ES2717798A1 - Disinfectant composition (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) - Google Patents
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Abstract
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
COMPOSICIÓN DESINFECTANTEDISINFECTING COMPOSITION
CAMPO DE LA INVENCIÓNFIELD OF THE INVENTION
La presente invención se encuadra en el sector de la industria alimentaria, en el ámbito sanitario o incluso puede ser usada a nivel doméstico. Concretamente, la presente invención hace referencia a una composición desinfectante, sin agentes bactericidas tóxicos o contaminantes del medio ambiente, aplicable en cualquier tipo de utensilio o superficie expuesta a la contaminación bacteriana. La composición de la invención también puede ser usada para el tratamiento de pacientes aquejados de infecciones bacterianas y/o de pacientes con intoxicaciones causadas por metales pesados.The present invention falls within the sector of the food industry, in the healthcare field or can even be used domestically. Specifically, the present invention refers to a disinfectant composition, without toxic bactericidal agents or environmental contaminants, applicable in any type of utensil or surface exposed to bacterial contamination. The composition of the invention can also be used for the treatment of patients suffering from bacterial infections and / or patients with heavy metal poisoning.
ESTADO DE LA TÉCNICASTATE OF THE TECHNIQUE
Una biopelícula, biofilm, tapiz bacteriano o tapete microbiano es un ecosistema microbiano organizado, conformado por uno o varios microorganismos asociados a una superficie viva o inerte, con características funcionales y estructuras complejas. Este tipo de conformación microbiana ocurre cuando las células se adhieren a una superficie o sustrato, formando una comunidad, que se caracteriza por la excreción de una matriz extracelular adhesiva protectora.A biofilm, biofilm, bacterial tapestry or microbial mat is an organized microbial ecosystem, consisting of one or several microorganisms associated with a living or inert surface, with functional characteristics and complex structures. This type of microbial conformation occurs when cells adhere to a surface or substrate, forming a community, which is characterized by the excretion of a protective adhesive extracellular matrix.
Una biopelícula puede contener aproximadamente un 15% de células y un 85% de matriz extracelular. Esta matriz generalmente está formada de exopolisacáridos, que forman canales por donde circulan agua, enzimas, nutrientes y residuos. Allí las células establecen relaciones y dependencias: viven, cooperan y se comunican a través de señales químicas (percepción de quórum), que regulan la expresión de genes de manera diferente en las distintas partes de la comunidad, como un tejido en un organismo multicelular.A biofilm can contain approximately 15% cells and 85% extracellular matrix. This matrix is usually formed of exopolysaccharides, which form channels through which water, enzymes, nutrients and waste circulate. There the cells establish relationships and dependencies: they live, cooperate and communicate through chemical signals (quorum perception), which regulate the expression of genes differently in different parts of the community, such as a tissue in a multicellular organism.
Se ha encontrado que más del 60% de las infecciones bacterianas son causadas por biopelículas. Por este motivo, han sido ampliamente estudiadas y se consideran una amenaza clínica contundente ya que son capaces de crecer en catéteres e utensilios médicos y quirúrgicos. En el ámbito sanitario es donde hay más susceptibilidad a infecciones nosocomiales. It has been found that more than 60% of bacterial infections are caused by biofilms. For this reason, they have been widely studied and are considered a blunt clinical threat as they are capable of growing in catheters and medical and surgical utensils. In the health field it is where there is more susceptibility to nosocomial infections.
Además del ámbito clínico o sanitario, es importante tener en cuenta la formación de biopelículas en las superficies y utensilios usados tanto a nivel doméstico como en la industria alimentaria. Particularmente, las biopelículas asociadas a las superficies usadas en la industria alimentaria, suponen un problema de mucha relevancia porque dichas biopelículas pueden llegar a estar en contacto con los alimentos, pudiendo causar enfermedades en el consumidor una vez ingeridos dichos alimentos contaminados. Además, dichas biopelículas pueden causar pérdidas económicas importantes debido a que los alimentos contaminados son desechados para evitar enfermedades asociadas a su consumo.In addition to the clinical or health field, it is important to take into account the formation of biofilms on surfaces and utensils used both domestically and in the food industry. Particularly, the biofilms associated with the surfaces used in the food industry, pose a problem of great relevance because said biofilms can become in contact with food, and can cause diseases in the consumer once ingested said contaminated food. In addition, said biofilms can cause significant economic losses because contaminated food is discarded to avoid diseases associated with its consumption.
Por otro lado, es importante tener en cuenta los problemas asociados con el incremento de la resistencia a antimicrobianos y la resistencia cruzada entre los antibióticos (usados en terapia) y biocidas (usados como desinfectantes). Las fórmulas de los desinfectantes deberían estar basadas en componentes que no creen resistencia a largo plazo, ya que esto dificultaría los tratamientos terapéuticos de las infecciones con patógenos que cada vez son más resistentes e invencibles. Actualmente, el problema de resistencia a antibióticos es uno de los más alarmantes en la Comunidad Europea debido a las muertes causadas por bacterias multirresistentes (aproximadamente 25000 personas por año en Europa) y también por el elevado coste de los tratamientos terapéuticos.On the other hand, it is important to take into account the problems associated with increased antimicrobial resistance and cross resistance between antibiotics (used in therapy) and biocides (used as disinfectants). Disinfectant formulas should be based on components that do not create long-term resistance, as this would make therapeutic treatments for pathogen infections that are increasingly resistant and invincible more difficult. Currently, the problem of antibiotic resistance is one of the most alarming in the European Community due to deaths caused by multidrug-resistant bacteria (approximately 25,000 people per year in Europe) and also due to the high cost of therapeutic treatments.
En el estado de la técnica se ha descrito mucha información relativa a diversas composiciones que permiten eliminar las biopelículas. Sin embargo, las composiciones desinfectantes presentes en el estado de la técnica suelen contener entre sus componentes surfactantes y detergentes que son tóxicos y contaminantes para el medio ambiente.In the state of the art, much information has been described regarding various compositions that allow biofilms to be eliminated. However, the disinfectant compositions present in the state of the art usually contain among their surfactant and detergent components that are toxic and pollutants to the environment.
Por lo tanto, se considera indispensable desarrollar una composición capaz de eliminar y/o evitar la formación de biopelículas de microorganismos patógenos de forma eficaz, pero que al mismo tiempo sea una composición que no comprenda agentes bactericidas tóxicos, ni contaminantes para el medio ambiente, y que tampoco comprenda componentes responsables de generar resistencias microbianas. La consecución de esta composición ayudaría a la eliminación eficaz de estos patógenos formadores de biopelículas en las diferentes superficies, interrumpiendo por ejemplo el proceso de diseminación y de transmisión de los agentes infecciosos tanto al personal sanitario como a los pacientes en el ámbito clínico y la contaminación de los alimentos en la industria alimentaria. Therefore, it is considered essential to develop a composition capable of effectively eliminating and / or preventing the formation of biofilms of pathogenic microorganisms, but that at the same time is a composition that does not include toxic bactericidal agents or pollutants for the environment, and that it also does not include components responsible for generating microbial resistance. The achievement of this composition would help the effective elimination of these biofilm-forming pathogens on the different surfaces, interrupting, for example, the process of dissemination and transmission of infectious agents to both healthcare personnel and patients in the clinical setting and contamination. of food in the food industry.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNDESCRIPTION OF THE INVENTION
Breve descripción de la invenciónBrief Description of the Invention
En la presente invención, se investigó el efecto de una composición desinfectante que comprende ácido láctico, peróxido de hidrógeno y EDTA (en adelante composición de la invención) sobre biopelículas compuestas por bacterias Gram-positivas o Gramnegativas, y también sobre biopelículas mixtas formadas por múltiples especies. Estas biopelículas son muy resistentes a los diferentes tratamientos aplicados debido a la baja difusión de los agentes antimicrobianos en la matriz de exopolisacáridos producidos por los mismos microorganismos. La composición de la invención permite evitar el desarrollo de estas biopelículas y también eliminarlas una vez establecidas sobre diferentes superficies. La composición de la invención permite la solubilización de la estructura de la biopelícula y la difusión de los agentes antimicrobianos que actúan sinérgicamente para destruir los microorganismos que componen dicha estructura.In the present invention, the effect of a disinfectant composition comprising lactic acid, hydrogen peroxide and EDTA (hereinafter composition of the invention) on biofilms composed of Gram-positive or Gram-negative bacteria, and also on mixed biofilms formed by multiple species. These biofilms are very resistant to the different treatments applied due to the low diffusion of antimicrobial agents in the matrix of exopolysaccharides produced by the same microorganisms. The composition of the invention allows avoiding the development of these biofilms and also eliminating them once established on different surfaces. The composition of the invention allows the solubilization of the biofilm structure and the diffusion of antimicrobial agents that act synergistically to destroy the microorganisms that make up said structure.
La composición de la invención resulta ser muy eficaz en la eliminación de biopelículas y se caracteriza por no contener agentes bactericidas tóxicos ni contaminantes del medio ambiente. La composición de la invención comprende componentes naturales producidos por las bacterias del ácido láctico, bacterias con el estatus GRAS "Generally Recognized As Safe”, con efecto antimicrobiano tales como el peróxido de hidrógeno y el ácido láctico, lo cual lo califica como producto natural con efectos antimicrobianos. Por otro lado, los componentes incluidos en la composición de la invención no tienen una diana específica y por lo tanto no se crean resistencias bacterianas tras sucesivas aplicaciones tal como sí ocurre con los compuestos de amonio cuaternario (cloruro de cetilpiridinio por ejemplo). Es importante indicar que el peróxido de hidrógeno se degrada rápidamente a oxígeno y agua. Así, este componente no supone ningún riesgo para el medio ambiente como contaminante. Por su parte, el ácido láctico como ingrediente natural respetuoso con el medio ambiente se degrada fácilmente en CO2, CO y CH4.The composition of the invention turns out to be very effective in removing biofilms and is characterized by not containing toxic bactericidal agents or pollutants from the environment. The composition of the invention comprises natural components produced by lactic acid bacteria, bacteria with the GRAS status "Generally Recognized As Safe", with antimicrobial effect such as hydrogen peroxide and lactic acid, which qualifies it as a natural product with antimicrobial effects On the other hand, the components included in the composition of the invention do not have a specific target and therefore no bacterial resistance is created after successive applications as it does with quaternary ammonium compounds (cetylpyridinium chloride for example) It is important to indicate that hydrogen peroxide is rapidly degraded to oxygen and water, so this component does not pose a risk to the environment as a pollutant, while lactic acid as an environmentally friendly natural ingredient easily degrades in CO2, CO and CH4.
Particularmente la composición de la invención comprende:Particularly the composition of the invention comprises:
• Dos agentes bactericidas: el ácido láctico y el peróxido de hidrógeno. El ácido láctico es un agente antimicrobiano con un amplio espectro de acción que se usa en la industria alimentaria por su poder acidulante más que antimicrobiano. En cuanto al peróxido de hidrógeno es un potente agente oxidante y un agente bactericida que permite en primer lugar debilitar la integridad de la biopelícula para así ejercer su acción bactericida sobre los microorganismos embebidos en dicha estructura. Ambos antimicrobianos actúan sinérgicamente para eliminar todos los microorganismos.• Two bactericidal agents: lactic acid and hydrogen peroxide. Lactic acid is an antimicrobial agent with a broad spectrum of action that is used in the food industry for its acidifying power rather than antimicrobial. In As for hydrogen peroxide, it is a potent oxidizing agent and a bactericidal agent that allows, in the first place, to weaken the integrity of the biofilm in order to exert its bactericidal action on the microorganisms embedded in said structure. Both antimicrobials act synergistically to eliminate all microorganisms.
• EDTA como agente quelante e inhibidor de las bombas de eflujo. El EDTA actúa con el objetivo de extraer iones de la membrana de las bacterias tanto Gramnegativas como Gram-positivas y así facilitar la acción bactericida de los agentes bactericidas empleados. Además actúa como inhibidor de bombas de eflujo de los antimicrobianos (responsables de la resistencia inespecífica) y así incrementa la susceptibilidad de las bacterias a la acción bactericida de los antimicrobianos.• EDTA as a chelating agent and inhibitor of efflux pumps. EDTA acts with the objective of extracting membrane ions from both Gram-negative and Gram-positive bacteria and thus facilitate the bactericidal action of the bactericidal agents used. It also acts as an inhibitor of antimicrobial efflux pumps (responsible for nonspecific resistance) and thus increases the susceptibility of bacteria to the bactericidal action of antimicrobials.
Los tres componentes actúan sinérgicamente a concentraciones precisas para eliminar todos los microorganismos incluso las bacterias esporuladas tales como Bacillus cereus cuya eliminación es un reto para la industria alimentaria debido a la resistencia de sus esporas tanto a tratamientos físicos como químicos.The three components act synergistically at precise concentrations to eliminate all microorganisms including sporulated bacteria such as Bacillus cereus whose elimination is a challenge for the food industry due to the resistance of its spores to both physical and chemical treatments.
El tiempo de contacto con las superficies altamente contaminadas (107-108 UCF/ml) debe ser al menos de 2 minutos, preferentemente entre 5-15 minutos, para reducir más del 99% de la población microbiana de la biopelícula. El ácido láctico y el peróxido de hidrógeno se encuentran entre las sustancias antimicrobianas producidas por las bacterias del ácido láctico (BAL). El ácido láctico, como producto de fermentación único o predominante en las BAL, desempeña un papel crucial en la conservación de alimentos, donde se produce hasta en un 8% en el proceso de fermentación. El efecto antimicrobiano del ácido láctico es capaz de inhibir el crecimiento bacteriano a través de la acción disruptiva en la membrana citoplasmática que conduce a la pérdida de fuerza motriz del protón y a la filtración de iones intracelulares y constituyentes de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Además, desde el punto de vista de la seguridad, no se considera que el ácido láctico esté asociado a riesgos crónicos para la salud y no represente ningún riesgo para el medio ambiente.The contact time with highly contaminated surfaces (107-108 UCF / ml) should be at least 2 minutes, preferably between 5-15 minutes, to reduce more than 99% of the biofilm's microbial population. Lactic acid and hydrogen peroxide are among the antimicrobial substances produced by lactic acid bacteria (BAL). Lactic acid, as the sole or predominant fermentation product in LABs, plays a crucial role in food preservation, where it is produced up to 8% in the fermentation process. The antimicrobial effect of lactic acid is able to inhibit bacterial growth through disruptive action in the cytoplasmic membrane that leads to loss of proton motive force and filtration of intracellular ions and constituents of Gram-positive and Gram-negative bacteria . In addition, from the point of view of safety, lactic acid is not considered to be associated with chronic health risks and does not represent any risk to the environment.
Así, la composición de la invención permite resolver tres importantes problemas asociados con la desinfección de superficies: i) es capaz de eliminar las biopelículas de forma eficaz en tiempos muy cortos de al menos 2 minutos, preferentemente entre 5-15 minutos, ii) no contiene agentes bactericidas tóxicos usados en la mayoría de los agentes desinfectantes debido a su poder desestabilizante de la integridad de la biopelícula pero que al mismo tiempo están asociados con un alto grado de toxicidad y contaminación del medio ambiente y iii) es capaz de inhibir las bombas de eflujo responsables de la resistencia de las bacterias a agentes antimicrobianos. Al tener solo agentes antimicrobianos con dianas no específicas, no crea resistencia tras repetidas aplicaciones como ocurre por ejemplo con los biocidas de amonio cuaternario que se usan en las diferentes formulaciones tales como cetilpiridinio.Thus, the composition of the invention allows three important problems associated with surface disinfection to be solved: i) it is capable of effectively removing biofilms in very short times of at least 2 minutes, preferably between 5-15 minutes, ii) no Contains toxic bactericidal agents used in most agents disinfectants due to their destabilizing power of biofilm integrity but at the same time they are associated with a high degree of toxicity and environmental pollution and iii) it is able to inhibit efflux pumps responsible for the resistance of bacteria to agents antimicrobials Having only antimicrobial agents with non-specific targets, it does not create resistance after repeated applications such as for example with quaternary ammonium biocides that are used in different formulations such as cetylpyridinium.
Por lo tanto, la composición de la invención puede ser aplicada para la eliminación de biopelículas comprendidas por los microorganismos patógenos en el sector sanitario, la industria alimentaria e incluso el hogar. En el sector de la industria alimentaria, la composición de la invención se puede utilizar para descontaminar superficies donde se manipulan, se producen o se envasan alimentos. Además, se pueden desinfectar las maquinarias o instrumentos usados en estos ambientes. En este sentido, las empresas de la industria alimentaria, mataderos e incluso áreas de venta de los alimentos pueden tener interés en este tipo de productos especialmente cuando se trata de un producto que carece de toxicidad o peligro para crear resistencias microbianas. En el sector sanitario o clínico, su uso también permite descontaminar superficies e instrumentos para evitar el desarrollo de biopelículas o eliminarlas una vez establecidas. Por lo tanto, se evitaría el contagio y las infecciones nosocomiales que se pueden originar en este ambiente. A nivel doméstico, es importante destacar que la composición de la invención ofrece un alto poder desinfectante siendo un producto natural, lo que hace que carezca de toxicidad. La composición de la invención también puede ser usada para el tratamiento de pacientes aquejados de infecciones bacterianas y/o de intoxicaciones causadas por metales pesados.Therefore, the composition of the invention can be applied for the elimination of biofilms comprised of pathogenic microorganisms in the health sector, the food industry and even the home. In the food industry sector, the composition of the invention can be used to decontaminate surfaces where food is handled, produced or packaged. In addition, machinery or instruments used in these environments can be disinfected. In this sense, companies in the food industry, slaughterhouses and even food sales areas may have an interest in this type of products, especially when it is a product that lacks toxicity or danger to create microbial resistance. In the health or clinical sector, its use also allows decontamination of surfaces and instruments to prevent the development of biofilms or eliminate them once established. Therefore, contagion and nosocomial infections that may arise in this environment would be avoided. At the domestic level, it is important to note that the composition of the invention offers a high disinfectant power being a natural product, which means that it lacks toxicity. The composition of the invention can also be used for the treatment of patients suffering from bacterial infections and / or poisonings caused by heavy metals.
Por lo tanto, el primer aspecto de la presente invención hace referencia a una composición que comprende peróxido de hidrógeno, ácido láctico y EDTA, caracterizada por no comprender agentes bactericidas tóxicos. En un aspecto preferido, la composición de la invención se caracteriza por no comprender fenoles, metales pesados, aldehídos y detergentes. En un aspecto preferido, la composición de la invención se caracteriza por no comprender: ácido mandélico, ácido peracético, SDS, cloruro de cetilpiridinio, Sodio Cocoyl Sarcosinato, Lauril sarcosinato de sodio, Sodio dodecil difenil éter disulfonato. En un aspecto preferido, la composición de la invención comprende: al menos 3-6% de peróxido de hidrógeno, al menos 2.2-4.4% de ácido láctico y al menos 12.5-25 mM de EDTA. En un aspecto preferido, la composición de la invención comprende: 6% de peróxido de hidrógeno, 4.25% de ácido láctico y 25 mM de EDTA.Therefore, the first aspect of the present invention refers to a composition comprising hydrogen peroxide, lactic acid and EDTA, characterized by not comprising toxic bactericidal agents. In a preferred aspect, the composition of the invention is characterized by not comprising phenols, heavy metals, aldehydes and detergents. In a preferred aspect, the composition of the invention is characterized by not comprising: mandelic acid, peracetic acid, SDS, cetylpyridinium chloride, Sodium Cocoyl Sarcosinate, Sodium lauryl sarcosinate, Sodium dodecyl diphenyl ether disulfonate. In a preferred aspect, the composition of the invention comprises: at least 3-6% hydrogen peroxide, at least 2.2-4.4% lactic acid and at least 12.5-25 mM of EDTA In a preferred aspect, the composition of the invention comprises: 6% hydrogen peroxide, 4.25% lactic acid and 25 mM EDTA.
El segundo aspecto de la presente invención hace referencia a una composición que comprende agentes bactericidas que consisten exclusivamente en peróxido de hidrógeno y ácido láctico, y un agente quelante inhibidor de la bomba de eflujo por ejemplo el EDTA. En un aspecto preferido, la composición de la invención comprende dos agentes bactericidas que consisten en al menos 3-6% de peróxido de hidrógeno y al menos 2.2-4.4% de ácido láctico y como agente quelante inhibidor de la bomba de eflujo al menos 12.5- 25 mM de EDTA. En un aspecto preferido, la composición de la invención comprende dos agentes bactericidas que consisten en 6% de peróxido de hidrógeno y 4.25% de ácido láctico y como agente quelante inhibidor de la bomba de eflujo 25 mM de EDTA.The second aspect of the present invention refers to a composition comprising bactericidal agents consisting exclusively of hydrogen peroxide and lactic acid, and an efflux pump inhibitor chelating agent for example EDTA. In a preferred aspect, the composition of the invention comprises two bactericidal agents consisting of at least 3-6% hydrogen peroxide and at least 2.2-4.4% lactic acid and as an efflux pump inhibiting chelating agent at least 12.5 - 25 mM EDTA. In a preferred aspect, the composition of the invention comprises two bactericidal agents consisting of 6% hydrogen peroxide and 4.25% lactic acid and as a chelating agent inhibiting the 25 mM efflux pump of EDTA.
El tercer aspecto de la presente invención hace referencia a una composición que comprende al menos dos agentes bactericidas que consisten en peróxido de hidrógeno y ácido láctico y EDTA como agente quelante inhibidor de la bomba de eflujo. En un aspecto preferido, la composición de la invención comprende al menos dos agentes bactericidas que consisten en al menos 3-6% de peróxido de hidrógeno y al menos 2.2-4.4% de ácido láctico y como agente quelante inhibidor de la bomba de eflujo al menos 12.5- 25 mM de EDTA. En un aspecto preferido, la composición de la invención comprende al menos dos agentes bactericidas que consisten en 6% de peróxido de hidrógeno y 4.25% de ácido láctico y como agente quelante inhibidor de la bomba de eflujo 25 mM de EDTA.The third aspect of the present invention refers to a composition comprising at least two bactericidal agents consisting of hydrogen peroxide and lactic acid and EDTA as an efflux pump inhibiting chelating agent. In a preferred aspect, the composition of the invention comprises at least two bactericidal agents consisting of at least 3-6% hydrogen peroxide and at least 2.2-4.4% lactic acid and as a chelating agent inhibiting the efflux pump at minus 12.5-25 mM EDTA. In a preferred aspect, the composition of the invention comprises at least two bactericidal agents consisting of 6% hydrogen peroxide and 4.25% lactic acid and as a chelating agent inhibiting the 25 mM efflux pump of EDTA.
El cuarto aspecto de la invención hace referencia a un método ex vivo (fuera del cuerpo humano o animal) para la eliminación de biopelículas conformadas por al menos una bacteria, en cualquier utensilio o superficie, que comprende la aplicación de la composición de la invención arriba descrita. En un aspecto preferido, la composición de la invención se aplica a la biopelícula al menos durante 2 minutos, preferentemente entre 5 y 15 minutos. En un aspecto preferido, las bacterias que conforman la biopelícula, que serían eliminadas por la composición de la invención, se seleccionan del grupo que comprende: Staphylococcus aureus CECT 4468, Listeria monocytogenes CECT 4032, Enterococcus faecalis S-47, Bacillus cereus CECT 5148, Escherichia coli CCUG 47553 y Salmonella Enteritidis UJ3449. The fourth aspect of the invention refers to an ex vivo method (outside the human or animal body) for the elimination of biofilms formed by at least one bacterium, on any utensil or surface, which comprises the application of the composition of the invention above. described. In a preferred aspect, the composition of the invention is applied to the biofilm for at least 2 minutes, preferably between 5 and 15 minutes. In a preferred aspect, the bacteria that make up the biofilm, which would be eliminated by the composition of the invention, are selected from the group comprising: Staphylococcus aureus CECT 4468, Listeria monocytogenes CECT 4032, Enterococcus faecalis S-47, Bacillus cereus CECT 5148, Escherichia coli CCUG 47553 and Salmonella Enteritidis UJ3449.
El quinto aspecto de la presente invención hace referencia al uso ex vivo de la composición de la invención como desinfectante. En un aspecto preferido, la invención hace referencia al uso de la composición de la invención para la eliminación de biopelículas conformadas por al menos una bacteria. En un aspecto preferido la composición se aplica a la biopelícula al menos durante 2 minutos, preferentemente entre 5 y 15 minutos. En un aspecto preferido las bacterias que conforman la biopelícula son: Staphylococcus aureus CECT 4468, Listeria monocytogenes CECT 4032, Enterococcus faecalis S-47, Bacillus cereus CECT 5148, Escherichia coli CCUG 47553 y Salmonella Enteritidis UJ3449.The fifth aspect of the present invention refers to the ex vivo use of the composition of the invention as a disinfectant. In a preferred aspect, the invention refers to the use of the composition of the invention for the removal of biofilms formed by at least one bacterium. In a preferred aspect the composition is applied to the biofilm for at least 2 minutes, preferably between 5 and 15 minutes. In a preferred aspect the bacteria that make up the biofilm are: Staphylococcus aureus CECT 4468, Listeria monocytogenes CECT 4032, Enterococcus faecalis S-47, Bacillus cereus CECT 5148, Escherichia coli CCUG 47553 and Salmonella Enteritidis UJ3449.
El sexto aspecto de la presente invención hace referencia a la composición de la invención para ser usada como medicamento, particularmente en el tratamiento de pacientes aquejados de infecciones bacterianas y/o de intoxicaciones causadas por metales pesados. En un aspecto preferido, la bacteria se selecciona de la lista que comprende: Staphylococcus aureus CECT 4468, Listeria monocytogenes CECT 4032, Enterococcus faecalis S-47, Bacillus cereus CECT 5148, Escherichia coli CCUG 47553 y Salmonella Enteritidis UJ3449. En otro aspecto preferido, el metal pesado es Cadmio.The sixth aspect of the present invention refers to the composition of the invention for use as a medicament, particularly in the treatment of patients suffering from bacterial infections and / or poisoning caused by heavy metals. In a preferred aspect, the bacterium is selected from the list comprising: Staphylococcus aureus CECT 4468, Listeria monocytogenes CECT 4032, Enterococcus faecalis S-47, Bacillus cereus CECT 5148, Escherichia coli CCUG 47553 and Salmonella Enteritidis UJ3449. In another preferred aspect, the heavy metal is Cadmium.
Es importante destacar que, en un aspecto particularmente preferido, la composición de la invención comprende unas concentraciones o cantidades precisamente establecidas con el objetivo de conseguir un efecto sinérgico entre sus componentes que dé lugar a la consecución de un triple efecto técnico: i) eliminación de la biopelícula en tiempos muy cortos de al menos 2 minutos, preferentemente entre 5-15 minutos, ii) sin generar toxicidad e iii) inhibiendo al mismo tiempo las bombas de eflujo responsables de la resistencia de las bacterias a agentes antimicrobianos. Las concentraciones o cantidades precisamente establecidas para conseguir dicho efecto sinérgico son: al menos 3-6% de peróxido de hidrógeno, al menos 2.2-4.4% de ácido láctico y al menos 12.5-25 mM de EDTA. En un aspecto preferido, la composición de la invención comprende 6% de peróxido de hidrógeno, 4.25% de ácido láctico y 25 mM de EDTA.It is important to note that, in a particularly preferred aspect, the composition of the invention comprises precisely established concentrations or amounts in order to achieve a synergistic effect among its components that results in the achievement of a triple technical effect: i) elimination of the biofilm in very short times of at least 2 minutes, preferably between 5-15 minutes, ii) without generating toxicity and iii) at the same time inhibiting efflux pumps responsible for the resistance of bacteria to antimicrobial agents. The concentrations or amounts precisely established to achieve said synergistic effect are: at least 3-6% hydrogen peroxide, at least 2.2-4.4% lactic acid and at least 12.5-25 mM EDTA. In a preferred aspect, the composition of the invention comprises 6% hydrogen peroxide, 4.25% lactic acid and 25 mM EDTA.
A los efectos de la presente invención se definen los siguientes términos:For the purposes of the present invention the following terms are defined:
• El término "que comprende" significa que incluye, pero no se limita a lo que sigue a la palabra "que comprende". Por lo tanto, el uso del término "que comprende" indica que los elementos enumerados son obligatorios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes.• The term "that understands" means that it includes, but is not limited to what follows the word "that understands." Therefore, the use of the term "comprising" indicates that the items listed are mandatory or mandatory, but that other items are optional and may or may not be present.
• Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a lo que sigue a la frase "que consiste en". Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos.• By "consisting of" is understood to include, and is limited to what follows the phrase "consisting of". Therefore, the phrase "consisting of" indicates that the elements listed are mandatory, and that other elements may not be present.
• Por “desinfectante” se entiende un producto que permite eliminar, o permite evitar el establecimiento, de microorganismos en general y bacterias en particular. La utilización de un desinfectante permite limitar o, incluso, hacer desaparecer completamente la contaminación causada por los microorganismos.• “Disinfectant” means a product that eliminates or prevents the establishment of microorganisms in general and bacteria in particular. The use of a disinfectant allows to limit or even completely eliminate the contamination caused by microorganisms.
• Por “agente bactericida tóxico” se entiende cualquier agente capaz de provocar la muerte de las bacterias pero que al mismo tiempo exhibe una cierta toxicidad para el ser humano y los animales tras la exposición a dicho agente. Ejemplos de agentes bactericidas tóxicos son: fenoles, metales pesados, aldehídos y detergentes, particularmente ácido mandélico, ácido peracético, SDS, cloruro de cetilpiridinio, Sodio Cocoyl Sarcosinato, Lauril sarcosinato de sodio, Sodio dodecil difenil éter disulfonato.• "Toxic bactericidal agent" means any agent capable of causing the death of bacteria but at the same time exhibiting a certain toxicity to humans and animals after exposure to said agent. Examples of toxic bactericidal agents are: phenols, heavy metals, aldehydes and detergents, particularly mandelic acid, peracetic acid, SDS, cetylpyridinium chloride, Sodium Cocoyl Sarcosinate, Sodium lauryl sarcosinate, Sodium dodecyl diphenyl ether disulfonate.
Descripción de las figurasDescription of the figures
Figura 1. Actividad antibacteriana de la composición de la invención en biopelículas mono y multiespecíficas (el cóctel de seis bacterias: Staphylococcus aureus CECT 4468, Listeria monocytogenes CECT 4032, Enterococcus faecalis S-47, Bacillus cereus CECT 5148, Escherichia coli CCUG 47553 y Salmonella Enteritidis UJ3449) durante 0 min (control), 5 minutos (T5), 10 minutos (T10), 20 minutos (T20) y 30 minutos (T30) a temperatura ambiente según lo determinado por la determinación del recuento viable (Log10 CFU/ml). En el eje Y se ilustra el Log10 CFU/ml y el eje X las muestras. Figure 1 Antibacterial activity of the composition of the invention in mono and multispecific biofilms (the cocktail of six bacteria: Staphylococcus aureus CECT 4468, Listeria monocytogenes CECT 4032, Enterococcus faecalis S-47, Bacillus cereus CECT 5148, Escherichia coli CCUG 47553 and UJ Salmonella 34idis) for 0 min (control), 5 minutes (T5), 10 minutes (T10), 20 minutes (T20) and 30 minutes (T30) at room temperature as determined by the determination of the viable count (Log10 CFU / ml). On the Y axis the Log10 CFU / ml and the X axis are shown.
Figura 2. Visualización de la inactivación de la biopelícula multiespecífica utilizando el kit de viabilidad BacLight Live / Dead (Invitrogen) después del tratamiento con la composición de la invención (100% v / v) durante 0 minutos (A, Control), 2 minutos (B), 5 minutos (C) y 10 minutos (D) a temperatura ambiente y resuspensión de la biopelícula en PBS. Todas las imágenes se obtuvieron utilizando microscopio confocal LEICA TCS SP5 II (objetivo x63) y zoom de 2,5 (A y D), 1,5 (C) y 1 (B). Figure 2 Visualization of the inactivation of the multispecific biofilm using the BacLight Live / Dead (Invitrogen) viability kit after treatment with the composition of the invention (100% v / v) for 0 minutes (A, Control), 2 minutes (B) , 5 minutes (C) and 10 minutes (D) at room temperature and resuspension of the biofilm in PBS. All images were obtained using LEICA TCS SP5 II confocal microscope (objective x63) and zoom 2.5 (A and D), 1.5 (C) and 1 (B).
Figura 3. Fotos de microscopía confocal de biopelícula del cóctel de bacterias tratadas o no con el compuesto. Izquierda (control, células vivas), centro (tratamiento durante 5 minutos, gran cantidad de células muertas) y derecha (tratamiento durante 10 minutos, totalidad de células muertas). Figure 3. Photos of confocal microscopy of biofilm of the cocktail of bacteria treated or not treated with the compound. Left (control, living cells), center (treatment for 5 minutes, large number of dead cells) and right (treatment for 10 minutes, all dead cells).
Figura 4. La composición de la invención adicionada a una concentración sub-inhibitoria (1/2 MIC) al cóctel de bacterias en TSB permitió la inhibición de la expresión de genes que codifican para las bombas de eflujo EfrAB (genes efrA y efrB) y NorE (el gen norE). C (Control). T (tratado con % MIC de la composición de la invención). Eje Y (Expresión relativa normalizada). Figure 4 The composition of the invention added to a sub-inhibitory concentration (1/2 MIC) to the bacterial cocktail in TSB allowed the inhibition of the expression of genes encoding the efflux pumps EfrAB (efrA and efrB genes) and NorE (the norE gene). C (Control). T (treated with% MIC of the composition of the invention). Y axis (Normalized relative expression).
Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention
MATERIAL Y MÉTODOSMATERIAL AND METHODS
Ejemplo 1. Cepas y condiciones de crecimiento bacteriano.Example 1. Strains and bacterial growth conditions.
En la presente invención se usaron Staphylococcus aureus CECT 4468, Listeria monocytogenes CECT 4032, Enterococcus faecalis S-47, Bacillus cereus CECT 5148, Escherichia coli CCUG 47553 y Salmonella Enteritidis UJ3449. Las cepas se cultivaron en Tryptone Soya Broth (TSB) (Fluka, Madrid, España) a 37°C durante 24 horas. Los cultivos se mantuvieron en 20% de glicerol a -20°C y -80°C para almacenamiento a corto y largo plazo, respectivamente.In the present invention Staphylococcus aureus CECT 4468, Listeria monocytogenes CECT 4032, Enterococcus faecalis S-47, Bacillus cereus CECT 5148, Escherichia coli CCUG 47553 and Salmonella Enteritidis UJ3449 were used. The strains were grown in Tryptone Soya Broth (TSB) (Fluka, Madrid, Spain) at 37 ° C for 24 hours. The cultures were kept in 20% glycerol at -20 ° C and -80 ° C for short and long term storage, respectively.
Ejemplo 2. Efecto de la composición de la invención sobre el crecimiento de células planctónicas.Example 2. Effect of the composition of the invention on the growth of planktonic cells.
Para determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) y la concentración mínima de bactericida (MBC) de la composición de la invención (6% de H2O2, 4.25% de ácido láctico y 25 mM de EDTA), se utilizó el método de microdilución en caldo. Durante la noche, los cultivos bacterianos cultivados en caldo TSB a 37°C durante 24 horas se diluyeron 1/10 (v/v) en caldo TSB fresco y se agregaron 20 ^l a cada pocillo de las placas de microtitulación de 96 pocillos. Posteriormente, se agregaron 180 ^l de caldo TSB suplementado con la composición de la invención a diferentes concentraciones (0.25-50%, v/v). Las placas se incubaron a 37°C en condiciones aerobias durante 24 horas y se evaluó el crecimiento bacteriano por la presencia de turbidez. Los pocillos que exhibieron la ausencia de turbidez se sometieron a determinación de recuento de viables (UFC/ml) mediante la siembra de las muestras (10 ^l) en placas de agar triptona Soja (TSA). Posteriormente las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas. La MIC se definió como la concentración más baja de la composición de la invención que inhibe el crecimiento visible y la MBC se definió como la concentración más baja de la composición de la invención que mata las bacterias (99%). Cada experimento fue hecho por triplicado.To determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericide concentration (MBC) of the composition of the invention (6% H2O2, 4.25% lactic acid and 25 mM EDTA), the broth microdilution method was used . Overnight, bacterial cultures grown in TSB broth at 37 ° C for 24 hours were diluted 1/10 (v / v) in fresh TSB broth and 20 ^ each well of the 96-well microtiter plates were added. Subsequently, 180 µl of TSB broth supplemented with the composition of the invention was added at different concentrations (0.25-50%, v / v). Plates were incubated at 37 ° C under aerobic conditions for 24 hours and bacterial growth was evaluated by the presence of turbidity. The wells they exhibited The absence of turbidity was subjected to determination of viable counts (CFU / ml) by sowing the samples (10 ^ l) in Soya triptone agar plates (TSA). Subsequently the plates were incubated at 37 ° C for 24 hours. MIC was defined as the lowest concentration of the composition of the invention that inhibits visible growth and MBC was defined as the lowest concentration of the composition of the invention that kills bacteria (99%). Each experiment was done in triplicate.
Ejemplo 3. Determinación de la actividad anti-biopelícula.Example 3. Determination of anti-biofilm activity.
Las propiedades anti-adherencia de la composición de la invención a diferentes cepas bacterianas (S. aureus CECT 4468, L. monocytogenes CECT 4032, E. faecalis S-47, B. cereus CECT 5148, E. coli CCUG 47553 y S. Enteritidis UJ3449) y el cóctel de todas las cepas se ensayaron en placas de microtitulación. Durante la noche, los cultivos bacterianos cultivados en caldo TSB a 37°C durante 24 horas se diluyeron 1/10 (v/v) en caldo TSB fresco y se agregaron 20 ^l a cada pocillo de las placas de microtitulación de 96 pocillos. Posteriormente, los pocillos se completaron con 180 ^l de caldo TSB suplementado con la composición de la invención a concentraciones sub-MIC (1/2 MIC de la composición de la invención para cada cepa hasta el 20% de la composición de la invención, v/v). Los controles sin la composición de la invención consistieron en 180 ^l de caldo TSB. Las placas se incubaron a 37°C en condiciones aerobias durante 24 horas y los pocillos se lavaron con tampón fosfato salino (PBS). La actividad anti-biopelícula de la composición de la invención se determinó tiñendo los pocillos lavados con 100 ^l de cristal violeta al 1% (p/v) que se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Posteriormente, se determinó la absorbancia a 590 nm usando un lector de microplacas (lector de absorbancias de microplacas iMark, instrumento Bio-Rad). El porcentaje de inhibición de la formación de biopelículas se determinó usando la siguiente fórmula como se describe por Zmantar et al. (2017):The anti-adhesion properties of the composition of the invention to different bacterial strains (S. aureus CECT 4468, L. monocytogenes CECT 4032, E. faecalis S-47, B. cereus CECT 5148, E. coli CCUG 47553 and S. Enteritidis UJ3449) and the cocktail of all strains were tested in microtiter plates. Overnight, bacterial cultures grown in TSB broth at 37 ° C for 24 hours were diluted 1/10 (v / v) in fresh TSB broth and 20 ^ each well of the 96-well microtiter plates were added. Subsequently, the wells were completed with 180 µl of TSB broth supplemented with the composition of the invention at sub-MIC concentrations (1/2 MIC of the composition of the invention for each strain up to 20% of the composition of the invention, v / v). Controls without the composition of the invention consisted of 180 µl of TSB broth. The plates were incubated at 37 ° C under aerobic conditions for 24 hours and the wells were washed with phosphate buffered saline (PBS). The anti-biofilm activity of the composition of the invention was determined by staining the washed wells with 100 µl of 1% violet glass (w / v) that were incubated at room temperature for 15 minutes. Subsequently, the absorbance at 590 nm was determined using a microplate reader (iMark microplate absorbance reader, Bio-Rad instrument). The percent inhibition of biofilm formation was determined using the following formula as described by Zmantar et al. (2017):
Ejemplo 4. Efecto antimicrobiano de la composición de la invención sobre la biopelícula preformada. Example 4. Antimicrobial effect of the composition of the invention on the preformed biofilm.
Se usó un inóculo con el 2% de cada bacteria y el cóctel de todas las cepas en TSB para la preparación de la biopelícula que se cultivó en placas de microtitulación de 96 pocillos durante 24 horas 37°C. Después de la incubación, el caldo de cultivo que contenía bacterias no adheridas se retiró y los pocillos se lavaron con PBS estéril. Las biopelículas se trataron con la composición de la invención durante diferentes períodos de tiempo (5, 10, 15, 20 y 30 minutos) a temperatura ambiente. Después de los tratamientos, se retiró la composición de la invención y los pocillos se incubaron con 200 ^l de caldo neutralizante D / E (Difco, Barcelona) durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se lavaron con 200 ^l de PBS. Las biopelículas se resuspendieron en 200 ^l de PBS y luego se sembraron en TSA. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas para la determinación del número total de UFC/ml.An inoculum was used with 2% of each bacterium and the cocktail of all strains in TSB for the preparation of the biofilm that was grown in 96-well microtiter plates for 24 hours 37 ° C. After incubation, the culture broth containing non-adherent bacteria was removed and the wells were washed with sterile PBS. The biofilms were treated with the composition of the invention for different periods of time (5, 10, 15, 20 and 30 minutes) at room temperature. After the treatments, the composition of the invention was removed and the wells were incubated with 200 µl of D / E neutralizing broth (Difco, Barcelona) for 5 minutes at room temperature and then washed with 200 µl of PBS. The biofilms were resuspended in 200 µl of PBS and then seeded in TSA. The plates were incubated at 37 ° C for 24 hours to determine the total number of CFU / ml.
Ejemplo 5. Evaluación microscópica del efecto de la composición de la invención en la biopelícula.Example 5. Microscopic evaluation of the effect of the composition of the invention on the biofilm.
La obtención de imágenes de la biopelícula tratada con la composición de la invención se realizó utilizando LIVE/DEAD BacLight ™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU) y un microscopio de escaneo láser confocal (LEICA TCS-SP5 II, Mannheim, Alemania) equipado con Plan-Apochromat 63x / 1.4 objetivo. Después de cultivar la biopelícula en una placa de microtitulación (200 ^l) como se describió anteriormente, algunos pocillos no se trataron con la composición de la invención (control) y los otros se sometieron a tratamiento con la composición de la invención durante 5 y 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con PBS estéril y se resuspendieron en 50 ^l de PBS. Posteriormente, 20 ^l de las suspensiones (control y tratamiento con la composición de la invención) fueron completadas con 0,5 ^l de tinción LIVE/DEAD y posteriormente se colocaron en un portaobjetos de vidrio y se obtuvieron imágenes usando un microscopio de escaneo láser confocal.Imaging of the biofilm treated with the composition of the invention was performed using LIVE / DEAD BacLight ™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) and a confocal laser scanning microscope (LEICA TCS-SP5 II, Mannheim , Germany) equipped with Plan-Apochromat 63x / 1.4 objective. After culturing the biofilm in a microtiter plate (200 µl) as described above, some wells were not treated with the composition of the invention (control) and the others were subjected to treatment with the composition of the invention for 5 and 10 minutes at room temperature, they were washed with sterile PBS and resuspended in 50 µl of PBS. Subsequently, 20 ^ l of the suspensions (control and treatment with the composition of the invention) were completed with 0.5 ^ LIVE / DEAD staining and subsequently placed on a glass slide and images were obtained using a scanning microscope confocal laser.
Ejemplo 6. Efecto de la concentración sub-inhibitoria de la composición de la invención sobre la resistencia a la biopelícula.Example 6. Effect of the sub-inhibitory concentration of the composition of the invention on biofilm resistance.
Se añadió (o no) 1/2 MIC de la composición de la invención en caldo TSB (2 ml) al cóctel de las seis cepas bacterianas (2%) y posteriormente se incubaron durante 18 horas a 37°C en tubos y también en placas de microtitulación de 12 pocillos para formación de biopelículas. La extracción de ARN se realizó a partir de cultivos bacterianos planctónicos y también de biopelículas multiespecie utilizando el kit de ARN Direct-zol ™ (Zymo Research, EE. UU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.1/2 MIC of the composition of the invention in TSB broth (2 ml) was added to the cocktail of the six bacterial strains (2%) and subsequently incubated for 18 hours at 37 ° C in tubes and also in tubes. 12-well microtiter plates for biofilm formation. RNA extraction was performed from planktonic bacterial cultures and also of multispecies biofilms using the Direct-zol ™ RNA kit (Zymo Research, USA) according to the manufacturer's instructions.
Ejemplo 7. Análisis estadístico.Example 7. Statistical analysis.
Todos los análisis se realizaron por triplicado. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, EE. UU). Para determinar los promedios y las desviaciones estándar. La evaluación estadística de la inhibición del desarrollo de biopelículas se realizó por análisis de varianza (ANOVA) usando el software Statgraphics Centurion XVI (Statpoint Technologie, Warrenton, Virginia, EE. UU). El mismo software se usó para realizar las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene para verificar la normalidad de los datos y realizar el contraste múltiple de Tukey bilateral para determinar las diferencias por pares entre las cepas, donde el nivel de significancia se estableció en el valor P de <0.05.All analyzes were performed in triplicate. Statistical analyzes were performed using the Excel 2007 program (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA). To determine the averages and standard deviations. Statistical evaluation of biofilm development inhibition was performed by analysis of variance (ANOVA) using Statgraphics Centurion XVI software (Statpoint Technologie, Warrenton, Virginia, USA). The same software was used to perform the Shapiro-Wilk and Levene tests to verify the normality of the data and perform the bilateral Tukey multiple contrast to determine the pairwise differences between the strains, where the level of significance was established in the value P of <0.05.
RESULTADOSRESULTS
Ejemplo 8. Actividad antimicrobiana de la composición de la invención en cultivos planctónicos.Example 8. Antimicrobial activity of the composition of the invention in planktonic cultures.
La Tabla 1 muestra el efecto antimicrobiano que ejerce la composición de la invención sobre el crecimiento de las células planctónicas de cada bacteria y también sobre el cóctel de todas las bacterias ensayadas. La Tabla 1 muestra la determinación de la Concentración Inhibidora Mínima (MIC) y Concentración Bactericida Mínima (MBC) de la composición de la invención. Table 1 shows the antimicrobial effect that the composition of the invention exerts on the growth of the planktonic cells of each bacterium and also on the cocktail of all the bacteria tested. Table 1 shows the determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of the composition of the invention.
Tabla 1Table 1
Se detectó una alta susceptibilidad de las cepas bacterianas planctónicas ya que exhibían MIC muy bajas que variaban de 0.15% a 0.4% de la composición de la invención (v/v) siendo L. monocytogenes CECT 4032 y E. faecalis S-47 las cepas más susceptibles. Sin embargo, S. aureus CECT 4468 fue menos susceptible que otras especies y también el cóctel. En cuanto a los valores de MBC, fueron muy similares, oscilando entre 0.2% y 0.5% de la composición de la invención (v/v). En este sentido, la composición de la invención fue efectiva contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas y además frente al cóctel hecho con las seis bacterias ya que también fue eliminado a la vista de la baja concentración de la composición de la invención (0.5%).High susceptibility of the planktonic bacterial strains was detected since they exhibited very low MICs ranging from 0.15% to 0.4% of the composition of the invention (v / v) with L. monocytogenes CECT 4032 and E. faecalis S-47 strains more susceptible However, S. aureus CECT 4468 was less susceptible than other species and also the cocktail. As for the MBC values, they were very similar, ranging between 0.2% and 0.5% of the composition of the invention (v / v). In this sense, the composition of the invention was effective against Gram-positive and Gram-negative bacteria and also against the cocktail made with the six bacteria since it was also eliminated in view of the low concentration of the composition of the invention (0.5 %).
Ejemplo 9. Inhibición de la formación de biopelículas por la composición de la invención.Example 9. Inhibition of biofilm formation by the composition of the invention.
Se logró una fuerte inhibición del desarrollo de biopelículas usando la composición de la invención para cada cepa y para el cóctel bacteriano. Los resultados obtenidos mostraron que se logró el 80-91% de la inhibición de la biopelícula en desarrollo para cepas individuales y también el cóctel (Tabla 2). Además, el uso de 1/2 MIC de la composición de la invención permitió una inhibición del 33-50% del desarrollo de la biopelícula (Tabla 2). Estos resultados indicaron que la composición de la invención inhibió la adherencia bacteriana al poliestireno (Tabla 2).A strong inhibition of biofilm development was achieved using the composition of the invention for each strain and for the bacterial cocktail. The results obtained showed that 80-91% of the inhibition of the developing biofilm was achieved for individual strains and also the cocktail ( Table 2 ). In addition, the use of 1/2 MIC of the composition of the invention allowed a 33-50% inhibition of biofilm development ( Table 2 ). These results indicated that the composition of the invention inhibited bacterial adhesion to polystyrene ( Table 2 ).
Tabla 2Table 2
±DS, desviación estándar de tres experimentos independientes.± DS, standard deviation of three independent experiments.
*Cada letra minúscula diferente representa diferencias significativas según el HSD de Tukey entre las cepas (p <0.05). * Each different lowercase letter represents significant differences according to Tukey's HSD between strains (p <0.05).
Ejemplo 10. Evaluación del efecto antimicrobiano de la composición de la invención en biopelículas.Example 10. Evaluation of the antimicrobial effect of the composition of the invention in biofilms.
Las biopelículas preformadas de diferentes cepas bacterianas en placas de microtitulación se sometieron al efecto antimicrobiano de la composición de la invención durante varios tiempos de contacto (5, 10, 15, 20 y 30 minutos). Los resultados obtenidos mostraron el efecto bactericida total de la composición de la invención contra todas las cepas bacterianas y también el cóctel después de todos los tiempos de contacto que varían de 5 a 30 minutos (ver Figura 1). Además, la microscopía confocal reveló que la composición de la invención tenía un fuerte efecto sobre la biopelícula multiespecie ya que no se detectaron células viables de las biopelículas tratadas con la composición de la invención (5 y 10 minutos) dentro de la matriz de la biopelícula (ver Figura 2 B-D), en comparación con controles no tratados con la composición de la invención (ver Figura 2 A). Sin embargo, se visualizaron células muertas (ver Figura 2 C y D).The preformed biofilms of different bacterial strains in microtiter plates were subjected to the antimicrobial effect of the composition of the invention for several contact times (5, 10, 15, 20 and 30 minutes). The results obtained showed the total bactericidal effect of the composition of the invention against all bacterial strains and also the cocktail after all contact times varying from 5 to 30 minutes (see Figure 1 ). In addition, confocal microscopy revealed that the composition of the invention had a strong effect on the multi-species biofilm since no viable cells of the biofilms treated with the composition of the invention (5 and 10 minutes) were detected within the biofilm matrix (see Figure 2 BD ), compared to controls not treated with the composition of the invention (see Figure 2 A ). However, dead cells were visualized (see Figure 2 C and D ).
Ejemplo 11. La composición de la invención inhibe las bombas de eflujo.Example 11. The composition of the invention inhibits efflux pumps.
La composición de la invención es capaz de inhibir las bombas de eflujo que actúan como mecanismos de resistencia inespecífica en las bacterias (particularmente bombas de eflujo EfrAB y NorE). Esto se demuestra en la presente invención mediante análisis de la expresión de dichos genes en el cóctel de las bacterias estudiadas en ausencia y presencia de bajas concentraciones del compuesto (1/2 MIC). La composición de la invención adicionada a una concentración sub-inhibitoria (1/2 MIC) al cóctel de bacterias en TSB permitió la inhibición de la expresión de genes que codifican para las bombas de eflujo EfrAB (genes efrA y efrB) y NorE (el gen norE) tal y como se muestra en la Figura 4. Esta inhibición de las bombas de eflujo reduce la diseminación de patógenos resistentes a los diferentes antimicrobianos. Así, se evita el desarrollo de biopelículas con mayor resistencia a los antimicrobianos. En la Figura 4 se ve claramente que la aplicación de la composición de la invención a una concentración sub-inhibitoria del crecimiento (1/2 MIC) tiene una baja expresión de los genes codificadores de las bombas de eflujo EfrAB y NorE, las cuales juegan un papel importante en la resistencia intrínseca e inespecífica a los diferentes agentes antimicrobianos (antibióticos y biocidas). Por lo tanto, por un lado, gracias a la acción inhibitoria de las bombas de eflujo, la composición de la invención permite potenciar la acción antimicrobiana de los dos agentes bactericidas (ácido láctico y peróxido de hidrógeno) al bloquear uno de los mecanismos de defensa bacteriana, permitiendo así restaurar la actividad antimicrobiana de diversos compuestos antimicrobianos que han perdido su actividad debido a la presencia de bombas de eflujo. Por otra parte, el uso de la composición de la invención, al bloquear o inhibir las bombas de eflujo, reducirá la emergencia existente relativa a la existencia de bacterias multirresistentes a los antimicrobianos. Actualmente, las bombas de eflujo representan unas dianas muy atractivas para reducir la diseminación de la resistencia a los antimicrobianos (antibióticos y biocidas). Particularmente, el mecanismo mediante el cual se cree que el EDTA promueve la inhibición de la bomba de eflujo es mediante el secuestro de los iones de calcio, así, no puede producirse la hidrólisis del ATP y no puede ponerse en funcionamiento las bombas de exporte de la familia de los transportadores ABC, como es el caso de la bomba de exporte EfrAB. The composition of the invention is capable of inhibiting efflux pumps that act as mechanisms of nonspecific resistance in bacteria (particularly EfrAB and NorE efflux pumps). This is demonstrated in the present invention by analyzing the expression of said genes in the cocktail of the bacteria studied in the absence and presence of low concentrations of the compound (1/2 MIC). The composition of the invention added to a sub-inhibitory concentration (1/2 MIC) to the bacterial cocktail in TSB allowed the inhibition of the expression of genes encoding the efflux pumps EfrAB (efrA and efrB genes) and NorE (the norE gene) as shown in Figure 4 . This inhibition of efflux pumps reduces the spread of pathogens resistant to different antimicrobials. Thus, the development of biofilms with greater resistance to antimicrobials is avoided. In Figure 4 it is clearly seen that the application of the composition of the invention at a sub-inhibitory growth concentration (1/2 MIC) has a low expression of the coding genes of the EfrAB and NorE efflux pumps, which play an important role in intrinsic and nonspecific resistance to different antimicrobial agents (antibiotics and biocides). Therefore, on the one hand, thanks to the inhibitory action of efflux pumps, the composition of the invention allows to enhance the antimicrobial action of the two bactericidal agents (lactic acid and hydrogen peroxide) by blocking one of the defense mechanisms bacterial, thus allowing to restore the antimicrobial activity of various Antimicrobial compounds that have lost their activity due to the presence of efflux pumps. On the other hand, the use of the composition of the invention, by blocking or inhibiting efflux pumps, will reduce the existing emergency regarding the existence of multimicrobial resistant bacteria. Currently, efflux pumps represent very attractive targets to reduce the spread of antimicrobial resistance (antibiotics and biocides). Particularly, the mechanism by which EDTA is believed to promote the inhibition of the efflux pump is by sequestering calcium ions, thus, hydrolysis of ATP cannot occur and the export pumps cannot be put into operation. The ABC conveyor family, as is the case with the EfrAB export pump.
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Legal Events
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| BA2A | Patent application published |
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| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2717798 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B2 Effective date: 20200922 |