ES2726603T3

ES2726603T3 - Nanopartículas lipídicas sólidas paramagnéticas (pSLN) que contienen complejos anfifílicos metálicos para IRM

Info

Publication number: ES2726603T3
Application number: ES13759502T
Authority: ES
Inventors: Simona Ghiani; Alessandro Maiocchi; Chiara Brioschi; Massimo Visigalli; Claudia Cabella; Luigi Miragoli
Original assignee: Bracco Imaging SpA
Current assignee: Bracco Imaging SpA
Priority date: 2012-09-07
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2033-09-06
Also published as: JP6251744B2; JP2015535811A; WO2014037498A3; WO2014037498A2; EP2892570A2; CN104602715A; EP2892570B1; US10039843B2; US20150258221A1

Abstract

Una nanopartícula lipídica sólida paramagnética (pSLN) que comprende: un núcleo lipídico sólido hasta 55 ºC, que comprende al menos un glicérido seleccionado del grupo que consiste en: un monoglicérido, un diglicérido y un triglicérido, o mezclas de los mismos, que tienen una cadena de alquilo C12-C24 lineal y ramificada, saturada o insaturada, en el que en el caso de un diglicérido y triglicérido, la cadena de alquilo puede ser igual o diferente, que además comprende opcionalmente un ácido graso C12-C22 saturado o insaturado, un éster de ácido graso, y mezclas de los mismos, estando rodeado dicho núcleo lipídico sólido por un componente anfifílico que comprende un resto quelante de metal paramagnético anfifílico seleccionado de entre: un derivado de diazepina de fórmula I y un tetraazociclododecano de fórmula II o sus sales:**Fórmula** en las que: Y es un grupo de fórmula Y'-NH- o (Y')2-N-, en las que Y' se selecciona del grupo que consiste en: un grupo alquilo C8-C16 lineal o ramificado, saturado o insaturado; un grupo alquilo C1-C10 interrumpido por un grupo fosfato -O-(HO-P=O)-O- opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados de entre: hidroxilo - OH, carboxi -COOR1, oxicarbonil-alquilo (C8-C16) y oxicarbonil-alquenilo (C8-C16); en el que R1 es hidrógeno H o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado; o Y' es un éster monofosfato de un glicerol sustituido o parcialmente sustituido, que tiene al menos un grupo funcional de dicho glicerol esterificado con un ácido graso alifático con cadenas de carbono saturadas o insaturadas, y la función de ácido fosfórico está libre o salificada con un metal alcalino o alcalinotérreo; L es un enlazador bivalente seleccionado de entre: un grupo cíclico o heterocíclico C3-C10 alifático y alquilo C1- C6, alquenilo o alquinilo C2-C6, lineal o ramificado opcionalmente sustituido o interrumpido con un átomo o un grupo seleccionado de entre: carbonilo -C=O, tiocarbonilo -C=S, amino -NR1-, carboxi -COO-, oxi-carbonilo - OCO-, amido -NR1CO- o -CONR1-, oxígeno -O- y azufre -S-, en los que R1 es tal como se ha definido anteriormente; RI-IV y RI-III son cada uno, independientemente un grupo alquil (C1-C3)-carboxi, en el que dicho resto quelante del mismo está complejado con un ion metálico paramagnético seleccionado del grupo que consiste en: Gd(III), Mn(II), Cr(III), Cu(II), Fe(III), Pr(III), Nd(III), Sm(III), Tb(III), Yb(III), Dy(III), Ho(III) y Er(III), o una sal del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Nanopartículas lipídicas sólidas paramagnéticas (pSLN) que contienen complejos anfifílicos metálicos para IRM Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso novedoso para la preparación de nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) con propiedades paramagnéticas (pSLN) que contienen derivados de agentes quelantes de iones metálicos paramagnéticos tales como tetraazaciclododecanos y derivados de diazepina para su uso como agentes de contraste en IRM (imagen por resonancia magnética).

Estado de la técnica

Los agentes de contraste comúnmente utilizados en el ámbito clínico son complejos de gadolinio hidrófilos de bajo peso molecular que, después de su administración intravenosa, se distribuyen de forma diferente en el espacio extracelular, en función de la diferente permeabilidad de los vasos en tejidos patológicos en comparación con los tejidos sanos. La diferente concentración alcanzada en los tejidos, que depende de la extensión de la extravasación, produce una intensidad diferente de la señal de resonancia magnética, lo que da como resultado un aumento del contraste positivo (blanco) en la imagen. La capacidad inherente de un agente de contraste para generar una señal medible mediante imágenes de resonancia magnética se debe a un parámetro denominado relaxividad (r) que indica la capacidad del agente de contraste para modificar los tiempos de relajación del vector de magnetización de los protones del agua.

Existen dos tipos de mecanismos de relajación denominados "longitudinal" y "transversal", cada uno con su propio parámetro de relaxividad r1 y r2, respectivamente. El parámetro de relaxividad generalmente utilizado para comparar la eficacia de un agente de contraste en el ámbito clínico es normalmente r1. Los productos que se utilizan actualmente en el ámbito clínico presentan valores de r1 en el intervalo comprendido entre 4-6 mM-1s-1 cuando se miden a 25 °C en agua con un campo magnético externo de 0,47 T. Una segunda característica importante de esta clase de productos es la ausencia total de interacciones específicas con biomoléculas, excepto, en algunos casos, una interacción débil con seroalbúmina. Como resultado, las tasas de depuración de la sangre son altas y la eliminación se produce principalmente por filtración glomerular, es decir, a través de la orina. De ello se deduce que esta clase de productos se caracteriza por la falta de especificidad para el torrente sanguíneo, tejidos y componentes celulares o moleculares. En los últimos años, la búsqueda de agentes de contraste de IRM alternativos se ha desarrollado de forma incremental. La investigación para producir nuevos agentes de contraste se ha dirigido hacia el desarrollo de plataformas tecnológicas basadas en nanopartículas que proporcionan una mayor especificidad para tejidos patológicos, debido a sus eficaces acumulación y retención en el sitio objetivo (efecto EPR) y semividas más prolongadas en el torrente sanguíneo. El esquema comúnmente utilizado implica la incorporación de numerosos complejos de gadolinio (1000-100000) en una nanopartícula (liposomas, micelas mixtas, nanoemulsiones, dendrímeros, etc.).

A este respecto, el uso de agentes quelantes modificados con cadenas de alquilo de > 10 átomos de carbono (cadena de alquilo media-larga) que proporcionan propiedades lipófilas a la unidad quelante que tienen como objetivo favorecer su incorporación en sistemas de partículas basados en lípidos (es decir, emulsiones, micelas, liposomas, etc.) se ha descrito ya en la técnica.

En particular, el documento WO 00/09170, por el mismo solicitante, describe la preparación de un agente de contraste de IRM dual micelar, que comprende tanto un complejo de IRM predominantemente vascular como uno predominantemente extravascular. La preparación de los agentes quelantes paramagnéticos con resto lipófilo, descrita en el documento WO97/00087, se utiliza en el documento WO00/09170 en asociación con uno o más compuestos orgánicos anfipáticos. Además, se describe la preparación de [10-[2-(octadecilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraaza-ciclododecano-1,4,7-triacetato-(3-)]gadolinio].

Briley-Saebo K.C. et al., J. Phys. Chem. 2009, 113 (18), 6283-6289, describe la conjugación de los agentes quelantes AAZTA y DTPA Gd derivatizados respectivamente con alquilo y fosfolípidos con lipoproteínas de alta densidad (HDL) para la preparación de lipoproteínas marcadas para resonancia magnética RM. Por su parte, Yamakoshi Y. et al., Chem. Com. 2011, 47 (31), 8835, describe la conjugación de cadenas de Gd DO3A-alquenilo con partículas de lipoproteína de baja densidad (LDL) para la obtención mejorada de imágenes de ateroplacas por IRM.

Feshitan J.A. et al., Biomaterials 2011, 33 (1), 247-255, describe la preparación de microburbujas de Gd-DOTA_DSPE, preparadas con una técnica de posmarcado y complejadas con Gd (III) después de la síntesis.

El documento US 6.342.598, por el mismo solicitante, describe la preparación de agentes quelantes policarboxílicos y macrocíclicos, modificados mediante un enlace carboxamido con una cadena de alquilo media-larga para las preparaciones de composiciones que pueden formar composiciones micelares.

Kielar F. et al., J.A.C.S. 2010, 132 (23), 7836-7837 proporciona mediciones de la relaxividad de liposomas preparados con complejos DOTA funcionalizados con dos cadenas hidrófobas. La relaxividad de los liposomas se mejora significativamente, lo que confirma que la organización supramolecular representa una estrategia atractiva para el desarrollo de sistemas de alta relaxividad.

Gianolio E. et al., Chem. Medicina. Chem. 2008, 3 (1), 60-62 describe el anclaje de complejos de AAZTA funcionalizados con dos cadenas alifáticas a la superficie celular mediante un enlazador polipeptídico catiónico. El documento EP 1803711 A1 y el documento WO2006/136564 A1, en nombre del mismo solicitante, describen la síntesis de complejos de AAZTa , que pueden derivatizarse o conjugarse con moléculas adecuadas capaces de interactuar con sistemas fisiológicos.

El documento WO2006/100305 A2, en nombre de Guerbet SA, describe jaulas quelantes de Gd, modificadas químicamente con cadenas lipófilas, que pueden ser útiles para la preparación de agentes de IRM particulados. El documento FR 2968999 A1, en nombre de Guerbet SA, describe microemulsiones que comprenden quelatos de Gd derivatizados con lípidos. El documento WO2011/044545 A2 divulga partículas basadas en lipoproteínas de alta densidad (rHDL) reconstituidas y liposomas que portan quelatos de Gd-DTPA, utilizadas para su direccionamiento a la placa aterosclerótica. El documento US 2007/243136 A1 divulga lipoproteínas de alta densidad (rHDL) reconstituidas en las que quelatos de Gd conjugados con fosfolípidos se mezclan junto con sustancias HDL o ApoA naturales para proporcionar nanopartículas sintéticas para su uso como agentes de IRM.

Kristl J. et al., Int. J. Pharm. 2003, 256 (1-2), 133-140, describe SLN sin quelatos paramagnéticos, y su absorción por leucocitos.

Ahlin P. et al., Acta Pharmaceutica 1998, 48, 259-267, describe la preparación de SLN, sin quelatos paramagnéticos, mediante el procedimiento de emulsificación por fusión.

Briley-Saebo K.C. et al., Magn. Reson. Med. 2003, 50 (2), 411-416, describe (emulsiones de) nanopartículas paramagnéticas caracterizadas por Gd-DTPA modificado con lípidos.

La relaxividad de los liposomas se mejora significativamente, lo que confirma que la organización supramolecular representa una estrategia atractiva para el desarrollo de sistemas de alta relaxividad.

Además, los sistemas macromoleculares ofrecen un diseño significativamente flexible, dado que es posible mejorar y modular las propiedades de las partículas producidas mediante la adición de restos moleculares específicos para el reconocimiento de sitios receptores sobreexpresados en tejidos patológicos, o agentes ocultos que pueden limitar el reconocimiento y la consiguiente eliminación/inactivación por sistemas reticuloendoteliales (RES) o inmunitarios. Estas propiedades, junto con la posibilidad de cargar las partículas con un gran número de sondas de imagen, permiten mejorar la sensibilidad de las diversas modalidades de imagen, en particular aquellas que poseen una sensibilidad más baja, tales como la imagen por resonancia magnética. El uso de nanopartículas paramagnéticas hace de la resonancia magnética una alternativa valiosa a las técnicas de diagnóstico con sondas radioactivas que se utilizan normalmente en los procedimientos de imagen molecular, proporcionando la ventaja adicional de una mejor resolución espacial. En teoría, es posible producir nanopartículas con valores de relaxividad (ni) elevados que se caracterizan por una persistencia satisfactoria en el torrente sanguíneo y son capaces de reconocer biomarcadores moleculares, si están modificadas adecuadamente.

Además, el uso de nanopartículas posibilita diseñar sistemas duales en los que pueden coexistir sondas de imagen con diferentes propiedades para generar agentes de contraste que pueden utilizarse para procedimientos combinados, tales como imagen por resonancia magnética y tomografía por emisión de positrones (PET/IRM) o tomografía computarizada de rayos X y tomografía computarizada de emisión de fotón único (SPECT/TC).

Sin embargo, las nanopartículas (es decir, liposomas, puntos cuánticos o partículas de óxido de hierro) tienen la desventaja de acumularse no solo en los sitios de interés, sino también en las células fagocíticas del sistema reticuloendotelial (especialmente células de Kupffer y macrófagos) y durante un periodo prolongado.

Independientemente de las estrategias utilizadas para enmascarar las partículas del reconocimiento por el sistema reticuloendotelial, el resultado suele ser una alta acumulación de nanopartículas que contienen gadolinio en órganos tales como el hígado y el bazo, aunque con tiempos de depuración variables. La eliminación de estos órganos es extremadamente lenta, lo que da como resultado un mayor tiempo de exposición del cuerpo humano al gadolinio, un ion sustancialmente tóxico (Longmire et al., Nanomedicine, 2008, 3: 703-717).

Por lo tanto, para los agentes de IRM en nanopartículas, el reto para su uso in vivo consiste en lograr, por una parte, una biodistribución óptima en el órgano y, por otra parte, una toxicidad reducida debida a la acumulación de Gd (III). Estas propiedades deben combinarse con la capacidad de las nanopartículas para transportar una carga útil alta de reportero de imagen, permitiendo una amplificación significativa de la señal de RM y, por lo tanto, reduciendo posiblemente la dosis del metal paramagnético administrado.

La toxicidad inducida por el aumento de la exposición al gadolinio se ha estudiado recientemente y se ha descubierto una correlación entre la aparición de enfermedades tales como la fibrosis sistémica nefrogénica (NSF), también conocida como dermopatía fibrosante nefrogénica, y la administración de complejos de gadolinio en pacientes con insuficiencia renal grave. Esta forma de fibrosis conduce a una rigidez subcutánea y muscular progresiva y debilitante, asociada con dolor difuso, que puede conducir a la muerte del paciente. La evidencia de toxicidad potencial de agentes de contraste basados en complejos de gadolinio, debido a su persistencia en el cuerpo humano, plantea una limitación importante a la posibilidad de desarrollar aplicaciones que utilicen nanopartículas que contengan el ion mencionado anteriormente, incluso cuando se encuentra en una forma quelada. Además, las nanopartículas, así como los liposomas, no son estables a lo largo del tiempo y se preparan con componentes lipídicos que pueden considerarse inseguros para su uso clínico (Mukherje S. et al., Indian J Pharm Sci., julio-agosto de 2009, 71 (4): 349-358; doi: 10.4103/0250-474X.57282 e). En un intento por identificar formulaciones más seguras y más flexibles de agentes de contraste, Morel (Morel S et al., Eur J Pharm Biopharm., marzo de 1998; 45 (2): 157-63), por ejemplo, describió la preparación de nanopartículas lipídicas sólidas (pSLN) que contienen complejos de quelatos de gadolinio tales como [GdDOTA]" y [GdDTPA]2-, para explorar la viabilidad de este enfoque. Sin embargo, la incorporación de los complejos de gadolinio mencionados anteriormente en pSLN es bastante baja.

La preparación de las pSLN descritas en Morel, explotando procedimientos originariamente descritos por Gasco (documento EP526666) que se desarrollaron principalmente para la administración de medicamentos o para su liberación controlada (documento WO 00/30 620) o para permitir su administración a través de vías de administración particulares (por ejemplo, por vía ocular para el tratamiento de patologías oftálmicas, tal como en el documento WO 2004/039 351) adolece de la baja afinidad de los complejos hidrófilos de Gd(III) por el núcleo lipídico, lo que da como resultado una carga reducida de Gd(III) en las SLN. Además, las propiedades de relajación de dichas nanopartículas no aumentan tal como se esperaba, como se confirma mediante los valores de relaxividad para las pSLN, que están muy próximos a los medidos para los complejos de Gd en solución (Kielar et al., J Am Chem Soc, 2010, citado; Mulder et al., NMR en Biomed, 2006, 19: 142-164).

Por lo tanto, se siente enormemente en el sector de la RM la necesidad de desarrollar nuevas estrategias para la preparación de agentes en nanopartículas sensibles a la RM estables que resuelvan los problemas mencionados anteriormente.

El presente enfoque para preparar SLN con complejos metálicos paramagnéticos, agentes quelantes anfifílicos específicamente seleccionados y diseñados tal como se divulga, supera las principales limitaciones anteriores relacionadas con la preparación de nanopartículas lipídicas sólidas como agentes de IRM (pSLN).

De hecho, las nanopartículas preparadas según la invención muestran una alta carga útil de Gd(III) y una buena accesibilidad de los iones metálicos paramagnéticos a las moléculas de agua a granel, debido a su orientación inducida por el núcleo lipídico sólido, lo que da como resultado una alta relaxividad de las nanopartículas. Por lo tanto, se pueden prever dosis más bajas del metal paramagnético para lograr la misma calidad de imagen en su uso clínico.

Además, la acumulación de Gd(III) en órganos tales como el hígado, el bazo y el riñón es limitada y muestra un tiempo óptimo de depuración desde estos órganos según se observa en los presentes estudios in vivo.

Se sabe que los sistemas de nanopartículas tienden a acumularse en el hígado y el bazo (Longmire et al., Nanomedicine, 2008, 3: 703-717) en los que el problema de la toxicidad de Gd(III) se convierte en un asunto más relevante y muy limitante para el desarrollo posterior de estos sistemas como agentes de IRM.

Las pSLN de la presente invención han resuelto los problemas indicados anteriormente: estudios en vivo han demostrado que se puede obtener una acumulación limitada de gadolinio en el sistema reticuloendotelial a medio/largo plazo modulando las propiedades de las cadenas lipófilas del resto quelante metálico y manteniendo la mejora de la relaxividad de estos sistemas.

Por lo tanto, se puede predecir razonablemente una mayor seguridad en comparación con los diversos sistemas de nanopartículas propuestos en la técnica.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una nanopartícula lipídica sólida paramagnética (pSLN) que comprende un resto quelante de metal paramagnético anfifílico seleccionado de entre: un derivado de diazepina de fórmula I y un derivado de tetraazociclododecano de fórmula II:

o sales de los mismos, en las que:

Y es un grupo de fórmula Y'-NH- o (Y')2-N-, en el que Y' se selecciona del grupo que consiste en: un grupo alquilo C8-C16 lineal o ramificado, saturado o insaturado; un grupo alquilo C1-C10 interrumpido por un grupo fosfato -O-(HO-P=O)-O- opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados de entre: hidroxilo -OH, carboxi -COOR1, oxicarbonil-alquilo (C8-C16) y oxicarbonil-alquenilo (C8-C16); en el que R1 es hidrógeno H o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado; o Y' es un éster monofosfato de un glicerol sustituido o parcialmente sustituido, que tiene al menos un grupo funcional de dicho glicerol esterificado con un ácido graso alifático con cadenas de carbono saturadas o insaturadas, y la función de ácido fosfórico está libre o salificada con un metal alcalino o alcalinotérreo;

L es un enlazador bivalente seleccionado de entre: un grupo cíclico o heterocíclico C3-C10 alifático y alquilo C1-C⁶, alquenilo o alquinilo C2-C6, lineal o ramificado, opcionalmente sustituido o interrumpido con un átomo o un grupo seleccionado de entre: carbonilo -C=O, tiocarbonilo -C=S, amino -NR1-, carboxi -COO-, oxi-carbonilo -OCO-, amido -NR1CO- o -CONR1-, oxígeno -O- y azufre -S-, en los que R1 es tal como se ha definido anteriormente;

ri-iv y RI-m son cada uno, independientemente, un grupo alquil (C1-C3)-carboxi,

en el que dicho resto quelante está complejado con un ion metálico paramagnético seleccionado del grupo que consiste en: Gd(III), Mn(II), Cr(III), Cu(II), Fe(III), Pr(III), Nd(III), Sm(III), Tb(III), Yb(III), Dy(III), Ho(III) y Er(III).

La invención se refiere además al proceso para la preparación de dichas nanopartículas lipídicas sólidas que comprenden complejos anfifílicos de metales paramagnéticos (pSLN) y las pSLN resultantes como agentes de contraste de IRM.

El proceso comprende las etapas siguientes:

a) preparar una fase orgánica (O) obtenida mezclando en un solvente orgánico de bajo punto de ebullición, inmiscible en agua:

- un componente anfifílico que comprende un compuesto adecuado para la coordinación de iones metálicos, seleccionado de un derivado de diazepina de fórmula I y un derivado de tetraazaciclododecano de fórmula II:

en las que:

Y es un grupo de fórmula Y'-NH-o (Y')2-N-, en la que Y' se selecciona de los grupos siguientes: un grupo alquilo C8-C16 lineal o ramificado, saturado o insaturado; un grupo alquilo C1-C10 que puede estar interrumpido por un grupo fosfato -O-(HO-P=O)-O- opcionalmente sustituido con uno o más átomos o grupos seleccionados de entre: grupos hidroxilo -OH, carboxi -COOR1, oxicarbonil-alquilo (C8-C16) y oxicarbonil-alquenilo (C8-C16); en el que R1 se selecciona de entre hidrógeno H y un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado.

L es un enlazador bivalente seleccionado de entre: un grupo cíclico o heterocíclico C3-C10 alifático, o alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C6, lineal o ramificado, opcionalmente sustituido o interrumpido con un átomo o un grupo seleccionado de entre: carbonilo -C=O, tiocarbonilo -C=S, amino -NR1-, carboxi -COO-, oxi-carbonilo -OCO-, amido -NR1CO- o -CONR1-, oxígeno -O- y azufre -S-, en los que R1 es tal como se ha definido anteriormente;

r I-^ivy r I-ⁱⁱⁱSQn cada uno, independientemente, un grupo alquil (Ci -C3)-carboxi,

en el que dicho resto quelante está complejado con un ion metálico paramagnético seleccionado del grupo que consiste en: Gd(lll), Mn(ll), Cr(lll), C^u(II), Fe(lll), Pr(lll), Nd(lll), Sm(lll), Tb(lll), Yb(lll), Dy(lll), H^o(III) y Er(lii);

- un componente anfifílico seleccionado del grupo que consiste en: un fosfolípido, lisolípido o esfingolípido C6-C24 de cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada, y en el que pueden estar presentes tensioactivos tales como un ácido biliar o derivados del mismo, un glicolípido, un alcohol graso alifático, un dialquiléter, tocoferol o mezclas de los mismos y

- un componente lipídico que comprende al menos un glicérido seleccionado del grupo que consiste en: monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos con cadenas de hidrocarburo lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas, con una longitud comprendida entre 12-24 átomos de carbono, o mezclas de los mismos, y opcionalmente un ácido graso C12-C22 saturado o un éster del mismo,

b) preparar una solución acuosa (W) que comprende uno o más tensioactivos iónicos o no iónicos y opcionalmente un cotensioactivo seleccionado de entre un alcohol polialquílico C3-C8 y un ácido graso C5-C12 saturado;

c) mezclar la fase orgánica (O) preparada en a) con la solución acuosa (W) preparada en b), para obtener una microemulsión (W/O) estable y transparente a una temperatura comprendida entre 20 °C y 40 °C;

d) añadir la microemulsión (W/O) según la etapa c) a una segunda solución acuosa (W1) que comprende al menos un tensioactivo iónico o no iónico como tensioactivo, a una temperatura comprendida entre 20 °C y 40 °C para obtener una emulsión múltiple (W/O/W1);

e) evaporar el disolvente orgánico de la emulsión múltiple y obtener una suspensión de nanopartículas lipídicas, f) enfriar la suspensión obtenida en la etapa e) a una temperatura inferior al punto de cristalización del componente lipídico tal como se define en la etapa a) para obtener pSLN.

También se describen composiciones inyectables que comprenden las pSLN de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Esquema de una partícula lipídica sólida paramagnética, que contiene opcionalmente un agente oculto. Figura 2. Barrido por DSC y pico endotérmico de una pSLN típica. Curva superior inmediatamente después de la preparación, curva intermedia después de un mes, curva inferior dos meses después del final de la preparación. Figura 3. Captación por U937 de SLN cargadas con B22286, liposomas y Phohance®. Las barras representan los moles Gd(lll)/mg de proteína en lisados de U937 después de la incubación con: pSLN cargadas con B22286 y liposomas, y ProHance.

Figura 4. imagen por RM adquirida después de la administración de pSLN a una dosis de 0,05 mmol/kg.

Figura 5. a y b): Biodistribución in vivo en órganos después de la administración de pSLN que contienen complejo B22286 en ratones C57BL/6 sanos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una nanopartícula lipídica sólida paramagnética (pSLN) que comprende un resto quelante de metal paramagnético anfifílico seleccionado de entre: un derivado de diazepina de fórmula l y un derivado de tetraazociclododecano de fórmula ll:

o sales de los mismos, en las que:

Y es un grupo de fórmula Y'-NH- o (Y')2-N-, en el que Y' se selecciona del grupo que consiste en: un grupo alquilo C8-C16 lineal o ramificado saturado o insaturado; un grupo alquilo C1-C10 interrumpido por un grupo fosfato -O-(HO-P=O)-O- opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados de entre: hidroxilo -OH, carboxi -COOR1, oxicarbonil-alquilo (C8-C16) y oxicarbonil-alquenilo (C8-C16); en los que R1 es hidrógeno H o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado; o Y' es un éster monofosfato de un glicerol sustituido o parcialmente sustituido, que tiene al menos un grupo funcional de dicho glicerol esterificado con un ácido graso alifático con cadenas de carbono saturadas o insaturadas, y la función de ácido fosfórico está libre o salificada con un metal alcalino o alcalinotérreo;

RI-IV y RI'm son cada uno, independientemente, un grupo alquil (C¹-C³)-carboxi,

Las pSLN de la invención tienen en promedio la siguiente composición:

- el componente lipídico (que se encuentra principalmente en el núcleo lipídico sólido), representa aproximadamente el 30-50% (peso/peso), preferentemente el 35-45%, y comprende al menos un glicérido seleccionado del grupo que consiste en: monoglicéridos, diglicéridos o triglicéridos con cadenas de hidrocarburo saturadas o insaturadas, lineales o ramificadas, con una longitud que varía de 12-24 átomos de carbono, con temperaturas de fusión superiores a 37 °C, o mezclas de las mismos, y opcionalmente una cadena de ácido graso saturada o insaturada, lineal o ramificada, que contiene de 12 a 24 átomos de carbono, o un éster del mismo. Preferentemente, el ácido graso se selecciona de entre: ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido behénico o mezclas de los mismos. El componente éster de ácido graso puede estar representado, por ejemplo, por el palmitato de cetilo. Opcionalmente, también pueden estar presentes monoésteres o diésteres de ácidos grasos de polietilenglicol y alcoholes alifáticos que contienen de 12 a 24 átomos de carbono. En las pSLN el componente lipídico se encuentra en forma sólida y cristalina.

- el componente anfifílico que se encuentra principalmente alrededor del núcleo lipídico y que es preferentemente un fosfolípido, un lisolípido o un esfingolípido, de cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene de 6 a 24 átomos de carbono. Representa el 27-45% (peso/peso) de la pSLN, tal como se define en la etapa a) del proceso. Es preferentemente un fosfolípido y de forma incluso más preferida representa aproximadamente el 33-38% de pSLN. Tal como se dijo anteriormente, se encuentra principalmente alrededor del núcleo lipídico, junto con el componente anfifílico del complejo paramagnético; y

- el componente anfifílico que consiste en un complejo paramagnético, que representa el 5-14%, de forma más preferida el 8-12%, de la pSLN y es un complejo de fórmula I y/o fórmula II.

Para los fines de la presente invención, por "núcleo lipídico sólido" se entiende un núcleo lipídico que es sólido hasta una temperatura de 55 °C.

En la figura 1 se muestra un esquema.

En una forma de realización preferida de las pSLN, en la que el tensioactivo presente en el componente anfifílico es un fosfolípido o un derivado del mismo, es posible expresar el contenido de complejo anfifílico con respecto al contenido de fósforo presente en el sistema. En este caso, el complejo anfifílico es aproximadamente el 10-30% y preferentemente el 17-23% molar con respecto a los fosfolípidos. De hecho, para una pSLN representativa que comprende el complejo 9b, la relación P/Gd(III) es inferior a 6, preferentemente 5 y corresponde, como se detalla mejor en la parte experimental, a una carga (carga útil) de Gd(III) de al menos 10000, o de forma más preferida al menos 11000, 12000 unidades moleculares de complejo por partícula.

Las pSLN comprenden opcionalmente recubrimientos poliméricos con función "oculta", por ejemplo PEG (polietilenglicol) que tiene preferentemente un peso molecular comprendido entre 500 y 10.000 daltons y de forma más preferida de 2.000 a 5.000 daltons, como tal o derivatizado con funciones alquilo y/o fosfolípido, ligandos específicos para receptores celulares, no derivatizados o derivatizados con funciones alquilo, tales como por ejemplo vitaminas o péptidos con función de ligando. En una forma de realización particularmente preferida, las pSLN incluyen DSPE-PEG 2000-folato.

Los agentes de contraste presentes en las pSLN así formuladas tienen generalmente una relaxividad mucho mayor que los complejos macrocíclicos de bajo peso molecular disponibles comercialmente (véase la tabla I) y, por lo tanto, son capaces de proporcionar una imagen de resonancia magnética de valor diagnóstico con dosis más reducidas del complejo de metal paramagnético. En general, con los agentes de contraste de IRM actualmente disponibles, la dosis administrada en el ámbito clínico es de 0,1 mmol de Gd/kg, aunque los datos preclínicos con pSLN muestran que es posible obtener imágenes de diagnóstico con dosis más reducidas. Además, la alta tasa de relajación, es decir, los altos valores de relaxividad, aseguran una adquisición rápida de información de diagnóstico y una clara identificación del medio de contraste en la región examinada con dosis más reducidas en comparación con los agentes de contraste de IRM tradicionales.

En general, las pSLN según la presente invención se caracterizan por altos valores de relaxividad r1p tanto en solución acuosa (datos no mostrados) como en condiciones fisiológicas (de 25-50 mM^"1s^"1) tal como se describe mejor en la sección experimental (tablas 3 y 4). De hecho, los valores de relaxividad de pSLN r1p a 0,47 T son normalmente superiores a 25 mM’V ¹, preferentemente superiores a 30 mM’V ¹, estando comprendidos de forma más preferida entre 25-50 mM' V ¹medidos en condiciones fisiológicas.

Las pSLN de la invención se caracterizan por un núcleo sólido tal como se demuestra por medio de los datos mostrados en la figura 2.

El pico de fusión endotérmico de una formulación de pSLN preferida, que comprende esencialmente tripalmitina en el núcleo lipídico, está comprendido entre 42 °C y 55 °C. Esto es coherente con el pico de fusión de la tripalmitina que se encuentra a aproximadamente 47 °C (y el valor de inicio de 45 °C) y que corresponde a la temperatura de fusión de una de las formas polimórficas metaestables de la tripalmitina (véase Chapman D. "The polymorphism of glycerides" 1962 y Windbergs et al. AAPS PharmSciTech, 2009, 10: 1224-1233). Un barrido por DSC, tal como se muestra en la figura 2, permite definir cualitativamente la presencia de una estructura sólida en el núcleo de las SLN.

Para composiciones más complejas del núcleo lipídico sólido, el pico de fusión deberá estar comprendido entre 37 °C y 55 °C. Las pSLN también pueden caracterizarse por más de un pico de fusión, cuando están presentes una o más formas polimórficas de un solo componente lipídico o de diferentes formas polimórficas de una mezcla de dos o más formas lipídicas.

Sin desear vincularse a ninguna teoría particular, las pSLN de la presente invención son más estables que las nanoemulsiones o liposomas debido a la presencia del núcleo sólido en su estructura interna. Esto también permite una orientación óptima de los iones Gd(III) quelados hacia el entorno exterior y una mejor accesibilidad de los protones del agua con la consiguiente alta eficacia en la reducción del tiempo de relajación tanto longitudinal como transversal de protones del agua.

Tal como se muestra mejor en la Sección Experimental, tabla 10, las pSLN según la invención muestran propiedades de biodistribución y acumulación de Gd óptimas en un intervalo de tiempo medio-largo (10 días). Muestran, en general, un mayor tropismo por el hígado (en particular por hepatocitos) que otros sistemas de partículas basados en lípidos (por ejemplo, micelas mixtas, véase Anelli et al. MAGMA 2001, 12: 114-120). El hígado es el órgano en el que las pSLN se concentran mayoritariamente dentro de un periodo de 6 horas después de una administración intravenosa, aunque presentan una tasa de depuración igualmente alta que permite una acumulación reducida en un intervalo de medio-largo plazo (en los puntos temporales utilizados, la medición de gadolinio es el indicador de la cantidad de complejo presente en los órganos debido a la estabilidad cinética extremadamente alta de las jaulas de coordinación de los complejos anfifílicos, en particular las de los complejos de fórmula I que, por lo tanto, son particularmente preferidas). Cabe destacar que la acumulación de gadolinio en el bazo (el otro órgano de almacenamiento de nanopartículas) es muy baja y generalmente es más reducida que para otro sistema de nanopartículas basadas en lípidos, por ejemplo micelas mixtas; véase Anelli et al. MAGMA 2001, 12: 114-120. Este es un comportamiento importante de las pSLN que demuestra directamente su capacidad para escapar de la captación de células fagocíticas en el bazo. Esto también está de acuerdo con la observación in vitro de una baja captación de las pSLN de la invención por una línea celular de monolitos-macrófagos U937 en comparación con otros sistemas de partículas basados en lípidos (liposomas). Estas observaciones experimentales demuestran la capacidad mejorada de las pSLN de la invención para escapar del reconocimiento de las células fagocíticas del sistema reticuloendotelial (RES), que afecta a su biodistribución, particularmente aumentando la cantidad de pSLN suministradas a los hepatocitos en el hígado. A través de los hepatocitos, los quelatos de gadolinio pueden eliminarse del cuerpo con una depuración que depende de la anfifilicidad de su estructura química. La baja acumulación de pSLN en las células fagocíticas del RES (células de Kupffer, monocitos y macrófagos) es un factor clave para un uso eficaz in vivo de las mismas. Como los procesos de eliminación de Gd(III) de las células fagocíticas pueden requerir mucho tiempo, el riesgo de efectos tóxicos producidos por el ion metálico aumenta. Aunque los mecanismos de biodistribución y depuración de las nanopartículas, en particular las pSLN, aún no se han aclarado completamente, se propone que las propiedades mejoradas de las pSLN de la presente invención puedan depender principalmente de sus propiedades de superficie optimizadas, que reducen su captación en las células fagocíticas y, en segundo lugar, de las propiedades de los complejos metálicos paramagnéticos seleccionados transportados al hígado por las pSLN.

Se observó que la depuración del complejo de Gd(III) en el hígado se modulaba mediante la lipofMicidad de los complejos metálicos incorporados en las pSLN (es decir, por la longitud de sus cadenas de alquilo), tal como sugieren los resultados in vivo

De hecho, los estudios de biodistribución muestran que las pSLN preparadas con diferentes tipos de complejos anfifílicos tienen perfiles de eliminación que dependen también de la longitud de la cadena. Las tablas 8-9 y 10 muestran algunos ejemplos de mediciones de biodistribución después de la administración de 50 pmol/kg de pSLN a ratones C57BL/6 sanos. La cantidad de metal en diferentes órganos se ha comunicado como % con respecto a la dosis administrada (% de dosis inyectada, % de ID). Los resultados obtenidos con los diferentes complejos anfifílicos utilizados para preparar las pSLN según la invención parecen indicar que la diferencia en la estructura de las cadenas de alquilo (tal como la longitud) y su naturaleza (tal como la presencia de grupos hidrolizables, tales como el fosfato, que hace que las cadenas sean más biodegradables), junto con lo anterior, son factores importantes para modular su biodistribución y para ajustar la tasa de captación en los hepatocitos y su posterior salida a los conductos biliares.

Por lo tanto, según un aspecto preferido, la invención se refiere a pSLN preparadas con los siguientes compuestos anfifílicos: 37a, 12d, 25a, 9b, 9c en orden de preferencia con respecto a su biodistribución (véanse las tablas 8-9 en la parte experimental). Particularmente preferidos son los compuestos 37a y 12d.

Según un aspecto aún más preferido, las pSLN anteriores contienen agentes de direccionamiento molecular y ocultos, por ejemplo ligandos específicos del receptor, tales como preferentemente el DSPE-PEG 2000-folato. Los resultados de los experimentos de captación celular muestran que las pSLN que contienen el derivado de ácido fólico se caracterizan por una mayor afinidad por líneas celulares que sobreexpresan el receptor de folato (por ejemplo, IGROV-1), por lo que se internalizan de forma eficaz dando como resultado, tal como se esperaba, una señal de IRM más intensa que aquellas sin folato. De hecho, en general se sabe que la distribución en tejidos y órganos puede optimizarse dirigiendo los agentes a estructuras biológicas endógenas.

Sin embargo, incluso en ausencia de moléculas dirigidas, las pSLN de la invención proporcionan una señal detectable y representan un agente de diagnóstico de IRM que puede usarse in vivo, tal como se muestra en la parte experimental (figura 4).

Como ya se ha indicado para otros sistemas basados en SLN, la biodistribución y la depuración de órganos de estos sistemas extremadamente complejos también se ven muy afectados por el tamaño de las nanopartículas y sus propiedades superficiales, tales como la densidad de carga superficial. A este respecto, las pSLN de la invención se caracterizan por una distribución de partículas comprendida entre 10 y 220 nm, un diámetro promedio (promedio z) < 100 nm y un índice de polidispersidad (PdI) < 0,2. Preferentemente, las pSLN se caracterizan por un diámetro promedio comprendido entre 50 y 70 nm y una PdI comprendida entre 0,12-0,18 (véase la Parte experimental, tablas 5 y 6).

Estas propiedades se obtienen según el proceso de la presente invención, con el que se puede lograr de forma estándar la dispersión óptima de los complejos anfifílicos y su distribución alrededor del núcleo lipídico. También se ha descubierto que el proceso optimiza la incorporación de complejos metálicos anfifílicos, lo que da como resultado una eficacia de incorporación siempre superior al 55%.

En particular, las mayores eficacias de incorporación se obtienen con complejos con una longitud de las cadenas de alquilo y/o carboxialquilo de al menos 8 átomos de carbono o de forma más preferida de entre 8-16 átomos de carbono o de forma incluso más preferida de entre 10-14 átomos de carbono.

Esto da como resultado una carga útil elevada de pSLN con complejos metálicos, es decir con el metal paramagnético en sí. Este parámetro, medido para algunos compuestos típicos como ejemplos representativos de los complejos de fórmula I y fórmula II, resulta ser superior o igual a aproximadamente 10000, 11000, 12000 unidades moleculares de gadolinio por partícula.

Las pSLN según la invención también ofrecen la ventaja de una estabilidad mejorada en comparación con sistemas micelares, dado que el núcleo sólido proporciona un factor de anclaje para la capa de sustancias tensioactivas y los complejos anfifílicos paramagnéticos. De hecho, a diferencia de los sistemas micelares conocidos, las pSLN no modifican su estructura tras la dilución.

La mayor estabilidad permite un almacenamiento más fácil y más prolongado, también en forma de una dispersión de pSLN de baja concentración lista para inyección.

Como se ha mencionado anteriormente, las pSLN muestran generalmente una relaxividad muy alta en medio fisiológico, más alta que los valores que se encuentran normalmente en complejos de gadolinio hidrófilos no derivatizados, en particular cuando se formulan en SLN, como se detalla mejor en la parte experimental para algunos compuestos representativos. Como ejemplo, los valores de relaxividad para algunos complejos de Gd(III) se indican a continuación, refiriéndose los valores medidos en condiciones fisiológicas a aquellos en HSA al 4% obtenida en NaCI al 0,9%. Algunos de estos compuestos están disponibles comercialmente o no contienen cadenas lipófilas o se han formulado en SLN (Ref. E).

Tabla I. Valores de relaxividad de algunos compuestos conocidos por IRM

Tal como se muestra en las tablas 3 y 4, las pSLN muestran valores de relaxividad más altos que los compuestos anfifílicos quelados en solución, es decir, no formulados en pSLN, como se detalla mejor en la Parte experimental. Por esta razón y por las características mencionadas anteriormente, las pSLN de la invención son adecuadas como agentes de contraste para IRM.

Por lo tanto, la presente invención también comprende composiciones farmacéuticas que comprenden las pSLN descritas suspendidas en una solución adecuada con excipientes, diluyentes o similares fisiológicamente compatibles para uso diagnóstico.

Son particularmente adecuados como agentes de "acumulación sanguínea" por sus características de biodistribución y para estudios de imagen de la microcirculación cerebral, en aplicaciones angiográficas y cuando se altere la permeabilidad de los tejidos, tal como en tejidos inflamados también como consecuencia de patologías tumorales. El procedimiento de obtención de imágenes consiste en obtener una imagen IRM después de la administración de una dosis adecuada de pSLN según la invención o composiciones fisiológicamente compatibles y estériles de las mismas. Una cantidad adecuada para obtener una imagen de IRM utilizando las pSLN de la invención es, por ejemplo, 25-100 pmol/kg.

La invención se refiere además a un proceso optimizado para la preparación de nanopartículas lipídicas sólidas con los complejos anfifílicos de metales paramagnéticos (nanopartículas lipídicas sólidas paramagnéticas pSLN) definidos anteriormente, que comprenden las etapas siguientes:

a) inicialmente se prepara una fase orgánica (O) disolviendo en un solvente orgánico, inmiscibile en agua, los componentes siguientes: un componente anfifílico representado por un complejo de un metal paramagnético y un tensioactivo seleccionado del grupo que consiste en: fosfolípidos, esfingolípidos y lisolípidos caracterizados por cadenas lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas, que contienen de 6 a 24 átomos de carbono y en el que también pueden estar presentes tensioactivos tales como un ácido biliar o derivados del mismo, un glicolípido, un alcohol graso alifático, un dialquiléter, tocoferol o mezclas de los mismos tal como se detalla mejor más adelante, un componente lipídico y, opcionalmente, otros componentes anfifílicos y/o hidrófilos (por ejemplo, polímeros para el recubrimiento de superficies, tales como PEG, preferentemente PEG-2000, opcionalmente modificados adicionalmente con ligandos apropiados para el reconocimiento específico de biomoléculas endógenas y/o componentes lipófilos o anfifílicos). La solubilización de estos componentes se lleva a cabo calentando la fase orgánica (O) a una temperatura comprendida entre 20 °C y 40 °C, de forma más preferida entre 25-37 °C, de forma incluso más preferida entre 30-35 °C. El disolvente orgánico utilizado, inmiscible en agua, es de bajo punto de ebullición, con una temperatura de evaporación comprendida entre 20 °C y 70 °C a presión atmosférica o en condiciones de vacío controlado. Según una forma de realización preferida, el disolvente se selecciona preferentemente de entre: cloruro de metileno, dietiléter, acetato de etilo, formiato de etilo o mezclas de los mismos. Es particularmente preferido el cloruro de metileno.

El componente lipídico se selecciona del grupo que consiste en monoglicéridos, diglicéridos o triglicéridos o mezclas de los mismos, con cadenas de hidrocarburo de longitud comprendida entre 12-24 átomos de carbono, con temperaturas de fusión superiores a 37 °C. Los monoglicéridos son, por ejemplo, 1-monopalmitato de glicerilo o 1-monoestearato de glicerilo; los diglicéridos son por ejemplo, 1,3-dilaurato de glicerilo, 1,3-dipalmitato de glicerilo, 1,3-diestearato de glicerilo. Las cadenas de hidrocarburo pueden ser saturadas o insaturadas y pueden estar ramificadas o no ramificadas. Preferentemente, el componente lipídico consiste en triglicéridos tales como trimiristina, tripalmitina, triestearina y triaraquidina o mezclas de las mismas. El componente lipídico también puede estar compuesto por una mezcla de monoglicéridos, diglicéridos o triglicéridos tales como, por ejemplo, las mezclas comerciales conocidas con la denominación SOFTISAN® y Witepsol®, preferentemente Witepsol® W35, H42, E76, E85 o SOFTISAN® 138, 142, 154.

Preferentemente, el componente lipídico comprende una o más cadenas de ácidos grasos saturadas o insaturadas, lineales o ramificadas, que contienen de 12 a 24 átomos de carbono. Preferentemente, los ácidos grasos pueden ser ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido behénico. El componente lipídico también puede estar compuesto opcionalmente por ésteres de ácidos grasos tales como, por ejemplo, palmitato de cetilo. Opcionalmente también se pueden incluir monoésteres o diésteres de polietilenglicol de ácidos grasos y alcoholes alifáticos que contienen de 12 a 24 átomos de carbono. Según una forma de realización particularmente preferida, el componente lipídico comprende tripalmitina y ácido esteárico, de forma incluso más preferida en una relación en peso comprendida entre 8- 9,9 y 2-0,1 respectivamente. De forma más preferida, la relación entre tripalmitina y ácido esteárico es de 9:1. Según una forma de realización particularmente preferida, se añade un componente anfifílico tal como DSPE-PEG 2000 al componente lipídico. Además, cuando se necesita la inserción de un componente que sea capaz de reconocer específicamente las células tumorales que expresan en exceso el receptor de folato, se puede añadir un componente anfifílico derivatizado con folato (por ejemplo, DSPE-PEG 2000-folato).

El complejo anfifílico de un metal paramagnético se selecciona del grupo que consiste en derivados de fórmula I y/o fórmula II, compuestos de coordinación de iones metálicos, caracterizados por una parte alifática lipófila y una jaula de coordinación.

Dicha jaula de coordinación pertenece principalmente a dos clases: derivados de diazepina (fórmula I) y derivados de tetraazaciclododecano (fórmula II).

Las estructuras anfifílicas derivadas de la jaula de coordinación de tipo diazepina se caracterizan por la fórmula (I) o una de sus sales:

Las estructuras anfifílicas con una jaula de coordinación de tipo tetraazaciclododecano se caracterizan por la fórmula (II), o una de sus sales:

(II)

en las que tanto para la fórmula I como para la fórmula II:

Y es un grupo de fórmula Y'NH- o (Y')2N-, en la que Y', que en el caso de (Y')2N- puede ser igual o diferente, se selecciona de entre los siguientes: un grupo alquilo C8-C16 lineal o ramificado saturado o insaturado; un grupo alquilo C1-C10 interrumpido por un grupo -O-(HO-P=O)-O, u opcionalmente sustituido con uno o más átomos o grupos seleccionados del grupo que consiste en: grupos hidroxilo -OH, carboxi -COOR1 , oxicarbonil-alquilo (C8-C16) y oxicarbonil-alquenilo (C8-C16); en el que R1 se selecciona de entre hidrógeno H y un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado; o Y' es un éster monofosfato de un glicerol sustituido o parcialmente sustituido, que tiene al menos un grupo funcional de dicho glicerol esterificado con un ácido graso alifático con cadenas de carbono saturadas o insaturadas, y la función de ácido fosfórico está libre o salificada con un metal alcalino o alcalinotérreo.

L es un enlazador bivalente seleccionado de entre: un grupo cíclico o heterocíclico C3-C10 alifático o alquilo o alquinilo C1-C6 lineal o ramificado, opcionalmente sustituido o interrumpido con un átomo o un grupo seleccionado de entre: carbonilo -C=O, tiocarbonilo -C=S, amino -NR1-, carboxi -COO-, oxi-carbonilo -OCO-, amido -NR1CO- o -CONR1-, oxígeno -O- y azufre -S-, en los que R1 es tal como se ha definido anteriormente; ri-iv y RI-m son cada uno, independientemente, un grupo alquil (C1-C3)-carboxi,

El grupo Y está unido al grupo L, preferentemente por medio de un enlace amida entre un átomo de nitrógeno terminal del grupo Y y un carbonilo (-C=O) o tiocarbonilo (-C=S), presente en el extremo terminal que se conecta con Y. Preferentemente, el grupo Y está en la forma: (Y')2-N- en la que los residuos Y' son iguales o diferentes y son cadenas de alquilo, con longitud de C8-C16, preferentemente C10-C14, y son de forma más preferida C10H21 y C12H25. Según una forma de realización preferida, el grupo Y tiene por lo tanto la fórmula:

^ ¹⁰^ ²¹^ ^ ¹²^ ²⁵^

N— # N— #

^ ¹⁰^ ²¹^ ^q^ ¹²^ ^{25^}

en la que # indica el punto de unión al enlazador L.

Alternativamente, el grupo Y también puede tener la fórmula: Y'-NH-, en la que Y' es un grupo alquilo C8-C16, de forma más preferida un grupo alquilo C10-C14, interrumpido por uno o más grupos fosfato de fórmula:

Según esta forma de realización, Y es un fosfolípido que tiene la fórmula: Y'-NH- en la que Y' es un grupo alquilo C10-C14, interrumpido por uno o más grupos fosfato tal como se han definido anteriormente, sustituido adicionalmente con al menos uno y preferentemente 2 o 3 grupos carboxialquilo que contienen 8-16 átomos de carbono, o de forma más preferida 10-14 átomos de carbono.

En una forma de realización alternativa adicional, Y es un éster monofosfato de un glicerol sustituido o parcialmente sustituido, que tiene al menos un grupo funcional de dicho glicerol esterificado con un ácido graso alifático con cadenas C-C saturadas o insaturadas, y la otra función del ácido fosfórico está libre o salificada con metales alcalinos o alcalinotérreos.

Según esta forma de realización alternativa adicional, Y se selecciona de entre los grupos siguientes:

en las que # indica el punto de unión al enlazador L.

Son particularmente preferidos los complejos que utilizan agentes quelantes de fórmula I.

El enlazador L es un grupo bivalente que en los derivados de fórmula (I) conecta el resto de diazepina con el grupo Y y, de forma similar, en los derivados de fórmula (II) conecta el tetraazaciclododecano con el grupo Y.

L es un grupo seleccionado de: un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C6, lineal o ramificado, opcionalmente funcionalizado en un extremo terminal con un grupo tiocarbonilo (-C=S), o de forma más preferida con un grupo carbonilo (-C=O) como punto de unión para el átomo de nitrógeno terminal del residuo Y en la fórmula (I).

Preferentemente, el enlazador L es un derivado de carbonil-alquilo seleccionado de entre: derivados de alquilo C1-C6 lineales y derivados de cicloalquilo C6-C8, sustituidos o no sustituidos, que tienen una función carbonilo en el extremo terminal conectada al grupo Y. Algunos ejemplos de enlazadores son: metilcarbonilo, etilcarbonilo, propilcarbonilo, butilcarbonilo, pentilcarbonilo y hexilcarbonilo lineal o cíclico.

Para los compuestos de fórmula (I), de forma más preferida, el enlazador L se selecciona de entre: butilcarbonilo de fórmula d) y ciclohexilcarbonilo de fórmula e.

en los que # indica el punto de unión a una diazepina de fórmula (I). Para los compuestos de fórmula (II), el enlazador L se selecciona preferentemente de entre: metilcarbonilo de fórmula f) y carboxipropilcarbonilo de fórmula g)

en los que # indica el punto de unión al tetraazaciclododecano de fórmula (II).

Como se ha indicado anteriormente, el enlazador L se une en un extremo al grupo Y y en el otro extremo a la diazepina o tetraazaciclododecano. El grupo Y de fórmula Y'-NH- o (Y')2-N- tiene un átomo de nitrógeno terminal al que se une el enlazador L a través de un enlace amida.

en los que Y' es según las definiciones anteriores y # indica el punto de unión a diazepina del derivado de fórmula (I).

Para los compuestos de fórmula (II), los sistemas L-Y se seleccionan preferentemente de entre:

en los que Y' se define como anteriormente y # indica el punto de unión al tetraazaciclododecano del derivado de fórmula (II).

Según una forma de realización preferida, la pSLN comprende preferentemente compuestos de fórmula (I) seleccionados del grupo que consiste en:

en los que RI-IV son tal como se han definido anteriormente.

Según una forma de realización preferida, los grupos RI_IV son iguales y son: CH2-COOH. El resto quelante está complejado con un ion metálico paramagnético seleccionado del grupo que consiste en: Gd(III), Mn(II), Cr(III), Cu(II), Fe(III), Pr(III), Nd(III), Sm(III), Tb(III), Yb(III), Dy(III), Ho(III) y Er(III), prefiriéndose Gd(III).

Por lo tanto, los agentes quelantes preferidos de fórmula (I) se definen por la fórmula general (I'):

o una de sus sales, preferentemente en forma de un complejo con un ion metálico paramagnético, preferentemente Gd3+, en la que L e Y y su combinación L-Y son tal como en las formas de realización preferidas descritas anteriormente.

De forma similar, los agentes quelantes preferidos de fórmula II tienen la fórmula general II', o una de sus sales tal como se ha definido anteriormente:

en la que L e Y, y su combinación L-Y, son como en sus formas de realización preferidas descritas anteriormente.

Por lo tanto, según la estructura de Y y L, los compuestos de fórmula (I') preferidos para la preparación de pSLN, en una forma complejada a un ion metálico paramagnético seleccionado del grupo que consiste en: Gd(III), Mn(II), Cr(III), Cu(II), Fe(III), Pr(III), Nd(III), Sm(III), Tb(III), Yb(III), Dy(III), Ho(III) y Er(III), preferentemente Gd3+, y/o en la forma de su sal fisiológicamente compatible, se seleccionan del grupo que consiste en:

Los complejos preferidos de fórmula II' se seleccionan del grupo que consiste en:

Son particularmente preferidos los complejos: 37a y 32a y 32b.

El uso del complejo preferido anterior de fórmula I' y II' y de los complejos quelados Gd(III) que se indicó anteriormente que son particularmente adecuados para la preparación de pSLN también se describe en la presente invención. La síntesis de compuestos quelantes anfifílicos se lleva a cabo según procedimientos resumidos brevemente a continuación, o detallados en la parte experimental.

Como se ha indicado anteriormente, en la etapa del procedimiento a), uno de los componentes anfifílicos está representado por un tensioactivo seleccionado del grupo que consiste en: fosfolípidos, esfingolípidos y lisolípidos caracterizados por cadenas lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas que contienen de 6 a 24 átomos de carbono. Este componente es preferentemente un fosfolípido, entre los cuales se prefieren fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol o mezclas de los mismos. De forma incluso más preferida, los fosfolípidos son de origen natural, tales como lecitina de soja o de huevo, ambas disponibles comercialmente (Epikuron 200®, Epikuron 170® o Epikuron 100®, Lipoid® S 75, Lipoid® S 100 o lecitina de huevo Lipoid® E80). El componente anfifílico con propiedades tensioactivas de la etapa a) también puede comprender ácidos biliares o sus sales, glicolípidos, ácidos grasos, alcoholes alifáticos, dialquiléteres o tocoferol.

Durante la solubilización se pueden incluir durante la solubilización opcionalmente otros tensioactivos, tales como monoglucósidos u oliglucósidos y sus análogos etoxilados, monoésteres, diésteres y triésteres de glicerol con bajo punto de fusión y preferentemente fundidos a temperatura ambiente.

Según una forma de realización preferida, la concentración de reactivos en la fase orgánica O preparada en la etapa a) se puede resumir de la forma siguiente:

- lípido:

■ del cual glicéridos: 0,115-0,170 M,

■ del cual fosfolípido, cuando está presente: 0,115-0,170 M,

■ ácido graso, cuando esté presente: 0,032-062 M

- recubrimiento polimérico (es decir, PEG) cuando está presente: 0-0,018 M

- complejo paramagnético: 0,014 -0,038 M;

b) en paralelo o subsiguientemente, se prepara una fase acuosa (W) que contiene uno o más tensioactivos y opcionalmente una sustancia cotensioactiva, normalmente un alcohol polialquílico útil para aumentar las propiedades de solvatación del disolvente utilizado en la etapa a). Las sustancias tensioactivas preferidas en esta fase se seleccionan de entre sustancias iónicas de bajo peso molecular, de forma incluso más preferida sustancias tensioactivas aniónicas seleccionadas del grupo que consiste en: ácido cólico y sus derivados, por ejemplo ácido taurocólico o sus sales hidratadas, colato de sodio, glicolato de sodio y taurodesoxicolato de sodio. Según una forma de realización particularmente preferida, se utiliza taurocolato sódico (como emulsionante), de forma incluso más preferida combinado con 1-butanol como cosolvente, disuelto para formar la fase acuosa (W). Entre los tensioactivos aniónicos también se pueden utilizar polialquilfosfatos, alquilsulfatos o sulfonatos o alquilsulfosuccinatos, tales como dioctilsuccinato de sodio.

Como sustancias cotensioactivas se utilizan alcoholes polialquílicos que contienen de 3 a 8 átomos de carbono tales como alcoholes monohidroxílicos (por ejemplo, 1-propanol, 1-butanol, 1-pentanol, 1-hexanol, 1-heptanol, 1-octanol, 3-heptanol y 4-pentanol), o dioles tales como esadiol o ácidos grasos de bajo peso molecular, tales como el ácido butírico.

Opcionalmente, se pueden añadir en esta fase los otros componentes hidrófilos (por ejemplo, agentes de direccionamiento, o sistemas poliméricos, tales como PEG);

c) la fase orgánica (O) preparada en a) se mezcla después suavemente con la fase acuosa (W) preparada en b), para obtener una microemulsión (W/O) estable y transparente a la temperatura definida en la etapa a). El tiempo de mezclado es generalmente de unos 20-30 minutos;

d) la microemulsión (W/O) obtenida en la etapa c) se añade después a una solución acuosa (W1) que comprende al menos un tensioactivo iónico o no iónico o sus mezclas a una temperatura preferentemente seleccionada de entre las definidas en la etapa a), para obtener una emulsión múltiple (W/O/W1).

Entre los tensioactivos no iónicos añadidos en la etapa W1 d) como tensioactivo, los preferidos son derivados monoéster, diéster y triéster de ácidos grasos saturados e insaturados que contienen de 6 a 24 átomos de carbono de sorbitán y derivados etoxilados análogos. De forma más preferida, la formulación comprende monooleato de polioximetilen-sorbitán, disponible comercialmente como Polysorbate 80 (Tween® 80) y/o compuestos similares tales como Polysorbate 60 (Tween® 60), Polysorbato 40 (Tween® 40). También pueden incluirse derivados adicionales de sorbitán, tales como monopalmitato de sorbitán (Span® 40) monoestearato de sorbitán (Span® 60), monooleato de sorbitán (Span® 80). Entre los agentes tensioactivos no iónicos se prefieren derivados de monoéster, diéster o triéster de ácidos grasos C6-C24, por ejemplo etoxilatos. De forma más preferida, la sustancia tensioactiva no iónica es monooleato de polioxietilen-sorbitán (Tween®80);

e) el disolvente orgánico se elimina de la emulsión múltiple, preferentemente por evaporación a presión atmosférica o en condiciones de vacío controlado. La evaporación también se puede obtener aumentando la temperatura de la emulsión múltiple, hasta una temperatura superior a la temperatura de evaporación del disolvente utilizado;

f) la suspensión se enfría lentamente en aproximadamente 2 horas hasta alcanzar una temperatura inferior al punto de cristalización del núcleo lipídico; preferentemente la dispersión se enfría a 10 °C a una velocidad comprendida entre 0,1 y 0,4 °C/min, preferentemente entre 0,2 y 0,4 °C/min, de forma incluso más preferida entre 0,22 y 0,3 °C/min y de forma más preferida a 0,25 °C/min.

Se obtiene una suspensión de pSLN que puede utilizarse, después de una dilución adecuada, como un agente de contraste de RM y, por ejemplo, para fines de investigación.

Según una forma de realización preferida para la preparación de agentes de contraste inyectables, la dispersión se purifica después del exceso de componentes no incorporados en las SLN (etapa g) y se esteriliza (etapa h). Los procedimientos de purificación pueden incluir diálisis, ultrafiltración o ultracentrifugación. Preferentemente, la formulación se somete a ultrafiltración utilizando una membrana de ultrafiltración de 30 kDa, preferentemente utilizando una solución isotónica de glucosa, y se concentra hasta una concentración final de gadolinio comprendida entre 8 y 12 mM, de forma más preferida entre 9 y 11 mM. La formulación después se esteriliza, por ejemplo, mediante filtración a través de filtros de 0,22 pm.

Con estos compuestos, la eficacia de incorporación del agente de contraste en pSLN, calculada como % de complejo metálico incluido en las pSLN en comparación con la cantidad inicial disuelta en la etapa a) de la preparación, es generalmente superior o igual al 55%, preferentemente superior al 60%, 70%, de forma incluso más preferida superior al 80%.

En particular, al final de la etapa de purificación, preferentemente llevada a cabo por ultrafiltración directa en un líquido inyectable y fisiológicamente compatible, se obtiene una dispersión coloidal para inyección en la que la fase particulada es preferentemente de aproximadamente el 5-16%, de forma más preferida del 6-12% de la dispersión. La fase particulada, que consiste en una pSLN cuya estructura se representa esquemáticamente en la figura 1, está constituida por un núcleo cristalino sólido, formado por el componente lipídico (tal como se identifica en la etapa a) del proceso de preparación que comprende: monoglicéridos, diglicéridos o triglicéridos que tienen una longitud de cadena de C12-C24, saturados o insaturados, lineales o ramificados, o sus mezclas. Preferentemente, el núcleo cristalino comprende un único triglicérido, preferentemente seleccionado de entre triglicéridos saturados, de forma más preferida tripalmitina. El núcleo también puede contener un ácido graso o un alcohol graso saturado o insaturado, lineal o ramificado, con una cadena C12-C24, o sus mezclas. También pueden estar presentes ácidos grasos tales como monoéster o diéster de óxido de etileno, aunque un ácido graso particularmente preferido es el ácido esteárico o sus sales. El núcleo lipídico es sólido hasta una temperatura de 55 °C.

El núcleo está rodeado por los componentes con características anfifílicas y los tensioactivos definidos en las etapas a)-d) del proceso para la preparación de las pSLN, que representan, así, la interfaz con el medio externo, generalmente acuoso, tal como la sangre o la formulación farmacéutica. Tal como se ilustra en la figura 1, el componente anfifílico puede comprender opcionalmente un recubrimiento polimérico (agente oculto).

Después de los procedimientos de purificación y/o lavado, la dispersión de pSLN deberá considerarse exenta de los tensioactivos iónicos hidrófilos de bajo peso molecular utilizados.

En consecuencia, un aspecto adicional de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden las SLN paramagnéticas, preparadas tal como se ha descrito y que comprenden un complejo quelante de iones metálicos seleccionado en los grupos de fórmula general fórmula I, fórmula II, o de forma más preferida de fórmula general I' y II'.

Para los fines de la invención, las fórmulas de la Descripción se aplican a los compuestos en su forma ópticamente pura y a sus mezclas racémicas. Además, en general, el término "complejo" define el compuesto anfifílico con dos tipos de jaulas de coordinación, cuando se "compleja" con el metal paramagnético, a menos que se proporcionen definiciones específicas diferentes en la descripción de la invención, obvias para un técnico del sector. La preparación de los complejos con el metal es conocida en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO00/30688).

Además, los compuestos de fórmula I y I' y II o II' tal como se definen en el presente documento pueden encontrarse en forma de sal con bases o iones fisiológicamente aceptables de ácidos orgánicos o inorgánicos.

Las bases particularmente preferidas se seleccionan de entre aminas primarias, secundarias o terciarias, aminoácidos básicos e hidróxidos inorgánicos de sodio, potasio, magnesio, calcio o mezclas de los mismos. Los aniones de ácidos orgánicos son: acetato, succinato, fumarato, maleato, oxalato; los aniones de ácidos inorgánicos son: sulfatos, fosfatos, fosfonatos, etc. Entre los aminoácidos se prefieren la lisina, arginina, ornitina, ácido aspártico o glutámico, etc.

Según una forma de realización adicional, la invención también se refiere a agentes quelantes anfifílicos de fórmula (II'):

en la que:

Y es un grupo de fórmula Y'-NH- o (Y')2-N-, en el que Y' se selecciona de entre los grupos siguientes: un grupo alquilo C8-C16 lineal o ramificado, saturado o insaturado; un grupo alquilo C1-C10 que puede estar interrumpido por un grupo fosfato -O-(HO-P=O)-O- opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados de entre: grupos hidroxilo -OH, carboxi -COOR1, oxicarbonil-alquilo (C8-C16) y oxicarbonil-alquenilo (C8-C16); en el que R1 es hidrógeno H o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, o una sal del mismo;

L es un enlazador bivalente que contiene un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado opcionalmente sustituido o interrumpido con un grupo o un átomo seleccionado de entre: carbonilo -C=O, amino -NR1-, carboxi -COO-, amida -NR1CO- o -CONR1-, en los que R1 es tal como se ha definido anteriormente;

Más preferidos son los compuestos:

Además, la invención comprende el uso de los compuestos siguientes para la preparación de nanopartículas lipídicas, preferentemente sólidas, caracterizadas por una alta eficacia de incorporación en la capa o núcleo lipídico,

Síntesis de los compuestos de fórmula I y II. Esquema general

Los compuestos de fórmula (I) de la invención pueden prepararse mediante un proceso que comprende en primer lugar la formación de un aducto entre el enlazador L seleccionado y el resto de diazepina, seguida de la activación de la función carboxílica del extremo terminal del enlazador, y la subsiguiente amidación con el grupo Y seleccionado. Finalmente, los grupos protectores, cuando están presentes en el producto obtenido, se eliminan y el derivado opcionalmente se compleja con un metal paramagnético seleccionado.

El aducto entre el enlazador L y el resto de diazepina denominado "reactivo" del proceso sintético se obtiene mediante la reacción de un derivado nitro adecuado, que es un precursor del enlazador seleccionado, con N,N'-dibenciletilendiamina, que es el precursor de la diazepina. Subsiguientemente, el grupo nitro se reduce y se funcionaliza, normalmente mediante hidrogenación y subsiguiente N-alquilación en condiciones básicas. Dicho aducto entre el enlazador y el resto de diazepina puede prepararse y utilizarse ventajosamente como bloque de construcción para la preparación de una serie de derivados de fórmula (I) variando el resto Y seleccionado.

Por lo tanto, la síntesis para la preparación de un compuesto definido por las fórmulas (I) y (II)

comprende las etapas siguientes:

a) preparación de un aducto de fórmula:

en la que RI IV son tal como se han definido anteriormente y L es el enlazador que comprende una función carboxílica terminal,

b) activación de dicha función carboxílica terminal del enlazador.

c) reacción de amidación entre el producto de la etapa b) y el grupo Y tal como se ha definido anteriormente. d) escisión de cualquier grupo protector para dar el derivado de fórmula (I) o (II);

e) quelación con un ion metálico paramagnético, para dar el derivado de fórmula (I) o (II) en forma de un complejo paramagnético.

Según un ejemplo ilustrativo, el proceso de la invención puede representarse generalmente por los procesos para la preparación del derivado 12a, en el que el compuesto 5 es el aducto de partida, tal como se indica a continuación:

En particular, el aducto 5 entre el enlazador y el resto de diazepina se prepara mediante reacción de diacetato de W,W-dibenciletilendiamina y una solución alcohólica de éster metílico del ácido 6-nitrohexanoico 1, en presencia de paraformaldehído seguida de: reducción del grupo nitro 2, funcionalización del derivado amino 3 y escisión selectiva del grupo carboxílico terminal 4, tal como se indica en el esquema 2, a continuación:

Esquema 2

El derivado de diazepina, representado en general por el compuesto 5, se somete a la activación de la función carboxílica terminal según la etapa b) del presente proceso. La activación puede llevarse a cabo según procedimientos generalmente conocidos en química orgánica para la activación de funciones carboxílicas, normalmente mediante reacción con un agente activador de carboxilo, tal como W-hidroxisuccinimida (NHS) en presencia de una carbodiimida tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) o 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC), en una proporción molar de al menos 1:1 o preferentemente en un ligero exceso con respecto al material de partida, por ejemplo en una relación molar de hasta 1:1,5, en un disolvente orgánico apropiado, tal como un disolvente orgánico apolar seleccionado de entre: CHCL, CH2Cl2 y similares. Preferentemente, la etapa b) se lleva a cabo en presencia de W-hidroxisuccinimida (NHS) y EDC en una relación molar de 1:1 a 1:1,1 con respecto al material de partida, y en presencia de CH2Cl2. El derivado así obtenido se somete después según la etapa c) a una reacción de amidación entre el grupo terminal carboxílico activado del enlazador L y el átomo de nitrógeno del residuo Y seleccionado, por ejemplo, dibutilamina, generalmente en presencia de una diisopropiletilamina (DIPEA).

Preferentemente, la reacción de amidación se lleva a cabo disolviendo el compuesto activado obtenido después de la etapa b) en CHCL y añadiendo, por ejemplo, dibutilamina y DIPEA en este orden en una relación molar de 1:1 a 1:1,7 con respecto al material de partida. La solución se agita después durante un período de tiempo adecuado a una temperatura seleccionada, generalmente a temperatura ambiente (por ejemplo a una temperatura comprendida entre 15 a 30 °C) generalmente durante un período de hasta 20-24 horas. El producto de amida así formado se purifica, por ejemplo lavando con agua y evaporando la fase orgánica separada, generalmente al vacío o mediante un procedimiento de destilación. Después de la purificación, por ejemplo, mediante cromatografía, el producto de fórmula (I) se obtiene en una forma protegida, por ejemplo preferentemente como derivado de éster terc-butílico, con un rendimiento elevado (aproximadamente 80%) y con un alto grado de pureza (aproximadamente 95-99% por HPLC). Según la etapa d), los derivados de fórmula (I) obtenidos en su forma protegida carboxílica pueden desprotegerse fácilmente en las condiciones conocidas en la técnica, y dependen, por ejemplo, del tipo de grupo protector realmente empleado en la etapa a). Para una referencia general sobre la elección de posibles grupos protectores, véase "Greene's protective groups in organic synthesis" Wiley, 14a edición.

En una forma de realización preferida, la función carboxílica se protege como éster terc-butílico, y la desprotección se lleva a cabo en condiciones ácidas, normalmente en presencia de ácido trifluoroacético (TFA) y un disolvente apolar orgánico tal como CH2O 2.

La síntesis de los compuestos de fórmula (II) se llevó a cabo partiendo del éster tris(1,1-dimetil)etílico del ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético 26 disponible comercialmente, o del éster tetra(1,1-dimetil)etílico del ácido a-(2-carboxietil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético 33 preparado según la literatura [Stuart G. Levy, Vincent Jacques, Kevin Li Zhou, Shirley Kalogeropoulos, Kelly Schumacher, John C. Amedio, Jonathan E. Scherer, Steven R. Witowski, Richard Lombardy y Karsten Koppetsch Org. Process. Res. Dev.

2009, 13 (3), 535-542].

Los compuestos 26 y 33 tal como se definen en la parte experimental se han sometido a activación de la función carboxílica, reacción de amidación y desprotección de las funciones carboxílicas protegidas.

Después de la desprotección, los compuestos así obtenidos de fórmula (I) y (II) pueden hacerse reaccionar adecuadamente con un compuesto que contiene ion metálico para obtener los derivados de complejos metálicos correspondientes. Dicha transformación se lleva a cabo típicamente por reacción con una sal u óxido inorgánico u orgánico del metal seleccionado, operando en presencia de un disolvente tal como agua o un disolvente orgánico, por ejemplo CHCh o MeOH, o una mezcla de los mismos. Los contraiones preferidos del metal son cloruro o acetato, y las sales preferidas son: GdCl3, Gd(OAc)3, mientras que entre los óxidos preferidos se encuentra el Gd²O³.

Parte experimental

Preparación de compuestos de fórmula (I)

Ejemplo 1: Preparación de compuestos 9a-c según el esquema 3

Ejemplo 1.1: Preparación del compuesto 5. El compuesto 5 se preparó en cinco etapas según el procedimiento descrito en el documento US2006018830 tal como se ilustra en el esquema 2 siguiente.

Esquema 2

Se sometió a reflujo 2-nitrociclohexanona en MeOH en presencia de Amberlyst A21 para dar el éster metílico del ácido 6-nitrohexanoico 1. La reacción de 1 con W,W'-diacetato de dibenciletilendiamina y paraformaldehído proporcionó diazepina 2 que en primer lugar se hidrogenó para dar 3 y después se alquiló con bromoacetato de tbutilo para dar el pentaéster 4. La hidrólisis selectiva de 4 por medio de LiOH en THF/H2O proporcionó 5. Rendimiento general del 13%.

Ejemplo 1.1a: Preparación del compuesto 6

Éster bis[(1,1-dimetil)etilílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1-dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi]-5-oxopent-1-il]tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

El compuesto 5 (14,6 g; 0,022 mol) se disolvió en CH2Cl2 (350 ml), después se añadió NHS (3,75 g; 0,033 mol) y la mezcla se enfrió a 0 °C en un baño de hielo. Se añadió gota a gota una solución de EDC (6,25 g; 0,033 mol) en CH2Cl2 (150 ml), después la solución de reacción se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. La mezcla se lavó con H2O (3 x 150 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO), se filtró y se evaporó para dar 6 como un aceite amarillo (15,42 g; 0,020 mol).

Rendimiento del 92%.

Datos analíticos:

Mr: 768,94 (C38H64N4O12)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura

Ejemplo 1.2: Preparación de compuestos 7a-c. Procedimiento general

El compuesto 6 (1 eq) se disolvió en CHCh (concentración del 1% p/v). Se añadieron una fosfoetanolamina adecuada (1 eq) (1,2-didecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DLPE o dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DPPE) y diisopropiletilamina (DIPEA) (1,7 eq) en este orden. La solución se agitó a temperatura ambiente de 3 h a 24 h. La mezcla se lavó secuencialmente con H2O (1 x 50 ml), H2O acidificada (pH 4-5 con HCl; 1 x 50 ml) y H2O (1 x 50 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó. El material bruto así obtenido se purificó por cromatografía ultrarrápida para proporcionar los compuestos 7a-c en forma de un material sólido blanco.

Ejemplo 1.2a: Preparación del compuesto 7a

Éster bis[(1,1-dimetil)etilílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1-dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[(13R)-10-hidroxi-10-oxido-5,16-dioxo-13-(1-oxodecil)oxi]-9,11,15-trioxa-6-aza-10-fosfapentacos-1-il]tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético Reactivos: Compuesto 6 (797 mg; 1,04 mmol); 1,2-didecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (543 mg; 1,04 mmol). Compuesto 7a (937 mg; 0,796 mmol). Rendimiento del 77%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 100% (% en área);

Mr: 1177,50 (C59H109N4O17P)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura

Ejemplo 1.2b: Preparación del compuesto 7b

Éster bis[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[(13R)-10-hidroxi-10-oxido-5,16-dioxo-13-(1 -oxodecil)oxi]-9,11,15-trioxa-6-aza-10-fosfaeptacos-1 -il]-tetrahidro- 1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético Reactivos: Compuesto 6 (700 mg; 0,91 mmol); 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DLPE (500 mg; 0,86 mmol)

Compuesto 7b (927 mg, 0,751 mmol). Rendimiento del 87%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 100% (% en área);

Mr: 1233,61 (C63H117N4O17P)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 1.2c: Preparación del compuesto 7c

Éster bis[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[(13R)-10-hidroxi-10-oxido-5,16-dioxo-13-(1-oxodecil)oxi]-9,11,15-trioxa-6-aza-10-fosfanonacos-1-il]-tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético Reactivos: Compuesto 6 (1,92 g; 2,50 mmol); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DPPE (1,73 g; 2,50 mmol).

Compuesto 7c (2,79 g; 2,07 mmol). Rendimiento del 83%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 100% (% en área);

Mr: 1345,82 (C71H133N4O17P)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 1.3: Escisión de ásteres t-butílicos. Procedimiento general

Se disolvió el compuesto 7a-c (1 eq) en CH2O 2 (concentración del 2-4% p/v) y la solución se agitó y se enfrió a 0 °C, después se añadió gota a gota TFA (6 eq). La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución se evaporó y el residuo se disolvió en TFA nuevo (30 eq). Esta solución se agitó durante 80 h a temperatura ambiente; la reacción se controló mediante análisis de EM y HPLC-ELSD. La mezcla se evaporó y el residuo se trató con diisopropiléter para obtener un sólido blanco que se centrifugó y se lavó con diisopropiléter (2 x 30 ml). Ese sólido se suspendió en H2O, se disolvió a pH 6-7 mediante la adición de NaHCO3 ac. al 5% y se precipitó a pH 2 mediante la adición de HCl 1 M. El sólido se filtró y se secó a presión reducida (P2O5) para obtener los ligandos 8a-c según los datos siguientes.

Ejemplo 1.3a: Preparación del compuesto 8a

Ácido 6-[bis[2-[(1,1dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[(13R)-10-hidroxi-10-oxido-5,16-dioxo-13-(1-oxodecil)oxi]-9,11,15-trioxa-6-aza-10-fosfapentacos-1-il]-tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

Reactivos: Compuesto 7a (885 mg; 0,752 mmol).

Compuesto 8a (669 mg; 0,702 mmol); Rendimiento del 93%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 92,3% (% en área)

Mr: 953,07 (C43H77N4O17P)

Título complejométrico (GdCl31,001 mM): 95,7%

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 1.3b: Preparación del compuesto 8b

Ácido 6-[bis[(carboximetil)amino]-6-[(13R)-10-hidroxi-10-oxido-5,16-dioxo-13-(1-oxodecil)oxi]-9,11,15-trioxa-6-aza-10-fosfaeptacos-1-il]-tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

Reactivos: Compuesto 7b (875 mg, 0,709 mmol).

Compuesto 8b (750 mg; 0,642 mmol); Rendimiento del 91%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 75,5% (% en área)

Mr: 1009,18 (C47H85N4O17P)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 1.3c: Preparación del compuesto 8c

Ácido 6-[bis[(carboximetil)amino]-6-[(13R)-10-hidroxi-10-oxido-5,16-dioxo-13-(1-oxodecil)oxi]-9,11,15-trioxa-6-aza-10-fosfanonacos-1 -il]-tetrahidro- 1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

Reactivos: Compuesto 7c (2,79 g; 2,07 mmol)

Compuesto 8c (1,77 g; 1,58 mmol); Rendimiento del 76%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 95,3% (% en área)

Mr: 1121,39 (C55H101N4017P)

Título complejométrico (GdCl31,001 mM): 95,7%

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 1.4: Complejación en medio acuoso. Procedimiento general

Los ligandos 8(a-c) (1 eq) se resuspendieron en H2O (concentración del 5%; pH 1-2) y se disolvieron a pH de 6,5-7 mediante la adición de solución acuosa al 5% de NaHCO3. Se añadió en porciones una solución titulada de GdCl3 (1 eq). La solución se agitó a temperatura ambiente y el pH se mantuvo constante mediante la adición de una solución al 5% de NaHCO3. La complejación se supervisó mediante HPLC-ELSD y con un ensayo de naranja de xilenol. El complejo se aisló mediante liofilización y se purificó a partir de sales mediante cromatografía de exclusión por tamaño para dar los compuestos 9a-c.

Ejemplo 1.4a: Preparación del compuesto 9a

[[6-[Bis[(carboximetil)amino]-6-[(13R)-10-hidroxi-10-oxido-5,16-dioxo-13-( 1-oxodecil)oxi]-9,11,15-trioxa-6-aza-10-fosfapentacos-1-il]-tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacetato(4-)]gadolinato(1-)]sodio

Reactivos: Compuesto 8a (400 mg, 0,438 mmol)

Compuesto 9a (257 mg, 0,228 mmol); Rendimiento del 52%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 98,9% (% en área)

Mr: 1129,28 (C43H73GdN4NaO17P)

EM es compatible con la estructura.

Ejemplo 1.4b: Preparación del compuesto 9b

[6-[Bis[(carboximetil)amino]-6-[(13R)-10-hidroxi-10-oxido-5,16-dioxo-13-(1-oxodecil)oxi]-9,11,15-trioxa-6-aza-10-fosfaeptacos-1-il]-tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacetato(4-)]gadolinato(1-)]sodio

Reactivos: Compuesto 8b (690 mg, 0,590 mmol)

Compuesto 9b (614 mg; 0,518 mmol); Rendimiento del 88%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 95,6% (% en área)

Mr: 1185,39 (C47H81GdN4NaO17P)

EM es compatible con la estructura.

Ejemplo 1.4c: Preparación del compuesto 9c

[6-[Bis[(carboximetil)amino]-6-[(13R)-10-hidroxi-10-oxido-5,16-dioxo-13-( 1-oxodecil)oxi]-9,11,15-trioxa-6-aza-10-fosfanonacos-1-il]-tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacetato(4-)]gadolinato(1-)]sodio

Reactivos: Compuesto 8c (500 mg, 0,435 mmol)

Compuesto 9c (517 mg, 0,398 mmol); Rendimiento: 92%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 99,2% (% en área) [8]

Mr: 1297,60 (C55H97GdN4NaO17P)

EM es compatible con la estructura.

Ejemplo 2: Preparación de compuestos 12d-e

El compuesto 6 preparado según el ejemplo 1.1a (1 eq) se disolvió en CHCI3 (concentración del 1-3% p/v) con la dialquilamina (1 eq) y DIPEA (1,7 eq). La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h y subsiguientemente se lavó con H2O (1 x 50 ml), H2O acidificada (pH 4-5 con HCl; 1 x 70 ml) y H2O (1 x 50 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó. El producto obtenido de esta forma se purificó por cromatografía ultrarrápida para dar los compuestos 10d-e en forma de aceite, según los resultados que se indican a continuación:

Ejemplo 2.1d: Preparación del compuesto 10d

Éster bis[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1-dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[5-(didecilamino)-5-oxopent-1-il]-tetrahidro- 1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

Reactivos: Compuesto 6 (1,92 g; 2,50 mmol); didecilamina (0,743 g; 2,50 mmol)

Compuesto 10d (2,26 g; 2,38 mmol). Rendimiento: 95%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 95,3% (% en área); Mr: 951,42 (C54H102N4O9)

RMN de ¹H y ¹³C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 2.1e: Preparación del compuesto 10e

Éster bis[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1-dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[5-(dodecilamino)-5-oxopent-1-il]-tetrahidro- 1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

Reactivos: Compuesto 6 (3,13 g; 4,07 mmol); didodecilamina (1,44 g; 4,07 mmol)

Compuesto 10e (4,30 g, 4,27 mmol). Rendimiento: 105% (residuo disolvente).

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 89,7% (% en área); Mr: 1007,53 (C58H110N4O9).

RMN de ¹H y ¹³C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 2.2. Preparación de compuestos 11d-e. Procedimiento general

Los compuestos 10d-e (1 eq) se disolvieron en CH2O 2 (20-50 ml) y la solución así obtenida se agitó y se enfrió a 0 °C, después se añadió gota a gota TFA (6 eq). La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó y el residuo obtenido se disolvió en TFA nuevo (50 eq). Esta solución se agitó durante 80 h. La mezcla se evaporó y el residuo se trató con diisopropiléter (70 ml) para obtener un precipitado blanco que se filtró o se centrifugó, se lavó con diisopropiléter (2 x 20 ml) y se secó a presión reducida (P2O5; gránulos de NaOH) para obtener ligandos 11d y 11e como sólidos blancos. El producto bruto se resuspendió en H²O, se disolvió a pH de 6-7 mediante la adición de NaOH 2 N y se precipitó a pH 2 mediante la adición de HCl 1 M.

Ejemplo 2.2d: Preparación del compuesto 11d

Ácido 6-[bis[(carboximetil)]amino]-6-[5-(didecilamino)-5-oxopent-1-il]-tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético Reactivos: Compuesto 10d (2,20 g, 2,31 mmol)

Compuesto 11d (1,08 g; 1:48 mmol) Rendimiento: 64%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 95,7% (% en área)

Mr: 726,99 (C38H70N4O9)

Título complejométrico (GdCb 1,001 mM): 94%.

RMN de ¹H y ¹³C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 2.2e: Preparación del compuesto 11e

Ácido 6-[bis[(carboximetil)amino]-6-[5-(dodecilamino)-5-oxopent-1-il]-tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético Reactivos: Compuesto 10e (4,30 g, 4,27 mmol);

Compuesto 11e (2,83 g, 3,61 mmol). Rendimiento: 85%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 82,4% (% en área).

Mr: 783,10 (C42H78N4O9).

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 2.3: Preparación de compuestos 12d-e. Procedimiento general

Los ligandos 11d-e (1 eq) se suspendieron en H2O (concentración del 5% p/v; a pH 1-2) y se disolvieron a pH 6,5-7 mediante la adición de NaOH 2 N. Se añadió en porciones una solución titulada de GdCh (1 eq). La mezcla se agitó a temperatura ambiente y el pH se mantuvo constante mediante la adición de NaOH 0,1 N. La solución de reacción se concentró para obtener una precipitación; se aislaron complejos 12d-e por filtración.

Ejemplo 2.3d: Preparación del compuesto 12d

[(6-[Bis[(carboximetil)amino]-6-[5-(didecilamino)-5-oxopent-1-il]-tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacetato[4-)]gadolinato(1-)]sodio

Reactivos: Compuesto 11d (1,1 g; 1,48 mmol);

Compuesto 12d (1,12 g; 1,24 mmol); Rendimiento del 90%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 94,6% (% en área)

Mr: 903,20 (C38H66GdN4NaO9)

EM es compatible con la estructura.

Ejemplo 2.3e: Preparación del compuesto 12e

[[6-[Bis[(carboximetil)amino]-6-[5-(dodecilamino)-5-oxopent-1-il]-tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacetato(4-)]gadolinato(1-)]sodio

Reactivos: Compuesto 11e (1,10 g, 1,37 mmol);

Compuesto 12e (1,02 g; 1,06 mmol); Rendimiento: 78%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 94,3% (% en área)

Mr: 959,31 (C42H74GdN4NaO9).

EM es compatible con la estructura.

Ejemplo 3: Preparación del compuesto 21

Éster bis[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1-dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[(1R,4R)-4-carboxiciclohexano-1-il]tetrahidro- 1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

El compuesto 21 se preparó según el esquema 5:

Esquema 5

Ejemplo 3a: Preparación del compuesto 14

Éster metílico del ácido (1R, 4R)-4-(hidroximetil)-ciclohexanocarboxílico

Se añadió H2SO4 concentrado (15 ml) a una solución de ácido trans-(1R,4R)-4-hidroximetilciclohexano-carboxílico 13 (15 g; 94,8 mmol) en MeOH (300 ml), después la mezcla de reacción se agitó y se sometió a reflujo durante 4 h. La solución se concentró y después se basificó mediante la adición de solución acuosa de NH4OH; el sólido blanco se retiró por filtración y el licor madre se extrajo con EtOAc (3 x 70 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución acuosa saturada de NaCl, se secaron (Na2SO4) y se evaporaron a presión reducida para dar 14 como un líquido amarillo (17,26 g) que se empleó en la reacción siguiente sin purificación adicional.

Rendimiento cuantitativo.

Datos analíticos:

Mr: 172,22 (C9H16O3)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 3b: Preparación del compuesto 15

Éster metílico del ácido (1R,4R)-4-(metilsulfoniloxi)metil]ciclohexanocarboxWco

A una solución de compuesto 14 (17,26 g) en THF (450 ml) enfriado a 0 °C, se añadió trietilamina (39,4 ml; 284,5 mmol) seguida de cloruro de metanosulfonilo (14,9 ml; 151,7 mmol). La mezcla se agitó a 0 °C durante 10 minutos adicionales, después la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de Celite (0,01-0,04 mm) que después se lavó con THF nuevo. La solución resultante se evaporó a presión reducida para dar el compuesto 15 como un aceite amarillo (30,95 g) que se empleó en la reacción siguiente sin purificación adicional.

Rendimiento cuantitativo.

Datos analíticos:

Mr: 250,30 (C10H18O5S)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 3c: Preparación del compuesto 16

Éster metílico del ácido (1R,4R)-4-(yodometil)ciclohexanocarboxílico

Una solución de compuesto 15 (30,95 g) y yoduro de sodio (42,64 g; 284,5 mmol) en acetona (450 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, después se sometió a reflujo durante 3,5 h. Después de 60 horas a temperatura ambiente, se añadió Nal adicional (5 g; 17,7 mmol) y la solución se sometió a reflujo durante 7 horas más. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo amarillo se trató con dietiléter; las sales insolubles se separaron por filtración y se lavaron con dietiléter nuevo. La solución de etér se evaporó y el producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para dar el compuesto 16 como un líquido amarillo (22,43 g; 79,5 mmol). Rendimiento: 84%.

Datos analíticos:

Mr: 282,12 (C9H15IO2)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 3d: Preparación del compuesto 17

Éster metílico del ácido (1R,4R)-4-(nitrometil)ciclohexanocarboxílico

El compuesto 16 (21,92 g; 77,7 mmol) se añadió a una solución de nitrito de sodio (10,72 g; 155,4 mmol) y floroglucinol (10,78 g; 85,4 mmol) en DMSO (1 l). La solución se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de N2 durante 48 h. La mezcla de reacción se diluyó con H2O (3 l) y se extrajo con Et2O. La capa orgánica se secó (Na2SO4) y se evaporó para dar un producto bruto que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida. El compuesto 17 (10,35 g; 51,4 mmol) se obtuvo como un líquido amarillo pálido.

Rendimiento: 66%.

Datos analíticos:

HPLC: 97,9% (% en área por HPLC)

Mr: 201,22 (C9H15NO4)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 3e: Preparación del compuesto 18

6-[(1R,4R)-4-(metoxicarbonil)ciclohexano-1-il]-6-nitro-1,4-bis(fenilmetil)-tetrahidro-1H-1,4-diazepina

Una suspensión de diacetato de W,W-dibenciletilendiamina (18,29 g; 50,7 mmol) en EtOH (400 ml) se agitó a 60 °C hasta que se obtuvo una solución transparente; se añadió paraformaldehído (4,57 g; 152,2 mmol) y la suspensión se calentó a 80 °C durante 1,5 h para dar una solución transparente de color naranja oscuro. Se añadió gota a gota una solución de compuesto 17 (10,21 g; 50,7 mmol) en EtOH y la solución final se agitó a 80 °C durante 6 h. Después de 15 h a temperatura ambiente, el precipitado resultante se filtró, se lavó con EtOH y se secó al vacío para dar el compuesto 18 en forma de un material sólido blanco (17,88 g; 38,4 mmol).

Rendimiento: 76%.

Datos analíticos:

HPLC: 99,61% (% en área)

Mr: 465,59 (C27H35N3O4)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 3f: Preparación del compuesto 19

6-Amino-4-(metoxicarbonil)ciclohexano-1-il]tetrahidro-1H-1,4-diazepina

Una suspensión de compuesto 18 (17,88 g; 38,4 mmol) en THF (200 ml) se agitó a 40 °C hasta que se obtuvo una solución transparente; la solución se diluyó después con MeOH (150 ml). Se añadió una suspensión de Pd/C al 5% (10,66 g) en MeOH (50 ml) y la mezcla se hidrogenó a 40 °C durante 11 horas a presión ambiente. El catalizador se eliminó por filtración y la solución se evaporó para dar el compuesto 19 como un aceite verdoso (9,57 g; 37,4 mmol). El producto obtenido se utilizó sin purificación adicional.

Rendimiento: 98%.

Datos analíticos:

Mr: 255,36 (C13H25N3O2)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 3g: Preparación del compuesto 20

Éster bis[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1-dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[(1R,4R)-4-(metoxicarbonil)-ciclohexano-1 -il]tetrahidro- 1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

El compuesto 19 (9,52 g; 37,3 mmol) se disolvió en CH3CN (400 ml), después se añadieron K2CO3 (23,19 g; 167,8 mmol) y Na2SO4 (15,88 g; 111,8 mmol). Subsiguientemente, se añadió bromoacetato de t-butilo (24,6 ml; 167,8 mmol) y la mezcla se agitó a 80 °C durante 16 h. Las sales se separaron por filtración y el filtrado se evaporó hasta obtener un residuo que se disolvió en EtOAc (200 ml) y la solución se lavó con H2O (3 x 70 ml) y solución acuosa saturada de NaCl (70 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó. El producto bruto (27,36 g) se purificó por cromatografía ultrarrápida para dar el compuesto 20 como un aceite amarillo pálido (5,34 g; 7,5 mmol). Rendimiento: 20%.

Datos analíticos:

Mr: 711,93 (C37H65N3O10)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 3h: Preparación del compuesto 21

Éster bis[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1-dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[(1R,4R)-4-carboxi-ciclohexano-1 -il]tetrahidro- 1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-acético

Se añadió NaOH 2 N (7,12 ml; 14,2 mmol) a una solución de compuesto 20 en i-PrOH (100 ml) agitada a temperatura ambiente y después se añadió H2O (5,5 ml) hasta obtener una mezcla homogénea. La solución se agitó durante 5,5 h a temperatura ambiente; dado que la reacción no se completó; la solución se almacenó a -20 °C durante 15 h. La temperatura se dejó que se elevara hasta temperatura ambiente y la mezcla de reacción se agitó durante 3 h adicionales. El pH se corrigió a 7 con HCl 2 N (7,12 ml) y la solución se evaporó a presión reducida a temperatura ambiente. El residuo se resuspendió en H2O (80 ml), se acidificó con HCl 2 N (7,12 ml) y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó (Na2SO4) y se evaporó para dar el compuesto 21 como un sólido blanco (4,5 g; 6,45 mmol).

Rendimiento: 90%.

Datos analíticos:

Mr: 697,91 (C36H63N3O10).

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 4: Preparación de compuestos 25a-c

Los compuestos 25a-c se prepararon según el esquema 6:

Ejemplo 4.1: Preparación del compuesto 22

Éster bis[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1-dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[(1R,4R)-4-[[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]carbonil]ciclohexano-1-il]tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

Se añadió NHS (0,27 g; 2,3 mmol) a una solución de compuesto 21 (1,09 g; 1,6 mmol) en CH2Cl2 (50 ml) agitada a 0 °C, después se añadió gota a gota una solución de EDC (0,45 g; 2,3 mmol) en CH2O 2 (50 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 49 h; la solución final se lavó con H2O (3 x 40 ml) y la capa orgánica se secó (Na2SO4) y se evaporó para dar 22 como un sólido (1,35 g) que se utilizó en la etapa siguiente sin purificación adicional.

Rendimiento cuantitativo.

Ejemplo 4.2: Preparación de compuestos 25a-c. Procedimiento general

La amina seleccionada (1-1,3 eq) se añadió a una solución de compuesto 22 (1 eq) en CHCh (concentración del 2%) seguida de la adición de DIPEA (1,7 eq). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 64-72 h. Cuando la solución de reacción se volvió neutra, se añadió DIPEA adicional (1,7 eq) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2-21 h adicionales. La mezcla de reacción se lavó posteriormente con H2O (35 ml), con HCl diluido hasta que el pH del lavado fuera ácido (3 x 40 ml) y con H2O (35 ml) La fase orgánica se secó (Na2SO4) y se evaporó para dar un material bruto amarillento viscoso que se purificó por cromatografía ultrarrápida para dar el compuesto 23a-c como un aceite amarillo, según los datos siguientes:

Ejemplo 4.2a: Preparación del compuesto 23a

Éster bis[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1-dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[(1R,4R)-4-[(didecilamino)-carbonil]ciclohexano-1 -il]tetrahidro 1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

Reactivos: Compuesto 22 (1,18 g; 1,48 mmol), didecilamina (0,44 g; 1,48 mmol).

Compuesto 23a (0,75 g, 0,77 mmol). Rendimiento: 52%.

Mr: 977,46 (C56H104N4O9)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 4.2c: Preparación del compuesto 23c

Éster bis[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 6-[bis[2-[(1,1-dimetil)etoxi]-2-oxoetil]amino]-6-[(1R,4R)-4-[[((7R)-4-hidroxi-4-oxido-10-oxido-10-oxo-7-[( 1 -oxodecil) oxi]-3,5,9-trioxa-4-fosfanonadec-1 -il]amino]carbonil]ciclohexano-1 -il]tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

Reactivos: Compuesto 22 (1,35 g; 1,56 mmol); 1,2-didecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (0,81 g; 1,56 mmol) Compuesto 23c (0,84 g; 0,70 mmol). Rendimiento: 45%.

Mr: 1203,54 (C61H111N4O17P)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 4.3: Preparación de compuestos 24a-c. Procedimiento general

Se añadió gota a gota TFA (6 eq) a una solución de compuesto 23a o 23c (1 eq) en CH2O 2 (50 ml) agitada a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente, después se evaporó hasta un residuo que se disolvió con TFA nuevo (350 eq); A continuación, la solución se agitó a temperatura ambiente durante 24-28 h. El TFA se evaporó y el residuo se trató con iPr2O (40-60 ml) para dar un sólido blanco que se aisló por centrifugación y se secó (a presión reducida y a 30 °C en presencia de gránulos de NaOH) para dar el compuesto 24a-c según los datos siguientes:

Ejemplo 4.3a: Preparación del compuesto 24a

Ácido 6-[[bis(carboximetil)]amino]-6-[(1R,4R)-4-[(didecilamino)carbonil]ciclohexano-1-il]tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

Reactivos: Compuesto 23a (0,75 g, 0,77 mmol)

Compuesto 24a (0,41 g; 0,54 mmol). Rendimiento: 70%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 94,1% (% en área)

Mr: 753,03 (C40H72N4O9)

Título complejométrico: (GdCÍ30,001 M): 81,7%

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 4.3c: Preparación del compuesto 24c

Ácido 6-[[bis(carboximetil)]amino]-6-[[[(7R)-4-hidroxi-4-oxido-10-oxo-7-[(1-oxodecil)oxi]-3,5,9-trioxa-4-fosfanonadec-1 -il]amino]carbonil]ciclohexano-1 -il]tetrahidro- 1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacético

Reactivos: Compuesto 23c (0,84 g, 0,70 mmol)

Compuesto 24c (0,67 g; 0,69 mmol); Rendimiento: 98%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 96,2% (% en área)

Mr: 979,11 (C45H79N4O17P)

Título complejométrico: (GdCl30,001 M): 96,9%

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 4.4: Preparación de compuestos 25a-c. Procedimiento general

Los compuestos titulados se prepararon según los procedimientos descritos en el ejemplo 2.3.

Ejemplo 4.4a: Preparación del compuesto 25a

[[6-[[Bis(carboximetil)]amino]-6-[(1R,4R)-4-(didecilamino)carbonil]ciclohexano-1-il]tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacetato(4-)]gadolinato(1-)]sodio

Reactivos: Compuesto 24a (0,32 g, 0,43 mmol)

Compuesto 25a (0,33 g; 0,35 mmol). Rendimiento: 83%.

Datos analíticos:

HPLC-ELSD: 95,2% (% de área)

Mr: 929,24 (C40H68GdN4NaO9)

TGA: 5,7%

EM es compatible con la estructura.

Ejemplo 4.4c: Preparación del compuesto 25c

[[6-[[Bis(carboximetil)]amino]-6-[(1R,4R)-4-[[(7R)-4-hidroxi-4-oxido-10-oxo-7-[(1-oxodecil)oxi]-3,5,9-trioxa-4-fosfanonadec-1-il]amino]carbonil]ciclohexano-1-il]tetrahidro-1H-1,4-diazepin-1,4(5H)-diacetato(4-)]gadolinato(1-)]sodio

Reactivos: Compuesto 24c (0,35 g, mmol 0,36)

Compuesto 25c (0,31 g; 0,27 mmol) Rendimiento: 77%.

Datos analíticos:

Mr: 1155,32 (C45H75GdN4NaO17P)

EM es compatible con la estructura.

Preparación de compuestos de fórmula (II)

Ejemplo 5:

Preparación de [10-[2-(didecilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacetato(3-)]gadolinio (29)

Esquema 7

Ejemplo 5.a: Preparación de éster tris[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 10-[2-(didecilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (27)

Se añadieron HBTU (g; mmol) y DIPEA (g; mmol) secuencialmente a una suspensión de compuesto 26 (5 g; 7,8 mmol) en CH3CN (500 ml) y la mezcla se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos; se añadió didecilamina (2,32 g; 7,8 mmol) y la mezcla se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 24 h.

La mezcla de reacción se evaporó y el residuo se disolvió en CHCh y se lavó secuencialmente con H2O (100 ml), H2O acidificada (pH 4-5 con HCl; 100 ml) y H2O (100 ml). La capa orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó, y el material bruto resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para obtener el compuesto 27 como un aceite incoloro (5,36 g; 7,24 mmol). Rendimiento del 93%.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 96,9% (% en área)

Mr: 740,08 (C40H77N5O7)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 5.b: Preparación de ácido 10-[2-(didecilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (28)

Se añadió gota a gota TFA (6 eq) a una solución de compuesto 27 (5,02 g; 5,89 mmol) en CH2Cl2 (100 ml) enfriado a 0 °C; la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h y después se evaporó. El residuo se disolvió en TFA nuevo (50 eq) y la solución así obtenida se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 96 h. La mezcla de reacción se evaporó y el residuo se trató con iPr2O (150 ml) para dar un material sólido blanco que se centrifugó, se lavó con iPr2O (2 x 40 ml). Dicho sólido se resuspendió en H2O, se disolvió a pH de 6-7 mediante la adición de NaOH 1 M y la solución así obtenida se purificó por percolación de resina Amberlite® XAD1600 utilizando un gradiente de H2O/CH3CN como eluyente. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se liofilizaron para obtener el ligando 28 como un material sólido blanco (2,04 g; 2,99 mmol). Rendimiento del 51%. Datos analíticos

HPLC-ELSD: 99,5% (% en área)

Mr: 683,97 (C36H69N5O7)

Título complejométrico (ZnSO40,01 M): 98,8%

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 5c: Preparación de [10-[2-(didecilamino)-2-oxoetil]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacetato(3-)]gadolinio (29)

Se añadió en porciones una solución de GdCh 0,1 M (14,5 ml; 1,45 mmol) a una solución de ligando 28 (1,01 g; 1,45 mmol) en H2O (50 ml) a pH de 5-6 y la solución se mantuvo con agitación a temperatura ambiente, manteniendo el pH entre 6,5 y 7,5 mediante la adición de NaOH 0,1 M. La solución se desalificó mediante elución en resina Amberlite® XAD1600 utilizando un gradiente de H2O/CH3CN como eluyente. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se liofilizaron para obtener un complejo 29 como un material sólido blanco (1,08 g; 1,29 mmol). Rendimiento del 89%.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 99,0% (% en área)

Mr: 838,20 (C36H66GdN5O7)

EM es compatible con la estructura.

Ejemplo 6: Preparación de complejos 32a-b

Esquema 8

Ejemplo 6.1: Preparación de compuestos 30a-b. Procedimiento general

Se añadieron secuencialmente HBTU (1 eq) y DIPEA (1,7 eq) a una suspensión de compuesto 26 en CH2Ch (concentración del 1% p/v) y la mezcla se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos; después se añadió fosfoetanolamina (DLPE n = 10 o DMPE n = 12) (1 eq) y la mezcla se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 24 h. La mezcla de reacción se lavó secuencialmente con H2O (100 ml), H2O acidificada (pH de 4-5 con HCl; 100 ml) y H2O (100 ml). La capa orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó, y el material bruto así obtenido se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para obtener compuestos 30a-b.

Ejemplo 6.1a. Preparación de éster tris[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 10-[(10R)-7-hidroxi-7-oxido-2,13-dioxo-10-[(1-oxododecil)oxi]-6,8,12-trioxa-3-aza-7-fosfatetracos-1-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético 30a Reactivos: Compuesto 26 (968 mg; 1,69 mmol); 1,2-didodecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (980 mg; 1,69 mmol).

Compuesto 30a (605 mg, 0,53 mmol); Rendimiento del 32%.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 40,6% (% en área)

Mr: 1134,48 (C57H108N5O15P)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 6.1b: Preparación de éster tris[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 10-[(10R)-7-hidroxi-7-oxido-2,13-dioxo-10-[(1-oxotetradecil)oxi-6,8,12-trioxa-3-aza-7-fosfaesacos-1-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético 30b Reactivos: Compuesto 26 (1,43 g; 2,36 mmol), 1,2-ditetradecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (1,50 g; 2,36 mmol). Compuesto 30b (2,18 g, 1,97 mmol). Rendimiento del 78%.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 82,4% (% en área)

Mr: 1190,49 (C61H116N5O15P)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 6.2: Preparación de compuestos 31a-b. Procedimiento general

Se añadió gota a gota TFA (6 eq) a una solución de compuestos 30a-b en CH2Cl2 (concentración del 1% p/v) enfriada a 0 °C y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 1 h y después se evaporó. El residuo se disolvió en TFA nuevo (30 eq) y la nueva solución se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 96 h. La mezcla de reacción se evaporó y el residuo se trató con iPr2O (150 ml) para producir un material sólido blanco que se centrifugó y se lavó con iP^O (2 x 40 ml).

El producto bruto 31a se purificó según el procedimiento siguiente. El producto bruto se suspendió en H2O y se disolvió a pH 6-7 mediante la adición de NaHCO3 ac. al 5% y subsiguientemente se volvió a precipitar a pH 3 mediante la adición de HCl 1 M. El material sólido así obtenido se centrifugó y se secó para obtener el ligando 31a.

El producto bruto 31b se purificó según el procedimiento siguiente. El producto bruto se suspendió en H2O, se disolvió a pH 6-7 mediante la adición de NaOH 1 M y la solución así obtenida se purificó por percolación en resina Amberlite® XAD1600 utilizando un gradiente de H2O/CH3CN como eluyente. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se liofilizaron para obtener el ligando 31b.

Ejemplo 6.2a: Preparación de ácido 10-[(10R)-7-hidroxi-7-oxido-2,13-dioxo-10-[(1-oxododecil)oxi]-6,8,12-trioxa-3-aza-7-fosfatetracos-1-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (31a)

Reactivos: Compuesto 30a (600 mg, 0,53 mmol)

Compuesto 31a (501 mg, 0,53 mmol). Rendimiento del 98%.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 61,3% (% en área)

Mr: 966,16 (C45H84N5O15P)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 6.2b: Preparación del ácido 10-[(10R)-7-hidroxi-7-oxido-2,13-dioxo-10-[(1-oxotetradecil)oxi]-6,8,12-trioxa-3-aza-7-fosfasacos-1-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (31b)

Reactivos: Compuesto 30b (2,0 g, 1,68 mmol)

Compuesto 31b (1,1 g; 1,07 mmol). Rendimiento del 63%.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 99,9% (% en área)

Mr: 1022,26 (C49H92N5O15P)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 6.3: Preparación de compuestos 32a-b. Procedimiento general

Se añadieron en porciones piridina (hasta neutralización) y una solución de Gd(Ac)3 en CH3OH/H2O 10:1 (1 eq) a una suspensión de ligandos 31a-b en CHCb (concentración del 1% p/v) agitada a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó y el residuo se trató con CH3OH/tolueno (3 x 50 ml) y CHCb (3 x 50 ml) mediante evaporación a sequedad después de cada solubilización. El residuo final se suspendió en H2O y se liofilizó para obtener complejos 32a-b como material sólido blanco.

Ejemplo 6.3a: Preparación de [10-[(10R)-7-hidroxi-7-oxido-2,13-dioxo-10-[(1-oxododecil)oxi]-6,8,12-trioxa-3-aza-7-fosfatetracos-1-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacetato(3-)]gadolinio (32a)

Reactivos: Compuesto 31a (423 mg, 0,44 mmol)

Compuesto 32a (472 mg, 0,42 mmol). Rendimiento 96%.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 69,5% (% en área)

Mr: 1120,38 (C45H81GdN5015P)

EM es compatible con la estructura.

Ejemplo 6.3b: Preparación de [10-[(10R)-7-hidroxi-7-oxido-2,13-dioxo-10-[(1-oxotetradecil)oxi]-6,8,12-trioxa-3-aza-7-fosfaesacos-1-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacetato(3-)]gadolinio (32b)

Reactivos: Compuesto 31b (900 mg, 0,85 mmol)

Compuesto 32b (991 mg, 0,84 mmol). Rendimiento del 99%.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 92,8% (% de área)

Mr: 1176,49 (C49H89GdN5O15P)

EM es compatible con la estructura.

Ejemplo 7: Preparación de complejos 37a-b

El compuesto 33, utilizado como reactivo inicial para la síntesis de complejos metálicos 37a-b, se sintetizó según un procedimiento conocido por el estado de la técnica (Org. Proceso. Res Dev. 2009, 13 (3), 535-542).

Ejemplo 7.1: Preparación de éster tris[(1,1-dimetil)etilílico] del ácido 10-[(4R)-7-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxi-2,2-dimetil-3,7-dioxo-2-oxiept-4-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (34)

Una solución de EDC (0,757 g; 3,95 mmol) en CH2Cl2 (30 ml) se añadió gota a gota a una solución de compuesto 33 (2 g; 2,63 mmol) y NHS (0,455 g; 3,95 mmol) en CH2Cl2 (50 ml) enfriada a 0 °C, la mezcla de reacción se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 20 h. La mezcla se lavó con H2O (3 x 60 ml) (hasta neutralización), se secó (Na2SO4) y se evaporó para dar el compuesto 34 (1,78 g; 2,22 mmol). Rendimiento del 84%.

Datos analíticos

Mr: 797,98 (C39H67N5O12)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 7.2a: Preparación de éster tris[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 10-[(1S)-1-[[(1,1-dimetil)etoxi]carbonil]-4-oxo-4-(didecilamino)but-1-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (35a)

Se añadieron secuencialmente didecilamina (0,665 g; 2,23 mmol) y DIPEA (646 microlitros; 3,79 mmol) a una solución de compuesto 34 (1,78 g; 2,23 mmol) en CHCb (70 ml) y la solución se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 72 h. La mezcla de reacción se lavó secuencialmente con H2O (1 x 50 ml), H2O ácida (pH de 4-5 con HCI, 1 x 50 ml) y H2O (1 x 50 ml), se secó (Na2SO4) y se evaporó para obtener el compuesto 35a (2,27 g; 2,23 mmol). Rendimiento cuantitativo.

Datos analíticos

Mr: 980,46 (C55H105N5O9)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 7.2b: Preparación de éster tris[(1,1-dimetil)etílico] del ácido 10-[(1S)(12R)-1-[[(1,1-dimetil)etoxi]carbonil]-9-hidroxi-9-oxido-4,15-dioxo-12-(1 -oxodecil))oxi]-8,10,14-trioxa-5-aza-9-fosfatetracos-1 -il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (35b)

Se añadieron secuencialmente 1,2-didecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (0,500 g; 0,955 mmol) y DIPEA [ ] (276 pl; 1,62 mmol) a una solución de compuesto 34 (0,762 g; 0,995 mmol) en CHCb (25 ml) y la solución se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 22 h. La mezcla de reacción se lavó secuencialmente con H2O (1 x 50 ml), ácido H2O (pH de 4-5 con HCI, 1 x 50 ml) y H2O (1 x 50 ml), se secó (Na2SO4) y se evaporó, y el residuo bruto así obtenido se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para obtener el compuesto 35b (0,725 g; 6,01 mmol). Rendimiento del 63%.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 79,7% (% en área)

Mr: 1205,53 (C60H111N5O17P)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 7.3. Preparación de compuestos 36a-b. Procedimiento general

Se añadió gota a gota TFA (6 eq) a una solución de compuestos 35a-b en CH2Cl2 (concentración del 1% p/v) enfriada a 0 °C y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 1 h y después se evaporó. El residuo se disolvió en TFA nuevo (30 eq) y la solución resultante se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 80 120 h. La mezcla de reacción se evaporó y el residuo se trató con iPr2O (80-100 ml) para dar un material sólido blanco que se centrifugó y se lavó con iPr2O (2 x 30 ml). El compuesto bruto 36a se purificó por cromatografía en resina Amberchrome® CG161 obteniéndose el ligando 36a mientras que el compuesto bruto 36b se secó y se utilizó sin purificación adicional.

Ejemplo 7.3a: Preparación de ácido 10-[(1S)-1-carboxi-4-oxo-4-(didecilamino)but-1-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (36a)

Reactivos: Compuesto 35a (1,87 g, 1,91 mmol)

Compuesto 36a (688 mg, 0,91 mmol). Rendimiento del 48%.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 99,8% (% en área)

Mr: 756,03 (C39H73N5O9)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 7.3b: Preparación de ácido 10-[(1S)(12R)-1-carboxi-9-hidroxi-9-oxido-4,15-dioxo-12-(1-oxodecil)oxi]-8,10,14-trioxa-5-aza-9-fosfatetracos-1-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético (36b)

Reactivos: Compuesto 35b (665 mg, 0,55 mmol)

Compuesto 36a (540 mg, 0,55 mmol). Rendimiento cuantitativo.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 99,8% (% en área)

Mr: 981,10 (C44H79N5O17P)

RMN de 1H y 13C y EM son compatibles con la estructura.

Ejemplo 7.4. Preparación de complejos 37a-b. Procedimiento general

Se suspendieron ligandos 36a-b en H2O y se disolvieron a pH 6-7 mediante la adición de NaOH 2 M (36a) o de NaHCO3 ac. al 5% (36b), después se añadió una solución de GdCh 0,1 M (1 eq) en porciones manteniendo el pH a 7 mediante la adición de NaOH 0,1 M (36a) o de NaHCO3 ac. al 5% (36b). Los complejos brutos se obtuvieron mediante liofilización y se purificaron de sales mediante cromatografía de exclusión por tamaño en resina Sephadex®G10 para obtener los complejos 37a-b.

Ejemplo 7.4a. Preparación de [[10-[(1S)-1-carboxi-4-oxo-4-(didecilamino)but-1-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacetato(4-)]gadolinato(1-)]sodio (37a)

Reactivos: Compuesto 36a (400 mg, 0,529 mmol)

Compuesto 37a (326 mg, 0,35 mmol). Rendimiento del 66%.

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 98,6% (% en área)

Mr: 932,24 (C39H69GdN5NaO9)

EM es compatible con la estructura.

Ejemplo 7.4b: Preparación de [[10-[(1S)(12R)-1-carboxi-9-hidroxi-9-oxido-4,15-dioxo-12-(1-oxodecil)oxi]-8,10,14-trioxa-5-aza-9-fosfatetracos-1-il]-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacetato(4-)]gadolinato(''/-)/sod/o 37b

Reactivos: Compuesto 36b (500 mg, 0,510 mmol)

Compuesto 37a (150 mg, 0,130 mmol). Rendimiento 25%

Datos analíticos

HPLC-ELSD: 61,1% (% en área)

Mr: 1158,32 (C44H76GdN5NaO17P)

EM es compatible con la estructura.

Ejemplo 8.1: Preparación de pSLN con el compuesto de fórmula I (9b) y DSPE-PEG-2000

Se preparó una fase orgánica (O) disolviendo 200 mg de Epikuron 200® (Cargill Deutschland GmbH, Krefeld, Alemania), 50 mg de [1,2-disteroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(metoxi(polietilenglicol)-2000) sal de amonio DSPE-PEG-2000, 65 mg del complejo 9b (título del 88%), 225 mg de tripalmitina, 25 mg de ácido esteárico en CH2Cl2. La fase orgánica se calentó a 36 °C y se mantuvo con agitación hasta la completa solubilización de los diversos componentes. Se añadió una fase acuosa (W) que contenía 175 mg de taurocolato de sodio, 0,2 ml de 1-butanol y 0,250 ml de agua a la fase orgánica. La solución se agitó durante 30 minutos a 36 °C hasta que se obtuvo una microemulsión (W/O) estable y transparente (etapa c del proceso de formulación). Al mismo tiempo se preparó una solución acuosa W1 que contenía el 0,24% (peso/volumen) de Tween 80® (Serva, Heidelberg, Alemania) y se calentó a 30 °C. La microemulsión W/O se añadió gota a gota a la fase acuosa W1 mantenida a 30 °C dando como resultado la emulsión múltiple W/O/W1 (etapa d del proceso de formulación). El disolvente orgánico se evaporó después a presión atmosférica manteniendo la emulsión múltiple con agitación durante 45 minutos (etapa e). La temperatura de la dispersión se redujo después a 10 °C para permitir la cristalización del núcleo lipídico de pSLN (etapa f). La dispersión así obtenida se purificó después del exceso de componentes emulsionantes mediante un proceso de ultrafiltración utilizando una membrana de celulosa regenerada (Pellicon XL 30kDa) y una solución de glucosa al 5,5% p/v. Finalmente, la dispersión se concentró hasta aproximadamente 8 ml y se filtró (filtro de 0,22 pm). La cantidad de metal y fósforo presente en la formulación final se midió mediante ICP-MS (ELAN 6100 Perkin Elmer). La eficacia de incorporación del complejo de Gd(III) en la SLN se calculó como el % en peso de Gd(III) en la dispersión final en comparación con la cantidad teórica. Las características de las partículas dispersadas, tales como el diámetro hidrodinámico promedio (promedio z) y el índice de polidispersidad (PdI) se midieron en PBS a una concentración de P = 2 mM mediante la técnica DlS (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments). El potencial de carga superficial (Potencial Z) siempre se midió a una concentración de P = 2 mM en una solución de glucosa al 5,5% mediante ELS (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments).

Además, la formulación de pSLN se caracterizó por las propiedades relaxométricas, según el procedimiento descrito en el ejemplo 8.3. Los datos de relaxividad en presencia de albúmina se presentan en la tabla 3.

Tabla 1. Caracterización de las pSLN que contienen el complejo 9b.

% de eficacia de incorporación promedio z (nm) Pdl Potencial Z (mV)

media S.D. media S.D. media S.D.

75 59,65 0,20 0,152 0,004 -33,00 0,95

La relación P/Gd(III) se calculó para que fuera 6,22.

Ejemplo 8.2: Preparación de pSLN con compuesto de fórmula II (B22286), DSPE-PEG-2000 y el ligando 1,2-diestearil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[folato(polietilenglicol)-2000] sal de amonio (DSPE-PEG-2000-folato)

La síntesis del compuesto B22286 se ha descrito en MAGMA 2001.12 (2-3), 114-120). Su fórmula se indica en el presente documento a continuación:

El complejo se formuló en SLN utilizando el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 8.1, reemplazando el complejo 9b por un número equivalente de moles de B22286. La caracterización químico-física de la dispersión se realizó tal como se describe en el ejemplo anterior y los datos se presentan en la tabla 2.

Tabla 2. Caracterización de la formulación que contiene B22286, DSPE-PEG2000 y DSPE-PEG2000-folato.

% de eficacia de incorporación promedio z (nm) Pdl Potencial Z media S.D. media S.D. media S.D.

75 56,60 0,34 0,160 0,007 -23,61 0,60

La carga de Gd(III) en pSLN preparada con el derivado de fórmula II (B22286), DSPE-PEG-2000, fue de aproximadamente 12000 unidades moleculares de complejos de Gd/partícula. Este valor se obtuvo midiendo la fracción de volumen ocupada por las partículas (f%) mediante el instrumento Turbiscan Lab Expert. El volumen de una única partícula (Vp) se calculó a partir del diámetro promedio de la partícula (50 nm) aproximando el volumen de cada partícula al volumen de una esfera perfecta. A continuación, el número de partículas np por cm3 se derivó de la relación: np = Vtot/ Vp,

(en la que Vtot es el volumen total ocupado por las nanopartículas en un cm3 de formulación), a partir de la cual el número de pSLN/cm3 se estima que es aproximadamente 1014/cm3.

Derivando el número de moléculas del complejo de Gd(III) de la concentración molar fue posible estimar que el número de moléculas incorporadas por cada partícula individual fue de aproximadamente 12000 unidades moleculares (carga útil).

P/Gd(III) se calculó para que fuera de 5,13.

Ejemplo 8.3: Mediciones de la relaxividad

Las mediciones de la relaxividad se realizaron utilizando una instrumentación Minispec mq20 (Bruker Biospin, Alemania). El valor de r1p para cada complejo incorporado en las SLN se determinó a partir de la medición de T1 utilizando la ecuación siguiente:

Riiobs= l/T i'Jiobs= HJip [Gd3+] 1/Tj !

en la que Ri1obs es el tiempo de relajación observado para el agente de contraste formulado en las SLN, Tiobs es el tiempo de relajación longitudinal, mientras que los índices i y j están relacionados respectivamente con el medio de contraste incorporado y con el medio. En detalle, se han realizado mediciones de la relaxividad en presencia de albúmina (HSA al 4% en NaCl al 0,9%) o plasma humano (HP) a 20 MHz y 25 °C (pH 7,4).

Tabla 3. Valores de relaxividad rip (mM-1s-1) de los complejos anfifílicos de Gd(III) de fórmula (I) incorporados en las SLN

Complejo incorporado Medio de incubacion media S.D.

9a HSA al 4% 35,35 0,19 9b HP 40,99 0,34 9c HP 28,19 0,54 12d HP 40,31 0,67 HSA al 4% 38,06 0,30 12e HP 39,37 0,39 25a HSA al 4% 36,29 1,27 25c HSA al 4% 34,95 0,24

^{Tabla 4. Valores de relaxividad r1p (mM'}V ^{1) de los complejos anfifílicos de Gd(III) de fórmula (II) incorporados en las}SLN

Complejo incorporado Medio de incubacion media S.D.

29 FBS 25,9 0,15 B22286 HSA al 4% 30,19 0,63 37a HSA al 4% 40,68 0,22 32a HP 19,54 0,11

Ejemplo 8.4. Caracterización físico-química de formulaciones de pSLN que contienen complejos de fórmula (I) y de fórmula (II).

Las tablas 3 y 4 muestran ejemplos de la caracterización físico-química de formulaciones preparadas tal como se describe en los ejemplos 8.1 y 8.2. La eficacia de incorporación del complejo de Gd(III) en las SLN se calculó como el % en peso de Gd(III) en la dispersión final en comparación con la cantidad teórica. Las características de las partículas dispersadas, tales como el diámetro hidrodinámico promedio (promedio z) y el índice de polidispersidad (PdI) se miden en PBS a una concentración de P = 2 mM utilizando la técnica DLS (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments). El potencial de carga superficial (Potencial Z) siempre se midió a una concentración de P = 2 mM en una solución de glucosa al 5,5% mediante ELS (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments).

Tabla 5. Eficacia de incorporación y caracterización por dispersión dinámica de la luz (DSC) de la distribución de partículas para pSLN que incorporan complejos anfifílicos de derivados de Gd(III) de fórmula (I)

Complejo % de eficacia de

incorporado _{incorporación}Promedio Z (nm) Pdl Potencial Z media S.D. media S.D. media S.D.

12d 70 63,71 1,12 0,16 0,020 -31,43 1,16 12e 65 49,90 0,43 0,12 0,002 -31,51 1,18 9a 50 67,75 1,28 0,263 0,005 -35,65 0,77 9b 75 59,65 0,20 0,152 0,004 -33,00 0,95 Complejo % de eficacia de

incorporado _{incorporación}Promedio Z (nm) Pdl Potencial Z

9c 81 69,45 1,17 0,172 0,012 -30,48 0,81 25a 82-75 55,79 0,80 0,179 0,001 -31,02 2,39

25c 55 64,51 0,03 0,274 0,002 -34,16 0,45

Tabla 6. Eficacia de incorporación y caracterización DLS de la distribución de partículas para pSLN que incorporan complejos anfifílicos de derivados de Gd(III) de fórmula (II)

Complejo % de eficacia de

incorporado _{incorporación}Promedio Z Pdl Potencial Z (mV)

media S.D. media S.D. media S.D.

29 75 51,65 0,52 0,196 0,008 -27,35 0,27

B22286 80 52,78 0,16 0,141 0,011 -27,81 0,36

37a 75-80 56,63 0,91 0,207 0,004 -37,40 0,54 32a 60 60,48 0,01 0,150 0,020 -26,30 0,26

Ejemplo 8.5. Mediciones calorimétricas de pSLN que incorporan el complejo 9b

Los estudios calorimétricos se realizaron con un instrumento DSC 25 (Mettler Toledo). En el experimento indicado como ejemplo, 30 mg de dispersión de pSLN que contienen complejo 9b se pesaron con precisión en un crisol de aluminio que después se cerró herméticamente. La muestra se calentó a una velocidad de barrido de 5 °C/min de 25 °C a 85 °C y subsiguientemente se enfrió a una velocidad de 1 °C/min hasta 25 °C. Las mediciones se realizaron utilizando un crisol que contiene agua como referencia. El mismo experimento se realizó dos meses después de la preparación de la formulación (almacenada a 4 °C) y no se observó ningún cambio significativo en el polimorfismo del núcleo cristalino.

Ejemplo 9. Imagen de RM con pSLN

Se realizaron estudios in vivo utilizando como modelo de tumor carcinoma de ovario humano (IGROV-1) implantado en el flanco de ratones Balb/C nu/nu. Las imágenes se adquirieron con un tomógrafo de IRM 7 Tesla (Bruker Biospin, Alemania). La figura 4 muestra los resultados obtenidos mediante la administración intravenosa de una formulación de pSLN preparada con el complejo B22286, utilizada para comparación, a una dosis de 50 pmol (Gd)/kg. Es posible observar la acumulación de pSLN en tejidos tumorales detectados por IRM 30 min después de la administración.

Ejemplo 10: Captación in vitro por U937 de SLN cargadas con B22286, liposomas cargados con B22286 y Prohance®

Se prepararon liposomas que comprenden B22286 utilizando una técnica de deposición de capa fina/extrusión siguiendo el procedimiento descrito por Terreno et al. (Chemistry and Biodiversity, vol. 5, 2008: 1901-1912). La formulación de liposomas tenía la composición siguiente: B22286 (15% en moles), POPC (59% en moles), colesterol (23% en moles) y DSPE-Peg2000 (3% en moles). Se sembraron células de una línea celular de linfoma de monocito leucémico humano (U937) (aproximadamente 2 x 106/placa) en placas de Petri de 10 cm de diámetro con 10 ml de medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 5%, glutamina 2 mM, 100 UI/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. La diferenciación de los macrófagos se inducirá mediante la adición de TPA (20 ng/ml) y la incubación durante 48 h. Antes del uso subsiguiente, las células se lavarán con 5 ml de PBS y se suplementarán con 3 ml de medio RPMI-1640 nuevo suplementado con suero bovino fetal al 5%, glutamina 2 mM, 100 UI/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina.

Las pSLN preparadas tal como se describe en la presente invención (ejemplo 8.1) y los liposomas se incubaron durante 6 horas a una concentración de Gd(III) 0,15 mM. El mismo experimento se llevó a cabo utilizando una concentración 1 mM de Prohance®. En cada experimento, el medio se eliminó y las células se lavaron con PBS. Las células se lisaron por sonicación y se mineralizaron en HCl al 37% durante la noche a 120 °C para la determinación de la cantidad de Gd(III) mediante la medición de la velocidad de relajación de protones (R1obs) de las soluciones a 20 MHz (0,47 T) y a 25 °C en un instrumento PC 120 Minispec (Bruker Biospin, Alemania). La concentración de proteína de cada muestra también se determinó a partir de lisados celulares mediante el procedimiento de Bradford.

Los resultados se muestran en la figura 3, en la que se ha observado una menor captación de pSLN en comparación con los liposomas por esta línea celular monocítica-macrófaga.

Ejemplo 11: Estudios de biodistribución de complejos paramagnéticos de fórmula (I) y (II) incorporados en pSLN

La biodistribución in vivo de complejos paramagnéticos de fórmula (I) y (II) incorporados en pSLN se estudió en ratones C57BL/6 sanos. Se administraron pSLN a un número n de animales (definiéndose n en las tablas 7-8-9-10 para cada estudio) a una dosis de 50 pmol (Gd)/kg. Los animales se sacrificaron en diferentes momentos después de la administración (véanse las Tablas 7-8-9-10). Después del sacrificio, la sangre se almacenó en tubos que contenían una solución de heparina sódica (Clexane® 4000 UI/0,4 ml) en una proporción de aproximadamente 1:100 (v/v) con la sangre. Después de la perfusión, se extrajeron el hígado, el bazo y el riñón derecho y se mineralizaron en ácido nítrico (65% p/v) utilizando mineralización por microondas (MDS-2000 CEM Corporation). Después se midió el contenido de Gd(III) mediante ICP-OES (OPTIMA 2100 DV Perkin Elmer) y se comunicó en los estudios como % de ID calculado tal como se describe a continuación:

% de ID en un órgano = (microgramos de Gd en un órgano/pg de Gd administrados en la dosis) x 100

% de ID en sangre = [(microgramos de Gd/ml de sangre) x (peso del animal x 72)/dosis administrada en pg de Gd) x 100]

correspondiendo 72 al volumen de sangre en el ratón (ml/kg); las pSLN preparadas tal como se describe en el ejemplo 8.1 se administraron a las dosis descritas en el esquema experimental en la tabla 7, que también presenta los tiempos de muestreo y el número de muestras.

Tabla 7. Esquema experimental.

Dosis (pmol/kg) Tiempo de muestreo N° de animales tratados por cada tiempo de muestreo

Se repitieron los estudios de biodistribución 1 min, 6 h y 10 días después de la administración de 50 pmol/kg de complejos Gd(III) de fórmula (I) y fórmula (II) para diversos complejos preparados como se ha descrito en los ejemplos anteriores. Los valores de biodistribución obtenidos para pSLN preparadas con diferentes complejos en los puntos temporales de 1' (o inmediatamente después de la administración), 6 horas, 10 (o 7) días después de la administración, se indican en las tablas 8-10 a continuación.

Tabla 8. Biodistribución después de la administración (1') de pSLN que contienen complejos anfifílicos de fórmula (I) y (II).

% de ID en sangre % de ID en el hígado % de ID en el bazo % de ID en riñón promedio SD n promedio SD n romedio SD n promedio SD n

B22286 78 17 5 4,99 0,44 5 0,125 0,032 5 1,24 0,21 5

25a 83,5 3,0 3 7,8 1,4 3 0,43 0,10 3 1,30

0,24 3 12d 83,8 2,3 3 18,4 1,5 3 0,391 0,086 3 1,25 0,15 3 37a 95,8 6,0 3 9,9 3,2 3 1,458 0,065 3 1,458 0,086 3 9c

89,9

5,9 3

5,32

0,33 3

0,255 0,036 3 0,71 0,10 3 9b 85,4 3,8 3 10,0 2,1 3 0,53

0,13 3 1,47

0,26 3 NQ (no cuantificable) < 0,006%, ND (no detectable) < 0,002%

Tabla 9. Biodistribución a las 6 h después de la administración de pSLN que contienen complejos anfifílicos de fórmula (I) y (II).

B22286 4,32 0,12 2 76,7 3,5 3 0,582 0,049 5 0,61 0,100 5

25a 3,1 1,8 4 35,4 7,7 4 1,17 0,66 4 0,31 0,130 4 12d 2,3 1,6 3 27,0 15,0 3 0,63 0,46 3 0,164 0,043 3 37a 4,80 0,10 3 14,7 2,6 3 0,57 0,11 3 0,463 0,069 3 9c

-

- -

39,0

6,9 3

1,58 0,25 3 0,283 0,086 3 9b 1,74 0,14 3 57,9 1,5 3 0,542

0,046 3 0,470 0,018 3 NQ (no cuantificable) < 0,006%, ND (no detectable) < 0,002%

Tabla 10. Biodistribución 10 días después de la administración de formulaciones que contienen complejos anfifílicos de fórmula (I) y (II).

NQ (no cuantificable) < 0,006%, ND (no detectable) < 0,002%

Los resultados obtenidos, particularmente a los 10 días, indican que la acumulación de nanopartículas y de gadolinio en el hígado y el bazo varía según la longitud de la cadena y la naturaleza del complejo anfifílico, aunque con medidas variables.

En particular para los complejos preferidos, que son solo formas de realización ejemplares de los complejos utilizados en la invención, la acumulación en el hígado de sus formulaciones de pSLN correspondientes fue siempre inferior que para pSLN con B22286, el complejo de Gd utilizado como modelo de un complejo anfifílico con alta acumulación en el hígado debido a una lenta depuración de los hepatocitos. Por el contrario, la cantidad de ion Gd(III) acumulada en el bazo no varía con respecto a la estructura química de la carga de complejo de gadolinio en las pSLN debido a que la absorción de las células fagocíticas en el bazo es un proceso regulado por las propiedades de superficie de las nanopartículas que solo pueden modificarse ligeramente por la estructura química del complejo de gadolinio cargado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una nanopartícula lipídica sólida paramagnética (pSLN) que comprende:

un núcleo lipídico sólido hasta 55 °C, que comprende al menos un glicérido seleccionado del grupo que consiste en: un monoglicérido, un diglicérido y un triglicérido, o mezclas de los mismos, que tienen una cadena de alquilo C12-C24 lineal y ramificada, saturada o insaturada, en el que en el caso de un diglicérido y triglicérido, la cadena de alquilo puede ser igual o diferente, que además comprende opcionalmente un ácido graso C12-C22 saturado o insaturado, un éster de ácido graso, y mezclas de los mismos,

estando rodeado dicho núcleo lipídico sólido por un componente anfifílico que comprende un resto quelante de metal paramagnético anfifílico seleccionado de entre: un derivado de diazepina de fórmula I y un tetraazociclododecano de fórmula II o sus sales:

en las que:

Y es un grupo de fórmula Y'-NH- o (Y')2-N-, en las que Y' se selecciona del grupo que consiste en: un grupo alquilo C8-C16 lineal o ramificado, saturado o insaturado; un grupo alquilo C1-C10 interrumpido por un grupo fosfato -O-(HO-P=O)-O- opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados de entre: hidroxilo -OH, carboxi -COOR1, oxicarbonil-alquilo (C8-C16) y oxicarbonil-alquenilo (C8-C16); en el que R1 es hidrógeno H o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado; o Y' es un éster monofosfato de un glicerol sustituido o parcialmente sustituido, que tiene al menos un grupo funcional de dicho glicerol esterificado con un ácido graso alifático con cadenas de carbono saturadas o insaturadas, y la función de ácido fosfórico está libre o salificada con un metal alcalino o alcalinotérreo;

L es un enlazador bivalente seleccionado de entre: un grupo cíclico o heterocíclico C3-C10 alifático y alquilo C1-C6, alquenilo o alquinilo C2-C6, lineal o ramificado opcionalmente sustituido o interrumpido con un átomo o un grupo seleccionado de entre: carbonilo -C=O, tiocarbonilo -C=S, amino -NR1-, carboxi -COO-, oxi-carbonilo -OCO-, amido -NR1CO- o -CONR1-, oxígeno -O- y azufre -S-, en los que R1 es tal como se ha definido anteriormente;

r i-iv y RI-m son cada uno, independientemente un grupo alquil (C1-C3)-carboxi,

en el que dicho resto quelante del mismo está complejado con un ion metálico paramagnético seleccionado del grupo que consiste en: Gd(III), Mn(II), Cr(III), Cu(II), Fe(III), Pr(III), Nd(III), Sm(III), Tb(III), Yb(III), Dy(III), Ho(III) y Er(III), o una sal del mismo.

2. La pSLN según la reivindicación 1, en la que dicho glicérido es un triglicérido y se selecciona preferentemente del grupo que consiste en: trimiristina, tripalmitina, triestearina, triaraquidina y mezclas de las mismas.

3. La pSLN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que dicho componente anfifílico comprende además un compuesto anfifílico seleccionado del grupo que consiste en: un fosfolípido, lisolípido o esfingolípido C6-C24 de cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada.

4. La pSLN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 caracterizada por un valor de relaxividad Hp a 0,47 T superior a 25 mM-1s-1, preferentemente superior a 30 mM-1s-1, medido en condiciones fisiológicas.

5. La pSLN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada por una distribución de partículas comprendida entre 10 y 220 nm, un diámetro hidrodinámico promedio inferior a 100 nm y un índice de polidispersidad (Pdl) inferior a 0,2.

6. La pSLN según la reivindicación 5, en la que dicho diámetro promedio está comprendido entre 50-70 nm y el Pdl está comprendido entre 0,12-0,18.

7. La pSLN según la reivindicación 3, en la que dicho fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en: fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidil-inositol o mezclas de los mismos, que comprende opcionalmente: un ácido biliar, un derivado de ácido biliar o una sal del mismo, un glicolípido, un ácido graso, un alcohol alifático, un dialquiléter o tocoferol.

8. La pSLN según la reivindicación 7, en la que dichos fosfolípidos son de origen natural y están derivados de lecitina de soja o de huevo.

9. La pSLN según la reivindicación 8, que además comprende al menos un componente seleccionado en el grupo que consiste en: al menos uno de un agente tensioactivo iónico o no iónico, un agente "oculto" opcionalmente modificado químicamente con un ligando específico adecuado y/o una cadena de alquilo o un componente anfifílico, una biomolécula endógena opcionalmente modificada químicamente, en la que dicho ligando específico o biomolécula endógena se selecciona del grupo que consiste en: vitaminas, péptidos y polipéptidos.

10. La pSLN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que el complejo paramagnético anfifílico se selecciona del grupo que consiste en los compuestos siguientes o sales de los mismos:

11. La pSLN según una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en la que el "agente oculto" es polietilenglicol (PEG) opcionalmente modificado químicamente con un fosfolípido y/o un folato (DSPE-PEG 2000-folato).

12. Un proceso para la preparación de nanopartículas lipídicas sólidas que comprenden complejos anfifílicos de un metal paramagnético (pSLN), que comprende las etapas siguientes:

a) preparar una fase orgánica (O) mezclando, en un disolvente de bajo punto de ebullición inmiscible en agua, al menos los componentes siguientes:

- un complejo anfifílico adecuado para iones metálicos quelantes seleccionados de entre un derivado de diazepina de fórmula I y un tetraazociclododecano de fórmula II tal como se definen en la reivindicación 1, estando dicho resto quelante complejado con un ion de metal paramagnético seleccionado del grupo que consiste en: Gd(III), Mn(II), Cr(III), Cu(II), Fe(III), Pr(III), Nd(III), Sm(III), Tb(III), Yb(III), Dy(III), Ho(III) y Er(III);

- un lípido, siendo dicho lípido un glicérido seleccionado del grupo que consiste en: un monoglicérido, un diglicérido, un triglicérido y mezclas de los mismos, que tiene una cadena de alquilo C12-C24 lineal y ramificada, saturada o insaturada, en el que, en el caso de un diglicérido y triglicérido, la cadena de alquilo puede ser igual o diferente, y además puede comprender opcionalmente un ácido graso C12-C22 saturado o insaturado, un éster de ácido graso, y mezclas de los mismos;

- un tensioactivo anfifílico seleccionado del grupo que consiste en: un fosfolípido, lisolípido o esfingolípido C6-C24 de cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada, que comprende opcionalmente además: un ácido biliar, un derivado de ácido biliar o una sal del mismo, un glicolípido, un ácido graso, un alcohol alifático, un dialquiléter y tocoferol;

b) preparar una solución acuosa (W) que comprende uno o más de un tensioactivo iónico o no iónico y opcionalmente un cotensioactivo seleccionado del grupo que consiste en: un alcohol polialquílico C3-C8, y un ácido graso C5-C12 saturado;

c) mezclar la fase orgánica (O) preparada en a) con la solución acuosa (W) preparada en b), para obtener una microemulsión (W/O) estable y transparente a una temperatura comprendida entre 20 °C a 40 °C;

d) añadir la microemulsión (W/O) según la etapa c) a una segunda solución acuosa (W1) que comprende al menos una sustancia tensioactiva no iónica o iónica a una temperatura comprendida entre 20 °C y 40 °C para obtener una emulsión múltiple (W/O/W1);

e) evaporar el disolvente orgánico de la emulsión múltiple y obtener una suspensión de nanopartículas lipídicas, f) enfriar la suspensión obtenida en la etapa e) a una temperatura inferior al punto de cristalización del componente lipídico tal como se ha definido en la etapa a) para obtener las pSLN.

13. El proceso según la reivindicación 12, en el que el lípido de la etapa a) es un triglicérido y se selecciona preferentemente del grupo que consiste en: trimiristina, tripalmitina, triestearina, triaraquidina y mezclas de las mismas.

14. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en el que el disolvente orgánico inmiscible de la etapa a) se selecciona del grupo que consiste en: cloruro de metileno, dietiléter, acetato de etilo, formiato de etilo, 1,2-dicloroetano y sus mezclas. .

15. El proceso según la reivindicación 14, en el que el disolvente es cloruro de metileno.

16. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el que la fase orgánica (O) de la etapa a) se calienta a una temperatura comprendida entre 25 °C-40 °C, de forma más preferida entre 30-35 °C.

17. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en el que el ácido graso del componente lipídico de la etapa a) se selecciona del grupo que consiste en: ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido behénico.

18. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-16 o 17, en el que el componente lipídico de a) comprende tripalmitina y ácido esteárico.

19. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-18, en el que el tensioactivo anfifílico de la etapa a) comprende o es un fosfolípido seleccionado del grupo que consiste en: fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol y una mezcla las mismas, o es lecitina de soja o de huevo.

20. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-19, que comprende además la adición de un monoglucósido u oligoglucósido y sus monoésteres, diésteres y triésteres de glicerol etoxilados, o mezclas de los mismos.

21. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-20 en el que la solución acuosa (W) tal como se define en la etapa b) comprende además un tensioactivo iónico de bajo peso molecular, preferentemente aniónico, seleccionado del grupo que consiste en: ácido cólico y derivados, ácido taurocólico y sus sales hidratadas, colato de sodio, glicolato de sodio y taurodesoxicolato de sodio y opcionalmente un tensioactivo seleccionado del grupo que consiste en: un glicolípido, un ácido graso, un alcohol alifático, un dialquiléter o tocoferol.

22. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-21, en el que la fase orgánica (O) tal como se define en la etapa a) o la solución acuosa (W) tal como se define en la etapa b) comprenden además al menos un componente adicional seleccionado del grupo que consiste en: un agente "oculto" opcionalmente modificado químicamente con un ligando específico adecuado y/o una cadena de alquilo o un componente anfifílico, una biomolécula endógena opcionalmente modificada químicamente, en el que dicho ligando específico o biomolécula endógena se selecciona del grupo que consiste en: vitaminas, péptidos y polipéptidos.

23. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-22, que comprende además las etapas siguientes: g) purificación de la suspensión de pSLN.

h) esterilización.

24. La pSLN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 que se puede obtener según el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 12-23.

25. Un complejo de Gd(III) anfifílico paramagnético o una sal del mismo, seleccionado del grupo que consiste en:

26. Uso de un derivado de diazepina de fórmula I':

o un tetraazociclododecano de fórmula II':

en las que:

Y es un grupo de fórmula Y'-NH- o (Y')2-N-, en el que Y' se selecciona del grupo que consiste en: grupo alquilo C8-C16 lineal o ramificado, saturado o insaturado; grupo alquilo C1-C10 opcionalmente interrumpido por un grupo fosfato -O-(HO-P=O)-O- opcionalmente sustituido con uno o más átomos o grupos seleccionados del grupo que consiste en: hidroxilo -OH, carboxi -COORi, oxicarbonil-alquilo (Ca-Cia) y oxicarbonil-alquenilo (Ca-Cia); en el que Ri es hidrógeno H o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado;

L es un enlazador bivalente seleccionado de: un alquilo Ci-Ca lineal o ramificado opcionalmente sustituido o interrumpido con un átomo o grupos de átomos seleccionados de entre: carbonilo -C=O, amino -NRi-, carboxi -COO-, oxi-carbonilo -OCO-, amido -NRiCO- o -CONRi-, oxígeno -O- y azufre -S-, y Ri es tal como se ha definido anteriormente,

estando dicha diazepina de fórmula I' o dicho tetraazaciclododecano de fórmula II' opcionalmente complejados con un ion de metal paramagnético seleccionado del grupo que consiste en: Gd(III), Mn(Il), Cr(III), Cu(II), Fe(III), Pr(III), Nd(lll), Sm(III), Tb(III), Yb(III), Dy(III), Ho(III) y Er(III), opcionalmente en forma de una sal fisiológicamente aceptable, para la preparación de la pSLN según el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones i2-23.

27. Uso de uno cualquiera de los complejos según la reivindicación 25 para la preparación de una pSLN.

28. Composiciones farmacéuticas que comprenden la pSLN según una cualquiera de las reivindicaciones i - i i o 24.