ES2716819T3 - Opsinas quiméricas activadas por luz y métodos de uso de las mismas - Google Patents
Opsinas quiméricas activadas por luz y métodos de uso de las mismas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2716819T3 ES2716819T3 ES11838855T ES11838855T ES2716819T3 ES 2716819 T3 ES2716819 T3 ES 2716819T3 ES 11838855 T ES11838855 T ES 11838855T ES 11838855 T ES11838855 T ES 11838855T ES 2716819 T3 ES2716819 T3 ES 2716819T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- light
- aspects
- activated
- protein
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 193
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 179
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 166
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 108
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 claims description 39
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 38
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 176
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 171
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 99
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 99
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 65
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 62
- 108050001704 Opsin Proteins 0.000 description 54
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 54
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 53
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 51
- 102000010175 Opsin Human genes 0.000 description 47
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 46
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 39
- 239000001654 beetroot red Substances 0.000 description 37
- 230000004044 response Effects 0.000 description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 36
- 239000004176 azorubin Substances 0.000 description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 34
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 26
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 210000002442 prefrontal cortex Anatomy 0.000 description 23
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 23
- 230000000401 corticothalamic effect Effects 0.000 description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 22
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 description 22
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 20
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 17
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 16
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 16
- 230000003461 thalamocortical effect Effects 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 102000001675 Parvalbumin Human genes 0.000 description 13
- 108060005874 Parvalbumin Proteins 0.000 description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 13
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 238000001720 action spectrum Methods 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000002999 depolarising effect Effects 0.000 description 10
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 9
- 102000034573 Channels Human genes 0.000 description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 9
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 9
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 8
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 8
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 210000002763 pyramidal cell Anatomy 0.000 description 8
- 101000944277 Homo sapiens Inward rectifier potassium channel 2 Proteins 0.000 description 7
- 241000195614 Volvox carteri Species 0.000 description 7
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 7
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 7
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 6
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 230000002102 hyperpolarization Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 6
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 6
- 235000020945 retinal Nutrition 0.000 description 6
- 239000011604 retinal Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000000542 thalamic effect Effects 0.000 description 6
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 6
- 229920000685 trimethylsilyl polyphosphate Polymers 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N vitamin A aldehyde Natural products O=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 5
- 241000195615 Volvox Species 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 5
- YSVQLWJDHYBITL-UHFFFAOYSA-N ppse Chemical compound C[Si](C)(C)OP(=O)=O YSVQLWJDHYBITL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 230000036749 excitatory postsynaptic potential Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000002360 prefrontal effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 4
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 4
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical class O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 3
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 3
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 3
- 102000004330 Rhodopsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000007278 cognition impairment Effects 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 2
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 2
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 2
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 2
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 2
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 2
- 241000649045 Adeno-associated virus 10 Species 0.000 description 2
- 241000649046 Adeno-associated virus 11 Species 0.000 description 2
- 241000649047 Adeno-associated virus 12 Species 0.000 description 2
- 241000300529 Adeno-associated virus 13 Species 0.000 description 2
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 2
- 102000004657 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010003721 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Proteins 0.000 description 2
- 108091005462 Cation channels Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051001 Kir2.1 channel Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- HUCVOHYBFXVBRW-UHFFFAOYSA-M caesium hydroxide Chemical compound [OH-].[Cs+] HUCVOHYBFXVBRW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 230000000848 glutamatergic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 210000001926 inhibitory interneuron Anatomy 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000007427 paired t-test Methods 0.000 description 2
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 2
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 2
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108010079442 Anion Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012739 Anion Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 101100220074 Arabidopsis thaliana CDA8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100277337 Arabidopsis thaliana DDM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108010035848 Channelrhodopsins Proteins 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 229920001651 Cyanoacrylate Polymers 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 102100033114 Inward rectifier potassium channel 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010083687 Ion Pumps Proteins 0.000 description 1
- 102000006391 Ion Pumps Human genes 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101000903581 Natronomonas pharaonis Halorhodopsin Proteins 0.000 description 1
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000083879 Polyommatus icarus Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108010083204 Proton Pumps Proteins 0.000 description 1
- 102000006270 Proton Pumps Human genes 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N Retinaldehyde Chemical compound O=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 1
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 210000003626 afferent pathway Anatomy 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 101150113676 chr1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000006690 co-activation Effects 0.000 description 1
- 230000036992 cognitive tasks Effects 0.000 description 1
- 230000007748 combinatorial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000005257 cortical tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007428 craniotomy Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 description 1
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 description 1
- JJJFUHOGVZWXNQ-UHFFFAOYSA-N enbucrilate Chemical compound CCCCOC(=O)C(=C)C#N JJJFUHOGVZWXNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N floxuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001153 interneuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- CVRPVRHBAOPDIG-UHFFFAOYSA-N methyl 2-methylprop-2-enoate;2-(2-methylprop-2-enoyloxy)ethyl 1,3-dioxo-2-benzofuran-5-carboxylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C.CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C1=CC=C2C(=O)OC(=O)C2=C1 CVRPVRHBAOPDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001423 neocortical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000003767 neural control Effects 0.000 description 1
- 210000000118 neural pathway Anatomy 0.000 description 1
- 230000010004 neural pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008904 neural response Effects 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 108010040225 picrotoxinin receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 229940070376 protein Drugs 0.000 description 1
- 230000001003 psychopharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 230000014624 response to red light Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000001020 rhythmical effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 230000011273 social behavior Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009782 synaptic response Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000001521 two-tailed test Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/405—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from algae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N5/00—Radiation therapy
- A61N5/06—Radiation therapy using light
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5058—Neurological cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N5/00—Radiation therapy
- A61N5/06—Radiation therapy using light
- A61N2005/0658—Radiation therapy using light characterised by the wavelength of light used
- A61N2005/0662—Visible light
- A61N2005/0663—Coloured light
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
Description
DESCRIPCIÓN
Opsinas quiméricas activadas por luz y métodos de uso de las mismas
Campo técnico
La presente solicitud se refiere a composiciones que comprenden células animales que expresan proteínas quiméricas activadas por luz en sus membranas plasmáticas y métodos de uso de las mismas para despolarizar selectivamente neuronas excitadoras o inhibidoras que residen en el mismo microcircuito en la corteza prefrontal.
Antecedentes
Los sustratos neurofisiológicos de la mayoría de los trastornos psiquiátricos son poco conocidos, a pesar de que está surgiendo rápidamente información acerca de factores genéticos que se asocian a fenotipos complejos de comportamiento, tales como los observados en el autismo y la esquizofrenia (Cichon et al., The American Journal of Psychiatry 166 (5): 540 (2009); O' Donovan et al., Human Genetics 126 (1): 3 (2009)). Un principio emergente notable es que una gama muy amplia de anomalías genéticas aparentemente no relacionadas puede dar origen a la misma clase de fenotipo psiquiátrico (tal como una disfunción del comportamiento social; Folstein y Rosen-Sheidley, Nature Reviews 2 (12): 943 (2001)). Este patrón sorprendente ha señalado la necesidad de identificar percepciones a nivel de circuito simplificadoras que puedan unificar diversos factores genéticos con un principio fisiopatológico común.
Una de dichas hipótesis a nivel de circuito es que la elevación en la relación de excitación e inhibición celular cortical (equilibrio E/I celular) podría dar origen a déficits sociales y cognitivos del autismo (Rubenstein, Current Opinion in Neurology 23 (2): 118; Rubenstein y Merzenich, Genes, Brain, and Behavior2 (5): 255 (2003)). Esta hipótesis podría posiblemente unificar diversas corrientes de evidencia fisiopatológica, incluyendo la observación de que muchos genes relacionados con el autismo están vinculados a fenotipos de ganancia de función en canales iónicos y proteínas sinápticas (Bourgeron, Current Opinion in Neurobiology 19 (2), 231 (2009)) y que el ~30 % de los pacientes autistas también muestran convulsiones clínicamente aparentes (Gillberg y Billstedt, Acta Psychiatrica Scandinavica, 102 (5): 321 (2000)). Sin embargo, no está claro si un desequilibrio de este tipo (para que sea relevante para los síntomas de la enfermedad) sería operativo en la escala temporal crónica (por ejemplo, durante el desarrollo) o aguda. Además, esta hipótesis no se acepta universalmente de ninguna manera, en parte porque aún no se ha expuesto a ensayos directos. Las intervenciones farmacológicas y eléctricas carecen de la especificidad necesaria para favorecer selectivamente la actividad (de una manera fundamentalmente distinta de la modulación del receptor) de las células excitadoras neocorticales sobre las células inhibidoras, ya sea en el entorno clínico o en mamíferos de comportamiento libre durante tareas sociales y cognitivas. Tal vez se relaciona con problemas tales como que los déficits sociales y cognitivos del autismo y la esquizofrenia han demostrado en gran medida no responder a tratamientos psicofarmacológicos convencionales en la clínica.
La optogenética es la combinación de métodos genéticos y ópticos utilizados para controlar eventos específicos en células diana de tejido vivo, incluso en mamíferos que se mueven libremente y en otros animales, con la precisión temporal (en una escala temporal de milisegundos) necesaria para mantener el ritmo con sistemas biológicos intactos en funcionamiento. La característica distintiva de la optogenética es la introducción de proteínas de canal activadas por luz rápidas en las membranas plasmáticas de las células neuronales diana que permite temporalmente la manipulación precisa del potencial de membrana neuronal manteniendo al mismo tiempo la resolución de tipo celular a través del uso de mecanismos específicos de direccionamiento. Entre las opsinas microbianas que pueden usarse para investigar la función de los sistemas neurales están las canalrodopsinas (ChR2, ChR1, VChR1 y SFO) utilizadas para promover la despolarización en respuesta a la luz. En solo unos pocos años, el campo de la optogenética ha promovido la comprensión científica fundamental de cómo tipos celulares específicos contribuyen a la función de tejidos biológicos tales como los circuitos neurales in vivo. Además, en el aspecto clínico, la investigación impulsada por la optogenética ha conducido a la comprensión de la enfermedad de Parkinson y otros trastornos neurológicos y psiquiátricos.
Sin embargo, existen limitaciones con respecto a las herramientas optogenéticas existentes para explorar la hipótesis de que la elevación en la relación del equilibrio E/I cortical podría estar asociada a los déficits sociales y cognitivos del autismo y otros trastornos tales como la esquizofrenia. Las fotocorrientes de canalrodopsinas convencionales muestran una desensibilización significativa que impide la generación de cambios progresivos en el equilibrio E/I (en lugar de esto requiere rampas o pulsos, lo que no sería adecuado para la investigación de cambios estables en el equilibrio E/I celular); además, tanto las SFO como las ChR convencionales están impulsadas por luz azul, lo que impide una comparación dentro de la preparación de los efectos de la activación de diferentes poblaciones de elementos del circuito (tales como neuronas excitadoras e inhibidoras). Por tanto, lo que se necesita es una herramienta que permita la manipulación de los equilibrios E/I corticales y el control de las oscilaciones gamma en cortes corticales para permitir la investigación de cómo estas manipulaciones afectan a neuronas corriente abajo que se encuentran en el mismo microcircuito en la corteza prefrontal.
El documento WO2009/131837 y Yizhar et al, Nature, vol. 477; 171-178 (2011) describen proteínas ópticamente sensibles. El documento WO2009/119782 describe una proteína rodopsina modificada en la que al menos uno de los dos o más dominios que contienen una estructura transmembrana en la proteína rodopsina de tipo canal fotorreceptor es un dominio que contiene una estructura transmembrana correspondiente derivado de la canalopsina-1 de Chlamydomonas reinhardtii o un mutante del dominio que contiene una estructura transmembrana y/o al menos uno de los dos o más dominios que contienen una estructura transmembrana es un dominio que contiene una estructura transmembrana correspondiente derivado de la canalopsina-2 de Chlamydomonas reinhardtii o un mutante del dominio que contiene una estructura transmembrana.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona un polipéptido quimérico activado por luz que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene más del 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, en la que el polipéptido es sensible a la luz y es capaz de mediar una corriente de despolarización en una célula cuando la célula se ilumina con luz.
La presente divulgación también establece una serie de otros métodos como se explica ("se proporciona en el presente documento") a continuación. Sin embargo, la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
En el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden canales catiónicos de proteínas activadas por luz quiméricas que son capaces de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz.
En el presente documento se proporcionan células animales que comprenden una proteína activada por luz expresada en la membrana celular, en las que la proteína es (a) una proteína quimérica derivada de VChR1 de Volvox carteri y ChR1 de Chlamydomonas reinhardti, en la que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de VChR1 que tiene al menos las hélices transmembrana primera y segunda reemplazadas por las hélices transmembrana primera y segunda de ChR1; (b) es sensible a la luz; y (c) es capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz. En algunos aspectos, las células están aisladas o están en un medio de cultivo celular.
En el presente documento también se proporciona una población de células que comprende la célula que expresa la proteína quimérica que se describe en el presente documento en la membrana celular. También se proporcionan en el presente documento animales no humanos y cortes de tejido cerebral que comprenden una célula que expresa la proteína quimérica que se describe en el presente documento en la membrana celular.
En el presente documento se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína activada por luz expresada en la membrana celular, en el que la proteína es una proteína quimérica derivada de VChR1 de Volvox carteri y ChR1 de Chlamydomonas reinhardti, en el que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de VChR1 que tiene al menos las hélices transmembrana primera y segunda reemplazadas por las hélices transmembrana primera y segunda de ChR1; es sensible a la luz; y es capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz. También se proporcionan vectores (tales como vectores de expresión) que comprenden los polinucleótidos. En algunos aspectos, el vector de expresión es un vector vírico (por ejemplo, un vector AAV, un vector retrovírico, un vector adenovírico, un vector del VHS o un vector lentivírico).
En el presente documento también se proporcionan métodos de uso de las células animales que expresan la proteína quimérica que se describe en el presente documento en la membrana celular, los métodos comprenden activar la proteína quimérica con luz.
En el presente documento también se proporcionan métodos de despolarización selectiva de neuronas excitadoras o inhibidoras que se encuentran en el mismo microcircuito, comprendiendo los métodos: despolarizar selectivamente una neurona excitadora que comprende una primera proteína activada por luz, en la que la primera proteína activada por luz se despolariza cuando se expone a luz que tiene una primera longitud de onda; o despolarizar selectivamente una neurona inhibidora que comprende una segunda proteína activada por luz, en la que la segunda proteína activada por luz se despolariza cuando se expone a luz que tiene una segunda longitud de onda.
En algunas realizaciones, la primera o la segunda proteína activada por luz es una proteína quimérica derivada de VChR1 de Volvox carteri y ChR1 de Chlamydomonas reinhardti, en las que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de VChR1 que tiene al menos las hélices transmembrana primera y segunda reemplazadas por las hélices transmembrana primera y segunda de ChR1. En algunas realizaciones, en las que la primera proteína activada por luz comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7 y en las que la segunda proteína activada por luz comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 11, 12, 13 o 14.
Un método de despolarización selectiva de neuronas inhibidoras o excitadoras que se encuentran en el mismo microcircuito, comprendiendo el método: expresar una primera proteína activada por luz en una neurona excitadora;
y expresar una segunda proteína activada por luz en una neurona inhibidora, en el que la primera proteína activada por luz se despolariza independientemente cuando se expone a luz que tiene una primera longitud de onda y en el que la segunda proteína activada por luz se despolariza independientemente cuando se expone a luz que tiene una segunda longitud de onda. En algunas realizaciones, la primera o la segunda proteína activada por luz es una proteína quimérica derivada de VChR1 de Volvox carteri y ChR1 de Chlamydomonas reinhardti, en las que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de VChR1 que tiene al menos las hélices transmembrana primera y segunda reemplazadas por las hélices transmembrana primera y segunda de ChR1. En algunas realizaciones, la primera proteína activada por luz comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7 y en las que la segunda proteína activada por luz comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 11, 12, 13 o 14.
En el presente documento también se proporcionan métodos para identificar un compuesto químico que inhiba selectivamente la despolarización de neuronas excitadoras o inhibidoras que se encuentran en el mismo microcircuito, comprendiendo el método: (a) despolarizar selectivamente una neurona excitadora que comprende una primera proteína activada por luz con luz que tiene una primera longitud de onda o despolarizar selectivamente una neurona inhibidora que comprende una segunda proteína activada por luz con luz que tiene una segunda longitud de onda; (b) medir un potencial postsináptico excitador (PPSE) en respuesta a la despolarización selectiva de la neurona que comprende una primera proteína activada por luz o medir una corriente postsináptica inhibidora (CPSI) en respuesta a la despolarización selectiva de una neurona inhibidora que comprende una segunda proteína activada por luz; (c) poner en contacto la neurona excitadora o la neurona inhibidora con un compuesto químico; (d) medir el potencial postsináptico excitador (PPSE) o medir la corriente postsináptica inhibidora (CPSI) para determinar si poner en contacto ya sea la neurona excitadora o la neurona inhibidora con el compuesto químico inhibe selectivamente la despolarización de cualquiera de las neuronas. En algunas realizaciones, la primera o la segunda proteína activada por luz es una proteína quimérica derivada de VChR1 de Volvox carteri y ChR1 de Chlamydomonas reinhardti, en las que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de VChR1 que tiene al menos las hélices transmembrana primera y segunda reemplazadas por las hélices transmembrana primera y segunda de ChR1. En algunas realizaciones, la primera proteína activada por luz comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 1, 3, 5 o 7 y en las que la segunda proteína activada por luz comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 11, 12, 13 o 14.
Ha de entenderse que una, algunas o todas las propiedades de las diversas realizaciones que se describen en el presente documento pueden combinarse para formar otras realizaciones de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes para un experto en la materia.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 representa la modificación por ingeniería genética de una canalrodopsina mejorada desplazada al rojo para optogenética combinatoria. (a) Imágenes confocales de neuronas de hipocampo cultivadas transfectadas con VChR 1-eYFP o C1V1-eYFP bajo el control del promotor CaMKIIa. El recuadro denota la región expandida en el último panel, que muestra la ubicación de la membrana dendrítica de C1V1-tsYFP. Barras de escala: 20 μm (izquierda), 4 μm (derecha). (b) Fotocorrientes máximas a partir de registros de pinzamientos zonales de células enteras en neuronas de hipocampo en cultivo que expresaban las opsinas indicadas. (c) Alineación de secuencias de ChR1, ChR2 y VChR1. Se indican sitios de corte y empalme para dos variantes de C1V1. Las hélices transmembrana putativas 1-7 se indican con barras (TM1-7); los aminoácidos mutados se indican en gris.
(d) Amplitudes de fotocorriente registradas en células HEK que expresaban las variantes 1 y 2 de corte y empalme de C1V1. (e) Imágenes del plano confocal único de neuronas de hipocampo cultivadas transfectadas con opsinas indicadas, fusionadas con EYFP. La concentración de ADN se emparejó en las construcciones. (f) Espectros de acción de ChR2, VChR1, C1V1 wt, C1V (E122T), C1V1 (E162T) y C1V1 (E122T/E162T). Se recogieron fotocorrientes con pulsos de luz de 2 ms en células HEK293. (g) Permeabilidad iónica de la variante 1 de corte y empalme de C1V1 medida por magnitud de fotocorriente a -40 mV en células HEK mediante pinzamiento zonal de células completas usando soluciones externas de aislamiento de cationes. Los datos se normalizaron a la corriente de Na de pico máximo. (h) Esquema de la quimera C1V1 con posiciones de mutaciones puntuales indicadas en blanco. Secuencia de ChR1 indicada con negro; Secuencia de VChR1 con gris.
La FIG. 2 muestra el ensayo de una canalrodopsina desplazada al rojo mejorada para optogenética combinatoria. (a) Rastros representativos y gráfico de sumario de la constante de tiempo de cierre de canal (toff) en neuronas cultivadas que expresaban las opsinas indicadas; los trazos se normalizan a la corriente máxima.
(b) Inactivación de C1V1-E122T comparada con la desactivación de ChR2. (c) Inactivación de la corriente en el mutante doble E122T/E162T de C1V1 frente a otras variantes de C1V1. (d) Fotocorrientes de pico promedio registradas en neuronas cultivadas que expresaban las opsinas indicadas en respuesta a un pulso de luz de 542 nm de 2 ms.
La FIG. 3 representa fotocorrientes a partir de registros de cortes agudos en neuronas piramidales prefrontales.
(a) Las fotocorrientes máximas muestran una correlación uniforme con la intensidad de fluorescencia integrada.
(b) Relación de fluorescencia-fotocorriente en ChR2(H134R) y C1V1 (E122T/E162T). Las líneas negras son
ajustes lineales a los datos. (c) Registros de cortes agudos en neuronas piramidales prefrontales estimuladas con series de pulsos de luz de 560 nm o inyecciones de corriente a las frecuencias indicadas. El gráfico de sumario muestra datos de población (n = 6). (d) Fracción de picos satisfactorios con respecto a inyecciones de corriente (200 pA, pulsos de 10 ms; parte superior a la izquierda) o pulsos de luz de 2 ms en las longitudes de onda y densidades de potencia lumínica indicadas. Todas las series de pulsos consistieron en pulsos de 20x2 ms entregados a través del objetivo del microscopio usando una fuente de luz Sutter DG-4, filtrados usando filtros de paso de banda de 20 nm y filtros de densidad neutra adicionales para atenuar la potencia lumínica (n = 6 células en 2 cortes). (e) Respuestas de pinzamiento de voltaje a pulsos de luz de 542 nm y 630 nm en células que expresaban C1V1-E122T o C1V1-E122T/E162T (parte superior). El registro de pinzamiento de corriente en una célula que expresa C1V1-E122T muestra picos en respuesta a una serie de 5 Hz de luz de 50 ms a 630 nm a 3,2 mW mm-2 (parte inferior). (f) Cinética de la respuesta a la luz roja en C1V1 (E122T). Constantes de tiempo de activación (ion) de fotocorrientes registradas de neuronas cultivadas que expresan C1V1 (E122T) a 540 nm y 630 nm. Obsérvese que las potencias lumínicas fueron de 3,2 mW mm-2 a 630 nm y de 7,7 mW mm-2 a 540 nm (n = 5 células, p = 0,0006 ensayo t pareado). (g) Los trazos de pinzamiento de voltaje muestran respuestas en una neurona que expresa C1V1 (E122T) a pulsos de luz de 630 nm. Las longitudes de pulso se indican sobre los trazos. La Ton calculada a partir del trazo de 150 ms es de 67 ms. (h) Registro de pinzamiento de corriente desde una neurona que expresa C1V1 (E122T) que muestra picos provocados por pulsos de 50 ms a 630 nm (densidad de potencia de 3,2 mW mm-2).
La FIG. 4 representa la activación independiente de neuronas piramidales excitadoras y células que expresan parvalbúmina inhibidoras. (a) Registros de pinzamiento de corriente de neuronas del hipocampo cultivadas que expresaban C1V1 (E1 22T/El62T) o ChR2(H134R) en respuesta a pulsos de luz de 2 ms a 560 nm o 405 nm (5 Hz; 7,6 mW/mm2 a las dos longitudes de onda). (b) Configuración de registro en animales doblemente inyectados que expresaban C1V1 en neuronas piramidales corticales y ChR2(H134R) en interneuronas inhibidoras positivas para parvalbúmina. Para expresar opsinas de forma independiente, se inyectaron ratones PV::Cre con una mezcla de dos virus que contenía Lenti-CaMK11a-C1V1 (E122T/E162T) y AAV5-EF 1a-DIO-Ch R2 (H 134R). (c) Registros de pinzamiento de voltaje de una neurona PYR sin expresión que recibe entrada sináptica de células PYR que expresaban C1V1 y células PV que expresaban ChR2. Pinzadas a 0 mV, los pulsos de luz de 405 nm disparan CPSI de latencia corta, mientras que los pulsos de 560 nm provocan solo respuestas sinápticas inhibidoras pequeñas y de latencia larga. (d) Registro de pinzamiento de voltaje de la misma célula que se muestra en c. Pinzada a -65 mV, los pulsos de luz de 560 nm disparan las CPSE, pero los pulsos de 405 nm no provocan corrientes sinápticas detectables. Las líneas grises muestran eventos individuales; las líneas negras muestran promedios disparados por pulsos de luz. (e) Registro de Optrode mPFC en un ratón PV::Cre anestesiado inyectado con CaMKIIa::C1V1 (E162T)-ts-eYFP y Efla-DIO::ChR2eYFP (el diagrama ilustra la configuración experimental). Los pulsos de luz violeta (405 nm) se presentan con un retardo variable (At) con respecto a los pulsos de luz verde (trazos de ejemplo). (f) El gráfico de sumario muestra la probabilidad de que se produzcan picos evocados por luz verde con pulsos de luz violeta que preceden a los pulsos de luz verde por los retrasos indicados. Los puntos individuales son de registros individuales. La línea negra muestra el promedio de todos los registros (> 3 sitios de registro por contenedor). (g) Registro de Optrode de un ratón inyectado con virus que muestra una presunta unidad piramidal y una presunta unidad PV, disparando en respuesta a una estimulación de 561 nm (derecha, forma de onda superior) y una estimulación de 405 nm (derecha, forma de onda inferior), respectivamente.
La FIG. 5 representa la excitación optogenética combinatoria en distintas preparaciones de sistemas intactos. (a) Control de proyección combinatoria con C1V1-E122T/E162T y ChR2-H134R in vitro. Paradigma experimental que muestra la expresión de C1V1 y ChR2 en células cortico-talámicas (CT) y tálamo-corticales (TC) ventrobasales (VB), respectivamente. (b) Registro de pinzamiento por voltaje de una célula nRT que recibe proyecciones tanto de células CT como de células TC. La estimulación simultánea (At = 0 ms) conduce a una suma lineal de CPSE provocadas desde ambas proyecciones. (c) Las entradas de subumbral inferiores individuales de las fibras TC y CT conducen a la propagación en una neurona nRT solo cuando las entradas son precisamente coincidentes. (d) Los retrasos entre las entradas CT y TC se indican a la izquierda. Las líneas discontinuas horizontales indican picos truncados. El número normalizado de potenciales de acción (de 6 células nRT) provocados por las fibras CT y TC activadas con latencias variables (At) indica que las entradas de CT y TC conducen a una integración eficaz solo si coinciden en 5 ms. Los datos de sumario representan la media ± ETM.
La FIG. 6 representa la separación espectrotemporal y el control combinatorio: modulación de circuitos y patrones emergentes en estados E/I alterados con actividad sináptica en curso. (a) Paradigma experimental para la activación de SSFO de las neuronas PV y la activación de C1V1 en las neuronas piramidales. (b) Registro de pinzamiento por voltaje a 0 mV de una neurona piramidal en una preparación de corte agudo de un ratón PV::Cre que expresa CaMKIla::C1V1 (E162T) y DIO-Ss Fo . SSFO y C1V1 se activan mediante un pulso de luz azul (2) y la frecuencia de CPSI se incrementa mediante la actividad sostenida de SSFO (3; compárense los trazos superior e inferior en el recuadro para la actividad de CPSI anterior y posterior a la activación). Un pulso de luz amarilla sostenido desactiva SSFO y activa C1V1 y aumenta transitoriamente la frecuencia de CPSI (4). Los espectros de potencia de la población (derecha) muestran una actividad de frecuencia gamma durante la activación de la neurona excitadora óptica (pulso de 590 nm) que aumenta durante la coactivación de las neuronas excitadoras y PV (pulso de 470 nm). Los diagramas debajo de los trazos muestran la actividad predicha de C1V1 y SSFO durante el experimento. (c) El pico de frecuencia gamma observado no dependía de la estimulación previa de la neurona PV a través de SSFO. (d) Sumario de las frecuencias de CPSI de (b) y (c)
en la línea basal y después del pulso azul o naranja inicial. Los diagramas debajo de los trazos muestran la actividad prevista de C1V1 y SSFO durante el experimento.
Descripción detallada
En el presente documento se describen, entre otras cosas, composiciones que comprenden células animales que expresan proteínas quiméricas activadas por luz en sus membranas plasmáticas y métodos de uso de las mismas para despolarizar selectivamente neuronas excitadoras o inhibidoras que se encuentran en el mismo microcircuito en la corteza prefrontal. Los inventores han desarrollado proteínas quiméricas que poseen propiedades fisicoquímicas únicas que, por primera vez, permiten la manipulación experimental de elevaciones E/I corticales y la capacidad de controlar las oscilaciones gamma en cortes corticales. Estas proteínas quiméricas sensibles a la luz únicas pueden expresarse en circuitos neurales excitadores o inhibidores en la corteza prefrontal de animales no humanos que después pueden despolarizarse en respuesta a luz que tiene longitudes de onda particulares. Además, pueden usarse cortes de cerebro de animales no humanos que contienen neuronas corticales excitadoras o inhibidoras que expresan las proteínas quiméricas sensibles a la luz que se desvelan en el presente documento para buscar compuestos químicos que puedan inhibir selectivamente la despolarización de neuronas excitadoras o inhibidoras que se encuentren dentro del mismo circuito neural.
Técnicas generales
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, biología celular, bioquímica, química de ácidos nucleicos e i nmunología, que son bien conocidas por los expertos en la materia. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía, tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición (Sambrook y Russel, 2001), (denominado conjuntamente en el presente documento "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., editores, 1987, incluyendo los suplementos hasta 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., editores, 1994); Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (denominado conjuntamente en el presente documento "Harlow y Lane"), Beaucage et al. editores, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000), Handbook of Experimental Immunology, 4a edición (D. M. Weir y C. C. Blackwell, editores, Blackwell Science Inc., 1987); y Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, editores, 1987).
Definiciones
Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "una", “el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que se indique lo contrario.
Un "animal" puede ser un vertebrado, tal como cualquier organismo modelo de laboratorio común o un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, ratones, ratas y otros roedores.
Una "mutación" o "sustitución de aminoácidos" como se usa en el presente documento significa que al menos un componente de aminoácido de una secuencia de aminoácidos definida se altera o sustituye con otro aminoácido que conduce a la proteína codificada por esa secuencia de aminoácidos que tiene una actividad o niveles de expresión alterados dentro de una célula.
Una "proteína quimérica" es una proteína que comprende una o más porciones derivadas de una o más proteínas diferentes. Las proteínas quiméricas pueden producirse cultivando una célula recombinante transfectada con un ácido nucleico que codifica la proteína quimérica.
Se pretende que cada limitación numérica máxima proporcionada a lo largo de la presente memoria descriptiva incluya todas las limitaciones numéricas inferiores, como si dichas limitaciones numéricas inferiores estuvieran expresamente escritas en el presente documento. Cada limitación numérica mínima proporcionada a lo largo de la presente memoria descriptiva incluirá todas las limitaciones numéricas superiores, como si dichas limitaciones numéricas superiores estuvieran expresamente escritas en el presente documento. Cada intervalo numérico proporcionado a lo largo de la presente memoria descriptiva incluirá cada intervalo numérico más estrecho que caiga dentro de un intervalo numérico más amplio, como si todos esos intervalos numéricos más estrechos estuvieran expresamente escritos en el presente documento.
Proteínas quiméricas V1C1 y células que expresan las mismas
En algunos aspectos, las células animales que se desvelan en el presente documento comprenden una proteína quimérica sensible a la luz, conocida como "C1V1", que deriva del canal de cationes VChR1 de Volvox carteri y el canal de cationes ChR1 de Chlamydomonas Reinhardti. La proteína puede comprender la secuencia de
aminoácidos de VChRI, pero adicionalmente puede tener al menos las hélices transmembrana primera y segunda del polipéptido VChRI reemplazadas por las hélices transmembrana primera y segunda correspondientes de ChR1. Las proteínas opsinas quiméricas C1V1 se ensamblan a partir de trozos de otras proteínas opsinas que no se expresan bien solas en las neuronas y que son canalrodopsinas potentes, desplazadas al rojo y estables. En algunas realizaciones, la célula animal puede expresar una segunda proteína activada por luz en la membrana plasmática de la célula. La segunda proteína activada por luz puede ser capaz de mediar una hiperpolarización de la membrana plasmática celular en respuesta a la activación por luz. Pueden encontrarse ejemplos de proteínas activadas por luz capaces de mediar una hiperpolarización de la membrana plasmática celular, por ejemplo, en la Publicación PCT N.°: WO2011116238.
Las realizaciones de la presente divulgación también pueden dirigirse hacia versiones modificadas o mutadas de C1V1. Estas proteínas pueden usarse solas o en combinación con otras diversas opsinas para evaluar el control óptico sobre las neuronas. En particular, se cree que el uso de C1V1 modificada, en conjunto con otras opsinas, es útil para el control óptico sobre los trastornos del sistema nervioso. Los usos específicos de C1V1 se relacionan con los sistemas o métodos optogenéticos que correlacionan el control temporal, espacial y/o específico de tipo celular sobre un circuito neural con métricas medibles.
Proteínas quiméricas V1C1
En el presente documento se proporcionan proteínas quiméricas activadas por luz expresadas en una membrana plasmática de células animales. En algunos aspectos, la proteína activada por luz es una proteína quimérica derivada de VChRI de Volvox carteri y ChR1 de Chlamydomonas reinhardti. En algunos aspectos, la proteína quimérica comprende la secuencia de aminoácidos de VChRI que tiene al menos las hélices transmembrana primera y segunda reemplazadas por las hélices transmembrana primera y segunda correspondientes de ChR1. En otros aspectos, la proteína quimérica comprende la secuencia de aminoácidos de VChRI que tiene las hélices transmembrana primera y segunda reemplazadas por las hélices transmembrana primera y segunda correspondientes de ChR1 y comprende adicionalmente al menos una porción del dominio de bucle intracelular ubicado entre las hélices transmembrana primera y segunda reemplazadas por la porción correspondiente de ChR1. En algunos aspectos, todo el dominio de bucle intracelular entre las hélices transmembrana segunda y tercera de la proteína activada por luz quimérica puede reemplazarse con el dominio de bucle intracelular correspondiente de ChR1. En otros aspectos, la porción del dominio de bucle intercelular ubicada entre las hélices transmembrana segunda y tercera que se reemplaza con la porción correspondiente de ChR1 puede extenderse a A145 de la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, la proteína quimérica comprende la secuencia de aminoácidos de VChRI que tiene las hélices transmembrana primera y segunda y el dominio de bucle intracelular reemplazado por las hélices transmembrana primera y segunda correspondientes y el dominio de bucle intracelular de ChR1 y comprende adicionalmente al menos una porción de la tercera hélice transmembrana reemplazada por la porción correspondiente de CR1. En otro aspecto, la porción de la tercera hélice transmembrana reemplazada por la porción correspondiente de ChR1 puede extenderse a W163 de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz comprende los aminoácidos 1-145 de ChR1 y los aminoácidos 102-316 de VChRI. En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz comprende los aminoácidos 1-162 de ChR1 y los aminoácidos 119-316 de VChR1. En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 1 sin la secuencia peptídica señal. En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 1.
La proteína quimérica activada por luz es capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz. En algunos aspectos la luz puede ser luz verde. En otros aspectos, la luz puede tener una longitud de onda de entre aproximadamente 540 nm y aproximadamente 560 nm. En algunos aspectos, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 542 nm. En algunos aspectos, la proteína quimérica puede no ser capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz violeta. En algunos aspectos, la proteína quimérica puede no ser capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz que tiene una longitud de onda de 405 nm.
En algunos aspectos, la proteína puede comprender adicionalmente una proteína fluorescente C-terminal. En algunos aspectos específicos, la proteína fluorescente C-terminal puede ser una proteína fluorescente amarilla potenciada (EYFP), una proteína fluorescente verde (GFP), una proteína fluorescente cian (CFP) o una proteína fluorescente roja (RFP). En algunas realizaciones, la proteína quimérica activada por luz se modifica mediante la adición de una señal de tráfico (ts, por sus siglas en inglés) C-terminal que potencia el transporte de la proteína a la membrana plasmática celular. En algunos aspectos, la señal de tráfico deriva de la secuencia de aminoácidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En algunos aspectos, la señal de tráfico comprende la secuencia de aminoácidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV. En algunos aspectos, la secuencia peptídica señal en la proteína puede reemplazarse con una secuencia peptídica señal diferente.
En algunos aspectos, la célula animal puede ser una célula neuronal, una célula muscular o una célula madre. En un aspecto, la célula animal es una célula neuronal. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona excitadora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona excitadora puede ser una neurona piramidal. En otros aspectos, la neurona inhibidora puede ser una neurona de parvalbúmina. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona inhibidora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona inhibidora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano.
En algunos aspectos, las células animales pueden comprender adicionalmente una segunda proteína activada por luz expresada en la membrana plasmática de las células. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede ser capaz de mediar una corriente hiperpolarizante en la célula cuando la célula se ilumina con luz. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede ser NpHr, eNpHr2.0, eNpHr3.0, eNpHr3.1 o GtR3. Puede encontrarse información adicional con respecto a otros canales catiónicos, bombas de aniones y bombas de protones activados por luz en la Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. N.°: 2009/0093403; y la Solicitud de Patente Internacional N.°: PCT/US2011/028893. En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz puede tener fotocorrientes potenciadas en células neurales expuestas a la luz con respecto a células que expresan otras proteínas del canal catiónico activadas por luz. En algunos aspectos, la potenciación en la fotocorriente proporcionada por la proteína quimérica activada por luz puede ser cualquiera de 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces o 15 veces, superior a las células que expresan otras proteínas de canales catiónicos activadas por luz, inclusive.
En el presente documento también se proporciona una o más proteínas activadas por luz expresadas en una membrana plasmática celular animal, en la que dicha una o más proteínas activadas por luz comprenden una secuencia de aminoácidos de núcleo al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13 o 14 y que comprende adicionalmente una señal de tráfico (por ejemplo, que potencia el transporte a la membrana plasmática). La señal de tráfico puede fusionarse con el extremo C de la secuencia de aminoácidos de núcleo o puede fusionarse con el extremo N de la secuencia de aminoácidos de núcleo. En algunos aspectos, la señal de tráfico puede unirse a la secuencia de aminoácidos de núcleo mediante un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoácidos de longitud. El enlazador puede comprender adicionalmente una proteína fluorescente, por ejemplo, pero no limitada a, una proteína fluorescente amarilla potenciada, una proteína fluorescente roja, una proteína fluorescente verde o una proteína fluorescente cian. En algunas realizaciones, la señal de tráfico puede derivar de la secuencia de aminoácidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En algunos aspectos, la señal de tráfico puede comprender la secuencia de aminoácidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV.
Variantes mutantes quiméricas de V1C1
En algunos aspectos, en el presente documento se describen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos sustituidas o mutadas, en los que el polipéptido mutante conserva la naturaleza activable por luz característica del polipéptido quimérico C1V1 precursor, pero también puede poseer propiedades alteradas en algunos aspectos específicos. Por ejemplo, las proteínas quiméricas activadas por luz mutantes que se describen en el presente documento pueden presentar un mayor nivel de expresión tanto dentro de una célula animal como sobre la membrana plasmática de la célula animal; una sensibilidad alterada cuando se expone a diferentes longitudes de onda de luz, en particular la luz roja; y/o una combinación de rasgos por los que el polipéptido C1V1 quimérico posee las propiedades de baja desensibilización, desactivación rápida, baja activación por luz violeta para una activación cruzada mínima con otros canales catiónicos activados por luz, y/o expresión fuerte en células animales.
Las proteínas quiméricas activadas por luz que comprenden mutaciones o sustituciones de aminoácidos incluyen aquellas en las que uno o más restos aminoacídicos han experimentado una sustitución de aminoácidos conservando al tiempo la capacidad de responder a la luz y la capacidad de controlar el estado de polarización de una membrana plasmática. Por ejemplo, pueden prepararse proteínas activadas por luz que comprenden mutaciones o sustituciones de aminoácidos sustituyendo uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la invención incluye proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos alteradas en comparación con la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 1, como se define en las reivindicaciones, en las que la proteína quimérica activada por luz alterada conserva la naturaleza activada por luz característica y/o la capacidad de regular el flujo de iones a través de las membranas plasmáticas de la proteína con la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 1, pero puede tener propiedades alteradas en algunos aspectos específicos.
Las sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteína nativa pueden ser conservadoras o no conservadoras y dichos restos aminoacídicos sustituidos pueden o no estar codificados por el código genético. El "alfabeto" convencional de veinte aminoácidos se divide en familias químicas basadas en las propiedades químicas de sus cadenas laterales. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales
no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales que tienen grupos aromáticos (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la que el resto aminoacídico se reemplaza con un resto aminoacídico que tiene una cadena lateral químicamente similar (es decir, el reemplazo de un aminoácido que posee una cadena lateral básica con otro aminoácido con una cadena lateral básica). Una "sustitución de aminoácidos no conservadora" es aquella en la que el resto aminoacídico se reemplaza con un resto aminoacídico que tiene una cadena lateral químicamente diferente (es decir, el reemplazo de un aminoácido que tiene una cadena lateral básica con un aminoácido que tiene una cadena lateral aromática). Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras o no conservadoras. Adicionalmente, las sustituciones de aminoácidos pueden ubicarse en el bolsillo de unión retiniano C1V1, en uno o más de los dominios de bucle intracelular C1V1, y/o en el bolsillo de unión retiniano o en los dominios de bucle intracelular.
En consecuencia, en el presente documento se proporcionan proteínas quiméricas activadas por luz C1V1 que pueden tener sustituciones de aminoácidos específicas en posiciones clave en todo el bolsillo de unión retiniano de la porción VChR1 del polipéptido quimérico. En algunos aspectos, la proteína C1V1 puede tener una mutación en el resto aminoacídico E122 de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la proteína C1V1 puede tener una mutación en el resto aminoacídico E162 de la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, la proteína C1V1 puede tener una mutación en los restos aminoacídicos E162 y E122 de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, cada una de las proteínas quiméricas C1V1 mutantes desveladas puede tener propiedades y características específicas para su uso en la despolarización de la membrana de una célula animal en respuesta a la luz.
Polipéptidos mutantes C1V1-E122
En el presente documento se proporcionan las proteínas quiméricas C1V1 activadas por luz que se desvelan en el presente documento expresadas sobre una membrana plasmática de célula animal, en la que uno o más restos aminoacídicos han experimentado una sustitución de aminoácidos conservando al mismo tiempo la actividad de C1V1 (es decir, la capacidad de catalizar la despolarización de una célula animal en respuesta a la activación de la luz) y en las que la mutación puede ser un resto de ácido glutámico que corresponde a E122 de la SEQ ID NO: 1 (C1V1-E122). En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz mutante C1V1-E122 comprende sustituciones introducidas en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 en el aminoácido E122 que puede dar como resultado que la proteína quimérica tenga mayor sensibilidad a la luz, mayor sensibilidad a longitudes de onda particulares de luz, y/o mayor capacidad para regular el estado de polarización de la membrana plasmática de la célula con respecto a las proteínas quiméricas activadas por luz C1V1 que no tienen una mutación en E122. En algunos aspectos, la mutación puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora. En algunos aspectos, la mutación puede ser una sustitución de aminoácidos no conservadora. En algunos aspectos, la mutación en el aminoácido E122 puede ser en la treonina (C1V1-E122T). En otros aspectos, la proteína quimérica activada por luz puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 3 sin la secuencia peptídica señal. En otros aspectos, la proteína quimérica activada por luz puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, la proteína quimérica activada por luz mutante C1V1-E122 puede fusionarse con una señal de tráfico C-terminal. En algunos aspectos, la señal de tráfico puede unirse a la proteína quimérica activada por luz C1V1-E122 mediante un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoácidos de longitud. El enlazador puede comprender adicionalmente una proteína fluorescente, por ejemplo, pero no limitada a, una proteína fluorescente amarilla potenciada, una proteína fluorescente roja, una proteína fluorescente verde o una proteína fluorescente cian. En algunos aspectos, la señal de tráfico puede derivar de la secuencia de aminoácidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En algunos aspectos, la señal de tráfico puede comprender la secuencia de aminoácidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV.
En otros aspectos, la proteína quimérica C1V1-E122 es capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz. En algunos aspectos la luz puede ser luz verde. En otros aspectos, la luz puede tener una longitud de onda de entre aproximadamente 540 nm y aproximadamente 560 nm. En algunos aspectos, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 546 nm. En otros aspectos, la proteína quimérica C1V1-E122 puede mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz roja. En algunas realizaciones, la luz roja puede tener una longitud de onda de aproximadamente 630 nm. En algunos aspectos, la proteína quimérica C1V1-E122 puede no ser capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz violeta. En algunos aspectos, la proteína quimérica puede no ser capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz que tiene una longitud de onda de 405 nm. En algunos aspectos, la célula animal puede ser una célula neuronal, una célula muscular o una célula madre. En un aspecto, la célula animal puede ser una célula neuronal. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona excitadora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona excitadora puede ser una neurona piramidal. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona inhibidora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la
neurona excitadora puede ser una neurona piramidal. En otros aspectos, la neurona inhibidora puede ser una neurona de parvalbúmina. En algunos aspectos, las células animales pueden comprender adicionalmente una segunda proteína activada por luz expresada en la membrana plasmática de las células. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede ser capaz de mediar una corriente hiperpolarizante en la célula cuando la célula se ilumina con luz. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede ser NpHr, eNpHr2.0, eNpHr3.0, eNpHr3.1 o GtR3.
Polipéptidos mutantes C1V1-E162.
En el presente documento se proporcionan las proteínas quiméricas C1V1 activadas por luz que se desvelan en el presente documento expresadas en una membrana plasmática de una célula animal, en las que uno o más restos aminoacídicos han experimentado una sustitución de aminoácidos conservando al mismo tiempo la actividad de C1V1 (es decir, la capacidad de catalizar la despolarización de una célula animal en respuesta a la activación por luz), en las que la mutación puede ser en un resto de ácido glutámico correspondiente a E162 de la SEQ ID NO: 1 (C1V1-E162). En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz mutante C1V1-E162 comprende sustituciones introducidas en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 en el aminoácido E162 que puede dar como resultado que la proteína quimérica tenga mayor sensibilidad a la luz, mayor sensibilidad a longitudes de onda particulares de luz y/o capacidad aumentada para regular el estado de polarización de la membrana plasmática de la célula con respecto a las proteínas quiméricas activadas por luz C1V1 que no tienen una mutación en E162. En algunos aspectos, la mutación puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora. En algunos aspectos, la mutación puede ser una sustitución de aminoácidos no conservadora. En algunos aspectos, la mutación en el resto aminoacídico E162 puede ser treonina (C1V1-E162T). En otros aspectos, la proteína quimérica activada por luz puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 5 sin la secuencia peptídica señal. En otros aspectos, la proteína quimérica activada por luz puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos, la proteína quimérica activada por luz mutante C1V1-E162 puede fusionarse con una señal de tráfico C-terminal. En algunos aspectos, la señal de tráfico puede unirse a la proteína quimérica activada por luz mutante C1V1-E162 mediante un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoácidos de longitud. El enlazador puede comprender adicionalmente una proteína fluorescente, por ejemplo, pero no limitada a, una proteína fluorescente amarilla potenciada, una proteína fluorescente roja, una proteína fluorescente verde o una proteína fluorescente cian. En algunos aspectos, la señal de tráfico puede derivar de la secuencia de aminoácidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En algunos aspectos, la señal de tráfico puede comprender la secuencia de aminoácidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV.
En otros aspectos, la proteína quimérica C1V1-E162 es capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz. En algunos aspectos la luz puede ser luz verde. En otras realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 540 nm a aproximadamente 535 nm. En algunos aspectos, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 542 nm. En otros aspectos, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 530 nm. En algunos aspectos, la proteína quimérica C1V1-E162 puede no ser capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz violeta. En algunos aspectos, la proteína quimérica puede no ser capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz que tiene una longitud de onda de 405 nm. En algunos aspectos, la proteína quimérica C1V1-E162 puede comprender adicionalmente una proteína fluorescente C-terminal. En algunos aspectos, la célula animal puede ser una célula neuronal, una célula muscular o una célula madre. En un aspecto, la célula animal puede ser una célula neuronal. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona excitadora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona excitadora puede ser una neurona piramidal. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona inhibidora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona excitadora puede ser una neurona piramidal. En otros aspectos, la neurona inhibidora puede ser una neurona de parvalbúmina. En algunos aspectos, las células animales pueden comprender adicionalmente una segunda proteína activada por luz expresada en la membrana plasmática de las células. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede ser capaz de mediar una corriente hiperpolarizante en la célula cuando la célula se ilumina con luz. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede ser NpHr, eNpHr2.0, eNpHr3.0, eNpHr3.1 o GtR3. En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz C1V1-E162 puede tener un fotociclo acelerado con respecto a las proteínas C1V1 que carecen de mutaciones en E162 o con respecto a otras proteínas del canal catiónico activadas por luz. En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz C1V1-E162 puede tener un fotociclo más de 1 vez, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces o 5 veces más rápido que las proteínas C1V1 que carecen de mutaciones en E162 o con respecto a otras proteínas del canal catiónico activadas por luz, inclusive.
Polipéptidos mutantes dobles C1V1-E122/E162
En el presente documento se proporcionan las proteínas quiméricas C1V1 activadas por luz que se desvelan en el presente documento expresadas en una membrana plasmática de células animales, en las que uno o más restos
aminoacídicos han experimentado una sustitución de aminoácidos conservando al mismo tiempo la actividad de C1V1 (es decir, la capacidad de catalizar la despolarización de una célula animal en respuesta a la activación por luz), en las que las mutaciones pueden ser en los restos de ácido glutámico correspondientes a E122 y E162 de la SEQ ID NO: 1 (C1V1-E122/E162). En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz mutante C1V1-E122/E162 puede comprender sustituciones introducidas en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 en los aminoácidos E122 y E162 que pueden dar como resultado que la proteína quimérica tenga mayor sensibilidad a la luz, aumento de la sensibilidad a longitudes de onda particulares de luz y/o aumento de la capacidad para regular el estado de polarización de la membrana plasmática de la célula con respecto a las proteínas quiméricas activadas por luz C1V1 que no tienen una mutación en E122 y E162. En algunos aspectos, las mutaciones pueden ser sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunos aspectos, las mutaciones pueden ser sustituciones de aminoácidos no conservadoras. En algunos aspectos, las mutaciones pueden ser sustituciones de aminoácidos tanto conservadoras como no conservadoras. En algunos aspectos, la mutación tanto en el resto aminoacídico E122 como en E162 puede ser en la treonina (C1V1-E122T/E162T). En otros aspectos, la proteína quimérica activada por luz puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 7 sin la secuencia peptídica señal. En otros aspectos, la proteína quimérica activada por luz puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos, la proteína quimérica activada por luz mutante C1V1-E122/E162 puede fusionarse con una señal de tráfico C-terminal. En algunos aspectos, la señal de tráfico puede unirse con la proteína quimérica activada por luz mutante C1V1-E122/E162 mediante un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoácidos de longitud. El enlazador puede comprender adicionalmente una proteína fluorescente, por ejemplo, pero no limitada a, una proteína fluorescente amarilla potenciada, una proteína fluorescente roja, una proteína fluorescente verde o una proteína fluorescente cian. En algunos aspectos, la señal de tráfico puede derivar de la secuencia de aminoácidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En algunos aspectos, la señal de tráfico puede comprender la secuencia de aminoácidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV.
En otros aspectos, la proteína quimérica C1V1-E122/E162 es capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz. En algunos aspectos, la luz puede ser luz verde. En otros aspectos, la luz puede tener una longitud de onda de entre aproximadamente 540 nm y aproximadamente 560 nm. En algunos aspectos, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 546 nm. En algunos aspectos, la proteína quimérica C1V1-E122/E162 puede no ser capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz violeta. En algunos aspectos, la proteína quimérica puede no ser capaz de mediar una corriente de despolarización en la célula cuando la célula se ilumina con luz que tiene una longitud de onda de 405 nm. En algunos aspectos, la proteína quimérica C1V1E122/E162 puede presentar menos activación cuando se expone a luz violeta con respecto a las proteínas C1V1 que carecen de mutaciones en E122/E162 o con respecto a otras proteínas del canal catiónico activadas por luz. En algunos aspectos, la célula animal puede ser una célula neuronal, una célula muscular o una célula madre. En un aspecto, la célula animal puede ser una célula neuronal. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona excitadora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona excitadora puede ser una neurona piramidal. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona inhibidora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona inhibidora puede ser una neurona de parvalbúmina. En algunos aspectos, las células animales pueden comprender adicionalmente una segunda proteína activada por luz expresada en la membrana plasmática de las células. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede ser capaz de mediar una corriente hiperpolarizante en la célula cuando la célula se ilumina con luz. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede ser NpHr, eNpHr2.0, eNpHr3.0, eNpHr3.1 o GtR3. En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz mutante C1V1-E122/E162 puede tener una inactivación disminuida con respecto a las proteínas C1V1 que carecen de mutaciones en E122/E162 o con respecto a otras proteínas del canal catiónico activadas por luz. En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz mutante C1V1-E122/E162 puede inactivarse por cualquiera de aproximadamente el 15 %, el 16 %, el 17 %, el 18 %, el 19 %, el 20 %, el 21 %, el 22 %, el 23 %, el 24 %, el 25 %, el 26v, el 27 %, el 28 %, el 29 % o el 30 % en comparación con las proteínas C1V1 que carecen de mutaciones en E122/E162 o con respecto a otras proteínas de canales catiónicos activadas por luz, inclusive. En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz C1V1-E122/E162 puede tener un fotociclo más de 1 vez, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 5,5 veces, 6 veces, 6,5 veces, 7 veces, 7,5 veces, 8 veces, 8,5 veces, 9 veces, 9,5 veces o 10 veces más rápido que las proteínas C1V1 que carecen de mutaciones en E122/E162 o con respecto a otras proteínas de canales catiónicos activadas por luz, inclusive.
Motivos de aminoácidos de transporte intracelular potenciado
La presente divulgación proporciona la modificación de proteínas quiméricas activadas por luz expresadas en una célula mediante la adición de uno o más motivos de secuencia de aminoácidos que potencian el transporte a las membranas plasmáticas de células de mamíferos. Las proteínas quiméricas activadas por luz que tienen componentes derivados de organismos evolutivamente más simples pueden no ser expresadas o toleradas por las células de mamíferos o pueden presentar una ubicación subcelular alterada cuando se expresan a niveles altos en
células de mamíferos. En consecuencia, en algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz expresada en una célula se fusiona con uno o más motivos de secuencia de aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en un péptido señal, una señal de exportación del retículo endoplásmico (RE), una señal de tráfico de membrana y una señal de exportación de Golgi N-terminal. Los uno o más motivos de secuencia de aminoácidos que potencian el transporte de proteínas quiméricas activadas por luz a las membranas plasmáticas de las células de mamíferos pueden fusionarse con el extremo N, el extremo C o ambos extremos N y C de la proteína activada por luz. Opcionalmente, la proteína activada por luz y los uno o más motivos de secuencia de aminoácidos pueden separarse mediante un enlazador. En algunos aspectos, la proteína quimérica activada por luz se modifica mediante la adición de una señal de tráfico (ts) que potencia el transporte de la proteína a la membrana plasmática celular. En algunos aspectos, la señal de tráfico deriva de la secuencia de aminoácidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En algunos aspectos, la señal de tráfico comprende la secuencia de aminoácidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV. Se describen motivos de proteínas adicionales que pueden potenciar el transporte de proteínas activadas por luz a la membrana plasmática de una célula en la Solicitud de Patente de los EE.UU. N.° 12/041.628. En algunos aspectos, la secuencia peptídica señal en la proteína quimérica se suprime o se sustituye con una secuencia peptídica señal de una proteína diferente.
Células animales, animales no humanos y cortes de cerebro
En el presente documento se proporcionan células que comprenden las proteínas quiméricas activadas por luz que se desvelan en el presente documento. En algunos aspectos, las células son células animales. En algunos aspectos, las células animales comprenden la proteína C1V1 correspondiente a la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, las células animales comprenden la proteína C1V1-E122T mutante correspondiente a la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos, las células animales comprenden la proteína C1V1-E162T mutante correspondiente a la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos, las células animales comprenden la proteína mutante C1V1-E122T/E162T correspondiente a la SEQ ID NO7. En algunos aspectos, la célula animal puede ser una célula neuronal, una célula muscular o una célula madre. En un aspecto, la célula animal puede ser una célula neuronal. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona excitadora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona excitadora puede ser una neurona piramidal. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona inhibidora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona inhibidora puede ser una neurona de parvalbúmina.
En el presente documento, también se proporcionan animales no humanos que comprenden las proteínas quiméricas activadas por luz que se desvelan en el presente documento expresadas en la membrana celular de las células en los animales. En algunos aspectos, las células animales comprenden la proteína C1V1 correspondiente a la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, las células animales comprenden la proteína C1V1-E122T mutante correspondiente a la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos, las células animales comprenden la proteína C1V1-E162T mutante correspondiente a la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos, las células animales comprenden la proteína mutante C1V1-E122T/E162T correspondiente a la SEQ ID NO7. En algunos aspectos, los animales que comprenden las proteínas quiméricas activadas por luz que se describen en el presente documento expresan transgénicamente dichas proteínas quiméricas activadas por luz. En otros aspectos, los animales que comprenden las proteínas quiméricas activadas por luz que se describen en el presente documento se han transfectado de forma vírica con un vector que lleva la proteína activada por luz, tal como, pero no limitado a, un vector adenovírico.
En el presente documento se proporcionan cortes de cerebro vivo de un animal no humano que comprende las proteínas quiméricas activadas por luz que se describen en el presente documento expresadas en la membrana celular de las células en los cortes. En algunos aspectos, los cortes de cerebro son de animales no humanos que expresan transgénicamente las proteínas quiméricas activadas por luz que se describen en el presente documento. En otros aspectos, los cortes de cerebro son de animales no humanos que se han transfectado de forma vírica con un vector que lleva dicha proteína activada por luz, tal como, pero no limitado a, un vector adenovírico. En algunos aspectos, los cortes de cerebro son corte s de cerebro coronal. En algunos aspectos, los cortes del cerebro tienen cualquier espesor de entre aproximadamente 100 μm, aproximadamente 150 μm, aproximadamente 200 μm, aproximadamente 250 μm , aproximadamente 300 μm , aproximadamente 350 μm , aproximadamente 400 μm, aproximadamente 450 μm o aproximadamente 500 μm , inclusive, incluyendo cualquier espesor entre estos números.
Polinucleótidos aislados
En el presente documento se proporcionan polinucleótidos C1V1 aislados que codifican cualesquier polipéptidos quiméricos que se describen en el presente documento que, por ejemplo, tienen al menos una actividad de un polipéptido C1V1. La divulgación proporciona polinucleótidos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente el 70 %, por ejemplo, al menos aproximadamente el 71 %, el 72 %, el 73 %, el 74 %, el 75 %, el 76 %, el 77 %, el 78 %, el 79 %, el 80 %, el 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %; 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia o una identidad de secuencia completa (100 %) con el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 en una región de al menos aproximadamente 10, por ejemplo, al menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 nucleótidos.
La divulgación proporciona específicamente un ácido nucleico que codifica C1V1 y/o una variante mutante del mismo. Por ejemplo, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada, en la que la molécula de ácido nucleico codifica: (1) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; (2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; o (4) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 7.
Promotores y vectores
La divulgación también proporciona casetes y/o vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos descritos anteriormente. Convenientemente, el ácido nucleico que codifica una proteína quimérica de la divulgación está unido operativamente a un promotor. Los promotores son bien conocidos en la técnica. Cualquier promotor que funcione en la célula hospedadora puede usarse para la expresión de C1V1 y/o cualquier variante de la misma de la presente divulgación. Las regiones de control de iniciación o los promotores, que son útiles para impulsar la expresión de una proteína quimérica C1V1 o una variante de la misma en una célula animal específica son numerosas y familiares para los expertos en la materia. Puede usarse prácticamente cualquier promotor capaz de impulsar estos ácidos nucleicos.
Específicamente, cuando se desea la expresión recombinante de proteínas quiméricas C1V1 en una célula neural excitadora, puede usarse un promotor de la proteína quinasa II alfa (CaMKIIa) dependiente de la calmodulina humana. En otros aspectos, puede usarse un promotor del factor de elongación 1a (EF-1a) junto con un vector de AAV recombinante inducible por Cre con ratones transgénicos parvalbuminCre para dirigir las proteínas quiméricas C1V1 a las neuronas inhibidoras.
En el presente documento también se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos que se desvelan en el presente documento que codifican un polipéptido quimérico C1V1 o cualquier variante del mismo. Los vectores que pueden administrarse de acuerdo con la presente divulgación también incluyen vectores que comprenden un polinucleótido que codifica un ARN (por ejemplo, ARNi, ribozimas, miARN, ARNip) que cuando se transcriben a partir de los polinucleótidos del vector darán como resultado la acumulación de proteínas quiméricas activadas por luz en las membranas plasmáticas de las células animales diana. Los vectores que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, vectores lentivíricos, VHS y adenovíricos. Los lentivirus incluyen, pero no se limitan a, VIH-1, VIH-2, VIS, VIF y VAIE. Los lentivirus pueden ser pseudotipados con las proteínas de la envoltura de otros virus, incluyendo, pero no limitados a, VEV, rabia, VLM-Mo, baculovirus y ébola. Dichos vectores pueden prepararse usando métodos convencionales en la técnica.
En algunos aspectos, el vector es un vector de AAV (virus adeno-asociado, por sus siglas en inglés) recombinante. Los vectores de AAV son virus de ADN de tamaño relativamente pequeño que pueden integrarse, de manera estable y específica de sitio, en el genoma de las células que infectan. Son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento celular, la morfología o la diferenciación y no parecen estar implicados en patologías humanas. El genoma de AAV se ha clonado, secuenciado y caracterizado. Abarca aproximadamente 4700 bases y contiene una región de repeticiones terminales invertidas (ITR, por sus siglas en inglés) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, que sirve como origen de replicación para el virus. El resto del genoma se divide en dos regiones esenciales que llevan las funciones de encapsidación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicación vírica y la expresión de los genes víricos; y la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las proteínas de la cápside del virus.
La aplicación de AAV como vector para la terapia génica se ha desarrollado rápidamente en los últimos años. El AAV de tipo silvestre podría infectar, con un título comparativamente alto, células en división o no en división o tejidos de mamíferos, incluyendo seres humanos, y también puede integrarse en células humanas en un sitio específico (en el brazo largo del cromosoma 19) (Kotin, R. M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2211-2215, 1990) (Samulski, R. J. et al, EMBO J. 10: 3941-3950, 1991). El vector AAV sin los genes rep y cap pierde la especificidad de la integración específica de sitio, pero aún puede mediar en la expresión estable a largo plazo de genes exógenos. El vector de AAV existe en células en dos formas, en las que una es episómica fuera del cromosoma; otra está integrada en el cromosoma, con la primera como la forma principal. Además, hasta la fecha no se ha encontrado que el AAV esté asociado a ninguna enfermedad humana, ni se ha observado ningún cambio en las características biológicas que derive de la integración. Existen dieciséis serotipos de AAV publicados en la bibliografía, denominados respectivamente AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 y AAV16, en los que AAV5 se aisló originalmente en seres humanos (Bantel-Schaal y H. zur Hausen. 1984. Virology 134: 52-63), mientras que AAV1-4 y AAV6 se encuentran en el estudio del adenovirus (Ursula Bantel-Schaal, Hajo Delius y Harald zur Hausen). J. Virol. 1999, 73: 939-947).
Los vectores de AAV pueden prepararse usando métodos convencionales en la técnica. Son adecuados los virus adenoasociados de cualquier serotipo (véase, por ejemplo, Blacklow, págs. 165-174 de "Parvoviruses and Human Disease" J. R. Pattison, ed. (1988); Rose, Comprehensive Virology 3:1, 1974; P. Tattersall "The Evolution of Parvovirus Taxonomy en Parvoviruses (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish, Eds.) p5-14, Hudder Arnold, Londres, Reino Unido (2006) y DE Bowles, JE Rabinowitz, RJ Samulski "The Genus Dependovirus" (JR Kerr, SF Cotmore, ME Bloom, RM Linden, CR Parrish, editores) p15-23, Hudder Arnold, Londres, Reino Unido (2006). Se pueden encontrar métodos para la purificación de vectores en, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. N.° 6566118, 6989264 y 6995006 y Wo /1999/011764, tituladas "Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors". La preparación de vectores híbridos se describe, por ejemplo, en la Solicitud PCT N.° PCT/US2005/027091. El uso de vectores derivados de los AAV para transferir genes in vitro e in vivo ha sido descrito (véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional N.°: 91/18088 y WO 93/09239; las Patentes de los Ee .UU. N.° 4.797.368, 6.596.535 y 5.139.941; y la Patente Europea N°.: 0488528). Estas publicaciones describen diversas construcciones derivadas de AAV en las que los genes rep y/o cap se suprimen y se reemplazan por un gen de interés, y el uso de estas construcciones para transferir el gen de interés in vitro (a células cultivadas) o in vivo (directamente a un organismo). Los AAV recombinantes defectuosos en la replicación de acuerdo con la divulgación pueden prepararse por la cotransfección de un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico de interés flanqueada por dos regiones de repetición terminal invertida (ITR) de AAV y un plásmido que lleva los genes de encapsidación de AAV (genes rep y cap), en una estirpe celular que está infectada con un virus auxiliar humano (por ejemplo, un adenovirus). Los recombinantes de AAV que se producen se purifican después mediante técnicas convencionales.
En algunos aspectos, el o los vectores para su uso en los métodos de la divulgación se encapsidan en una partícula vírica (por ejemplo, una partícula vírica de AAV que incluye, pero no se limita a, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 y AAV16). En consecuencia, la divulgación incluye una partícula de virus recombinante (recombinante porque contiene un polinucleótido recombinante) que comprende cualquiera de los vectores que se describen en el presente documento. Se conocen en la técnica métodos para producir dichas partículas y se describen en la Patente de los EE.UU. N.° 6.596.535.
Para las células animales que se describen en el presente documento, se entiende que pueden administrarse uno o más vectores a células neurales, células cardíacas o células madre. Si se usa más de un vector, se entiende que pueden administrarse al mismo tiempo o en diferentes momentos a la célula animal.
Métodos de la divulgación
En el presente documento se proporcionan métodos para despolarizar selectivamente neuronas excitadoras o inhibidoras que se encuentran en el mismo microcircuito mediante la expresión en esas neuronas de las proteínas quiméricas activadas por luz que se describen en el presente documento. En algunos aspectos, una primera proteína activada por luz, como las que se desvelan en el presente documento, puede expresarse en una neurona excitadora, mientras que una segunda proteína activada por luz puede expresarse en una neurona inhibidora. En algunos aspectos, la primera proteína activada por luz expresada en la neurona excitadora puede activarse mediante una longitud de onda de luz diferente a la de la segunda proteína activada por luz expresada en la neurona inhibidora. En algunos aspectos, la primera y la segunda proteínas activadas por luz pueden expresarse en un animal vivo no humano o en una porción de cerebro vivo de un animal no humano.
En otros aspectos, se proporciona un método para identificar un compuesto químico que inhiba selectivamente la despolarización de neuronas excitadoras o inhibidoras que se encuentran en el mismo circuito neural mediante la expresión en esas neuronas de las proteínas quiméricas activadas por luz que se describen en el presente documento. En algunos aspectos, una primera proteína activada por luz puede expresarse en una neurona excitadora, mientras que una segunda proteína activada por luz puede expresarse en una neurona inhibidora. En algunos aspectos, la primera proteína activada por luz expresada en la neurona excitadora puede activarse mediante una longitud de onda de luz diferente a la de la segunda proteína activada por luz expresada en la neurona inhibidora. En algunos aspectos, las proteínas activadas por luz primera y segunda pueden expresarse en un animal vivo no humano o en una porción de cerebro vivo de un animal no humano.
Métodos para alterar selectivamente el equilibrio E/I en neuronas que se encuentran en el mismo microcircuito
En algunos aspectos, se proporciona un método de despolarización selectiva de neuronas excitadoras o inhibidoras que se encuentran en el mismo microcircuito, comprendiendo el método: despolarizar selectivamente una neurona excitadora que comprende una primera proteína activada por luz, en la que la primera proteína activada por luz se despolariza cuando se expone a luz que tiene una primera longitud de onda o despolarizar selectivamente una neurona inhibidora que comprende una segunda proteína activada por luz, en la que la segunda proteína activada por luz se despolariza cuando se expone a luz que tiene una segunda longitud de onda. En algunos aspectos, la primera proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, la primera proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o
un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la primera proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 11. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 12. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 13. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 14. Puede encontrarse más información acerca de la divulgación de otros canales catiónicos activados por luz en la Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. N.° 2007/0054319; la Solicitud de Patente de los EE.UU. N.°: 61/410.704; y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.°: WO 2010/056970.
En otros aspectos, se proporciona un método de despolarización selectiva de las neuronas excitadoras o inhibidoras que se encuentran en el mismo microcircuito, comprendiendo el método: expresar una primera proteína activada por luz en una neurona excitadora; y expresar una segunda proteína activada por luz en una neurona inhibidora, en donde la primera proteína activada por luz se despolariza independientemente cuando se expone a luz que tiene una primera longitud de onda y en donde la segunda proteína activada por luz se despolariza independientemente cuando se expone a luz que tiene una segunda longitud de onda . En algunas realizaciones, la primera proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, la primera proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la primera proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 11. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 12. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 13. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 14.
En algunos aspectos, la primera proteína activada por luz puede activarse con luz verde. En un aspecto, la primera proteína activada por luz puede activarse mediante luz que tenga una longitud de onda de aproximadamente 560 nm. En un aspecto, la primera proteína activada por luz puede activarse mediante luz roja. En otro aspecto, la primera proteína activada por luz puede activarse mediante luz que tenga una longitud de onda de aproximadamente 630 nm. En otros aspectos, la segunda proteína activada por luz puede activarse mediante luz violeta. En un aspecto, la segunda proteína activada por luz puede activarse mediante luz que tenga una longitud de onda de aproximadamente 405 nm. En otros aspectos, la segunda proteína activada por luz puede activarse mediante luz verde. En algunos aspectos, las proteínas activadas por luz se activan mediante pulsos de luz que pueden tener una duración de aproximadamente 1 milisegundo (ms), aproximadamente 2 ms, aproximadamente 3, ms, aproximadamente 4 ms, aproximadamente 5 ms, aproximadamente 6 ms, aproximadamente 7 ms, aproximadamente 8 ms, aproximadamente 9 ms, aproximadamente 10 ms, aproximadamente 15 ms, aproximadamente 20 ms, aproximadamente 25 ms, aproximadamente 30 ms, aproximadamente 35 ms, aproximadamente 40 ms, aproximadamente 45 ms, aproximadamente 50 ms, aproximadamente 60 ms, aproximadamente 70 ms, aproximadamente 80 ms, aproximadamente 90 ms, aproximadamente 100 ms, aproximadamente 200 ms, aproximadamente 300 ms, aproximadamente 400 ms, aproximadamente 500 ms, aproximadamente 600 ms, aproximadamente 700 ms, aproximadamente 800 ms, aproximadamente 900 ms, aproximadamente 1 segundo, aproximadamente 1,25 segundos, aproximadamente 1,5 segundos o aproximadamente 2 segundos, inclusive, incluyendo los tiempos entre estos números. En algunos aspectos, las proteínas activadas por luz pueden activarse mediante pulsos de luz que pueden tener una densidad de potencia lumínica de cualquiera de entre aproximadamente 0,05 mW mm-2, aproximadamente 0,1 mW mm-2, aproximadamente 0,25 mW mm-2, aproximadamente 0,5 mW mm- 2, aproximadamente 0,75 mW mm-2, aproximadamente 1 mW mm-2, aproximadamente 2 mW mm-2, aproximadamente 3 mW mm-2, aproximadamente 4 mW mm-2, aproximadamente 5 mW mm-2, aproximadamente 6 mW mm-2, aproximadamente 7 mW mm-2, aproximadamente 8 mW mm-2, aproximadamente 9 mW mm-2, aproximadamente 10 mW mm-2, aproximadamente
11 mW mm-2, aproximadamente 12 mW mm-2, aproximadamente 13 mW mm-2, aproximadamente 14 mW mm-2, aproximadamente 15 mW mm-2, aproximadamente 16 mW mm-2, aproximadamente 17 mW mm-2, aproximadamente 18 mW mm-2, aproximadamente 19 mW mm-2, aproximadamente 20 mW mm-2, aproximadamente 21 mW mm-2, aproximadamente 22 mW mm-2, aproximadamente 23 mW mm-2, aproximadamente 24 mW mm-2 o aproximadamente 25 mW mm-2, inclusive, incluyendo cualquier valor entre estos números. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona excitadora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona excitadora puede ser una neurona piramidal. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona inhibidora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona inhibidora puede ser una neurona de parvalbúmina. En algunos aspectos, las neuronas inhibidoras y excitadoras pueden estar en un animal vivo no humano. En otros aspectos, las neuronas inhibidoras y excitadoras pueden estar en una porción de cerebro de un animal no humano.
Métodos para identificar un compuesto químico que altere selectivamente el equilibrio E/I en neuronas que se encuentran en el mismo microcircuito
En algunos aspectos, se proporciona un método para identificar un compuesto químico que inhiba selectivamente la despolarización de las neuronas excitadoras o inhibidoras que se encuentran en el mismo microcircuito, comprendiendo el método: (a) despolarizar selectivamente una neurona excitadora que comprende una primera proteína activada por luz con luz que tiene una primera longitud de onda o despolarizar selectivamente una neurona inhibidora que comprende una segunda proteína activada por luz con luz que tiene una segunda longitud de onda; (b) medir un potencial postsináptico excitador (PPSE) en respuesta a la despolarización selectiva de la neurona que comprende una primera proteína activada por luz o medir una corriente postsináptica inhibidora (CPSI) en respuesta a la despolarización selectiva de una neurona inhibidora que comprende una segunda proteína activada por luz; (c) poner en contacto la neurona excitadora o la neurona inhibidora con un compuesto químico; (d) medir el potencial postsináptico excitador (PPSE) o medir la corriente postsináptica inhibidora (CPSI) para determinar si el contacto entre la neurona excitadora o la neurona inhibidora con el compuesto químico inhibe selectivamente la despolarización de cualquiera de las neuronas. En algunas realizaciones, la primera proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos, la primera proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la primera proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 11. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 12. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 13. En algunos aspectos, la segunda proteína activada por luz puede comprender una proteína al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 14. En algunos aspectos, el compuesto químico puede ser un miembro de una biblioteca química combinatoria. En otros aspectos, el método comprende adicionalmente someter a ensayo el compuesto químico para determinar si afecta adversamente a la función del tejido cardíaco o al potencial de acción cardíaco en los mamíferos.
En algunos aspectos, la primera proteína activada por luz puede activarse con luz verde. En un aspecto, la primera proteína activada por luz puede activarse mediante luz que tenga una longitud de onda de aproximadamente 560 nm. En un aspecto, la primera proteína activada por luz puede activarse mediante luz roja. En otro aspecto, la primera proteína activada por luz puede activarse mediante luz que tenga una longitud de onda de aproximadamente 630 nm. En otros aspectos, la segunda proteína activada por luz puede activarse mediante luz violeta. En un aspecto, la segunda proteína activada por luz puede activarse mediante luz que tenga una longitud de onda de aproximadamente 405 nm. En algunos aspectos, las proteínas activadas por luz pueden activarse mediante pulsos de luz que pueden tener una duración de aproximadamente 1 milisegundo (ms), aproximadamente 2 ms, aproximadamente 3, ms, aproximadamente 4, ms, aproximadamente 5 ms, aproximadamente 6 ms, aproximadamente 7 ms, aproximadamente 8 ms, aproximadamente 9 ms, aproximadamente 10 ms, aproximadamente 15 ms, aproximadamente 20 ms, aproximadamente 25 ms, aproximadamente 30 ms, aproximadamente 35 ms, aproximadamente 40 ms, aproximadamente 45 ms, aproximadamente 50 ms, aproximadamente 60 ms, aproximadamente 70 ms, aproximadamente 80 ms, aproximadamente 90 ms, aproximadamente 100 ms, aproximadamente 200 ms, aproximadamente 300 ms, aproximadamente 400 ms, aproximadamente 500 ms, aproximadamente 600 ms, aproximadamente 700 ms, aproximadamente 800 ms, aproximadamente 900 ms, aproximadamente 1 segundo, aproximadamente 1,25 segundos, aproximadamente 1,5 segundos o aproximadamente 2 segundos, inclusive, incluyendo los tiempos entre estos números. En algunos aspectos, las proteínas activadas por luz pueden activarse mediante pulsos de luz que pueden tener una densidad
de potencia lumínica de aproximadamente 0,05 mW mm-2, aproximadamente 0,1 mW mm-2, aproximadamente 0,25 mW mm-2, aproximadamente 0,5 mW mm-2, aproximadamente 0,75 mW mm-2, aproximadamente 1 mW mm-2, aproximadamente 2 mW mm-2, aproximadamente 3 mW mm-2, aproximadamente 4 mW mm-2, aproximadamente 5 mW mm-2, aproximadamente 6 mW mm-2, aproximadamente 7 mW mm-2, aproximadamente 8 mW mm-2, aproximadamente 9 mW mm-2, aproximadamente 10 mW mm-2, aproximadamente 11 mW mm-2, aproximadamente 12 mW mm-2, aproximadamente 13 mW mm-2, aproximadamente 14 mW mm-2, aproximadamente 15 mW mm-2, aproximadamente 16 mW mm-2, aproximadamente 17 mW mm-2, aproximadamente 18 mW mm-2, aproximadamente 19 mW mm-2, aproximadamente 20 mW mm-2, aproximadamente 21 mW mm-2, aproximadamente 22 mW mm-2, aproximadamente 23 mW mm-2, aproximadamente 24 mW mm-2 o aproximadamente 25 mW mm-2, inclusive, incluyendo cualquier valor entre estos números. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona excitadora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona excitadora puede ser una neurona piramidal. En algunos aspectos, la célula neuronal puede ser una neurona inhibidora ubicada en la corteza prefrontal de un animal no humano. En otros aspectos, la neurona inhibidora puede ser una neurona de parvalbúmina. En algunos aspectos, las neuronas inhibidoras y excitadoras pueden estar en un animal vivo no humano. En otros aspectos, las neuronas inhibidoras y excitadoras pueden estar en una porción de cerebro de un animal no humano.
REALIZACIONES DE EJEMPLO
La presente divulgación se refiere a una opsina quimérica activada por luz que modifica el voltaje de una membrana cuando se expresa en ella. Aunque la presente divulgación no está necesariamente limitada en estos contextos, pueden apreciarse diversos aspectos de la divulgación a través de un análisis de ejemplos que usan estos y otros contextos.
Diversas realizaciones de la presente divulgación se refieren a una opsina activada por luz modificada para la expresión en membranas celulares incluyendo células de mamíferos. La opsina deriva de una combinación de dos opsinas diferentes, canalrodopsina de Volvox (VChR1) y canalrodopsina de Chlamydomonas reinhardtii (ChR1). La opsina puede ser útil para expresarse a niveles de una velocidad más alta que cualquiera de las opsinas individuales de las que deriva.
En determinados aspectos más específicos, la secuencia genética de la quimera ChR1/VChR1 (C1V1) es principalmente VChR1. Algunas partes de la secuencia VChR1 asociada al tráfico se reemplazan con secuencias homólogas de ChR1.
Diversos aspectos se relacionan con la modificación dirigida a la adición de una señal de tráfico para mejorar la expresión en células de mamíferos.
Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a versiones modificadas adicionales de C1V1. Por ejemplo, determinados aspectos incluyen una mutación de E162T a C1V1, experimentos que sugieren que proporciona un fotociclo acelerado (por ejemplo, casi 3 veces).
Diversos aspectos de la presente divulgación se refieren a un sistema o método optogenético que correlaciona el control temporal, espacial y/o específico de tipo celular sobre un circuito neural con métricas medibles. El sistema optogenético usa basándose opsinas, incluyendo las variantes C1V1 y/o C1V1, para evaluar el control sobre porciones de circuitos neuronales. Por ejemplo, diversas métricas o síntomas pueden asociarse a un trastorno neurológico. El sistema optogenético se refiere a un circuito neural en un paciente para el control selectivo del mismo. El sistema optogenético implica controlar al paciente para determinar las métricas o los síntomas asociados al trastorno neurológico. De esta manera, el sistema optogenético puede proporcionar información detallada acerca del circuito neural, su función y/o el trastorno neurológico.
De acuerdo con los aspectos que se analizan en el presente documento, aspectos particulares se refieren al estudio y la investigación de trastornos que usan basándose opsinas. Otros aspectos se refieren a la identificación y/o el estudio de fenotipos y endofenotipos. Otros aspectos se refieren a la identificación de dianas de tratamiento.
Aspectos de la presente divulgación se refieren a la inducción artificial a trastornos/patologías en una escala temporal de tiempo rápido. El uso de una opsina tal como C1V1 puede ser particularmente útil basándose en las características en lo que concierne a un fotociclo acelerado. Además, determinados aspectos permiten patologías reversibles, que pueden ser particularmente útiles para establecer puntos basales/de control para someter a ensayo y/o para someter a ensayo los efectos de un tratamiento en el mismo animal cuando presenta la patología y cuando no presenta la patología. El uso de opsinas tales como C1V1 permite el control de una célula usando una fuente de luz. La C1V1 reacciona a la luz, provocando un cambio en el potencial de membrana de la célula. La retirada de la luz y el posterior cese de la activación de C1V1 permite que la célula vuelva a su estado basal. Existen otras posibilidades diversas, algunas de las cuales se analizan con más detalle en el presente documento.
Diversos aspectos de la presente divulgación se refieren a una mutación E122T de una opsina C1V1. En determinados aspectos de la presente divulgación, la mutación E122T desplaza la absorción máxima de C1V1 o sus
variantes hacia el espectro de luz roja con respecto a la opsina no mutada.
Diversos aspectos de la presente divulgación se refieren a una opsina modificada para la expresión en células de mamíferos y desplazada, con respecto a ChR2, para la absorción máxima en el espectro de luz verde. La opsina C1V1 deriva de una combinación de opsinas y se expresa a una velocidad más alta que cualquiera de las opsinas de las que deriva. La opsina, C1V1, deriva de canalrodopsina de Volvox (VChR1) y canalrodopsina de Chlamydomonas reinhardtii (ChR1). La opsina resultante, C1V1 y sus variantes, tienen una absorción máxima en longitudes de onda entre 530 nm y 546 nm.
Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a versiones modificadas adicionalmente de C1V1. Por ejemplo, determinados aspectos incluyen una mutación E122T, que desplaza la absorción máxima de C1V1 hacia el espectro de luz roja. Otras modificaciones pueden incluir una mutación adicional E162T, experimentos que sugieren que proporciona un fotociclo acelerado además del desplazamiento al rojo proporcionado por la mutación E122T.
En algunos aspectos, se proporciona una molécula transmembrana derivada de VChR1 y que tiene las secuencias de tráfico reemplazadas con secuencias homólogas de ChR1. En algunos aspectos, la molécula incluye adicionalmente una mutación E122T. En otros aspectos, la molécula incluye adicionalmente mutaciones en E162T y E122T. En determinados aspectos, la molécula activa un canal iónico en respuesta a la luz verde. En un aspecto, la molécula tiene una absorción de luz máxima de aproximadamente 546 nm. En otro aspecto, la molécula tiene una absorción de luz máxima de aproximadamente 535 nm.
En algunos aspectos, se proporciona una célula animal que comprende: una molécula exógena integrada que expresa un canal iónico que responde a la luz roja; la molécula exógena derivada de VChR1 y que incluye secuencias de tráfico transmembrana de la misma reemplazadas por secuencias homólogas de ChR1. En algunos aspectos, la molécula exógena incluye adicionalmente E122T. En otros aspectos, la célula tiene una relación de activación neural de aproximadamente el 14 % al 94 % en respuesta a la luz que tiene longitudes de onda de 405 nm y 560 nm, respectivamente. En otros aspectos, la célula tiene una relación de activación neural de aproximadamente el 11 % al 72 % en respuesta a la luz que tiene longitudes de onda de 405 nm y 560 nm, respectivamente.
Aspectos de ejemplo adicionales de la presente divulgación se relacionan con el uso de una quimera híbrida ChR1/VChR1 que no contiene ninguna secuencia ChR2, deriva de dos genes de opsinas que no se expresan bien individualmente y, en el presente documento, se denomina C1V1. Los aspectos de la presente divulgación también se refieren a mejoras del direccionamiento a la membrana de VChR1 a través de la adición de una señal de tráfico de membrana derivada del canal K2.1. Imágenes confocales de neuronas cultivadas que expresan VChR1-EYFP revelaron una gran proporción de proteína intracelular en comparación con ChR2; por tanto, se usó una señal de tráfico de membrana (ts) derivada del canal K2.1 para mejorar el direccionamiento a la membrana de VChR1. El direccionamiento a la membrana de este VChR1-ts-EYFP se potenció ligeramente en comparación con VChR1-EYFP; sin embargo, las fotocorrientes medias registradas a partir de neuronas del hipocampo cultivadas que expresan VChR1-ts-EYFP fueron solo ligeramente más grandes que las de VChR1-EYFP. En consecuencia, aspectos de la presente divulgación se refieren a VChR1, que se ha modificado mediante el intercambio de hélices con las hélices correspondientes de otros ChR. Por ejemplo, se ha descubierto una mejora robusta en dos quimeras donde las hélices 1 y 2 se reemplazaron con los segmentos homólogos de ChR1. Se descubrió que si los sitios de corte y empalme se encontraban en el bucle intracelular entre las hélices 2 y 3 (en el resto Ala145 de ChR1) o en la hélice 3 (en el resto Trp163 de ChR1), las quimeras resultantes se expresaban de manera robusta y mostraban propiedades de fotocorriente y espectrales potenciadas de forma similar. Este resultado fue inesperado ya que ChR1 solo se expresa débilmente y se integra escasamente en las membranas de la mayoría de las células hospedadoras de mamíferos.
Aspectos específicos de la presente divulgación se relacionan con genes de opsina microbiana adaptados para la neurociencia, permitiendo la transducción de series de pulsos de luz en cambios potenciales de la membrana en escalas temporales de milisegundos en tipos celulares específicos dentro del cerebro de mamíferos intactos (por ejemplo, canalrodopsina (ChR2), canalrodopsina de Volvox (VCHR1) y halorodopsina (NpHR). ChR2 es una rodopsina derivada del alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii. El término "rodopsina", como se usa en el presente documento, es una proteína que comprende al menos dos componentes básicos, una proteína opsina y un cofactor unido covalentemente, por lo general retinal (retinaldehído). La rodopsina ChR2 deriva de la opsina Canalopsina-2 (Chop2), originalmente denominada Chlamiopsina-4 (Cop4) en el genoma de Chlamydomonas. Las propiedades temporales de una canalrodopsina despolarizante, ChR2, incluyen una cinética rápida de activación y desactivación, lo que permite la generación de series de potenciales de acción de tiempo preciso. Para las aplicaciones que buscan una activación a largo plazo, se ha descubierto que la cinética-off de las canalrodopsinas puede ser más lenta. Por ejemplo, determinadas implementaciones de canalrodopsinas aplican luz 1 mW/mm2 durante prácticamente todo el tiempo en que se desea la despolarización, lo que puede ser menos que deseable.
Gran parte del análisis en el presente documento se refiere a ChR2. A menos que se indique lo contrario, la divulgación incluye una serie de variantes similares. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, Chop2, ChR2-310, Chop2-310 y canalrodopsina de Volvox (VChR1). Para obtener detalles adicionales acerca de VChR1, puede
hacerse referencia a "Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carterí', Nat Neurosci. Junio de 2008, 11 (6): 631-3. Epub 2008 23 de abril. En otras implementaciones, pueden hacerse modificaciones similares a otras moléculas de opsina. Por ejemplo, pueden hacerse modificaciones/mutaciones a variantes de ChR2 o VChR1. Además, las variantes modificadas pueden usarse en combinación con bombas de iones activadas por luz.
Aspectos de la presente divulgación incluyen variantes de aminoácidos relativamente menores de las secuencias de origen natural. En un caso, las variantes son más de aproximadamente un 75 % homólogas a la secuencia proteínica de las secuencias de origen natural. En otras variantes, la homología es superior a aproximadamente el 80 %. Sin embargo, otras variantes tienen una homología superior a aproximadamente el 85 %, superior al 90 % o incluso tan alta como de aproximadamente el 93 % a aproximadamente el 95 % o de aproximadamente el 98 %. Homología en este contexto significa similitud o identidad de secuencia, prefiriéndose la identidad. Esta homología puede determinarse usando técnicas convencionales conocidas en el análisis de secuencias. Las composiciones de la presente divulgación incluyen las secuencias de proteína y ácido nucleico proporcionadas en el presente documento, incluyendo variantes que son más de aproximadamente un 50 % homólogas a la secuencia proporcionada, más de aproximadamente un 55 % homólogas a la secuencia proporcionada, más de aproximadamente un 60 % homólogas a la secuencia proporcionada, más de aproximadamente un 65 % homólogas a la secuencia proporcionada, más de aproximadamente un 70 % homólogas a la secuencia proporcionada, más de aproximadamente un 75 % homólogas a la secuencia proporcionada, más de aproximadamente un 80 % homólogas a la secuencia proporcionada, más de aproximadamente un 85 % homólogas a la secuencia proporcionada, más de aproximadamente un 90 % homólogas a la secuencia proporcionada o más de aproximadamente un 95 % homólogas a la secuencia proporcionada.
Como se usa en el presente documento, la "estimulación de una célula diana" se usa generalmente para describir la modificación de las propiedades de la célula. Por ejemplo, el estímulo de una célula diana puede dar como resultado un cambio en las propiedades de la membrana celular que puede conducir a la despolarización o la polarización de la célula diana. En un caso particular, la célula diana es una neurona y el estímulo afecta a la transmisión de impulsos mediante la facilitación o la inhibición de la generación de impulsos (potenciales de acción) por la neurona.
Para obtener detalles adicionales acerca de opsinas activadas por luz, puede hacerse referencia a la Publicación PCT N.° WO 2010/056970, titulada "Optically-Based Stimulation of Target Cells and Modifications Thereto", a Deisseroth et al.
Ejemplos
Ejemplo 1: Desarrollo de la variante de canalrodopsina quimérica C1V1
En este ejemplo, se buscó una herramienta que permitiera la conducción de elevaciones de E/I corticales y el control de oscilaciones gamma en cortes corticales, así como in vivo en experimentos con animales vivos, con tres propiedades clave: 1) una potencia mucho mayor para permitir la investigación de dosis-respuesta; 2) baja desensibilización para permitir cambios graduales en el equilibrio E/I; y 3) excitación desplazada al rojo para permitir el impulso comparativo de diferentes poblaciones dentro de la misma preparación.
Estos experimentos se intentaron inicialmente con VChR1, que muestra tanto un desplazamiento al rojo como una reducción de la desensibilización14, pero una investigación previa sugirió que las fotocorrientes en las células que expresan VChR1 eran pequeñas (-100-150 pA14) y no desencadenaron una actividad sináptica robusta en células corriente abajo (no se muestra). De hecho, cuando se intentó por primera vez expresar VCHR1 en células, solo se observaron fotocorrientes pequeñas (FIG. 1A) coherentes con hallazgos anteriores. La adición de una señal de tráfico de membrana derivada del canal Kir2.1 para generar VChR1-is-EYFP entregó solamente una tendencia modesta hacia fotocorrientes potenciadas en comparación con VChR1-EYFP (FIG. 1B). Sin embargo, teniendo en cuenta que en ChR2, el reemplazo de segmentos transmembrana con la región homóloga de ChR1 aumentó el direccionamiento de la membrana y las fotocorrientes potenciadas, se planteó la hipótesis de que un intercambio sistemático similar entre las hélices de VChR1 con las hélices correspondientes de otros ChR, podría dar como resultado igualmente una expresión de membrana potenciada en células HEK.
Materiales y métodos
Se generó una variante de canalrodopsina quimérica C1V1 fusionando una canalrodopsina-1 de tipo silvestre u optimizada con codón humano con un VChR1 adaptado con codón humano (número de acceso de GenBankTM ACD70142,1) mediante PCR de extensión por solapamiento. Se generaron variantes de corte y empalme de C1V1 mediante PCR solapada. La variante uno contenía los primeros 145 aminoácidos de ChR1 y los aminoácidos de 102 a 316 de VChR1. La variante dos contenía los primeros 162 aminoácidos de ChR1 y los aminoácidos 119 a 316 de VChR1. Los fragmentos de PCR quiméricos resultantes se clonaron en pECFP-N1 (Clonetech, Mountain View, CA) y en vectores de expresión lentivíricos con el promotor CaMKIIa. La señal de tráfico de membrana derivó del canal Kir2.1. Las mutaciones se confirmaron mediante la secuenciación de la secuencia de codificación y los sitios de corte y empalme. Para la entrega de genes mediada por AAV, se subclonaron fusiones de opsina-EYFP junto con el
promotor CaMKIIa en una versión modificada del vector pAAV2-MCS. La expresión de opsina dependiente de Cre se consiguió clonando el casete opsina-EYFP en la orientación inversa entre pares de sitios lox incompatibles (loxP y 1ox2722) para generar un marco de lectura abierto invertido de doble efecto (D10) con el control promotor del factor de elongación 1a (EF-1a). Todas las construcciones están disponibles en Deisseroth Lab (www.optogenetics.org).
Se cultivaron células HEK293 en medio esencial mínimo de Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10 %, glutamina 2 mM (Biochrome, Berlín, Alemania) y penicilina/estreptomicina al 1 % (p/p). Se sembraron células en cubreobjetos a una concentración de 0,175 x 106 células/ml y se complementaron con retina todo-trans 1 mM. La transfección transitoria se realizó con Fugene 6 (Roche, Mannheim, Alemania) y se realizaron registros entre 20 y 28 horas más tarde. Se registraron fotocorrientes en células HEK293 transfectadas transitoriamente mediante pinzamiento zonal convencional de células completas. La solución externa contenía [mM]: NaCl 140, CaCh 2, MgCh 2, KCl 2, HEPES 10 (pH 7,2). La solución interna contenía [mM]: NaCl 110, EGTA 10, MgCh 2, CaCh 1, KCl 5, HEPES 10 (el pH se ajustó a 7,2, ya sea usando CsOH o HCl). Las pipetas zonales se extrajeron con un extractor de micropipetas modelo P-97 (Sutter Instrument Co., Novato, CA) de tubos de microhematocrito (Hecht-Assistant, Sondheim, Alemania) con una resistencia de 1,5-2 MQ. El pinzamiento zonal de célula completa de células HEK se realizó con un amplificador EPC 7 (HEKA, Elektronik GmbH, Lambrecht, Alemania). Se muestrearon datos analógicos a 20 kHz, se digitalizaron con Digidata1440 (Molecular Devices, Foster City, CA) y se mostraron usando el software pClamp10.1 (Molecular Devices, Foster City, CA). Para registrar la dependencia de la longitud de onda, se instaló una guía de luz de una unidad Polychrome V (TILL Photonics, Planegg, Alemania) en el puerto de epiluminiscencia de un microscopio Olympus IX70. Para reflejar la luz en el objetivo, se usó un divisor de haz (70 % R/30 % T) dando como resultado una densidad final de fotones de ~ 1 x 1022 fotones m-2 s-1 a 470 nm en el cubreobjetos. Para registrar los espectros de acción solo se usó el 50 % de la intensidad de la luz. La Unidad Polychrome V se controló con el software Tillvision (TILL Photonics, Planegg, Alemania) sincronizado con el software pClamp.
Resultados
Curiosamente, la mejora más robusta en las quimeras se descubrió cuando las hélices 1 y 2 se reemplazaron con los homólogos de ChR1 (FIG. 1C-D). Se sometieron a ensayo dos canales quiméricos ChR1-VChR1 para determinar el direccionamiento a la membrana y el tamaño de fotocorriente en células HEK293 cultivadas. El primero se unió en el segundo bucle intracelular después de A1a145 de ChR1 y el segundo se unió dentro de la hélice tres después de Trp163 de ChR1 (FIG. 1C). Mientras que ambas variantes se expresaron casi igual de bien en células HEK293 (FIG. 1D), en neuronas cultivadas, la segunda variante se expresó de forma más robusta (FIG. 1E) y mostró fotocorrientes de pico muy potenciadas (888 ± 128 pA, n = 11 células; p < 0,0005) en comparación con VChR1-EYFP (FIG. 1B). El pico del espectro de acción permaneció desplazado al rojo robustamente con respecto a ChR2 (Tabla 1; Figura 1F) y la selectividad iónica de la quimera fue similar a la publicada anteriormente para ChR2 y VChR1 (FIG. 1G). La adición de la secuencia de tráfico Kir2.1 a este híbrido tendió a aumentar adicionalmente las fotocorrientes (1104 ± 123 pA, n = 12 células; p < 0,0005 en comparación con VChR1-EYFP, p = 0,23 en comparación con C1V1-EYFP; FIG. 1B; Tablas 1-2). La quimera ChR1/VChR1 híbrida resultante no contiene ninguna secuencia ChR2, deriva en particular de dos genes de opsina que no se expresan bien por sí solos y en el presente documento se denomina C1V1 (FIG. 1 A, H).
Ejemplo 2: Optimización de la cinética de fotocorriente de C1V1
Se necesitarían propiedades de desactivación rápida28 de la presente opsina desplazada al rojo para la separación temporal y espectral máximas de otras opsinas que se activan mediante longitudes de onda ubicadas hacia el extremo azul del espectro visible. Sin embargo, se descubrió que las fotocorrientes que mostró C1V1-ts-EYFP presentaron un descomposición > 10 veces más lento que ChR2, y un descomposición incluso más lento que el VChR1 original (FIG. 2A; Toff 156 ± 12 ms y 132 ± 12 ms para C1V1-ts-EYFP (n = 4) y VChR1-EYFP (n = 5), respectivamente; Tabla 1), lo que posiblemente impide el uso de C1V1 para aplicaciones que requieren velocidades de disparo rápidas. Para corregir la cinética de fotocorriente de C1V1, se realizó una búsqueda en la región cromófora usando modelos estructurales conocidos22,28 (FIG. 1H) para determinar mutaciones con una cinética de fotociclo más rápida, menor inactivación y menor absorción de azul. A continuación, se mutó glutamato-122 a treonina, basándose en los estudios del motivo rico en glutamato en la hélice 2, lo que demuestra que la presente mutación reduce la inactivación3.
Materiales y métodos
Todas las mutaciones puntuales en los vectores C1V1 se generaron en los plásmidos mediante mutagénesis dirigida al sitio (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). La señal de tráfico de membrana derivó del canal Kir2.1. Las mutaciones se confirmaron mediante la secuenciación de la secuencia de codificación y los sitios de corte y empalme.
Resultados
La mutación homóloga a ChETA E162T28 aceleró notablemente el fotociclo a casi el triple de Toff 58 ± 4,7 ms, n = 7 células; FIG. 2A, Tabla 1). Sorprendentemente, mientras que mutaciones análogas en ChR2 u otras opsinas microbianas han provocado un desplazamiento al rojo2829 , en C1V1 esta mutación desplazó el espectro de acción en la dirección no deseada, hipocromática a 530 nm (FIG. 1F; Tabla 1). C1V1-E122T se desactivó solo en un 26 % en comparación con un 46 % de desactivación de ChR2 (FIG. 2B, Tabla 1); además, el espectro se desplazó al rojo adicionalmente a 546 nm (FIG. 1F, Tabla 1) y mostró una pérdida sorprendente del hombro azul problemático del espectro de acción C1V1. Por último, en el mutante doble E122T/E162T, la inactivación de la corriente fue incluso inferior que en el mutante E122T y el fotociclo fue aún más rápido en comparación con E162T Toff 34 ± 4,9 ms, n = 7 células; FIG. 2A, FIG. 2C, Tabla 1), conservando al mismo tiempo el desplazamiento al rojo y la ausencia del hombro azul del espectro de acción. Además, aunque el mutante E122 redujo gravemente la amplitud de la fotocorriente (FIG. 2D, el mutante doble restauró las corrientes muy altas características del C1V1-ts original. Por tanto, se conservaron múltiples propiedades sorprendentes y útiles de las mutaciones individuales en la quimera C1V1 potenciada para el tráfico doble mutante.
Tabla 1: Propiedades espectrales/cinéticas de las variantes ChR2, VChR1 y C1V1 Se registró la longitud de onda de activación máxima en células HEK usando pulsos de luz de 2 ms en la longitud de onda de activación máxima. Se registraron cinéticas de desactivación (Toff) y fotocorrientes máximas en neuronas de hipocampo cultivadas usando pulsos de luz de 2 ms a la longitud de onda de activación máxima. Para identificar las variantes óptimas para la activación combinatoria con ChR2, se registró el porcentaje de respuesta a 405 nm y 560 nm en células HEK. La desensibilización de la fotocorriente se registró usando pulsos de luz de 300 ms, cuantificando la descomposición de la fotocorriente máxima (Imáx) al estado estable.
Absorción Cinética Toff Corriente pico (pA) Relación % de máxima (nm) pH7,2 (ms) a -60 Mv* 405/560 desensibilización
ChR2 460 ± 6 (N = 5) 10 ± 1 (N = 60 %:8 %
= 5) 816 ± 181 (N = 5) 65 ± 8 (N = 5) (N = 7)
VChR1 543 ± 7 (N = 7) 85 ± 11 (N = 6) 284 ± 54 (N = 5) 9 %:82 %
(N = 7) 53 ± 10 (N = 18)
C1V1 539 ± 4 (N = 10) 60 ±6 (N = 6) 1035± 158(N = 6) 28
(N
%:86 %
= 10) 46 ± 12 (N = 14)
C1V1 (E162T) 530 ± 4 (N = 6) 23 ± 5 (N = 4) 1183 ± 53 (N = 6) 20 %:71 %
(N = 6) 41 ± 12 (N = 7)
C1V1 (E122T) 546 ± 5 (N = 4) 55 ± 8 (N = 5) 572 ± 21 (N = 5) 14 %
(N
%
=
:94
4) 26 ± 6 (N 4) C1V1 (E122T,
E162T) 535 ± 5 (N = 7) 12 ± 1 (N = 5) 1072 ± 89 (N = 9) 11 %:72 % 11 ± 9 (N = 9) (N = 7)
Por tanto, se conservaron juntas múltiples propiedades útiles de las mutaciones individuales en el doble mutante.
Ejemplo 3: Uso de nuevas quimeras C1V1 en neuronas de la corteza prefrontal
Para someter a ensayo estos nuevos genes de opsina C1V1 en neuronas, se generaron vectores lentivíricos que codifican C1V1-ts-EYFP y las combinaciones de mutaciones puntuales anteriores. Estas opsinas se expresaron después en neuronas de hipocampo cultivadas y se registraron fotocorrientes de células completas en condiciones de estimulación idénticas (pulsos de 2 ms, luz de 542 nm, 5,5 mW mm-2) para determinar si la mejora en la amplitud de la fotocorriente fue resultado directamente del aumento de la expresión de C1V1 en comparación con VChR1.
Materiales y métodos
Animales
Se alojaron en grupos de tres a cinco por jaula ratones machos Parvalbumin::Cre C57/BL6J de tipo silvestre o transgénicos y se mantuvieron en un ciclo inverso de luz/oscuridad de 12 horas con alimento y agua a demanda. Los protocolos experimentales fueron aprobados por IACUC de la Universidad de Stanford y cumplen con las directrices de la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los EE.UU.
Electrofisiología de pinzamiento zonal de células enteras en hipocampo y neuronas corticales
Se aislaron cultivos primarios de hipocampo de ratas PO Sprague-Dawley, se colocaron en cubreobjetos de vidrio revestidos con Matrigel (Invitrogen) y se trataron con FUDR para inhibir el crecimiento excesivo de la glía. Se transfectó ADN plasmídico sin endotoxinas en neuronas cultivadas usando una mezcla de solución salina tamponada con HEPES /CaPO4. Se obtuvieron registros electrofisiológicos de neuronas individuales identificadas por la expresión de proteínas fluorescentes en medio Tyrode ([mM] NaCl 150, KCl 4, MgCl22, MgCl22, D-glucosa 10, HEp Es 10, pH 7,35 con NaOH) usando una solución interna patrón ([mM] K-gluconato 130, KCl 10, HEPES 10, EGTA 10, MgCl2 2, pH 7,3 con KOH) en pipetas de vidrio de 3-5 MQ. Para la fisiología del corte cortical, se obtuvieron cortes agudos de 300 gm de corte coronal de ratones C57BL/6J o PV::Cre de 8-9 semanas de edad, anteriormente inyectados con virus, en solución de corte de sacarosa enfriada con hielo ([mM] D-glucosa 11, sacarosa 234, KCl 2,5, NaH2PO4 1,25, MgSO4 10, CaCl2 0,5, NaHCO3 26) usando un Vibratome (Leica). Los cortes se recuperaron en líquido cafalorraquídeo oxigenado (ACSF; [mM] NaCl 124, KCl 3, MgCl2 1,3, CaCl22,4, NaH2PO4 1,25, NaHCO3 26, D-glucosa 10) a 32 °C durante una hora. Se obtuvieron parches de neuronas individuales después de identificar la expresión de la proteína fluorescente de la capa cortical prefrontal indicada con una perfusión de ACSF constante. La luz filtrada de una fuente de lámpara de xenón de longitud de onda amplia (Sutter Instruments DG-4) se acopló al puerto de fluorescencia del microscopio (Leica DM-LFSA). Los filtros de paso de banda (Semrock) tenían un ancho de banda de 20 nm y se ajustaron con filtros de densidad neutra adicionales (ThorLabs) para igualar la potencia lumínica en todo el espectro.
Las imágenes de células cultivadas se obtuvieron en el mismo microscopio usando una cámara CCD Retiga Exi (Qimaging, Inc.) a 100 ms de exposición con 30 de ganancia. La densidad de potencia de iluminación fue de 12 mW mm-2 a 500 nm con un conjunto de filtros EYFP convencional. La cuantificación de la fluorescencia se realizó con el software ImageJ marcando una región que contenía el soma y las neuritas proximales y calculando para cada célula la intensidad total de píxeles integrados en esa región, en lugar de la fluorescencia promedio, puesto que es probable que las fotocorrientes estén relacionadas con el número total de canales unidos a la membrana en lugar de la expresión de canales promedio por área.
Preparación e inyección de virus
Tanto la entrega de genes lentivíricos y mediada por AAV se usaron para la expresión heteróloga de opsinas en ratones. Las opsinas indicadas fueron activadas por el promotor de la proteína cinasa II alfa dependiente de calmodulina humana (CaMKIIa) para el direccionamiento a neuronas excitadoras corticales o el Factor de elongación 1a (EF-1a) en conjunto con un casete inducible por Cre y seguida del elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis Woodchuck (WPRE). El vector de AAV recombinante inducible por Cre se produjo mediante el Vector Core de la Universidad de Carolina del Norte (Chapel Hill, NC, EE.UU.) y se usó junto con ratones transgénicos parvalbúmina::Cre para el direccionamiento a interneuronas positivas a parvalbúmina. En resumen, se subclonaron construcciones de AAV en una versión modificada del pAAV2-MCS, se tomaron serotipos con proteínas de la capa de AAV5 y se empaquetaron con el núcleo del vector vírico en la Universidad de Carolina del Norte. La concentración vírica final de los vectores de AAV como 1x 1012 copias del genoma (gc)/ml. Se generaron construcciones lentivíricas como se ha notificado. Todas las construcciones están disponibles en Deisseroth Lab (www.optogenetics.org). Las inyecciones víricas estereotácticas se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de Stanford. Se dispusieron ratones juveniles (4-6 semanas) mantenidos con anestesia con isoflurano en un marco estereotáctico (Kopf Instruments) y se nivelaron usando los puntos de referencia de cráneo bregma y lambda. Se realizaron craneotomías con el fin de provocar un daño mínimo al tejido cortical. La corteza prefrontal infralímbica (IL; de bregma: 1,8 mm anterior, 0,35 mm lateral, -2,85 mm ventral) se seleccionó usando una jeringa de 10 ul y una aguja biselada de 35 g (Word Precision Instruments). El virus se
infundió a una velocidad de 0,1 |jl/min. a los sujetos a los que se inyectó virus para estudios de comportamiento se les implantó adicionalmente un dispositivo de acoplamiento de fibra óptica crónico para facilitar la entrega de luz con o sin una fibra cerebral penetrante unida para la entrega local a la región cortical diana como se indica (Doric Lenses, Canadá). Las fibras penetrantes se insertaron estereotácticamente a una profundidad de -2,5 mm desde las mismas coordenadas anteriores y laterales y se fijaron con cemento adhesivo (C&B MetaBond) antes del cierre adhesivo del cuero cabelludo (Vetbond, 3M). A los animales se les administró alivio analgésico después de la recuperación de la cirugía.
Resultados
Se obtuvieron registros de neuronas del hipocampo cultivadas que expresaban construcciones individuales y una lectura de fluorescencia integrada de cada célula individual. En células individuales, los niveles de fluorescencia se correlacionaron estrechamente con las amplitudes de fotocorriente medidas en las construcciones (FIG. 3A). Por tanto, se llegó a la conclusión de que la fotocorriente potenciada de C1V1 se debía principalmente a una mejor expresión de las neuronas. Puesto que el doble mutante C1V1-E122T/E162T mostró un rendimiento superior en todas las dimensiones sometidas a ensayo (tamaño de fotocorriente, cinética de inactivación y espectro de acción), el rendimiento en ChR2(H134R) también se comparó directamente midiendo la fluorescencia de YFP somática integrada y las fotocorrientes de pico. Sorprendentemente, las células C1V1-E122T/E162T mostraron fotocorrientes más fuertes que las células ChR2-H134R a niveles de fluorescencia equivalentes (FIG. 3B), lo que potencialmente sugiere un aumento de la conductancia unitaria.
Para examinar si C1V1-E122T/E162T sería adecuado para la activación óptica del aumento en las neuronas piramidales, se generaron vectores víricos adeno-asociados que albergaban el gen C1V1-E122T/E162T-ts-EYFP con el promotor CaMKIIa (AAV5-CaMKIIa-C1V1-E122/E162T-ts-EYFP) y se inyectó el virus en la corteza prefrontal de los ratones. Las respuestas se registraron a partir de neuronas expresadas en cortes agudos con series de pulsos de luz de 2 ms y se compararon con las respuestas a series de inyecciones de corriente (10 ms, 200 pA) a frecuencias idénticas. Se descubrió que la respuesta de frecuencia de las neuronas a las series de pulsos de 560 nm era indistinguible de la respuesta a las inyecciones de corriente en las mismas frecuencias (FIG. 3C; n = 6 células en 2 cortes), lo que sugiere que las propiedades intrínsecas de la célula y no la cinética de C1V1 limitan el rendimiento de aumento a velocidades altas. Se observaron propiedades de rendimiento similares en un intervalo de condiciones de iluminación verde, amarilla y ámbar, con un rendimiento fuerte en las intensidades de luz moderadas (<10 mW/mm2) adecuadas para aplicaciones in vivo en mamíferos (FIG. 3D). De hecho, las respuestas a 540 nm y 590 nm fueron igualmente eficaces al provocar potenciales de acción precisos, con una fidelidad más baja en las potencias lumínicas más bajas como se esperaba (FIG. 3D).
Con el espectro de acción desplazado al rojo prominentemente, se consideró la posibilidad de que el C1V1 incluso pudiera usarse para impulsar el aumento con luz roja, no notificado anteriormente con ninguna opsina y potencialmente importante para permitir una mejor separación espectral y el control de las neuronas en el tejido más profundo. Por tanto, se examinó si se podía usar alguna variante de C1V1 para impulsar picos usando luz roja lejana. Aunque la cinética de C1V1-E122T fue más lenta que la de C1V1E122T/E162T, su espectro de acción fue el más desplazado al rojo de todas las variantes (FIG. 1F) y de hecho se descubrió que las células que expresaban C1V1-E122T respondían con más fuerza a la luz roja (630 nm) que las células que expresaban el mutante doble (FIG. 3E, parte superior). Aunque las cinéticas en el mutante E122T a 630 nm fueron más lentas que a 545 nm (FIG.
3F), las fotocorrientes se reclutaron usando pulsos más largos de luz de 630 nm a intensidad moderada (FIG. 3G) que bastaron para obtener series de picos definidos (FIG. 3H; FIG. 3E, parte inferior).
Ejemplo 4: Uso de nuevas quimeras C1V1 en cortes de cerebro vivo de las neuronas de la corteza prefrontal de ratones
El estudio buscó determinar si las neuronas inhibidoras y excitadoras que se encuentran en el mismo microcircuito podrían dirigirse con la introducción de las variantes C1V1. Se exploró la activación independiente de dos poblaciones neuronales dentro de cortes de cerebro vivo; en este caso, CaMKIIa-C1V1-E122T/E162Tts e YFP y EF1a-DIO-ChR2-H134R-EYFP se expresaron en mPFC de ratones PV::Cre.
Materiales y métodos
Se obtuvieron cortes coronarios agudos de 300 μm aislados de ratones C57BL/6J o PV::Cre de tipo silvestre de 8-9 semanas de edad anteriormente inyectados con virus en solución de corte de sacarosa enfriada con hielo ([mM] D-glucosa 11, sacarosa 234, KCl 2,5, NaH2PO41,25, MgSO410, CaCh 0,5, NaHCO326) usando un Vibratome (Leica). Se recuperaron cortes en líquido cafalorraquídeo oxigenado (ACSF; [mM] NaCl 124, KCl 3, MgCh 1,3, CaCl22,4, NaH2PO4 1,25, NaHCO3 26, D-glucosa 10) a 32 °C durante una hora. Se obtuvieron parches de neuronas individuales después de identificar la expresión de la proteína fluorescente de la capa cortical prefrontal indicada con una perfusión de ACSF constante. Se acopló una luz filtrada de una fuente de lámpara de xenón de longitud de onda amplia (Sutter Instruments DG-4) al puerto de fluorescencia del microscopio (Leica DM-LFSA). Los datos de la fisiología de los cortes se importaron a Matlab y se analizaron usando un software personalizado. Los espectros de potencia se calcularon usando el método de wavelet descrito por Sohal et al.55 En resumen, para cada frecuencia f,
los trazos registrados se filtraron en primer lugar con un filtro de paso de banda de entre f ± 5 Hz. Los trazos filtrados se convirtieron en la función de wavelet:
donde * denota convolución, a = 5/(6f). La amplitud al cuadrado de W (f, t) en una ventana de 500 ms se usó después para medir la potencia a diversas frecuencias. Todos los espectros de potencia de los registros de corte se normalizaron a 1/f.
Las imágenes de células cultivadas se obtuvieron en el mismo microscopio usando una cámara CCD Retiga Exi (Qimaging inc.) a 100 ms de exposición con la ganancia de 30. La densidad de potencia de iluminación fue de 12 mW mm-2 a 500 nm con un conjunto de filtros EYFP convencionales. La cuantificación de la fluorescencia se realizó con el software ImageJ marcando una región que contenía el soma y la neuritis proximal y calculando para cada célula la intensidad total de píxeles integrados en esa región, en lugar de la fluorescencia promedio, puesto que es probable que las fotocorrientes estén relacionadas con el número total de canales unidas a la membrana en lugar de la expresión de canales promedio por área.
Usando el pinzamiento de corriente, se estimuló una única célula piramidal con una serie de formas de onda de CPSE simuladas. Los eventos de CPSEs individuales tuvieron magnitudes de pico de corriente de 200 pA y decayeron con una constante de tiempo de 2 ms. Cada experimento se dividió en 10 barridos, cada 10 segundos de duración y se separaron por 5 segundos para minimizar la reducción. Cada barrido se dividió en segmentos de 500 ms. El número total de CPSEs en cada segmento de 500 ms se eligió al azar de entre una distribución uniforme de entre 0 y 250. Después, los tiempos de las CPSEs dentro del segmento de 500 ms se seleccionaron al azar de entre una distribución uniforme que se extiende a lo largo de todo el segmento, simulando una entrada excitadora de una población de neuronas no sincronizadas. Empíricamente, estos parámetros de estimulación condujeron de manera confiable a las neuronas piramidales a velocidades de disparo de 0 a 30 Hz. En condiciones marcadas como línea de base, se administró un pulso de 10 segundos de luz de 590 nm para desactivar completamente la opsina antes de ejecutar el protocolo de CPSEs. En condiciones donde se activó la opsina, un pulso de 1 segundo de luz de 470 nm precedió al protocolo de CPSEs.
Para comprender el efecto neto del equilibrio E/I alterado en el procesamiento de la información, se calculó la información mutua entre la velocidad de las CPSEs de entrada de cada neurona y la velocidad de picos de salida, que captura los cambios relevantes en forma de la curva I-O y en la variabilidad de la respuesta. En primer lugar, se estimó la distribución conjunta de la velocidad de las CPSEs y la velocidad de aumento puntual, la velocidad de las CPSEs y la velocidad de aumento y la construcción de un histograma conjunto. Los intervalos de tiempo tenían 125 ms de ancho y la velocidad de las CPSEs se dividió en 10 intervalos igualmente espaciados de 0 a 500 Hz, aunque los resultados de información mutua fueron uniformes en una amplia gama de parámetros de agrupación. La velocidad de aumento se dividió usando el menor ancho significativo del intervalo dado el ancho de la bandeja de tiempo (por ejemplo, el ancho del intervalo de 8 Hz para los intervalos de tiempo de 125 ms) A partir de este histograma conjunto, se computó la información mutua, como se ha descrito anteriormente, igual a la diferencia entre la entropía de respuesta y la entropía de ruido.
La entropía de respuesta cuantifica la cantidad total de incertidumbre en la velocidad de aumento de salida de la neurona. La entropía de ruido cuantifica la incertidumbre que permanece en la velocidad de aumento de salida dada la velocidad de entrada. Obsérvese que la información máxima que las respuestas neuronales pueden transmitir sobre el estímulo de entrada es la entropía del conjunto de estímulos. Para 10 intervalos de velocidad de las CPSEs de entrada igualmente espaciados y una distribución uniforme de la velocidad de entrada en estos intervalos, la entropía de la velocidad de entrada es log2(10) = 3,322 bits.
La información mutua calculada a partir de distribuciones de probabilidad submuestreadas puede sesgarse ascendenetemente. En consecuencia, todos los valores notificados de información mutua, entropía de respuesta y entropía de ruido se corrigieron por el sesgo debido al submuestreo. Esta corrección se realiza calculando valores de fracciones más pequeñas (de la mitad a una octava parte) de los datos completos y extrapolando al límite de datos infinitos. Usando ventanas de tiempo de 125 ms, los factores de corrección fueron siempre inferiores a 0,07 bits.
Se crearon vectores y se realizaron inyecciones como anteriormente.
Resultados
Usando esta agrupación de genes de opsina modificados por ingeniería genética múltiples veces, se exploraron las posibilidades para el control combinatorio de células y proyecciones dentro de sistemas de mamíferos intactos. En primer lugar, se preguntó si las neuronas excitadoras e inhibidoras que se encuentran en el mismo microcircuito
podrían abordarse de forma separada mediante la respectiva introducción de variantes C1V1 y ChR convencionales en estas dos poblaciones de células. Se descubrió que las neuronas del hipocampo cultivadas que expresaban C1V1E122T/E162T se dispararon en respuesta a pulsos de luz verde de 2 ms (560 nm) pero no a pulsos de luz violeta. Por el contrario, las células que expresaban ChR2-H134R se disparaban en respuesta a pulsos de luz de 2 ms a 405 nm, pero no en respuesta a pulsos de luz de 2 ms a 561 nm (FIG. 4A). Por tanto, este principio se sometió a ensayo dentro de cortes de cerebro vivo; en el presente documento, AAV5-CaMKIIa::C1V1-El22T/E162T-ts-mCherry junto con AAV5-EFla-DIO::ChR2-H134R-EYFP se expresó en mPFC de ratones PV::Cre (FIG. 4B). En las neuronas piramidales que no expresaban ninguna opsina, los pulsos de luz de 405 nm disparaban corrientes postsinápticas inhibidoras robustas y rápidas debido a la activación directa de células PV (FIG.4C), mientras que los pulsos de luz de 561 nm disparaban tanto CPSE de latencia corta (FIG. 4D) como CPSI polisinápticas de larga latencia esperadas que surgían del impulso de células piramidales que expresaban C1V1 de neuronas inhibidoras locales (FiG.4C).
Después se exploró la excitación de estos elementos celulares independientes in vivo con registros de Optrode (FIG.
4E, izquierda). Para examinar el efecto inhibitorio de la actividad de las células PV en la activación de las neuronas piramidales, se diseñó un protocolo experimental en el que los pulsos de luz violeta de 5 Hz (para activar ChR2 en células PV) precedió a los pulsos de luz verde de 5 Hz (para activar C1V1 en las neuronas piramidales excitadoras) con intervalos entre pulsos variables. Cuando los pulsos de luz violeta y verde se separaron por 100 ms (FIG. 4E, trazo superior), las respuestas a los pulsos de luz verde no se vieron afectadas por los pulsos violetas. Sin embargo, a medida que se redujeron los retrasos entre los pulsos violeta y verde, los eventos inducidos por luz verde se inhibieron más fácilmente y se suprimieron completamente cuando los pulsos de luz se presentaron con suficiente sincronía (FIG. 4E, trazo inferior; datos de sumario en la FIG. 4F). Estos datos demuestran la activación optogenética combinatoria dentro de un mamífero intacto (impulsando una población sola o en combinación temporal precisa con otra), aprovechando la velocidad de las opsinas y las propiedades de los pulsos de luz entregados.
Ejemplo 5: Efecto de la activación independiente de los axones glutamatérgicos corticotalámicos (CT) y talamocorticales (TC) que inciden en las neuronas del núcleo talámico reticular
Para validar la propiedad de control combinatorio para proyecciones axonales en lugar de la estimulación somática celular directa, el efecto de la activación independiente de axones glutamatérgicos corticotalámicos (CT) y talamocorticales (TC) que inciden en las neuronas del núcleo talámico reticular (nRT) (FIG. 5A) se examinó en cortes talámicos.
Materiales y métodos
Se anestesiaron ratones C57BL/6J de tipo silvestre (días postnatales 90-120) con pentobarbital (100 mg/kg, i.p.) y se decapitaron. Se realizó la preparación de corte talámico y los registros de pinzamiento zonal de células completas. Se obtuvieron registros de neuronas nRT (talámicas reticulares) y TC (talamocorticales de relevo) identificadas visualmente usando ópticas de contraste diferencial con un Zeiss (Oberkochen, Alemania), un microscopio Axioskop y una cámara de video infrarroja. Para los registros de CPSEs y pinzamiento de corriente, la solución interna contenía (en mM): K-gluconato 120, KCl 11, MgCh 1, CaCl21, Hepes 10, EGTA 1. El pH se ajustó a 7,4 con KOH (290 mOsm). Se estimó Eci- ~ -60 mV basándose la ecuación de Nernst. Los potenciales se corrigieron para un potencial de unión líquida de -15 mV. Para experimentos de pinzamiento de voltaje, las neuronas se pinzaron a -80 mV y las EPSE se aislaron farmacológicamente mediante la aplicación en baño del antagonista del receptor GABAA picrotoxina (50 |jM, Tocris). En todas las condiciones de registro, se controló la resistencia de acceso y se incluyeron células para el análisis solo si la resistencia de acceso era < 18 MQ y el cambio de resistencia era < 25 % en el transcurso del experimento.
Se inyectaron 600 nl de rAAV5/CamKIIa-hChR2(H134R)-EYFP o 900 nl de rAAV5-CaMKIIaC1V1(E122T/E162T)-TS-mCherry estereotáxicamente en el tálamo ventrobasal (VB) o la corteza de barril, respectivamente, de ratones C57/6J de tipo silvestre in vivo, entre los días postnatales 30-35. Las inyecciones intra-corticales e intra-tálamicas (VB) se realizaron en los mismos ratones (n = 6). Las inyecciones intra-corticales se realizaron (desde bregma) 1,3 mm posteriores, 3 mm laterales, 1,15 mm por debajo de la superficie cortical. Las inyecciones intra-talámicas fueron 1,7 mm posteriores, 1,5 mm laterales, 3,5 mm por debajo de la superficie cortical. Los ratones se sacrificaron ~2-3 meses después de las inyecciones y se hicieron corte s talámicos cerebrales horizontales para la estimulación óptica y los registros in vitro como se ha descrito anteriormente. Se retiró el tálamo VB para evitar la activación disináptica de las neuronas nRT a través de la vía CT-TC-nRT. El corte del tálamo VB a partir de los cortes retiró todos los cuerpos celulares fotosensibles de la preparación, permitió el examen directo de las proyecciones CTnRT y TC-nRT y no afectó a las propiedades de la membrana eléctrica de las neuronas nRT (no se muestra). La activación óptica de TC que expresaba ChR2 y los axones de TC que expresaban C1V1 se realizaron con estímulos láser de 405 nm y 560 nm, respectivamente (pulsos de luz de 5 ms de duración, 2-3 mW) (OEM Laser Systems, MI) entregados con fibra óptica (BFL 37-300, ThorLabs) en sentido ascendente a lo largo de las vías CT y TC que se proyectan a nRT. Se usó una intensidad de estimulación mínima, definida como la potencia lumínica que dio como resultado fallos del 50 al 70 % (30-50 % de éxitos), cinética de respuesta fija y variabilidad de amplitud de respuesta baja. Consecuentemente, las CPSE provocadas mínimas fueron resultado presumiblemente de la activación óptica
selectiva de axones de TC o TC únicos presinápticos a la célula registrada. La potencia lumínica de estimulación se incrementó ligeramente (~5 % por encima de la estimulación mínima) hasta que el número de fallos se convirtió en 0. Las entradas de CT y TC se estimularon (simultáneamente) y se registraron las CPSE y PPSE provocadas mínimas (cada una por debajo del umbral individualmente para el disparo del potencial de acción) en células nRT. La significación estadística se calculó usando ensayos t de dos colas pareados o no pareados, según corresponda. Los datos se analizaron usando el conjunto de herramientas Matlab Statistics o Microsoft Excel
Resultados
La estimulación mínima de axones TC provocó corrientes post-sinápticas excitadoras grandes y rápidas (CPSE) en las neuronas nRT, mientras que la estimulación mínima de axones CT provocó CPSEs pequeñas y lentas en las neuronas nRT (FIG. 5B), ambas son típicas de estas vías.
A continuación, se examinó la integración sináptica de las entradas CT y TC en condiciones de retardo variable entre estas dos entradas. Los PPSE por debajo de los umbrales de cada vía se convirtieron en un umbral superior para el disparo del potencial de acción solo cuando coincidían en 5 ms (FIG. 5C-D). La precisión temporal de la activación de C1V1 y ChR2 permitió un control fiable del retardo entre las entradas TC y CT y, por tanto, permitió la determinación de una ventana estrecha (-5 ms) de integración sináptica eficaz en las células nRT, no observable anteriormente con las características eléctricas, farmacológicas o técnicas optogenéticas existentes debido a la conectividad recíproca de la corteza y el tálamo, así como la estrecha aproximación de los axones CT y TC. Estos resultados demuestran por primera vez, en la misma preparación intacta, la activación independiente de distintas proyecciones axonales para examinar sus efectos combinatorios en la misma célula diana.
Ejemplo 6: Uso de C1V1 y SSFO para conseguir la separación espectrotemporal de la activación neural dentro del mismo circuito
En las dos preparaciones anteriores, se usaron láseres de espectro visible violeta (405 nm) y verde (560 nm) para conseguir la activación separable del dos opsinas. Aunque los láseres de 405 nm entregan luz no UV segura, para muchas aplicaciones puede ser preferible usar luz láser de 470 nm para la opsina que responde al azul, puesto que la luz de 470 nm penetrará en el tejido más profundamente, se dispersará menos y se entregará más fácil y económicamente desde fuentes de luz azul comunes. Aunque esto puede parecer imposible, puesto que la luz de 470 nm activará parcialmente C1V1 (FIG. 1G) así como ChR2, el control combinatorio podría conseguirse incluso con luz de 470 nm, aprovechando tanto las propiedades temporales de SSFO como la naturaleza de desplazamiento al rojo de C1V1 para conseguir la "separación espectrotemporal" dentro del tejido de mamífero intacto. Para someter a ensayo la presente posibilidad, se decidió comparar directamente, dentro de la misma preparación, los efectos sobre la actividad rítmica de potenciar de manera estable células excitadoras o inhibidoras (FIG. 6A).
Materiales y métodos
Se generaron ChR2-D156A y SSFO insertando mutaciones puntuales en el vector pLenti-CaMKIIa-ChR2-EYFP-WPRE usando mutagénesis dirigida al sitio (Quikchange II XL; Stratagene). La entrega de genes víricos, el corte cerebral coronal y el registro de pinzamientos zonal se realizaron como se ha indicado anteriormente. Se realizaron inyecciones de virus dobles para expresar CaMKIIa::C1V1 y DIO-SSFO en mPFC de ratones PV::Cre.
Mientras se manipulaban células o tejidos que expresaban SSFO, se tuvo cuidado de minimizar la exposición a la luz para evitar la activación por la luz ambiental. Antes de cada experimento, se aplicó un pulso de 20 s de luz de 590 nm para convertir todos los canales de SSFO en el estado oscuro y evitar la reducción de las fotocorrientes. Para la adquisición de espectros de activación y desactivación de SSFO, se realizaron registros de neuronas cultivadas en modo de pinzamiento de voltaje. Para registrar espectros de activación, se aplicó un pulso de 1 s de longitud de onda variable, seguido de un pulso de 10 s de 590 nm. Los espectros de desactivación se adquirieron aplicando en primer lugar un pulso de 1 s de 470 nm para activar SSFO, seguido de un pulso de 10 s de longitud de onda variable. La activación o desactivación de la red se calculó dividiendo el cambio de fotocorriente después del primer o segundo pulso, respectivamente, por el cambio máximo de fotocorriente inducido por la longitud de onda máxima para esa célula. Los valores negativos en los espectros de desactivación fueron resultado de trazos en los que, por ejemplo, un pulso de 10 s a 470 nm condujo a un ligero aumento de la fotocorriente en lugar de desactivar los canales. Esto podría ser el resultado del ancho del filtro de paso de banda relativamente amplio (20 nm) utilizado para estos registros con el Sutter DG-4. Se espera que las longitudes de onda intermedias (entre 470 nm y 520 nm) tengan un efecto mixto sobre la población del canal por las mismas razones.
Se realizaron cálculos de flujo de fotones para las propiedades de integración de SSFO calculando el flujo de fotones a través del objetivo del microscopio a cada potencia lumínica y después dividiéndolo para alcanzar el flujo de fotones a través de la superficie celular, según el diámetro de las células registradas y aproximando la forma aproximada de la célula a un esferoide.
Resultados
SSFO es una nueva canalrodopsina modificada por ingeniería genética múltiple con una constante de descomposición de 29 minutos que puede desactivarse de manera eficaz en las mismas longitudes de onda que activan C1V1 y permite una excitación biestable de las neuronas durante muchos minutos con una mayor sensibilidad a la luz. Puede encontrarse información sobre SSFO en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2010/056970 y en la Solicitud de Patente de los EE.UU. N.° 61/410.704 y 61/410.711. Se realizaron inyecciones dobles de virus para expresar CaMKIIa::C1V1 y DIO::SSFO en cortes agudos de mPFC de ratones PV::Cre. En estas condiciones, las células piramidales excitadoras deben responder a la luz de desplazamiento al rojo y las células PV inhibidoras a la luz azul. De hecho, en respuesta a un pulso de luz de 1 s de 470 nm para activar SSFO en las células PV, la velocidad de las CPSI en curso aumentó de manera estable de 8,5 ± 1,2 Hz en el momento basal (período 3, FIG. 6B) a 16,8 ± 2,1 Hz después del pulso de luz azul (período 2; n = 4 registros, p < 0,005, ensayo t pareado; FIG. 6C), demostrando la activación persistente de las células inhibidoras que expresan SSFO. A pesar de que la luz de 470 nm también activará de forma transitoria C1V1, la presente activación solo puede ocurrir durante el pulso de luz debido a la desactivación muy rápida de C1V1 después del apagado de la luz; el período posterior a la luz prolongado se caracteriza solamente por la actividad de SSFO (FIG.
6B), que ilustra la separación temporal de los modos de control optogenético. Curiosamente, durante este período prolongado de actividad elevada de la neurona PV, no se produjo ningún pico significativamente elevado en el espectro de potencia de la CPSI, lo que sugiere que la activación directa de las neuronas PV solas en esta preparación reducida es insuficiente para desencadenar la sincronía gamma en la red. Sin embargo, en marcado contraste, durante el pulso de luz de 470 nm cuando se espera el mismo nivel de activación de la neurona PV, pero también la activación parcial de células piramidales que expresan C1V1, se observó un pico gamma pronunciado (frecuencia máxima 39,2 ± 3,5 Hz; n = 4 registros) que se extendieron al intervalo gamma alto (> 60 Hz).
Además, en los mismos experimentos (de hecho, más tarde en los mismos barridos registrados), la activación directa en este caso de células piramidales de C1V1 solas con luz de 590 nm (que activa simultáneamente C1V1 en células PY y desactiva el SSFO en células PV) condujo a una sincronía gamma robusta, con un pico de frecuencia más bajo (26,6 ± 1 Hz, n = 6 registros). Demostrar que no fue necesaria ninguna actividad residual de la neurona PV asociada a la historia previa de activación de SSFO en células PV para este efecto, de lo contrario, barridos idénticos con solo una historia de activación de C1V1 en las células piramidales y ninguna historia previa de velocidad de CPSI elevada provocaron el mismo resultado). Estos resultados ilustran el principio integrado del control combinatorio espectrotemporal y también sugieren que la actividad elevada en las neuronas piramidales puede dar origen a oscilaciones gamma a través de las propiedades de red31. Curiosamente, durante el pulso de luz de 470 nm, cuando se esperaba la activación de células tanto PV como piramidales, se observó uniformemente sincronía gamma a frecuencias más altas que cuando solo se activaron neuronas excitadoras, apoyando y ampliando la información sobre la importancia coordinada de las células PV y piramidales en provocar oscilaciones gamma.31-33
Conclusión
En el curso de este trabajo, se generó una familia de nuevas herramientas que se denominan variantes C1V1. C1V1 es un gen de opsina desplazada al rojo ensamblado, en particular, a partir de fragmentos de otros genes de opsina que no se expresan bien solo en las neuronas, pero que se identificaron en búsquedas genómicas anteriores (VChR1 y RCP). C1V1 no contiene ninguna secuencia de ChR2 en absoluto, sin embargo, sus variantes modificadas por ingeniería genética múltiple notificadas en el presente documento ahora representan las canalrodopsinas más potentes, más desplazadas al rojo y más estables conocidas. La mutagénesis en posiciones clave de aminoácidos a lo largo del bolsillo de unión retiniano condujo a la generación de (1) C1V1(E162T), un gen de opsina desplazado al rojo de alta expresión generado como un homólogo rápido de la mutación ChETA; (2) C1V1(E122T) que muestra el hombro del espectro de acción más rojo e incluso puede usarse para disparar potenciales de acción con luz roja (3) C1V1(E122T/E162T) -un mutante combinado con la desensibilización inferior, la desactivación más rápida, la menor activación por luz violeta para la activación cruzada mínima con ChR2 y la expresión fuerte. De hecho, pueden seleccionarse variantes de C1V1 para diferentes aplicaciones basadas en las consideraciones del tamaño actual, la cinética de desactivación y el espectro de acción (Tabla 1), por ejemplo, en el trabajo con dos fotones, puesto que la activación de ChR2 por 2P ha sido difícil debido al tamaño de corriente y la cinética rápida del cierre del canal, es probable que C1V1(E162T) sea de interés. Las variantes de C1V1 permitieron el ensayo directo de la hipótesis de que niveles crecientes de equilibrio E/I celular elevado darían origen a intensidades crecientes del ritmo gamma, un fenómeno anteriormente vinculado a la esquizofrenia y al autismo. Por supuesto, las diferentes herramientas también son sinérgicas; el uso de variantes de C1V1 junto con ChR2 permitió el impulso fiable y separado de la propagación en las dos poblaciones neuronales distintas abordadas en este estudio, las neuronas piramidales excitadoras y las interneuronas inhibidoras que expresan parvalbúmina de aumento rápido, y confirman que el equilibrio constante de E/I celular fue eficaz en la generación de actividad de circuito de banda gamma, aprovechando las diferencias tanto cinéticas como espectrales en las herramientas optogenéticas. Este tipo de activación combinatoria puede extenderse más allá de múltiples tipos celulares a múltiples tipos de vías neurales, por ejemplo, la activación separable de los picos, dentro de una única región del cerebro, en dos vías aferentes axonales convergentes que surgen de distintas ubicaciones, un objetivo largamente buscado de sistemas de neurociencia.
Los ejemplos, que tienen por objeto ser puramente de ejemplo de la invención y, por tanto, no han de considerarse limitantes de la invención de ninguna manera, también describen y detallan aspectos y realizaciones de la invención analizada anteriormente. Los ejemplos anteriores y la descripción detallada se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación. Pueden implementarse juntas y/o de otras maneras diversas realizaciones descritas anteriormente y analizadas en los Apéndices adjuntos. También pueden implementarse uno o más de los aspectos de la presente divulgación y de los Apéndices de manera más separada o integrada, como debería ser evidente y es útil de acuerdo con aplicaciones específicas de destino. En particular, todas las publicaciones y apéndices citados en el presente documento tienen el fin de describir y desvelar composiciones y metodologías que podrían usarse en relación con la invención. Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y con fines de claridad de comprensión, será evidente para los expertos en la materia a la luz de contenido de la presente invención que pueden hacerse determinados cambios y modificaciones.
REFERENCIAS
Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods 8, 26-29 (2011).
Boyden, E.S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G. y Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci 8, 1263-1268 (2005).
Nagel, G. et al. Light activation of canalrodopsina-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol 15, 2279-2284 (2005).
Li, X. et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae canalrodopsina. Proc Natl Acad Sci USA 102, 17816-17821 (2005).
Bi, A. et al. Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration. Neuron 50, 23-33 (2006).
Schroll, C. et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol 16, 1741-1747 (2006).
Zhang, F. et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature 446, 633-639 (2007).
Douglass, A.D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A.F. y Engert, F. Escape behavior elicited by single, canalrodopsina-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr Biol 18, 1133-1137 (2008).
Hagglund, M., Borgius, L, Dougherty, K.J. y Kiehn, O. Activation of groups of excitatory neurons in the mammalian spinal cord or hindbrain evokes locomotion. Nature neuroscience 13, 246-252, doi:10.1038/nn.2482 (2010).
Huber, D. et al. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature 451,61-64 (2008).
Hira, R. et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods 179, 258-263 (2009).
Higley, M.J. y Sabatini, B.L. Competitive regulation of synaptic Ca2+ influx by D2 dopamine and A2A adenosine receptors. Nature neuroscience 13, 958-966, doi:10.1038/nn.2592 (2010).
Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A. y Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci 10, 663-668 (2007).
Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R. y Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci Res 54, 85-94 (2006).
Nagel, G. et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci USA 100, 13940-13945 (2003).
Rickgauer, J.P. y Tank, D.W. Two-photon excitation of canalrodopsina-2 at saturation. Proc Natl Arad Sci USA 106, 15025-15030 (2009).
Yonehara, K. et al. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature 469, 407-410, doi:10.1038/nature09711 (2011).
Yaroslavsky, A.N. et al. Optical properties of selected native and coagulated human brain tissues in vitro in the visible and near infrared spectral range. Phys Med Biol 47, 2059-2073 (2002).
Wang, H. et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two canalrodopsinas from chlamydomonas. J Biol Chem 284, 5685-5596 (2009).
Wen, L. et al. Opto-current-clamp actuation of cortical neurons using a strategically designed canalrodopsina. PLoS One 5, e12893 (2010).
Zhang, F. et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat Neurosci 11,631-633 (2008).
Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L.A., Hegemann, P. y Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat Neurosci 12, 229-234 (2009).
Barnann, C., Gueta, R., Kleinlogel, S., Nagel, G. y Bamberg, E. Structural guidance of the photocycle of canalrodopsina-2 by an interhelical hydrogen bond. Biochemistry 49, 267-278 (2010).
Schoenenberger, P., Gerosa, D. y Oertner, T.G. Temporal control of immediate early gene induction by light. PLoS One 4, e8185 (2009).
Stehfest, K., Ritter, E., Berndt, A., Bartl, F. y Hegernann, P. The branched photocycle of the slow-cycling canalrodopsina-2 mutant C128T. J Mol Biol 398, 690-702 (2010).
Sohal, V.S., Zhang, F., Yizhar, O. y Deisseroth, K. Parvalbumin neurons and gamma rhythms enhance cortical circuit performance. Nature 459, 698-702 (2009).
Lin, J.Y., Lin, M.Z., Steinbach, P. y Tsien, R.Y. Characterization of engineered canalrodopsina variants with
improved properties and kinetics. Biophys J 96, 1803-1814 (2009).
Gunaydin, L.A. et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci 13, 387-392 (2010).
Tittor, J., Schweiger, U., Oesterhelt, D. y Bamberg, E. Inversion of proton translocation in bacteriorhodopsin mutants D85N, D85T, and D85,96N. Biophys J 67, 1682-1690 (1994).
Sugiyama, Y. et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of canalrodopsina-2. Photochem Photobiol Sci 8, 328-336 (2009).
Adesnik, H. y Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature 464, 1155-1160 (2010).
Colgin, L.L. et al. Frequency of gamma oscillations routes flow of information in the hippocampus. Nature 462, 353-357 (2009).
Cardin, J.A. et al. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature 459, 663-667 (2009).
Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G. y Bamberg, E. Spectral characteristics of the photocycle of canalrodopsina-2 and its implication for channel function. J Mol Biol 375, 686-694 (2008).
SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 (secuencia de aminoácidos de C1V1 humanizado)
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVI
CIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMI
KFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGC
IVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWG
MFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQ
EMEVETLVAEEED SEQ ID NO: 2 (secuencia de nucleótido de C1V1 humanizado) atgtcgcgacgcccgtggctccttgctctcgcattggcggtggcgcttgcagcgggatcggcaggagcgtcaaccggaagcgatgcgaccgtccccgtggct acgcaagacggaccagattacgtgttccacagagcccacgagcggatgttgtttcagacatcatacacacttgaaaacaatggtagcgtcatttgcatccctaac aatgggcagtgtttttgcctggcctggttgaaatcgaacggtacgaacgccgagaagctggcggcgaacattctgcagtggatcacattcgcactctcggcgct ctgccttatgttctatggctaccagacttggaaatccacgtgtggttgggaagagatctacgtagcaaccattgaaatgatcaagtttatcattgagtatttccatgagt ttgacgaaccggccgtaatctactcatcgaatgggaataagacagtctggttgaggtatgcggagtggctcctcacctgcccggtccttctgatccatctgagcaa cctcacaggcctgaaggacgattatagcaaaaggactatgggcctgttggtttctgatgtgggatgcatcgtgtggggcgcaaccagcgccatgtgtacggggt ggacgaagatcctgttcttcctcatctcattgagctatggtatgtatacctattttcatgctgctaaagtttatatcgaagcattccacacagttccaaaagggatttgtc gagaactggtccgagtgatggcctggacattctttgtggcttggggaatgtttccagtcctgtttctgctgggcacggaaggattcggtcatatcagcccttatggat ctgccattgggcactccatcctcgacctgattgcaaagaacatgtggggtgtgctggggaattacctgcgcgtcaaaatccacgagcacatcctgttgtatggcg acatcagaaagaagcagaaaattacgatcgccggccaagagatggaggttgagacactggtggctgaagaggaggactaa
SEQ ID NO: 3 (secuencia de aminoácidos de C1V1 E122T humanizado)
MSRRPWLLALALAVAI.AAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHÍUHERMLFQTSY1LENNGSVICIPNNGQCFC
LAWIJKSNGrrNAEKLAA,N[[jQWITFALSALCLlVIFYGYGTWKErOGWETIYVATIEMIKFIÍEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTV
WLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRIMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWI’KILFFLISLSYGMYTYFHAAK
WIEAFHWPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSrLDLIAKNMWGVLGNYLRV KIHEHILLYGDÍRKKQKITrAGQEMEVETLVAEEED
SEQ ID NO: 4 (secuencia de nucleótido de C1V1 E122T humanizado)
atgtcgcgacgcccgtggctccttgctctcgcattggcggtggcgcttgcagcgggatcggcaggagcgtcaaccggaagcgatgcgaccgtccccgtggc tacgcaagacggaccagattacgtgttccacagagcccacgagcggatgttgtttcagacatcatacacacttgaaaacaatggtagcgtcatttgcatccctaa caatgggcagtgtttttgcctggcctggttgaaatcgaacggtacgaacgccgagaagctggcggcgaacattctgcagtggatcacattcgcactctcggcg ctctgccttatgttctatggctaccagacttggaaatccacgtgtggttgggaaaccatctacgtagcaaccattgaaatgatcaagtttatcattgagtatttccatg agtttgacgaaccggccgtaatctactcatcgaatgggaataagacagtctggttgaggtatgcggagtggctcctcacctgcccggtccttctgatccatctga gcaacctcacaggcctgaaggacgattatagcaaaaggactatgggcctgttggtttctgatgtgggatgcatcgtgtggggcgcaaccagcgccatgtgtac ggggtggacgaagatectgttcttcctcatctcattgagctatggtatgtatacctattttcatgctgctaaagtttatatcgaagcattccacacagttccaaaaggg atttgtcgagaactggtccgagtgatggcctggacattctttgtggcttggggaatgtttccagtcctgtttctgctgggcacggaaggattcggtcatatcagccc ttatggatctgccattgggcactccatcctcgacctgattgcaaagaacatgtggggtgtgctggggaattacctgcgcgtcaaaatccacgagcacatcctgtt gtatggcgacatcagaaagaagcagaaaattacgatcgccggccaagagatggaggttgagacactggtggctgaagaggaggactaa
SEQ ID NO: 5 (secuencia de aminoácidos de C1V1 E162T humanizado)
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVI CIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMI KFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGC IVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWG MFP VLFLLGTEGF GHISPYGS AIGHSILDLIAKNM W G VLGN YLRVKIFIEHILLY GDIRKKQKITIAGQ EMEVETLVAEEED SEQ ID NO: 6 (secuencia de nucleótido de C1V1 E162T humanizado)
atgtcgcgacgcccgtggctccttgctctcgcattggcggtggcgcttgcagcgggatcggcaggagcgtcaaccggaagcgatgcgaccgtccccgtggct acgcaagacggaccagattacgtgttccacagagcccacgagcggatgttgtttcagacatcatacacacttgaaaacaatggtagcgtcatttgcatccctaac aatgggcagtgtttttgcctggcctggttgaaatcgaacggtacgaacgccgagaagctggcggcgaacattctgcagtggatcacattcgcactctcggcgct ctgccttatgttctatggctaccagacttggaaatccacgtgtggttgggaagagatctacgtagcaaccattgaaatgatcaagtttatcattgagtatttccatgagt ttgacgaaccggccgtaatctactcatcgaatgggaataagacagtctggttgaggtatgcgacgtggctcctcacctgcccggtccttctgatccatctgagcaa cctcacaggcctgaaggacgattatagcaaaaggactatgggcctgttggtttctgatgtgggatgcatcgtgtggggcgcaaccagcgccatgtgtacggggt ggacgaagatcctgttcttcctcatctcattgagctatggtatgtatacctattttcatgctgctaaagtttatatcgaagcattccacacagttccaaaagggatttgtc gagaactggtccgagtgatggcctggacattctttgtggcttggggaatgtttccagtcctgtttctgctgggcacggaaggattcggtcatatcagcccttatggat ctgccattgggcactccatcctcgacctgattgcaaagaacatgtggggtgtgctggggaattacctgcgcgtcaaaatccacgagcacatcctgttgtatggcg acatcagaaagaagcagaaaattacgatcgccggccaagagatggaggttgagacactggtggctgaagaggaggactaa
SEQ ID NO: 7 (secuencia de aminoácidos de C1V1 E122T/E162T humanizado)
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVI CIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWETIYVATIEMI KFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGC IVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWG MFP VLFLLGTEGFGHISP Y GS AIGHSILDLIAKNM W G VLGN YLRVKIFIEHILLY GDIRKKQKITIAGQ EMEVETLVAEEED
SEQ ID NO: 8 (secuencia de nucleótido de C1V1 E122T/E162T humanizado) atgtcgcgacgcccgtggctccttgctctcgcattggcggtggcgcttgcagcgggatcggcaggagcgtcaaccggaagcgatgcgaccgtccccgtggct acgcaagacggaccagattacgtgttccacagagcccacgagcggatgttgtttcagacatcatacacacttgaaaacaatggtagcgtcatttgcatccctaac aatgggcagtgtttttgcctggcctggttgaaatcgaacggtacgaacgccgagaagctggcggcgaacattctgcagtggatcacattcgcactctcggcgct ctgccttatgttctatggctaccagacttggaaatccacgtgtggttgggaaaccatctacgtagcaaccattgaaatgatcaagtttatcattgagtatttccatgagt ttgacgaaccggccgtaatctactcatcgaatgggaataagacagtctggttgaggtatgcgacgtggctcctcacctgcccggtccttctgatccatctgagcaa cctcacaggcctgaaggacgattatagcaaaaggactatgggcctgttggtttctgatgtgggatgcatcgtgtggggcgcaaccagcgccatgtgtacggggt ggacgaagatcctgttcttcctcatctcattgagctatggtatgtatacctattttcatgctgctaaagtttatatcgaagcattccacacagttccaaaagggatttgtc gagaactggtccgagtgatggcctggacattctttgtggcttggggaatgtttccagtcctgtttctgctgggcacggaaggattcggtcatatcagcccttatggat
ctgccattgggcactccatcctcgacctgattgcaaagaacatgtggggtgtgctggggaattacctgcgcgtcaaaatccacgagcacatcctgttgtatggcg acatcagaaagaagcagaaaattacgatcgccggccaagagatggaggttgagacactggtggctgaagaggaggactaa
SEQ ID NO: 9 (secuencia de aminoácidos de C1V1 humanizado alternativo (C1V1_25)) MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVAl'QDOPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVrCIPNNGQCF CLAWLKSNGTNAEKI.AANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPATLWLS SGNGVWMRYGEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYG MYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNM WGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVIÍTLVAEEED SEQ ID NO: 10 (secuencia de nucleótido de C1V1 humanizado alternativo (C1V1_25)) Atgagcagacggccctggctgctggccctggctctcgctgtggccctggccgccggcagcgccggagccagcaccggcagcgacgccaccgtgcccgtt gccacacaggacggccccgactacgtgttccaccgggcccacgagcggatgctgttccagaccagctacacccttgaaaacaacggcagcgtgatctgcatc cccaacaacggccagtgcttctgcctggcctggctgaagtccaacggcaccaacgccgagaagctggccgccaacatcctgcagtggatcaccttcgccctg tctgccctgtgcctgatgttctacggctaccagacctggaagtccacctgcggctgggaggaaatctacgtggccaccatcgagatgatcaagttcatcatcgag tacttccacgagttcgacgagcccgccaccctgtggctgtccagcggaaacggcgtggtgtggatgagatacggcgagtggctgctgacctgccctgtgctgc tgatccacctgagcaacctgaccggactgaaggatgactacagcaagagaaccatgggactgctggtgtccgatgtgggatgcatcgtgtggggagccacct ccgccatgtgcaccggatggaccaagatcctgttcttcctgatcagcctgagctacggaatgtacacctacttccacgccgccaaggtgtacattgaggcctttca caccgtgcctaagggaatctgcagagaactggtcagagtgatggcctggaccttcttcgtggcctggggaatgttccctgtgctgttcctgctgggaaccgagg gattcggacacatcagcccttacggaagcgccatcggacacagcatcctggatctgatcgccaagaacatgtggggagtgctgggaaactacctgagagtga agatccacgagcacatcctgctgtacggcgacatcagaaagaagcagaagatcaccatcgccggacaggaaatggaagtcgagaccctggtggccgagga agaggat
SEQ ID NO: 11 secuencia de aminoácidos de ChR2
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAA
GFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLR
YAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCL
GLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVL
SVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLV
EDEAEAGAVP
SEQ ID NO: 12 ChR2(H134R)
MDYGGALSAVGRELLFVTNPWVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAA
GFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLR
YAEWLLTCPVILIRLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCL
GLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVL
SVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLV
EDEAEAGAVP
SEQ ID NO: 13 SFO
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVWNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILL LMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILI HLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGY HTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYL RVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVP
SEQ ID NO: 14 (SSFO)
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILL LMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILI HLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSAIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGY HTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYL RVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVP
Claims (7)
1. Un polipéptido quimérico activado por luz que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene más del 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 1, en donde el polipéptido es sensible a la luz y es capaz de mediar una corriente de despolarización en una célula cuando la célula se ilumina con luz.
2. El polipéptido quimérico de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una señal de tráfico C-terminal.
3. El polipéptido quimérico de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el polipéptido quimérico activado por luz comprende una secuencia de aminoácidos que tiene más del 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 1.
4. El polipéptido quimérico de la reivindicación 3, que comprende la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.
5. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Una célula de mamífero que expresa el polipéptido quimérico activado por luz de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el polipéptido quimérico activado por luz está presente en la membrana celular.
7. Un método in vitro de uso de la célula de la reivindicación 6, que comprende activar con luz la proteína activada por luz.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41074410P | 2010-11-05 | 2010-11-05 | |
| US41073610P | 2010-11-05 | 2010-11-05 | |
| US201161511912P | 2011-07-26 | 2011-07-26 | |
| PCT/US2011/059276 WO2012061679A2 (en) | 2010-11-05 | 2011-11-04 | Light-activated chimeric opsins and methods of using the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2716819T3 true ES2716819T3 (es) | 2019-06-17 |
Family
ID=46024835
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES11838855T Active ES2716819T3 (es) | 2010-11-05 | 2011-11-04 | Opsinas quiméricas activadas por luz y métodos de uso de las mismas |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US9175095B2 (es) |
| EP (2) | EP2635108B1 (es) |
| JP (3) | JP6276591B2 (es) |
| CN (2) | CN106947741A (es) |
| AU (1) | AU2011323226B2 (es) |
| CA (1) | CA2816971A1 (es) |
| ES (1) | ES2716819T3 (es) |
| WO (2) | WO2012061679A2 (es) |
Families Citing this family (64)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9274099B2 (en) | 2005-07-22 | 2016-03-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Screening test drugs to identify their effects on cell membrane voltage-gated ion channel |
| US9238150B2 (en) | 2005-07-22 | 2016-01-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optical tissue interface method and apparatus for stimulating cells |
| US8926959B2 (en) | 2005-07-22 | 2015-01-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
| US10052497B2 (en) | 2005-07-22 | 2018-08-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
| US8906360B2 (en) | 2005-07-22 | 2014-12-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Light-activated cation channel and uses thereof |
| US8398692B2 (en) | 2007-01-10 | 2013-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
| US8401609B2 (en) | 2007-02-14 | 2013-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System, method and applications involving identification of biological circuits such as neurological characteristics |
| WO2008106694A2 (en) | 2007-03-01 | 2008-09-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells |
| US10434327B2 (en) | 2007-10-31 | 2019-10-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Implantable optical stimulators |
| US10035027B2 (en) | 2007-10-31 | 2018-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Device and method for ultrasonic neuromodulation via stereotactic frame based technique |
| EP3165534B1 (en) | 2008-04-23 | 2018-09-26 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells |
| US8729040B2 (en) | 2008-05-29 | 2014-05-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Cell line, system and method for optical control of secondary messengers |
| MY162929A (en) | 2008-06-17 | 2017-07-31 | Univ Leland Stanford Junior | Apparatus and methods for controlling cellular development |
| AU2009260029B2 (en) | 2008-06-17 | 2016-03-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods, systems and devices for optical stimulation of target cells using an optical transmission element |
| WO2010006049A1 (en) | 2008-07-08 | 2010-01-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Materials and approaches for optical stimulation of the peripheral nervous system |
| NZ602416A (en) | 2008-11-14 | 2014-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Optically-based stimulation of target cells and modifications thereto |
| WO2011116238A2 (en) | 2010-03-17 | 2011-09-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University. | Light-sensitive ion-passing molecules |
| EP2635346B1 (en) | 2010-11-05 | 2017-03-29 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Optogenetic control of reward-related behaviors |
| CA2816990A1 (en) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Stabilized step function opsin proteins and methods of using the same |
| WO2012061690A2 (en) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optically-controlled cns dysfunction |
| ES2690172T3 (es) | 2010-11-05 | 2018-11-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Conversión ascendente de la luz para su uso en métodos optogenéticos |
| WO2012061679A2 (en) * | 2010-11-05 | 2012-05-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Light-activated chimeric opsins and methods of using the same |
| US10086012B2 (en) | 2010-11-05 | 2018-10-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Control and characterization of memory function |
| CN106267236A (zh) * | 2010-11-05 | 2017-01-04 | 斯坦福大学托管董事会 | 精神病状态的控制和表征 |
| US8696722B2 (en) | 2010-11-22 | 2014-04-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic magnetic resonance imaging |
| WO2013016392A1 (en) | 2011-07-25 | 2013-01-31 | Neuronexus Technologies, Inc. | Neuromodulation transfection system with passive fluid delivery |
| WO2013016391A1 (en) | 2011-07-25 | 2013-01-31 | Neuronexus Technologies, Inc. | Neuromodulation transfection system with means for active fluid delivery and a method for its use |
| US9782091B2 (en) | 2011-07-25 | 2017-10-10 | Neuronexus Technologies, Inc. | Opto-electrical device for artifact reduction |
| US8759492B2 (en) * | 2011-08-17 | 2014-06-24 | The Regents Of The University Of California | Engineered red-shifted channelrhodopsin variants |
| EP2776455B1 (en) | 2011-11-12 | 2018-01-10 | Massachusetts Institute of Technology | Channelrhodopsins for optical control of cells |
| CA3036859A1 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Opsin polypeptides and methods of use thereof |
| ES2728077T3 (es) | 2012-02-21 | 2019-10-22 | Univ Leland Stanford Junior | Composiciones para el tratamiento de trastornos neurogénicos del suelo pélvico |
| US9636380B2 (en) * | 2013-03-15 | 2017-05-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic control of inputs to the ventral tegmental area |
| US10974064B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-04-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic control of behavioral state |
| WO2014179331A2 (en) | 2013-04-29 | 2014-11-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Devices, systems and methods for optogenetic modulation of action potentials in target cells |
| JP6621747B2 (ja) | 2013-08-14 | 2019-12-18 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 疼痛を制御するための組成物及び方法 |
| JP6118239B2 (ja) * | 2013-11-29 | 2017-04-19 | 雅敏 堀 | 害虫の防除方法及び防除装置 |
| US10039934B2 (en) * | 2013-12-30 | 2018-08-07 | PhotonEdge Inc. | Multi-wavelength interleaved optical stimulation |
| US10392426B2 (en) | 2014-02-07 | 2019-08-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Blue-light-activated ion channel polypeptides and uses thereof |
| AU2015237265A1 (en) | 2014-03-28 | 2016-10-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Engineered light-activated anion channel proteins and methods of use thereof |
| US10882892B2 (en) | 2014-08-05 | 2021-01-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Channelrhodopsin variants and uses thereof |
| US10542961B2 (en) | 2015-06-15 | 2020-01-28 | The Research Foundation For The State University Of New York | System and method for infrasonic cardiac monitoring |
| US10568516B2 (en) | 2015-06-22 | 2020-02-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and devices for imaging and/or optogenetic control of light-responsive neurons |
| US11801301B2 (en) * | 2015-09-15 | 2023-10-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Light-responsive polypeptides and methods of use thereof |
| US10324080B2 (en) * | 2015-11-17 | 2019-06-18 | Purdue Research Foundation | Systems and methods for automated image-guided patch-clamp electrophysiology in vitro |
| DK3383482T3 (da) * | 2015-11-24 | 2023-04-11 | Massachusetts Inst Technology | Systemer og fremgangsmåder til forebyggelse, mildnelse og/eller behandling af demens |
| CN109640949B (zh) | 2016-07-29 | 2022-11-25 | 加利福尼亚大学董事会 | 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体和其使用方法 |
| CN117701604A (zh) | 2016-09-02 | 2024-03-15 | 学校法人庆应义塾 | 视觉功能再生剂或视觉功能降低预防剂 |
| AU2017372351B2 (en) * | 2016-11-06 | 2019-12-12 | Nanoscope Technologies Llc | Optogenetic modulation by multi-characteristic opsins for vision restoration and other applications thereof |
| US11294165B2 (en) | 2017-03-30 | 2022-04-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Modular, electro-optical device for increasing the imaging field of view using time-sequential capture |
| EP3608375B1 (en) | 2017-04-03 | 2024-03-13 | FUJIFILM Corporation | Ink composition, production method therefor, and image formation method |
| US11723579B2 (en) | 2017-09-19 | 2023-08-15 | Neuroenhancement Lab, LLC | Method and apparatus for neuroenhancement |
| JP2020536653A (ja) | 2017-10-10 | 2020-12-17 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 認知症の予防、緩和および／または治療のためのシステムならびに方法 |
| US11717686B2 (en) | 2017-12-04 | 2023-08-08 | Neuroenhancement Lab, LLC | Method and apparatus for neuroenhancement to facilitate learning and performance |
| WO2019133997A1 (en) | 2017-12-31 | 2019-07-04 | Neuroenhancement Lab, LLC | System and method for neuroenhancement to enhance emotional response |
| US11364361B2 (en) | 2018-04-20 | 2022-06-21 | Neuroenhancement Lab, LLC | System and method for inducing sleep by transplanting mental states |
| US11452839B2 (en) | 2018-09-14 | 2022-09-27 | Neuroenhancement Lab, LLC | System and method of improving sleep |
| WO2020072427A1 (en) * | 2018-10-01 | 2020-04-09 | Cornell University | Kits and methods for performing optical dynamic clamp on excitable cells |
| IL265486A (en) | 2019-03-19 | 2020-09-30 | Yeda Res & Dev | Bistable type ii opsins and uses thereof |
| EP4029521A4 (en) * | 2019-09-13 | 2023-09-06 | Restore Vision Inc. | CONSTRUCTION OF NUCLEIC ACIDS ENCODING CHIMERIC RHODOPSIN |
| US11771741B2 (en) | 2019-09-13 | 2023-10-03 | Restore Vision Inc. | Nucleic acid construct that encodes chimeric rhodopsin |
| WO2021066053A1 (ja) * | 2019-09-30 | 2021-04-08 | 国立大学法人筑波大学 | 冬眠様状態を誘発する方法およびそのための装置 |
| EP4130271A4 (en) * | 2020-03-24 | 2024-03-06 | National Univ Corporation Iwate Univ | MODIFIED RHODOPSIN CHANNEL |
| WO2024092248A1 (en) * | 2022-10-28 | 2024-05-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enhanced light gated potassium selective channelrhodopsin |
Family Cites Families (306)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2968302A (en) | 1956-07-20 | 1961-01-17 | Univ Illinois | Multibeam focusing irradiator |
| US3131690A (en) | 1962-10-22 | 1964-05-05 | American Optical Corp | Fiber optics devices |
| US3499437A (en) | 1967-03-10 | 1970-03-10 | Ultrasonic Systems | Method and apparatus for treatment of organic structures and systems thereof with ultrasonic energy |
| US3567847A (en) | 1969-01-06 | 1971-03-02 | Edgar E Price | Electro-optical display system |
| US4162808A (en) | 1978-05-23 | 1979-07-31 | Gulf Oil Corporation | In-situ retorting of carbonaceous deposits |
| US4343301A (en) | 1979-10-04 | 1982-08-10 | Robert Indech | Subcutaneous neural stimulation or local tissue destruction |
| US4559951A (en) | 1982-11-29 | 1985-12-24 | Cardiac Pacemakers, Inc. | Catheter assembly |
| US4616231A (en) | 1984-03-26 | 1986-10-07 | Hughes Aircraft Company | Narrow-band beam steering system |
| US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| FR2580277B1 (fr) | 1985-04-15 | 1988-06-10 | Oreal | Nouveaux derives naphtaleniques a action retinoique, le ur procede de preparation et compositions medicamenteuse et cosmetique les contenant |
| US4865042A (en) | 1985-08-16 | 1989-09-12 | Hitachi, Ltd. | Ultrasonic irradiation system |
| US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
| DE68916080T2 (de) | 1988-03-28 | 1994-09-22 | Canon Kk | Ionenpermeable Membran und Ionentransportverfahren unter Verwendung dieser Membran. |
| US5082670A (en) | 1988-12-15 | 1992-01-21 | The Regents Of The University Of California | Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage or the central nervous system |
| JP2882818B2 (ja) | 1989-09-08 | 1999-04-12 | 株式会社エス・エル・ティ・ジャパン | レーザ光の照射装置 |
| CA2028261C (en) | 1989-10-28 | 1995-01-17 | Won Suck Yang | Non-invasive method and apparatus for measuring blood glucose concentration |
| US5032123A (en) | 1989-12-28 | 1991-07-16 | Cordis Corporation | Laser catheter with radially divergent treatment beam |
| AU7906691A (en) | 1990-05-23 | 1991-12-10 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
| US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
| ES2109336T3 (es) | 1990-11-26 | 1998-01-16 | Genetics Inst | Expresion de pace en celulas huesped y metodos de utilizacion de la misma. |
| US5550316A (en) | 1991-01-02 | 1996-08-27 | Fox Chase Cancer Center | Transgenic animal model system for human cutaneous melanoma |
| US6497872B1 (en) | 1991-07-08 | 2002-12-24 | Neurospheres Holdings Ltd. | Neural transplantation using proliferated multipotent neural stem cells and their progeny |
| US5249575A (en) | 1991-10-21 | 1993-10-05 | Adm Tronics Unlimited, Inc. | Corona discharge beam thermotherapy system |
| US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
| SE9103752D0 (sv) | 1991-12-18 | 1991-12-18 | Astra Ab | New compounds |
| US5670113A (en) | 1991-12-20 | 1997-09-23 | Sibia Neurosciences, Inc. | Automated analysis equipment and assay method for detecting cell surface protein and/or cytoplasmic receptor function using same |
| US5739273A (en) | 1992-02-12 | 1998-04-14 | Yale University | Transmembrane polypeptide and methods of use |
| US5460954A (en) | 1992-04-01 | 1995-10-24 | Cheil Foods & Chemicals, Inc. | Production of human proinsulin using a novel vector system |
| US5330515A (en) | 1992-06-17 | 1994-07-19 | Cyberonics, Inc. | Treatment of pain by vagal afferent stimulation |
| US5382516A (en) | 1992-09-15 | 1995-01-17 | Schleicher & Schuell, Inc. | Method and devices for delivery of substrate for the detection of enzyme-linked, membrane-based binding assays |
| US5527695A (en) | 1993-01-29 | 1996-06-18 | Purdue Research Foundation | Controlled modification of eukaryotic genomes |
| PL176653B1 (pl) | 1993-03-25 | 1999-07-30 | The Regents Of The University Of California | Wektor ekspresyjny i sposób otrzymywania polipeptydów heterologicznych w komórkach Halobacteria |
| JP3128386B2 (ja) | 1993-04-07 | 2001-01-29 | 三洋電機株式会社 | 神経モデル素子 |
| US5411540A (en) | 1993-06-03 | 1995-05-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Method and apparatus for preferential neuron stimulation |
| GB2278783A (en) | 1993-06-11 | 1994-12-14 | Daniel Shellon Gluck | Method of magnetically stimulating neural cells |
| US6346101B1 (en) | 1993-07-19 | 2002-02-12 | Research Foundation Of City College Of New York | Photon-mediated introduction of biological materials into cells and/or cellular components |
| US5445608A (en) | 1993-08-16 | 1995-08-29 | James C. Chen | Method and apparatus for providing light-activated therapy |
| JPH07171162A (ja) | 1993-09-07 | 1995-07-11 | Olympus Optical Co Ltd | レーザプローブ |
| US6251100B1 (en) | 1993-09-24 | 2001-06-26 | Transmedica International, Inc. | Laser assisted topical anesthetic permeation |
| US5470307A (en) | 1994-03-16 | 1995-11-28 | Lindall; Arnold W. | Catheter system for controllably releasing a therapeutic agent at a remote tissue site |
| DE69535703T2 (de) | 1994-04-13 | 2009-02-19 | The Rockefeller University | AAV-vermittelte Zufuhr von DNA an Zellen des Nervensystems |
| US6436908B1 (en) | 1995-05-30 | 2002-08-20 | Duke University | Use of exogenous β-adrenergic receptor and β-adrenergic receptor kinase gene constructs to enhance myocardial function |
| US5495541A (en) | 1994-04-19 | 1996-02-27 | Murray; Steven C. | Optical delivery device with high numerical aperture curved waveguide |
| US5503737A (en) | 1994-07-25 | 1996-04-02 | Ingersoll-Rand Company | Air inflow restrictor for disc filters |
| US5807285A (en) | 1994-08-18 | 1998-09-15 | Ethicon-Endo Surgery, Inc. | Medical applications of ultrasonic energy |
| US5520188A (en) | 1994-11-02 | 1996-05-28 | Focus Surgery Inc. | Annular array transducer |
| US6334846B1 (en) | 1995-03-31 | 2002-01-01 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Ultrasound therapeutic apparatus |
| US5795581A (en) | 1995-03-31 | 1998-08-18 | Sandia Corporation | Controlled release of molecular components of dendrimer/bioactive complexes |
| WO1996032076A1 (en) | 1995-04-11 | 1996-10-17 | Baxter Internatonal Inc. | Tissue implant systems |
| US6342379B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-01-29 | The Regents Of The University Of California | Detection of transmembrane potentials by optical methods |
| US6480743B1 (en) | 2000-04-05 | 2002-11-12 | Neuropace, Inc. | System and method for adaptive brain stimulation |
| US5755750A (en) | 1995-11-13 | 1998-05-26 | University Of Florida | Method and apparatus for selectively inhibiting activity in nerve fibers |
| US5722426A (en) | 1996-02-26 | 1998-03-03 | Kolff; Jack | Coronary light probe and method of use |
| US5703985A (en) | 1996-04-29 | 1997-12-30 | Eclipse Surgical Technologies, Inc. | Optical fiber device and method for laser surgery procedures |
| US5898058A (en) | 1996-05-20 | 1999-04-27 | Wellman, Inc. | Method of post-polymerization stabilization of high activity catalysts in continuous polyethylene terephthalate production |
| US5939320A (en) | 1996-05-20 | 1999-08-17 | New York University | G-coupled receptors associated with macrophage-trophic HIV, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US20040076613A1 (en) | 2000-11-03 | 2004-04-22 | Nicholas Mazarakis | Vector system |
| US7732129B1 (en) | 1998-12-01 | 2010-06-08 | Crucell Holland B.V. | Method for the production and purification of adenoviral vectors |
| US5741316A (en) | 1996-12-02 | 1998-04-21 | Light Sciences Limited Partnership | Electromagnetic coil configurations for power transmission through tissue |
| US5756351A (en) | 1997-01-13 | 1998-05-26 | The Regents Of The University Of California | Biomolecular optical sensors |
| US5782896A (en) | 1997-01-29 | 1998-07-21 | Light Sciences Limited Partnership | Use of a shape memory alloy to modify the disposition of a device within an implantable medical probe |
| US5904659A (en) | 1997-02-14 | 1999-05-18 | Exogen, Inc. | Ultrasonic treatment for wounds |
| EP0969876A2 (en) | 1997-04-17 | 2000-01-12 | Paola Leone | Delivery system for gene therapy to the brain |
| US5816256A (en) | 1997-04-17 | 1998-10-06 | Bioanalytical Systems, Inc. | Movement--responsive system for conducting tests on freely-moving animals |
| US7276488B2 (en) | 1997-06-04 | 2007-10-02 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Vector system |
| US5984861A (en) | 1997-09-29 | 1999-11-16 | Boston Scientific Corporation | Endofluorescence imaging module for an endoscope |
| ES2557997T3 (es) | 1997-09-05 | 2016-02-01 | Genzyme Corporation | Métodos para generar preparados de vectores AAV de título elevado sin virus auxiliar |
| US6566118B1 (en) | 1997-09-05 | 2003-05-20 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
| US6989264B2 (en) | 1997-09-05 | 2006-01-24 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
| US6016449A (en) | 1997-10-27 | 2000-01-18 | Neuropace, Inc. | System for treatment of neurological disorders |
| US6597954B1 (en) | 1997-10-27 | 2003-07-22 | Neuropace, Inc. | System and method for controlling epileptic seizures with spatially separated detection and stimulation electrodes |
| US6647296B2 (en) | 1997-10-27 | 2003-11-11 | Neuropace, Inc. | Implantable apparatus for treating neurological disorders |
| US6790652B1 (en) | 1998-01-08 | 2004-09-14 | Bioimage A/S | Method and apparatus for high density format screening for bioactive molecules |
| US6289229B1 (en) | 1998-01-20 | 2001-09-11 | Scimed Life Systems, Inc. | Readable probe array for in vivo use |
| EP1091685B1 (en) | 1998-04-07 | 2008-06-11 | Cytyc Corporation | Devices for the localization of lesions in solid tissue |
| US6319241B1 (en) | 1998-04-30 | 2001-11-20 | Medtronic, Inc. | Techniques for positioning therapy delivery elements within a spinal cord or a brain |
| US6108081A (en) | 1998-07-20 | 2000-08-22 | Battelle Memorial Institute | Nonlinear vibrational microscopy |
| WO2000011155A1 (en) | 1998-08-19 | 2000-03-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for genomic modification |
| US6377842B1 (en) | 1998-09-22 | 2002-04-23 | Aurora Optics, Inc. | Method for quantitative measurement of fluorescent and phosphorescent drugs within tissue utilizing a fiber optic probe |
| US6253109B1 (en) | 1998-11-05 | 2001-06-26 | Medtronic Inc. | System for optimized brain stimulation |
| AU1344100A (en) | 1998-11-06 | 2000-05-29 | University Of Rochester | A method to improve circulation to ischemic tissue |
| US6303362B1 (en) | 1998-11-19 | 2001-10-16 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Adenoviral vector and methods for making and using the same |
| US6790657B1 (en) | 1999-01-07 | 2004-09-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Lentivirus vector system |
| US7507545B2 (en) | 1999-03-31 | 2009-03-24 | Cardiome Pharma Corp. | Ion channel modulating activity method |
| US6224566B1 (en) | 1999-05-04 | 2001-05-01 | Cardiodyne, Inc. | Method and devices for creating a trap for confining therapeutic drugs and/or genes in the myocardium |
| US6161045A (en) | 1999-06-01 | 2000-12-12 | Neuropace, Inc. | Method for determining stimulation parameters for the treatment of epileptic seizures |
| US7655423B2 (en) | 1999-06-14 | 2010-02-02 | Henry Ford Health System | Nitric oxide donors for inducing neurogenesis |
| US6662039B2 (en) | 1999-06-18 | 2003-12-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Optical probing of neuronal connections with fluorescent indicators |
| US20040034882A1 (en) | 1999-07-15 | 2004-02-19 | Vale Wylie W. | Corticotropin releasing factor receptor 2 deficient mice and uses thereof |
| US7674463B1 (en) | 1999-07-15 | 2010-03-09 | Research Development Foundation | Method of inhibiting angiogenesis by administration of a corticotropin releasing factor receptor 2 agonist |
| EP1207788A4 (en) | 1999-07-19 | 2009-12-09 | St Jude Medical Atrial Fibrill | FABRIC ABLATION TECHNIQUES AND CORRESPONDING DEVICE |
| ES2152900B1 (es) | 1999-07-23 | 2001-08-16 | Palleja Xavier Estivill | Ratones transgenicos y modelo de sobreexpresion del gen ntrk3 (trkc) basado en los mismos para el estudio y monitorizacion de tratamientos de la ansiedad, depresion y enfermedades psiquiatricas relacionadas. |
| US6780490B1 (en) | 1999-08-06 | 2004-08-24 | Yukadenshi Co., Ltd. | Tray for conveying magnetic head for magnetic disk |
| ES2308989T3 (es) | 1999-08-09 | 2008-12-16 | Targeted Genetics Corporation | Aumento de la expresion de una secuencia nucleotidica heterologa a partir de vectores viricos recombinantes que contienen una secuencia que forman pares de bases intracatenarios. |
| GB9923558D0 (en) | 1999-10-05 | 1999-12-08 | Oxford Biomedica Ltd | Producer cell |
| GB9928248D0 (en) | 1999-12-01 | 2000-01-26 | Gill Steven S | An implantable guide tube for neurosurgery |
| ATE291737T1 (de) | 2000-01-14 | 2005-04-15 | Migenix Corp | Screening-assays unter verwendung von intramitochondrialem kalzium |
| US7706882B2 (en) | 2000-01-19 | 2010-04-27 | Medtronic, Inc. | Methods of using high intensity focused ultrasound to form an ablated tissue area |
| US6595934B1 (en) | 2000-01-19 | 2003-07-22 | Medtronic Xomed, Inc. | Methods of skin rejuvenation using high intensity focused ultrasound to form an ablated tissue area containing a plurality of lesions |
| WO2001061049A1 (en) | 2000-02-18 | 2001-08-23 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Altered recombinases for genome modification |
| US6473639B1 (en) | 2000-03-02 | 2002-10-29 | Neuropace, Inc. | Neurological event detection procedure using processed display channel based algorithms and devices incorporating these procedures |
| WO2001083729A2 (en) | 2000-05-01 | 2001-11-08 | Novartis Ag | Vectors for ocular transduction and use thereof for genetic therapy |
| US6599281B1 (en) | 2000-05-03 | 2003-07-29 | Aspect Medical Systems, Inc. | System and method for adaptive drug delivery |
| US6551346B2 (en) | 2000-05-17 | 2003-04-22 | Kent Crossley | Method and apparatus to prevent infections |
| US7250294B2 (en) | 2000-05-17 | 2007-07-31 | Geron Corporation | Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells |
| AU2001268149B2 (en) | 2000-06-01 | 2005-08-18 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compounds for controlled release of recombinant parvovirus vectors |
| AU2001271839A1 (en) | 2000-07-05 | 2002-01-14 | Pharmacia And Upjohn Company | Human ion channels |
| US7399599B2 (en) | 2000-07-10 | 2008-07-15 | Vertex Pharmaceuticals (San Diego) Llc | Ion channel assay methods |
| WO2002013906A1 (en) | 2000-08-16 | 2002-02-21 | Vanderbilt University | Methods and devices for optical stimulation of neural tissues |
| US6567690B2 (en) | 2000-10-16 | 2003-05-20 | Cole Giller | Method and apparatus for probe localization in brain matter |
| US6536440B1 (en) | 2000-10-17 | 2003-03-25 | Sony Corporation | Method and system for generating sensory data onto the human neural cortex |
| US6584357B1 (en) | 2000-10-17 | 2003-06-24 | Sony Corporation | Method and system for forming an acoustic signal from neural timing difference data |
| US7350522B2 (en) | 2000-10-17 | 2008-04-01 | Sony Corporation | Scanning method for applying ultrasonic acoustic data to the human neural cortex |
| US20020106327A1 (en) | 2000-11-15 | 2002-08-08 | Brian Storrie | B/b-like fragment targeting for the purposes of photodynamic therapy and medical imaging |
| US6506154B1 (en) | 2000-11-28 | 2003-01-14 | Insightec-Txsonics, Ltd. | Systems and methods for controlling a phased array focused ultrasound system |
| SE525540C2 (sv) | 2000-11-30 | 2005-03-08 | Datainnovation I Lund Ab | System och förfarande för automatisk provtagning från ett provobjekt |
| US20070196838A1 (en) | 2000-12-08 | 2007-08-23 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US6489115B2 (en) | 2000-12-21 | 2002-12-03 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Genetic assays for trinucleotide repeat mutations in eukaryotic cells |
| US6615080B1 (en) | 2001-03-29 | 2003-09-02 | John Duncan Unsworth | Neuromuscular electrical stimulation of the foot muscles for prevention of deep vein thrombosis and pulmonary embolism |
| US7047078B2 (en) | 2001-03-30 | 2006-05-16 | Case Western Reserve University | Methods for stimulating components in, on, or near the pudendal nerve or its branches to achieve selective physiologic responses |
| WO2002080758A2 (en) | 2001-04-04 | 2002-10-17 | Irm Llc | Methods for treating drug addiction |
| US7107996B2 (en) | 2001-04-10 | 2006-09-19 | Ganz Robert A | Apparatus and method for treating atherosclerotic vascular disease through light sterilization |
| US6961045B2 (en) | 2001-06-16 | 2005-11-01 | Che-Chih Tsao | Pattern projection techniques for volumetric 3D displays and 2D displays |
| US6810285B2 (en) | 2001-06-28 | 2004-10-26 | Neuropace, Inc. | Seizure sensing and detection using an implantable device |
| AU2002323210A1 (en) | 2001-08-16 | 2003-03-03 | Sloan Kettering Institute For Cancer Research | Bio-synthetic photostimulators and methods of use |
| CA2458224A1 (en) | 2001-08-23 | 2003-03-06 | The Regents Of The University Of California | A universal light-switchable gene promoter system |
| US6974448B2 (en) | 2001-08-30 | 2005-12-13 | Medtronic, Inc. | Method for convection enhanced delivery catheter to treat brain and other tumors |
| US7904176B2 (en) | 2006-09-07 | 2011-03-08 | Bio Control Medical (B.C.M.) Ltd. | Techniques for reducing pain associated with nerve stimulation |
| WO2003020103A2 (en) | 2001-09-04 | 2003-03-13 | Amit Technology Science & Medicine Ltd. | Method of and device for therapeutic illumination of internal organs and tissues |
| EP1496860A1 (en) | 2001-09-28 | 2005-01-19 | Saoirse Corporation | Localized non-invasive biological modulation system |
| US7175596B2 (en) | 2001-10-29 | 2007-02-13 | Insightec-Txsonics Ltd | System and method for sensing and locating disturbances in an energy path of a focused ultrasound system |
| US8308784B2 (en) | 2006-08-24 | 2012-11-13 | Jackson Streeter | Low level light therapy for enhancement of neurologic function of a patient affected by Parkinson's disease |
| US7303578B2 (en) | 2001-11-01 | 2007-12-04 | Photothera, Inc. | Device and method for providing phototherapy to the brain |
| AU2002363478A1 (en) | 2001-11-08 | 2003-05-19 | Children's Medical Center Corporation | Bacterial ion channel and a method for screening ion channel modulators |
| JP3679403B2 (ja) | 2001-11-14 | 2005-08-03 | アステラス製薬株式会社 | トランスジェニック動物 |
| JP2005510232A (ja) | 2001-11-26 | 2005-04-21 | アドバンスド セル テクノロジー、インク． | 再プログラムされたヒト体細胞核ならびに自系および同系なヒト幹細胞の製造および使用方法 |
| US20030104512A1 (en) | 2001-11-30 | 2003-06-05 | Freeman Alex R. | Biosensors for single cell and multi cell analysis |
| US6873868B2 (en) | 2001-12-31 | 2005-03-29 | Infraredx, Inc. | Multi-fiber catheter probe arrangement for tissue analysis or treatment |
| US6721603B2 (en) | 2002-01-25 | 2004-04-13 | Cyberonics, Inc. | Nerve stimulation as a treatment for pain |
| US6666857B2 (en) | 2002-01-29 | 2003-12-23 | Robert F. Smith | Integrated wavefront-directed topography-controlled photoablation |
| WO2003066123A2 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-14 | The Cleveland Clinic Foundation | Microinfusion device |
| EP1476080A4 (en) | 2002-02-20 | 2010-06-02 | Medicis Technologies Corp | ULTRASOUND TREATMENT AND COMPOSITE EXPLANATION OF FAT FABRICS |
| JP4363843B2 (ja) | 2002-03-08 | 2009-11-11 | オリンパス株式会社 | カプセル型内視鏡 |
| US20030186249A1 (en) | 2002-04-01 | 2003-10-02 | Zairen Sun | Human TARPP genes and polypeptides |
| US20070135875A1 (en) | 2002-04-08 | 2007-06-14 | Ardian, Inc. | Methods and apparatus for thermally-induced renal neuromodulation |
| DE10216005A1 (de) * | 2002-04-11 | 2003-10-30 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung von biologischen Photorezeptoren als direkt lichtgesteuerte Ionenkanäle |
| US9592409B2 (en) | 2002-04-30 | 2017-03-14 | The Regents Of The University Of California | Methods for modifying electrical currents in neuronal circuits |
| US7283861B2 (en) | 2002-04-30 | 2007-10-16 | Alexander Bystritsky | Methods for modifying electrical currents in neuronal circuits |
| AU2003224374A1 (en) | 2002-05-13 | 2003-11-11 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Reduction of susceptibility artifacts in subencoded single-shot magnetic resonance imaging |
| AU2003239947A1 (en) | 2002-05-31 | 2003-12-19 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Heterologous stimulus-gated ion channels and methods of using same |
| WO2003101532A2 (en) | 2002-06-04 | 2003-12-11 | Cyberkinetics, Inc. | Optically-connected implants and related systems and methods of use |
| WO2003106486A1 (de) | 2002-06-12 | 2003-12-24 | Fraunhofer-Gelellschaft Zur Förderung Der Angewandten Forschung E.V. | Pflanzliche proteinpräparate und deren verwendung |
| US7292890B2 (en) | 2002-06-20 | 2007-11-06 | Advanced Bionics Corporation | Vagus nerve stimulation via unidirectional propagation of action potentials |
| US20050020945A1 (en) | 2002-07-02 | 2005-01-27 | Tosaya Carol A. | Acoustically-aided cerebrospinal-fluid manipulation for neurodegenerative disease therapy |
| US20040049134A1 (en) | 2002-07-02 | 2004-03-11 | Tosaya Carol A. | System and methods for treatment of alzheimer's and other deposition-related disorders of the brain |
| WO2004021243A2 (de) | 2002-08-09 | 2004-03-11 | Siemens Aktiengesellschaft | Verfahren sowie computerprogramm mit programmcode-mitteln und computerprogramm-produkt zur analyse einer wirksamkeit eines pharmazeutischen präparats |
| WO2004016315A1 (en) | 2002-08-19 | 2004-02-26 | Arizona Board Regents | Neurostimulator |
| EP1560915B1 (en) | 2002-10-10 | 2009-03-04 | Merck & Co., Inc. | Assay methods for state-dependent calcium channel agonists/antagonists |
| US7355033B2 (en) | 2002-11-18 | 2008-04-08 | Health Research, Inc. | Screening for West Nile Virus antiviral therapy |
| JP2006513725A (ja) | 2002-12-16 | 2006-04-27 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | ヒトｃｄ２０及び／又はｃｄ１６を発現するトランスジェニックマウス |
| US20040122475A1 (en) | 2002-12-18 | 2004-06-24 | Myrick Andrew J. | Electrochemical neuron systems |
| US20040216177A1 (en) | 2003-04-25 | 2004-10-28 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Congenic rats containing a mutant GPR10 gene |
| US7377900B2 (en) | 2003-06-02 | 2008-05-27 | Insightec - Image Guided Treatment Ltd. | Endo-cavity focused ultrasound transducer |
| CA2432810A1 (en) | 2003-06-19 | 2004-12-19 | Andres M. Lozano | Method of treating depression, mood disorders and anxiety disorders by brian infusion |
| WO2005007233A2 (en) | 2003-06-20 | 2005-01-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Application of electrical stimulation for functional tissue engineering in vitro and in vivo |
| US7091500B2 (en) | 2003-06-20 | 2006-08-15 | Lucent Technologies Inc. | Multi-photon endoscopic imaging system |
| JP2005034073A (ja) | 2003-07-16 | 2005-02-10 | Masamitsu Iino | ミオシン軽鎖リン酸化の測定用蛍光性プローブ |
| US20050153885A1 (en) | 2003-10-08 | 2005-07-14 | Yun Anthony J. | Treatment of conditions through modulation of the autonomic nervous system |
| EP1684861B1 (en) | 2003-10-21 | 2014-12-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Intracranial neural interface system |
| US6952097B2 (en) | 2003-10-22 | 2005-10-04 | Siemens Aktiengesellschaft | Method for slice position planning of tomographic measurements, using statistical images |
| US20060034943A1 (en) | 2003-10-31 | 2006-02-16 | Technology Innovations Llc | Process for treating a biological organism |
| US20080119421A1 (en) | 2003-10-31 | 2008-05-22 | Jack Tuszynski | Process for treating a biological organism |
| EP1701772A4 (en) | 2003-11-21 | 2012-03-28 | Univ Johns Hopkins | BIOMOLECULAR SEPARATION PATTERNS AND USES |
| US20050124897A1 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-09 | Scimed Life Systems, Inc. | Apparatus and methods for delivering acoustic energy to body tissue |
| US7783349B2 (en) | 2006-04-10 | 2010-08-24 | Cardiac Pacemakers, Inc. | System and method for closed-loop neural stimulation |
| CN1236305C (zh) | 2004-02-03 | 2006-01-11 | 复旦大学 | 生物光敏蛋白－纳米半导体复合光电极的制备方法 |
| US7662114B2 (en) | 2004-03-02 | 2010-02-16 | Focus Surgery, Inc. | Ultrasound phased arrays |
| US20050215764A1 (en) | 2004-03-24 | 2005-09-29 | Tuszynski Jack A | Biological polymer with differently charged portions |
| ITMI20040598A1 (it) | 2004-03-26 | 2004-06-26 | Carlotta Giorgi | Metodo per la rilevazione di parametri intracellulari con sonde proteiche luminescenti per lo screening di molecole in grado di alterare detti parametri |
| US8512219B2 (en) | 2004-04-19 | 2013-08-20 | The Invention Science Fund I, Llc | Bioelectromagnetic interface system |
| EP1750800A1 (en) | 2004-04-30 | 2007-02-14 | Advanced Neuromodulation Systems, Inc. | Method of treating mood disorders and/or anxiety disorders by brain stimulation |
| US7670838B2 (en) | 2004-05-24 | 2010-03-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Coupling of excitation and neurogenesis in neural stem/progenitor cells |
| US20050279354A1 (en) | 2004-06-21 | 2005-12-22 | Harvey Deutsch | Structures and Methods for the Joint Delivery of Fluids and Light |
| US20060057614A1 (en) | 2004-08-04 | 2006-03-16 | Nathaniel Heintz | Tethering neuropeptides and toxins for modulation of ion channels and receptors |
| US7699780B2 (en) | 2004-08-11 | 2010-04-20 | Insightec—Image-Guided Treatment Ltd. | Focused ultrasound system with adaptive anatomical aperture shaping |
| US8409099B2 (en) | 2004-08-26 | 2013-04-02 | Insightec Ltd. | Focused ultrasound system for surrounding a body tissue mass and treatment method |
| WO2006024038A2 (en) | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Codman & Shurtleff | Light-based implant for treating alzheimer’s disease |
| US8239029B2 (en) | 2004-10-21 | 2012-08-07 | Advanced Neuromodulation Systems, Inc. | Stimulation of the amygdalohippocampal complex to treat neurological conditions |
| US7544171B2 (en) | 2004-10-22 | 2009-06-09 | General Patent Llc | Methods for promoting nerve regeneration and neuronal growth and elongation |
| US7833257B2 (en) | 2004-11-12 | 2010-11-16 | Northwestern University | Apparatus and methods for optical stimulation of the auditory nerve |
| AU2005307870A1 (en) | 2004-11-15 | 2006-05-26 | Christopher Decharms | Stimulation of neural tissue with light |
| US8109981B2 (en) | 2005-01-25 | 2012-02-07 | Valam Corporation | Optical therapies and devices |
| US7686839B2 (en) | 2005-01-26 | 2010-03-30 | Lumitex, Inc. | Phototherapy treatment devices for applying area lighting to a wound |
| US7553284B2 (en) | 2005-02-02 | 2009-06-30 | Vaitekunas Jeffrey J | Focused ultrasound for pain reduction |
| US9034650B2 (en) | 2005-02-02 | 2015-05-19 | Intrexon Corporation | Site-specific serine recombinases and methods of their use |
| JP2006217866A (ja) * | 2005-02-10 | 2006-08-24 | Tohoku Univ | 光感受性を新たに賦与した神経細胞 |
| US7548780B2 (en) | 2005-02-22 | 2009-06-16 | Cardiac Pacemakers, Inc. | Cell therapy and neural stimulation for cardiac repair |
| US7288108B2 (en) | 2005-03-14 | 2007-10-30 | Codman & Shurtleff, Inc. | Red light implant for treating Parkinson's disease |
| US20070059775A1 (en) | 2005-03-29 | 2007-03-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Synthesis and conjugation of iron oxide nanoparticles to antibodies for targeting specific cells using fluorescence and MR imaging techniques |
| EP1871476B1 (en) | 2005-03-31 | 2018-01-03 | Esther Mayer | Probe device for photobiomodulation of tissue lining a body cavity |
| JP2006295350A (ja) | 2005-04-07 | 2006-10-26 | Sony Corp | 撮像装置及び撮像結果の処理方法 |
| US9445211B2 (en) | 2005-04-11 | 2016-09-13 | St. Jude Medical, Atrial Fibrillation Division, Inc. | Methods for manufacturing high intensity ultrasound transducers |
| GB0508254D0 (en) | 2005-04-23 | 2005-06-01 | Smith & Nephew | Ultrasound device |
| US7640057B2 (en) | 2005-04-25 | 2009-12-29 | Cardiac Pacemakers, Inc. | Methods of providing neural markers for sensed autonomic nervous system activity |
| CA2650213A1 (en) | 2005-04-26 | 2006-11-02 | University Of Victoria Innovation And Development Corporation | Production of light from sol-gel derived thin films made with lanthanide doped nanoparticles, and preparation thereof |
| MX2007013734A (es) | 2005-05-02 | 2008-03-14 | Genzyme Corp | Terapia genica para trastornos de la medula espinal. |
| CN1879906A (zh) | 2005-06-15 | 2006-12-20 | 郑云峰 | 中枢神经***磁刺激装置及其使用方法 |
| US20070027443A1 (en) | 2005-06-29 | 2007-02-01 | Ondine International, Ltd. | Hand piece for the delivery of light and system employing the hand piece |
| US8906360B2 (en) | 2005-07-22 | 2014-12-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Light-activated cation channel and uses thereof |
| US9274099B2 (en) | 2005-07-22 | 2016-03-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Screening test drugs to identify their effects on cell membrane voltage-gated ion channel |
| US10052497B2 (en) | 2005-07-22 | 2018-08-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
| US9238150B2 (en) | 2005-07-22 | 2016-01-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optical tissue interface method and apparatus for stimulating cells |
| US8926959B2 (en) | 2005-07-22 | 2015-01-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
| US7736382B2 (en) | 2005-09-09 | 2010-06-15 | Lockheed Martin Corporation | Apparatus for optical stimulation of nerves and other animal tissue |
| US8852184B2 (en) | 2005-09-15 | 2014-10-07 | Cannuflow, Inc. | Arthroscopic surgical temperature control system |
| US20080077200A1 (en) | 2006-09-21 | 2008-03-27 | Aculight Corporation | Apparatus and method for stimulation of nerves and automated control of surgical instruments |
| US8058509B2 (en) | 2005-12-21 | 2011-11-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for in planta production of inverted repeats |
| US7610100B2 (en) | 2005-12-30 | 2009-10-27 | Boston Scientific Neuromodulation Corporation | Methods and systems for treating osteoarthritis |
| US20070191906A1 (en) | 2006-02-13 | 2007-08-16 | Anand Iyer | Method and apparatus for selective nerve stimulation |
| US20070219600A1 (en) | 2006-03-17 | 2007-09-20 | Michael Gertner | Devices and methods for targeted nasal phototherapy |
| US20070282404A1 (en) | 2006-04-10 | 2007-12-06 | University Of Rochester | Side-firing linear optic array for interstitial optical therapy and monitoring using compact helical geometry |
| US20070253995A1 (en) | 2006-04-28 | 2007-11-01 | Medtronic, Inc. | Drug Delivery Methods and Devices for Treating Stress Urinary Incontinence |
| US8057464B2 (en) | 2006-05-03 | 2011-11-15 | Light Sciences Oncology, Inc. | Light transmission system for photoreactive therapy |
| WO2007131180A2 (en) | 2006-05-04 | 2007-11-15 | Wayne State University | Restoration of visual responses by in vivo delivery of rhodopsin nucleic acids |
| US20080176076A1 (en) | 2006-05-11 | 2008-07-24 | University Of Victoria Innovation And Development Corporation | Functionalized lanthanide rich nanoparticles and use thereof |
| US20080262411A1 (en) | 2006-06-02 | 2008-10-23 | Dobak John D | Dynamic nerve stimulation in combination with other eating disorder treatment modalities |
| EP2550992B1 (en) | 2006-06-19 | 2015-08-19 | Highland Instruments, Inc. | Apparatus for stimulation of biological tissue |
| US7795632B2 (en) | 2006-06-26 | 2010-09-14 | Osram Sylvania Inc. | Light emitting diode with direct view optic |
| US20080027505A1 (en) | 2006-07-26 | 2008-01-31 | G&L Consulting, Llc | System and method for treatment of headaches |
| US9284363B2 (en) | 2006-07-26 | 2016-03-15 | Case Western Reserve University | System and method for controlling G-protein coupled receptor pathways |
| SG139588A1 (en) | 2006-07-28 | 2008-02-29 | St Microelectronics Asia | Addressable led architecure |
| US7848797B2 (en) | 2006-08-17 | 2010-12-07 | Neurometrix, Inc. | Motor unit number estimation (MUNE) for the assessment of neuromuscular function |
| US7521590B2 (en) | 2006-09-01 | 2009-04-21 | Korea Institute Of Science And Technology | Phospholipase C β1 (PLCβ1) knockout mice as a model system for testing schizophrenia drugs |
| US10420948B2 (en) | 2006-10-30 | 2019-09-24 | Medtronic, Inc. | Implantable medical device with variable data retransmission characteristics based upon data type |
| WO2008070765A2 (en) | 2006-12-06 | 2008-06-12 | Case Western Reserve University | Light-sensitive constructs for inducing cell death and cell signaling |
| EE200600039A (et) | 2006-12-12 | 2008-10-15 | Tartu Ülikool | Transgeenne loommudel patoloogilise ärevuse modelleerimiseks, meetod patoloogilisest ärevusest p?hjustatud haiguste v?i seisundite ravimiseks sobilike ühendite tuvastamiseks ja meetod Wfs1 valgu kasutamiseks sihtmärgina patoloogilise ärevuse vastase |
| US8398692B2 (en) | 2007-01-10 | 2013-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
| US7883536B1 (en) | 2007-01-19 | 2011-02-08 | Lockheed Martin Corporation | Hybrid optical-electrical probes |
| US8401609B2 (en) | 2007-02-14 | 2013-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System, method and applications involving identification of biological circuits such as neurological characteristics |
| WO2008106694A2 (en) | 2007-03-01 | 2008-09-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells |
| US8282559B2 (en) | 2007-03-09 | 2012-10-09 | Philip Chidi Njemanze | Method for inducing and monitoring long-term potentiation and long-term depression using transcranial doppler ultrasound device in head-down bed rest |
| US8139339B2 (en) | 2007-03-16 | 2012-03-20 | Old Dominion University Research Foundation | Modulation of neuromuscular functions with ultrashort electrical pulses |
| US20080287821A1 (en) | 2007-03-30 | 2008-11-20 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Computational user-health testing |
| WO2008137579A1 (en) | 2007-05-01 | 2008-11-13 | Neurofocus, Inc. | Neuro-informatics repository system |
| US20110165681A1 (en) | 2009-02-26 | 2011-07-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Light-Activated Proton Pumps and Applications Thereof |
| US8097422B2 (en) * | 2007-06-20 | 2012-01-17 | Salk Institute For Biological Studies | Kir channel modulators |
| US9138596B2 (en) | 2007-08-22 | 2015-09-22 | Cardiac Pacemakers, Inc. | Optical depolarization of cardiac tissue |
| US10035027B2 (en) | 2007-10-31 | 2018-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Device and method for ultrasonic neuromodulation via stereotactic frame based technique |
| US10434327B2 (en) | 2007-10-31 | 2019-10-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Implantable optical stimulators |
| DE112008003192T5 (de) | 2007-11-26 | 2010-10-07 | Micro-Transponder, Inc., Dallas | Übertragungsspulenarchitektur |
| EP2222372A2 (en) * | 2007-12-06 | 2010-09-01 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Method and system for optical stimulation of neurons |
| US8883719B2 (en) | 2008-01-16 | 2014-11-11 | University Of Connecticut | Bacteriorhodopsin protein variants and methods of use for long term data storage |
| US20090254134A1 (en) | 2008-02-04 | 2009-10-08 | Medtrode Inc. | Hybrid ultrasound/electrode device for neural stimulation and recording |
| JP5544659B2 (ja) * | 2008-03-24 | 2014-07-09 | 国立大学法人東北大学 | 改変された光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質 |
| EP2268311A4 (en) | 2008-04-04 | 2014-08-27 | Immunolight Llc | NON-INVASIVE SYSTEMS AND METHOD FOR PHOTOBIOMODULATION IN SITU |
| EP3165534B1 (en) | 2008-04-23 | 2018-09-26 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells |
| CN102159713A (zh) | 2008-05-20 | 2011-08-17 | Eos神经科学公司 | 用于递送光敏蛋白的载体和使用方法 |
| US8729040B2 (en) | 2008-05-29 | 2014-05-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Cell line, system and method for optical control of secondary messengers |
| US8636653B2 (en) | 2008-06-09 | 2014-01-28 | Capso Vision, Inc. | In vivo camera with multiple sources to illuminate tissue at different distances |
| MY162929A (en) | 2008-06-17 | 2017-07-31 | Univ Leland Stanford Junior | Apparatus and methods for controlling cellular development |
| AU2009260029B2 (en) | 2008-06-17 | 2016-03-17 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods, systems and devices for optical stimulation of target cells using an optical transmission element |
| WO2010006049A1 (en) | 2008-07-08 | 2010-01-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Materials and approaches for optical stimulation of the peripheral nervous system |
| US9846313B2 (en) | 2008-09-25 | 2017-12-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Devices, apparatus and method for providing photostimulation and imaging of structures |
| NZ602416A (en) | 2008-11-14 | 2014-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Optically-based stimulation of target cells and modifications thereto |
| WO2010061686A1 (ja) | 2008-11-26 | 2010-06-03 | シャープ株式会社 | 液晶表示装置、液晶表示装置の駆動方法、テレビジョン受像機 |
| US8380318B2 (en) | 2009-03-24 | 2013-02-19 | Spinal Modulation, Inc. | Pain management with stimulation subthreshold to paresthesia |
| KR101081360B1 (ko) | 2009-03-25 | 2011-11-08 | 한국과학기술연구원 | 어레이형 광 자극 장치 |
| JP5908396B2 (ja) | 2009-04-21 | 2016-04-26 | イミュノライト・エルエルシー | ｉｎｓｉｔｕフォトバイオモジュレーションのための、非侵襲的エネルギーアップコンバージョン方法およびシステム |
| WO2011005978A2 (en) | 2009-07-08 | 2011-01-13 | Duke University | Methods of manipulating cell signaling |
| JP5322067B2 (ja) * | 2009-08-10 | 2013-10-23 | 国立大学法人東北大学 | 発現効率が改善された光受容チャネルロドプシン |
| US20110112463A1 (en) | 2009-11-12 | 2011-05-12 | Jerry Silver | Compositions and methods for treating a neuronal injury or neuronal disorders |
| US20110125078A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-05-26 | Medtronic, Inc. | Optical stimulation therapy |
| CN106137531B (zh) | 2010-02-26 | 2019-02-15 | 康奈尔大学 | 视网膜假体 |
| WO2011116238A2 (en) | 2010-03-17 | 2011-09-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University. | Light-sensitive ion-passing molecules |
| WO2011127088A2 (en) | 2010-04-05 | 2011-10-13 | Eos Neuroscience, Inc. | Methods and compositions for decreasing chronic pain |
| US10051240B2 (en) | 2010-06-14 | 2018-08-14 | Howard Hughes Medical Institute | Structured plane illumination microscopy |
| WO2012027358A1 (en) | 2010-08-23 | 2012-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Optogenetic probes for measuring membrane potential |
| HUE025952T2 (en) | 2010-09-08 | 2016-04-28 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wss E V | Mutant channel rhodopsin |
| EP2635346B1 (en) | 2010-11-05 | 2017-03-29 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Optogenetic control of reward-related behaviors |
| CA2816990A1 (en) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Stabilized step function opsin proteins and methods of using the same |
| CN106267236A (zh) | 2010-11-05 | 2017-01-04 | 斯坦福大学托管董事会 | 精神病状态的控制和表征 |
| WO2012061690A2 (en) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optically-controlled cns dysfunction |
| WO2012061679A2 (en) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Light-activated chimeric opsins and methods of using the same |
| US10086012B2 (en) | 2010-11-05 | 2018-10-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Control and characterization of memory function |
| ES2690172T3 (es) | 2010-11-05 | 2018-11-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Conversión ascendente de la luz para su uso en métodos optogenéticos |
| US8957028B2 (en) | 2010-11-13 | 2015-02-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Red-shifted opsin molecules and uses thereof |
| US8696722B2 (en) | 2010-11-22 | 2014-04-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic magnetic resonance imaging |
| WO2012106407A2 (en) | 2011-02-01 | 2012-08-09 | The University Of Vermont And State Agricultural College | Diagnostic and therapeutic methods and products related to anxiety disorders |
| US20120253261A1 (en) | 2011-03-29 | 2012-10-04 | Medtronic, Inc. | Systems and methods for optogenetic modulation of cells within a patient |
| CA2839938A1 (en) | 2011-06-28 | 2013-01-03 | University Of Rochester | Photoactivatable receptors and their uses |
| US9782091B2 (en) | 2011-07-25 | 2017-10-10 | Neuronexus Technologies, Inc. | Opto-electrical device for artifact reduction |
| EP2737536B1 (en) | 2011-07-27 | 2018-05-09 | The Board of Trustees of the University of Illionis | Nanopore sensors for biomolecular characterization |
| CA3036859A1 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Opsin polypeptides and methods of use thereof |
| ES2728077T3 (es) * | 2012-02-21 | 2019-10-22 | Univ Leland Stanford Junior | Composiciones para el tratamiento de trastornos neurogénicos del suelo pélvico |
| CN104471462B (zh) | 2012-02-23 | 2017-09-19 | 美国卫生与公共服务秘书部 | 多焦结构化照明显微***和方法 |
| WO2013142196A1 (en) * | 2012-03-20 | 2013-09-26 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Non-human animal models of depression and methods of use thereof |
| AU2013348395A1 (en) | 2012-11-21 | 2015-06-11 | Circuit Therapeutics, Inc. | System and method for optogenetic therapy |
| CN105379253A (zh) | 2013-01-25 | 2016-03-02 | 纽约市哥伦比亚大学理事会 | 景深3d成像空间光调制器显微镜 |
| US9636380B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-05-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic control of inputs to the ventral tegmental area |
| US10974064B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-04-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic control of behavioral state |
| WO2014179331A2 (en) | 2013-04-29 | 2014-11-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Devices, systems and methods for optogenetic modulation of action potentials in target cells |
| JP6621747B2 (ja) | 2013-08-14 | 2019-12-18 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 疼痛を制御するための組成物及び方法 |
| US20150112411A1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Varaya Photoceuticals, Llc | High powered light emitting diode photobiology compositions, methods and systems |
| AU2015237265A1 (en) | 2014-03-28 | 2016-10-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Engineered light-activated anion channel proteins and methods of use thereof |
| JP2017527419A (ja) | 2014-07-29 | 2017-09-21 | サーキット セラピューティクス， インコーポレイテッド | 光遺伝学療法のためのシステムおよび方法 |
| AU2014411185B2 (en) | 2014-11-11 | 2017-10-26 | Guangdong Oppo Mobile Telecommunications Corp., Ltd. | Power adaptor, terminal and charging system |
-
2011
- 2011-11-04 WO PCT/US2011/059276 patent/WO2012061679A2/en active Application Filing
- 2011-11-04 CA CA2816971A patent/CA2816971A1/en not_active Abandoned
- 2011-11-04 AU AU2011323226A patent/AU2011323226B2/en not_active Ceased
- 2011-11-04 CN CN201710163507.2A patent/CN106947741A/zh active Pending
- 2011-11-04 ES ES11838855T patent/ES2716819T3/es active Active
- 2011-11-04 EP EP11838855.2A patent/EP2635108B1/en not_active Not-in-force
- 2011-11-04 EP EP18212473.5A patent/EP3486253A1/en not_active Withdrawn
- 2011-11-04 WO PCT/US2011/059272 patent/WO2012061676A1/en active Application Filing
- 2011-11-04 CN CN201180061697.8A patent/CN103492564B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-11-04 JP JP2013537851A patent/JP6276591B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-05-02 US US13/875,966 patent/US9175095B2/en active Active
-
2015
- 2015-09-23 US US14/862,926 patent/US9340589B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-05-05 US US15/147,772 patent/US9850290B2/en active Active
- 2016-12-05 JP JP2016235566A patent/JP6590786B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-11-03 US US15/803,472 patent/US10196431B2/en active Active
-
2018
- 2018-12-05 US US16/211,083 patent/US20190241627A1/en not_active Abandoned
-
2019
- 2019-07-26 JP JP2019137443A patent/JP2019205455A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2635108A2 (en) | 2013-09-11 |
| US20180051058A1 (en) | 2018-02-22 |
| US20160237126A1 (en) | 2016-08-18 |
| US20190241627A1 (en) | 2019-08-08 |
| US9340589B2 (en) | 2016-05-17 |
| US20130224821A1 (en) | 2013-08-29 |
| US9175095B2 (en) | 2015-11-03 |
| AU2011323226B2 (en) | 2015-03-12 |
| EP2635108B1 (en) | 2019-01-23 |
| EP2635108A4 (en) | 2014-02-26 |
| CN103492564A (zh) | 2014-01-01 |
| JP6276591B2 (ja) | 2018-02-07 |
| WO2012061679A3 (en) | 2013-08-08 |
| WO2012061676A1 (en) | 2012-05-10 |
| CA2816971A1 (en) | 2012-05-10 |
| CN103492564B (zh) | 2017-04-19 |
| AU2011323226A1 (en) | 2013-05-09 |
| JP6590786B2 (ja) | 2019-10-16 |
| CN106947741A (zh) | 2017-07-14 |
| US9850290B2 (en) | 2017-12-26 |
| JP2019205455A (ja) | 2019-12-05 |
| EP3486253A1 (en) | 2019-05-22 |
| US20160002302A1 (en) | 2016-01-07 |
| WO2012061679A2 (en) | 2012-05-10 |
| JP2014500716A (ja) | 2014-01-16 |
| US10196431B2 (en) | 2019-02-05 |
| JP2017074056A (ja) | 2017-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2716819T3 (es) | Opsinas quiméricas activadas por luz y métodos de uso de las mismas | |
| JP6509165B2 (ja) | 安定化階段関数オプシンタンパク質及びその使用方法 | |
| ES2682962T3 (es) | Control y caracterización de estados psicóticos | |
| ES2742492T3 (es) | Control optogenético del estado conductual | |
| US20200121942A1 (en) | Compositions and methods for controlling pain | |
| AU2015203097B2 (en) | Light-activated chimeric opsins and methods of using the same | |
| Fenno | Development of Novel Optogenetic and Molecular Tools and Their Application to Understanding the Neurological Basis of Behavior |