ES2727630T3 - Removal of tumor cells from intraoperative autologous blood recovery - Google Patents

Abstract

Procedimiento ex vivo para la eliminación de células tumorales de la sangre recuperada intraoperatoriamente que comprende las siguientes etapas: - proporcionar la sangre recuperada intraoperatoriamente, la cual puede contener células tumorales; - poner en contacto dicha sangre recuperada intraoperatoriamente con - al menos un anticuerpo biespecífico trifuncional que comprende las siguientes propiedades: a) unión a una célula T; b) unión a un antígeno asociado a un tumor o a una célula tumoral; c) unión por medio de su porción Fc a una célula positiva de un receptor Fc, siendo dicho anticuerpo capaz de formar una red tridimensional con las células tumorales contenidas en la sangre, donde dicho al menos un anticuerpo entra en contacto con la sangre recuperada intraoperatoriamente por un período de tiempo de 10 a 180 minutos, lo cual es suficiente para la reticulación de células tumorales y, opcionalmente, células inmunitarias y/u otras células tumorales a fin de obtener asociados y/o agregados, donde dichas células tumorales, tales otras células tumorales y las células inmunitarias antes mencionadas están potencialmente presentes en la sangre recuperada intraoperatoriamente, y donde dichas células tumorales son específicamente reconocidas por dicho al menos un anticuerpo; y - eliminar mecánicamente dichos asociados y/o agregados de dicha sangre recuperada intraoperatoriamente.Ex vivo procedure for the removal of tumor cells from intraoperatively recovered blood comprising the following steps: - providing intraoperatively recovered blood, which may contain tumor cells; - contacting said intraoperatively recovered blood with - at least one trifunctional bispecific antibody comprising the following properties: a) binding to a T cell; b) binding to an antigen associated with a tumor or a tumor cell; c) binding by means of its Fc portion to a positive cell of an Fc receptor, said antibody being able to form a three-dimensional network with the tumor cells contained in the blood, where said at least one antibody comes into contact with intraoperatively recovered blood for a period of 10 to 180 minutes, which is sufficient for the cross-linking of tumor cells and, optionally, immune cells and / or other tumor cells in order to obtain associates and / or aggregates, where said tumor cells, such other tumor cells and the aforementioned immune cells are potentially present in intraoperatively recovered blood, and where said tumor cells are specifically recognized by said at least one antibody; and - mechanically eliminating said associates and / or aggregates of said intraoperatively recovered blood.

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Eliminación de células tumorales de la recuperación de sangre autóloga intraoperatoriaRemoval of tumor cells from intraoperative autologous blood recovery

Campo de la invenciónField of the Invention

[0001] La invención se refiere a un procedimiento que se realiza ex vivo para la eliminación de células tumorales de la recuperación de sangre recolectada intraoperatoriamente, al uso de dicho procedimiento ex vivo para la eliminación de células tumorales de la recuperación de sangre recolectada intraoperatoriamente, seguido por la reintroducción de dicha recuperación de sangre purificada obtenida o de las concentraciones de eritrocitos purificadas mediante dicho procedimiento en un paciente de quien se obtuvo dicha sangre recolectada intraoperatoriamente. Antecedentes de la invención [0001] The invention relates to a method that is performed ex vivo for the removal of tumor cells from intraoperatively collected blood recovery, to the use of said ex vivo method for removal of tumor cells from intraoperatively collected blood recovery, followed by the reintroduction of said recovery of purified blood obtained or of the concentrations of purified erythrocytes by said procedure in a patient from whom said blood collected intraoperatively was obtained. Background of the invention

[0002] Desde la epidemia del SIDA a principios de los años 1980, el interés en las alternativas a las transfusiones de sangre alogénicas ha crecido, en particular para la cirugía electiva. Una alternativa que actualmente representa más del 5 % de la sangre donada en los Estados Unidos y algunos países de Europa es la transfusión autóloga, obtenida principalmente mediante la donación preoperatoria. Además de la donación de sangre preoperatoria, la recuperación de sangre intraoperatoria (RSI) (Tabla 1) del campo quirúrgico representa una opción importante para la cobertura de las demandas de transfusión. A lo largo de este procedimiento de RSI, se recolecta la sangre que un paciente pierde en el quirófano y después se la limpia y pone a disposición para su reinfusión a ese paciente. [0002] Since the AIDS epidemic in the early 1980s, interest in alternatives to allogeneic blood transfusions has grown, particularly for elective surgery. An alternative that currently represents more than 5% of donated blood in the United States and some countries in Europe is autologous transfusion, obtained mainly through preoperative donation. In addition to preoperative blood donation, intraoperative blood recovery (RSI) (Table 1) of the surgical field represents an important option for coverage of transfusion demands. Throughout this RSI procedure, the blood that a patient loses in the operating room is collected and then cleaned and made available for reinfusion to that patient.

[0003] En pocas palabras, la sangre eliminada en el campo quirúrgico es aspirada de este sitio hacia un contenedor especialmente diseñado. Se le añade un anticoagulante de citratos o heparina y los contenidos son centrifugados y/o filtrados para eliminar los leucocitos, coágulos y desechos. Los dispositivos de RSI usados pueden variar entre simples y económicos frascos estériles llenos de anticoagulantes hasta sofisticados y costosos dispositivos de lavado de células de alta velocidad (por ejemplo, Medtronic Sequestra 1000, Cobre BRAT 2, Medtronic Autolog, Haemonetics Cell Saver-5 ® y Fresenius CATS®; Bentzien y col., Anaesthesist 49: 505, 2000; Serrick y col., J. Extra Corpor. Technol. 35(1): 28, 2003; Carless y col., The Cochrane Review, En: The Cochrane Library, John Wiley & Sons, Ltd., 3ra edición, páginas 1-180, 2010). Usado en cerca de un millón de cirugías cada año en los EE.UU., el procedimiento de RSI se ha convertido en una parte integral de los programas de manejo y conservación de sangre en los hospitales. [0003] In a nutshell, blood removed in the surgical field is aspirated from this site into a specially designed container. A citrate or heparin anticoagulant is added and the contents are centrifuged and / or filtered to remove leukocytes, clots and wastes. The RSI devices used can vary between simple and economical sterile bottles filled with anticoagulants to sophisticated and expensive high-speed cell washing devices (for example, Medtronic Sequestra 1000, Copper BRAT 2, Medtronic Autolog, Haemonetics Cell Saver-5 ® and Fresenius CATS®; Bentzien et al., Anaesthesist 49: 505, 2000; Serrick et al., J. Extra Corpor. Technol. 35 (1): 28, 2003; Carless et al., The Cochrane Review, In: The Cochrane Library, John Wiley & Sons, Ltd., 3rd edition, pages 1-180, 2010). Used in about one million surgeries every year in the US, the RSI procedure has become an integral part of blood management and conservation programs in hospitals.

Tabla 1. Puntos de referencia de la recuperación de sangre intraoperatoria en la cirugía de cáncer Recuperación de sangre eficiente Liberación de recursos sanguíneos Table 1. Benchmarks of intraoperative blood recovery in cancer surgery Efficient blood recovery Release of blood resources

Compatibilidad Suministro de sangreCompatibility Blood supply

Rápida disponibilidad Terapia óptima para la pérdida de sangre Rentabilidad Aplicación dependiente de la pérdida deQuick availability Optimal therapy for blood loss Profitability Dependent application of blood loss

sangreblood

Ausencia de exceso de transfusión Después de al menos 1 l de pérdida deAbsence of excess transfusion After at least 1 l of loss of

sanguínea sangreblood blood

Menos deficiencias en la transfusión Eficacia mejorada de laLess transfusion deficiencies Improved efficiency of

sanguínea quimioterapia/radioterapiablood chemotherapy / radiotherapy

Alta calidad de la sangre Eritrocitos lavados y frescosHigh blood quality Erythrocytes washed and fresh

Aumento de seguridad Reducción de los riesgos de laIncreased security Reduction of the risks of

transfusión (por ejemplo, infección, errortransfusion (for example, infection, error

de transfusión, difíciles pruebas de histocompatibilidad cruzada)transfusion, difficult cross histocompatibility tests)

Ausencia de la necesidad de una Reducción del costo de unidadesAbsence of the need for a unit cost reduction

predonación autóloga desperdiciadaswasted autologous predonation

Más práctico para los médicos clínicosMore practical for clinical doctors

[0004] Además del aumento de incidencia de la anemia preoperatoria, la donación sanguínea previa a la cirugía genera serias preguntas económicas adicionales debido a las altas tasas de transfusión en general (Carless y col., Transfus. Med. 14: 123, 2004). Además, alrededor del 30 % de las donaciones de sangre autólogas preoperatorias deben descartarse en Italia porque los productos sanguíneos autólogos no requeridos se excluyen de las transfusiones de sangre alogénicas per se según las pautas reglamentarias. En cuanto a esto, la RSI y la posterior autotransfusión generalmente representan medidas seguras y más costo-efectivas en el manejo de sangre. [0004] In addition to the increased incidence of preoperative anemia, blood donation prior to surgery raises serious additional economic questions due to high transfusion rates in general (Carless et al., Transfus. Med. 14: 123, 2004) . In addition, about 30% of preoperative autologous blood donations should be discarded in Italy because autologous blood products not required are excluded from allogeneic blood transfusions per se according to regulatory guidelines. In this regard, RSI and subsequent autotransfusion generally represent safe and more cost-effective measures in blood management.

Ventajas de la recuperación de sangre intraoperatoria Advantages of intraoperative blood recovery

[0005] En contraste con las transfusiones de glóbulos rojos alogénicas, la RSI es considerada como una alternativa segura y eficaz. Resulta importante que, más allá del excelente diagnóstico viral, el riesgo de transferir una infección por VIH es de 1 en 493.000 transfusiones de sangre alogénicas; el riesgo de transferir una infección por el virus de la hepatitis C es de 1 por 103.000; y el riesgo de transmitir una infección por el virus de la hepatitis B es de 1 en 63.000 (Schreiber y col., N. Engl. J. Med. 334: 1685, 1996). Los resultados de un estudio titulado "Los peligros graves de las transfusiones" (Serious Hazards of Transfusions) realizado entre 1996 y 2001 documentaron estos riesgos de las incidencias de las transfusiones alogénicas (Dzik y col., Transfusion 43: 1190, 2003). Sorprendentemente, la transmisión de enfermedades infecciosas por medio de transfusiones de sangre contaminada parece ser un riesgo menor en comparación con los enormes riesgos de la sangre incompatible con ABO debido a la falla administrativa o humana a lo largo del procedimiento de transfusión y donación de sangre (Sazama, Transfusion 30: 583, 1990; Dzik y col., Transfusion 43: 1190, 2003). Más del 70 % de las incidencias de transfusión podrían atribuirse a componentes de sangre incorrectos transfundidos principalmente como resultado de fallas administrativas y errores en las muestras, prescripciones y recolección de componentes (Dzik y col., Transfusion 43: 1190, 2003). La autotransfusión pre e intraoperatoria de glóbulos rojos evita per se estos riesgos inherentes de la transfusión de sangre alogénica. En general, las técnicas de recuperación de sangre autóloga ofrecen ventajas pero no requieren de infusiones de cristaloides o coloides a fin de preservar el volumen sanguíneo (Tabla 1). Es posible recuperar muchos litros de sangre intraoperatoriamente durante un gran sangrado, muchos más que con otras técnicas autólogas. [0005] In contrast to allogeneic red blood cell transfusions, RSI is considered a safe and effective alternative. It is important that, beyond the excellent viral diagnosis, the risk of transferring an HIV infection is 1 in 493,000 allogeneic blood transfusions; the risk of transferring a hepatitis C virus infection is 1 per 103,000; and the risk of transmitting a hepatitis B virus infection is 1 in 63,000 (Schreiber et al., N. Engl. J. Med. 334: 1685, 1996). The results of a study entitled "The Serious Hazards of Transfusions " ( Serious Hazards of Transfusions) conducted between 1996 and 2001 documented these risks of the incidence of allogeneic transfusions (Dzik et al., Transfusion 43: 1190, 2003). Surprisingly, the transmission of infectious diseases through transfusions of contaminated blood seems to be a lower risk compared to the enormous risks of blood incompatible with ABO due to administrative or human failure throughout the blood transfusion and donation procedure ( Sazama, Transfusion 30: 583, 1990; Dzik et al., Transfusion 43: 1190, 2003). More than 70 % of transfusion incidents could be attributed to incorrect blood components transfused primarily as a result of administrative failures and sample errors, prescriptions and component collection (Dzik et al., Transfusion 43: 1190, 2003). Pre and intraoperative red blood cell autotransfusion per se avoids these inherent risks of allogeneic blood transfusion. In general, autologous blood recovery techniques offer advantages but do not require infusions of crystalloids or colloids in order to preserve blood volume (Table 1). It is possible to recover many liters of blood intraoperatively during heavy bleeding, many more than with other autologous techniques.

Idoneidad de los pacientes para la RSISuitability of patients for RSI

[0006] La recuperación de sangre intraoperatoria lleva disponible más de 25 años. Se usa ampliamente en la cirugía cardiotorácica, vascular y de traumatismos, así como en el trasplante de hígado. Las contraindicaciones de su uso son las infecciones bacterianas y las células tumorales probablemente eliminadas dentro de la sangre del campo quirúrgico, y el uso de colágeno microfibrilar u otro material extraño en el sitio de operación. En la actualidad, debido a la escasez de donantes de sangre y los miedos de infecciones transmitidas, el uso de la RSI también gana un gran interés en la cirugía de cáncer con altas pérdidas de sangre. La reticencia de los cirujanos al uso de la autotransfusión en la cirugía de cáncer ha decrecido, ya que los informes no hallaron ningún incremento en la recurrencia local o enfermedad metastásica en la comparación con los datos estándares de supervivencia (Klimberg y col. Arch. Surg. [0006] Intraoperative blood recovery has been available for more than 25 years. It is widely used in cardiothoracic, vascular and trauma surgery, as well as in liver transplantation. Contraindications to its use are bacterial infections and tumor cells probably eliminated within the blood of the surgical field, and the use of microfibrillar collagen or other foreign material at the site of operation. At present, due to the shortage of blood donors and fears of transmitted infections, the use of RSI also earns great interest in cancer surgery with high blood loss. Surgeons' reluctance to use autotransfusion in cancer surgery has decreased, since the reports found no increase in local recurrence or metastatic disease compared to standard survival data (Klimberg et al. Arch. Surg .

212: 1326, 1986; Perseghin y col., Vox Sang. 72: 221, 1997). Según la reseña de Vanderlinde y col. (BMJ 324: 772, 2002) las autotransfusiones de glóbulos rojos recolectadas de las donaciones de sangre preoperatoria podrían llevar significativamente a incidencias de infección y recurrencia reducidas durante la cirugía de cáncer colorrectal, en comparación con las transfusiones alogénicas (Tabla 2). Algunos de estos ensayos clínicos revisados son incluso más importantes, ya que las cirugías colorrectales han sido excluidas per se de las recomendaciones de la RSI debido al riesgo inherente de la transmisión de infecciones bacterianas. 212: 1326, 1986; Perseghin et al., Vox Sang. 72: 221, 1997). According to the review by Vanderlinde et al. (BMJ 324: 772, 2002) Autotransfusions of red blood cells collected from preoperative blood donations could lead to significantly reduced incidence of infection and recurrence during colorectal cancer surgery, compared to allogeneic transfusions (Table 2). Some of these reviewed clinical trials are even more important, since colorectal surgeries have been excluded per se from the RSI recommendations due to the inherent risk of transmission of bacterial infections.

[0007] Sin embargo, un estudio mostró con claridad que las células tumorales podían detectarse en el campo quirúrgico, aunque su impacto en la recurrencia del cáncer permanecía poco claro (Hansen y col., Arch.) Surg. 130: 387, 1995). Por ejemplo, se comparó el número de células tumorales en la sangre periférica y la RSI de 61 pacientes con cirugía de cáncer de un tumor maligno abdominal, ortopédico, urológico, ginecológico o de cabeza y cuello. En 57 de 61 de pacientes, se detectaron células tumorales en la sangre eliminada durante la cirugía oncológica. Estas células tumorales fueron identificadas por la capacidad de proliferación, invasividad y tumorigenicidad con una sensibilidad de 10 células tumorales por 500 ml de sangre (Hansen y col., Arch. Surg. 130: 387, 1995). De modo interesante, el número de células tumorales en la sangre eliminada no era correlativa a la cantidad de sangre perdida y solo en 26 % de estos pacientes fue posible detectar células tumorales circulantes en la sangre periférica. Por lo tanto, se estima que el número de células tumorales en la sangre eliminada en el campo quirúrgico podría variar de 10 a 107. Estos resultados también fueron independientemente confirmados por Dale y col., Br. J. Surg. 75: 581, 1988 y Muller y col., Anaesthesist 45: 834, 1996. [0007] However, one study clearly showed that tumor cells could be detected in the surgical field, although their impact on cancer recurrence remained unclear (Hansen et al., Arch.) Surg. 130: 387, 1995). For example, the number of tumor cells in the peripheral blood and the RSI of 61 patients with cancer surgery of an abdominal, orthopedic, urological, gynecological or head and neck malignant tumor were compared. In 57 of 61 patients, tumor cells were detected in the blood removed during cancer surgery. These tumor cells were identified by the proliferation, invasiveness and tumorigenicity capacity with a sensitivity of 10 tumor cells per 500 ml of blood (Hansen et al., Arch. Surg. 130: 387, 1995). Interestingly, the number of tumor cells in the blood removed was not correlative to the amount of blood lost and only in 26% of these patients was it possible to detect circulating tumor cells in the peripheral blood. Therefore, it is estimated that the number of tumor cells in the blood removed in the surgical field could vary from 10 to 107. These results were also independently confirmed by Dale et al., Br. J. Surg. 75: 581, 1988 and Muller et al., Anaesthesist 45: 834, 1996.

[0008] Para seguir abordando las preocupaciones de seguridad en cuanto al riesgo de las células tumorales residuales en muestras de RSI, se necesitan estrategias adicionales para eliminar las células tumorales contaminantes de manera efectiva: [0008] To continue addressing safety concerns regarding the risk of residual tumor cells in RSI samples, additional strategies are needed to effectively eliminate contaminating tumor cells:

• Un procedimiento que se usa en combinación con los dispositivos de RSI automáticos, como Cell Saver-5®, está representado por la filtración adicional de muestras a través de filtros de reducción de leucocitos (por ejemplo, Pall RC400, RCEZ1T), RC XL-1) (Bontadini y col., Transfusion 34. 531, 1994; Yaprak y col., Turk. J. Pediatr. 40: 89, 1998; Gwak y col., Liver Transplant. 11: 331, 2005). Como se ha evaluado en varios ensayos, la transfusión segura de eritrocitos recolectados mediante RSI no afecta el resultado clínico (Edelman y col., Urology 47: 179, 1996; Perseghin y col., Vox Sang. 72: 221,1996; Davis y col., BJU International 91: 474, 2003).• A procedure that is used in combination with automatic RSI devices, such as Cell Saver-5®, is represented by additional filtration of samples through leukocyte reduction filters (for example, Pall RC400, RCEZ1T), RC XL -1) (Bontadini et al., Transfusion 34. 531, 1994; Yaprak et al., Turk. J. Pediatr. 40: 89, 1998; Gwak et al., Liver Transplant. 11: 331, 2005). As has been evaluated in several trials, the safe transfusion of erythrocytes collected by RSI does not affect the clinical outcome (Edelman et al., Urology 47: 179, 1996; Perseghin et al., Vox Sang. 72: 221,1996; Davis and col., BJU International 91: 474, 2003).

• En una estrategia diferente de RSI, las muestras se irradian a 50 Gy debido al principio básico de radiosensibilidad de células cancerosas nucleadas y debido a la radiorresistencia de los glóbulos rojos anucleados.• In a different RSI strategy, the samples are irradiated at 50 Gy due to the basic principle of radiosensitivity of nucleated cancer cells and due to the radioresistance of the anucleated red blood cells.

[0009] Debido a la compleja demanda logística de la RSI/estrategia de irradiación incluyendo el requerimiento de personal adicional, problemas de dosimetría, equipos de irradiación adecuados y certificados en el departamento clínico, este último procedimiento no está a favor de la aplicación generalizada. Por el contrario, el procedimiento de filtración para la disminución de leucocitos representa una estrategia elegante para reducir las células tumorales residuales durante la RSI, aunque esta técnica aún presenta el riesgo inherente de que haya células tumorales residuales que incluso pasen el filtro. [0009] Due to the complex logistic demand of the RSI / irradiation strategy including the requirement of additional personnel, dosimetry problems, adequate and certified irradiation equipment in the clinical department, the latter procedure is not in favor of widespread application. On the contrary, the filtration procedure for the reduction of leukocytes represents an elegant strategy to reduce residual tumor cells during RSI, although this technique still presents the inherent risk of residual tumor cells that even pass the filter.

[0010] El documento de Edmund A.M. Neugebauer: "Jahresbericht 2010, Institut fur Forschung in der Operativen Medizin", Universitat Witten / Herdecke, 1 de marzo de 2011 (2011-03-01), páginas 1-98 describe el anticuerpo trifuncional Catumaxomab para la eliminación de células tumorales libres de la sangre recolectada intraoperatoriamente de heridas para la autotransfusión durante la cirugía oncológica. [0010] The Edmund AM Neugebauer document: "Jahresbericht 2010, Institut fur Forschung in der Operativen Medizin", Universitat Witten / Herdecke, March 1, 2011 (2011-03-01), pages 1-98 describes the Catumaxomab trifunctional antibody for the removal of free tumor cells from the blood collected intraoperatively from wounds for autotransfusion during cancer surgery.

[0011] El documento de Alexandra Schoberth: "Entwicklung und Verbesserung von Methoden zur Charakterisierungdisseminierter Tumorzellen bei soliden Tumoren", Dissertation an der Medizinischen Fakultat der Ludwig-Maximilians-Universitat zu Munchen, 9 de diciembre de 2004 (2004-12-09) describe la eliminación (la purga de células tumorales de productos de aféresis de células madres autólogas (para su readministración) ex vivo usando anticuerpos trifuncionales. [0011] Alexandra Schoberth's document: "Entwicklung und Verbesserung von Methoden zur Charakterisierungdisseminierter Tumorzellen bei soliden Tumoren", Dissertation an der Medizinischen Fakultat der Ludwig-Maximilians-Universitat zu Munchen, December 9, 2004 (2004-12-09) describes the removal (purging of tumor cells from autologous stem cell apheresis products (for re-administration) ex vivo using trifunctional antibodies.

[0012] El documento de Schoberth A. y col.: "A new class of trifunctional bispecific antibodies mediated efficient immunological purging of peripheral blood stem cells", European Journal of Cancer, Vol. 37, 1 de setiembre de 2001 (2001-09-01), página S51 describe que los anticuerpos biespecíficos trifuncionales podrían usarse eficientemente para la purga inmunológica de células madre de sangre periférica. [0012] The document by Schoberth A. et al .: "A new class of trifunctional bispecific antibodies mediated efficient immunological purging of peripheral blood stem cells", European Journal of Cancer, Vol. 37, September 1, 2001 (2001-09 -01), page S51 describes that trifunctional bispecific antibodies could be efficiently used for immunological purging of peripheral blood stem cells.

Problemas que ha de resolver la presente invenciónProblems to be solved by the present invention

[0013] Por lo tanto, para una seguridad mejorada en la cirugía de cáncer para eliminar células tumorales residuales, todos los procedimientos conocidos para la reintroducción de sangre autóloga obtenida, por ejemplo, durante una cirugía de heridas de pacientes con tumores, debe mejorarse a fin de proporcionar una eliminación confiable de células tumorales posiblemente contaminantes; dicha mejora debe ser capaz de implementarse de manera sencilla en, por ejemplo, dispositivos como Cell Saver-5® o CATS®, o con cualquier otro procedimiento para la reintroducción de sangre de pacientes que se han sometido a una cirugía. [0013] Therefore, for improved safety in cancer surgery to remove residual tumor cells, all known procedures for the reintroduction of autologous blood obtained, for example, during wound surgery of patients with tumors, should be improved to in order to provide a reliable elimination of potentially contaminating tumor cells; such improvement must be able to be implemented in a simple way in, for example, devices such as Cell Saver-5® or CATS®, or with any other procedure for the reintroduction of blood from patients who have undergone surgery.

Resumen de la invenciónSummary of the Invention

[0014] La innovadora estrategia descubierta por los presentes inventores se basa en la formación, mediada por anticuerpos, de complejos multicelulares, es decir, asociados, que comprenden células tumorales reconocidas mediante el reconocimiento de antígenos asociados a un tumor impulsado por un anticuerpo, y opcionalmente también mediante el reconocimiento de células inmunitarias (leucocitos) como células T y células accesorias positivas para el receptor Fc y/o también células tumorales, seguido de la eliminación de dichos asociados por medio de, por ejemplo, etapas de centrifugación y/o filtración. También es posible usar andamios de proteínas con anticuerpos miméticos en combinación con los anticuerpos como se describe en la reivindicación 1. [0014] The innovative strategy discovered by the present inventors is based on the formation, mediated by antibodies, of multicellular complexes, that is, associated, comprising tumor cells recognized by the recognition of antigens associated with a tumor driven by an antibody, and optionally also by recognizing immune cells (leukocytes) as T cells and accessory cells positive for the Fc receptor and / or also tumor cells, followed by the removal of said associates by means of, for example, centrifugation and / or filtration steps. It is also possible to use protein scaffolds with mimetic antibodies in combination with the antibodies as described in claim 1.

Breve descripción de las figurasBrief description of the figures

[0015] La invención se ilustrará con más detalles también mediante las figuras adjuntas. Las figuras muestran: [0015] The invention will be illustrated in more detail also by the attached figures. The figures show:

Figura 1: Se muestra el principio de formación de grandes complejos multicelulares, inducidos por anticuerpos trifuncionales. La formación de dicho complejo permite la eliminación de células tumorales por medio de etapas de procedimiento específicos del dispositivo para la muestra de sangre intraoperatoria. Figure 1: The principle of formation of large multicellular complexes, induced by trifunctional antibodies, is shown. The formation of said complex allows the removal of tumor cells by means of specific procedure steps of the device for the intraoperative blood sample.

Figura 2: Dibujos esquemáticos de los formatos de anticuerpos representativos con la capacidad de formar complejos multicelulares que consisten en células tumorales y leucocitos de sangre periférica (es decir, células inmunitarias). Los dibujos han sido extraídos de Jin P y Z Zhu En: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, páginas 151-170 (2011) y han sido ligeramente modificados. La invención solo comprende aquellos anticuerpos cubiertos por la presente reivindicación 1; cualquier otro formato de anticuerpo se describe solo para fines informativos. Figure 2: Schematic drawings of representative antibody formats with the ability to form multicellular complexes consisting of tumor cells and peripheral blood leukocytes (i.e., immune cells). The drawings have been extracted from Jin P and Z Zhu In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pages 151-170 (2011) and have been slightly modified. The invention only comprises those antibodies covered by the present claim 1; Any other antibody format is described for informational purposes only.

Figura 3: Realización ejemplar de un procedimiento de la invención que usa catumaxomab. Figure 3: Exemplary embodiment of a method of the invention using catumaxomab.

Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidasDetailed description of the invention and preferred embodiments

[0016] La siguiente discusión se incluye para los fines de describir la presente invención e ilustrar las realizaciones preferidas de la misma. [0016] The following discussion is included for the purpose of describing the present invention and illustrating preferred embodiments thereof.

[0017] A menos que se expliquen de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales, a menos que el contexto claramente indique lo contrario. De manera similar, se pretende que la palabra "o" incluya "y", a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Aunque los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta invención se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la presente descripción, a continuación se describen los procedimientos y materiales adecuados. El término "comprende" significa que "incluye". Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otra bibliografía mencionadas en esta invención se incorporan como antecedentes en tu totalidad. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las explicaciones de los términos. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden ser limitantes. [0017] Unless explained otherwise, all technical and scientific terms used in this invention have the same meaning commonly understood by those skilled in the art to which this description belongs. The singular terms "a", "a", "the" and "the" include plural references, unless the context clearly indicates otherwise. Similarly, it is intended that the word "or" include "and", unless the context clearly indicates otherwise. Although procedures and materials similar or equivalent to those described in this invention can be used in the practice or test of the present description, suitable procedures and materials are described below. The term "understand" means that "includes". All publications, patent applications, patents and other bibliography mentioned in this invention are incorporated as background in your entirety. In case of conflict, the present specification will prevail, including explanations of the terms. In addition, the materials, procedures and examples are illustrative only and are not intended to be limiting.

[0018] La presente invención tiene que ver con un procedimiento ex vivo para la eliminación de células tumorales de la recuperación de sangre obtenida intraoperatoriamente que comprende las siguientes etapas: [0018] The present invention has to do with an ex vivo method for the removal of tumor cells from intraoperatively obtained blood recovery comprising the following steps:

- proporcionar la sangre recuperada intraoperatoriamente, la cual puede contener células tumorales; - provide intraoperatively recovered blood, which may contain tumor cells;

- poner en contacto dicha sangre recuperada intraoperatoriamente con - contacting said intraoperatively recovered blood with

- al menos un anticuerpo biespecífico trifuncional que comprende las siguientes propiedades: - at least one trifunctional bispecific antibody comprising the following properties:

a) unión a una célula T;a) binding to a T cell;

b) unión a un antígeno asociado a un tumor o a una célula tumoral;b) binding to an antigen associated with a tumor or a tumor cell;

c) unión por medio de su porción Fc a una célula positiva de un receptor Fc,c) binding by means of its Fc portion to a positive cell of an Fc receptor,

siendo dicho anticuerpo capaz de formar una red tridimensional con las células tumorales contenidas en la sangre, donde dicho al menos un anticuerpo entra en contacto con la sangre recuperada intraoperatoriamente por un período de tiempo de 10 a 180 minutos, lo cual es suficiente para reticular células tumorales y opcionalmente células inmunitarias y/u otras células tumorales a fin de obtener asociados y/o agregados, donde dichas células tumorales, tales otras células tumorales y las células inmunitarias antes mencionadas están potencialmente presentes en la sangre recuperada intraoperatoriamente, y donde dichas células tumorales son específicamente reconocidas por dicho al menos un anticuerpo; ysaid antibody being capable of forming a three-dimensional network with the tumor cells contained in the blood, where said at least one antibody comes into contact with the blood recovered intraoperatively for a period of 10 to 180 minutes, which is sufficient to cross-link cells tumor and optionally immune cells and / or other tumor cells in order to obtain associates and / or aggregates, where said tumor cells, such other tumor cells and the aforementioned immune cells are potentially present in intraoperatively recovered blood, and where said tumor cells they are specifically recognized by said at least one antibody; Y

- eliminar mecánicamente dichos asociados y/o agregados de dicha sangre recuperada intraoperatoriamente. - mechanically remove said associates and / or aggregates from said intraoperatively recovered blood.

[0019] Además, la invención se refiere al uso de un anticuerpo trifuncional biespecífico con las siguientes propiedades: [0019] In addition, the invention relates to the use of a bispecific trifunctional antibody with the following properties:

a) unión a una célula T;a) binding to a T cell;

b) unión a un antígeno asociado a un tumor o a una célula tumoral;b) binding to an antigen associated with a tumor or a tumor cell;

c) unión por medio de su porción Fc a una célula positiva de un receptor Fc, c) binding by means of its Fc portion to a positive cell of an Fc receptor,

siendo dicho anticuerpo capaz de formar una red tridimensional con células tumorales contenidas en la sangre, en un procedimiento ex vivo como se describe en la reivindicación 1.said antibody being capable of forming a three-dimensional network with tumor cells contained in the blood, in an ex vivo method as described in claim 1.

[0020] En la siguiente descripción y los ejemplos en combinación con las figuras, se describen otras realizaciones preferidas. A partir de las reivindicaciones, es posible obtener más características preferidas. [0020] In the following description and examples in combination with the figures, other preferred embodiments are described. From the claims, it is possible to obtain more preferred features.

[0021] El procedimiento descrito en esta invención se practica ex vivo, es decir, fuera del cuerpo humano. La recuperación de sangre intraoperatoria (RSI) es muy conocida en la técnica y también se describe como "recuperación de sangre autóloga". La sangre que se pierde durante la cirugía es recuperada y reinfusionada al mismo paciente del cual se obtuvo la sangre perdida durante la cirugía. [0021] The procedure described in this invention is practiced ex vivo, that is, outside the human body. Intraoperative blood recovery (RSI) is well known in the art and is also described as "autologous blood recovery." The blood that is lost during surgery is recovered and reinfused to the same patient from whom the blood lost during surgery was obtained.

[0022] El procedimiento descrito en esta invención apunta a la eliminación de células tumorales que potencialmente podrían contaminar la recuperación de sangre obtenida intraoperatoriamente. La sangre se obtiene de pacientes que se someten a un tratamiento quirúrgico y sufren de tumores o que se sospecha que albergan células que podrían considerarse como tumorigénicas. [0022] The procedure described in this invention aims at the removal of tumor cells that could potentially contaminate the recovery of blood obtained intraoperatively. Blood is obtained from patients who undergo surgical treatment and suffer from tumors or are suspected of harboring cells that could be considered as tumorigenic.

[0023] En general, el procedimiento comienza con la aspiración de la sangre del campo quirúrgico por parte del cirujano. Generalmente, la etapa de recolección se realiza a través de un dispositivo de succión. Después, la sangre aspirada se mezcla con un anticoagulante a fin de evitar la coagulación de la sangre. La sangre aspirada se recolecta en un reservorio hasta que haya sangre suficiente para su procesamiento. [0023] In general, the procedure begins with the aspiration of blood from the surgical field by the surgeon. Generally, the collection stage is performed through a suction device. Then, the aspirated blood is mixed with an anticoagulant to prevent blood clotting. The aspirated blood is collected in a reservoir until there is enough blood for processing.

[0024] La referencia a un "anticoagulante" incluye clases de anticoagulantes como anticoagulantes, medicamentos antiplaquetarios, medicamentos trombolíticos y fibrinolíticos y agentes quelantes de iones metálicos como, por ejemplo, citrato, citrato dextrosa (ACD), etilen-diamino-tetra-acético (EDTA) y oxalato. En un aspecto relacionado, los anticoagulantes incluyen heparina y glicosaminoglicanos como la heparina de bajo peso molecular, como la Bemiparina, Certoparina, Dalteparina, Enoxaparina, Nadroparina, Pamaparina, Reviparina y Tinzaparina, y heparinoides como el Danaparoide, la Sulodexida y el Dermatán sulfato; Inhibidores directos de la trombina (II), como Argatroban, Bivalirudina, Dabigatrán, Desirudina, HIrudina, Lepirudina, Melagatrán, Ximelagatrán; inhibidores del factor Xa (como el Péptido anticoagulante Tick), como Apixabán, Otamixabán, Rivaroxabán y oligosacáridos como el Fondaparinux y el Idraparinux; antagonistas de la vitamina K, como el Acenocumarol, la Clorindiona, el Cumatetralil, el Dicumarol, la Difenadiona, el Biscumacetato de Etilo, el Fenprocumón, la Fenindiona, el Tioclomarol y la Warfarina. [0024] The reference to an "anticoagulant" includes classes of anticoagulants such as anticoagulants, antiplatelet drugs, thrombolytic and fibrinolytic drugs and metal ion chelating agents such as citrate, citrate dextrose (ACD), ethylene diamine tetra tetraacetic acid. (EDTA) and oxalate. In a related aspect, anticoagulants include heparin and glycosaminoglycans such as low molecular weight heparin, such as Bemiparin, Certoparin, Dalteparin, Enoxaparin, Nadroparin, Pamaparin, Reviparin and Tinzaparin, and heparinoids such as Danaparoid, Sulodexidate and Dermatan sulfate; Direct thrombin (II) inhibitors, such as Argatroban, Bivalirudin, Dabigatran, Desirudin, HIrudin, Lepirudin, Melagatrán, Ximelagatrán; Factor Xa inhibitors (such as Tick anticoagulant peptide), such as Apixabán, Otamixabán, Rivaroxaban and oligosaccharides such as Fondaparinux and Idraparinux; Vitamin K antagonists, such as Acenocoumarol, Chlorindione, Cumatetralil, Dicumarol, Diphenadione, Ethyl Biscumacetate, Fenprochumon, Fenindione, Thioclomarol and Warfarin.

[0025] En una realización de la presente invención, la recuperación de sangre recolectada como se dijo, puede probarse en búsqueda de la presencia de células tumorales, donde, particularmente de preferencia, se determina el tipo de antígeno asociado a un tumor mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la reacción específica de anticuerpos etiquetados ante epítopes de antígenos asociados a tumores, a fin de determinar el tipo de antígeno de tumor al que se une dicho anticuerpo y que debe aplicarse en la invención. [0025] In one embodiment of the present invention, the recovery of blood collected as stated, can be tested for the presence of tumor cells, where, particularly preferably, the type of antigen associated with a tumor is determined by known procedures. in the art, for example, by the specific reaction of antibodies labeled to epitopes of tumor associated antigens, in order to determine the type of tumor antigen to which said antibody binds and which should be applied in the invention.

[0026] Los ejemplos de tumores incluidos en la presente invención (aunque no se limitan a la misma) comprenden sarcomas y carcinomas, incluyendo el fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico y otros sarcomas, el sinovioma, mesotelioma, el tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, tumor maligno linfoide, cáncer de páncreas, de mamas (incluyendo el carcinoma de mama basal, el carcinoma ductal y el carcinoma de mama lobular), cánceres de pulmón, cáncer de ovario, de próstata, hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de tiroides medular, carcinoma de tiroides papilar, feocromocitomas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del ducto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, semioma, cáncer de vejiga y tumores del sistema nervioso central (como glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma). Los ejemplos adicionales incluyen tumores epiteliales, hematológicos y neuroedectodérmicos. [0026] Examples of tumors included in the present invention (although not limited thereto) include sarcomas and carcinomas, including fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma and other sarcomas, synovium, mesothelioma, tumor of Ewing, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon carcinoma, lymphoid malignant tumor, pancreatic cancer, breast cancer (including basal breast carcinoma, ductal carcinoma and lobular breast carcinoma), lung cancers, ovarian cancer, prostate cancer, hepatocellular, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, medullary thyroid carcinoma, papillary thyroid carcinoma, pheochromocytomas, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinomas, medullary carcinoma, carcinoma of the medullary carcinoma renal cells, hepatoma, bile duct carcinoma, choriocarcinoma, Wilms tumor, cervical cancer, Testicular tumor, semioma, bladder cancer and central nervous system tumors (such as glioma, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma, pinealoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma and retinoblastoma). Additional examples include epithelial, hematologic and neuroedectodermal tumors.

[0027] La recuperación de sangre intraoperatoria después se pone en contacto con un anticuerpo o un andamio de proteína adecuado que es capaz de detectar específicamente al menos un epítope de al menos un antígeno asociado a un tumor de al menos una célula tumoral. [0027] Intraoperative blood recovery is then contacted with an antibody or a suitable protein scaffold that is capable of specifically detecting at least one epitope of at least one antigen associated with a tumor of at least one tumor cell.

[0028] Como un requerimiento adicional, dicho anticuerpo debe ser capaz de formar una red tridimensional de al menos dichos anticuerpos y tales células tumorales contenidas en la sangre a fin de obtener agregados o asociados que consisten en dichos anticuerpos y células tumorales. En una realización más particularmente preferida de la presente invención, dicho anticuerpo también es capaz de unirse a otras células tumorales y/o células inmunitarias a fin de formar una red tridimensional de anticuerpos y células tumorales y opcionalmente células inmunitarias y más opcional o adicionalmente otras células tumorales. Debido a la composición, estructura y tamaño de dichos asociados que resultan de la formación de complejos multicelulares, los asociados son capaces de ser eliminados de dicha RSI mediante centrifugación o filtración, o una combinación de las mismas. Debe entenderse que la filtración y centrifugación son procedimientos preferidos, mientras que el experto en la materia podría reconocer otros procedimientos a fin de eliminar eficientemente dichos asociados que comprenden células tumorales residuales. [0028] As an additional requirement, said antibody must be capable of forming a three-dimensional network of at least said antibodies and such tumor cells contained in the blood in order to obtain aggregates or associates consisting of said antibodies and tumor cells. In a more particularly preferred embodiment of the present invention, said antibody is also capable of binding to other tumor cells and / or immune cells in order to form a three-dimensional network of antibodies and tumor cells and optionally immune cells and more optionally or additionally other cells. Tumor Due to the composition, structure and size of said associates that result from the formation of multicellular complexes, the associates are capable of being removed from said RSI by centrifugation or filtration, or a combination thereof. It should be understood that filtration and centrifugation are preferred procedures, while the skilled person could recognize others procedures in order to efficiently eliminate said associates comprising residual tumor cells.

[0029] La invención por lo tanto se concentra en la eliminación mecánica de asociados y agregados formados mediante la asociación y agregación de anticuerpos con antígenos asociados a tumores en células tumorales y opcionalmente células inmunitarias y/u otras células tumorales y no en la disminución de células tumorales llevando antígenos asociados a tumores mediante la destrucción de dichas células tumorales por medio de interacciones específicas de los anticuerpos y efectos inmunológicos. Mientras el uso de anticuerpos en un modo convencional como agentes inmunológicos a fin de destruir células tumorales por medio de la interacción con células inmunitarias, la invención se vuelve beneficiosa solo por la capacidad de los anticuerpos de ser capaces de hacer reticulaciones con antígenos que están, en el presente caso, ubicadas en células tumorales o fragmentos de las mismas. Por lo tanto, los efectos de la invención solo se logran por, y consisten en, la interacción de los anticuerpos con dichas células tumorales y la eliminación de la red tridimensional antes mencionada mediante procedimientos de separación centrífugos y/o de filtración. [0029] The invention therefore concentrates on the mechanical removal of associates and aggregates formed by association and aggregation of antibodies with tumor associated antigens in tumor cells and optionally immune cells and / or other tumor cells and not in the decrease of tumor cells carrying tumor associated antigens by destroying said tumor cells through specific interactions of antibodies and immunological effects. While the use of antibodies in a conventional manner as immunological agents in order to destroy tumor cells through interaction with immune cells, the invention becomes beneficial only by the ability of the antibodies to be able to cross-link with antigens that are, in the present case, located in tumor cells or fragments thereof. Therefore, the effects of the invention are only achieved by, and consist of, the interaction of the antibodies with said tumor cells and the elimination of the aforementioned three-dimensional network by centrifugal separation and / or filtration procedures.

[0030] Si bien en los procedimientos conocidos en la materia los anticuerpos o moléculas del tipo de anticuerpos pueden unirse a componentes magnéticos como perlas magnéticas u otros elementos estructurales que facilitan la eliminación de complejos de anticuerpos por medio de dichos elementos estructurales, o las células tumorales son eliminadas por procedimientos de clasificación de células como la citometría de flujo, estas realizaciones han sido excluidas de la presente invención. Solo debido a la formación de una red tridimensional de anticuerpos con antígenos, como los antígenos asociados a un tumor, en células tumorales o fragmentos de las mismas, y, opcionalmente, células inmunitarias y/u otras células tumorales, una eliminación mecánica de dichos asociados resulta posible. Por consiguiente, el anticuerpo o la proteína de andamiaje no se asocia con ningún otro componente estructural como perlas magnéticas o moléculas fluorescentes que pueden facilitar dicha eliminación. [0030] While in the methods known in the art antibodies or antibody-like molecules can bind to magnetic components such as magnetic beads or other structural elements that facilitate the removal of antibody complexes by means of said structural elements, or cells Tumors are removed by cell sorting procedures such as flow cytometry, these embodiments have been excluded from the present invention. Only due to the formation of a three-dimensional network of antibodies with antigens, such as tumor-associated antigens, in tumor cells or fragments thereof, and, optionally, immune cells and / or other tumor cells, a mechanical removal of said associates It is possible. Therefore, the antibody or scaffolding protein is not associated with any other structural component such as magnetic beads or fluorescent molecules that can facilitate such removal.

[0031] La presente invención se describe y reivindica en esta invención con respecto a anticuerpos biespecíficos trifuncionales dentro de las limitaciones de la reivindicación 1, particularmente con respecto al anticuerpo biespecífico trifuncional catumaxomab, que se dirige contra el antígeno EpCAM asociado a un tumor, y que se une adicionalmente a una célula T mediante CD3 y a las células positivas del receptor Fc por medio de su porción Fc. Las realizaciones específicas que se describen en los ejemplos deben entenderse como realizaciones ejemplares que proporcionan evidencias para la factibilidad de la presente invención. Habiendo proporcionado evidencia de la excelente eliminación de células tumorales de la RSI mediante catumaxumab, se ha dado prueba del concepto para el principio en el que se basa el procedimiento reivindicado. Habiendo proporcionado esta evidencia, el experto en la materia inevitablemente tendrá la posibilidad de extender el concepto a otros tumores y otros anticuerpos en la medida cubierta por la presente reivindicación 1, que son capaces de interactuar con dichas células tumorales y las células inmunitarias antes mencionadas a fin de proporcionar una red tridimensional, es decir, complejos multicelulares que pueden eliminarse, por ejemplo, mediante centrifugación y/o filtración. [0031] The present invention is described and claimed in this invention with respect to trifunctional bispecific antibodies within the limitations of claim 1, particularly with respect to catumaxomab trifunctional bispecific antibody, which is directed against the tumor associated EpCAM antigen, and which additionally binds to a T cell by CD3 and to the positive Fc receptor cells through its Fc portion. The specific embodiments described in the examples should be understood as exemplary embodiments that provide evidence for the feasibility of the present invention. Having provided evidence of the excellent removal of RSI tumor cells by catumaxumab, proof of concept has been given for the principle on which the claimed procedure is based. Having provided this evidence, the person skilled in the art will inevitably have the possibility of extending the concept to other tumors and other antibodies to the extent covered by the present claim 1, which are capable of interacting with said tumor cells and the aforementioned immune cells to in order to provide a three-dimensional network, that is, multicellular complexes that can be removed, for example, by centrifugation and / or filtration.

[0032] Los anticuerpos de la presente invención son específicamente seleccionados de anticuerpos biespecíficos trifuncionales. Un anticuerpo biespecífico se define como un anticuerpo capaz de unirse a dos tipos diferentes de antígenos; un anticuerpo triespecífico se caracteriza por unirse a tres tipos diferentes de antígenos; Un anticuerpo tetraespecífico se caracteriza por unirse a cuatro tipos diferentes de antígenos mientras que un anticuerpo multiespecífico se define como aquel capaz de unirse a múltiples tipos diferentes de antígenos. El anticuerpo biespecífico catumaxumab se define por la unión al antígeno EpCAM asociado a un tumor, por un lado, y al CD3 de una célula T, por el otro, así como también a células accesorias por medio de su parte Fc. La invención solo cubre aquellos anticuerpos que presentan el formato biespecífico trifuncional como se describe en la reivindicación 1. Todos los demás anticuerpos se describen solo para fines informativos. [0032] The antibodies of the present invention are specifically selected from trifunctional bispecific antibodies. A bispecific antibody is defined as an antibody capable of binding to two different types of antigens; a trypecific antibody is characterized by binding to three different types of antigens; A tetra-specific antibody is characterized by binding to four different types of antigens while a multi-specific antibody is defined as one capable of binding to multiple different types of antigens. The bispecific antibody catumaxumab is defined by the binding to the EpCAM antigen associated with a tumor, on the one hand, and with the CD3 of a T cell, on the other, as well as with accessory cells through its Fc part. The invention only covers those antibodies that have the trifunctional bispecific format as described in claim 1. All other antibodies are described for informational purposes only.

[0033] Los anticuerpos bi-, tri-, tetra- y multiespecéficos que se describen arriba pueden ser monovalentes, divalentes, trivalentes, tretravalentes o multivalentes. Un anticuerpo con una propiedad de unión monovalente se define como un anticuerpo que es capaz de unirse a un antígeno asociado a un tumor. Un anticuerpo monoclonal bivalente se define como un anticuerpo que es capaz de unirse a dos antígenos asociados a un tumor o un antígeno asociado a un tumor y un antígeno asociado a una célula inmunitaria. Un anticuerpo monoclonal trivalente se define como un anticuerpo que es capaz de unirse a tres antígenos diferentes asociados a un tumor o dos antígenos asociados a un tumor y un antígeno asociado a una célula inmunitaria o un antígeno asociado a un tumor y dos antígenos asociados a una célula inmunitaria. Un anticuerpo monoclonal tetravalente se define como un anticuerpo capaz de unirse a cuatro antígenos diferentes asociados a un tumor o dos antígenos diferentes asociados a un tumor, siendo que cada uno presenta dos brazos de unión de antígenos idénticos, o dos/tres antígenos asociados a un tumor y un antígeno asociado a una célula inmunitaria o dos antígenos asociados a un tumor y dos antígenos asociados a una célula inmunitaria. Un anticuerpo monoclonal multivalente se define como un anticuerpo capaz de unirse a uno o más antígenos asociados a un tumor y/o uno o más antígenos asociados a una célula inmunitaria. El término "unirse a un antígeno asociado a un tumor" se define como la unión a un epítope de dicho antígeno asociado a un tumor en una célula tumoral. La invención solo cubre aquellos anticuerpos que presentan el formato biespecífico trifuncional como se describe en la reivindicación 1. Todos los demás anticuerpos se describen solo para fines informativos. [0033] The bi-, tri-, tetra- and multispecific antibodies described above may be monovalent, divalent, trivalent, tretravalent or multivalent. An antibody with a monovalent binding property is defined as an antibody that is capable of binding to a tumor associated antigen. A bivalent monoclonal antibody is defined as an antibody that is capable of binding two antigens associated with a tumor or an antigen associated with a tumor and an antigen associated with an immune cell. A trivalent monoclonal antibody is defined as an antibody that is capable of binding to three different antigens associated with a tumor or two antigens associated with a tumor and an antigen associated with an immune cell or an antigen associated with a tumor and two antigens associated with a tumor. immune cell A tetravalent monoclonal antibody is defined as an antibody capable of binding to four different antigens associated with a tumor or two different antigens associated with a tumor, each of which has two identical antigen binding arms, or two / three antigens associated with a tumor. tumor and an antigen associated with an immune cell or two antigens associated with a tumor and two antigens associated with an immune cell. A multivalent monoclonal antibody is defined as an antibody capable of binding to one or more antigens associated with a tumor and / or one or more antigens associated with an immune cell. The term "binding to an antigen associated with a tumor" is defined as the binding to an epitope of said antigen associated with a tumor in a tumor cell. The invention only covers those antibodies that have the trifunctional bispecific format as described in claim 1. All other antibodies are described for informational purposes only.

[0034] Los ejemplos de anticuerpos con formatos biespecíficos o triespecíficos (formatos trifuncionales con propiedades de unión bivalente, trivalente y tetravalente a un antígeno asociado a un tumor y a uno o más antígenos superficiales de leucocitos, es decir, células del sistema inmunitario) descritos en Kontermann RE (ed.) Springer Heidelberg Dordrecht London New York, páginas 1-28 (2011) son importantes para esta solicitud de patente. La invención solo cubre aquellos anticuerpos que presentan el formato biespecífico trifuncional como se describe en la reivindicación 1. Todos los demás anticuerpos se describen solo para fines informativos. [0034] Examples of antibodies with bispecific or trypecific formats (trifunctional formats with bivalent, trivalent and tetravalent binding properties to an antigen associated with a tumor and one or more superficial leukocyte antigens, i.e. immune system cells) described in Kontermann RE (ed.) Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pages 1- 28 (2011) are important for this patent application. The invention only covers those antibodies that have the trifunctional bispecific format as described in claim 1. All other antibodies are described for informational purposes only.

• Formatos de anticuerpos biespecíficos con características de unión bivalente a antígenos:• Bispecific antibody formats with bivalent antigen binding characteristics:

por ejemplo, scFv (por ejemplo, clase BiTE), Db, scDb, dsDb, DART, dAb2/VHH2, derivados de botón en ojal, SEED-IgG, heteroFc- scfv, Fab-scFv, CrossMabsfor example, scFv (for example, BiTE class), Db, scDb, dsDb, DART, dAb2 / VHH2, buttonhole derivatives, SEED-IgG, heteroFc- scfv, Fab-scFv, CrossMabs

• Formatos bi-(tri-) específicos con características de unión trivalente a antígenos:• Specific bi- (tri-) formats with trivalent antigen binding characteristics:

por ejemplo, cuerpo triple, DNL-F(ab)³, ^{s c Fv} 2- ^ch1/^{c l ,} dAb³, Fab-scFv2, IgG-scFabfor example, triple body, DNL-F (ab) ³ , ^{sc Fv} 2 - ^ch 1 / ^{cl ,} dAb ³ , Fab-scFv2, IgG-scFab

• Formatos bi-(tri-) específicos con características de unión tetravalente a antígenos:• Specific bi- (tri-) formats with tetravalent antigen binding characteristics:

por ejemplo, IgG-scFv, scFv-IgG, scFv-Fc, F(ab')2-scFv2, sDb-Fc, scDb-CH3, Db-Fc, scFv2-H/L, DVD-Ig, tandAb, scFvdhlx- scFv, dAb2-IgG, mAb dos en uno, mAb², dAb-IgG, dAb-Fc-dAb.for example, IgG-scFv, scFv-IgG, scFv-Fc, F (ab ') 2-scFv2, sDb-Fc, scDb-CH3, Db-Fc, scFv2-H / L, DVD-Ig, tandAb, scFvdhlx- scFv, dAb2-IgG, two-in-one mAb, mAb ² , dAb-IgG, dAb-Fc-dAb.

[0035] En la Figura 2 incluida, se muestran ejemplos adicionales de anticuerpos. [0035] In Figure 2 included, additional examples of antibodies are shown.

[0036] En la siguiente bibliografía se describen anticuerpos adicionales: [0036] Additional antibodies are described in the following literature:

Muller D. y RE Kontermann. En: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, páginas 83-100 (2011)Muller D. and RE Kontermann. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pages 83-100 (2011)

scFv (BiTE)scFv (BiTE)

[0037] Baeuerle PA, Zugmaier G y D Ruttinger. En: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, páginas 273-288 (2011) [0037] Baeuerle PA, Zugmaier G and D Ruttinger. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pages 273-288 (2011)

DVD-IgDVD-Ig

[0038] Tarcsa E., Fraunhofer W., Ghayur T., Salfeld J. y J. Gu. En: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, páginas 171-186 (2011) [0038] Tarcsa E., Fraunhofer W., Ghayur T., Salfeld J. and J. Gu. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pages 171-186 (2011)

Derivados de DNLDNL derivatives

[0039] Chang C-H, Rossi EA, Sharkey RM, DM Goldenberg. En: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, páginas 199-216 (2011) [0039] Chang CH, Rossi EA, Sharkey RM, DM Goldenberg. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pages 199-216 (2011)

Anticuerpos dos en unoTwo in one antibodies

[0040] Koeing P y G Fuh. En: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, páginas 187-198 (2011) [0040] Koeing P and G Fuh. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pages 187-198 (2011)

CrossMabsCrossmabs

[0041] Schaefer y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 108: 11187 (2011) [0041] Schaefer et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 108: 11187 (2011)

[0042] En una realización preferida de la invención, los anticuerpos biespecíficos trifuncionales usados en la presente invención son anticuerpos monoclonales. [0042] In a preferred embodiment of the invention, the trifunctional bispecific antibodies used in the present invention are monoclonal antibodies.

[0043] Lo siguiente describe en mayor detalle los anticuerpos biespecíficos y triespecíficos trifuncionales donde solo los biespecíficos trifuncionales se usan en la invención. La invención solo cubre aquellos anticuerpos que presentan el formato biespecífico trifuncional como se describe en la reivindicación 1. Todos los demás anticuerpos se describen solo para fines informativos. [0043] The following describes in greater detail the trifunctional bispecific and trypecific antibodies where only the trifunctional bispecific are used in the invention. The invention only covers those antibodies that have the trifunctional bispecific format as described in claim 1. All other antibodies are described for informational purposes only.

[0044] Además, cabe señalar que los anticuerpos biespecíficos y triespecíficos trifuncionales se describen en esta invención también con respecto a su modo de acción en el cuerpo humano, a fin de proporcionar una definición completa de estos anticuerpos monoclonales. Sin embargo, las propiedades intrínsecas de dichos anticuerpos biespecíficos y triespecíficos trifuncionales no tienen efecto en la invención reivindicada en este documento, ya que los anticuerpos son eliminados casi por completo de la RSI, al menos hasta una medida indetectable, de modo tal que no proporcionan ningún modo de acción en el cuerpo humano después de la reinfusión de la RSI en la que se han disminuido las células tumorales. Específicamente, el procedimiento descrito en esta invención se realiza in vitro fuera del cuerpo humano, de modo tal que no pueda producirse ninguna actividad biológica intrínseca de los anticuerpos. Sin embargo, para una descripción completa, se cree que debería proporcionarse una descripción del rol que estos anticuerpos podrían desempeñar in vivo. [0044] Furthermore, it should be noted that bispecific and trifunctional trispecific antibodies are also described in this invention with respect to their mode of action in the human body, in order to provide a complete definition of these monoclonal antibodies. However, the intrinsic properties of said bispecific and trifunctional trispecific antibodies have no effect on the invention claimed herein, since the antibodies are almost completely eliminated from the RSI, at least to an undetectable extent, so that they do not provide no mode of action in the human body after the reinfusion of the RSI in which the tumor cells have decreased. Specifically, the procedure described in this invention is performed in vitro outside the human body, such that no intrinsic biological activity of the antibodies can occur. However, for a complete description, it is believed that a description of the role that these antibodies could play in vivo.

[0045] Los anticuerpos trifuncionales a usar en la presente invención son conocidos en la técnica y se describen en varios documentos. Se hace referencia, por ejemplo, a los documentos US 6.551.592, US2003223999, US2002051780 y US6210668 y a los artículos antes indicados. [0045] The trifunctional antibodies to be used in the present invention are known in the art and are described in various documents. Reference is made, for example, to US 6,551,592, US2003223999, US2002051780 and US6210668 and to the aforementioned articles.

[0046] Los anticuerpos a usar en la presente invención se caracterizan preferentemente por los efectos adicionales de: [0046] The antibodies to be used in the present invention are preferably characterized by the additional effects of:

- la activación de la célula positiva del receptor Fc mediante la unión a la misma por medio de receptores Fcy de tipo I, IIa y III (CD64 y CD16) (18) y, de este modo, la iniciación o incremento de la expresión de citocinas y/o antígenos coestimuladores; y- the activation of the positive cell of the Fc receptor by binding to it by means of Fcy receptors of type I, IIa and III (CD64 and CD16) (18) and, thus, the initiation or increase of the expression of cytokines and / or costimulatory antigens; Y

- la transferencia de, al menos, una segunda señal de activación, requerida para la activación fisiológica de la célula T, a la célula T por medio de antígenos coestimuladores y/o citocinas, con esta activación siendo indicada por la regulación hacia arriba de los marcadores de activación, destruyendo la célula tumoral y/o la proliferación de células T.- the transfer of at least a second activation signal, required for the physiological activation of the T cell, to the T cell by means of costimulatory antigens and / or cytokines, with this activation being indicated by the upward regulation of the activation markers, destroying the tumor cell and / or proliferation of T cells.

[0047] Preferentemente, los anticuerpos usados en el procedimiento y la composición de la presente invención también son capaces de activar células T específicas de un tumor, reconociendo un péptido específico de un tumor presentado en las células tumorales por la clase MHC I y/o II mediante su receptor de células T, tras la unión del anticuerpo biespecífico o triespecífico trifuncional, como se describe en esta invención. [0047] Preferably, the antibodies used in the process and the composition of the present invention are also capable of activating tumor-specific T cells, recognizing a tumor-specific peptide presented in tumor cells by the MHC class I and / or II via its T-cell receptor, after binding of the trispecific bispecific or trispecific antibody, as described in this invention.

[0048] La unión a la célula T ocurre mediante CD3, CD2, CD5, CD28 y/o CD44. Las células positivas del receptor Fc presentan al menos un receptor F^cy I, IIa o III. [0048] T cell binding occurs through CD3, CD2, CD5, CD28 and / or CD44. Fc receptor positive cells have at least one Fc ^and I, IIa or III receptor.

[0049] El anticuerpo usado según la invención es capaz de unirse a monocitos, macrófagos, células dendríticas, células destructoras naturales, neutrófilos y/o células eosinofílicas que son células positivas del receptor F^cy. [0049] The antibody used according to the invention is capable of binding monocytes, macrophages, dendritic cells, natural destructive cells, neutrophils and / or eosinophilic cells that are positive F ^cy receptor cells.

[0050] Los anticuerpos usados según la invención llevan al inicio o incremento de la expresión de CD40, CD80, CD86, ICAM-1 y/o LFA-3 siendo antígenos coestimuladores y/o la secreción de citocinas por parte de la célula positiva del receptor Fc. Preferentemente, las citocinas son IL-1, IL-2. [0050] The antibodies used according to the invention lead to the start or increase of the expression of CD40, CD80, CD86, ICAM-1 and / or LFA-3 being costimulatory antigens and / or the secretion of cytokines by the positive cell of the Fc receiver. Preferably, the cytokines are IL-1, IL-2.

[0051] Preferentemente, la unión a las células T ocurre por medio del complejo del receptor de células T de la célula T. Dicho al menos un anticuerpo biespecífico trifuncional reconoce un marcador superficial de células T seleccionadas del grupo que consiste en CD3, CD2, CD4, CD5, CD6, CD6, CD8 y CD28. [0051] Preferably, T-cell binding occurs through the T-cell T receptor complex. Said at least one trifunctional bispecific antibody recognizes a surface marker of T cells selected from the group consisting of CD3, CD2, CD4, CD5, CD6, CD6, CD8 and CD28.

[0052] Dicho antígeno asociado a un tumor al que se une el anticuerpo o proteína de andamiaje, preferentemente un anticuerpo biespecífico trifuncional, se selecciona de un grupo que consiste en: EpCAM, Her2neu, EGFR, CD30, CD20, CD22, MUC1, MUC1*, PSMA, CD33, MCSP, cMet, EphA2, Endosialina, Carboanhidrasa IX, IGF-1R, FAP-alfa, CD19, CD52, GD2, CEA, FR, proteoglicanos, G250, GC182, GT468, GT512. [0052] Said antigen associated with a tumor to which the antibody or scaffold protein binds, preferably a trifunctional bispecific antibody, is selected from a group consisting of: EpCAM, Her2neu, EGFR, CD30, CD20, CD22, MUC1, MUC1 *, PSMA, CD33, MCSP, cMet, EphA2, Endosialin, Carboanhydrase IX, IGF-1R, FAP-alpha, CD19, CD52, GD2, CEA, FR, proteoglycans, G250, GC182, GT468, GT512.

[0053] El anticuerpo biespecífico trifuncional usado en la invención, es preferentemente un anticuerpo de antígeno asociado a un anti-tumor X anti-CD3 y/o un anticuerpo de antígeno asociado a un anti-tumor X anti-CD2 y/o un anticuerpo de antígeno asociado a un anti-tumor X anti-CD5 y/o un anticuerpo de antígeno asociado a un antitumor X anti-CD28 y/o un anticuerpo de antígeno asociado a un anti-tumor X anti-CD44. [0053] The trifunctional bispecific antibody used in the invention is preferably an antigen antibody associated with an anti-CD3 anti-tumor X and / or an antigen antibody associated with an anti-CD2 anti-tumor X and / or an antibody of antigen associated with an anti-CD5 anti-tumor X and / or an antigen antibody associated with an anti-CD28 anti-tumor X and / or an antigen antibody associated with an anti-CD44 anti-tumor X.

[0054] El anticuerpo triespecífico descrito en esta invención, pero no reivindicado, es un anticuerpo de antígeno asociado a un anti-tumor X anti-CD3 y/o un anticuerpo de antígeno asociado a un anti-tumor X anti-CD2 y/o un anticuerpo de antígeno asociado a un anti-tumor X anti-CD5 y/o un anticuerpo de antígeno asociado a un anti-tumor X anti-CD28 y/o un anticuerpo de antígeno asociado a un anti-tumor X anti-CD44 que presenta un brazo de unión anti­ receptor Fc adicional. [0054] The trispecific antibody described in this invention, but not claimed, is an antigen antibody associated with an anti-CD3 anti-tumor X and / or an antigen antibody associated with an anti-CD2 anti-tumor X and / or an antigen antibody associated with an anti-CD5 anti-tumor X and / or an antigen antibody associated with an anti-CD28 anti-tumor X and / or an antigen antibody associated with an anti-CD44 anti-tumor X having an additional anti-Fc receptor binding arm.

[0055] Los anticuerpos preferidos son anticuerpos biespecíficos trifuncionales heterólogos, preferentemente monoclonales, seleccionados de entre una o más de las siguientes combinaciones de isotipos: [0055] Preferred antibodies are heterologous, preferably monoclonal, trifunctional bispecific antibodies, selected from one or more of the following combinations of isotypes:

• IgG2b de rata/IgG2a de ratón,• rat IgG2b / mouse IgG2a,

• IgG2b de rata/IgG2b de ratón, igG2b de rata/IgG3 de ratón;• rat IgG2b / mouse IgG2b, rat igG2b / mouse IgG3;

• IgG2b de rata/IgG1 de humano,• rat IgG2b / human IgG1,

• IgG2b de rata/IgG2 de humano• rat IgG2b / human IgG2

• IgG2b de rata/IgG3 de humano [alotipo oriental G3m(st)=con unión a la proteína A], IgG2b de rata/IgG4 de humano; IgG2b de rata/IgG2c de rata;• rat IgG2b / human IgG3 [eastern allotype G3m (st) = with protein A binding], rat IgG2b / human IgG4; Rat IgG2b / rat IgG2c;

• IgG2a de ratón/IgG3 de humano [alotipos caucásicos G3m(b+g)= sin unión a la proteína A, indicado en lo siguiente como *] IgG2a de ratón/[VH-CH1, V^l-CL] de ratón-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] IgG2a de ratón/[VH-CH1, VL-CL] de rata-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] IgG2a de ratón/[VH-CH1, VL-CL] de humano-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] • mouse IgG2a / human IgG3 [Caucasian G3m allotypes (b + g) = no protein A binding, indicated as *] mouse IgG2a / [VH-CH1, V ^l -CL] mouse-IgG1 from human- [hinge] -IgG3 * from human- [CH2-CH3] mouse IgG2a / [VH-CH1, VL-CL] from rat-human IgG1- [hinge] -IgG3 * from human- [CH2-CH3 ] Mouse IgG2a / [VH-CH1, VL-CL] of human-IgG1 of human- [hinge] -IgG3 * of human- [CH2-CH3]

• [VH-CH1, VL-CL] de ratón-IgG1 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de rata-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] [VH-CH1, VL-CL] de ratón-IgG4 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de rata-IgG4 de humano-[bisagra]-IgG4 de humano [región de extremo N de CH2]-IgG3* de humano [región de extremo C de CH2:>posición aa 251]-IgG3* de humano [CH3] IgG2b de rata/[VH-CH1, VL-CL] de ratón-IgG1 de humano-[bisagra-CH2-CH3]• [VH-CH1, VL-CL] of mouse-IgG1 of human / [VH-CH1, VL-CL] of rat-IgG1 of human- [hinge] -IgG3 * of human- [CH2-CH3] [VH- CH1, VL-CL] of mouse-IgG4 of human / [VH-CH1, VL-CL] of rat-IgG4 of human- [hinge] -IgG4 of human [N-end region of CH2] -IgG3 * of human [ C-end region of CH2:> position aa 251] -IgG3 * of human [CH3] rat IgG2b / [VH-CH1, VL-CL] of mouse-human IgG1- [hinge-CH2-CH3]

• IgG2b de rata/[VH-CH1, VL-CL] de ratón-IgG2 de humano-[bisagra-CH2-CH3]• rat IgG2b / [VH-CH1, VL-CL] mouse-human IgG2- [hinge-CH2-CH3]

• IgG2b de rata/[VH-CH1, VL-^c L] de ratón-IgG3 de humano-[bisagra-CH2-CH3, alotipo oriental] IgG2b de rata/[VH-CH1, VL-CL] de ratón-IgG4 de humano-[bisagra-CH2-CH3]• rat IgG2b / [VH-CH1, VL- ^c L] mouse-human IgG3- [hinge-CH2-CH3, eastern allotype] rat IgG2b / [VH-CH1, VL-CL] mouse-IgG4 human- [hinge-CH2-CH3]

• IgG1 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de humano-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] IgG1 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de rata-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG4 de humano [región de extremo N de CH2]-IgG3* de humano [región de extremo C de CH2:>posición aa 251]-IgG3* de humano [CH3]• human IgG1 / [VH-CH1, VL-CL] of human-IgG1 of human- [hinge] -IgG3 * of human- [CH2-CH3] human IgG1 / [VH-CH1, VL-CL] of rat -IgG1 of human- [hinge] -IgG4 of human [N-end region of CH2] -IgG3 * of human [C-end region of CH2:> position aa 251] -IgG3 * of human [CH3]

• IgG1 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de ratón-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG4 de humano [región de extremo N de CH2]-IgG3* de humano [región de extremo C de CH2:>posición aa 251]-IgG3* de humano [C^h3]• human IgG1 / [VH-CH1, VL-CL] mouse-human IgG1- [hinge] -IgG4 of human [N-end region of CH2] -IgG3 * of human [C-end region of CH2:> position aa 251] -IgG3 * of human [C ^h 3]

• IgG1 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de rata-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG2 de humano [región de extremo N de CH2]-IgG3* de humano [región de extremo C de CH2:>posición aa 251]-IgG3* de humano [Ch3]• human IgG1 / [VH-CH1, VL-CL] of rat-IgG1 of human- [hinge] -IgG2 of human [N-end region of CH2] -IgG3 * of human [C-end region of CH2:> position aa 251] -IgG3 * of human [Ch3]

• IgG1 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de ratón-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG2 de humano [región de extremo N de CH2]-IgG3* de humano [región de extremo C de CH2:>posición aa 251]-IgG3* de humano [C^h3]• human IgG1 / [VH-CH1, VL-CL] mouse-human IgG1- [hinge] -IgG2 of human [N-end region of CH2] -IgG3 * of human [C-end region of CH2:> position aa 251] -IgG3 * of human [C ^h 3]

• IgG1 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de rata-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] IgG1 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de ratón-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] IgG2 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de humano-IgG2 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] IgG4 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de humano-IgG4 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] IgG4 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de humano-IgG4 de humano-[bisagra]-IgG4 de humano [región de extremo N de CH2]-IgG3* de humano [región de extremo C de CH2:>posición aa 251]-IgG3* de humano [CH3]• human IgG1 / [VH-CH1, VL-CL] rat-human IgG1- [hinge] -IgG3 * human- [CH2-CH3] human IgG1 / [VH-CH1, VL-CL] -IgG1 of human- [hinge] -IgG3 * of human- [CH2-CH3] IgG2 of human / [VH-CH1, VL-CL] of human-IgG2 of human- [hinge] -IgG3 * of human- [CH2 -CH3] human IgG4 / [VH-CH1, VL-CL] of human-IgG4 of human- [hinge] -IgG3 * of human- [CH2-CH3] human IgG4 / [VH-CH1, VL-CL] of human-IgG4 of human- [hinge] -IgG4 of human [N-end region of CH2] -IgG3 * of human [C-end region of CH2:> position aa 251] -IgG3 * of human [CH3]

• IgG2b de ratón/[VH-CH1, VL-CL] de rata-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] IgG2b de ratón/[VH-CH1, VL-CL] de humano-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] IgG2b de ratón/[VH-CH1, VL-CL] de ratón-IgG1 de humano-[bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3]• mouse IgG2b / [VH-CH1, VL-CL] from rat-human IgG1- [hinge] -IgG3 * from human- [CH2-CH3] mouse IgG2b / [VH-CH1, VL-CL] from human -IgG1 of human- [hinge] -IgG3 * of human- [CH2-CH3] mouse IgG2b / [VH-CH1, VL-CL] mouse-human IgG1- [hinge] -IgG3 * of human- [CH2 -CH3]

[0056] El anticuerpo biespecífico trifuncional con especificidades de unión monovalente usado en la presente invención cuenta con las siguientes propiedades: [0056] The trifunctional bispecific antibody with monovalent binding specificities used in the present invention has the following properties:

a) unión a una célula T;a) binding to a T cell;

b) unión a un antígeno asociado a un tumor o a una célula tumoral;b) binding to an antigen associated with a tumor or a tumor cell;

c) unión por medio de su porción Fc a una célula positiva de un receptor Fc;c) binding by means of its Fc portion to a positive cell of an Fc receptor;

el anticuerpo biespecífico trifuncional es más preferentemente seleccionado de un grupo de anticuerpos con las siguientes combinacionesthe trifunctional bispecific antibody is more preferably selected from a group of antibodies with the following combinations

de isotipos:of isotypes:

IgG2b de rata/IgG2a de ratón,Rat IgG2b / mouse IgG2a,

IgG2b de rata/IgG2b de ratón,Rat IgG2b / mouse IgG2b,

IgG2b de rata/IgG1 de humano,Rat IgG2b / human IgG1,

[VH-CH1; VL-CL] de ratón-IgG1 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de rata-IgG1 de humano [bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] [* = G3m(b+g) de alotipos caucásicos = sin unión a la proteína A].[VH-CH1; VL-CL] of mouse-IgG1 of human / [VH-CH1, VL-CL] of rat-IgG1 of human [hinge] -IgG3 * of human- [CH2-CH3] [* = G3m (b + g) of Caucasian allotypes = no protein A binding].

[0057] Resulta específicamente preferido un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo biespecífico trifuncional y/o una proteína de andamiaje dirigida contra EpCAM y CD3 con la combinación de isotipos IgG2b de rata/IgG2a de ratón. Un ejemplo preferido para dicho anticuerpo biespecífico trifuncional es catumaxomab. Preferentemente, dicho anticuerpo es monoclonal. [0057] An antibody is preferably preferred, preferably a trifunctional bispecific antibody and / or a scaffolding protein directed against EpCAM and CD3 with the combination of rat IgG2b / mouse IgG2a isotypes. A preferred example for said trifunctional bispecific antibody is catumaxomab. Preferably, said antibody is monoclonal.

[0058] Preferentemente, los anticuerpos según la invención son anticuerpos intactos monoclonales, quiméricos, recombinantes, sintéticos, semisintéticos o químicamente modificados que presentan, por ejemplo, fragmentos Fv, Fab, scFV o F (ab)2. [0058] Preferably, the antibodies according to the invention are intact monoclonal, chimeric, recombinant, synthetic, semi-synthetic or chemically modified antibodies that have, for example, Fv, Fab, scFV or F (ab) 2 fragments.

[0059] En el procedimiento de la presente invención, también es posible usar anticuerpos o derivados o fragmentos de origen humano, o bien anticuerpos modificados a fin de que sean adecuados para el uso en humanos (los denominados "anticuerpos humanizados") (véase, por ejemplo, Shalaby y col., J. Exp. Med. 175 (1992), 217; Mocikat y col., Transplantation 57 (1994), 405). [0059] In the process of the present invention, it is also possible to use antibodies or derivatives or fragments of human origin, or modified antibodies so that they are suitable for use in humans (so-called "humanized antibodies") (see, for example, Shalaby et al., J. Exp. Med. 175 (1992), 217; Mocikat et al., Transplantation 57 (1994), 405).

[0060] La preparación de los diferentes tipos de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos mencionados anteriormente resultará obvia para un profesional experto. La preparación de anticuerpos monoclonales preferentemente de origen mamífero, por ejemplo, de humanos, ratas, ratones, conejos o cabras, puede llevarse a cabo usando procedimientos convencionales, por ejemplo, como aquellos descritos en Kohler y Milstein (Nature 256 (1975), 495), in Harlow y Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor) o en Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3). [0060] The preparation of the different types of antibodies and antibody fragments mentioned above will be obvious to an expert professional. The preparation of monoclonal antibodies preferably of mammalian origin, for example, from humans, rats, mice, rabbits or goats, can be carried out using conventional methods, for example, such as those described in Kohler and Milstein (Nature 256 (1975), 495 ), in Harlow and Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor) or in Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3).

[0061] Incluso es posible preparar los anticuerpos descritos por medio de tecnología de ADN recombinante según las técnicas obvias para el profesional experto (véase Kurucz y col., J. Immunol. 154 (1995), 4576; Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90 (1993), 6444). [0061] It is even possible to prepare the antibodies described by recombinant DNA technology according to techniques obvious to the skilled professional (see Kurucz et al., J. Immunol. 154 (1995), 4576; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 6444).

[0062] La preparación de anticuerpos que presentan dos especificidades diferentes, los denominados anticuerpos biespecíficos, puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando tecnología de ADN recombinante, pero también mediante la denominada técnica de fusión de hibridoma híbrido (véase, por ejemplo, MIlstein y col., Nature 305 (1983), 537). Esta técnica consiste en fusionar líneas celulares de hibridoma, en las que cada una de ellas produce anticuerpos que presentan una de las especificidades deseadas, e identificar y aislar las líneas celulares recombinantes que producen anticuerpos que presentan ambas especificidades. [0062] The preparation of antibodies having two different specificities, the so-called bispecific antibodies, can be carried out, for example, using recombinant DNA technology, but also by the so-called hybrid hybridoma fusion technique (see, for example, MIlstein et al., Nature 305 (1983), 537). This technique consists in fusing hybridoma cell lines, in which each one produces antibodies that have one of the desired specificities, and identifies and isolates the recombinant cell lines that produce antibodies that have both specificities.

[0063] Según la invención, hay anticuerpos biespecíficos intactos usados. Los anticuerpos biespecíficos intactos se componen de dos semimoléculas de anticuerpo (donde cada una presenta una cadena de inmunoglobulina H y una L), con cada una representando una especificidad, y adicionalmente como anticuerpos normales presentando una porción Fc que realiza las bien conocidas funciones de efector. Preferentemente se preparan usando la tecnología de cuadroma. Este procedimiento de preparación se ejemplifica en DE-A-44 19399. Para su completa descripción, este documento es incorporado en su totalidad como bibliografía al respecto de una definición de anticuerpos biespecíficos. Debe entenderse que otros procedimientos de preparación también resultan útiles si llevan a los anticuerpos biespecíficos intactos según la definición anterior requerida según la invención. [0063] According to the invention, there are intact bispecific antibodies used. The intact bispecific antibodies are composed of two antibody half-molecules (where each one has a chain of immunoglobulin H and one L), with each representing a specificity, and additionally as normal antibodies presenting an Fc portion that performs the well-known effector functions . They are preferably prepared using quadroma technology. This preparation procedure is exemplified in DE-A-44 19399. For its full description, this document is incorporated in its entirety as a bibliography regarding a definition of bispecific antibodies. It should be understood that other preparation procedures are also useful if they carry intact bispecific antibodies according to the previous definition required according to the invention.

[0064] Por ejemplo, es posible producir anticuerpos biespecíficos intactos en cantidades suficientes usando un procedimiento de preparación recientemente desarrollado (Lindhofer y col., J. Immunology, 155:219 (1995)). La combinación de dos anticuerpos biespecíficos dirigidos contra dos antígenos diferentes asociados a un tumor (por ejemplo, c-erb-B2, EpCAM, como GA-733-2=C215) en las células de carcinoma mamario minimiza el riesgo de que las células tumorales que expresan solo uno de los antígenos permanece sin identificar. [0064] For example, it is possible to produce intact bispecific antibodies in sufficient quantities using a newly developed preparation procedure (Lindhofer et al., J. Immunology, 155: 219 (1995)). The combination of two bispecific antibodies directed against two different antigens associated with a tumor (for example, c-erb-B2, EpCAM, such as GA-733-2 = C215) in breast carcinoma cells minimizes the risk of tumor cells that express only one of the antigens remains unidentified.

[0065] De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, los anticuerpos o las proteínas de andamiaje que reconocen los antígenos asociados a un tumor en una célula tumoral no se unen a o por cualquier medio como partículas o perlas magnéticas que podrían haber sido usadas en la técnica como una herramienta a fin de eliminar asociados que se forman por medio de la unión de dichos anticuerpos a tales células tumorales y, opcionalmente, a células inmunitarias. Además, la técnica anterior describe el etiquetado de las células tumorales o los anticuerpos con, por ejemplo, sustancias cromogénicas como fluorocromas seguidos de una clasificación celular, como la citometría de flujo. Al contrario de eso, el principio de la invención recae en la formación de redes tridimensionales (asociados) como se describió anteriormente de un tamaño suficiente para ser retenidas por los filtros o separadas por las fuerzas centrífugas y para la eliminación directa de dichas redes a través de medios mecánicos como filtración o centrifugación o una combinación de las mismas. El tamaño de los asociados formados por la interacción de los anticuerpos presenta una magnitud que permite su eliminación mediante filtración o centrifugación. Las realizaciones con perlas magnéticas o herramientas similares que se unen a los anticuerpos o las células tumorales como medios auxiliares indirectos para eliminar los asociados entre los anticuerpos y las células tumorales han sido excluidas de la presente invención. Los procedimientos de separación como los procedimientos citométricos de flujo donde las células tumorales son separadas de las normales también han sido excluidos de la invención. [0065] In accordance with the method of the present invention, the antibodies or scaffolding proteins that recognize the antigens associated with a tumor in a tumor cell do not bind to or by any means such as particles or magnetic beads that could have been used in the technique as a tool in order to eliminate associates that are formed by binding said antibodies to such tumor cells and, optionally, to immune cells. In addition, the prior art describes the labeling of tumor cells or antibodies with, for example, chromogenic substances such as fluorochromes followed by a cellular classification, such as flow cytometry. Contrary to that, the principle of the invention lies in the formation of three-dimensional (associated) networks as described above of a size sufficient to be retained by the filters or separated by centrifugal forces and for the direct elimination of said networks through of mechanical means such as filtration or centrifugation or a combination thereof. The size of the associates formed by the interaction of the antibodies has a magnitude that allows their elimination by filtration or centrifugation. Embodiments with magnetic beads or similar tools that bind to antibodies or tumor cells as indirect auxiliary means for eliminating those associated between antibodies and tumor cells have been excluded from the present invention. Separation procedures such as flow cytometric procedures where tumor cells are separated from normal ones have also been excluded from the invention.

Puesta en contacto del anticuerpo y/o proteína de andamiaje con la RSIContact of the antibody and / or scaffolding protein with the RSI

[0066] En el entendido de que cualquiera de los anticuerpos no pueda unirse a las células inmunitarias salvo que sean antígenos diferentes o idénticos asociados a un tumor, es de crucial importancia que haya una reticulación entre al menos dos células tumorales diferentes a fin de obtener asociados entre el anticuerpo y al menos dos células tumorales. [0066] In the understanding that any of the antibodies cannot bind to immune cells unless they are different or identical antigens associated with a tumor, it is crucial that there is a cross-linking between at least two different tumor cells in order to obtain associated between the antibody and at least two tumor cells.

[0067] Los términos "asociados", "complejos multicelulares" y "agregados" se usan indistintamente y siempre definen una red tridimensional entre anticuerpos, células tumorales y/o células inmunitarias y/o más células tumorales a fin de formar células tumorales reticulares que pueden ser eliminadas por centrifugación o filtración, o una combinación de las mismas. Dichos asociados específicamente comprenden: [0067] The terms "associated", "multicellular complexes" and "aggregates" are used interchangeably and always define a three-dimensional network between antibodies, tumor cells and / or immune cells and / or more tumor cells in order to form reticular tumor cells that they can be removed by centrifugation or filtration, or a combination thereof. Such associates specifically include:

a) anticuerpos, células tumorales y células inmunitarias y/oa) antibodies, tumor cells and immune cells and / or

b) anticuerpos y células tumorales.b) antibodies and tumor cells.

[0068] Dicho al menos un anticuerpo se pone en contacto con dicha recuperación de sangre obtenida interaoperatoriamente por un período de tiempo que es suficiente para reticular células tumorales y opcionalmente células inmunitarias y/u otras células tumorales a fin de obtener asociados. Dichas células tumorales y las células inmunitarias antes mencionadas están potencialmente presentes en tal recuperación de sangre obtenida intraoperatoriamente. Dichas células tumorales son específicamente reconocidas por dicho al menos un anticuerpo de dicha al menos única proteína de andamiaje. [0068] Said at least one antibody is contacted with said blood recovery obtained intraoperatively for a period of time that is sufficient to cross-link tumor cells and optionally immune cells and / or other tumor cells in order to obtain associates. Said tumor cells and the aforementioned immune cells are potentially present in such intraoperatively obtained blood recovery. Said tumor cells are specifically recognized by said at least one antibody of said at least single scaffolding protein.

[0069] El período de tiempo necesario para alcanzar dicha reticulación puede ser determinado por un experto en la materia a través de procedimientos de rutina. El período de tiempo usado en la invención es de 10 a 180 minutos. En general, un período de contacto es de 10 a 118 minutos, preferentemente de entre 20 y 90 minutos y más preferentemente de 30 a 60 minutos. La temperatura es preferentemente ambiente, la cual puede oscilar entre 19 y 25°C, preferentemente alrededor de 21 °C. [0069] The period of time necessary to achieve such cross-linking can be determined by an expert in the matter through routine procedures. The period of time used in the invention is 10 to 180 minutes. In general, a contact period is 10 to 118 minutes, preferably between 20 and 90 minutes and more preferably 30 to 60 minutes. The temperature is preferably ambient, which can range between 19 and 25 ° C, preferably around 21 ° C.

[0070] La cantidad de anticuerpos que deban aplicarse a fin de obtener dichos asociados que comprendan anticuerpos puede ser determinados por un experto en la materia a través de mediciones rutinarias. La cantidad de anticuerpo y/o proteína de andamiaje a aplicar generalmente depende de la afinidad de unión y/o proteína de andamiaje a dicho antígeno de tumor. Más cantidades son de 1 pg a 20 pg por litro de RSI, más preferentemente de 1 pg a 10 pg por litro de RSI, de 1 pg a 5 pg por litro de RSI o de 1 pg a 2 pg por litro de RSI. [0070] The amount of antibodies to be applied in order to obtain said associates comprising antibodies can be determined by a person skilled in the art through routine measurements. The amount of scaffold antibody and / or protein to be applied generally depends on the affinity of binding and / or scaffolding protein to said tumor antigen. More quantities are from 1 pg to 20 pg per liter of RSI, more preferably from 1 pg to 10 pg per liter of RSI, from 1 pg to 5 pg per liter of RSI or from 1 pg to 2 pg per liter of RSI.

[0071] A fin de optimizar dicho procedimiento, se aplican al menos dos anticuerpos y/o proteínas de andamiaje diferentes, de los que la especificidad del antígeno del tumor o especificidad del marcador de superficie de célula T difiere entre sí, siempre que al menos alguno de los anticuerpos caiga dentro de las limitaciones de la reivindicación 1. [0071] In order to optimize said procedure, at least two different antibodies and / or scaffolding proteins are applied, of which the tumor antigen specificity or T cell surface marker specificity differs from each other, provided that at least any of the antibodies falls within the limitations of claim 1.

Eliminación de células tumorales y asociados de anticuerpos/proteínas de andamiaje de la RSIElimination of tumor cells and associated antibody / scaffold proteins of the RSI

[0072] Los asociados son eliminados finalmente de dicha recuperación de sangre obtenida intraoperatoriamente (RSI) a fin de obtener una RSI que se encuentra esencialmente libre de células tumorales. La disminución de dichos agregados celulares se logra preferentemente por centrifugación, filtración o una combinación de las mismas. En un procedimiento preferido, se incluye al menos una etapa de centrifugación y más preferentemente al menos una etapa de filtración. [0072] Associates are finally eliminated from said intraoperatively obtained blood recovery (RSI) in order to obtain an RSI that is essentially free of tumor cells. The decrease of said cell aggregates is preferably achieved by centrifugation, filtration or a combination thereof. In a preferred method, at least one centrifugation stage and more preferably at least one filtration stage is included.

[0073] La filtración es, generalmente, una reducción de leucocitos o filtración de disminución donde todos los leucocitos contaminados por dichas células tumorales son eliminados mientras los eritrocitos pasan el filtro y son recolectados. Los filtros pueden seleccionarse entre filtros de pantalla con tamaños de poros entre 20 y 40 pm, los cuales retienen los asociados formados por el procedimiento de la invención y también, por ejemplo, hebras de fibrina y mata de células muertas. Los eritrocitos que presentan alrededor de 8 pm de tamaño pueden pasar a través de los filtros. Los filtros de microagregados se usan normalmente para la reinfusión de sangre autóloga eliminada y recolectada durante o después de la cirugía. A fin de recibir glóbulos rojos reducidos en leucocitos, se usará la filtración a través de un filtro de sangre estándar con un tamaño de poros de entre 170 y 260 pm. [0073] Filtration is generally a reduction of leukocytes or decrease filtration where all leukocytes contaminated by said tumor cells are removed while the erythrocytes pass the filter and are collected. The filters can be selected from screen filters with pore sizes between 20 and 40 pm, which retain the associates formed by the process of the invention and also, for example, fibrin strands and kill dead cells. Erythrocytes that are about 8 pm in size can pass through the filters. Microaggregated filters are normally used for reinfusion of autologous blood removed and collected during or after surgery. In order to receive reduced red blood cells in leukocytes, filtration through a standard blood filter with a pore size between 170 and 260 pm will be used.

[0074] Una revisión que describe los dispositivos de recuperación de células, incluyendo los procedimientos de separación es la de Carless PA, Henry DA, Moxey AJ, O'Connell D, Brown T, Fergusson DA, Cell salvage for minimizing perioperative allogeneic blood transfusion, 2010, The Cochrane Collaboration, John Wiley & Sons, Ltd. la cual ha sido incorporada en su totalidad en la bibliografía. [0074] A review describing cell recovery devices, including separation procedures is that of Carless PA, Henry DA, Moxey AJ, O'Connell D, Brown T, Fergusson DA, Cell salvage for minimizing perioperative allogeneic blood transfusion , 2010, The Cochrane Collaboration, John Wiley & Sons, Ltd. which has been incorporated in its entirety in the bibliography.

[0075] Un ejemplo de un filtro de sangre de microagregados a fin de recibir solo una fracción que contiene eritrocitos es el Filtro de transfusión sanguínea Pall SQ 40S. [0075] An example of a microaggregate blood filter in order to receive only a fraction containing erythrocytes is the Pall SQ 40S Blood Transfusion Filter.

[0076] La centrifugación se realiza generalmente mediante una etapa de centrifugación en gradiente de densidad seguida de un lavado con suero fisiológico por un tiempo y con una velocidad de rotación suficiente para eliminar dichos asociados que comprenden las células tumorales y para separar los eritrocitos de dichos asociados de células tumorales y, opcionalmente, de los leucocitos. [0076] Centrifugation is generally carried out by a density gradient centrifugation step followed by a physiological serum wash for a time and with a rotation speed sufficient to eliminate said associates comprising the tumor cells and to separate the erythrocytes from said associated with tumor cells and, optionally, leukocytes.

[0077] La filtración se realiza generalmente por un período de tiempo suficiente para eliminar dichos asociados que comprenden las células tumorales y para separar los eritrocitos de tales asociados de células tumorales y, opcionalmente, de los leucocitos. [0077] Filtration is generally carried out for a period of time sufficient to eliminate said associates comprising the tumor cells and to separate the erythrocytes of such associates from tumor cells and, optionally, from the leukocytes.

[0078] En una realización preferida, dicho concentrado de eritrocitos libre de células tumorales contaminantes se usa sin la adición de suero fisiológico. [0078] In a preferred embodiment, said free erythrocyte concentrate tumor cell contaminants is used without the addition of saline.

[0079] Pueden usarse etapas de filtración adicionales a fin de eliminar asociados residuales y/o leucocitos. [0079] Additional filtration steps may be used in order to eliminate residual associates and / or leukocytes.

[0080] Como la tecnología de filtración de leucocitos subyacentes es diferente de los procedimientos de filtración clasificados por micrones, incluyendo los problemas de obstrucción, esta estrategia de eliminación de células tumorales parece ser factible. [0080] Because the underlying leukocyte filtration technology is different from filtration procedures classified by microns, including obstruction problems, this tumor cell removal strategy seems to be feasible.

[0081] Uno de los beneficios de la invención es que el tiempo involucrado para dicha eliminación de células tumorales se reduce drásticamente con la invención, en comparación con la disminución de células tumorales mediante la destrucción de anticuerpos o por la eliminación con perlas magnéticas o procedimientos de clasificación de células. [0081] One of the benefits of the invention is that the time involved for said removal of tumor cells is drastically reduced with the invention, compared to the decrease of tumor cells by destruction of antibodies or by removal with magnetic beads or procedures. of cell classification.

[0082] Los productos sanguíneos obtenidos con el uso del procedimiento de la invención después son readministrados al paciente del que se obtuvo la muestra de sangre inicial. [0082] The blood products obtained with the use of the method of the invention are then readministrated to the patient from whom the initial blood sample was obtained.

EjemplosExamples

Eliminación de células tumorales mediada por anti-EpCAM a través de la disminución de complejos multicelulares por centrifugación y/o filtración durante la RSIElimination of anti-EpCAM-mediated tumor cells through the decrease of multicellular complexes by centrifugation and / or filtration during RSI

[0083] Los perfiles de expresión de la glicoproteína transmembrana EpCAM clasificada por teñido de micromatrices de tejido ocurre en carcinomas de varios tumores (Tabla 3). Este patrón EpCAM de amplia expresión representa una interesante marca distintiva de carcinomas que podría ser no solo considerable para su aplicación terapéutica, sino también para protocolos mejorados de RSI durante cirugías de cáncer. Sin embargo, cabe señalar que la mayoría de los tumores de tejidos blandos y todos los linfomas fueron completamente negativos para EpCAM. [0083] EpCAM transmembrane glycoprotein expression profiles classified by tissue microarray staining occurs in carcinomas of several tumors (Table 3). This broadly expressed EpCAM pattern represents an interesting distinctive brand of carcinomas that could be not only considerable for therapeutic application, but also for enhanced RSI protocols during cancer surgeries. However, it should be noted that most of the soft tissue tumors and all lymphomas were completely negative for EpCAM.

Tabla 3. Table 3. Micromatriz de tejido: Perfil de expresión en varias entidades tumoralesTissue microarray: Expression profile in several tumor entities ______ ________________ Entidad Número de Expresión Expresión débil/ Expre______ ________________ Entity Expression Number Weak Expression / Expre

tumoral muestras (n) negativa (%) moderada# (%) fuerte Tumor samples (n) negative (%) moderate # (%) strong

Prostética1 Prosthetic1

414

11,9

10,9

87,2

414

11.9

10.9

87.2

Colon1 Colon1

1186

0,3

1,9

197,7

1186

0.3

1.9

197.7

Pulmón1Lung1

1287

13,5

22,5

63,9

1287

13.5

22.5

63.9

Gástrica1Gastric1

473

2,5

6,8

90,7

473

2.5

6.8

90.7

Ovárica2Ovarian2

272 2,6

12,1

85,3 272 2.6

12.1

85.3

1 Datos extraídos de Went y col., Brit. J. Cancer 94: 128, 2006.

1 Data extracted from Went et al., Brit. J. Cancer 94: 128, 2006.

2 Datos extraídos de Spizzo y col., Gyneological Oncology 103: 483, 2006.2 Data extracted from Spizzo et al., Gyneological Oncology 103: 483, 2006.

# Puntuación 1-4; La expresión de EpCAM se definió mediante el cálculo de la puntuación total de teñido como el producto de una puntuación de proporción (0-4) y una puntuación de intensidad (0­ 3) La puntuación de proporción describe la fracción estimada de células tumorales teñidas# Score 1-4; EpCAM expression was defined by calculating the total dyeing score as the product of a proportion score (0-4) and an intensity score (0 3) The proportion score describes the estimated fraction of stained tumor cells

positivas (0, ninguna; 1, <10 %; 2, 10-50 %; 3, 50-80 %; 4, >80 %). La puntuación de intensidad representa la intensidad de teñido estimada (0, sin teñido; 1, débil; 2, moderada; 3, fuerte).positive (0, none; 1, <10%; 2, 10-50%; 3, 50-80%; 4,> 80%). The intensity score represents the estimated dyeing intensity (0, no dyeing; 1, weak; 2, moderate; 3, strong).

* Puntuación > 4; la puntuación de expresión total osciló entre 0 y 12, por consiguiente, la sobreexpresión de EpCAM se definió como una puntuación total de > 4._______________________ * Score> 4; the total expression score ranged from 0 to 12, therefore, overexpression of EpCAM was defined as a total score of> 4 ._______________________

3.1. Cálculos para la aplicación in vitro de catumaxomab anti-EpCAM durante la RSI3.1. Calculations for in vitro application of catumaxomab anti-EpCAM during RSI

[0084] Nuestra hipótesis de investigación es que las células tumorales, presentes en grandes complejos multicelulares mediados por catumaxomab (véanse las Fig. 1 y 2), podrían eliminarse de manera eficiente mediante centrifugación y/o filtros de leucocitos (por ejemplo, el RC400 u otros filtros de disminución de leucocitos de tecnología de punta de Pall), en contraste con las células tumorales que solo flotan en suspensiones celulares simples antes de la filtración. [0084] Our research hypothesis is that tumor cells, present in large multicellular complexes mediated by catumaxomab (see Figs. 1 and 2), could be efficiently removed by centrifugation and / or leukocyte filters (for example, RC400 or other leukocyte reduction filters from Pall's state-of-the-art technology), in contrast to tumor cells that only float in simple cell suspensions before filtration.

[0085] En base a los cálculos siguientes, daremos especificaciones para la formación mediada por catumaxomab de grandes complejos celulares. Un litro de sangre recolectada intraoperatoriamente (sangre periférica) contiene aproximadamente 5x1012 eritrocitos, 5x109 leucocitos (incluyendo una proporción de 34 % linfocitos con aproximadamente un 80 % de células T CD3+) (Hansen, TATM 2: 472, 2003; Labor und Diagnose editado por L. Thomas, TH-Books Verlagsgesellschaft mbh, Frankfurt/Main, 2000). Por consiguiente, los adultos jóvenes presentan alrededor de 1.3x109 células T CD3+ por litro de sangre periférica o RSI. El volumen de sangre RSI de una cirugía de cáncer también podría contener células tumorales residuales en un 10 a un 107. Suponiendo que una célula T muestra alrededor de 105 moléculas CD3 en su superficie (Ginaldi y col. Br. J. Haematol. 93: 921, 1996) y que solo el 3 % de las moléculas CD3 son suficientes para el redireccionamiento mediado por catumaxomab de las células T a las células tumorales, por consiguiente, se requerirá al menos 1 pg (que representa 1012 moléculas) del anticuerpo anti-EpCAM/anti-CD3 biespecífico trifuncional catumaxomab para la unión cuantitativa a 1.3x109 células T. Según estos cálculos, debería usarse 1-5 pg de catumaxomab por 1 litro de muestra de RSI para la formación de grandes complejos celulares que consisten en 107 (hasta 108 células tumorales en base a las consideraciones de seguridad) células tumorales que expresan EpCAM unidas a alrededor de 109 células T CD3. Además, en una proporción similar, catumaxomab también interactuaría con el receptor Fc gamma tipo I, IIa y tipo III de células accesorias como macrófagos, células destructoras naturales y monocitos que podrían agrandar estos complejos multicelulares incluso en mayor medida. [0085] Based on the following calculations, we will give specifications for the formation mediated by catumaxomab of large cell complexes. One liter of intraoperatively collected blood (peripheral blood) contains approximately 5x1012 erythrocytes, 5x109 leukocytes (including a proportion of 34% lymphocytes with approximately 80% CD3 + T cells) (Hansen, TATM 2: 472, 2003; Labor und Diagnose edited by L. Thomas, TH-Books Verlagsgesellschaft mbh, Frankfurt / Main, 2000). Consequently, young adults have about 1.3x109 CD3 + T cells per liter of peripheral blood or RSI. The RSI blood volume of a cancer surgery could also contain residual tumor cells in 10 to 107. Assuming that a T cell shows about 105 CD3 molecules on its surface (Ginaldi et al. Br. J. Haematol. 93: 921, 1996) and that only 3% of the CD3 molecules are sufficient for catumaxomab-mediated redirection of T cells to tumor cells, therefore, at least 1 pg (representing 1012 molecules) of the anti-antibody will be required Epiphane / anti-CD3 bispecific trifunctional catumaxomab for quantitative binding to 1.3x109 T cells. According to these calculations, 1-5 pg of catumaxomab should be used per 1 liter of RSI sample for the formation of large cell complexes consisting of 107 (up to 108 tumor cells based on safety considerations) cells Tumors expressing EpCAM bound to about 109 CD3 T cells. In addition, in a similar proportion, catumaxomab would also interact with the Fc gamma receptor type I, IIa and type III of accessory cells such as macrophages, natural destructive cells and monocytes that could enlarge these multicellular complexes even to a greater extent.

En resumen, la concentración de catumaxomab de 1-5 ug por litro de RSI aseguraría la formación de grandes complejos celulares que contengan hasta 108 células tumorales.In summary, the concentration of catumaxomab of 1-5 ug per liter of RSI would ensure the formation of large cell complexes containing up to 108 tumor cells.

[0086] Cabe señalar que los filtros de reducción de leucocitos no se clasifican por micrones, sino por su efectividad para reducir leucocitos. La filtración se basa principalmente en un número de mecanismos, incluyendo la adsorción de los leucocitos al medio de filtración. Las reivindicaciones de efectividad para los filtros de reducción de leucocitos de alta efectividad Pall Purecell® se basan en los datos de rendimiento, usando conteos residuales de leucocitos promedios (véase el Apéndice). Por el contrario, los filtros de microagregados Pall SQ40S para la transfusión sanguínea se clasifican en 40 micrones. Los filtros de microagregados Pall son un filtro de tipo pantalla, y la filtración se basa en la intercepción directa a fin de retener partículas y microagregados. Los filtros de microagregados Pall son indicados para la transfusión de sangre almacenada, concentrados de glóbulos rojos, plaquetas y una solución de limpieza de órganos y almacenamiento. Si bien los filtros Pall SQ40S retienen microagregados que consisten en leucocitos no viables, no alcanzan los bajos niveles residuales posibles con los filtros de reducción de leucocitos Pall (véase el Apéndice). [0086] It should be noted that leukocyte reduction filters are not classified by microns, but by their effectiveness in reducing leukocytes. Filtration is mainly based on a number of mechanisms, including adsorption of leukocytes to the filtration medium. The effectiveness claims for Pall Purecell® high-efficiency leukocyte reduction filters are based on performance data, using average residual leukocyte counts (see Appendix). In contrast, Pall SQ40S microaggregate filters for blood transfusion are classified as 40 microns. Pall microaggregate filters are a screen type filter, and filtration is based on direct interception in order to retain particles and microaggregates. Pall microaggregate filters are indicated for transfusion of stored blood, red blood cell concentrates, platelets and an organ cleaning and storage solution. While Pall SQ40S filters retain microaggregates consisting of non-viable leukocytes, they do not reach the lowest possible residual levels with Pall leukocyte reduction filters (see Appendix ).

[0087] A fin de analizar la capacidad de eliminación de células tumorales de una estrategia combinada de catumaxomab/disminución de leucocitos durante la RSI con un dispositivo automático (por ejemplo, Cell-Saver-5®), se llevaron a cabo los siguientes experimentos: [0087] In order to analyze the tumor cell removal capacity of a combined catumaxomab / leukocyte reduction strategy during RSI with an automatic device (eg, Cell-Saver-5®), the following experiments were carried out :

Paciente 1:Patient 1:

[0088] Se recolectaron 1500 ml de sangre del paciente con la adición de anticoagulantes durante la cirugía. [0088] 1500 ml of blood was collected from the patient with the addition of anticoagulants during surgery.

100 ml de 1500 ml de sangre fueron tomados y enviados al laboratorio (muestra 1: Sangre). 400 ml de los 1400 ml de sangre restantes se centrifugaron en el sistema de recuperación de sangre y la concentración emergente de eritrocitos se envió al laboratorio (muestra 2: CE). Los 1000 ml de sangre restantes se incubaron por 1 h con 2 pg de catumaxomab. Después de la incubación, 500 ml de sangre fueron centrifugados nuevamente en la máquina de recuperación de sangre y la concentración emergente de eritrocitos se envió al laboratorio (muestra 3: CE anticuerpo). Los 500 ml restantes también fueron centrifugados con el sistema de recuperación de sangre, purificados con un filtro de leucocitos y la CE fue enviada al laboratorio (muestra 4: CE anticuerpo Filtro).100 ml of 1500 ml of blood were taken and sent to the laboratory (sample 1: Blood). 400 ml of the remaining 1400 ml of blood were centrifuged in the blood recovery system and the emerging concentration of erythrocytes was sent to the laboratory (sample 2: CE). The remaining 1000 ml of blood was incubated for 1 h with 2 pg of catumaxomab. After incubation, 500 ml of blood was centrifuged again in the blood recovery machine and the emerging concentration of erythrocytes was sent to the laboratory (sample 3: CE antibody). The remaining 500 ml were also centrifuged with the blood recovery system, purified with a leukocyte filter and the EC was sent to the laboratory (sample 4: EC antibody Filter).

[0089] El laboratorio analizó las 4 muestras para un conteo de células tumorales, la secreción de citocinas y anticuerpos catumaxomab libres. A partir de la centrifugación de densidad y/o lisis de eritrocitos se obtuvieron células nucleares. Se muestrearon los sobrenadantes a fin de analizar la secreción de citocinas y hacer mediciones de catumaxomab libre. Las células fueron transferidas a diapositivas de Cytospin (2.5x10e5 células por diapositiva) y 6 diapositivas fueron teñidas con el anticuerpo anti-EpCAM VU1D9, reconociendo un epítope diferente de catumaxomab para eliminar un bloqueo potencial o efectos de enmascaramiento. Después del teñido, las células tumorales fueron contadas por medio de un sistema de análisis por imagen computarizada y revisadas por un operador calificado. Por medio del uso de tecnología Luminex se midieron las citocinas y se determinaron los niveles de catumaxomab por medio de la técnica ELISA sensible. La tabla 1-3 muestra los resultados del paciente 1: [0089] The laboratory analyzed the 4 samples for a tumor cell count, cytokine secretion and free catumaxomab antibodies. From the centrifugation of density and / or lysis of erythrocytes, nuclear cells were obtained. Supernatants were sampled to analyze cytokine secretion and make measurements of free catumaxomab. The cells were transferred to Cytospin slides (2.5x10e5 cells per slide) and 6 slides were stained with the anti-EpCAM antibody VU1D9, recognizing a different epitope of catumaxomab to eliminate a potential blockage or masking effects. After dyeing, the tumor cells were counted by means of a computerized image analysis system and checked by a qualified operator. Through the use of Luminex technology, cytokines were measured and catumaxomab levels were determined by means of the sensitive ELISA technique. Table 1-3 shows the results of patient 1:

Tabla 1: Conteo de células tumorales:Table 1: Tumor cell count:

Tabla 2: Secreción de citocinasTable 2: Cytokine secretion

Tabla 3: Catumaxomab libreTable 3: Catumaxomab free

Paciente 2Patient 2

[0090] Se recolectaron 1100 ml de sangre del paciente con la adición de anticoagulantes durante la cirugía. [0090] 1100 ml of blood was collected from the patient with the addition of anticoagulants during surgery.

100 ml de los 1100 ml100 ml of 1100 ml

de sangre fueron tomados y enviados al laboratorio (muestra 1: Sangre). Los 1000 ml de sangre restantes se incubaron por 1 h con 2 |jg de catumaxomab. Después de la incubación, 100 ml de sangre fueron tomados y enviados al laboratorio (muestra 2: Sangre anticuerpo). Después, los 900 ml de sangre restantes se centrifugaron en el sistema de recuperación de sangre y la concentración emergente de eritrocitos se envió al laboratorio (muestra 3: CE anticuerpo).of blood were taken and sent to the laboratory (sample 1: Blood). The remaining 1000 ml of blood was incubated for 1 h with 2 | jg of catumaxomab. After incubation, 100 ml of blood were taken and sent to the laboratory (sample 2: Blood antibody). Then, the remaining 900 ml of blood was centrifuged in the blood recovery system and the emerging concentration of erythrocytes was sent to the laboratory (sample 3: EC antibody).

[0091] El laboratorio analizó las 3 muestras para un conteo de células tumorales, la secreción de citocinas y anticuerpos catumaxomab libres. A partir de la centrifugación de densidad y/o lisis de eritrocitos se obtuvieron células nucleares. Se muestrearon los sobrenadantes a fin de analizar la secreción de citocinas y hacer mediciones de catumaxomab libre. Las células fueron transferidas a diapositivas de Cytospin (2.5x10e5 células por diapositiva) y 6 diapositivas fueron teñidas con el anticuerpo anti-EpCAM VU1D9, reconociendo un epítope diferente de catumaxomab para eliminar un bloqueo potencial o efectos de enmascaramiento. Después del teñido, as células tumorales fueron contadas por medio de un sistema de análisis por imagen computarizada y revisadas por un operador calificado. Por medio del uso de tecnología Luminex se midieron las citocinas y se determinaron los niveles de catumaxomab por medio de la técnica ELISA sensible. La tabla 1-3 muestra los resultados del paciente 2: [0091] The laboratory analyzed the 3 samples for a tumor cell count, cytokine secretion and free catumaxomab antibodies. From the centrifugation of density and / or lysis of erythrocytes, nuclear cells were obtained. Supernatants were sampled to analyze cytokine secretion and make measurements of free catumaxomab. The cells were transferred to Cytospin slides (2.5x10e5 cells per slide) and 6 slides were stained with the anti-EpCAM antibody VU1D9, recognizing a different epitope of catumaxomab to eliminate a potential blockage or masking effects. After dyeing, the tumor cells were counted through a computerized image analysis system and reviewed by a qualified operator. Through the use of Luminex technology, cytokines were measured and catumaxomab levels were determined by means of the sensitive ELISA technique. Table 1-3 shows the results of patient 2:

Tabla 1: Conteo de células tumorales:Table 1: Tumor cell count:

Tabla 2: Secreción de citocinasTable 2: Cytokine secretion

Tabla 3: Catumaxomab libreTable 3: Catumaxomab free

ResumenSummary

[0092] Ambas muestras de sangre de pacientes con cáncer, purificadas con el sistema de recuperación de células y catumaxomab no mostrar ninguna célula tumoral restante (0) en la concentración de eritrocitos. Además, las citocinas que son secretadas durante la cirugía son claramente disminuidas en la concentración de eritrocitos después del procedimiento descrito, revelando la ausencia de problemas de seguridad para el paciente. Lo que resulta importante, es que el catumaxomab residual no pudo ser detectado en la concentración producida de eritrocitos, incluso con un procedimiento ELISA muy sensible (límite de detección: 250 pg/ml) confirmando la seguridad para pacientes potenciales que reciben estas concentraciones autólogas purificadas de eritrocitos. [0092] Both blood samples from cancer patients, purified with the cell recovery system and catumaxomab do not show any remaining tumor cells (0) in the erythrocyte concentration. In addition, cytokines that are secreted during surgery are clearly decreased in the concentration of erythrocytes after the procedure described, revealing the absence of safety problems for the patient. What is important is that residual catumaxomab could not be detected in the concentration produced of erythrocytes, even with a very sensitive ELISA procedure (detection limit: 250 pg / ml) confirming the safety for potential patients receiving these purified autologous concentrations of erythrocytes.

ConclusionesConclusions

[0093] Debido a la infección y otros riesgos que presentan las transfusiones de sangre alogénicas, el aumento de la demanda y las necesidades económicas, aumenta el interés de los programas de gestión de sangre de los hospitales en la recuperación de sangre intraoperatoria. Sin embargo, el uso de la autotransfusión intraoperatoria en cirugías mayores de cáncer ha sido limitado debido a la probabilidad de que las células tumorales sean reinfusionadas al paciente, llevando, por lo tanto, a mayores incidencias de recurrencia. [0093] Due to infection and other risks of allogeneic blood transfusions, increased demand and economic needs, the interest of hospital blood management programs in intraoperative blood recovery increases. However, the use of intraoperative autotransfusion in major cancer surgeries has been limited due to the likelihood of tumor cells being reinfused to the patient, thus leading to higher recurrence incidents.

[0094] Se ha descubierto que el anticuerpo catumaxomab EpCAM específico con su capacidad de unirse a las células de carcinomas, células T y células accesorias, media la formación de grandes complejos multicelulares que podrían ser sencillamente eliminados por centrifugación y/o filtración de leucocitos, etapas convencionales para la eliminación de leucocitos. La invención muestra la capacidad de eliminación de leucocitos/células tumorales mediada por catumaxomab durante la recuperación de sangre intraoperatoria mediante el uso de, por ejemplo, dispositivos automáticos como Cell Saver-5® o CATS®. La aplicación in vitro de catumaxomab representa, además, su uso terapéutico como un uso secundario como dispositivo médico y producto médico, respectivamente, durante el procedimiento de recuperación de sangre intraoperatoria en la cirugía de cáncer. [0094] It has been discovered that the specific CatChexomab EpCAM antibody with its ability to bind to carcinoma cells, T cells and accessory cells mediates the formation of large multicellular complexes that could simply be removed by centrifugation and / or leukocyte filtration, Conventional steps for the removal of leukocytes. The invention shows the ability to eliminate leukocytes / tumor cells mediated by catumaxomab during intraoperative blood recovery by using, for example, automatic devices such as Cell Saver-5® or CATS®. The in vitro application of catumaxomab also represents its therapeutic use as a secondary use as a medical device and medical product, respectively, during the intraoperative blood recovery procedure in cancer surgery.

[0095] Comenzando por estos datos fundamentados en experimentos, resulta evidente para un experto en la materia que este concepto probado experimentalmente también puede transferirse efectivamente a otros anticuerpos monoclonales, siempre y cuando sean capaces de interactuar con células tumorales y, opcionalmente, con células inmunitarias y/o tumorales a fin de formar agregados o asociados que puedan eliminarse mediante, por ejemplo, filtración o centrifugación. Por estos motivos, la presente invención no se limita a anticuerpos biespecíficos trifuncionales como catumaxomab, que reconoce el antígeno EpCAM asociado a un tumor y las células T mediante CD3 y las combinaciones de isotipos específicos que se presentan en esta invención; habiendo descrito en esta invención el concepto de la presente invención, el mismo puede ser fácilmente trasladado a otros anticuerpos y antígenos asociados con tumores, como se describe en esta invención, mientras sean capaces de reconocer antígenos asociados a un tumor y presenten la habilidad de formar asociados capaces de ser eliminados. [0095] Beginning with these data based on experiments, it is clear to one skilled in the art that this experimentally proven concept can also be effectively transferred to other monoclonal antibodies, as long as they are capable of interacting with tumor cells and, optionally, with immune cells. and / or tumor in order to form aggregates or associates that can be removed by, for example, filtration or centrifugation. For these reasons, the present invention is not limited to trifunctional bispecific antibodies such as catumaxomab, which recognizes the EpCAM antigen associated with a tumor and T cells by CD3 and the combinations of specific isotypes presented in this invention; Having described in this invention the concept of the present invention, it can easily be transferred to other antibodies and antigens associated with tumors, as described in this invention, as long as they are able to recognize tumor associated antigens and have the ability to form Associates capable of being eliminated.

[0096] En conjunto, la aplicación del procedimiento de la presente invención, por ejemplo, mediante el uso de catumaxomab para minimizar el riesgo de células tumorales autólogas residuales, podría ser un requisito previo para la realización de la RSI durante la cirugía de cáncer. [0096] Overall, the application of the method of the present invention, for example, by using catumaxomab to minimize the risk of residual autologous tumor cells, could be a prerequisite for performing RSI during cancer surgery.

Filtros de transfusión sanguínea para los laboratorios/cabeceras de hospitalesBlood transfusion filters for laboratories / hospital headers

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Claims (13)

REIVINDICACIONES 1. Procedimiento ex vivo para la eliminación de células tumorales de la sangre recuperada intraoperatoriamente que comprende las siguientes etapas:1. Ex vivo procedure for the removal of tumor cells from intraoperatively recovered blood comprising the following stages: - proporcionar la sangre recuperada intraoperatoriamente, la cual puede contener células tumorales;- provide intraoperatively recovered blood, which may contain tumor cells; - poner en contacto dicha sangre recuperada intraoperatoriamente con- contacting said intraoperatively recovered blood with - al menos un anticuerpo biespecífico trifuncional que comprende las siguientes propiedades:- at least one trifunctional bispecific antibody comprising the following properties: a) unión a una célula T;a) binding to a T cell; b) unión a un antígeno asociado a un tumor o a una célula tumoral;b) binding to an antigen associated with a tumor or a tumor cell; c) unión por medio de su porción Fc a una célula positiva de un receptor Fc,c) binding by means of its Fc portion to a positive cell of an Fc receptor, siendo dicho anticuerpo capaz de formar una red tridimensional con las células tumorales contenidas en la sangre, donde dicho al menos un anticuerpo entra en contacto con la sangre recuperada intraoperatoriamente por un período de tiempo de 10 a 180 minutos, lo cual es suficiente para la reticulación de células tumorales y, opcionalmente, células inmunitarias y/u otras células tumorales a fin de obtener asociados y/o agregados, donde dichas células tumorales, tales otras células tumorales y las células inmunitarias antes mencionadas están potencialmente presentes en la sangre recuperada intraoperatoriamente, y donde dichas células tumorales son específicamente reconocidas por dicho al menos un anticuerpo; ysaid antibody being capable of forming a three-dimensional network with the tumor cells contained in the blood, where said at least one antibody comes into contact with the blood recovered intraoperatively for a period of 10 to 180 minutes, which is sufficient for crosslinking. of tumor cells and, optionally, immune cells and / or other tumor cells in order to obtain associates and / or aggregates, wherein said tumor cells, such other tumor cells and the aforementioned immune cells are potentially present in intraoperatively recovered blood, and wherein said tumor cells are specifically recognized by said at least one antibody; Y - eliminar mecánicamente dichos asociados y/o agregados de dicha sangre recuperada intraoperatoriamente.- mechanically remove said associates and / or aggregates from said intraoperatively recovered blood. 2. Procedimiento ex vivo según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo biespecífico tridimensional es seleccionado de un grupo de anticuerpos con las siguientes combinaciones de isotipos:2. Ex vivo method according to claim 1, wherein said three-dimensional bispecific antibody is selected from a group of antibodies with the following combinations of isotypes: IgG2b de rata/IgG2a de ratón,Rat IgG2b / mouse IgG2a, IgG2b de rata/IgG2b de ratón,Rat IgG2b / mouse IgG2b, IgG2b de rata/IgG1 de humano,Rat IgG2b / human IgG1, [VH-CH1; VL-CL] de ratón-IgG1 de humano/[VH-CH1, VL-CL] de rata-IgG1 de humano [bisagra]-IgG3* de humano-[CH2-CH3] [* = G3m(b+g) de alotipos caucásicos = sin unión a la proteína A].[VH-CH1; VL-CL] of mouse-IgG1 of human / [VH-CH1, VL-CL] of rat-IgG1 of human [hinge] -IgG3 * of human- [CH2-CH3] [* = G3m (b + g) of Caucasian allotypes = no protein A binding]. 3. Procedimiento ex vivo según la reivindicación 1 a 2, donde dicho antígeno asociado a un tumor es seleccionado de un grupo que consiste en: EpCAM, Her2neu, EGFR, CD30, CD20, CD22, MUC1, MUC1*, PSMA, CD33, MCSP, cMet, EphA2, Endosialina, Carboanhidrasa IX, IGF-1R, FAP-alfa, CD19, CD52, GD2, CEA, FR, proteoglicanos, G250, GC182, GT468, GT512.3. Ex vivo method according to claim 1 to 2, wherein said tumor-associated antigen is selected from a group consisting of: EpCAM, Her2neu, EGFR, CD30, CD20, CD22, MUC1, MUC1 *, PSMA, CD33, MCSP , cMet, EphA2, Endosialin, Carboanhydrase IX, IGF-1R, FAP-alpha, CD19, CD52, GD2, CEA, FR, proteoglycans, G250, GC182, GT468, GT512. 4. Procedimiento ex vivo según una o más de las reivindicaciones 1 a 3 anteriores donde se aplican al menos dos anticuerpos diferentes, cuya especificidad de antígenos tumorales o especificidad de marcador de superficie de célula T difieren entre sí.4. Ex vivo method according to one or more of the preceding claims 1 to 3 wherein at least two different antibodies are applied, whose tumor antigen specificity or T cell surface marker specificity differ from each other. 5. Procedimiento ex vivo según una o más de las reivindicaciones 1 a 4 anteriores, donde dichos asociados comprenden5. Ex vivo method according to one or more of the preceding claims 1 to 4, wherein said associates comprise a) anticuerpos, células tumorales y células inmunitarias y/oa) antibodies, tumor cells and immune cells and / or b) anticuerpos y células tumorales.b) antibodies and tumor cells. 6. Procedimiento ex vivo según una o más de las reivindicaciones 1 a 5 anteriores, donde dichos anticuerpos se aplican en una cantidad de pg hasta 20pg, preferentemente 1 a 10pg o 1 a 5pg o 1 a 2pg por litro de sangre recuperada intraoperatoriamente.6. Ex vivo method according to one or more of the preceding claims 1 to 5, wherein said antibodies are applied in an amount of pg up to 20pg, preferably 1 to 10pg or 1 to 5pg or 1 to 2pg per liter of intraoperatively recovered blood. 7. Procedimiento ex vivo según una o más de las reivindicaciones 1 a 6 anteriores, donde dichos anticuerpos se dirigen contra EpCAM y CD3.7. Ex vivo method according to one or more of the preceding claims 1 to 6, wherein said antibodies are directed against EpCAM and CD3. 8. Procedimiento ex vivo según una o más de las reivindicaciones 1 a 7 anteriores donde dicho procedimiento comprende al menos una de las siguientes etapas adicionales:8. Ex vivo method according to one or more of the preceding claims 1 to 7 wherein said method comprises at least one of the following additional steps: a) mezclar la sangre recuperada intraoperatoriamente antes de la adición de dicho al menos un anticuerpo con al menos un agente anticoagulante;a) mixing the recovered blood intraoperatively before the addition of said at least one antibody with at least one anticoagulant agent; b) separar los eritrocitos de dichos asociados y/o agregados y componentes adicionales de la sangre por medio de la centrifugación, preferentemente por medio de centrifugación en gradiente de densidad;b) separating the erythrocytes from said associates and / or aggregates and additional components from the blood by means of centrifugation, preferably by means of density gradient centrifugation; c) opcionalmente, filtrar dicha mezclac) optionally, filter said mixture para eliminar agregados y/o asociados potencialmente residuales y complejos celulares residuales; yto eliminate aggregates and / or potentially residual associates and residual cell complexes; Y c) recolectar la fracción que contiene eritrocitos y componentes adicionales de la sangre en contenedores separados.c) collect the fraction containing erythrocytes and additional blood components in separate containers. 9. Procedimiento ex vivo según una o más de las reivindicaciones 1 a 8 anteriores, donde el tiempo de incubación del anticuerpo con dicha sangre recuperada intraoperatoriamente se ubica entre 20 y 90 minutos, más preferentemente entre 30 y 60 minutos, opcionalmente donde dicha incubación se realiza a una temperatura de entre 19 y 25°C preferentemente a temperatura ambiente.9. Ex vivo method according to one or more of the preceding claims 1 to 8, wherein the time of incubation of the antibody with said intraoperatively recovered blood is between 20 and 90 minutes, more preferably between 30 and 60 minutes, optionally where said incubation is performed at a temperature between 19 and 25 ° C preferably at room temperature. 10. Procedimiento ex vivo según una o más de las reivindicaciones 1 a 9 anteriores, donde dicha eliminación de asociados es por centrifugación, filtración o una combinación de las mismas.10. Ex vivo method according to one or more of the preceding claims 1 to 9, wherein said removal of associates is by centrifugation, filtration or a combination thereof. 11. Procedimiento ex vivo según una o más de las reivindicaciones 1 a 10 anteriores, donde los complejos celulares que contienen leucocitos y/o células tumorales celulares son eliminados en una etapa separada usando un filtro de adsorción de leucocitos.11. Ex vivo method according to one or more of the preceding claims 1 to 10, wherein the cell complexes containing leukocytes and / or cell tumor cells are removed in a separate step using a leukocyte adsorption filter. 12. Uso de un procedimiento ex vivo según una o más de las reivindicaciones 1 a 11 anteriores, donde dichas células tumorales son de tumores epiteliales, hematológicos o neuroectodérmicos.12. Use of an ex vivo method according to one or more of the preceding claims 1 to 11, wherein said tumor cells are from epithelial, hematological or neuroectodermal tumors. 13. Uso de un anticuerpo trifuncional biespecífico con las siguientes propiedades:13. Use of a bispecific trifunctional antibody with the following properties: a) unión a una célula T;a) binding to a T cell; b) unión a un antígeno asociado a un tumor o a una célula tumoral;b) binding to an antigen associated with a tumor or a tumor cell; c) unión por medio de su porción Fc a una célula positiva de un receptor Fc,c) binding by means of its Fc portion to a positive cell of an Fc receptor, siendo dicho anticuerpo capaz de formar una red tridimensional con células tumorales contenidas en la sangre, en un procedimiento ex vivo según una o más de las reivindicaciones anteriores 1 a 12. said antibody being capable of forming a three-dimensional network with tumor cells contained in the blood, in an ex vivo method according to one or more of the preceding claims 1 to 12.