ES2708999T3 - Solución que contiene trehalosa y dextrano para el trasplante celular de mamíferos - Google Patents
Solución que contiene trehalosa y dextrano para el trasplante celular de mamíferos Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para conservar una célula de mamífero en una solución acuosa fisiológica para el trasplante celular que comprende del 2,0 al 6,0 % (p/v) de trehalosa, o una sal de la trehalosa, y del 4,0 al 7,0 % (p/v) de dextrano, o una sal del dextrano, en el que la célula de mamífero se conserva en la solución acuosa fisiológica para el trasplante celular durante 1 a 14 días.
Description
DESCRIPCION
Solucion que contiene trehalosa y dextrano para el trasplante celular de mamlferos
Campo tecnico
[0001] La presente invencion se refiere a un procedimiento para conservar celulas de mamlfero en una solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular que comprende del 2,0 al 6,0 % (p/v) de trehalosa, o una sal de trehalosa (en adelante, a veces denominada "una trehalosa") y del 4,0 al 7,0 % (p/v) de dextrano, o una sal de dextrano (en adelante, a veces denominado "un dextrano") (en adelante, a veces referido como "la presente solucion para trasplante celular"), donde la celula de mamlfero se conserva en la solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular durante 1 a 14 dlas.
Antecedentes en la tecnica
[0002] En los ultimos anos, el rapido progreso de los estudios con celulas madre ha aumentado el impulso hacia la medicina regenerativa, y su conocimiento y comprension se han generalizado no solo en los investigadores sino tambien en el publico. La medicina regenerativa que utiliza celulas madre es un tratamiento destinado a restablecer la funcion de las celulas y tejidos danados por diversas enfermedades mediante el uso del potencial de auto-renovacion y la pluripotencia de las celulas madre o los factores secretados por las celulas madre. El trasplante de medula osea en pacientes con enfermedades hematologicas intratables, como la leucemia y la anemia aplasica, provoca el injerto de progenitores hematopoyeticos en el cuerpo de estos pacientes, lo que permite el mantenimiento de la capacidad hematopoyetica durante casi toda la vida. Recientemente, muchos investigadores han apuntado a la aplicacion cllnica utilizando celulas madre distintas de las celulas madre hematopoyeticas, han identificado celulas madre en nervios centrales, nervios perifericos, medula osea, intestino delgado y similares, y han comenzado a implementar el tratamiento de trasplante celular madre de tejido de enfermedad traumatica y enfermedad de degeneracion tisular (Documentos sin patente 1 a 3). Por otro lado, la terapia de celulas inmunitarias contra el cancer es el tratamiento celular mas avanzado en el que las celulas inmunitarias que actuan para atacar el cancer se llevan al exterior del cuerpo, seguidas de la potenciacion de su accion y a continuacion las celulas se devuelven al interior del cuerpo y se implementan terapias que utilizan celulas T, como la terapia con vacunas de celulas dendrlticas, terapia con celulas T alfa/beta (terapia con celulas T ap), terapia con celulas T delta/delta (terapia con celulas T y5), terapia con CTL, y la terapia de celulas asesinas naturales (terapia de celulas NK).
[0003] Cuando las celulas madre o celulas T utilizadas para el tratamiento de trasplante se conservan durante un largo perlodo de tiempo, la conservacion en un llquido no puede mantener satisfactoriamente la tasa de supervivencia de las celulas. Por ejemplo, se informa que la conservacion en frlo (a 4 °C) de las celulas madre de medula osea humana en solucion salina disminuye la tasa de supervivencia celular al 40 % o menos despues de 48 horas y al 20 % o menos despues de 72 horas (Documento sin patente 4). Por lo tanto, cuando las celulas madre para trasplante o las celulas T para trasplante se conservan durante un largo perlodo de tiempo, comunmente se lleva a cabo la conservacion por congelacion. Sin embargo, el llquido de conservacion por congelacion normalmente contiene un agente de conservacion por congelacion, como DMSO o glicerol; por lo tanto, es necesario eliminar el agente de conservacion por congelacion para el trasplante antes de realizar el tratamiento de trasplante despues de descongelar celulas madre o celulas T conservadas por congelacion, que ha sido considerado problematico por ser muy laborioso. El llquido de conservacion por congelacion que contiene un agente de conservacion por congelacion tambien se ha considerado problematico porque provoca un dano significativo del citoesqueleto debido a la cristalizacion del agua durante la congelacion y disminuye la tasa de supervivencia celular despues de la congelacion y descongelacion. Por lo tanto, se ha considerado una necesidad urgente para el desarrollo de un llquido de conservacion celular excelente en cuanto a la simplicidad de uso y capaz de suprimir una disminucion en la tasa de supervivencia celular.
[0004] La trehalosa es un tipo de disacarido formado por el enlace 1,1-glucosido de las glucosas. La trehalosa se usa en diversos alimentos y cosmeticos porque presenta un sabor dulce y tiene una alta capacidad de retencion de agua. La trehalosa tambien se usa como ingrediente activo de una solucion protectora de organos en el trasplante de organos porque tiene las propiedades de estabilizar la membrana celular y eliminar el dano celular. Por ejemplo, se han desarrollado excelentes soluciones de conservacion de organos que contienen trehalosa, como la solucion ET-Kyoto y la nueva solucion ET-Kyoto (documentos de patente 1 y 2 y documento sin patente 5).
[0005] El dextrano es un tipo de polisacarido que consiste en glucosa y se usa ampliamente como espesante, humectante o similar en los campos de la medicina y la cosmetica.
[0006] Los presentes inventores han informado que el lavado de celulas madre mesenquimales desprendidas de un recipiente de cultivo celular mediante tratamiento con enzimas proteollticas con una solucion acuosa fisiologica que contiene trehalosa suprimio la muerte de las celulas madre mesenquimales (Documento de patente 3). Debido a que el dano de las celulas por el tratamiento con enzimas proteollticas induce una via de muerte celular (apoptosis o similar), dicho efecto por la trehalosa se debe probablemente a la supresion de una via de apoptosis o
la promocion de la funcion que repara el dano celular. Los presentes inventores tambien han informado que la adicion de un sacarido, como la trehalosa o el dextrano, a una suspension de celulas madre mesenquimales puede suprimir la agregacion, y una disminucion en la tasa de supervivencia, de las celulas madre mesenquimales cuando se han conservado durante un corto perlodo de tiempo (30 minutos a 6 horas) (Documentos de patente 4 y 5). Sin embargo, no esta claro si el uso combinado de trehalosa y dextrano puede suprimir sinergicamente una disminucion en la tasa de supervivencia de celulas de mamlferos, como las celulas madre mesenquimales, y aumentar sinergicamente el porcentaje de celulas vivas.
Documentos de la tecnica anterior
Documentos de patente
[0007]
Documento de patente 1 : Patente japonesa n.° 3253131
Documento de patente 2 : Publicacion Internacional n.° WO 2007/043698
Documento de patente 3 : Publicacion Internacional n.° WO 2012/133575
Documento de patente 4 : n.° de publicacion de solicitud de patente japonesa no examinada 2012-115253 Documento de patente 5 : Publicacion Internacional n.° WO 2012/063870
Documentos sin patente
[0008]
Documento sin patente 1: Gage, F. H., Science 287: 1433-1438 (2000)
Documento sin patente 2: Morrison, S. J. et al., Cell 96: 737-749 (1999)
Non-patente Documento 3: Batle, E. et al., Cell 111: 251-263 (2002)
Documento sin patente 4: Lane, T. A. et al., Transfusion 49: 1471-1481 (2009)
Documento sin patente 5: Chem, F. et al., Yonsei Med. J. 45: 1107-1114 (2004)
Resumen de la invencion
Objeto para resolver por la invencion
[0009] Un objeto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento para conservar celulas de mamlfero durante un largo perlodo de tiempo usando una solucion para trasplante celular, capaz de suprimir eficazmente la muerte celular cuando las celulas de mamlfero se han conservado, y la solucion para trasplante celular.
Medios para resolver el objeto
[0010] Los presentes inventores han informado que, como se ha descrito anteriormente, la conservacion a corto plazo (de 30 minutos a 6 horas) de las celulas madre mesenquimales en una solucion que contiene un sacarido, como trehalosa o dextrano, puede suprimir una disminucion en la tasa de supervivencia de las celulas (Documentos de patente 4 y 5). Sin embargo, la invencion descrita en los Documentos de patente 4 y 5 no demostro un efecto sinergico por el uso combinado de trehalosa y dextrano. En estudios intensivos para resolver el problema anterior, se ha encontrado que la conservacion de celulas madre mesenquimales humanas de medula osea (hMSC-BM) o celulas T de sangre periferica humana (hPBT) en una solucion fisiologica acuosa que contiene trehalosa y dextrano a concentraciones particulares del 2,0 al 6,0 % [p/v] y del 4,0 al 7,0 % [p/v], respectivamente, pueden suprimir sinergicamente una disminucion en la tasa de supervivencia de las celulas durante un largo perlodo de tiempo (1 a 14 dlas) y aumentar sinergicamente el porcentaje de celulas vivas, logrando as! la presente invencion.
[0011] Por lo tanto, la presente invencion se refiere a (1) un procedimiento para conservar una celula de mamlfero en una solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular que comprende del 2,0 al 6,0 % (p/v) de trehalosa, o una sal de trehalosa, y del 4,0 al 7,00 (p/v) de dextrano, o una sal de dextrano, en el que la celula de mamlfero se conserva en la solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular durante 1 a 14 dlas, (2) el procedimiento de acuerdo con (1) anterior, en el que la solucion acuosa fisiologica se selecciona del grupo que consiste en solucion de lactato de Ringer, solucion salina, solucion de Ringer y solucion de acetato de Ringer, (3) el procedimiento de acuerdo con (1) o (2) anterior, en el que la celula de mamlfero se conserva en la solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular durante 3 a 14 dlas, (4) el procedimiento de acuerdo con uno de los puntos (1) a (3) anteriores, en el que la celula de mamlfero es una celula madre mesenquimal de mamlfero o una celula T de mamlfero, y (5) el procedimiento de acuerdo con (4) anterior, en el que la celula madre mesenquimal de mamlfero es una celula madre mesenquimal humana de medula osea y la celula T de mamlfero es una celula T de sangre periferica humana.
[0012] En el presente documento tambien se describe (6) una solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular que comprende del 2,0 al 6,0 % (p/v) de trehalosa, uno de sus derivados, o una sal de trehalosa o uno de sus derivados, y del 4,0 al 7,0 % (p/v) de dextrano, uno de sus derivados, o una sal de dextrano o uno de sus derivados, (7) la solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular de acuerdo con (6) anterior, en el que la solucion acuosa fisiologica se selecciona del grupo que consiste en solucion de lactato de Ringer, solucion salina, solucion de Ringer y solucion de acetato de Ringer, (8) la solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular de acuerdo con (6) o (7) anterior, en el que la celula de mamlfero es una celula madre mesenquimal de mamlfero o una celula T de mamlfero, y (9) la solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular de acuerdo con (8) anterior, en el que la celula madre mesenquimal de mamlfero es una celula madre mesenquimal humana de medula osea y la celula T de mamlfero es una celula T de sangre periferica humana.
[0013] Tambien se describe (10) una solucion acuosa fisiologica que contiene celulas para trasplante que comprende: una celula de mamlfero; del 2,0 al 6,0 % (p/v) de trehalosa, uno de sus derivados, o una sal de trehalosa o uno de sus derivados; y del 4,0 al 7,0 % (p/v) de dextrano, uno de sus derivados o una sal de dextrano o uno de sus derivados, (11) la solucion fisiologica acuosa que contiene celulas para trasplante de acuerdo con (10) anterior, en la que la solucion acuosa fisiologica se selecciona del grupo que consiste en la solucion de lactato de Ringer, solucion salina, solucion de Ringer y solucion de acetato de Ringer, (12) la solucion acuosa fisiologica que contiene celulas para trasplante segun (10) u (11) anterior, en el que la celula de mamlfero es una celula madre mesenquimal de mamlfero o una celula T de mamlfero, y (13) la solucion acuosa fisiologica que contiene celulas para trasplante de acuerdo con (12) anterior, en el que la celula madre mesenquimal de mamlfero es una celula madre mesenquimal humana de medula osea y la celula T de mamlfero es una celula T de sangre periferica humana.
[0014] Ademas, se describe una combination de una solucion acuosa fisiologica y trehalosa, uno de sus derivados, o una sal de trehalosa o uno de sus derivados y dextrano, uno de sus derivados o una sal de dextrano o uno de sus derivados para conservar celulas de mamlferos, y el uso de una combinacion de una solucion acuosa fisiologica y trehalosa, uno de sus derivados, o una sal de trehalosa o uno de sus derivados y dextrano, uno de sus derivados o una sal de dextrano o uno de sus derivados para preparar una solucion para el trasplante celular de mamlferos; mas especlficamente, la trehalosa descrita anteriormente, uno de sus derivados, o una sal de trehalosa o uno de sus derivados y el dextrano, uno de sus derivados o una sal del dextrano o uno de sus derivados son ingredientes activos para suprimir una disminucion en la tasa de supervivencia de las celulas.
Efecto de la invencion
[0015] De acuerdo con la presente invencion, se puede suprimir una disminucion en la tasa de supervivencia de las celulas, incluidas las celulas madre, como las celulas madre mesenquimales, y los leucocitos, como las celulas T, cuando la suspension de las celulas se conserva durante un largo perlodo de tiempo (1 a 14 dlas); por lo tanto, se puede proporcionar una suspension celular de buena calidad para trasplante en medicina regenerativa o tratamiento contra el cancer no solo a un area de production para la suspension celular y sus areas perifericas sino tambien a lugares distantes, y aunque se realiza una prueba de esterilidad para la inspection de garantlas de calidad en el envlo de un producto farmaceutico y la prueba de esterilidad dura un perlodo de 14 dlas segun la Farmacopea japonesa, la suspension celular de buena calidad se puede proporcionar incluso despues de producir la suspension celular y realizar la prueba de esterilidad.
Breve descripcion de los dibujos
[0016]
[Figura 1] La Figura 1 es un grafico que muestra los resultados del analisis de la tasa de supervivencia celular cuando se conservaron hMSC-BM durante 14 dlas utilizando cada una de las 11 soluciones para trasplante celular de mamlferos (soluciones S, LR, "LR 1 % D", "LR 3 % D", "LR 5 % D", "LR 7 % D", "LR 3 % T", "LR 3 % T 1 % D", "LR 3 % T 3 % D", "LR 3 % T 5 % D", y" LR 3 % T 7 % D": vease "1-1-1 Solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 1). El eje de ordenadas muestra el porcentaje de celulas vivas segun el numero total de celulas de acuerdo con la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica [n = 4]). Como control, se muestra la tasa de supervivencia celular antes de la conservation en solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS [-]) (en lo sucesivo, simplemente denominada "PBS") ("P" en el eje de abscisas de la figura).
[Figura 2] La Figura 2 es un grafico que muestra los resultados del analisis de la tasa de supervivencia celular cuando se conservaron hMSC-BM durante 3 dlas, 7 dlas y 14 dlas utilizando cada una de las 11 soluciones para trasplante celular de mamlferos (soluciones S, LR, "LR 1 % D", "LR 3 % D", "LR 5 % D", "LR 7 % D", "LR 3 % T", "LR 3 % T 1 % D", "LR 3 % T 3 % D", "LR 3 % T 5 % D", y "LR 3 % T 7 % D" ["2 a 12 ", respectivamente en el eje de abscisas en la figura]: vease "1-1-1 Solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 1). El eje de ordenadas muestra el porcentaje de celulas vivas segun el numero total de celulas de acuerdo con la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica [n = 4]). Como control, se muestra la tasa de supervivencia celular antes de la conservacion (0 dlas despues de la conservacion) en solucion de PBS ("1" en el
eje de abscisas en la figura).
[Figura 3] La Figura 3 es un grafico que muestra los resultados del analisis de la tasa de supervivencia celular cuando se conservaron hMSC-BM durante 14 dlas utilizando cada una de las 13 soluciones para el trasplante celular de mamlferos (soluciones S, LR, "LR 1 % T", "LR 3 % T", "LR 5 % T", "LR 7 % T", "LR 10 % T", "LR 5 % D", "LR 5 % D 1 % T", "LR 5 % D 3 % T"," LR 5 % D 5 % T", "LR 5 % D 7 % T" y "LR 5 % D 10 % T": vease "2-1 -1 Solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 2). El eje de ordenadas muestra el porcentaje de celulas vivas segun el numero total de celulas de acuerdo con la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica [n = 4]). Como control, se muestra la tasa de supervivencia celular antes de la conservacion en solucion de PBS ("P" en el eje de abscisas en la figura).
[Figura 4] La Figura 4 es un grafico que muestra los resultados del analisis de la tasa de supervivencia celular cuando se conservaron hMSC-BM durante 3 dlas, 7 dlas y 14 dlas utilizando cada una de las 11 soluciones para trasplante celular de mamlferos (soluciones S, LR, "LR 1 % T", "LR 3 % T", "LR 5 % T", "LR 7 % T", "Lr 5 % D", "LR 5 % D 1 % T", "LR 5 % D 3 % T", "LR 5 % D 5 % T", y "LR 5 % D 7 % T" ["2 a 12", respectivamente en el eje de abscisas en la figura]: vease "2-1-1 Solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 2). El eje de ordenadas muestra el porcentaje de celulas vivas segun el numero total de celulas de acuerdo con la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica [n = 4]). Como control, se muestra la tasa de supervivencia celular antes de la conservacion (0 dlas despues de la conservacion) en solucion de PBS ("1" en el eje de abscisas en la figura).
[Figura 5] La Figura 5 es un grafico que muestra los resultados del analisis de la tasa de supervivencia celular cuando se conservaron hMSC-BM durante 14 dlas usando cada una de las 11 soluciones para el trasplante celular de mamlferos (soluciones S, LR, LRD, LRTD, "LRD GL", "LRD SR", "LRD MN", "LRD LC", "Lr D RF", "LRD ML" y "LRD SC": vease "3-1-1 Solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 3). El eje de ordenadas muestra el porcentaje de celulas vivas segun el numero total de celulas de acuerdo con la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica [n = 4]). "*" en la figura muestra que existe una diferencia estadlsticamente significativa (P <0,05) contra la LRD segun la prueba de Dunnett.
[Figura 6] La Figura 6 es un grafico que muestra los resultados del analisis de la tasa de supervivencia celular cuando se conservaron hMSC-BM durante 14 dlas usando cada una de las 11 soluciones para el trasplante celular de mamlferos (soluciones S, LR, LRT, LRTD, "LRT GL", "LRT SR", "LRT MN", "LRT LC", "LRT RF", "LRT ML" y "LRT SC": vease "4-1-1 Solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 4). El eje de ordenadas muestra el porcentaje de celulas vivas segun el numero total de celulas de acuerdo con la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica [n = 4]). "*" en la figura muestra que existe una diferencia estadlsticamente significativa (P <0,05) contra LRT segun la prueba de Dunnett.
[Figura 7] La Figura 7 es un grafico que muestra los resultados del analisis de la tasa de supervivencia celular cuando se conservaron hMSC-BM durante 14 dlas usando cada una de las 11 soluciones para el trasplante celular de mamlferos (soluciones S [solucion salina normal de Otsuka], LR [inyeccion de Lactec], LRD [5 % (p/v) de inyeccion de Lactec que contiene dextrano], LRT [3 % (p/v) de inyeccion de Lactec que contiene trehalosa], "LR GL" [inyeccion de Lactec que contiene glucosa], "LR SR" [inyeccion de Lactec que contiene sorbitol], "LR MN" [inyeccion de Lactec que contiene manitol], "Lr + LC" [inyeccion de Lactec que contiene lactosa], "LR RF" [inyeccion de Lactec que contiene rafinosa], "LR ML" [inyeccion de Lactec que contiene maltosa], y "LR SC" [inyeccion de Lactec que contienen sacarosa]. El eje de ordenadas muestra el porcentaje de celulas vivas en funcion del numero total de celulas como la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica [n = 4]). "***" en la figura muestra que existe una diferencia estadlsticamente significativa (P <0,001) contra LR segun la prueba de Dunnett.
[Figura 8] La Figura 8 es un grafico que muestra los resultados del analisis de la tasa de supervivencia celular cuando se conservaron hMSC-BM durante 14 dlas utilizando cada una de las 10soluciones para trasplante celular de mamlferos (soluciones LR, LRTD, S, STD, 5 % de glucosa, 5 % de glucosa TD, Ringer TD, Veen y Veen TD: vease "5-1-1 Solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 5). El eje de ordenadas muestra el porcentaje de celulas vivas segun el numero total de celulas de acuerdo con la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica [n = 4]). Como control, se muestra la tasa de supervivencia de las celulas antes de la conservacion en solucion de PBS ("P" en el eje de abscisas en la figura).
[Figura 9] La Figura 9 es un grafico que muestra los resultados del analisis de la tasa de supervivencia celular cuando se conservaron las hPBT durante 1 dla, 3 dlas, 7 dlas y 14 dlas utilizando cada una de las 5 soluciones para trasplante celular de mamlferos (soluciones S, LR, LRT, LRD y LRTD). El eje de ordenadas muestra el porcentaje de celulas vivas en funcion del numero total de celulas segun la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica [n = 6]). Como control, se muestra la tasa de supervivencia de las celulas antes de la conservacion (0 dlas despues de la conservacion) en solucion de PBS ("P" en el eje de abscisas en la figura).
Modo de realizacion de la invencion
[0017] El procedimiento para conservar celulas de mamlferos de acuerdo con la presente invencion es un procedimiento limitado a la aplicacion de "para su uso en trasplantes de celulas", que implica conservar celulas de mamlferos en una solucion acuosa fisiologica que comprende del 2,0 al 6,0 % (p/v) de una trehalosa y del 4,0 al 7,0 % (p/v) de un dextrano (la presente solucion para el trasplante celular); mas especlficamente, la presente solucion para el trasplante celular comprende una trehalosa y un dextrano como ingredientes activos para suprimir una disminucion en la tasa de supervivencia celular. La densidad de celulas de mamlfero conservadas en la presente
solucion para trasplante celular normalmente esta en el intervalo de 103 a 1010 celulas/ml.
[0018] Para la presente solucion para trasplante celular, las celulas de mamiferos estan contenidas en la misma. La presente solucion para trasplante celular se puede preparar anadiendo celulas de mamifero a la presente solucion para trasplante celular, o anadiendo una trehalosa del 2,0 al 6,0 % (p/v) y un dextrano del 4,0 al 7,0 % (p/v) a una solucion acuosa fisiologica que contiene celulas de mamiferos.
[0019] Los ejemplos de mamiferos segun la presente invention pueden incluir un roedor, como un raton, una rata, un hamster o un conejillo de indias, un lagomorfo, como un conejo, un ungulado, como un cerdo, una vaca, una cabra, un caballo o una oveja, un carnivora, como un perro o un gato, y un primate, como un ser humano, un mono, un mono rhesus, un mono cynomolgus, un titi, un orangutan o un chimpance; entre otros, los ejemplos preferibles de los mismos pueden incluir un raton, un cerdo y un ser humano.
[0020] La solucion acuosa fisiologica aplicada a la presente solucion para trasplante celular no esta particularmente limitada siempre que sea una solucion acuosa isotonica en la que las concentraciones de sal y azucar y similares se ajusten con sodio, potasio y similares para proporcionar casi la misma presion osmotica que la del fluido corporal o celular. Los ejemplos especificos de los mismos pueden incluir solucion salina, soluciones salinas que tienen efectos de tamponamiento (solucion salina tamponada con fosfato [PBS], solucion salina tamponada con Tris [TBS] y solucion salina tamponada con HEPES), solucion de Ringer, solucion de lactato de Ringer, solucion de acetato de Ringer, solucion de bicarbonato de Ringer, solucion acuosa de glucosa al 5 %, medios basales para cultivo de celulas animales (DMEM, EMEM, RPMI-1640, a-MEM, F-12, F-10, M-199 y similares) y agentes isotonicos (glucosa, D-sorbitol, D-manitol, lactosa, cloruro de sodio y similares); entre otros, se prefiere uno seleccionado del grupo que consiste en solucion de lactato de Ringer, solucion salina, solucion de Ringer y solucion de acetato de Ringer; la solucion de lactato de Ringer o solucion salina son particularmente preferidas. La solucion acuosa fisiologica puede estar disponible en el mercado o ser de preparation propia. Los ejemplos disponibles en el mercado pueden incluir solucion salina normal de Otsuka (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (solucion salina), solucion de Ringer "OTSUKA" (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (solucion de Ringer), inyeccion Lactec (R) (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (solucion de lactato de Ringer), Veen F Infusion (de Kowa Pharmaceutical Co., Ltd.) (solucion de acetato de Ringer), OTSUKA GLUCOSE INYECTION 5 % (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (solucion acuosa de glucosa al 5 %), y Bicanate Infusion (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (solucion de bicarbonato de Ringer). Tal como se usa en el presente documento, el termino "isotonico" significa que tiene una presion osmotica que oscila de 250 a 380 mOsm/l.
[0021] La presente solucion para trasplante celular puede complementarse adecuadamente con aditivos, como un estabilizador (por ejemplo, albumina de suero humano o polietilenglicol), un tampon (por ejemplo, tampon fosfato o tampon de acetato de sodio), un agente quelante (por ejemplo, EDTA, EGTA, acido citrico o salicilato), un aminoacido (por ejemplo, un aminoacido no esencial, como glutamina, alanina, asparagina, serina, acido aspartico, cisteina, acido glutamico, glicina, prolina o tirosina), una vitamina (por ejemplo, cloruro de colina, acido pantotenico, acido folico, nicotinamida, clorhidrato de piridoxal, riboflavina, clorhidrato de tiamina, acido ascorbico, biotina o inositol), un solubilizante, un conservante y un antioxidante.
[0022] El periodo de conservation cuando las celulas de mamiferos se conservan en la presente solucion para el trasplante celular puede ser un tiempo suficiente para suprimir una disminucion en la tasa de supervivencia celular y aumentar el porcentaje de celulas vivas, y es de 1 dia o mas, 2 dias o mas, 3 dias o mas, o 7 dias o mas. Debido a que un periodo demasiado largo para conservar celulas de mamiferos tiene la posibilidad de afectar negativamente la supervivencia de las celulas, el periodo es de 14 dias o menos para evitar el efecto adverso sobre la tasa de supervivencia de las celulas. Por lo tanto, el periodo de conservacion es de 1 a 14 dias, de 2 a 14 dias, de 3 a 14 dias, o de 7 a 14 dias, mas preferiblemente de 3 a 14 dias. La supresion de la muerte de celulas de mamiferos conservadas en la presente solucion para trasplante celular puede confirmarse mediante un procedimiento conocido capaz de detectar la muerte celular, como el procedimiento de tincion con azul de tripano, procedimiento TUNEL, procedimiento Nexin o procedimiento FLICA.
[0023] La temperatura de conservacion cuando las celulas de mamiferos se conservan en la presente solucion para trasplante celular puede ser una temperatura a la que la solucion para trasplante celular no se congele y las celulas sean viables, y se encuentren en el intervalo de 0 a 37 °C, preferiblemente de 0 a 25 °C (temperatura ambiente).
[0024] Los ejemplos de trehalosa en forma de una trehalosa como se ha descrito anteriormente pueden incluir a, p-trehalosa como un disacarido en el que las moleculas de a-glucosa y p-glucosa estan unidas por enlaces 1,1-glucosido y p, p-trehalosa como un disacarido en el que 2 moleculas de p-glucosa estan unidas por enlaces 1,1-glucosido, ademas de a,a-trehalosa como disacarido en el que 2 moleculas de a-glucosa estan unidas por enlaces 1,1-glucosido; entre otras, es preferible la a,a-trehalosa. Estas trehalosas pueden producirse por cualquiera de los procedimientos conocidos, tales como sintesis quimica, production por un microorganismo y production por una enzima; sin embargo, tambien se pueden utilizar las disponibles en el mercado. Sus ejemplos pueden incluir a,atrehalosa (de Hayashibara Co., Ltd.) y a,a-trehalosa (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.).
[0025] Los ejemplos de la sal de trehalosa en forma de una trehalosa como se ha descrito anteriormente pueden incluir una sal de adicion de acido, tal como un clorhidrato, un bromhidrato, un yodhidrato, un fosfato, un nitrato, un sulfato, un acetato, un propionato, un toluenosulfonato, un succinato, un oxalato, un lactato, un tartrato, un glicolato, un metanosulfonato, un butirato, un valerato, un citrato, un fumarato, un maleato y un malato; una sal metalica, tal como una sal de sodio, una sal de potasio y una sal de calcio; una sal de amonio; y una sal de alquilamonio. Estas sales se utilizan cada una en forma de solucion en el momento de su uso, y su accion tiene preferiblemente la misma potencia que la de la trehalosa. Estas sales pueden formar hidratos o solvatos, y pueden usarse solas o en una combinacion adecuada de dos o mas de ellas.
[0026] El dextrano en forma de un dextrano como se ha descrito anteriormente no esta particularmente limitado siempre que sea un polisacarido (C6HioO5)n que consiste en D-glucosa, usando un enlace a 1 ^ 6 como cadena principal, y ejemplos del mismo pueden incluir dextrano 40 (peso molecular promedio en peso (Mw) = 40.000) y dextrano 70 (Mw = 70.000). Estos dextranos pueden producirse por cualquiera de los procedimientos conocidos, como slntesis qulmica, produccion por un microorganismo y produccion por una enzima; sin embargo, tambien se pueden utilizar disponibles en el mercado. Los ejemplos de los mismos pueden incluir productos comerciales, tales como la inyeccion Low Molecular Weight Dextran L Injection (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) y Dextran 70 (de Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.).
[0027] Los ejemplos de la sal de dextrano en forma de un dextrano como se ha descrito anteriormente pueden incluir una sal de adicion de acido, como un clorhidrato, un bromhidrato, un yodhidrato, un fosfato, un nitrato, un sulfato, un acetato, un propionato, un toluenosulfonato, un succinato, un oxalato, un lactato, un tartrato, un glicolato, un metanosulfonato, un butirato, un valerato, un citrato, un fumarato, un maleato y un malato; una sal metalica, tal como una sal de sodio, una sal de potasio y una sal de calcio; una sal de amonio; y una sal de alquilamonio. Estas sales se usan cada una en forma de solucion en el momento de uso, y su accion tiene preferiblemente la misma potencia que la del dextrano. Estas sales pueden formar hidratos o solvatos, y pueden usarse solas o en una combinacion adecuada de dos o mas de ellas.
[0028] Los ejemplos de celulas de mamlferos segun la presente invention pueden incluir celulas de islotes pancreaticos de mamlferos administrados por via intravenosa a pacientes con diabetes tipo I, y celulas dendrlticas de mamlferos, celulas asesinas naturales (NK), celulas T (por ejemplo, celulas T alfa beta (ap), celulas T gamma delta (y5), linfocitos T citotoxicos (CTL) y celulas T auxiliares), macrofagos y leucocitos (por ejemplo, neutrofilos y eosinofilos) administrados por via intravenosa a pacientes con cancer, ademas de celulas madre de mamlferos administrados a traves de los vasos sangulneos para medicina regenerativa o similares; se prefieren las celulas T. Estas celulas se pueden aislar mediante procedimientos comunes conocidos. Por ejemplo, los leucocitos, celulas T, celulas T auxiliares, celulas T citotoxicas, y celulas T yS pueden aislarse de una muestra de sangre periferica o sangre de cordon tratada con hemolisis usando un clasificador de celulas activadas por fluorescencia (FACS) usando anticuerpos contra un marcador de superficie de celulas de leucocitos (CD45), un marcador de superficie de celulas T (CD3), un marcador de superficie de celulas T auxiliares (CD4), una celula T citotoxica (CD8) y un marcador de superficie de celulas T yS (CD39) o un aparato automatico de separation de celulas magneticas (autoMACS) que utiliza anticuerpos contra los marcadores de superficie celular marcados con una sustancia marcadora, como una sustancia fluorescente, biotina o avidina, y un anticuerpo conjugado con perlas MACS (perlas magneticas) a la sustancia marcadora. Los ejemplos de la sustancia marcadora pueden incluir aloficocianina (APC), ficoeritrina (PE), FITC (isotiocianato de fluorescelna), Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, PE-Texas Red, PE-Cy5 y PE-Cy7.
[0029] Las "celulas madre" son las celulas inmaduras que tienen potencial de auto-renovacion y potencial de diferenciacion/proliferacion. Las celulas madre incluyen una subpoblacion, como celulas madre pluripotentes, celulas madre multipotentes o celulas madre unipotentes, segun la capacidad de diferenciacion. Celulas madre pluripotentes significa celulas que, como tales, no pueden convertirse en un organismo individual, pero tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tejidos o celulas que constituyen un cuerpo vivo. Celulas madre multipotentes significa una celula que tiene la capacidad de diferenciarse en una pluralidad de tipos de tejidos o celulas, pero no todos. Celulas madre unipotentes significa celulas que tienen la capacidad de diferenciarse en un tejido o celula particular.
[0030] Los ejemplos de celulas madre pluripotentes pueden incluir celulas madre embrionarias (celulas ES), celulas EG y celulas iPS. Las celulas ES se pueden producir mediante el cultivo de una masa celular interna en celulas alimentadoras o en un medio que contiene LIF. El procedimiento para producir celulas ES se describe, por ejemplo, en los documentos WO 96/22362, WO 02/101057, US 5.843.780, US 6.200.806 o US 6.280.718. Las celulas EG pueden producirse cultivando celulas germinales primordiales en un medio que contiene mSCF, LIF y bFGF (Cell, 70: 841-847, 1992). Las celulas iPS se pueden producir mediante la introduction de factores de reprogramacion, como Oct3/4, Sox2, Klf4 (y, opcionalmente, c-Myc o n-Myc), en celulas somaticas (por ejemplo, fibroblastos o celulas de la piel) (Cell, 126: p. 663-676, 2006; Nature, 448: p. 313-317, 2007; Nat. Biotechnol, 26; p.
101-106, 2008; Cell 131: p. 861-872, 2007; Science, 318: p 1917-1920, 2007; Cell Stem Cells 1: p. 55-70, 2007; Nat. Biotechnol, 25: p. 1177-1181, 2007; Nature, 448: p. 318-324, 2007; Cell Stem Cells 2: p. 10-12, 2008; Nature 451: p.
141-146, 2008; Science, 318: p. 1917-1920, 2007). Tambien son preferibles como celulas madre pluripotentes
celulas madre establecidas mediante el cultivo de embriones tempranos hechos mediante trasplante del nucleo de celulas somaticas (Nature, 385, 810 (1997); Science, 280, 1256 (1998); Nature Biotechnology, 17, 456 (1999); Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, 14984 (1999)), y Rideout III et al. (Nature Genetics, 24, 109 (2000)).
[0031] Los ejemplos de celulas madre multipotentes incluyen celulas madre mesenquimales capaces de diferenciarse en celulas, como un adipocito, un osteocito, un condrocito, y un adipocito, progenitores hematopoyeticos capaces de diferenciarse en celulas hematoclticas, como un leucocito, un eritrocito y una plaqueta, celulas madre neurales capaces de diferenciarse en celulas, como una neurona, un astrocito y un oligodendrocito, y celulas madre somaticas, como una celula madre mieloide y una celula madre germinal. Las celulas madre multipotentes preferiblemente son celulas madre mesenquimales. Celulas madre mesenquimales significa celulas madre capaces de diferenciarse en todo o parte de un osteoblasto, un condroblasto y un lipoblasto. Las celulas madre multipotentes se pueden aislar de un cuerpo vivo por procedimientos conocidos per se. Por ejemplo, Las celulas madre mesenquimales se pueden recoger de la medula osea, el tejido adiposo, la sangre periferica, la sangre del cordon umbilical y similares de mamlferos por procedimientos generales conocidos. Por ejemplo, las celulas madre mesenquimales humanas pueden aislarse cultivando y subcultivando celulas madre hematopoyeticas o similares despues de la puncion de la medula osea (Journal of Autoimmunity, 30 (2008) 163-171). Las celulas madre multipotentes tambien se pueden obtener cultivando las celulas madre pluripotentes descritas anteriormente en condiciones de induccion adecuadas. Las celulas madre mesenquimales preferiblemente son celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea humana.
[0032] Los ejemplos de celulas de mamlfero segun la presente invencion pueden incluir celulas adherentes. Como se usa en este documento, celulas "adherentes" significa celulas dependientes de andamios capaces de sobrevivir, proliferar y producir sustancias mediante la adhesion al andamio. Los ejemplos de celulas madre adherentes pueden incluir celulas madre pluripotentes, celulas madre mesenquimales, celulas madre neurales, celulas madre mieloides y celulas madre germinales. Las celulas madre adherentes son preferiblemente celulas madre mesenquimales o celulas madre pluripotentes.
[0033] Las celulas de mamlferos (poblacion) segun la presente invencion pueden ser aquellas separadas de un cuerpo vivo o las subcultivadas in vitro; sin embargo, preferiblemente son las aisladas o purificadas. Como se usa en este documento, "aislado o purificado" significa que se ha aplicado la operacion de eliminar componentes distintos de un componente deseado. La pureza de las celulas de mamlferos aisladas o purificadas (el porcentaje de celulas deseadas, como las celulas madre de mamlferos, en funcion del numero total de celulas) normalmente es del 30 % o mas, preferiblemente del 50 % o mas, mas preferiblemente del 70 % o mas, incluso mas preferiblemente del 90 % o mas (por ejemplo, del 100 %).
[0034] Las celulas de mamlferos (poblacion) conservadas en la presente solucion para trasplante celular estan preferiblemente en un estado de celulas individuales. Tal como se usa en el presente documento, el "estado de celulas individuales" significa que las celulas no se juntan con otras celulas para formar una masa (en otras palabras, un estado no agregado). Las celulas de mamlfero en un estado de celulas individuales pueden prepararse sometiendo celulas de mamlfero cultivadas in vitro a tratamiento enzimatico con tripsina/EDTA o similares. El porcentaje de celulas de mamlfero en un estado individual en las celulas de mamlfero normalmente es del 70 % o mas, preferiblemente del 90 % o mas, mas preferiblemente del 95 % o mas, aun mas preferiblemente del 99 % o mas (por ejemplo, del 100 %). El porcentaje de celulas en un estado individual puede determinarse dispersando las celulas de mamlferos en PBS, observando la dispersion bajo un microscopio y examinando una pluralidad de (por ejemplo, 1000) celulas seleccionadas al azar para la presencia de agregacion.
[0035] Las celulas de mamlfero (poblacion) conservadas en la presente solucion para trasplante celular son preferiblemente flotantes. Como se usa en este documento, el termino "flotante" se refiere a que las celulas se mantienen en la solucion para trasplante sin entrar en contacto con la pared interna de un recipiente que contiene la solucion para trasplante.
[0036] Cuando las celulas de mamlfero se conservan en la presente solucion para el agregado o el precipitado de trasplante celular, las celulas se suspenden preferiblemente antes del trasplante por un procedimiento bien conocido en la tecnica, tal como pipeteado o extraccion.
[0037] La presente invencion se describira mas especlficamente a continuacion con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no pretenden limitar el alcance tecnico de la presente invencion.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
1. La confirmacion 1 de la presente solucion para trasplante celular tiene un efecto sinergico de la supresion de la disminucion en la tasa de supervivencia celular. (Evaluacion de la relacion entre el cambio en la concentracion de
dextrano y el efecto sinergico a una concentracion de trehalosa fija del 3 % (p/v))
1-1 Material
1-1-1 Solucion para el trasplante celular
[0038] S: solucion salina normal de Otsuka (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR 1 % D: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 1 % (p/v)
LR 3 % D: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 3 % (p/v)
LR 5 % D: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v)
LR 7 % D: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 7 % (p/v)
LR 3 % T: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v)
LR 3 % T 1 % D: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y que contiene dextrano al 1 % (p/v)
LR 3 % T 3 % D: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y que contiene dextrano al 3 % (p/v)
LR 3 % T 5 % D: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y que contiene dextrano al 5 % (p/v)
LR 3 % T 7 % D: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y que contiene dextrano al 7 % (p/v)
1-1-2 Preparacion de la solucion para el trasplante celular
[0039]
1) La inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) (solucion "LR 3 % T") se preparo anadiendo y disolviendo trehalosa (de Hayashibara Co., Ltd.) en la inyeccion de Lactec (solucion LR).
2) Se preparo una inyeccion de Lactec que contenla trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 10 % (p/v) ("LR 3 % T 10 % D") anadiendo y disolviendo trehalosa (de Hayashibara Co., Ltd.) en inyeccion Low Molecular Dextran L Injection (inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 10 % [p/v]) (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (solucion "LR 10 % D").
3) Las inyecciones de Lactec que contienen concentraciones predeterminadas (1, 3, 5 y 7 % [p/v]) de dextrano (soluciones "LR 1, 3, 5 y 7 % D") se prepararon diluyendo la solucion "LR 10 % D" con la solucion LR.
4) Las inyecciones de Lactec que contienen trehalosa al 3 % (p/v) y concentraciones predeterminadas (1, 3, 5 y 7 % [p/v]) de dextrano ("soluciones LR 3 % T 1, 3, 5, y 7 % D" se prepararon diluyendo la solucion "LR 3 % T 10 % D" con la solucion "LR 3 % T".
1-1-3 Preparacion de celulas de mamlfero
[0040] Se prepararon celulas madre mesenquimales humanas de medula osea [hMSC-BM] (de Lonza Co., Ltd.) de acuerdo con los procedimientos descritos en [1] a [8] a continuacion y se usaron en el presente experimento.
[1] Se cultivaron hMSC-BM en una incubadora de CO2 al 5 % a 37 °C en presencia de un kit de medio especlfico para celulas madre mesenquimales humanas (de Lonza Co., Ltd.) (en lo sucesivo denominado "medio MSC") utilizando un matraz de 75 cm1234. El estado de las celulas se observo bajo un microscopio y el cultivo se realizo hasta que se alcanzo un estado confluente de aproximadamente el 80 %.
[2] El medio MDC se elimino utilizando un aspirador, y las hMSC-BM se enjuagaron con 8 ml/matraz de PBS (de Invitrogen Co., Ltd.).
[3] Se elimino el PBS utilizando un aspirador y se anadieron 3,75 ml/matraz de tripsina-EDTA (de Lonza Co., Ltd.), seguido de reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos.
[4] La agitacion se llevo a cabo de manera lenta, mientras que se observaron hMSC-BM bajo un microscopio hasta que se separo aproximadamente el 90 % de las mismas.
[5] Se anadieron 3,75 ml/matraz del medio MSC para detener la reaccion de tripsina, y se recuperaron las hMSC-BM mediante pipeteo y se transfirio a un tubo de centrlfuga de 50 ml.
[6] La centrifugacion se llevo a cabo a 600 x g y 25 °C durante 5 minutos.
[7] El medio MSC como sobrenadante se elimino utilizando un aspirador, y se anadieron 4 ml/matraz de PBS (de Invitrogen Co., Ltd.), seguido de la suspension de un sedimento de hMSC-BM (precipitado).
[8] Se tomaron 10 pl de la suspension de hMSC-BM; el numero de celulas se midio usando un contador de celulas; y se anadio PBS (de Invitrogen Co., Ltd.) a 5 x 105678celulas/ml, que luego se enfrio con hielo.
1-2 Procedimiento
[0041] Para confirmar que la presente solucion para trasplante celular tenia un efecto sinergico al suprimir una disminucion en la tasa de supervivencia celular, se llevo a cabo un experimento de acuerdo con los
procedimientos descritos en [1] a [3] a continuacion.
[1] La suspension de hMSC-BM preparada en la etapa [7] de la "1-1-3 Preparacion de celulas de mamlfero" descrita anteriormente se dispenso en un tubo de centrlfuga conico de 15 ml utilizando FINPIPETTE (100 a 1000 pl) y se centrifugo a 600 * g y 25 °C durante 5 minutos.
[2] El sobrenadante se aspiro/elimino despues del tratamiento de centrifugacion, y el resultante se suspendio en cada una de las 11 soluciones para trasplante celular y a continuacion se conservo en un refrigerador (bajo condiciones de 4 °C) durante 14 dlas. Para medir la tasa de supervivencia celular antes de la conservacion, se aspiro/elimino el sobrenadante despues del tratamiento de centrifugacion y a continuacion se suspendio el resultante en PBS (de Invitrogen Co., Ltd.), seguido inmediatamente por la toma de una porcion (20 pl) de la suspension, mezclando la porcion con 20 pl de solucion de tincion de azul de tripano (de Gibco Co., Ltd.) y a continuacion midiendo el numero total de celulas y el numero de celulas muertas utilizando un contador de celulas bajo un microscopio para evaluar la tasa de celulas vivas (vease "P" en la Figura 1).
[3] Despues de conservar las hMSC-BM en la solucion para el trasplante celular durante 14 dlas, la agitacion (se pipeteo 5 veces a un volumen de llquido de 500 pl) se realizo suavemente en un estado en el que el extremo de una punta se inserto visualmente del orden de 5 mm desde la parte inferior para formar celulas en un estado suspendido, y una porcion (20 pl) de la suspension se tomo en un microtubo de 1,5 ml, mezclado con 20 pl de solucion de tincion de azul de tripano (de Gibco Co., Ltd.), y a continuacion se midio el numero total de celulas y el numero de celulas muertas utilizando un contador de celulas bajo un microscopio para evaluar la tasa de celulas vivas.
1-3 Resultado
[0042] Los resultados de evaluar la tasa de celulas vivas se muestran en la Tabla 1 y la Figura 1. Cuando las hMSC-BM se conservaron en la solucion S y en la solucion LR, se observaron pocas hMSC-BM supervivientes (menos del 1 % para la solucion S y el 1 % para la solucion LR), mientras que cuando las hMSC-BM se conservaron en la solucion "LR 1, 3, 5 y 7 % D", el porcentaje de hMSC-BM supervivientes aumento al 4 %, 9 %, 12 % y 20 %, respectivamente (Tabla 1 y Figura 1). Cuando las hMSC-BM se conservaron en la solucion "LR 3 % T", el porcentaje de hMSC-BM supervivientes tambien aumento al 4 % (Tabla 1 y Figura 1). Estos resultados muestran que, aunque la conservacion a largo plazo de celulas de mamlferos, como hMSC-BM, en solucion salina o una solucion acuosa fisiologica, tal como solucion de lactato de Ringer, resulta en la muerte de la mayorla de las celulas, el uso de una solucion acuosa fisiologica que contiene el dextrano o la trehalosa pueden suprimir la muerte celular y aumentar el porcentaje de celulas vivas.
[0043] Cuando las hMSC-BM se conservaron en las soluciones "LR 3 % T 1, 3, 5 y 7 % D", el porcentaje de hMSC-BM supervivientes fue del 11 %, 33 %, 57 % y 50 %, respectivamente y se incremento en comparacion con cuando se conservaron hMSC-BM en la solucion "Lr + 3 % T" (Tabla 1 y Figura 1). Ademas, las tasas de supervivencia celular cuando se utilizaron las soluciones "LR 3 % T" y "LR 1 % D" fueron cada una del 4 %, totalizando el 8 %, mientras que la tasa de supervivencia celular cuando se uso una solucion de "LR 3 % T 1 % D" fue de hasta un 11 % (1,4 veces). De manera similar, los valores de las tasas de supervivencia celular cuando se utilizaron las soluciones "LR 3 % T" y "LR 3 % D" totalizaron el 13 %, mientras que la tasa de supervivencia celular cuando se uso una solucion de "LR 3 % T 3 % D" fue de hasta un 33 % (2,5 veces); los valores de las tasas de supervivencia celular cuando se utilizaron las soluciones "LR 3 % T" y "LR 5 % D" totalizaron el 16 %, mientras que la tasa de supervivencia celular cuando se uso la solucion "LR 3 % T 5 % D" fue de hasta un 57 % (3,6 veces); y los valores de las tasas de supervivencia celular cuando se utilizaron las soluciones "LR 3 % T" y "LR 7 % D" totalizaron el 24 %, mientras que la tasa de supervivencia celular cuando se utilizo la solucion de "LR 3 % T 7 % D" fue de hasta un 50 % (2,1 veces). Estos resultados muestran que el uso combinado del 3 % de trehalosa y alrededor del 5 % (4 a 7 %) de dextrano puede suprimir sinergicamente una disminucion en la tasa de supervivencia celular cuando las celulas de mamlferos, como hMSC-BM, se conservaron durante un largo perlodo y puede aumentar sinergicamente el porcentaje de celulas vivas.
Tabla 1: Tasa de supervivencia (%) de la celula cuando se conserva durante 14 dlas Solucion para el trasplante celular Tasa de supervivencia celular (%)
S 0 ± 1
LR 1 ± 1
LR 1 % D 4 ± 4
LR 3 % D 9 ± 3
LR 5 % D 12 ± 2
LR 7 % D 20 ± 7
LR 3 % T 4 ± 1
LR 3 % T 1 % D 11 ± 3
LR 3 % T 3 % D 33 ± 7
LR 3 % T 5 % D 57 ± 11
LR 3 % T 7 % D 50 ± 17
[0044] Para la "Tasa de supervivencia celular (%)" en la tabla anterior, el porcentaje de celulas vivas basado en el numero total de celulas se muestra como la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica, [n = 4]). La tasa de supervivencia antes de la conservacion fue del "93 ± 2 (%)". Para los 11 tipos de "Solucion para trasplante celular" en la tabla anterior, vease "1-1-1 Solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 1.
[0045] Ademas, se estudio el perlodo de conservacion de hMSC-BM en la solucion para trasplante celular durante 3 dlas y 7 dlas, ademas de 14 dlas. Los resultados se muestran en la Figura 2. Al igual que cuando las hMSC-BM se conservaron durante 14 dlas, se demostro que el uso combinado del 3 % de trehalosa y alrededor del 5 % (4 a 7 %) de dextrano tambien podrla suprimir de manera sinergica una disminucion en la tasa de supervivencia celular cuando las hMSC-BM se conservaron durante un largo perlodo de tiempo y aumenta sinergicamente el porcentaje de celulas vivas, incluso cuando las hMSC-BM se conservaron durante 3 dlas o 7 dlas.
Ejemplo 2
2. La confirmacion 2 de la presente solucion para trasplante celular tiene un efecto sinergico de la supresion de la disminucion de la tasa de supervivencia (evaluacion de la relacion entre el cambio en la concentracion de trehalosa y el efecto sinergico a una concentracion de dextrano fija del 5 % (p/v)
2-1 Material
2-1-1 Solucion para el trasplante celular
[0046] S: Solucion salina normal de Otsuka (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
[0047] LR: inyeccion de Lactec (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR 1 % T: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 1 % (p/v)
LR 3 % T: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v)
LR 5 % T: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 5 % (p/v)
LR 7 % T: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 7 % (p/v)
LR 10 % T: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 10 % (p/v)
LR 5 % D: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v)
LR 5 % D 1 % T: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y que contiene trehalosa al 1 % (p/v)
LR 5 % D 3 % T: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y que contiene trehalosa al 3 % (p/v)
LR 5 % D 5 % T: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y que contiene trehalosa al 5 % (p/v)
LR 5 % D 7 % T: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y que contiene trehalosa al 7 % (p/v)
LR 5 % D 10 % T: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y que contiene trehalosa al 10 % (p/v)
2-1-2 Preparacion de la solucion para el trasplante celular
[0048]
1) La inyeccion de Lactec que contenla dextrano al 5 % (p/v) (solucion "LR 5 % D") se preparo mediante la inyeccion de Lactec de bajo peso molecular (inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 10 % [p/v]) (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) (solucion "LR 10 % D") con la inyeccion de Lactec (solucion Lr ).
2) Se preparo la inyeccion de Lactec que contenla trehalosa al 10 % (p/v) (solucion "LR 10 % T") anadiendo y disolviendo trehalosa (de Hayashibara Co., Ltd.) en la solucion LR.
3) La inyeccion de Lactec que contiene el 5 % (p/v) de dextrano y el 10 % (p/v) de trehalosa ("LR 5 % D 10 % T") se preparo anadiendo y disolviendo trehalosa (de Hayashibara Co., Ltd.) en la solucion "LR 5 % D".
4) Las inyecciones de Lactec que contienen concentraciones predeterminadas (1, 3, 5 y 7 % [p/v]) de trehalosa (soluciones "LR 1, 3, 5 y 7 % T") se prepararon diluyendo la solucion de "LR 10 % T" con la solucion LR. 5) Las inyecciones de Lactec que contienen el 5 % (p/v) dextrano y concentraciones predeterminadas (1, 3, 5 y 7 % [p/v]) de trehalosa (soluciones de "LR 5 % D 1, 3, 5, y 7 % T" se prepararon diluyendo la solucion "LR 5 % D 10 % T" con la solucion "LR 5 % D".
2-2 Resultado
[0049] Despues de preparar hMSC-BM mediante el procedimiento descrito en "1-1-3 Preparacion de celulas de mamlfero" en el Ejemplo 1, se realizo un experimento de acuerdo con los procedimientos descritos en "1-2 Procedimiento" en el Ejemplo 1 utilizando las 13 soluciones para el trasplante celular. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y la Figura 3. Como en los resultados del Ejemplo 1, cuando las hMSC-BM se conservaron en la solucion S y en la solucion LR, se observaron pocas o ninguna hMSC-BM supervivientes (1 % para la solucion S y 0 % para
la solucion LR). Cuando las hMSC-BM se conservaron en las soluciones "LR 1, 3, 5, 7 y 10 % T", los porcentajes de hMSC-BM vivas fueron del 2 %, 6 %, 7 %, 5 % y 3 %, respectivamente, mientras que cuando las hMSC-BM se conservaron en las soluciones "LR 5 % D 1, 3, 5, 7 y 10 % T", los porcentajes de hMSC-BM vivas fueron del 30 %, 48 %, 49 %, 30 % y 14 %, respectivamente, mostrando aumentos sustanciales (Tabla 2 y Figura 3). En particular, las tasas de supervivencia celular cuando se utilizaron las soluciones "LR 5 % D" y "LR 1 % T" fueron del 11 % y 2 %, respectivamente, totalizando el 13 %, mientras que la tasa de supervivencia celular cuando se utilizo la solucion "LR 5 % D 1 % T" fue de hasta un 30 % (2,3 veces). De manera similar, los valores de las tasas de supervivencia celular cuando se utilizaron las soluciones "LR 5 % D" y "LR 3 % T" fueron del 17 %, mientras que la tasa de supervivencia celular cuando se utilizo la solucion "LR 5 % D 3 % T" fue de hasta un 48 % (2,8 veces); los valores de las tasas de supervivencia celular cuando se utilizaron las soluciones "LR 5 % D" y "LR 5 % T" totalizaron el 18 %, mientras que la tasa de supervivencia celular cuando se utilizo la solucion "LR 5 % D 5 % T" fue de hasta un 49 % (2,7 veces); y los valores de las tasas de supervivencia celular cuando se utilizaron las soluciones "LR 5 % D" y "LR 7 % T" totalizaron el 16 %, mientras que la tasa de supervivencia celular cuando se utilizo la solucion de "LR 5 % D 7 % T" fue de hasta un 30 % (1,9 veces). Estos resultados muestran que el uso combinado de alrededor del 3 % (2 a 6 %) de trehalosa y el 5 % de dextrano puede suprimir sinergicamente una disminucion en la tasa de supervivencia celular cuando las celulas de mamlferos, como hMSC-BM, se conservan durante un largo perlodo de tiempo y puede aumentar sinergicamente el porcentaje de celulas vivas.
Tabla 2: Tasa de supervivencia (%) de la celula cuando se conserva durante 14 dlas Solucion para el trasplante celular Tasa de supervivencia celular (%)
S 1 ± 1
LR 0 ± 0
LR 1 % T 2 ± 1
LR 3 % T 6 ± 2
LR 5 % T 7 ± 2
LR 7 % T 5 ± 3
LR 10 % T 3 ± 2
LR 5 % D 11 ± 4
LR 5 % D 1 % T 30 ± 5
LR 5 % D 3 % T 48 ± 3
LR 5 % D 5 % T 49 ± 4
LR 5 % D 7 % T 30 ± 7
LR 5 % D 10 % T 14 ± 5
[0050] Para la "Tasa de supervivencia celular (%)" en la tabla anterior, el porcentaje de celulas vivas basado en el numero total de celulas se muestra como la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica, [n = 4]). La tasa de supervivencia celular antes de la conservacion fue del "95 ± 2 (%)". Para los 13 tipos de "Solucion para el trasplante celular" en la tabla anterior, vease "2-1-1 Solucion para el trasplante celular" en el Ejemplo 2.
[0051] Ademas, se estudio el perlodo de conservacion de hMSC-BM en la solucion para trasplante celular durante 3 dlas y 7 dlas, ademas de 14 dlas. Los resultados se muestran en la Figura 4. Al igual que cuando las hMSC-BM se conservaron durante 14 dlas, se demostro que el uso combinado de alrededor del 3 % (2 a 6 %) de trehalosa y el 5 % de dextrano tambien podrla suprimir de forma sinergica una disminucion en la tasa de supervivencia celular cuando las hMSC-BM se conservan durante un largo perlodo de tiempo y aumentan sinergicamente el porcentaje de celulas vivas, incluso cuando las hMSC-BM se conservaron durante 3 dlas o 7 dlas.
[0052] Al resumir los resultados de los Ejemplos 1 y 2, se demostro que el uso combinado de alrededor del 3 % (2 a 6 %) de trehalosa y alrededor del 5 % (4 a 7 %) de dextrano podrla suprimir sinergicamente una disminucion en la tasa de supervivencia celular cuando las celulas de mamlferos, como las hMSC-BM, se conservaron durante un largo perlodo de tiempo (14 dlas) y pudieron aumentar sinergicamente el porcentaje de celulas vivas.
Ejemplo 3
3. Estudio sobre el efecto de la supresion de la disminucion en la tasa de supervivencia celular cuando se usa una solucion para trasplante celular que tiene una combinacion de dextrano y otro sacarido
3-1 Material
3-1-1 Solucion para trasplante celular
[0053] S: solucion salina normal de Otsuka (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR: inyeccion de Lactec (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LRD: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v)
LRTD: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
LRD GL: una inyeccion de Lactec que contiene glucosa al 1,6 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
LRD SR: una inyeccion de Lactec que contiene sorbitol al 1,6 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
LRD MN: una inyeccion de Lactec que contiene manitol al 1,6 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
LRD LC: una inyeccion de Lactec que contiene lactosa al 3,0 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
LRD RF: una inyeccion de Lactec que contiene rafinosa al 4,8 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
LRD ML: una inyeccion de Lactec que contiene maltosa al 3,0 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
LRD SC: una inyeccion de Lactec que contiene sacarosa al 3,0 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
3-1-2 Preparacion de la solucion para el trasplante celular
[0054]
1) La inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) (solucion "LRD") y la inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v) (solucion "LRTD") se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito en "1-1-2 Preparacion de solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 1.
2) La inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y glucosa al 1,6 % (p/v) (solucion "LRD GL") se preparo anadiendo y disolviendo glucosa (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRD".
3) La inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y sorbitol al 1,6 % (p/v) (solucion "LRD SR") se preparo anadiendo y disolviendo sorbitol (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRD".
4) La inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y manitol al 1,6 % (p/v) (solucion "LRD MN") se preparo anadiendo y disolviendo manitol (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRD".
5) La inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y lactosa al 3,0 % (p/v) se preparo anadiendo y disolviendo lactosa (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRD".
6) La inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y rafinosa al 4,8 % (p/v) (solucion "LRD RF") se preparo anadiendo y disolviendo rafinosa (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRD".
7) La inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y maltosa al 3,0 % (p/v) (solucion "LRD ML") se preparo anadiendo y disolviendo maltosa (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRD".
8) La inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) y sacarosa al 3,0 % (p/v) (solucion "LRD SC") se preparo anadiendo y disolviendo sacarosa (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRD". Los 7 sacaridos (glucosa, sorbitol, manitol, lactosa, rafinosa, maltosa y sacarosa) se sometieron a un ajuste de concentracion para que tuvieran la misma presion osmotica que la de trehalosa al 3 % (p/v).
3- 2 Resultado
[0055] Despues de preparar hMSC-BM mediante el procedimiento descrito en "1-1-3 Preparacion de celulas de mamlfero" en el Ejemplo 1, se realizo un experimento de acuerdo con los procedimientos descritos en "1-2 Procedimiento" en el Ejemplo 1 utilizando las 11 soluciones para trasplante celular. Los resultados se muestran en la Figura 5. Al igual que en los resultados de los Ejemplos 1 y 2, se demostro que el uso combinado de trehalosa y dextrano suprime de forma sinergica una disminucion en la tasa de supervivencia celular cuando se conservaron hMSC-BM durante 14 dlas y aumento la tasa de celulas vivas (comparacion de "LRTD "con" LRD", "LR" o "S" en la Figura 5). Por otro lado, el uso combinado de dextrano con cada uno de los 7 sacaridos (glucosa, sorbitol, manitol, lactosa, rafinosa, maltosa y sacarosa) en lugar de trehalosa cambio poco la tasa de supervivencia celular en comparacion con el uso de dextrano solo (comparacion de "LRD" con "LRD GL", "LRD SR", "LRD MN", "LRD LC", "LRD RF", "LRD ML" o "LRD SC" en la Figura 5). Estos resultados muestran que, a diferencia de la trehalosa, los 7 sacaridos no tienen el efecto de suprimir la muerte celular cuando las celulas de mamlferos, como las hMSC-BM, se conservan durante un largo perlodo de tiempo y aumentan la tasa de celulas vivas en la solucion para el trasplante celular.
Ejemplo 4
4. Estudio sobre el efecto de la supresion de la disminucion en la tasa de supervivencia celular cuando se usa una solucion para trasplante celular que tiene una combinacion de trehalosa y otro sacarido
4- 1 Material
4-1-1 Solucion para el trasplante celular
[0056] S: solucion salina normal de Otsuka (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR: inyeccion de Lactec (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LRT: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v)
LRTD: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
LTD GL: una inyeccion de Lactec que contiene glucosa al 1,6 % (p/v) y trehalosa al 3 % (p/v)
LTD SR: una inyeccion de Lactec que contiene sorbitol al 1,6 % (p/v) y trehalosa al 3 % (p/v)
LTD MN: una inyeccion de Lactec que contiene manitol al 1,6 % (p/v) y trehalosa al 3 % (p/v)
LTD LC: una inyeccion de Lactec que contiene lactosa al 3,0 % (p/v) y trehalosa al 3 % (p/v)
LTD RF: una inyeccion de Lactec que contiene rafinosa al 4,8 % (p/v) y trehalosa al 3 % (p/v)
LTD ML: una inyeccion de Lactec que contiene maltosa al 3,0 % (p/v) y trehalosa al 3 % (p/v)
LTD SC: una inyeccion de Lactec que contiene sacarosa al 3,0 % (p/v) y trehalosa al 3 % (p/v)
4-1-2 Preparacion de la solucion para el trasplante celular
[0057]
1) La inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) (solucion "LRT") y la inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v) (solucion "LRTD") se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito en "1-1-2 Preparacion de solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 1.
2) La inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y glucosa al 1,6 % (p/v) (solucion "LRT GL") se preparo anadiendo y disolviendo glucosa (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRT".
3) La inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y sorbitol al 1,6 % (p/v) (solucion "LRT SR") se preparo anadiendo y disolviendo sorbitol (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRT".
4) La inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y manitol al 1,6 % (p/v) (solucion "LRT MN") se preparo anadiendo y disolviendo manitol (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRT".
5) La inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y lactosa al 3,0 % (p/v) se preparo anadiendo y disolviendo lactosa (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRT".
6) La inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y rafinosa al 4,8 % (p/v) (solucion "LRT RF") se preparo anadiendo y disolviendo rafinosa (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRT".
7) La inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y maltosa al 3,0 % (p/v) (solucion "LRT ML") se preparo anadiendo y disolviendo maltosa (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRT".
8) La inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y sacarosa al 3,0 % (p/v) (solucion "LRT SC") se preparo anadiendo y disolviendo sacarosa (de Wako Pure Chemical Industries Ltd.) en la solucion "LRT". Los 7 sacaridos (glucosa, sorbitol, manitol, lactosa, rafinosa, maltosa y sacarosa) se sometieron a un ajuste de concentracion para que tuvieran la misma presion osmotica que la de dextrano al 5 % (p/v).
Resultado
[0058] Despues de preparar hMSC-BM mediante el procedimiento descrito en "1-1-3 Preparacion de celulas de mamlfero" en el Ejemplo 1, se realizo un experimento de acuerdo con los procedimientos descritos en "1-2 Procedimiento" en el Ejemplo 1 utilizando las 11 soluciones para trasplante celular. Los resultados se muestran en la Figura 6. Como en los resultados de los Ejemplos 1 a 3, se demostro que el uso combinado de dextrano y trehalosa suprime de forma sinergica una disminucion en la tasa de supervivencia celular cuando las celulas se conservaron durante 14 dlas y aumenta la tasa de celulas vivas con "LRT", "LR" o "S" en la Figura 6). Por otro lado, el uso combinado de trehalosa con cada uno de los 7 sacaridos (glucosa, sorbitol, manitol, lactosa, rafinosa, maltosa y sacarosa) cambio la tasa de supervivencia celular en comparacion con el uso de trehalosa sola (comparacion de "LRT" con "LRT GL", "LRT SR", "LRT MN", "LRT LC", "LRT RF", "LRT ML" o "LRT SC" en la Figura 6). Estos resultados muestran que, a diferencia del dextrano, los 7 sacaridos no tienen el efecto de suprimir la muerte celular cuando las celulas de mamlferos, como las hMSC-BM, se conservan durante un largo perlodo de tiempo y aumentan la tasa de celulas vivas en la solucion para el trasplante celular.
[0059] Ademas, se realizo un experimento cuando cada uno de los 7 sacaridos (glucosa, sorbitol, manitol, lactosa, rafinosa, maltosa y sacarosa) se uso solo sin combinacion con trehalosa o dextrano para confirmar que los 7 sacaridos no tuvieron el efecto de suprimir la muerte celular cuando las celulas de mamlferos, como las hMSC-BM, se conservaron durante un largo perlodo de tiempo y aumentaron la tasa de celulas vivas en la solucion para el trasplante celular (Figura 7).
Ejemplo 5
5. Estudio sobre la solucion acuosa fisiologica en la presente solucion para trasplante celular
Material
5-1-1 Solucion para trasplante celular
[0060] LR: inyeccion de Lactec (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LRTD: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
S: solucion salina normal de Otsuka (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
STD: solucion salina normal de Otsuka que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
5 % de glucosa: INYECCION DE GLUCOSA OTSUKA 5 % (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) Glucosa 5 % TD: INYECCION DE GLUCOSA OTSUKA 5 % que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
Ringer: Solucion de Ringer "OTSUKA" (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
Ringer TD: solucion de Ringer "OTSUKA" que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v) Veen: Veen F Infusion (de Kowa Pharmaceutical Co., Ltd.)
Veen TD: Veen F Infusion que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
5-1-2 Preparacion de la solucion para el trasplante celular
[0061]
1) La inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v) (solucion "LDT") y la inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v) (solucion "LRTD") se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito en "1-1-2 Preparacion de solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 1.
2) La solucion salina normal de Otsuka que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v) (solucion "STD") se preparo anadiendo y disolviendo trehalosa (de Hayashibara Co., Ltd.) y dextrano 40 (de Meito Sangyo Co., Ltd.) en solucion salina normal de Otsuka (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.).
3) La INYECCION DE GLUCOSA OTSUKA 5 % que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v) (solucion "Glucosa TD" al 5 %) se preparo anadiendo y disolviendo trehalosa (de Hayashibara Co., Ltd.) y dextrano 40 (de Meito Sangyo Co., Ltd.) en INYECCION DE GLUCOSA OTSUKA 5 % (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.).
4) La solucion de Ringer "OTSUKA" (solucion "Ringer TD") que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v) se preparo anadiendo y disolviendo trehalosa (de Hayashibara Co., Ltd.) y dextrano 40 (de Meito Sangyo Co., Ltd.) en la Solucion de Ringer "OTSUKA" (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.).
5) Veen F Infusion que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v) se preparo anadiendo y disolviendo trehalosa (de Hayashibara Co., Ltd.) y dextrano 40 (de Meito Sangyo Co)., Ltd.) en Veen F Infusion (de Kowa Pharmaceutical Co., Ltd.).
5- 2 Resultado
[0062] Despues de preparar hMSC-BM mediante el procedimiento descrito en "1-1-3 Preparacion de celulas de mamlfero" en el Ejemplo 1, se realizo un experimento de acuerdo con los procedimientos descritos en "1-2 Procedimiento" en el Ejemplo 1 utilizando las 10 soluciones para trasplante celular. Los resultados se muestran en la Figura 8. El uso de Solucion Salina Normal Otsuka (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.), la Solucion de Ringer "OTSUKA" (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.), o Veen F Infusion (de Kowa Pharmaceutical Co., Ltd.) como solucion acuosa fisiologica en la solucion para el trasplante celular se demostro que suprime la muerte celular cuando las hMSC-BM se conservan durante 14 dlas y aumenta la tasa de celulas vivas en la solucion para el trasplante celular (la comparacion de "S" con "STD", la comparacion de "Ringer" con "Ringer TD", o la comparacion de "Veen" con "Veen TD" en la Figura 8). Por otro lado, con el uso de INYECCION DE GLUCOSA OTSUKA 5 % (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) no se observo la supresion de la muerte celular cuando las hMSC-BM se conservaron durante 14 dlas (comparacion de "5 % de glucosa" con "5 % de glucosa TD" en la Figura 8). Los resultados anteriores muestran que se observa el efecto de suprimir una disminucion en la tasa de celulas vivas mediante el uso combinado de trehalosa y dextrano cuando se utiliza al menos cada una de la solucion salina, la solucion de lactato de Ringer, la solucion de Ringer y la solucion de acetato de Ringer como solucion acuosa fisiologica.
Ejemplo 6
6. La confirmacion 3 de la presente solucion para trasplante celular tiene un efecto sinergico de la supresion de la disminucion en la tasa de supervivencia celular (evaluacion utilizando celulas de mamlfero distintas de hMSC-BM)
[0063] Se confirmo si el efecto de suprimir una disminucion en la tasa de supervivencia celular por la presente solucion para el trasplante celular se observaba de manera similar cuando se utilizaron celulas de mamlferos distintas de hMSC-BM.
6- 1 Material
6-1-1 Solucion para el trasplante celular
[0064] S: solucion salina normal de Otsuka (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LR: inyeccion de Lactec (de Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)
LRT: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v)
LRD: una inyeccion de Lactec que contiene dextrano al 5 % (p/v)
LRTD: una inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v)
6-1-2 Preparacion de la solucion para el trasplante celular
[0065] La inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) (solucion "LRT"), la inyeccion de Lactec
que contiene dextrano al 5 % (p/v) (solucion "LRD") y la inyeccion de Lactec que contiene trehalosa al 3 % (p/v) y dextrano al 5 % (p/v) (solucion "LRTD") se preparo de acuerdo con el procedimiento descrito en "1-1-2 Preparacion de solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 1.
6-2 Procedimiento
[0066]
[1] Se anadio medio RPMI (18 ml) (de Gibco Co., Ltd.) a temperatura ambiente a un tubo de centrlfuga conico de 50 ml.
[2] La tapa de un contenedor de conservacion (vial) en el que se conservaron celulas T de sangre periferica humana (hPBT) (de CELL APPLICATIONS, INC.) por congelacion se aflojaron para liberar la presion, y a continuacion se cerro la tapa.
[3] Las celulas se descongelaron mientras se agitaban ligeramente en una incubadora a 37 °C.
[4] Las celulas descongeladas se transfirieron al tubo de centrlfuga conico al que se anadio el medio RPMI anterior.
[5] El tratamiento de centrifugacion se llevo a cabo a 400 x g y 25 °C durante 5 minutos, y las celulas se recuperaron aspirando el sobrenadante y se suspendieron en 10 ml/vial de PBS (de Invitrogen Co., Ltd.).
[6] El numero de celulas se midio utilizando un contador de celulas y se anadio PBS (de Invitrogen Co., Ltd.) a 5 x 105 celulas/ml, seguido de enfriamiento con hielo.
[7] La suspension celular (0,5 ml) se dispenso en cada uno de 12 tubos de centrlfuga conicos de 15 ml usando FINPIPETTE (100 a 1000 pl) y se sometio a un tratamiento de centrifugacion a 400 x g y 25 °C durante 5 minutos para recuperar las celulas.
[8] El sobrenadante se aspiro/elimino, y se suspendieron hPBT en cada una de las 5 soluciones para trasplante celular y a continuacion se conservaron en un refrigerador (en condiciones de 4 °C). Para medir la tasa de supervivencia celular antes de la conservacion, se aspiro/elimino el sobrenadante despues del tratamiento de centrifugacion y a continuacion se suspendio el resultante en PBS (de Invitrogen Co., Ltd.), seguido inmediatamente por la toma de una porcion (20 pl) de la suspension, mezclando la porcion con 20 pl de solucion de tincion de azul de tripano (de Gibco Co., Ltd.) y a continuacion midiendo el numero total de celulas y el numero de celulas muertas utilizando un contador de celulas bajo un microscopio para evaluar la tasa de celulas vivas (vease "P" en la Figura 9).
[9] Despues de conservar las hPBT en la solucion para trasplante celular, se realizo una agitacion suavemente (pipeteo 5 veces a un volumen de llquido de 250 pl) en un estado en el que se inserto el extremo de una punta visualmente en una posicion del orden de 5 mm desde el fondo para formar celulas en estado suspendido el dla 1, el dla 3, el dla 7 y el dla 14 de conservacion, y se tomo una porcion (20 pl) de la suspension en un microtubo de 1,5 ml, mezclado con 20 pl de solucion de tincion de azul de tripano (de Gibco Co., Ltd.), y a continuacion se midio el numero total de celulas y el numero de celulas muertas utilizando un contador de celulas bajo un microscopio para evaluar la tasa de celulas vivas.
6-3 Resultado
[0067] Los resultados de evaluar la tasa de celulas vivas se muestran en la Tabla 3 y la Figura 9. Las tasas de supervivencia celular cuando se conservaron las hPBT en la solucion S y la solucion LR durante 1 dla se redujeron al 18 % y al 29 %, respectivamente ("S" y "LR" 1 dla despues del inicio de la conservacion en la Tabla 3 y la Figura 9). Las tasas de supervivencia celular cuando se conservaron las hPBT en la solucion LRT y la solucion LRD durante 1 dla se mejoraron al 37 % y 49 %, respectivamente, sin diferencias significativas ("LRT" y "LRD" 1 dla despues del inicio de la conservacion en la Tabla 3 y la Figura 9). Por otro lado, la tasa de supervivencia celular cuando se conservaron las hPBT en la solucion LRTD durante 1 dla fue de hasta un 82 % con una diferencia significativa en comparacion con la que se conservo en la solucion LR ("LRTD" 1 dla despues del inicio de conservacion en la Tabla 3 y la Figura 9). Estos resultados muestran que el uso combinado de trehalosa y dextrano puede suprimir efectivamente una disminucion en la tasa de supervivencia celular de hPBT.
[0068] El efecto del uso combinado de trehalosa y dextrano se hizo mas notable cuando las hPBT se conservaron durante 3 dlas, 7 dlas y 14 dlas. Especlficamente, el uso combinado de trehalosa y dextrano hizo que la tasa de supervivencia celular fuera dos veces o incluso mas alta que el uso de trehalosa o dextrano solo, y se observo que el uso combinado de trehalosa y dextrano tenia un efecto sinergico ("LRTD" a los 3 dias, 7 dias y 14 dias despues del inicio de la conservacion en la Tabla 3 y la Figura 9). Particularmente para la conservacion de 7 dias, los porcentajes de hPBT que sobrevivieron en la solucion de LRT y la solucion de LRD fueron del 13 % y 17 %, respectivamente, totalizando un 30 %, mientras que el porcentaje de hPBT que sobrevivieron en la solucion de LRTD fue del 57 % (1,9 veces), mostrando el alto efecto sinergico del uso combinado de trehalosa y dextrano. Estos resultados muestran que el efecto de suprimir una disminucion en la tasa de celulas vivas mediante el uso combinado de trehalosa y dextrano tambien se observa de manera similar cuando se usan celulas de mamiferos (hPBT) distintas de hMSC-BM.
Tabla 3: Tasa de supervivencia celular (%) cuando se conservaron las hPBT
Solucion para el trasplante celular 1 dla 3 dlas 7 dlas 14 dlas
S 18 ± 12 4 ± 4 1 ± 1 0 ± 0
LR 29 ± 21 22 ± 15 8 ± 5 4 ± 3
LRT 37 ± 17 22 ± 11 13 ± 7 11 ± 6
LRD 49 ± 13 25 ± 18 17 ± 7 16 ± 7*
LRTD 82 ± 7*** 66 ± 19*** 57 ± 14*** 32 ± 8***
[0069] Para la "Tasa de supervivencia celular (%)" en la tabla anterior, el porcentaje de celulas vivas basado en el numero total de celulas se muestra como la tasa de supervivencia celular (%) (media ± desviacion tlpica, [n = 6]). "*" y "***" en la tabla muestran que existen diferencias estadlsticamente significativas (P <0,05 y P <0,001, respectivamente) contra LR segun la prueba de Dunnett. La tasa de supervivencia celular antes de la conservacion fue del "92 ± 3 (%)". Para los 5 tipos de "Solucion para trasplante celular" en la tabla anterior, vease "6-1-1 Solucion para trasplante celular" en el Ejemplo 6.
Aplicabilidad industrial
[0070] La presente invencion puede proporcionar una suspension celular de buena calidad capaz de suprimir una disminucion en la tasa de supervivencia celular cuando la suspension celular que contiene celulas madre, como MSC, y leucocitos, como celulas T, se conserva durante un largo perlodo de tiempo y, por lo tanto, es util en el campo del trasplante medico en medicina regenerativa o similar y en el campo del tratamiento del cancer.
Claims (5)
1. Un procedimiento para conservar una celula de mamlfero en una solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular que comprende del 2,0 al 6,0 % (p/v) de trehalosa, o una sal de la trehalosa, y del 4,0 al 7,0 % (p/v) de dextrano, o una sal del dextrano, en el que la celula de mamlfero se conserva en la solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular durante 1 a 14 dlas.
2. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la solucion acuosa fisiologica se selecciona del grupo que consiste en solucion de lactato de Ringer, solucion salina, solucion de Ringer y solucion de acetato de Ringer.
3. El procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la celula de mamlfero se conserva en la solucion acuosa fisiologica para el trasplante celular durante 3 a 14 dlas.
4. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la celula de mamlfero es una celula madre mesenquimal de mamlfero o celula T de mamlfero.
5. El procedimiento segun la reivindicacion 4, en el que la celula madre mesenquimal de mamlfero es una celula madre mesenquimal humana de medula osea y la celula T de mamlfero es una celula T de sangre periferica humana.
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