ES2729202T3 - Inhibición de HER3 en cánceres ováricos serosos de grado bajo - Google Patents

Abstract

Agente para la utilización en el tratamiento de cáncer ovárico seroso de grado bajo, comprendiendo el agente un anticuerpo o agente del mismo que se une específicamente a un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o un ARNip que inhibe la señalización del miembro de la familia de EGFR, en el que el ARNip está dirigido contra NRG1 o HER3

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibición de HER3 en cánceres ováricos serosos de grado bajo

Antecedentes

Campo técnico

La invención se refiere al tratamiento del cáncer y, en particular, al tratamiento de los cánceres ováricos serosos de grado bajo mediante la inhibición de la señalización un miembro de la familia de EGFR.

Información de los antecedentes

El cáncer ovárico es la quinta causa más importante de muerte por cáncer en mujeres en los Estados Unidos, con 22.000 casos estimados y 14.000 muertes producidas en 2014 (Siegel et al., Cancer Statistics, CA Cancer J. Clin.

64(1):9-29, enero-febrero de 2014. Doi:10.3322/caac.21208. Epub. 7 de enero, 2014). Aunque el tratamiento primario con cirugía y quimioterapia basada en el platino puede resultar eficaz, la enfermedad con frecuencia recurre y se torna crecientemente resistente a la terapia (Modesitt, Expert Opin. Pharmacother., 2293, 2007). Hasta hoy, se han identificado pocas terapias dirigidas que presenten éxito para el cáncer ovárico.

Farley et al., The Lancet Oncology, vol 14, n° 2, 2013-02-01, página 134 describen la utilización de Selumetinib, un inhibidor de MEK1/2, para tratar el carcinoma seroso de grado bajo del ovario o del peritoneo.

Grisham et al., International Journal of Gynaecological Cancer, vol. n° 6, 2014-07-01, páginas 1010-1014 describen el Bevacizumab, un anticuerpo anti-factor A de crecimiento endotelial vascular, en el tratamiento de pacientes con cáncer ovárico seroso de grado bajo y peritoneal primario.

Vang et al., Advances in Anatomic Pathology, vol. 16, n° 52009-09-01, páginas 267-282 describen la patogénesis, características clinicopatológicas y de biología molecular, y los problemas diagnósticos del carcinoma ovárico seroso de grado bajo y de grado alto.

Gershenson, American Society of Clinical Oncology educational book/ASCO Meeting 2013-01-01 proporciona una revisión del carcinoma seroso de grado bajo del ovario.

Breve descripción resumida

La invención se refiere al tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo. En algunos aspectos, se proporcionan agentes para la utilización en el tratamiento del cáncer. La invención proporciona un agente para la utilización en el tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo, comprendiendo el agente: un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés), o un ARNip que inhibe la señalización del miembro de la familia de EGFR, en el que el ARNip se dirige contra NRG1 o HER3. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) puede administrarse en un sujeto con cáncer, en el que el cáncer es cáncer ovárico seroso de grado bajo. En una realización, el miembro de la familia de EGFR es HE3 y el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo de Her3 o fragmento del mismo. En una realización, el anticuerpo de Her3 o fragmento del mismo se une a un epítopo conformacional que comprende residuos aminoácidos dentro del dominio 2 y dominio 4 de HER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente de ligando como independiente de ligando.

En algunos aspectos, el agente comprende un ARNip que inhibe la señalización de un miembro de la familia de EGFR, en el que el ARNip se dirige contra NRG o HER3. El agente puede incluir una molécula pequeña, un polipéptido, un anticuerpo, un oligonucleótido antisentido o una molécula de ARNip. En algunos aspectos, el agente comprende MOR1073, Celuximab o Trastuzumab y combinaciones de los mismos. En un aspecto, el agente para la utilización según la presente invención, en el que el miembro de la familia de EGFR comprende HER3, el agente comprende además un agente terapéutico seleccionado de Cetuximab o T rastuzumab, o Cetuximab y T rastuzumab.

Los presentes inventores describen en la presente memoria un agente que inhibe la señalización de un miembro de la familia de EGFR, la preparación de un medicamento para la utilización en el tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra el efecto del anticuerpo monoclonal anti-Her3 MOR10703 sobre 21 cultivos ováricos primarios diferentes. Cuatro paquetes de células primarias (DF76, DF141, DF192 y DF225) presentaban una reducción significativa de la proliferación tras 6 días de exposición continua a MOR10703 a una concentración de 1:1000. Las figuras 2A-2B ilustran el efecto de ARNi (ARNip) dirigido contra Her3 y NRG1 en células DF76 (2A) y DF141 (2B). (2A) 6 días después de la transfección inicial, Her3ip resultó en una reducción significativa de la expresión de la proteína Her3 y una fosforilación reducida de Her3, mientras que NRPip redujo significativamente la expresión de la proteína NRG1 y presentaba un efecto moderado sobre la fosforilación de Her3. ARNip contra Her3 y NRG1 resultó en una reducción significativa de la proliferación en las células DF76. (2B) 3 días después de la transfección inicial, Her3ip resultó en una reducción de la expresión de la proteína Her3 y una ligera reducción de la fosforilación de Her3 en las células DF141.6 días después de la transfección inicial, Her3ip resultó en una reducción significativa en la expresión de la proteína Her3 y una reducción significativa de la fosforilación de Her3 en células DF141. ARNip también resultó en una reducción significativa en la expresión de NRG1 a los 3 días. No pudieron observarse efectos sobre la fosforilación de Her3 a los 3 y 6 días por NRG1 ip debido al insuficiente lisado en dichos puntos temporales debido a la toxicidad.

Las figuras 3A-3B ilustran el efecto sobre la expresión y fosforilación de Her3 en líneas celulares serosas de grado bajo por MOR10703. (3A) MOR10703 redujo la expresión y fosforilación de Her3 tanto en células MPSC1 como h OC-7. Las células HEY presentaban cantidades muy bajas de expresión de Her3 y ninguna prueba de fosforilación de Her3. (3B) MOR10703 no presentó ningún efecto sobre la proliferación de las células HeY, MPSC1 o HOC-7. Las figuras 4A-4D ilustran el efecto de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra EGFR, Her-2 y Her3 en paquetes de células serosas de grado bajo DF primarias. Aunque hay variabilidad, cada uno de los paquetes de células DF de grado bajo muestra algún grado de sensibilidad frente a Cetuximab, Trastuzmab y MOR10703. Se observó un mayor efecto al combinar anticuerpos que con cualquier anticuerpo dado por sí solo.

Las figuras 5A-5D ilustran el efecto de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra EGFR, Her-2 y Her3 en dos células de cáncer ovárico primario de grado alto (DF09 y DF14) y en líneas celulares de cáncer ovárico seroso de grado bajo (HEY y MPSC1).

Descripción detallada

La presente invención se refiere al resultado de que un subgrupo particular de cáncer ovárico, el cáncer ovárico seroso de grado bajo, puede tratarse con un agente que inhibe la señalización de un miembro de la familia de EGFR. En particular, se encontró que la interferencia en la señalización de HER3 puede utilizarse para tratar cáncer ovárico seroso de grado bajo.

El tipo más común de cáncer ovárico aparece en células epiteliales que revisten la superficie del ovario. Aproximadamente el 50% de los tumores ováricos epiteliales se clasifican como serosos, o tumores con características glandulares, y constituyen aproximadamente 80% de todos los tumores ováricos. Pueden aparecer otros tipos de cáncer ovárico a partir de células germinales (p.ej., cáncer de las células productoras de óvulos del ovario) y sarcomas. Los tumores serosos de grado alto indican tumores invasivos altamente agresivos comparado con tumores de bajo potencial maligno (BPM). La clasificación de un tumor seroso invasivo como de grado alto o bajo se basa en el curso clínico de la enfermedad. Por ejemplo, se ha encontrado que los tumores serosos de grado alto sobreexpresan genes que controlan diversas funciones celulares asociadas a las células de cáncer, por ejemplo, genes que controlan el crecimiento celular, la estabilidad del ADN (o falta de la misma) y genes que silencian otros genes. A la inversa, no se ha encontrado que los tumores BMP sobreexpresen estos tipos de genes y los tumores BMP se han caracterizado alternativamente según la expresión de rutas de control del crecimiento, tales como las rutas de proteína tumoral 53 (TP53 o p53).

Más recientemente, se ha descrito un sistema de dos niveles para caracterizar los tumores ováricos serosos (Vang et al., Adv. Anat. Pathol. 16:267-282, 2009) basándose en estudios realizados en el Johns Hopkins Hospital y en el M.D. Anderson Cancer Center. Brevemente, los tumores ováricos serosos de grado bajo se caracterizan basándose en varios criterios, por ejemplo los tumores serosos de grado bajo presentan una inestabilidad cromosómica baja a nula, típicamente presentan genes KRAS, BRAF y HER2 mutados, muestran un desarrollo tumoral lento, típicamente presentan núcleos celulares que son uniformes, pequeños y redondos, y generalmente presentan un índice mitótico bajo. A la inversa, un tumor seroso de grado alto presenta un grado elevado de inestabilidad cromosómica, presenta un gen TP53 mutado, muestra un desarrollo tumoral muy rápido, típicamente presenta núcleos que son no uniformes, agrandados y de forma irregular y presenta un índice mitótico elevado.

El receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico humano (ErbB3, también conocido como HER3) es una proteína receptora de tirosina quinasa y pertenece a la subfamilia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de las proteínas receptores de las tirosina quinasas, que también incluye EGFR (HER1, ErbBI), HER2 (ErbB2 Neu) y HER4 (ErbB4) (Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4905-4909, 1990; Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:9193-9197, 1989 y Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2900-2904, 1988). Al igual que el receptor del factor de crecimiento epidérmico prototípico, el receptor transmembrana HER3 consiste en un dominio extracelular de unión a ligando (DEC), un dominio de dimerización dentro de DEC, un dominio transmembrana, un dominio intracelular de proteína tirosina quinasa (DTQ) y un dominio C-terminal de fosforilación. Al contrario que otros elementos de la familia de EGFR, el dominio de quinasa de HER3 muestra una actividad de quinasa intrínseca muy baja.

Los ligandos neuregulina 1 (NRG) o neuregulina 2 se unen al dominio extracelular de HER3 y activan la ruta de señalización mediada por receptor mediante la estimulación de la dimerización con otras parejas de dimerización, tales como HER2. La heterodimerizacion resulta en la activación y trans-fosforilación del domino intracelular de HER3 y es un medio no sólo para la diversificación de señales sino también la amplificación de señales. Además, la heterodimerización de HER3 también puede producirse en ausencia de ligandos activadores y ésta se denomina habitualmente activación de HER3 independiente de ligando. Por ejemplo, en el caso de que HER2 se exprese a niveles elevados como resultado de la amplificación génica (p.ej. en cáncer de mama, pulmonar, ovárico o gástrico), pueden formarse dímeros HER2/HER3 espontáneos. En esta situación, HER2/HER3 se considera el dímero de señalización de ErbB más activo y es, por lo tanto, altamente transformante.

La expresión “miembro de la familia de EGFR” se refiere a una subfamilia de miembros de la familia del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que incluye el receptor 3 de factor de crecimiento epidérmico humano (ErbB3, también conocido como HER3), EGFR (HER1, ErbBI), HER2 (ErbB2, Neu) y HER4 (ErbB4).

Los términos “HER1”, “ErbB1”, “receptor de factor de crecimiento epidérmico” y “EGFR” se utilizan intercambiablemente en la presente memoria y se refieren a EGFR tal como se da a conocer, por ejemplo, en Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem. 56:881-914, 1987), incluyendo formas mutantes naturales de los mismos (p.ej., un EGFR mutante por deleción, tal como en Humphrey et al., PNAS (USA) 87:4207-4211, 1990). egfr se refiere al gen codificante del producto proteína EGFR.

Los términos “HER2” y “ErbB2” se utilizan intercambiablemente en la presente memoria y se refieren a la proteína HER2 humana descrita en, por ejemplo, Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501, 1983, y Yamamoto et al., Nature 319:230-234, 1986 (Genebank, número de acceso X03363). El término “her2” se refiere al gen codificante de HER2 humano y “neu” se refiere al gen codificante de p85neu de rata.

Los términos “HER4” y “ErbB4” en la presente memoria se refieren al polipéptido receptor tal como se da a conocer en, por ejemplo, la solicitud de patente EP n° 599.275; Plowman et al., Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750, 1993, y Plowman et al., Nature, 366:473-475, 1993, incluyendo isoformas de los mismos, p.ej., tal como se da a conocer en el documento n° WO99/19488, publicado el 22 de abril, 1999.

Los términos “HER3” o “receptor de HER3”, también conocido como “ErbB3” tal como se utiliza en la presente memoria, se refieren a la proteína HER3 de mamífero, y “her3” o “erbB3” se refieren al gen her3 de mamífero. La proteína Her3 preferente es la proteína HER3 humana presente en la membrana celular de una célula. El gen her3 humano se describe en la patente US n° 5.480.968, y en Plowman et al., Natl. Acad. Sci. 87:4905-4909, 1990. La HER3 humana se define en el n° de acceso NP 001973 (humana) y representada posteriormente como SEC ID n° 1. Toda la nomenclatura es para la HER3 inmadura de longitud completa (aminoácidos 1 a 1342). La HER3 inmadura se corta entre las posiciones 19 y 20, resultando en la proteína HER3 madura (aminoácidos 20 a 1342).

MRANDALQVL GLLFSLARGS EVGNSQAVCP GTLNGLSVTG DAENQYQTLY KLYERCEWM GNLEIVLTGH NADLSFLQWI REVTGYVLVA MNEFSTLPLP NLRWRGTQV YDGKFAIFVM LNYNTNSSHA LRQLRLTQLT EILSGGVYIE KNDKLCHMDT IDWRDIVRDR DAEIWKDNG RSCPPCHEVC KGRCWGPGSE DCQTLTKTIC APQCNGHCFG PNPNQCCHDE CAGGCSGPQD TDCFACRHFN DSGACVPRCP QPLVYNKLTF QLEPNPHTKY QYGGVCVASC PHNFWDQTS CVRACPPDKM EVDKNGLKMC EPCGGLCPKA CEGTGSGSRF QTVDSSNIDG FVNCTKILGN LDFLITGLNG DPWHKIPALD PEKLNVFRTV REITGYLNIQ SWPPHMHNFS VFSNLTTIGG RSLYNRGFSL LIMKNLNVTS LGFRSLKEIS AGRIYISANR QLCYHHSLNW TKVLRGPTEE RLDIKHNRPR RDCVAEGKVC DPLCSSGGCW GPGPGQCLSC RNYSRGGVCV THCNFLNGEP REFAHEAECF SCHPECQPME GTATCNGSGS DTCAQCAHFR DGPHCVSSCP

HGVLGAKGPI YKYPDVQNEC RPCHENCTQG CKGPELQDCL GQTLVLIGKT

HLTMALTVIA GLWIFMMLG GTFLYWRGRR IQNKRAMRRY LERGESIEPL

DPSEKANKVL ARIFKETELR KLKVLGSGVF GTVHKGVWIP EGESIKIPVC IKVIEDKSGR QSFQAVTDHM LAIGSLDHAH IVRLLGLCPG SSLQLVTQYL PLGSLLDHVR QHRGALGPQL LLNWGVQIAK GMYYLEEHGM VHRNLAARNV

LLKSPSQVQV ADFGVADLLP PDDKQLLYSE AKTPIKWMAL ESIHFGKYTH

QSDVWSYGVT VWELMTFGAE PYAGLRLAEV PDLLEKGERL AQPQICTIDV

YMVMVKCWMI DENIRPTFKE LANEFTRMAR DPPRYLVIKR ESGPGIAPGP

EPHGLTNKKL EEVELEPELD LDLDLEAEED NLATTTLGSA LSLPVGTLNR

PRGSQSLLSP SSGYMPMNQG NLGESCQESA VSGSSERCPR PVSLHPMPRG

CLASESSEGH VTGSEAELQE KVSMCRSRSR SRSPRPRGDS AYHSQRHSLL TPVTPLSPPG LEEEDVNGYV MPDTHLKGTP SSREGTLSSV GLSSVLGTEE

EDEDEEYEYM NRRRRHSPPH PPRPSSLEEL GYEYMDVGSD LSASLGSTQS CPLHPVPIMP TAGTTPDEDY EYMNRQRDGG GPGGDYAAMG ACPASEQGYE

EMRAFQGPGH QAPHVHYARL KTLRSLEATD SAFDNPDYWH SRLFPKANAQ RT

(SEQ ID NO: 1)

La expresión “ligando de HER” o “ligando de ErbB” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a polipéptidos que se unen y activan receptores de HER, tales como HER1, HER2, HER3 y HER4. Entre los ejemplos de ligandos de HER se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, neuregulina (NRG) 1, neuregulina 2, neuregulina 3, neuregulina 4, betacelulina, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, epirregulina, factor de crecimiento epidérmico, anfirregulina y factor alfa de crecimiento transformante. El término incluye fragmentos y/o variantes biológicamente activos de un polipéptido natural.

La expresión “ligando de HER3” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a polipéptidos que se unen y activan HER3. Entre los ejemplos de ligandos de HER3 se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, neuregulina (NRG) 1 y neuregulina 2, betacelulina, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina y epirregulina. El término incluye fragmentos y/o variantes biológicamente activos de un polipéptido natural.

La expresión “complejo de proteínas HER-HER” es un oligómero asociado no covalentemente que contiene correceptores de HER en cualquier combinación (p.ej., HER1-HER2, HER1-HER3, HER1-HER4, HER2-HER3, HER3-HER4 y similares). Este complejo puede formarse en el caso de que una célula que expresa los dos receptores se expone a un ligando de HER, p.ej., NRG, o en el caso de que un receptor de HER se encuentre activo o sobreexpresado.

El “complejo de proteínas HER2-HER3” es un oligómero asociado no covalentemente que contiene receptor de HER2 y el receptor de HER3. Este complejo puede formar en el caso de que una célula que expresa ambos receptores se expone a un ligando de h Er 3, p.ej., NRG o en el caso de que h Er2 se encuentre activo/sobreexpresado. La expresión “actividad de HER3” o “activación de HER3” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un incremento de la oligomerización (p.ej., un incremento de los complejos que contienen HER3), fosforilación de HER3, reorganizaciones conformacionales (por ejemplo los inducidos por ligandos) y señalización corriente abajo mediada por HER3.

El término “estabilización” o “estabilizado” utilizado en el contexto de HER3 se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo que mantiene directamente (bloquea, ancla, sujeta, se une preferentemente, favorece), el estado o conformación inactiva de Her3 sin bloquear la unión de ligando a HER3, de manera que la unión de ligando ya no es capaz de activar HER3. Pueden utilizarse ensayos para medir la unión de ligando a un receptor de HER3 estabilizado, p.ej., un ensayo Biacore.

La expresión “señalización independiente de ligando” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la activación de ErbB (p.ej., HER3) mediante ligando. La activación de HER3 se pone de manifiesto en una oligomerización incrementada (p.ej., heterodimerización) y/o fosforilación de HER3, de manera que se activan las rutas de señalización corriente abajo (p.ej., PI3K). El anticuerpo o fragmento del mismo puede reducir de manera estadísticamente significativa la cantidad de HER3 fosforilado en una célula estimulada expuesta a la proteína de unión a antígeno (p.ej., un anticuerpo) respecto a una célula no tratada (de control), según se mide utilizando los ensayos descritos en los Ejemplos. La célula que expresa HER3 puede ser una línea celular natural (p.ej., MCF7) o puede producirse recombinantemente mediante la introducción de ácidos nucleicos codificantes de la proteína HER3 en una célula huésped. La estimulación celular puede producirse mediante la adición exógena de un ligando de HER3 activador o mediante la expresión endógena de un ligando activador. El anticuerpo o fragmento del mismo que “reduce la activación de HER3 inducida por neregulina en una célula” es uno que reduce de manera estadísticamente significativa la fosforilación de tirosinas de HER3 respecto a una célula no tratada (de control). Ello puede determinarse basándose en los niveles de fosforilación de h ER3 tras la exposición de HER3 a NRG y el anticuerpo de interés. La célula que expresa la proteína HER3 puede ser una célula o línea celular natural (p.ej., MCF7) o puede producirse recombinantemente.

La expresión “señalización independiente de ligando” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la actividad de HER3 celular (p.ej., la fosforilación) en ausencia de un requisito de unión de ligando. Por ejemplo, la activación de HER3 independiente de ligando puede ser el resultado de la sobreexpresión de HER2 o mutaciones activadoras en parejas heterodiméricas de HER3, tal como EGFR y HER2. El anticuerpo o fragmento del mismo puede reducir de manera estadísticamente significativa la cantidad de HER3 fosforilado en una célula expuesta a la proteína de unión a antígeno (p.ej., un anticuerpo) respecto a una célula no tratada (de control). La célula que expresa HER3 puede ser una línea celular natural (p.ej., SK-Br-3) o puede producirse recombinantemente mediante la introducción de ácidos nucleicos codificantes de la proteína HER3 en una célula huésped.

El término “bloques” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a detener o bloquear una interacción o un procedimiento, p.ej., señalización de parada dependiente de ligando o independiente de ligando.

El término “reconoce” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo que encuentra e interactúa (p.ej., se une) con su epítopo conformacional.

La expresión “se une concurrentemente” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un ligando de ErbB que puede unirse a un sitio de unión a ligando en el receptor de ErbB junto con el anticuerpo de ErbB. Lo anterior significa que tanto el anticuerpo como anticuerpo pueden unirse al receptor de HER juntos. Únicamente a título ilustrativo, el ligando de HER3 NRG puede unirse al receptor de HER3 junto con el anticuerpo de HER3.

El término “no consigue” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo que no experimenta un suceso particular. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que “no consigue activar la transducción de señales” es uno que no induce la transducción de señales; un anticuerpo o fragmento del mismo que “no consigue inducir un cambio conformacional” es uno que no causa una alteración estructural en el receptor de ErbB; un anticuerpo o fragmento del mismo que estabiliza el receptor de ErbB en un estado inactivo, de manera que el receptor de ErbB “no consigue dimerizarse” es uno que no forma complejos de proteína-proteína.

El término “anticuerpo” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a anticuerpos completos que interactúan con (p.ej., mediante unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) un epítopo de HER3 e inhiben la transducción de señales. Un “anticuerpo” natural es una glucoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente memoria como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y V^l pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (RDC), con regiones dispersas que están más conservadas, denominadas regiones marco (RM). Cada VH y VL está compuesto de tres RDC y cuatro RM dispuestos de extremo amino-terminal a extremo carboxi-terminal en el orden siguiente: RM1, RDC1, RM2, RDC2, RM3, RDC3, RM4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunológico (p.ej., células efectoras) y el primer componente (CIq) del sistema del complemento clásico. El término “anticuerpo” incluye, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, Fv de cadena sencilla (scFv), Fv unidos mediante disulfuro (sdFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab') y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluyendo, p.ej., anticuerpos anti-Id de anticuerpos de la invención) y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo (p.ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p.ej., IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgAI e IgA2) o subclase. Tanto las cadenas ligeras como pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos “constante” y “variable” se utilizan funcionalmente. A este respecto, se apreciará que los dominios variables de las partes tanto de cadena ligera (VL) como de cadena pesada (VH) determinan el reconocimiento y especificidad de antígeno. A la inversa, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, c H2 o CH3) confieren importantes propiedades biológicas, tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión de receptores de Fc, unión del complemento, y similares. Por convención, la numeración de los dominios de región constante se incrementa a medida que son más distales al sitio de unión a antígeno o al extremo amino-terminal del anticuerpo. El extremo N-terminal es una región variable y en el extremo C-terminal se encuentra una región constante; el extremo carboxi-terminal de hecho comprende los dominios CH3 y CL de las cadenas pesada y ligera, respectivamente.

La expresión “fragmento de anticuerpo”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una o más partes de un anticuerpo que conservan la capacidad de interactuar específicamente con (p.ej., mediante unión, impedimento estérico, estabilización/desestabillización, distribución espacial) un epítopo de HER3 e inhibir la transducción de señales. Entre los ejemplos de fragmentos de unión se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, v H, CL y CH1, un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra, un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), que consiste en un dominio VH y una región determinante de complementariedad (RDC) aislada.

Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que permite formar una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan formando moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv), ver, p.ej., Bird et al., Science 242:423-426, 1988, y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

85:5879-5883, 1988). Dichos anticuerpos de cadena sencilla también pretenden estar comprendidos dentro de la expresión “fragmento de anticuerpo”. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por el experto en la materia y los fragmentos se criban para su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Los fragmentos de anticuerpo también pueden incorporarse en anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (ver, p.ej., Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 1990). Los fragmentos de anticuerpo pueden injertarse en andamiajes basados en polipéptidos tales como fibronectina de tipo III (Fn3) (ver la patente US n° 6.703.199, que describe monocuerpos de polipéptido fibronectina).

Los fragmentos de anticuerpo pueden incorporarse en moléculas de cadena sencilla que comprenden una pareja de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman una pareja de regiones de unión a antígeno (Zapata et al., Protein Eng. 8: 1057-1062, 1995, y la patente US Pat. n° 5.641.870).

El término “epítopo” incluye cualquier determinante de proteína capaz de unión específica a una inmunoglobulina o que, de otro modo, interactúe con una molécula. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones de moléculas en superficie químicamente activos, tales como cadenas laterales de sacáridos y pueden presentar características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser “lineal” o “conformacional”.

La expresión “epítopo lineal” se refiere a un epítopo con todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula de interacción (tal como un anticuerpo) situados linealmente a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína (continua). Una vez se determina un epítopo deseado sobre un antígeno, resulta posible generar anticuerpos contra dicho epítopo, p.ej. utilizando las técnicas descritas en la presente invención. Alternativamente, durante el procedimiento de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos puede elucidar información sobre epítopos deseables. A partir de esta información, a continuación resulta posible cribar competitivamente anticuerpos para la unión al mismo epítopo. Un enfoque para conseguir lo anterior es llevar a cabo estudios de competición cruzada para encontrar anticuerpos que se unen competitivamente entre sí, p.ej., los anticuerpos compiten para la unión al antígeno. Un procedimiento de alto rendimiento para la clasificación de anticuerpos basándose en su competición cruzada se describe en el documento n° WO 2003/48731. Tal como apreciará el experto en la materia, prácticamente cualquier cosa a la que pueda unirse específicamente un anticuerpo podría ser un epítopo. Un epítopo puede comprender aquellos residuos a los que se une el anticuerpo.

La expresión “epítopo conformacional” se refiere a un epítopo en el que se reúnen aminoácidos discontinuos en la conformación tridimensional. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción se producen en residuos aminoácidos de la proteína que están separados unos de otros. En una realización, el epítopo conformacional se define como: (i) residuos aminoácidos 265-277 y 315 de HER (del dominio 2), e (ii) residuos aminoácidos 571, 582­ 584, 596-597, 600-602 y 609-615 de HER3 (del dominio 4) de SEC ID n° 1 o un subgrupo de los mismos. Tal como apreciará el experto en la materia, el espacio que está ocupado por un residuo o cadena lateral que crea la forma de una molécula ayuda a determinar qué es el epítopo.

Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno diana particular reconocen preferentemente un epítopo sobre el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

Las regiones de un polipéptido dado que incluyen un epítopo pueden identificarse utilizando cualquiera de entre varias técnicas de mapeado de epítopos, bien conocidas de la técnica. Ver, p.ej., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996), Humana Press, Totowa, New Jersey Por ejemplo, pueden determinarse epítopos lineales mediante, p.ej., la síntesis concurrente de un gran número de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a partes de la molécula de proteína y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos todavía se encuentran adheridos a los soportes. Dichas técnicas son conocidas de la técnica y se describen en, p.ej., la patente US n° 4.708.871; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 8:3998-4002, 1984; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182, 1985; Geysen et al., Mol. Immunol.

23:709-715, 1997). De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente mediante determinación de la conformación espacial de aminoácidos, tal como mediante, p.ej., intercambio hidrógeno/deuterio, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Ver, p.ej., Epitope Mapping Protocols, supra. También pueden identificarse regiones antigénicas de proteínas utilizando gráficos estándares de antigenicidad e hidropatía, tales como los calculados utilizando, p.ej., el programa de software Omiga, versión 1.0, disponible de Oxford Molecular Group. Este programa informático utiliza el método de Hopp/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828, 1981; para determinar los perfiles de antigenicidad, y la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., J.Mol. Biol. 157: 105-132, 1982; para los gráficos de hidropatía.

El término “paratopo”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la estructura general de una región de unión que determina la unión a un epítopo. Esta estructura influye sobre si la región de unión puede unirse o no a un epítopo y de qué manera. El término paratopo puede referirse a un sitio antigénico de un anticuerpo que es responsable de que un anticuerpo o fragmento del mismo se una a un determinante antigénico. El término paratopo también se refiere al idiotopo del anticuerpo y a la región determinante de complementariedad (RDC) que se une al epítopo. En una realización, el paratopo es la región del anticuerpo que se une al epítopo conformacional que comprende: (i) los residuos aminoácidos 265-277 y 315 (del dominio 2) de HER3, e (ii) los residuos aminoácidos 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de HER3 de Se C ID n° 1 o un subgrupo de los mismos. En una realización, el paratopo es la región del anticuerpo que comprende las secuencias de RDC. En una realización, el paratopo comprende por lo menos un residuo aminoácido que se une a los residuos de HER3: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596 y Lys597. En una realización, el paratopo comprende por lo menos un residuo aminoácido que se une a los residuos de HER3: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614 y Glu615. Tal como apreciará el experto en la materia, el paratopo de cualquier anticuerpo, o variante del mismo, puede determinarse de la manera explicada por la presente solicitud.

Las expresiones “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpos monoclonales” tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a polipéptido, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos biespecíficos, etc., que presentan una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica o que se derivan de la misma fuente genética. Esta expresión también incluye preparaciones de moléculas de anticuerpos de una única composición molecular. Una composición de anticuerpos monoclonales muestra una única especificidad y afinidad de unión únicas para un epítopo particular.

La expresión “anticuerpo humano”, tal como se utiliza en la presente memoria, incluye anticuerpos que presentan regiones variables en las que tanto las regiones de marco como las RDC se derivan de secuencias de origen humano. Además, en el caso de que el anticuerpo contenga una región constante, la región constante también se deriva de dichas secuencias humanas, p.ej., secuencias de línea germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de línea germinal humana o anticuerpo que contiene secuencias de marco de consenso derivadas del análisis de secuencias de marco humanas, por ejemplo tal como se indica en Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000). Las estructuras y localizaciones de los dominios variables de inmunoglobulina, p.ej., las RDC, pueden definirse utilizando esquemas de numeración bien conocidos, p.ej., el esquema de numeración de Kabat, el esquema de numeración de Chothia, o una combinación de Kabat y Chothia (ver, p.ej., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Lazikani et al., J. Mol. Bio. 273:927-948, 1997); Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., publicación del NIH n° 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989; and Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948, 1997). Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos aminoácidos no codificados por secuencias humanas (p.ej., mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o o mediante mutación somática in vivo, o una sustitución conservadora para fomentar la estabilidad o la fabricación). La expresión “anticuerpo monoclonal humano” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a anticuerpos que muestran una única especificidad de unión que presentan regiones variables en las que tanto las regiones marco como de RDC se derivan de secuencias humanas. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo de un ratón transgénico, que presenta un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana fusionados con una célula inmortalizada.

La expresión “anticuerpo humano recombinante”, tal como se utiliza en la presente memoria, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (p.ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, p.ej., de un transfectoma, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorial recombinante, y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualesquiera otros medios que implican el corte y empalme de la totalidad o una parte de secuencias de un gen de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes presentan regiones variables en las que las regiones de marco y de RDC se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en determinadas realizaciones, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, en el caso de que se utilice un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, de esta manera, las secuencias de aminoácidos de las regiones V^h y V^l de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas y relacionadas con secuencias de V^h y V^l de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Unión específica entre dos entidades se refiere a la unión con una constante de equilibrio (KA) (kon/koff) de por lo menos 102 M-1, de por lo menos 5x102 M-1, de por lo menos 103 M-1, de por lo menos 5x103 M-1 de por lo menos 104 M de por lo menos 5x104 M-1, de por lo menos 105 M-1, de por lo menos 5x105M-1, de por lo menos 106 M-1 de por lo menos 5x106 M-1, de por lo menos 107 M-1, de por lo menos 5x107M-1, de por lo menos 108M-1 , de por lo menos 5x108 M-1 de por lo menos 109 M-1, de por lo menos 5x109M-1, de por lo menos 1010 M-1, de por lo menos 5x1010 M-1, de por lo menos 10 nM-1, de por lo menos 5x10 nM-1, de por lo menos 1012 M-1, de por lo menos 5x1012 M-1, de por lo menos 1013 M-1, de por lo menos 5x1013 M-1, de por lo menos 1014 M-1, de por lo menos 5x1014 M-1, de por lo menos 1015 M-1, o de por lo menos 5x1015 M-1. La expresión “se une específicamente (o selectivamente)” a un anticuerpo (p.ej., un anticuerpo de unión a HER3) se refiere a una reacción de unión que es determinativa de la presencia de un antígeno afín (p.ej., un HER3 humano) en una población heterogénea de proteínas y otros compuestos biológicos. Además de la constante de equilibrio (KA) indicada anteriormente, un anticuerpo de unión a HER3 de la invención típicamente también presenta una constante de tasa de disociación (KD) (k0ff/kon) inferior a 5x10-2 M, inferior a 10-2 M, inferior a 5x10-3 M, inferior a 10-3 M, inferior a 5x10-4 M, inferior a 10-4 M, inferior a 5x10-5 M, inferior a 10-5 M, inferior a 5x10-6 M, inferior a 10-6 M, inferior a 5x10-7 M, inferior a 10-7 M, inferior a 5x10-8 M, inferior a 10-8 M, inferior a 5x10-9 M, inferior a 10-9 M, inferior a 5x10-10 M, inferior a 10-10 M, inferior a 5x10-11 M, inferior a 10-11 M, inferior a 5x10-12 M, inferior a 10-12 M, inferior a 5x10-13 M, inferior a 10-13 M, inferior a 5x10-14 M, inferior a 10-14 M, inferior a 5x10-15 M, o inferior a 10-15 M o inferior, y se une a HER3 con una afinidad que es por lo menos dos veces superior a su afinidad para la unión a un antígeno no específico (p.ej., HSA).

En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una constante de disociación (Ka) inferior a 3.000 pM, inferior a 2.500 pm, inferior a 2.000 pM, inferior a 1.500 pM, inferior a 1.000 pM, inferior a 750 pM, inferior a 500 pM, inferior a 250 pM, inferior a 200 pM, inferior a 150 pM, inferior a 100 pM, inferior a 75 pM, inferior a 10 pM, inferior a 1 pM, según se evalúa utilizando un método descrito en la presente memoria o conocido por el experto en la materia (p.ej., un ensayo BIAcore, ELISA, FACS, SET) (Biacore International AB, Uppsala, Suecia). El término "KaSSOC" o "Ka", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la tasa de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "Kü8" o "Kd,", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "KD", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la proporción de Kj a Ka (es decir, Kj/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para los anticuerpos pueden determinarse utilizando métodos bien establecidos en la técnica. Un método para determinar la KD de un anticuerpo utiliza la resonancia del plasmón superficial, o utiliza un sistema de biosensor, tal como un sistema Biacore®.

El término “afinidad” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la fuerza de interacción entre anticuerpo y antígeno en sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del “brazo” de anticuerpo interactúa mediante fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; a más interacciones, más fuerte es la afinidad. El término “avidez” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una medida informativa de la estabilidad o fuerza global del complejo de anticuerpo-antígeno. Está controlada por tres factores principales: la afinidad de los epítopos de anticuerpo; la valencia de tanto antígeno como anticuerpo, y la organización estructural de las partes interactuantes. En última instancia, estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el anticuerpo particular se una a un epítopo antigénico preciso.

El término “valencia”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere al número de sitios de unión a diana potenciales en un polipéptido. Cada sitio de unión a diana se une específicamente a una molécula diana o sitio específico (es decir, un epítopo) en una molécula diana. En el caso de que un polipéptido comprenda más de un sitio de unión a diana, cada sitio de unión a diana puede unirse específicamente a las mismas o a diferentes moléculas (p.ej., puede unirse a diferentes moléculas, p.ej., diferentes antígenos, o diferentes epítopos en la misma molécula).

La expresión “anticuerpo antagonista” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo que se une a HER3 y neutraliza la actividad biológica de la señalización de HER3, p.ej., reduce, disminuye y/o inhibe la actividad de señalización inducida por HER3, p.ej., en un ensayo de fosfo-HER3 o de fosfo-Akt. De acuerdo con lo anticuerpo, un anticuerpo que “inhibe” una o más de estas propiedades funcionales de HER3 (p.ej., actividades bioquímicas, inmunoquímicas, celulares, fisiológicas u otras actividades biológicas, o similares) según se determina según metodologías conocidas de la técnica y descritas en la presente memoria, se entiende que se relaciona con una reducción estadísticamente significativa en la actividad particular respecto a la observada en ausencia del anticuerpo (p.ej., en el caso de que se encuentre presente un anticuerpo de control de especificidad irrelevante). Un anticuerpo que inhibe la actividad de HER3 produce dicha reducción estadísticamente significativa a un nivel de por lo menos 10% del parámetro medido, de por lo menos 50%, de por lo menos 80% o 90%, y en determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención puede inhibir más de 95%, 98% o 99% de la actividad funcional de HER3, tal como pone de manifiesto una reducción del nivel de fosforilación de HER3 celular.

La expresión “anticuerpo aislado” se refiere a un anticuerpo que se encuentra sustancialmente libre de otros anticuerpos con diferentes especificidades antigénicas (p.ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente a HER3 se encuentra sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos diferentes de HER3). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a HER3 puede presentar, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos. Además, un anticuerpo aislado puede encontrarse sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o compuestos químicos.

La expresión “variante modificada conservadoramente” se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas conservadoramente se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en las que el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, o a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. De esta manera, en cada posición en la que una alanina se encuentra especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes indicados sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácidos nucleicos son “variaciones silenciosas”, que son una especie de variaciones modificadas conservadoramente. Cada secuencia de ácidos nucleicos en la presente memoria que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. El experto en la materia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que habitualmente es el único codón para metionina, y TGG, que habitualmente es el único codón para triptófano) puede modificarse para rendir una molécula funcionalmente idéntica. De acuerdo con lo anterior, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido se encuentra implícita en cada secuencia descrita.

Para las secuencias de polipéptido, “variantes modificadas conservadoramente” incluye sustituciones, deleciones o adiciones individuales de una secuencia polipeptídica que resultan en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas de la técnica. Dichas variantes modificadas conservadoramente son, adicionalmente y sin exclusión, variantes polimórficas, homólogos interespecíficos y alelos de la invención. Los ocho grupos siguientes contienen aminoácidos que son sustituciones conservadoras de uno respecto a otro: 1) alanina (A), glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W); 7) serina (S), treonina (T) y 8) cisteína (C), metionina (M) (ver, p.ej., Creighton, Proteins (1984). En algunas realizaciones, la expresión “modificaciones de secuencia conservadoras” se utiliza para referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos.

Las expresiones “compite cruzadamente” y “de competencia cruzada” se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a la capacidad de un anticuerpo u otro agente de unión para interferir con la unión de otros anticuerpos o agentes de unión a HER3 en un ensayo de unión competitiva estándar.

La capacidad o medida en que un anticuerpo u otro agente de unión es capaz de interferir con la unión de otro anticuerpo o molécula de unión a HER3 y, por lo tanto, si puede afirmarse que compite cruzadamente según la invención, puede determinarse utilizando ensayos de unión competitiva estándares. Un ensayo adecuado implica la utilización de la tecnología Biacore (p.ej., mediante la utilización del instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suecia)), que puede medir el grado de interacción utilizando tecnología de resonancia del plasmón superficial. Otro ensayo para medir la competición cruzada utiliza un enfoque basado en ELISA.

El término “optimizado” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una secuencia de nucleótidos que ha sido alterada para codificar una secuencia de aminoácidos utilizando codones que resultan preferentes en la célula u organismo de producción, generalmente una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de Pichia, una célula de Trichoderma, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se manipula para conservar por completo, o en la máxima medida posible, la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos inicial, que también se conoce como secuencia “parental”.

Los ensayos estándares para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos a HER3 de diversas especies son conocidos de la técnica, incluyendo, por ejemplo, los ELISA, las transferencias western y los RIA. Se describen ensayos adecuados en detalle en los Ejemplos. La cinética de unión (p.ej., la afinidad de unión) de los anticuerpos también puede evaluarse mediante ensayos estándares conocidos de la técnica, tales como mediante análisis Biacore o afinidad relativa de FACS (Scatchard). Pueden utilizarse ensayos conocidos de la técnica de evaluación de los efectos de los anticuerpos sobre las propiedades funcionales de HER3 (p.ej., ensayos de unión de receptores, modulando la ruta de Her).

Las expresiones "por ciento idéntico" y porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son “sustancialmente idénticas” si las dos secuencias presentan un porcentaje especificado de residuos aminoácidos o nucleótidos que son iguales {es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad en una región especificada o, en caso de no especificarse, a lo largo de la secuencia completa), al compararlas y alinearlas para máxima correspondencia en una ventana de comparación, o región designada tal como se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes, o mediante alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe en una región que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos), o más preferentemente, en una región que presenta 100 a 500 o 1.000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.

Para la comparación entre secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con las que se comparan las secuencias de ensayo. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se fijan las coordenadas de la subsecuencia, en caso necesario, y se fijan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Pueden utilizarse parámetros por defecto del programa, o pueden fijarse parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye la referencia a un segmento de cualquiera de entre varias posiciones contiguas seleccionadas de entre el grupo que consiste en 20 a 600, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas tras la alineación óptima de las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos de la técnica. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, p.ej., mediante el algoritmo de homologías locales de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482C, 1970; mediante el algoritmo de alineación de homologías de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.

48:443, 1970; mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; mediante implementaciones informatizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003).

Dos ejemplos de algoritmos que resultan adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y de similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales han sido descritos en Altschul et al., Acids Res. 25:3389-3402, 1977, y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis de BLAST se encuentra disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar en primer lugar las parejas de secuencias de alta puntuación (PAP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de pregunta que corresponden o satisfacen alguna puntuación umbral T de valor positivo estando alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., supra). Estos resultados iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas de PAP más largas que las contengan. Los resultados de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como pueda incrementarse la puntuación acumulada de alineación. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de premio para una pareja de residuos correspondientes, siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos no correspondientes, siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de resultados de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación acumulada de alineación cae en una cantidad X respecto al valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada va a cero o menos debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuaciones negativas, o se alcanza el final de cualquiera de las dos secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, un valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 3, un valor esperado (E) de 10, y la matriz de puntuaciones BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1989), alineaciones (B) de 50, valores esperados (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo de BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (ver, p.ej., Karlin y Altschul, Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se produzca por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia en el caso de que la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo y el ácido nucleico de referencia sea inferior a aproximadamente 0,2, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoácidos también puede determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17, 1988) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) utilizando una tabla de pesos de residuos PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970), que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software del GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una

Matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4, y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Aparte del porcentaje de identidad de secuencias indicado anteriormente, otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reacción inmunológica cruzada con los anticuerpos generados contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, tal como se indica posteriormente. De esta manera, un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren únicamente por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí bajo condiciones restrictivas, tal como se indica posteriormente. Todavía otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que pueden utilizarse los mismos cebadores para amplificar las secuencias.

La expresión “ácido nucleico” se utiliza en la presente memoria intercambiablemente con el término “polinucleótido” y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de cadena sencilla o de doble cadena. La expresión comprende ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótido conocidos o residuos del esqueleto o enlaces modificados, los cuales son sintéticos, naturales y no naturales, que presentan propiedades de unión simlares a las del ácido nucleico de referencia, y que resultan metabolizados de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Entre los ejemplos de dichos análogos se incluyen, aunque sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2'-O-metil ribonucleótidos y ácidos péptidonucleicos (APN).

A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácidos nucleicos también comprende implícitamente las variantes modificadas conservadoramente de la misma (p.ej., sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como las secuencias indicadas explícitamente. Específicamente, tal como se indica posteriormente, las sustituciones de codones degenerados pueden conseguirse mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.

260:2605-2608, 1985, y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).

La expresión “operablemente unido” se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos polinucleótidos (p.ej., de ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora transcripcional con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor o secuencia intensificadora se encuentra operablemente ligada a una secuencia codificante si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula huésped u otro sistema de expresión apropiado. Generalmente, las secuencias reguladoras de la transcripción promotores que están operablemente ligadas a una secuencia transcrita son físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, actúan en cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripción, tales como los intensificadores, no necesitan ser físicamente contiguas o encontrarse situadas en estrecha proximidad a las secuencias codificantes la transcripción de las cuales potencian.

Los términos “polipéptido” y “proteína” se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a un polímero de residuos aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos aminoácidos son miméticos químicos artificiales de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales y a polímeros de aminoácidos no naturales. A menos que se indique lo contrario, una secuencia polipeptídica particular también comprende implícitamente variantes modificadas conservadoramente de la misma.

La expresión “transducción de señales” o “actividad de señalización” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una relación bioquímica causal generalmente indiada por una interacción proteína-proteína, tal como la unión de un factor de crecimiento a un receptor, que da como resultado la transmisión de una señal de una parte de una célula a otra parte de una célula. Para HER3, la transmisión implica la fosforilación específica de uno o más residuos de tirosina, serina oa treonina en una o más proteínas en la serie de reacciones que causan la transducción de señales. Entre los procesos penúltimos típicamente se incluyen sucesos nucleares, que resultan en un cambio en la expresión génica.

El término “sujeto” incluye seres humanos y animales no humanos. Entre los animales no humanos se incluyen todos los vertebrados, p.ej., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios y reptiles. Excepto en donde se indique, los términos “paciente” o “sujeto” se utilizan intercambiablemente en la presente memoria.

La expresión “agente anticáncer” se refiere a cualquier agente que puede utilizarse para tratar un trastorno celular proliferativo, tal como cáncer, incluyendo agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, radioterapia y agentes radioterapéuticos, agentes anticáncer dirigidos y agentes inmunoterapéuticos. El término “tumor” se refiere al crecimiento y proliferación celular neoplásicos, sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.

La expresión “actividad antitumoral” se refiere a una reducción de la tasa de proliferación, viabilidad o actividad metastásica de las células tumorales. Un modo posible de mostrar actividad antitumoral se manifiesta en una reducción de la tasa de crecimiento de células anormales que aparece durante la terapia o en la estabilidad o reducción del tamaño tumoral. Dicha actividad puede evaluarse utilizando modelos tumorales in vitro o in vivo aceptados, incluyendo, aunque sin limitación, modelos de xenoinjerto, modelos de aloinjerto, modelos MMTV, y otros modelos conocidos de la técnica para investigar la actividad antitumoral.

El término “malignidad” se refiere a un tumor no benigno o a un cáncer. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “cáncer” incluye una malignidad caracterizada por un crecimiento celular desregulado o incontrolado. El término “cáncer” incluye tumores malignos primarios (p.ej., aquellos cuyas células no han migrado a sitios en el cuerpo del sujeto diferentes del sitio del tumor original) y tumores malignos secundarios (p.ej., los que surgen a partir de metástasis, la migración de células tumorales a sitios secundarios que son diferentes del sitio del tumor original).

“Tratando”, “tratar” o “tratamiento” en el contexto de la presente invención se refiere a un alivio de los síntomas asociados a un trastorno o enfermedad, o a la detención de la progresión o agravamiento posteriores de dichos síntomas, o a la prevención o profilaxis de la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, el tratamiento con éxito puede incluir un alivio de los síntomas relacionado con cáncer ovárico seroso de grado bajo o a una detención en el avance de una enfermedad, tal como cáncer ovárico seroso de grado bajo.

Los “tumores ováricos serosos de grado bajo” en el contexto de la presente invención se caracterizan basándose en varios criterios, por ejemplo los tumores serosos de grado bajo presentan una inestabilidad cromosómica baja a nula, típicamente presentan genes KRAS, BRAF y HER2 mutados, muestran un desarrollo tumoral lento, típicamente presentan núcleos celulares que son uniformes, pequeños y redondos, y generalmente presentan un índice mitótico bajo.

Anticuerpos de HER3

En algunas realizaciones, el agente para la utilización en el tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a HER3. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo bloquea la transducción de señales tanto dependiente de ligando como independiente de ligando. En otra realización, los anticuerpos se unen a HER3 y no bloquean la unión de ligandos de ErbB al sitio de unión a ligando (es decir, tanto ligando como anticuerpo pueden unirse a HER3 concurrentemente). El anticuerpo o fragmento del mismo según la presente invención se une a un epítopo conformacional que comprende residuos aminoácidos dentro del dominio 2 y del dominio 4 de HER3. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo que comprende los residuos aminoácidos 208 a 328 dentro del dominio 2 de HER3. En todavía otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo reconoce un epítopo no lineal de HER3 que comprende residuos aminoácidos dentro del dominio 3 de HER3 y se une a por lo menos un residuo aminoácido seleccionado de la superficie de unión B.

Se conocen de la técnica ejemplos específicos de anticuerpos de HER3. En una realización, el VH del anticuerpo o fragmento del mismo se une a por lo menos uno de los residuos de HER3 siguientes: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596 y Lys597. En otra realización, el VL del anticuerpo o fragmento del mismo se une a por lo menos uno de los residuos de HER3 siguientes: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614 y Glu615.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a la proteína HER3 humana que presenta un epítopo conformacional que comprende: (i) residuos aminoácidos 265-277 (del dominio 2) de HER3, e (ii) los residuos aminoácidos 571, 582-584, 596-597, 600-602 y 609-615 (del dominio 4) de HER3 de SEC ID n° 1 o un subgrupo de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a los aminoácidos dentro o solapando los residuos aminoácidos 265-277 y 315 (del dominio 2), e (ii) los residuos aminoácidos 571, 582-584, 596-597, 600-602 y 609-615 (del dominio 4) de h Er 3 de SEC ID n° 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a los aminoácidos en (y/o las secuencias de aminoácidos que consisten en) los aminoácidos 265-277 y 315 (del dominio 2) e (ii) los residuos aminoácidos 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de HER3 de SEC ID n° 1 o un subgrupo de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al epítopo conformacional de manera que restringe la movilidad del dominio 2 y del dominio 4, estabilizándolo en una conformación inactiva o cerrada. El fracaso en la formación de la conformación activa resulta en el fracaso de la activación de la transducción de señales. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al epítopo conformacional de manera que obstruye el bucle de dimerización dentro del dominio 2, provocando de esta manera que no se encuentre disponible para la interacción receptor-receptor. El fracaso en la formación de homodímeros o heterodímeros resulta en el fracaso de la activación de la transducción de señales. La presente invención puede utilizar anticuerpos de HER3 que reconocen un epítopo conformacional de HER3 de manera que bloquean las rutas de transducción de señales de HER3 tanto dependientes de HER3 como independientes de h Er 3. Dicha clase de anticuerpos se da a conocer en la Tabla 1.

El anticuerpo aislado o fragmento del mismo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo sintético.

En otro ejemplo, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo puede unirse al mismo epítopo conformacional que un anticuerpo indicado en la Tabla 1.

Tabla 1: ejemplos de anticuerpos de HER3 útiles en los métodos de la presente invención

La presente invención proporciona anticuerpos para la utilización en el tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo, en el que los anticuerpos se unen específicamente a proteína HER3 (p.ej., HER3 humana y/o de Cynomolgus), comprendiendo dichos anticuerpos un dominio VH que presenta una secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231,249, 267, 285, 303, 321, 339, 357 y 375. La presente invención proporciona anticuerpos para la utilización en el tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo, en el que los anticuerpos se unen específicamente a proteína HER3 (p.ej., HER3 humana y/o de Cynomolgus), comprendiendo dichos anticuerpos un dominio VL que presenta una secuencia de aminoácidos de s Ec ID n° 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 y 374. La presente invención proporciona además anticuerpos para la utilización en el tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo, en el que los anticuerpos se unen específicamente a proteína HER3 (p.ej., HER3 humano y/o de Cynomolgus), comprendiendo dichos anticuerpos un RDC de VH que presenta una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los RDC de VH listados en la Tabla 1, infra. En particular, la invención proporciona anticuerpos para la utilización en el tratamiento de cáncer ovárico seroso de grado bajo, donde los anticuerpos se unen específicamente a proteína HER3 (p.ej., HER3 humano y/o de Cynomolgus), comprendiendo dichos anticuerpos (o alternativamente, consistiendo en) uno, dos, tres, cuatro, cinco o más RDC de VH que presentan una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los RDC de VH listados en la Tabla 1, infra.

Entre otros anticuerpos para la utilización según la invención se incluyen aminoácidos que han sido mutados, aunque presentan por lo menos 60, 70, 80, 90, 95 o 98 por ciento de identidad en las regiones de RDC respecto a las regiones RDC ilustradas en las secuencias indicadas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en las que no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos han sido mutados en las regiones RDC en comparación con las regiones RDC ilustradas en la secuencia indicada en la Tabla 1, aunque manteniendo simultáneamente su especificidad para el epítopo del anticuerpo original.

Entre otros anticuerpos para la utilización según la invención se incluyen aminoácidos que han sido mutados, aunque presentan por lo menos 60, 70, 80, 90, 95 o 98 por ciento de identidad en las regiones de marco respecto a las regiones de marco ilustradas en las secuencias indicadas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en las que no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos han sido mutados en las regiones de marco en comparación con las regiones de marco ilustradas en la secuencia indicada en la Tabla 1, aunque manteniendo simultáneamente su especificidad para el epítopo del anticuerpo original. Los presentes inventores describen secuencias de ácidos nucleicos que codifican VH, VL, la cadena pesada de longitud completa y la cadena ligera de longitud completa de los anticuerpos que se unen específicamente a la proteína HER3 (p.ej., HER3 humana y/o de Cynomolgus) para la utilización según la presente invención.

Los anticuerpos de HER3 para la utilización según la presente invención pueden unirse al epítopo conformacional de HER3 que comprende los residuos aminoácidos del dominio 2 y del dominio 4 de HER3.

En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos de unión a HER3 para la utilización en el tratamiento de cáncer ovárico seroso de grado bajo, en el que los anticuerpos comprenden las RDC1, RDC2 y RDC3 de cadena pesada y cadena ligera indicadas en la Tabla 1, o combinaciones de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de las RDC1 de VH de los anticuerpos se muestran en las SEC ID n° 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 y 368. Las secuencias de aminoácidos de las RDC2 de VH de los anticuerpos se muestran en las SEC ID n° 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 y 369. Las secuencias de aminoácidos de las RDC3 de VH de los anticuerpos se muestran en las SEC ID n° 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 y 370. Las secuencias de aminoácidos de las RDC1 de VL de los anticuerpos se muestran en las SEC ID n° 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 y 371. Las secuencias de aminoácidos de las RDC2 de VL de los anticuerpos se muestran en las SEC ID n° 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 y 372. Las secuencias de aminoácidos de las RDC3 de VL de los anticuerpos se muestran en las SEC ID n°: 7, 13, 25, 31,43, 49, 61,67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 y 373. Las regiones RDC se delinean utilizando el sistema de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación del NIH n n° 91-3242, 1991; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989 y Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273, 927-948, 1997).

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 2, una RDC2 de SEC ID n° 3, una RDC3 de SEC ID n° 4; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 5, una RDC2 de SEC ID n° 6 y una CDR3 de SEC ID n° 7.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 20, una RDC2 de SEC ID n° 21, una RDC3 de SEC ID n° 22; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 23, una RDC2 de SEC ID n° 24 y una CDR3 de SEC ID n° 25.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 38, una RDC2 de SEC ID n° 39, una RDC3 de SEC ID n° 40; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 41, una RDC2 de SEC ID n° 42 y una CDR3 de SEC ID n° 43.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 56, una RDC2 de SEC ID n° 57, una RDC3 de SEC ID n° 58; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 59, una RDC2 de SEC ID n° 60 y una CDR3 de SEC ID n° 61.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 74, una RDC2 de SEC ID n° 75, una RDC3 de SEC ID n° 76; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 77, una RDC2 de SEC ID n° 78 y una CDR3 de SEC ID n° 79.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 92, una RDC2 de SEC ID n° 93, una RDC3 de SEC ID n° 94; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 95, una RDC2 de SEC ID n° 96 y una CDR3 de SEC ID n° 97.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 110, una RDC2 de SEC ID n° 111, una RDC3 de SEC ID n° 112; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 113, una RDC2 de SEC ID n° 114 y una CDR3 de SEC ID n° 115.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 128, una RDC2 de Se C ID n° 129, una RDC3 de SEC ID n° 130; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 131, una RDC2 de SEC ID n° 132 y una CDR3 de SEC ID n° 133.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 146, una RDC2 de Se C ID n° 147, una RDC3 de SEC ID n° 148; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 149, una RDC2 de SEC ID n° 150 y una CDR3 de SEC ID n° 151.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 164, una RDC2 de Se C ID n° 165, una RDC3 de SEC ID n° 166; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 167, una RDC2 de SEC ID n° 168 y una CDR3 de SEC ID n° 169.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 182, una RDC2 de Se C ID n° 183, una RDC3 de SEC ID n° 184; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 185, una RDC2 de SEC ID n° 186 y una CDR3 de SEC ID n° 187.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 200, una RDC2 de Se C ID n° 201, una RDC3 de SEC ID n° 202; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 203, una RDC2 de SEC ID n° 204 y una CDR3 de SEC ID n° 205.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 218, una RDC2 de Se C ID n° 219, una RDC3 de SEC ID n° 220; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 221, una RDC2 de SEC ID n° 222 y una CDR3 de SEC ID n° 223.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 236, una RDC2 de Se C ID n° 237, una RDC3 de SEC ID n° 238; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 239, una RDC2 de SEC ID n° 240 y una CDR3 de SEC ID n° 241.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 254, una RDC2 de Se C ID n° 255, una RDC3 de SEC ID n° 256; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 257, una RDC2 de SEC ID n° 258 y una CDR3 de SEC ID n° 259.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 272, una RDC2 de Se C ID n° 273, una RDC3 de SEC ID n° 274; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 275, una RDC2 de SEC ID n° 276 y una CDR3 de SEC ID n° 277.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 290, una RDC2 de Se C ID n° 291, una RDC3 de SEC ID n° 292; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 293, una RDC2 de SEC ID n° 294 y una CDR3 de SEC ID n° 295.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 308, una RDC2 de Se C ID n° 309, una RDC3 de SEC ID n° 310; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 311, una RDC2 de SEC ID n° 312 y una CDR3 de SEC ID n° 313.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 326, una RDC2 de Se C ID n° 327, una RDC3 de SEC ID n° 328; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 329, una RDC2 de SEC ID n° 330 y una CDR3 de SEC ID n° 331.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 344, una RDC2 de Se C ID n° 345, una RDC3 de SEC ID n° 346; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 347, una RDC2 de SEC ID n° 348 y una CDR3 de SEC ID n° 349.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 362, una RDC2 de Se C ID n° 363, una RDC3 de SEC ID n° 364; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 365, una RDC2 de SEC ID n° 366 y una CDR3 de SEC ID n° 367.

En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 15 y VL de SEC ID n° 14. En una realización específica, un anticuerpo que se une a h ER3 comprende una VH de SEC ID n° 33 y VL de SEC ID n° 32. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 51 y VL de SEC ID n° 50. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una SEC ID n° 69 y VL de SEC ID n° 68. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 87 y VL de SEC ID n° 86. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 105 y VL de SEC ID n° 104. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 123 y VL de SEC ID n° 122. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 141 y VL de SEC ID n° 140. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 159 y VL de SEC ID n° 158. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 177 y VL de SEC ID n° 176. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 195 y VL de SEC ID n° 194. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 213 y VL de SEC ID n° 212. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 231 y VL de SEC ID n° 230. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 249 y VL de SEC ID n° 248. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 267 y VL de SEC ID n° 266. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 285 y VL de SEC ID n° 284. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 303 y VL de SEC ID n° 302. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 321 y VL de SEC ID n° 320. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 339 y VL de SEC ID n° 338. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 357 y VL de SEC ID n° 356. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEC ID n° 375 y VL de SEC ID n° 374.

Los anticuerpos dados a conocer en la presente memoria pueden ser derivados de anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos, anticuerpos de dominio, nanocuerpos y unicuerpos. En todavía otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo para la utilización en el tratamiento de cáncer ovárico seroso de grado bajo, en el que el anticuerpo o fragmento comprende secuencias de aminoácidos que son homólogas respecto a las secuencias indicadas en la Tabla 1, y dicho anticuerpo se une a la proteína HER3 (p.ej., HER3 humana y/o de Cynomolgus) y conserva las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos indicados en la T abla 1.

Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado (o un fragmento funcional del mismo) para la utilización en el tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo, en el que el anticuerpo monoclonal aislado (o fragmento funcional del mismo) comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en el que la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n° 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357 y 375; la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID n° 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 y 374; el anticuerpo se une a HER3 (p.ej., HER3 humano y/o de Cynomolgus) y neutraliza la actividad de señalización de HER3, que puede medirse en un ensayo de fosforilación u otra medida de la señalización de HER (p.ej., ensayos de fosfo-HER3, ensayos de fosfo-Akt, proliferación celular y ensayos de bloqueo de ligando tal como se describen en el documento n° WO2012022814). En la presente memoria también se describen secuencias de nucleótidos parentales variables de cadena pesada y de cadena ligera y secuencias de cadena pesada y cadena ligera de longitud completa optimizadas para la expresión en una célula de mamífero. Entre otros anticuerpos para la utilización según la invención se incluyen aminoácidos o ácidos nucleicos que han sido mutados, aunque presentan por lo menos 60, 70, 80, 90, 95 o 98% de identidad respecto a las secuencias indicadas anteriormente. En algunas realizaciones, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en las que no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos han sido mutados mediante deleción, inserción o sustitución de aminoácidos en las regiones variables en comparación con las regiones variables ilustradas en la secuencia indicada anteriormente.

En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL pueden ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias indicadas en la Tabla 1. En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL pueden ser idénticas excepto por una sustitución de aminoácido en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones aminoácidas. Un anticuerpo que presenta regiones VH y VL con elevada identidad (es decir, de 80% o superior) respecto a las regiones VH y VL de los anticuerpos indicados en la Tabla 1 puede obtenerse mediante mutagénesis (p.ej., mutagénesis dirigida a sitio o mediada por PCR), seguido del ensayo del anticuerpo alterado codificado para la conservación de la función, utilizando los ensayos funcionales indicados en la presente memoria.

En otras realizaciones, las regiones variables de las secuencias de nucleótidos de cadena pesada y/o cadena ligera pueden ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias indicadas anteriormente.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo para la utilización según la invención presenta una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de RDC1, RDC2 y RDC3, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de RDC1, RDC2 y RDC2, en la que una o más de estas secuencias de RDC presentan secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos indicados en la presente memoria o modificaciones conservadoras de las mismas, y en la que los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos de unión a HER3 de la invención.

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal de HER3 aislado, o un fragmento del mismo, para la utilización en el tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo consiste en una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de RDC1, RDC2 y RDC3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de RDC1, RDC2 y RDC3, en la que: las secuencias de aminoácidos de la RDC1 de región variable de cadena pesada se seleccionan del grupo que consiste en las SEC ID n° 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 y 368, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de RDC2 de región variable de cadena pesada se seleccionan del grupo que consiste en las SEC ID n° 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 y 369, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de RDC3 de región variable de cadena pesada se seleccionan del grupo que consiste en las SEC ID n° 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 y 370, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de RDC1 de región variable de cadena pesada se seleccionan del grupo que consiste en las SEC ID n° 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191,203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311,317, 329, 335, 347, 353, 365 y 371, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de RDC2 de región variable de cadena ligera se seleccionan del grupo que consiste en las SEC ID n° 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 y 372, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de RDC3 de región variable de cadena ligera se seleccionan del grupo que consiste en las SEC ID n° 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 y 373, y modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo o fragmento del mismo se une específicamente a h ER3 y neutraliza la actividad de HER3 mediante la inhibición de una ruta de señalización de HER3, que puede medirse en un ensayo de fosforilación u otra medida de señalización de HER (p.ej., ensayos de fosfo-HER3, ensayos de fosfo-Akt, proliferación celular y ensayos de bloqueo de ligandos, tal como se indica en el documento n° WO2012022814).

En otro ejemplo, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo compite cruzadamente con un anticuerpo indicado en la Tabla 1. Los anticuerpos pueden comprender un VH seleccionado del grupo que consiste en SEC ID n° 15, SEC ID n° 33, SEC ID n° 51, SEC ID n° 69, SEC ID n° 87, SEC ID n° 105, SEC ID n° 123, SEC ID n° 141, SEC ID n° 159, SEC ID n° 177, SEC ID n° 195, SEC ID n° 213, SEC ID n° 231, SEC ID n° 249, SEC ID n° 267, SEC ID n° 285, SEC ID n° 303, SEC ID n° 321, SEC ID n° 339, SEC ID n° 357 y SEC ID n° 375 y una VL seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 14, SEC ID n° 32, SEC ID n° 50, SEC ID n° 68, SEC ID n° 86, SEC ID n° 104, SEC ID n° 122, SEC ID n° 140, SEC ID n° 158, SEC ID n° 176, SEC ID n° 194, SEC ID n° 212, SEC ID n° 230, SEC ID n° 248, SEC ID n° 266, SEC ID n° 284, SEC ID n° 302, SEC ID n° 320, SEC ID n° 338, SEC ID n° 356 y SEC ID n° 374 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas.

En otro ejemplo, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende un RDC1 de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 2, 20, 38, 56, 74, 92, 110, 128, 146, 164, 182, 200, 218, 236, 254, 272, 290, 308, 326, 344 y 362; RDC2 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 3, 21, 39, 57, 75, 93, 111, 129, 147, 165, 183, 201, 219, 237, 255, 273, 291, 309, 327, 345 y 363; RDC3 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 4, 22, 40, 58, 76, 94, 112, 130, 148, 166, 184, 202, 220, 238, 256, 274, 292, 310, 328, 346 y 364; RDC1 de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 5, 23, 41, 59, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, 203, 221, 239, 257, 275, 293, 311, 329, 347 y 365; RDC2 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n° 6, 24, 42, 60, 78, 96, 114, 132, 150, 166, 186, 204, 222, 240, 258, 276, 294, 312, 330, 348 y 366; y RDC3 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID n° 7, 25, 43, 61, 79, 97, 115, 133, 151, 169, 187, 205, 223, 241, 259, 277, 295, 313, 331, 349 y 367.

En un ejemplo específico, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo, comprende una RDC1 de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 128; RDC2 de SEC ID n° 129; RDC3 de SEC ID n° 130; una RDC1 de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 131; RDC2 de SEC ID n° 132, y RDC3 de SEC ID n° 133.

Los anticuerpos utilizados en la invención pueden ser fragmentos de un anticuerpo que se une a HER3 seleccionados del grupo que consiste en Fab, F(ab2)', F(ab)2', scFv, VHH, VH, VL y dAb.

La presente invención incluye además anticuerpos que interactúan con (p.ej., mediante unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) el mismo epítopo que los anticuerpos de unión a HER3 indicados en la T abla 1, para la utilización en el tratamiento de cáncer ovárico seroso de grado bajo.

La presente invención proporciona anticuerpos totalmente humanos que se unen específicamente a una proteína HER3 (p.ej., HER3 humano y/o de Cynomolgus/ratón/rata) para la utilización en el tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo. En comparación con los anticuerpos quiméricos o humanizados, los anticuerpos de unión a HER3 humanos para la utilización según la invención presentan una antigenicidad adicionalmente reducida al administrarlos en sujetos humanos.

Los anticuerpos de unión a HER3 humanos para la utilización según la presente invención pueden generarse utilizando métodos que son conocidos de la técnica. Por ejemplo, la tecnología de humanización utilizada para convertir anticuerpos no humanos en anticuerpos humanos de ingeniería genética. La publicación de patente US n° 20050008625 describe un método in vivo para sustituir una región variable de anticuerpo no humano por una región variable humana en un anticuerpo, manteniendo simultáneamente las mismas características, o proporcionando características de unión mejores que las del anticuerpo no humano.

En otro aspecto, se utilizan según la invención moléculas biparatópicas, biespecíficas o multiespecíficas que comprenden un anticuerpo de unión a HER3, o un fragmento del mismo. Un anticuerpo para la utilización según la invención, o fragmentos del mismo, pueden derivatizarse o unirse a otra molécula funcional, p.ej., otro péptido o proteína (p.ej., otro anticuerpo o ligando para un receptor), generando una molécula biespecífica que se une a por lo menos dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. El anticuerpo para la utilización según la invención puede de hecho derivatizarse o unirse a más de otra molécula funcional para generar moléculas biparatópicas o multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes, tales como moléculas biparatópicas o multiespecíficas. Para crear una molécula biespecífica para la utilización según la invención, puede unirse funcionalmente un anticuerpo (p.ej., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a otra u otras moléculas de unión, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de manera que resulta una molécula biespecífica.

En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos que pueden utilizarse para el tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo pueden ser cualquiera de los anticuerpos y fragmentos de los mismos que se describen en los documentos n° WO 2012/022814, n° WO 2013/084147, n° WO 2013/084148 y n° WO 2013/084151.

Combinaciones de anticuerpos

En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos de HER3, o fragmentos de los mismos, que se utilizan con un agente terapéutico adicional seleccionado de Cetuximab o Trastuzumab, o Cetuximab y Trastuzumab, para la utilización en el tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo.

Inhibidores de HER1: Pueden utilizarse los anticuerpos de HER3 o fragmentos de los mismos con inhibidores de HER1, entre los que se incluyen, aunque sin limitación, Matuzumab (EMD72000),

Erbitux®/Cetuximab (Imclone), Vectibix® /Panitumumab (Amgen), mAb 806 y Nimotuzumab (TheraCIM), Iressa® /Gefitinib (Astrazeneca); CI-1033 (PD183805) (Pfizer), Lapatinib (GW-572016) (Glaxo SmithKline), Tykerb® /ditosilato de lapatinib (SmithKlineBeecham), Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774) (OSI Pharma) y PKI-166 (Novartis), yN-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[[(3"S")-tetrahidro-3-furanil]oxi]-6-quinazolinil]-4(dimetilamino)-2-butenamida, comercializado bajo el nombre comercial Tovok® de Boehringer Ingelheim).

Inhibidores de HER2: Los anticuerpos de HER3 o fragmentos de los mismos pueden utilizarse con inhibidores de HER2, que incluyen, aunque sin limitación, Pertuzumab (comercializado bajo la marca comercial Omnitarg®, de Genentech), Trastuzumab (comercializado bajo la marca comercial Herceptin®, de Genentech/Pvoche), MM-111, neratinib (también conocido como HKI-272, (2E)-N-[4-[[3-cloro-4- [(piridín-2-il)metoxi]fenil] amino] -3 -ciano-7-etoxiquinolín-6-il] -4-(dimetilamino)but-2-enamida, y se describe en la publicación de patente p Ct n° WO 05/028443), lapatinib o ditosilato de lapatinib (comercializado bajo la marca comercial Tykerb®, de Glaxo SmithKline.

Inhibidores de HER3: Los anticuerpos de HER3 o fragmentos de los mismos pueden utilizarse con inhibidores de HER3 entre los que se incluyen, aunque sin limitación, MM- 121, MM-111, IB4c 3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203(Aveo), MEHD7945A (Genentech) y moléculas pequeñas que inhiben HER3.

Inhibidores de HER4: Los anticuerpos de HER3 o fragmentos de los mismos pueden utilizarse como inhibidores de HER4.

Inhibidores de PI3K: Los anticuerpos de HER3 o fragmentos de los mismos pueden utilizarse con inhibidores de PI3 quinasa que incluyen, aunque sin limitación, 4-[2-(lH-indazol-4-il)-6-[[4-(metilsulfonil)piperazín-1-il]metil]tieno [3,2-d]pirimidín-4-il]morfolina (también conocido como GDC 0941 y descrito en las publicaciones de patente n° WO 09/036082 y n° WO 09/055730), 2-metil-2-[4-[3-metil-2-oxo-8-(quinolín-3-il)-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolín-1-il]fenil]propionitrilo (también conocido como BEZ 235 o NVP-BEZ 235, y se describe en la publicación de patente PCT n° WO 06/122806), BMK120 y BYL719. En un ejemplo, el inhibidor de PI3K es 2-amida 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridín-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de ácido (S)-pirrolidín-1,2-dicarboxílico.

Inhibidores de mTOR: Los anticuerpos de HER3 o fragmentos de los mismos pueden utilizarse con inhibidores de mTOR entre los que se incluyen, aunque sin limitación, Temsirolimus (comercializado bajo el nombre comercial Torisel®, de Pfizer), ridaforolimus (formalmente conocido como deferolimus, dimetilfosfinato de (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15, 17,21,23, 29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.04,9] hexatriaconta-16,24,26,28-tetraén-12-il]propil]-2-metoxiciclohexilo, también conocido como Deforolimus, AP23573 y MK8669 (Ariad Pharm.), y descrito en la publicación de patente PCT n° 03/064383), everolimus (RADOOI) (comercializado bajo el nombre comercial Afinitor®, de Novartis). Puede administrarse uno o más agentes terapéuticos simultáneamente, antes o después de la administración de un anticuerpo de HER3 o fragmento del mismo de la presente invención.

Usos profilácticos y terapéuticos

La presente invención proporciona métodos de tratamiento de una enfermedad o trastorno mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz (p.ej., una dosis de un anticuerpo que inhibe el crecimiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo) de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a HER3. En una realización específica, la presente invención proporciona un método de tratamiento del cáncer ovárico seroso de grado bajo. En algunas realizaciones, puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a HER2. En algunas realizaciones, puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a EGFR. En todavía otras realizaciones, puede administrarse un agente terapéutico adicional. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se selecciona de uno o más inhibidores de HER1, y/o uno o más inhibidores de HER2 y/o uno o más inhibidores de HER3 y/o uno o más inhibidores de HER4, y/o uno o más inhibidores de mTOR, y/o uno o más inhibidores de PI3 quinasa. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se selecciona de: gemcitabina, paclitaxel, mesilato de imatinib, malato de sunitinib, adriamicina, daunomicina, cisplatino, etopósido, vinblastina, vincristina y metotrexato.

Composiciones farmacéuticas

Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles, incluyendo anticuerpos de unión a HER3 (fragmentos intactos o de unión), se mezclan anticuerpos de unión a HER3 (intactos o fragmentos de unión) con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener adicionalmente otro u otros agentes terapéuticos que resultan adecuados para tratar o evitar el cáncer ovárico seroso de grado bajo.

Las formulaciones de agentes terapéuticos y diagnósticos pueden prepararse mediante la mezcla con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables en forma de, p.ej., polvos liofilizados, suspensiones, soluciones acuosas, lociones o suspensiones (ver, p.ej., Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y., 2000; Avis, et al. (editores) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (editores) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (editores) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y).

La selección de un régimen de administración para un terapéutico depende de varios factores, incluyendo la tasa de renovación en suero o tejido de la entidad, el nivel de síntomas, la inmunogenicidad de la entidad y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. En determinadas realizaciones, un régimen de administración maximiza la cantidad de terapéutico administrada en el paciente consistente con un nivel aceptable de efectos secundarios. De acuerdo con lo anterior, la cantidad de compuesto biológico depende en parte de la entidad particular y de la severidad de la condición bajo tratamiento. Se encuentran disponibles guías para seleccionar dosis apropiadas de anticuerpos, citoquinas y moléculas pequeñas (ver, p.ej., Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, Reino Unido, 1996; Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993.; Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341: 1966-1973, 1999; Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med.

342:613-619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003; Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343: 1594­ 1602, 1990).

La determinación de la dosis apropiada la realiza el médico clínico, p.ej., utilizando parámetros o factores conocidos o que se sospecha en la técnica que afectan al tratamiento o que se predice que afectan al tratamiento. Generalmente, la dosis se inicia con una cantidad algo inferior a la dosis óptima y se incrementa posteriormente en incrementos pequeños hasta alcanzar el efecto deseado u óptimo respecto a cualesquiera efectos secundarios negativos. Entre las medidas diagnósticas importantes se incluyen las de síntomas de, p.ej., la inflamación o el nivel de citoquinas inflamatorias producido.

Los niveles reales de las dosis de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden modificarse de manera que se obtenga una cantidad del ingrediente activo que resulte eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin resultar tóxicos para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención utilizadas, o el éster, sal o amida de las mismas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto particular utilizado, la duración del tratamiento, otros fármacos, los compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares utilizadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, el estado general de salud y la historia médica anterior del paciente bajo tratamiento, y factores similares bien conocidos de las técnicas médicas. Pueden proporcionarse composiciones que comprenden anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la presente invención mediante infusión continua, o mediante dosis a intervalos de, p.ej., un día, una semana o 1 a 7 veces a la semana. Las dosis pueden proporcionarse por vía intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral o mediante inhalación. Un protocolo de dosis específica es uno que implica la dosis o frecuencia de dosis máximas que evitan efectos secundarios no deseables significativos. Una dosis semana total puede ser de por lo menos 0,05 p /kg de peso corporal, de por lo menos 0,2 |jg/kg, de por lo menos 0,5 pg/kg, de por lo menos 1 pg/kg, de por lo menos 10 pg/kg, de por lo menos 100 pg/kg, de por lo menos 0,2 mg/kg, de por lo menos 1,0 mg/kg, de por lo menos 2,0 mg/kg, de por lo menos 10 mg/kg, de por lo menos 25 mg/kg, de por lo menos 30 mg/kg, de por lo menos 40 mg/kg o de por lo menos 50 mg/kg (ver, p.ej., Yang et al., New Engl. J. Med. 349:427-434, 2003; Herold et al., New Engl. J. Med. 346: 1692-1698, 2002; Liu et al., J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456, 1999; Portielji et al., Cancer Immunol. Immunother. 52: 133-144, 1990). La dosis deseada de anticuerpos o fragmentos de los mismos es aproximadamente igual que para un anticuerpo o polipéptido, en una escala de moles/kg de peso corporal. La concentración plasmática deseada de los anticuerpos o fragmentos de los mismos es aproximadamente, en una escala de moles/kg de peso corporal. La dosis puede ser de por lo menos 15 pg, de por lo menos 20 pg, de por lo menos 25 pg, de por lo menos 30 pg, de por lo menos 35 pg, de por lo menos 40 pg, de por lo menos 45 pg, de por lo menos 50 pg, de por lo menos 55 pg, de por lo menos 60 pg, de por lo menos 65 pg, de por lo menos 70 pg, de por lo menos 75 pg, de por lo menos 80 pg, de por lo menos 85 pg, de por lo menos 90 pg, de por lo menos 95 pg, o de por lo menos 100 pg. Las dosis administradas en un sujeto pueden ser de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12, o más. Para anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la presente invención, la dosis administrada en un paciente puede ser de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal del paciente. La dosis puede ser de entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg, de entre 0,0001 mg/kg y 10 mg/kg, de entre 0,0001 mg/kg y 5 mg/kg, de entre 0,0001 y 2 mg/kg, de entre 0,0001 y 1 mg/kg, de entre 0,0001 mg/kg y 0,75 mg/kg, de entre 0,0001 mg/kg y 0,5 mg/kg, de entre 0,0001 mg/kg y 0,25 mg/kg, de entre 0,0001 y 0,15 mg/kg, de entre 0,0001 y 0,10 mg/kg, de entre 0,001 y 0,5 mg/kg, de entre 0,01 y 0,25 mg/kg o de entre 0,01 y 0,10 mg/kg de peso corporal del paciente.

Las dosis de los anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la presente invención pueden calcularse utilizando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por la dosis que debe administrarse, en mg/kg. La dosis de los anticuerpos o fragmentos de los mismos según la presente invención puede ser de 150 pg/kg o inferior, 125 pg/kg o inferior, 100 pg/kg o inferior, 95 pg/kg o inferior, 90 pg/kg o inferior, 85 pg/kg o inferior, 80 pg/kg o inferior, 75 pg/kg o inferior, 70 pg/kg o inferior, 65 pg/kg o inferior, 60 pg/kg o inferior, 55 pg/kg o inferior, 50 pg/kg o inferior, 45 pg/kg o inferior, 40 pg/kg o inferior, 35 pg/kg o inferior, 30 pg/kg o inferior, 25 pg/kg o inferior, 20 pg/kg o inferior, 15 pg/kg o inferior, 10 pg/kg o inferior, 5 pg/kg o inferior, 2,5 pg/kg o inferior, 2 pg/kg o inferior, 1,5 pg/kg o inferior, 1 pg/kg o inferior, 0,5 pg/kg o inferior, o 0,5 pg/kg o inferior de peso corporal del paciente.

La dosis unitaria de los anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la presente invención puede ser de 0,1 mg a 20 mg, 0,1 mg a 15 mg, 0,1 mg a 12 mg, 0,1 mg a 10 mg, 0,1 mg a 8 mg, 0,1 mg a 7 mg, 0,1 mg a 5 mg, 0,1 a 2,5 mg, , 0,25 mg a 60 mg, , 0,25 mg a 40 mg, 0,25 mg a 20 mg, 0,25 a 15 mg, 0,25 a 12 mg, 0,25 a 10 mg, 0,25 a 8 mg, 0,25 mg a 7 mg, 0,25 mg a 5 mg, 0,5 mg a 2,5 mg, 1 mg a 20 mg, 1 mg a 15 mg, 1 mg a 12 mg, 1 mg a 10 mg, 1 mg a 8 mg, 1 mg a 7 mg, 1 mg a 5 mg, o 1 mg a 2,5 mg.

Las dosis de los anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la presente invención pueden alcanzar un título sérico de por lo menos 0,1 pg/ml, por lo menos 0,5 pg/ml, por lo menos 1 pg/ml, por lo menos 2 pg/ml, por lo menos 5 pg/ml, por lo menos 6 pg/ml, por lo menos 10 pg/ml, por lo menos 15 pg/ml, por lo menos 20 pg/ml, por lo menos 25 pg/ml, por lo menos 50 pg/ml, por lo menos 100 pg/ml, por lo menos 125 pg/ml, por lo menos 150 pg/ml, por lo menos 175 pg/ml, por lo menos 200 pg/ml, por lo menos 225 pg/ml, por lo menos 250 pg/ml, por lo menos 275 pg/ml, por lo menos 300 pg/ml, por lo menos 325 pg/ml, por lo menos 350 pg/ml, por lo menos 375 pg/ml, o por lo menos 400 pg/ml en un sujeto. Alternativamente, las dosis de los anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la presente invención pueden alcanzar un título sérico de por lo menos 0,1 pg/ml, por lo menos 0,5 pg/ml, por lo menos 1 pg/ml, por lo menos 2 pg/ml, por lo menos 5 pg/ml, por lo menos 6 pg/ml, por lo menos 10 pg/ml, por lo menos 15 pg/ml, por lo menos 20 pg/ml, por lo menos 25 pg/ml, por lo menos 50 pg/ml, por lo menos 100 pg/ml, por lo menos 125 pg/ml, por lo menos 150 pg/ml, por lo menos 175 pg/ml, por lo menos 200 pg/ml, por lo menos 225 pg/ml, por lo menos 250 pg/ml, por lo menos 275 pg/ml, por lo menos 300 pg/ml, por lo menos 325 pg/ml, por lo menos 350 pg/ml, por lo menos 375 pg/ml, o por lo menos 400 pg/ml en el sujeto.

Las dosis de anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la presente invención pueden repetirse y las administraciones pueden separarse por como mínimo 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 7 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o por lo menos 6 meses.

Una cantidad eficaz para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como la condición bajo tratamiento, la salud global del paciente, la vía del método y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios (ver, p.ej., Maynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch PubL, London, Reino Unido, 2001).

La vía de administración puede ser, p.ej., aplicación tópica o cutánea, inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intracerebroespinal, intralesional o mediante sistemas de liberación sostenida o un implante (ver, p.ej., Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983; Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; patente US n° 6.350.466 y n° 6.316.024). En caso necesario, la composición puede incluir además un agente solubilizador y un anestésico local, tal como lidocaína, para aliviar el dolor en el sitio de inyección. Además, también puede utilizarse la administración pulmonar, p.ej., mediante la utilización de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente aerosolizante. Ver, p.ej., la patente US n° 6.019.968, n° 5.985.320, n° 5.985.309, n° 5.934.272, n° 5.874.064, n° 5.855.913, n° 5.290.540 y 4.880.078; y las publicaciones de patente PCT n° WO 92/19244, n° WO 97/32572, n° WO 97/44013, n° WO 98/31346 y n° w O 99/66903, cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.

Una composición para la utilización según la presente invención también puede administrarse mediante una o más vías de administración utilizando uno o más de entre una diversidad de métodos conocidos de la técnica. Tal como apreciará el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Entre las vías de administración seleccionadas para anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención se incluyen la vía intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La administración parenteral puede representar modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, aunque sin limitación, las inyecciones e infusiones intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural, e intraesternal. Alternativamente, puede administrarse una composición para la utilización según la presente invención por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejempmlo por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. En una realización, los anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la presente invención se administran mediante infusión. En otra realización, la proteína de unión epitópica multiespecífica se administra por vía subcutánea. En el caso de que los anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la invención se administren en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida, puede utilizarse una bomba para conseguir la liberación controlada o sostenida (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321 :574, 1989). Pueden utilizarse materiales poliméricos para conseguir una liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (ver, p.ej., Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger y Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983; ver tambiénLevy et al., Science 228: 190, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosurg. 71:105, 1989); patentes US n° 5.679.377, n°. 5.916.597, n°. 5.912.015, n°. 5.989.463, n°. 5.128.326; publicaciones de patente PCT n° WO 99/15154 y n° WO 99/20253. Entre los ejemplos de polímeros utilizados en formulaciones de liberación sostenida se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), poliláctidos (PLA), poli(láctido-glicólidos) (PLGA) y poliortoésteres. En una realización, el polímero utilizado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estable durante el almacenamiento, estéril y biodegradable. Puede situarse un sistema de liberación controlada o sostenida en proximidad de la diana profiláctica o terapéutica, requiriendo de esta manera sólo una fracción de la dosis sistémica (ver, p.ej., Goodson, en: Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, páginas 115 a 138, 1984).

Los sistemas de liberación controlada se comentan en la revisión de Langer, Science 249: 1527-1533, 1990). Puede utilizarse cualquier técnica conocida por el experto en la materia para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención. Ver, p.ej., la patente US n° 4.526.938, las publicaciones de patente PCT n° WO 91/05548, y n° WO 96/20698; Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39: 179-189, 1996, Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995; Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997 y Lam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997).

En el caso de que anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la presente invención se administren por vía tópica, pueden formularse en forma de una pomada, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, spray, aerosol, solución, emulsión u otra forma bien conocida por el experto en la materia. Ver, p.ej., Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1995. Para las formas de administración tópica no pulverizable, típicamente se utilizan formas viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un portador o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y que presentan una viscosidad dinámica, en algunos casos, superior a la del agua. Entre las formulaciones adecuadas se incluyen, aunque sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, polvos, linimentos, ungüentos y similares, que, si se desea, se esterilizan o se mezclan con agentes auxiliares (p.ej., conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, tampones o sales) para influir sobre diversas propiedades, tales como, por ejemplo, la presión osmótica. Entre otras formas de administración tópica adecuadas se incluyen preparaciones de aerosol pulverizable, en las que el ingrediente activo, en algunos casos, en combinación con un portador inerte sólido o líquido, se envasa en una mezcla con un volátil presurizado (p.ej., un propelente gaseoso, tal como freón) o en una botella flexible. También pueden añadirse hidratantes o humectantes a las composiciones farmacéuticas y formas de dosis, si se desea. Los ejemplos de dichos ingredientes adicionales son bien conocidos de la técnica.

En el caso de que las composiciones que comprenden anticuerpos o fragmentos de los mismos se administren por vía intranasal, pueden formularse en una forma de aerosol, spray, niebla o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para la utilización según la presente invención pueden administrarse convenientemente en forma de una presentación de spray de aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, utilizando un propelente adecuado (p.ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloroetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos (compuestos de, p.ej., gelatina) para la utilización en un inhalador o insuflador pueden formularse para contener una mezcla de polvos del compuesto y una base de polvos adecuada, tal como lactosa o almidón.

Los métodos para la coadministración o tratamiento con un segundo agente terapéutico, p.ej., una citoquina, esteroide, agente quimioterapéutico, antibiótico o radiación, son conocidos de la técnica (ver, p.ej., Hardman et al. (eds.), Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, IO. sup. ed., McGraw-Hill, New York, N.Y, 2001; Poole y Peterson (eds.) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa., 2001; Chabner y Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.). Una cantidad eficaz de terapéutico puede reducir los síntomas en por lo menos 10%, en por lo menos 20%, en por lo menos 30%, en por lo menos 40% o en por lo menos 50%.

Pueden administrarse terapias adicionales (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos), que pueden administrarse en combinación con los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, separados por menos de 5 minutos, por menos de 30 minutos, por 1 hora, por entre aproximadamente 1 hora, por entre aproximadamente entre 1 y aproximadamente 2 horas, por entre aproximadamente entre 2 horas y aproximadamente 3 horas, por entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 4 horas, por entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 5 horas, por entre aproximadamente 5 horas y aproximadamente 6 horas, por entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 7 horas, por entre aproximadamente 7 horas y aproximadamente 8 horas, por entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 9 horas, por entre aproximadamente 9 horas y aproximadamente 10 horas, por entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 11 horas, por entre aproximadamente 11 horas y aproximadamente 12 horas, por entre aproximadamente 12 y 18 horas, por entre 18 y 24 horas, por entre 24 y 36 horas, por entre 36 y 48 horas, por entre 48 y 52 horas, por entre 52 y 60 horas, por entre 60 y 72 horas, por entre 72 y 84 horas, por entre 84 y 96 horas, o por entre 96 y 120 horas respecto de los anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la invención. Las dos o más terapias pueden administrarse en una misma visita del paciente.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la invención y las terapias adicionales pueden administrarse cíclicamente. La terapia cíclica implica la administración de una primera terapia (p.ej., un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un periodo de tiempo, seguido de la administración de una segunda terapia (p.ej., un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un periodo de tiempo, opcionalmente seguida de la administración de una tercera terapia (p.ej., un agente profiláctico o terapéutico) durante un periodo de tiempo y así sucesivamente, y repitiendo esta administración secuencial, es decir, el ciclo, con el fin de reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias, a fin de evitar los efectos secundarios de una de las terapias y/o para mejorar la eficacia de las terapias.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la presente invención pueden formularse para garantizar una distribución in vivo correcta. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHC) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos para la utilización según la invención crucen la BHC (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de preparación de liposomas, ver, p.ej., las patentes US n° 4.522.811, n° 5.374.548 y n° 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o más fracciones que son selectivamente transportadoras al interior de células u órganos específicos, potenciando de esta manera la administración dirigida del fármaco (ver, p.ej., Ranade, J. Clin. Pharmacol. 29:685, 1989). Entre las fracciones de reconocimiento ejemplares se incluyen folato o biotina (ver, p.ej., la patente US n° 5.416.016, de Low et al); manósidos (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038, 1988); anticuerpos (Bloeman et al., Fe Bs Lett. 357: 140, 1995; Owais et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180, 1995); receptor de proteína A surfactante (Briscoe et al., Am. J. Physiol. 1233: 134, 1995); página 120 (Schreier et al., J. Biol. Chem. 269:9090, 1994); ver también K. Keinanen; M. L. Laukkanen, FEBS Lett. 346: 123, 1994; J. J. Killion; I. J. Fidler, Immunomethods 4:273, 1994.

En la presente memoria los presentes inventores describen protocolos para la administración de una composición farmacéutica que comprende anticuerpos o fragmentos para la utilización según la presente invención sola o en combinación con otras terapias en un sujeto que las necesita. Las terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la presente invención pueden administrarse concomitante o secuencialmente en un sujeto. La terapia (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la presente invención también pueden administrarse cíclicamente. La terapia cíclica implica la administración de una primera terapia (p.ej., un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un periodo de tiempo, seguido de la administración de una segunda terapia (p.ej., un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un periodo de tiempo y la repetición de esta administración secuencial, es decir, el ciclo, con el fin de reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias (p.ej., agentes) a fin de evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias (p.ej., agentes) y/o para mejorar la eficacia de las terapias.

Las terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación para la utilización según la invención pueden administrarse en un sujeto concurrentemente. El término “concurrentemente” no se limita a la administración de terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) exactamente al mismo tiempo, sino que por el contrario se refiere a que una composición farmacéutica que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos para la utilización según la invención, se administran en un sujeto en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo de manera que los anticuerpos para la utilización según la invención puedan actuar junto con la otra terapia o terapias proporcionando un beneficio mayor que si se administrasen de otra manera. Por ejemplo, cada terapia puede administrarse en un sujeto a la vez o secuencialmente en cualquier orden en diferentes puntos del tiempo; sin embargo, si no se administran a la vez, deberían administrarse suficientemente próximos en el tiempo para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada terapia puede administrarse en un sujeto por separado, en cualquier forma apropiada y mediante cualquier vía adecuada. En diversas realizaciones, las terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) se administran en el sujeto separados por menos de 15 minutos, por menos de 30 minutos, por menos de 1 hora, por aproximadamente 1 hora, por entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 2 horas, por entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 3 horas, por entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 4 horas, por entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 5 horas, por entre aproximadamente 5 horas y aproximadamente 6 horas, por entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 7 horas, por entre aproximadamente 7 horas y aproximadamente 8 horas, por entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 9 horas, por entre aproximadamente 9 horas y aproximadamente 10 horas, por entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 11 horas, por entre aproximadamente 11 horas y aproximadamente 12 horas, por 24 horas, por 48 horas, por 72 horas o por 1 semana. En otras realizaciones, se administran dos o más terapias (p.ej., agentes profilácticos o terapéuticos) dentro de la misma visita del paciente.

Los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias de combinación pueden administrarse en el sujeto en la misma composición farmacéutica. Alternativamente, los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias de combinación pueden administrarse concurrentemente en un sujeto en composiciones farmacéuticas separadas. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden administrarse en el sujeto por las mismas vías de administración o por vías diferentes.

En un ejemplo, la invención proporciona un agente para la utilización en el tratamiento de cáncer ovárico seroso de grado bajo en un sujeto, comprendiendo el agente un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a HER3, p.ej., tal como se muestra en la Tabla 1. En un ejemplo, el anticuerpo comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de MOR10703. En todavía otro ejemplo, el anticuerpo comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de MOR10703 a una dosis de entre 10 y 50 mg/kg. En todavía otro ejemplo, el anticuerpo comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de MOR10703 a una dosis (p.ej., una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes) de entre 10 y 50 mg/kg en un paciente que presenta cáncer ovárico seroso de grado bajo. En todavía otro ejemplo, el método incluye administrar un anticuerpo que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de MOR10703 a una dosis semanal de 40 mg/kg.

Ejemplos

El bloqueo de HER3 con MOR10703 o ARNi puede inhibir la proliferación en un subgrupo de células de cáncer ovárico primario.

Se añadió MOR10703, un anticuerpo monoclonal anti-ectodominio de HER3, a un panel de cepas de células de cáncer ovárico primario, cada una obtenida de ascites derivado de un único paciente portador de cáncer ovárico. Se evaluó la posterior proliferación y viabilidad celular en un ensayo CellTiter-Glo basado en ATP realizado tras 6 días de exposición continua a anticuerpo (figura 1). Aunque la mayor parte de los 21 paquetes de células de cáncer ovárico primario sometidos a ensayo se encontró que contenían HER3 fosforilado en la posición Y1289, determinado mediante transferencia western, sólo cuatro mostraron pruebas de sensibilidad a la exposición a MOR10703.

Con el fin de determinar si el efecto observado con MOR10703 estaba mediada por la interferencia con el circuito de señalización de NRG1/HER3, los presentes inventores llevaron a cabo interferencia del ARN (ARNi) en dos de los paquetes de células sensibles, DF76 y DF141, con ARN interfirientes pequeños (ARNip) bien validados (Sheng et al.) con diana en NRG1 y HER3 (figura 2). Tanto NRG1ip como HER3ip, sometidos a ensayo independientemente, afectaron a la proliferación/viabilidad celular en comparación con la transfección simulada o ARNip de control. Estos resultados sugieren que los efectos observados de MOR10703 en estas células son el resultado de la interferencia con la función de HER3 activado.

La sensibilidad al bloqueo de HER3 se encuentra presente en células de cáncer ovárico seroso de grado bajo primario, pero no en líneas celulares de cáncer ovárico seroso de grado bajo.

Se investigó si los paquetes de células primarias con sensibilidad observada a anticuerpo de HER3 compartían alguna característica común que pudiese ayudar a definir adicionalmente un subgrupo de cáncer ovárico en que la terapia dirigida a HER3 resultase más eficaz. Aunque DF76 y DF141 contenían ambas HER3 activado, esta característica también se encontraba presente en paquetes celulares que no eran sensibles a MOR10703 (Tabla 1). Sin embargo, la caracterización histopatológica de ambos paquetes de células sensibles, así como de los dos otros paquetes de células sensibles, DF192 y DF225, era la del cáncer ovárico seroso de grado 1 o grado 2, consistente con un diagnóstico de carcinoma ovárico seroso de grado bajo. No se observó sensibilidad a MOR10703 entre ninguno de los otros paquetes celulares, la mayoría de los cuales se caracterizó como carcinomas ováricos serosos de grado alto.

Tabla 2. Características de DF primarias y efecto de MOR10703

Dados estos resultados, se investigó si las líneas celulares de carcinoma ovárico seroso de grado bajo también son sensibles a la interferencia en la ruta de HER3. Se identificaron de la literatura tres líneas celulares de cáncer ovárico seroso de grado bajo. Una de ellas, HEY, reveló una expresión baja o nula de HER3, no presentaba HER3 activado detectable y no era sensible a MOR10703 (figura 3). Las otras dos líneas celulares, MPSC1 y HOC-7, expresaban HER3 que estaba activado (a niveles más bajos en HOC-7 que en MPSC1), aunque las dos también eran insensibles a MOR10703 (figura 3).

Las diferencias en las secuencias genómicas tumorales se investigaron para determinar si las diferencias de secuencia podían explicar las diferencias de sensibilidad a MOR10703 entre las células de cáncer ovárico seroso de grado bajo primario y las líneas celulares de cáncer ovárico seroso de grado bajo que se habían sometido a ensayo. Se llevó a cabo la secuenciación de nueva generación de aproximadamente 700 genes en los que se habían detectado mutaciones asociadas a tumor. Mientras que HEY, MPSC1 y HOC-7 revelaron todas mutaciones en BRAF o KRAS (HEY, BRAF G464E, KRAS G12D; MPSC1: V600L; HOC-7: KRAS G12A), no se detectaron mutaciones en ninguno de estos genes en las muestras de grado bajo primarias. Ninguna mutación adicional diferenció claramente las cepas respondedoras de cáncer ovárico seroso de grado bajo primario de las líneas celulares serosas de grado bajo no respondedoras.

Efectos del bloqueo combinado de la ruta de la familia de EGFR sobre células de cáncer ovárico seroso de grado bajo primario.

Dados los informes de que la señalización incrementada de determinados miembros de la familia de EGFR pueden compensar la pérdida de otros miembros de la familia (Sergina et al., 2007; Engelman et al., 2007), se investigó la inhibición de la función de miembros de la familia de EGFR diferentes de HER3 para determinar si la inhibición podía comprometer la proliferación celular en las células sensibles a MOR10703. Las cepas respondedoras de cáncer ovárico seroso de grado bajo primario, por lo tanto, se expusieron al anticuerpo monoclonal anti-EGFR Cetuximab y al anticuerpo monoclonal anti-Her2 Trastuzumab, solos, en combinación de uno con otro, o en combinación con MOR10703 (figura 4). La totalidad de las cuatro cepas de células serosas de grado bajo (DF76, DF141, DF192 y DF225) demostró sensibilidad significativa a la inhibición anti-familia de EGFR, son un anticuerpo anti-EGFR solo, con un anticuerpo anti-HER2 solo o con un anticuerpo anti-HER3 solo, y también se observó un efecto incrementado al combinar los anticuerpos. En contraste, la sensibilidad a anticuerpos de la familia de EGFR se encontraba ausente en dos células de cáncer ovárico primario de grado alto (DF09, DF14) y en las líneas celulares de cáncer ovárico seroso de grado bajo anteriormente indicadas (figura 5).

Los resultados muestran que un subtipo específico de cáncer ovárico humano, el subtipo seroso de grado bajo, era más sensible a la interferencia en la ruta de HER3 por anticuerpos monoclonales anti-HER3. En una colección de 21 cepas celulares de cáncer ovárico primario, cuatro mostraron sensibilidad al anticuerpo monoclonal anti-HER3 MOR10703. La totalidad de estas cuatro cepas celulares primarias se derivó de cánceres ováricos de grado 1 o grado 2 consistentes con un tipo celular de cáncer ovárico seroso de grado bajo. La transducción de ARNip dirigido a NRG1 y HER3 en dos de estas cepas celulares primarias también resultó en la inhibición de la proliferación celular, apoyando la hipótesis de que los efectos observados con MOR10703 en estas células están mediados por la interferencia con el circuito de señalización de NRG1/HER3. También se ha demostrado que las células de cáncer ovárico seroso de grado bajo presentan una sensibilidad incrementada a anticuerpos monoclonales dirigidos a otros miembros de la familia de EGFR, y que los efectos de los diversos anticuerpos monoclonales anti-familia de EGFR pueden ser aditivos.

El cáncer ovárico seroso de grado bajo es una forma de cáncer ovárico que constituye un desafío. Aunque menos común que los cánceres ováricos serosos de grado alto, más estándares, los tumores serosos de grado bajo pueden, sin embargo, resultar letales y se ha demostrado que son menos sensibles a las quimioterapias estándares para el cáncer ovárico (Gershenson, Sun, Lu, Obstet. Gynecol. 361, 2006). Por lo tanto, la terapia dirigida ha sido un área de interés activo en estos tumores.

El trabajo anterior sugiere que un porcentaje significativo de cánceres serosos de grado bajo alojan mutaciones KRAS o BRAF (Singer, Oldt, et al., JNCI, 484, 2003), y un ensayo de fase 2 del inhibidor de MEK 1/2 Selumetinib en mujeres con cáncer ovárico seroso de grado bajo recurrente ha demostrado actividad de grado bajo, con una tasa de respuesta de 15% y una mediana de supervivencia libre de progresión (SLP) de 11 meses (Farley, Brady et al., Lancet Oncol., p134, 2013). Además, 63% de los pacientes experimentaron una SLP superior a 6 meses de duración. Actualmente se están realizando pruebas adicionales de dichas terapias dirigidas, incluyendo una prueba que compara el inhibidor de MEK, MEK 162, a quimioterapia estándar (NCT01849874, clinicaltrials.gov) y una prueba que compara la combinación del inhibidor de MEK Pimasertib, con el inhibidor de PI3K SAR245409, con Pimasertib solo (NCT01936363, clinicaltrials.gov).

La ruta de HER3 podría ser otra diana potencial de interés en los cánceres ováricos serosos de grado bajo. Una discrepancia con los resultados de los presentes inventores era que en ninguna de las tres líneas celulares de cáncer ovárico seroso de grado bajo que se pudieron obtener mostró ninguna sensibilidad a MOR10703 u otros anticuerpos con diana en la familia de Eg Fr , mientras que la totalidad de las cuatro cepas celulares de cáncer ovárico primario sí mostró sensibilidad.

Resulta interesante que, con el perfilado molecular, los presentes inventores observaron que cada una de las líneas celulares de grado bajo contenía una mutación en KRAS, BRAF, o ambas, consistente con la literatura anteriormente publicada (Estep, PLOSOne, e1279, 2007; Pohlle-Ming Shih, Cancer Research, 1994, 2005), mientras que en los paquetes de células primarias de los presentes inventores no se detectó ninguna mutación BRAF o KRAS. Las mutaciones BRAF y KRAS se han documentado en hasta 30% a 50% de tumores serosos de grado bajo (Farley, Lancet Oncol., p134, 2013). Resulta posible que la supervivencia y crecimiento de los tumores de grado bajo con mutación BRAF/KRAS esté controlada por rutas alternativas que operan corriente abajo y, de esta manera, anulan cualesquiera efectos independientes de señalización de HER3, convirtiendo a los tumores con mutación de BRAF/KRAS en menos probablemente respondedores a la interferencia en la ruta de HER3.

La familia de EGFR consiste en cuatro miembros de la familia estrechamente relacionados. EGFR, HER2, HER3 y ErbB4 y la señalización por estas quinasas se ha descrito canónicamente mediante homodímeros y heterodímeros activados por ligando entre los miembros de la familia (Yarden, 2001). Además, al bloquear la señalización a través de un miembro específico de la familia (p.ej., mediante inhibidores de molécula pequeña o anticuerpos bloqueantes), se ha descrito la regulación positiva de la actividad de otros miembros de la familia como un mecanismo potencial de resistencia (Sergina, Engelman, Garrett, PNAS 5021,2011). Este potencial de señalización a través de diferentes miembros de la familia de EGFR para compensar para el bloque de cualquier miembro de la familia puede subyacer a la observación de que las cepas celulares serosas de grado bajo primarias son más sensibles al bloqueo combinado de miembros de la familia de EGFR. Desde una perspectiva clínica, lo anterior podría sugerir que la inhibición multiquinasa seleccionada que comprende la totalidad de los miembros de la familia de EGFR podría presentar un mayor efecto sobre estos tumores que la terapia dirigida a HER3 por sí sola. Un ensayo de fase 2 de un inhibidor de la familia pan-ErbB, CI-1033, demostró una actividad mínima en pacientes refractarios al platino (Campos et al., 2005); sin embargo, este ensayo comprendía todos los subtipos de cáncer ovárico y la actividad de dicha molécula sobre los cánceres ováricos serosos de grado bajo se desconoce.

Reactivos y anticuerpos. Se obtuvieron de Cell Signaling Technology anticuerpos para transferencia western dirigida a pHer3 (Y1289), pAKT (T308) y AKT total. Se obtuvo anticuerpo anti-HER3, región C-terminal (clon 2F12) para la transferencia western de Lab Vision. Se obtuvo anticuerpo anti-NRG1 para la transferencia western de Santa Cruz (sc-348). El anticuerpo monoclonal anti-HER3 MOR10703 se obtuvo de Novartis, Inc. Se adquirió Cetuximab de grado clínico (ImClone LLC, New York, NY) y Trastuzumab (Genetech, Inc., South San Francisco, CA) para los experimentos in vitro.

Líneas celulares. Se identificaron líneas celulares de cáncer ovárico seroso de grado bajo mediante búsqueda en la literatura. Se informó de células HEY inicialmente derivadas de un cistadenocarcinoma papilar diferenciado moderadamente de ovario (Buick, Pullano, Trent, Cancer Res., 3668, 1985). Se establecieron células MPSC1 a partir de un carcinoma seroso de grado bajo (Pohl) obtenidas gracias al Dr. Ie-Ming Shih, de la John Hopkins University. Las células HOC-7 se derivaron de un paciente con adenocarcinoma seroso bien diferenciado del ovario (Buick) y se obtuvieron gracias al Dr. Kwong-Kowk Wong, del MD Anderson Cancer Center y el Dr. Louis Dubeau, de la University of Southern California. Se cultivaron células HEY en RPMI 1640 (Gibco) complementado con suero de feto bovino (FBS, Invitrogen) al 10% y 1x L-glutamina (Gibco). Se cultivaron células MPSC1 en RPMI 1640 con FBS al 5% y 1x L-glutamina. Se cultivaron células HOC7 en DMEM (Gibco) con FBS al 10% y 1x L-glutamina. Las células se incubaron a 37°C en una atmósfera que contenía 5% de CO2.

Células primarias. Las células primarias se obtuvieron de pacientes con cáncer ovárico avanzado del Dana-Farber Cancer Institute (DFCI) sometidos a paracentesis para ascites maligno o cirugía de reducción bajo protocolos aprobados por el comité de revisión institucional de Dana-Farber/Harvard Cancer Center (DFHCC IRB) y el comité de investigación Partners Human Research Committee. Se obtuvo el consentimiento de los pacientes siguiendo directrices de IRB. Se proceso líquido ascites y se purificaron células tumorales según un protocolo descrito anteriormente (Clauss et al., 2009). Se cultivaron cepas de células primarias para experimentos in vitro en RPMI 1640 con FBS al 10% y 1x anti-anti (Invitrogen). Las células se incubaron a 37°C en una atmósfera que contenía 5% de CO2.

Evaluación de la proliferación celular. Se sembraron en placa células primarias a una densidad de aproximadamente 30% y se sembraron en placa líneas celulares a razón de 3000 a 5000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadió MOR10703, Cetuximab y Trastuzumab a una concentración de 1:1000 a partir de sus concentraciones iniciales (10 mg/ml, 2 mg/ml y 21 mg/ml, respectivamente). Se intercambiaron medios y anticuerpos cada 3 días después de la siembra en placa. Se evaluó la proliferación y crecimiento celulares utilizando CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI) y se comparó el crecimiento relativo con una medición de línea base obtenida el día de la siembra en placa.

Interferencia de ARN. Se llevó a cabo ARNip contra NRG1 con NRG1-9 obtenido de Qiagen. Se llevó a cabo ARNip contra HER3 con la secuencia de ARNip AAGAGGATGTCAACGGTTA (SEC ID n° 2). Los ARNip de control se obtuvieron de Dharmacon. Se llevó a cabo ARNip con ARNip en serie utilizando Lipofectamine™ RNAi Max (Invitrogen). Las líneas celulares se sembraron en placa a razón de 1000 a 3000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y de 6 pocillos. Las células se transfectaron en serie los días cero (día de siembra en placa), dos y cuatro con 5 |jl de Lipofectamine™ RNAiMax y 100 pmoles de ARNip para las placas de 6 pocillos Los volúmenes de transfección se escalaron a placas de 96 pocillos en proporción 1:10 el día de la siembra en placa y en proporción 1:25 los días dos y cuatro. Se cambiaron los medios después de cada transfección.

Extractos celulares y transferencia western. Para la preparación de extracto se utilizó tampón RIPA sin SDS (Boston Bioproducts, Ashland, MA) que contenía NaF 50 mM, ortovanadato de sodio 0,4 mM y tabletas de cóctel inhibidor de proteasas completo (Roche) recién añadidos. Para la transferencia western, los inmunoprecipitados se lavaron tres veces con tampón de lisis; se resolvieron mediante electroforesis en gel de SDS y las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa que se revelaron con los anticuerpos apropiados.

Secuenciación de nueva generación. Se llevó a cabo secuenciación de nueva generación en el Center for Cancer Genome Discovery utilizando OncoPanel versión 2 (OPv2). Se aisló el ADN a partir de líneas celulares de cáncer ovárico y cepas de células DF utilizando el kit Qiagen DNeasy (Qiagen).

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   i. Agente para la utilización en el tratamiento de cáncer ovárico seroso de grado bajo, comprendiendo el agente un anticuerpo o agente del mismo que se une específicamente a un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o un ARNip que inhibe la señalización del miembro de la familia de EGFR, en el que el ARNip está dirigido contra NRg 1 o HER3.
2. 2. Agente para la utilización según la reivindicación 1, en el que el miembro de la familia de EGFR se selecciona del grupo que consiste en EGFR, HER2 y HER3.
3. 3. Agente para la utilización según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se une específicamente a HER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente de ligando como independiente de ligando.
4. 4. Agente para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo conformacional que comprende residuos aminoácidos dentro del dominio 2 y dominio 4 deHER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente de ligando como independiente de ligando.
5. 5. Agente para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el miembro de la familia de EGFR comprende HER3, comprendiendo además un agente terapéutico adicional seleccionado de Cetuximab o Trastuzumab, o Cetuximab y Trastuzumab.
6. 6. Agente para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el agente comprende MOR10703, Cetuximab o Trastuzumab y combinaciones de los mismos.
7. 7. Agente para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se administra por una vía seleccionada del grupo que consiste en la administración oral, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intraparenquimal, intratecal, intracraneal, bucal, mucosal, nasal y rectal.
8. 8. Agente para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo o fragmento se formula en una composición farmacéutica que comprende un portador, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.
9. 9. Agente para la utilización según la reivindicación 8, que comprende además un agente terapéutico adicional.
10. 10. Agente para la utilización según la reivindicación 9, en el que el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de HER1, un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de PI3 quinasa.
11. 11. Agente para la utilización según la reivindicación 10, en el que el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 seleccionado del grupo que consiste en Matuzumab (EMD72000), Cetuximab, Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Gefitinib, C i-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), ditosilato de Lapatinib, Erlotinib HCL (OSI- 774), PKI-166, y N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[[(3"S")-tetrahidro-3-furanil]oxi]- 6-quinazolinil]-4(dimetilamino)-2-butenamida; un inhibidor de HER2 seleccionado del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-111, neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib; un inhibidor de HER3 seleccionado del grupo que consiste en MM- 121, MM- 111, IB4C3, 2DID 12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203(Aveo), MEHD7945A (Genentech), MOR10703 (Novartis) y moléculas pequeñas que inhiben HER3, y/o un inhibidor de HER4.
12. 12. Agente para la utilización según la reivindicación 10, en el que el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR seleccionado del grupo que consiste en Temsirolimus, Ridaforolimus, AP23573, MK8669 y Everolimus.
13. 13. Agente para la utilización según la reivindicación 10, en el que el agente terapéutico adicional es un inhibidor de PI3 quinasa seleccionado del grupo que consiste en GDC 0941, BEZ235, BMK120 y BYL719.
14. 14. Agente para la utilización según la reivindicación 10, en el que el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en gemcitabina, paclitaxel, mesilato de imatinib, malato de sunitinib, adriamicina, daunomicina, cisplatino, etopósido, vinblastina, vincristina y metotrexato.
15. 15. Agente para la utilización según la reivindicación 4, en el que el epítopo conformacional comprende los residuos aminoácidos 265-277, 315 (del dominio 2), 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) o un subgrupo de los mismos.
16. 16. Agente para la utilización según la reivindicación 4, en el que el VH del anticuerpo o fragmento del mismo se une a por lo menos uno de los residuos de HER3 siguientes: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596 y Lys597.
17. 17. Agente para la utilización según la reivindicación 4, en el que el VL del anticuerpo o fragmento del mismo se une a por lo menos uno de los residuos de HER3 siguientes: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614 y Glu615.
18. 18. Agente para la utilización según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 RDC tal como se muestra en la Tabla 1.
19. 19. Agente para la utilización según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende un RDC3 de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en SEC ID n° 4, SEC ID n° 10, SEC ID n° 22, SEC ID n° 28, SEC ID n° 40, SEC ID n° 46, SEC ID n° 58, SEC ID n° 64, SEC ID n° 76, SEC ID n° 82, SEC ID n° 94, SEC ID n° 100, SEC ID n° 112, SEC ID n° 118, SEC ID n° 130, SEC ID n° 136, SEC ID n° 148, SEC ID n° 166, SEC ID n° 184, SEC ID n° 202, SEC ID n° 220, SEC ID n° 238, SEC ID n° 256, SEC ID n° 274, SEC ID n° 292, SEC ID n° 310, SEC ID n° 328, SEC ID n° 346 y SEC ID n° 364.
20. 20. Agente para la utilización según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo de HER3 aislado o fragmento se selecciona del grupo que consiste en:

    VH que comprende la SEC ID n° 15 y VL que comprende la SEC ID n° 14 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 33 y VL que comprende la SEC ID n° 32 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 51 y VL que comprende la SEC ID n° 50 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 69 y VL que comprende la SEC ID n° 68 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 87 y VL que comprende la SEC ID n° 86 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 105 y VL que comprende la SEC ID n° 104 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 123 y VL que comprende la SEC ID n° 122, o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 141 y VL que comprende la SEC ID n° 140 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 159 y VL que comprende la SEC ID n° 158 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 177 y VL que comprende la SEC ID n° 176 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 195 y VL que comprende la SEC ID n° 194 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 213 y VL que comprende la SEC ID n° 212 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 231 y VL que comprende la SEC ID n° 230 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 249 y VL que comprende la SEC ID n° 248 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 267 y VL que comprende la SEC ID n° 266 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 285 y VL que comprende la SEC ID n° 284, o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 303 y VL que comprende la SEC ID n° 302 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 321 y VL que comprende la SEC ID n° 320 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 339 y VL que comprende la SEC ID n° 338 o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas,

    VH que comprende la SEC ID n° 357 y VL que comprende la SEC ID n° 356, o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas, y

    VH que comprende la SEC ID n° 375 y VL que comprende la SEC ID n° 374, o una secuencia de aminoácidos con 97-99 por ciento de identidad respecto a las mismas.