ES2714453T3 - Fármacos para inhibir la agregación de proteínas implicadas en enfermedades relacionadas con enfermedades neurodegenerativas y/o agregación de proteínas - Google Patents

Abstract

Un compuesto representado por la fórmula (E):**Fórmula** en donde: R se selecciona de hidrógeno; alquilo(C1-4); y -alquileno(C1-4)-halógeno; y Hal se selecciona de F, Cl, Br e I; RA9 es H o alquilo(C1-4); y RA10 es H o alquilo(C1-4); o un solvato o sal de estos compuestos.

Description

DES

Farmacos para inhibir la agregacion de protemas im neurodegenerativas y/o agregacion de protemas

Compendio de la invencion

La presente invencion se refiere a un compuesto repres refiere a un compuesto representado por la formula enfermedades relacionadas con la agregacion de una presente invencion se refiere a composiciones farmac invencion, asf como a un kit. Ademas, la presente inv depositos de la protema agregada. Tambien se describe de la presente invencion.

A lo largo del texto de esta especificacion se citan documentos citados en la presente memoria (entre ellos incorpora en ella por referencia.

Antecedentes de la invencion

En M. Ono et al. (Bioorganic & Medicinal Chemistry 16 amiloide basadas en los 3,5-difenil-1,2,4-oxadiazoles.

En la patente de los EE. UU. 2007/0276034 se describe analogos de metilendioxi y esteres farmaceuticament sinucleinopatias.

En la solicitud de patente internacional WO 2008/131148 uso para la fijacion y la toma de imagenes de las placas

Los compuestos heterodclicos que son utiles como acti internacional WO 2004/072050.

El etilenglicol o el polietilenglicol radiomarcado se utiliza ser utiles para tomar imagenes de tejidos en la solicitud

En la solicitud de patente internacional WO 98/17652 se que son idoneos para tratar enfermedades neurodegene

Se conocen un gran numero de enfermedades neurologic curar en la actualidad. Estas enfermedades incluyen afe de Huntington, enfermedad de Hallervorden-Spatz, e Creutzfeldt-Jakob, demencia arteriosclerotica, tromboa (DCL), atrofia multisistemica (AMS) y muchas otras.

Las enfermedades causadas por los priones, que incluy Jakob (ECJ), la tembladera de las ovejas y la encefalo punto de vista anatomopatologico por una degeneracion los priones estan ocasionadas por un agente infeccioso de la glucoprotema membranaria PrPC denominada Pr agregados.

Las enfermedades causadas por los priones han prov publica debido a la aparicion de la EEB. Las pruebas cie y ha ocasionado una nueva variante de la enfermedad 1997). Se desconoce cuantas personas estan en la actu vECJ en el futuro. Las pruebas disponibles no descarta pacientes (Andrews et al. 2000). Esto eleva la necesi medidas que impidan una posterior diseminacion de la puede producir la transmision secundaria por transfusion

El acontecimiento central en la patogenia de las enferme prionica celular PrPC en la isoforma patologica PrPSc, qu de agregados de PrPSc es un distintivo de la patogenia disponibles sugieren que la PrPSc actua de plantilla para provoca disfuncion neuronal y muerte celular (Prusiner terapeutico mas prometedor contra las enfermedades c de la PrPSc. Las pruebas procedentes del cultivo celular ION

as en enfermedades relacionadas con enfermedades

o por la formula (E). La presente invencion tambien se ara ser usado en el tratamiento o la prevencion de ma y/o enfermedades neurodegenerativas. Ademas, la s y diagnosticas que comprenden el compuesto de la se refiere a un metodo para tomar imagenes de los t para preparar un compuesto marcado detectablemente

documentos. El contenido de la descripcion de los uier especificacion del fabricante, instrucciones, etc.) se

) 6867-6872) se describen determinadas sondas de p-

terminados compuestos de bis- y trisdihidroxiarilo y sus ptables, que presuntamente son idoneos para tratar

escriben derivados de difenilheteroarilo espedficos y su ides.

res de NURR-1 se describen en la solicitud de patente

un grupo de marcacion en los compuestos que pueden tente internacional WO 2007/002540.

iben determinados derivados de oxadiazol que se afirma s y la isquemia cerebral.

neurodegenerativas, muchas de las cuales no se pueden s medicas tales como enfermedad de Parkinson, corea edad de Alzheimer, demencia senil, enfermedad de obliterante cerebral, demencia con cuerpos de Lewy

nfermedades tales como la enfermedad de Creutzfeldtespongiforme bovina (EEB), se caracterizan desde el ngiforme del cerebro. Las enfermedades causadas por onvencional que consiste principalmente en la isoforma ue es rica en laminas p por estar mal plegada, y forma

una preocupacion importante con respecto a la salud s sugieren que la EEB se ha transmitido a los humanos reutzfeldt-Jakob (vECJ) (Will et al., 1996, Bruce et al., d incubando la enfermedad o se veran afectadas por la a epidemia inminente que afecte a un gran numero de e desarrollar un tratamiento eficaz ademas de aplicar edad. Ademas, las pruebas recientes sugieren que se angre (Llewelyn et al., 2004).

causadas por los priones es la conversion de la protema grega en grandes agregados proteicos. Esta formacion enfermedades causadas por los priones. Las pruebas conversion y tambien como un agente neurotoxico que , Giese y Kretzschmar, 2001). Por lo tanto, el metodo as por los priones pasa por interferir en la amplificacion los estudios in vivo sugiere que una vez que se inhibe la formacion de la PrPSc, puede tener lugar la eliminacio terapeutica tambien podna ser eficaz mas tarde en el pe de los signos clmicos de la enfermedad, lo que es esenc causada por los priones en los humanos.

Hay una serie de compuestos que se ha demostrado que PrPSc in vitro, tales como los derivados de la acridina, rojo de laminas p y variantes de PrP (Caughey et al., 1998, Ch Perrier et al. 2000, Rudyk et al. 2000, Soto et al, 2000).

hasta la fecha con exito para el tratamiento de las enfe compuestos con un incremento de su potencial terapeutic

Las sustancias identificadas hasta la fecha con potencial t Hasta ahora se han consolidado pocos ensayos in vitro compuestos en busca de farmacos con potencial antipri cribado sistematico en los estudios publicados recientem otro que utiliza cultivos de celulas ScN2a infectadas (Ko estrategias permitfan el cribado de colecciones limitada necesitaban mucho tiempo.

Ademas de las sustancias de masa molecular baja, en Primero, se estan utilizando anticuerpos contra PrP para con exito en cultivos celulares, asf como con ratones p 2003). Otra estrategia es la aplicacion de oligonucleotid incubacion en los ratones infectados con el prion de la te mecanismo de accion de este metodo no se ha elucidado que suprimen la expresion de PrPC en las neuronas de l este metodo inhibe la formacion de PrPSc en los cultivos d al mismo problema, a saber, que las moleculas atraviese estas estrategias son solo idoneas para la profilaxis en lo el tratamiento de la enfermedad en el sistema nervioso c

Otra clase de enfermedades neurodegenerativas, la acumulacion intracelular de agregados, oligomeros, prot a-sinuclema. En los casos de las sinucleinopatfas, se cr estan inducidos por la formacion de agregados oligomeri membrana. Los ejemplos de sinucleinopatfas son la enfer (DCL) y la atrofia multisistemica (AMS). Hasta la fecha inhibicion de la agregacion de la a-sinuclema.

Por lo tanto, existe la necesidad de identificar nuevos co relacionadas con la agregacion de una protema, tales sinucleinopatfas.

Asf pues, el problema tecnico que subyace en la presente de las enfermedades causadas por los priones, las si agregacion de una protema, en particular la enfermedad compuestos que son sondas idoneas para tomar imagen mencionados mas arriba.

Descripcion de las figuras

Figura 1: Mapa de REA generado para DIVERSet 1 y 2, mapa muestra aglomeraciones de compuestos similare estrellas o cajas) construidas a partir de 837 compuestos 1 y 2. A su vez, las aglomeraciones estan distribuidas de t unas de otras. Los sfmbolos que representan las aglomer se corresponden con su tamano y las proporciones

respectivamente, tal y como se explica en la leyenda.

grandes proporciones de activos por SIFT y por cultivo seleccionaron cinco aglomeraciones, denominadas de D que representan a estas aglomeraciones.

Figura 2: Todos los compuestos clasificados en las aglo de A a F, junto con su actividad en los diferentes ensayos. que se obtienen por modificacion del 3,5-difenilpirazol (D En la figura 2F, se muestra otra aglomeracion, DPP_6, q de la PrPSc (Mallucci, 2003). As^ pues, esta estrategia do de incubacion, e incluso despues de la manifestacion para encontrarle uso en el tratamiento de la enfermedad

n eficaces a la hora de interferir con la amplificacion de la ongo, porfirinas/ftalocianinas, Cp-60, peptidos disruptores y et al., 1998, Demaimay et al., 2000, Horiuchi et al, 2000, embargo, ninguno de estos compuestos se han utilizado edades o como compuestos de partida para desarrollar y de sus propiedades farmacologicas.

peutico se han descubierto en su mayona por casualidad. neos para el cribado masivo de grandes colecciones de co. Se han propuesto dos estrategias diferentes para el te: uno que se basa en la levadura (Bach et al., 2003) y o et al., 2004, Kocisko et al., 2003). Sin embargo, estas 2500 y 2000 compuestos, respectivamente, y ademas

actualidad se han analizado tres metodos posibles mas. primir la formacion de PrPSc. Este metodo se ha utilizado inyeccion intraperitoneal (Enari et al., 2001; White et al., con CpG, que se hallo que incrementaban el periodo de ladera de las ovejas (Sethi et al., 2002). Sin embargo, el sta ahora. Finalmente, se esta debatiendo sobre los siRNA animales o humanos infectados. Se ha demostrado que elulas (Daude et al., 2003). Los tres metodos se enfrentan barrera hematoencefalica. Debido a este inconveniente, rganos perifericos despues de la exposicion, pero no para ral.

enominadas sinucleinopatfas, se caracterizan por la rillas y fibrillas de protema, que contienen principalmente que los efectos patologicos sobre las celulas nerviosas s de a-sinuclema y la posterior formacion de poros en la dad de Parkinson (EP), la demencia con cuerpos de Lewy o hay disponible ninguna estrategia terapeutica para la

uestos idoneos para el tratamiento de las enfermedades mo las enfermedades causadas por los priones y las

vencion es la provision de compuestos para el tratamiento leinopatfas y otras enfermedades caracterizadas por la Parkinson. Ademas, existe la necesidad de dar a conocer e los depositos de protemas agregadas en los trastornos

ado mediante SIFT bidimensional y en cultivo celular. El desde el punto de vista estructural (representados por itivos del cribado del cultivo celular primario de DIVERSet manera que las aglomeraciones parecidas estan cercanas iones estan con la escala, con la forma y con el color que los activos por SIFT y los activos por cultivo celular, pues, las aglomeraciones mas grandes, que contienen lar, estan representados por estrellas rojas grandes. Se _1 a DPP_5 y se muestran los compuestos prototfpicos

aciones identificadas (figura 1) se muestran en la figura 2 odos ellos pertenecen a la clase de compuestos qrnmicos ) (comparese con el motivo DPP mostrado en la figura 1). no esta contenida en el mapa de REA de la figura 1 y que contiene un unico compuesto activo, segun el cultivo celul 2F, se muestran adicionalmente 4 de los 33 compuestos en el cultivo celular y a los que el programa DM juzgo que estos compuestos mediante una busqueda del motivo de

Figura 3: Lista de compuestos que se sintetizaron de acu en los resultados del cribado inicial y en las consideracion con el uso de diferentes ensayos de comprobacion (a sab enfermedades causadas por los priones, pruebas in vivo c sinuclema).

Figura 4: Efectos del tratamiento sobre el tiempo de super con la cepa RML de la tembladera de las ovejas. Los co partir del dfa 80 tras la infeccion (50 pl del compuesto a prolonga la supervivencia de los ratones infectados por vi tiempos de supervivencia despues del tratamiento con los con los compuestos anle138b y sery149 prolonga sign provocacion con la cepa RML de la tembladera de las ovej tiempos de supervivencia se expresa en dfas ± desviacion

Figura 5: Influencia del tratamiento sobre la cantidad intraperitoneal con la cepa RML de la tembladera de las tembladera de las ovejas, los ratones se trataron una ve para la administracion intraperitoneal y 50 mg/kg para la ad de PrPSc esplenicos en una inmunotransferencia por punt de la cantidad de PrPSc en comparacion con el control ( ratones infectados con el prion de la tembladera de las ov el porcentaje de bazos con poco deposito de PrPSc (grad ++). En (D) se muestran dos ejemplos de depositos de P muestra una tincion intensa de PrPSc (grado ++), mientra ). Las barras indican la cantidad media de PrPSc ± error e

Figura 6: Inmunotransferencia y analisis histologico del despues de la inoculacion intracerebral de ratones con la despues de la infeccion. Se administraron los compuestos para la aplicacion i.p. y 50 mg/kg para la administracio homogeneizados de cerebro de los ratones inoculados c anle138b bloquea completamente la acumulacion de PrPS en los valores del dfa 80. El tratamiento con anle186b c cerebro de los ratones. (C) Cambio de la cantidad relativa comparacion con el control sin tratar el dfa 80. (D) Evalu cortes de cerebro tenidos con hematoxilina y eosina (HE) numero medio de celulas apoptosicas ± error estandar.

apoptosica (flecha).

Figura 7: Prolongacion del tiempo de supervivencia me invencion. Los ratones, que se han infectado por via intra muestra una prolongacion del tiempo de supervivencia hast de las ovejas.

Figura 8: Supresion de la agregacion de la a-sinuclema po 351F11 es capaz de inhibir la formacion de complejos m dosis. (B) (C) Deteccion del efecto inhibidor dependient presentan otros compuestos relacionados con el DPP.

Figura 9: Cultivos celulares infectados con priones y tr invencion. Los compuestos relacionados con DPP mostrab concentraciones micromolares bajas e incluso submicrom

Figura 10: Influencia del tratamiento diario con anle138b s los priones en los ratones infectados con la cepa RML tenidos para la PrPSc (fila superior: corteza e hipocamp anle138b reduce la acumulacion de PrPSc en comparacion de la cantidad de PrPSc en los homogeneizados de cereb indicados demuestra que se reduce mucho la acumulaci despues del comienzo del tratamiento en una etapa tardfa de las celulas apoptosicas en el cerebelo en los cortes de con un atomo de N unido al anillo de pirazol. En la figura DPP de DIVERSet 1 y 2, que se hallo que eran inactivos diferentes a las seis clases de DPP. Hemos identificado P en la coleccion.

o con los metodos descritos en el ejemplo 2 basandose químicas medicinales. Estos compuestos se analizaron SlFT, ensayos con cultivos celulares de modelos de las animales o ensayos bioqmmicos de agregacion de la a-

ncia de los ratones despues de la infeccion intracerebral uestos se administraron diariamente durante 14 dfas a mM). (A) El tratamiento con el compuesto 10353_F11 tracerebral (p < 0,05). En (B) se muestra la media de los erentes compuestos. Una inyeccion intraperitoneal al dfa ativamente el tiempo de supervivencia despues de la (anle138b: p < 0,01; sery149: p < 0,05). La media de los tandar.

PrPSc en el bazo de los ratones infectados por via vejas. (A) Despues de la inoculacion con priones de la l dfa con el compuesto (25 pl del compuesto a 100 mM nistracion oral). (B) Analisis densitometrico de la cantidad El tratamiento con anle138b indujo una fuerte reduccion 0,001). (C) Analisis inmunohistologico del bazo de los s. Despues del tratamiento con anle138b, se incrementa ), y desaparecen los depositos intensos de PrPSc (grado c tenidos (flechas) en el bazo. La imagen de la izquierda ue la de la derecha muestra poca tincion de PrPSc (grado ndar.

ebro de los ratones. (A) El tratamiento de los ratones a RML de la tembladera de las ovejas comenzo 80 dfas los momentos indicados (25 pl del compuesto a 100 mM ral). (B) Cuantificacion de la cantidad de PrPSc en los priones en los diferentes momentos. El tratamiento con el cerebro. La cantidad de PrPSc el dfa 106 esta todavfa uce a una reduccion de la acumulacion de PrPSc en el e PrPSc despues del tratamiento con los compuestos en on histologica de celulas apoptosicas (flecha en (E)) en los momentos indicados. El grafico de lmeas muestra el (E) se muestra un corte tenido con HE con una celula

nte la administracion diaria de los compuestos de la rebral con la cepa RML de la tembladera de las ovejas, lcanzar la etapa terminal de la infeccion de la tembladera

s compuestos de la invencion. (A) El compuesto de DPP mericos de a-sinuclema de un modo dependiente de la e la dosis sobre la agregacion de la a-sinuclema que

dos con los compuestos relacionados con DPP de la una fuerte reduccion de PrPSc en el cultivo celular a unas res.

e la acumulacion de PrPSc y la enfermedad causada por la tembladera de las ovejas. (A) Los cortes de cerebro fila inferior: cerebelo) muestran que el tratamiento con n los animales tratados con DMSO. (B) La cuantificacion de los ratones inoculados con priones en los momentos de PrPSc en los ratones tratados con anle138b, incluso la enfermedad (120 dpi). (C) La cuantificacion histologica rebro tenidos con HE demuestra que la inhibicion de la acumulacion de PrPSc da lugar a la inhibicion de la muert con DMSO mas mantequilla de cacahuete sin el compue con anle138b desde los 80 dpi en adelante impide e tratamiento desde los 120 dpi inhibe el adelgazamiento d C indican el error estandar (n = 4 ratones). La leyenda qu y D.

Figura 11: Comparacion de diferentes protocolos de trata y con diferentes pautas, tal y como se indica en la figura, despues de la provocacion con la cepa RML de la tembl supervivencia se expresan en dfas ± desviacion estandar

Figura 12: Efecto dependiente de la dosis que presenta l el cerebro. Los ratones C57BL/6 se inocularon por via in 1% (cepa RML de la tembladera de las ovejas). El trat aplicacion de diferentes cantidades de anle138b (tal y co y mantequilla de cacahuete. A los 120 dfas de la infeccio PrPSc en el cerebro en comparacion con los animales sac indican el error estandar (n = 4 ratones).

Figura 13: Cuantificacion de PrPSc por inmunotransferenc 1 mg al dfa de anle138b mezclado con DMSO y mantequ cuatro ratones en cada grupo.

Figura 14: Analisis farmacocinetico de anle138b. A los ra anle138b tal y como esta indicado. En diferentes moment del compuesto en el cerebro y en el suero para 2 animale

Figura 15: Inhibicion de la formacion de agregados de a estructura de los compuestos ensayados en la tabla 2.

Figura 16: Cuantificacion de la perdida de neuronas en los sin tratar con MPTP, segun se evaluo mediante la determ que dan positivo para la tirosina hidroxilasa (TH) en cort analizo un corte de cada dos a lo largo de la SNc con el Colchester, VT, EE. UU.). Las celulas inmunotenidas se objetivo de 20*. Los recuentos estereologicos los realizar

Figura 17: Efecto de anle138c en la agregacion de Ap. dinamica. Ap40 monomerica y oligomerica en ausencia panel inferior muestra la distribucion por tamanos del est la muestra.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion se resume mediante las realizaciones r combinaciones de todas las realizaciones preferidas re considera que estan dentro del alcance de la presente de

La presente descripcion se refiere a un compuesto repre lular de las neuronas. (D) Los ratones de control tratados muestran un adelgazamiento progresivo. El tratamiento delgazamiento durante aproximadamente 100 dfas. El nte aproximadamente 70 dfas. Las barras de error en By e muestra en la figura B tambien se aplica a las figuras C

nto. El tratamiento con anle138b en diferentes momentos longaron significativamente los tiempos de supervivencia era de las ovejas (p < 0,01). La media de los tiempos de

dministracion de anle138b sobre la cantidad de PrPSc en cerebral (i.c.) con 30 pl del homogeneizado de cerebro al iento comenzo 80 dfas despues de la infeccion con la se muestra en la figura) por via oral mezclado con DMSO se sacrificaron los animales y se cuantifico la cantidad de ados 80 dfas despues de la infeccion. Las barras de error

del tejido cerebral de los ratones sin infectar tratados con de cacahuete durante 1 semana. Cada barra representa

es C57BL/6 sin infectar se les aplico una dosis unica de despues de la aplicacion, se midio por LC-MS la cantidad or momento y el grupo experimental.

nuclema debida a diferentes compuestos. Se muestra la

tones tratados con MPTP en comparacion con los ratones cion de las celulas de la sustancia negra compacta (SNc) de 50 pm inmunotenidos con un anticuerpo anti-TH. Se rograma informatico Stereo Investigator (MicroBrightfield, taron mediante el metodo del fraccionador optico con un con anonimato dos investigadores independientes.

agregacion de Ap se analizo mediante dispersion optica nel superior) y presencia (panel central) de anle138. El fibrilar amiloide de Ap40, medido despues de centrifugar

gidas en las reivindicaciones. Se debe saber que las gidas de aqrn en adelante y en las reivindicaciones se ripcion.

tado por la formula general (E)

En el anillo, D, se seleccionan X, Y y L de manera indep N=, -N+(R5)=, -O- y -S-;

M y Z se seleccionan de manera independiente y no dire diente y no direccional de -C(R1)(R2)-, -C(R3)=, -N(R4)-, -

nal de

------ representa un doble enlace optativo.

Es evidente por s^ mismo que X, Y, Z, L y M se seleccio R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 se seleccionan independient alquileno(Ci-4)-OH; -alquileno(Ci-4)-alcoxi(Ci-4); -C(O)-al sustituido optativamente por alquilo(Ci-4) o halogeno. El p. ej., seleccionar de fenilo y naftilo. El atomo de haloge Preferiblemente, R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 se sel alquileno(Ci-4)-halogeno; -alquileno(C1-4)-OH; -alquileno R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 se seleccionan de hidrogeno; La eleccion del sustituyente puede depender del uso qu realizacion preferida, al menos uno de R1, R2, R3, R4, R es -alquileno(C1-4)-halogeno. Esto es particularmente ut tomar imagenes de los depositos de las proternas agr eficacia con un marcador detectable, tal como un iso halogeno detectables incluyen 18F, 125I, 123I, 131I, 77Br y 76 de halogeno detectable como cualquiera de los otros at (E), tales como los atomos de halogeno unidos al anillo Como alternativa, se puede utilizar 11C para marcar det estar presente en al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, en cualquier otra parte del compuesto de la formula (E). En una realizacion preferida alternativa, R1, R2, R3, R4, y alquilo(C1-4), preferiblemente hidrogeno.

El anillo D no esta particularmente limitado. Ejemplos tf segun lo permitan la Valencia y la estabilidad.

e de hidrogeno; alquilo(Ci-4); alquileno(C1-4)-halogeno; -Ci-4); y arilo(C6-io), en donde el anillo de arilo puede estar arilo(C6-io) no esta particularmente limitado y se puede, ede ser F, Cl, Br o I y es tipicamente F o Cl.

an independientemente de hidrogeno; alquilo(Ci-4); --alcoxi(C1-4); y -C(O)-alquilo(C1-4). Mas preferiblemente, lo(C1-4); y -alquileno(C1-4)-halogeno.

retenda dar a los compuestos de la formula (E). En una R7 (mas preferiblemente al menos uno de R4, R5 y R7) s compuestos se han de emplear como una sonda para s, porque entonces es posible marcarlos con rapidez y de halogeno detectable. Los ejemplos de isotopos de concreto 18F. Por supuesto, es posible utilizar un isotopo de halogeno presentes en los compuestos de la formula ilo.

emente los compuestos de la formula (E). El 11C puede 7 (mas preferiblemente, al menos uno de R4, R5 y R7) o

y R7 se seleccionan independientemente de hidrogeno

del mismo incluyen

Ejemplos particularmente preferidos de anillo D son

En las formulas de mas arriba, R8 se selecciona de hidro 4)-OH; -alquileno(C1-4)-alcoxi(C1-4); -C(O)-alquilo(C1-4); optativamente sustituido por alquilo(Ci-4) o halogeno. Pre alquileno(Ci-4)-halogeno; -alquileno(Ci-4)-OH; -alquileno( R8 se selecciona de hidrogeno; -alquilo(Ci-4); -alquilen hidrogeno; y alquilo(Ci-4), mas preferiblemente hidroge halogeno. Tal y como se explico mas arriba, R8 se puede

En las formulas de mas arriba, R9 se selecciona de hidro 4)-OH; -alquileno(Ci-4)-alcoxi(Ci-4); -C(O)-alquilo(Ci-4); optativamente sustituido por alquilo(Ci-4) o halogeno. Pre alquileno(Ci-4)-halogeno; -alquileno(Ci-4)-OH; -alquileno( R9 se selecciona de hidrogeno; -alquilo(Ci-4); -alquilen hidrogeno; y alquilo(Ci_4), mas preferiblemente hidroge halogeno. Tal y como se explico mas arriba, R9 se puede

En una realizacion mas, R8 y R9 son hidrogeno. Aun e hidrogeno.

Hal se selecciona de F, Cl, Br e I, y es preferiblemente F, Br.

REi se selecciona de hidroxi, alcoxi(Ci-a) y -NRE5REa.

RE2 se selecciona de hidrogeno, halogeno, hidroxi, alc hidrogeno, hidroxi, alcoxi(Ci-a) y -NRE5REa.

En una realizacion alternativa, REi y RE2 juntos pueden f asf como las correspondientes estructuras en las que e carbono adyacentes. En esta estructura, T se selecciona O. Preferiblemente, al menos uno de T y V es NH u O. Ej O-, -O-(CH2)n-CH2-, -NH-(CH2)n-NH-, -NH-(CF2)n-NH-, -esta presente un doble enlace. Por ejemplo, si n = i, ent un doble enlace y que corresponde a -NH-CH2-NH-. Prefe O-. Se supone que este grupo tambien podna hidrolizars

n es de i a 3; preferiblemente n es i o 2, mas preferible

RE5 y REa se seleccionan independientemente de hidrog independientemente de hidrogeno y alquilo(Ci-4).

RE7 y RE8 son independientemente H o F y son preferible

RE9 y REi0 son independientemente H o F y son preferibl

Puede variar la posicion en la que REi y RE2 estan unidos

En una realizacion, REi y RE2 son independientemente hi con el atomo de carbono que une el anillo fenilo al anillo

En una segunda realizacion, REi y RE2 son una estructu que esta presente un doble enlace y estan unidos en met el anillo fenilo al anillo D. Las definiciones preferidas de manera analoga a esta realizacion.

En una tercera realizacion, REi es -NRE5REa y esta unido que une el anillo fenilo al anillo D.

o; -alquilo(Ci-4); -alquileno(Ci-4)-halogeno; -alquileno(C-iarilo(Ca.10), en donde el anillo de arilo puede estar iblemente R8 se selecciona de hidrogeno; -alquilo(Ci-4); -4)-alcoxi(Ci-4); y -C(O)-alquilo(Ci-4). Mas preferiblemente, i-4)-halogeno. En una realizacion, R8 se selecciona de . En una realizacion alternativa, R8 es -alquileno(Ci-4)-arcar de manera detectable, si se desea.

o; -alquilo(Ci-4); -alquileno(Ci-4)-halogeno; -alquileno(Ciarilo(Ca-io), en donde el anillo de arilo puede estar iblemente R9 se selecciona de hidrogeno; -alquilo(Ci-4); -4)-alcoxi(Ci-4); y -C(O)-alquilo(Ci-4). Mas preferiblemente, i-4)-halogeno. En una realizacion, R9 se selecciona de . En una realizacion alternativa, R9 es -alquileno(Ci-4)-arcar de manera detectable, si se desea.

tra realizacion, R8 es -alquileno(Ci-4)-halogeno y R9 es

o Br, mas preferiblemente Cl o Br, lo mas preferiblemente

Ci-a) y -NRE5REa, preferiblemente RE2 se selecciona de

ar no direccionalmente una estructura -T-(CRE7RE8)n-V-, presente un doble enlace, si estan unidos a atomos de CRE9REi0, NH y O, y V se selecciona de CRE9REi0, NH y los de tales estructuras incluyen -O-(CH2)n-O-, -O-(CF2)n-(CH2)n-CH2- o una estructura correspondiente en la que es -N=CH-NH- es una estructura en la que esta presente emente, REi y RE2juntos forman una estructura -O-(CH2)n-vivo a los correspondientes grupos hidroxi.

te n es i.

y alquilo(Ci-a); preferiblemente RE5 y REa se seleccionan

nte H.

nte H.

anillo fenilo.

xi o alcoxi, estan unidos en meta y para por comparacion

-T-(CRE7RE8)n-V- o una estructura correspondiente en la para por comparacion con el atomo de carbono que une s arriba para la estructura -T-(CRE7RE8)n-V- se aplican de

posicion para por comparacion con el atomo de carbono Otros sustituyentes RE3 pueden estar optativamente pre un grupo alquilo(C1-6) o un grupo arilo(C5-10) (tal como 6), mas preferiblemente un grupo alquilo(Ci-4). El numer tipicamente en el margen de 0 a 2, preferiblemente de Tambien pueden estar presentes otros sustituyentes RE 6) o un grupo arilo(C5-10) (tal como un grupo fenilo o alquilo(C1-6), mas preferiblemente un grupo alquilo(C1-6) sustituyentes, p, no esta particularmente limitado y est tipicamente 0.

En algunas realizaciones, los siguientes compuestos qu 3(5)-(2-hidroxi-5-metilfenil)-5(3)-(4-clorofenil)-pirazol (D orfo-hidroxifenil-5-dicloro-3'-4'-fenil-3-metil-2-pirazol (FR orfo-hidroxifenil-5-dicloro-3'-4'-fenil-3-fenil-2-pirazol (FR s en el anillo fenilo ademas de RE1 y RE2. RE3 puede ser po fenilo o naftilo), preferiblemente un grupo alquilo(Ciustituyentes, m, no esta particularmente limitado y esta ipicamente 0.

tipicamente un atomo de halogeno, un grupo alquilo(C1-), preferiblemente un atomo de halogeno o un grupo as preferiblemente un grupo alquilo(C1-4). El numero de amente en el margen de 0 a 2, preferiblemente 0 o 1,

xcluidos:

6 543: compuesto 26 en la tabla 1);

.932: ejemplo IV);

.932: ejemplo IV);

Estos compuestos se describen como los compuestos internacional WO 2004/080972.

En otras realizaciones de la descripcion, estos compues

Los ejemplos preferidos del compuesto representado po formula (A)

IA-47, IA-81, IA-106 e IA-115 en la solicitud de patente

quedan excluidos.

rmula (E) incluyen los compuestos representados por la

Las definiciones de X, Y, Z, M, L, anillo D, m, p y Hal dadas manera analoga a la formula (A).

RA1 y RA2 se seleccionan cada uno independientemente de siempre y cuando al menos uno de RA1 y RA2

seleccionan independientemente de hidrogeno, hidroxi, alcoxi( Como alternativa, RA1 y RA2 pueden formar juntos y no di explicaciones dadas mas arriba con respecto a RE1 y RE2 form arriba de RE7, RE8, T, n y V se aplican de manera analoga a R En una realizacion, RA1 y RA2 son de manera independiente hi En una segunda realizacion, RA1 y RA2 son una estructura -T que esta presente un doble enlace. Las definiciones preferida aplican de manera analoga a esta realizacion.

En una tercera realizacion, RA1 es -NRA5RA6 y RA2 es hidrogen Otros sustituyentes RA3 pueden estar optativamente presentes ser un grupo alquilo(C1_6) o un grupo arilo(C5-1o) (tal como un gr 6), mas preferiblemente un grupo alquilo(C1-4).

Tambien pueden estar presentes otros sustituyentes RA4. Son t 6) o un grupo arilo(C5-1o) (tal como un grupo fenilo o naftilo) alquilo(C1-6), mas preferiblemente un grupo alquilo(C1-6), lo ma RA5 y RA6 se seleccionan independientemente de hidrogeno y independientemente de hidrogeno y alquilo(C1-4).

Los ejemplos preferidos del compuesto representado por la f formula (B)

arriba con respecto a la formula (E) se aplican de

geno, halogeno, hidroxi, alcoxi(Ci-6) y -NRA5RA6,

hidroxi, alcoxi(Ci-6) o -NRA5RA6. Preferiblemente, RA1 y -NRA5RA6.

onalmente una estructura -T-(CRE7RE8)n-V-. Las

l estructura y en particular las definiciones de mas

A2 que forman esta estructura.

o alcoxi.

E7RE8)n-V- o una estructura correspondiente en la

mas arriba para la estructura -T-(CRE7RE8)n-V- se

el anillo de fenilo ademas de RA1 y RA2. RA3 puede

enilo o naftilo), preferiblemente un grupo alquilo(C1-

mente un atomo de halogeno, un grupo alquilo(C1-feriblemente un atomo de halogeno o un grupo

feriblemente un grupo alquilo(C1-4).

ilo(C1-e); preferiblemente RA5 y RA6 se seleccionan

la (E) incluyen compuestos representados por la

Las definiciones de X, Y, Z, M, L, anillo D, m, p y Hal dadas manera analoga a la formula (B).

RB1 se selecciona de hidroxi, alcoxi(C1-6) y -NRB5RB6 Preferibl RB2 se selecciona de hidrogeno, halogeno, hidroxi, alcoxi(C1 hidrogeno, hidroxi, alcoxi(C1-6) y -NRB5RB6

En una realizacion, RB1 es hidroxi o alcoxi(C1-6) y RB2 es hidrog RB5 y RB6 se seleccionan independientemente de hidrogeno y independientemente de hidrogeno y alquilo(C1-4).

Otros sustituyentes RB3 pueden estar optativamente presentes ser un grupo alquilo(C1-6) o un grupo arilo(C5-1o) (tal como un gr 6), mas preferiblemente un grupo alquilo(C1-4).

Tambien pueden estar presentes otros sustituyentes RB4. Son t 6) o un grupo arilo(C5-1o) (tal como un grupo fenilo o naftilo) alquilo(C1-6), mas preferiblemente un grupo alquilo(C1-6), lo ma Los compuestos de la presente invencion son:

arriba con respecto a la formula (E) se aplican de

te, RB1 es hidroxi o alcoxi(C1-6).

-NRB5RB6, preferiblemente RB2 se selecciona de

ilo(C1-@), preferiblemente RB5 y RB6 se seleccionan

el anillo de fenilo ademas de RB1 y RB2. RB3 puede enilo o naftilo), preferiblemente un grupo alquilo(C1-

mente un atomo de halogeno, un grupo alquilo(C1-feriblemente un atomo de halogeno o un grupo feriblemente un grupo alquilo(C1-4).

Los compuestos preferidos de la presente descripción in yen

Las definiciones dadas más arriba con respecto a RE7, R R se selecciona de hidrogeno; alquilo(Ci-4); -alquileno(Ci el anillo de arilo puede optativamente estar sustituido p de hidrogeno; alquilo(Ci-4); -alquileno(Ci-4)-halogeno. En 4), mas preferiblemente hidrogeno. En una realizacion alt mas arriba, R se puede marcar de manera detectable, si RA7 es H o alquilo(Ci-a), preferiblemente H o alquilo(Ci-4) RA8 es H o alquilo(Ci-a), preferiblemente H o alquilo(Ci-4) RA9 es H o alquilo(Ci-a), preferiblemente H o alquilo(Ci-4) RAi0 es H o alquilo(Ci-a), preferiblemente H o alquilo(Ci-RB7 es H o alquilo(Ci-a), preferiblemente H o alquilo(Ci-4) Los siguientes compuestos de la presente invencion so una eficacia elevada a la hora de inhibir la agregacion de y Hal se aplican de manera análoga a estos compuestos.

-halogeno; y arilo(Ca-io) (tal como fenilo y naftilo), en donde lquilo(Ci-4) o halogeno. Preferiblemente, R se selecciona na realizacion, R se selecciona de hidrogeno; y alquilo(Ciativa, R es -alquileno(Ci-4)-halogeno. Tal y como se explico desea.

articularmente preferidos porque se ha hallado que tienen protema o de tomar imagenes de las protemas agregadas:

en donde Hal es Cl o Br, preferiblemente Hal es Br.

El compuesto mas preferido de la presente invencion es tualmente el siguiente compuesto

Los siguientes compuestos de esta descripcion son par eficacia elevada a la hora de inhibir la agregacion de un larmente preferidos porque se ha hallado que tienen una rotema o de tomar imagenes de protemas agregadas:

en donde Hal es Cl o Br, preferiblemente Hal es Br.

Los compuestos mas preferidos de esta descripcion son la actualidad los compuestos siguientes

Los compuestos de la formula (E) pueden estar tambien p de los mismos.

Los compuestos de la formula (E) forman sales que estan a un compuesto de la formula (E) en la presente memoria a menos que se indique otra cosa. El termino «sal» o «sale sales acidas y/o basicas formadas con acidos y bases contiene tanto un resto basico como un resto acido, se p dentro del termino «sal» o «sales», tal y como se utiliza en aceptables (a saber, que no son toxicas y son fisiologica ej., en las etapas de aislamiento o purificacion que se compuestos de la presente invencion se pueden formar cantidad de acido o base, tal como una cantidad equivale o en un medio acuoso y luego la liofilizacion.

Los compuestos que contienen un resto basico pueden f Las sales por adicion de acido de ejemplo incluyen ac trihaloacetico, por ejemplo, acido trifluoroacetico),

bencenosulfonatos, bisulfatos, boratos, butiratos, citrat digluconatos, dodecilsulfatos, etanosulfonatos, fuma heptanoatos, hexanoatos, hidrocloruros, hidrobromu hidroxietanosulfonatos), lactatos, maleatos, metanosulf entes en forma de profarmacos, esteres, solvatos o sales

mbien dentro del alcance de esta invencion. La referencia entiende que incluye la referencia a las sales del mismo, , tal y como se emplea en la presente memoria, representa rganicos y/u organicos. Ademas, cuando un compuesto en formar zwitterions («sales internas») y estan incluidos presente memoria. Se prefieren sales farmaceuticamente te aceptables), aunque son tambien utiles otras sales, p. eden emplear durante la preparacion. Las sales de los or ejemplo, al hacer reaccionar un compuesto con una , en un medio, tal como uno en el cual la sal se precipita,

ar sales con numerosos acidos organicos e inorganicos. tos (tales como los formados con acido acetico o acido patos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, canforatos, canforsulfonatos, ciclopentanopropionatos, os, glucoheptanoatos, glicerofosfatos, hemisulfatos, , hidroyoduros, hidroxietanosulfonatos (p. ej., 2-tos, naftalenosulfonatos (p. ej., 2-naftlalenosulfonatos), nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfatos, fe pivalatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos (p. mencionados en la presente memoria), tartratos, tiocianat similares.

Los compuestos que contienen un resto acido pueden f Las sales basicas de ejemplo incluyen sales de amonio, potasio, sales de metales alcalinoterreos, tales como sal aminas organicas) tales como benzatinas, dic bis(deshidroabietil)etilendiamina), N-metil-D-glucamina aminoacidos, tales como arginina, lisina y similares.

cuaternizar con agentes tales como haluros de alquilo inf propilo y butilo), sulfatos de dialquilo (p. ej., sulfatos de di ej., cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y fenetilo), y otros.

Los profarmacos (referencia) y los solvatos de los comp presente memoria. El termino «profarmaco», tal y como s que, tras la administracion a un sujeto, sufre una conversi producir un compuesto de la formula (E) o una sal y/o sol

Los solvatos de los compuestos de la formula (E) incluye

Los esteres de los compuestos de la formula (E) incluyen

Los compuestos de la formula (E) pueden existir en su Todas estas formas tautomericas estan contempladas en descripcion, respectivamente.

Todos los estereoisomeros de los presentes compuestos en diferentes sustituyentes), entre ellos las formas enanti dentro del alcance de esta invencion o descripcion, r compuestos de la formula (E) pueden, por ejemplo, esta isomero optico puro o sustancialmente puro que tiene ejemplo, como racematos o con todos los otros, o solo l los compuestos de la formula (E) pueden tener la configur de 1974 de la IUPAC.

Las formas racemicas se pueden resolver mediante meto o cristalizacion de derivados diastereomericos, o separa uno de los isomeros opticos se puede obtener a partir de l entre otros, la formacion de sales con un acido opticame

Todos los isomeros configuracionales de los compuestos en una forma pura o sustancialmente pura. La definicion d de alqueno cis (Z) y trans (E) como los isomeros cis y tra

A lo largo de la especificacion, los grupos y sustituyente estables y compuestos.

Los compuestos de la formula (E) se pueden dar a conoc que incluye optativamente un vehnculo farmaceuticament

La aplicacion de un sistema de ensayo bioqmmico b fluorescentes (SIFT)» en combinacion con ensayos cel causadas por priones, los presentes inventores han criba busca de inhibidores de los procesos de agregacion que particular, las enfermedades causadas por los priones y la la capacidad de ser nuevos tratamientos para estas enfer

Este sistema de ensayo sobrepasa con mucho los sistem que inhiban la agregacion de una protema con respecto segundos por muestra), la cantidad de compuestos qmm agente utilizado (p. ej., solo el equivalente de 0,2 mg de estos requisitos relativamente bajos de recursos y tie compuestos (a saber, 20000). Ademas, el mapeo de todo y su analisis automatico permite la evaluacion eficaz y el La combinacion con los procedimientos de cribado en cult ropionatos (p. ej., 3-fenilpropionatos), fosfatos, picratos, ., los formados con acido sulfurico), sulfonatos (p. ej., los , toluenosulfonatos, tales como tosilatos, undecanoatos y

ar sales con numerosas bases organicas e inorganicas. es de metales alcalinos, tales como sales de sodio, litio y de calcio y magnesio, sales con bases organicas (p. ej., hexilaminas, hidrabaminas (formadas con N,N-N-metil-D-glucamidas, t-butilaminas, y sales con s grupos basicos que contienen nitrogeno se pueden ores (p. ej., cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, tilo, dietilo, dibutilo y diamilo), haluros de cadena larga (p. estearilo), haluros de aralquilo (p. ej., bromuros de bencilo

tos de la formula (E) tambien estan contemplados en la mplea en la presente memoria, representa un compuesto química mediante procesos metabolicos o qmmicos para o del mismo.

por ejemplo, hidratos.

teres de alquilo(Ci-6), preferiblemente de alquilo(Ci-4).

ma tautomerica (p. ej., como un eter de amida o imino). presente memoria como parte de la presente invencion o

ej., los que pueden existir debido a carbonos asimetricos ericas y las formas diastereomericas, estan contempladas ectivamente. Cada uno de los estereoisomeros de los ustancialmente libres de otros isomeros (p. ej., como un actividad especificada) o pueden estar mezclados, por seleccionados, estereoisomeros. Los centros quirales de n S o R, tal y como se define segun las recomendaciones

ffsicos, tales como cristalizacion fraccionada, separacion por cromatograffa de columna en columna quiral. Cada racematos mediante cualquier metodo idoneo que incluye, activo seguida de la cristalizacion.

la formula (E) estan contemplados, bien en mezcla o bien s compuestos de la formula (E) abarca tanto los isomeros de los hidrocarburos dclicos o anillos de heterociclo.

e los mismos se pueden elegir para dar a conocer restos

en forma de una composicion farmaceutica o diagnostica ceptable.

do en la tecnica de «cribado de dianas intensamente es por cultivo celular de los modelos de enfermedades grandes colecciones de compuestos sinteticos in vitro en ompanan a las enfermedades neurodegenerativas y, en inucleinopatfas a nivel molecular. Tales inhibidores tienen dades.

de ensayo en uso para la busqueda de nuevos farmacos l grado de automatizacion, la velocidad de medicion (75 s (solo 200 picomoles por ensayo primario), asf como el erebro de un caso de ECJ por ensayo) necesarios. Solo permiten el cribado de tales cantidades elevadas de os datos de cribado sobre una base de datos centralizada alisis de las relaciones entre la estructura y la actividad. celular, que se incluyen en la presente invencion, permite la identificacion de los compuestos que son activos tanto e As^ pues, se identifican compuestos que no son solo activ asegura la estabilidad y reactividad apropiadas de los aplicaciones in vivo.

As^ pues, los presentes inventores identificaron una s posteriormente se validaron con diluciones seriadas para muy bajas. Los compuestos caracterizados como «activ aglomeracion, lo que revelo un grupo de cinco aglomeraci compuestos muy activos, que pertenecen a la clase de (DPP) (comparese con el motivo DPP mostrado en la fig

Los presentes inventores sustituyeron ademas diferentes identificar los compuestos relacionados idoneos como in las enfermedades neurodegenerativas y, en particular, la a nivel molecular. Mediante el uso de este metodo m adicionales. Estos compuestos, junto con las sustancia pruebas, entre ellas los ensayos de SIFT, ensayos con c ensayos bioqmmicos dirigidos a la agregacion de la aactividad de estos compuestos tanto in vitro como in vivo. de inhibir con eficacia la formacion de multfmeros de la modelos in vitro para esta agregacion patologica de prot de que los compuestos identificados no pueden funcio tienen potencial terapeutico para las sinucleinopatfas, selectivamente sobre el mecanismo patologico a nivel mol sobre ambos, agregacion de protemas prionicas y de antiagregante general contra un abanico mas amplio de plegamiento incorrecto de las protemas en conformacio para la posterior agregacion de la protema en las fibrillas relacionados con los miembros de la clase de sustancias el tratamiento causativo de un panel entero de enfermed entre ellas, pero sin limitarse a ellas, enfermedad de P Alzheimer, atrofia multisistemica, enfermedad difusa con amiotrofica, enfermedad de Huntington, ataxias espino amiloide cerebral hereditaria, polineuropatia amiloidotic amiloidosis sistemica reactiva (amiloidosis AA), diabetes microglobulina p2, amiloidosis no neuropatica hereditaria,

La presente invencion se refiere ademas al compuesto de mismo, para ser usado en el tratamiento o la prevencion protema y/o una enfermedad neurodegenerativa. Otras invencion para la preparacion de una composicion farm con la agregacion de una protema y/o una enfermedad n

El termino «agregacion», de acuerdo con la presente inve multimericos de tfpicamente uno o varios tipos de prote biomoleculas adicionales, como glucidos, acidos nucleico

El termino «protema implicada en una enfermedad relacio neurodegenerativa», tal y como se utiliza en la presente por la presencia de protemas agregadas. Tales protemas mas preferiblemente en el tejido nervioso o en el tejido enfermedad concreta.

La presente invencion se refiere ademas al uso de un c mas arriba para preparar una composicion farmaceutica agregacion de una protema y/o una enfermedad neurode

De acuerdo con la presente invencion, el termino «comp administracion a un paciente, preferiblemente un pacie comprende los compuestos citados mas arriba y, optativa de los compuestos de la invencion, con lo que, por eje composicion puede estar en forma solida, lfquida o gas polvos, uno o varios comprimidos, una o varias solucione la presente invencion puede, optativamente y ademas, ejemplos de vehmulos farmaceuticos idoneos se conocen con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones d os ensayos bioqmmicos como en los ensayos con celulas. in vitro, sino tambien en un contexto celular, p. ej., lo que mpuestos identificados para el posterior desarrollo para

de compuestos activos en este cribado primario, que ntificar los compuestos activos incluso a concentraciones » en el cribado primario se sometieron a un analisis de es cercanas (DPP_1 a DPP_5; figura 1), que comprenden puestos qmmicos de los derivados del 3,5-difenilpirazol 1).

stituyentes de la clase de compuestos identificados para idores de los procesos de agregacion que acompanan a nfermedades causadas por priones y las sinucleinopatfas cino-qmmico, se sintetizaron una serie de compuestos seleccionadas del cribado inicial, se sometieron a mas os celulares, experimentos in vivo con ratones, asf como uclema (veanse los ejemplos). Asf pues, se verifico, la hallazgo de que estos compuestos son tambien capaces sinuclema a concentraciones micromolares bajas en los as hallada en las sinucleinopatias es una indicacion clara solo como compuestos antiprionicos, sino que tambien o la enfermedad de Parkinson, DCL y AMS, al actuar ular. Ademas, la actividad inhibidora de estos compuestos a-sinuclema in vitro, puede ser reflejo de su actividad ermedades por agregacion de una protema, en donde el en las que predominan las laminas p conforma la base amiloide. Asf pues, estos compuestos y los compuestos DPP es posible que resulten utiles como tratamiento para s por agregacion de una protema (neurodegenerativas), inson, enfermedad causada por priones, enfermedad de rpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral rebelosas y otras enfermedades por poli-Q, angiopatfa amiliar, amiloidosis sistemica primaria (amiloidosis AL), tipo 2, amiloidosis localizada por inyeccion, amiloidosis de iloidosis sistemica hereditaria finlandesa.

presente invencion, asf como a un ester, solvato o sal del una enfermedad relacionada con la agregacion de una alizaciones son el uso de un compuesto de la presente utica para tratar o prevenir una enfermedad relacionada odegenerativa.

ion, se refiere a la formacion de complejos oligomericos o s, que pueden estar acompanadas por la integracion de lfpidos, en los complejos.

da con la agregacion de una protema y/o una enfermedad moria, se refiere a las enfermedades que se caracterizan egadas pueden formar depositos en determinadostejidos, l cerebro. La extension de la agregacion depende de la

puesto de la presente invencion tal y como esta definido ara tratar o prevenir una enfermedad relacionada con la nerativa.

icion farmaceutica» se refiere a una composicion para la humano. La composicion farmaceutica de la invencion nte, otras moleculas capaces de alterar las caractensticas lo, se estabiliza, se modula y/o se activa su funcion. La a y puede estar, entre otros, en forma de uno o varios uno o varios aerosoles. La composicion farmaceutica de prender un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Los n en la tecnica e incluyen soluciones salinas tamponadas ceite/agua, diferentes tipos de humectantes, soluciones esteriles, solventes organicos entre ellos DMSO, etc. La formular mediante los metodos convencionales bien con

La composicion farmaceutica se formulara y se dosificar en cuenta la afeccion clmica de cada paciente, el sitio de administracion, la pauta de administracion y otros fac La «cantidad eficaz» de la composicion farmaceutica p pues, mediante tales consideraciones. El experto en l farmaceuticas administradas a un individuo dependeran,

Las composiciones farmaceuticas de la invencion o des intracisterna, intravaginal, intraperitoneal, topica (tal com bucal, o como un pulverizador oral o nasal. Con «vehfc a un relleno solido, semisolido o lfquido, diluyente, mat que no es toxico. El termino «parenteral», tal y como administracion que incluyen la inyeccion e infusion subcutanea e intraarticular.

La composicion farmaceutica tambien se administra id ejemplos idoneos de composiciones de liberacion prolon de artfculos conformados, p. ej., pelfculas o microcapsul (patente de los EE. UU. n.° 3 773 919, patente europ glutamato (Sidman. U et al., Biopolymers 22: 547-556 ( Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981) y R. Langer, C Langer et al., vease mas arriba) o acido poli-D-(-)-3-hi farmaceutica de liberacion prolongada tambien incluye contienen la composicion farmaceutica se preparan me 32 18121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 77: 4030-4034 (1980); patente europea EP 52322; pate europea EP 143949; patente europea EP 142641; solic nos 4 485 045 y 4 544 545; y patente europea EP 10 pequeno (aproximadamente 200 a 800 A) en los que el en moles de colesterol, en donde la proporcion seleccio

Para la administracion parenteral, la composicion farma deseado de pureza, en una forma inyectable de dosis farmaceuticamente aceptable, a saber, uno que no es empleadas, y que es compatible con otros ingredientes

Por lo general, las formulaciones se preparan al poner de manera uniforme e mtima con los vehfculos lfquidos Entonces, si es necesario, se conforma el producto en vehfculo parenteral, mas preferiblemente una solucion de tales vehfculos incluyen agua, solucion salina, solucio tales como aceites no volatiles y oleato de etilo son tamb vehfculo contiene idoneamente cantidades minusculas la estabilidad qrnmica. Tales materiales no son toxico empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, cit sales; antioxidantes tales como acido ascorbico; (poli)p diez restos), p. ej., poliarginina o tripeptidos; protem polfmeros hidrofilos, tales como polivinilpirrolidona; ami o arginina; monosacaridos, disacaridos y otros glucidos dextrinas; quelantes, tales como EDTA; glucidos polialco sodio; y/o tensioactivos no ionicos, tales como polisorba

Los componentes de la composicion farmaceutica a esteriles. La esterilidad se lleva a cabo con facilidad med (p. ej., membranas de 0,2 pm). Los componentes tera general en un contenedor que tiene un puerto de acces que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccio

Los componentes de la composicion farmaceutica se al o de varias dosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados para la reconstitucion. A modo de ejemplo de una form solucion acuosa al 1% (p/v) esterilizada por filtracion prepara mediante la reconstitucion del compuesto o co para inyeccion.

posiciones que comprenden tales vehuculos se pueden s.

consonancia con las buenas practicas medicas, y tendra ministracion de la composicion farmaceutica, el metodo conocidos por los medicos encargados del tratamiento. s propositos de la presente memoria se determina, asf ica sabe que la cantidad eficaz de las composiciones e otras cosas, de la naturaleza del compuesto.

on se pueden administrar por via oral, rectal, parenteral, diante polvos, unguentos, gotas o parche transdermico), rmaceuticamente aceptable» se quiere hacer referencia e encapsulacion o formulacion auxiliar de cualquier tipo liza en la presente memoria, se refiere a los modos de avenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal,

ente mediante sistemas de liberacion prolongada. Los incluyen matrices de polfmero semipermeable en forma s matrices de liberacion prolongada incluyen polilactidas 58 481), copolfmeros de acido L-glutamico y Y-etil-L-)), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (R. Langer et al., J.

Tech. 12: 98-105 (1982)), acetato de etileno y vinilo (R. utmco (patente europea EP 133 988). La composicion ompuesto atrapado en liposomas. Los liposomas que los metodos conocidos de por sf: patente alemana DE -3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA): uropea EP 36676; patente europea EP 88046; patente e patente japonesa 83-118008; patentes de los Ee . UU. . Habitualmente, los liposomas son de tipo unilaminar nido de lfpidos es superior a aproximadamente el 30% se ajusta para el tratamiento optimo.

a se formula en lmeas generales mezclandola al grado ria (solucion, suspension o emulsion), con un vehfculo para los destinatarios en las dosis y concentraciones formulacion.

ntacto los componentes de la composicion farmaceutica los vehfculos solidos molidos en un polvo fino, o ambos. rmulacion deseada. Preferiblemente, el vehfculo es un s isotonica con la sangre del destinatario. Los ejemplos Ringer y solucion de dextrosa. Los vehfculos no acuosos, tiles en la presente memoria, asf como los liposomas. El itivos, tales como sustancias que refuerzan la isotoma y a los destinatarios en las dosis y las concentraciones succinato, acido acetico y otros acidos organicos y sus s de baja masa molecular (menos de aproximadamente les como seroalbumina, gelatina o inmunoglobulinas; os, tales como glicina, acido glutamico, acido aspartico incluyen la celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o s, tales como manitol o sorbitol; contraiones, tales como oloxameros o PEG.

ilizada para la administracion terapeutica deben estar la filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles cos de la composicion farmaceutica se colocan por lo ril, por ejemplo, una bolsa o vial de solucion intravenosa dermica.

naran habitualmente en contenedores de dosis unitarias o una solucion acuosa o como una formulacion liofilizada on liofilizada, los viales de 10 ml se llenan con 5 ml de iofiliza la mezcla resultante. La solucion de infusion se stos liofilizados mediante el uso de agua bacteriostatica Tal y como se utiliza en la presente memoria, el termino suficiente para desencadenar la respuesta biologica d deseada es la inhibicion de la agregacion de una protema

Se describe un metodo para identificar un compuesto co protema implicada en una enfermedad relacionada c neurodegenerativa, que comprende las etapas de (a) p agregado marcado de manera diferente de dicha protema de la agregacion que es un derivado de un compuesto tal de marcaciones colocalizadas que representan la extens dicha protema; y (c) comparar el resultado obtenido en disminucion de las marcaciones colocalizadas en prese compuesto para inhibir la agregacion de dicha protema.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el termino compuesta por una sola cadena (poli)peptfdica con un concreta que es preferiblemente soluble en las solucione micromolares o milimolares, y pueden estar modificad derivados de glucidos, lfpidos, fosfato, sulfato, acidos gra Preferiblemente, dicha modificacion es una fosforilac oxidacion y nitracion. El termino «(poli)peptido», tal y co moleculas que comprende el grupo de peptidos, que co polipeptidos, que consiste en mas de 30 aminoacidos. Ta termino «protema» tambien se refiere a (poli)peptidos.

El termino «protema agregada» significa oligomeros o m «protema(s) o polipeptido(s) monomerico(s)», tal y co alteracion de la conformacion tridimensional de las unida a las unidades de las protemas monomericas y una solu acuosas.

El termino «compuesto para inhibir la agregacion de una la formacion de agregados de protemas y/o que es capa ya existen, en donde dichos compuestos se derivan Preferiblemente, tales compuestos estan disenador computacional significa el uso de herramientas de cribad forma monomerica o a la forma agregada de la protema estructura tridimensional de las protemas, preferiblemen preferiblemente, el sustrato se remplaza por un candidato

El termino «protema... marcada» se refiere a una protem unido de manera directa o indirecta. La marcacion indirect mas en concreto a anticuerpos marcados. La union del que conoce el experto en la materia y que estan descrita Harlow y Lane, «Antobodies, A Laboratory Manual», CSH

El termino «protema marcada diferencialmente» significa llevan unidas diferentes marcadores. Un ejemplo tfpico Texas» a la protema monomerica. Ya que estos marcado puede determinar la cantidad y/o la localizacion de las iso marcadores permite cuantificar la presencia de marcador muy cerca los unos de los otros.

La «determinacion de la cantidad de marcadores colocal separado (a saber, espedfica de la longitud de onda) de onda diferentes que vienen desde el mismo elemento de una muestra en un periodo de tiempo muy breve de t computarizada del numero de fotones respectivo, que multidimensional con un eje para el numero de fotones de de onda, el numero de fotones de un periodo de tiempo c en un histograma de intensidad de fluorescencia bidimen

El termino «comparar el resultado obtenido en presencia del compuesto sobre la formacion y/o la cantidad de a memoria, una disminucion de los marcadores colocaliza incluso mas preferiblemente de mas del 50% y lo mas pref candidato a inhibir la agregacion, es indicativa de la cap ntidad terapeuticamente eficaz» se refiere a una cantidad ada. En la presente invencion, la respuesta biologica

na mejora de la eficacia para inhibir la agregacion de una la agregacion de una protema y/o una enfermedad er en contacto una protema monomerica marcada y un (1) presencia y/o (2) ausencia de un candidato a inhibidor como esta definido mas arriba; (b) determinar la cantidad de la fijacion de la protema monomerica al agregado de esencia o ausencia de dicho compuesto, en donde una a de dicho compuesto es indicativa de la capacidad del

rotema monomerica» se refiere a una unidad molecular onformacion tridimensional espedfica de cada protema cuosas hasta concentraciones tfpicamente nanomolares, mediante la union covalente de uno o varios glucidos, y nucleotidos a determinados aminoacidos en la cadena. , glucosilacion, procesamiento proteolftico, glucacion, se utiliza en la presente memoria, describe un grupo de iste en 30 aminoacidos o menos, asf como el grupo de como se utiliza a lo largo de la presente especificacion, el

fmeros unidos no covalentemente de uno o mas tipos de esta definido mas arriba, que se caracterizan por una de protema con las que forman complejos con respecto dad tfpicamente baja de los complejos en las soluciones

tema» se refiere a un compuesto que es capaz de impedir e desintegrar o degradar los agregados de protema que r modificacion de los compuestos de la formula (E). r modelado computacional, en donde el modelado virtual para la busqueda de compuestos que se fijan a la a ambas. Por lo general, estos metodos se basan en la de las protemas cristalizadas junto con el sustrato. Mas modulador o inhibidor.

la cual se une un marcador. Dicho marcador puede estar ace referencia en particular a los (poli)peptidos marcados, rcador se puede realizar mediante una serie de tecnicas n los manuales de texto estandares (vease, por ejemplo, ress, Cold Spring Harbor, 1998).

ue la isoforma agregada y la monomerica de la protema la union de «FITC» a la protema agregada y del «rojo son detectables con luz de diferente longitud de onda, se mas de la protema. Mas en particular, el uso de diferentes colocalizados, a saber, de marcadores que se encuentran

dos» se puede llevar a cabo, p. ej., con la medicion por umero de fotones sueltos de al menos dos longitudes de lumen pequeno de tfpicamente menos de 1 femtolitro de amente menos de 100 ps seguido de la comparacion e pueden representar graficamente en un histograma a longitud de onda concreta. En el caso de dos longitudes reto se puede representar, asf pues, como puntos unicos nal.

ausencia de dicho compuesto» significa valorar el efecto gados de protema. Tal y como se utiliza en la presente de mas del 10%, mas preferiblemente de mas del 25%, blemente de mas del 95%, en presencia de un compuesto ad que tienen los compuestos para inhibir la agregacion de una protema. El termino «ausencia de dicho compue o ha sido, anadido a la protema agregante. En casos c saber, compuestos que no tienen ningun efecto sobre l compuesto» tambien hace referencia a estos casos. De inhiben la agregacion de una protema se puede utilizar nuevos compuestos inhibidores. Es evidente que el termi obvias, los compuestos a los que se hace referencia eficaz. Preferiblemente, la concentracion eficaz es de m incluso mas preferiblemente por debajo de 1 j M.

El metodo de la presente especificacion es particular interferir con la agregacion de una protema con una m compuestos derivados y permite identificar los compue presente invencion, el metodo se basa en la espectrosc espectroscopia de correlacion de fluorescencia (FCS, po permite el analisis muy sensible de la agregacion de u como las enfermedades causadas por los priones, a niv Giese et al., 2000, Post et al., 1998). Ademas, la FCS se y se ha convertido en un metodo consolidado para el cr 1998). La espectroscopia de correlacion de fluorescenci de las senales causadas por la difusion de las molec elemento de volumen abierto definido por un haz de microscopio de gran abertura y que toma imagenes de

(Schwille et al. 1997). En su realizacion mas preferida, e para el cribado masivo basandose en la inhibicion de, formacion de oligomeros o protofibrillas o fibrillas de a-si

Este sistema de ensayo para la deteccion de inhibidore busqueda de nuevas sustancias terapeuticas para cualq la agregacion de protemas espedficas, tales como la Ademas, debe ser posible buscar sustancias con pote formacion de multfmeros desempena una funcion cru qrnmica de sus componentes.

En una realizacion preferida de la presente descripcion,

Preferiblemente, el marcador se selecciona del grupo que (FITC), rodamina, rojo Texas, Alexa 488, Alexa 647, fic dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluorescema (JOE),

hexaclorofluorescema (HEX), 5-carboxifluorescema (5 marcadores radiactivos, p. ej., 32P, 35S, 3H, etc. El marc p. ej., la protema o el (poli)peptido o el compuesto de la que llevan un companero de fijacion de alta afinidad, companero de fijacion esta conjugado a un marcador de

En otra realizacion preferida de la presente descripcio fragmento de un anticuerpo que se fija espedficamente

El termino «fijacion espedfica» de los anticuerpos se cruzada. Preferiblemente, «anticuerpo que se fija esped (poli)peptidos con una identidad de menos del 98%, de menos del 80%, de menos del 75%, de menos del 70 conocidos en la tecnica) con un (poli)peptido codificado p tambien describirse o especificarse en terminos de su afi las que tienen una constante de disociacion o Kd de me M, 5 * 10-9M, 10-9 M, 5 * 10-10 M, 10-10 M, 5 * 10'11 M, 5 * 10-15M y 10-15M.

El termino «anticuerpo» se refiere a anticuerpos policl unica, Fv de cadena unica, o a fragmentos de anticuerp derivados de anticuerpos comprenden ademas los frag (1988) y (1999), loc. cit. En la tecnica se conocen diferen tales anticuerpos y/o fragmentos. Asf pues, los d peptidomimetica. Ademas, las tecnicas descritas para l otras, la patente de los EE. UU. n.° 4 946 778) se p espedficos contra uno o varios polipeptidos y protema transgenicos se pueden utilizar para expresar anticuerpo ignifica que ningun inhibidor ni candidato a inhibidor es, tos, puede ser util la adicion de controles negativos, a gacion de una protema. El termino «ausencia de dicho modo, ninguno de los compuestos de la formula (E) que control positivo en los ensayos para la identificacion de presencia» tambien se refiere a la cantidad. Por razones presente especificacion tienen diferente concentracion de 100 j M, mas preferiblemente por debajo de 10 j M e

util para identificar nuevos compuestos capaces de eficacia. Permite el cribado de grandes colecciones de ue inhiben con una alta fidelidad. En un aspecto de la de correlacion de fluorescencia. En los ultimos anos, la ombre en ingles) se ha reconocido como un metodo que rotema en las enfermedades neurodegenerativas, tales lecular (Bieschke y Schwille, 1997, Bieschke et al. 2000, a por sf misma a la miniaturizacion y a la automatizacion, masivo en la industria farmaceutica (Koltermann et al. S) en su forma confocal actual analiza las fluctuaciones marcadas con una unica fluorescencia a traves de un ser de excitacion enfocado a traves de un objetivo de a confocal en un detector de recuento de fotones sueltos odo se basa en esta tecnologfa. Este metodo es idoneo jemplo, la fijacion de PrPC a agregados de PrPSc o la ma.

la agregacion de una protema se puede utilizar para la nfermedad neurodegenerativa que esta relacionada con rmedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. terapeutico para todas las enfermedades en las que la n la patogenia, independientemente de la naturaleza

s marcadores son marcadores fluorescentes.

iste en fluorocromos, p. ej., isotiocianato de fluorescema na, aloficocianina, 6-carboxifluorescema (6-FAM), 2',7'-arboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2',4',7',4,7-) o W,W,W,W-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), ambien puede ser un sistema de dos etapas, en donde, ente invencion esta conjugado a biotina, haptenos, etc., j., avidina, anticuerpos espedficos, etc., en donde el ble.

hos marcadores estan unidos a un anticuerpo o a un a protema.

describir, por ejemplo, en terminos de su reactividad ente a...» se refiere a los anticuerpos que no se fijan a os del 95%, de menos del 90%, de menos del 85%, de de menos del 65% (segun se calcula con los metodos protema agregante. No obstante, los anticuerpos pueden de fijacion. Las afinidades de fijacion preferidas incluyen e 5 * 10'6 M, 10'6 M, 5 * 10'7 M, 10'7 M, 5 * 10'8 M, 10'8 , 5 * 10'12 M, 10'12 M, 5 * 10'13 M, 5 * 10'14 M, 10'14M,

s, monoclonales, quimericos, humanizados, de cadena mo, entre otros, los fragmentos Fab. Los fragmentos o s F(ab')2, Fv o scFv; vease, por ejemplo, Harlow y Lane rocedimientos y se pueden utilizar para la produccion de dos (de anticuerpo) se pueden producir mediante duccion de anticuerpos de cadena unica (vease, entre n adaptar para producir anticuerpos de cadena unica fusion de esta invencion. De igual forma, los animales anizados espedficos contra los polipeptidos y protemas de fusion de esta invencion. Lo mas preferiblemente, el Para la preparacion de anticuerpos monoclonales, se p producidos mediante el cultivo continuo de lmeas celu hibridomas (Kohler y Milstein, Nature 256 (1975), 495-497 B de humano (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodi resonancia de plasmones superficiales segun se emplea la eficacia de los anticuerpos fagicos que se fijan a un Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. I en el contexto de esta invencion que el termino «anticuerp expresar en las celulas, p. ej., construcciones de anticu entre otros, virus o vectores plasirftdicos. El experto en la ser remplazados por otros compuestos de fijacion esped de fagos (exposicion en fagos) o con (poli)peptidos aislad o marcados con cualquiera de los marcadores descritos e pueden obtener de humano, raton, rata, cabra o conejo.

En una realizacion mas preferida de la presente descripcio agregada y la protema monomerica.

El termino «capaz de discriminar» se refiere a un anticu agregada de la protema. Preferiblemente, dicho anticuerp protema, mas preferiblemente la Kd esta disminuida 10 fijarse a una isoforma de la protema, mientras que es ese

En otra realizacion preferida de la presente descripcion, la del metodo de «cribado de dianas intensamente fluoresc de imagenes de alta resolucion.

Preferiblemente, dicha toma confocal de imagenes de al laser confocal o con un microscopio que utiliza la tecnolo

En otra realizacion preferida de la presente descripcion, del grupo que consiste en protema prionica, protema dismutasa, protema t, inmunoglobulina, amiloide A, trans TDP-43, amilina, ANF, gelsolina, insulina, lisozima, fibrin de poli-Q, y fragmentos o derivados de dichas protemas. agregantes se seleccionan del grupo que consiste en pro realizacion mas preferida, las protemas monomericas y a

Preferiblemente, dichas protemas con un tramo de poli-Q consecutivos. Mas preferiblemente, dichas protemas con huntingtina y ataxina.

Preferiblemente, dichos fragmentos o derivados se selec procesamiento proteolftico, glucacion, oxidacion y nitracio pueden contener uno o varios glucidos, derivados de gl unidos a aminoacidos independientes en la cadena.

glucosilacion, procesamiento proteolftico, glucacion, oxid

La protema puede ser una protema de vertebrado o de in mairftfero o de ave. Mas preferiblemente, la protema de ganado bovino (vacuno), cerdo y oveja. En casos concreto por ejemplo, la forma agregada de PrPSc derivada de hu

Las protemas se pueden aislar de un animal o de un cultiv Los inventores han contemplado que las protemas pue tratadas con enzimas, tales como proteasas o glucosidas

En otra realizacion mas preferida de la presente descri protema agregada es la PrPSc (Prusiner, 1998).

En otra realizacion mas preferida de la presente descri protema agregada se selecciona del grupo que consiste

Se describe un metodo para seleccionar compuestos qu enfermedades relacionadas con la agregacion de una prot (a) administrar un compuesto candidato, que es un deriv ticuerpo de esta invencion es un anticuerpo monoclonal. e utilizar cualquier tecnica que proporciona anticuerpos es. Ejemplos de tales tecnicas incluyen la tecnica de a tecnica de triomas, la tecnica de hibridomas de linfocitos tecnica de hibridomas con EBV para producir anticuerpos and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc, (1985), 77-96). La el sistema de BIAcore se puede utilizar para incrementar ftopo de un polipeptido de la invencion (Schier, Human unol. Methods 183 (1995), 7-13). Tambien se contempla comprende construcciones de anticuerpos que se pueden os que se pueden transfectar y/o transducir a traves de, nica sabe que, en muchos casos, los anticuerpos pueden a, tales como los peptidos expuestos sobre la superficie El anticuerpo o los (poli)peptidos pueden estar sin marcar a presente invencion. Preferiblemente, los anticuerpos se

dicho anticuerpo es capaz de discriminar entre la protema

o que es espedfico de la isoforma monomerica o de la iene una Kd disminuida en 5 veces por una isoforma de la es. Como consecuencia, dicho anticuerpo es capaz de ialmente incapaz de unirse a la otra isoforma.

ntidad de marcador colocalizado se determina con el uso s (SIFT)» (Bieschke et al., 2000), FRET o toma confocal

resolucion se realiza con un microscopio de barrido con de discos giratorios.

as protemas monomericas o agregantes se seleccionan ecursora del amiloide (PPA), a-sinuclema, superoxido etina, microglobulina p2, cistatina C, apolipoprotema A1, no, huntingtina y ataxina, y otras protemas con un tramo n una realizacion preferida, las protemas monomericas y a precursora del amiloide (PPA) y a-sinuclema. En una gantes son la a-sinuclema.

n protemas que tienen al menos 36 restos de glutamina ramo de poli-Q se seleccionan del grupo que consiste en

nan del grupo modificado por fosforilacion, glucosilacion, Los (poli)peptidos mencionados en la presente invencion os, ftpidos, fosfato, sulfato, acidos grasos y nucleotidos feriblemente, dicha modificacion es una fosforilacion, n y nitracion.

rtebrado. Preferiblemente, la protema es una protema de airftfero se selecciona de primate, humano, raton, rata, puede ser preferible utilizar isoformas mezcladas, a saber, o y la forma monomerica derivada de raton.

e tejidos, o se pueden preparar por medios recombinantes. n estar modificadas químicamente o que puedan estar para mejorar la manipulacion en el sistema de ensayo.

on, la protema monomerica es la protema prionica y la

ion, la protema monomerica es la a-sinuclema y dicha oligomeros o protofibrillas o fibrillas de la a-sinuclema.

ayan mejorado su eficacia in vivo para el tratamiento de a y/o enfermedades neurodegenerativas, que comprende del compuesto de la formula (E), a un cultivo celular o a un animal que tiene la isoforma agregable de la protema cantidad de agregados observables; y (c) identificar y sele o la formacion de agregados de dicha protema.

Este metodo permite analizar los compuestos candidato saber, fuera de un organismo vivo. El analisis de los com en los ejemplos (vease mas adelante). El analisis de los adicional importante que incluye datos en cuanto a toxici entorno, y la capacidad para alcanzar la ubicacion donde

Preferiblemente, el compuesto se administra a varias co se puede observar un efecto sobre la agregacion de una refiere a la concentracion (molar) de un compuesto que compuesto.

La presente invencion o descripcion tambien se refiere definido mas arriba para inhibir la agregacion de una prot

En una realizacion preferida, el animal es un animal no h

La presente invencion o descripcion se refiere ademas a el compuesto de la invencion o descripcion, respe farmaceuticamente aceptable.

De acuerdo con la presente especificacion, el termino «c diagnosticar en cada uno de los pacientes su posible resp farmaceuticas de la especificacion. El termino «composici determinar la presencia de las protemas agregadas q composicion diagnostica comprende los compuestos comprender ademas los tampones adecuados y las e termoestables, etc. Las composiciones diagnosticas se p

En una realizacion preferida mas, la eficacia de dicho co

El termino «derivacion», de acuerdo con la presente relacionados desde el punto de vista qmmico que tienen

En una realizacion preferida de la presente invencion o de manera detectable. Se entiende que un compuesto presencia se puede seguir mediante tecnicas convencion tomograffa de emision de positrones (TEP), microscopia (RMN), espectrometna, cromatograffa, ELISA, deteccio recuento de centelleo o recuento y, preferiblemente TEP.

Cuando los compuestos de la formula (E) se han de uti agregadas, en concreto de los depositos de amiloide, de dependera del metodo que se ha de utilizar para la to radiactivos que emiten positrones (TEP) y que tienen una en concreto 18F y 11C. Debido a su semivida breve, los poco antes de ser usados para el analisis.

En consecuencia, la composicion diagnostica tambien s precursores de los compuestos de la formula (E), que se es particularmente comodo, si el compuesto de la formul N(R4)- y R4 comprende un marcador detectable.

En una realizacion preferida, el compuesto que se utiliza en el que R4 es -alquileno(Ci-4)-halogeno, en donde el at el compuesto que se utiliza para tomar imagenes posee que contiene al menos un isotopo de 11C.

El experto en la tecnica sera capaz de idear metodos compuestos de la formula (E). Los siguientes esquemas

El tosilato de 2-[18F]fluoroetilo 2 es un precursor util p fluoroetilacion de los compuestos que contienen los nu metilaciones mediadas por metales (R. Schirrmacher et tosilato de 2-[18F]fluoroetilo se puede sintetizar en una smt gun se define en la presente invencion; (b) cuantificar la onar un compuesto que es capaz de reducir los agregados

vivo, a saber, en el interior de las celulas, o ex vivo, a stos candidatos in vivo y ex vivo se muestra, por ejemplo, puestos candidatos in vivo y ex vivo da una informacion , estabilidad en presencia de un complejo qmmico en el consigue un efecto molecular deseado.

ntraciones para determinar una concentracion en la que tema y para calcular la CE50, en donde el termino CE50 se duce el 50% de la respuesta maxima posible para dicho

uso de un compuesto de la formula (E) tal y como esta a en un animal (referencia), in vitro o ex vivo.

ano.

composicion farmaceutica o diagnostica que comprende amente y, optativamente, un vehmulo o excipiente

posicion diagnostica» se refiere a las composiciones para sta o capacidad de curacion debidas a las composiciones diagnostica» tambien se refiere a las composiciones para subyacen en las enfermedades citadas mas arriba. La ados mas arriba. La composicion diagnostica puede imas, tales como la transcriptasa inversa, polimerasas en empaquetar en un envase o en varios envases.

esto se mejora adicionalmente por derivacion.

ecificacion, se refiere a la generacion de compuestos dificaciones en al menos una posicion de la molecula.

cripcion, dicho compuesto es detectable o esta marcado detectable o esta marcado de manera detectable si su s, tales como espectroscopia de RMN, deteccion optica, lectronica, toma de imagenes por resonancia magnetica de emision de radiactividad, preferiblemente mediante

r como sondas para la toma de imagenes de protemas n estar marcadas. La naturaleza espedfica del marcador de imagenes. Tfpicamente, seran utiles los marcadores mivida breve, tales como 18F, 11C, 125l, 123l, 131l, 77Br y 76Br, puestos marcados de la formula (E) se deben preparar

uede dar a conocer en forma de un kit, que consiste en cen reaccionar para formar el compuesto deseado. Tal kit (E) contiene al menos un resto que es X, Y o L que es -

ra tomar imagenes posee un resto -N(R4)- como X, Y o L, de halogeno es radiactivo. En otra realizacion preferida, resto -N(R4)- como X, Y o L, en el que R4 es -alquilo(Ci-4),

los cuales el marcador detectable se puede unir a los den servir como ejemplos ilustrativos.

incorporar 18F (semivida de 109,8 min) a traves de la filos oxfgeno, azufre y nitrogeno, o mediante diferentes ., J. Label. Compd. Radiopharm. 2002, 45, 763-774). El is de dos etapas, mediante la sustitucion nucleofila directa del 1,2-ditosilato de etilenglicol 1 por la sustitucion nucleofil 18F-fluoroetilante 2. El reactivo no radiactivo 2 se utilizo radiactivos de acuerdo con el esquema A. Se pueden utiliz radioactivos de estos compuestos.

irecta con K[18F]/Kryptofix 2.2.2 para producir el agente a la smtesis de sery 363A, sery 363B y sery 388B no las mismas condiciones para la smtesis de los analogos

Un emisor de positrones mas util, el 11C (semivida de 20,38 (J. Eriksson et al., J. Label. Compd. Radiopharm. 2006, 49, utilizo el yoduro de metilo no radiactivo para la smtesis d esquema B. Se pueden utilizar las mismas condiciones par n), se puede introducir mediante el yoduro de [11C]metilo 77-1186) con el mismo tipo de sustitucion nucleofila. Se ery 392A y sery 392B no radiactivos de acuerdo con el a smtesis de analogos radiactivos de estos compuestos.

Aunque se prefiere unir el resto detectable al anillo D porque esto no es esencial. Es igualmente posible dar a conocer esta en una posicion diferente en la molecula.

La presente descripcion da a conocer un metodo para to comprende las etapas de:

(i) introducir una cantidad detectable de una composici detectable de la presente invencion en un sujeto;

(ii) dar el tiempo suficiente para que el compuesto se asoci (iii) detectar el compuesto asociado a la protema agregada. En una realizacion preferida del metodo de toma de ima consiste en la protema precursora del amiloide (PPA) y la agregada es la a-sinuclema.

La composicion que comprende el compuesto marcado mediante cualquiera de las administraciones descritas ma El compuesto marcado se puede introducir en un paciente compuesto se termine asociando a la protema agregada, dentro del paciente. Como alternativa, el compuesto marc tos compuestos son particularmentefaciles de sintetizar, puestos de la invencion en los que el resto detectable

r imagenes de depositos de protemas agregadas, que

que comprende un compuesto marcado de manera

la protema agregada; y

es, la protema agregada se selecciona del grupo que inuclema. En una realizacion mas preferida, la protema

manera detectable se puede introducir en el sujeto rriba, tales como, por ejemplo, por via oral o parenteral. espues de un intervalo de tiempo suficiente para que el compuesto marcado se detecta de manera no invasiva se puede introducir en un paciente, se deja un tiempo suficiente para que el compuesto se termine asociando a de tejido del paciente y se detecta el compuesto marcado una muestra de tejido de un paciente antes de introduc detectar el compuesto despues de dejar una cantidad de a la protema agregada.

Los metodos para la deteccion del compuesto marcado a e incluyen, sin limitacion, resonancia magnetica nucle tomograffa computarizada de emision monofotonica (SP marcador que se introduce en el compuesto depende de selecciona la TEP como metodo de deteccion, el comp 11C o 18F.

La toma de imagenes de las protemas agregadas tambie se puede determinar la cantidad de protema agregada.

En una realizacion preferida de la invencion o descripci protema se caracteriza por la presencia de formas agreg la misma, en donde esta protema se selecciona del grup amiloide (PPA), a-sinuclema, superoxido dismutasa, microglobulina p2, cistatina C, apolipoprotema A1, TDP huntingtina y ataxina, y otras protemas con un tramo de del grupo que consiste en protema precursora del amiloi protema es la a-sinuclema.

Preferiblemente, dichas protemas con un tramo de polide glutamina. Mas preferiblemente, dichas protemas co huntingtina y ataxina.

El experto en la tecnica sabe que dichas protemas pued modificadas por fosforilacion, glucosilacion, procesamie refiere al hecho conocido por el experto en la tecnica presencia de mas de una protema en la forma agregada. de fragmentos de la protema precursora del amiloide (P

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el enfermedades tales como la enfermedad de Parkins Alzheimer, atrofia multisistemica, enfermedad difusa con amiotrofica, enfermedad de Huntington, ataxias espin amiloide cerebral hereditaria, polineuropatia amiloidotica el termino «enfermedad por agregacion de una prot predominantemente fuera del sistema nervioso e incluye (amiloidosis AL), la amiloidosis sistemica reactiva (amil inyeccion, amiloidosis de la microglobulina p2, amilo hereditaria finlandesa.

En otra realizacion preferida de la invencion, la enferme Parkinson, enfermedad causada por los priones, enferm con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, escler espinocerebelosas y otras enfermedades por poli-Q, amiloidotica familiar, amiloidosis sistemica primaria (amil diabetes de tipo 2, amiloidosis localizada por inyeccion, a hereditaria, amiloidosis sistemica hereditaria finlandes enfermedad de Parkinson.

En una realizacion preferida de la invencion o descripcio de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, variante de la enfe causada por priones, encefalopatfa espongiforme bovina

Finalmente, se describe un kit que comprende el compu de anticuerpo que se fija espedficamente a dicho comp definido mas arriba; y/o protema monomerica o agregada un complejo con dicho compuesto e instrucciones para e

Procedimientos experimentales generales

Los compuestos de la formula (E) se pueden preparar organica. Muchas de tales tecnicas aparecen elaborada rotema agregada y, a continuacion, se toma una muestra el tejido al margen del paciente. Tambien se puede retirar compuesto marcado en la muestra de tejido. Se puede po suficiente para que el compuesto se termine por fijar

ado a la protema agregada se conocen bien en la tecnica MN), tomograffa de emision de positrones (TEP) o la ) para la deteccion de los compuestos radiomarcados. El todo de deteccion a utilizar. Asf pues, por ejemplo, si se debe poseer un atomo emisor de positrones, tal como

puede realizar de manera cuantitativa, de tal forma que

icha enfermedad relacionada con la agregacion de una de al menos una protema o un fragmento o derivado de e consiste en protema prionica, protema precursora del otema t, inmunoglobulina, amiloide A, transtirretina, amilina, ANF, gelsolina, insulina, lisozima, fibrinogeno, . En una realizacion preferida, la protema se selecciona PA) y a-sinuclema. En una realizacion mas preferida, la

n protemas que tienen al menos 36 restos consecutivos mo de poli-Q se seleccionan del grupo que consiste en

xistir en diferentes isoformas, que incluyen las protemas proteolftico y similares. El termino «al menos un...» se ue las enfermedades pueden estar relacionadas con la ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer, los agregados los agregados de t suelen ser detectables.

ino «enfermedades neurodegenerativas» comprende enfermedad causada por los priones, enfermedad de pos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral ebelosas y otras enfermedades por poli-Q, angiopatfa liar. Ademas, tal y como se utiliza en la presente memoria, » se refiere a las enfermedades que se manifiestan rmedades tales como la amiloidosis sistematica primaria sis AA), diabetes de tipo 2, amiloidosis localizada por is no neuropatica hereditaria y amiloidosis sistemica

se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de de Alzheimer, atrofia multisistemica, enfermedad difusa lateral amiotrofica, enfermedad de Huntington, ataxias giopatfa amiloide cerebral hereditaria, polineuropatia sis AL), amiloidosis sistemica reactiva (amiloidosis AA), idosis de la microglobulina p2, amiloidosis no neuropatica n una realizacion mas preferida, la enfermedad es la

icha enfermedad causada por los priones se selecciona dad de Creutzfeldt-Jakon, enfermedad genetica humana B) y tembladera de las ovejas.

de la formula (E) y, ademas, un anticuerpo o fragmento o; y/o protema monomerica o agregada tal y como esta y como esta definido mas arriba, optativamente formando , en uno o mas envases.

ante cualquiera de las tecnicas aplicables de la smtesis L. F. Tietze, Th. Eicher «Reaktionen und Synthesen», 2.

Auflage (Georg Thieme Verlag, Stuttgart, NY, 1991), T Synthesis», tercera edicion (John Wiley & Sons, NY, 199 edicion (John Wiley & Sons, NY, 1985).

A continuacion, se dan a conocer una serie de metodos Estos metodos estan destinados a ilustrar la naturalez alcance de los metodos aplicables.

Por lo general, las condiciones de reaccion, tales como de aislamiento y purificacion, y similares, seran los habit material de referencia citado, junto con el material citado Tfpicamente, las temperaturas seran de -80 °C a 150 ° reaccion seran de 10 segundos a 10 dfas. El aislamient reactivo que no haya reaccionado seguido del reparto e separacion de la capa que contiene el producto.

Las tecnicas sinteticas estandares, tales como el uso de inerte) son frecuentes en la tecnica y se aplicaran cuan

Las modificaciones de cada uno de los esquemas que materiales de ejemplo espedficos que se producen a metodos idoneos de smtesis organica son aplicables a t

En cada uno de los esquemas de ejemplo que aparec reaccion los unos de los otros y/o de los materiales de p purifican (a partir de ahora, se separan) hasta el grado en el campo. Tfpicamente, tales separaciones implican o una mezcla de solventes, destilacion, sublimacion o cantidad de metodos, entre ellos, por ejemplo, la cro intercambio ionico, la cromatograffa de alta, media o baj capa fina o gruesa, asf como tecnicas de cromatograffa

Otra clase de metodos de separacion conlleva el tratam o si no por producir en forma separable, un producto des de la reaccion, o similares. Tales reactivos incluyen ab medios de intercambio ionico o similares. Como alternati basico, bases en el caso de un material acido, reactiv quelantes selectivos tales como eteres de corona, extra

La seleccion de metodos de separacion apropiados d ejemplo, el punto de ebullicion y la masa molecular en grupos funcionales polares en la cromatograffa, la esta extraccion multifasica, y similares. El experto en la tecni separacion deseada.

En concreto, los compuestos de la formula (E) se pueden que se describen, por ejemplo, en M. Ono et al. (Bioorg de patente internacional WO 2008/131148, WO 2004/08 ejemplifican tambien en el apartado de los ejemplos de

Los siguientes ejemplos tienen el proposito de ilustrar.

Los compuestos o realizaciones que no formen parte d han de considerar solo a modo de ilustracion.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificacion de una nueva clase de compu

Dos subconjuntos de la coleccion de compuestos come cada uno con 10000 compuestos, y llamados DIVERSet de la propagacion de los priones mediante el uso del en y un modelo de cultivo celular de la enfermedad causad primarios al analizar los compuestos a una sola concent Ademas, los positivos del cultivo celular se analizaron c

Cribado por SIFT bidimensional

Para analizar el efecto inhibidor de los farmacos sobr . Greene, P. G. M. Wuts «Protective Groups in Organic asf como J. March «Advanced Organic Chemistry», tercera

e ejemplo para preparar los compuestos de la formula (E). de tales preparaciones y no estan destinados a limitar el

mperatura, tiempo de reaccion, solventes, procedimientos les en la tecnica para realizar en concreto esta reaccion. El el, contiene descripciones detalladas de tales condiciones. los solventes seran aproticos o proticos, y los tiempos de la purificacion ffpicamente consisten en extinguir cualquier e un sistema de capas de agua/organico (extraccion), y la

s condiciones de reaccion anhidras (p. ej., entornos de gas sea aplicable.

nen a continuacion conduce a diferentes analogos de los ntinuacion. Las citas dadas mas adelante que describen s modificaciones.

mas abajo, puede ser ventajoso separar los productos de ida. Los productos deseados de cada etapa se separan y/o seado de homogeneidad mediante las tecnicas habituales tracciones multifasicas, la cristalizacion desde un solvente omatograffa. La cromatograffa puede conllevar cualquier tograffa de exclusion por tamanos o la cromatograffa de resion, la cromatograffa preparativa y a pequena escala en equena escala rapida y en capa fina.

to de una mezcla con un reactivo seleccionado por fijarse, do, material de partida sin reaccionar, producto secundario bentes, tales como carbon activado, tamices moleculares, , los reactivos pueden ser acidos en el caso de un material de fijacion tales como anticuerpos, protemas de fijacion, on de iones ffquido/ffquido, o similares.

ende de la naturaleza de los materiales implicados. Por destilacion y la sublimacion, la presencia o ausencia de ad de los materiales en los medios acidos y basicos en la aplicara las tecnicas que con mas probabilidad consigan la

eparar de una manera que es analoga a los procedimientos c & Medicinal Chemistry 16 (2008) 6867-6872), solicitudes 72, 2004/072050 y WO 98/17652. Las das alternativas se resente especificacion.

embargo, no se han de considerar como limitantes.

invencion tal y como se define en las reivindicaciones se

s para inhibir la agregacion de una protema.

ales DIVERSet (ChemBridge Corp., San Diego, CA, USA), y 2 por nosotros, se han cribado en busca de los inhibidores o antiprionico de SIFT bidimensional (Bertsch et al., 2005) or los priones. En ambos ensayos, se obtuvieron positivos ion y posteriormente se verificaron en diluciones seriadas. otra lmea celular.

asociacion entre PrPC y PrPSc en un ensayo de cribado masivo y de alto contenido, aplicamos la tecnica de «cri nombre en ingles), que utiliza una configuracion del micr fotones unicos para dos colores de luz fluorescente. Se 384 pocillos con fondo de portaobjetos de cristal. La m (rPrP), el anticuerpo monoclonal (Acm) L42, que no recon Prpsc preparados a partir del cerebro de humano con ECJ. verde y rojo, respectivamente. La fijacion de varias molec a la formacion de complejos terciarios que muestran mu pueden identificar y analizar mediante el metodo de SIFT, en ambos canales de fluorescencia. La distribucion de las mediante un histograma bidimensional de intensidad de un inhibidor de la asociacion entre rPrP y PrPSc, debe dis terciarios. La distribucion del color de los agregados en sectores «rojos» de dicho histograma.

Cribado primario por SIFT de 20000 compuestos

El sistema de ensayo descrito mas arriba se aplico a dos tipo farmaco (ChemBridge; «DIVERSet1» y «DlVERSet2» primario que incluye controles negativos sin ningun comp DOSPA, asf como controles sin cilindros de ECJ ni compu en la mezcla de anticuerpo y de rPrP).

Las muestras que contienen DOSPA mostraron una red senales de los agregados predominantemente marcados habfa fijado menos rPrp a los cilindros de priones de la anticuerpos marcados en rojo, su fluorescencia todavfa g de los compuestos no influyen en la distribucion de la se hicieron disminuir el numero de agregados detectados en l estan desplazadas hacia los controles de DOSPA. Asf pu que son positivos primarios de posibles farmacos anti generaron artefactos, que obscurecieron toda una medic solo aproximadamente el 7% de las mediciones sin alt idoneas para el analisis de SIFT automatico, principalme analizados. No se esperaba este porcentaje mas bien b SIFT y acentuo la versatilidad y la robustez del ensayo. compuestos esta facilitado por la naturaleza de alto conte registran simultaneamente varios parametros de fluor fluorescencia para cada canal de color. Estos se presenta en cada sector del histograma de distribucion de colores. alta se pueden clasificar con facilidad.

Positivos primarios por SIFT y validacion mediante dilucio

Para que un compuesto se clasifique como un positivo p picos en los sectores «verdes» 1 a 5 y definimos un valor en comparacion con los controles sin tratar como el ef asignaron a valores de actividad de SIFT escalonables caracterizan su efecto inhibidor sobre la agregacion de valores de actividad menores que cero no reflejan ningun reflejan un efecto inhibidor. Aqrn, los valores en torno a 1 mediciones de los controles positivos en una placa dada.

En los positivos primarios se comprobo la inhibicion dep mediante el uso de seis series de diluciones por duplica SIFT. Las curvas de respuesta de la dosis confirmaron l presentaban estos compuestos. En comparacion con el fijacion de rPrP a los cilindrod con los priones se observo

Positivos primarios porcultivo celular y validacion median

Ademas del ensayo por SIFT, las colecciones de DIVE enfermedades causadas por los priones. En estos ensay se analizo inicialmente a una concentracion de 20 pM. L las celulas SMB a 20 pM) estan codificados por una varia «activo» y «0,0» codifica «inactivo». Se validaron los com el objetivo era identificar los compuestos activos incluso a do de dianas intensamente fluorescentes» (SIFT, por su opio confocal de dos colores invertido con detectores de paran las muestras en placas de microtitulacion de 96 y la del ensayo consiste en la PrP recombinante de raton e la PrP de raton sino la PrP de humano, y agregados de as moleculas de rPrP y del Acm se marcan con fluoroforos s de rPrP y del Acm a los agregados de PrPSc dara lugar s fluoroforos unidos rojos y verdes. Tales agregados se rque dan lugar simultaneamente a intensidades elevadas tensidades de fluorescencia roja y verde se puede valorar luorescencia. Siempre y cuando se incluya en el ensayo uir la intensidad de fluorescencia verde de los agregados histograma bidimensional cambiara entonces hacia los

ecciones, cada una con 10000 compuestos diferentes de n placas de microtitulacion de 96 pocillos para un cribado to adicional y controles positivos que contienen 17 pM de tos (que sirven para comprobar la ausencia de agregacion

cion de la senal de SIFT en los sectores que vigilan las on rPrP en verde. Esto indica que en estos controles se . Ya que los cilindros de priones estan marcados por los ra una senal de SIFT en los sectores «rojos». La mayona de SIFT. Pero algunos de los compuestos de DIVERSet sectores «verdes». Las curvas de SIFT de estas muestras , los compuestos correspondientes se pueden considerar nicos. De vez en cuando, algunos problemas tecnicos de una placa de microtitulacion entera. Aparte de esto, r se habfan de tratar como valores extremos y no eran debido a la fluorescencia intrmseca de los compuestos de compuestos que no se podfan tratar en el ensayo de identificacion de las mediciones problematicas y de los o de los datos del ensayo de SIFT. Para cada muestra se encia, como por ejemplo la intensidad media de la nto con la suma de los acontecimientos de alta intensidad or lo tanto, las muestras con una fluorescencia intrmseca

s seriadas

ario, analizamos la suma de la posicion esperada de los corte de aproximadamente el 50% del efecto de DOSPA o mmimo necesario. Los compuestos de DIVERSet se p1_sift) a partir de los datos de cribado por SIFT que nes tal y como describieron Bertsch et al. en 2005. Los cto inhibidor, mientras que los valores mayores que cero dican un efecto inhibidor igualmente grande que el de las

iente de la dosis sobre la asociacion entre PrPC y PrPSc (de 0,1 a 100 pM) de cada compuesto en el ensayo por ctividad inhibidora dependiente de la concentracion que cto de DOSPA a 17 pM, la inhibicion semimaxima de la alores de CE50 en el margen de 0,3 a 60 pM.

diluciones seriadas

et tambien se cribaron en modelos de cultivo celular de la actividad antiprionica de los compuestos de DIVERSet resultados del cribado primario del cultivo de celulas (en binaria (tp3_reduktion), donde un valor de «1,0» codifica stos activos identificados en el cribado primario, en donde ncentraciones muy bajas. La verificacion de los positivos primarios de los cultivos celulares se realizo en series d |jM) para DIVERSet 1 y solo a dos concentracio (tp3_reduktion_mue) se anotan mediante «1,0» para a activo a 2 j M (DS2). Los compuestos inactivos a conc (DS1 2). Ademas, los positivos primarios del cultivo las celulas ScN2a (tp3_scn2a), donde de nuevo «0 respectivamente.

Difenilpirazoles (DPP) y compuestos relacionados a mo

Generacion del mapa de REA

Los compuestos de DIVERSet caracterizados como sometieron a un analisis de aglomeracion con el uso del Inc., St. Louis, MO, EE. UU.) que da lugar al mapa de r compuestos contenidos en las dos colecciones (20 00 analisis de aglomeracion utilizando DataMiner, el an compuestos) del cribado en cultivo de celulas de DIVE para los compuestos activos. Aqm, el programa DataMin estructural y eran activos, y es, por lo tanto, idoneo pa relevantes. En una segunda etapa, la clasificacion asf compuestos inactivos en el cultivo celular. Aqm, el pr aglomeraciones generadas, si la medicion empleada in

El resultado del analisis de aglomeracion se muestra gra en el cual las aglomeraciones de sustancias S estan sfmbolos de tal manera que estan localizados cerca si la de vista estructural. El tamano, la forma y el color d espedficas de la aglomeracion, y los puede seleccionar

Asf pues, se selecciono que el tamano de los sfmbolos numero de compuestos C contenidos en esta. La forma iluciones a cuatro concentraciones (1 j M, 4 j M, 10 j M, 40 (0,2 j M, 2 j M) para DIVERSet 2. Los resultados o a 1 j M (DS1) o a 0,2 j M (DS2) y mediante «0,5» para raciones por encima de 20 j M se anotan mediante «0,0» las celulas SMB se validaron a concentraciones unicas en y «1,0» senalan los compuestos inactivos y activos,

de compuestos antiprionicos nuevos

ctivos» en el cribado primario del cultivo de celulas se quete informatico Benchware HTS DataMiner (DM; Tripos que se muestra en la figura 1. Ya que la gran cantidad de es demasiado grande como un punto de partida para el is se limito inicialmente a los positivos primarios (837 et 1 y 2. Asf pues, los aglomerados se determinaron solo grupo en aglomerados los compuestos que teman similitud identificar nuevas estructuras prototfpicas potencialmente tablecida se aplico al resto de la coleccion que cubre los ama DataMiner anadio mas compuestos (inactivos) a las ba una similitud estructural elevada.

amente mediante DataMiner en forma de un mapa de REA, resentadas mediante sfmbolos. El DataMiner ordena los glomeraciones representadas son similares desde el punto los sfmbolos esta distribuido en funcion las propiedades usuario.

proporcional al tamano de la aglomeracion |S|, a saber, al los sfmbolos se determino en funcion de la fraccion

de dichas sustancias C en las correspondientes aglom segun el cribado por SIFT estaba por encima de un umb cuya fraccion P^sift(S) esta por encima del 50% se mu aglomeraciones inactivas, se muestran como cuadrado fracciones de las aglomeraciones

ciones S, cuya actividad primaria a(C) que se determino seleccionado de amin = 0,25. Asf pues, las aglomeraciones tran como estrellas mientras que el resto, principalmente De manera analoga, el color de los sfmbolos codifica las

de acuerdo con los positivos primarios del cribado b aglomeraciones con mas del 50% de sustancias activa figura 1 se muestra el mapa de REA que se obtiene d rojas grandes simbolizan las aglomeraciones con una al celular. Estas aglomeraciones representan las posibles de interes se analizaron adicionalmente y se identific DPP_1 a DPP_5), que se muestran en la figura 1 aglomeraciones se muestran en la figura 2 junto con s aglomeraciones esten localizadas en una posicion cerca tienen una estructura similar, a saber, todos pertenece difenilpirazol (DPP) (comparese con el motivo de DPP q

Ejemplo 2: Smtesis de nuevos farmacos para inhibir la

Sobre la base del descubrimiento de la nueva estructur serie de sustancias adicionales mediante la sustitucion mas abajo. En lo que viene a continuacion, los compues han de considerar como compuestos de referencia.

ado en el cultivo celular, en donde los sfmbolos de las on rojas y las aglomeraciones restantes son grises. En la nalisis de aglomeracion descrito mas arriba. Las estrellas proporcion de sustancias positivas por SIFT y en el cultivo ucturas prototfpicas. Con el DataMiner, las aglomeraciones n grupo de cinco aglomeraciones vecinas (denominadas negrita. Todos los compuestos clasificados en estas ctividad en los diferentes ensayos. El hecho de que estas las unas con las otras indica que contienen sustancias que a la clase de compuestos qmmicos de derivados del 3,5-se muestra en la figura 1).

egacion bajo los aspectos medico-qmmicos

rototfpica que se describio mas arriba, se sintetizaron una lectiva de diferentes sustituyentes, tal y como se esboza que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones se Esquema 1: Smtesis de isoxazoles

(E)-1-(3,4-Dimetoxifenil)-3-(3-fluorofenil)-2-propeno-1-o

Se agito a temperatura ambiente durante 24 h una fluorobenzadelmdo (1,24 g, 10 mmol), NaOH (50 mg, 1 (10 ml). La reaccion se enfrio a 4 °C, lo que dio lugar a q a partir de metanol y se secara para producir 1 (1,65 g,

2,3-Dibromo-1-(3,4-dimetoxifenil)-3-(3-fluorofenil)-propa

A una solucion de 1 (715 mg, 2,5 mmol) en cloroformo mg, 2,5 mmol) en cloroformo (4 ml) a 0 °C. Despues de de petroleo (20 ml) y la mezcla se refrigero (-24 °C) dura se lavo con n-hexano (10 ml) y se seco para dar 2 (780

3-(3,4-Dimetoxifenil)-5-(3-fluorofenil)isoxazol (3) [Harris

A una solucion de 2 (450 mg, 1 mmol) en etanol (6 ml) s seguido de una solucion de NaOH (460 mg, 11,5 mmol) se enfrio y se trato con agua (3 ml). Despues de la refri filtracion, se lavo con agua (5 ml) y se seco para dar 3 (

3-(3,4-Dihidroxifenil)-5-(3-fluorofenil)isoxazol (4) [Vanell

Una solucion de 3 (100 mg, 0,33 mmol) en diclorometan ml, 1,7 mmol), se agito a -78 °C durante 3 h y a continu se enfrio a -78 °C y se paro con metanol (5 ml). Desp disolventes se evaporaron a presion reducida, y el r precipitado resultante se sometio a reflujo en 5 ml de filtracion y se seco para dar 4 (60 mg, 67%) como un p

Esquema 2: Smtesis de pirazoles

[Nam et al., 2004]

ion de 3,4-dimetoxiacetofenona (1,8 g, 10 mmol), 3-mol) y B a(O H ^8H2O (100 mg, 0,32 mmol) en metanol precipitado se recogiese por filtracion, se retrocristalizara como un polvo amarillento.

na (2) [Harris et al., 1977]

l) se le anadio gota a gota una solucion de bromo (400 rla durante 2 h a 0 °C, la reaccion se diluyo con bencina horas, tras lo cual el precipitado se recogio por filtracion, 0%) como un polvo blanco.

1977]

to con hidrocloruro de hidroxilamina (306 mg, 4,4 mmol) gua (1,5 ml). La mezcla se calento a reflujo durante 2 h, on (4 °C) durante una noche, el producto se recogio por g, 60%) como un polvo blanco.

l., 2000]

l) se enfrio a -78 °C tratada con tibromuro de boro (0,16 durante una noche a temperatura ambiente. La mezcla e la agitacion durante 3 h a temperatura ambiente, los se coevaporo cuatro veces con metanol (10 ml). El formo, despues de enfriar el producto, se recogio por lanco.

1,3-Bis(3,4-dimetoxifenil)-propán-1,3-diona (5) [Anselm

Una suspension al 60% de hidruro de sodio en aceite mi dos veces, y se le anadio DMSO anhidro (10 ml). Desp argon, se le anadio THF (5 ml), se enfrio el matraz a 1 temperatura se dejo descender hasta 10 °C y se le ana en DMSO (4 ml) a tal velocidad que la temperatura no 7]

(0,4 g, 10 mmol) se lavo con bencina de petroleo (20 ml) la agitacion durante 30 min a temperatura ambiente en se le anadio 3,4-dimetoxibenzoato (2,1 g, 10 mmol). La a solucion de 3,4-dimetoxiacetofenona (1,08 g, 6 mmol) nto por encima de los 15 °C. Despues de completar la adicion, la mezcla de reaccion se agito 72 h a temperat picado (250 g) que contema acido fosforico al 85% (1 m con agua (50 ml) y se seco para dar 5 (2,1 g, 99%) como

3,5-Bis(3,4-dimetoxifenil)pirazol (6) [Hauser et al., 1957]

Una solucion de 5 (1,0 g, 2,9 mmol) e hidrato de hidrazi durante 3 h con agitacion. La solucion amarilla transpar precipitado resultante se recogio por filtracion, se lavo c amarillento.

Hidrobromuro de 3,5-bis(3,4-dihidroxifenil)pirazol (7) [Va

Una solucion de 6 (120 mg, 0,35 mmol) en diclorometan (0,34 ml, 3,5 mmol), se agito a -78 °C durante 3 h y a c mezcla se enfrio a -78 °C y se paro con metanol (5 ml). los solventes se evaporaron a presion reducida, y el r precipitado resultante se sometio a reflujo en 5 ml de filtracion y se seco para dar 7 (108 mg, 85%) como un p biente, y a continuacion se vertio lentamente en hielo precipitado resultante se recogio por filtracion, se lavo olvo amarillento.

8 mg, 4,4 mmol) en etanol (15 ml) se calento a reflujo se evaporo a presion reducida, se le anadio agua y el ua y se seco para dar 6 (960 mg, 97%) como un polvo

et al., 2000]

ml) se enfrio a -78 °C, se trato con tribromuro de boro uacion durante una noche a temperatura ambiente. La es de la agitacion durante 3 h a temperatura ambiente, se coevaporo cuatro veces con metanol (10 ml). El ormo, despues de enfriar el producto, se recogio por marillo.

1-(1,3-Benzodioxol-5-il)-3-(3-bromofenil)-propan-1,3-dion

1. Procedimiento

Un matraz de tres cuellos de 500 ml seco se equipo con tabique de goma, un termometro y un condensador de r fuente de nitrogeno puro. La junta restante del tubo T e que la tasa de flujo del nitrogeno se puede observar a lo l que el matraz se puede enfriar intermitentemente con un haya enjuagado con nitrogeno, se mantiene en el recipie el resto de la reaccion. El matraz de carga con aproxim 0. 125 mol) en aceite mineral (nota 1). El aceite mineral ml) (nota 2). La capa de bencina de petroleo del sobrena con conector Luer-lock con una aguja de acero inoxidabl residual se mezcla con 80 ml de sulfoxido de dimetilo (n goteo igualador de la presion. Una solucion de 16,4 g (0 (0,125 mol) de 3-bromobenzoato de metilo (nota 5) en 60 El embudo se tapa, se comienza la agitacion y el conten anade lentamente la solucion de 1-(1,3-benzodioxol-5-il) evolucion del hidrogeno se mantiene a una velocidad co durante un periodo de 60 minutos (nota 6). Se retira el b se agita a temperatura ambiente (23 °C) durante 15 hora oscuro se vierte lentamente en 500 ml de hielo y agua q agitacion. Al cabo de 1 hora de agitacion, el producto se con agua (2 * 100 ml) y se seca al vado hasta que el pe producto bruto (nota 9). Se retrocristaliza desde 200 ml d seca al vado hasta que el peso es constante a 40 °C benzodioxol-5-il)-3-(3-bromofenil)propano-1,3-diona pura reducida hasta un volumen de aproximadamente 30 ml, lava por filtracion con succion con etanol (2 * 10 ml) y se 6 horas, lo que produce una masa adicional (3,15 g) del desde 20 ml de etanol al 99,9% y 20 ml de acetato de etil durante 6 horas para dar 1,8 g adicionales (rendimiento 1,3-diona pura (nota 12). El rendimiento total del product

2. Notas

1. Se utilizo hidruro de sodio, dispersion de aceite al 57-6 & Co KG, Karlsruhe.

2. Se utilizo bencina de petroleo de calidad para el anali ) [Anselme, 1967]

barra de agitacion magnetica revestida con Teflon®, un al cual estaba unido un tubo de tipo T conectado a una conectada a un dispositivo de burbujeo de tal manera e la reaccion. El aparato esta organizado de tal manera de Marfa. Despues de que el recipiente de reaccion se e reaccion una atmosfera de nitrogeno estatica durante ente el 60% de la dispersion de hidruro de sodio (5 g, a desde el hidruro con bencina de petroleo 40/60 (3 * 40 se retira mediante el uso de una jeringuilla hipodermica rtada a traves del tabique de goma. El hidruro de sodio ) y el tabique de goma se remplaza por un embudo de ol) de 1-(1,3-benzodioxol-5-il)etanona (nota 4) y 26,9 g sulfoxido de dimetilo se coloca en el embudo de goteo. el matraz se enfna en un bano de Marfa a 15 °C. Se le na y 3-bromobenzoato de metilo de tal manera que la ble y la temperatura no aumenta por encima de 20 °C na vez completada la adicion, y la mezcla de reaccion mezcla de reaccion homogenea resultante de color rojo ntiene 5 ml de acido ortofosforico al 85% (nota 7) con por filtracion (nota 8), se lava por filtracion con succion constante a 40 °C durante 6 horas para dar 34,4 g del nol al 99,9% y 200 ml de acetato de etilo (nota 10) y se te 6 horas da 28,5 g (rendimiento del 82%) de 1-(1,3-11), p. f. 136-137 °C. El filtrado se concentra a presion lido cristalino que se separa se recoge en un filtro, se al vado hasta que el peso es constante a 40 °C durante cto bruto. El producto bruto se retrocristaliza dos veces e seca al vado hasta que el peso es constante a 40 °C %) de 1-(1,3-benzodioxol-5-il)-3-(3-bromofenil)propanoe 30,3 g (87%).

umero de orden 13431 disponible de Alfa Aesar GmbH

hervido oscila entre 40-60 °C, numero de orden 101775 de Merk KGaA, Darmstadt.

3. Se utilizo sin mas purificacion sulfoxido de dimetilo d KGaA, Darmstadt.

4. Se utilizo 1-(1,3-benzodioxol-5-il)etanona, 98%, nume Karlsruhe.

5. Se utilizo 3-bromobenzoato de metilo, 98%+, numero Karlsruhe.

6. Se observa la formacion de espuma durante la a antiespumante, como el eter de polietilenglicol y dimetilo 7. Se utilizo acido ortofosforico, 85% (p/p) en solucion de Merck KGaA Darmstadt.

8. El valor del pH de la mezcla de reaccion es pH = 7.

a pH = 2, se pueden obtener 1,3 g de acido 3-bromoben 9. La pureza del producto que se determino por HPLC e 10. Se utilizo etanol al 99,9% absoluto, de calidad para a para analisis, numero de orden 109623 disponibles de 11. La pureza del producto determinada por HPLC es del de Waters con un detector de fotodiodos ordenados W de acido trifluoroacetico (TFA) al 0,1% (p/p) en agua ( mediante el uso de una columna de fase inversa (RP) E de flujo de 1 ml/min. El compuesto se disolvio en aceto Los picos con los tiempos de retencion (TR) 20,9 y 10,3 La reinyeccion de los picos recogidos por separado de mismos TR.

12. La pureza del producto determinada por HPLC es d 3-(1,3-Benzodioxol-5-il)-5-(3-bromofenil)-1H-pirazol (22) 1. Procedimiento

Una mezcla de 28,4 g (81,8 mmol) de 1-(1,3-benzodiox alcohol de n-butilo (nota 2) se coloca en un matraz con f magnetica revestida de Teflon®, un condensador de re agitacion y el calentamiento, se le anaden 6 ml (6,2 g, 1 la disolucion del solido y la mezcla de reaccion se cal reaccion se enfna a 20 °C, se almacena 1 hora 0 °C y el El lavado con agua (100 ml) y el secado al vacfo hasta al g (rendimiento del 95%) de 3-(1,3-benzodioxol-5-il-5-(3-2. Notas

1. El 1-(1,3-benzodioxol-5-il)-3-(3-bromofenil)propano-1, 138A.

2. Se utilizo el alcohol de n-butilo, 99,4% de calidad «B Baker B. V., Deventer, Holanda.

3. Se utilizo el monohidrato de hidrazina, de calidad pura, GmbH, Taufkirchen.

4. La pureza del producto determinada por HPLC es del de Waters con un detector de fotodiodos ordenados W de acido trifluoroacetico (TFA) al 0,1% (v/v) en agua (so el uso de una columna de fase inversa (RP) Eurospher 1 ml/min. El compuesto se disuelve en acetonitrilo de ca Esquema 3: Smtesis de imidazoles

ad para el analisis, numero de orden 102952 de Merck

orden A13597 disponible de Alfa Aesar GmbH & Co KG,

rden A16174 disponible de Alfa Aesar GmbH & Co KG,

de la solucion. El uso del agitador mecanico y un de ser necesario cuando se escale.

a, de calidad para el analisis, numero de orden 100573

nte la acidificacion con 15 ml mas de acido ortofosforico .

96,3%.

s, numero de orden 100983 y acetato de etilo de calidad KGaA, Darmstadt.

%. La HPLC analftica se realiza con un sistema de HPLC 996. Todas las separaciones implicaban una fase movil nte A) y TFA al 0,1% (v/v) en acetonitrilo (solvente B) her RP 18, 100 A, 5 pm, 250 * 4,6 mm a una velocidad de calidad para HPLC a una concentracion de 1 mg/ml. as formas enol y ceto, respectivamente, del ANLE 138A.

y 10,3 min da de nuevo los mismos dos picos con los

%.

ser et al., 1957]

-3-(3-bromofenil)propano-1,3-diona (nota 1) y 200 ml de redondo de 500 ml equipado con una barra de agitacion y un manto de calentamiento electrico. Se comienza la mmol) de monohidrato de hidrazina (nota 3) despues de a reflujo con agitacion durante 4 horas. La mezcla de ucto que se separa se recoge por filtracion con succion. ar una masa constante a 40 °C durante 36 horas da 26,8 fenil)-1H-pirazol (nota 4), punto de fusion 195-197 °C.

na se prepara de acuerdo con el protocolo para ANLE

analyzed™», numero de orden 8017 disponible de J. T.

ero de orden 53850 disponible de Sigma-Aldrich Chemie

. La HPLC analftica se realiza con un sistema de HPLC 996. Todas las separaciones implicaron una fase movil e A) y TFA al 0,1% (v/v) en acetonitrilo (solvente B) con , 100 A, 5 pm, 250 * 4,6 mm a una velocidad de flujo de para HPLC a una concentracion de 1 mg/ml.

4-(3,4-Dimetoxifenil)-2-fenilimidazol (8) [Li et al., 2000]

Se calento a reflujo una mezcla de hidrocloruro de benz mmol) en THF (6 ml) y agua (15 ml). Se le anadio una sol en THF (1,5 ml) durante un periodo de 30 min, mientras reaccion se calento a reflujo durante 2 h, y el THF se eva a la mezcla, se separo la fase organica, se lavo con sal presion reducida. El producto bruto resultante se

(cloroformo/metanol 100:1) para dar 8 (470 mg, 84%) co

Hidrobromuro de 4-(3,4-dihidroxifenil)-2-fenilimidazol (9)

Una solucion de 8 (190 mg, 0,68 mmol) en diclorometan (0,32 ml, 3,4 mmol), se agito a -78 °C durante 3 h y a c mezcla se enfrio a -78 °C y se paro con metanol (5 ml). solventes se evaporaron a presion reducida, y el residuo s resultante se sometio a reflujo en 5 ml de cloroformo y, d seco para dar 9 (192 mg, 85%) como un polvo.

Esquema 4: Smtesis de pirroles

na (313 mg, 2 mmol) y bicarbonato de sodio (672 mg, 8 de a-bromo-3,4-dimetoxiacetofenona (518 mg, 2 mmol) antema la reaccion a reflujo. Despues de la adicion, la a presion reducida. Se le anadio acetato de etilo (20 ml) ra (5 ml), se seco con sulfato de sodio y se evaporo a o por cromatograffa en columna de gel de sflice n solido.

elle et al., 2000]

ml) se enfrio a -78 °C, se trato con tribromuro de boro uacion durante una noche a temperatura ambiente. La pues de agitar durante 3 h a temperatura ambiente, los evaporo cuatro veces con metanol (10 ml). El precipitado es de enfriarlo, el producto se recogio por filtracion y se

(E)-1-Fenil)-3-(3,4-dimetoxifenil)-2-propeno-1-one (10)

El compuesto 10 se preparo de acuerdo con el procedimie

3- (3,4-Dimetoxifenil)-4-nitro-1-fenilbutan-1-ona (11) [Hal

Una solucion de 10 (774 mg, 2,9 mmol) en MeOH (30 ml) ml, 15 mmol) y se calento a reflujo durante 24 h. La solucio ml), y se acidifico con acido clorhfdrico a 1 M. Se separo la (20 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con sodio. El solvente se retiro a presion reducida y el aceite r de sflice (n-hexano/acetato de etilo 3:2) para dar 11 (780

4- (3,4-Dimetoxifenil)-1 -fenilpirrol (12) [Hall et al, 2005]

Una solucion agitada de 11 (400 mg, 1,22 mmol) en met con hidroxido de potasio (343 mg, 6,1 mmol). Al cabo solucion de acido sulfurico (2,44 ml) en metanol (13 ml) a agua (20 ml) y hielo (20 ml), y la mezcla se neutraliz diclorometano (2 * 50 ml). Las fracciones organicas com sulfato de sodio y se evaporaron a presion reducida. El a amonio (470 mg), y la solucion se calento a 100 °C duran ml) y la mezcla se neutralizo con hidroxido de sodio acu ml). Las fracciones organicas combinadas se lavaron co evaporaron a presion reducida. El producto bruto se hexano/acetato de etilo 3:1) y a continuacion se retrocrist para dar 12 (150 mg, 44%) como un solido.

4-(3,4-Dihidroxifenil)-1 -fenilpirrol (13) [Vanelle et al., 2000

Una solucion de 12 (80 mg, 0,29 mmol) en diclorometan (0,13 ml, 1,4 mmol), se agito a -78 °C durante 3 h y a c mezcla se enfrio a -78 °C y se paro con metanol (5 ml).

escrito para la preparacion de 1. Rendimiento del 90%.

l., 2005]

to con dietilamina (1,55 ml, 15 mmol) y nitrometano (0,81 enfrio, se repartio entre diclorometano (60 ml) y agua (50 organica, y se extrajo la capa acuosa con diclorometano (50 ml) y salmuera (50 ml), y se secaron con sulfato de tante se purifico por cromatograffa en columna de un gel 2%) como un solido.

(13 ml) y THF (26 ml) a temperatura ambiente se trato h, la mezcla de reaccion se anadio gota a gota a una y se agito 1 h a temperatura ambiente. Se le anadieron n hidroxido de sodio acuoso a 1 M y se extrajo con das se lavaron con salmuera (25 ml), se secaron sobre resultante se trato con acido acetico (8 ml) y cloruro de h. Se enfrio la mezcla de reaccion, se le anadio hielo (50 1 M. La solucion se extrajo con diclorometano (2 * 50 lmuera (25 ml), se secaron sobre sulfato de sodio y se o por cromatograffa en columna de gel de silice (na partir de una mezcla de n-hexano/acetato de etilo (2:1)

ml) se enfrio a -78 °C, se trato con tribromuro de boro uacion durante una noche a temperatura ambiente. La ues de la agitacion durante 3 h a temperatura ambiente, los solventes se evaporaron a presion reducida, y el re producto bruto resultante se purifico por cromatograffa continuacion se retrocristalizo desde cloroformo con unas un solido.

Esquema 5: Smtesis de pirazolinas

o se coevaporo cuatro veces con metanol (10 ml). El olumna de gel de s lîce (cloroformo/metanol 95:5) y a as gotas de acetonitrilo para dar 13 (36 mg, 50%) como

3-(3,4-Dimetoxifenil)-5-(3-fluorofenil)-4,5-dihidro-1H-piraz Una suspension de 1 (57 mg, 0,2 mmol) e hidrato de hidr °C durante 1,5 h con agitacion. Se enfrio la mezcla de re se recogio por filtracion, se lavo con agua y se seco para Esquema 6: Smtesis de N-Ac-pirazolinas

4)

a (0,5 ml, 10 mmol) en agua (0,14 ml) se calento a 100 n, se le anadio agua (0,2 ml) y el precipitado resultante 14 (37 mg, 62%) como un solido blanco.

(E)-1-(3,4-Metilendioxifenil)-3-fenil-2-propeno-1-ona (15)

El compuesto 15 se preparo de acuerdo con el procedimie

1-Acetil-3-(3,4-metilendioxifenil)-5-fenil-4,5-dihidropirazol

Una solucion de 15 (504 mg, 2 mmol) e hidrato de hidraz 120 °C durante 24 h con agitacion. La mezcla de reacci resultante se recogio por filtracion, se retrocristalizo a pa solido blanco.

1-Acetil-3-(3,4-dihidroxifenil)-5-fenil-4,5-dihidropirazol (17

Una solucion de 17 (70 mg, 0, 23 mmol) en diclorometan (0,11 ml, 1,16 mmol), se agito a -78 °C durante 3 h y a c mezcla se enfrio a -78 °C y se paro con metanol (5 ml).

los solventes se evaporaron a presion reducida, y se c producto bruto resultante se purifico por cromatograffa en dar 17 (25 mg, 37%) como un solido.

Esquema 7: Smtesis de 1,2,4-oxadiazoles

escrito para la preparacion de 1. Rendimiento del 64%.

[Chimenti et al., 2004]

(250 mg, 5 mmol) en acido acetico (12 ml) se calento a e enfrio, se le anadio agua fna (40 ml) y el precipitado e etanol y se seco para dar 16 (458 mg, 74%) como un

nelle et al., 2000]

ml) se enfrio a -78 °C, se trato con tribromuro de boro nuacion durante una noche a temperatura ambiente. La ues de la agitacion durante 3 h a temperatura ambiente, aporo el residuo cuatro veces con metanol (10 ml). El mna de gel de silice (n-hexano/acetato de etilo 1:1) para

3,4-Dimetoxibenzamidoxima (18) [Chalquest, 2001]

Una solucion de 3,4-dimetoxibenzonitrilo (4,0 g, 24,5 m diisopropiletilamina (5,0 ml, 29,2 mmol) en etanol (70 ml) evaporo a presion reducida, se le anadio agua fna (60 ml) para dar 18 (3,4 g, 71%) como un polvo blanco.

hidrocloruro de hidroxilamina (2,0 g, 28,8 mmol), N,N-agito a temperatura ambiente durante 48 h. El etanol se l precipitado resultante se recogio por filtracion y se seco 3,5-Bis-(3,4-dimetoxifenil)-1,2,4-oxadiazol (19) [Korbonits,

A una solucion de 18 (700 mg, 3,57 mmol) y 3,4-dimetoxi le anadio ferf-butoxido de potasio (425 mg, 3,79 mmol) y mezcla se enfrio y el precipitado se recogio por filtracion, 44%) como un polvo blanco.

Hidrobromuro de 3,5,-bis-(3,4-dihidroxifenil)-1,2,4-oxadiaz

Una solucion de 19 (220 mg, 0,64 mmol) en diclorometan (0,59 ml, 6,1 mmol), se agito a -78 °C durante 3 h y a c mezcla se enfrio a -78 °C y se paro con metanol (5 ml). D los solventes se evaporaron a presion reducida, y el re precipitado resultante se sometio a reflujo en 5 ml de cl filtracion y se seco para dar 20 (190 mg, 81%) como un p

Los ejemplos de mas arriba representan ejemplos de c compuestos restantes mostrados en la figura 3 se sintetiz medios qmmicos, junto con las sustancias seleccionadas ensayos de SIFT, ensayos basados en cultivo de celul bioqmmicos dirigidos a la agregacion de la a-sinuclema (v las sustancias analizadas.

Ejemplo 3: Material y metodos utilizados

Colecciones de compuestos

Las colecciones cribadas contienen 10000 compuestos c cubren solo una parte de la coleccion DIVERSet mas gra coleccion de moleculas pequenas diferentes de tipo farma se suministraron en una solucion de sulfoxido de dimetilo base de datos que contiene estructuras moleculares y algu esta disponible en www.chembridge.cam.

Produccion de PrP 23-231 recombinante de raton

Se produjo la PrP 23-231 recombinante y se purifico esenc que, para la expresion en bacterias, las celulas de E. coli pET17b-MmPrp23-231WT31 para la PrP 23-231 de raton densidad optica de 0,5 antes de inducir la produccion de recogieron dos horas despues. A continuacion, se lisaron l de lisis y la incubacion durante 30 min a 37 °C en vez de remplazada por una etapa de cromatograffa de afinidad cromatograffa de intercambio de cationes despues del rep

En concreto, la PrP previamente purificada por cromatog como esta descrito, y la oxidacion se termino con la adicio 6. Despues de la adicion de NiCh a 0,1 mM, hasta 50 (Pharmacia), cargada previamente con NiCh de acuerdo previamente con el tampon A (urea a 8 M, MOPS a 10 m realizo durante al menos 3 h a temperatura ambiente m matriz a una columna Polyprep (BioRad) y se dreno con del tampon B (urea a 8 M, MOPS a 10 mM, pH 7,0, NaCl 6 x 5 ml del tampon D (urea a 7,2 M, MOPS a 10 mM, pH fracciones que conteman la PrP purificada, se concentrar 1:50 para volverlas a plegar en MES a 10 mM, pH 6,0.

Marcacion fluorescente de anticuerpos y PrP recombinant

El anticuerpo monoclonal L42 (r-biopharm, Darmstadt, Ale Eugene) de acuerdo con el manual del fabricante. La Pr 488 (Alexa-488; Invitrogen, Eugene) en el tampon de fosf de bicarbonato de sodio a 40 mM, pH 8,3. Los fluorofor PD10 (GE Healthcare, Freigburg, Alemania) equilibradas P40 al 0,1%. El control de calidad de la reaccion y la espectroscopia de correlacion de fluorescencia (FCS) en u La razon de marcacion fue de aproximadamente 1,3 fluor 2]

oato de etilo (834 mg, 3,97 mmol) en etanol (12 ml), se ezcla de reaccion se calento a reflujo durante 12 h. La lavo con etanol caliente y se seco para dar 19 (540 mg,

0) [Vanelle et al., 2000]

ml) se enfrio a -78 °C, se trato con tribromuro de boro uacion durante una noche a temperatura ambiente. La ues de la agitacion durante 3 h a temperatura ambiente, o se coevaporo cuatro veces con metanol (10 ml). El ormo, despues de enfriarlo, se recogio el producto por

sintetizar o modificar los compuestos deseados. Los de acuerdo con esto. Estas sustancias sintetizadas por cribado inicial, se sometieron a mas analisis, entre ellos experimentos in vivo con ratones, asf como ensayos mas abajo). En la figura 3 se da a conocer una lista de

una y las llamamos DIVERSet 1 y DIVERSet 2 porque (ChemBridge Corp., San Diego, CA). DIVERSet es una seleccionadas con criterios racionales. Los compuestos SO) y en placas de microtitulacion de 96 pocillos. Una datos ffsico-qmmicos para cada uno de los compuestos

ente como esta descrito en Liemann et al., (1998), salvo 1DE3 RIL (Novagen) se transformaron con el plasmido igual forma, las bacterias se hicieron crecer hasta una rotema con la adicion de IPTG a 1 mM, y las celulas se acterias con la adicion de Triton X-100 al 0,5% al tampon ar una prensa francesa. Ademas, la filtracion en gel fue quelatos de mquel. Tambien se omitio la etapa final de miento.

a de intercambio ionico se sometio a la oxidacion tal y EDTA a 0,1 mM y el ajuste del pH a aproximadamente de PrP se aplicaron a 2 ml de la Sepharose quelante las recomendaciones de los fabricantes, y se equilibro H 7,0). La fijacion de la PrP a la matriz de Ni-quelato se nte la inversion continua de la mezcla. Se transfirio la lacion directa. La columna se lavo dos veces con 5 ml 00 mM) y a continuacion se eluyo secuencialmente con , NaCl a 150 mM, imidazol a 50 mM). Se agruparon las on un dispositivo centriprep y finalmente se diluyeron a

ia) se marco con Alexa Fluor 647 (Alexa-647; Invitrogen, -231 recombinante de raton se marco con Alexa Fluor e potasio a 20 mM, pH 6, Nonidet P40 al 0,1%, tampon in fijar se separaron por filtracion en gel con columnas el tampon de fosfato de potasio a 20 mM, pH 6, Nonidet on de marcacion se realizo mediante mediciones de ctor Insight (Evotec Technologies, Hamburgo, Alemania). s por molecula de rPrP.

Ensayo para la asociacion entre PrPC y PrPSc

Se preparo la PrPSc del cerebro de pacientes con ECJ d sedimento final resuspendidas en la solucion de PBS 1 A (tampon de fosfato de potasio a 20 mM a pH 6,0, homogeneizador ultrasonico de bano de Marfa durante el sobrenadante se diluyo 100 veces en el tampon A par

Una mezcla de rPrP de raton marcada y del anticuerpo de potasio a 20 mM, pH 6, Nonidet P40 al 0,1%, para q abundantes a 2-6 nM. En un volumen de ensayo de 20 compuesto y 10 pl de la preparacion de PrPSc diluida. La de cubreobjetos de cristal (Evotec-Technologies, Hamb

Medicion y analisis de partmulas sueltas

Las mediciones de FIDA se realizaron a energfas de ex el laser de 633 nm. Los parametros de barrido se est frecuencia del haz de barrido de 50 Hz, y movimiento medicion fue de 10 s. La fluorescencia desde los dos f sueltos, y los fotones se sumaron en intervalos de tiem longitud de compartimento de 40 ps. Se midio el numer histograma de distribucion de intensidad bidimensional,

Los datos de intensidad de la fluorescencia se evaluaro Technologies, Hamburgo, Alemania) al sumar los comp corte para las intensidades de los compartimentos pa acuerdo con las mediciones de control.

Ejemplo 4: Aplicacion terapeutica de los posibles nuev cepa de la tembladera de las ovejas transcurridos 80 df

Para demostrar la eficacia de estos nuevos posibles com espongiformes transmisibles (EET) o las enfermedade animales, en los que los compuestos que tienen activida con la tembladera de las ovejas se utilizaron para tratar las ovejas en una etapatardfa del periodo de incubacion un intervalo de tiempo de 14 dfas 80 dfas despues d aparecen los primeros smtomas subclmicos en los ani al tiempo mas temprano en el que un humano afectado recibina realmente un tratamiento terapeutico. Al elegir valorar la funcionalidad de los compuestos analizados Tfpicamente, los tratamientos de las EET hasta la fech los experimentos con animales, cuando se aplican en to hay muy pocas ocasiones en las que tal tratamiento te Para la mayona de los pacientes con EET, se descono comienzo del tiempo de incubacion para los casos famili la mayona de los pacientes con EET solo podran rec smtomas de las EET.

Procedimientos experimentales:

Las ratonas C57BI6 hembra de 6 a 7 semanas de edad mediante una inyeccion intracerebral con 30 pl del h tamponada con fosfato (PBS) de los ratones enfermos t los 80 dfas de la infeccion, estos ratones se trataron nuevos o con el vehmulo acuoso sulfoxido de dimetil seleccionado de acuerdo con su actividad antiprionica denominaron 10353F11 de acuerdo con la posicion de (Chembridge Corp., San Diego, EE. UU.) y anle138 compuestos se realizo durante 14 dfas consecutivos m dilucion del compuesto 10353F11 con los correspondien utilizo el compuesto 10353F11 a una concentracion de sery149, se inyectaron a 100 mM a lo largo de todo correspondiente vigilaron en los animales todos los dfas Se sacrificaron los animales cuando habfan alcanzado l clmicos, que son ataxia, temblores, dificultad para poner cuerdo con Safar et al., (Safar et al., (1998)) y almuotas del as sarcosil al 0,1% se diluyeron cinco veces en el tampon nidet P40 al 0,1%) y se trataron con ultrasonidos en un s. Despues de la centrifugacion a 1000 rpm durante 1 min, l ensayo.

noclonal L42 marcado se preparo en el tampon de fosfato las moleculas marcadas fueran aproximadamente igual de , se mezclaron 8 pl de la mezcla rPrP/anticuerpo, 2 pl del uestras se cargaron en placas de 96 pocillos con un fondo o, Alemania) y se midio en un lector Insight.

cion de 200 pW para el laser de 488 nm y de 300 pW para lecieron en una longitud de paso del barrido de 100 pm, l soporte de posicionamiento de 2000 pm. El tiempo de roforos se grabo por separado con detectores de fotones de longitud constante (compartimentos) con el uso de una e fotones fluorescentes rojos y verdes, y se analizo en un y como se describio anteriormente (Bieschke et al., 2000).

on un modulo del programa informatico 2D-SIFT (Evotecimentos de alta intensidad en los sectores. Los valores de cada serie de mediciones se ajustaron manualmente de

compuestos antiprionicos en los ratones infectados con la desde la infeccion

estos antiprionicos a la hora de combatir las encefalopatfas ausadas por los priones, se realizaron experimentos con ntiprionica en el SIFT y/o en el analisis de cultivo de celulas s ratones infectados con la cepa RML de la tembladera de legimos la aplicacion intraperitoneal de los compuestos en a infeccion porque es tfpicamente el momento en el que s infectados con esta cepa de prion. Esto corresponded n EET que muestra los primeros smtomas de la enfermad s condiciones muy rigurosas para el tratamiento, quisimos o tratamientos contra los priones en un contexto realista. olo se han analizado por la profilaxis tras la exposicion en al momento de infeccion con los priones. En la vida real, eutico es factible para los individuos afectados con EET. y no se pueden detectar el momento de la infeccion o el s y esporadicos (que son la inmensa mayona). Por lo tanto, r el tratamiento despues de la aparicion de los primeros

inocularon con la cepa RML de la tembladera de las ovejas ogeneizado esteril de cerebro al 1% en solucion salina inales con la cepa RML de la tembladera de las ovejas. A una seleccion de los posibles compuestos antiprionicos MSO). Cinco posibles compuestos antiprionicos se han un modelo de cultivo celular para este tratamiento, que se placa en la coleccion de compuestos qrnmicos DIvERSet anle143b, sery106 y sery149. El tratamiento con estos ante inyeccion por via intraperitoneal de 50 pl al dfa de la 25 pl de los otros compuestos en el vehmulo (DMSO). Se mM y para los compuestos anle138b, anle143b, sery106 y periodo. Los cuidadores de animales con la formacion signos de la enfermedad a partir del dfa 80 de la infeccion. tapa terminal de la enfermedad, marcada por los smtomas e pie desde una posicion en la que yacen sobre la espalda y rigidez de la cola, y estaban moribundos. Tfpicamen terminal de la enfermedad conducira a la muerte del congelaron a -80 °C un hemisferio y una mitad del ba segundo hemisferio y la segunda mitad del bazo asf co formaldehndo al 4% para la (inmuno)histologfa.

Resultados

Tal y como se muestra en la figura 4, el tratamiento de l la cepa RML de la tembladera de las ovejas, en una ultim mediante la aplicacion intraperitoneal diaria de los po prolongacion del tiempo de incubacion, hasta alcanzar la para 10353F11 (figura 4A) y anle138b y sery149 (figura los compuestos anle138b y sery149 para los grupos de dfas, respectivamente, en comparacion con un grupo de 100%. Para los compuestos sery106 y anle143b, la pr animales tratados en comparacion con el mismo gru significacion estadfstica. Para el compuesto 10353F11, e animales cada uno se prolongo hasta 11 dfas en compa tiempo de supervivencia en los experimentos correspond implicar que el tratamiento con estos farmacos ha det administraran los farmacos. En este caso, el tratamiento de los individuos infectados con EET y a una estabilizac adicional al detener el progreso de la enfermedad.

Ejemplo 5: Aplicacion terapeutica de un posible compu tembladera de las ovejas despues de la infeccion intrap

Para demostrar la eficacia de este nuevo compues espongiformes transmisibles (EET) o las enfermedades animales. Para este experimento, los ratones se infecta de las ovejas y se trataron con el compuesto anle138b, animal para las ultimas etapas de la enfermedad causa aplicacion intraperitoneal y oral del compuesto, y comen

Procedimientos experimentales:

Infeccion con la cepa de la tembladera de las ovejas y tr

Las ratonas C57BL/6 hembra de 6 a 7 semanas de edad mediante la inoculacion intraperitoneal con 100 pl de tamponada con fosfato (PBS) de ratones enfermos en f El tratamiento de estos ratones con el compuesto anle comenzo justo despues de la infeccion. El tratamien consecutivos mediante la inyeccion intraperitoneal de 25 de de 4 y 5 dfas de administracion oral de 50 pl al dfa del alimentacion por sonda nasogastrica oral (figura 5A). E nM para la aplicacion intraperitoneal y a 50 mg/kg para dfas de la infeccion, cuando la PrPSc se detecta con clarid De los animales sacrificados, una mitad del bazo se cong que la segunda mitad del bazo asf como todos los orga para la inmunohistologfa.

Transferencia de TIP

El tejido de cerebro fijado en formol se corto en bloques formico concentrado durante 1 hora, se fijo posteriorme fosfato al 4% durante 48 horas siguiendo el protocolo cortes de 5 a 7 pm en un microtomo, se colocaron en u nitrocelulosa con poros de 0,45 pm humedecida previam 30 minutos a 55 °C. La membrana de nitrocelulosa se d seguido de una rehidratacion escalonada. Se anadio T de rehidratacion en H2O destilada. Se secaron las me meses sin perdida de la calidad de la posterior tincion d

Despues de humedecer previamente con TBST (Tris-HC se realizo la digestion con 250 pg/ml de proteinasa K (B NaCl a 100 mmol/l; Brij 35 al 0,1%) durante 8 horas a 5 el progreso de la enfermedad hasta el final de la etapa al en uno o dos d^as. De los animales sacrificados, se ara el analisis de inmunotransferencia, mientras que el todos los organos internos se fijaron en una solucion de

atones, que se habfan infectado por via intracerebral con pa del tiempo de incubacion (a los 80 dfas de la infeccion) s farmacos antiprionicos seleccionados dio lugar a una pa terminal de la infeccion de la tembladera de las ovejas, El tiempo de supervivencia medio que se determino para y ocho animales cada uno se prolongo hasta 14,9 y 11,5 animales que habfa recibido solo el vehnculo de DMSO al acion del tiempo de supervivencia en un grupo de ocho de control con DMSO estaba por debajo del nivel de po de supervivencia determinado para un grupo de ocho n con el grupo de control. La prolongacion observada del roximadamente a la duracion del tratamiento. Esto puede la progresion de la enfermedad, siempre y cuando se estos farmacos conducina a una prolongacion de la vida de su estado de salud, lo que los protege de un deterioro

antiprionico en los ratones infectados con la cepa de la eal

ntiprionico a la hora de combatir las encefalopatfas adas por los priones, se realizo un experimento mas con por via intraperitoneal con la cepa RML de la tembladera actividad antiprionica estaba demostrada en un modelo or los priones (ejemplo 4). Elegimos una combinacion de os el tratamiento justo despues de la infeccion.

iento de los ratones

nocularon con la cepa RML de la tembladera de las ovejas ogeneizado esteril de cerebro al 1% en solucion salina erminal con la cepa RML de la tembladera de las ovejas.

o con el vehnculo acuoso sulfoxido de dimetilo (DMSO) on este compuesto se llevo a cabo durante 14 dfas dfa del compuesto diluido en el vehnculo (DMSO) seguido puesto en una mezcla de aceite vegetal/DMSO mediante puesto anle138b se utilizo a una concentracion de 100 dministracion oral. Los animales se sacrificaron a los 35 n el bazo de los ratones infectados por via intraperitoneal. a -80 °C para el analisis de inmunotransferencia, mientras nternos se fijaron en una solucion de formaldetndo al 4%

tejido con un grosor de 2 mm, se descontamino en acido n formol tamponado con solucion salina tamponada con rowmn et al., 1990 y se incluyo en parafina. Se cortaron no de Marfa (55 °C), se recogieron en una membrana de (Bio-Rad, Richmond, CA) y se secaron durante al menos rafino con xileno. El xileno se remplazo por isopropanol, 20 a una concentracion final del 0,1% a la ultima etapa nas y se conservaron a temperatura ambiente durante Sc.

0 mmol/l, pH 7,8; NaCl a 100 mmol/l; Tween 20 al 0,05%), inger) en el tampon de PK (Tris-HCl a 10 mmol/l; pH 7,8; . Con esta etapa, las protemas pegadas a la membrana se fijaron a la membrana. Despues de lavar tres veces co con isotiocianato de guanidina a 3 mol/l en Tris-HCl a 10 con tres lavados con TBST. La inmunodeteccion se rea (casema al 0,2% en TBST) durante 30 minutos. Como an contra la PrP recombinante de raton, denominado CD anticuerpo (Ventana). La incubacion duro al menos 1 ho al menos 1 hora se realizo con un anticuerpo antirmurino a una dilucion de 1:500. Despues de cinco lavados en T alcalino al incubarlas dos veces durante 5 minutos en N a 50 mmol/l). La visualizacion de la reaccion del anticue uso de NBT/BCIP. Las transferencias se evaluaron con

Resultados

El tejido de bazo extrafdo despues de la muerte de los r tino para la deteccion inmunohistoquímica de la presen esplenica por inmunotransferencia. Tal y como se mue animales tratados disminuye significativamente en comp del tejido del bazo de los ratones infectados muestra que con el compuesto anle138b. Se incrementa el porcentaj depositos intensos de PrPSc (figura 5C). En la figura 5D s de PrPSc. Los resultados indican una clara eficacia anti configuracion experimental y la pauta terapeutica elegida

Ejemplo 6: Aplicacion terapeutica de nuevos compuest tembladera de las ovejas a los dfas 80 de la infeccion

Para demostrar la observacion del ejemplo 4 de que la duracion del tratamiento, se realizo un experimento con dosis mayor y durante mas tiempo para tratar a los raton en una etapa tardfa del periodo de incubacion. Elegimos compuestos a los 80 dfas de la infeccion porque este e smtomas subclmicos en los animales infectados con est

Procedimientos experimentales:

Las ratonas C57BL/6 hembra de 6 a 7 semanas de edad mediante una inyeccion intracerebral con 30 pl de ho tamponada con fosfato (PBS) de ratones enfermos termi ratones se trataron a los dfas 80 de la infeccion con los n utilizaron los dos compuestos antiprionicos en potencia a llevo a cabo durante 14 dfas consecutivos mediante la i en el vehteulo DMSO seguido de dos administraciones mezcla de aceite vegetal/DMSO a traves de sonda naso tratados con el anle138b, el compuesto se administro ade alimenticios de mantequilla de cacahuete mezclados compuestos se utilizaron a una concentracion de 100 administracion oral. Cuatro animales de cada grupo de tr (figura 6A). Los cuidadores de animales con la formaci animales de cada grupo de tratamiento desde el dfa 80 habfan alcanzado la fase terminal de la enfermedad, m dificultad para ponerse de pie desde una posicion en la q moribundos. Tfpicamente, el progreso de la enfermedad a la muerte del animal en uno o dos dfas. De los ani congelaron a -80 °C recien tomados para el analisis por la segunda mitad del bazo asf como todos los organos in la histologfa.

Resultados

Cantidad de PrPSc en los homogeneizados de cerebro y

En los homogeneizados de cerebro de los ratones tratad la cantidad de PrPSc mediante analisis de inmunotransfer PrPSc en el cerebro de todos los animales examinados puede mantener en el nivel de los ratones sin tratar el df grupo de control. Los resultados de anle186b aparecen T, las protemas en las membranas se desnaturalizaron l/l (pH 7,8) durante 10 minutes. La guanidina se elimino espues de la preincubacion en la solucion de bloqueo po primario, se utilizo un anticuerpo policlonal de conejo una dilucion de 1:500 en la solucion de diluyente de espues de tres lavados en TBST, la incubacion durante nejo conjugado a la fosfatasa alcalina (Dako, Hamburgo) durante 10 minutos, las membranas se ajustaron a pH ris-HCl a 100 mmol/l, pH 9,5; NaCl a 100 mmol/l; MgCh e proporciono mediante la reaccion de formazan con el croscopio disector Olympus.

s tratados con el farmaco y tratados con el vehteulo se e depositos de PrPSc y se analizo la cantidad de PrPSc n la figura 5B, la cantidad de PrPSc en el bazo de los on con los ratones tratados con el vehteulo. El examen epositos de PrPSc se redujeron despues del tratamiento azos con poco deposito de PrPSc y se reduce el de los estran ejemplos de dos transferencias de TIP, depositos ica de este compuesto en los tejidos perifericos por la

ntiprionicos en los ratones infectados con depa de la

ngacion del tiempo de supervivencia corresponde a la ales, en el que los compuestos se administraron a una ectados con la cepa RML de la tembladera de las ovejas ombinacion de la aplicacion intraperitoneal y oral de los camente el momento en el que aparecen los primeros a de priones.

cularon con la cepa RML de la tembladera de las ovejas eizado esteril de cerebro al 1% en la solucion salina con la cepa RML de la tembladera de las ovejas. Estos s compuestos antiprionicos o con el vehteulo DMSO. Se 8b y anle186b. El tratamiento con estos compuestos se ion intraperitoneal de 25 pl al dfa del compuesto diluido s durante 5 dfas de 50 pl al dfa del compuesto en una ica oral (figura 6A). En 3 ratones de control y 2 ratones por via oral desde el dfa 109 al dfa 136 al darle granulos soluciones de reserva de compuesto en DMSO. Los ara la aplicacion intraperitoneal y de 50 mg/kg para la iento se sacrificaron en los puntos de tiempo indicados cesaria vigilaron los signos de la enfermedad en ocho es de la infeccion. Se sacrificaron los animales cuando a por los smtomas clmicos, que son ataxia, temblores, scansan sobre la espalda y rigidez en la cola, y estaban el final de la etapa terminal de la enfermedad conducira sacrificados, un hemisferio y una mitad del bazo se unotransferencia, mientras que el segundo hemisferio y s se fijaron en una solucion de formaldetndo al 4% para

erte celular por apoptosis despues de la infeccion

n el farmaco y de los tratados con el vehteulo se analizo . Tal y como se muestra en la figura 6B, la cantidad de puntos de tiempo indicados del grupo de anle138b se mientras que se incrementa la cantidad de PrPSc en el el grupo de control y anle138b. El incremento de PrPSc se podfa enlentecer (figura 6B). En la figura 6C se mue tratamiento con los compuestos en comparacion con el cerebro disminuye ligeramente despues del tratamiento cortes de cerebro tenidos con HE en los puntos de tiem mostraban una reduccion de los cambios patologicos.

granulos cerebelosos de los ratones infectados de los g control (figura 6D). Estos resultados indican que ambos Por lo tanto, el tratamiento fue capaz de prevenir mas cerebro de los animales durante el tratamiento. Estos anle138b habfa detenido la progresion de la enfermed resultados indican que cabe la posibilidad de modificar utilice este compuesto que interfiere con la formacion prolongacion de la vida de los individuos infectados con estado de salud al protegerlos de un deterioro adicional y

Prolongacion del tiempo de incubacion

Tal y como se muestra en la figura 7, el tratamiento de lo la cepa RML de la tembladera de las ovejas, en una etapa mediante la administracion diaria de los compuestos dio l alcanzar la fase terminal de la infeccion de la temblad supervivencia en los dos ratones que recibieron un tratami con anle138b mezclado con mantequilla de cacahuete duracion de tratamiento, ii) el compuesto es eficaz cuan barrera hematoencefalica.

Ejemplo 7: Supresion de la agregacion de la a-sinuclema

Las sinucleinopatfas son enfermedades (neurodegener agregados y fibrillas compuestos principalmente de la pro Las sinucleinopatfas neurodegenerativas mas prominent cuerpos de Lewy (DCL) y la atrofia multisistemica (AMS).

Se ha demostrado que la agregacion de la a-sinuclema solventes organicos, que imitan las condiciones dielectr membranas biologicas (Munishkina et al., 2003). Se han d sistemas modelo para la investigacion de los aspectos sinuclema, y para la formacion de especies de agregados 2008).

Para analizar los compuestos seleccionados por su capa utilizado un sistema in vitro, en donde el solvente orga (<3%) y, en algunos experimentos, el hierro ferrico se uti La formacion de multfmeros se vigilo con un equipo de c analisis de correlacion cruzada y el analisis de SIFT aplic con los fluoroforos Alexa488 verde o Alexa647 rojo, resp paralelo a las muestras en las que se anadio un compue

Procedimientos experimentales:

Marcacion de la a-sinuclema con fluorescencia

La a-sinuclema recombinante se marco con los colorante succinimidilo con Alexa Fluor 488 o con el ester de O-suc respectivamente. Despues de completarse la reaccion, las de reaccion por cromatograffa de exclusion por taman Bioscience, Alemania) de acuerdo con las instrucciones d colorante sin fijar se determino mediante mediciones contienen los monomeros de la a-sinuclema marcados.

Mediciones de correlacion de la fluorescencia de partmul

En un volumen de 20 pl en los pocillos de una placa de mi de cristal para las mediciones de correlacion de la flu agregacion de la a-sinuclema en un tampon que contem a-sinuclema marcados con los fluoroforos Alexa-488 o bi aproximadamente 5 a 10 nM de cada especie de a-sinu correlacion de fluorescencia Insight (Evotec-Tecnologies, el cambio de la cantidad relativa de PrPSc despues del ntrol sin tratar en el dfa 80. La cantidad de PrPSc en el anle138b. Despues de la evaluacion histologica de los indicados, los ratones tratados con anle138b y anle186b umero de celulas apoptosicas en la capa celular de los os tratados disminuye en comparacion con el grupo de mpuestos pueden atravesar la barrera hematoencefalica. ositos de PrPSc y la progresion de la enfermedad en el sultados implican que el tratamiento con el compuesto siempre y cuando se administren los farmacos. Estos progreso de la enfermedad mediante un tratamiento que PrPSc. En este caso, el tratamiento conducina a una EET y a la estabilizacion o quizas a una mejona en su tener el progreso de la enfermedad.

atones, que se habfan infectado por via intracerebral con dfa del tiempo de incubacion (a los 80 dfas de la infeccion) ar a una prolongacion del tiempo de supervivencia, hasta de las ovejas (figura 7). Ademas, el mayor tiempo de to adicional desde el dfa 109 al dfa 136 por la alimentacion dica que i) la supervivencia esta correlacionada con la se administra por via oral, y iii) el compuesto atraviesa la

vitro

vas) caracterizadas por la acumulacion intracelular de a a-sinuclema (para una revision, vease: Goedert, 2001). son la enfermedad de Parkinson (EP), la demencia con

vitro se produce en presencia de sustancias, tales como s que existen de forma natural en la proximidad de las arrollado ensayos de agregacion in vitro que proporcionan trales del plegamiento erroneo y la agregacion de la axicos durante el proceso de la enfermedad (Kostka et al.,

ad para suprimir la agregacion de la a-sinuclema, hemos sulfoxido de dimetilo (DMSO) a concentraciones bajas ron para inducir la agregacion de la a-sinuclema in vitro. lacion de fluorescencia de partmulas sueltas mediante el s a las mezclas de monomeros de a-sinuclema marcados vamente. Tales mezclas de a-sinuclema se agregaron en a la reaccion.

orescentes con aminos reactivos, bien con el ester de O-imidilo con Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, EE. UU.), oleculas de colorante sin fijar se separaron de las mezclas a traves de dos columnas PD10 sucesivas (Amersham fabricante. La eficacia de la marcacion y de la retirada del FCS con las diluciones idoneas de las fracciones que

sueltas

titulacion especial equipada con un fondo de cubreobjetos scencia (Evotec-Technologies, Alemania), se realizo la ris a 50 mM a pH 7,0 y una mezcla de monomeros de la Alexa-647, respectivamente, a una concentracion final de ma. Las mediciones se realizaron en un instrumento de lemania) con el uso de un objetivo de microscopio a 40* de 1,2 NA (Olympus, Japon) con ajustes opticos de FID pW con el laser de 488 nm, asf como una excitacion de 10 s, durante el cual el foco del laser se movio a lo larg el uso de una longitud de trayectoria del escaner de 100 la mesa de posicionamiento de 2000 pm. Esto es equi mm/s. Se generaron histogramas bidimensionales de d informatico 2D-SIFT (Evotec OAI, Alemania).

Resultados: Supresion de la agregacion de la a-sinucle

La agregacion de la a-sinuclema ocasionada por DMS complejos multimericos de la a-sinuclema que contienen verde en cantidades mas elevadas. Asf pues, la reaccio la presencia de un gran numero de complejos que emit 351F11 de tipo DPP a la solucion del analisis es ca multimericos de la a-sinuclema de un modo dependient tanto, el compuesto 351F11 es capaz de inhibir de mane concentracion micromolar baja en este modelo in vitro sinucleinopatias. Esto es una clara indicacion de que compuesto antiprionico, sino que tambien tiene la capa sinucleinopatfas, como la enfermedad de Parkinson, D nivel molecular. Tambien se puede detectar un efecto in sinuclema en otros compuestos relacionados con DPP compuestos representan un nuevo grupo de sustancias de la a-sinuclema, lo que permitira el desarrollo de un trat sinucleinopatias.

Ademas, la actividad inhibidora de estos compuestos so la de la a-sinuclema, puede ser el reflejo de su activid enfermedades por agregacion de una protema, en las q en las que predomina la lamina p forma la base para la p Por lo tanto, estos compuestos y otros miembros de la utiles como farmacos para el tratamiento causativo de to una protema (neurodegenerativas), entre ellas por ejemp priones, enfermedad de Parkinson, atrofia multisiste frontotemporal, esclerosis lateral amiotrofica, enferm enfermedades por poli-Q, angiopatfa amiloide cerebral sistemica primaria (amiloidosis A l ), amiloidosis sistemi localizada por inyeccion, amiloidosis de la microglobul sistemica hereditaria finlandesa.

Ejemplo 8: Inhibicion de PrPSc en el cultivo celular

Procedimientos experimentales:

Los cultivos de celulas infectados con priones se trata describe para el cribado primario que esta descrito mas indicadas en la figura 9. La estructura de los compuesto diametro estenopeico de 70 pm y una excitacion de 200 pW con el laser de 633 nm. El tiempo de medicion fue de l pocillo mediante un dispositivo de barrido de haces con a una frecuencia de barrido de 50 Hz y un movimiento de nte a una velocidad de barrido de aproximadamente 10 ucion de la intensidad y se analizaron con el programa

ebida a los compuestos

DMSO/Fe3+ queda reflejada mediante una formacion de dades de la a-sinuclema marcadas tanto en rojo como en control sin la adicion de compuestos inhibidores muestra randes cantidades de fotones. La adicion del compuesto de inhibir en gran medida la formacion de complejos la dosis, como se puede observar en la figura 8A. Por lo ficaz la formacion de multfmeros de la a-sinuclema a una la agregacion patologica de la protema hallada en las compuesto 351F11 no solo puede funcionar como un de convertirse en un compuesto terapeutico contra las AMS, ya que interfiere con el mecanismo patologico a dor dependiente de la dosis sobre la agregacion de la ase han investigado (figura 8B, C). Por lo tanto, estos una capacidad probada para inhibir la agregacion in vitro ento causativo contra la enfermedad de Parkinson y otras

ambas agregaciones in vitro, la de la protema prionica y ntiagregante general contra un abanico mas amplio de l plegamiento erroneo de la protema en conformaciones rior agregacion de la protema en las fibrillas del amiloide. e de sustancias de tipo DPP tienen la capacidad de ser n conjunto completo de enfermedades por agregacion de a enfermedad de Alzheimer, enfermedad causada por los enfermedad difusa con cuerpos de Lewy, demencia d de Huntington, ataxias espinocerebelosas y otras editaria, polineuropatfa amiloidotica familiar, amiloidosis eactiva (amiloidosis AA), diabetes de tipo 2, amiloidosis p2, amiloidosis no neuropatica hereditaria, amiloidosis

con los compuestos recien sintetizados tal y como se ba. Los compuestos se anadieron a las concentraciones muestra a continuacion y en la figura 3.

5-(3,5-Dibromofenil)-3-(3,4,5-trihidroxifenil)pirazol (anle1 )

5-(3-Bromofenil)-3-(3,4-dimetoxifenil)pirazol (sery255b) Resultados:

Una proporcion muy alta de compuestos relacionados co celular a concentraciones micromolares bajas e incluso compuestos representan un grupo de sustancias químic Ejemplo 9: Efecto inhibidor de diferentes derivados de D Los compuestos se analizaron con respecto a su efecto i protocolos experimentales:

a) Los ratones C57BL/6 se inocularon por via intracerebr RML de la tembladera de las ovejas). El tratamiento com dfa aplicado por via oral mezclado con DMSO mas man midio a los l2o dfas de la infeccion mediante analisis de b) Los ratones C57BL/6 se inocularon por via intracerebr RML de la tembladera de las ovejas). El tratamiento com (en DMSO) al dfa aplicado por inyeccion intraperitone tratamiento entre ellos) de 1 mg del compuesto (en DM nasogastrica. La cantidad de PrPSc en el cerebro se midi c) Los ratones C57BL/6 se inocularon por via intraperit (cepa RML de la tembladera de las ovejas). La cantidad tras 34 dfas de tratamiento con 1 mg del compuesto al df La inhibicion relativa de la acumulacion de PrPSc en co la tabla 1 (el valor medio de los animales tratados con D de inhibicion, el valor medio de los animales de control al de inhibicion).

Tabla 1: Efecto inhibidor de los diferentes derivados de D (a, b, c indican el protocolo experimental (tal y como esta d PP mostraban una reduccion fuerte de PrPSc en el cultivo concentraciones submicromolares. Esto indica que estos relacionadas con actividad antiprionica.

sobre la acumulacion de PrPSc en el cerebro y en el bazo ibidor sobre la acumulacion de PrPSc in vivo mediante tres

(i.c.) con 30 pl de homogeneizado de cerebro al 1% (cepa o a los 80 dfas de la infeccion con 1 mg del compuesto al uilla de cacahuete. La cantidad de PrPSc en el cerebro se unotransferencia.

(i.c.) con 30 pl de homogeneizado de cerebro al 1% (cepa o a los 80 dfas de la infeccion con 0,84 mg del compuesto durante 14 dfas seguido de 2 * 5 dfas (con 2 dfas sin mas aceite vegetal) aplicado por via oral mediante sonda los 106 dfas de la infeccion.

al (i.p.) con 100 pl de homogeneizado de cerebro al 1% PrPSc en el bazo se determino a los 35 dfas de la infeccion ezclado con DMSO y mantequilla de cacahuete.

racion con los grupos tratados con DMSO se muestra en O al final del periodo de tratamiento se definio como el 0% ienzo del periodo de tratamiento se definio como el 100%

sobre la acumulacion de PrPSc en el cerebro y en el bazo crito mas arriba) que se utilizo).

Los resultados de estos experimentos indican que bajo e los compuestos químicamente relacionados proporciona hay una relacion entre la estructura y la actividad qu experimentales, el anle138b represente un optimo relativ

Ejemplo 10: Se puede atravesar la barrera hematoen patologicos de la protema

Los ratones C57BL/6 se inocularon por via intracerebral RML de la tembladera de las ovejas). El tratamiento co (sery383) o 3 mg del compuesto (sery363a) al dfa apl cacahuete. Se midio la cantidad de PrPSc en el cere inmunotransferencia.

s condiciones expe rim en ta l i) el compuesto anle138b y na fuerte inhibicion de la amplificacion prionica in vivo, ii) indica que, para esta aplicacion en estas condiciones e actividad.

alica y se observa una interaccion con los agregados

.) con 30 pl de homogeneizado de cerebro al 1% (cepa zo a los 80 dfas de la infeccion con 1 mg del compuesto do por via oral mezclado con DMSO y mantequilla de a los 120 dfas de la infeccion mediante analisis de

En comparacion con los controles tratados con DMSO, s del 35%, y sery383 dio lugar a una reduccion de la acu

El sery363a se sintetizo y se analizo en estos experim esta bien adaptada para la marcacion con isotopos, lo para la toma de imagenes por TEP.

El sery383 se analizo en este ensayo porque este com vista estructural que contienen un grupo -NH2 y un ato inhibir la agregacion de la a-sinuclema (vease el ejemplo con diferentes compuestos»).

Los resultados de estos experimentos indican que amb e interaccionar con los agregados patologicos de la propiedades que se pueden explotar mediante el u diagnostico.

Ejemplo 11: Influencia del tratamiento diario con anle causada por los priones en los ratones infectados con l

Los ratones C57BL/6 se inocularon por via intracerebr RML de la tembladera de las ovejas). El tratamiento respectivamente, con 5 mg del compuesto cada dfa a cacahuete (figura 10).

Los cortes de cerebro tenidos para PrPSc (figura 10A) mu de PrPSc en comparacion con los animales tratados c homogeneizados de cerebro de los ratones inoculad acumulacion de PrPSc en los ratones tratados con anle el tratamiento en la fase tardfa de la enfermedad (120 apoptosicas en el cerebelo en los cortes de cerebro teni PrPSc da lugar a la inhibicion de la muerte celular neuro mantequilla de cacahuete sin compuesto muestran un anle138b desde los 80 dpi hacia adelante impide el adel desde los 120 dpi impide el adelgazamiento durante apr

Estos hallazgos experimentales indican que el tratamient de las celulas neuronales y la progresion de los signos comienza tarde despues de que aparezcan los signos o

Ejemplo 12: Comparacion de los diferentes protocolos d

Los ratones C57BL/6 se inocularon por via intracerebr RML de la tembladera de las ovejas). El tratamiento co indica en la leyenda de de la figura 11) prolongo sig provocacion con la cepa RML de la tembladera de las o expresa en dfas ± desviacion estandar.

Tal y como se muestra en la figura 11, estos hallazgos es eficaz tambien despues de la aplicacion oral del comp en una fase clmica tardfa de la enfermedad, y iii) que la duradera.

Ejemplo 13: Efecto dependiente de la dosis de la admini

Los ratones C57BL/6 se inocularon por via intracerebr RML de la tembladera de las ovejas). El tratamiento co de anle138b (tal y como se muestra en la figura 12) a 3a dio lugar a una reduccion de la acumulacion de PrPSc ion de PrPSc del 30%.

porque proporciona una modificacion de anle138b que e necesita para ser usado como un trazador diagnostico

, asf como los compuestos similares desde el punto de e halogeno, se hallo que eran muy activos a la hora de Inhibicion de la formacion de agregados de a-sinuclema

mpuestos pueden atravesar la barrera hematoencefalica ma, lo que demuestra que estos compuestos tienen mo compuesto terapeutico, asf como un compuesto

sobre la acumulacion de PrPSc y sobre la enfermedad RML de la tembladera de las ovejas.

.) con 30 pl de homogeneizado de cerebro al 1% (cepa enzo a los 80 dfas o a los 120 dfas de la infeccion, do por via oral mezclado con DMSO y mantequilla de

n que el tratamiento con anle138b reduce la acumulacion MSO. La cuantificacion de la cantidad de PrPSc en los n priones en diferentes momentos demuestra que la se reduce enormemente, incluso despues de comenzar figura 10B). La cuantificacion histologica de las celulas on HE demuestra que la inhibicion de la acumulacion de igura 10C). Los ratones de control tratados con DMSO y gazamiento progresivo (figura 10D). El tratamiento con iento durante aproximadamente 100 dfas. El tratamiento adamente 70 dfas.

el compuesto inhibe la acumulacion de PrPSc, la muerte cos de la enfermedad, incluso cuando el tratamiento se de la enfermedad.

amiento

.) con 30 pl de homogeneizado de cerebro al 1% (cepa le138b en diferentes momentos y pautas (tal y como se tivamente los tiempos de supervivencia despues de la (p < 0,01). La media de los tiempos de supervivencia se

imentales indican que i) el tratamiento con el compuesto , ii) el tratamiento tambien es eficaz cuando se comienza gacion del tratamiento da lugar a una supervivencia mas

on de anle138b sobre la cantidad de PrPSc en el cerebro

.) con 30 pl de homogeneizado de cerebro al 1% (cepa o a los 80 dfas de la infeccion con diferentes cantidades o por via oral y mezclado con DMSO y mantequilla de cacahuete. A los 120 dfas de la infeccion, se sacrificaron en comparacion con los animales sacrificados a los 80 Los datos dados a conocer en la figura 12 demuestran una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 14: Cuantificacion de PrPC por inmunotransfer con 1 mg al dfa de anle138b mezclado con DMSO y muestra en la figura 13, no se observo ninguna reduccio cuando se comparo con los ratones de control.

Estos hallazgos experimentales indican que el efect tembladera de las ovejas no se debe a una reduccion de especies patologicas agregadas de la protema.

Ejemplo 15: Analisis farmacocinetico de anle138b

Se aplico una dosis unica de anle138b a los ratones diferentes momentos despues de la aplicacion, la canti animales por punto temporal y grupo experimental medi Estos hallazgos experimentales indican que hay una cerebro. El anle138c se detecto en la sangre de los rato Ejemplo 16: Inhibicion de la formacion de agregados de La agregacion de la a-sinuclema se indujo mediante DM de moleculas sueltas, tal y como esta descrito en Kostk diferentes compuestos anadidos a una concentracion d intermedio II se estudio en comparacion con los control estructura de los compuestos correspondientes se mue Tabla 2. Inhibicion de la formacion de agregad nimales, y la cantidad de PrPSc en el cerebro se cuantifico e la infeccion.

nle138b redujo la acumulacion de PrPSc en el cerebro de

de tejido de cerebro de los ratones sin infectar tratados equilla de cacahuete durante 1 semana. Tal y como se la cantidad de PrPC en los ratones tratados con anle138b

peutico en los ratones infectados con la cepa de la expresion de PrPC sino a una inhibicion de la formacion

L/6 sin infectar tal y como se indica en la figura 14. En el compuesto en el cerebro y en el suero se midio en 2 LC-MS.

a biodisponibilidad oral y una buena penetracion en el por lo que se supone que es un metabolito de anle138b. sinuclelma mediante diferentes compuestos

10 pM de FeCh, y se analizo por espectroscopia confocal l (J. Biol. Chem. (2008) 283: 10992-11003). El efecto de pM sobre el efecto de la formacion de los oligomeros del in el compuesto, tal y como se muestra en la tabla 2. La n la figura 15.

a-sinuclema mediante diferentes compuestos.

Los hallazgos experimentales indican que estos com sinuclema, lo que indica que estos compuestos con rel tratamiento de las enfermedades de la protema con la tratamiento de enfermedades en las que se puede obse

Ejemplo 16: Efecto de los compuestos en un modelo de

Las pruebas experimentales sugieren que en los model toxinas mitocondriales tales como MPTp y rotenona a l de agregados de a-sinuclema y contribuye a la muerte c de masa corporal al dfa) por inyeccion intraperitoneal l tos inhiben la formacion de agregados toxicos de aestructural tienen la capacidad de ser utilizados para el gacion de una protema y, en particular, tambien para el la agregacion de la a-sinuclema.

n in vivo de la enfermedad de Parkinson

perimentales de la enfermedad de Parkinson que utilizan ncentraciones idoneas, se puede observar la formacion r neuronal. Los ratones se trataron con MPTP (30 mg/kg fas 1 a 5 para inducir la degeneracion de las neuronas dopaminergicas de la sustancia negra. Los animales (d compuestos o con el vehnculo (250 mg/kg de masa c compuesto en 12,5 pl de DMSO mezclado con 487,5 pl perdida de neuronas en comparacion con los ratones tr celular) y los ratones tratados con MPTP que se tratar muerte celular). Para la cuantificacion de las celulas de hidroxilasa (TH), se inmunotineron cortes de 50 pm con largo de la SNc con el uso del programa Stereo Investi inmunotenidas se contaron con el metodo del fraccionad realizaron dos investigadores independientes con anoni

Los hallazgos experimentales que se muestran en la fi muerte celular en un modelo in vivo de la enfermedad de

Ejemplo 17: Efecto de anle138c sobre la agregacion de

La Ap40 a una concentracion de 50 pM se incubo en la mM, cloruro de sodio a 50 mM, azida de sodio al 0,01%, o sin anle138c a 50 pM. Se le anadio DMSO a la muestra La concentracion de DMSO era del 2% (v/v) y la solucion se centrifugo a 16000g durante 15 minutos antes de los

Mientras que el pico mas grande en la Ap40 mon aproximadamente 1,5 nm y un pico de oligomero a aprox de Ap40 en presencia de anle138c (panel central) mostr monomero. El panel inferior muestra la distribucion se medido despues de centrifugar la muestra. La agregaci Las mediciones de DLD se realizaron por duplicado a Corp., CA), con un laser de 827,08 nm. El angulo de adquisiciones de 10 s de duracion. El mdice refractivo (I el IR a la longitud de onda estudiada se obtuvo mediante viscosidad era de 1,019 cp a 20 °C y las variaciones depe acuoso. La distribucion segun el tamano se determino m

Estos hallazgos experimentales tal y como se muestran grandes oligomeros de Ap40, lo que indica que el anle1 con la agregacion de Ap, lo que se puede utilizar con pr como la enfermedad de Alzheimer que se caracterizan agregados.

Una realizacion alternativa de los compuestos de la pre compuestos se pueden utilizar de una manera identica a

1. Un compuesto representado por la formula (I)

a 10 por grupo experimental) se trataron con diferentes ral al dfa, aplicacion oral (alimentacion por sonda del ceite de oliva) los dfas 0 a 12). El dfa 12 se cuantifico la os sin MPTP (control, definidos como el 0% de muerte olo con el vehnculo (DMSO, definido como el 100% de ustancia negra compacta (SNc) positivas para la tirosina nticuerpo anti-TH. Se analizaron los cortes alternos a lo (MicroBrightfield, Colchester, VT, EE. UU.). Las celulas ptico y un objetivo 20*. Los recuentos estereologicos los .

16 indican que los compuestos analizados reducen la rkinson.

iente condicion durante 30 horas: fosfato de sodio a 50 7,4, 37 °C, agitado con barras magneticas delgadas, con ontrol a la misma concentracion que la muestra problema. eserva de anle138c era de 3 mM. La solucion del peptido erimentos de DLD.

rica se correspondfa con un radio hidrodinamico de amente 30 nm (panel superior), el estado de agregacion pico de oligomero en torno a 20 nm ademas del pico de el tamano del estado de la Ap40 en fibrillas amiloides, e Ap40 se analizo mediante dispersion de luz dinamica. C, en un instrumento DynaPro Titan (Wyatt Technology rsion era de 90°. La medicion de DLD consistio en 20 e la solucion se establecio en 1,333 a 589 nm y 20 °C, y cuacion de Cauchy, con un coeficiente de 3119 nm2. La ntes de la temperatura se calcularon mediante un modelo nte un metodo de regularizacion constrenido.

la figura 17 indican que anle138c inhibe la formacion de y los compuestos relacionados tambien pueden interferir sitos terapeuticos y diagnosticos en enfermedades tales e el punto de vista neuropatologico por depositos de Ap

e descripcion se resume en los siguientes puntos. Estos compuestos de la invencion mencionados mas arriba.

en donde

X, Y y L se seleccionan de manera independiente y N+(R17)=, -O -y -S-;

M y Z se seleccionan de manera independiente y no dire ireccional de -C(R11)(R12)-, -C(R13)=, -N(R14)-, -N=,

nal de

------ representa un doble enlace optativo;

R1 a R15 o R17 o R18 se seleccionan independientemente sulfonilo, tio, fosfonilo, carboxi, carbonilamido, alquilo, alquen carbodclico, carboxiclooxi, carbocicloalquilo, carbocicloalque arilalcoxi, un grupo heterodclico, heterociclooxi, heterocicloalq heteroarilalquenilo y heteroarilalcoxi, o dos grupos adyacente que tiene de 1 a 6 atomos de carbono, en donde uno o dos at o -N(R')-, en donde R' se selecciona de H y alquilo(Ci-4); cada asf como un profarmaco, ester, solvato o sal del mismo;

siempre y cuando el compuesto no sea uno de los siguientes hidrogeno, halo, ciano, hidroxi, nitro, amino, azido, alquinilo, alcoxi, acilo, aciloxi, acilamino, un grupo , arilo, arilalquilo, arilalquenilo, arilalquinilo, ariloxi, , un grupo heteroarilo, heteroariloxi, heteroalrilalquilo, ueden estar unidos para formar un grupo de puente os de carbono pueden estar remplazado por -O-, -S­ o de los cuales esta sustituido optativamente;

puestos (a), (b) o (c)

2. El compuesto de acuerdo con el punto 1, en dond estructuras:

l anillo A se selecciona de manera direccional de las siguientes

3. El compuesto de acuerdo con el punto 1 o 2, en donde R7 amino, haloalcoxi, alquilo o haloalquilo.

4. El compuesto de acuerdo con cualquiera de los element halo, ciano, hidroxi, nitro, azido, alcoxi, tfo, alquiltio,

1 a 3, en donde R2 y R3 cada uno se selecciona independientemente de hidroxi y alcoxi(Ci-6); o R2 y R3 j 1 a 3, preferiblemente n es 1.

5. Un compuesto representado por la formula (I)

os forman una estructura -O-(CH2)n-O-, en donde n es de

en donde

X, Y y L se seleccionan de manera independiente y n N+(R17)=, -O -y -S-;

M y Z se seleccionan de manera independiente y no dire ireccional de -C(R11)(R12)-, -C(R13)=, -N(R14)-, -N=, -

nal de

------ representa un doble enlace optativo;

R1 a R15 o R17 o R18 se seleccionan independientem sulfonilo, tio, fosfonilo, carboxi, carbonilamido, alquilo, al carbodclico, carboxiclooxi, carbocicloalquilo, carboxiclo arilalcoxi, un grupo heterodclico, heterociclooxi, heterocicl heteroarilalquenilo y heteroarilalcoxi o dos grupos adyac que tiene de 1 a 6 atomos de carbono, en donde uno o d o -N(R')-,

en donde R' se selecciona de H y alquilo(Ci-4); cada uno asf como un profarmaco, ester, solvato o sal del mismo;

para ser usado en el tratamiento o la prevencion de una y/o una enfermedad neurodegenerativa.

6. Uso de un compuesto representado por la formula (I composicion farmaceutica para tratar o prevenir una enf una enfermedad neurodegenerativa.

7. Un metodo para tratar o prevenir una enfermedad enfermedad neurodegenerativa que comprende la admi compuesto representado por la formula (l), tal y como es necesita.

8. Un metodo de identificacion de un compuesto para enfermedad relacionada con la agregacion de una prote las etapas de:

poner en contacto una protema monomerica marcada y u en (1) presencia y/o (2) ausencia de un candidato a inhi definido en el punto 5;

determinar la cantidad de los marcadores colocalizados monomerica al agregado de dicha protema; y

comparar el resultado obtenido en presencia y ausenci e de hidrogeno, halo, ciano, hidroxi, nitro, amino, azido, enilo, alquinilo, alcoxi, acilo, aciloxi, acilamino, un grupo enilo, arilo, arilalquilo, arilalquenilo, arilalquinilo, ariloxi, lquilo, un grupo heteroarilo, heteroariloxi, heteroarilalquilo, es pueden estar unidos para formar un grupo de puente tomos de carbono puede estar reemplazado por -O-, -S-,

los cuales esta optativamente sustituido;

fermedad relacionada con la agregacion de una protema

l y como esta definido en el punto 5 para preparar una edad relacionada con la agregacion de una protema y/o

lacionada con la agregacion de una protema y/o una tracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un definido en el punto 5, que se aplica a un paciente que lo

hibir la agregacion de una protema implicada en una y/o una enfermedad neurodegenerativa, que comprende

gregado de dicha protema marcado de manera diferente r de la agregacion que es un compuesto tal y como esta

e representan la extension de la fijacion de la protema

de dicho compuesto, en donde una disminucion de los marcadores colocalizados en presencia de dicho compue la agregacion de dicha protema.

9. El metodo de acuerdo con el punto 8, en donde dichos 10. El metodo de acuerdo con el punto 8 o 9, en dond fragmento de un anticuerpo espedficamente fijado a dich 11. El metodo de acuerdo con el punto 10, en donde di discriminar entre la protema agregada y la protema mono 12. El metodo acuerdo con de cualquiera de los puntos 8 determina con el uso del metodo de «cribado de dianas in por resonancia de fluorescencia (FRET) o toma de image 13. El metodo acuerdo con de cualquiera de los puntos 8 se seleccionan del grupo que consiste en protema prio superoxido dismutasa, protema t, inmunoglobulina, a apolipoprotema A1, TDP-43, amilina, ANF, gelsolina, in protemas con un tramo de poli-Q, y fragmentos o derivad 14. El metodo de acuerdo con el punto 13, en donde dicha agregada es la PrPSc.

15. El metodo de acuerdo con el punto 13, en donde dic agregada se selecciona del grupo que consiste en oligom 16. Un metodo para seleccionar compuestos con eficacia i relacionada con la agregacion de una protema y/o una e (a) administrar un compuesto candidato tal y como esta humano que tiene la isoforma agregable de la protema, t (b) cuantificar la cantidad de agregados observables; y

(c) identificar y seleccionar un compuesto que es capaz dicha protema o de incrementar el tiempo de supervivenc 17. Uso de un compuesto tal y como esta definido en el p un animal o ex vivo.

18. Una composicion farmaceutica o de diagnostico que punto 5, y optativamente un vehmulo farmaceuticamente 19. El compuesto de acuerdo con cualquiera de los punt acuerdo con cualquiera de los puntos 7 a 16 o el uso de punto 18, en donde dicho compuesto se selecciona del g es indicativo de la capacidad del compuesto para inhibir

arcadores son marcadores fluorescentes.

ichos marcadores estan unidos a un anticuerpo o a un rotema.

o anticuerpo o fragmento de un anticuerpo es capaz de rica.

11, en donde la cantidad de marcadores colocalizados se samente fluorescentes (SIFT)» o transferencia de energfa s confocales de alta resolucion.

12, en donde dichas protemas monomericas y agregadas a, protema precursora del amiloide (PPA), a-sinuclema, loide A, transtirretina, microglobulina p2, cistatina C, lina, lisozima, fibrinogeno, huntingtina y ataxina, y otras de dichas protemas.

otema monomerica es la protema prionica y dicha protema

protema monomerica es la a-sinuclema y dicha protema s o protofibrillas o fibrillas de la a-sinuclema.

ivo para el tratamiento o la prevencion de una enfermedad rmedad neurodegenerativa, que comprende:

finido en el punto 5 a un cultivo celular o a un animal no como esta definido en cualquiera de los puntos 13 a 15;

reducir los agregados o la formacion de agregados de del cultivo celular o el animal no humano.

to 5 para inhibir la agregacion de una protema in vitro, en

omprende un compuesto, tal y como esta definido en el eptable.

1 o 5 o el uso de acuerdo con el punto 6 o el metodo de erdo con el punto 17 o la composicion de acuerdo con el o que consiste en:

y

en donde cada R16 se selecciona independientemente estar unidos para forma un grupo de puente que tiene solvato o sal del mismo.

20. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos o 19, la composicion de diagnostico de acuerdo con cual marcado de manera detectable.

21. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 17, 19 a 20, en donde dos o mas de dichos compuestos

22. El compuesto de acuerdo con cualquiera de los pu agregacion de una protema se caracteriza por la prese fragmento o derivado del mismo, en donde la protema protema precursora del amiloide (PPA), a-sinuclema, su transtirretina, microglobulina p2, cistatina C, apolipoprot fibrinogeno, huntingtina y ataxina, y otras protemas con

23. El compuesto de acuerdo con cualquiera de los punt grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfer atrofia multisistemica, enfermedad difusa con cuerpos de enfermedad de Huntington, ataxias espinocerebelosas y hereditaria, polineuropatfa amiloidotica familiar, amiloido reactiva (amiloidosis AA), diabetes de tipo 2, amiloidosis amiloidosis no neuropatica hereditaria y amiloidosis sist

24. El compuesto de acuerdo con el punto 23, en donde y alquilo(Ci_4); o dos grupos R16 adyacentes pueden 3 atomos de carbono; asf como un profarmaco, ester,

9, o el uso de acuerdo con cualquiera de los puntos 17 de los puntos 18 o 19, en donde dicho compuesto esta

a 20, o el uso de acuerdo con cualquiera de los puntos ilizan simultaneamente.

o 19, en donde dicha enfermedad relacionada con la e una forma agregada de al menos una protema o un elecciona del grupo que consiste en protema prionica, ido dismutasa, protema t, inmunoglobulina, amiloide A, A1, TDP-43, amilina, ANF, gelsolina, insulina, lisozima, mo de poli-Q.

19 o 22, en donde dicha enfermedad se selecciona del d causada por los priones, enfermedad de Parkinson, , demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedades por poli-Q, angiopatfa amiloide cerebral stemica primaria (amiloidosis AL), amiloidosis sistemica zada por inyeccion, amiloidosis de la microglobulina p2, hereditaria finlandesa.

enfermedad causada por los priones se selecciona de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, variante de la enfer causada por los priones, encefalopatia espongiforme bov

25. Un kit que comprende el compuesto tal y como esta un anticuerpo o fragmento de anticuerpo espedficame agregada tal y como esta definido en los puntos 13 a 15; y en los puntos 13 a 15 optativamente formando complejo varios envases.

El termino «halo», tal y como se utiliza en la presente m fluor, cloro, bromo y yodo, preferiblemente bromo.

El termino «carboxi», tal y como se utiliza en la presente

El termino «alquilo» y «alq» se refiere a un radical de alca de 1 a 12 atomos de carbono, preferiblemente de 1 a 6 a carbono. Tales grupos de ejemplo incluyen, pero sin limit isobutilo, pentilo, hexilo, isohexilo, heptilo.

El termino «alquenilo» se refiere a un radical de hidrocar atomos de carbono, preferiblemente de 2 a 6 atomos de Tales grupos de ejemplo incluyen etenilo o alilo.

El termino «alquinilo» se refiere a un radical de hidrocar atomos de carbono, preferiblemente de 2 a 6 atomos de Tales grupos de ejemplo incluyen etinilo.

El termino «alcoxi» se refiere a un grupo alquilo tal y co oxfgeno (-O-).

Un «grupo acilo» de acuerdo con la presente invencion e heteroarilo esta unido a un grupo carbonilo. Los ejemplos tal como grupo acetilo, grupo propionilo, grupo butirilo y g etenoflo, grupo propenoflo y grupo butenoflo; grupo aroflo, acetilo.

El termino «aciloxi», tal y como se utiliza en la presente

igual forma, «acilamino» es un grupo acilo que esta unido

El termino «grupo carbodclico» se refiere a un grupo de 4 anillos, preferiblemente 1 anillo, y de 3 a 8 carbonos ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc.

El termino «carbociclooxi» se refiere a un grupo carbodcl enlace de oxfgeno (-O-).

El termino «carbocicloalquilo» se refiere a un grupo alquil y el alquilo son tal y como estan esbozados mas arriba.

El termino «carbocicloalquenilo» se refiere a un grupo grupo carbodclico y el alquenilo estan definidos tal y com

El termino «arilo» se refiere a grupos de hidrocarburo aro atomos de carbono en el esqueleto, y tienen de 1 a 3 anil tales como fenilo, bifenilo o naftilo. Cuando contienen aromaticos del grupo arilo pueden estar unidos por un s naftilo, fenantrenilo y similares).

El termino «arilalquilo» se refiere a un grupo alquilo susti definidos tal y como esta esbozado mas arriba.

El termino «arilalquenilo» se refiere a un grupo alquenilo estan definidos tal y como esta esbozado mas arriba.

El termino «arilalquinilo» se refiere a un grupo alquinilo estan definidos tal y como esta esbozado mas arriba.

El termino «ariloxi» se refiere a un grupo arilo tal y com oxfgeno (-O-), por ejemplo, grupo fenoxi, grupo antriloxi, dad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad genetica humana (EEB) y tembladera de las ovejas.

finido en cualquiera de los puntos 5 y 18 a 24 y, ademas, fijado a dicho compuesto; y/o protema monomerica o protema monomerica o agregada tal y como esta definido dicho compuesto; e instrucciones para el uso, en uno o

oria, se refiere a un atomo de halogeno seleccionado de

moria, se refiere al grupo -COOH.

(hidrocarburo) de cadena lineal o ramificada que contiene os de carbono, mas preferiblemente de 1 a 4 atomos de e a ellos, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, f-butilo,

ro de cadena lineal o ramificada que contiene de 2 a 12 bono y al menos un doble enlace de carbono a carbono.

o de cadena lineal o ramificada que contiene de 2 a 12 bono, y al menos un triple enlace de carbono a carbono.

esta descrito mas arriba unido a traves de un enlace de

n grupo funcional en el que un alquilo, arilo, heterociclo o grupos acilo son grupo formilo; grupo alquil(C1-6)-carbonilo, o pivaloflo; grupo alquenil(C2-6)-carbonilo tal como grupo l como grupo benzoflo, y similares, preferiblemente grupo

oria, se refiere a un grupo acilo que esta unido a -O-. De -N(R")-, en donde R'' es H o alquilo(C1-6).

rocarburo dclico totalmente saturado que contiene de 1 a r anillo. Tales grupos de ejemplo incluyen ciclopropilo,

tal y como esta descrito mas arriba unido a traves de un

stituido con un grupo carbodclico, en donde el carbociclo

enilo sustituido con un grupo carbodclico, en donde el sta esbozado mas arriba.

tico dclicos que tienen de 6 a 20, preferiblemente 6 a 10, aromaticos, sobre todo grupos monodclicos o bidclicos, s o mas anillos aromaticos (bidclicos, etc.), los anillos punto (p. ej., bifenilo) o pueden estar fusionados (p. ej.,

o con un grupo arilo, en donde el arilo y el alquilo estan

tituido con un grupo arilo, en donde el arilo y el alquenilo

tituido con un grupo arilo, en donde el arilo y el alquinilo

sta descrito mas arriba unido a traves de un enlace de po bifeniloxi y similares, preferiblemente un grupo fenoxi.

El termino «arilalcoxi» se refiere a un grupo alcoxi susti definidos tal y como esta esbozado mas arriba.

El termino «grupo heterodclico» se refiere a los gru insaturados (por ejemplo, sistemas de anillos monodcli tridclicos con 10 a 16 miembros) que tienen al menos un carbono. Cada anillo del grupo heterodclico que contie seleccionados de atomos de nitrogeno, atomos de oxf nitrogeno y azufre pueden estar optativamente oxidados cuaternizados (el termino «heteroarilio» se refiere a un g y asf una carga positiva). El grupo heterodclico puede es atomo de carbono del anillo o del sistema de anillos. Los de etileno, azetidinilo, pirrolidinilo, pirrolilo, pirazolilo, ox oxazolilo, oxazolidinilo, isoxazolinilo, isoxazolilo, tiazolil tetrahidrofurilo, tienilo, oxadiazolilo, piperidinilo, piperazi oxoazepinilo, azepinilo, hexahidrodiazepinilo, 4-piperid triazolilo, tetrazolilo, tetrahidropiranilo, morfolinilo, tiamor dioxolano y tetrahidro-1,1 -dioxotienilo y similares. Los g isoindolilo, benzotiazolilo, benzodioxolilo, benzoxazolilo tetrahiroisoquinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, cromonilo, cumarinilo, benzopiranilo, cinolinilo, quinoxali c]piridinilo, furo[3,2-b]piridinilo o furo[2,3-b]piridini dihidroisoindolilo, dihidroindolilo, dihidroquinolinilo, dih triazinilazepinilo, tetrahidroquinolinilo y similares. Los gru benzidolilo, fenantrolinilo, dibenzofuranilo, acridinilo, fena

El termino «heterociclooxi» se refiere a un grupo hetero un enlace de oxfgeno (-O-).

El termino «heterocicloalquilo» se refiere a un grupo heterociclo y el alquilo estan definidos tal y como esta es

El termino «heteroarilo», tal y como se utiliza en la present que puede contener, como heteroatomos, oxfgeno, azufre mas. Los ejemplos no limitantes y sin limitacion de grup tiazolilo, imidazolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, pirrolilo, piranilo, tetrahidropiranilo, pirazolilo, piridilo, q benzamidazolilo, indolilo, isoindolilo, pirazinilo, diazinilo, benzopiridilo y bencimidazolilo.

El termino «heteroariloxi» se refiere a un grupo heteroar enlace de oxfgeno (-O-).

Los terminos «heteroarilalquilo», «heteroarilalquenilo» y alquilo, alquenilo o alquinilo esta sustituido con un grupo alquinilo estan definidos tal y como se esbozo mas arriba

El termino «heteroarilalcoxi» se refiere a un grupo alcoxi estan definidos tal y como se esbozo mas arriba.

«Sustituido», tal y como se utiliza en la presente memoria, preferiblemente de 1 a 4 sustituyentes, en cualquier punt pero sin limitarse a ellos, uno o varios de los grupos sigui alcoxicarbonilo, alquilcarboniloxi, amino (a saber, -NH2), t

En una realizacion alternativa preferida, R1 se selecci preferiblemente hidrogeno.

En una realizacion alternativa preferida, R2 se seleccion

En una realizacion alternativa preferida, R3 se seleccion

En otra realizacion alternativa preferida, R2 y R3 estan donde n es de 1 a 3, preferiblemente n es 1.

En una realizacion alternativa preferida, R4 se seleccion preferiblemente hidrogeno.

o con un grupo arilo, en donde el arilo y el alcoxi estan

dclicos totalmente saturados, o parcial o totalmente con 3 a 7 miembros, bidclicos con 7 a 11 miembros, o teroatomo en al menos un anillo que contiene atomos de un heteroatomo puede tener 1, 2, 3 o 4 heteroatomos o y/o atomos de azufre, en donde los heteroatomos de s heteroatomos de nitrogeno pueden estar optativamente o heteroarilo que lleva un atomo de nitrogeno cuaternario unido al resto de la molecula en cualquier heteroatomo o pos heterodclicos monodclicos de ejemplo incluyen oxido nilo, pirazolinilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, iadiazolilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, isotiazolidinilo, furilo, , 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 2-oxopirrolidinilo, 2­ lo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, triazinilo, inilo, sulfoxido de tiamorfolinilo, tiamoilfolinilsulfona, 1,3-os heterodclicos bidclicos de ejemplo incluyen indolilo, benzoxadiazolilo, benzotienilo, quinuclidinilo, quinolinilo, nzopiranilo, indolizinilo, benzofurilo, benzofurazanilo, , indazolilo, pirrolopiridilo, furopiridinilo (tal como furo[2,3-, dihidrobenzodioxinilo, dihidrodioxidobenzotiofenilo, oquinazolinilo (tal como 3,4-dihidro-4-oxoquinazolinilo), heterodclicos tridclicos de ejemplo incluyen carbazolilo, idinilo, xantenilo y similares.

ico tal y como esta descrito mas arriba unido a traves de

uilo sustituido con un grupo heterodclico, en donde el zado mas arriba.

emoria, se refiere a un anillo aromatico de 5 a 6 miembros o nitrogeno, y al cual se puede fusionar un anillo aromatico heteroarilo son benzofuranilo, furilo, tienilo, benzotienilo, nzotiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, olinilo, isoquinolinilo, purinilo, carbazolilo, benzoxazolilo. zina, triaziniltriazina, tetrazinilo, tetrazolilo, benzotiofenilo,

tal y como esta descrito mas arriba unido a traves de un

teroarilalquinilo» se refieren a grupos en los que un grupo eteroarilo, en donde el heteroarilo y el alquilo, alquenilo y

n un grupo heteroarilo, en donde el heteroarilo y el alcoxi

refiere a un grupo sustituido con uno o mas sustituyentes, e union disponible. Los sustituyentes de ejemplo incluyen, es: alquilo, alcoxi, halo, hidroxi, carboxi (a saber, -COOH), y nitro.

a del grupo que consiste en hidrogeno y alquilo, mas

el grupo que consiste en hidroxi y alcoxi.

el grupo que consiste en hidroxi y alcoxi.

lazados entre sf y forman una estructura -O(CH2)nO-, en

el grupo que consiste en hidrogeno, hidroxi y alcoxi, mas En una realizacion alternativa preferida, R5 se selecci preferiblemente hidrogeno.

En una realizacion alternativa preferida, R6 se selecci preferiblemente hidrogeno.

En una realizacion alternativa preferida, R7 se seleccio hidroxi y alcoxi, mas preferiblemente R7 es hidrogeno, ha En una realizacion alternativa preferida, R8 se selecciona En una realizacion alternativa preferida, R9 se selecciona En una realizacion alternativa preferida, R10 se selecc preferiblemente hidrogeno.

En una realizacion alternativa preferida, R11 se seleccio En una realizacion alternativa preferida, R12 se seleccio En una realizacion alternativa preferida, R13 se seleccio En una realizacion alternativa preferida, R14 se seleccio En una realizacion alternativa preferida, R15 se seleccio En otra realizacion alternativa preferida del compuesto de l tfo, alquiltfo, amino, haloalcoxi, alquilo o haloalquilo.

En una realizacion alternativa preferida, R7 es halo, ciano, En otra realizacion alternativa preferida, R2 y R3 se selec 6); o R2 y R3 juntos forman una estructura -O-(CH2)n-O-, En una realizacion alternativa preferida, el compuesto se del grupo que consiste en hidrogeno y alquilo, mas

del grupo que consiste en hidrogeno y alquilo, mas

del grupo que consiste en hidrogeno, halo, ciano, nitro, hidroxi o alcoxi, incluso mas preferiblemente R7 es halo. l grupo que consiste en hidrogeno, hidroxi y alcoxi.

l grupo que consiste en hidrogeno, halo, hidroxi y alcoxi. a del grupo que consiste en hidrogeno y alquilo, mas

el grupo que consiste en hidrogeno y alquilo.

el grupo que consiste en hidrogeno y alquilo.

el grupo que consiste en hidrogeno y alquilo. el grupo que consiste en hidrogeno y alquilo.

el grupo que consiste en hidrogeno y alquilo.

nvencion, R7 es halo, ciano, hidroxilo o nitro, azido, alcoxi,

idroxilo o nitro, mas preferiblemente halo.

nan cada uno independientemente de hidroxi y alcoxi(Cidonde n es de 1 a 3, preferiblemente n es 1.

ecciona del grupo que consiste en

y

en donde cada R16 se selecciona independientemente estar enlazados para formar un grupo de puente que tiene solvatos o sales de los mismos.

En una realizacion alternativa mas preferida, el compuest H y alquilo(Ci_4); o dos grupos R16 adyacentes pueden 1 a 3 atomos de carbono; asf como profarmacos, esteres, e selecciona del grupo que consiste en:

3-(4-Hidroxifenil)-5-(3,4-dihidroxifenil)isoxazol

3,5-Bis(3,4-dimetoxifenil)pirazol

5-(3-Bromofenil)-3-(3,4-metilendioxifenil)pirazol

5-(3-Fluorofenil)-3-(3,4-metilendioxifenil)pirazol

3-(3,4-Dihidroxifenil)-5-(3-fluorofenil)pirazol

Hidrobromuro de 2,4-bis(3,4-dihidroxifeni azol

3-(3,4-Dimetoxifenil)-5-(3,4,5-trimetoxife

Hidrobromuro de 5-(3,5-dibromofenil)-3-(

5-(3-Bromofenil)-3-(2-hidroxifenil)pirazol Los compuestos de la realizacion alterna zol

-trihidroxifenil)pirazol

3_F11)

e pueden marcar de manera detectable.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto representado por la formula (E):

en donde:

R se selecciona de hidrogeno; alquilo(Ci-4); y -alquileno(C1-4)-halogeno; y

Hal se selecciona de F, Cl, Br e I;

RA9 es H o alquilo(Ci-4); y

RA10 es H o alquilo(Ci-4);

o un solvato o sal de estos compuestos.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el compuesto es:

en donde Hal es Cl o Br;

o un solvato o sal de estos compuestos.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde el compuesto esta marcado de manera detectable, en donde el marcador detectable se selecciona de 18F, 11C, 125l, 131l, 77Br y 76Br.

4. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde el marcador detectable se selecciona de 18F y 11C.

5. Una composicion farmaceutica o diagnostica que comprende un compuesto segun esta definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un solvato o sal del mismo, y optativamente un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

6. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un solvato o sal del mismo, para ser usado en el tratamiento o la prevencion de una enfermedad relacionada con la agregacion de una protema y/o una enfermedad neurodegenerativa.

7. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde la enfermedad relacionada con la agregacion de una protema se caracteriza por la presencia de una forma agregada de al menos una protema o un fragmento o derivado de la misma, en donde la protema se selecciona del grupo que consiste en protema prionica, protema precursora del amiloide (PPA), a-sinuclema, superoxido dismutasa, protema t, inmunoglobulina, amiloide A, transtirretina, microglobulina p2, cistatina C, apolipoprotema A1, TDP-43, amilina, ANF, gelsolina, insulina, lisozima, fibrinogeno, huntingtina y ataxina, y otras protemas con un tramo de poli-Q.

8. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, enfermedad causada por los priones, enfermedad de Alzheimer, atrofia multisistemica, enfermedad difusa con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Huntington, ataxias espinocerebelosas y otras enfermedades por poli-Q, angiopatfa amiloide cerebral hereditaria, polineuropatia amiloidotica familiar, amiloidosis sistemica primaria (amiloidosis AL), amiloidosis sistemica reactiva (amiloidosis AA), diabetes de tipo 2, amiloidosis localizada por inyeccion, amiloidosis de la microglobulina p2, amiloidosis no neuropatica hereditaria y amiloidosis sistemica hereditaria finlandesa.

9. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde la enfermedad causada por los priones se selecciona de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad genetica humana causada por priones, encefalopatfa espongiforme bovina (EEB) y tembladera de las ovejas.

10. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un solvato o sal del mismo, para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar o prevenir una enfermedad relacionada con la agregacion de una protema y/o una enfermedad neurodegenerativa.

11. El uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde la enfermedad relacionada con la agregacion de una protema se caracteriza por la presencia de una forma agregada de al menos una protema o un fragmento o derivado de la misma, en donde la protema se selecciona del grupo que consiste en protema prionica, protema precursora del amiloide (PPA), a-sinuclema, superoxido dismutasa, protema t, inmunoglobulina, amiloide A, transtirretina, microglobulina p2, cistatina C, apolipoprotema A1, TDP-43, amilina, ANF, gelsolina, insulina, lisozima, fibrinogeno, huntingtina y ataxina, y otras protemas con un tramo de poli-Q.

12. El uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, enfermedad causada por los priones, enfermedad de Alzheimer, atrofia multisistemica, enfermedad difusa con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Huntington, ataxias espinocerebelosas y otras enfermedades por poli-Q, angiopatfa amiloide cerebral hereditaria, polineuropatfa amiloidotica familiar, amiloidosis sistemica primaria (amiloidosis AL), amiloidosis sistemica reactiva (amiloidosis AA), diabetes de tipo 2, amiloidosis localizada por inyeccion, amiloidosis de microglobulina p2, amiloidosis no neuropatica hereditaria y amiloidosis sistemica hereditaria finlandesa.

13. El uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde la enfermedad causada por los priones se selecciona de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad genetica humana causada por priones, encefalopatfa espongiforme bovina (EEB) y tembladera de las ovejas.

14. Uso de un compuesto tal y como esta definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un solvato o sal del mismo, para inhibir la agregacion de una protema in vitro o ex vivo.

15. Un kit que comprende el compuesto tal y como esta definido en la reivindicacion 3 o 4 o un solvato o sal del mismo, y, ademas, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se fija espedficamente al compuesto; y/o una protema monomerica o agregada tal y como esta definido en la reivindicacion 11; y/o una protema monomerica o agregada tal y como esta definido en la reivindicacion 11 que forma optativamente un complejo con el compuesto; e instrucciones de uso, en uno o varios envases.

16. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, o un solvato o sal del mismo, para ser usado en un metodo de toma de imagenes de los depositos de la protema agregada, en donde el metodo comprende las etapas de:

(i) introducir una cantidad detectable de una composicion que comprende un compuesto marcado de manera detectable tal y como esta definido en la reivindicacion 3 o 4, o un solvato o sal del mismo, en un sujeto, en donde el marcador detectable se selecciona de 18F, 11C, 125l, 123l, 131l, 77Br y 76Br;

(ii) dejar el tiempo suficiente para que el compuesto se asocie a la protema agregada; y

(iii) detectar el compuesto asociado a la protema agregada.

17. El compuesto para ser usado de acuerdo con la reivindicacion 16, en donde el marcador detectable se selecciona de 18F y 11C.

18. Un kit para preparar un compuesto marcado de manera detectable tal y como esta definido en la reivindicacion 3 o 4 o un solvato o sal del mismo, en donde el kit comprende al menos dos compuestos precursores que, tras la reaccion, forman el compuesto tal y como esta definido en la reivindicacion 3 o 4 o un solvato o sal del mismo, en donde R comprende un marcador detectable seleccionado de 18F, 11C, 125l, 123l, 131l, 77Br y 76Br.

19. El kit de acuerdo con la reivindicacion 18, en donde el marcador detectable se selecciona de 18F y 11C.