ES2728939T3 - Variantes de alfa-amilasa con estabilidad mejorada - Google Patents

Abstract

Variante de alfa-amilasa aislada, que comprende una sustitucion en tres o mas posiciones que corresponden a cualquiera de las posiciones 59, 89, 91, 96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281, 284, 416 y 427, en particular, en las posiciones que corresponden a las posiciones 129, 177 y 179, en las que la variante tiene al menos el 90 % y menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de la SEQ ID n.o: 6, y la variante tiene actividad de alfa-amilasa, y donde la variante comprende un conjunto de sustituciones, usando la SEQ ID n.o: 1 para la numeracion, que consiste en: E129V + K177L + R179E, y en la que se mantienen las alteraciones de I181* + G182* + N193F presentes en la SEQ ID n.o: 6 y las variantes tienen una termoestabilidad mejorada en comparacion con la alfa-amilasa descrita como la SEQ ID n.o: 6.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de alfa-amilasa con estabilidad mejorada

Referencia a un listado de secuencias

[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en formato legible por ordenador.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

[0002] La presente invención se refiere a variantes de alfa-amilasa que tienen una propiedad mejorada, p.ej., estabilidad mejorada, polinucleótidos que codifican las variantes, métodos para producir las variantes y métodos para usar las variantes. Descripción de la técnica relacionada

[0003] Las alfa-amilasas (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligosacáridos y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados.

[0004] Las alfa-amilasas se usan comercialmente para una variedad de propósitos, como en las etapas iniciales del procesamiento del almidón (p.ej., licuefacción); en procesos de molienda húmeda y en la producción de alcohol a partir de fuentes de hidratos de carbono. También se usan como agentes de limpieza o complementos en matrices de detergentes, en la industria textil para el desencolado de almidón, en aplicaciones de horneado, en la industria de las bebidas, en campos petroleros en procesos de perforación, en procesos de reciclaje, p.ej., para destintar papel, y en piensos para animales.

[0005] WO2002/010355 describe las alfa-amilasas de tipo Termamyl que muestran una estabilidad alterada a altas temperaturas y bajas concentraciones de calcio.

[0006] Hatada et al., (Enzyme and Microbial Technol. 39 (2006) 1333-1340) describe una alfa-amilasa oxidativa estable de un aislado de Bacillus de aguas profundas.

[0007] JP 62-104580 describe una alfa-amilasa resistente al calor derivada de Bacillus stearothermophilus, sin embargo, las posiciones correspondientes a las posiciones 129, 177 y 179 de la presente invención no se han modificado.

Resumen de la invención

[0008] La presente invención proporciona variantes de alfa-amilasa con propiedades mejoradas, p.ej., termoestabilidad mejorada en comparación con su enzima original.

[0009] La presente invención se refiere a una variante de alfa-amilasa aislada, que comprende una sustitución en tres o más posiciones que corresponden a cualquiera de las posiciones 59, 89, 91,96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269 , 270, 274, 276, 281, 284, 416 y 427, en particular, en las posiciones que corresponden a las posiciones 129, 177 y 179, en las que la variante tiene al menos el 90 % y menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID n.°: 6 , y la variante tiene actividad de alfa-amilasa, y donde la variante comprende un conjunto de sustituciones, utilizando la SEQ ID n.°: 1 para la numeración, que consta de: E129V K177L R179E, y en la que se mantienen las alteraciones de I181* G182* N193F presentes en la SEQ ID n.°: 6 y las variantes tienen una termoestabilidad mejorada en comparación con la alfa-amilasa descrita como la SEQ ID n.°: 6.

[0010] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican una variante de alfa-amilasa, construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos, y métodos para producir una variante de una alfa-amilasa progenitora.

[0011] La presente invención también se refiere al uso de las variantes en la licuefacción de almidón. Además, la presente invención se refiere a un proceso para producir un producto de fermentación, que comprende

a) licuar un material que contiene almidón con una variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para producir una mezcla licuada;

b) sacarificar la mezcla licuada para producir azúcares fermentables; y

c) fermentar los azúcares fermentables en presencia de un organismo fermentador.

Breve descripción de las figuras

[0012] La figura 1 muestra una alineación de los dominios catalíticos de las alfa-amilasas con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID n.os: 1, 2, 3, 4, 5 y 7. La SEQ ID n.°: 1 es una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus; la SEQ ID NO: 2 es una amilasa de Bacillus flavothermus, AMY1048 descrita en WO 2005/001064; la SEQ ID n.°: 3 es la alfa-amilasa TS-22 de Bacillus; la SEQ ID n.°: 4 es la alfa-amilasa TS-23 de Bacillus descrita en J. Appl. Microbiology, 1997, 82: 325-334. (SWALL: q59222); la SEQ ID n.°: 5 es una alfa-amilasa descrita en WO 2004/091544; y la SEQ ID n.°: 7 es otra alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus.

Descripción detallada de la invención

[0013] La presente divulgación se refiere a variantes aisladas de una alfa-amilasa progenitora, que comprenden una sustitución en tres o más posiciones correspondientes a las posiciones 59, 89, 91, 96, 108, 112, 129, 157, 165, 166 , 168, 171, 177 , 179, 180, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281,284, 416 y 427, donde la variante tiene al menos un 65 % y menos de un 100 % de identidad de secuencia con al menos uno de los polipéptidos maduros de la SEQ ID n.°: 1; y la variante tiene actividad de alfa-amilasa.

Definiciones

[0014] Variante alélica: El término "variante alélica" significa cualesquiera dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural a través de la mutación, y puede dar lugar a un polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

[0015] Las alfa-amilasas (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1) son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligosacáridos y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados.

[0016] Secuencia codificante: El término "secuencia codificante" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto polipeptídico. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente mediante un marco de lectura abierto, que comienza normalmente con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos como GTG y TTG, y acaba con un codón de terminación tal como TAA, TAG y TGA. La secuencia codificante puede ser un polinucleótido de ADN, de ADNc, sintético o recombinante.

[0017] Secuencias de control: El término "secuencias de control" significa todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extranjera al polinucleótido que codifica la variante, o nativa o extranjera a cada una de las otras. Dichas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica, un promotor, una secuencia peptídica y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden proporcionarse con enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica un polipéptido.

[0018] Expresión: El término "expresión" incluye cualquier paso involucrado en la producción del polipéptido que incluye, entre otros, la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción, la modificación postraduccional y la secreción.

[0019] Vector de expresión: El término "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención y está operativamente enlazado a nucleótidos adicionales que proporcionan su expresión.

[0020] Célula huésped: El término "célula huésped" significa cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción y similares con un constructo de ácidos nucleicos o un vector de expresión que comprenden un polinucleótido de la presente invención. El término "célula huésped" abarca cualquier descendiente de una célula madre que no es idéntico a la célula madre debido a las mutaciones que se producen durante la replicación.

[0021] Propiedad mejorada: El término "propiedad mejorada" significa una característica asociada a una variante mejorada en comparación con la alfa-amilasa original. Tales propiedades mejoradas incluyen la termoestabilidad.

[0022] Variante aislada: Los términos "aislado" y "purificado" significan un polipéptido o polinucleótido que se retira de al menos un componente con el que está naturalmente asociado. Por ejemplo, una variante puede ser al menos un 1 % pura, por ejemplo, al menos un 5 % pura, al menos un 10 % pura, al menos un 20 % pura, al menos un 40 % pura, al menos un 60 % pura, al menos un 80 % pura y al menos un 90 % pura, según lo determinado mediante SDS-PAGE y un polinucleótido puede tener al menos un 1 % puro, por ejemplo, al menos un 5 % puro, al menos un 10 % puro, al menos un 20 % puro, al menos un 40 % puro, al menos un 60 % puro, al menos un 80 % puro y al menos un 90 % puro, según lo determinado mediante electroforesis en agarosa.

[0023] Polipéptido maduro: El término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y de cualquier modificación postraduccional, como el procesamiento del terminal N, el truncamiento del terminal C, la glicosilación, la fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro consiste en los aminoácidos 1 a 483, 1 a 486 o 1 a 493 de la SEQ ID n.°: 1. Se sabe en la técnica que una célula huésped puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresado por el mismo polinucleótido.

[0024] Secuencia codificante del polipéptido maduro: El término "secuencia codificante del polipéptido maduro" significa una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad de alfa-amilasa.

[0025] Constructo de ácidos nucleicos: El término "constructo de ácidos nucleicos" significa una molécula de ácido nucleico, ya sea de cadena simple o doble, que se aísla a partir de un gen que se produce de forma natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otra forma no existirían en la naturaleza o que es sintético. El término constructo de ácidos nucleicos es sinónimo del término "casete de expresión" cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante.

[0026] Operativamente enlazado: El término "operativamente enlazado" significa una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con respecto a la secuencia codificante de la secuencia de polinucleótidos, de tal manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido.

[0027] Progenitor: El término alfa-amilasa "progenitora" significa una alfa-amilasa en la que se realiza una alteración para producir una variante de la presente invención. El progenitor puede ser un polipéptido de origen natural (tipo salvaje) o una variante del mismo, preparado mediante medios adecuados. El progenitor también puede ser una variante alélica.

[0028] Fragmento de polipéptido: El término "fragmento de polipéptido" significa un polipéptido que tiene uno o más (varios) aminoácidos eliminados de los extremos amino y/o carboxilo de un polipéptido maduro; en el que el fragmento tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 483 residuos de aminoácidos, p. ej., al menos 486 y al menos 493 residuos de aminoácidos, del polipéptido maduro de la SEQ ID n.°: 1.

[0029] Identidad de secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia".

[0030] Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementó en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son la penalización de abertura de gap de 10, penalización por extensión de gap de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (EMBOSS versión de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenida mediante la opción -nobrief) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Residuos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento — Número total de gaps en el alineamiento)

[0031] Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) tal como se implementó en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son la penalización de abertura de gap de 10, penalización por extensión de gap de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenida mediante la opción -nobrief) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento — Número total de gaps en el alineamiento)

[0032] Subsecuencia: El término "subsecuencia" significa una secuencia de polinucleótidos que tiene uno o más (varios) nucleótidos eliminados de los extremos 5’ y/o 3’ de una secuencia codificante de un polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento de polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa.

[0033] Variante: El término "variante" significa un polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción de uno o más (varios) residuos de aminoácidos en una o más (varias) posiciones. Una sustitución significa un reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una deleción significa la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa agregar 1-5 aminoácidos justo a continuación de un aminoácido que ocupa una posición.

[0034] Tipo salvaje: El término "tipo salvaje" significa una alfa-amilasa expresada por un microorganismo de origen natural, tal como una bacteria, levadura u hongo filamentoso encontrado en la naturaleza.

Convenciones para la designación de variantes

[0035] Para los fines de la presente invención, el polipéptido maduro descrito en la SEQ ID n.°: 1 se usa para determinar el residuo correspondiente de aminoácido en otra alfa-amilasa. La secuencia de aminoácidos de otra alfa-amilasa se alinea con el polipéptido maduro descrito en la SEQ ID n.°: 1 y, según el alineamiento, el número de la posición del aminoácido correspondiente a cualquier residuo de aminoácido en el polipéptido maduro descrito en la SEQ ID n.°: 1 se puede determinar usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementó en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: European Molecular Biology Open SoftwareSuite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior.

[0036] La identificación del residuo de aminoácido correspondiente en otra alfa-amilasa se puede confirmar mediante un alineamiento de múltiples secuencias de polipéptido usando "ClustalW" (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948).

[0037] Cuando la otra enzima ha divergido del polipéptido maduro de la SEQ ID n.°: 1, de modo que la comparación tradicional basada en secuencias no detecta su relación (Lindahl & Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), se pueden usar otros algoritmos de comparación de secuencias por pares. Se puede lograr una mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencias utilizando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para buscar en las bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda en base de datos iterativo y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Incluso se puede lograr una mayor sensibilidad si la familia o la superfamilia del polipéptido tiene uno o más (varios) representantes en las bases de datos de estructuras de proteínas. Programas como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de la estructura secundaria, perfiles de alineación estructural y potenciales de solvatación) como entrada a una red neuronal que predice el pliegue estructural para una secuencia de consulta. Del mismo modo, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, se puede usar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilia presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones se pueden usar a su vez para generar modelos de homología para el polipéptido, y se puede evaluar la precisión de dichos modelos utilizando una variedad de herramientas desarrolladas para ese propósito.

[0038] Para proteínas de estructura conocida, varias herramientas y recursos están disponibles para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteínas SCOP se han alineado estructuralmente, y esas alineaciones son accesibles y descargables. Se pueden alinear dos o más estructuras de proteínas utilizando una variedad de algoritmos, como la matriz de alineación de distancia (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Eng. 11: 739-747), y las implementaciones de estos algoritmos se pueden utilizar además para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interés con el fin de descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567). Estas alineaciones estructurales se pueden usar para predecir los residuos de aminoácidos correspondientes estructural y funcionalmente en proteínas dentro de la misma superfamilia estructural. Esta información, junto con la información derivada de los modelos de homología y las búsquedas de perfiles, se puede usar para predecir qué residuos hay que mutar al mover mutaciones de interés de una proteína a un homólogo cercano o remoto.

[0039] Al describir las variantes de alfa-amilasa de la presente invención, la nomenclatura que se describe a continuación se adapta para facilitar la referencia. En todos los casos, se emplea la abreviatura de una sola letra o de tres letras para aminoácidos aceptada por la IUPAC.

[0040] Sustituciones. Para una sustitución de aminoácidos, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina con alanina en la posición 226 se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones múltiples están separadas por signos de suma ("+"), p. ej., "Gly205Arg Ser411Phe" o "G205R S411F", que representan mutaciones en las posiciones 205 y 411 sustituyendo la glicina (G) por arginina (R) y la serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[0041] Deleciones. Para una deleción de aminoácidos, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, *. Por consiguiente, la deleción de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195*" o "G195*". Las deleciones múltiples están separadas por signos de suma ("+"), p. ej., "Gly195* Ser411*" o "G195* S411 *".

[0042] Inserciones. Para una inserción de aminoácidos, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido original, nuevo aminoácido insertado. Por consiguiente, la inserción de lisina después de la glicina en la posición 195 se designa "Gly195GlyLys" o "G195GK". Las inserciones múltiples de aminoácidos se designan [aminoácido original, posición, aminoácido original, nuevo aminoácido insertado #1, nuevo aminoácido insertado #2; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de la glicina en la posición 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".

[0043] En tales casos, los residuos de aminoácidos insertados se numeran añadiendo letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácidos que precede al (a los) aminoácido(s) insertado(s). En el ejemplo anterior, la secuencia sería:

[0044] Múltiples alteraciones. Las variantes que comprenden múltiples alteraciones están separadas por signos de suma ("+"), p. ej., "Arg170Tyr Gly195Glu" o "R170Y G195E" que representan una sustitución de tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina en las posiciones 170 y 195, respectivamente.

[0045] Diferentes alteraciones. Cuando se pueden introducir diferentes alteraciones en una posición, las diferentes alteraciones están separadas por una coma, p. ej., "Arg170Tyr, Glu" representa una sustitución de arginina con tirosina o ácido glutámico en la posición 170. Por lo tanto, "Tyr167Gly, Ala Arg170Gly, Ala" designa las siguientes variantes:

Tyr167Gly Arg170Gly, Tyr167Gly Arg170Ala, Tyr167Ala Arg170Gly y Tyr167Ala Arg170Ala.

Preparación de variantes

[0046] La presente divulgación también se refiere a métodos para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa, que comprende: (a) introducir en una alfa-amilasa progenitora una sustitución en tres o más (varias) posiciones correspondientes a las posiciones 59, 89, 91,96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 181, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274,276, 281,284, 416 y 427, donde la variante tiene actividad alfa-amilasa; y (b) recuperar la variante.

[0047] Las variantes pueden prepararse de acuerdo con cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica, tal como mutagénesis dirigida, construcción de genes sintéticos, construcción de genes semisintéticos, mutagénesis aleatoria, barajado, etc.

[0048] La mutagénesis dirigida es una técnica en la que se crean una o más (varias) mutaciones en un sitio definido en una molécula de polinucleótido que codifica la alfa-amilasa progenitora. La técnica puede realizarse in vitro o in vivo.

[0049] La construcción del gen sintético conlleva síntesis in vitro de una molécula de polinucleótidos diseñada para codificar una molécula de polipéptidos de interés. La síntesis de genes se puede realizar utilizando varias técnicas, como la tecnología múltiplex basada en microchips descrita por Tian et al., 2004, Nature 432: 1050-1054, y tecnologías similares en las que los oligonucleótidos se sintetizan y ensamblan en chips microfluídicos fotoprogramables.

[0050] La mutagénesis dirigida se puede lograr in vitro mediante PCR involucrando el uso de cebadores de oligonucleótidos que contienen la mutación deseada. También se puede realizar mutagénesis dirigida in vitro mediante mutagénesis en casete que involucra la escisión mediante una enzima de restricción en un sitio en el plásmido que comprende un polinucleótido que codifica la alfa-amilasa progenitora y la subsiguiente unión de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Generalmente, la enzima de restricción que realiza la digestión en el plásmido y el oligonucleótido es la misma, permitiendo que los extremos cohesivos del plásmido y el inserto se unan entre sí. Ver, por ejemplo, Scherer y Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 7349-4966.

[0051] La mutagénesis dirigida se puede lograr en vivo mediante métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, publicación de solicitud de patente EE. UU. n.° 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnology 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med.4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett.43: 15-16.

[0052] Cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida puede usarse en la presente invención. Hay muchos kits comerciales disponibles que pueden usarse para preparar variantes de una alfa-amilasa progenitora.

[0053] Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos simples o múltiples pueden realizarse y probarse utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o mezcla aleatoria, seguidos de un procedimiento de selección pertinente, como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR propensa a errores, despliegue de fagos (p. ej., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente EE.UU. n.° 5.223.409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, ADN 7: 127).

[0054] Los métodos de mutagénesis/barajado pueden combinarse con métodos de selección automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por las células huésped. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden recuperarse de las células huésped y secuenciarse rápidamente usando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten determinar rápidamente la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés.

[0055] La construcción de genes semisintéticos se logra combinando aspectos de la construcción de genes sintéticos y/o mutagénesis dirigida y/o mutagénesis aleatoria y/o barajado. La construcción semisintética se tipifica mediante un proceso que utiliza fragmentos de polinucleótidos que se sintetizan, en combinación con técnicas de PCR. Se pueden así sintetizar regiones definidas de genes de novo mientras que otras regiones pueden amplificarse utilizando cebadores mutagénicos específicos del sitio, e incluso mientras que otras regiones pueden someterse a una PCR propensa a errores o a una amplificación de PCR no propensas a errores. Los fragmentos de polinucleótidos pueden luego barajarse.

Variantes

[0056] La presente divulgación se refiere a variantes que comprenden una sustitución en tres o más (varias) posiciones que corresponden a las posiciones 59, 89, 91,96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 181, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281, 284, 416 y 427, en donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa.

[0057] En un aspecto de la divulgación, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 65 %, por ejemplo, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, pero menos del 100 %, con la secuencia de aminoácidos de la alfaamilasa progenitora.

[0058] En otro aspecto de la divulgación, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 65 %, por ejemplo, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % y al menos el 99 %, pero menos del 100 % con el polipéptido maduro de la SEQ ID n.°: 1.

[0059] En otro aspecto de la divulgación, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 65 %, por ejemplo, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % y al menos el 99 %, pero menos del 100 % con el polipéptido maduro de la SEQ ID n.°: 2.

[0060] En otro aspecto de la divulgación, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 65 %, por ejemplo, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % y al menos el 99 %, pero menos del 100 % con el polipéptido maduro de la SEQ ID n.°: 3.

[0061] En otro aspecto de la divulgación, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 65 %, por ejemplo, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % y al menos el 99 %, pero menos del 100 % con el polipéptido maduro de la SEQ ID n.°: 4.

[0062] En otro aspecto de la divulgación, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 65 %, por ejemplo, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % y al menos el 99 %, pero menos del 100 % con el polipéptido maduro de la SEQ ID n.°: 5.

[0063] En otro aspecto la variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % y al menos el 99 %, pero menos del 100 % con la madurez Polipéptido de la SEQ ID n.°: 6.

[0064] En otro aspecto de la divulgación, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 65 %, por ejemplo, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % y al menos el 99 %, pero menos del 100 % con el polipéptido maduro de la SEQ ID n.°: 7.

[0065] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

59 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp o Tyr, en particular con Ala, Gln,

Glu, Gly, Ile, Leu, Prot o Thr.

[0066] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

89 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Arg, His o

Lys.

[0067] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

91 con Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Ile, Leu o

Val.

[0068] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

96 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Ile, Leu o

Val.

[0069] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

108 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Ala.

[0070] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

112 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Ala, Asp o

Glu.

[0071] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

129 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Ala, Thr o

Val.

[0072] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

157 con Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con His, Lys,

Phe o Tyr.

[0073] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

165 con Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Asn.

[0074] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

166 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr o Val, en particular con Phe.

[0075] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

168 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Ala.

[0076] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

171 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Glu.

[0077] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

177 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Arg, Leu o

Met.

[0078] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 179 con Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Gln, Glu,

Ile, Leu, Lys o Val.

[0079] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

180 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Glu o Val.

[0080] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

181 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Glu, Gly o Val.

[0081] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

184 con Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Ser.

[0082] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 208 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Phe o

Tyr.

[0083] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición

220 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Pro.

[0084] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 224 con Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Leu.

[0085] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 242 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Ala, Asp, Glu, Gln o Met.

[0086] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 254 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Ala, Ser o Thr.

[0087] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 269 con Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Gln o Glu.

[0088] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 270 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Leu, Thr o Val.

[0089] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 274 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Arg, Gln, Glu, Lys o Phe.

[0090] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 276 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp o Val, en particular con Phe.

[0091] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 281 con Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Asn o Ser.

[0092] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 284 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con His, Thr o Val.

[0093] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 416 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Ala, Asn, Asp, Ser, Thr o Val.

[0094] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en una posición que corresponde a la posición 427 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Ile, Met o Val.

[0095] En un aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en tres posiciones que corresponden a cualquiera de las posiciones 59, 89, 91, 96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 181, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281,284, 416 y 427. En particular, la variante comprende una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 129, 177 y 179 o las posiciones 220, 242, y 254.

[0096] En otro aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en cuatro posiciones que corresponden a cualquiera de las posiciones 59, 89, 91, 96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 181, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281,284, 416 y 427. En particular, la variante comprende una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 129, 177, 179 y 208; las posiciones 129, 177, 179 y 242; las posiciones 129, 177, 179 y 284; las posiciones 208, 220, 224 y 254; las posiciones 220, 224, 242 y 254; o las posiciones 220, 224, 254 y 284.

[0097] En otro aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en cinco posiciones que corresponden a cualquiera de las posiciones 59, 89, 91, 96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 181, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281,284, 416 y 427. En particular, la variante comprende una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 129, 177, 179,208 y 242; posiciones 129, 177, 179, 208 y 284; posiciones 208, 220, 224, 242 y 254; o posiciones 208, 220, 224, 254 y 284.

[0098] En otro aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en seis posiciones que corresponden a cualquiera de las posiciones 59, 89, 91, 96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 181, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281,284, 416 y 427. En particular, la variante comprende una sustitución en las posiciones que corresponden a las posiciones 129, 177, 179,208, 242 y 284 o posiciones 129, 177, 179, 220, 224 y 254.

[0099] En otro aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en siete posiciones que corresponden a cualquiera de las posiciones 59, 89, 91, 96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 181, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281, 284, 416 y 427.

[0100] En otro aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en ocho posiciones que corresponden a cualquiera de las posiciones 59, 89, 91, 96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 181, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281, 284, 416 y 427.

[0101] En otro aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en nueve posiciones que corresponden a cualquiera de las posiciones 59, 89, 91, 96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 181, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281, 284, 416 y 427.

[0102] En otro aspecto de la divulgación, la variante comprende una sustitución en diez posiciones que corresponden a cualquiera de las posiciones 59, 89, 91, 96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 181, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281, 284, 416 y 427.

[0103] Las variantes tienen preferiblemente de 3 a 20, por ejemplo, de 3 a 10 y de 6 a 10, alteraciones como, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 alteraciones. En un aspecto de la divulgación, las alteraciones son sustituciones.

[0104] En un aspecto de la divulgación, las alfa-amilasas variantes comprenden o consisten en un conjunto de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

V59A G108A;

S242Q M284V;

V59A M284V;

G108A M284V;

V59A G108A M284V;

V59A G108A S242Q M284V;

E129V K177L R179E;

K220P N224L Q254S;

E129V K177L R179E M284V;

V59A E129V K177L R179E H208Y M284V;

V59A H208Y K220P N224L Q254S M284V;

E129V K177L R179E K220P N224L Q254S;

V59A Q89R E129V K177L R179E H208Y K220P N224L Q254S;

V59A E129V K177L R179E H208Y K220P N224L S242Q Q254S;

V59A Q89R E129V K177L R179E H208Y K220P N224L Q254S M284V;

V59A E129V K177L R179E H208Y K220P N224L S242Q Q254S M284V;

V59A Q89R G108A E129V K177L R179E H208Y K220P N224L Q254S M284V; y

V59A G108A E129V K177L R179E H208Y K220P N224L S242Q Q254S M284V.

[0105] Las variantes pueden comprender además una deleción en una o más posiciones, por ejemplo, dos, tres o cuatro, posiciones que corresponden a las posiciones 179, 180, 181 y 182. Por ejemplo, las variantes pueden comprender una eliminación en posiciones que corresponden a las posiciones 181 y 182.

[0106] Las variantes también pueden comprender además una alteración, preferiblemente una sustitución, en una posición que corresponde a la posición 193. Por ejemplo, la alteración en una posición que corresponde a la posición 193 puede ser una sustitución con Phe.

[0107] Las variantes también pueden comprender además una deleción del aminoácido en la posición que corresponde a las posiciones 376 y/o 377.

[0108] En otro aspecto, las variantes comprenden además una alteración adicional, preferiblemente una sustitución, en una posición que corresponde a la posición 200, tal como una sustitución en una posición que corresponde a la posición 200 con Leu, Ile o Thr.

[0109] Las variantes de la presente invención consisten preferiblemente en los aminoácidos 483 a 515, 483 a 493 o 483 a 486.

Polinucleótidos

[0110] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de las variantes de la presente invención.

Constructos de ácidos nucleicos

[0111] La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención operativamente enlazada a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control. .

[0112] Un polinucleótido aislado que codifica una variante puede manipularse en una variedad de formas para ocuparse de la expresión de la variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.

[0113] La secuencia de control puede ser una secuencia promotora, que es reconocida por una célula huésped para la expresión del polinucleótido. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped, incluyendo los promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, ya sea homólogos o heterólogos a la célula huésped.

[0114] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos a partir del gen de alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, el gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, el gen de penicilinasa (penP) de Bacillus licheniformis, el gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, el gen de levansacarasa (sacB) de Bacillus subtilis, los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el operón lac de E. coli, el gen de agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor y el gen procariótico de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80: 21­ 25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.

[0115] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son los promotores obtenidos a partir de los genes de acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable frente al ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado que incluye un gen que codifica una alfa-amilasa neutra en Aspergilli en el que el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido de un gen que codifica triosa fosfato isomerasa en Aspergilli; ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados que incluyen el gen que codifica alfa-amilasa neutra en Aspergillus niger en el que el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa en Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.

[0116] En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles a partir de los genes de enolasa (ENO - 1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae y 3- fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488..

[0117] La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, que es reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está operativamente enlazada al terminal 3’ del polinucleótido que codifica la variante. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped puede usarse en la presente invención.

[0118] Los terminadores preferidos para las células huésped fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes de antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0119] Los terminadores preferidos para células huésped de levadura se obtienen a partir de los genes de enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[0120] La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por parte de la célula huésped. La secuencia líder está operativamente enlazada al terminal 5’ del polinucleótido que codifica la variante. Cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula huésped puede usarse en la presente invención.

[0121] Los líderes preferidos para las células huésped fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes de TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

[0122] Los líderes adecuados para las células huésped de levadura se obtienen a partir de los genes de enolasa (ENO - 1) de Saccharomyces cerevisiae, 3- fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[0123] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente enlazada al terminal 3’ de la secuencia codificante del polipéptido y, cuando se transcribe, la célula huésped la reconoce como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped puede usarse en la presente invención.

[0124] Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células huésped fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes de antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0125] Las secuencias útiles de poliadenilación para células huésped de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[0126] La secuencia de control también puede ser una región codificante de péptido señal que codifica una secuencia de aminoácidos enlazada al amino-terminal de una variante y dirige el polipéptido codificado hacia la vía secretora de la célula. El extremo 5 'de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener de forma inherente una región codificante de péptido señal enlazada de manera natural en un marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica la variante secretada. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante de péptido señal que es extranjera para la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal extranjera puede ser necesaria cuando la secuencia codificante no contiene una región codificante de péptido señal de manera natural. Alternativamente, la región codificante del péptido señal extranjera puede simplemente reemplazar la región codificante del péptido señal natural para aumentar la secreción de la variante. Sin embargo, en la presente invención se puede usar cualquier región codificante de péptido señal que dirija el polipéptido expresado hacia la ruta secretora de una célula huésped.

[0127] Las secuencias codificantes de péptidos señal eficaces para células huésped bacterianas son las secuencias codificantes de péptido señal obtenidas a partir de los genes de amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta - lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa - amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[0128] Las secuencias codificantes de péptidos señal eficaces para las células huésped fúngicas filamentosas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas a partir de los genes de amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

[0129] Se obtienen péptidos señal útiles para células huésped de levadura a partir de los genes de factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias codificantes de péptidos señal útiles son descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[0130] La secuencia de control también puede ser una región codificante de propéptido que codifica una secuencia de aminoácidos posicionada en el amino-terminal de una variante El polipéptido resultante se conoce como proenzima o propolipéptido (o zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido está generalmente inactivo y puede convertirse en un polipéptido activo maduro por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región codificante del propéptido se puede obtener de los genes para lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[0131] Cuando tanto las regiones de péptido señal como de propéptido están presentes en el amino-terminal de un polipéptido, la región de propéptido se coloca al lado del amino-terminal de un polipéptido y la región de péptido señal se coloca al lado del amino-terminal de la región de propéptido.

[0132] También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de la variante en relación con el crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo físico o químico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procarióticos incluyen los sistemas de operadores lac, tac y trp. En levaduras, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En los hongos filamentosos, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae se pueden usar como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En los sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la variante estaría operativamente enlazado a la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

[0133] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control descritas anteriormente pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en dichos sitios. Alternativamente, el polinucleótido puede expresarse insertando el polinucleótido o un constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se ubica en el vector de modo que la secuencia codificante esté operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

[0134] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o un virus) que puede someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede producir la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos circulares lineales o cerrados.

[0135] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser tal que, cuando se introduce en la célula huésped, está integrado en el genoma y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que ha sido integrado. Además, se puede usar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que se introducirá en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

[0136] Los vectores de la presente invención contienen contiene preferiblemente uno o más (varios) marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos, y similares.

[0137] Ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia a antibióticos, por ejemplo, resistencia a ampicilina, cloranfenicol, kanamicina o tetraciclina. Marcadores adecuados para células huésped de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para usar en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, entre otros, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. Se prefiere para su uso en una célula de Aspergillus los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

[0138] Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente un elemento o elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

[0139] Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para su integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una o varias ubicaciones precisas en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en un lugar preciso, los elementos de integración deben contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, como de 100 a 10000 pares de bases, preferiblemente de 400 a 10000 pares de bases y más preferiblemente de 800 a 10000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia objetivo correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o codificantes. Por otra parte, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped mediante recombinación no homóloga.

[0140] Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que medie la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

[0141] Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli,, y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMR1 que permiten la replicación en Bacillus.

[0142] Ejemplos de orígenes de replicación para usar en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, el ARS1, el ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6.

[0143] Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67.; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175.; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se pueden lograr de acuerdo con los métodos descritos en WO 00/24883.

[0144] Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en la célula huésped para aumentar la producción de una variante de alfa-amilasa. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo tanto copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

[0145] Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Sambrook et al. 1989, supra) para obtener variantes de alfa-amilasa sustancialmente puras.

Células huésped

[0146] La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido que codifica una variante, que se utilizan de manera favorable en la producción recombinante de la variante. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se describió anteriormente. La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

[0147] La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, p.ej, un procariota o un eucariota.

[0148] La célula huésped procariótica puede ser cualquier bacteria gram-positiva o gram-negativa. Las bacterias grampositivas incluyen, entre otras, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias gram-negativas incluyen, entre otras, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.

[0149] La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus, incluyendo, entre otras, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis.

[0150] La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus, incluyendo, entre otras, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus

[0151] La célula huésped bacteriana puede ser también cualquier célula de Streptomyces incluyendo, entre otras, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans.

[0152] La introducción del ADN en una célula de Bacillus puede, por ejemplo, efectuarse mediante transformación de protoplastos (véase, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), utilizando células competentes (véase, p. ej., Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829,o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), mediante electroporación (véase, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o mediante conjugación (véase, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción del ADN en una célula de E. coli puede, por ejemplo, efectuarse mediante transformación de protoplastos (véase, p. ej., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (véase, p. ej., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción del ADN en una célula de Streptomyces puede efectuarse, por ejemplo, mediante transformación de protoplastos y electroporación (véase, p. ej., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praga) 49: 399 -405), mediante conjugación (véase, p. ej., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) o mediante transducción (véase, p. ej., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98: 6289-6294). La introducción del ADN en una célula de Pseudomonas puede, por ejemplo, efectuarse mediante electroporación (véase, p. ej., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397), o mediante conjugación (véase, p. ej., Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introducción del ADN en una célula de Streptococcus puede, por ejemplo, efectuarse mediante competencia natural (véase, p. ej., Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), mediante transformación de protoplastos (véase, p. ej., Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-2070, mediante electroporación (véase, p. ej., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o mediante conjugación (véase, p. ej., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, puede usarse cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula huésped.

[0153] La célula huésped también puede ser un eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta o fúngica.

[0154] En un aspecto, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongos" tal como se usa en el presente documento incluye los fila Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como Oomycota y todos los hongos mitospóricos (como lo definen Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).

[0155] En otro aspecto, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura", tal como se usa en el presente documento, incluye levadura ascosporógena (Endomycetales), levadura basidiosporógena y levadura perteneciente a los fungi imperfecti (Blastomycetes). Dado que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura se definirá como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series n.°.9, 1980).

[0156] En otro aspecto, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

[0157] En otro aspecto, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica.

[0158] En otro aspecto, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como lo definen Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación hifal y el catabolismo de carbono es obligatoriamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es mediante la germinación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

[0159] En otro aspecto, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o T richoderma

[0160] En otro aspecto, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride

[0161] Las células fúngicas pueden transformarse mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238023 y Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81: 1470-1474. Métodos adecuados para la transformación de la especie Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156y WO 96/00787. La levadura puede transformarse utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, In Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, páginas 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 75: 1920.

Métodos de producción

[0162] La presente invención también se refiere a métodos para producir una variante, que comprenden: (a) cultivar una célula huésped de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) recuperar la variante del medio de cultivo.

[0163] Las células huésped se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción de la variante utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede cultivarse mediante cultivo en matraz de agitación y fermentaciones a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lote, por lote alimentado o de estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizadas en un medio adecuado y bajo condiciones adecuadas que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles en los proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con las composiciones publicadas (p. ej., en los catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido se secreta en el medio nutriente, puede recuperarse directamente del medio. Si el polipéptido no se secreta, puede recuperarse de los lisados celulares.

[0164] En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que se utiliza como fuente de la variante una célula huésped de la presente invención que expresa una variante.

[0165] La variante puede detectarse usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para las variantes. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, puede usarse un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido tal como se describe en el presente documento en los ejemplos.

[0166] La variante puede recuperarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede recuperarse del medio nutriente mediante procedimientos convencionales que incluyen, entre otros, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

[0167] Una variante de la presente invención puede purificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, entre otros, cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, hidrofobia, cromatoenfoque y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (p. ej., precipitado de sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción (véase, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.

Plantas

[0168] La presente divulgación también se refiere a plantas, p. ej., una planta transgénica, una parte de planta o una célula vegetal, que comprende un polinucleótido aislado que codifica una variante de la presente invención para expresar y producir la variante en cantidades recuperables. La variante puede recuperarse de la planta o de la parte de la planta. Alternativamente, la planta o la parte de la planta que contienen la variante recombinante pueden usarse como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, p.ej, para mejorar el valor nutricional, la palatabilidad y las propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.

[0169] La planta transgénica puede ser dicotiledónea o monocotiledónea. Ejemplos de plantas monocotiledóneas son las gramíneas, tales como poa pratense (hierba azul, poa), hierba forrajera como Festuca, Lolium, hierba templada como Agrostis y cereales, p. ej., trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz.

[0170] Ejemplos de plantas dicotiledóneas son el tabaco, las leguminosas, como los altramuces, la patata, la remolacha azucarera, el guisante, las judías y la semilla de soja; y las plantas crucíferas (familia Brassicaceae), como la coliflor, la semilla de colza y el organismo modelo estrechamente relacionado de Arabidopsis thaliana.

[0171] Ejemplos de partes de planta son tallo, callo, hojas, raíz, frutos, semillas y tubérculos, así como los tejidos individuales que comprenden estas partes, p. ej., epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares y meristemas. Los compartimentos específicos de células vegetales, tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondrias, vacuolas, peroxisomas y citoplasma, también se consideran una parte de la planta. Además, cualquier célula vegetal, independientemente del origen del tejido, se considera una parte de la planta. Del mismo modo, las partes de la planta, tales como las células y tejidos específicos aislados para facilitar la utilización de la invención, también se consideran partes de la planta, p. ej., embriones, endospermos, aleurona y tegumentos.

[0172] También se incluyen dentro del alcance de la presente invención los descendientes de tales plantas, partes de plantas y células vegetales.

[0173] La planta transgénica o célula vegetal que expresa una variante de la presente invención puede construirse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En resumen, la célula vegetal o planta se construye incorporando uno o más (varios) constructos de expresión que codifican un polipéptido en el genoma huésped de la planta o el genoma del cloroplasto y propagando la planta o célula vegetal modificada resultante a una planta o célula vegetal transgénica.

[0174] El constructo de expresión es convenientemente un constructo de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención operativamente enlazada con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de nucleótidos en la planta o parte de la planta elegida. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar las células huésped en las que se ha integrado el constructo de expresión, y las secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (este último depende del método de introducción de ADN que se va a utilizar) .

[0175] La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente las secuencias de señal o de tránsito, se determina, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde y cómo se desea expresar la variante. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica una variante puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica de desarrollo, fase o tejido, y el producto genético puede ser dirigido a tejidos o partes de planta específicos como las semillas o las hojas. Las secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiol. 86: 506.

[0176] Para la expresión constitutiva, se pueden usar los promotores 35S-CaMV, de ubiquitina 1 de maíz y de actina 1 de arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Los promotores específicos de órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata y frutos (Edwards y Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos como los meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla tal como los promotores de glutelina, prolamina, globulina o albúmina del arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen de la proteína de semilla desconocida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), un promotor de una proteína de cuerpo aceitoso de semilla (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), el promotor de la proteína de almacenamiento napA de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, p. ej., tal como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor rbcs del arroz o del tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), el promotor del gen de la adenina metiltransferasa del virus de la chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol. Biol.

26: 85-93), el promotor del gen aldP del arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), o un promotor inducible por herida tal como el promotor pin2 de la patata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Del mismo modo, el promotor puede inducirse mediante tratamientos abióticos como la temperatura, la sequedad o las alteraciones de la salinidad o inducirse mediante sustancias aplicadas de forma exógena que activan el promotor, p. ej., etanol, estrógenos, hormonas vegetales tales como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico, y metales pesados.

[0177] También se puede usar un elemento potenciador del promotor para conseguir una expresión más alta de un polipéptido en la planta. Por ejemplo, el elemento potenciador del promotor puede ser un intrón que se coloca entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et a/., 1993, supra, describen el uso del primer intrón del gen de la actina 1 del arroz para potenciar la expresión.

[0178] El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte del constructo de expresión pueden elegirse entre los disponibles en la técnica.

[0179] El constructo de ácidos nucleicos se incorpora al genoma de la planta de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en la técnica, que incluyen transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[0180] Actualmente, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefacienses el método elegido para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, véase Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) y también se puede utilizar para transformar monocotiledóneas, aunque a menudo se usan otros métodos de transformación para estas plantas. En la actualidad, el método elegido para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o de tungsteno recubiertas con el ADN transformante) de callos embrionarios o de embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos como describen Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428. Los métodos de transformación adicionales para usar de acuerdo con la presente divulgación incluyen los descritos en las patentes EE. UU. n.os 6.395.966 y 7.151.204.

[0181] Después de la transformación, los transformantes que han incorporado el constructo de expresión se seleccionan y regeneran en plantas completas de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. A menudo, el procedimiento de transformación está diseñado para la eliminación selectiva de genes de selección durante la regeneración o en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, cotransformación con dos constructos de ADN-T separados o escisión específica del sitio del gen de selección mediante una recombinasa específica.

[0182] Además de la transformación directa de un genotipo de planta particular con un constructo preparado de acuerdo con la presente invención, las plantas transgénicas pueden hacerse cruzando una planta que tiene un constructo de la presente invención con una segunda planta que carece del constructo. Por ejemplo, un constructo que codifica una variante o una porción de la misma puede introducirse en una variedad de planta particular mediante el cruce, sin la necesidad alguna de transformar directamente una planta de esa variedad dada. Por lo tanto, la presente invención abarca no sólo una planta directamente regenerada a partir de células que se han transformado de acuerdo con la presente invención, sino también la progenie de dichas plantas. Tal como se usa en el presente documento, descendiente puede referirse a la descendencia de cualquier generación de una planta original preparada de acuerdo con la presente invención. Dicho descendiente puede incluir un constructo de ADN preparado de acuerdo con la presente invención, o una porción de un constructo de ADN preparada de acuerdo con la presente invención. El cruce da como resultado un transgén de la presente invención que se introduce en una línea de plantas mediante la polinización cruzada de una línea de partida con una línea de plantas donantes que incluye un transgén de la presente invención. Los ejemplos no limitantes de tales pasos se explican con más detalle en la patente EE. UU. n.° 7.151.204.

[0183] Las plantas pueden generarse mediante un proceso de conversión de retrocruzamiento. Por ejemplo, las plantas incluyen plantas denominadas como genotipos, líneas, innatos o híbridos convertidos por retrocruzamiento.

[0184] Se pueden usar marcadores genéticos para ayudar en la introgresión de uno o más transgenes de la invención de un antecedente genético a otro. La selección asistida por marcadores ofrece ventajas en relación con la reproducción convencional, ya que puede usarse para evitar errores causados por variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proporcionar datos sobre el grado relativo de germoplasma élite en los descendientes individuales de un cruce particular. Por ejemplo, cuando una planta con un rasgo deseado que por otro lado tiene un antecedente genético no deseable agronómicamente se cruza con un origen de élite, se pueden usar marcadores genéticos para seleccionar la progenie que no sólo posean el rasgo de interés, sino que también tengan una proporción relativamente grande de germoplasma deseado. Proporción de germoplasma deseado. De esta manera, se minimiza el número de generaciones requeridas para la introgresión de uno o más rasgos en un antecedente genético particular.

[0185] La presente invención también se refiere a métodos para producir una variante de la presente invención, que comprenden: (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención en condiciones favorables para la producción de la variante; y (b) recuperar la variante.

Composiciones

[0186] La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden una variante de alfa-amilasa y al menos una enzima adicional. La(s) enzima(s) adicional(es) puede(n) seleccionarse del grupo que consiste en beta-amilasa, celulasa (beta-glucosidasa, celobiohidrolasa y endoglucanasa), glucoamilasa, hemicelulasa (p. ej., xilanasa), isoamilasa, isomerasa, lipasa, fitasa, proteasa, pululanasa y/u otras enzimas útiles en un proceso comercial junto con una alfa-amilasa. La enzima adicional también puede ser una segunda alfa-amilasa. Dichas enzimas son conocidas en la técnica en el procesamiento de almidón, la conversión de azúcar, las fermentaciones de alcohol y otros productos finales útiles, los detergentes comerciales y las ayudas para limpieza, eliminación de manchas, tratamiento o desencolado de tejidos, y similares.

Métodos de uso de las variantes de alfa-amilasa: aplicaciones industriales

[0187] Las variantes de la presente invención poseen propiedades valiosas que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En particular, las variantes se pueden usar en detergentes, en particular composiciones detergentes para lavado de ropa y composiciones detergentes para lavavajillas, composiciones de limpieza de superficies duras, y para desencolar productos textiles, telas o prendas, producción de pulpa y papel, elaboración de cerveza, producción de etanol y procesos de conversión de almidón.

[0188] Las variantes de alfa-amilasa pueden usarse para procesos de almidón, en particular la conversión de almidón, especialmente la licuefacción de almidón (ver, p. ej., patente EE. UU n.° 3.912.590, EP 252730 y EP 063909, WO 99/19467y WO 96/28567). También se contemplan composiciones para fines de conversión de almidón, que además de la variante de la invención también comprenden AMG, pululanasa y otras alfa-amilasas.

[0189] Además, las variantes son particularmente útiles en la producción de edulcorantes y etanol (véase, p. ej., la patente n.° 5.231.017), como etanol para combustibles, para consumo y para uso industrial, a partir de almidón o granos enteros.

[0190] Las variantes también se pueden usar para el desencolado de productos textiles, telas y prendas (véase, p. ej., WO 95/21247, patente EE. UU. n.° 4.643.736y EP 119920), la elaboración o destilación de cerveza, y en la producción de pulpa y papel o procesos relacionados.

Procesamiento de almidón

[0191] El almidón nativo consiste en gránulos microscópicos, que son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando se calienta una suspensión acuosa de almidón, los gránulos se hinchan y finalmente revientan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" hay un aumento drástico en la viscosidad. Ya que el nivel de sólidos es del 30-40 % en un proceso industrial típico, el almidón debe ser diluido o "licuado" para que pueda procesarse adecuadamente. Esta reducción de la viscosidad se logra principalmente mediante la degradación enzimática en la práctica comercial actual.

[0192] Los procesos convencionales de conversión de almidón, tales como los procesos de licuefacción y sacarificación, se describen, p. ej., en la patente EE. UU. n.° 3.912.590, EP 252730 y EP 063909.

[0193] En una realización, el proceso de conversión que degrada el almidón a componentes de carbohidratos de bajo peso molecular, tales como azúcares o sustitutos de grasa, incluye una etapa de desramificación.

[0194] En el caso de convertir almidón en azúcar, el almidón se despolimeriza. Dicho proceso de despolimerización consiste en, p. ej., una etapa de tratamiento previo y dos o tres etapas de proceso consecutivas, es decir, un proceso de licuefacción, un proceso de sacarificación y, dependiendo del producto final deseado, un proceso de isomerización opcional.

[0195] Cuando el producto de azúcar final deseado es, p. ej., jarabe de alto contenido en fructosa, el jarabe de dextrosa se puede convertir en fructosa. Después del proceso de sacarificación, el pH se incrementa a un valor en el rango de 6-8, p. ej., pH 7.5, y el calcio se elimina mediante intercambio iónico. El jarabe de dextrosa se convierte luego en jarabe de alto contenido de fructosa usando, p. ej., una glucosa isomerasa inmovilizada.

Generación de productos de fermentación.

[0196] En general, la producción de alcohol (etanol) a partir de granos enteros se puede separar en cuatro pasos principales: molienda, licuefacción, sacarificación y fermentación.

[0197] El grano se muele para abrir la estructura y permitir que el procesamiento continúe. Dos procesos utilizados son la molienda en húmedo o en seco. En la molienda en seco, todo el grano se muele y se utiliza en la parte restante del proceso. La molienda húmeda proporciona una muy buena separación de germen y harina (gránulos de almidón y proteína) y, con algunas excepciones, se aplica en lugares donde hay una producción paralela de jarabes.

[0198] En el proceso de licuefacción, los gránulos de almidón se solubilizan a maltodextrinas mediante hidrólisis, principalmente de un GP superior a 4. La hidrólisis se puede llevar a cabo mediante tratamiento ácido o enzimáticamente mediante una alfa-amilasa. La hidrólisis ácida se utiliza de forma limitada. La materia prima puede ser grano entero molido o un flujo lateral del procesamiento de almidón.

[0199] Durante una licuefacción enzimática típica, el almidón de cadena larga se degrada en unidades ramificadas y lineales más cortas (maltodextrinas) mediante una alfa-amilasa. La licuefacción enzimática se lleva a cabo generalmente como un proceso de suspensión en caliente de tres etapas. La suspensión se calienta a una temperatura de 60-95 °C (p. ej., 77-86 °C, 80-85 °C, o 83-85 °C) y la(s) enzima(s) se agrega(n). El proceso de licuefacción se lleva a cabo a 85 °C durante 1-2 horas. El pH está generalmente entre 5.5 y 6.2. Con el fin de garantizar la estabilidad enzimática óptima en estas condiciones, se añade 1 mM de calcio (para proporcionar aproximadamente 40 ppm de iones de calcio libres). Después de dicho tratamiento, el almidón licuado tendrá un "equivalente de dextrosa" (DE) de 10-15.

[0200] La suspensión se cocina posteriormente con chorro a una temperatura de 95-140 °C, p. ej., 105-125 °C, se enfrió a 60­ 95 °C y se añadieron más enzimas para obtener la hidrólisis final. El proceso de licuefacción se lleva a cabo a pH 4.5-6.5, típicamente a un pH entre 5 y 6. El grano molido y licuado también se conoce como mezcla.

[0201] El material que contiene almidón licuado se sacarifica en presencia de enzimas sacarificadoras tales como las glucoamilasas. El proceso de sacarificación puede durar de 12 a 120 horas (p. ej., de 12 a 90 horas, de 12 a 60 horas y de 12 a 48 horas).

[0202] Sin embargo, es común realizar una etapa de presacarificación durante aproximadamente de 30 minutos a 2 horas (p. ej., 30 a 90 minutos) a una temperatura de 30 a 65 °C, típicamente alrededor de 60 ° C, seguida de una sacarificación completa durante la fermentación, que se denomina sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). El pH suele estar entre 4.2-4.8, p. ej., pH 4.5. En un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF), no hay etapa de retención para la sacarificación, sino que la levadura y las enzimas se añaden juntas.

[0203] En un proceso típico de sacarificación, las maltodextrinas producidas durante la licuefacción se convierten en dextrosa mediante la adición de una glucoamilasa y una enzima desramificante, como una isoamilasa ( patente EE. UU. n.° 4.335.208) o una pululanasa. La temperatura baja hasta 60 °C, antes de la adición de la glucoamilasa y la enzima desramificante. El proceso de sacarificación se realiza durante 24-72 horas.

[0204] Antes de la adición de las enzimas sacarificadoras, el pH se reduce a menos de 4.5, mientras se mantiene una temperatura alta (por encima de 95 °C), para inactivar la alfa-amilasa en licuefacción. Este proceso reduce la formación de un oligosacárido corto llamado "precursor de panosa", que no puede ser hidrolizado adecuadamente por la enzima desramificante. Normalmente, alrededor del 0.2-0.5 % del producto de sacarificación es el trisacárido ramificado panosa (Glc pa1-6Glc pa1-4Glc), que no puede ser degradado por una pululanasa. Si la amilasa activa de la licuefacción permanece presente durante la sacarificación (es decir, no hay desnaturalización), la cantidad de panosa puede llegar a ser de hasta el 1-2 %, lo cual es altamente indeseable ya que disminuye significativamente el rendimiento de la sacarificación.

[0205] Los azúcares fermentables (p. ej., dextrinas, monosacáridos, particularmente glucosa) se producen a partir de la sacarificación enzimática. Estos azúcares fermentables pueden purificarse y/o convertirse en productos de azúcar útiles. Además, los azúcares pueden usarse como materia prima de fermentación en un proceso de fermentación microbiana para generar productos finales, como el alcohol (p. ej., etanol y butanol), ácidos orgánicos (p. ej., ácido succínico y ácido láctico), alcoholes de azúcar (p. ej., glicerol), intermedios de ácido ascórbico (p. ej., gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato y ácido 2-ceto-L-gulónico), aminoácidos (p. ej., lisina), proteínas (p. ej., anticuerpos y fragmentos de los mismos).

[0206] En una realización, los azúcares fermentables obtenidos durante las etapas del proceso de licuefacción se usan para producir alcohol y particularmente etanol. En la producción de etanol, se usa comúnmente un proceso de SSF en el que las enzimas sacarificadoras y los organismos fermentadores (p. ej., levadura) se añaden a la vez y luego se lleva a cabo a una temperatura de 30-40 °C.

[0207] El organismo utilizado en la fermentación dependerá del producto final deseado. Típicamente, si el etanol es el producto final deseado, la levadura se usará como organismo de fermentación. En algunas realizaciones preferidas, el microorganismo productor de etanol es una levadura y específicamente Saccharomyces tales como cepas de S. cerevisiae ( patente EE. UU. n.° 4.316.956). Una variedad de S. cerevisiae están disponibles comercialmente e incluyen, entre otros, FALI (Fleischmann’s Yeast), SUpErSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), RED STAR (Lesaffre) y Angel alcohol yeast (Angel Yeast Company, China). La cantidad de levadura de partida empleada en los métodos es una cantidad eficaz para producir una cantidad comercialmente significativa de etanol en una cantidad adecuada de tiempo, (p. ej., para producir al menos un 10 % de etanol a partir de un sustrato que tenga entre un 25-40 % de DS en menos de 72 horas). Las células de levadura se suministran generalmente en cantidades de aproximadamente 104 a aproximadamente 1012, y preferiblemente de aproximadamente 107 a aproximadamente 1010 de recuento de levadura viable por ml de caldo de fermentación. Después de añadir la levadura a la mezcla, se somete típicamente a fermentación durante aproximadamente 24-96 horas, p. ej., 35-60 horas. La temperatura está entre aproximadamente 26-34 °C, típicamente a aproximadamente 32 °C, y el pH es de pH 3-6, p. ej., aproximadamente pH 4-5.

[0208] La fermentación puede incluir, además de un microorganismo fermentador (p. ej., levadura), nutrientes y enzimas adicionales, incluyendo las fitasas. El uso de levadura en la fermentación es bien conocido en la técnica.

[0209] En otras realizaciones, el uso de microorganismos de fermentación apropiados, tal como se conoce en la técnica, puede dar como resultado un producto final de fermentación que incluye, p. ej., glicerol, 1,3-propanodiol, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato, ácido 2-ceto-L-gulónico, ácido succínico, ácido láctico, aminoácidos y derivados de los mismos. Más específicamente cuando el ácido láctico es el producto final deseado, se puede usar un Lactobacillus sp. (L. Casei); cuando el glicerol o el 1,3-propanodiol son los productos finales deseados se puede usar E. coli; y cuando los productos finales deseados son 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato y ácido 2-ceto-L-gulónico, se puede usar Pantoea citrea como microorganismo fermentador. La lista enumerada anteriormente está compuesta solo de ejemplos y un experto en la técnica conocerá una multitud de microorganismos fermentadores que pueden usarse para obtener un producto final deseado.

Procesos para generar productos de fermentación a partir de material no gelatinizado que contiene almidón.

[0210] La divulgación se refiere a procesos para generar productos de fermentación a partir de material que contiene almidón sin la gelatinización (es decir, sin cocer) del material que contiene almidón. El producto de fermentación, por ejemplo, el etanol, se puede producir sin licuar la suspensión acuosa que contiene agua y el material que contiene almidón. En una realización, un proceso de la invención incluye sacarificar el material que contiene almidón (p. ej., molido), p. ej., almidón granular, por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, preferiblemente en presencia de alfa-amilasa y/o enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos para producir azúcares que pueden ser fermentados para dar lugar al producto de fermentación por un organismo fermentador adecuado. En esta realización, el producto de fermentación deseado, p. ej., el etanol, se produce a partir de granos de cereales, como el maíz, preferiblemente molidos, no gelatinizados (es decir, sin cocer). Por consiguiente, en el primer aspecto, la invención se refiere a procesos para generar productos de fermentación a partir de material que contiene almidón que comprenden sacarificar y fermentar simultáneamente el material que contiene almidón usando una enzima generadora de fuentes de carbohidratos y un organismo de fermentación a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho material que contiene almidón. En una realización también está presente una proteasa. La proteasa puede ser cualquier proteasa fúngica ácida o metaloproteasa. El producto de fermentación, p. ej., etanol, opcionalmente puede ser recuperado después de la fermentación, p. ej., mediante destilación. Normalmente, la(s) amilasa(s), como la(s) glucoamilasa(s) y/u otras enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos, y/o alfa-amilasa(s), está(n) presente(s) durante la fermentación. Los ejemplos de glucoamilasas y otras enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos incluyen las glucoamilasas que hidrolizan el almidón crudo. Los ejemplos de alfa-amilasas incluyen alfa-amilasas ácidas, tales como alfaamilasas fúngicas ácidas. Los ejemplos de organismos fermentadores incluyen levadura p. ej., una cepa de Saccharomyces cerevisiae. El término "temperatura de gelatinización inicial" significa la temperatura más baja a la que comienza la gelatinización del almidón. En general, el almidón calentado en agua comienza a gelatinizarse entre aproximadamente 50 °C y 75 °C; la temperatura exacta de la gelatinización depende del almidón específico y puede ser determinada fácilmente por el experto en la técnica. Por lo tanto, la temperatura de gelatinización inicial puede variar según las especies vegetales, la variedad particular de las especies vegetales y las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención, la temperatura de gelatinización inicial de un material dado que contiene almidón puede determinarse como la temperatura a la que se pierde la birrefringencia en el 5 % de los gránulos de almidón usando el método descrito por Gorinstein y Lii, 1992, Starch/Starke 44 (12): 461-466. Antes de iniciar el proceso, se puede preparar una suspensión de material que contiene almidón, como el almidón granular, que tiene un 10-55 % p/p de sólidos secos (DS), preferiblemente un 25-45 % p/p de sólidos secos, más preferiblemente un 30-40 % p/p de sólidos secos de material que contiene almidón. La suspensión puede incluir agua y/o aguas de proceso, vinaza (residuo de destilación), agua de depuradora, condensado o destilado de evaporador, agua resultante de la destilación o agua de proceso de otras plantas de productos de fermentación. Debido a que el proceso de la invención se lleva a cabo por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, y por lo tanto, no se produce un aumento significativo de la viscosidad, se pueden usar altos niveles de residuos de destilación si se desea. En una realización, la suspensión acuosa contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 70 % vol. , preferiblemente 15-60 % vol. , especialmente de aproximadamente 30 a 50 % vol. de agua y/o aguas de proceso, vinaza (residuo de destilación), agua de depuradora, condensado o destilado de evaporador, agua resultante de la destilación o agua de proceso de otras plantas de productos de fermentación, o combinaciones de las mismas o similares. El material que contiene almidón puede prepararse reduciendo el tamaño de partícula, preferiblemente mediante molienda seca o húmeda, a 0.05 a 3.0 mm, preferiblemente 0.1­ 0.5 mm. Después de haber sido sometido a un proceso de la invención, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93%, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o preferiblemente al menos el 99 % de los sólidos secos en el material que contiene almidón se convierten en un hidrolizado soluble de almidón. Un proceso en este aspecto de la invención se lleva a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, lo que significa que la temperatura típicamente se encuentra en el rango entre 30-75 °C, preferiblemente entre 45-60 °C. En una realización preferida, el proceso se lleva a cabo a una temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferiblemente alrededor de 32°C. En una realización, el proceso se lleva a cabo de manera que el nivel de azúcar, por ejemplo, el nivel de glucosa, se mantenga en un nivel bajo, tal como por debajo del 6 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente el 3 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente el 2 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente el 1 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente el 0.5% p/p o por debajo del 0.25 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente el 0.1 % p/p. Dichos niveles bajos de azúcar se pueden lograr simplemente empleando cantidades ajustadas de enzimas y organismos fermentadores. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué dosis/cantidades de enzima y organismo fermentador utilizar. Las cantidades empleadas de enzima y organismo fermentador también pueden seleccionarse para mantener bajas concentraciones de maltosa en el caldo de fermentación. Por ejemplo, el nivel de maltosa puede mantenerse por debajo de aproximadamente el 0.5 % p/p, tal como por debajo de aproximadamente el 0.2 % p/p. El proceso de la invención se puede llevar a cabo a un pH de aproximadamente 3 y 7, preferiblemente un pH de 3.5 a 6, o más preferiblemente un pH de 4 a 5. En una realización, la fermentación se realiza durante un periodo de 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas.

Procesos para generar productos de fermentación a partir de material gelatinizado que contiene almidón.

[0211] En este aspecto, la invención se refiere a procesos para generar productos de fermentación, especialmente etanol, a partir de un material que contiene almidón, proceso que incluye una etapa de licuefacción y etapas de fermentación y sacarificación de forma secuencial o simultánea. En consecuencia, la invención se refiere a procesos para generar productos de fermentación a partir de un material que contiene almidón que comprenden las etapas de:

(a) licuefacción del material que contiene almidón en presencia de una variante de alfa-amilasa, o

(b) sacarificación del material licuado obtenido en la etapa (a) utilizando una enzima generadora de fuentes de carbohidratos;

(c) fermentación utilizando un organismo fermentador.

[0212] En un aspecto, una pululanasa como, por ejemplo, una familia de pululanasa GH57 también se usa en la etapa de licuefacción. En una realización, se añade una proteasa, tal como una proteasa fúngica ácida o una metaloproteasa, antes, durante y/o después de la licuefacción. En una realización, la metaloproteasa se deriva de una cepa de Thermoascus, por ejemplo, una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC n.° 0670. En una realización, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una glucoamilasa derivada de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger o Aspergillus awamori, una cepa de Talaromyces, especialmente Talaromyces emersonii; o una cepa de Athelia especialmente Athelia rolfsii; una cepa de Trametes, por ejemplo, Trametes cingulata; una cepa del género Pachykytospora, por ejemplo, una cepa de Pachykytospora papyracea; o una cepa del género Leucopaxillus, por ejemplo, Leucopaxillus giganteus; o una cepa del género Peniophora, por ejemplo, una cepa de la especie Peniophora rufomarginata; o una mezcla de las mismas. La etapa de sacarificación (b) y la etapa de fermentación (c) se pueden llevar a cabo de forma secuencial o simultánea. Se puede añadir una pululanasa y/o una metaloproteasa durante la sacarificación y/o fermentación cuando el proceso se realiza como un proceso de sacarificación y fermentación secuencial y antes o durante la fermentación cuando las etapas (b) y (c) se llevan a cabo simultáneamente (proceso SSF) . La pululanasa y/o la metaloproteasa también se pueden añadir de manera favorable antes de la licuefacción (tratamiento de prelicuefacción), es decir, antes del paso (a) o durante el mismo, y/o después de la licuefacción (tratamiento postlicuefacción), es decir, después del paso (a). La pululanasa se añade de manera más favorable antes o durante la licuefacción, es decir, antes o durante el paso (a). El producto de fermentación como, especialmente, el etanol, se puede recuperar opcionalmente después de la fermentación, p. ej., por destilación. El organismo fermentador es preferiblemente levadura, preferiblemente una cepa de Saccharomyces cerevisiae. En una realización particular, el proceso de la invención comprende además, antes de la etapa (a), las etapas de:

x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente mediante molienda (p. ej., utilizando un molino de martillo);

y) formar una suspensión que comprende agua y el material que contiene almidón.

[0213] En una realización, el tamaño de partícula es más pequeño que una malla 7, p. ej., una malla 6. Una malla 7 se usa generalmente en procesos convencionales de la técnica anterior. La suspensión acuosa puede contener 10-55, p. ej., 25-45 y 30-40, % p/p de sólidos secos (DS) del material que contiene almidón. La suspensión se calienta por encima de la temperatura de gelatinización y se puede añadir una variante de alfa-amilasa para iniciar la licuefacción (dilución). En una realización, la suspensión se puede cocinar a chorro para gelatinizar adicionalmente la suspensión antes de someterla a la alfa-amilasa en la etapa (a). En una realización, la licuefacción puede llevarse a cabo como un proceso de suspensión en caliente de tres etapas. La suspensión se calienta hasta entre 60-95 °C, preferiblemente entre 70-90 °C, preferiblemente entre 80-85 °C a pH 4-6, preferiblemente 4.5-5.5, y se añade la variante de alfa-amilasa, opcionalmente junto con una pululanasa y/o proteasa, preferiblemente metaloproteasa, para iniciar la licuefacción (dilución). En una realización, la suspensión se puede cocinar a chorro a una temperatura entre 95-140 °C, preferiblemente 100-135 °C, tal como 105-125 °C, durante aproximadamente 1-15 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 3-10 minutos , especialmente alrededor de unos 5 minutos. La suspensión se enfría hasta los 60-95 °C y se añade más variante de alfa-amilasa y, opcionalmente, se añade variante de pululanasa y/o proteasa, preferiblemente metaloproteasa, para finalizar la hidrólisis (licuefacción secundaria). El proceso de licuefacción se realiza generalmente a pH 4.0-6, en particular a un pH de 4.5 a 5.5. La etapa de sacarificación (b) se puede llevar a cabo usando condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un proceso completo de sacarificación puede durar de aproximadamente de 24 a aproximadamente 72 horas, sin embargo, es común hacer una presacarificación típicamente de 40 a 90 minutos a una temperatura de entre 30 y 65 °C, típicamente alrededor de 60 °C, seguido de la sacarificación completa durante la fermentación en un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (proceso SSF). La sacarificación se realiza típicamente a temperaturas de 20-75 °C, preferiblemente de 40-70 °C, típicamente alrededor de 60 °C, y a un pH entre 4 y 5, normalmente alrededor de pH 4.5. El proceso más ampliamente utilizado para generar un producto de fermentación, especialmente etanol, es un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF), en el que no hay una etapa de retención para la sacarificación, lo que significa que un organismo fermentador, como la levadura, y la(s) enzima(s), se pueden añadir juntos. El SSF se puede llevar a cabo típicamente a una temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferiblemente aproximadamente de 32 °C. En una realización, la fermentación dura de 6 a 120 horas, en particular 24 a 96 horas.

Fabricación de cerveza

[0214] Las variantes de alfa-amilasa también pueden usarse en un proceso de fabricación de cerveza y fermentaciones similares; las alfa-amilasas se agregarán típicamente durante el proceso de maceración. El proceso es sustancialmente similar a los procesos de molienda, licuefacción, sacarificación y fermentación descritos anteriormente.

Procesamiento de una suspensión de almidón con vinaza

[0215] El material molido que contiene almidón se combina con agua y vinaza diluida reciclada, dando como resultado una suspensión acuosa. La suspensión puede comprender entre el 15 y el 55 % p/p DS (p. ej., del 20 al 50 %, del 25 al 50 %, del 25 al 45 %, del 25 al 40 %, del 20 al 35 % y del 30 al 36% DS). En algunas realizaciones, la vinaza (residuo de destilación) diluida reciclada está en el rango de aproximadamente el 10 al 70 % v/v (p. ej., del 10 al 60 %, del 10 al 50 %, del 10 al 40 %, del 10 al 30 %, del 10 al 20 %, del 20 al 60 %, del 20 al 50 %, del 20 al 40 % y también del 20 al 30 %).

[0216] Una vez que el material molido que contiene almidón se combina con agua y residuo de destilación, el pH no se ajusta en la suspensión. Además, el pH no se ajusta después de añadir una fitasa y, opcionalmente, una alfa-amilasa a la suspensión. En una realización, el pH de la suspensión estará en el intervalo de aproximadamente pH 4.5 a aproximadamente menos de pH 6.0 (p.ej., pH 4.5 a 5.8, pH 4.5 a 5.6, pH 4.8 a 5.8, pH 5.0 a 5.8, pH 5.0 a 5.4, pH 5.2 a 5.5 y pH 5.2 a 5.9). El pH de la suspensión puede estar entre aproximadamente pH 4.5 y 5.2, dependiendo de la cantidad de vinaza diluida añadida a la suspensión y del tipo de material que comprende la vinaza diluida. Por ejemplo, el pH de la vinaza diluida puede estar entre pH 3.8 y pH 4.5.

[0217] Durante la producción de etanol, se pueden agregar ácidos para disminuir el pH en el pozo de la cerveza, para reducir el riesgo de contaminación microbiana antes de la destilación.

[0218] En algunas realizaciones, se agrega una fitasa a la suspensión. En otras realizaciones, además de la fitasa, se añade una alfa-amilasa a la suspensión. En algunas realizaciones, se añaden secuencialmente una fitasa y una alfa-amilasa a la suspensión. En otras realizaciones, se agregan simultáneamente una fitasa y una alfa-amilasa. En algunas realizaciones, la suspensión que comprende una fitasa y, opcionalmente, una alfa-amilasa, se incuban (pretratadas) durante un período de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 8 horas (p. ej., de 5 minutos a 6 horas, de 5 minutos a 4 horas, de 5 minutos a 2 horas y de 15 minutos a 4 horas). En otras realizaciones, la suspensión se incuba a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 40 a 115 °C (p. ej., de 45 a 80 °C, de 50 a 70 °C, de 50 a 75 °C, de 60 a 110 °C, de 60 a 95 °C, de 70 a 110 °C, de 70 a 85 °C y de 77 a 86 °C).

[0219] En otras realizaciones, la suspensión se incuba a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 30 °C (p. ej., de 0 a 25 °C, de 0 a 20 °C, de 0 a 15 °C, de 0 a 10 °C y de 0 a 5 °C) por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón del material que contiene almidón. En algunas realizaciones, la temperatura está por debajo de aproximadamente 68 °C, por debajo de aproximadamente 65 °C, por debajo de aproximadamente 62 °C, por debajo de aproximadamente 60 °C y por debajo de aproximadamente 55 °C. En algunas realizaciones, la temperatura es superior a aproximadamente 45 °C, superior a aproximadamente 50 °C, superior a aproximadamente 55 °C y superior a aproximadamente 60 °C. En algunas realizaciones, la incubación de la suspensión que comprende una fitasa y una alfa-amilasa a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón se denomina licuefacción primaria (1°).

[0220] En una realización, el material molido que contiene almidón es maíz o millo. La suspensión comprende del 25 al 40 % de DS, el pH está en el rango de 4.8 a 5.2, y la suspensión se incuba con una fitasa y, opcionalmente, una alfa-amilasa durante un tiempo de 5 minutos a 2 horas, en un rango de temperatura de 60 a 75 ° C.

[0221] Actualmente, se cree que las alfa-amilasas microbianas disponibles comercialmente utilizadas en el proceso de licuefacción generalmente no son lo suficientemente estables como para producir un sustrato de almidón licuado a partir de un proceso de molienda en seco utilizando grano entero molido a una temperatura superior a aproximadamente 80 °C a un nivel de pH que es menor que pH 5.6. La estabilidad de muchas alfa-amilasas disponibles en el mercado se reduce a un pH de menos de aproximadamente 4.0.

[0222] En una etapa de licuefacción adicional, el material incubado o pretratado que contiene almidón se expone a un aumento de la temperatura, como de aproximadamente 0 a aproximadamente 45 °C por encima de la temperatura de gelatinización del almidón del material que contiene almidón (p. ej., de 70 °C a 120 °C, de 70 °C a 110 ° C y de 70 °C a 90 °C) durante un período de tiempo de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 6 horas (por ejemplo, de 2 minutos a 4 horas, 90 minutos, 140 minutos y de 90 a 140 minutos) a un pH de aproximadamente 4.0 a 5.5 más preferiblemente entre 1 hora y 2 horas. La temperatura puede aumentarse mediante un sistema convencional de cocción a chorro de alta temperatura durante un corto período de tiempo, por ejemplo, de 1 a 15 minutos. Luego, el almidón puede hidrolizarse aún más a una temperatura que varía entre aproximadamente 75 ° C y 95 °C (p. ej., de 80°C a 90 °C y de 80 °C a 85 °C) durante un período de aproximadamente 15 a 150 minutos (p. ej., de 30 a 120 minutos). En una realización preferida, el pH no se ajusta durante estas etapas del proceso y el pH de la mezcla licuada está en el rango de aproximadamente pH 4.0 a pH 5.8 (p. ej., pH 4.5 a 5.8, pH 4.8 a 5.4 y pH 5.0 a 5.2). En algunas realizaciones, se agrega una segunda dosis de alfa-amilasa termoestable a la etapa de licuefacción secundaria, pero en otras realizaciones no hay una dosis adicional de alfa-amilasa.

[0223] Las etapas de incubación y licuefacción pueden ir seguidas de etapas de sacarificación y fermentación bien conocidas en la técnica.

Destilación

[0224] Opcionalmente, tras la fermentación, puede extraerse un alcohol (p. ej., etanol) mediante, por ejemplo, destilación y, opcionalmente, seguir una o más etapas del proceso.

[0225] En algunas realizaciones, la producción de etanol generada por los métodos proporcionados en este documento es de al menos del 8 %, al menos del 10 %, al menos del 12 %, al menos del 14 %, al menos del 15 %, al menos del 16 %, al menos del 17 % y al menos del 18 % (v/v) y al menos del 23 % v/v. El etanol obtenido de acuerdo con el proceso proporcionado en el presente documento puede usarse, por ejemplo, como etanol combustible, etanol para beber, es decir, alcoholes neutros potables, o etanol industrial.

Subproductos

[0226] Lo que queda de la fermentación es el grano, que normalmente se utiliza en piensos para animales en forma líquida o seca. En realizaciones adicionales, el producto final puede incluir los coproductos de fermentación tales como granos secos de destilería (DDG) y granos secos de destilería con solubles (DDGS), que se pueden usar, por ejemplo, como pienso para animales.

[0227] Otros detalles sobre cómo llevar a cabo la licuefacción, la sacarificación, la fermentación, la destilación y la recuperación de etanol son bien conocidos por los expertos.

[0228] De acuerdo con el proceso proporcionado en el presente documento, la sacarificación y la fermentación se pueden llevar a cabo de forma simultánea o por separado.

Producción de pulpa y papel

[0229] Las variantes de alfa-amilasa también se pueden usar en la producción de materiales lignocelulósicos, como pulpa, papel y cartón, a partir de papel y cartón de desecho reforzado con almidón, especialmente cuando la nueva producción de pulpa ocurre a un pH superior a 7 y cuando las amilasas facilitan la desintegración del material de desecho por degradación del almidón de refuerzo. Las variantes de alfa-amilasa son especialmente útiles en un proceso para producir una pulpa de fabricación de papel a partir de papel impreso recubierto con almidón. El proceso se puede realizar como se describe en WO 95/14807 y comprende los siguientes pasos:

a) desintegrar el papel para producir una pulpa,

b) tratar con una enzima que degrada el almidón antes, durante o después del paso a), y

c) separar las partículas de tinta de la pulpa después de los pasos a) y b).

[0230] Las variantes de alfa-amilasa también pueden ser útiles para modificar el almidón cuando se usa almidón modificado enzimáticamente en la fabricación de papel junto con rellenos alcalinos tales como carbonato de calcio, caolín y arcillas. Con las variantes de alfa-amilasa es posible modificar el almidón en presencia del relleno, lo que permite un proceso integrado más simple.

Desencolado de telas, tejidos y prendas.

[0231] Las variantes de alfa-amilasa también pueden ser muy útiles en el desencolado de telas, tejidos o prendas. En la industria de procesamiento textil, las alfa-amilasas se usan tradicionalmente como auxiliares en el proceso de desencolado para facilitar la eliminación de la cola que contiene almidón, que ha servido como revestimiento protector en los hilos de trama al tejer. La eliminación completa del recubrimiento de cola después de tejer es importante para garantizar resultados óptimos en los procesos subsiguientes, en los que el tejido se lava, se decolora y se tiñe. Se prefiere la descomposición enzimática del almidón porque no implica ningún efecto perjudicial sobre el material de la fibra. Para reducir el coste de procesamiento y aumentar el rendimiento de molienda, el proceso de desencolado se combina a veces con las etapas de lavado y decoloración. En dichos casos, los auxiliares no enzimáticos, como los agentes alcalinos u oxidantes, se usan típicamente para descomponer el almidón, debido a que las alfa-amilasas tradicionales no son muy compatibles con los altos niveles de pH y los agentes de blanqueo. La descomposición no enzimática de la cola de almidón provoca algunos daños en la fibra debido a los productos químicos bastante agresivos utilizados. En consecuencia, sería deseable utilizar las variantes de alfa-amilasa, ya que tienen un rendimiento mejorado en soluciones alcalinas. Las variantes de alfa-amilasa se pueden usar solas o en combinación con una celulasa cuando se desencola la tela o tejido que contiene celulosa.

[0232] Los procesos de desencolado y blanqueo son bien conocidos en la técnica. Dichos procesos se describen en p. ej., WO 95/21247, patente EE. UU. n.° 4.643.736, EP 119920.

Procesos de limpieza y composiciones detergentes.

[0233] Las variantes de alfa-amilasa se pueden agregar como componente de una composición detergente para diversos procesos de limpieza o lavado, incluyendo lavado de ropa y lavavajillas. Por ejemplo, las variantes se pueden usar en las composiciones detergentes descritas en WO 96/23874 y WO 97/07202.

[0234] Las variantes de alfa-amilasa pueden incorporarse en detergentes con concentraciones empleadas convencionalmente. Por ejemplo, una variante de la invención puede incorporarse en una cantidad correspondiente a 0.00001-10 mg (calculada como proteína enzimática activa pura) de alfa-amilasa por litro de líquido de lavado/lavaplatos usando niveles de dosificación convencionales de detergente.

[0235] La composición detergente puede formularse, por ejemplo, como una composición detergente para lavado de ropa a mano o a máquina, que incluye una composición aditiva para lavado de ropa adecuada para el pretratamiento de telas manchadas y una composición suavizante de telas, o puede formularse como una composición detergente para uso en operaciones de limpieza general de superficies duras en el hogar, o formularse para operaciones de lavado de vajillas a mano o a máquina.

[0236] La composición detergente puede comprender además otra(s) enzima(s), tales como lipasa, peroxidasa, proteasa, otra enzima amilolítica, p. ej., otra alfa-amilasa, glucoamilasa, amilasa maltogénica, CGTasa, celulasa, mananasa (como Mannaway™ de Novozymes, Dinamarca), pectinasa, pectín liasa, cutinasa y/o lacasa.

[0237] En general, las propiedades de la(s) enzima(s) elegida(s) deben ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) deben estar presentes en cantidades eficaces.

[0238] La enzimas o enzimas detergentes pueden incluirse en una composición detergente añadiendo aditivos separados que contienen una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Un aditivo de detergente, p. ej., un aditivo separado o un aditivo combinado, puede formularse, por ejemplo, como un granulado, un líquido, una suspensión, etc. Las formulaciones de aditivos de detergentes preferidas son granulados, en particular granulados no pulverulentos, líquidos, en particular líquidos estabilizados o suspensiones.

[0239] Pueden producirse granulados no pulverulentos, p. ej., como se describe en las patentes EE. UU. n.os 4.106.991 y 4.661.452, y pueden recubrirse opcionalmente mediante métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son productos de poli(oxietileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los que hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento que forman películas adecuados para aplicación mediante técnicas de lecho fluidificado se dan GB 1483591. Los preparados enzimáticos líquidos pueden, por ejemplo, estabilizarse añadiendo un poliol como propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según los métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden prepararse de acuerdo con el método descrito en EP 238216.

[0240] La composición detergente puede estar en cualquier forma conveniente, p. ej., una barra, una tableta, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente con un contenido de hasta aproximadamente un 70 % de agua y de un 0 a aproximadamente un 30 % de disolvente orgánico, o no acuoso.

[0241] La composición detergente comprende uno o más surfactantes, que pueden ser no iónicos incluyendo semi-polares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos. Los surfactantes están presentes típicamente en un nivel de aproximadamente el 0.1 % al 60 % en peso.

[0242] Cuando se incluye, el detergente generalmente contendrá de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 40 % de un surfactante aniónico, como el alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, alquil sulfato (sulfato de alcohol graso), alcohol etoxisulfato, alcanosulfonato secundario, metil éster de ácido graso alfa sulfonado , ácido alquil o alquenilsuccínico o jabón.

[0243] Cuando se incluye, el detergente generalmente contendrá de aproximadamente un 0.2 % a aproximadamente un 40 % de un surfactante no iónico, como el etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglucosido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, polihidroxi alquilamida de ácido graso o derivados de N-acilo N-alquilo de glucosamina ("glucamidas").

[0244] El detergente puede contener de 0 a aproximadamente un 65 % de un agente potenciador o complejante de detergente, como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiaminotetraacético, ácido dietilentriaminopentaacético, ácido alquil o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos en capas (p. ej., SKS-6 de Hoechst).

[0245] El detergente puede comprender uno o más polímeros. Los ejemplos son carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli(etilenglicol), poli(vinil alcohol), N-óxido de (poli)vinilpiridina, poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico y acrílico y lauril metacrilato/copolímeros ácido acrílico.

[0246] El detergente puede contener un sistema de blanqueo, que puede comprender una fuente de H2O2 como perborato o percarbonato que puede combinarse con un activador de blanqueo formador de perácido, como tetraacetiletilendiamina o nonanoil oxibenzeno sulfonato. Alternativamente, el sistema de blanqueo puede comprender peroxiácidos, por ejemplo, del tipo amida, imida o sulfona.

[0247] La(s) enzima(s) de la composición detergente pueden estabilizarse utilizando agentes estabilizantes convencionales, p. ej., un poliol como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico, p. ej., un éster de borato aromático o un derivado de ácido fenilborónico como el ácido 4-formilfenilborónico, y la composición puede formularse tal como se describe en, p. ej., WO 92/19708 y WO 92/19709.

[0248] El detergente también puede contener otros ingredientes convencionales de detergentes tales como, p. ej., acondicionadores de tejidos que incluyen arcillas, reforzador de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de suciedad, agentes contra la redeposición de suciedad, colorantes, bactericidas, blanqueantes ópticos, hidrótropos, inhibidores de deslustre o perfumes.

[0249] Las composiciones detergentes pueden comprender cualquier enzima en una cantidad correspondiente a 0.01-100 mg de proteína enzimática por litro de líquido de lavado, preferiblemente 0.055 mg de proteína enzimática por litro de líquido de lavado, en particular 0.1-1 mg de proteína enzimática por litro de líquido de lavado.

[0250] Una o más de las variantes de enzimas descritas en el presente documento pueden incorporarse además en las formulaciones detergentes descritas en WO 97/07202.

[0251] Esta descripción incluye más detalles en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ensayo para determinar la actividad de alfa-amilasa residual

[0252] La actividad de alfa-amilasa residual se determina mediante un método que emplea el sustrato EnzChek®. El sustrato en el kit de ensayo de amilasa EnzChek® Ultra (E33651, Invitrogen, La Jolla, CA, EE. UU.) es un derivado de almidón de maíz, almidón DQ ™ , que es almidón de maíz marcado con colorante BODIPY® FL hasta un grado tal que la fluorescencia se desactiva .

[0253] Un vial que contiene aprox. 1 mg de sustrato liofilizado se disuelve en 100 microlitros de acetato de sodio 50 mM (pH 4.0). El vial se agita en vórtice durante 20 segundos y se deja a temperatura ambiente, a oscuras, con mezclado ocasional hasta que se disuelve. Luego se añaden 900 microlitros de acetato 100 mM, 0.01 % (p/v) TRITON® X100, CaCl20.12 mM, pH 5.5, se agita en vórtice y se almacena a temperatura ambiente, a oscuras hasta que esté listo para usar. La solución funcional del sustrato se prepara diluyendo 10 veces en tampón de actividad residual (acetato 100 mM, 0.01 % (p/v) TRITON® X100, CaCl20.12 mM, pH 5.5) lo que da una concentración de sustrato de 100 microgramos/ml. Inmediatamente después de la incubación, la enzima se diluye hasta una concentración de 15 ng de proteína enzimática/ml en acetato 100 mM, 0.01 % (p/v) TRITON® X100, CaCl20.12 mM, pH 5.5.

[0254] Para el ensayo, se mezclan 25 microlitros de la solución funcional del sustrato durante 10 segundos con 25 microlitros de la enzima diluida en una placa negra de microtitulación de 384 pocillos. La intensidad de fluorescencia se mide (excitación: 485 nm, emisión: 555 nm) una vez por minuto durante 15 minutos en cada pocillo a 25 °C y Vmax Se calcula como la pendiente de la gráfica de intensidad de fluorescencia frente al tiempo. El gráfico debe ser lineal y el ensayo de actividad residual se ha ajustado para que la solución enzimática diluida de referencia se encuentre dentro del rango lineal del ensayo de actividad.

Actividad de glucoamilasa (AGU)

[0255] Una unidad de glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima, que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto en condiciones estándar de 37 °C, pH 4.3, sustrato: maltosa 23.2 mM, tampón: acetato 0.1 M, tiempo de reacción 5 minutos.

[0256] Se puede utilizar un sistema de autoanalizador. Se agrega mutarotasa al reactivo de glucosa deshidrogenasa para que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierta en beta-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con la beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, formando NADH, lo que se determina utilizando un fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa original.

Ejemplo 1

Estabilidad de las variantes de alfa-amilasa

[0257] La estabilidad de una alfa-amilasa de referencia (alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las mutaciones I181* G182* N193F truncadas a 491 aminoácidos (SEQ ID n.°: 6)) y sus variantes de alfa-amilasa se determinó incubando la alfa-amilasa de referencia y las variantes a pH 4.5 y 5.5 y temperaturas de 75 °C y 85 °C con CaCl20.12 mM y, a continuación, determinando la actividad residual utilizando el sustrato EnzChek® (kit de ensayo de amilasa EnzChek® Ultra, E33651, Molecular Probes).

[0258] Las muestras de enzimas purificadas se diluyeron hasta concentraciones de trabajo de 0.5 y 1 o 5 y 10 ppm (microgramos/ml) en tampón de dilución de enzimas (acetato 10 mM, Triton X100 al 0.01 %, CaCl20.12 mM, pH 5.0). Se transfirieron veinte microlitros de muestra de enzima a una PCR de MTP de 48 pocillos y se añadieron 180 microlitros de tampón de estabilidad (acetato 150 mM, MES 150 mM, Triton X100 al 0,01%, CaCl20.12 mM, pH 4.5 o 5.5) a cada pozo y se mezclaron. El ensayo se realizó utilizando dos concentraciones de enzima en duplicados. Antes de la incubación a 75 °C o 85 °C, se retiraron 20 microlitros y se almacenaron en hielo como muestras de control. La incubación se realizó en una máquina de PCR a 75 °C y 85 °C.

[0259] Después de la incubación, las muestras se diluyeron hasta 15 ng/ml en un tampón de actividad residual (acetato 100 mM, Triton X100 al 0.01 %, CaCl2 0.12 mM, pH 5.5) y 25 microlitros de enzima diluida se transfirieron a una placa de microtitulación de 384 pocillos negra. La actividad residual se determinó utilizando el sustrato EnzChek agregando 25 microlitros de solución de sustrato (100 microgramos/ml) a cada pocillo. La fluorescencia se determinó cada minuto durante 15 minutos utilizando un filtro de excitación a 485-P nm y un filtro de emisión a 555 nm (el lector de fluorescencia es Polarstar, BMG). La actividad residual se normalizó a las muestras de control para cada configuración.

[0260] Suponiendo que la semivida logarítmica (T / (min)) se ha calculado utilizando la ecuación: T / (min) = T (min) * LN (0.5)/Ln (%RA/100), donde T es el tiempo de incubación del ensayo en minutos, y %RA es el % de actividad residual determinada en el ensayo.

[0261] Usando esta configuración de ensayo, se determinó la semivida para la alfa-amilasa de referencia y su variante, como se muestra en la tabla 1.

Tabla 1

[0262] Los resultados demuestran que las variantes de alfa-amilasa tienen una semivida y una estabilidad significativamente mayores que la alfa-amilasa de referencia.

Ejemplo 2

Producción de etanol utilizando variantes de alfa-amilasa

[0263] Se prepararon cuatro purés a pequeña escala de la alfa-amilasa de referencia y dos variantes de alfa-amilasa descritas en el ejemplo 1 de la siguiente manera: aproximadamente 54 g de maíz molido, aproximadamente 51 g de agua del grifo y aproximadamente 45 g de residuo de destilación se mezclaron en una botella de plástico de 250 ml hasta un peso total de la suspensión de 150 g. El pH de la suspensión de maíz se ajustó a 4.5. Las enzimas se agregaron a las suspensiones con 2 microgramos de amilasa por gramo de sólidos secos. Para la licuefacción, las alfa-amilasas se agregaron a las botellas y las botellas se mezclaron exhaustivamente y se colocaron en un baño de agua precalentado a 85 °C. Las muestras se mantuvieron en el baño de agua durante 2 horas a pH 4.5 mientras se agitaban cada 10 minutos durante los primeros 30 minutos y luego cada 30 minutos durante el resto de la licuefacción de 2 horas. Las muestras se enfriaron luego en un baño de

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Variante de alfa-amilasa aislada, que comprende una sustitución en tres o más posiciones que corresponden a cualquiera de las posiciones 59, 89, 91,96, 108, 112, 129, 157, 165, 166, 168, 171, 177, 179, 180, 184, 208, 220, 224, 242, 254, 269, 270, 274, 276, 281, 284, 416 y 427, en particular, en las posiciones que corresponden a las posiciones 129, 177 y 179, en las que la variante tiene al menos el 90 % y menos del 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID n.°: 6, y la variante tiene actividad de alfa-amilasa, y donde la variante comprende un conjunto de sustituciones, usando la SEQ ID n.°: 1 para la numeración, que consiste en: E129V K177L R179E, y en la que se mantienen las alteraciones de I181* G182* N193F presentes en la SEQ ID n.°: 6 y las variantes tienen una termoestabilidad mejorada en comparación con la alfa-amilasa descrita como la SEQ ID n.°: 6.

2. Variante según la reivindicación 1, en la que la alfa-amilasa progenitora tiene al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % y un 100 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID. n.°: 6.

3. Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que la variante consta de 483 a 515, de 483 a 493 o de 483 a 486 aminoácidos.

4. Composición que comprende una variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en beta-amilasa, celulasa, beta-glucosidasa, celobiohidrolasa y endoglucanasa, glucoamilasa, hemicelulasa, xilanasa, isoamilasa, isomerasa, lipasa, fitasa, proteasa y pululanasa.

5. Uso de una variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para licuar un material que contiene almidón.

6. Método para producir almidón licuado, que comprende licuar un material que contiene almidón con una variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

7. Proceso de generación de un producto de fermentación, que comprende

a. licuar un material que contiene almidón con una variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para producir una mezcla licuada;

b. sacarificar la mezcla licuada para producir azúcares fermentables; y

c. fermentar los azúcares fermentables en presencia de un organismo fermentador.

8. Proceso para generar un producto de fermentación, que comprende poner en contacto un sustrato de almidón con una variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, una glucoamilasa y un organismo fermentador.

9. Polinucleótido aislado que codifica la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

10. Constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido según la reivindicación 9.

11. Vector de expresión que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 10.

12. Célula huésped que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 10.

13. Método para producir una variante de alfa-amilasa, que comprende:

a. cultivar la célula huésped según la reivindicación 12 en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y b. recuperar la variante del medio de cultivo.