ES2710435T3 - Nuevas cepas de Lactobacillus y sus usos - Google Patents

Abstract

Bacteria láctica, registrada como Lactobacillus brevis DSM 22721, o un lisado de la misma, para el uso como un aditivo alimentario, donde la bacteria láctica es heteroláctica y donde la bacteria láctica o su lisado inhibe el crecimiento de al menos un organismo fúngico.

Description

DESCRIPCION

Nuevas cepas de Lactobacillus y sus usos

Campo de la invencion

[0001] La invencion se refiere a nuevas cepas de Lactobacillus y sus usos, en particular para conservar alimentos, alimentos para animales, composiciones farmaceuticas y/o composiciones cosmeticas.

Estado de la tecnica y antecedentes de la invencion

[0002] Los alimentos y los alimentos para animales son, debido a su composicion nutritiva, buenos sustratos para los microorganismos. Consideraciones similares se aplican a las composiciones farmaceuticas y cosmeticas debido a las sustancias galenicas o las sustancias de soporte y auxiliares a menudo contenidas en las mismas. Muchos de estos microorganismos, en particular los hongos, son una de las razones mas frecuentes para el deterioro de alimentos y alimentos para animales, pero tambien de composiciones farmaceuticas o cosmeticas. Particularmente crfticas son en especial las micotoxinas toxicas y cancerfgenas formadas por los microorganismos, que son peligrosas para la salud de los seres humanos. Ademas de este efecto, el deterioro de los alimentos tiene un impacto economico enorme cada ano. Se asume que aprox. un 5-10 % de los alimentos se destruye cada ano debido al deterioro microbiano.

[0003] Para evitar el deterioro de, por ejemplo, alimentos y alimentos para animales, se hacen mas duraderos mediante el procesado o la adicion de conservantes qufmicos o biologicos. La demanda de conservantes biologicos en particular esta en aumento, ya que muchos consumidores buscan evitar los conservantes qufmicos.

[0004] A estos conservantes biologicos pertenecen, por ejemplo, las bacterias lacticas. Estas bacterias son normalmente inocuas para el ser humano y se han usado historicamente durante siglos en la conservacion de los alimentos. Su seguridad e inocuidad se expresa en su denominado estado GRAS (reconocido generalmente como seguro) de la FDA estadounidense (Food and Drug Administration). Ademas, en muchos alimentos, las bacterias lacticas ya ocurren de manera natural.

[0005] El mecanismo de bioconservacion puede estar causado por crecimiento competitivo o por la biosfntesis de metabolitos antagonistas y antimicrobianos. Principalmente, el efecto conservante de las bacterias lacticas se debe a la generacion de acidos organicos tal como el acido lactico. Asf, se reduce el valor del pH, que inhibe el crecimiento de muchos microorganismos.

[0006] Ademas del acido lactico, hay una serie de otros metabolitos, tales como el acido acetico, el peroxido de hidrogeno, el diacetilo, la reuterina y las denominadas bacteriocinas, que son importantes para la conservacion de los alimentos y los alimentos para animales.

[0007] Algunos de estos metabolitos, tales como el acido lactico y la reuterina, inhiben el crecimiento de las bacterias y los hongos, otras sustancias, tales como las bacteriocinas, inhiben exclusivamente el crecimiento de las bacterias, y de nuevo otras sustancias actuan solo contra los hongos. En estudios sobre la actividad antifungica de bacterias lacticas, se pudieron identificar numerosas sustancias inhibidoras: acido caproico, propionico, butfrico, acetico, formico y valerianico (Corsetti, A.G., Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1, Applied Microbiology and Biotechnology (50), pags. 253-256, (1998)), metilhidantofna y mevalonolactona (Niku-Paavola, M.L., New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum, Journal of Applied Microbiology (86), pags. 29-35; (1999), varios acidos grasos hidroxilados (Sjogren, J.M., Antifungal 3-hydroxy fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14, Applied and Environmental Microbiology (69), pags. 7554-7557, (2003)), acido 3-fenil-lactico (Lavermicocca, P.V., Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B, Applied and Environmental Microbiology (66), pags. 4084-90; (2000), y dicetopiperazinas (Niku-Paavola, vease arriba). No obstante, algunos componentes proteinogenicos con actividad antifungica no se pudieron identificar (Magnusson, J., Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound, Applied and Environmental Microbiology (67), pags. 1-5, (2001)).

[0008] Mientras que muchos de los metabolitos se forman acompanando el crecimiento celular de las bacterias lacticas, se sabe que otros se generan solo despues de una induccion. Este mecanismo se denomina generalmente autoinduccion o "deteccion de quorum". Este efecto se conoce ya para algunas bacteriocinas, tales como Carnobacterium piscicola (Kleerebezem, M.K., A two-component signal transduction cascade in Carnobacterium piscicola LV17B: two signaling peptides and one sensor-transmitter, Peptides (22), pags. 15971601, (2003)), Lactobacillus sakei (Diep, D.B., The synthesis of the bacteriocin sakacin A is a temperaturesensitive process regulated by a pheromone peptide through a three-component regulatory system, Microbiology (146), pags. 2155-2160, (2000)), Lactobacillus plantarum (Maldonado, A.J.-D., Induction of Plantaricin Production in Lactobacillus plantarum NC8 after Coculture with Specific Gram-Positive Bacteria Is Mediated by an Autoinduction Mechanism, J. Bacteriol., 5 (186), pags. 1556-1564 (2003)) y Enteroccoccus faecium (Nilsen, T.I., An exported inducer peptide regulates bacteriocin production in Enterococcus faecium CTC 492, J. Bacteriol. (180), pags. 1848-1854, (1998)).

[0009] Sin embargo, las bacterias de las especies Burkholderia y Pseudomonas no tienen el estado GRAS y, por lo tanto, no son adecuadas para uso en alimentos o alimentos para animales.

[0010] Patra Falguni et al. ("Productions of proteinaceous antifungal substances form Lactobacillus brevis NDCD 02", International Journal of Dairy Technology vol. 63, n.° 1, 1 febrero 2010, paginas 70-76), divulga una cepa de Lactobacillus brevis con un amplio espectro antifungico, que se puede usar en los alimentos como un bioconservante y como BL no iniciadora. La cepa de Lactobacillus brevis necesita medio rico en nutrientes para producir sustancias antifungicas.

[0011] EP 2543246 divulga el efecto antifungico de bacterias viables de la cepa de Lactobacillus plantarum contra Penicillium y Aspergillus en un recubrimiento de queso. EP 2592158 describe cepas aisladas de Lactobacillus plantarum con actividad antifungica en zumos de frutas y productos lacteos fermentados.

[0012] Dados estos antecedentes, serfa deseable proporcionar microorganismos reconocidos como GRAS, que formen metabolitos antifungicos, inhiban el crecimiento de hongos y sean, por lo tanto, adecuados como conservantes.

Objetivo tecnico de la invencion

[0013] Por lo tanto, el objetivo tecnico de la invencion es proporcionar microorganismos que inhiben el crecimiento de hongos y son adecuados para usarse en alimentos, alimentos para animales, composiciones farmaceuticas y/o cosmeticas.

Fundamentos de la invencion y formas de realizacion preferidas

[0014] Para lograr este objetivo tecnico, la invencion ensena un microorganismo perteneciente al grupo de una bacteria lactica, registrada como Lactobacillus brevis DSM 22721, o un lisado de la misma para usar como aditivo alimentario, donde la bacteria lactica es heterolactica y donde la bacteria lactica inhibe el crecimiento de al menos un organismo fungico.

[0015] Las bacterias lacticas se dividen, desde un punto de vista taxonomico, en las subdivisiones de Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus y Lactococcus. Se prefiere que el microorganismo de la presente invencion sea una especie de Lactobacillus. Los miembros del grupo de las bacterias lacticas carecen normalmente de porfirinas y citocromos, no realizan fosforilacion con transporte de electrones y, por lo tanto, obtienen energfa solo por fosforilacion a nivel de sustrato. Es decir, en bacterias lacticas, el ATP se sintetiza a traves de la fermentacion de carbohidratos. Todas las bacterias lacticas crecen anaerobicamente, sin embargo, a diferencia de muchos anaerobios, la mayorfa de bacterias lacticas no son sensibles al oxfgeno y por lo tanto pueden crecer en su presencia, asf como en su ausencia. Por consiguiente, las bacterias de la presente invencion son preferiblemente bacterias lacticas anaerobicas aerotolerantes pertenecientes al genero Lactobacillus.

[0016] Las bacterias lacticas de la presente invencion tienen preferiblemente forma de baston, y varfan desde bastones largos y delgados hasta cortos y curvados, ademas son preferiblemente inmoviles y/o asporogenos. Se prefiere que las bacterias lacticas de la invencion esten separadas o en pares. Producen preferiblemente acido lactico como producto principal o unico del metabolismo fermentativo. Se prefiere que las bacterias lacticas de la invencion produzcan acido lactico, preferiblemente el isomero DL del acido lactico en una cantidad de al menos un 50% de glucosa a traves de la via de las pentosas fosfato. Las bacterias lacticas de la invencion pueden producir tambien dioxido de carbono y etanol. Se prefiere que las bacterias lacticas muestren crecimiento variable a una temperatura de 15°C o 45°C. Ademas, se prefiere que tengan acido teicoico de glicerol en su pared celular.

[0017] En base a las caracterfsticas descritas anteriormente, las bacterias lacticas de la presente invencion se pueden clasificar como pertenecientes al genero Lactobacillus. Usando la sistematica tradicional, por ejemplo, en referencia a las descripciones pertinentes en "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (Williams & Wilkins Co., 1984), una bacteria lactica de la presente invencion se puede determinar que pertenece al genero Lactobacillus. Alternativamente, las bacterias lacticas de la presente invencion se pueden clasificar como pertenecientes al genero Lactobacillus por metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, por su huella metabolica, es decir, una vision general comparable de la capacidad del microorganismo o los microorganismos de la presente invencion para metabolizar azucares o por otros metodos descritos, por ejemplo, en Schleifer et al., System. Appl. Microb., 18 (1995), 461-467 o Ludwig et al., System. Appl. Microb., 15 (1992), 487-501. Los microorganismos de la presente invencion son capaces de metabolizar fuentes de azucar que son tfpicas y conocidas en la tecnica para microorganismos pertenecientes al genero Lactobacillus. En una forma de realizacion preferida, sin embargo, la bacteria lactica de la presente invencion tiene una huella metabolica seleccionada del grupo que consiste en:

(i) metaboliza D-lactosa, pero no L-sorbosa y/o D-sacarosa y/o D-inulina,

(ii) metaboliza inulina,

(iii) metaboliza L-sorbosa, pero no D-lactosa y/o D-sacarosa y/o inulina, y

(iv) metaboliza L-sorbosa, D-lactosa e inulina.

[0018] Preferiblemente, la bacteria lactica de la presente invencion tiene una huella metabolica seleccionada del grupo que consiste en:

(i) metaboliza D-lactosa, pero no L-sorbosa, D-sacarosa e inulina,

(ii) metaboliza L-sorbosa, D-lactosa e inulina, pero no D-sacarosa,

(iii) metaboliza L-sorbosa, pero no D-lactosa, D-sacarosa e inulina, y

(iv) metaboliza L-sorbosa, D-lactosa, D-sacarosa, pero no inulina.

[0019] Por supuesto, la bacteria lactica de la presente invencion no esta limitada a la metabolizacion de los azucares mencionados en el patron de huella metabolica anteriormente mencionado, sino que puede ser capaz de metabolizar azucares adicionales que son metabolizados comunmente por especies de Lactobacillus.

[0020] La afiliacion de los microorganismos de la presente invencion al genero Lactobacillus puede caracterizarse tambien por el uso de otros metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, usando electroforesis en gel SDS-PAGE de la protefna total de las especies que se van a determinar y comparandolas con cepas conocidas y ya caracterizadas del genero Lactobacillus. Una persona experta en la tecnica conoce bien las tecnicas para preparar un perfil de protefna total como se ha descrito anteriormente, asf como el analisis numerico de tales perfiles. Sin embargo, los resultados son solo fiables en la medida en que cada fase del proceso esta suficientemente estandarizada. Frente al requisito de precision cuando se determina la adhesion de un microorganismo al genero Lactobacillus, los autores ponen regularmente a disposicion del publico procedimientos estandarizados como el de Pot et al., presentado durante un "taller" organizado por la Union Europea, en la universidad de Gante, en Belgica, del 12 al 16 de septiembre de 1994 (Fingerprinting techniques for classification and identification of bacteria, SDS-PAGE of whole cell protein). El software usado en la tecnica para el analisis del gel de electroforesis SDS-PAGE es de vital importancia, ya que el grado de correlacion entre las especies depende de los parametros y algoritmos usados por este software. Sin entrar en los detalles teoricos, la comparacion cuantitativa de las bandas medidas por un densitometro y normalizadas por un ordenador se hace preferiblemente con el coeficiente de correlacion de Pearson. La matriz de similitud asf obtenida se puede organizar con la ayuda del algoritmo UPGMA (metodo de ligamiento promedio no ponderado de grupos de pares) que no solo hace posible agrupar los perfiles mas similares, sino tambien construir dendogramas (vease Kersters, Numerical methods in the classification and identification of bacteria by electrophoresis, in Computer-assisted Bacterial Systematics, 337-368, M. Goodfellow, A. G. O'Donnell Ed., John Wiley and Sons Ltd, 1985).

[0021] Alternativamente, la afiliacion de dichos microorganismos de la presente invencion al genero Lactobacillus se puede caracterizar con respecto al ARN ribosomico en una asf denominada Riboprinter®. Mas preferiblemente, la afiliacion de las especies recien identificadas de la invencion al genero Lactobacillus se demuestra comparando la secuencia de nucleotidos del ARN ribosomico 16S de las bacterias de la invencion, o de su ADN genomico que codifica el ARN ribosomico 16S, con los de otros generos y especies de bacterias lacticas conocidas hasta la fecha. Otra alternativa preferida para determinar la adhesion de las especies recien identificadas de la invencion al genero Lactobacillus es el uso de cebadores de PCR especfficos de especie que se dirigen a la region espaciadora del ARNr 16S-23S. Otra alternativa preferida es la RAPD-PCR (Nigatu et al. en Antonie van Leenwenhoek (79); 1-6, 2001) en virtud de que se genera un patron de ADN especffico de la cepa que permite determinar la afiliacion de unos microorganismos identificados conforme a la presente invencion al genero Lactobacillus. Otras tecnicas utiles para determinar la afiliacion del microorganismo de la presente invencion al genero Lactobacillus son los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccion (RFLP) (Giraffa et al., Int. J. Food Microbiol. 82 (2003); 163-172), la identificacion genetica de los elementos repetitivos (Gevers et al., FEMS Microbiol. Lett. 205 (2001) 31-36) o el analisis del patron de esteres metflicos de acidos grasos (FAME) de celulas bacterianas (Heyrman et al., FEMS Microbial. Lett. 181 (1991), 55- 62).

Alternativamente, los lactobacilos se pueden determinar mediante tipificacion de lectina (Annuk et al., J. Med.

Microbiol. 50 (2001) 1069-1074) o por analisis de las protefnas de su pared celular (Gatti et al., Lett. Appl.

Microbiol. 25 (1997), 345-348).

[0022] Tambien se prefiere que la bacteria lactica de la invencion se caracterice porque se puede analizar segun los pasos siguientes:

a) se establece un sustrato,

b) se establece una preparacion que comprende las bacterias lacticas bajo investigacion,

c) la preparacion que comprende las bacterias lacticas se anade al sustrato, opcionalmente seguido de un paso de fermentacion,

d) el producto del paso c) se muestrea en soportes de muestra, aquf se forman las muestras de ensayo, e) un numero predeterminado de esporas fungicas se anade a al menos una muestra de ensayo,

f) la incubacion de la muestra de ensayo obtenida en el paso d) se realiza durante una duracion predeterminada a una temperatura predeterminada,

g) deteccion, opcionalmente seguida de la evaluacion del crecimiento fungico.

[0023] Se prefiere que el crecimiento fungico se detecte realizando un disparo de camara o mediante inspeccion visual de la muestra de ensayo despues del paso f) y evaluacion del crecimiento fungico.

[0024] Si no es detectable ningun crecimiento fungico, la bacteria lactica es una bacteria lactica segun la invencion. Ademas, si se detecta crecimiento fungico reducido, comparado con una muestra de ensayo de control, donde se ha omitido el paso c), entonces la bacteria lactica es tambien una especie segun la invencion.

Aquf, la expresion "reducido" significa una reduccion del crecimiento fungico de al menos un 20%, mejor al menos un 50%, preferiblemente al menos un 90%. La cuantificacion se puede llevar a cabo realizando el disparo de una camara con un ajuste de contraste definido y el recuento automatizado de los pfxeles relativos a la cobertura fungica, donde el recuento de pfxeles relativos a la cobertura fungica se refiere al numero de pfxeles total del disparo de la camara de la muestra de ensayo. El disparo de la camara sera preferiblemente en negro/blanco. En algunos casos sera de ayuda tenir el sustrato con un pigmento o color oscuro (que es preferiblemente inerte microbiologicamente) para aumentar el contraste de los hongos sobre el sustrato, por ejemplo, si el sustrato es un sustrato de yogur de color blanco y los hongos muestran tambien color blanco. En particular, el ensayo se puede realizar como se describe en el ejemplo 1.2, ultimo parrafo. Como camara, es util el sistema FluorChem® FC2 Imaging System (Alpha Innotech/Cell Biosciences, Santa Clara, EE.UU.) con los ajustes siguientes: tiempo de exposicion: 100 - 150 ms, abertura: 8, ajustes de contraste: nivel de negro: 55000, nivel de blanco: 60000, gamma: 3.0, ajustes de luz: trans-luz "on", luz reflejada "on", chemi display “on", velocidad/resolucion: normal/ultra. Las imagenes se analizaron con el software AlphaEaseFC.

[0025] Como una muestra de ensayo de control alternativa o adicional, se puede usar una muestra de ensayo, donde se emplea sorbato de potasio en una cantidad predeterminada habitual en la tecnica de conservacion de alimentos (por ejemplo, 0,2 mg por gramo) en el paso c) en vez del paso c) anteriormente descrito. Esta muestra de ensayo de control puede servir entonces como valor de referencia, es decir, las bacterias lacticas de la invencion efectuan una inhibicion del crecimiento fungico al menos en la misma cantidad que esta muestra de ensayo de control.

[0026] Las celulas son viables, si cumplen con el ensayo de viabilidad de la DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania, si es aplicable en cocultivo con el respectivo sustrato al que las celulas se deben anadir o sobre el que deben aplicarse.

[0027] Se prefiere que la bacteria lactica sea una bacteria lactica viva.

[0028] Se prefiere especialmente que la bacteria lactica sea Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus plantarum o Lactobacillus fructivorans.

[0029] Conforme a la presente invencion, los microorganismos son bacterias lacticas del genera Lactobacillus, mas preferiblemente especies de Lactobacillus como se describe aquf. Aun mas preferiblemente, el Lactobacillus de la presente invencion es Lactobacillus brevis; otro Lactobacillus preferido es L. parafarraginis. Sin embargo, las especies de Lactobacillus no se limitan a las mismas. En una forma de realizacion preferida particular los microorganismos de la presente invencion estan "aislados" o "purificados". El termino "aislado" significa que el material se elimina de su entorno original, por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural. Por ejemplo, se afsla un microorganismo natural, preferiblemente una especie de Lactobacillus, separado de algun o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Tal microorganismo podrfa ser parte de una composicion, y debe considerarse todavfa que esta aislado porque la composicion no es parte de su entorno natural.

[0030] El termino "purificado" no requiere pureza absoluta; mas bien, se pretende como una definicion relativa. Los microorganismos individuales obtenidos a partir de una biblioteca se han purificado convencionalmente hasta la homogeneidad microbiologica, es decir, crecen como colonias individuales cuando se extienden en placas de agar por metodos conocidos en la tecnica. Preferiblemente, las placas de agar que se usan para este fin son selectivas para especies de Lactobacillus. Tales placas de agar selectivas se conocen en la tecnica.

[0031] Se prefiere especialmente que la bacteria lactica sea una bacteria lactica registrada como DSM 22721 o un lisado de la misma, donde dicho lisado retiene la capacidad de inhibir el crecimiento de un organismo fungico.

[0032] En una forma de realizacion particularmente preferida de la presente invencion, las bacterias lacticas de la presente invencion se seleccionan del grupo que consiste en el Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un lisado del mismo, donde dicho mutante o derivado retiene la capacidad de inhibir el crecimiento de organismos fungicos. El termino "Lactobacillus brevis que tiene el numero de registro de DSMZ" se refiere a celulas de un microorganismo pertenecientes a la especie Lactobacillus brevis depositada en la Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ("DSMZ") el 26 de junio de 2009 y que tiene el siguiente numero de deposito DSM 22721. La DSMZ esta ubicada en Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania. Los depositos DSMZ anteriormente mencionados se hicieron conforme a los terminos del tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos con fines del procedimiento de patentes.

[0033] "Un mutante o derivado" de las bacterias lacticas de la presente invencion, preferiblemente del Lactobacillus brevis depositado tiene preferiblemente las mismas caracterfsticas que la cepa respectiva depositada, es decir, retiene la capacidad de inhibir el crecimiento de organismos fungicos, preferiblemente con las caracterfsticas de inhibicion descritas anteriormente. Por ejemplo, dicho derivado puede ser geneticamente modificado. En el contexto de la presente invencion, el termino "geneticamente modificado" se usa en su sentido mas amplio para metodos conocidos por la persona experta en la tecnica para modificar acidos nucleicos deseados in vitro e in vivo de manera que se vean afectadas modificaciones geneticas y se alteren los genes mediante tecnologfa de ADN recombinante. Por consiguiente, se prefiere que dichos metodos comprendan clonacion, secuenciacion y transformacion de acidos nucleicos recombinantes. Para este fin, vectores apropiados, incluyendo vectores de expresion para especies de Lactobacillus como, por ejemplo, los descritos en EP-B1 506 789, EP-B1 316677, EP-B1251 064, EP-B1-218230, EP-B1 133046 o WO 89/01970.

[0034] Cuando se usa en el contexto de la presente invencion, el termino "bacterias lacticas de la presente invencion" abarca tambien lisados, tal como una fraccion de membrana como se describe aquf, de dicho(s) microorganismos(s) que retienen la capacidad descrita anteriormente de inhibir el crecimiento de un organismo fungico.

[0035] Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo se caracterizan por las especificaciones siguientes. Los organismos muestran un crecimiento optimo a de 30°C a 37°C bajo condiciones aerobicas o anaerobicas. No se puede detectar ningun crecimiento por encima de 42°C.

[0036] La fermentacion aerobica de Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo resulta en una densidad de celulas mas alta.

[0037] El cultivo de Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo bajo condiciones estandares (por ejemplo, medio MRS, 37°C, anaerobico) resulta en una acidificacion con pH 3,5-3,7.

[0038] Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo estan presentes como bastones separados o como pares o, raramente, como cadenas cortas (2-10 pm). Bajo condiciones estandares tienden a formar colonias de color blanco a crema con un aspecto ligeramente mate y una superficie ligeramente estructurada.

[0039] Sorprendentemente, la adicion de las bacterias lacticas de la invencion, con preferencia Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo, no cambia la textura o el color de los productos alimentarios, especialmente yogur.

[0040] Se prefiere que las bacterias lacticas de la invencion, preferiblemente Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo, comprendan rADN 16S con la siguiente secuencia 1 (SEC ID No.1):

G CG ACTTTTCGG ATT ATT GG G C GT AAAG CG AG CG C AG G C GGTTTTTT AGGT CT GAT

GTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGGGCATCGGAAACCGGGAGACTTGAGTG

CAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAG

AACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAG

CATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTG

CTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCC

GCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCA

CAAG C G GTG GAG CAT GT G GTTT AATT C G ATG CTACGC G AAG AACCTTAC C AG GT CT

TGACATCTTCTGCTAACCTAAGAGATTAGGCGTTCCCTTCGGGGACGGAATGACAG

GTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC

G AG CG C AACC CTTATTGTC AGTTGCC AG C ATTTAGTTGG G CACTCTGG C G AG ACTG

CCGGT GAC AAACCGGAGGAAGGTGGGGAT GACGT CAAAT CAT CATGCCCCTT AT GA

CCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAAACCGCGAGG

TCAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGC

ATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCCC

GGGCCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCCG

TGAGGTAACCTTCGGGAACCAGCCGTCTAAGTGGGACAGATGATTAGGTGAAGTCG

AC

[0041] Otra ventaja de las bacterias lacticas de la invencion, con preferencia Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo, es que es posible congelar la cepa durante al menos 6 meses a aproximadamente -20°C o aproximadamente -80°C. Las bacterias permanecen estables y no pierden su capacidad de inhibir el crecimiento de organismos fungicos. Tambien es posible almacenar las bacterias lacticas de la invencion despues de la liofilizacion (vease tambien la Fig. 2).

[0042] Una ventaja es que la bacteria lactica de la invencion, especialmente la registrada como DSM 22721 o un lisado de la misma, inhibe el crecimiento de Penicillium, en particular Penicillium commune o Penicillium roqueforti, el genero Aspergillus y el genero Alternaria, en particular Alternaria alternata, Penicillium expansum, Penicillium citrinum, Penicillium digitatum, Penicillium italicum, Scopulariopsis breviacaulis, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Botrytis cinerea, Rhizopus sp., Mucor sp., Eurotium herbariorum, Geotrichum candidum, Cladosporium herbarum, Fusarium sambucinum, Phytophora infestans y Sclerotinia scerotiorum.

[0043] En otra forma de realizacion preferida, la invencion se refiere al uso de dichas bacterias lacticas o un lisado de las mismas para la produccion de una composicion alimentaria, alimento para animales o una composicion farmaceutica o cosmetica, donde las bacterias lacticas, con preferencia bacterias lacticas vivas, o un lisado de las mismas se anaden al alimento, a alimento para animales o a una composicion farmaceutica o cosmetica.

[0044] Se sabe comunmente que Lactobacillus brevis usa un metabolismo heterofermentativo y, por lo tanto, es heterolactico. El metabolismo heterofermentativo se caracteriza normalmente por la produccion de gas y acido. Ambos efectos son adversos para la produccion de alimentos, farmacos o cosmeticos. Fue, por lo tanto, muy sorprendente que las bacterias lacticas de la invencion, especialmente Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo, muestran caracterfsticas homofermentativas cuando se cultivan en composiciones cosmeticas o farmaceuticas o alimentos, por ejemplo, productos lacteos, preferiblemente yogur.

[0045] La preparacion galenica de una composicion farmaceutica segun la invencion se puede hacer de una manera habitual en esta tecnologfa. Son formas adecuadas de preparaciones galenicas solidas o lfquidas, por ejemplo, granulados, polvos, grageas, comprimidos, (micro)capsulas, supositorios, jarabes, zumos, suspensiones o emulsiones, para la produccion de las cuales se usan medios habituales, tales como sustancias portadoras, explosivos, agentes aglutinantes, de recubrimiento, de hinchamiento, deslizantes o lubricantes, saborizantes, edulcorantes y mediadores de soluciones. Como sustancias auxiliares se nombran aquf carbonato de magnesio, dioxido de titanio, lactosa, manita y otros azucares, talco, protefna de la leche, gelatina, almidon, celulosa y derivados, aceites animales y vegetales, tales como aceite de hfgado de bacalao, aceite de girasol, aceite de cacahuete o aceite de sesamo, polietilenglicoles y solventes, tales como agua esterilizada y alcoholes mono o multivalentes, por ejemplo, glicerina. Una composicion farmaceutica segun la invencion se puede producir mezclando bacterias lacticas segun la invencion en una dosis definida con un portador farmaceuticamente adecuado y fisiologicamente bien tolerado y, posiblemente, otras sustancias activas adecuadas adicionales o auxiliares, y se prepara en la forma deseada de administracion. Los portadores son en particular sustancias que se seleccionan del grupo que comprende "maltodextrina, celulosa microcristalina, almidon, en particular almidon de mafz, levulosa, lactosa, dextrosa y mezclas de tales sustancias". La composicion puede contener de un 0,1 a un 95% en peso de portador y de un 5 a un 99,9% en peso de bacterias lacticas liofilizadas, con respecto a la cantidad total de celulas y portadores, o consistir en las mismas.

[0046] Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo son heterofermentativos bajo condiciones estandares (por ejemplo, medio de fermentacion o medio MRS bajo condiciones anaerobicas). Esto significa que los organismos producen gas durante la fermentacion si se cultivan bajo condiciones estandares.

[0047] Por lo tanto, fue muy sorprendente que Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo presenten caracterfsticas homofermentativas cuando se cultivan en productos lacteos, preferiblemente yogur. Se produjo "yogur estandar" con iniciadores de fermentacion estandares a 43°C, pH 4,5-4,7 y con leche desnatada enriquecida con leche desnatada en polvo. Despues, el yogur se almacena a 7°C. Cuando se anadio al yogur Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo, no se puede observar ninguna produccion de gas (burbujas de gas o tapa convexa). Despues de 30 dfas, el sabor extrano se midio mediante HPLC o analisis del espacio de cabeza. El efecto sorprendente de las caracterfsticas homofermentativas en productos lacteos tiene la ventaja de que no hay cambio en el sabor extrano del producto.

[0048] Otra caracterfstica de Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo es que estos organismos no producen H²O² , ni en condicion estandar (medio MRS) ni en condiciones de fermentacion. Esto se evaluo con tiras reactivas de H²O².

[0049] Otra ventaja es que la composicion de acidos organicos es muy estable en yogur con Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo anadido. Casi no se observa ningun cambio del pH. Esto es especialmente importante para el uso en productos alimentarios.

[0050] Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo muestran un crecimiento estatico en yogur. Se produjo "yogur estandar" con iniciadores de fermentacion estandares a 43°C, con leche desnatada enriquecida con leche desnatada en polvo y con un pH final de 4,5-4,7. Se anadio Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721. El yogur producido se almaceno a 7°C durante 3 semanas. Despues de estas 3 semanas no se observo ningun aumento de las bacterias de la invencion.

[0051] Cuando se usa en composiciones farmaceuticas o cosmeticas, se requiere, por supuesto, que la composicion no contenga ninguna sustancia, en particular sustancias activas, que perjudique sustancialmente la viabilidad de las celulas y/o la actividad de celulas, compuestos, fragmentos o sobrenadantes de los mismos empleados segun la invencion. La persona experta en la tecnica de las respectivas sustancias o sustancias activas puede determinar esto facilmente con un ensayo de viabilidad, por ejemplo, como propone la DSMZ, se hace solo en cocultivo con la respectiva sustancia o sustancia activa a la concentracion a la que esta en la respectiva composicion. Si este ensayo es positivo, las celulas segun la invencion pueden usarse con exito. Si esta prueba es negativa, se excluye la aplicacion de la respectiva composicion, ya que el efecto segun la invencion no se consigue o solo con un alcance reducido. Con respecto a la actividad, por ejemplo, es posible introducir la composicion farmaceutica o cosmetica en un ensayo para determinar la actividad de inhibicion, como se ha descrito anteriormente, que caracteriza al microorganismo de la presente invencion.

[0052] Las composiciones cosmeticas son, por ejemplo, champu, crema hidratante, locion hidratante, crema glicolica, locion glicolica, limpiador, base de maquillaje de color, polvo de maquillaje de color o corrector de maquillaje de color.

[0053] Las bacterias lacticas de la invencion se pueden usar como un producto de inoculacion directa. Por lo tanto, las bacterias se pueden anadir a composiciones alimentarias, cosmeticas o farmaceuticas sin ningun paso de procesamiento previo. Se prefiere que las bacterias de la invencion se crioconserven en su propio sobrenadante de fermentacion. Esto facilita la produccion de los productos y, por lo tanto, contribuye a ahorrar tiempo y costes.

[0054] En otra forma de realizacion preferida, la invencion se refiere a una composicion alimentaria, que comprende un alimento y dichas bacterias lacticas o lisados de las mismas.

[0055] Se prefiere que la composicion alimentaria, el alimento para animales, la composicion farmaceutica o una composicion cosmetica contenga de 10A2 a 10A15, preferiblemente de 10A6 o 10A8 a 10A12, en particular de 10A8 a 10A10 celulas de bacterias lacticas o lisados de las mismas, absolutas o referidas a 100 g del alimento, el alimento para animales o la composicion farmaceutica que contiene las celulas. Estas cantidades son especialmente beneficiosas porque permiten una inhibicion muy eficaz del crecimiento de hongos sin ningun efecto adverso.

[0056] Se prefiere que las bacterias lacticas esten presentes en una concentracion del 0,0001% o mas. Estas concentraciones son especialmente beneficiosas porque proporcionan una inhibicion eficiente del crecimiento fungico en productos alimentarios.

[0057] Tambien se prefiere que la composicion alimentaria sea un producto carnico o un producto lacteo, preferiblemente yogur, leche, queso, crema y/o requeson. Estos productos son generalmente propensos al moho, que es por lo que el uso de las bacterias lacticas de la invencion, preferiblemente Lactobacillus brevis con el numero de registro de DSMZ DSM 22721 o un mutante o derivado del mismo, es especialmente beneficioso. Una ventaja adicional es que el efecto de inhibicion del crecimiento fungico no depende del tipo de cultivo iniciador y/o leche desnatada en polvo usados para la produccion de productos lacteos, especialmente yogur. Por lo tanto, las bacterias lacticas de la invencion se pueden usar en varios productos alimentarios sin perder el efecto beneficioso.

[0058] En otra forma de realizacion preferida, la invencion se refiere a un metodo para conservar alimento, alimento para animales o una composicion farmaceutica o cosmetica, donde dichas bacterias lacticas se anaden al alimento, al alimento para animales o a la composicion farmaceutica.

[0059] Para la conservacion con bacterias lacticas segun la invencion, en principio se pueden usar todos los alimentos, alimentos para animales o composiciones farmaceuticas o cosmeticas que puedan contener organismos fungicos, bien por produccion o bien por contaminacion durante el almacenamiento.

[0060] Se prefiere que, por 100 g de alimento, alimento para animales o composicion farmaceutica o cosmetica, se anadan de 10A2 a 10a15, preferiblemente de 10A6 o 10A8 a 10A12, en particular de 10A8 a 10A10 celulas de bacterias lacticas o lisados de las mismas.

[0061] Tambien se prefiere que las bacterias lacticas se anadan en una concentracion de 0,0001% a 0,01%, preferiblemente 0,001%. Estas concentraciones son especialmente beneficiosas porque proporcionan una inhibicion eficiente del crecimiento fungico en productos alimentarios. Mediante la adicion de bacterias lacticas en una concentracion de 0,0001% o mas, preferiblemente 0,001%, el crecimiento fungico se inhibe permanentemente de modo que el alimento, el alimento para animales o la composicion farmaceutica o cosmetica se pueda almacenar durante un largo periodo de tiempo sin perder la capacidad de evitar el crecimiento fungico.

[0062] Especialmente se prefiere que se anada de un 0,0001% a un 0,01%, preferiblemente un 0,001%, de cultivo congelado granulado de los lactobacilos de la invencion, preferiblemente a la fermentacion de yogur. El uso de cultivo congelado granulado de lactobacilos es ventajoso para la produccion industrial.

[0063] Tambien se prefiere que 1 ml de cultivo congelado de lactobacilos contenga 0,5x10A10 UFC (unidades formadoras de colonias).

[0064] En otra forma de realizacion preferida, la invencion se refiere a un metodo de identificacion de dicha bacteria lactica que comprende:

a) proporcionar un sustrato,

b) proporcionar una preparacion que comprende las bacterias lacticas bajo investigacion,

c) adicion de la preparacion que comprende las bacterias lacticas al sustrato, opcionalmente seguido de un paso de fermentacion,

d) adicion de un numero predeterminado de esporas fungicas al producto del paso c),

e) incubacion de la muestra de ensayo obtenida en el paso d) durante una duracion predeterminada a una temperatura predeterminada,

f) deteccion, opcionalmente seguida de la evaluacion del crecimiento fungico.

[0065] Otro aspecto de la presente invencion es un lisado de dicha bacteria lactica que esta inactivado termicamente o liofilizado, donde dicho lisado retiene la capacidad de inhibir el crecimiento del organismo fungico. En particular, el lisado puede estar presente en un sobrenadante de un cultivo de los microorganismos de la invencion o un fragmento de tal microorganismo. La capacidad se puede medir como se ha descrito anteriormente para caracterizar el microorganismo de la invencion.

[0066] Como una alternativa adicional para caracterizar los microorganismos de la invencion, es posible emplear los ensayos de biocontrol descritos en la referencia P. Raspor et al., Food Technol. Biotechnol. 48(3): 336-343 (2010), donde este ensayo se realiza usando los microorganismos bajo inspeccion y en comparacion con experimentos de control en ausencia de un microorganismo y/o experimentos de control donde el microorganismo se reemplaza con un compuesto qufmico antimoho convencional a la concentracion definida.

[0067] Se inhibe el crecimiento del organismo fungico si, con el cultivo del organismo fungico sin celulas segun la invencion, el crecimiento del organismo fungico aumenta en al menos un 10%, preferiblemente en al menos un 50%, en comparacion con un cocultivo del organismo fungico con las celulas segun la invencion bajo condiciones identicas de cultivo, medido como una densidad de asentamiento en un tiempo dado en un medio de cultivo para el organismo fungico. Se hace referencia adicional al ensayo especffico descrito anteriormente solo como un ejemplo.

[0068] Cebadores, enzimas, celulas huesped adicionales para la clonacion de constructos intermedios y similares se pueden usar y se conocen por la persona experta en la materia. Preferiblemente, los mutantes geneticamente modificados comprenden celulas del microorganismo de la presente invencion, preferiblemente de las especies de Lactobacillus depositadas que albergan acidos nucleicos recombinantes comprendidos en su cromosoma bacteriano o un plasmido o plasmidos o comprendidos en su cromosoma bacteriano y/o un plasmido o plasmidos. Dichos acidos nucleicos recombinantes son preferiblemente extranos al microorganismo de la presente invencion. Por "extrano" se hace referencia a que el polinucleotido o molecula de acido nucleico es o bien heterologa con respecto a la celula huesped, esto quiere decir, derivada a partir de una celula u organismo con un fondo genomico diferente, o bien es homologa respecto a la celula huesped, pero esta situada en un entorno genomico diferente que el homologo de origen natural de dicha molecula de acido nucleico. Esto significa que, si la molecula de acido nucleico es homologa respecto a la celula huesped, no se situa en su ubicacion natural en el genoma de dicha celula huesped, en particular esta rodeada por genes diferentes. En este caso, el polinucleotido puede estar bajo el control de su propio promotor o bajo el control de un promotor heterologo. El vector o molecula de acido nucleico segun la invencion que esta presente en la celula huesped puede o bien integrarse en el genoma de la celula huesped o bien puede mantenerse de alguna forma extracromosomicamente. A este respecto, tambien debe entenderse que la molecula de acido nucleico de la invencion se puede usar para restaurar o crear un gen mutante mediante recombinacion homologa.

[0069] Un mutante del microorganismo de la presente invencion, preferiblemente un mutante de las cepas de Lactobacillus depositadas es mutado preferiblemente de manera artificial. Conforme a la presente invencion, el termino "mutado" significa una modificacion permanente o unas modificaciones permanentes de material genetico, es decir, acidos nucleicos, causadas, por ejemplo, de manera natural o por medios físicos o compuestos/sustancias/agentes qufmicos, tales como EMS o ENU. Dichas modificaciones incluyen mutaciones puntuales, como transiciones o transversiones, la delecion/insercion/adicion de una o mas bases dentro de un acido nucleico/gen/cromosoma, modificando asf el acido nucleico/gen/cromosoma que puede causar, entre otras cosas, la expresion/transcripcion/traduccion genica aberrante o productos genicos inactivos, productos genicos activos/inactivos constitutivos que conducen, por ejemplo, a efectos negativos dominantes. Preferiblemente, una mutacion lleva a una mayor capacidad de inhibir el crecimiento de organismos fungicos. Asf, tambien se prefiere que las celulas mutantes del microorganismo depositado que albergan una mutacion o mutaciones en un gen o genes deseado(s) o donde una mutacion o mutaciones en un gen o genes deseado(s) se induzca(n) por metodos conocidos por la persona experta en la materia. Tambien se conoce en el estado de la tecnica que las celulas bacterianas mutadas o geneticamente modificadas se pueden seleccionar por cualquier metodo/fenotipo adecuado. En el contexto de la presente invencion, un mutante que tiene una mayor capacidad de inhibir el crecimiento de organismos fungicos se puede evaluar conforme a los metodos descritos en los ejemplos en la presente. El termino "mutante", sin embargo, incluye tambien celulas del microorganismo de la presente invencion, preferiblemente celulas del microorganismo depositado que albergan mutaciones naturales espontaneas en su genoma, es decir, cromosoma bacteriano. Las "mutaciones espontaneas" son mutaciones que surgen de manera natural, es decir, sin manipulacion genetica directa por el hombre, o por exposicion a un mutageno. La seleccion de mutantes espontaneos se puede realizar cultivando la cepa y seleccionando las variantes deseadas mediante, por ejemplo, la capacidad de la bacteria variante para mostrar un crecimiento mejorado. Metodos para la seleccion de mutantes espontaneos se conocen bien en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Por ejemplo, tales mutaciones pueden ocurrir durante el cultivo, por ejemplo, durante el proceso de division celular normal acoplado con la replicacion de ADN o durante el pase y/o la preservacion del mutante del microorganismo de la presente invencion.

[0070] En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un lisado del microorganismo de la presente invencion, que esta inactivado termicamente o liofilizado, donde dicho analogo retiene la capacidad de inhibir el crecimiento de organismos fungicos.

[0071] Segun la presente invencion, el termino "analogo del microorganismo de la presente invencion" incluye tambien una celula muerta o inactivada del microorganismo de la presente invencion, preferiblemente de las especies de Lactobacillus descritas en la presente, que ya no es capaz de formar una colonia individual en una placa espedfica para microorganismos pertenecientes al genero Lactobacillus. Dicha celula muerta o inactivada puede tener una membrana celular intacta o rota. Metodos para matar o inactivar celulas del microorganismo de la presente invencion se conocen en la tecnica. El-Nezami et al., J. Food Prot. 61 (1998), 466-468 describe un metodo para inactivar especies de Lactobacillus por irradiacion de UV. Preferiblemente, las celulas del microorganismo de la presente invencion estan inactivadas termicamente o liofilizadas. La liofilizacion de las celulas de la presente invencion tiene la ventaja de que se pueden almacenar facilmente y manejar mientras que retienen su capacidad de inhibir el crecimiento de organismos fungicos. Ademas, las celulas liofilizadas se pueden cultivar de nuevo cuando se aplican, en condiciones conocidas en la tecnica, a medios apropiados lfquidos o solidos. La liofilizacion se hace mediante metodos conocidos en la tecnica. Preferiblemente, se realiza durante al menos 2 horas a temperatura ambiente, es decir, cualquier temperatura entre 16°C y 25°C. Ademas, las celulas liofilizadas del microorganismo de la presente invencion son estables durante al menos 4 semanas a una temperatura de 4°C para inhibir todavfa un organismo fungico como se describe en la presente. La inactivacion termica se puede conseguir incubando las celulas del microorganismo de la presente invencion durante al menos 2 horas a una temperatura de 170°C. Ademas, la inactivacion termica se consigue preferiblemente autoclavando dichas celulas a una temperatura de 121°C durante al menos 20 minutos en presencia de vapor saturado a una presion atmosferica de 2 bar. En la alternativa, la inactivacion termica de las celulas del microorganismo de la presente invencion se consigue por congelacion de dichas celulas durante al menos 4 semanas, 3 semanas, 2 semanas, 1 semana, 12 horas, 6 horas, 2 horas o 1 hora a -20°C. Se prefiere que al menos un 70%, un 75% o un 80%, mas preferiblemente, un 85%, un 90% o un 95% y, particularmente preferido, al menos un 97%, un 98%, un 99% y, mas particularmente preferido, un 99,1%, un 99,2%, un 99,3%, un 99,4%, un 99,5%, un 99,6%, un 99,7%, un 99,8% o un 99,9% y, de la manera mas particularmente preferida, el 100% de las celulas del analogo del microorganismo de la presente invencion esten muertas o inactivadas, sin embargo, tienen todavfa la capacidad de inhibir el crecimiento de organismos fungicos. Si el lisado del microorganismo de la presente invencion esta, de hecho, muerto o inactivado, se puede evaluar por metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante un ensayo de viabilidad. El termino "analogo del microorganismo de la presente invencion" abarca lisados o fracciones del microorganismo de la presente invencion, preferiblemente de las especies de Lactobacillus descritas en la presente. Segun la presente invencion, el termino "lisado" significa una solucion o suspension en un medio acuoso de celulas del microorganismo de la presente invencion que estan rotas. El lisado celular comprende, por ejemplo, macromoleculas, como ADN, ARN, protemas, peptidos, carbohidratos, lfpidos y similares, y/o micromoleculas, como aminoacidos, azucares, acidos lipfdicos y similares, o fracciones de las mismas. Adicionalmente, dicho lisado comprende restos celulares que pueden ser de estructura lisa o granular. Metodos para preparar lisados celulares de microorganismo se conocen en la tecnica, por ejemplo, utilizando prensa francesa, trituracion de celulas usando perlas de cristal o hierro o lisis celular enzimatica y similares. Ademas, la lisis celular se refiere a varios metodos conocidos en la tecnica para abrir/destruir celulas. El metodo para lisar una celula no es importante y puede emplearse cualquier metodo que pueda conseguir la lisis de las celulas del microorganismo de la presente invencion. La persona experta en la tecnica puede elegir uno apropiado, por ejemplo, la abertura/destruccion de celulas se puede hacer enzimatica, qufmica o ffsicamente. Ejemplos no limitativos de enzimas y cocteles de enzimas son proteasas, como proteinasa K, lipasas o glicosidasas; ejemplos no limitativos de productos qufmicos son ionoforos, detergentes, como dodecilsulfato de sodio, acidos o bases; y ejemplos no limitativos de medios físicos son alta presion, como la prensa francesa, osmolaridad, temperatura, como calor o frfo. Ademas, tambien pueden utilizarse un metodo que utiliza una combinacion apropiada de una enzima distinta de la enzima proteolftica, un acido, una base y similares. Por ejemplo, las celulas del microorganismo de la presente invencion se lisan congelando y descongelando, mas preferiblemente congelando a temperaturas inferiores a -70°C y descongelando a temperaturas superiores a 30°C, particularmente, se prefiere congelar a temperaturas inferiores a -75°C y se prefiere descongelar a temperaturas superiores a 35°C y las mas preferidas son temperaturas para congelar por debajo de -80°C y temperaturas para descongelar superiores a 37°C. Tambien se prefiere que dicha congelacion/descongelacion se repita al menos 1 vez, mas preferiblemente al menos 2 veces, aun mas preferiblemente al menos 3 veces, se prefiere particularmente al menos 4 veces y, de la forma mas preferida, al menos 5 veces.

[0072] Por consiguiente, las personas expertas en la tecnica pueden preparar los lisados deseados refiriendose a las explicaciones generales anteriores y modificando o alterando apropiadamente esos metodos, si es necesario. Preferiblemente, el medio acuoso usado para los lisados como se ha descrito es agua, solucion salina fisiologica o una solucion tampon. Una ventaja de un lisado de celulas bacterianas es que puede producirse facilmente y almacenarse economicamente, ya que se necesitan instalaciones menos tecnicas.

[0073] Segun la invencion, los lisados son tambien preparaciones de fracciones de moleculas de los lisados anteriormente mencionados. Estas fracciones se pueden obtener por metodos conocidos por aquellas personas expertas en la tecnica, por ejemplo, cromatograffa, incluyendo, por ejemplo, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de fase inversa y cromatograffa con otro material cromatografico en columna o metodos por lotes, otros metodos de fraccionamiento, por ejemplo, metodos de filtracion, por ejemplo, ultrafiltracion, dialisis, dialisis y concentracion con exclusion por tamano en centrifugacion, centrifugacion en gradientes de densidad o matrices de paso, precipitacion, por ejemplo, precipitaciones de afinidad, solubilizacion por sales o precipitacion por sales (precipitacion con sulfato de amonio), precipitaciones alcoholicas u otros metodos proteicoqufmicos, biologicos moleculares, bioqufmicos, inmunologicos, qufmicos o físicos para separar los componentes anteriores de los lisados.

[0074] "Un fragmento del microorganismo de la presente invencion" abarca cualquier parte de las celulas del microorganismo de la presente invencion. Preferiblemente, dicho fragmento es una fraccion de membrana obtenida mediante una preparacion de membrana. Se pueden obtener preparaciones de membrana de microorganismos pertenecientes al genero de Lactobacillus mediante metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, empleando el metodo descrito en Rollan et al., Int. J. Food Microbiol. 70 (2001), 303-301, Matsuguchi et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003), 259-266 o Stentz et al., Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000), 4272-4278 o Varmanen et al., J. Bacteriology 182 (2000), 146-154. Alternativamente, tambien se preve una preparacion de celulas enteras. Preferiblemente, el derivado o fragmento del microorganismo de la presente invencion aquf descrito retiene la capacidad de inhibir el crecimiento de organismos fungicos que se describe en detalle en la presente.

[0075] La invencion se basa ante todo en el descubrimiento de cepas de Lactobacillus, que son capaces de extender el tiempo de conservacion del yogur mediante la inhibicion del crecimiento fungico. Usando tal cepa de Lactobacillus, se puede reemplazar el conservante sorbato de potasio, empleado hasta la fecha. En experimentos, se evaluo la actividad de inhibicion de celulas de Lactobacillus respecto a los hongos de las especies Penicillium, Aspergillus y Alternaria. Primero, se usaron celulas vivas de Lactobacillus respecto a una actividad antifungica. Se identifico una cepa de Lactobacillus (Lactobacillus brevis) que es capaz de inhibir el crecimiento de las cepas fungicas evaluadas. La bacteria se designo "Lactobacillus antimold" y se entrego a la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) bajo la designacion DSM 22721 el 26 de junio de 2009.

[0076] En otro experimento, se evaluo la cepa de Lactobacillus en un alimento. Para este fin, la cepa de Lactobacillus se anadio junto con un cultivo iniciador de yogur a un medio de partida para la produccion de yogur. Despues de la fermentacion del yogur, se anadieron esporas fungicas y el yogur se almaceno a 7°C. En comparacion con los lotes de control con y sin adicion de sorbato de potasio como conservante, se observo que, en el lote con Lactobacillus de la invencion, se ha conseguido una extension significativa de la durabilidad, es decir, el crecimiento del hongo pudo inhibirse durante un periodo de tiempo claramente mas largo que con sorbato de potasio.

[0077] El uso de tal cepa de Lactobacillus para la conservacion de alimentos, alimentos para animales o composiciones farmaceuticas o cosmeticas tiene una ventaja decisiva sobre los metodos de conservacion comunes. Es un conservante biologico que no altera el sabor o la textura del alimento.

[0078] La invencion se refiere ademas al uso de celulas de microorganismo segun la invencion para producir un alimento conservado, un alimento para animales o una composicion farmaceutica o cosmetica, donde se anaden las celulas de microorganismo al alimento, al alimento para animales o a la composicion farmaceutica o cosmetica, y a un metodo para conservar un alimento, un alimento para animales o una composicion farmaceutica o cosmetica, donde se anaden las celulas de microorganismo segun la invencion al alimento, alimento para animales o composicion farmaceutica o cosmetica.

[0079] La aplicacion de las celulas de microorganismo segun la invencion es simple, en el caso de los alimentos, se anaden las celulas (vivas) o los lisados de las bacterias de la invencion en la cantidad especificada al alimento. Se aplican consideraciones analogas a los alimentos para animales o las composiciones farmaceuticas.

EJEMPLOS

[0080] En lo que sigue, la invencion se describe con mas detalle con referencia a ejemplos.

La figura 1 muestra los resultados del ejemplo 2.

La figura 2 muestra la estabilidad de bacterias lacticas liofilizadas de la invencion. La estabilidad se mide mediante unidades formadoras de colonias (UFC) por g.

La figura 3 muestra la estabilidad de bacterias lacticas congeladas de la invencion, despues del almacenamiento a -20°C.

La figura 4 muestra la estabilidad de bacterias lacticas congeladas de la invencion, despues del almacenamiento a -80°C.

Ejemplo 1: inhibicion de hongos en alimentos.

[0081] Materiales usados:

Los cultivos usados fueron: cultivo iniciador de yogur Yo-Mix 401 (Danisco, Dinamarca), Lactobacillus DSM 22721, Penicillium commune, Penicillium roqueforti, Anternaria alternata y otros aislados propios, tal como Aspergillus.

[0082] Los productos qufmicos o medios usados fueron:

leche homogeneizada tratada a temperatura ultra alta, 1,5% de grasa, por ejemplo, de Campina Mark Brandenburg,

leche desnatada en polvo instantanea "frema Reform" de Granovita GmbH, D-87751 Heimertingen (obtenible de Reformhaus Demski),

solucion de sorbato de potasio 20 mg/ml (VWR International GmbH, Darmstadt), esterilizada por filtracion, caldo YDA (extracto de levadura PTU (Ohly GmbH) 25,0 g/l, D(+)-glucosa monohidratada (Merck, Darmstadt) 20,0 g/l, Tween 80 (Merck, Darmstadt) 1,0 g/l, hidrogenocitrato de diamonio (Merck, Darmstadt) 2,0 g/l, acetato sodico (Merck, Darmstadt) 5,0 g/l, sulfato de magnesio heptahidratado (Merck, Darmstadt) 0,1 g/l, sulfato de manganeso (II) monohidratado (Sigma-Aldrich, Seelze) 0,05 g/l, hidrogenofosfato de dipotasio (Merck, Darmstadt) 2,0 g/l, autoclavado a 121°C durante 20 min, pH 5,7 despues de autoclavar, medio de yogur artificial (medio aYH), D(+)-glucosa monohidratada (Merck, Darmstadt) 22 g/l, extracto de levadura Biospringer 0207/0-MG-L (Biospringer, Maisons-Afort Cedex, Francia) 15 g/l, leche desnatada en polvo (Granovita GmbH, Heimertingen) 20 g/l, Tween 80 (Merck, Darmstadt) 1,0 g/l, hidrogenocitrato de diamonio (Merck, Darmstadt) 2,0 g/l, acetato sodico (Merck, Darmstadt) 5,0 g/l, sulfato de magnesio heptahidratado (Merck, Darmstadt) 0,1 g/l, sulfato de manganeso (II) monohidratado (Sigma-Aldrich, Seelze) 0,05 g/l, hidrogenofosfato de dipotasio (Merck, Darmstadt) 2,0 g/l,

medio de yogur (leche tratada a temperature ultra alta (1,5% de grasa) 2,0% p/p de leche desnatada bio), caldo MRS (caldo MRS para lactobacilos (BD Difco, Augsburg) 55 g/l, pH 6,5),

agar de dextrosa de patata (caldo de dextrosa de patata (BD Difco, Augsburg) 24 g/l, agar, granulado (BD Difco, Augsburg) 1,5 g/l, pH 5,1), y

solucion de crioproteccion (glucosa monohidratada (Merck, Darmstadt) 80 g/l, peptona tripticasa (BD Difco, Augsburg) 2 g/l, magnesio heptahidratado (Merck, Darmstadt) 10 g/l, dihidrogenofosfato de potasio (Merck, Darmstadt) 4 g/l, nitrato sodico (Merck, Darmstadt) 6 g/l, cloruro de potasio (Merck, Darmstadt) 1 g/l, sulfato heptahidratado de hierro (II) (Merck, Darmstadt) 0,02 g/l, glicerina (85%) (Merck, Darmstadt) 200 g/l, pH 5,6).

[0083] Metodos usados:

Los cultivos iniciadores se prepararon disolviendo 1 g de iniciador liofilizado de yogur (Yo-Mix 401, Danisco, Dinamarca) en 500 ml de leche baja en grasa tratada a temperatura ultra alta y dejando que se hinche durante 20 min a temperatura ambiente.

[0084] El precultivo de Lactobacillus segun la invencion se realizo inoculando 9 ml de caldo YDA con 1,5 ml de cultivo congelado, seguido de incubacion anaerobica a 37°C durante 48 h.

[0085] El cultivo principal de Lactobacillus segun la invencion se realizo inoculando 30 ml de caldo YDA con el sedimento de 8 ml del precultivo, seguido de incubacion anaerobica a 37°C durante 24 h.

[0086] La fermentacion de Lactobacillus segun la invencion se realizo centrifugando 28 ml del cultivo principal durante 5 min a 4.500 rpm, y se descarto el sobrenadante. El sedimento obtenido se resuspendio en 5 ml de solucion esteril de NaCl al 0,9% y se transfirio por completo a un matraz Erlenmeyer de 1 l con 0,5 l de medio aYH. Posteriormente, se realizo una incubacion anaerobica a 37°C durante 24 h en un agitador a 150 rpm. Despues de la fermentacion, el valor del pH se ajusto a un valor de 5,5 ± 0,1 con 2 M de KOH.

[0087] Para producir el yogur, se anadieron 100 ml de leche tratada a temperatura ultra alta (1,5% de grasa) 2,0 g de leche desnatada en polvo (2% p/p) dentro de un matraz Schott. Luego, la mezcla se calento a 110°C durante 15 min en un autoclave. Despues de enfriar a 42°C, se anadio 0,5 ml de cultivo iniciador de yogur recien producido. Luego, una incubacion anaerobica se realizo a 42°C para obtener un valor de pH de 4,6 ± 0,1. El almacenamiento hasta el uso posterior se hizo a 7°C.

[0088] Para producir una suspension de esporas fungicas criogenica, se sembro en placas una muestra de hongo en agar de dextrosa de patata, seguido por el cultivo durante 1-4 semanas a 25-30°C bajo condiciones aerobicas hasta la esporulacion. Luego, el cultivo se sumergio en 10 ml de cultivo de crioproteccion, el sobrenadante lfquido se retiro y se transfirio a criotubos. El almacenamiento de los criocultivos se hizo a -80°C.

[0089] Para preparar el hongo para el bioensayo, se sembro 0,1 ml de la suspension criogenica de esporas fungicas en placas en agar de dextrosa de patata, seguido por el cultivo durante 1-4 semanas a 25-30°C bajo condiciones aerobicas hasta la esporulacion. Luego, el cultivo se sumergio en 10 ml de una solucion de Tween 80 al 0,1%. El sobrenadante lfquido se transfirio a tubos Falcon y se almaceno a 4-6°C. Se realizo una dilucion de la suspension con H² O destilada a 250 esporas/ml.

[0090] El bioensayo para la inhibicion de hongos por Lactobacillus en agar de dextrosa de patata se hizo sembrando en placas 200 pl de una suspension de esporas con 250 esporas/ml sobre una placa de agar de dextrosa de patata. Tras el secado, se perforaron 5 agujeros en la placa de agar mediante un taladro de corcho. Se pipetearon 40 pl de cada una de las mezclas siguientes:

1) cultivo de 24 h de Lactobacillus en medio MRS,

2) sobrenadante de cultivo de 24 h de Lactobacillus en medio MRS,

3) Lactobacillus de cultivo de 24 h en MRS, granulado y resuspendido en tampon PBS ( ^ celulas en PBS), 4) medio MRS,

5) PBS.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Bacteria lactica, registrada como Lactobacillus brevis DSM 22721, o un lisado de la misma, para el uso como un aditivo alimentario, donde la bacteria lactica es heterolactica y donde la bacteria lactica o su lisado inhibe el crecimiento de al menos un organismo fungico.

2. Bacteria lactica segun la reivindicacion 1, donde la bacteria lactica se caracteriza por el hecho de que se puede analizar segun los pasos siguientes:

a) se establece un sustrato,

b) se establece una preparacion que comprende las bacterias lacticas bajo investigacion,

c) la preparacion que comprende las bacterias lacticas se anade al sustrato, opcionalmente seguido de un paso de fermentacion,

d) el producto del paso c) se muestrea en soportes de muestra, aquf se forman las muestras de ensayo, e) un numero predeterminado de esporas fungicas se anade a al menos una muestra de ensayo, f) la incubacion de la muestra de ensayo obtenida en el paso e) se realiza durante una duracion predeterminada a una temperatura predeterminada,

g) deteccion, opcionalmente seguidNNza de la evaluacion del crecimiento fungico.

3. Bacteria lactica segun las reivindicaciones 1 o 2, donde la bacteria lactica es una bacteria lactica viva.

4. Bacteria lactica o un lisado de la misma segun al menos una de las reivindicaciones precedentes, donde el organismo fungico se selecciona del grupo que comprende el genero Penicillium, en particular Penicillium commune o Penicillium roqueforti, el genero Aspergillus y el genero Alternaria, en particular Alternaria alternata, Penicillium expansum, Penicillium citrinum, Penicillium digitatum, Penicillium italicum, Scopulariopsis breviacaulis, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Botrytis cinerea, Rhizopus sp., Mucor sp., Eurotium herbariorum, Geotrichum candidum, Cladosporium herbarum, Fusarium sambucinum, Phytophora infestans y Sclerotinia scerotiorum.

5. Uso de bacterias lacticas o un lisado de las mismas segun al menos una de las reivindicaciones 1 a 4 para la produccion de una composicion alimentaria, un alimento para animales, o una composicion farmaceutica o cosmetica, donde las bacterias lacticas, preferiblemente bacterias lacticas vivas, o un lisado de las mismas se anaden al alimento, al alimento para animales, o a la composicion farmaceutica o cosmetica.

6. Composicion alimentaria, alimento para animales, o una composicion farmaceutica o cosmetica, que comprende las bacterias lacticas o los lisados de las mismas segun al menos una de las reivindicaciones 1 a 4 en el alimento, el alimento para animales, o la composicion farmaceutica o cosmetica.

7. Composicion alimentaria, alimento para animales, o composicion farmaceutica o cosmetica segun la reivindicacion precedente, donde la composicion alimentaria, el alimento para animales, la composicion farmaceutica o cosmetica contiene de 102 a 1015 preferiblemente de 106 *o 108 a 1012, en particular de 108 a 1010 celulas de bacterias lacticas o lisados de las mismas por 100 g de composicion.

8. Composicion alimentaria, alimento para animales, o una composicion farmaceutica o cosmetica segun la reivindicacion 6 o 7, donde las bacterias lacticas estan presentes en una concentracion de 0,0001% a 0,01%, preferiblemente 0,001%.

9. Composicion alimentaria segun al menos una de las reivindicaciones 6 a 8, donde la composicion alimentaria es un producto carnico o un producto lacteo, preferiblemente yogur, leche, queso, crema y/o requeson.

10. Metodo para conservar un alimento, un alimento para animales, o una composicion farmaceutica o cosmetica, donde las bacterias lacticas o lisados de las mismas segun al menos una de las reivindicaciones 1 a 4 se anaden al alimento, al alimento para animales, o a la composicion farmaceutica o cosmetica.

11. Metodo segun la reivindicacion precedente, donde por 100 g de alimento, alimento para animales, o composicion farmaceutica o cosmetica, se anaden de 102 a 1015, preferiblemente de 106 o 108 a 1012, en particular de 108 a 1010 celulas de bacterias lacticas o lisados de las mismas.

12. Metodo segun la reivindicacion 10 u 11, donde las bacterias lacticas se anaden en una concentracion de 0,0001% a 0,01%, preferiblemente 0,001%.