Como otro ejemplo, para aplicaciones en las que la liberación de ADN de un tejido particular en plasma es de especial importancia, se puede seleccionar un número preferentemente mayor de marcadores de metilación que están metilados de manera diferencial en este tipo de tejido (por ejemplo, marcador de tipo I) cuando se compara con los otros en el conjunto de marcador.

El número y la elección de los marcadores de metilación en el análisis de deconvolución pueden variarse de acuerdo con el uso previsto. Si la contribución fraccional del hígado es de particular interés, por ejemplo, en un paciente que ha recibido un trasplante de hígado, pueden usarse más marcadores específicos de hígado de tipo I en el análisis de deconvolución para aumentar la precisión de la cuantificación de la contribución del hígado trasplantado al ADN plasmático.

MI. EXACTITUD DE LA COMPOSICIÓN

Como se ha descrito anteriormente, las realizaciones pueden identificar las contribuciones de tejido del ADN plasmático. En diversos ejemplos, se llevó a cabo la secuenciación con bisulfito de todo el genoma del a Dn plasmático y se analizó en referencia a los perfiles de metilación de diferentes tejidos. Usando como ejemplo programación cuadrática, se deconvolucionaron los datos de secuenciación de ADN plasmático en contribuciones proporcionales de diferentes tejidos. Las realizaciones se evaluaron para mujeres gestantes, pacientes con carcinoma hepatocelular, de pulmón y colorrectal y sujetos después del trasplante de médula ósea e hígado.

En la mayoría de sujetos, aunque las células sanguíneas eran los principales aportadores al conjunto de ADN circulante, las contribuciones placentarias en mujeres gestantes se correlacionaron con las contribuciones proporcionales reveladas por marcadores genéticos específicos del feto. Las contribuciones derivadas del injerto al plasma en los receptores de trasplante se correlacionaron con las determinadas utilizando marcadores genéticos específicos del donante. Los pacientes con cáncer hepatocelular, de pulmón o colorrectal mostraron contribuciones de ADN plasmático elevadas del órgano con el tumor. Las contribuciones del hígado en pacientes con carcinoma hepatocelular también se correlacionaron con las mediciones efectuadas usando aberraciones en el número de copias asociadas con el tumor.

En pacientes con cáncer y en mujeres gestantes que muestran aberraciones en el número de copias en el plasma, la deconvolución de la metilación destacó el tipo de tejido responsable de las aberraciones. En una mujer gestante diagnosticada de linfoma folicular durante el embarazo, la deconvolución de la metilación indicó una contribución muy elevada de los linfocitos B al grupo de ADN plasmático y localizó a los linfocitos B (en lugar de la placenta) como el origen de las aberraciones en el número de copias observadas en el plasma. Por consiguiente, las realizaciones pueden servir como una potente herramienta para evaluar una gran variedad de afecciones fisiológicas y patológicas basándose en la identificación de contribuciones proporcionales alteradas de diferentes tejidos en el plasma.

A. Contribución de diferentes tipos de células sanguíneas

Como ejemplo de la deconvolución de la metilación, se determinó la contribución de diferentes tejidos y tipos de células al ADN circulante. Se recogieron dos muestras de sangre de dos pacientes que padecían lupus eritematoso sistémico (LES). Tras la recogida, las muestras de sangre venosa se centrifugaron a 1.500 g durante 10 minutos. Tras la centrifugación, se separaron las células sanguíneas y el plasma. Después, se extrajo el ADN de las células sanguíneas. El ADN se convirtió con bisulfito y se secuenció usando un carril de una celda de flujo en un secuenciador HiSeq2000. Se analizaron dos muestras de células sanguíneas usando el análisis de patrón de metilación específico de tipo celular. Se incluyeron los patrones de metilación de neutrófilos, linfocitos, esófago, colon, páncreas, hígado, pulmón, corazón, glándulas suprarrenales e hipocampo como candidatos potenciales del ADN de células sanguíneas. Se seleccionaron para el análisis 609 marcadores de metilación. Las muestras de sangre completa de los dos sujetos también se remitieron para recuento celular para determinar la composición fraccional de los neutrófilos y linfocitos de las células sanguíneas.

T l 2. n ri i n l i n ín m i n n li i l r n nv l i n r n l l r

(continuación)

Para el análisis del patrón de mutilación, se determinó que los neutrófilos y linfocitos eran los principales componentes constituyentes del ADN de células sanguíneas. La proporción relativa de la contribución de neutrófilos y linfocitos se asemeja a su abundancia relativa en las muestras de sangre de acuerdo con el análisis de recuento celular.

B. Mujeres gestantes

Las aportaciones de diferentes tejidos, incluyendo el hígado, pulmón, páncreas, colon, hipocampo, intestino delgado, células sanguíneas, corazón, glándula suprarrenal, esófago y placenta, se analizaron usando análisis de metilación del ADN plasmático de mujeres gestantes. Ya que el genotipo placentario es en general idéntico al genotipo del feto pero diferente del genotipo de la mujer gestante, puede determinarse con precisión la contribución precisa de la placenta al plasma materno contando el número de alelos específicos fetales en la muestra.

1. Composición y correlación con el porcentaje de ADN fetal

Se llevó a cabo secuenciación con bisulfito de todo el genoma para 15 mujeres gestantes, cinco por cada uno de los trimestres primero, segundo y tercero. Se llevó a cabo la deconvolución de la metilación y se dedujeron las contribuciones porcentuales de diferentes tejidos. Se determinaron las contribuciones de diferentes órganos basándose en los niveles de metilación (tales como densidades de metilación) de todos los marcadores de tipo I y de tipo II en la tabla S1 usando análisis de programación cuadrática.

La FIG. 3A muestra una gráfica 300 de las contribuciones porcentuales de diferentes órganos al ADN plasmático para 15 mujeres gestantes de acuerdo con las realizaciones de la presente invención. Cada barra corresponde a los resultados de una muestra. Los diferentes colores representan las contribuciones de diferentes órganos al plasma. Estos resultados muestran que los glóbulos blancos (es decir, los neutrófilos y los linfocitos) son los contribuyentes más importantes al conjunto de ADN plasmático. Esta observación es consistente con las obtenidas previamente después del trasplante de médula ósea (Lui YY et al. Clin Chem 2002; 48: 421-7).

La FIG. 4 muestra una tabla 400 de contribuciones porcentuales determinadas a partir de un análisis de mapeo en tejidos de ADN plasmático entre mujeres gestantes de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Estos resultados también muestran que la placenta es otro contribuyente clave del ADN plasmático en mujeres gestantes, con concentraciones fraccionarias del 9,9 % al 38,4 %.

T ambién se midieron las contribuciones placentarias usando alelos de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) fetales de herencia paterna que las mujeres gestantes no poseían. Para analizar los alelos de SNP fetales específicos, se determinaron los genotipos de los fetos analizando muestras de vello coriónico o de la placenta. Los genotipos de las mujeres gestantes se determinaron mediante el análisis de las células sanguíneas. Los resultados basados en SNP muestran la validación independiente de los resultados de la deconvolución de la metilación.

La FIG. 3B muestra una gráfica 350 de una correlación entre las fracciones de ADN plasmático aportadas por la placenta deducidas mediante la deconvolución de la metilación del ADN plasmático y las fracciones de ADN fetal deducidas utilizando alelos SNP específicos del feto de acuerdo con las realizaciones de la presente invención. La gráfica 350 muestra que las contribuciones placentarias determinadas por la deconvolución de la metilación tienen una fuerte correlación con las fracciones de ADN fetal medidas utilizando SNP (r = 0,99, p <0,001, correlación de Pearson). Por consiguiente, se observó una buena correlación positiva entre los valores de los dos parámetros, lo que sugiere que la deconvolución de la metilación del ADN plasmático determinó con precisión la contribución de la placenta a las muestras de plasma maternas.

La FIG. 5 muestra diagramas de las contribuciones porcentuales distintos de la placenta mediante mapeo en tejidos de ADN plasmático y fracciones de ADN fetal basándose en alelos de SNP específicos fetales de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El eje X representa las fracciones de ADN fetal estimadas mediante el análisis basado en SNP y el eje Y representa la contribución porcentual deducida por el análisis de mapeo del ADN del tejido plasmático. Las contribuciones al ADN plasmático de los neutrófilos mostraron una correlación inversa. Esto se debe probablemente al hecho de que los neutrófilos fueron un importante contribuyente al conjunto de ADN plasmático y, por lo tanto, a medida que aumentó la contribución placentaria, se reduciría necesariamente la contribución relativa de los neutrófilos. Los resultados de deconvolución de la metilación de los demás tejidos no muestran correlación con la fracción de ADN fetal.

La FIG. 6 muestra una tabla 600 de contribuciones porcentuales a partir del análisis de mapeo en tejidos de ADN plasmático entre los sujetos de control sanos no gestantes de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Cuando se aplicó el proceso a plasma de controles sanos no gestantes, la contribución placentaria estaba ausente en la mayoría de las muestras (mediana: 0 %; intervalo intercuartílico: 0 % al 0,3 %).

2. Comparación de marcadores seleccionados frente a marcadores aleatorios

Se evaluó la precisión de las contribuciones porcentuales con marcadores seleccionados en relación con marcadores aleatorios. Se realizaron diferentes cálculos de composición para diferentes conjuntos de marcadores. Se eligió un conjunto basándose en los criterios mencionados anteriormente y el otro es un conjunto aleatorio. Los resultados demuestran que es importante elegir con un criterio sensato el uso de marcadores de metilación (locus genómicos), para obtener resultados precisos.

Se reclutaron once mujeres gestantes y cuatro sujetos sanos no gestantes para este análisis. Su ADN plasmático se convirtió con bisulfito y se secuenció utilizando el secuenciador Illumina HiSeq2000. Cada muestra de plasma se secuenció con un carril de una celda de flujo de secuenciación. Después, se analizaron las lecturas secuenciadas usando un programa bioinformático, Methy-Pipe (Jiang P. PLoS One 2014; 9: e100360). Este programa puede alinear las lecturas de la secuencia convertida con bisulfito con el genoma de referencia y determinar el estado de metilación de cada sitio de CpG en cada fragmento secuenciado. Por lo tanto, pueden medirse los niveles de metilación de la mezcla usando lecturas de secuencia que se alinean cada una con al menos uno de los sitios genómicos del genoma de referencia.

El primer conjunto de marcadores tiene una alta especificidad para identificar los diferentes tejidos en el ADN plasmático. Para cada tipo de tejido, se seleccionaron marcadores que tienen la mayor diferencia en la densidad de metilación en comparación con los otros tejidos. Los marcadores se determinaron a partir de regiones genómicas que contienen al menos un dinucleótido de CpG. En este ejemplo, se usaron las islas de CpG (CGI) como marcadores potenciales, que tienen una alta frecuencia de sitios de CpG en un tramo de ADN particular. Los CGI en este ejemplo particular se descargaron de la base de datos de la Universidad de California, Santa Cruz (UCSC) (genome.ucsc.edu). En total, se obtuvieron 27.048 islas de CpG del genoma humano. La mediana del tamaño de una isla de CpG es de 565 pb (intervalo: 200 pb a 45 kb). El 90 % de las islas tienen menos de 1,5 kb.

Para cada marcador de metilación, se determinó la diferencia en la densidad de metilación entre el tejido de interés y los otros tejidos. Después, se expresa la diferencia como el número de desviaciones típicas (DT) entre los demás tejidos. Para el tejido de interés, todos los marcadores se clasificaron de acuerdo con esta diferencia en la densidad de metilación. Se seleccionaron los 20 marcadores con la mayor diferencia por encima (10 marcadores) y por debajo (10 marcadores) de las densidades de metilación medias de los otros tejidos. Otros ejemplos del número de marcadores incluyen 5, 15, 20, 30, 40, 50, 100 y 200.

Además, también se seleccionaron marcadores con una alta variabilidad en todos los diferentes tejidos. En este ejemplo, se seleccionaron marcadores con una diferencia > 50 % entre los tejidos con las densidades de metilación más altas y más bajas. Otros ejemplos de valores para la diferencia incluyen un 20 %, 30 %, 40 %, 60 %, 70 % y 80 %. Además, también se calculó la variabilidad de las densidades de metilación entre diferentes tejidos basándose en la media y la DT. En este ejemplo, también se seleccionó un marcador si el valor de DT es más de dos veces la media. Otros ejemplos de valores de corte pueden incluir desviaciones típicas de 1, 1,5, 2,5 y 3. Basándose en estos criterios de selección, se seleccionaron 344 marcadores de metilación para el primer conjunto.

Para el segundo conjunto, se seleccionaron aleatoriamente 341 marcadores de las 27.048 CGI descritas anteriormente. En primer lugar, se numeraron todas las CGI de 1 a 27.048. Posteriormente, se generó un número aleatorio (de 1 a 27.048) por ordenador para la selección de marcadores. Después, se repitió este proceso hasta que se seleccionó un total de 341 marcadores. En caso de haberse usado un número aleatorio generado, se podría generar otro. Se espera que este conjunto de marcadores tenga una especificidad mucho menor en la identificación de los patrones de metilación específicos del tejido. Por lo tanto, se espera que se reduzca la precisión para determinar la composición del ADN plasmático.

La FIG. 7 muestra una tabla 700 de las contribuciones estimadas de diferentes órganos al ADN plasmático para 11 mujeres gestantes y 4 sujetos sanos no gestantes utilizando el primer conjunto de marcadores (con alta especificidad de órgano) de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Las fracciones de ADN fetal se determinaron contando alelos específicos fetales y se muestran en la fila inferior. En cada uno de los cuatro sujetos de control no gestantes, se determinó que la contribución de la placenta al plasma era próxima al 0 %. Esto indica la especificidad de este enfoque.

La FIG. 8 muestra una tabla 800 de las contribuciones estimadas de diferentes órganos al ADN plasmático para 11 mujeres gestantes y 4 sujetos sanos no gestantes que utilizan el segundo conjunto de marcadores (con baja especificidad de órganos) de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Las fracciones de ADN fetal determinadas contando alelos específicos fetales se muestran en la fila inferior. Usando estos marcadores menos específicos, se observó un porcentaje relativamente no concordante de la contribución de la placenta y se observaron contribuciones considerables de la placenta en los cuatro sujetos de control no gestantes. Esto indica que la especificidad tisular de los marcadores es importante en este enfoque.

La FIG. 9A es una gráfica 900 que muestra la correlación entre la fracción de ADN fetal estimada (contribución de la placenta) y la fracción de ADN fetal determinada al contar los alelos específicos fetales en las muestras de plasma materno. Los resultados de las dos técnicas tienen una buena correlación al utilizar el primer conjunto de marcadores de metilación. Sin embargo, utilizando el segundo conjunto de marcadores de metilación, la estimación mediante el uso del análisis de metilación mostró una desviación significativa de los valores verdaderos determinados mediante el recuento de alelos específicos fetales.

La FIG. 9B es una gráfica 950 que muestra la diferencia absoluta entre la estimación a partir de marcadores de metilación y la fracción de ADN fetal determinada mediante recuento de alelos específicos fetales. La mediana de error de la estimación usando análisis de metilación fue del 4 % y el 8 % usando el primer conjunto de marcadores y el segundo conjunto de marcadores, respectivamente.

C. Pacientes con cáncer

Las realizaciones también pueden usarse para determinar la cantidad de ADN derivado del cáncer en el plasma de los pacientes con cáncer. En este ejemplo, se recogieron muestras de sangre venosa de 10 pacientes que padecen carcinoma hepatocelular (HCC). La contribución porcentual de los diferentes órganos, incluido el hígado, pulmón, colon, intestino delgado, páncreas, esófago, glándulas suprarrenales, corazón, el cerebro y las células sanguíneas se determinaron mediante el análisis del patrón de metilación específico del tejido como se ha descrito anteriormente. Además, los tejidos tumorales también se analizaron utilizando la secuenciación con bisulfito para identificar los patrones de metilación específicos del tumor. Los resultados de todos los diferentes tejidos se promediaron para determinar un patrón de tejido tumoral representativo. Usando estos marcadores de metilación específicos del tumor, también se determinó la contribución del tumor al ADN plasmático.

Se utilizó un total de 828 marcadores específicos de órganos para este análisis. Como controles, también se incluyeron en el análisis cuatro sujetos de control sanos sin cáncer. Para cada caso, la contribución real de los tejidos tumorales al ADN plasmático en los pacientes con cáncer se determinó mediante el nivel total de metilación del plasma. Se ha demostrado que los tejidos tumorales están generalmente hipometilados en comparación con los tejidos no tumorales (Feinberg et al. Nature.1983;301:89-92 y Chan et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110:18761-8). El nivel de metilación en todo el genoma de los tejidos no malignos fue de aproximadamente el 70 %, mientras que el de los tejidos tumorales fue de aproximadamente el 45 %. Por lo tanto, Puede estimarse la contribución tumoral al ADN plasmático usando la siguiente fórmula:

f x 45 % ( 1 - f ) x 75 % = MDp

donde MDp es el nivel de metilación en todo el genoma medido para la muestra de plasma y f es la concentración fraccional del ADN procedente del tumor en el plasma. Se ha demostrado que este método para estimar la fracción de ADN procedente de un tumor se correlaciona bien con los métodos basados en la detección de aberraciones cromosómicas (Chan et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110:18761-8).

La FIG. 10 muestra una tabla 1000 de contribuciones de diferentes tejidos al ADN plasmático de pacientes con cáncer y sanos basándose en el patón de metilación específico de órgano de acuerdo con realizaciones de la presente invención. En cada uno de los cuatro sujetos de control sanos sin cáncer, la contribución de los tejidos tumorales se determinó como el 0 %. Esto indica que el análisis del patrón de metilación es específico.

La FIG. 11A es una gráfica 1100 que muestra los valores de la fracción de ADN tumoral determinada mediante el análisis del patrón de metilación específico de órgano y se determinó mediante el nivel de metilación por todo el genoma de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La gráfica 1100 muestra que las fracciones de ADN tumoral determinadas por el análisis del patrón de metilación específico del órgano y las fracciones de ADN tumoral determinadas por el análisis del nivel de metilación en todo el genoma se correlacionan bien en los 10 pacientes con HCC.

También medimos las concentraciones fraccionales de ADN tumoral de HCC en el plasma mediante el estudio de las regiones genómicas con pérdida de heterocigosidad, que es una técnica que anteriormente hemos denominado pérdida alélica agregada de todo el genoma (GAAL) (Chan KCA, et al. (2013) Clin Chem 59(1):211-224).

La FIG. 11B es una gráfica 1150 que muestra una correlación entre las fracciones de ADN plasmático aportadas por el hígado basándose en el análisis de mapeo tisular de ADN plasmático y las fracciones de ADN plasmático procedentes de tumores determinadas mediante el análisis GAAL. La gráfica 1150 muestra que existe una buena correlación entre las contribuciones del ADN derivado del hígado al plasma deducidas por la deconvolución de la metilación y la concentración de ADN tumoral medida por GAAL (r = 0,63, p = 0,015, correlación de Pearson).

En otra realización, el análisis de la pérdida alélica agregada en todo el genoma (GAAL) se puede realizar de la siguiente manera. Las muestras de tumores de los casos de HCC pueden analizarse utilizando el sistema Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0. Las regiones que muestran pérdida de heterocigosidad (LOH) pueden identificarse como se describió anteriormente (Chan et al. Clin Chem. 2013; 59: 211-24). Las concentraciones fraccionarias de ADN procedente de tumor en plasma se pueden determinar analizando, de un modo por todo el genoma, los recuentos alélicos para los SNP que muestran LOH en los datos de secuenciación de plasma utilizando la siguiente ecuación:

~ ^Nno-el ^Ne{

^{~ N} _{lvn o - e l} '

donde Nno-el representa el número de lecturas secuenciadas que portan los alelos no eliminados en los tejidos tumorales y Nel representa el número de lecturas secuenciadas que portan los alelos eliminados en los tejidos tumorales.

La FIG. 12A es una gráfica 1200 que muestra el ADN procedente de tumores estimado en el plasma del paciente de HCC 10 en varios momentos. Las muestras se tomaron antes de la cirugía (Pre-Tx) y 3 días y 3 meses después de la resección quirúrgica del paciente. Este paciente estaba en remisión clínica a los 2 años de la resección del tumor. A los 3 días y 3 meses después de la resección quirúrgica del tumor, el patrón de metilación específico del tumor no fue detectable en el plasma. Este hallazgo fue compatible con el hallazgo de la ausencia de cualquier cáncer detectable a los 2 años de la operación.

La FIG. 12B es una gráfica 1250 que muestra el ADN procedente de tumores estimado en el plasma del paciente de HCC 9. Las muestras se tomaron antes del tratamiento (Pre-Tx) y 3 días y 2 meses después de la resección quirúrgica del paciente. A este paciente se le diagnosticó posteriormente que tenía depósitos tumorales multifocales (previamente desconocidos en el momento de la cirugía) en el hígado no reseccionado restante a los 3 meses y se observó que tenía metástasis pulmonares múltiples a los 4 meses después de la operación. El paciente falleció por enfermedad metastásica a los 8 meses de la operación. Usando análisis de patrones de metilación específicos de tejido, se estimó que el tejido tumoral aporta un 8 % y un 12 % del ADN plasmático total a los 3 días y 2 meses después de la operación.

D. Trasplante de órganos y deconvolución

La cuantificación de la contribución de un órgano al ADN plasmático se puede aplicar de manera útil para el seguimiento de pacientes que reciben trasplante de órganos. Se ha demostrado que el nivel de ADN liberado por un órgano trasplantado aumentaría en situaciones asociadas con el daño del órgano trasplantado, por ejemplo, en el rechazo de tejidos (De Vlaminck et al. Sci Transl Med. 2014;6:241ra77). Sin embargo, los métodos existentes solo se basan en la detección de marcadores polimórficos que son diferentes entre el donante y el receptor, por ejemplo, los alelos de SNP que están presentes en el donante pero están ausentes en el receptor (De Vlaminck et al. Circulating cell-free DNA enables noninvasive diagnosis of heart transplant rejection. Sci Transl Med. 2014;6:241ra77) o secuencias del cromosoma Y para casos de trasplantes de sexo no emparejado (Garcia Moreira et al. Cell-free DNA as a noninvasive acute rejection marker in renal transplantation. Clin Chem. 2009;55:1958-66). Para el análisis de marcadores polimórficos, se requieren tejidos del donante de órganos y del receptor para el genotipado. El genotipado de los tejidos del donante y del receptor agregaría costes adicionales al análisis y es posible que el tejido del donante de órganos no esté disponible en la práctica. Asimismo, las secuencias en los cromosomas X e Y solo son útiles en situaciones donde el donante y el receptor tienen diferentes sexos. Por consiguiente, las técnicas de deconvolución de la metilación pueden ser menos laboriosas y costosas que algunas técnicas anteriores y más aplicables que otras técnicas anteriores.

1. Correlación de fracciones

Esta sección muestra la precisión de la determinación de la proporción del ADN plasmático aportado por el órgano donante, según se determina mediante el análisis de deconvolución de metilación del ADN plasmático. En este método, no se requiere el genotipado de los tejidos del donante y el receptor.

Los sujetos que habían recibido un trasplante brindaron una valiosa oportunidad para validar el enfoque del mapeo en tejidos del ADN plasmático. Mediante el uso de alelos SNP que estaban presentes en un donante de órganos y que estaban ausentes en un receptor de trasplante, se podría medir la concentración fraccional del trasplante de órganos en plasma como se ha descrito anteriormente (Zheng YW, et al. 2012). Este resultado podría compararse con el deducido utilizando la deconvolución de la metilación.

La FIG. 13 es una tabla 1300 que muestra el análisis de mapeo en tejidos de ADN plasmático entre pacientes de trasplante de órganos de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Se realizó el mapeo en tejidos del ADN plasmático para 4 receptores de trasplante de hígado y 3 receptores de trasplante de médula ósea. Para cada caso, se obtuvieron y genotiparon los tejidos del donante y el receptor usando secuenciación paralela masiva. Se identificaron alelos SNP específicos del donante y se usaron para el cálculo de la fracción de ADN plasmático aportada por el órgano donante. Las fracciones de ADN de donante estimadas usando los alelos SNP específicos de donante se compararon con las contribuciones del hígado entre los receptores de trasplante de hígado, mientras que aquellas entre los receptores de trasplante de médula ósea se compararon con las contribuciones de glóbulos blancos sanguíneos (es decir, neutrófilos más linfocitos). Posteriormente, se llevó a cabo la deconvolución de la metilación plasmática para determinar la contribución del hígado y las células sanguíneas en los casos de trasplante de hígado y de trasplante de médula ósea, respectivamente.

La FIG. 14 es una gráfica 1400 que muestra una correlación entre las fracciones de ADN plasmático aportadas por el injerto trasplantado deducidas por el mapeo en tejidos de ADN plasmático y las fracciones de ADN del donante determinadas utilizando alelos de SNP específicos del donante. Los triángulos representan los resultados de los receptores de trasplante de hígado y los puntos representan los resultados de los receptores de trasplante de médula ósea. La gráfica 1400 muestra una fuerte correlación entre la deconvolución de la metilación y los resultados basados en SNP (r = 0,99, p < 0,001, correlación de Pearson).

2. Comparación de diferentes tipos de marcadores

Se compararon las contribuciones relativas de los marcadores de tipo I y tipo II en el análisis de deconvolución de la metilación. Para comparar equitativamente sus contribuciones, primero se seleccionaron aleatoriamente 1013 marcadores de tipo II, de modo que el número de marcadores de tipo I y tipo II utilizados para el análisis posterior fue el mismo. Los 1013 marcadores de tipo I y 1013 marcadores de tipo II formaron un conjunto.

La deconvolución de la metilación utilizando diferentes números de marcadores de metilación seleccionados al azar se realizó para determinar las contribuciones del órgano trasplantado (es decir, hígado para receptores de trasplante de hígado y células sanguíneas para receptores de trasplante de médula ósea). Tras seleccionar los marcadores al azar, se realizaron los análisis de deconvolución basándose en los datos de secuenciación reales. En cada análisis, se utilizó el mismo número de marcadores de tipo I y tipo II. Sin embargo, el número total de marcadores se varió en diferentes conjuntos de análisis de deconvolución para determinar el efecto del número de marcadores sobre la precisión del análisis de deconvolución de la metilación. Para cada análisis, se representó gráficamente la diferencia entre la contribución porcentual del órgano trasplantado al ADN plasmático por la deconvolución de la metilación y el valor derivado de los alelos SNP específicos del donante.

La FIG. 15A es una gráfica 1500 que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 503 marcadores de tipo I, 503 de tipo II y de ambos tipos (503 de cada uno) para la deconvolución de la metilación. Se muestra la diferencia entre el porcentaje de contribución del órgano trasplantado al ADN plasmático por deconvolución de la metilación y el valor derivado de los alelos SNP específicos del donante para los pacientes que recibieron trasplante de hígado (LTP1 a LTP5) y para los pacientes que recibieron trasplante de médula ósea (BMT1 a BMT3). Para cada paciente, los resultados de deconvolución de la metilación usando solo marcadores de tipo I, solo marcadores de tipo II y ambos tipos de marcadores se muestran mediante las cajas a la izquierda, en el medio y a la derecha, respectivamente. El análisis usando solo marcadores de tipo I tuvo un mayor sesgo en comparación con el uso de solo marcadores de tipo II o ambos tipos de marcadores. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas entre los resultados utilizando solo marcadores de tipo II y usando ambos tipos de marcadores.

La FIG. 15B es una gráfica 1550 que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 251 marcadores de tipo I, 251 de tipo II y de ambos tipos (251 de cada uno) para la deconvolución de la metilación. Se muestra la diferencia entre el porcentaje de contribución del órgano trasplantado al ADN plasmático por deconvolución de la metilación y el valor derivado de los alelos SNP específicos del donante para los pacientes que recibieron trasplante de hígado (LTP1 a LTP5) y aquellos que recibieron trasplante de médula ósea (BMT1 a BMT3). Para cada paciente, los resultados de deconvolución de la metilación usando solo marcadores de tipo I, solo marcadores de tipo II y ambos tipos de marcadores se muestran mediante las cajas a la izquierda, en el medio y a la derecha, respectivamente. El análisis usando solo marcadores de tipo I tuvo un mayor sesgo en comparación con el uso de solo marcadores de tipo II o ambos tipos de marcadores. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas entre los resultados utilizando solo marcadores de tipo II y usando ambos tipos de marcadores.

La FIG. 16A es una gráfica 1600 que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 123 marcadores de tipo I, 123 de tipo II y de ambos tipos (123 de cada uno) para la deconvolución de la metilación. Se muestra la diferencia entre el porcentaje de contribución del órgano trasplantado al ADN plasmático por deconvolución de la metilación y el valor derivado de los alelos SNP específicos del donante para los pacientes que recibieron trasplante de hígado (LTP1 a LTP5) y aquellos que recibieron trasplante de médula ósea (BMT1 a BMT3). Para cada paciente, los resultados de deconvolución de la metilación usando solo marcadores de tipo I, solo marcadores de tipo II y ambos tipos de marcadores se muestran mediante las cajas a la izquierda, en el medio y a la derecha, respectivamente. El análisis usando solo marcadores de tipo I tuvo un mayor sesgo en comparación con el uso de solo marcadores de tipo II o ambos tipos de marcadores. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas entre los resultados utilizando solo marcadores de tipo II y usando ambos tipos de marcadores.

La FIG. 16B es una gráfica 1650 que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 52 marcadores de tipo I, 52 de tipo II y de ambos tipos (52 de cada uno) para la deconvolución de la metilación. Se muestra la diferencia entre el porcentaje de contribución del órgano trasplantado al ADN plasmático por deconvolución de la mutilación y el valor derivado de los alelos SNP específicos del donante para los pacientes que recibieron trasplante de hígado (LTP1 a LTP5) y aquellos que recibieron trasplante de médula ósea (BMT1 a BMT3). Para cada paciente, los resultados de deconvolución de la metilación usando solo marcadores de tipo I, solo marcadores de tipo II y ambos tipos de marcadores se muestran mediante las cajas a la izquierda, en el medio y a la derecha, respectivamente. El análisis usando solo marcadores de tipo I tuvo un mayor sesgo en comparación con el uso de solo marcadores de tipo II o ambos tipos de marcadores. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas entre los resultados utilizando solo marcadores de tipo II y usando ambos tipos de marcadores.

La FIG. 17A es una gráfica 1700 que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 26 marcadores de tipo I, 26 de tipo II y de ambos tipos (26 de cada uno) para la deconvolución de la metilación. Se muestra la diferencia entre el porcentaje de contribución del órgano trasplantado al ADN plasmático por deconvolución de la metilación y el valor derivado de los alelos SNP específicos del donante para los pacientes que recibieron trasplante de hígado (LTP1 a LTP5) y aquellos que recibieron trasplante de médula ósea (BMT1 a BMT3). Para cada paciente, los resultados de deconvolución de la metilación usando solo marcadores de tipo I, solo marcadores de tipo II y ambos tipos de marcadores se muestran mediante las cajas a la izquierda, en el medio y a la derecha, respectivamente. El análisis usando solo marcadores de tipo I tuvo un mayor sesgo en comparación con el uso de solo marcadores de tipo II o ambos tipos de marcadores. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas entre los resultados utilizando solo marcadores de tipo II y usando ambos tipos de marcadores.

La FIG. 17B es una gráfica 1750 que muestra un análisis que compara las exactitudes del uso de 13 marcadores de tipo I, 13 de tipo II y de ambos tipos (13 de cada uno) para la deconvolución de la metilación. Se muestra la diferencia entre el porcentaje de contribución del órgano trasplantado al ADN plasmático por deconvolución de la metilación y el valor derivado de los alelos SNP específicos del donante para los pacientes que recibieron trasplante de hígado (LTP1 a LTP5) y aquellos que recibieron trasplante de médula ósea (BMT1 a BMT3). Para cada paciente, los resultados de deconvolución de la metilación usando solo marcadores de tipo I, solo marcadores de tipo II y ambos tipos de marcadores se muestran mediante las cajas a la izquierda, en el medio y a la derecha, respectivamente. El análisis usando solo marcadores de tipo I tuvo obviamente un mayor sesgo en comparación con el uso de solo marcadores de tipo II o ambos tipos de marcadores. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas entre los resultados utilizando solo marcadores de tipo II y usando ambos tipos de marcadores.

En general, los marcadores de tipo II proporcionaron mejor resultados que los marcadores de tipo I, lo que es sorprendente, especialmente dada la atención prestada a los marcadores de tipo I en estudios previos. Los presentes resultados también demuestran que más marcadores proporcionan una mayor precisión.

E. Efecto de diferentes criterios

Como se ha descrito anteriormente, pueden usarse diversos criterios para identificar marcadores de distintos tipos. Por ejemplo, puede identificarse un marcador de tipo I mediante un nivel de metilación en un tejido particular que es diferente del nivel medio de metilación para todos los tejidos, por ejemplo, al menos por un umbral específico, tal como 3 DT. Asimismo, para los marcadores de tipo II, se usan criterios de una cierta variación y máxima diferencia. Las secciones a continuación muestran la precisión de diferentes criterios para identificar marcadores.

1. Rendimiento de los marcadores con criterios menos restrictivos

Se comparó el rendimiento del análisis de deconvolución de la metilación usando marcadores con diferente variabilidad entre diferentes tejidos. Se determinaron las contribuciones de la placenta al ADN plasmático para 15 mujeres gestantes basándose en dos conjuntos de marcadores con diferentes criterios de selección. Ambos conjuntos de marcadores incluyen todos los marcadores de tipo I como se describe en las secciones anteriores. Sin embargo, los criterios de selección de los marcadores de tipo II son diferentes para los dos conjuntos de marcadores.

Los marcadores del conjunto I incluyen los 5820 marcadores de tipo II que cumplen los criterios de tener un CV de densidad de metilación >0,25 y una diferencia entre las densidades de metilación máxima y mínima para los grupos de tejidos mayor de 0,2. Para los marcadores del conjunto II, el requisito de CV fue > 0,15 y la diferencia entre las densidades de metilación máxima y mínima para los grupos de tejidos fue mayor de 0,1. Había 8.511 marcadores de tipo II en este conjunto de marcadores.

La FIG. 18A es una gráfica 1800 que muestra la contribución placentaria al ADN plasmático deducida utilizando marcadores con diferentes criterios de selección de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El eje vertical corresponde a la contribución placentaria deducida utilizando los marcadores del conjunto II. El eje horizontal corresponde a la contribución placentaria deducida utilizando los marcadores del conjunto II. Hubo una buena correlación entre los resultados de la contribución placentaria basados en los dos conjuntos de marcadores con diferentes criterios de selección (r = 0,99, correlación de Pearson). Por consiguiente, se puede obtener una buena precisión utilizando los requisitos de CV >0,15 y de una diferencia entre las densidades de metilación máxima y mínima para los grupos de tejidos mayor de 0,1.

2. Efecto de la variación del nivel de metilación en el mismo tipo de tejido

Para investigar si la variación en el nivel de metilación de los marcadores entre el mismo tipo de tejidos (por ejemplo, de diferentes individuos) afectaría a la realización del análisis de deconvolución, se analizaron tejidos placentarios de dos casos de embarazo. Se identificaron dos categorías de marcadores de metilación. Específicamente, las dos categorías se identificaron basándose en su similitud en los niveles de metilación en dos tejidos placentarios. Los marcadores de la categoría i tienen una densidad de metilación del 10 % o menor. Los marcadores de la categoría ii tienen una alta variabilidad entre los dos tejidos placentarios (diferencia en la densidad de metilación de más del 10 %).

La FIG. 18B es una gráfica 1850 que muestra la precisión de la deconvolución del ADN plasmático utilizando marcadores con baja variabilidad (categoría i) y alta variabilidad (categoría ii) en el mismo tipo de tejido. La deconvolución del ADN plasmático se realizó para determinar la contribución placentaria al ADN plasmático para 15 mujeres gestantes. Para cada marcador, se usó la media de las densidades de metilación de los dos tejidos placentarios para representar el nivel de metilación de la placenta en el análisis. Para cada uno de los análisis de deconvolución usando los marcadores de categoría i y categoría ii, se usó un total de 1024 marcadores.

Además, se determinó la cantidad de ADN de origen placentario basándose en la proporción de los alelos SNP específicos fetales. El porcentaje de contribución deducido por el análisis de deconvolución de metilación basado en marcadores de categoría i y categoría ii se comparó con los resultados basados en alelos de SNP específicos de feto. La mediana de desviación de la contribución placentaria derivada a partir del valor estimado basándose en alelos específicos fetales fue del 2,7 % y del 7,1 % usando los marcadores de categoría i y categoría ii, respectivamente. Por lo tanto, el uso de marcadores de categoría i que tenían una menor variación entre individuos en el nivel de metilación de tejido proporcionaron una mejor precisión en el análisis de deconvolución de la metilación.

Se observó una diferencia significativamente mayor entre los resultados de la deconvolución de la metilación y el análisis de alelos específicos de feto cuando se usaron marcadores con alta variabilidad en el mismo tipo de tejido (categoría ii) (P<0,0001, prueba de rango de signo de Wilcoxon). En otras palabras, el uso de marcadores con baja variabilidad dentro del mismo tipo de tejido aumentaría la precisión del análisis de deconvolución de la metilación. Por consiguiente, los marcadores pueden seleccionarse basándose en la variabilidad entre el mismo tipo de tejidos, por ejemplo, pero sin limitación, el valor de CV y la diferencia entre la densidad de metilación máxima y mínima para el mismo tipo de tejidos.

IV. IDENTIFICACIÓN DE ENFERMEDADES EN TEJIDOS A PARTIR DE UNA CONTRIBUCIÓN AUMENTADA

En una aplicación para usar las contribuciones fraccionales determinadas, las realizaciones pueden detectar contribuciones fraccionales anormales a partir de un tipo de tejido particular en relación con los niveles de referencia. En una realización, los niveles de referencia pueden corresponder a los valores establecidos en organismos que están sanos para el tipo de tejido. En otra realización, el nivel de referencia puede corresponder a una contribución fraccional determinada utilizando moléculas de ADN libre de células de un intervalo de tamaños diferente.

A. Porcentaje aumentado en relación con porcentajes sanos

Las realizaciones pueden detectar que la contribución fraccional determinada de un tipo de tejido particular es mayor de lo que normalmente se esperaría para un organismo sano. Una mayor contribución fraccional para el tejido particular podría ser el resultado de que el tejido esté enfermo y por lo tanto, libere más moléculas de ADN libre de células. Por ejemplo, un órgano enfermo liberaría más moléculas de ADN libre de células como resultado de la apoptosis u otros mecanismos celulares.

1. Determinación del tejido de origen para cánceres de origen primario desconocido

En estudios previos, se ha demostrado que pueden detectarse cambios en el ADN asociado con tumores en el plasma libre de células de pacientes con cáncer. Por ejemplo, pueden detectarse cambios en el número de copias cromosómicas asociados con el cáncer e hipometilación global asociada con el cáncer en el ADN plasmático de pacientes con cáncer. Por lo tanto, el análisis del ADN plasmático sería potencialmente útil para la detección de cánceres en individuos aparentemente sanos (Chan et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110:18761-8 y Chan et al. Clin Chem. 2013;59:211-24). Tras la detección de características asociadas al cáncer en el plasma, también es importante determinar dónde está el tumor primario.

En este caso, se propone que las células tumorales exhibirían algunas de las características de metilación de ADN del tejido primario del que proceden. Los presentes inventores razonaron que el ADN procedente de tumores podría tener un perfil de metilación más similar al tejido de origen que a otros tejidos. Por lo tanto, en presencia de ADN procedente de tumores en el plasma, habrá un aumento evidente en la contribución del tejido de origen del tumor al ADN plasmático. Por lo tanto, el análisis de los patrones de metilación específicos de tejido en el ADN plasmático de pacientes con cánceres podría ser útil para indicar el sitio del tumor primario.

En este ejemplo, se analizó el ADN plasmático de los 10 pacientes de HCC analizados anteriormente, dos pacientes con cánceres de pulmón y un paciente con cáncer colorrectal. Se usaron para el análisis los patrones de metilación de diferentes órganos. Sin embargo, no se incluyeron los patrones de metilación de los tejidos tumorales en el análisis debido a que en un escenario de exploración del cáncer, el tejido tumoral normalmente no se encuentra disponible para el análisis de la metilación.

La FIG. 19 es una tabla 1900 que muestra las contribuciones de diferentes tejidos al ADN plasmático de pacientes con diversos tipos de cáncer y sujetos sanos basándose en el análisis de patrones de metilación específicos de órganos de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La contribución del hígado aumenta en 9 de los 10 plasmas de pacientes con HCC en comparación con la media de los sujetos sanos. Las contribuciones del pulmón y el colon aumentan en los pacientes con cáncer de pulmón y cáncer colorrectal, respectivamente. Por consiguiente, el tejido enfermo corresponde a la contribución de la fracción anormal.

La FIG. 20 muestra una tabla 2000 que muestra las contribuciones de los diferentes órganos para cada paciente con cáncer en comparación con la media de los cuatro sujetos de control de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Las contribuciones se muestran como diferencias en la contribución fraccional de la media de los cuatro sujetos control.

Los valores positivos y negativos indican aumento y disminución, respectivamente, en la aportación del órgano particular. En cada paciente, el número en negrita representa el mayor incremento en comparación con los sujetos de control. Para 8 de los 10 pacientes con HCC, la contribución del hígado tuvo el mayor aumento en comparación con los cuatro sujetos de control. Para ambos pacientes con cáncer de pulmón, la contribución del pulmón mostró el mayor aumento. Para el paciente con cáncer colorrectal, el mayor incremento fue del colon. Estos resultados muestran que el análisis del patrón de metilación específico de tejido en plasma puede ser útil para determinar el origen de los cánceres en los que se oculta el cáncer primario.

La FIG. 21A es una gráfica 2100 que muestra las contribuciones del hígado al ADN plasmático estimadas a partir de marcadores de metilación para sujetos con HCC y de control sanos de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La contribución del hígado al plasma está significativamente elevada en los sujetos con HCC en comparación con los sujetos de control sanos. Por consiguiente, la contribución fraccional se puede utilizar como una medida de una muestra, donde la medición puede compararse con un umbral (por ejemplo, aproximadamente el 8 %) para identificar un riesgo elevado de enfermedad. La comparación con el umbral puede proporcionar una clasificación de si el tipo de tejido está enfermo, donde la clasificación puede ser diversos niveles de probabilidad de que el tejido esté enfermo.

Se proporcionan ejemplos adicionales para el análisis de ADN plasmático usando deconvolución de la metilación aplicados a la detección del cáncer. Para demostrar este fenómeno, se analizó el ADN plasmático de 29 pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC), cuatro pacientes con cáncer de pulmón y un paciente con cáncer colorrectal. Se reclutaron como controles treintaidós sujetos sanos, como se muestra en la tabla 600 de la FIG. 6. Entre ellos, se han comunicado los resultados de secuenciación con bisulfito de todo el genoma del ADN plasmático en un estudio anterior (Chan et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110:18761-8) para 26 pacientes con HCC, 4 pacientes con cáncer de pulmón y 32 controles. En estos ejemplos, se determinaron los perfiles de metilación del ADN plasmático usando secuenciación con bisulfito. También pueden usarse otros métodos de detección de la metilación, por ejemplo, pero sin limitación, los mencionados en la sección anterior.

La FIG. 21B es una gráfica 2150 que muestra el porcentaje de ADN plasmático aportado por el hígado entre los controles sanos y los pacientes con HCC según lo deducido por realizaciones de la presente invención. El porcentaje de ADN plasmático aportado por el hígado fue significativamente mayor (P <0,001, prueba de suma de rangos de Mann-Whitney) en pacientes con HCC en comparación con los sujetos de control. La gráfica 2150 proporciona pruebas adicionales de la capacidad para comparar una contribución fraccional de un tejido con un valor de referencia para identificar una patología del tejido.

Las FIG. 22A y 22B muestran las contribuciones porcentuales de (A) los pulmones y (B) el colon deducidas a partir de las realizaciones de la presente invención con comparaciones entre controles sanos no gestantes y pacientes con cáncer de pulmón o cáncer colorrectal. La FIG. 22A es una gráfica 2200 que muestra que el porcentaje de ADN plasmático aportado por el pulmón fue significativamente mayor (P = 0,002, prueba de suma de rangos de Mann-Whitney) en pacientes con cáncer de pulmón en comparación con los sujetos de control. La FIG. 22B es una gráfica 2250 que muestra que el porcentaje de ADN plasmático aportado por el colon de los pacientes con cáncer de pulmón fue más alto que todos los sujetos de control. Estos datos demuestran que el análisis del ADN plasmático usando análisis de deconvolución de metilación es útil para identificar el tejido de origen de un cáncer (por ejemplo, después de que se haya identificado que es probable que el sujeto tenga cáncer) y para explorar a un paciente para identificar patologías de tejidos en primer lugar.

La FIG. 23 es una tabla 2300 que muestra el análisis de mapeo en tejidos de ADN plasmático entre los pacientes con cáncer de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La deconvolución de la metilación indicó que el porcentaje medio de contribuciones del hígado al plasma para pacientes con HCC y de control fue del 12,9 % (intervalo intercuartílico: 8,7 % - 32,9 %) y del 5,5 % (intervalo intercuartílico: 4,6 % - 7,1 %), respectivamente.

2. Método para detectar patologías basándose en una contribución aumentada

La FIG. 24 es un diagrama de flujo que ilustra un método 2400 para analizar una mezcla de ADN de moléculas de ADN libre de células para identificar una patología en un tejido basándose en la contribución fraccional elevada del tejido a la mezcla de ADN de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La muestra biológica incluye una mezcla de moléculas de ADN libre de células de una pluralidad de tipos de tejidos, incluyendo un primer tipo de tejido.

En el bloque 2410, se identifican para su análisis N sitios genómicos. Los N sitios genómicos pueden tener varios atributos, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. A modo de ejemplo, los N sitios genómicos pueden incluir únicamente sitios de tipo I o de tipo II o una combinación de ambos. El bloque 2410 puede llevarse a cabo de un modo similar al del bloque 110 de la FIG. 1.

En el bloque 2420, se recibe la muestra biológica que incluye una mezcla de moléculas de ADN libre de células de M tipos de tejidos. El bloque 2420 puede llevarse a cabo de un modo similar al del bloque 130 de la FIG. 1.

En el bloque 2430, se analizan las moléculas de ADN libre de células para identificar sus ubicaciones en un genoma de referencia correspondiente al organismo. El bloque 2430 puede llevarse a cabo de un modo similar al del bloque 140 de la FIG. 1. Las moléculas de ADN libre de células analizadas pueden ser fragmentos de ADN cortos, que pueden proporcionar una precisión suficiente con un menor número de fragmentos de ADN, como se explica en la sección IV.B a continuación.

En el bloque 2440, se miden los N niveles de metilación de la mezcla en los N sitios genómicos usando moléculas de ADN libre de células que están ubicadas cada una en uno cualquiera de N sitios genómicos del genoma de referencia. Puede medirse un nivel de metilación de mezcla para cada uno de los N sitios genómicos. El bloque 2440 puede llevarse a cabo de un modo similar al bloque 150 del método 100 de la FIG. 1. Por lo tanto, puede usarse cualquier técnica para medir un nivel de metilación de una molécula de ADN. En algunas realizaciones, la medición del nivel de metilación de una molécula de ADN puede usar resultados de secuenciación sensible a la metilación, que también pueden usarse para determinar la ubicación de la molécula de ADN.

En el bloque 2450, se determina una primera aportación fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla usando los N primeros niveles de metilación. En algunas realizaciones, el bloque 2450 puede llevarse a cabo mediante los bloques 160 y 170 del método 100 de la FIG. 1. Por lo tanto, puede determinarse simultáneamente una contribución fraccional para un panel de M tipos de tejido. El bloque 2450 puede usar N niveles de metilación específicos de tejido en N sitios genómicos, determinados para cada uno de M tipos de tejido, por ejemplo, como en el bloque 120 del método 100 de la FIG. 1.

En el bloque 2460, se calcula un valor de separación entre la primera contribución fraccional y una contribución fraccional de referencia. A modo de ejemplo, el valor de separación puede incluir una diferencia o una relación de la primera contribución fraccional y la contribución fraccional de referencia. El valor de separación puede incluir otros factores y puede usarse una diferencia de funciones de las contribuciones fraccionales. La contribución fraccional de referencia se puede determinar utilizando muestras de organismos que están sanos para el primer tipo de tejido.

En el bloque 2470, puede compararse el valor de separación con un valor umbral para determinar una clasificación de si el primer tipo de tejido tiene o no una patología. Como se muestra en los resultados en el presente documento, un aumento estadísticamente significativo en la cantidad de un tipo de tejido particular a la mezcla indica una patología. En caso de que se restrinja a 1 el total de las contribuciones (es decir, al 100 %), un aumento en el tipo de tejido particular podría ir acompañado de reducciones correspondientes en uno o más tejidos distintos en la mezcla. Por consiguiente, puede compararse una primera cantidad (por ejemplo, una contribución fraccionaria) del primer tipo de tejido en la mezcla con una cantidad umbral para determinar una clasificación de si el primer tipo de tejido tiene o no una patología.

En una realización, el valor umbral se determina en función de las cantidades del primer tipo de tejido en mezclas de un primer conjunto de organismos que están sanos para el primer tipo de tejido y de un segundo conjunto de organismos que están enfermos para el primer tipo de tejido. Los organismos enfermos pueden tener una enfermedad que se está buscando, por ejemplo, cáncer. Por ejemplo, el segundo grupo de organismos puede tener cáncer en el primer tipo de tejido. Como otro ejemplo, el segundo grupo de organismos puede tener un trasplante del primer tipo que ha sufrido rechazo. Para un órgano trasplantado, la identificación de una patología puede corresponder con una clasificación de si el primer tipo de tejido está siendo rechazado por el organismo, donde el rechazo es una patología.

3. Lupus eritematoso sistémico (LES)

Para ilustrar adicionalmente la utilidad potencial del análisis de deconvolución de la metilación de ADN plasmático, se analizó el ADN plasmático de nueve pacientes con LES. Estos pacientes tenían un índice de actividad de enfermedad de LES (SLEDAI) de menos de 8, lo que indica que su enfermedad está relativamente inactiva. Se llevó a cabo deconvolución de la metilación de ADN plasmático para estos ocho pacientes.

La FIG. 25 es una tabla 2500 que muestra la contribución porcentual de diferentes órganos al ADN plasmático mediante deconvolución de la metilación en nueve pacientes con LES de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La contribución del hígado aumentó en los pacientes 8 y 9 en comparación con otros pacientes con LES. El paciente 8 tenía hepatitis inducida por fármacos con una actividad elevada de alanina transaminasa (ALT) de 235U/l. El paciente 9 tenía una tuberculosis diseminada que afectaba al hígado. Estos resultados sugieren que el análisis de deconvolución de la metilación del ADN plasmático fue capaz de identificar la patología del órgano afectado.

4. Identificación del tipo de tejido asociado con la enfermedad detectada

Las secciones anteriores determinaron de manera automática el tipo de tejido como parte de la identificación de la enfermedad cuando se observa un gran porcentaje de aumento. Si una enfermedad es identificada por otros medios, un menor aumento para un tejido particular puede permitir identificar el tipo de tejido, incluso si el aumento no es lo suficientemente grande como para significar una patología por sí mismo. Por ejemplo, si el cáncer se identificó anteriormente, el análisis anterior puede identificar el tejido implicado. En la sección V se proporciona una descripción adicional de realizaciones que identifican el tipo de tejido para un cáncer detectado.

B. Selección del tamaño con deconvolución de la metilación

Como alternativa o además de identificar contribuciones fraccionales elevadas en relación con los valores de tejidos sanos, las realizaciones pueden analizar contribuciones fraccionales para diferentes tamaños de moléculas de ADN sin células. Cuando se lleva a cabo de manera adicional, puede identificarse que ciertos tipos de tejido tienen contribuciones fraccionales elevadas y el análisis de tamaño puede confirmar si el tipo de tejido está enfermo.

En cuanto al tamaño de las moléculas de ADN libre de células, se ha demostrado que la distribución del tamaño del ADN de origen fetal es más corta que la del ADN de origen materno en el plasma de las mujeres gestantes. Además, la distribución del tamaño del ADN procedente de tumores es más corta que la del ADN procedente de tejidos no malignos en pacientes con cáncer (Jiang et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:E1317-25). En este sentido, el análisis selectivo de fragmentos de ADN largos y cortos podría identificar el enriquecimiento de moléculas de ADN libre de células cortas de un tejido particular.

Por consiguiente, puede obtenerse una precisión aumentada analizando fragmentos de ADN de un tamaño específico. Por ejemplo, podría observarse una contribución aumentada del hígado al ADN plasmático en pacientes que padecen cáncer de hígado. Se ha demostrado que las moléculas de ADN plasmático procedentes del cáncer de hígado son más cortas que el ADN plasmático procedente de tejidos no malignos (Jiang et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112:E1317-25). Por lo tanto, la observación de que la contribución del hígado es mayor cuando se analizan moléculas de ADN cortas en comparación con cuando se analizan moléculas de ADN largas podría respaldar que la elevación de la aportación del hígado es compatible con la presencia de cáncer hepática en el paciente.

1. Resultados

Se secuenciaron tres muestras de plasma materno y dos muestras de plasma de pacientes con cáncer usando un protocolo de secuenciación de extremos emparejados, de tal forma que se pudieron determinar las coordenadas de los nucleótidos más externos en ambos extremos de cada molécula de ADN plasmático en el genoma humano de referencia. Posteriormente, se dedujo el tamaño de cada molécula de ADN plasmático a partir de las coordenadas de los nucleótidos en los dos extremos.

Para ilustrar si la composición de ADN plasmático podría ser diferente cuando se analizan de manera selectiva moléculas de ADN cortas o largas, se ha usado de manera arbitraria un valor de corte de 150 pb para definir moléculas de ADN largas y cortas. Otros ejemplos de valores de corte de tamaño incluyen 70 pb, 75 pb, 80 pb, 90 pb, 100 pb, 110 pb, 120 pb, 130 pb, 140 pb, 160 pb, 170 pb, 180 pb, 190 pb y 200 pb. Aparte de la longitud, también puede usarse la masa como medida del tamaño. Como ejemplo para espectrometría de masas, una molécula más larga podría tener una masa mayor (un ejemplo de un valor de tamaño). La longitud es otro ejemplo de tamaño, por ejemplo, medida en pares de bases. La selección por tamaños también puede llevarse a cabo usando un método físico, tal como mediante electroforesis en gel o por filtración o por precipitación selectiva de tamaño o mediante hibridación.

Los resultados a continuación muestran que pueden usarse los análisis de tamaño en combinación con el análisis de la contribución de tejidos al ADN plasmático mediante deconvolución de la metilación. En algunas realizaciones, la deconvolución de la metilación del ADN plasmático puede centrarse en un intervalo de tamaño específico del ADN plasmático. Debido a que las moléculas de tejidos no hematopoyéticos tienen una distribución de tamaños más corta, el análisis selectivo de fragmentos de ADN cortos puede proporcionar un análisis menos costoso para el ADN liberado del órgano diana. Por ejemplo, para determinar si hay un daño significativo al hígado trasplantado en un paciente que reciba un trasplante de hígado, puede llevarse a cabo deconvolución del ADN solo en fragmentos de ADN cortos. Ya que los tejidos no hematopoyéticos pueden tener una mayor contribución fraccional al ADN plasmático cuando se analizan de manera selectiva fragmentos de ADN cortos, puede obtenerse una diferencia estadística respecto de los valores de referencia analizando menos moléculas de ADN libre de células. Por ejemplo, una mayor contribución fraccional da como resultado cambios detectables (es decir, cambios por encima de un umbral) en la contribución fraccional con menos moléculas de ADN libre de células debido a la mayor concentración de moléculas de ADN libre de células de tejido no hematopoyético. Por consiguiente, las moléculas de ADN libre de células analizadas en el método 2400 pueden estar por debajo de un valor de corte de tamaño, lo que puede proporcionar una precisión deseada con menos moléculas de ADN libre de células. El aumento de la contribución hepática en este caso puede indicar un aumento de la muerte celular en el hígado trasplantado.

La FIG. 26A es una gráfica 2600 que muestra las contribuciones placentarias determinadas a partir de moléculas de ADN libre de células de diferentes longitudes para tres mujeres gestantes (M6941p, M7171p y M396p) de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Las contribuciones de la placenta al ADN plasmático fueron mayores cuando solo se analizaron los fragmentos cortos de ADN plasmático de <150 pb en comparación con el análisis que involucraba todo el ADN plasmático sin selección de tamaño. Por el contrario, las contribuciones de la placenta al ADN plasmático fueron menores cuando solo se analizaron los fragmentos largos de ADN plasmático de >150 pb en comparación con el análisis que involucraba todo el ADN plasmático sin selección de tamaño.

Estos resultados son consistentes con que la distribución de tamaño del ADN derivado de placenta (con el mismo genotipo del feto) es más corta que la del ADN de procedencia materna. Dichos resultados indican que pueden usarse las realizaciones para detectar una afección en un tipo de tejido específico.

La FIG. 26B es una tabla 2650 que muestra las contribuciones de tejidos no hematopoyéticos determinadas a partir de moléculas de ADN libre de células de diferentes longitudes para pacientes de trasplante de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Se agruparon para su análisis las lecturas secuenciadas de los cinco pacientes que habían recibido trasplante de hígado (pacientes con LT). Como controles, se agruparon las lecturas secuenciadas de cuatro controles sanos para este análisis. Se observó que la contribución proporcionar de los tejidos no hematopoyéticos aumentó cuando se analizaron únicamente los fragmentos de a Dn plasmático de < 150 pb, en comparación con el análisis que involucró todo el ADN plasmático sin selección de tamaño. La contribución proporcional disminuyó cuando solo se analizaron los fragmentos largos de ADN plasmático de >150 pb en comparación con el análisis que involucraba todo el ADN plasmático sin selección de tamaño.

Dichos resultados también indican que las realizaciones pueden identificar afecciones en órganos. Aunque normalmente no se usarían las realizaciones para identificar el órgano trasplantado, las realizaciones pueden monitorizar un valor de separación (por ejemplo, diferencia o proporción) entre las contribuciones fraccionales para diferentes tamaños. Pueden identificarse problemas con el órgano trasplantado cuando aumenta el valor de separación.

La FIG. 27A es una gráfica 2700 que muestra las contribuciones del hígado determinadas a partir de moléculas de ADN libre de células de diferentes longitudes para pacientes de trasplante de acuerdo con realizaciones de la presente invención. También se analizó la contribución proporcional del hígado para los sujetos de control sanos y los pacientes que habían recibido trasplante de hígado. La contribución proporcional del hígado aumentó cuando se analizaron los fragmentos cortos de a Dn y la contribución proporcional del hígado disminuyó cuando se analizaron los fragmentos largos de ADN, en relación con el análisis que implicó todo el ADN plasmático sin selección de tamaño.

La contribución del hígado fue mayor cuando se analizaron fragmentos cortos de ADN en plasma, que cuando se analizaron fragmentos de ADN largos. Además, la cantidad de diferencia es mayor que para el tejido no hematopoyético, que incluye otros tejidos además del hígado. Dichos resultados ilustran además la capacidad para determinar con precisión el tejido que tiene una afección asociada con un aumento en las moléculas de ADN libre de células más cortas.

La FIG. 27B es una gráfica 2750 que muestra las contribuciones del hígado determinadas a partir de moléculas de ADN libre de células de diferentes longitudes para pacientes con HCC de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La contribución proporcional del hígado se analizó para dos pacientes con HCC. La contribución proporcional del hígado aumentó cuando se analizaron los fragmentos cortos de ADN y la contribución proporcional del hígado disminuyó cuando se analizaron los fragmentos largos de ADN, en relación con el análisis que implicó todo el ADN plasmático sin selección de tamaño.

Por consiguiente, las realizaciones pueden analizar una separación entre las contribuciones fraccionales para moléculas de ADN libre de células largas y cortas para identificar un tejido que está enfermo. Dichos valores de separación pueden determinarse para cada uno de un panel de tipos de tejidos. Cuando un valor de separación particular para un tipo de tejido particular se encuentra por encima de un umbral, puede clasificarse que un tejido corresponde a una patología. Como se puede observar, el diferencial para un organismo normal es tan solo un pequeño porcentaje, donde el diferencial es próximo al 8 % o más para los casos de HCC.

2. Método

La FIG. 28 es un diagrama de flujo que ilustra un método para analizar una mezcla de ADN de moléculas de ADN libre de células para identificar una patología en un tejido basándose en la contribución fraccional diferencial del tejido a la mezcla de ADN a partir de moléculas de ADN libre de células de diferentes tamaños de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Una muestra biológica incluye la mezcla de moléculas de ADN libre de células de una pluralidad de tipos de tejidos, incluyendo un primer tipo de tejido.

En el bloque 2810, se analiza una pluralidad de moléculas de ADN libre de células de la muestra biológica. El bloque 3910 puede llevarse a cabo de un modo similar al bloque 140 del método 100 de la FIG. 1. Se analizan al menos 1.000 moléculas de ADN libre de células para determinar dónde se ubican las moléculas de ADN libre de células y pueden medirse los niveles de metilación como se describe a continuación.

Además, puede medirse el tamaño de cada una de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células. Los tamaños pueden medirse de varias maneras. Por ejemplo, pueden secuenciarse las moléculas de ADN libre de células (por ejemplo, usando secuenciación sensible a la metilación) para obtener lecturas de secuencia y un tamaño puede corresponder a una longitud de una lectura de secuencia. Las lecturas de secuencia pueden alinearse con un genoma de referencia para determinar dónde se encuentra una molécula de ADN libre de células. En una implementación, la secuenciación incluye secuenciar dos extremos de cada una de las moléculas de ADN libre de células y la alineación incluye la alineación de los dos extremos. Los tamaños de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células pueden determinarse basándose en la alineación de los dos extremos con el genoma de referencia.

La determinación de la ubicación y el tamaño puede realizarse en diferentes procedimientos, por ejemplo, puede llevarse a cabo una separación física y después puede determinarse una ubicación (por ejemplo, usando sondas de secuenciación o hibridación). Los ejemplos del proceso de separación físico incluyen electroforesis en gel, filtración, precipitación selectiva de tamaño o hibridación. El proceso de separación física se puede realizar antes de analizar las moléculas de ADN libre de células para determinar su ubicación. En una implementación, pueden determinarse las ubicaciones usando sondas de hibridación. En otras realizaciones (por ejemplo, secuenciación), puede determinarse el tamaño de cada una de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células.

En el bloque 2820, se identifica una pluralidad de moléculas de ADN libre de células que están ubicadas en cualquiera de los N sitios genómicos del genoma de referencia correspondiente al organismo. En tanto que una molécula de ADN libre de células incluya uno de los N sitios genómicos, puede estar incluida. Los N sitios genómicos pueden identificarse de varias maneras y usando varios criterios, como se describe en el presente documento. Pueden usarse las técnicas descritas en la sección II. N es un número entero, que puede ser mayor o igual a 10.

En el bloque 2830, se identifica un primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células que tienen tamaños dentro de un primer intervalo de tamaños. El primer intervalo de tamaños puede corresponder a cualquier intervalo de tamaños, por ejemplo, menos que una longitud especificada, más que una longitud especificada o entre dos tamaños. El primer conjunto puede identificarse mediante un proceso físico (por ejemplo, como se describe en el presente documento) o conociendo el tamaño de cada una de las moléculas de ADN e identificarlas en un ordenador.

En el bloque 2840, se miden los N primeros niveles de metilación en los N sitios genómicos usando el primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células. Puede medirse un primer nivel de metilación de mezcla para cada uno de los N sitios genómicos. El bloque 28400 puede llevarse a cabo de un modo similar al bloque 150 del método 100 de la FIG. 1.

En el bloque 2850, se determina una primera aportación fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla usando los N primeros niveles de metilación. En algunas realizaciones, el bloque 28500 puede llevarse a cabo mediante los bloques 160 y 170 del método 100 de la FIG. 1. Por lo tanto, puede determinarse simultáneamente una contribución fraccional para un panel de M tipos de tejido.

En el bloque 2860, se identifica un segundo conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células que tienen tamaños dentro de un segundo intervalo de tamaños. El segundo intervalo de tamaños es diferente del primer intervalo de tamaños. El segundo intervalo de tamaños puede corresponder a cualquier intervalo de tamaños, por ejemplo, menos que una longitud especificada, más que una longitud especificada o sin selección de tamaño (es decir, todos los tamaños), en tanto que haya diferencia respecto del primer intervalo de tamaños. Cuando el segundo intervalo de tamaños no tiene selección de tamaños, el primer intervalo de tamaños sería un subconjunto del segundo intervalo de tamaños.

En algunas realizaciones, los dos intervalos de tamaños no se superponen, mientras que en otras realizaciones puede existir una superposición. Los intervalos de tamaños no se centrarían en un mismo tamaño, pero podría compensarse, potencialmente sin superposición. En una realización, el primer intervalo de tamaños es inferior a 150 bases y el segundo intervalo de tamaños es de 150 bases o más.

En el bloque 2870, se miden los N segundos niveles de metilación en los N sitios genómicos usando el segundo conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células. Puede medirse un segundo nivel de metilación de mezcla para cada uno de los N sitios genómicos. El bloque 2870 puede llevarse a cabo de un modo similar al del bloque 2840.

En el bloque 2880, se determina una segunda aportación fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla usando los N segundos niveles de metilación. El bloque 2880 puede llevarse a cabo de un modo similar al del bloque 2850.

En el bloque 2890, se calcula un valor de separación entre la primera contribución fraccional y la segunda contribución fraccional. En el presente documento se describen ejemplos de un valor de separación e incluyen una diferencia o una proporción. Sin un tipo de tejido aporta relativamente más moléculas de ADN cortas a la mezcla, la contribución fraccional será mayor para el intervalo de tamaño que sea más corto.

En el bloque 2895, se compara el valor de separación con un valor umbral para determinar una clasificación de si el primer tipo de tejido tiene o no una patología. Una clasificación puede ser que el primer tipo de tejido tiene la patología cuando el valor de separación excede el valor umbral. La patología puede identificar que hay algo mal (por ejemplo, cáncer) con el tejido como resultado de la liberación de una cantidad desproporcionada de moléculas de ADN libre de células más cortas. El umbral puede definirse como un número negativo o pueden determinarse valores absolutos.

En algunas realizaciones, puede determinarse el valor umbral basándose en valores de separación determinados para mezclas de un primer conjunto de organismos que están sanos para el primer tipo de tejido y de un segundo conjunto de organismos que están enfermos para el primer tipo de tejido. Varias clasificaciones pueden dar cuenta de hasta qué punto el valor de separación supera al valor umbral. Por consiguiente, pueden usarse múltiples umbrales, lo que puede hacerse para cualquier método descrito en el presente documento.

V. IDENTIFICACIÓN DE TEJIDO CORRESPONDIENTE A UNA ABERRACIÓN EN EL NÚMERO DE COPIAS

Las aberraciones en el número de copias corresponden a amplificaciones y eliminaciones en regiones cromosómicas, por ejemplo, un cromosoma entero o parte de un cromosoma. En muchos tumores existen aberraciones en el número de copias(CNA) y por lo tanto, pueden indicar la existencia de cáncer u otra enfermedad. Pueden encontrarse detalles adicionales acerca de la identificación del cáncer mediante la detección de regiones que muestran CNA en la Patente de los Estados Unidos n.° 8.741.811. Sin embargo, puede no saberse el origen del tumor estrictamente a partir del análisis de CNA. Las realizaciones pueden usar deconvolución de la metilación para identificar un origen de las moléculas de ADN libre de células que corresponden a las aberraciones del número de copias. Las realizaciones también pueden usar deconvolución de la metilación para evaluar una región cromosómica particular.

Por ejemplo, el plasma consta de ADN liberado de múltiples tejidos del organismo. Usando la secuenciación con bisulfito de todo el genoma del ADN plasmático, los presentes inventores han obtenido las aportaciones de estos tejidos al conjunto de ADN circulante. Los tejidos contribuyentes y sus proporciones relativas se identifican mediante un proceso de deconvolución bioinformático que extrae la referencia de firmas de metilación de ADN representativas de cada tipo de tejido, como se ha descrito anteriormente. Los presentes inventores validaron esta estrategia en mujeres gestantes, pacientes con cáncer y receptores de trasplantes. Las realizaciones permiten identificar el tejido de origen de las aberraciones genómicas observadas en el ADN plasmático. Esta estrategia tiene numerosas aplicaciones en investigación y diagnóstico en pruebas prenatales, oncología, monitorización de trasplantes y otros campos.

A. Mapeo en tejidos de aberraciones de número de copias (CNA)

La detección de aberraciones de número de copias en el plasma se ha usado en contextos de pruebas prenatales no invasivas (Chiu RWK, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:20458-20463; Chiu RWK, et al. (2011) BMJ 342:c7401; Bayindir B, et al. (2015) Eur J Hum Genet doi: 10.1038/ejhg.2014.282; y Norton ME, et al. (2015) N Engl J Med 372:1589-1597) y detección del cáncer (Leary RJ, et al. (2012) Sci Transl Med 4(162):162ra154; Chan et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013; 110:18761-8; Heitzer E, et al. (2013) Int J Cancer 133(2):346-356). Sería altamente ventajoso poder identificar el tejido de origen de las aberraciones del número de copias.

Para la detección prenatal no invasiva de aberraciones de número de copias subcromosómicas (Yu SCY, et al. (2013) PLoS One 8(4):e60968), podría ser útil identificar si las aberraciones en el plasma tienen como origen (i) solo la placenta, (ii) solo la madre o (iii) tanto la placenta como la madre. Para la detección del cáncer, podría ser informativo desde el punto de vista clínico identificar el tejido de origen del cáncer para procedimientos de diagnóstico o terapéuticos posteriores.

Normalmente se observan aberraciones de número de copias en diferentes tipos de cáncer. Las aberraciones de número de copias asociadas con el cáncer pueden detectarse en el plasma de pacientes con cáncer (Chan et al. Clin Chem. 2013; 59: 211-24). En el contexto de la detección del cáncer, puede no ser evidente el tejido de origen para la CNA. Por lo tanto, es útil poder identificar el tejido de origen de la CNA. La deconvolución de la metilación del ADN plasmático se puede usar para identificar el tejido de origen de la CNA plasmática.

La FIG. 29 es un diagrama de flujo que ilustra un método 2900 para determinar el tejido de origen para las aberraciones del número de copias de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El método 2900 puede realizarse utilizando el plasma de un paciente y se realiza al menos parcialmente utilizando un sistema informático.

En el bloque 2910, se lleva a cabo el análisis del ADN plasmático para identificar regiones que muestran aberraciones de número de copias. La aberración puede corresponder a una representación por exceso o por defecto. En algunas realizaciones, el genoma puede separarse en agrupaciones (por ejemplo, agrupaciones de 1 Mb) y puede determinarse la cantidad de moléculas de ADN libre de células de una agrupación particular (por ejemplo, mapeando lecturas de secuencia en dicha parte de un genoma de referencia). Puede normalizarse la cantidad para una agrupación particular (por ejemplo, respecto de una cantidad media para una agrupación) y puede identificarse una representación por exceso o por defecto.

Aparte de identificar regiones basándose en el análisis de CNA, una región puede seleccionarse sencillamente para su análisis en diversas realizaciones. Por ejemplo, puede sospecharse que una región tiene una CNA, por ejemplo, ya que ciertas regiones pueden tener comúnmente aberraciones en los tumores. Para aplicación fetal (descrita más adelante), ciertas regiones cromosómicas normalmente pueden tener aberraciones.

En el bloque 2915, no se identificaron regiones de CNA. El método 2900 puede detenerse en este punto, en algunas realizaciones.

En el bloque 2920, puede realizarse la deconvolución de la metilación, por ejemplo, como se describe en la FIG. 1. Puede realizarse la deconvolución de la metilación para cada una de las regiones de CNA. Por consiguiente, puede realizarse la deconvolución de la metilación específica de una región cromosómica.

En el bloque 2932, se obtienen contribuciones de tejido para regiones con ganancia de número de copias, como resultado de la deconvolución de la metilación. En el bloque 2934, se obtienen contribuciones de tejido para regiones sin CNA, como resultado de la deconvolución de la metilación. En el bloque 2936, se obtienen contribuciones de tejido para regiones con pérdida de número de copias, como resultado de la deconvolución de la metilación.

En el bloque 2940, pueden compararse las composiciones de tejido para diferentes regiones cromosómicas. Por ejemplo, pueden determinarse valores de separación para estas diversas contribuciones de tejido. Para dos regiones cualesquiera, puede determinarse un valor de separación para un tejido particular. Los valores de separación podrían ser entre una región con una ganancia de número de copias y una región sin CNA, entre una región con una ganancia de número de copias y una región con una pérdida de número de copias y entre una región con CNA y una región con una pérdida de número de copias.

En el bloque 2950, puede identificarse la identidad del tejido de origen basándose en la magnitud de los valores de separación para los tejidos. Un tejido con una gran contribución podría estar liberando moléculas de ADN libre de células con la aberración evaluada.

Para esta aplicación, es ventajoso tener marcadores de metilación que estén dispersos a lo largo del genoma. En este sentido, los marcadores de metilación de tipo II, debido a sus números relativamente grandes cuando se comparan con marcadores de tipo I, son especialmente útiles. Para ciertas realizaciones, pueden ajustarse adicionalmente los criterios de selección para los marcadores para aumentar adicionalmente el número de marcadores que pueden emplearse. En otras realizaciones más, pueden combinarse marcadores tanto de tipo I como de tipo II para aumentar adicionalmente el número de marcadores que pueden usarse.

B. Identificando regiones aberrantes

Puede llevarse el análisis de las CNA de diversos modos, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 8.741.811. Por ejemplo, el genoma humano (o el genoma para otro tipo de organismo) puede dividirse en aproximadamente 3000 agrupaciones de 1 Mb no superpuestas. Puede determinarse el número de lecturas que se mapean en cada agrupación de 1 Mb. Tras corregir respecto del sesgo de GC (Chen EZ, et al. (2011) PLoS One 6(7):e21791), puede calcularse la densidad de la lectura de secuencia de cada agrupación. Para cada agrupación, puede compararse la densidad de la lectura secuenciada del caso de ensayo con los valores de los sujetos de control de referencia. Las ganancias y pérdidas de número de copias pueden definirse como 3 desviaciones típicas por encima y por debajo, respectivamente, de la media de los controles. Por consiguiente, la identificación de que una primera región cromosómica muestra una aberración de número de copias puede basarse en una primera cantidad de moléculas de ADN libre de células que se ubican en la primera región cromosómica.

Para determinar el tejido de origen de las aberraciones de número de copias en el plasma, puede llevarse a cabo el mapeo en tejidos del ADN plasmático usando los marcadores de metilación ubicados en las regiones genómicas que muestran dichas aberraciones en el plasma. En los ejemplos más adelante para los pacientes con cáncer, se llevó a cabo el mapeo de las aberraciones de número de copias en el ADN plasmático únicamente en los casos con aberraciones que afectan a una región cromosómica contigua de al menos 30 Mb, de tal forma que puede usarse un número suficiente de marcadores de metilación para el mapeo.

C. Ejemplos para detectar el origen de la CNA

Deconvolución de la metilación para identificar el tejido de origen de las aberraciones de número de copias en el plasma. Por ejemplo, cuando se observa una ganancia de número de copias en plasma, la deconvolución de la metilación de los marcadores ubicados dentro de la región genómica afectada debería revelar una mayor contribución del tejido de origen de la aberración en comparación con el mismo análisis realizado en una región genómica sin aberración de número de copias. Por el contrario, cuando se observa una pérdida de número de copias en plasma, la deconvolución de la metilación de los marcadores ubicados dentro de la región genómica afectada debe revelar una disminución en la contribución del tejido de origen de la aberración. En las siguientes secciones, se ilustra el uso de este concepto en mujeres gestantes que portan fetos afectados de trisomía 21, en pacientes con HCC y en una mujer gestante que padecía linfoma. En estos ejemplos, no es necesario saber que las regiones identificadas tienen una CNA; y en ese caso, pueden usarse las técnicas para determinar si existe un desequilibrio de secuencia para la región evaluada.

1. Anomalías fetales

La FIG. 30A muestra una ilustración del análisis de la deconvolución de la metilación del ADN plasmático específico de cromosoma en una mujer gestante que porta una trisomía 21 de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Un feto con trisomía 21 podría liberar una cantidad aumentada de secuencias del cromosoma 21 que portan una firma de metilación placentaria en el plasma de su madre gestante. Por tanto, cuando se lleva a cabo la deconvolución de la metilación en los datos de secuenciación con bisulfito del plasma usando marcadores presentes en el cromosoma 21, se espera que la contribución placentaria (indicada como Mp¡lí[l¡!e1nta) aumente en comparación con la contribución placentaria estimada utilizando marcadores presentes en los otros cromosomas (indicados como

En esta ilustración, se asume que la fracción de ADN fetal en el plasma materno es del 20 %. Debido a la copia adicional del cromosoma 21 en el feto, la contribución del ADN de origen placentario podría aumentar en un 50 % cuando se lleva a cabo el análisis de deconvolución de la metilación basándose en los marcadores en el cromosoma 21 en comparación con el uso de marcadores en uno o más cromosomas de referencia.

Por consiguiente, las realizaciones pueden determinar una contribución fraccionaria utilizando moléculas de ADN libre de células del cromosoma 21 en el proceso de deconvolución de la metilación, dando como resultado una contribución fraccional del 30 % para el tejido placentario. También se lleva a cabo la deconvolución de la metilación usando moléculas de ADN libre de células de uno o más cromosomas de referencia, dando como resultado una contribución fraccional del 20 % para el tejido placentario. Pueden determinarse las diferencias en las contribuciones fraccionales para los diversos tejidos para detectar si el cromosoma 21 tiene un desequilibrio de secuencia (por ejemplo, una trisomía en este caso).

En este caso, se indica como AM la diferencia en la contribución al ADN plasmático de los diferentes órganos entre el cromosoma 21 y los uno o más cromosomas (indicados como Crom. Ref.).

AM = Mchr21 —MCromRef'

donde MChr21 es la contribución de un tejido al ADN plasmático basándose en marcadores en el cromosoma 21 y MCrom■ Ref es la contribución de un tejido al a Dn plasmático basándose en los cromosomas de referencia. Por lo tanto, AM es una serie de diferencias de contribución, correspondiendo cada una a un tejido diferente. Por tanto, las realizaciones pueden calcular:

A M = M Chr21 ^ C r o m . r e f '

LAm Placen ta m Placen ta m Placen ta ^■

Los otros valores de AM para cada uno de los otros tipos de tejido implicados en la deconvolución de la metilación se calcularían de una manera similar. Si la placenta es el origen del número de copias aumentado del cromosoma 21 en el plasma materno, se esperaría que el valor de AM para la placenta sea máximo cuando se compara con los de otros tipos de tejido.

Para ilustrar adicionalmente esta técnica, se analizó el plasma de 5 mujeres gestantes que portaban cada una un feto con trisomía 21. Las edades gestacionales variaron de 13 a 14 semanas. Se observó una representación aumentada del cromosoma 21 en el ADN plasmático de cada caso. Se llevó a cabo deconvolución de la metilación en los datos de secuenciación y se calcularon los valores de AM para múltiples tipos de tejido.

La FIG. 30B es un diagrama 3050 que muestra los valores de separación AM del cromosoma 21 en diferentes tejidos para mujeres gestantes, cada una de las cuales porta un feto con trisomía 21 (T21) de acuerdo con realizaciones de la presente invención. En cada uno de los cinco casos, el valor de AM fue el más elevado para la placenta, lo que sugiere que las aberraciones del número de copias se originaron en la placenta. Asimismo, en caso de no haberse identificado previamente una CNA para el cromosoma 21, el alto valor de AM para el tejido placentario indica que había una aberración en el cromosoma 21 para el tejido placentario.

La FIG. 31 es un diagrama 3050 que muestra los valores de separación AM de otros cromosomas en diferentes tejidos para mujeres gestantes, cada una de las cuales porta un feto con trisomía 21 (T21) de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Los marcadores de mutilación en todos los autosomas excepto el cromosoma 21 se dividieron aleatoriamente en dos conjuntos, concretamente, el conjunto A y el conjunto B. La aleatorización se implementó utilizando una serie de números aleatorios (en el intervalo de 0 a 1) generados por un ordenador. Un marcador asociado con un número aleatorio inferior a 0,5 se asignó al conjunto A, de lo contrario, se asignó al conjunto B. En este análisis, el conjunto A incluyó marcadores procedentes de los cromosomas 1, 2, 4, 5, 6, 8, 12, 14, 15, 17, 22 y el conjunto B incluyó marcadores procedentes de los cromosomas 3, 7, 9, 10, 11, 13, 16, 18, 19 y 20. El mapeo en tejidos de ADN plasmático se llevó a cabo usando cada conjunto de marcadores. Los valores de a M mostrados representan la diferencia en las contribuciones de un tejido particular al ADN plasmático usando marcadores en los conjuntos A y B. Como se puede observar, ningún tejido individual mostró de manera consistente un valor de AM elevado.

El análisis de deconvolución de la metilación del ADN plasmático también puede ser útil para determinar si una CNA tiene como origen la madre o el feto, por ejemplo, en las pruebas prenatales no invasivas de microeliminación o microduplicación utilizando análisis de ADN en plasma materno. Recientemente, se ha demostrado que la microeliminación o la microduplicación en un feto puede detectarse usando análisis del ADN plasmático materno (Yu et al. PLoS One 2013; 8: e60968). Sin embargo, cuando se detecta una microeliminación o microduplicación en el ADN plasmático materno, la aberración puede proceder de la madre, del feto o de ambos. El análisis de deconvolución de la metilación puede usarse para resolver esta cuestión.

Considerando el escenario en que una mujer gestante es normal y porta una microduplicación, en caso de llevar a cabo una deconvolución de la metilación específica del cromosoma en la región duplicada y otras regiones normales para el ADN plasmático materno, el valor de AM podría ser el más positivo para la placenta, lo que indica que se libera una dosis adicional de ADN placentario en el plasma en la región duplicada. Por otro lado, para el escenario donde la madre es portadora de la microduplicación y el feto es normal, la contribución del ADN placentario al plasma materno estaría relativamente reducida en la región duplicada, debido a que los tejidos maternos tendrían una mayor contribución al ADN plasmático, en comparación con el feto en la región duplicada. Si tanto la madre como el feto son portadores de la microduplicación, la contribución proporcional de la madre y el feto no serían diferentes en las regiones cromosómicas afectadas y no afectadas. Lo contrario sería cierto para los escenarios que implican microeliminación. En la tabla a continuación se muestran los cambios de AM esperados en diferentes escenarios.

Tabla 3. Valores de AM esperados para escenarios con diferentes cambios de número de copias en una mujer estante su feto.

En ciertas realizaciones, el feto o la madre o ambos portan más de una aberración de número de copias para diferentes regiones. Como ejemplo, el feto puede portar una microduplicación, así como una microeliminación para diferentes regiones.

2. Carcinoma hepatocelular (HCC)

También pueden usarse algunas realizaciones para determinar un origen de una CNA resultante de un tumor. En pacientes en los que el sitio del tumor no es evidente en el momento de la presentación, el análisis de deconvolución de la metilación de las CNA del ADN plasmático sería útil para la identificación del origen del cáncer.

La FIG. 32A es una ilustración del análisis de las regiones CNA en el ADN plasmático de pacientes con cáncer de acuerdo con realizaciones de la presente invención. En pacientes con cáncer, puede esperarse que las regiones genómicas en las que hay un número de copias aumentado (es decir, amplificaciones) estén enriquecidas en ADN liberado de los tejidos de origen de los cánceres respectivos. Por lo tanto, podría observarse un aumento en las contribuciones proporcionales de los tejidos de origen del cáncer en plasma (indicado como M ^ f d0). Por el contrario, puede esperarse que las regiones genómicas en las que hay un número de copias reducido (es decir, eliminaciones) estén empobrecidas en ADN liberado de los tejidos de los cánceres respectivos. Por tanto, podría observarse una disminución en las contribuciones proporcionales de los tejidos de origen del cáncer en plasma (indicado como m T e j id o ) .

De manera similar al ejemplo anterior de trisomía 21, se puede definir un valor de AM usando la siguiente ecuación, donde,

A A _M M _{T ejid o} — _{— l}M_vITA _em_jip_{d o}— _lM_VITE _eli _jm_{ld o} .

Para los tejidos que no eran los tejidos de origen del cáncer, no habría ningún efecto sistemático por las aberraciones del número de copias (es decir, amplificaciones o eliminaciones) en sus contribuciones proporcionales al plasma. Por tanto, en dicho análisis, el valor de Am podría ser el más elevado para los tejidos de origen del cáncer, en comparación con los de los demás tipos de tejido.

En otras realizaciones, puede calcularse el AM comparando las regiones genómicas que muestran amplificación y regiones que muestran un número de copias normal. En otras realizaciones más, puede calcularse el AM comparando las regiones genómicas que muestran eliminación y regiones que muestran un número de copias normales.

A modo de ejemplo, se analizó el ADN plasmático de siete pacientes con HCC, un paciente con cáncer de pulmón y un paciente de cáncer colorrectal. Se detectaron CNA en el plasma de estos nueve pacientes. Para determinar el tejido de origen de estas CNA detectadas en plasma, se llevó a cabo deconvolución de la metilación para regiones cromosómicas que muestran ganancias en el número de copias y pérdidas en el número de copias. Entre las muestras de HCC, cáncer de pulmón y cáncer colorrectal estudiadas anteriormente, se observaron aberraciones de número de copias que afectaban a una región de al menos 30 Mb (es decir, ~1 % del genoma humano) en el plasma de 7 pacientes de HCC, 1 de cáncer de pulmón y 1 de cáncer colorrectal.

Se determinaron por separado las contribuciones proporcionales de cada tipo de tejido en el plasma basándose en las regiones genómicas que muestran amplificaciones y eliminaciones. Se calcularon las diferencias en las contribuciones para cada tipo de tejido entre los dos conjuntos de regiones genómicas y se indican como AM, donde AM es una matriz de las diferencias para los tipos te tejidos. Por lo tanto,

A M = MAmp —MElim

donde MAmp es una matriz que representa las contribuciones de tejidos basándose en marcadores ubicados en regiones genómicas que muestran ganancias de número de copias; y MElim es una matriz que representa las contribuciones de tejidos basándose en marcadores ubicados en regiones genómicas que muestran pérdidas de número de copias.

La FIG. 32B es un diagrama 3250 que muestra valores de separación AM entre regiones que muestran ganancias en el número de copias y pérdidas en el número de copias en diferentes tejidos para los pacientes con cáncer de acuerdo con realizaciones de la presente invención. En este ejemplo, los valores de AM entre los diferentes tejidos para los pacientes con cáncer. a M representa la diferencia en las contribuciones de un tejido particular al ADN plasmático entre regiones que muestran ganancias en el número de copias y pérdidas en el número de copias.

Para cada caso, el AM más elevado se muestra en amarillo, azul o verde. Los otros valores de AM se muestran en gris. El tejido con el AM más elevado se considera el tejido de origen de la aberración de número de copias. La diferencia en la contribución al ADN plasmático entre regiones con ganancias de número de copias y pérdidas de número de copias (AM) fue máxima para el hígado, pulmón y colon para los siete pacientes con h Cc , el paciente con cáncer de pulmón y el paciente con cáncer colorrectal, respectivamente. Por lo tanto, el análisis de deconvolución de la metilación indicó correctamente el tejido de origen para las CNA en las muestras de plasma.

La FIG. 33 es un diagrama 3300 que muestra los valores de separación AM entre las regiones genómicas elegidas al azar en diferentes tejidos para los pacientes con cáncer de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Como control, también se llevó a cabo el mismo análisis usando dos conjuntos de regiones genómicas elegidas aleatoriamente que no mostraban aberraciones de número de copias en el plasma. Los valores de AM mostrados representan la diferencia en las contribuciones de un tejido particular al ADN plasmático entre dos conjunto de regiones seleccionadas aleatoriamente son aberraciones de número de copias en el ADN plasmático. Como puede observarse en la FIG. 33, para este análisis de control, no existe una relación sistemática entre los valores de AM y el tejido de origen del cáncer.

3. Mujer gestante con linfoma

Además de las aberraciones de número de copias, también puede usarse deconvolución de la metilación para determinar el tejido de origen de otros tipos de aberraciones genómicas, por ejemplo, pero sin limitación, mutaciones y traslocaciones de un solo nucleótido. Puede determinarse el estado de metilación de las regiones próximas a las aberraciones genómicas y compararse con el estado de metilación de las regiones no afectadas. Se espera que el tejido de origen para las aberraciones genómicas muestre una mayor contribución al ADN plasmático en la región afectada.

La FIG. 34A muestra una ilustración del análisis de la deconvolución de la metilación para la mujer gestante con un linfoma concurrente de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La FIG. 38 muestra una región con ganancia de número de copias y una región sin ganancia de número de copias. Para confirmar el tejido de origen de las aberraciones de número de copias en el plasma, puede llevarse a cabo deconvolución de la mutilación plasmática por separado usando marcadores presentes en las regiones genómicas que muestran amplificaciones en el plasma (indicadas como ) y regiones que muestran números de copias normales (indicadas como M "e“™0aí):

La FIG. 34A muestra un diagrama de las contribuciones fraccionales para linfocitos B, placenta y otros tejidos. Como el tejido de origen de las CNA es el linfoma folicular, el tipo de tejido (linfocitos B) del que surgió el linfoma daría el valor más alto de AM.

Para ilustrar aún más la utilidad de las realizaciones, se analizó el ADN plasmático de una mujer gestante a la que se le diagnosticó un linfoma folicular recurrente durante el embarazo temprano. Esta mujer tenía antecedentes de linfoma folicular y recibió quimioterapia con intención curativa. Se quedó embarazada posteriormente, cuando su linfoma se encontraba en remisión clínica. Durante la 11a semana de gestación, se extrajo una muestra de sangre de la mujer gestante para la evaluación prenatal no invasiva de aneuploidías cromosómicas fetales. Los resultados de la secuenciación del ADN del plasma materno revelaron anomalías evidentes. Se confirmó la recurrencia del linfoma folicular mediante examen histológico de biopsias de ganglios linfáticos y médula ósea.

La FIG. 34B es una gráfica 3450 que muestra el análisis de secuenciación del ADN de todo el genoma para la detección de la aberración del número de copias entre las muestras tomadas de la mujer gestante a la que se le diagnosticó un linfoma folicular recurrente durante el embarazo temprano. La gráfica 3450 muestra el análisis de número de copias de todo el genoma en capa leucocitaria, biopsia de ganglio linfático, plasma antes del tratamiento, así como una muestra de plasma recogida 10 semanas después de iniciarse la quimioterapia. Del interior al exterior: capa leucocitaria de la muestra de plasma antes del tratamiento, biopsia de ganglio linfático, muestra de plasma recogida antes del tratamiento y muestra de plasma recogida después del tratamiento. El ideograma del cromosoma se muestra en sentido horario en el anillo más externo. Cada punto representa una región de 1 Mb. Los puntos verdes, rojos y grises representan regiones con ganancias de número de copias, pérdidas de número de copias y sin aberraciones de número de copias, respectivamente. Los números de copias están dispuestos en orden ascendente del centro hacia el exterior. Los puntos más próximos al centro en comparación con las demás regiones cromosómicas indican una pérdida de número de copias. Los puntos desviados adicionalmente respecto del centro en comparación con las demás regiones cromosómicas indican una ganancia de número de copias.

Se detectaron aberraciones de número de copias en la biopsia de ganglio linfático y la muestra de plasma antes del tratamiento, pero no en la muestra de plasma después del tratamiento y la capa leucocitaria de la muestra de plasma antes del tratamiento. Hubo una alta similitud entre los perfiles de aberraciones de número de copias del linfoma y los del plasma antes del tratamiento. La presencia de aberraciones en el número de copias en la porción de plasma antes del tratamiento, pero la ausencia de dichas aberraciones en la porción de células sanguíneas de la misma muestra de sangre, sugieren que las anomalías del ADN plasmático procedían del ADN libre de células asociado con el linfoma en lugar de las células tumorales circulantes.

La secuenciación con bisulfito por todo el genoma seguida de deconvolución de la metilación se llevó a cabo en la muestra de plasma antes del tratamiento. En este paciente, ninguna de las regiones contiguas que exhibieron pérdidas en el número de copias en plasma tenía un tamaño de 30 Mb o más. Como resultado, el número de marcadores de metilación ubicados dentro de las regiones eliminadas fue insuficiente para el análisis de mapeo en tejidos. Por lo tanto, se usaron como referencia las regiones que no mostraron aberraciones de número de copias.

La FIG. 35A es una tabla 3500 que muestra las contribuciones fraccionales determinadas a partir del mapeo en tejidos de ADN plasmático en la muestra de plasma antes del tratamiento para la mujer gestante con linfoma folicular recurrente. La contribución proporcional del ADN plasmático de los linfocitos fue del 70,2 %. La contribución del ADN plasmático de los linfocitos B fue del 62,2 % y los linfocitos T contribuyeron el 8 %.

La FIG. 35B es un diagrama 3550 que muestra los valores de separación AM para diferentes tejidos de la mujer gestante con linfoma folicular concurrente. Se muestran valores de AM en diferentes tejidos para la muestra de plasma antes del tratamiento de este paciente. Los linfocitos B muestran el valor de AM más elevado, lo que sugiere que las aberraciones del número de copias procedían de los linfocitos B. Las células de linfoma folicular proceden de los linfocitos B. Como puede observarse, los linfocitos B muestran el valor de AM más elevado, confirmando de este modo que son el origen de las aberraciones de número de copias en plasma.

4. Lesiones metastásicas en pacientes con cáncer

La deconvolución de la metilación de estas aberraciones genómicas puede ser particularmente útil para los escenarios clínicos donde no está claro si un tumor es un cáncer primario del órgano afectado o una lesión metastásica procedente de un cáncer de otro órgano. Como se ilustró anteriormente, la participación de un órgano por un tumor conduciría a una alteración en la contribución del órgano afectado al plasma. Además, el análisis de las CNA del ADN plasmático mediante deconvolución de la metilación es útil para identificar el tejido de origen del cáncer primario. La combinación de estos dos tipos de análisis puede ser útil para determinar si una lesión metastásica está presente.

Para ilustrar esto, a continuación se analizan tres ejemplos hipotéticos:

i. un paciente con HCC (un cáncer hepático primario);

ii. un paciente con un cáncer colorrectal primario son metástasis en el hígado; y

iii. un paciente con un cáncer colorrectal primario con metástasis en el hígado.

Tabla 4. Resultados esperados para el análisis de deconvolución de la metilación del ADN plasmático para los tres acientes hi otéticos.

Para el paciente con HCC, la presencia de tumor en el hígado podría ocasionar una contribución aumentada del hígado al ADN plasmático. Además, ya que el cáncer procede de las células hepáticas, el tejido de origen de las CNA asociadas con el cáncer será el hígado. Para el paciente colorrectal sin metástasis en el hígado, ya que el hígado no está implicado, se espera que la contribución del hígado al ADN plasmático sea normal; y la deconvolución de la metilación indica que el tumor procede del colon. Para el paciente con cáncer colorrectal con metástasis en el hígado, la invasión del hígado por parte de las células tumorales ocasionaría un aumento en la liberación de ADN hepático en el plasma. Ya que el cáncer procede del colon, el análisis de las CNA podría indicar que las aberraciones tienen como origen el colon.

Como ejemplo, un paciente presenta una masa hepática en el estudio por ecografía. En la investigación clínica posterior, se observa que el paciente tiene un cáncer colorrectal que metastatiza al hígado. La deconvolución de la metilación se lleva a cabo en el plasma. La tabla 5 muestra que este paciente muestra una contribución aumentada del colon al ADN plasmático.

Tejido Contribución (%)

Hígado 2,5

Pulmón 6,2

Colon 20,0

Intestino delgado 0,0

Páncreas 0,0

Glándulas suprarrenales 0,0

Esófago 0,4

Tejidos adiposos 4,7

Corazón 0,0

Cerebro 0,0

Linfocitos T 3,4

Linfocitos B 14,2

Neutrófilos 48,5

La FIG. 36A es una gráfica 3600 que muestra el análisis de aberración del número de copias en el ADN plasmático de un paciente con cáncer colorrectal que metastatiza al hígado de acuerdo con las realizaciones de la presente invención. Cada punto representa una región de 1 Mb. Los resultados se expresan como el número de desviaciones típicas a partir de la representación genómica media del ADN plasmático para un grupo de 32 sujetos de control sanos. Los puntos grises que se encuentran entre las dos líneas negras indican que no había desviación en la representación del ADN plasmático respecto de la media de los sujetos sanos. Los puntos oscuros que se encuentran dentro y fuera de las regiones entre las dos líneas negras indican que estas regiones estaban representadas por defecto y por exceso, respectivamente, en el ADN plasmático del paciente. Después, se analizaron las regiones con representación por exceso y por defecto en el ADN plasmático usando análisis de deconvolución para determinar el tejido de origen de las aberraciones.

La FIG. 36B es un diagrama 36B que muestra el análisis de deconvolución de metilación de las aberraciones del número de copias del ADN plasmático para el paciente con cáncer colorrectal y metástasis hepática de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El análisis indica que la diferencia entre las regiones amplificadas y eliminadas (AM) fue mayor para el colon, lo que sugiere que las aberraciones probablemente procedían del colon. Por lo tanto, las realizaciones fueron capaces de identificar el cáncer primario que dio como resultado la masa hepática.

5. Mosaicismo somático

El mosaicismo somático describe la presencia de células con diferentes constituciones genéticas en ciertos tejidos del organismo. Esto surge a partir de errores que se producen durante la segregación de los cromosomas o la replicación del ADN, lo que ocasiona una variedad de aberraciones genómicas, tales como aneuploidía de cromosomas, variaciones de número de copias (CNV), reordenamientos genéticos, variaciones de un solo nucleótido o expansiones repetidas e inestabilidades de microsatélites (Lupski. Science 2013; 341: 358-9).

Pueden usarse las realizaciones de deconvolución del ADN plasmático para identificar el tejido afectado por el mosaicismo somático. El ADN plasmático se analizaría en primer lugar para caracterizar la aberración genómica, por ejemplo, una CNA. Posteriormente, puede llevarse a cabo la deconvolución de la metilación usando marcadores de metilación en la región afectada y otra región no afectada. Al comparar las composiciones de ADN plasmático de estos dos conjuntos de regiones, puede determinarse el AM. Posteriormente, puede identificarse el tejido afectado por el mosaicismo somático mediante tejidos que tienen valores de separación significativos (por ejemplo, valores de AM).

6. Detección y monitorización de diversas patologías

Puede usarse la deconvolución de la metilación del ADN plasmático para la detección y monitorización de diversas patologías, por ejemplo, pero sin limitación, ictus, infarto de miocardio, enfermedades autoinmunitarias e infecciones. Por ejemplo, se ingresa a un paciente por pérdida de consciencia y se sospecha un diagnóstico clínico de ictus. Puede ser útil la elevación de la contribución del cerebro para indicar la presencia de un daño significativo en el cerebro. La elevación de la contribución del cerebro al ADN plasmático puede determinarse comparando los resultados del paciente con los de sujetos de control sanos. También pueden usarse los niveles de elevación de la contribución para indicar el pronóstico del paciente.

De manera similar, para pacientes que se sospecha que tienen infarto de miocardio u otras enfermedades cardíacas debido a los síntomas clínicos, puede usarse la contribución del corazón para indicar el diagnóstico o para predecir el pronóstico del paciente. Pueden determinarse los valores de corte usando los valores de la contribución del corazón al ADN plasmático en un grupo de sujetos de control sanos.

En una realización, un valor de corte puede ser un percentil concreto de la contribución del cerebro de los sujetos de control sanos, por ejemplo, el percentil 90o, 95o o 99o. En otra realización, puede establecerse un valor de corte como 2 DT, 2,5 DT, 3 DT o 3,5 DT por encima del valor medio de los sujetos de control.

La deconvolución de la metilación del ADN plasmático también se puede aplicar para identificar la fuente de infección en pacientes con septicemia de origen desconocido. Se espera que el tejido infectado libere más ADN en el plasma debido al aumento del daño celular.

7. Sumario

Como se ha detallado anteriormente, se han validado realizaciones para la detección de la contribución plasmática de (i) la placenta usando mujeres gestantes, (ii) el hígado usando pacientes con HCC y sujetos después de un trasplante hepático, (iii) glóbulos blancos usando receptores de trasplante de médula ósea y el caso de linfoma diagnosticado durante el embarazo, (iv) los pulmones a partir de los casos de cáncer de pulmón y (v) el colon del caso de cáncer colorrectal. Ya que el ADN plasmático generalmente se ha considerado un marcador de la muerte celular, puede usarse el presente enfoque como un método general para evaluar fenómenos de muerte celular en diferentes tipos de tejido. Por tanto, además de aplicaciones en pruebas prenatales, detección/monitorización del cáncer y monitorización de trasplantes, las realizaciones también pueden tener aplicaciones en muchas ramas de la medicina para estudiar la muerte celular o la lesión de diversos tejidos corporales, por ejemplo, ictus, infarto de miocardio, traumatismo, trastornos autoinmunitarios, enfermedades infecciosas, etc.

Además, los datos demuestran que las alteraciones características de la composición de tejido del grupo de ADN plasmático podría observarse de acuerdo con el estado fisiológico o la patología subyacente del paciente. La capacidad para identificar el tejido de origen de las aberraciones de número de copias que puede observarse en el plasma tiene numerosas aplicaciones clínicas potenciales. Por ejemplo, para el uso de secuenciación de ADN plasmático para exploraciones de cáncer, las realizaciones pueden identificar el tejido de origen probable del cáncer, para planear investigaciones diagnósticas adicionales o procedimientos terapéuticos. Como otro ejemplo, las realizaciones serían muy útiles para pruebas prenatales no invasivas. Usando la detección de la trisomía 2 l como un sistema modelo, se ha demostrado que se puede identificar la placenta como el tejido de origen de la cantidad en exceso de cromosoma 21 en el plasma materno.

Las aplicaciones para detección del cáncer y las pruebas prenatales no invasivas convergen en el caso de la mujer embarazada que padecía linfoma folicular. Se observaron aberraciones de número de copias en el plasma de esta mujer gestante (FIG. 34A). La deconvolución de la mutilación plasmática reveló una contribución muy elevada de los linfocitos en el plasma. Los linfocitos B son el tipo de célula implicada en la patología del linfoma folicular. Por lo tanto, fue interesante que las realizaciones identificaron los linfocitos B (62,2 %, FIG. 35A), en lugar de linfocitos T, como el principal contribuyente de ADN plasmático en el paciente.

El análisis de AM que compara los resultados de deconvolución de la metilación obtenidos usando marcadores de metilación que proceden de regiones genómicas que muestran aberraciones de aumento de número de copias frente a aquellas que muestran números de copias normales confirmaron que los linfocitos B eran la fuente de las aberraciones de número de copias (FIG. 35B). Por lo tanto, estos resultados son totalmente consistentes con el diagnóstico de linfoma folicular. Con el aumento en la utilidad clínica de las pruebas prenatales no invasivas y la tendencia al alza en la edad de maternidad, es probable que se detecten más casos de neoplasias malignas durante el transcurso de dichas pruebas (Osborne CM, et al. (2013) Prenat Diagn 33(6):609-611; Vandenberghe P, et al. (2015) Lancet Haematol 2:e55-e65). Por lo tanto, las realizaciones descritas en el presente documento serían muy útiles en la investigación adicional de dichos casos.

En algunas realizaciones, la selección de marcadores de metilación que podría usarse para el proceso de deconvolución podría refinarse adicionalmente. En una variación, puede ajustarse el conjunto de marcadores para centrarse más en los tipos de tejido que son los contribuyentes menos prominentes al grupo de ADN plasmático. Esto puede desvelar nuevos estados fisiopatológicos que pueden monitorizarse usando las realizaciones.

Además del uso de marcadores de metilación de ADN, las realizaciones también pueden investigar la contribución de tejidos hacia el grupo de ácidos nucleicos circulantes mediante el estudio del ARNm (Ng EKO, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:4748-4753; Tsui NBY, et al. (2014) Clin Chem 60(7):954-962; Koh W, et al. (2014) Proc Natl Acad Sci U S A 111(20):7361-7366) y microARN (Chim SSC, et al. (2008) Clin Chem 54(3):482-490; Wang K, et al. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106(11):4402-4407). Las estrategias de metilación del ADN y transcriptómicas pueden ser sinérgicas entre sí y podrían dar diferentes tipos de información.

En los ejemplos anteriores, se prepararon bibliotecas de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante (Illumina) y se secuenciaron en un sistema HiSeq o NextSeq (Illumina). Para HiSeq, se llevaron a cabo 76 (modo de un solo extremo) o 76 x 2 (modo de extremos emparejados) ciclos de secuenciación con el kit TruSeq SBS v3 (Illumina). Para NextSeq, se llevaron a cabo 76 x 2 ciclos de secuenciación de extremos emparejados usando el kit NextSeq 500 High Ouput v2 (Illumina). Después de las llamadas de bases, se retiraron las secuencias adaptadoras y las bases de baja calidad (es decir, con una puntuación de calidad < 5). Después, se procesaron las lecturas recortadas en formato FASTQ mediante la estructura de análisis de datos de metilación Methy-Pipe. Los parámetros de secuenciación básicos, incluyendo la profundidad de secuenciación, de todas las muestras se resumen en la tabla 3700 de las FIG. 37 y 38.

D. Método para determinar desequilibrio de secuencia

La FIG. 39 es un diagrama de flujo que ilustra un método 3900 para analizar una muestra biológica de un organismo para determinar si una región cromosómica muestra un desequilibrio de secuencia utilizando deconvolución de la metilación de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La muestra biológica incluye una mezcla de moléculas de ADN libre de células de una pluralidad de tipos de tejidos, incluyendo un primer tipo de tejido. El método 3900 se lleva a cabo, al menos parcialmente, usando un sistema informático.

En el bloque 3910, se analiza una pluralidad de moléculas de ADN libre de células de la muestra biológica. El bloque 3910 puede llevarse a cabo de un modo similar al bloque 140 del método 100 de la FIG. 1.

Se analizan al menos 1.000 moléculas de ADN libre de células para determinar dónde se ubican las moléculas de ADN libre de células y pueden medirse los niveles de metilación como se describe a continuación.

En el bloque 3920, se identifica un primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células. Se ubica cada una de las moléculas de ADN del primer conjunto en uno cualquiera de los N sitios genómicos de una primera región cromosómica del genoma de referencia correspondiente al organismo. Por ejemplo, puede ubicarse una molécula de ADN en (por ejemplo, tener una lectura de secuencia alineada con) un primero de los N sitios genómicos y puede ubicarse una segunda molécula de ADN en un segundo de los N sitios genómicos. Ambas moléculas de ADN podrían incluirse en el primer conjunto.

Los N sitios genómicos pueden identificarse de varias maneras y usando varios criterios. Pueden usarse las técnicas descritas en la sección II. Los N sitios genómicos pueden cumplir ciertos criterios, tales como los niveles de metilación entre tejidos y entre individuos. Los sitios genómicos pueden identificarse basándose en datos de otras muestras, por ejemplo, análisis de metilación de bases de datos. N es un número entero, que puede ser mayor o igual a 10.

Los N sitios genómicos pueden encontrarse en la primera región cromosómica, que puede ser contigua o estar compuesta de regiones no contiguas. Puede seleccionarse la primera región cromosómica basándose en un análisis de CNA, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, puede identificarse que una región tiene una representación por exceso o una representación por defecto de moléculas de ADN en relación con otras regiones, donde el análisis puede usar potencialmente la misma muestra biológica usada para el análisis de mutilación. La representación por exceso o por defecto sugiere una aberración de número de copias y el análisis de la metilación más adelante puede determinar qué tejido es un origen de la CNA.

En el bloque 3930, se miden los N primeros niveles de metilación en los N sitios genómicos usando el primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células. Puede medirse un primer nivel de metilación de mezcla para cada uno de los N sitios genómicos. El bloque 3930 puede llevarse a cabo de un modo similar al bloque 150 del método 100 de la FIG. 1. Por lo tanto, puede usarse cualquier técnica para medir un nivel de metilación de una molécula de ADN. En algunas realizaciones, la medición del nivel de metilación de una molécula de ADN puede usar resultados de secuenciación sensible a la metilación, que también pueden usarse para determinar la ubicación de la molécula de ADN.

En el bloque 3940, se determina una primera aportación fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla usando los N primeros niveles de metilación. En algunas realizaciones, el bloque 3940 puede llevarse a cabo mediante los bloques 160 y 170 del método 100 de la FIG. 1. Por lo tanto, puede determinarse simultáneamente una contribución fraccional para un panel de M tipos de tejido.

El bloque 3940 puede usar N niveles de metilación específicos de tejido en N sitios genómicos, determinados para cada uno de M tipos de tejido, por ejemplo, como en el bloque 120 del método 100 de la FIG. 1. En algunas realizaciones, los N niveles de metilación específicos de tejido pueden ser simplemente para el primer tipo de tejido y de manera colectiva para todos los demás tipos de tejido. Por lo tanto, M puede ser efectivamente tan solo 2. En caso de que el primer tipo de tejido es el único tipo de tejido de interés, dicha generalización no pierde información alguna. El valor colectivo para los otros tipos de tejido pueden generarse a partir de los valores separados para cada uno de los otros tipos de tejido.

En el bloque 3950, se identifica un segundo conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN sin células. Se ubica cada una de las moléculas de ADN del segundo conjunto en uno cualquiera de los K sitios genómicos de una segunda región cromosómica del genoma de referencia correspondiente al organismo. La segunda región cromosómica es diferente de la primera región cromosómica (por ejemplo, diferentes cromosomas) y por lo tanto, los K sitios genómicos son diferentes de los N sitios genómicos. K es un número entero, que puede ser mayor o igual a 10. Los valores de K y N también pueden ser diferentes y por lo tanto, K puede no ser igual a N. El bloque 3950 puede llevarse a cabo de un modo similar al del bloque 3920.

La segunda región cromosómica puede identificarse como una región que no muestra aberración alguna. La identificación puede estar basada en una medición de una muestra del organismo, por ejemplo, de un modo similar a la primera región a la primera región cromosómica que se identificó, pero sin mostrar cualquier representación por exceso o por defecto. En otras realizaciones, puede identificarse que la segunda región cromosómica tiene una aberración opuesta a la de la primera región cromosómica, donde puede suponerse que las aberraciones provienen del mismo tipo de tejido.

En otras realizaciones más, puede identificarse la segunda región cromosómica basándose en las ubicaciones típicas de las aberraciones o la ausencia de las mismas. Para el ejemplo de un feto, es más común que las aneuploidías se produzcan para los cromosomas 13, 18 y 21, pero son relativamente infrecuentes para los demás cromosomas. Por lo tanto, puede usarse uno o más de los demás cromosomas como la segunda región cromosómica. La segunda región cromosómica puede ser contigua o estar compuesta de subregiones no contiguas.

En el bloque 3960, se miden los K segundos niveles de metilación en los K sitios genómicos usando el segundo conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células. Puede medirse un segundo nivel de metilación de mezcla para cada uno de los K sitios genómicos. El bloque 3960 puede llevarse a cabo de un modo similar al del bloque 3930.

En el bloque 3970, se determina una segunda aportación fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla usando los K segundos niveles de metilación. El bloque 3970 puede llevarse a cabo de un modo similar al del bloque 3940.

En el bloque 3980, se calcula un primer valor de separación entre la primera contribución fraccional y la segunda contribución fraccional. A modo de ejemplo, un valor de separación puede incluir una diferencia o una relación de la primera contribución fraccional y la segunda contribución fraccional. El valor de separación puede incluir otros factores, por ejemplo, factores multiplicativos. Como otros ejemplo, puede usarse una diferencia de funciones de las contribuciones fraccionales, por ejemplo, una diferencia de los logaritmos naturales (ln) de las contribuciones fraccionales.

En el bloque 3990, se compara el primer valor de separación con un valor umbral para determinar una clasificación de si el primer tipo de tejido tiene un desequilibrio de secuencia para la primera región cromosómica. La clasificación puede ser que el primer tipo de tejido tiene un desequilibrio de secuencia para la primera región cromosómica cuando el valor de separación supera el valor umbral. Como se ha descrito en las secciones anteriores, un gran valor de separación indica que existe un desequilibrio de secuencia (por ejemplo, una aberración de número de copias) para el primer tipo de tejido. Como ejemplo, en caso de que la primera contribución fraccional sea mayor que la segunda contribución fraccional por el valor umbral, puede determinarse que la primera región cromosómica muestra una amplificación en el primer tipo de tejido. En caso de que la primera contribución fraccional sea menor que la segunda contribución fraccional por el valor umbral, puede determinarse que la primera región cromosómica muestra una eliminación en el primer tipo de tejido.

En un ejemplo, el organismo está gestando un feto y el primer tipo de tejido es tejido placentario, como para la sección V. C.1. Por lo tanto, el método puede detectar si el feto tiene una aneuploidía en la primera región cromosómica. En otro ejemplo, el primer tipo de tejido puede no ser tejido placentario, incluso cuando el organismo es gestante. Dicha prueba puede determinar si otros tejidos tienen un desequilibrio de secuencia, por ejemplo, como en la sección V.C.3.

Como se ha mencionado anteriormente, puede identificarse que la primera región cromosómica muestra una aberración de número de copias basándose en una cantidad de moléculas de ADN libre de células que están ubicadas en la primera región cromosómica. Una representación por exceso o por defecto de la cantidad relativa a otra región (por ejemplo, por al menos un umbral) puede indicar una aberración de número de copias. A modo de ejemplo, la cantidad de moléculas de ADN libre de células que están ubicadas en la primera región cromosómica puede ser un recuento en bruto de moléculas de ADN libre de células, una longitud acumulada de moléculas de ADN libre de células y una densidad, que pueden determinarse como recuento por unidad de longitud de la región.

Una vez que se identifica una región para su evaluación, pueden determinarse los valores de separación para los M tipos de tejidos. Por lo tanto, para cada una de las regiones cromosómicas primera y segunda, pueden determinarse M contribuciones fraccionales para cada uno de los M tipos de tejidos. Puede compararse cada uno de los valores de separación con un umbral para determinar si un tipo de tejido es un origen. Los valores de separación pueden indicar que más de un tipo de tejido muestra el desequilibrio de secuencia, como en V.C.4. En una realización, el valor de separación más elevado puede identificarse como el cáncer primario.

En caso de que se identifique que el organismo tiene un desequilibrio de secuencia para la primera región cromosómica en un tejido concreto (por ejemplo, no tejido placentario), puede clasificarse que el organismo tiene un cierto nivel de cáncer para el tejido concreto. Puede determinarse el nivel de cáncer basándose en el alcance del valor de separación. El nivel de cáncer puede determinarse adicionalmente basándose en un nivel de representación por exceso o de representación por defecto para la primera región cromosómica, así como el número de regiones cromosómicas que muestran una aberración.

En algunas realizaciones, puede evaluarse un desequilibrio de secuencia en múltiples regiones en el primer tipo de tejido. En caso de que diversas regiones (por ejemplo, más de un valor de corte) muestren un desequilibrio de secuencia para el primer tipo de tejido, la identificación del primer tipo de tejido como origen puede tener una mayor precisión estadística. Asimismo, en caso de que se evalúen diversas regiones, puede reducirse el umbral para determinar un desequilibrio de secuencia, usándose un valor de corte de un número de regiones que tienen un desequilibrio de secuencia para mejorar la especificidad. Por lo tanto, la clasificación de si el primer tipo de tejido tiene el desequilibrio de secuencia para la primera región cromosómica puede basarse en el número de las diferentes regiones cromosómicas que tienen un valor de separación correspondiente que supera el valor umbral. De esta manera, puede aumentarse la sensibilidad identificando regiones que tienen un valor de separación pequeño (que de otro modo puede no haberse detectado). El valor umbral puede ser dependiente del valor de corte, con un valor umbral menor para un valor de corte superior y viceversa.

Una vez que se ha diagnosticado a un organismo un nivel concreto de cáncer, puede tratarse al organismo basándose en el diagnóstico. El tratamiento también puede llevarse a cabo para otros métodos que clasifican una patología. A modo de ejemplo, el tratamiento puede incluir cirugía, radioterapia o quimioterapia.

VI. ANÁLISIS DIRIGIDO

La deconvolución de la contribución de tejido basándose en el análisis de metilación puede implicar la determinación del estado de metilación de los sitios de CpG. Además de usar secuenciación con bisulfito no dirigida para determinar el perfil de metilación de todo el genoma de la mezcla de ADN (por ejemplo, ADN plasmático), también puede usarse una estrategia dirigida para estudiar el estado de metilación o las densidades de metilación de los sitios de CpG de interés u otros niveles de metilación. El direccionamiento de los sitios de CpG de interés puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, pero sin limitación, hibridación de ADN, micromatriz, amplificación por la PCR y PCR específica de metilación. También pueden usarse combinaciones de estas técnicas. La estrategia dirigida puede aumentar la información de metilación relativa a los sitios de CpG individuales sin aumentar sustancialmente la cantidad de secuenciación general. La estrategia dirigida también puede aumentar la sensibilidad y/o especificidad y/o precisión para la detección de la contribución de ADN de un tejido en un fluido corporal, especialmente de uno que es un contribuyente menor cuando se compara con uno o más tejidos diferentes.

En un ejemplo, las regiones de interés pueden enriquecerse mediante hibridación, por ejemplo, pero sin limitación, usando el sistema Nimblegen SeqCap o el sistema de enriquecimiento de diana Agilent SureSelect. En otro ejemplo, pueden diseñarse sondas de hibridación para capturar específicamente secuencias de ADN convertidas con bisulfito.

Después, pueden secuenciarse las bibliotecas de secuenciación enriquecidas para las regiones de interés. Usando esta estrategia, puede aumentarse significativamente la profundidad de secuenciación de las regiones de interés con el mismo número de secuencias de ADN secuencias de la muestra en comparación con la estrategia de secuenciación no dirigida.

Como otro ejemplo, pueden usarse como diana las regiones de interés usando amplificación por la PCR. Pueden diseñarse cebadores para la PCR para amplificar regiones con sitios de CpG que son informativos para el análisis de deconvolución de la metilación. Pueden analizarse las regiones amplificadas, por ejemplo, pero sin limitación, usando secuenciación paralela masiva, incluyendo secuenciación de una sola molécula (tal como secuenciación Nanopore o el sistema en tiempo real de una sola molécula de Pacific Biosciences), PCR en tiempo real, PCR digital o espectrometría de masas, para los niveles de metilación generales.

En una implementación, pueden diseñarse los cebadores de la PCR para que se dirijan a las secuencias metiladas o a las secuencias no metiladas. En esta implementación, pueden compararse las cantidades de moléculas de ADN que están metiladas y no metiladas a fin de determinar los niveles de metilación de los sitios de CpG informativos (marcadores de metilación de tipo I o de tipo II). En otra implementación, los cebadores de la PCR solo hibridan con regiones sin metilación diferencial, por ejemplo, una región con un sitio de CpG. En este caso, pueden amplificarse secuencias tanto metiladas como no metiladas. Sin embargo, el amplicón amplificado podría contener sitios de CpG y después puede determinarse el estado de metilación de cada molécula amplificada, por ejemplo, pero sin limitación, usando sondas fluorescentes que son específicas para las secuencias metiladas o las no metiladas. Como alternativa, pueden analizarse los productos de la p Cr usando secuenciación paralela masiva o espectrometría de masas.

También pueden aplicarse diferentes realizaciones para analizar los perfiles de metilación de diferentes sitios de CpG a fin de maximizar la rentabilidad del análisis.

A. Uso como diana de marcadores tanto de tipo I como de tipo II

El uso como diana de marcadores tanto de tipo I como de tipo II es útil para aumentar la rentabilidad general del análisis de deconvolución de la metilación, ya que una gran cantidad de moléculas de ADN libre de células analizada podría corresponder a los sitios genómicos que se están usando. En otras palabras, para obtener el mismo número de moléculas de ADN informativas para el análisis de deconvolución de la metilación, puede reducirse sustancialmente la cantidad de secuenciación usando la estrategia dirigida en comparación con el uso del análisis por todo el genoma.

B. Uso como diana de marcadores de tipo I y todo el genoma para marcadores de tipo II

El uso como diana de marcadores de tipo I y un análisis de todo el genoma de marcadores de tipo II es particularmente útil cuando se necesita determinar con más precisión la contribución de un tipo de tejido específico y las contribuciones de otros tejidos son de interés en general. El uso como diana de marcadores tanto de tipo I como de tipo II también puede lograr esto, pero el diseño los ensayos para usar como diana ambos tipos de marcadores puede requerir grandes esfuerzos.

En esta situación, los marcadores de tipo I que se metilan de manera diferencial en el tejido de interés pueden analizarse de una manera dirigida, de tal forma que sus niveles de metilación en la mezcla de ADN, por ejemplo, ADN plasmático y ADN urinario, puede determinarse con mayor precisión. En algunos ejemplos, los tejidos diana de los marcadores de tipo I son aportaciones menores al grupo de ADN plasmático. El uso como diana de dichos tejidos usando marcadores de tipo I podría aumentar la sensibilidad que puede detectarse y medir sus contribuciones al grupo de ADN plasmático. Otra ventaja es que se puede refinar el intervalo de concentración para el que se optimizan dichas medidas.

Como ilustración, si se desea usar como diana un tejido A que normalmente aporta un nivel muy bajo de ADN en el plasma, se pueden usar múltiples marcadores de tipo I para usar el tejido A como diana, por ejemplo, usando 10 o 100 marcadores. Se puede hacer un ajuste adicional de la contribución medida del tejido A al plasma si tan solo una fracción de los 10 o 100 marcadores, respectivamente, fuese positiva para una muestra plasmática particular. Cuando la contribución del tejido A al plasma es muy baja, puede ser baja la probabilidad de detectar marcadores que son específicos para el tejido A en el plasma y la tasa de detección está regida por una o más funciones estadísticas, por ejemplo, la distribución de Poisson. En este caso, puede deducirse la contribución relativa del tejido A al ADN plasmático por el porcentaje de marcadores de tipo I que son detectables en el plasma. Pueden determinarse las contribuciones de otros tejidos usando marcadores de tipo II.

C. Uso como diana de marcadores de tipo II y todo el genoma para marcadores de tipo I

El uso como diana de marcadores de tipo II y un análisis de todo el genoma de marcadores de tipo I puede ser útil para excluir la contribución de un tipo de tejido particular. Por ejemplo, se espera que se reduzca la contribución de la placenta hasta un nivel indetectable tras el alumbramiento. El análisis dirigido de marcadores de tipo II y el análisis de todo el genoma de marcadores de tipo I que son específicos para la placenta puede ser útil para determinar con precisión las contribuciones de los diferentes tejidos de órganos y para excluir la contribución de la placenta al ADN plasmático. Esto puede ser útil para excluir la retención de producto gestacional en una mujer previamente embarazada.

VII. DECONVOLUCIÓN DE LA METILACIÓN DE DIFERENTES FLUIDOS LIBRES DE CÉLULAS

A. ADN en orina

También puede llevarse a cabo deconvolución de la metilación del ADN en ADN en orina. Los estudios previos han demostrado que puede detectarse ADN libre de células en la orina de sujetos sanos y de pacientes con una gran variedad de enfermedades (Hung et al. Clin Chem. 2009;55:715-22; Chan et al. Clin Cancer Res. 2008;14:4809-13; Garcia Moreira et al. Clin Biochem. 2009;42:729-31; Hoque et al. J Natl Cancer Inst. 2006;98:996-1004). El ADN libre de células en la orina puede ser de origen local de las células en el sistema renal y urinario (Hoque et al. J Natl Cancer Inst. 2006;98:996-1004) o tener una procedencia transrenal del plasma sanguíneo (Hung et al. Clin Chem.

2009;55:715-22; Chan et al. Clin Cancer Res. 2008; 14: 4809-13). El análisis de deconvolución de la metilación puede ser útil para la identificación de enfermedades locales y sistémicas.

En una realización, puede usarse deconvolución de la metilación del ADN en orina para monitorizar a pacientes que han recibido un trasplante renal. Se ha demostrado anteriormente que puede liberarse una cantidad aumentada de ADN para el riñón injertado en la orina en receptores de trasplante renal en presencia de rechazo del injerto (Zhong et al. Ann N Y Acad Sci. 2001;945:250-7). Por lo tanto, la elevación del porcentaje de contribución del riñón en el ADN en la orina podría ser útil para indicar la presencia de rechazo renal.

En otra realización, la presencia de neoplasias malignas en el tracto urinario puede detectarse o monitorizarse usando deconvolución del ADN en orina. El tejido de origen del cáncer puede indicarse con el aumento en la contribución al ADN en la orina. Por ejemplo, podría esperarse que los pacientes con cáncer de vejiga y próstata tengan una contribución elevada de la vejiga y la próstata, respectivamente. También puede realizarse deconvolución de la metilación junto con las aberraciones genómicas (por ejemplo, aberraciones de número de copias y variaciones de un solo nucleótido) para ubicar el tejido de origen de las aberraciones genómicas.

Otros escenarios clínicos, tales como una infección y traumatismo, también pueden detectarse mediante la deconvolución del ADN en la orina. En el caso de una infección, se podrían observar concentraciones aumentadas de las poblaciones de leucocitos en el ADN en la orina después de la deconvolución de la metilación.

También se puede aplicar deconvolución de la metilación del ADN en orina para detectar y monitorizar trastornos renales. Por ejemplo, puede aplicarse la tecnología para detectar y monitorizar enfermedades renales de origen autoinmunitario. En una realización, podrían observarse contribuciones aberrantes de poblaciones de leucocitos seleccionadas (por ejemplo, de los linfocitos) en la agrupación de ADN en la orina. Los ejemplos de trastornos renales relacionados con la autoinmunidad incluyen la nefropatía por IgA y la glomerulonefritis causada por lupus eritematoso sistémico.

Como otro ejemplo, puede aplicarse la tecnología para detectar y monitorizar la enfermedad renal en la que se produce daño en la barrera de filtración glomerular. En dichos casos, podría esperarse un aumento en el componente transrenal del ADN en la orina. En otra realización más, puede usarse deconvolución de la metilación del ADN en la orina para detectar neoplasias malignas del riñón, por ejemplo, cáncer de células renales y carcinoma de células transicionales de la pelvis renal. En este escenario, también puede realizarse deconvolución de la metilación junto con las aberraciones genómicas (por ejemplo, aberraciones de número de copias y variaciones de un solo nucleótido) para ubicar el tejido de origen de las aberraciones genómicas.

Se recogieron muestras de orina de dos mujeres gestantes que se encontraban en el tercer trimestre del embarazo. Para cada muestra de orina, se extrajo el ADN de 17 ml de orina usando el sistema de purificación de ADN Wizard Plus Minipreps (Promega) como se ha descrito previamente (Tsui et al. PLoS One 2012;7:e48319). Se prepararon bibliotecas de secuenciación de ADN con el kit de preparación de bibliotecas de ADN KAPA (Kapa Biosystems). Después, se sometió a las bibliotecas de secuenciación de ADN de la orina a 2 rondas de modificación con bisulfito usando un kit EpiTect Bisulfite (Qiagen). Las moléculas de ADN ligadas a adaptador se enriquecieron mediante 10 ciclos de PCR. Las bibliotecas de ADN tratadas con bisulfito se secuenciaron para 75 pb en un formato de extremos emparejados en instrumentos HiSeq 2000 (Illumina). Las lecturas secuenciadas se alinearon con el genoma humano de referencia (hg19). El análisis de deconvolución basado en el nivel de metilación de los 1013 marcadores de tipo I y los 5820 de tipo II se llevó a cabo para determinar la contribución de los diferentes órganos al ADN en la orina.

Tabla . n ri i n fr i n l rmin rir^ n m r orina.

(continuación)

La tabla 6 muestra contribuciones porcentuales de los diferentes órganos a la orina de las dos mujeres gestantes. Se dedujo que un 4,3 % y un 5 % del ADN en la orina procedía de la placenta. Esto es consistente con los hallazgos previos de que el ADN fetal puede pasar por vía transrenal a la orina de las mujeres embarazadas (Tsui et al. PLoS One 2012;7:e48319). Además, la vejiga también aportó un 12,2 % y 8,1 % del ADN total en las dos muestras de orina.

Puede deducirse el tamaño de cada molécula de ADN en la orina a partir de las coordenadas genómicas de los nucleótidos más externos.

La FIG. 42A es una gráfica 4200 que muestra las distribuciones de tamaño del ADN de la orina de las dos mujeres gestantes de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Como comparación, también se muestran las distribuciones de tamaño del ADN plasmático de cinco mujeres gestantes. Las distribuciones de tamaño del ADN en orina fueron significativamente más cortas que las del a Dn plasmático. Estos hallazgos indican que es factible la deconvolución de la metilación en el ADN corto en la orina.

La FIG. 42B muestra una gráfica 4250 de la representación genómica (GR) de diferentes cromosomas en el ADN de la orina de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Como comparación, también se muestran las representaciones genómicas de los cromosomas de las muestras de ADN plasmático de las dos mujeres gestantes. Las representaciones proporcionales de los diferentes cromosomas fueron similares entre las muestras de orina y de plasma. Un 0,063 % y un 0,059 % de las secuencias de ADN en la orina se alinearon con el cromosoma Y. Esto es compatible con el hecho de que ambas mujeres gestantes portaban fetos masculinos.

B. Fluido cefalorraquídeo (CSF)

Como otro ejemplo, también puede llevarse a cabo deconvolución de la metilación en ADN extraído del CSF. Un aumento de la destrucción de tejido puede asociarse con diferentes patologías intracraneales, por ejemplo, enfermedad cerebrovascular, infecciones, cánceres, trastornos autoinmunitarios (por ejemplo, esclerosis múltiple) y trastornos degenerativos (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, etc. La contribución aumentada de un tipo celular específico al ADN del CSF podría asociarse con la renovación celular aumentada de dicho tipo celular particular y puede usarse para la detección y monitorización (incluyendo la respuesta al tratamiento) de diversas enfermedades.

C. Fluido pleural y fluido de ascitis

En un ejemplo adicional, también puede llevarse a cabo deconvolución de la metilación en ADN extraído de fluido pleural. Normalmente se observa efusión pleural en pacientes que padecen diversas patologías pulmonares. También se observa efusión pleural en pacientes con insuficiencia cardíaca, enfermedades renales y en aquellos con enfermedades hepáticas. En un estudio anterior, se demostró que la medición de la concentración del ADN en el fluido pleural en pacientes con efusión pleural es útil para clasificar la efusión pleural en transudativa o exudativa (Chan et al. Clin Chem. 2003;49:740-5). Esta clasificación es útil para indicar la posible patología que está padeciendo el paciente. La deconvolución del ADN de fluido pleural podría ser útil para indicar el tejido de origen de la patología. Por ejemplo, en pacientes que padecen efusión pleural maligna, la deconvolución del fluido pleural puede indicar si la efusión pleural se debe a un cáncer de pulmón primario o a un cáncer metastásico de otro órgano al pulmón. Además, puede llevarse a cabo deconvolución de la metilación en las regiones que muestran diversos tipos de aberraciones genéticas, incluyendo aberraciones de número de copias y mutaciones puntuales, de tal forma que puede determinarse el tejido de origen de las aberraciones.

En otro ejemplo más, puede llevarse a cabo deconvolución de la mutilación en el ADN extraído de fluido de ascitis. Puede observarse ascitis en diversas patologías, por ejemplo, cirrosis hepática, infección y neoplasias malignas. También puede observarse en sujetos con insuficiencia cardiaca y enfermedades renales. La deconvolución del ADN de fluido de ascitis podría ser útil para indicar el tejido de origen de la patología. En particular, la identificación del origen de las neoplasias malignas que provocan la ascitis. De manera similar al análisis del fluido pleural, puede llevarse a cabo deconvolución de la metilación en las regiones que muestran diversos tipos de aberraciones genéticas, incluyendo aberraciones de número de copias y mutaciones puntuales, de tal forma que puede determinarse el tejido de origen de las aberraciones.

VIII. SISTEMA INFORMÁTICO

Cualquiera de los sistemas informáticos mencionados en el presente documento pueden utilizar cualquier número adecuado de subsistemas. Se muestran ejemplos de dichos subsistemas en la FIG. 42 en el aparato informático 10. En algunas realizaciones, un sistema informático incluye un solo aparato informático, donde los subsistemas pueden ser los componentes del aparato informático. En otras realizaciones, un sistema informático puede incluir múltiples aparatos informáticos, siendo cada uno de ellos un subsistema, con componentes internos.

Los subsistemas mostrados en la FIG. 42 se interconectan a través de un bus de sistema 75. Se muestran subsistemas adicionales, tales como una impresora 74, teclado 78, dispositivos de almacenamiento 79, monitor 76, que se acopla al adaptador de presentación 82 y otros. Los periféricos y los dispositivos de entrada/salida (E/S), que se acoplan al controlador de e /s 71, pueden conectarse al sistema informático mediante cualquier número de medios conocidos en la técnica, tal como el puerto de entrada/salida (E/S) 77 (por ejemplo, USB, FireWire®). Por ejemplo, el puerto E/S 77 o la interfaz externa 81 (por ejemplo, Ethernet, Wi-Fi, etc.) puede usarse para conectar el sistema informático 10 a una red de área amplia, tal como Internet, un dispositivo de entrada de ratón o un escáner. La interconexión mediante un bus de sistema 75 permite que el procesador central 73 se comunique con cada subsistema y controle la ejecución de las instrucciones de la memoria de sistema 72 o los dispositivos de almacenamiento 79 (por ejemplo, un disco fijo, tal como un disco duro o un disco óptico), así como el intercambio de información entre subsistemas. La memoria de sistema 72 y/o los dispositivos de almacenamiento 79 pueden representar un medio legible por ordenador. Cualquiera de los datos mencionados en el presente documento pueden ser la salida de un componente a otro componente y puede ser la salida al usuario.

Un sistema informático puede incluir una pluralidad de los mismos componentes o subsistemas, por ejemplo, conectados entre sí mediante la interfaz externa 81 o mediante una interfaz interna. En algunas realizaciones, los sistemas, subsistemas o aparatos informáticos pueden comunicarse a través de una red. En dichos casos, puede considerarse que un ordenador es un cliente y otro ordenador es un servidor, donde cada uno puede formar parte del mismo sistema informático. Un cliente y un servidor pueden incluir cada uno múltiples sistemas, subsistemas o componentes.

Se entenderá que cualquiera de las realizaciones de la presente invención puede implementarse en forma de lógica de control usando hardware (por ejemplo, un circuito integrado específico para una aplicación o una matriz de ventanas programables de cambio) y/o usando programas informáticos con un procesador generalmente programable en de un modo modular o integrado. Como se usa en el presente documento, un procesador incluye un procesador de un solo núcleo, un procesador de múltiples núcleos en una sola placa integrada o múltiples unidades de procesamiento en una sola placa de circuito o en una red. Basándose en la divulgación y las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, un experto habitual en la materia conocerá y apreciará otras formas y/o medios para implementar realizaciones de la presente invención usando hardware y una combinación de hardware y software.

Puede implementarse cualquiera de los componentes de software o las funciones descritas en la presente solicitud como código informático para su ejecución por un procesador usando cualquier lenguaje informático adecuado, tal como, por ejemplo, Java, C, C++, C#, C orientado a objetos, Swift o un lenguaje de script usando Perl o Python que usa, por ejemplo, técnicas convencionales u orientadas a objetos. El código informático puede almacenarse como una serie de instrucciones u órdenes en un medio legible por ordenador para su almacenamiento o transmisión, los medios adecuados incluyen memoria de acceso aleatorio (RAM), una memoria de solo lectura (ROM), un medio magnético, tal como un disco duro o un disco flexible o un medio óptico, tal como un disco compacto (CD) o DVD (disco digital versátil), memoria flash y similares. El medio legible por ordenador puede ser cualquier combinación de dichos dispositivos de almacenamiento o transmisión.

Dichos programas también pueden codificarse y transmitirse usando señales portadoras adaptadas para su transmisión por redes cableadas, ópticas y/o inalámbricas que conforman una variedad de protocolos, incluyendo Internet. Como tal, un medio legible por ordenador de acuerdo con una realización de la presente invención puede crearse usando una señal de datos codificada por dichos programas. Los medios legibles por ordenador codificados por el código del programa pueden empaquetarse con un dispositivo compatible o proporcionarse por separado de otros dispositivos (por ejemplo, mediante una descarga de Internet). Cualquiera de dichos medios legibles por ordenador puede encontrarse en un solo producto informático (por ejemplo, un disco duro, un CD o un sistema informático completo) y puede estar presente en diferentes productos informáticos en un sistema o red. Un sistema informático puede incluir un monitor, impresora u otro dispositivo de presentación adecuado para proporcionar cualquiera de los resultados mencionados en el presente documento a un usuario.

Cualquiera de los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse parcial o totalmente con un sistema informático que incluye uno o más procesadores, que pueden estar configurados para llevar a cabo las etapas. Por lo tanto, las realizaciones pueden referirse a sistemas informáticos configurados para llevar a cabo las etapas de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, potencialmente, con diferentes componentes que llevan a cabo las etapas respectivas o un grupo de etapas respectivo. Aunque se presentan como etapas numeradas, las etapas y los métodos del presente documento pueden llevarse a cabo en el mismo orden o en un orden diferente. Además, pueden usarse partes de estas etapas con partes de otras etapas para otros métodos. Asimismo, la totalidad o partes de una etapa pueden ser opcionales. Además, cualquiera de las etapas de cualquiera de los métodos puede llevarse a cabo con módulos, circuitos u otros medios para llevar a cabo estas etapas.

La descripción anterior de realizaciones ejemplares de la invención se ha presentado con fines ilustrativos y descriptivos.

La cita de "un", "una" o "el/la" pretende hacer referencia a "uno o más", a menos que se indique claramente lo contrario. El uso de "o" pretende indicar un "o inclusivo", y no un "o excluyente", a menos que se indique claramente lo contrario.

Apéndice A

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para analizar una muestra biológica de un organismo, incluyendo la muestra biológica una mezcla de al menos 1.000 moléculas de ADN libre de células de una pluralidad de tipos de tejidos, incluyendo un primer tipo de tejido, comprendiendo el método:

analizar, mediante un sistema informático, una pluralidad de moléculas de ADN libre de células de la muestra biológica, siendo la pluralidad de moléculas de ADN libre de células al menos 1.000 moléculas de ADN libre de células, en donde el análisis de una molécula de ADN libre de células incluye:

identificar una ubicación de la molécula de ADN libre de células en un genoma de referencia correspondiente al organismo;

identificar un primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células que están ubicadas cada una en uno cualquiera de N sitios genómicos de una primera región cromosómica del genoma de referencia correspondiente al organismo, siendo N un número entero mayor o igual a 10;

medir N primeros niveles de metilación en los N sitios genómicos usando el primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células;

determinar, mediante el sistema informático, una primera contribución fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla utilizando los N primeros niveles de metilación y niveles de metilación conocidos en los N sitios genómicos; identificar un segundo conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células que están ubicadas cada una en uno cualquiera de K sitios genómicos de una segunda región cromosómica del genoma de referencia correspondiente al organismo, siendo K un número entero mayor o igual a 10, en donde la segunda región cromosómica es diferente de la primera región cromosómica;

medir K segundos niveles de metilación en los K sitios genómicos usando el segundo conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células;

determinar, mediante el sistema informático, una segunda contribución fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla utilizando los K segundos niveles de metilación y niveles de metilación conocidos en los K sitios genómicos; calcular un primer valor de separación entre la primera contribución fraccional y la segunda contribución fraccional; y

comparar el primer valor de separación con un valor umbral para determinar una clasificación de si el primer tipo de tejido tiene un desequilibrio de secuencia para la primera región cromosómica.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la medición de los N primeros niveles de metilación en los N sitios genómicos incluye analizar resultados de secuenciación sensible a la metilación y en donde las ubicaciones de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células se determinan usando los resultados de secuenciación sensible a la metilación.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la clasificación es que el primer tipo de tejido tiene el desequilibrio de secuencia para la primera región cromosómica cuando el primer valor de separación supera el valor umbral, que además comprende:

calcular una pluralidad de valores de separación para el primer tipo de tejido, correspondiendo cada uno de la pluralidad de valores de separación a una región cromosómica diferente; y

determinar un número de las diferentes regiones cromosómicas que tienen un valor de separación correspondiente que supera el valor umbral.

4. El método de la reivindicación 3, que además comprende:

determinar la clasificación de si el primer tipo de tejido tiene el desequilibrio de secuencia para la primera región cromosómica basándose en el número de las diferentes regiones cromosómicas que tienen un valor de separación correspondiente que supera el valor umbral.

5. El método de la reivindicación 4, en donde se determina que el primer tipo de tejido tiene el desequilibrio de secuencia para la primera región cromosómica cuando el número de regiones cromosómicas supera un valor de corte.

6. El método de la reivindicación 3, que además comprende:

determinar un nivel de cáncer para el primer tipo de tejido basándose en el número de las diferentes regiones cromosómicas.

7. El método de la reivindicación 6, que además comprende:

para cada uno del número de diferentes regiones cromosómicas:

determinar un alcance de que el valor de separación correspondiente supere el valor umbral,

en donde la determinación del nivel de cáncer para el primer tipo de tejido se basa además en el alcance de que el valor de separación correspondiente supere el valor umbral.

8. El método de la reivindicación 1, que además comprende:

identificar que la primera región cromosómica muestra una aberración de número de copias está basada en una primera cantidad de moléculas de ADN libre de células que se ubican en la primera región cromosómica; y determinar cuál de los M tipos de tejido está asociado con la aberración de número de copias evaluando los valores de separación correspondientes en las contribuciones fraccionales para cada uno de los M tipos de tejido, siendo el primer tipo de tejido uno de los M tipos de tejido.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la determinación de cuál de los M tipos de tejido está asociado con la aberración del número de copias identifica al menos dos tipos de tejidos como asociados con la aberración del número de copias mediante los al menos dos tipos de tejido que tienen cada uno un valor de separación correspondiente que supera el valor umbral.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el primer tipo de tejido es uno de los al menos dos tipos de tejido, comprendiendo el método además:

identificar el primer tipo de tejido como origen de un cáncer primario cuando el primer valor de separación tiene un valor más alto entre los valores de separación correspondientes.

11. El método de la reivindicación 8, en donde la primera región cromosómica muestra una amplificación, comprendiendo el método además:

identificar que la segunda región cromosómica muestra una eliminación basándose en una segunda cantidad de moléculas de ADN libre de células que están ubicadas en la segunda región cromosómica; y

usar la segunda región cromosómica para determinar el primer valor de separación basándose en la segunda región cromosómica que muestra la eliminación.

12. El método de la reivindicación 1, en donde el análisis de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células comprende:

secuenciar la pluralidad de moléculas de ADN libre de células para obtener lecturas de secuencia; y alinear las lecturas de secuencia con el genoma de referencia, en donde los N primeros niveles de metilación se miden usando lecturas de secuencia que se alinean cada una con al menos uno de los N sitios genómicos del genoma de referencia.

13. El método de la reivindicación 1, en donde los N primeros niveles de metilación de un vector de metilación b y en donde la determinación de la primera contribución fraccional del primer tipo de tejido incluye:

para cada uno de M tipos de tejido:

obtener N niveles de metilación específicos de tejido en los N sitios genómicos, siendo N mayor o igual a M, en donde los niveles de metilación específicos de tejido pueden formar una matriz de dimensiones N por M, incluyendo los M tipos de tejido el primer tipo de tejido, en donde los niveles de metilación conocidos en los N sitios genómicos incluyen los N niveles de metilación específicos de tejido en los N sitios genómicos;

resolver un vector de composición x que proporciona el vector de metilación b para la matriz A

para cada uno de uno o más componentes del vector de composición x:

usando el componente para determinar una contribución fraccional correspondiente de un tipo de tejido correspondiente de los M tipos de tejido en la mezcla.

14. El método de la reivindicación 1, que además comprende: para cada uno del primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células: determinar un tamaño de la molécula de ADN libre de células;

identificar un primer grupo del primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células que tiene tamaños en un primer intervalo de tamaños;

medir N terceros niveles de metilación en los N sitios genómicos usando el primer grupo de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células;

determinar una tercera contribución fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla utilizando los N terceros niveles de metilación y los niveles de metilación conocidos en los N sitios genómicos;

identificar un segundo grupo del primer conjunto de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células que tiene tamaños en un segundo intervalo de tamaños, siendo el segundo intervalo de tamaños diferente del primer intervalo de tamaños;

medir N cuartos niveles de metilación en los N sitios genómicos usando el segundo grupo de la pluralidad de moléculas de ADN libre de células;

determinar una cuarta contribución fraccional del primer tipo de tejido en la mezcla utilizando los N cuartos niveles de metilación y los niveles de metilación conocidos en los N sitios genómicos;

calcular un segundo valor de separación entre la tercera contribución fraccional y la cuarta contribución fraccional; y comparar el segundo valor de separación con otro valor umbral para determinar otra clasificación de si el primer tipo de tejido tiene el desequilibrio de secuencia para la primera región cromosómica.

15. Un programa informático que comprende una pluralidad de instrucciones que pueden ejecutarse en un sistema informático, que cuando se ejecutan de este modo controlan el sistema informático para llevar a cabo el método de Ċ

una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.