ES2739129T3 - IL-22 para uso en el tratamiento de la enfermedad gastrointestinal del injerto contra el huesped - Google Patents

Abstract

IL-22 para uso en el tratamiento de lesiones o daños en el tracto gastrointestinal debido a la enfermedad de injerto contra huésped (EICH).

Description

DESCRIPCIÓN

IL-22 para uso en el tratamiento de la enfermedad gastrointestinal del injerto contra el huesped

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención proporciona composiciones para el uso de IL-22 para el tratamiento de condiciones de lesión intestinal y condiciones inflamatorias tales como enfermedad injerto contra huésped. Específicamente, la IL-22 puede usarse para aumentar la recuperación de células madre iniciales (ISC) y para mejorar la reconstitución inmune después del trasplante alogénico hematopoyético. En realizaciones particularmente preferidas, la presente invención proporciona el uso de IL-22 terapéutica, que incluye una forma dimérica de IL-22, en composiciones terapéuticas para tratar la enfermedad de injerto contra huésped, que incluye injerto hepático, tímico, gastrointestinal u otro tipo de enfermedad injerto vs. huésped en pacientes con trasplante de células madre hematopoyéticas y en pacientes con afecciones inflamatorias intestinales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Los mecanismos que regulan la recuperación del tejido del hospedador a partir del daño mediado por el sistema inmune en injerto gastrointestinal frente a la enfermedad del hospedador (GI-EICH) aún no se comprenden completamente. Las estrategias actuales para reducir la EICH clínica tienen el efecto no deseado de limitar tanto las respuestas de la función inmunitaria después del trasplante como las injertos terapéuticos (beneficiosos) frente a la leucemia/linfoma (GVL). De particular preocupación es el mantenimiento y la regeneración de los tejidos epiteliales intestinales durante la enfermedad del injerto contra el huésped (EICH) porque la EICH causa patología de las células intestinales que interfiere con las funciones intestinales.

[0003] GI EICH es el contribuyente predominante a la mortalidad aguda relacionada con EICH después del trasplante de células alogénicas hematopoyéticas madre/progenitoras.

[0004] Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad de estrategias de post-trasplante para promover selectivamente la regeneración epitelial intestinal después de transplante de células madre/progenitoras alogénicas hematopoyéticas (allo-HCT) para reducir EICH sin limitar respuestas de injerto terapéutico vs. leucemia/linfoma (GVL)

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0005] La presente invención se basa en la observación de que la administración de IL-22 in vivo después de la recuperación mejorada del trasplante de médula ósea alogénica (BMT) de las células madre intestinales (ISC), redujo la patología intestinal de la enfermedad injerto contra huésped (EICH) y mejoría de la supervivencia general después del trasplante sin el aumento de la función de nicho de células madre o la alteración de la inmunidad aloreactiva. IL-22 aumenta la recuperación de ISC de patologías inmunomediadas al acelerar la regeneración del conjunto de ISC. IL-22 aumentó directamente la proliferación de ISC de Lgr5 in vivo y ex vivo. Esto dio lugar a una recuperación aumentada de epitelio maduro sin aumentar la producción de factor de crecimiento por el nicho de células madre.

[0006] Según la presente invención, se prevé IL-22 para su uso en el tratamiento de lesiones o daños al tracto gastrointestinal debido a la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). En el presente documento se describe un método para mejorar el crecimiento/proliferación de células madre intestinales (ISC), el método que comprende poner en contacto ISC con interleucina-22 (IL-2) exógena o recombinante, o un dímero, proteína de fusión o conjugado del mismo en condiciones para promover el crecimiento de ISC in vivo o in vitro. En algunas realizaciones, los ISC son células Lgr5+.

[0007] Además, se describe aquí un método para promover la recuperación/regeneración de las células epiteliales gastrointestinales en un sujeto después de daños en el revestimiento epitelial del tracto gastrointestinal (GI), el método comprende poner en contacto las células madre intestinales del sujeto con IL-22 o un dímero, proteína de fusión (por ejemplo, una proteína de fusión Fc) o conjugado de la misma. El daño al tracto GI puede ser el resultado de una enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria intestinal, una colitis ulcerosa, una enfermedad de Crohn), una enfermedad intestinal autoinmune o un trasplante (EICH).

[0008] De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona IL-22 para su uso en el tratamiento de la EICH en un sujeto después de un trasplante sin inmunosupresión. En este documento se describe un método para tratar la EICH en un sujeto después de un trasplante, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de IL-22 o un dímero, una proteína de fusión o un conjugado de la misma. El método no requiere inmunosupresión para lograr su efecto terapéutico.

[0009] Además, se describe aquí un método en el que la administración de IL-22 se comienza una vez que se observa el inicio de los síntomas asociados con la lesión intestinal por un experto en la materia. En una realización, la IL-22 se administra al sujeto desde 1 día hasta 6 meses después del trasplante; en una realización, la IL-22 se administra al sujeto desde 1 semana hasta 4 meses después del trasplante.

[0010] La invención también describe un IL-22 o dímero, proteína de fusión o conjugado del mismo para uso en la recuperación/regeneración de las células epiteliales intestinales o en el tratamiento o la prevención/inhibición de la EICH.

DEFINICIONES

[0011] Para facilitar la comprensión de la presente invención, una serie de términos y frases se definen a continuación:

[0012] Tal como se utiliza aquí, el término "polipéptido IL22" o "IL22" o "IL22" o "proteína IL22" se refiere a un polipéptido biológicamente activo capaz de producir la actividad biológica como se describe aquí. La IL-22 de la presente invención incluye pero no se limita a IL-22 humana, IL-22 humana recombinante, IL-22 murina y/o IL-22 murina recombinante. Las secuencias de polipéptidos específicos se describen en la Patente de EE.UU. US2003/0100076, Patente de EE.UU. N° 7,226,591 y Patente de EE.UU. N° 6.359.117. "IL-22" también incluye IL-22 modificada, tal como IL-22 pegilada y proteínas IL-22 modificadas covalentemente. Los polipéptidos de IL-22 utilizados en el presente documento se pueden aislar de una variedad de fuentes, tales como, por ejemplo, de tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o preparados por métodos recombinantes o sintéticos. Por ejemplo, las descripciones de la preparación, la administración de, la derivación, la formación de anticuerpos a o contr la administración de las composiciones que contienen, el tratamiento de una enfermedad con, etc., pertenecen a cada polipéptido de la invención individualmente. Además, la IL-22 para uso en la presente invención puede ser un producto de un método recombinante en el que el ADN que codifica IL-22 se administra a un sujeto, por ejemplo, como lactobicilos que expresan IL-22. El término "polipéptido IL-22" también incluye variantes de los polipéptidos IL-22. La IL-22 de la presente invención también puede modificarse de manera que forme una molécula quimérica que comprende IL-22 fusionada a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. El término IL-22, como se usa en el presente documento, incluye tanto un monómero como una forma de dímero de IL-22. Sin embargo, a menos que se especifique lo contrario, se utilizó rIL-22 en estos métodos. IL-22 también se conoce como factor inducible derivado de células T relacionado con interleucina-10 (IL-TIF).

[0013] Tal como se utiliza aquí, el término "monómero IL-22" se refiere a una unidad de una proteína IL-22.

[0014] Tal como se utiliza aquí, el término "dímero IL-22" se refiere a una proteína que tiene más de una unidad de una molécula de IL-22, por un ejemplo, un dímero de IL-22 puede tener dos IL-22 en moléculas vinculadas utilizando enlazadores como un polipéptido corto, un enlace químico y un enlace covalente. En algunas realizaciones, un dímero de IL-22 contiene dos moléculas duplicadas de IL-22, en otras realizaciones, un dímero de IL-22 está formado por diferentes proteínas de IL-22. Otros ejemplos de dímeros de IL-22 que pueden encontrar uso en la presente invención se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 20130171100. Un dímero de IL-22 adecuado es una proteína dimerizada de IL-22 recombinante que contiene interleuquina humana 22 (IL-22) y producido en células de ovario de hámster chino (CHO) transformadas en cultivo sin suero producido por Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Los dímeros de IL-22 se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 20130171100, incluyendo información de secuencia. Los polipéptidos formadores de dímeros de IL-22 usados en el presente documento pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o prepararse mediante métodos recombinantes o sintéticos. En algunas realizaciones, un dímero de IL-22 comprende una proteína portadora, que incluye pero no se limita a un fragmento Fc de IgG humana (1,2, 3, 4) o albúmina humana. La iL-22 se puede localizar en el extremo C-terminal o N-terminal de la proteína transportadora.

[0015] En algunas realizaciones, el dímero IL-22 usado en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento comprende dos unidades monoméricas, en donde cada unidad monomérica comprende un dominio de IL-22 y un dominio de dimerización. En algunas realizaciones, cada unidad monomérica del dímero IL-22 comprende un dominio IL-22 unido a un dominio de dimerización a través de una secuencia enlazadora opcional, tal como una secuencia enlazadora que es de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende al menos dos cisteínas capaces de formar enlaces disulfuro intermoleculares. En algunas realizaciones, el dominio de dimerización comprende al menos una porción del fragmento Fc. En algunas realizaciones, el fragmento Fc comprende los dominios CH2 y CH3. En algunas realizaciones, los dímeros de IL-22 comprenden dos unidades monoméricas como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 20130171100. En algunas realizaciones, el dímero de IL-22 se administra por vía intravenosa.

[0016] Tal como se utiliza aquí, el término "injerto contra huésped" o "GVH" se refiere a una respuesta inmune de injerto (donante) a las células contra células hospedadoras y tejidos.

[0017] Tal como se utiliza aquí, el término "enfermedad injerto contra huésped" o "EICH" se refiere a una condición, incluyendo aguda y crónica, resultante de efectos trasplantados celulares (injerto) en células huésped y los tejidos resultantes de GVH. En otras palabras, las células inmunitarias del donante infundidas dentro del injerto o las células inmunitarias del donante que se desarrollan a partir de las células madre, pueden ver las células del paciente (huésped) como extrañas y volverse contra ellas con una respuesta inmune. Como ejemplos, los pacientes que han recibido un trasplante de sangre o médula ósea de otra persona corren el riesgo de tener una EICH aguda. Incluso los donantes que son compatibles con HLA con el receptor pueden causar EICH porque las células del donante también pueden potencialmente generar una respuesta inmune contra diferencias menores de antígenos en el receptor. La enfermedad aguda de injerto contra huésped (EICH) es específicamente un trastorno causado por las células inmunitarias del donante en pacientes que han recibido un trasplante alogénico de médula o células sanguíneas. Los tejidos más comúnmente afectados son la piel, el intestino y el hígado. En casos severos, la EICH puede causar ampollas en la piel o diarrea y desgaste excesivos. Además, la inflamación causada por las células inmunitarias del donante en el hígado puede causar una obstrucción que causa una enfermedad. Otros tejidos como el pulmón y el timo también pueden verse afectados. El diagnóstico generalmente se confirma al observar un pequeño trozo de piel, hígado, estómago o intestino con un microscopio para observar características inflamatorias específicas. En los casos graves, el hígado no funciona correctamente para eliminar los productos de desecho del cuerpo. La EICH aguda generalmente comienza durante los primeros 3 meses después del trasplante. En algunos casos, puede persistir, regresar o comenzar más de 3 meses después del trasplante. La prednisona y/u otros medicamentos inmunosupresores se usan para tratar la enfermedad aguda de injerto contra huésped. Se utilizan otros medicamentos inmunosupresores si el tratamiento con prednisona no es exitoso, aunque una gran proporción de pacientes es refractario a los medicamentos inmunosupresores y mueren.

[0018] Los pacientes que han tenido EICH aguda y sobrevivir tienen un mayor riesgo de desarrollar EICH crónica. Los pacientes mayores, los pacientes que recibieron un trasplante de sangre periférica (en lugar de la médula ósea) y los pacientes que tenían un donante no compatible o no relacionado tienen un mayor riesgo de EICH crónica. La EICH crónica generalmente comienza más tarde después del trasplante y dura más que la EICH aguda. Los pacientes con EICH crónica pueden presentar una amplia variedad de síntomas. La erupción cutánea y/o las llagas en la boca se encuentran entre los signos iniciales más comunes de la enfermedad. A diferencia de la EICH aguda, la EICH crónica puede causar daño en las glándulas que producen lágrimas en los ojos y saliva en la boca dando como resultado ojos secos o una boca seca. Los pacientes pueden tener úlceras en la boca que causan dolor al comer, erupciones en la piel o inflamación del hígado. La EICH crónica también puede causar muchos otros problemas. Uno de estos problemas es la formación de tejido cicatricial en la piel (esclerosis cutánea) y articulaciones. Otro problema similar es el daño crónico a las vías aéreas en los pulmones (síndrome de bronquiolitis obliterante). Predisona u otros medicamentos antiinflamatorios o inmunosupresores similares se usan para tratar la enfermedad crónica de injerto contra huésped. Se pueden usar otros medicamentos inmunosupresores si el tratamiento con prednisona no es exitoso. Al igual que en la EICH aguda, una gran proporción de pacientes no se cura de la EICH crónica.

[0019] Tal como se utiliza aquí, el término "injerto contra leucemia" o "GVL" o "efecto injerto contra tumor" o "GVT" se refiere a una reacción inmune terapéutica beneficiosa de los linfocitos T del donante injertado contra la médula ósea enferma y células tumorales residuales del receptor.

[0020] Tal como se utiliza aquí, el término "injerto gastrointestinal vs. enfermedad del huésped" y "GI-EICH" se refiere a los daños causados por las células inmunitarias del donante para alojar el tejido del estómago y el intestino que puede causar pérdida de apetito, náuseas, vómitos o diarrea como parte de la EICH, ya sea aguda o crónica. En casos severos, GI- EICH puede causar dolor en el abdomen y sangrado en el estómago o los intestinos.

[0021] Tal como se utiliza aquí, el término "trasplante alogénico" se refiere a las infusiones de sangre de donante o de trasplantes de células madre de médula espinal de un donante a un paciente anfitrión. En otras palabras, el paciente recibe células madre de la médula ósea o la sangre de un donante de tejido similar, es decir, en los principales loci HLA, que pueden o no ser un familiar. Los trasplantes alogénicos gemelos idénticos se llaman trasplantes singénicos.

[0022] Tal como se utiliza aquí, el término "trasplante de células madre hematopoyéticas" o "TCMH" o "trasplante de células hematopoyéticas" o "TCH" se refiere a un trasplante de células hematopoyéticas multipotentes, incluyendo células madre, por lo general derivados de la médula ósea, sangre periférica, o sangre del cordon umbilical.

[0023] Como se usa en este documento, el término "HSCT alogénico" se refiere al trasplante de células madre hematopoyéticas multipotentes a partir de un individuo a otro. Este TCMH alogénico se realiza en pacientes con ciertos cánceres de la sangre o la médula ósea, como mieloma múltiple o leucemia, inmunodeficiencias congénitas y fallas en la médula ósea u otra enfermedad hematológica. En estos casos, el sistema inmunitario del receptor generalmente se destruye con radiación o quimioterapia antes del trasplante. La infección y la enfermedad de injerto contra huésped son una complicación importante del TCMH.

[0024] Tal como se utiliza aquí, el término "célula intestinal madre" y "ISC" se refiere a una célula madre multipotente, tal como una célula Lgr5+.

[0025] Tal como se utiliza aquí, el término "célula progenitora" como referencia a una célula intestinal se refiere a células multipotentes que pueden dar lugar a células diferenciadas del intestino delgado o grueso, tal como una célula columnar y una de las células caliciformes.

[0026] Tal como se utiliza aquí, el término "base cripta" como referencia a una célula intestinal se refiere a células multipotentes que pueden dar lugar a células diferenciadas del intestino delgado o grueso, tal como una célula columnar y una célula calciforme.

[0027] Tal como se utiliza aquí, el término "célula Paneth" o "célula de Davidoff" se refiere a un tipo especializado de célula epitelial que se encuentra en el intestino delgado y el apéndice. Una célula de Paneth o una célula de Paneth se deriva de una célula madre intestinal.

[0028] Tal como se utiliza aquí, el término "organoide" en referencia a un organoide intestinal que comprende un lumen central revestido por un epitelio de tipo vellosidades que resultan del cultivo de células madre epiteliales o criptas aisladas en un medio de cultivo. Las criptas se refieren al nicho de células intestinales/progenitoras en la base del epitelio.

[0029] Como se usa en el presente documento, "células" se refieren a la unidad estructural de un organismo que consta de un núcleo y orgánulos rodeados de una membrana celular semipermeable. No está destinado a limitarse a células vivas o funcionales.

[0030] Tal como se utiliza aquí, el término "poner en contacto" o "tratar" o "administrar" un compuesto a una célula o tejido, tal como una proteína IL-22 o composición de proteína IL-22, o citoquina, o composición de citoquina y similares, se refiere a colocar el compuesto en una ubicación que le permita tocar la célula para producir células "contactadas" o "tratadas". El contacto se puede realizar utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, en una realización, el contacto es mediante la adición del compuesto a un tubo de células. El contacto también se puede lograr agregando el compuesto a las células en una placa de microtitulación. El contacto también se puede lograr agregando el compuesto a un cultivo de las células o a un cultivo de organoides. No pretende limitar la forma en que el compuesto entra en contacto con las células. En una realización, el contacto se puede lograr mediante la administración del compuesto, tal como una composición de la molécula de IL-22 a un animal in vivo.

[0031] Como se usa en el presente documento, los términos "medios de cultivo" y "medio de cultivo celular" se refiere a medios que son adecuados para soportar el crecimiento de las células in vitro (es decir, cultivos celulares). No se pretende que el término esté limitado a ningún medio de cultivo celular en particular. Por ejemplo, se pretende que la definición abarque tanto el crecimiento como los medios de mantenimiento. De hecho, se pretende que el término abarque cualquier medio de cultivo adecuado para el crecimiento de los cultivos celulares de interés.

[0032] El término "muestra" tal como una "muestra de ensayo" se utiliza en su sentido más amplio. En cierto sentido, puede referirse a una célula o tejido animal, incluida una célula o tejido humano. En otro sentido, pretende incluir un espécimen o cultivo obtenido de cualquier fuente, en particular como una muestra biológica. Las muestras biológicas se pueden obtener de animales (incluidos los humanos) y abarcan líquidos, sólidos, gases, tejidos, células, médula ósea y huesos.

[0033] Como se usa en este documento, el término "aislamiento primario" se refiere al proceso de obtención de células directamente de una muestra. Por lo tanto, el aislamiento primario de células, como las células aisladas directamente de ratones o humanos utilizados para el análisis de citometría de flujo, involucra procesos tales como la remoción de tejido de un sujeto, como una muestra de médula ósea o muestra intestinal, etc., seguida de digestión. En una enzima, por ejemplo, dispasa. El aislamiento primario puede lograrse utilizando medios de agar sólidos o semisólidos, o en líquido.

[0034] Tal como se utiliza aquí, el término "porción" cuando se usa en referencia a una población de células (como en "una porción de las células intestinales" o "una porción de células de médula ósea") se refiere a al menos una célula de esa población hasta el 99% de esas células. Por ejemplo, cuando el contacto resulta en al menos una "porción" de dicha población celular, debe quedar claro que la porción es con referencia a una población.

[0035] Como se usa en este documento, "polipéptido" o "proteína" se refiere a un aminoácido, la secuencia de aminoácidos, oligopéptido, péptido o proteína o porciones de los mismos tanto si se producen de modo natural o sintético.

[0036] Tal como se utiliza aquí, el término "porción" cuando se usa en referencia a una proteína (como en "una porción de una proteína dada") se refiere a fragmentos de esa proteína. Los fragmentos pueden variar en tamaño desde cuatro residuos de aminoácidos hasta la secuencia de aminoácidos completa menos un aminoácido.

[0037] Tal como se utiliza aquí, el término "TBI" se refiere a "la irradiación total del cuerpo" como se describe en el presente documento.

[0038] Como se usa en este documento, "linfoide" en referencia a una célula se refiere a las del linaje linfoide, tales como células T, células B y las células NKT (asesino natural T).

[0039] Como se usa en este documento, "mieloide" en referencia a una célula se refiere a aquellas células de un linaje mieloide tales como macrofagos (y monocitos), granulocitos (incluyendo neutrófilos, eosinófilos y basófilos).

[0040] Como se usa en el presente documento, el término "función alterada" se refiere a un cambio en la función, ya sea aumentando o disminuyendo una función de una función, por ejemplo, un cambio en el número de células, tales como timocitos totales, un cambio en el tipo de células, como un cambio en el número de células pre B, un cambio en el número de células CD8+, un cambio en la función, como las células epiteliales capaces de secretar una citoquina específica o inducir la supervivencia o maduración de un tipo de célula específica, y similares.

[0041] Para los fines de la presente invención, "aumentar" o "aumento" o "regulado hacia arriba" o "mejorado" o "muestra función aumentada" o "función aumentada" o "mejorar" en relación a la función, se refiere a un nivel más alto de una acción o un tipo de célula, como un mayor número de un tipo de célula específico, es decir, células intestinales funcionales maduras, células T funcionales maduras o una cantidad de un compuesto en comparación con un control o tipo salvaje. El aumento de la función puede aumentar un tipo de célula, como cuando "aumenta la producción de células de Paneth" o cuando "aumenta la producción de células linfoides", etc., por ejemplo, el tratamiento de células intestinales con IL-22 como se describe en el presente documento aumenta la producción de células basales, células de la cripta, células de Paneth y similares, y al tratar células de la médula ósea, in vivo, la función celular aumentada de las células de la médula ósea aumentó las células linfoides, por ejemplo, el aumento de las células B inmaduras, una célula pre-B, etc., un tipo de célula mieloide, como granulocitos, macrófagos, etc. Por lo tanto, los ejemplos de células linfoides funcionales maduras incrementadas de la médula ósea son números incrementados (mejorados) de al menos un tipo de células linfoides, como las células B inmaduras, una célula pre-B, etc. durante la GVL. Además, los ejemplos de la función mejorada contemplada o inmunológica mejorada también pueden referirse a la mejora de la inmunocompetencia, tales como los métodos en los que los pacientes inmunocomprometidos tienen una función inmune reducida, como los repertorios reducidos del receptor de antígeno de células T, la secreción reducida de citoquinas, las respuestas proliferativas reducidas al antígeno y similares, se tratan con composiciones que comprenden la IL-22. en el aumento de la función inmune. El aumento de la función inmune puede medirse como un aumento en cualquiera de los repertorios de receptores de antígenos de células T, la secreción de citoquinas, las respuestas proliferativas al antígeno, la capacidad para responder a infecciones y similares.

[0042] Para los fines de la presente invención, "disminuir" o "disminuido" o "reducido" o "función reducida" o "regulado hacia abajo" o "teniendo función reducida" se refiere a un menor nivel de producción en comparación con un control o de tipo salvaje, de tal manera que "las células tienen una función reducida", como una división celular reducida, un número reducido de células progenie que se diferencian en tipos de células diferenciadas, como un número reducido de células Paneth generadas a partir de células madre intestinales y células progenitoras intestinales, etc. Otro ejemplo de función reducida puede ser una producción reducida de una citoquina, es decir, IL-22 en ratones knock-out (KO) en comparación con ratones IL-22 /+ o de tipo salvaje. Como otros ejemplos, una función reducida son las células epiteliales tímicas que producen un número menor de timocitos funcionales maduros, una función disminuida son las células de la médula ósea que producen un número reducido de células linfoides funcionales maduras, las células madre derivadas de la médula ósea han disminuido el número de células linfoides. En otras palabras, una función reducida también puede ser una función alterada, por ejemplo, la generación de células inmunes alteradas en la médula ósea puede mostrar que las células madre derivadas de la médula ósea tienen (o producen) una disminución de las células linfoides. Tener una función reducida no pretende ser un resultado estático. En algunas realizaciones, poner en contacto o administrar una composición de iL-22 de las presentes invenciones puede alterar una función, como cuando IL-22 induce a las células a tener una función reducida para mostrar una función aumentada, ver Ejemplos.

[0043] Tal como se utiliza aquí, el término "ensayo in vitro" se refiere a cualquier ensayo in vitro usado para medir el aumento o disminución de la función o el número de células o subtipos de células. Las lecturas para ensayos in vitro de cultivos organoides podrían incluir, por ejemplo, mediciones de citometría de flujo de la progenie de células madre intestinales, como las células de la cripta basal. Las lecturas para los ensayos in vitro de la función inmune podrían incluir, por ejemplo, los ensayos funcionales de células T, incluida la producción de citoquinas, los subtipos de células T, los granulocitos, las células cerebrales, la proliferación, la extensión de la apoptosis, etc., véanse los ejemplos utilizados en los Ejemplos..

[0044] Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluyendo, pero no limitado a, seres humanos, primates no humanos, roedores, y similares, que es para ser el receptor de un tratamiento particular. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan de manera intercambiable en este documento, particularmente en referencia a un "sujeto humano". Para los fines de la presente invención, un sujeto puede estar inmunocomprometido, es decir, no ser capaz de combatir infecciones o controlar el crecimiento celular anormal. Los ejemplos de sujetos inmunocomprometidos incluyen sujetos que tienen cualquiera de las siguientes condiciones, quimioterapia, exposición a la radiación, irradiación deliberada, infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana, trasplantes, etc.

[0045] Los términos "tratamiento", "tratar" y similares se usan aquí para significar generalmente la obtención de un efecto farmacológico deseado y/o fisiológico. En relación con un tratamiento terapéutico del sujeto, el efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de curar parcial o completamente una enfermedad y/o un efecto adverso atribuido a la enfermedad. Por lo tanto, "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la afección o trastorno patológico diana. Los sujetos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno, así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en quienes se debe prevenir el trastorno.

[0046] Como se usa en este documento, cuando se refiere a un método de la presente invención, el término "tratamiento" cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (a) prevenir la enfermedad de ocurrir en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero aún no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, causar la regresión de la enfermedad. La presente invención se dirige al tratamiento de pacientes con afecciones médicas relacionadas con una pérdida de inmunocompetencia de un tratamiento relacionado con una enfermedad como la irradiación, la quimioterapia, la inmunosupresión, etc. Por consiguiente, un tratamiento de la invención implicaría prevenir, inhibir o aliviar cualquier condición médica en la que se lograría un nivel deseado de inmunocompetencia mediante el uso de una composición de IL-22 de las presentes invenciones. En ciertas realizaciones, el tratamiento se refiere a exponer a un sujeto a una terapia dirigida a tratar una enfermedad, como la irradiación, la quimioterapia y similares.

[0047] Como se usa en el presente documento, el término "administrar" o "administración" se refiere al acto de dar un fármaco, profármaco, composición farmacéutica, o de otro agente, o tratamiento terapéutico (por ejemplo, una composición de la presente invención) a un sistema fisiológico (por ejemplo, un sujeto o células, tejidos y órganos in vivo, in vitro o ex vivo). Las vías aceptables de administración al cuerpo humano pueden ser a través de los ojos (oftálmica), boca (oral), piel (transdérmica), nariz (nasal), pulmones (inhalatoria), mucosa (p. ej., mucosa oral o bucal), rectal, oído, mediante inyección (p. ej., por vía intravenosa, subcutánea, intratumoral, intraperitoneal, etc.) y similares. La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

[0048] Como se usa en este documento, el término "farmacéutico" o "terapéutico" en referencia a una composición que se refiere a la combinación de un agente activo (por ejemplo, en una cantidad efectiva) (por ejemplo, tal como una proteína IL-22 o ADN IL-22)) con un portador, inerte o activo, lo que hace que la composición sea especialmente adecuada para uso diagnóstico o terapéutico in vitro, in vivo o ex vivo (in vitro).

[0049] Una "cantidad eficaz" de un polipéptido descrito en la presente memoria o un agonista o antagonista del mismo es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito planteado específicamente. Una "cantidad efectiva" puede determinarse empíricamente y de manera rutinaria, en relación con el propósito declarado. Ejemplos de cantidades efectivas. Al usar la composición farmacéutica, una cantidad segura y efectiva del dímero de IL-22 de la presente invención se administra a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que lo necesite, en el cual la dosis administrada es un fármaco farmacéuticamente aceptable. Posible administración eficaz de la dosificación. Como ejemplo, para un humano de 60 kg, la dosis de administración suele ser de 0,01 a 300 mg; en una realización preferida, la dosis de administración es de 0,5-100 mg, ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos 201301711 00.

[0050] Tal como se utiliza aquí, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, incluyendo, pero no limitado a, solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones (por ejemplo, tal como un aceite/agua o emulsiones de agua/aceite), y varios tipos de agentes humectantes, cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, lauril sulfato de sodio, agentes isotónicos y de absorción, desintrigantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón de sodio), y similares. Las composiciones también pueden incluir estabilizantes y conservantes. Ejemplos de vehículos, estabilizantes y adyuvantes se describen en la técnica (véase por ejemplo, Martin, de Remington Pharmaceutical Sciences, 15a Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. (1975).

[0051] Los términos "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable", como se usan en el presente documento, se refieren a composiciones que no producen sustancialmente reacciones adversas (por ejemplo, reacciones tóxicas, alérgicas o inmunológicas) cuando se administran a un sujeto. Ejemplos de formas de IL-22 de la presente invención utilizada para la administración comprenden ungüento, polvo, parche, rociador, y inhalante.

[0052] como se usa en el presente documento, "citoquina" se refiere a una proteína o glicoproteína que se utiliza en un organismo como una señal de compuestos. Se pretende incluir homólogos y versiones sintéticas. Los ejemplos incluyen la familia IL-22, IL-23, IL-21, iL-10, IL-7, la familia de interferón (IFN), quimioquinas CC, quimiocinas CXC y similares.

[0053] Tal como se utiliza aquí, el término "polipéptido biológicamente activo" se refiere a cualquier polipéptido que mantiene una actividad biológica deseada, por un ejemplo, actividades biológicas IL-22, como se describe en el presente documento, como el aumento de células madre intestinal y la división celular progenitor intestinal, la maduración, y similares.

[0054] Donde "secuencia de aminoácidos" se recita en el presente documento para referirse a una secuencia de aminoácidos de una molécula de proteína de origen natural, "secuencia de aminoácidos" y términos similares, tales como "polipéptido" y "proteína" no están destinados a limitar la secuencia de aminoácidos hasta la secuencia completa de aminoácidos nativos asociada con la molécula de proteína citada. Como se usa en el presente documento, el término "proteína recombinante" o "polipéptido recombinante" se refiere a una molécula de proteína que se expresa a partir de una molécula de ADN recombinante (por ejemplo, la IL-22 humana expresada por células que contienen un plásmido o virus que expresa un gen de la IL-22 humana).

[0055] Tal como se utiliza aquí, el término "molécula de ADN recombinante" se refiere a una molécula de ADN que se compone de segmentos de ADN unidos juntos por medio de técnicas de biología molecular (por ejemplo un gen humano IL-22 se ligó en un plásmido de secuencia de ADN o secuencia viral).

[0056] Como se usa en el presente documento, los términos "ácido nucleico que codifica moléculas", "secuencia de ADN de codificación," y "ADN que codifica" se refieren al orden o secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena del polipéptido (proteína). La secuencia de ADN codifica así la secuencia de aminoácidos.

[0057] El término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que comprende secuencias de codificación necesarias para la producción de un polipéptido o precursor. Se pretende que el término abarque los polipéptidos codificados por una secuencia de codificación de longitud completa, así como cualquier parte de la secuencia de codificación, siempre que la actividad deseada y/o las propiedades funcionales (por ejemplo, actividad de IL-22, unión a ligando, se retiene la actividad enzimática, etc.) del polipéptido de longitud completa o fragmentado. El término también abarca la región de codificación de un gen estructural y las secuencias ubicadas adyacentes a la región de codificación en los extremos 5' y 3' para una distancia de aproximadamente 1 kb en cualquier extremo, de manera que el gen corresponda a la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias que están ubicadas en 5' de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan "secuencias no traducidas en 5'". Las secuencias que están ubicadas en 3' (es decir, "corriente abajo") de la región de codificación y que están presentes en el ARNm se conocen como "secuencias no traducidas en 3'".

[0058] El término "gen" abarca tanto ADNc y las formas genómicas de un gen. Una forma genómica de un clon genético contiene la región de codificación interrumpida con secuencias no codificantes denominadas "intrones" o "regiones de intervención" o "secuencias de intervención". Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en ARN nuclear (ARNnn); los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores. Los intrones se eliminan o se "empalman" de la transcripción nuclear o primaria; por lo tanto, los intrones están ausentes en la transcripción del a Rn mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.

[0059] Como se usa en el presente documento, los términos "producto de PCR", "fragmento de PCR" y "producto de amplificación" se refieren a la mezcla resultante de compuestos después de dos o más ciclos de las etapas de PCR de desnaturalización, hibridación y extensión son completas. Estos términos abarcan el caso donde ha habido amplificación de uno o más segmentos de una o más secuencias diana.

[0060] Como se usa en este documento, el término "reacción de cadena de la polimerasa" ("PCR") se refiere a los métodos descritos en la Patente de los Estados Unidos Nos 4.683.195, 4.683.202, y 4.965.188, que describen un método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este proceso para amplificar la secuencia diana consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores oligonucleotídicos en la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguida de una secuencia precisa de ciclos térmicos en presencia de una polimerasa de ADN. Los dos cebadores son complementarios a sus cadenas respectivas de la secuencia diana de doble cadena. Para efectuar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores se recocen a sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana. Después del recocido, los cebadores se extienden con una polimerasa para formar un nuevo par de cadenas complementarias. Los pasos de desnaturalización, recocido del cebador y extensión de la polimerasa se pueden repetir muchas veces (es decir, la desnaturalización, el recocido y la extensión constituyen un "ciclo"; puede haber numerosos "ciclos") para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada está determinada por las posiciones relativas de los cebadores entre sí, y por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. Por el hecho de que se repite el aspecto del proceso, el método se denomina "reacción en cadena de la polimerasa" (en adelante, "PCR"). Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están "amplificadas por PCR". Además del ADN genómico, cualquier secuencia de oligonucleótido o polinucleótido puede amplificarse con el conjunto apropiado de moléculas de cebador. En particular, los segmentos amplificados creados por el propio proceso de PCR son, en sí mismos, plantillas eficientes para las posteriores amplificaciones de PCR. Con la Pc R, es posible amplificar una copia única de una secuencia diana específica en el ADN genómico a un nivel detectable por el dispositivo y los sistemas de la presente invención.

[0061] Como se usa en el presente documento, el término "reactivos de amplificación" se refiere a aquellos reactivos (desoxirribonucleótidos trifosfatos, tampón, etc.), necesarios para la amplificación, excepto para los cebadores, molde de ácido nucleico, y la enzima de amplificación. Típicamente, los reactivos de amplificación junto con otros componentes de reacción se colocan y contienen en un recipiente de reacción (tubo de ensayo, micropocillos, etc.).

[0062] Como se usa en el presente documento, los términos "transcriptasa inversa" y "RT-PCR" se refieren a un tipo de PCR en el que el material de partida es ARNm. El ARNm de partida se convierte enzimáticamente en a Dn complementario o "ADNc" utilizando una enzima transcriptasa inversa. El ADNc se usa luego como "plantilla" para una reacción de "PCR".

[0063] Tal como se utiliza aquí, el término "reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real" o "reacción de la polimerasa cuantitativa en cadena" o "qPCR" se refiere a la medición de cambios en el ARNm para la determinación de los niveles de secuencias específicas de ADN o ARN en las muestras de tejido. Se basa en la detección de una señal fluorescente producida proporcionalmente durante la amplificación de un producto de PCR. Por ejemplo, el ARNm de medición de la PCR en tiempo real se realiza utilizando un método Taqman™ de RT-PCR cuantitativa para medir los cambios en ARNm utilizando el Detector de Secuencia 7700 de Perkin Elmer/Applied Biosystems.

[0064] Como se usa en este documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, tanto si se producen de forma natural como en un digesto de restricción purificada o sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de iniciación de la síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como polimerasa de ADN y a una temperatura y pH adecuados). El cebador es preferiblemente monocatenario para una máxima eficiencia en la amplificación, pero alternativamente puede ser bicatenario. Si es de doble cadena, primero se trata el cebador para separar sus hebras antes de usarlo para preparar productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser lo suficientemente largo como para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluida la temperatura, la fuente del cebador y el uso del método.

[0065] Como se usa en el presente documento, el término "plantilla de muestra" se refiere al ácido procedente de una muestra que se analiza para la presencia de una "diana" como IL-22 producido en las células intestinales. En contraste, la "plantilla de fondo" se usa en referencia a un ácido nucleico distinto del de la muestra que puede o no estar presente en una muestra. La plantilla de fondo es a menudo inadvertida. Puede ser el resultado de la transferencia, o puede ser debido a la presencia de contaminantes de ácido nucleico que se buscan purificar de la muestra. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de otros organismos que no sean los que se detectan pueden estar presentes como fondo en una muestra de prueba.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS.

[0066]

Fig. 1. La ausencia de IL-22 derivada del huésped aumenta la mortalidad después de alo-BMT/TCH. A, destinatarios de KO, desajuste de MHC. B, destinatarios de KO, desajuste de MHC. C, anticuerpo neutralizante anti-IL-22, falta de coincidencia de MHC. D, médula KO, desajuste de MHC. E, células T donantes KO, desajuste MHC. F, destinatarios de KO hematopoyéticos, falta de coincidencia de antígeno menor con BMT de intensidad reducida (3 meses después de que se generaron las quimeras hematopoyéticas mediante la reconstitución de ratones WT B6 con médula CD45.1 B6 congénita IL-22 o WT). Datos representativos (D) o combinados de 2 a 4 experimentos independientes.

Fig. 2. A, puntuación EICH de LP^B6 BMT/TCH con receptores de WT o IL-22 KO. (n = 4-5 BM sin células T y 10 ratones/grupo BM T). B, ELISA de los sobrenadantes de cultivos pequeños y de órganos de LI 2 semanas después de B6^-BALB/c BMT. C, qPCR de células de la lámina propia 2 semanas después de B10.BR^B6 BMT. D, ELISA del timo 2 semanas después de la radiación subletal sin BMT o B6^-BALB/c BMT. E, suero IL-22 después de alo-BMT con o sin EICH. F, ELISA en homogeneizados intestinales de ratones B6 (combinados a partir de dos experimentos). G, células huésped CD45+CD3' RORyt+ de la lámina propia SI 2 semanas después de B6^BALB/c BMT, estimuladas con IL-23 in vitro, representativas de 3 trasplantes independientes.

Fig. 3. A, esquema de la cripta SI. B-C, tinción IL-22R: los paréntesis indican los progenitores, las flechas verdes indican ISC y las flechas rojas o IF rojas indican las células de Paneth. B, IL-22R IHC. C, IF para IL-22R (verde), lisozima de células de Paneth (rojo) y núcleos (azul). DG, LP^B6, 3 semanas después de BMT/TCH. D, recipientes Lgr5-LacZ. Lgr5 marca CBC/ISC, y el reservador de p-galactosidasa se indica mediante tinción oscura en la cripta base del intestino normal (parte superior derecha). Esta tinción, y por lo tanto la supervivencia de ISC, todavía está presente en ausencia de EICH (parte inferior izquierda), pero la tinción y las células madre se pierden significativamente durante la EICH (parte inferior derecha). También se muestran las estadísticas combinadas para los conteos de CBC (arriba a la izquierda). E, Evaluación de ISC histológicamente basada en la ubicación de nicho en las bases de cripta entre células de Paneth en ratones WT o IL-22 KO. F, apoptosis histológica 3 semanas después de BMT/TCH en receptores de WT o IL-22 KO. G, Plasma FITC-dextrano después de una sonda oral de receptores de WT o IL-22 KO de células BM + T. La translocación FITC-dextrano a través del epitelio en el torrente sanguíneo indica la pérdida de integridad de la barrera. *p<,05, **p<01, ***p<001.

Fig. 4. La administración de rIL-22 disminuye la patología intestinal de la EICH y aumenta la recuperación de ISC, pero no afecta la función o la recuperación de células de Paneth. LP^ B6 3 semanas después del BMT, administración de rIL-22 diariamente a partir del día 7 posterior al BMT. A, Disminución de la patología intestinal de EICH después de la administración de IL-22. B. No se encontraron cambios observados en la EICH de la piel después de la administración de IL-22. C. Disminución de la apoptosis de la cripta después de la administración de IL-22. D. Los receptores de Lgr5-LacZ demostraron una mayor recuperación de los ISC de la base de la cripta LacZ+ después de IL-22. E. Las células de paneth disminuyeron en EICH y no aumentaron con la administración de iL-22. F-G. qPCR de ARNm a partir del intestino delgado. F, No se encontró cambio en la expresión de moléculas derivadas de células de Paneth después de la IL-22. G, los genes antimicrobianos innatos aumentan en la EICH después del tratamiento con IL-22. Todos los datos representativos o combinados de al menos dos experimentos y al menos cinco ratones por grupo. **p<,01, ***p<,001.

Fig. 5. Organoides cultivados ex vivo a partir de pequeñas criptas integrales. Las criptas se aislaron del intestino delgado B6 y se cultivaron en matrigel con R-espondinal, EGF y noggin. A. 1er día del cultivo, el lumen de cripta está empezando a cerrarse. B. Formación de la esfera desde la cripta después de 24 horas en cultivo. C. Organoide con nuevos brotes de cripta después de 7 días en cultivo.

Fig. 6. Aumento de dímero de IL-22 de la función ISC. A. Expresión del receptor de IL-22 en IS ISC aisladas de ratones indicadores Lgr5-GFP: el panel izquierdo indica la activación de las células GFP+, los paneles medio y derecho indican la expresión de IL-22R. B. Aumento del Ki-67 que demuestra la proliferación de SI ISC Lgr5-GFP+ de ratones informadores con EICH después del tratamiento con IL-22. C. Gran aumento del organoide in vitro que muestra el trazado del perímetro para la medición del perímetro y área del organoide.

D. Aumento del tamaño de los organoides SI después del cultivo con IL-22 durante una semana. D. Imágenes representativas. E. Tamaño de organoides después del cultivo con IL-22 murino. F. Tamaño del órgano después del cultivo con dímero de IL-22 humano F-652. *p<,05 ** p<,01, *** p<,001.

Fig. 7. La IL-22 y las células linfoides innatas aumentan el crecimiento de los organoides intestinales cultivados ex vivo. a, Microscopía de campo claro de organoides SI después de siete días de cultivo de ENR con o sin IL-22 (5 ng/ml). b, trazado microscópico del organoide para medir el perímetro y calcular el área de superficie. c-d, Perímetro (micras) y área (micras2) del plano horizontal a través de los organoides cultivados con 0-5 ng/ml de rmIL-22 durante siete días: c, SI; d, Li. e, IL-22 aumentó la formación de nuevas criptas (brotes) de los organoides SI (día 4) y LI (día 7). f-g, Tamaño (perímetro y área de superficie) de los organoides SI (f) y LI (g) cultivados en presencia del dímero F-652 de IL-22 humano. h, Tamaño de los organoides del SI cultivados en Matrigel con ENR /- IL-2, IL-15, IL-7 e IL-23 en presencia o ausencia de ILC en SI (proporción de cripta: ILC = 1:3). Datos combinados o representativos de al menos dos experimentos independientes. *p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Fig. 8. Modelos Gv L. A-B. GVL contra el linfoma A20. A, WT frente a células T donadoras de IL-22 KO. No se observó que la IL-22 de células T del donante afectara la GVL contra el linfoma A20. La supervivencia fue equivalente en los receptores de células T WT e IL-22 KO después de la exposición al tumor con A20. B, células T WT y IP PBS diaria frente a rIL-22. No se observó que la administración de IL-22 interfiriera con la GVL contra luciferasa+ A20 (A20 TGL) como lo demuestra la bioluminiscencia de tumores. C. Modelo de GVL alternativo potencial: leucemia relacionada con MLL. Las células T de donante median GVT contra la AML generada por transducción lentiviral con la construcción de fusión MLL-AF9. TCH con leucemia MLL-AF9. Se muestra un B6^-BALB/c BMT con leucemia MLL-AF9. La AML se generó mediante la transducción de BALB/c BM con la construcción MLL-AF9 y luego se transfirió a receptores secundarios para ensayar la GVL.

Fig. 9. Administración diaria de IP con la proteína rIL-22.

Se observó una disminución en la patología de la EICH en receptores de intestino delgado, intestino grueso e hígado tres semanas después del TCH. Histopatología LP ^B 6 BMT EICH 3 semanas después del trasplante con administración de IL-22. p<, 001.

Fig. 10. Recipientes tratados con proteína rIL-22. Los números aumentados de Lgr5+ ISC estaban presentes tres semanas después del t Ch durante la EICH activa sin inmunosupresión observada. Las células madre intestinales Lgr5+ 3 semanas después del trasplante con administración de IL-22. p<,05.

Fig. 11. FVB en trasplante BALB/c de MHC no coincidente con médula Rag2-GFP y células T WT. La administración de la proteína rIL-22 aumentó el desarrollo de emigrantes tímicos CD4 y CD8+ derivados de la médula del donante cuatro semanas después del TCH. Células T derivadas de médula 4 semanas después del trasplante con administración de rIL-22. p<,01.

Fig. 12. Administración de IL-22 post-TCH. LP^B6. (AB) 3 semanas después de la TCH después de la administración diaria de r-22 de IP de IL-22, BM sin células T (blanco), células BM T PBS IP (negro), células BM T IL-22 (gris): A, puntuación de patología EICH intestinal B, puntuación de apoptosis de la cripta intestinal. C, ELISA de IL-22 después del cultivo de lactobicillus in vitro, la barra izquierda es lacto-22s.

D, IL-22 FACS de lactobacilos anclados en la superficie IL-22 con ajuste de pH (rosado) o sin él (azul), y lactobacilos de control negativo (verde). D, Supervivencia (izquierda) y puntuación EICH (derecha) después de un TCH con glucosa diaria lacto, BM sin células T (negro, círculos), BM T PBS (negro, cuadrados), células BM T lacto-WT (verde), células BM T lacto-22s (rojo), células BM T lacto-22a (azul). *p<,05, *** p<,001.

Fig. 13. Administración de IL-22 disminuye la patología de EICH. LP en B6, 3 semanas después del BMT.

IL-22: 4ug día de inicio diario 7. *** = p<,001

Fig. 14. Administración de IL-22 disminuye la apoptosis de las criptas.

LP en B6, 3 semanas después del BMT. IL-22: 4ug día de inicio diario 7. *** = p<,001

Fig. 15. La administración de IL-22 aumenta la expresión de antimicrobianos innatos. LP en B6. 3 semanas post-BMT.

Fig. 16. IL-22 activa la señalización STAT-3 dentro de los organoides y aumenta la regeneración de ISC. a-b, qPCR para la expresión relativa de los genes Wnt3, p-catenina y Axin 2 del eje Wnt/p-catenina (a), así como el ARNm de los anticmicrobianos innatos Reg3p y Reg3y (b) en organoides SI cultivados con 0, 1 o 5 ng/ml de rmIL-22. Datos combinados de tres experimentos independientes. c, tinción intracelular de fosfo-STAT3 (Y705) en células organoides cultivadas en condiciones ENR seguidas de un pulso de 20 minutos de 20 ng/ml de IL-22, evaluada por citometría de flujo. d, Imágenes de Brightfield y mediciones de área de superficie de organismos del SI cuatro días después del cultivo de criptas con inhibidor ENR /- STAT3 Stattic. e, IL-22 indujo la activación de fosfo-STAT3 (Y705) en células Lgr5-GFP+. f-g, se cultivaron ISC individuales de Lgr5-GFP+ de SI en organoides en presencia o ausencia de rmIL-22 (1 ng/ml). f, IL-22 aumentó la brotación de organoides (día de cultivo 4). Las imágenes representativas de la brotación temprana se muestran en orden ascendente. * indica un organoide temprano sin brotes. A indica polarización antes de la brotación. t indica brote en un sitio de polarización. g, IL-22 también aumentó el tamaño de organoides en cultivos a partir de células madre únicas (día 13 de cultivo). h, IL-22 (1 ng/ml) condujo a una mayor incorporación de EdU en criptas organoides SI. i, IL-22 (1-5 ng/ml) aumentó el número de Lgr5-GFPhigh SI ISC. j, pasaje en serie demostró que se podrían generar mayores números de organoides después del cultivo con IL-22 (1 ng/ml). c-j se combinan o representan al menos dos experimentos independientes. *p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Fig. 17. La IL-22 reduce la patología del tejido intestinal sin alterar sustancialmente la inmunidad alorreactiva. Los ratones receptores B6 se trasplantaron con médula ósea empobrecida en células LP solo o con médula ósea y células T LP (H-2b^H-2b) para inducir EICH y se trataron diariamente con PBS o 4ug rmIL-22 por inyección de IP. a-b, la evaluación histopatológica se realizó en tejidos intestinales tres semanas después del BMT.

a, los gráficos de barras muestran la puntuación de la EICH y la apoptosis.

b, hematoxilina representativa y tinción de eosina de intestinos de ratones tratados con PBS o IL-22. Las flechas indican células apoptóticas dentro del epitelio intestinal. c, los esplenocitos de los destinatarios se analizan con citometría de flujo de tres semanas después de BMT, indicando frecuencias de subconjuntos de células T donantes, expresión de CD25 marcador de activación, y la expresión de la molécula de intestino homing a4p7 integrina. d, se analizó la expresión de citoquinas inflamatorias en el bazo e intestino delgado en tejidos receptores tres semanas después del BMT. e, la administración de IL-22 aumentó expresión de ARNm reg3p y Reg3yen el intestino delgado tres semanas después de BMT. Datos combinados o representativos de dos experimentos independientes con al menos nueve ratones por grupo. **p<0,01; ***p<0,001.

Fig. 18. IL-22 incrementa directamente los ISC de Lgr5+ in vivo independiente del nicho ISC. a-f, LP ^B 6 BMT (H-2b^H-2b) /- células T; los receptores fueron tratados diariamente con PBS o 4 pg rmIL-22 IP a partir del día siete después del TMO. Los datos se combinan de dos experimentos independientes con al menos siete ratones por grupo. a, LP ^B 6 BMT se realizó con ratones indicadores Lgr5-LacZ como receptores. Se evaluaron las ISC de Lgr5+ CBC de intestino delgado tres semanas después del BMT (después de dos semanas de PBS diario o rmIL-22). b, LP^B6 BMT con ratones informadores Lgr5-GFP como receptores. GFP+ ISCs se evaluaron mediante citometría de flujo para la expresión de Ki-67 catorce días después del BMT (después de una semana de DBSP o rmIL-22). c, Números de células de Paneth con lisozima positiva por cripta de intestino delgado tres semanas después del TMO. d, Expresión relativa (qPCR) de WNT3 y ARNm de EGF de intestino delgado de ratones con EICH tres semanas después del BMT. e, expresión de IL-22R de células de Paneth y fosforilación de STAT3 evaluada por citometría de flujo. Se muestran en la compuerta de células de Paneth en base a la dispersión lateral y la expresión de CD24 (panel izquierdo), expresión de IL-22R de células Paneth al inicio del estudio y cinco días después de 1.200 cGy de irradiación corporal total (panel medio), y fosforilación STAT3 en células de Paneth derivadas de organoide después de un pulso de 20 minutos de 20 ng/ml de IL-22 (panel derecho). f, Expresión relativa (qPCR) de ARNm de R-espondina-3 de intestino delgado de ratones con EICH tres semanas después del BMT. g, expresión relativa (qPCR) de los genes activados por Wnt p-catenina y Axin 2 en criptas aisladas de intestino delgado de ratones con EICH tres semanas después del BMT. h-i, los ratones se trataron por vía subcutánea con PBS o 100 pg/kg de F-652 cada dos días durante 10 semanas, comenzando una semana después del LP^B6 BMT. Los ratones receptores se monitorizaron para detectar signos clínicos de EICH (h) y mortalidad relacionada con EICH (i). *p<,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Fig. 19. El tratamiento con F-652 reduce la gravedad de la eliminación de FOX3P. La eliminación de T-reg después del tratamiento con toxina de la difteria (DT) (50 ug/Kg) de ratones FOX3P-DTR conduce a la autoinmunidad sistémica, incluida la autoinmunidad gastrointestinal. Esto altera la homeostasis de la cripta y afecta de manera negativa el compartimento de las células madre intestinales, como lo demuestra el deterioro del crecimiento de los organoides en el intestino delgado (SI). Las criptas SI se cosecharon ocho días después del tratamiento con DT. Cuando se compara con DT solo (+ PBS), la administración de F-652 (100 ug/KG) cada dos días (después del tratamiento con DT) protege el compartimento ISC de la regablación en T, como lo demuestra el aumento en el número de organoides observados. Después de 7 días en cultivo. Para cada determinación, se analizaron 20 campos seleccionados al azar de cuatro cultivos independientes y los valores se expresan como media DE. *p<0,01 vs CTRL (Anova one Way). ** p<0,05 frente a DT+ F-652 (Anova unidireccional). CTRL: control, DT: toxina diftérica.

Fig. 20. El tratamiento con F-652 mejora la supervivencia general y reduce los marcadores sistémicos de EICH in vivo. Diseño experimental: modelo de trasplante alogénico de médula ósea ajustado a LP^-B6 MHC, dosis dividida 1100cGy XRT, 5x10A6 células TCD BM, 4x10A6 células T CD5+ para los grupos de células BM T tratadas ya sea con PBS subcutánea o F-652 en una dosis de 100 pg/kg en días alternos. Los experimentos A-B fueron un modelo de trasplante alogénico de médula ósea alogénico con MHC con 10 ratones por grupo en cada uno de los grupos de tratamiento, 5 en el control de médula ósea solamente. Estos ratones comenzaron el tratamiento con F-652 o PBS siete días después del trasplante de médula ósea. A continuación, estos ratones recibieron inyecciones subcutáneas cada dos días durante diez semanas con F-652 a una dosis de 100 pg/kg o con PBS. A: puntuación de EICH sistémica para el experimento donde el tratamiento comenzó siete días después del BMT. B: supervivencia global para el experimento donde el tratamiento comenzó siete días después del TMO. * indica p<,05. Los experimentos de CD fueron un modelo de trasplante alogénico de médula ósea compatible con MHC con 5 ratones por grupo en cada uno de los grupos que recibieron tratamiento con F-652 o PBS solo después de que los síntomas sistémicos de EICH empezaron a desarrollarse (cuatro semanas después del BMT). A continuación, a estos ratones se les administraron inyecciones subcutáneas cada dos días con F-652 a una dosis de 100 pg/kg o con PBS. C: puntuación de EICH sistémica para el experimento donde el tratamiento se inició solo después de que los ratones mostraron síntomas de EICH. D: supervivencia global para el experimento donde el tratamiento se inició solo después de que los ratones exhibieron síntomas de EICH.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0067] La presente invención proporciona composiciones para el uso de IL-22 para el tratamiento de condiciones de lesión intestinal y condiciones inflamatorias tales como enfermedad injerto contra huésped. Específicamente, la IL-22 puede usarse para aumentar la recuperación de células madre iniciales (ISC) y para mejorar la reconstitución inmune después del trasplante alogénico hematopoyético. En realizaciones particularmente preferidas, la presente invención proporciona métodos de uso de IL-22 terapéutica, que incluye una forma dimérica de IL-22, en composiciones terapéuticas para tratar la enfermedad de injerto contra huésped, incluidas células afectadas tales como hepática, tímica, etc. Efectos de la enfermedad gastrointestinal u otro injerto contra huésped en pacientes con trasplante de células madre hematopoyéticas y en pacientes con afecciones inflamatorias intestinales.

[0068] El uso de IL-22 se informó para su uso en el tratamiento de enfermedades humanas, tales como la enfermedad pancreática (por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 6.551.799) y la hepatitis viral incluyendo para promover la supervivencia y la proliferación de hepatocitos (por ejemplo, Solicitud de Patente de Estados Unidos 20130171100, incorporada aquí como referencia en su totalidad). Sin embargo, la IL-22 no se usa actualmente como tratamiento para la EICH humana. De hecho, los inventores encontraron que el tratamiento de EICH con células T de donante diseñadas para producir IL-22 puede causar efectos no deseados, como un aumento de EICH en la piel.

[0069] Una IL-22 para su uso en la práctica del método de la presente invención puede no sólo generarse utilizando tecnología de ADN recombinant, sino también se puede producir a través de la fusión de polipéptidos heterólogos. Una descripción de otros métodos, vectores y células huésped para la síntesis de una IL-22 para uso en la práctica del método de la presente invención se puede encontrar en Gething et al., Nature, 293: 620-625; Mantei et al., Nature, 281: 40-46; EP117,060 y EP 117,058. La IL-22 recombinante, los dímeros y las proteínas de fusión de los mismos se producen utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Para más detalles, vea la solicitud publicada en EE.UU. N° 2013/0171100.

[0070] Las secuencias de ADN que codifican una proteína de dímero o fusión IL-22 pueden ser totalmente sintetizadas artificialmente. Alternativamente, el ADN que codifica IL-22 se puede obtener mediante amplificación o síntesis por PCR y luego se puede unir para formar una secuencia de ADN que codifica un dímero de IL-22.

[0071] Brevemente, las células huésped adecuadas son transformadas o transfectadas con un vector de expresión de IL-22 de acuerdo con métodos conocidos y posteriormente cultivados en condiciones conocidas por los expertos en la técnica para promover el crecimiento; las técnicas de transfección se describen con mayor detalle en, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual 3a edición, JF Sambrook y DW Russell, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.

[0072] Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de IL-22 también se conocen en la técnica e incluyen células de invertebrados, tales como células de insecto y células de mamíferos. Las células mamarias adecuadas incluyen ovario de hámster chino (CHO), células COS; en particular, la línea celular CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea celular de riñón de embrión humano 293 (Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1997)); CHO/-DHFR (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77: 4216 (1980)); células trofoblásicas del testículo murino (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251) (1980)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); células de cáncer de mama murino (MMT 060562, ATCC CCL51).

[0073] Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica IL-22 se puede insertar en un vector replicable para la clonación de genes o expresión de proteínas. En la técnica se conocen muchos vectores para la expresión de proteínas. Usando estas técnicas, una secuencia de ácido nucleico que codifica IL-22 se inserta en un vector apropiado, que puede incluir cualquiera de los siguientes: una o más secuencias de señales, un origen de replicación, uno o más genes informadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

[0074] Los métodos de transfección de células eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos también para los expertos en la técnica, y pueden incluir el uso de cloruro de calcio, precipitación con fosfato de calcio, lipofectamina o electroporación. Un experto en la técnica podrá seleccionar un método adecuado dependiendo de la célula huésped seleccionada.

[0075] En una realización, se utiliza una proteína recombinante que contiene IL-22 humana y producida en células CHO en cultivo libre de suero.

[0076] Una composición farmacéutica para uso en practicar el método de la presente invención comprende una cantidad segura y eficaz de la proteína IL-22 o dímero de fusión o conjugado del mismo y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. "Cantidad segura y efectiva" se refiere a una cantidad de un compuesto suficiente para mejorar significativamente la condición del paciente que lo necesita, sin causar efectos secundarios graves. En general, una composición farmacéutica de IL-22 comprende 0,001-1,000 mg de IL-22 o su dímero por dosis; en una realización, la composición farmacéutica comprende 0,05-300 mg de IL-22 o su dímero por dosis; en una realización adicional, la composición farmacéutica comprende 0,5-200 mg de IL-22 o su dímero por dosis.

[0077] Los excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden incluir celulosa y sus derivados (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa sódica, acetato de celulosa, etc.), gelatina, speckstone, agente lubricante sólido (por ejemplo, ácido esteárico, estearato de magnesio), sulfato de calcio, aceite vegetal (por ejemplo, aceite de arveja, aceite de sésamo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, etc.), polioles (por ejemplo, propilenglicol, glicerol, manitol, sorbitol, etc.), emulsionante (por ejemplo, Tween®), agente humectante (por ejemplo, lauril sulfato de sodio), colorante, agente saborizante, estabilizante, antioxidante, antiséptico, agua libre de pirógenos, etc.

[0078] Las vías de administración de IL-22, dímero, proteína de fusión o conjugado de la misma incluyen administración oral, administración rectal, administración parenteral (intravenosa, intramuscular o subcutánea) y administración parcial.

[0079] Los linfocitos alogénicos producen un fuerte efecto de injerto contra leucemia (GVL), pero el efecto beneficioso está limitado por la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). El agotamiento de las células T anuló los efectos de EICH y g Vl . Así, en los modelos de ratón inactivado y de ratón irradiado con IL-22, la IL-22 fue producida por células linfoides innatas (ILC) derivadas del receptor y se contempló como una señal para la recuperación epitelial después del trasplante alogénico experimental de células hematopoyéticas (alo-TCH). Estos receptores deficientes en IL-22 demostraron una mayor mortalidad por EICH y una pérdida significativamente mayor de células madre intestinales criptográficas (ISC) durante la EICH. Paradójicamente, la EICH también condujo a niveles reducidos de IL-22 gastrointestinal (GI) en receptores de tipo salvaje irradiados (WT) debido a la eliminación de células intestinales radiorresistentes (ILC). Por lo tanto, los inversores se sorprendieron al descubrir que la administración de IL-22 después de alo-TCH negó (redujo) el efecto de la eliminación de la ILC y redujo aún más la patología de EICH sin perjudicar las respuestas de injerto contra leucemia (GvL).

[0080] Los beneficios de usar composiciones y métodos de IL-22 que comprenden administrar IL-22 exógeno de la presente invención incluyen protección profiláctica y recuperación de la enfermedad de células de EICH que incluyen, entre otras, células del intestino delgado, intestino grueso e hígado.

I. Contribuciones de la IL-22 a la biología de las células del epitelio intestinal y la EICH.

A. Mantenimiento epitelial in vivo post-trasplante con y sin EICH.

[0081] Los números de células ISC y Paneth persisten después del trasplante en ausencia de EICH, sin embargo, estos números se reducen en EICH (Figs. 3D, 4E). La pérdida de ISC en EICH puede deberse a la pérdida de su nicho, o la pérdida de células de Paneth puede deberse a la pérdida de sus ISC parentales. Se cree que el epitelio velloso del SI se renueva cada 3 a 5 días en la homeostasis normal, mientras que las células de Paneth son más longevas, duran tres semanas o incluso más. Estas cinéticas pueden alterarse después del daño tisular y específicamente en el entorno del trasplante.

Renovación epitelial de Lgr5+ ISC en ratones sin EICH.

[0082] La medición de la expresión GI de moléculas implicadas con ISC y función de las células Paneth y la cinética de renovación epitelial. Usando C57BL/6 (B6), se desarrollaron ratones informadores de rastreo de linaje Lgr5-LacZ de fondo en colaboración con colegas de MSKCC. Estos ratones expresan una molécula informadora de pgalactosidasa en células Lgr5+ y en su progenie después del tratamiento con tamoxifeno. Al tratar a los ratones receptores con tamoxifeno el día del trasplante, esto permitirá la identificación de células en la cripta y las vellosidades regeneradas a partir de ISC de Lgr5+ después del trasplante. Los ratones serán evaluados por la cinética de la regeneración epitelial a partir de células Lgr5+ tanto en el tamaño pequeño como en el LI, y se prestará atención específica en el SI a la cinética de la renovación celular de Paneth. Los ratones se evaluarán 5, 7 y 10 días después de a) TBI subletal (550 cGy x1) y letal (550 cGy x2) en ausencia de trasplante, después de b) singeneico (B6^B6) TCD BMT y después c) células T singeneicas repletas de TMO para controlar los efectos de a) condicionamiento, b) trasplante celular y c) transferencia de células T en el impacto de la cinética de la renovación de células de Paneth desde ISC. Además del trazado del linaje, el tejido intestinal se recolectará para medir la expresión de ARN y proteína de los genes ISC informados (Lgr5, BMI-1, Hopx, mTert, Lrigl), genes de células de Paneth relacionados con la función ISC (Wnt3, EGF) mediante (q) PCR cuantitativa y transferencia western.

2. Renovación epitelial, pérdida de ISC y pérdida de células de Paneth en ratones con EICH.

[0083] Los números de células ISC y Paneth se reducen en EICH (Figs. 3D, 4E). La función de la cripta y la renovación de células de Paneth después del BMT se alteran debido a la pérdida observada de células de Paneth en la EICH. La pérdida se debe a una función deficiente de las células madre o se determinará la pérdida mediada por el sistema inmunitario de las células madre. La evaluación de la cinética de ISC y la pérdida de células de Paneth en la EICH se puede hacer para identificar la evidencia más temprana de daños a los ISC y su nicho. El rastreo de células epiteliales en ratones informadores del rastreo de linaje Lgr5-LacZ se puede realizar como se describe en el presente documento, sin embargo, en un entorno de trasplante de alo. Renovación de células cripta, vellosidad y Paneth post-BMT en receptores de LP ^B 6 (H-2b^ H -2 b) miHA y B10.BR^-B6 (H-2k^ H -2 b) Los trasplantes no coincidentes de MHC pueden ser evaluados, comparando los receptores de TCD BMT (sin EICH) frente a los receptores de médula ósea y células T (EICH). El trazado de linajes se puede realizar nuevamente 5, 7 y 10 días después del BMT para evaluar las cinéticas de la regeneración epitelial a partir de ISC de Lgr5+. La expresión de las moléculas relacionadas con células ISC y Paneth (Lgr5, BMI-1, Hopx, mTert, Lrigl, Wnt3, EGF) se puede medir de nuevo.

[0084] Además, una relación temporal entre la pérdida de ISC y la pérdida de células Paneth puede ser establecida por una medición de tiempo de estudio que mide números de células ISC y Paneth de orden pre-trasplante y 1, 3, 5, 7, 10, y 14 días post BMT. Esto se puede realizar utilizando ratones indicadores B6 de células madre de Lgr5-LacZ, en los que la molécula conservadora de p-galactosidasa se expresa de forma constitutiva en las ISC de Lgr5+ pero no en su progenie. Las ISC de Lgr5+ se pueden contar con el uso de ratones informadores, y las células de Paneth se pueden contar en función de su aspecto histológico característico después de la tinción con H&E. La primera evidencia directa de daño en el compartimiento de ISC se puede establecer para determinar si la pérdida de ISC o la pérdida de células de Paneth se produce antes de la otra en la EICH.

[0085] De acuerdo con el estándar en modelos murinos, TBI se puede utilizar como el método de pre-trasplante acondicionado. Además, la evaluación de la renovación epitelial GI después del tratamiento con dosis no mieloablativas y ablativas de quimioterapia se puede realizar mediante la evaluación de daños en el compartimento ISC en pacientes que se han sometido a un trasplante clínico. Los estudios propuestos destacan la expresión de Lgr5 como un marcador de ISC soportado por la función de células madre in vivo y ex vivo de las células Lgr5+. Un enfoque alternativo al fenotipado de células madre, como la evaluación de células CD44+CD166+CD24-. Las células de Paneth forman el nicho ISC en el SI pero están ausentes en gran medida en el LI, donde se cree que las señales Wnt se proporcionan a los ISC mediante células kit+ de soporte de nicho. Por lo tanto, los estudios descritos en este documento y los experimentos contemplados se describen en este documento para evaluar las células de Paneth en el SI en EICH. Se pueden realizar estudios adicionales sobre la LI evaluando histológicamente las células nichos ckit+ LI.

Daño de la cripta por EICH con un modelo in vitro de la función ISC.

[0086] Las ISC post-BMT pueden evaluarse mediante el cultivo de organoides intestinales de ratones transplantados. Las ISC se reducen en EICH mediante el uso de marcadores genéticos, fenotípicos e histológicos (Figs. 3D-E). Las células madre pueden evaluarse funcionalmente en la EICH por su capacidad para formar organoides intestinales in vitro. Las criptas se aislaron a partir del epitelio intestinal y pequeñas y se cultivaron en medio semisólido en presencia de factores de crecimiento de células madre (R-espondina1, EGF, noggin para SI; R-espondina1, EGF, noggin, HGF y Wnt3a para LI). Ya que cada cripta contiene un compartimento funcional de células madre con ISC y células de nicho de apoyo, las criptas cultivadas ex vivo crecen en organoides con yemas de cripta que recapitulan la organización intestinal in vivo con estructuras de cripta-vellosidades y lúmenes centrales (Fig. 6). Además, como prueba de su capacidad ISC, las células Lgr5+ individuales de SI y LI cultivadas de esta manera pueden generar sus propias células de nicho y formar organoides a partir de células individuales38, 39 Los alo-BMT descritos en el presente documento pueden realizarse aislando las criptas SI y LI de receptores sin EICH (médula de TCD sola) y receptores con EICH (médula células T). Las criptas se pueden recolectar en los días 1, 3, 5, 7, 10 y 14 post-TMO para evaluar la cinética del daño al nicho de células progenitoras/funcionales. Además, los ratones informadores Lgr5-GFP se pueden usar como receptores de trasplantes, de modo que las ISC únicas pueden aislarse mediante FACS post-BMT y cultivarse in vitro para evaluar la función de las ISC aisladas en EICH, lo que proporciona una lectura funcional del tallo nicho celular y específicamente ISCs en EICH.

4. Un sistema in vitro que modela las reacciones de GVH contra el nicho de células madre.

[0087] La EICH intestinal se manifiesta como una enfermedad intestinal, sin embargo, aparentemente es la culminación de un proceso sistémico que involucra la activación y migración de células T. De hecho, las interacciones directas que ocurren entre las células T alo y las células epiteliales receptoras no se conocen. Para visualizar y ensayar eficientemente los mecanismos sin limitar la invención a ningún mecanismo particular de daño mediado por células T en el nicho de células madre, un sistema in vitro que modela EICH intestinal con células T que interactúan directamente con el epitelio GI cultivado ex vivo puede ser ensayado En estudios preliminares, criptas cultivadas in vitro en presencia de células T alo tienen una capacidad reducida para crecer en organoides.

[0088] Por lo tanto, criptas SI y LI murinas se pueden aislar y cultivar en organoides en la presencia de células T alo. Las criptas se cultivan con células T vírgenes, células T pre-activadas policlonalmente (anti-CD3/anti-CD28) y células T activadas por APC de ratones de fondo de cripta. Las criptas pueden ser evaluadas por su capacidad para crecer en organoides. Esto permite la discriminación entre el requisito de pre-activación/presentación de antígeno y la capacidad del epitelio intestinal para activar las células T directamente para su propia eliminación, así como para las capacidades diferenciales de las células T CD4 y CD8. Los organoides se pueden contar y medir por diámetro y área mediante microscopía óptica. Las imágenes tridimensionales de alta resolución también pueden evaluarse mediante microscopía confocal. Además de cultivar criptas intactas, los experimentos anteriores pueden repetirse cultivando ISC individuales aisladas de ratones reporteros Lgr5-GFP con células T alo y midiendo la formación de organoides como se indicó anteriormente. Esto también permite obtener imágenes directas de las ISC en organoides cultivados mediante la expresión de GFP, y también permite la evaluación de las interacciones entre las células T alo y las ISC para determinar si las células T alo pueden eliminar o alterar directamente la función de las ISC.

[0089] Alternativamente, solo ISC se pudo aislar por FACS en base al fenotipo CD44+CD166+CD24'37. Además, esto proporcionaría un beneficio adicional de poder cultivar células de ratones de fondos adicionales.

B. Evaluar la elim inación de células madre en la EICH.

1. Evaluar ISC y la expresión de células de nicho de los receptores de la muerte antes y después del TMO.

[0090] La pérdida de ISC en EICH puede ser debido a la pérdida de sus células de Paneth que proporcionan nicho, o la pérdida de células de Paneth puede ser debido a la pérdida de sus ISC precursoras. Alternativamente, puede haber un daño no específico integral al compartimiento de ISC mediado por las células T alo que atacan tanto a las ISC como a las células de nicho. Planteamos la hipótesis de que las ISC y/o las células de Paneth expresarán los receptores de muerte que están involucrados en su eliminación inmune mediada en la EICH.

[0091] En este sub-diana podemos aislar células ISCS y de Paneth murinas de los ratones reportero Lgr5-GFP y fenotipar estas células por FACS para la expresión de receptores de muerte potenciales implicados en la EICH (Fas, TNFR, IFNyR, y DR5). La expresión se puede comparar al inicio del estudio, después de t Cd BMT y en ratones con EICH. Las células ISC y Paneth se pueden distinguir por la expresión de GFP en ISCs, y el fenotipo brillante CD24 granular (dispersión lateral alta) (ver Fig. 18E) para células Paneth. También podemos comparar las células ISC y Paneth por su expresión de MHC de clase I y II y su expresión de moléculas que podrían proporcionar resistencia a la apoptosis (BCl-2, Bcl-6 y c-FLIP).

2. Función de las moléculas citotóxicas de células T para dañar el compartim iento ISC.

[0092] Las vías de células T citotóxicas pueden estar implicadas en el daño del compartimiento de ISC durante EICH. Podemos ensayar la capacidad de las células T deficientes para las vías citotóxicas para dañar las ISC y su nicho in vivo e in vitro. Las criptas SI y LI pueden cultivarse con células T alo de ratones deficientes en ligandos de receptores de muerte de superficie celular o secretados (FasL, TNFa, IFNy, TRAIL), así como perforina y evaluar el número y tamaño del desarrollo de organoides como se describe en este documento. Las células T con el deterioro de la capacidad para dañar criptas in vitro se evalúan a continuación in vivo al realizar alo BMT con las células T deficientes y evaluar histológicamente post-BMT para ISC y eliminación de las células Paneth. Si el sistema de cultivo in vitro de células T alo/cripta no es confiable, los efectos de los posibles ligandos de muerte se pueden ensayar en los modelos tradicionales de EICH in vivo.

[0093] La utilización de células T citotóxicas deficientes requieren principalmente el uso de ratones B6 como la fuente de células T alo, prevenir el uso de ratones reporteros Lgr5 de fondo B6 para la lectura in vivo de lectura de expresión Lgr5 y para la selección de los CSI individuales para el cultivo con células T deficientes. Por lo tanto, los anticuerpos neutralizantes se pueden usar para bloquear las vías citotóxicas independientemente de las células T y las tinciones de criptas utilizadas, y pueden aislar ISC por FACS en base al fenotipo CD44+CD166+CD24'37y cultivarlas con células T deficientes en el fondo B.

Expresión de moléculas de ISC y moléculas de nicho en pacientes post-BMT.

[0094] La apoptosis de la cripta es una característica de GI EICH, y hemos observado una deficiencia de ISC y células de Paneth en modelos experimentales de EICH, y los recuentos bajos de células de Paneth se asocian con un aumento de la mortalidad no recidivante en los pacientes. Sin embargo, el daño específico al ISC y al compartimiento de células de nicho en la EICH clínica es poco conocido. Por lo tanto, podemos evaluar la expresión de moléculas relacionadas con ISC en pacientes con b Mt .

[0095] A fin de evaluar los CSI y su nicho en EICH clínica, podemos evaluar ARNm y expresión de proteínas de moléculas relacionadas con ISC en el tracto GI de los pacientes requiriendo la endoscopia para la evaluación de las quejas gastrointestinales postrasplante. Las muestras de biopsia para fines de investigación pueden ser adquiridas bajo el protocolo MSKCC IRB de pacientes sometidos a biopsias GI clínicamente indicadas relacionadas con los síntomas post-trasplante. Las muestras se compararon entre pacientes para los que se ha demostrado que tienen GI EICH demostrada por biopsia y los que no tienen EICH, incluidos los pacientes que se han sometido a trasplante TCD. Las muestras de tejido se pueden evaluar para determinar la expresión de Lgr5, BMI-1, Hopx, mTerc, Lrig1, Wnt3 y EGF como se describió anteriormente. Además, dados nuestros hallazgos del soporte mediado por IL-22 dependiente de IL-22 de las ISC en EICH experimental, también podemos evaluar la expresión de IL-22 e IL-23 en muestras biopsiadas. También podemos realizar IHC en estas muestras para identificar la expresión de IL-22R en criptas humanas. Finalmente, la expresión de GI de las moléculas enumeradas anteriormente puede compararse con su expresión en sangre periférica extraída el día de la endoscopia para evaluar la correlación entre la expresión intestinal y la sistémica.

[0096] Las muestras de biopsia también pueden ser evaluadas por FACS para identificar la expresión de IL-22R en las células de ISCS y Paneth fenotípicamente identificadas como se describe anteriormente con tinción CD44, CD166 y CD24. Alternativamente, los ISC podrían identificarse por hibridación in situ o IF para Lgr5.

Daño funcional al compartimiento ISC en pacientes con EICH.

[0097] Mientras que se cree que el daño ISC ocurre debido a los daños cripta encontrados en GI EICH, y aunque no hay datos para la pérdida de ISC en ratones con EICH, este tipo de daño no se ha demostrado directamente en los pacientes. Contemplamos que los pacientes con EICH tendrán menos ISC detectables que los pacientes sin EICH.

[0098] A fin de evaluar la pérdida de ISC en pacientes humanos con EICH, criptas Si y Li se pueden aislar de los pacientes sometidos a endoscopias y biopsias clínicamente indicadas para la evaluación de los síntomas GI post­ trasplante. Las criptas aisladas de muestras de biopsias de pacientes se pueden cultivar in vitro para la formación de organoides como se describe en este documento, comparando la generación de organoides de pacientes con o sin EICH, así como comparando la etapa de gravedad de EICH. Como alternativa, también podemos evaluar la pérdida de ISC y células de nicho realizando FACS de células aisladas para células de nicho de ISC como se describió anteriormente. Además, el tejido GI normal del departamento de patología del MSKCC también puede evaluarse para que sirva como control negativo de los efectos relacionados con el trasplante en el compartimento ISC.

C. Estrategias de apoyo de ISC para tratar la EICH.

[0099] Los inventores han identificado que los ratones deficientes para IL-22 han exacerbado la pérdida de ISC en EICH y muestran aquí que la administración exógena de IL-22 aumenta la recuperación de ISC. Por lo tanto, la IL-22 se puede usar para servir como factor de crecimiento de ISC en organoides in vitro y como tratamiento de EICH dirigido a epitelio en ratones con EICH.

1. Efecto de la IL-22 sobre los organoides in vitro.

[0100] Mientras que IL-22 puede mantener la integridad epitelial después del daño, el efecto de la IL-22 en el compartimiento de ISC es en gran parte desconocida. Nuestros datos preliminares indican que el IL-22R se expresa en las ISC (Fig. 7A) y que la administración de IL-22 a ratones con EICH aumenta la recuperación de las ISC (Fig. 4D). Además, hemos observado que la administración de IL-22 aumenta la proliferación de ISC in vivo (Fig. 7B) y que las criptas SI y LI cultivadas con 1-5 ng/ml de rmIL-22 crecen en organoides más grandes que las criptas cultivadas sin IL-22 (Figs. 7C-F).

[0101] El efecto de la IL-22 en la función de ISC puede observarse cultivando criptas e ISC aisladas como se describe anteriormente en presencia de 0,1-10 ng/ml de rIL-22, comenzando el día cero o el día dos de cultivo. IL-22 también se puede agregar en el día cero de cultivo y luego retirarse de los medios de cultivo en el día dos. Los organoides pueden evaluarse en cuanto a tamaño y número, y también pueden evaluarse mediante microscopía confocal para imágenes de alta resolución. Después de identificar las condiciones óptimas de cultivo de IL-22, podemos cultivar organoides de ratones indicadores Lgr5-GFP con IL-22 y luego evaluar la señalización, proliferación y expresión de JAK/STAT de moléculas antipoptóticas por FACS. También evaluamos el efecto de la IL-22 en criptas humanas aisladas de pacientes trasplantados.

[0102] Para comenzar la evaluación de un papel de IL-22 en la regulación del compartimiento de ISC, criptas de intestino delgado murino (SI) se aislaron y se cultivaron con EGF, Noggin, y R-espondina-1 (ENR) en presencia o ausencia de IL-22 murino (rm) recombinante. El cultivo de criptas con rmIL-22 durante siete días condujo al crecimiento de organoides sustancialmente más grandes que los cultivados con ENR solo (Fig. 7A). El aumento del tamaño de los organoides fue evidente tan pronto como 5 días después del cultivo. El trazado perimetral bidimensional de organismos cultivados en condiciones de cultivo tridimensional permitió una medición precisa del tamaño de los organoides (Fig. 7B). El cultivo con 0,5-5 ng/ml de rmIL-22 condujo a un aumento del crecimiento de los organoides del SI en una forma dependiente de la concentración según lo determinado por el perímetro y el área de la superficie (Fig. 7C). Aunque el cultivo con >5 ng/ml de rmIL-22 también condujo a un aumento del tamaño de los organoides, las concentraciones más altas de IL-22 dieron lugar a una disminución en el número de organoides cultivados a partir de criptas cultivadas (datos no mostrados). Esta toxicidad dependió de los efectos aditivos de las señales de crecimiento, ya que las concentraciones crecientes de R-espondina-1, Wnt3 y EGF redujeron aún más la eficiencia de recubrimiento de los organoides generados con IL-22 como porcentaje de criptas puestas en cultivo.

[0103] Además del tamaño aumentado de los organoides de SI, el cultivo con IL-22 condujo a un aumento del tamaño del perímetro y del área de superficie de los organoides del intestino grueso (Fig. 7D). Las ISC están ubicadas dentro de las yemas de las criptas que crecen durante el desarrollo de los organoides. El cultivo de IL-22 condujo a un crecimiento de criptas significativamente mayor en los organoides tanto SI como LI (Figs. 7A, E), lo que sugiere evidencia estructural de la regeneración del compartimento de las células madre. Además, una proteína dímera de IL-22 humana recombinante fue capaz de aumentar el tamaño de los organoides SI y LI (Figs. 7F, G), lo que sugiere un potencial de traducción para este compuesto.

[0104] Las ILC del grupo 3 son una fuente importante de GI IL-22 en la colitis, durante la infección bacteriana entérica y después de BMT13-16. Para determinar si las ILC podrían regular el compartimiento ISC y aumentar el crecimiento de organoides, las células CD45+CD11b-CD11c-B220-CD3-CD90+ se clasificaron de la lámina propia del intestino y se cultivaron en Matrigel con criptas SI recién aisladas. ENR proporcionó señales básicas para el desarrollo de organoides, y se incluyó un cóctel de citoquinas que incluía IL-23 para la activación de las ILC. La presencia de citoquinas de activación de la ILC solas no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de los organoides SI. Sin embargo, el co-cultivo con ILC condujo a un aumento del tamaño de los organoides (Fig. 7H), lo que demuestra el potencial de las ILC para regular el compartimento ISC y regeneración epitelial ex vivo.

[0105] A continuación, evaluamos la señalización intracelular activada por IL-22 dentro de los organoides. Aunque la señalización de Wnt/p-catenina es esencial para el mantenimiento de la ISC y la función organoide ex vivo12, no encontramos evidencia de una producción mejorada de moléculas en la ruta de Wnt/p-catenina dentro de los organoides del SI cultivados con IL-22, lo que incluye ninguna diferencia en expresión de Wnt3, p-catenina o Axin 2 (Fig. 16A). A pesar del hallazgo reciente de que Slit2 y Robol pueden regular la recuperación de ISC del daño inducido por la quimioterapia y la radiación17, tampoco encontramos diferencias en su expresión después del cultivo con IL-22 (no se muestra). Sin embargo, el cultivo de organoides con rmIL-22 condujo a un aumento del ARNm para Reg3p y Reg3y (Fig. 16B), moléculas antimicrobianas innatas cuya expresión depende de la señalización de STAT3.

[0106] Se sabe poco de JAK/STAT de señalización dentro de las ESI, aunque se ha informado de que la STAT3 puede ser importante para el mantenimiento de ISC. Evaluamos la señalización de STAT3 en organoides SI por flujo de fósforo y encontramos que la IL-22 condujo a la fosforilación de STAT3 Y705 (Fig. 16C). Además, el cultivo con el inhibidor STAT3 Stattic afectó significativamente el crecimiento de los organoides SI (Fig. 16D). Las ISC de Lgr5+ pueden generar todos los tipos de células del epitelio intestinal maduro in vivo y ex vivo. El examen de las células de la cripta SI aisladas de ratones indicadores Lgr5-GFP mediante citometría de flujo indicó una fosforilación de STAT3 Y705 dentro de las ISC de GFP+ en respuesta a la estimulación de IL-22 in vitro (Fig. 16E), lo que demuestra la señalización de IL-22 dentro de las células Lgr5+.

[0107] Para determinar si la señalización de IL-22-dependiente en ISC era funcionalmente significativa, aislamos Lgr5-GFP ISC por fluorescencia de células activadas por la clasificación, y ISC individuales cultivadas en Matrigel en condiciones estándar /- IL-22. IL-22 condujo a una brote significativamente mayor de los organoides tempranos después de solo cuatro días de cultivo (Fig. 16F), lo que finalmente resultó en un aumento del tamaño de los organoides después de comenzar con ISC individuales cultivadas en presencia de IL-22 (Fig. 16G). IL-22 puede actuar así en ISCs individuales para activar la fosforilación de STAT3 y acelerar el crecimiento de organoides.

[0108] Debido a que la IL-22 condujo a un aumento del tamaño de los organoides, el crecimiento de las criptas y la activación de STAT3, se intentó determinar si esto daba lugar a la expansión de las ISC. Se evaluó la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) en organismos cultivados con IL-22, ya que se ha demostrado que una corta incubación de organoides con EdU durante una hora corta marca la fase S de las células CBC de ciclo rápido. IL-22 condujo a una mayor incorporación de EdU organoide, lo que indica una proliferación aumentada dentro de las criptas organoides (Fig. 16H). Además, el cultivo de organoides derivados de ratones indicadores Lgr5-GFP con IL-22 indicó la expansión de las ISC de Lgr5-GFPhigh en respuesta a IL-22 (Fig. 16I). Finalmente, el pase en serie demostró que se podría generar un mayor número de organoides después del cultivo con IL-22, lo que indica aún más la expansión de los compartimentos funcionales ISC (Fig. 16J).

[0109] Los FACS de organoides cultivados purificados a partir de medios semisólidos pueden tener una alta tinción de fondo y pueden ser difíciles de interpretar. En ese caso, los organoides cultivados /- IL-22 podrían evaluarse para la proliferación y apoptosis por expresión génica. Además, se podría realizar una micromatriz para evaluar globalmente la expresión del gen de la cripta después del tratamiento con IL-22.

2. Efecto de la administración de IL-22 en EICH in vivo.

[0110] La biología de ISC aquí propuesta desarrolla una modalidad terapéutica para promover la función de ISC como un tratamiento dirigido a epitelio para la EICH. Los datos preliminares descritos en este documento indicaron que la producción de IL-22 está disminuida en la EICH debido a la pérdida de las ILC productoras de IL-22 (Fig. 2), y la reintroducción de IL-22 por la administración de rmIL-22 a ratones con EICH disminuye la patología EICH de intestino e incrementa la recuperación de ISC (Fig. 4). Además, la vía de la IL-22 no parece ser un componente de la GVL, ya que las células T KO de la IL-22, así como las células T WT en ratones tratados con la administración de rIL-22 demostraron una GVL equivalente contra las células tumorales del linfoma A20. (Figs. 8A, B).

[0111] Adquirimos un dímero de IL-22 humano de grado clínico, F-652 (Generon (Shanghai) Corporation Ltd ), que reacciona de forma cruzada con el IL-22R de ratón. Los beneficios potenciales de usar este dímero incluyen el uso en la traducción clínica junto con el beneficio de una vida media mayor si el dímero de IL-22 se compara con el IL-22 recombinante, como se describe en la Patente de EE.UU. US2003/0100076. Observamos que el F-652 fue capaz de aumentar el crecimiento de organoides in vitro (Figs. 7F, G). Por lo tanto, podemos ensayar el efecto de este dímero IL-22 en la recuperación de ISC, la patología y la supervivencia de la EICH, y en la GVL, además de otros efectos de crecimiento en los organoides in vitro. En una realización preferida, se contempla el uso de un dímero de IL-22 para tratar pacientes con afecciones que involucran tejido gastrointestinal inflamatorio que incluyen, entre otros, irradiación, tratamiento de radiación, tratamiento de quimioterapia, enfermedad inflamatoria del tazón, colitis, enfermedad de Crohn, trastornos autoinmunes, enfermedades infecciosas y enfermedad de injerto contra huésped. En otra realización preferida, el uso de un dímero de IL-22 se contempla como un tratamiento profiláctico para los pacientes que se someten a procedimientos que incluyen, entre otros, la exposición a la radiación, los tratamientos de quimioterapia, el trasplante de tejidos y el trasplante de células, incluidos los pacientes en riesgo de condiciones que involucran tejido gastrointestinal inflamatorio que incluye, entre otros, un paciente irradiado, un paciente de quimioterapia, un paciente con una enfermedad infecciosa, un paciente de trasplante, un paciente con una enfermedad autoinmune y similares.

[0112] El alo-BMT se puede realizar como se describió anteriormente con ratones informadores Lgr5-LacZ como receptores con modelos que no coinciden con mi-HA y MHC. Los receptores pueden tratarse antes del trasplante y/o después del trasplante con el dímero de IL-22 humano F-652 y luego sacrificarse tres semanas después del BMT para evaluar la patología de la EICH y la recuperación de ISC. Se puede realizar y evaluar Alo-BMT con receptores de WT para determinar las diferencias de supervivencia en la EICH después del tratamiento con F-652, y se pueden trasplantar ratones en presencia de tumores malignos hematológicos (como en la Fig. 8) para evaluar la eficacia de la GVL después del tratamiento con F-652. Ya que la administración de IL-22 puede ser más efectiva para promover la función de ISC si se le proporciona un agente inmunosupresor, también evaluaremos la combinación de la administración de F-652 con un anticuerpo neutralizador anti-IL-23 dirigido. Se describió el papel de la IL-23 en la estimulación de las células T alo para mediar en la EICH y el beneficio potencial de bloquearla en la EICH. Sin embargo, los anticuerpos neutralizantes anti-IL-23 pretenden evitar que las células T causen la EICH que se espera que limite la producción de expresión de IL-22 endógena. Por lo tanto, este enfoque combinatorio puede, por lo tanto, servir para limitar la EICH mediada por células T mediante el bloqueo de la IL-23 al mismo tiempo que promueve la función de ISC mediante la adición de la IL-22 que se pierde debido a la neutralización de la EICH y la IL-23. Si bien la neutralización de IL-23 es un tratamiento potencial de la EICH, no es un estándar de atención actual para el tratamiento de la EICH.

[0113] Los datos preliminares indican que la IL-22 puede reducir EICH por estimulación directa de la proliferación de ISC, y no por los CSI indirectamente de apoyo por la orientación de las células Paneth de apoyo a ISC (Figs. 4,7). Estas observaciones se realizan sin limitar la invención a ningún mecanismo particular. Por lo tanto, un enfoque alternativo es ensayar la reintroducción de nuevas células madre mediante la transferencia de ISC aisladas o criptas intactas a ratones con EICH como se ha descrito en un modelo experimental de colitis.

[0114] Números reducidos de ISC y células de Paneth de formación de nichos se han descrito recientemente en ratones con EICH. Dada la inmunidad alorreactiva estable después del tratamiento con IL-22, a continuación evaluamos el efecto de IL-22 directamente en el compartimiento de ISC. Realizamos BMT alogénico LP^B6 utilizando recipientes de Lgr5-LacZ para identificar ISCs después del trasplante. El BMT con células T condujo a EICH y una pérdida significativa de ISC Lgr5+ SI tres semanas después del BMT (Fig. 18a). Sin embargo, el tratamiento diario con rmIL-22 condujo a una mayor recuperación de las ISC de Lgr5+ incluso con una respuesta aloinmune en curso y sin inmunosupresión (Fig. 18A).

[0115] Para entender cómo la administración de IL-22 podría llevar a un mayor número de ISC en ratones con EICH, transplantamos ratones indicadores B6 Lgr5-GFP con células médula LP y células T. Los receptores se trataron diariamente durante siete días con rmIL-22 o PBS IP, y luego se aislaron las criptas SI y se evaluaron mediante citometría de flujo en el día 14 después del BMT. De acuerdo con nuestros hallazgos ex vivo de un mayor crecimiento de organoides e incorporación de EdU, las células Lgr5-GFP+ expresaron un aumento de Ki-67 después del tratamiento in vivo con rmIL-22, lo que indica que el tratamiento aumentó la proliferación de la reserva de ISC (Fig. 18B).

[0116] Las células Paneth proporcionan un microentorno de apoyo para las ISC de Lgr5+ a través de la entrega de señales Wnt y EGF a las células madre CBC. Además, se cree que la IL-22 regula las células de Paneth y su producción de moléculas antimicrobianas innatas. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la administración de IL-22 podría apoyar la recuperación de ISC post-BMT al mejorar el nicho de células madre y aumentar el soporte de ISC mediado por células de Paneth. Consistente con los estudios de los modelos experimentales clínicos de EICH y de desajuste de MHC, el trasplante de BMT B ^B 6 menor no emparejó el antígeno y condujo a una reducción en las células de Paneth tres semanas después del trasplante (Fig. 18C). Sin embargo, a pesar de la reducción en la patología del tejido (Fig. 17A), la administración de rmIL-22 después del BMT no aumentó la recuperación de las células de Paneth (Fig. 18C). Además, no observamos ningún aumento en el ARNm de SI para las moléculas Wnt3 y EGF derivadas de células de Paneth que se sabe que soportan las ISC de Lgr5+ (Fig. 18D). También encontramos poca evidencia de la expresión de IL-22R en células de Paneth al inicio del estudio o después de una lesión por radiación, y si bien aún pueden responder a la IL-22 en otras circunstancias, las células de Paneth no demostraron la fosforilación de STAT3 en respuesta a la IL-22. in vitro (Fig. 18E).

[0117] Aunque la IL-22 no mejoró la capacidad de soporte de nicho de las células de Paneth, seguía siendo posible que la IL-22 pudiera promover indirectamente la proliferación de ISC in vivo al aumentar el soporte de las células madre mediadas por estroma. Recientemente se demostró que las células estromales pueden contribuir al mantenimiento del nicho ISC, apoyando la homeostasis intestinal normal in vivo a través de la producción de Wnts y R-espondina-3, incluso en ausencia de Wnts33 derivados de células de Paneth33. Sin embargo, no encontramos evidencia de un aumento de las señales de Wnt derivadas de nichos después del tratamiento con IL-22 in vivo (Fig. 18F, G), lo que indica que la IL-22 puede inducir la proliferación de ISC después de un daño mediado por el sistema inmunitario sin actuar. ya sea la célula de Paneth o los nichos de células madre derivadas de estroma.

[0118] Por último, dado el claro efecto de la IL-22 en aumentar la regeneración ISC y recuperación epitelial in vivo, se evaluó el impacto de la administración de IL-22 en EICH sistémicos. Se ha propuesto que el daño GI puede ser fundamental para la patogénesis de la EICH sistémica. En consonancia con un informe reciente en el que se administró peri-trasplante de IL-22, no encontramos mejoría en la mortalidad por EICH después de la administración de F-652 a receptores de BMT no coincidentes con el MHC (no se muestra). Sin embargo, encontramos que un modelo de intervención temprana con F-652 a partir de una semana después de un BMT alogénico compatible con MHC condujo a una reducción de los signos sistémicos de EICH y mejoró significativamente la supervivencia general (Figs. 18H, I).

II. IL-22 lactobacilos como un nuevo enfoque terapéutico dirigido para la prevención y el tratamiento de la EICH clínica.

[0119] Como un enfoque alternativo para la reintroducción farmacológica de la IL-22, es decir, IL-22 exógeno, desarrollamos una estrategia probiótica con Lactobacillus que constitutivamente produce IL-22, ver más abajo y en la sección experimental. Así, en una realización, la IL-22 exógena se usa en métodos de tratamiento junto con un probiótico. En otra realización, se administra IL-22 exógena a pacientes como se describe en el presente documento, junto con un probiótico. En estudios preliminares, la administración de un probiótico de las presentes invenciones a ratones post-BMT pareció reducir la EICH sistémica.

[0120] Por lo tanto, se contemplan los lactobacilos IL-22+ como un nuevo enfoque terapéutico dirigido para la prevención de la EICH clínica y el daño tisular relacionado con el trasplante sin limitar las funciones inmunitarias esenciales del donante. Se demostró que la administración de lacto bacilo reduce la EICH experimental. Además, Lactobacillus paracasei es un componente normal de la flora GI humana. Por lo tanto, los inventores contemplaron el uso de Lactobacillus paracasei diseñado para administrar dosis terapéuticas de IL-22 exógena para proporcionar beneficios terapéuticos adicionales. De hecho, lo siguiente describe la creación y el uso de bacterias que expresan IL-22 junto con experimentos preliminares que muestran los resultados de la producción endógena reducida de IL-22, sección A. Se describen los métodos y los materiales para elaborar y usar lactobacilos IL-22+, incluidos los experimentos contemplativos. en la sección B.

A. TCH en ratones que expresan IL-22 endógena reducida.

[0121] Los receptores de IL-22-/- KO de TCH demostraron una mayor mortalidad luego de un TCH no compatible con el antígeno menor (Fig. 1A) y mayor (Fig. 1B), al igual que los receptores de tipo silvestre (WT) tratados sistémicamente con un anticuerpo neutralizante anti-IL-22 (Fig. 1C). El trasplante en receptores de IL-22 KO condujo a un aumento de la evidencia histopatológica de GI y EICH hepática (Fig. 2A). Por lo tanto, la IL-22 derivada del huésped afectó la mortalidad y la patología de la EICH tras el trasplante.

[0122] La expresión de IL-22 se encontró dentro del tracto GI (Fig. 2B) y el suero (Fig. 2E) después de alo-TCH. Sin embargo, los niveles de IL-22 se redujeron durante la EICH (Figs. 2B, E). La IL-23 intestinal, un regulador derivado de células dendríticas de la expresión de IL-22, también se expresó después de la TCH. CD45+CD3'RORyt+ ILC que produce IL-22 se identificaron en la lamina propia después de TCH agotado en células T (TCD) (Fig. 2G). Estas ILC eran células de tipo inductor de tejido linfoide IL-7R+CCR6+NKp46 derivadas del huésped. A pesar de su radiorresistencia, la ILC productora de IL-22 se eliminó rápidamente durante la EICH (Fig. 2G). Por lo tanto, la IL-22 derivada del huésped redujo la mortalidad por EICH, pero la respuesta de IL-22 a la lesión se debilita durante la EICH debido a la eliminación de la ILC del huésped.

[0123] Aunque la deficiencia de IL-22 del hospedador aumentó la EICH (Figs. 1A-C y 2A), no hubo diferencias observables en la infiltración intestinal de linfocitos del donante ni en la secreción de citoquinas en los receptores de IL-22 KO, lo que indica que la reducción de EICH fue improbablemente debido a la manipulación de la inmunidad de donante alorreactiva. La expresión de IL-22R intestinal se midió por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) con un aumento observado de IL-22R en el epitelio GI post-TCH.

[0124] La inmunohistoquímica (IHC) y la inmunofluorescencia (IF) indicaron la expresión de IL-22R dentro de las criptas intestinales donde se ubica el nicho ISC (Figs. 3A-C). Alo-TCH se transplantaron en ratones informadores Lgr5-LacZ, que produjeron p-galactosidasa aguas abajo de Lgr5 para identificar ISC. Como evidencia de la función de ISC, las células columnares básicas de la cripta Lgr5+ (CBC) fueron capaces de generar estructuras de cripta completas in vitro e in vivo. Se observó una reducción dramatica de ISC durante la EICH (Fig. 3D). Además, la evaluación del nicho ISC por IHC en ratones WT no informadores confirmó la pérdida de CBC/ISC durante la EICH (Fig. 3E). Sorprendentemente, los receptores de IL-22 KO demostraron la mayor pérdida de CBC/ISC (Fig. 3E) y el aumento de la apoptosis de las células epiteliales de la cripta (Fig. 3F) durante la EICH, lo que indica que la IL-22 protegió a las células ISC y progenitoras. Finalmente, los ratones IL-22 KO con EICH demostraron una expresión disminuida de GI de las moléculas antimicrobianas reguladas por IL-22 Reg3yy Reg3p y aumentaron la translocación de sebo del carbohidrato no absorbible FITC-dextrano después del desafío oral (Fig. 3G) que indica daño aumentado a la barrera epitelial.

[0125] Por lo tanto, el daño GI condujo a la inducción de IL-23. IL-23 a su vez puede estimular la producción de IL-22 por ILC. Esta IL-22 endógena protegió el epitelio y el compartimento de las células madre/progenitoras del daño del tejido inflamatorio. Sin embargo, la ILC productora de IL-22 necesaria para limitar el daño tisular se perdió durante la EICH. Como se muestra en este documento, la administración de rIL-22 después de la TCH mediante inyección intraperitoneal (por ejemplo, 4 pg/ratón al día) revirtió los efectos del agotamiento de la CLI y la pérdida de IL-22 en la patología de EICH en los intestinos y redujo la apoptosis dentre de las criptas intestinales donde se encuentra el compartimiento ISC/progenitor (Figs. 12A-B). Sin embargo, para uso clínico, la administración de citoquinas sistémicas es costosa y puede tener efectos sistémicos no anticipados. Por lo tanto, los inventores hicieron dos cepas de Lactobacillus paracasei que produjeron constitutivamente IL-22 (Figs. 12C-D). Una cepa produce IL-22 secretada (lacto-22s) mientras que la otra produce IL-22 anclada a la superficie de la célula bacteriana (lacto-22a).

B. Tratamiento de IL22 Lactobacilli de EICH.

[0126] Como se describe en este documento, después de descubrir que la deficiencia de IL-22 conduce a un aumento de EICH (Figs 1 a 3), la reducción de IL-22 mediada de EICH (Fig. 12), y la inducción de IL-22 dependiente de moléculas antimicrobianas post-TCH, se administró IL-22 post-TCH utilizando las bacterias lacto-22s y lacto-22a de las presentes invenciones como se describe en el presente documento. Las dos cepas de lactobacilos se administraron asociadas con TCH (Fig. 12E). Los ratones se sometieron a alo-TCH con médula ósea y células T para causar EICH. Comenzando en el día del trasplante, a los ratones se les administró Lactobacillus paracsei (lacto-WT) 108-109 de tipo silvestre, lacto-22, o lacto-22a se resuspendieron en PBS, o con PBS solo hasta el día 30 post-TCH. La EICH condujo a una mortalidad significativa en ratones administrados con PBS. Si bien hubo una tendencia hacia una mejor supervivencia en los ratones que recibieron lacto-WT, estos ratones aún sufrieron una mortalidad significativa debido a la EICH.

[0127] En contraste, los ratones que recibieron lacto-22 o lacto 22a no tienen significativamente diferente mortalidad en comparación con los ratones trasplantados sin células T. Además, los receptores de lacto-22 habían reducido significativamente los puntajes clínicos de EICH, una evaluación que abarca el peso, la calidad de la piel, la integridad de la piel, la postura y la actividad. Mientras que el cambio en el peso de los ratones después de la TCH puede servir como una medida alternativa para la GI GVGV, la naturaleza sistémica de estos hallazgos sugiere que la protección GI puede ser fundamental para prevenir la enfermedad sistémica de la EICH.

[0128] El alo-TCH emparejado con MHC empobrecido de células T se realizó como se describió anteriormente y los ratones se alimentaron diariamente con lacto-WT, lacto-22s y lacto-22a. Además, se contempla que la PCR para IL-22 se realice a partir de gránulos intestinales receptores para confirmar la presencia de lacto-22 en el tracto GI. El modelo alo-TCH adaptado al MHC coincide más estrechamente con los trasplantes que se realizan clínicamente en pacientes humanos, donde los donantes de trasplante se seleccionan de forma preferente en función de la correspondencia del MHC con el receptor. Además, se realizarán experimentos en los que se sacrificarán ratones tres semanas después del TCH para evaluar la patología de la EICH y la apoptosis de las criptas. Para ensayar directamente el efecto de lacto-22 en ISC, los trasplantes como se describió anteriormente se realizarán con ratones Lgr5-LacZ como receptores para evaluar la eliminación de Lgr5+ ISC. La administración de Lacto-22 se comparará con rIL-22 para la seguridad y la reducción de la patología GI y la mortalidad.

Efectos de la IL-22 producida por lactobacilos en el epitelio intestinal.

[0129] El tratamiento con Lacto-22 de ratones pareció reducir la mortalidad y los síntomas de la EICH. Por lo tanto, se contemplan experimentos para los efectos sobre el lacto-22 en el epitelio intestinal mediante la medición de IL-22 sistémica en suero por ELISA. ELISA para IL-22 a partir de muestras de tejido homogeneizado y evaluar los efectos posteriores de IL-22 dentro de los tejidos mediante la medición de STAT-3 fosforilado intestinal por IHC y Transferencia Western. Finalmente, la microscopía electrónica se realizará en un intento de obtener imágenes de si los lactobacilos gavagedizados pueden penetrar en el epitelio. Alternativamente, se cultivarán lactobicilos de la sangre o de homogeneizados de tejido de ratones transplantados para determinar si las bacterias están entrando en la circulación sistémica. Lacto-22 transporta un gen de resistencia para el cloranfenicol para facilitar la identificación adecuada de lacto-22 en condiciones de cultivo.

Efectos del lacto-22 sobre las células T del donante y la flora receptora.

[0130] B6 TCH en ratones BALB/c alo-TCH se tratarán diariamente con una sonda de lacto-WT y lacto-22 como se describe anteriormente. La médula del donante se derivará de CD45.1 B6 y las células T se derivarán de WT B6 (CD45.2+) para facilitar la identificación de las células T de donante por citometría de flujo. Se medirá la expansión de las células T del donante en el bazo, los ganglios linfáticos mesentéricos y la lámina propia del intestino, incluida la proporción de efectoras a células T reguladoras. También evaluaremos la expresión de los marcadores de activación/memoria en las células T del donante y las moléculas efectoras citotóxicas, incluido el ligando Fas. Expresión de citocinas en suero e intracelular para citoquinas inflamatorias, y mediremos mediante PCR la expresión en tejido epitelial de moléculas antimicrobianas innatas inducidas por IL-22 (Reg3y y Reg3p). Ya que los antimicrobianos aguas abajo de IL-22 pueden tener efectos en la flora y la presencia de lactobacilos administrados pueden tener efectos profundos en la flora, realizaremos una secuencia de 16S ARNr como hemos publicado recientemente para evaluar la diversidad de la microbiota después de la administración de lacto-22.

Efecto del lacto-22 sobre la GVL.

[0131] Dada la limitación de la expresión de IL-22R a células no hematopoyéticas, el lacto-22 no debe suprimir la GVL ni promover el crecimiento de tumores hematopoyéticos. Esta línea de experimentación es importante para la posible traducción clínica de lacto-22. Los experimentos preliminares con células T donantes de IL-22 KO o con células T WT después del tratamiento con rIL-22 in vivo no mostraron diferencias observables en la capacidad de GVL (Figs. 8A-B). Por lo tanto, los efectos del lacto-22 en la GVL se pueden medir realizando TCH repleto de células T con líneas de células tumorales estándar (A20, EL4). Los ratones pueden controlarse para determinar la progresión del tumor y la morbilidad/mortalidad relacionada. Además, el crecimiento del tumor se controlará por bioluminiscencia.

[0132] Aunque es experimentalmente eficaz, la TCH con líneas celulares tumorales representa un modelo con una correlación directa cuestionable con el trasplante clínico con neoplasias malignas de novo. Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo de GVL experimental (Fig. 8C) contra la leucemia mieloide aguda relacionada con la leucemia de linaje mixto (MLL). Los reordenamientos que involucran el gen MLL son particularmente relevantes para los estudios de trasplante, ya que son altamente prevalentes en la AML relacionada con la terapia, tienen un mal pronóstico clínico y son una indicación de alo-TCH31. Después de la sonda de lacto-22, se medirá la GVL frente a la AML inducida por transducción con MLL-AF9. Este modelo de leucemia secundaria de alto riesgo refleja la enfermedad clínica más estrechamente que las líneas de células tumorales. Por lo tanto, la progresión del tumor podría controlarse mediante el resultado del trasplante y la expresión del indicador de GFP en sangre periférica, bazo y médula.

EXPERIMENTAL

[0133] Los siguientes ejemplos se proporcionan a fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones preferidas y aspectos de la presente invención además, no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma.

[0134] En la descripción experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: N (normal); M (molar); mM (milimolar); pM (micromolar); mol (moles); mmol (milimoles); pmol (micromoles); mnol (nanomoles); pmol (picomoles); g (gramos); mg (miligramos); pg (microgramos); ng (nanogramos); 1 o L (litros); ml (mililitros); pl (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); pm (micrómetros); nm (nanómetros); grado C. (grados centígrados); Gy (gris) y cGy (centigris).

EJEMPLO I

[0135] Este ejemplo describe los materiales y métodos utilizados en el presente documento.

Materiales y métodos:

[0136] C57BL/6 (CD45.2 B6, H-2b), B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1 B6 congénico, H-2b), Il12b-/-B6, BALB/c (H-2d), y los ratones LP (H-2b) se obtuvieron de Jackson Laboratory. B6 y BALB/c Il22-/-ice fueron provistos por Genentech, al igual que el anticuerpo neutralizante anti-IL-22 8E11. Los ratones Lgr5-LacZ y Lgr5-GFP B6 fueron suministrados por H. Clevers (Barker et al., 2007). El procedimiento de TMO se realizó como se describió anteriormente (Petrovic et al., 2004), con una irradiación letal de dosis dividida de 850 cGy de huéspedes que recibían BALB/c de médula ósea (5x 106), células T agotadas con anti-Thy-1.2. y el complemento de bajo contenido de TOX-Mrabbit (Cedarlane Laboratories), o realizado con 1100 cGysplit de irradiación letal de huéspedes B6 que reciben médula ósea agotada de células T (5 x 106) también. Se prepararon células T donantes (típicamente 1 x 106B6 o 4x 106 LP, a menos que se especifique lo contrario) para el trasplante mediante la recolección de no esplenocitos y enriquecimiento para las células T ya sea por un pasaje de lana de nylon (rutinariamente> 70% de pureza de las células T) o por purificación de CD5 Miltenyi MACs (rutinariamente >90% de pureza). Los ratones receptores se controlaron para detectar la supervivencia y los síntomas clínicos de la EICH y se sacrificaron para realizar un análisis histológico y citométrico de flujo ciego como se describió anteriormente (Petrovic et al., 2004). En experimentos perimétricos, los ratones congénicos CD45.1 B6 se irradiaron letalmente y se reconstituyeron con médula de tipo silvestre o de Il22 -/- CD45.2. Tres meses después, se confirmó la reconstitución del donante mediante FACS de sangre periférica para CD45.1 frente a CD45.2, y los ratones quiméricos se irradiaron nuevamente (900 cGy, dosis dividida) y se transplantaron con médula LP (10 x 106) y células T (3 x 106).

Ratones.

[0137] Los ratones C57BL/6 (CD45.2 B6, H-2b) y LP (H-2b) se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, EE. UU.). Los ratones B6 Lgr5-LacZ y B6 Lgr5-gfp-ires-CreERT2 (Lgr5-GFP) fueron proporcionados amablemente por H. Clevers. Los ratones se alojaron en jaulas de microaislamiento, cinco por jaula, en instalaciones libres de patógenos MSKCC y recibieron comida estándar y agua potable esterilizada en autoclave. El mantenimiento y los procedimientos del ratón se realizaron de acuerdo con la guía de protocolo institucional del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering (MSKCC).

Aislamiento de criptas y disociación celular.

[0138] El aislamiento de las criptas intestinales y la disociación de las células para el análisis de citometría de flujo se realizaron en gran medida como se describió anteriormente. Brevemente, después de la eutanasia de los ratones a través de la asfixia con CO² y la extracción del intestino delgado y grueso, los órganos se abrieron longitudinalmente y se lavaron. El intestino delgado se ha incubado en ácido etilendiamino-tetraacetático (EDTA) 5 mM durante 60 min o 10 mM durante 25 min (4°C) para disociar las criptas; El intestino grueso fue incubado en colagenasa tipo 4 (Worthington) durante 30 min (37°C). Se recogió el sobrenadante que contenía las criptas. Para la desagregación de la cripta en células individuales, el sedimento de la cripta se incubó adicionalmente en 1x trypLE Express (Gibco, Life technologies) complementado con 0,8 KU/ml de DNasa1 (Roche). Las criptas aisladas para la extracción de ARN se resuspendieron en 1 ml de Trizol (invitrogen) y se almacenaron a -80°C.

Cultivo organoide.

[0139] 400 criptas por pocillo se suspendieron en factor de crecimiento licuado reducido Matrigel (Corning) (25% medio DMEM/F12 avanzado (Gibco); factor de crecimiento de 75% reducido Matrigel) a 4°C. Luego, se colocaron en placas Nunc de 24 pocillos precalentadas en superficie delta en gotas de 50 pl de intestino delgado y 30 ul de gotas de intestino grueso, cada una de las cuales contenía aproximadamente 100-500 criptas. Después de que las gotas de Matrigel se polimerizaran, se agregaron 500 ul de medio de cultivo de cripta completa a los cultivos de cripta de intestino delgado (medio ENR: DMEM/F12 avanzado (Sigma), L-glutamina 2 mM (Sigma), HEPES 10 mM (Sigma), 100 U/ml penicilina/100 pg/ml estreptomicina (Sigma), 1 mM N-acetil cisteína (Sigma), 1x B27 suplemento (Invitrogén), 1x N2 suplemento (Invitrogen), 50 ng/ml mEGF (Peprotech), 100 ng/ml de mNoggin (Peprotech) y 10% de medio condicionado con R-espondina-1 humana de hK-espondina-1 células HEK 293T transfectadas. En algunos experimentos que evalúan la brotación, la concentración de hR-espondina-1 se redujo a 1,25-5 Las criptas de intestino grueso se cultivaron en medio WENR que contenía 50% de medio acondicionado Wnt3a además de las proteínas mencionadas anteriormente y Albúmina de suero bovino al 1% (Sigma). Para cultivos de intestino grueso 10 uM SB202190 (Sigma, Cat.nr.S7067) y inhibidor de ALK5 (A83-01, Tocris) a la WENR. Todas las placas se incubaron a 37°C/5% de CO² y el medio se reemplazó cada 2-3 días. Los pocillos de control se dejaron sin tratar y, cuando fue aplicable, los pocillos de tratamiento recibieron diferentes concentraciones de IL-22 murino (rm) recombinante (Genscript) junto con cambios de medio. Las criptas se pasaron el día siete al interrumpirlas mecánicamente con un seropipeta, lavando el Matrigel girando las criptas en medio de exceso y repeliéndolas después de la reconstitución del sedimento en Matrigel licuado. También ensayamos los efectos de F-652, una molécula de dímero de IL-22 humana recombinante proporcionada por Generon (Shanghai) Corporation Ltd, China. En algunos experimentos, los organoides se cultivaron a partir de criptas en presencia de Stattic (compuesto inhibidor STAT tres, 6-Nitrobenzo[b]tiofeno 1,1 -dióxido; Tocris Bioscience).

[0140] Se aislaron células madre intestinales de ratones Lgr5-GFP usando un protocolo modificado de aislamiento de cripta con 20 minutos de 30 mM EDTA3,4 seguido por varios pasos de cebador y de una incubación de 5 min con TrypLE y 0,8 bajo vórtex de min a minuto para hacer una suspensión de células individuales. Las células Lgr5-GFPhigh se aislaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia. Se colocaron 5000 ILC en 30 uL. El factor de crecimiento redujo las gotas de Matrigel y se cultivó en WENR que contenía 10 uM de inhibidor de rho-quinasa Y-27632 en el medio y 1 uM de ligando Jagged 1 (Anaspec) e inhibidor de la Roquinasa (10 uM) en el Matrigel. Los cultivos ISC se cultivaron sin Wnt a partir de D4.

[0141] Para experimentos de co-cultivo de células linfoides innatas (ILC), los linfocitos intestinales se aislaron de la lámina propria del intestino delgado. Después de lavar pequeños fragmentos de intestino, 20 ml/solución de EDTA/IEL precalentado de ratón (1xPBS con 5% de FBS, 10 mM de tampón de Hepes, 1% de Pen/strep Corning, 1% de L-glutamina (Gibco), 1mM de EDTA y 1 mM Se añadió DTT, seguido de la colocación de las muestras en un agitador a 37°C durante 15 minutos. Las muestras se filtraron (100 uM) y se pusieron en una solución de colagenasa (RP-MI 1640, 5% FCS, 10 mM Hepes, 1% PS, 1% de glutamina y 1 mg/ml de colagenasa A (Roche) y 1u/ml de ADNasa 1 (Roche) y se dejó durante 10 minutos en el agitador a 37°C. Luego, las muestras se centrifugaron a 1500 rpm durante cinco minutos y se lavaron con Solución de RPMI sin enzimas. Después de varios lavados, la suspensión celular se transfirió a una solución de Percoll al 40% (Percoll en RPMI), que se superpone a una solución de Percoll al 80%. Después de girar la interfasa que contiene la lámina propia, se aspiraron las células mononucleares y se lavaron en medio. Luego, la suspensión celular se tiñó con marcadores extracelulares y Topro 3 para la viabilidad. Se seleccionaron y clasificaron las ILC como células Topro3-, B220-, CDllb-, CD11c-, CD45+, CD3 y CD90.2+. Se colocaron 1000 ILC con 400 criptas en el Matrigel por pocillo. Para los co-cultivos con ILCs rmIL-2 (1000 u/ml), rmIL-15 (10 ng/ml) y rmIL-7 (50 ng/ml) y rmIL-23 (50 ng/ml) se agregaron al medio ENR. Los cocultivos se compararon con las criptas cultivadas en la citoquina que contenía ENR sin las ILC presentes.

Trasplante de médula ósea.

[0142] Los procedimientos de trasplante de médula ósea (BMT) se realizaron como se describió previamente. Se utilizó un modelo de BMT menor de histocompatibilidad no coincidente con el antígeno (LP^B6, H-2b^ -H-2b). Los ratones hembra B6 WT se utilizaron típicamente como receptores para el trasplante a una edad de 8 a 10 semanas. Los ratones receptores recibieron 1.100 cGy de irradiación letal de dosis divididas (550 cGy x2) con un intervalo de 3 a 4 horas para reducir la toxicidad gastrointestinal. Para obtener células LP de médula ósea de ratones donados eutanasiados, se recolectaron asépticamente el flujo y la tibia y se lavaron los canales de médula ósea con medio estéril. Las células de la médula ósea se agotaron de las células T por incubación con el complemento de conejo anti-Thy 1.2 y bajo en TOX-M (Cedarlee Laboratories). La médula ósea empobrecida en células T se analizó para determinar su pureza mediante la cuantificación de las células T que contaminan restantes. La contaminación de las células T generalmente fue de aproximadamente el 0,2% de todos los leucocitos después de una sola ronda de agotamiento del complemento y del 0,1% después de una segunda ronda. Las células T de los donantes LP se prepararon recogiendo esplénocitos asépticamente de ratones donantes eutanasiados. Las células T se purificaron utilizando una selección positiva con microesferas magnéticas CD5 con el sistema MACS (Miltenyi Biotec). La pureza de las células se determinó por citometría de flujo y fue rutinariamente aproximadamente 90%. Los destinatarios típicamente recibieron 5x106 células de médula ósea con o sin 4 x 106 células T por ratón, a menos que se especifique lo contrario a través de una inyección en la vena de la cola.

[0143] Los ratones se monitorizaron diariamente para determinar la supervivencia y semanalmente los puntajes de enfermedad de injerto contra huésped (EICH) con un sistema clínico establecido de puntuación de EICH (incluido el peso, la postura, la actividad, la piel erizada y la integridad de la piel) como se describió anteriormente6. Luego se generó un índice clínico de EICH con una puntuación máxima de diez. Los ratones con una puntuación de cinco o más fueron considerados moribundos y sacrificados por asfixia con CO².

Administración de citocinas.

[0144] Murina recombinante IL-22 se adquirió de GenScript y se reconstituyó como se describe por el fabricante a una concentración de 40 |jg de IL-22/1000ul salina tamponada fosfato (PBS). Cada ratón se trató con o bien 100 j l de PBS o 100 j l de PBS que contenía 4 jg de IL-22 de ratón recombinante a diario a través de inyección intrapertitoneal. La administración de IL-22 se inició el día siete después del TMO. Este programa se basó en los resultados de la farmacocinética de rIL-22 ensayada en ratones no transplantados. Para la administración de F-652 in vivo, los ratones se trataron con PBS o 100 jg/kg de F-652 por vía subcutánea cada dos días durante diez semanas a partir del séptimo día posterior al BMT.

Análisis histopatológico de órganos diana de EICH.

[0145] Los ratones se sometieron a eutanasia para el análisis de órganos en D21 post-BMT utilizando asfixia con CO2. Para el análisis histopatológico de EICH, los intestinos delgado y grueso se conservaron en formalina, se incrustaron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Se calculó una puntuación semicuantitativa que consta de 19 parámetros diferentes asociados con EICH, como se describió anteriormente.

Tinción histológica de células de paneth y células madre.

[0146] Para la tinción de las células de Paneth, los intestinos fueron cosechados a partir de ratones sacrificados y conservados con formalina, embebidos en parafina, seccionados, y teñidos con una lisozima anti-humana de conejo policlonal 3.2.1.17 (Dakocytomaion). Para la evaluación de los números de células madre, se recolectaron pequeñas iteratinas de ratones receptores Lgr5-LacZ que fueron trasplantados con médula ósea LP (y células T cuando corresponda). La tinción con p-galactosidasa (LacZ) se realizó según lo descrito previamente por Barker et al. Los fragmentos de intestino delgado lavados de 2,5 cm de tamaño se incubaron con un fijador enfriado con hielo, que consiste en 1% de formaldehído, 0,02% de NP40 y 0,2% de gluteraldehído. Después de retirar el fijador, los órganos se tiñeron para detectar la presencia de LacZ. Luego, los órganos se conservaron en formalina, se embebieron en parafina, se seccionaron y se tiñeron de nuevo con Nuclear Fast Red (Vector).

Ensayo multiplex de citocinas.

[0147] El bazo y el intestino delgado se recogieron de receptores de BMT sacrificados. Luego se homogeneizaron los órganos, se hicieron girar y el sobrenadante se almacenó a -20°C hasta que se usó para el análisis de citocinas. Los ensayos de multiplexación de citoquinas se realizaron en muestras descongeladas con el kit de multiplexor de múltiplex FlowCytomix Th1/Th2/Th17/Th22 de ratón (eBioscience) y se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Citometría de flujo.

[0148] Para los experimentos in vivo que evalúan el efecto de la IL-22, los órganos linfoides se recogieron de ratones sacrificados y transformados en suspensión de células individuales. Las células se tiñeron con la mezcla apropiada de anticuerpos. Para el análisis de las moléculas intracelulares, se utilizó un kit de fijación/permeabilización de eBioscience según el protocolo del fabricante para la tinción intracelular. Después de un lavado completo, las células se tiñeron con anticuerpos intracelulares y extracelulares simultáneamente. Los anticuerpos marcados con fluorocromo para la tinción intracelular y extracelular se adquirieron de BD Pharmingen (CD4, CD8, CD24, CD25, CD45, a4p7, Ki-67 y P-STAT3 Y705), eBioscience (Foxp3) I+D (IL-22R) e Invitrogen (GFP). Se utilizaron DAPI y los kits de tinción de células vivas/muertas fijables (Invitrogen) para la tinción de viabilidad. Las células de Paneth se identificaron en función de la tinción con CD24 brillante y la granularidad de dispersión lateral, según lo descrito por Sato et al.7.

[0149] Para la citometría de flujo de células organoides de intestino delgado, el medio ENR se retiró y las criptas y Matrigel se resuspendieron en TrypLE durante aproximadamente ocho minutos. Después de pipetear vigorosamente a través de una pipeta p200 que causó la rotura mecánica, la suspensión de criptas se lavó con 10 ml de medio DMEM/F12 que contenía FBS al 10% y 0,8 KU/ml de DNasa1. Las suspensiones se evaluaron para determinar el porcentaje de células GFP+. En su caso, las células se tiñeron directamente o se fijaron por primera vez y se permeabilizaron según la ubicación extra o intracelular de la proteína diana. Todas las tinciones con células vivas se realizaron en PBS sin Mg2+ y Ca2+ con BSA al 0,5%. Para los experimentos de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), hubo una preincubación de 1 hora de EdU en el medio ENR de los cultivos de organoides intactos antes de disociar las células con el triángulo. Las células se tiñeron con los kits Click-it para la obtención de imágenes y la citometría de flujo (Life Technologies).

[0150] Para la tinción con fosfo-STAT3 en organoides, antes o para la fijación con PFA4% (10 min a 37°C), las células se estimularon como criptas rotas mecánicamente (como para el pasaje) o como células individuales (tripo), durante 20 minutos con 20 ng/ml de IL-22 a 37°C. En algunos experimentos, la estimulación con IL-22 se realizó con suspensiones de células individuales generadas a partir de criptas recién aisladas (no de organoides). Después de obtener una suspensión celular única de células estimuladas y fijas, las muestras se filtraron (40 j M) y se permeabilizaron con metanol enfriado en hielo (-20°C). Células fijas/permedidas se rehidrataron con PBS y se lavaron concienzudamente con PBS antes de la tinción, se realizó la tinción con anti-fosfo-STAT3, anti-GFP y/o marcadores de superficie celular durante 30 minutos a 4°C. Toda la citometría de flujo se realizó en un citómetro LSR II (BD Biosciences) utilizando FACSDiva (BD Biosciences), y los datos se analizaron con el software Flow-Jo (Treestar).

Medición de organoides.

[0151] Números de organoides por pocillo se contaron mediante microscopía óptica para evaluar la eficiencia de crecimiento en cultivo día siete. Para la evaluación del tamaño, se tomaron fotografías bidimensionales de microscopía de campo brillante utilizando un microscopio del sistema de imágenes en vivo Meta-Morph Widefield con objetivos de Zeiss 5x (0,25NA DRY) y 10x (0,3 NA DRY), que presentan la sección transversal horizontal más grande de cada organoide. El área y el perímetro de cada sección transversal se midieron con el software MetaMorph.

qPCR

[0152] Para la PCR cuantitativa (q), se recolectaron segmentos de pequeñas criptas aisladas o aisladas de ratones sacrificados y se almacenaron a -80°C. El ARN se extrajo de esos tejidos y se almacenó a -20°C. Alternativamente, el ARN se aisló de los organoides después del cultivo in vitro. La transcripción PCR inversa se realizó con un kit de transcripción inversa Quanti-Tec (QIAGEN). Se obtuvieron cebadores específicos para PCR en tiempo real de Applied Biosystems como sigue: Beta-actina: Mm01205647_g1; HPRT: Mm00446968_m1; Reg3p : Mm00440616_gl; Reg3y: Mm00441127_m1; WNT3: Mm00437336_m1 y EGF: Mm00438696_m1; Rspo3: Mm00661105_m1; Axin2: Mm00443610_m1; Beta-catenina: Mm00483039_m1. qPCR se realizó en un Step-One Plus (Applied Biosystems) con TaqMan Universal PCR Master Mix (Aplied Biosystems). Las cantidades relativas de ARNm fueron calculadas por el método comparativo ^A C(t) con beta-actina o HPRT como genes de limpieza.

Estadística y software.

[0153] Todas las barras y barras de error representan los medios SEM para los diversos grupos. Para las comparaciones de dos grupos, se realizó una prueba de t o una prueba de U no paramétrica. ANOVA se utilizó para comparaciones de más de dos grupos. Todas las estadísticas se calcularon y los gráficos de visualización se generaron utilizando Graphpad Prism. Todos los experimentos se realizaron al menos dos veces con al menos 3-5 ratones en cada grupo.

Análisis histopatológico de órganos diana EICH.

[0154] Ratones EICH se sacrificaron, y el intestino delgado, intestino grueso, y el hígado se retiraron, se conservaron con formalina, se embebieron en parafina, se seccionaron, y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E). Puntuación se realizó como se describió previamente (Petrovic et al., 2004).

[0155] Análisis de Tejido y Citometría de Flujo. Los órganos linfáticos de ratones con EICH se procesaron en suspensiones de células únicas y se aislaron linfocitos de la lámina propia después de la disociación del epitelio y la degradación en DNasa I (Roche) y Colagenasa D (Roche). Se realizó con el cóctel de anticuerpos correspondiente y se utilizó un kit de fijación/permeabilización de eBioscience según el protocolo del fabricante para la tinción intracelular. Los FACS para IL-22R (rata anti-mouseIL-22R a anticuerpo 496514, sistemas de I+D) incluyeron tinción tanto superficial como intracelular. La tinción intracelular de citoquinas se realizó con anti-IL-22 (1H8PWSR, eBioscience), anti-IFN-g (XMG1.2, BD PharMingen) o anti-TNF-a (MP6-XT22, BD PharMingen) después de 5 h de reestimulación con BD GolgiPlug (1 ul/ml) e IL-23 (40 ng/ml) para la expresión de IL-22 o forbol-12-myris-tate-13-acetato (50 ng/ml) y ionomicina (500 ng/ml) para IFN-g y TNFexpression. iL-22 e IL-23 ELISA se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (BioLegend) en homogeneizados de intestino delgado y grueso o sobrenadantes de intestino que se cultivaron a 37°C durante la noche en RPMI con FBS. Immunohistoquímica, inmunofluorescencia, TUNEL, LacZ e ISC se recolectaron de ratones normales, fijados con formalina y teñidos con IL-22R anti-ratón de ratón formados con formalina frente a isquicontrol y/o lisozima de conejo policlonal 3.2.1.17 (Dacocitomación). La tinción secundaria por inmunofluorescencia se realizó con AF488 fILR-22R y AF568 para la lisozima. El ensayo TUNEL se realizó en tejido fijado con formalina/embebido en parafina como lo describen Gavrieli et al. (1992). Para las plantas trans de Lgr5-LacZ, se obtuvieron segmentos de íleon de 2,5 cm, y la tinción para detectar la presencia de beta-galactosidasa (LacZ) se realizó según Barker y otros (2007). En resumen, los pequeños testículos se fijaron en formaldehído al 1%, glutaraldehído al 0,2% y NP40 al 0,02% en PBS y luego se incubaron con sustrato de balactosidasa. Luego, los tejidos se fijaron de nuevo en PFA al 4% en PBS y se incluyeron en parafina, y las secciones se contrastaron con Nuclear Fast Red (Vector). Para evaluar las ISC en ratones no informadores, se identificaron células madre intestinales de base cripta como informadas por su morfología y su ubicación en la cripta base entre las células de Paneth (Barker et al., 2007). transcripción inversa-PCR de PCR cuantitativa se realizó con un kit de transcripción inversa QuantiTect (QIAGEN). Para la PCR en tiempo real, se obtuvieron conjuntos específicos de cebadores y sondas de Applied Biosystems de la siguiente manera: Beta-actina: Mm01205647_g1, Reg3b: Mm00440616_g1, y Reg3g: Mm00441127_m1. La PCR se realizó en ABI7500 (Applied Biosystems) con TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Las cantidades relativas de ARNm de Reg3g y Reg3b se calcularon mediante el método de DC (t) comparativo.

[0156] Estadística. Las barras y las barras de error representan los medios SEM, respectivamente, para los diversos grupos. Los datos de supervivencia se analizaron con la prueba de log-rank de Mantel-Cox. Se utilizaron análisis puntuales de supervivencia de Fornons, prueba t no pareada para las comparaciones entre dos grupos experimentales, o prueba U de Mann-Whitney no paramétrica para distribuciones no gaussianas y ANOVA para comparaciones con más de dos grupos. Los trasplantes de supervivencia se realizaron con 10-38 ratones por grupo, y todos los demás experimentos se realizaron al menos dos veces con al menos seis ratones por grupo.

[0157] Tanto los trasplantes de no ajustados de histología incompatibles de MHC como los de menor importancia (miHA) se realizan para modelar EICH altamente agresivos y escenarios de trasplante clínicamente relevantes. Los ratones receptores están condicionados con un TBI letal, ya que la farmacocinética de la quimioterapia de dosis altas es difícil de controlar experimentalmente. Luego, los receptores se trasplantan con médula ósea agotada de células T (TCD), que se complementa con células T purificadas con perlas magnéticas para controlar los efectos de la EICH. Los ratones receptores se monitorizan después del trasplante para detectar signos clínicos de EICH (incluido el peso, la actividad, la postura, el pelaje y la integridad de la piel) de acuerdo con el MSKCC IACUC, y los receptores se sacrifican rutinariamente entre 2 y 3 semanas después del trasplante para evaluar la función de células T y la patología EICH. Los análisis estadísticos se realizarán con Sean Devlin, especialista en bioestadística para el servicio MSKCC BMT. En general, los trasplantes se realizarán con al menos cinco ratones por grupo, y todos los experimentos se repetirán al menos una vez. Las comparaciones entre dos grupos se harán con pruebas U no paramétricas. Los experimentos con más de dos grupos serán evaluados por ANOVa .

[0158] Cultivo organoide: las criptas se aislaron del intestino delgado y grueso del epitelio intestinal y se cultivaron en medio semisólido en presencia de factores de crecimiento de células madre (R-espondinal, EGF, noggin para SI; R-espondinal, EGF, noggin, HGF, y Wnt3a para el intestino grueso). Ya que cada cripta contiene un compartimento funcional de células madre con ISC y células de nicho de apoyo, las criptas cultivadas ex vivo crecen en organoides con yemas de cripta que recapitulan la organización intestinal in vivo con estructuras de cripta-vellosidades y lúmenes centrales (Fig. 6). Además, como prueba de su capacidad ISC, las células Lgr5+ individuales de intestino delgado e intestino grueso cultivadas de esta manera pueden generar sus propias células de nicho y formar organoides a partir de células individuales 38, 39. Los alo-BMT se realizaron como se describe y las criptas de intestino delgado e intestino grueso se aislaron de receptores sin EICH (médula de TCD solo) y receptores con EICH (células de médula T). Las criptas se cosecharán los días 1, 3, 5, 7, 10 y 14 después del BMT para evaluar la cinética del daño al nicho de células madre/progenitoras funcionales. Además, los ratones informadores Lgr5-GFP serán receptores de trasplantes, de modo que las ISC únicas puedan aislarse mediante FACS post-BMT y cultivarse in vitro para evaluar la función de las ISC aisladas en la EICH. Esto proporcionará una lectura funcional del nicho de células madre y específicamente de ISC en EICH.

EJEMPLO II

[0159] La IL-22 derivada del huésped es importante para limitar la mortalidad y la patología de la EICH después del trasplante.

[0160] La eliminación del receptor IL-22 aumenta la mortalidad después del trasplante: dado el papel protector informado para la IL-22 en el daño del tejido GI, comenzamos a evaluar la función del IL-22 después del BMT.

[0161] Los receptores inactivados de IL-22 (KO) demostraron un aumento de la mortalidad luego de un BMT no compatible con el antígeno, tanto menor (Fig. 1A) como mayor (Fig. 1B), al igual que los receptores de tipo silvestre (WT) tratados sistémicamente con un anticuerpo anti-neutralizante IL-22 (Fig. 1C). La deficiencia de IL-22 en la médula donante (Fig. 1D) o en las células T (Fig. 1E) no tuvo un impacto observable en el resultado. El BMT de intensidad reducida (dosis de células T y radiación más bajas) en las quimemias hematopoyéticas indicó que la deficiencia de IL-22 limitada al compartimiento hematopoyético del hospedador incrementó la mortalidad por EICH (Fig. IF), el trasplante en los receptores de IL-22 KO condujo a un aumento de la evidencia histopatológica de GI EICH (Fig. 2A).

[0162] La IL-22 se expresa post-BMT y se reduce durante la EICH: a continuación identificamos la expresión de IL-22 dentro del tracto GI (Figs. 2B-C), timo (Fig. 2D) y suero (Fig. 2E) después de Alo-BMT. Sin embargo, los niveles de IL-22 se redujeron durante la EICH (Figs. 2B-E). La expresión de IL-22 en el tejido se indujo después de la irradiación corporal total (TBI) sin BMT (Figs. 2D, F), y la IL-23 intestinal, un regulador derivado30 de células dendríticas de la expresión de IL-22 31-34, también fue expresado post-BMT y después de TBI sin BMT. ILCs CD45+CD3-RORyt+ que producen IL-22 fueron identificados en la lámina propia después de células T empobrecidas (TCD) BMT (Fig 2G). Estas ILC eran IL-7R+CCR6+NKp46‘ derivadas de células huésped tipo inductor de tejido linfoide, y comprendían más del 50% de las ILC de lámina propia incluso tres meses después del BMT-TCD. Otros productores de iL-22 intestinal no fueron identificados después del BMT. A pesar de su radiorresistencia y persistencia a largo plazo después del BMT-TCD, las ILC que producen IL-22 se eliminaron rápidamente durante la ElCH (Fig. 2G). Estos datos indican que a) la IL-22 se expresa después del BMT pero se reduce durante la EICH debido a la eliminación de las ILC del huésped yb) la IL-22 derivada del huésped reduce la mortalidad después del BMT.

[0163] Las ISC expresan IL-22R: aunque la deficiencia de IL-22 del hospedador aumentó la EICH (Figs. 1-2A), no se encontraron diferencias observables en la infiltración intestinal de linfocitos del donante o la secreción de citoquinas en los receptores de IL-22 KO, lo que indica que la reducción de EICH no se debió a la manipulación de la inmunidad de donante alorreactiva. Para identificar los objetivos directos de la IL-22, evaluamos la expresión de IL-22R intestinal mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y observamos un aumento de IL-22R en el epitelio GI post-BMT.

[0164] La inmunohistoquímica (IHC) y la inmunofluorescencia (IF) indicaron la expresión de IL-22R dentro de las criptas intestinales donde se ubica el nicho ISC (Figs. 3A-C). La expresión de ISC de IL-22R se confirmó mediante FACS de ISC autorizadas de ratones informadores Lgr5-GFP (ver Fig. 7A).

[0165] Las ISC se pierden en la EICH y la eliminación de IL-22 conduce a una mayor pérdida de las ISC durante la EICH: para determinar si las ISC podrían ser objetivos de la EICH, realizamos alo-BMT en ratones informadores Lgr5-LacZ, que producen p-galactosidasa aguas abajo de Lgr5 para identificar ISCs8. Como evidencia de la función de ISC, las células Lgr5+ CBC individuales pueden generar estructuras de cripta completas in vitro e in vivo. De acuerdo con los hallazgos reportados, observamos una reducción dramática de ISC durante la EICH (Fig. 3D). Además, la evaluación del nicho ISC por IHC en ratones WT no informadores confirmó la pérdida de ISC CBC durante la EICH (Fig. 3E). Sorprendentemente, los receptores de IL-22 KO demostraron la mayor pérdida de ISC CBC (Fig. 3E) y el aumento de la apoptosis de las células epiteliales de la cripta (Fig. 3F) durante la ElCH, lo que indica que IL-22 protege a las ISC y los progenitores. Finalmente, los ratones IL-22 KO con EICH demostraron una expresión disminuida de GI de las moléculas antimicrobianas reguladas por IL-22 Reg3yy Reg3p y aumentaron la translocación de sebo del carbohidrato no absorbible FITC-dextrano después del desafío oral (Fig. 3G), lo que indica un mayor daño a la barrera epitelial GI.

[0166] La administración de IL-22 conserva las ISC en la EICH y reduce la patología de la EICH: dada la reducción de la expresión de la IL-22 en la EICH y la pérdida exacerbada de las ISC en la EICH con deficiencia de IL-22, a continuación se examina el efecto de la administración de IL-22 en EICH. Encontramos que la administración diaria de rmIL-22 (4ug IP al inicio del día 7) condujo a una patología EICH disminuida en el receptor SI, LI e hígado tres semanas después del BMT (Fig. 4A); no se observaron diferencias patológicas en la piel (Fig. 4B). Los receptores de rIL-22 tuvieron una disminución de la apoptosis de la cripta intestinal (Fig. 4C) sin diferencias en los niveles de citoquinas inflamatorias intestinales. Para evaluar los efectos de la administración de IL-22 en el compartimiento ISC, realizamos LP en B6 alo-BMT utilizando ratones informadores ISC Lgr5-LacZ. Los receptores tratados con rIL-22 demostraron un mayor número de ISC de Lgr5+ tres semanas después del BMT durante la EICH activa sin inmunosupresión (Fig. 4D). Además, encontramos un aumento en la proliferación de ISC después del tratamiento con IL-22 en EiCH utilizando el Lgr5-GFP reportero (ver Fig. 7B).

[0167] La administración de IL-22 aumenta la función de ISC sin mejorar el nicho de ISC: dada la pérdida de ISC que observamos en la EICH, se intentó evaluar las células de Paneth que constituyen el nicho de ISC en el mantenimiento epitelial normal. De manera similar a lo que se informó en la EICH agresiva no compatible con el MHC, observamos una reducción en las células de Paneth en un modelo de EICH de falta de coincidencia menor (Fig. 4E). Sin embargo, aunque la administración de IL-22 aumentó la recuperación de las ISC de Lgr5+ en la EICH, no se observaron diferencias en el número de células de Paneth después de la administración de IL-22 (Fig. 4E). Además, no hubo diferencias en la expresión del ARNm de Wnt3 o EGF, argumentando que el beneficio de las células madre después de la administración de IL-22 no se debió a una mejora en la función de nicho de ISC (Fig. 4F). En contraste, el tratamiento con IL-22 condujo a un aumento de la expresión de Reg3yy Reg3p Fig. 4G), lo que sugiere un potencial beneficio antimicrobiano de la administración de IL-22.

[0168] Resumen: Nuestros datos preliminares revelan redes recíprocas entre el epitelio y el sistema inmune, donde el daño del tejido GI conduce a la inducción de IL-23, que puede estimular la producción de IL-22 por las ILC. Esta IL-22 protege el epitelio y el compartimiento ISC de daño inflamatorio del tejido. Sin embargo, las ILC que producen IL-22 necesarias para promover la función ISC se pierden durante la EICH. Esto indica que la EICH conduce al daño del compartimiento ISC y su capacidad para mediar la regeneración epitelial después del daño tisular. Esto también sugiere un posible enfoque terapéuti

embargo, la traducción efectiva de estos hallazgos requiere una comprensión detallada de la homeostasis intestinal normal después del trasplante, el daño infligido directamente a las ISC y su nicho de células de Paneth, y el efecto de la IL-22 en las ISC y sus progenitores.

EJEMPLO III

Administración diaria de IP con rIL-22.

[0170] Un LP clínicamente modelado en modelo no coincidente de antígeno C57BL/6 menor (B6) con médula empobrecida en células T y células T purificadas con MACS transplantadas en ratones con radiación letal. Los receptores se trataron diariamente con PBS o 4 |jg de IL-22 recombinante murina (r) administrada mediante inyección intraperitoneal (IP) a partir del día 7 después de la TCH. Este programa se basó en los resultados de la farmacocinética de rIL-22 ensayada en ratones no trasplantados.

[0171] La administración diaria de IP con rIL-22 condujo a una patología de EICH disminuida en el intestino delgado, intestino grueso e hígado del receptor tres semanas después del TCH (Fig. 9, p<,001). No se observaron diferencias en la histopatología de la piel, lo que concuerda con nuestro hallazgo anterior de que los receptores con deficiencia de IL-22 demostraron una EICH cutánea equivalente. Una evaluación adicional de la patología intestinal indicó que los receptores de rIL-22 habían disminuido la apoptosis de la cripta intestinal tanto en el intestino delgado como en el grueso (p<,01), sin diferencia en la infiltración linfocítica intestinal, lo que sugiere que la disminución de la EICH fue debida directamente a efectos de la IL-22 en el epitelio. Además, no se observaron diferencias en la expansión de las células T esplénicas o en la expresión de citoquinas GI, incluido un panel múltiple de citoquinas inflamatorias.

EJEMPLO IV.

[0172] Los efectos de la administración de IL-22 en el compartimiento de células madre intestinales (ISC).

[0173] LP en B6 alo-TCH usando ratones conservadores ISc Lgr5-LacZ. Los receptores tratados con rIL-22 demostraron un mayor número de Lgr5+ ISC tres semanas después del TCH durante la EICH activa sin inmunosupresión (Fig. 10, p<,05). La evidencia preliminar con ratones informadores de Lgr5-GFP sugirió un aumento de la tinción con ISC Ki-67 y, por lo tanto, una mayor proliferación de ISC después de la administración de IL-22. La qPCR del intestino delgado después del tratamiento con IL-22 demostró un aumento en la expresión de Reg3y p<,001) y Reg3p p<,01), lo que sugiere un beneficio benéfico antimicrobiano de la administración de IL-22. Sin embargo, no hubo diferencias en la expresión de Wnt3 o EGF, argumentando que el beneficio de las células madre después de la administración de IL-22 no se debió a una mejora en la función de nicho de ISC.

EJEMPLO V

[0174] La administración de IL-22 a B6 en receptores de desafío de tumor BALB/c no limitó la GVL.

[0175] La expresión de IL-22R no se encontró en células hematopoyéticas. Por lo tanto, se monitorizó la bioluminiscencia de células tumorales luciferasa A20 para seguir el efecto GVT mediado por células T B6 transplantadas en receptores de reto de tumores BALB/c tratados con rIL-22.

EJEMPLO VI

[0176] La administración de IL-22 mejoró la reconstitución de células T periféricas incluso durante la EICH activa.

[0177] La médula ósea de trasplante no compatible con MHC se trasplantó en BALB/c con mariposas Rag2-GFP y células T WT. La administración de IL-22 como se describe aquí, incrementó el desarrollo de emigrantes tímicos CD4 y CD8+ derivados de la médula del donante cuatro semanas después del TCH (Fig. 11, p<,01).

EJEMPLO VII

[0178] Usos de IL-22+ lactobacilos de las presentes invenciones y efectos de IL-22+ lactobacilos en EICH y daño tisular GI post-TCH.

[0179] Este ejemplo muestra los resultados de pérdida endógena de la producción de IL-22 en EICH (sección A), junto con una reducción del daño tisular EICH mediante la administración de IL-22+ lactobacilos. Como se muestra en la sección B a continuación, se demostró que la administración de lacto bacilo reduce la EICH experimental.

[0180] Lactobacillus paracasei es un constituyente normal de la flora GI humana. Por lo tanto, los inventores contemplaron el uso de Lactobacillus paracasei para administrar dosis terapéuticas de IL-22 exógena para proporcionar beneficios terapéuticos adicionales.

Resultados experimentales de TCH en ratones que expresan IL-22 endógena reducida.

[0181] Los receptores IL-22 -/- de KO de TCH demostraron una mayor mortalidad luego de un TCH no compatible con el antígeno menor (Fig. 1A) y mayor (Fig. 1B), al igual que los receptores de tipo silvestre (WT) tratados sistémicamente con un anticuerpo neutralizante anti-IL-22 (Fig. 1C). El trasplante en receptores de IL-22 KO condujo a un aumento de la evidencia histopatológica de GI y EICH hepática (Fig. 2A). Por lo tanto, la IL-22 derivada del huésped afectó la mortalidad y la patología de la EICH tras el trasplante.

[0182] La expresión de IL-22 se encontró dentro del tracto GI (Fig. 2B) y el suero (Fig. 2E) después de alo-TCH. Sin embargo, los niveles de IL-22 se redujeron durante la EICH (Figs. 2B, E). La IL-23 intestinal, un regulador derivado de células dendríticas de la expresión de IL-22, también se expresó después de la TCH. CD45+CD3'RORyt+ ILC que produce IL-22 se identificaron en la lamina propia después de TCH agotado en células T (TCD) (Fig. 2G). Estas ILC eran células inductoras del tejido linfoide IL-7R+CCR6+NKp46 derivadas del huésped. A pesar de su radiorresistencia, la ILC productora de IL-22 se eliminó rápidamente durante la EICH (Fig.2G). Por lo tanto, la IL-22 derivada del huésped redujo la mortalidad por EICH, pero la respuesta de IL-22 a la lesión se debilita durante la EICH debido a la eliminación de la ILC del huésped.

[0183] Aunque la deficiencia de IL-22 del huésped aumentó la EICH (Figs. 1 y 2A), no se observaron diferencias en la infiltración intestinal de linfocitos del donante ni en la secreción de citoquinas en los receptores de IL-22 KO, lo que indica que la reducción de EICH no fue debido a la manipulación de la inmunidad aloreactiva donante. La expresión de IL-22R intestinal se midió mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) con un aumento observado de IL-22R en el epitelio GI post-TCH.

[0184] La inmunohistoquímica (IHC) y la inmunofluorescencia (IF) indicaron la expresión de IL-22R dentro de las criptas intestinales donde se ubica el nicho ISC (Figs. 3A-C). Alo-TCH se transplantaron en ratones informadores Lgr5-LacZ, que produjeron p-galactosidasa aguas abajo de Lgr5 para identificar ISC. Como evidencia de la función de ISC, las células columnares básicas de la cripta Lgr5+ (CBC) fueron capaces de generar estructuras de cripta completas in vitro e in vivo. Se observó una reducción dramática de ISC durante la EICH (Fig. 3D). Además, la evaluación del nicho ISC por IHC en ratones WT no informadores confirmó la pérdida de CBC/ISC durante la EICH (Fig. 3E). Sorprendentemente, los receptores de IL-22 KO demostraron la mayor pérdida de CBC/ISC (Fig. 3E) y el aumento de la apoptosis de las células epiteliales de la cripta (Fig. 3F) durante la EICH, lo que indica que la IL-22 protegió a las células ISC y progenitoras. Finalmente, los ratones IL-22 KO con EICH demostraron una expresión disminuida de GI de las moléculas antimicrobianas Reg3y y Reg3p reguladas por IL-22 y aumentaron la translocación de sebo del carbohidrato no absorbible FITC-dextrano después del desafío oral (Fig. 3G) indicando daño aumentado a la barrera epitelial.

[0185] Por lo tanto, el daño GI dio lugar a la inducción de IL-23. IL-23 a su vez puede estimular la producción de IL-22 por ILC. Esta IL-22 endógena protegió el epitelio y el compartimento de las células madre/progenitoras del daño del tejido inflamatorio. Sin embargo, la ILC productora de IL-22 necesaria para limitar el daño al tejido se perdió durante la EICH. Como se muestra en este documento, la administración de rIL-22 después de la TCH mediante inyección intraperitoneal (por ejemplo, 4 pg/ratón al día) revirtió los efectos del agotamiento de la CLI y la pérdida de IL-22 en la patología de EICH en los intestinos y redujo la apoptosis dentro de criptas intestinales donde se ubica el compartimiento ISC/progenitor (Fig. 12A, B). Sin embargo, para uso clínico, la administración de citoquinas sistémicas es costosa y puede tener efectos sistémicos no anticipados. Por lo tanto, los inventores hicieron dos cepas de Lactobacillus paracasei que produjeron constitutivamente IL-22 (Figs. 12C, D). Una cepa produce IL-22 secretada (lacto-22s) mientras que la otra produce IL-22 anclada a la superficie de la célula bacteriana (lacto-22a).

B. Resultado del tratamiento con IL22 Lactobacilli de EICH.

[0186] Como se describe en este documento, después de descubrir que la deficiencia IL-22 conducía a un aumento de la EICH (Figs. 1 a 3), la reducción mediada por IL-22 de la EICH (Fig. 12) y la inducción de moléculas antimicrobianas post-TCH dependientes de IL-22, se administró IL-22 post-TCH utilizando bacterias lacto-22s y lacto-22a de las presentes invenciones como se describe en el presente documento. Las dos cepas de lactobacilos se administraron asociadas con TCH (Fig. 12E). Los ratones se sometieron a alo-TCH con médula ósea y células T para causar EICH. Comenzando en el día del trasplante, a los ratones se les administró 108-109 de tipo silvestre Lactobacillus paracsei (WT lacto), lacto-22, o lacto-22a se resuspendieron en PBS, o con PBS solo hasta el día 30 post-TCH. La EICH condujo a una mortalidad significativa en ratones administrados con PBS. Si bien hubo una tendencia hacia una mejor supervivencia en los ratones que recibieron lacto-WT, estos ratones aún sufrieron una mortalidad significativa debido a la EICH.

[0187] En contraste, los ratones que recibieron lacto-22 o lacto 22a no tienen significativamente diferente mortalidad comparada a ratones trasplantados sin células T. Además, los receptores de lacto-22 habían reducido significativamente los puntajes clínicos de EICH, una evaluación que abarca el peso, la calidad de la piel, la integridad de la piel, la postura y la actividad. Si bien el cambio en el peso de los ratones post-TCH puede servir como una medida sustituta para la GI EICH, la naturaleza sistémica de estos hallazgos sugiere que la protección GI puede ser fundamental para prevenir la enfermedad sistémica de la EICH.

[0188] El alo-TCH emparejado con MHC empobrecido de células T se realizó como se describió anteriormente y los ratones se alimentaron diariamente con lacto-WT, lacto-22s y lacto-22a.

EJEMPLO VIII

[0189] Utilizando el HSCT no coincidente de antígeno menor de LP^C57BL/6 (B6) modelado clínicamente (H-2b^ H -2b), encontramos que el tratamiento diario con IL-22 murino (rm) recombinante (4ug, inyección intraperitoneal) a partir del séptimo día después del trasplante condujo a una patología intestinal reducida por EICH sin alterar la inmunidad alorreactiva. Tanto la patología general de la EICH como las puntuaciones de la apoptosis epitelial fueron significativamente más bajas tres semanas después del BMT en ratones tratados con rmIL-22 con EICH en comparación con los controles tratados con PBS (p<0,001). Observamos que los ratones tratados con rmIL-22 (y sin inmunosupresión farmacológica) tuvieron un mayor número de ISC de Lgr5+ y una proliferación de ISC significativamente mayor (p<0,01). Esto no se debió a cambios dependientes de IL-22 en el nicho ISC, ya que los números de células de Paneth, los factores de crecimiento derivados de células de Paneth (EGF, Wnt3) y los factores de crecimiento derivados de estroma (Rspo3) fueron todos cambiados después de la administración de IL-22. Sin embargo, las proteínas antimicrobianas Reg3p y Reg3y fueron reguladas al alza por qPCR en el intestino delgado (SI) de ratones tratados con rmIL-22 (p<0,01 yp<0,0oi respectivamente), aunque esto no dio lugar a cambios constantes en la flora microbiana intestinal.

[0190] Para evaluar los efectos directos sobre regeneración epitelial, hemos realizado ensayos de cultivo organoides intestinales en presencia de IL-22. Organoides generados a partir de SI y criptas de intestino grueso (LI) de ratones B6 de tipo silvestre demostrados de tamaño sustancialmente aumentados después de siete días de cultivo con IL-22 (p<0,001, SI, Fig. 1A; p<0,05, LI). El cultivo de criptas con células linfoides innatas (ILC), potentes productores de IL-22 in vivo, también condujo a un aumento del tamaño de los organoides. Además, el cultivo con IL-22 incrementó significativamente la brotación de organoides (formación de nuevas criptas), lo que resultó en un aumento de la expansión de los organoides con pases en serie en presencia de IL-22 (1 ng/ml), lo que sugiere que la IL-22 podría directamente aumentar la expansión de ISC. De hecho, el cultivo de IL-22 condujo a una mayor incorporación de EDU organoides y expansión de las ISC de Lgr5+ después del cultivo de criptas SI de ratones indicadores Lgr5-GFP (p<0,001, Fig. 1B). Demostrando un efecto directo en las ISC, la IL-22 condujo a la fosforilación de STAT3 específicamente en células Lgr5+ y dio lugar a un aumento de la brotación de organoides cultivados a partir de ISCs singulares aisladas solo después de cuatro días en cultivo (p<0,01).

[0191] Para investigar el potencial de traducción para uso en humanos, ensayamos una molécula de dímero IL-22 humano (F-652, Generon (Shanghai) Corporation Ltd.) en criptas intestinales de ratón y encontramos que el F-652 aumentó significativamente el tamaño de los organoides de intestino delgado e intestino grueso. Usando el modelo alo-HSCT LP ^B 6 descrito anteriormente, encontramos que cada dos días de tratamiento subcutáneo (SQ) con 100 ug/kg F-652 a partir del séptimo día posterior al BMT condujo a una mejoría significativa en la puntuación clínica de EICH (P<0,0001) y supervivencia (p<0,05, Fig. 1C).

[0192] La IL-22 y las células linfoides innatas pueden salvar la función inmune y la regeneración tisular actuando directamente sobre las células madre epiteliales. La terapia con IL-22 y F-652 puede representar un enfoque novedoso para promover la recuperación intestinal en pacientes con EICH sin aumentar la inmunodeficiencia post-trasplante.

[0193] En resumen, se descubrió que la administración de IL-22 reducía la patología intestinal, mejoraba la recuperación de ISC y promovía el desarrollo de células T derivadas de médula de donante durante la EICH. Sorprendentemente, la administración de IL-22 no afectó la GVL. Estos resultados sugieren que la administración de IL-22 post-transbordo representa una nueva estrategia para proteger el epitelio intestinal y mejorar la reconstitución inmune después de alo-TCH.

[0194] Las siguientes referencias se incorporan en este documento como referencia en su totalidad:

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. IL-22 para uso en el tratamiento de lesiones o daños en el tracto gastrointestinal debido a la enfermedad de injerto contra huésped (EICH).

2. IL-22 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la lesión o daño se realiza después del trasplante de células madre alohematopoyéticas (HSC).

3. IL-22 para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha IL-22 es IL-22 recombinante.

4. IL-22 para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que IL-22 está en forma de un dímero de IL-22.

5. IL-22 para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la IL-22 está en forma de una proteína de fusión.

6. IL-22 para uso según la reivindicación 5, en la que la proteína de fusión está en forma de un dímero de proteína de fusión.

7. IL-22 para uso en el tratamiento de EICH en un sujeto después de un trasplante sin inmunosupresión.

8. IL-22 para uso según la reivindicación 7, en la que se administra al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de IL-22 antes del trasplante.

9. IL-22 para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de IL-22 al sujeto una vez que se observan los síntomas asociados con una lesión en el tracto gastrointestinal (GI).

10. IL-22 para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que se administra al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de IL-22 desde 1 día hasta 6 meses después del trasplante.

11. IL-22 para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que se administra al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de IL-22 desde 1 semana hasta 4 meses después del trasplante.

12. IL-22 para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde IL-22 se administra diariamente.