ES2694629T3

ES2694629T3 - Métodos y composiciones para modificaciones genéticas objetivo y métodos de uso

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Publication number: ES2694629T3
Application number: ES15745288.9T
Authority: ES
Inventors: David Frendewey; Gustavo Droguett; Anthony Gagliardi; Junko Kuno; Wojtek Auerbach; David M. Valenzuela
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2018-12-26
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: DK3161128T3; JP6889762B2; CA2953559C; US20160046960A1; US20150376651A1; RU2771532C2; HRP20181630T1; LT3161128T; RS58009B1; IL249637A0; AU2021201239A1; AU2015279642A1; EP3161128A2; WO2015200805A2; PL3161128T3; JP2017518758A; CN113322277A; MX2019012311A; SG10201911411YA; EP3161128B1

Abstract

Un método para modificar un locus genómico objetivo en un cromosoma Y en una célula, que comprende: (a) proporcionar la célula que comprende el locus genómico objetivo en el cromosoma Y, en donde el locus genómico objetivo comprende un sitio de reconocimiento para un agente de nucleasa, y en el que la célula está en un cultivo que comprende un medio base DMEM; (b) la introducción en la célula: (i) del agente de nucleasa, en el que el agente de nucleasa induce un corte o ruptura de la cadena doble en el sitio de reconocimiento; y (ii) de un vector de direccionamiento grande que comprende un polinucleótido de inserción flanqueado por los brazos de homología primero y segundo correspondientes a los sitios objetivo primero y segundo ubicados dentro del locus genómico objetivo, en donde la suma total del primer brazo de homología y el segundo brazo de homología es al menos de 10 kb, y en el que el vector de direccionamiento experimenta recombinación homóloga con el locus genómico objetivo; e (c) identificar al menos una célula que comprende en su genoma el polinucleótido de inserción integrado en el locus genómico objetivo, en donde la integración del polinucleótido de inserción introduce una modificación genética que comprende la eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico y la sustitución con una secuencia exógena de ácido nucleico en el locus genómico objetivo, en el que la célula no se produce mediante un proceso que implica modificar la identidad genética de la línea germinal de los seres humanos o que implica el uso de un embrión humano para fines industriales o comerciales, y en el que el método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

Description

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Los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido", usados indistintamente en este documento, incluyen formas poliméricas de aminoácidos de cualquier longitud, incluidos los aminoácidos codificados y no codificados y los aminoácidos derivados o modificados química o bioquímicamente. Los términos también incluyen polímeros que se han modificado, tales como polipéptidos que tienen esqueletos peptídicos modificados.

Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido", usados indistintamente en este documento, incluyen formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, incluidos ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, o análogos o versiones modificadas de los mismos. Incluyen ADN o ARN de cadena simple, doble y múltiple, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN y polímeros que comprenden bases de purina, bases de pirimidina u otras sustancias naturales, modificadas químicamente, modificadas bioquímicamente, no naturales, o bases de nucleótidos derivadas. Por simplicidad, el tamaño del ácido nucleico puede referirse en pb si el ácido nucleico está en forma de doble cadena o de cadena sencilla, en este último caso, siendo los pb los que se forman cuando el ácido nucleico de cadena sencilla se duplica con su cadena exactamente complementaria.

La "optimización de codones" generalmente incluye un proceso de modificación de una secuencia de ácido nucleico para la expresión mejorada en células huésped particulares reemplazando al menos un codón de la secuencia nativa con un codón que se usa más frecuentemente o lo más frecuentemente en los genes de célula huésped manteniendo la secuencia nativa de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína Cas puede modificarse para sustituir codones que tienen una mayor frecuencia de uso en una célula procariota o eucariota dada, incluida una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula humana, una célula no humana, una célula de mamífero, una célula de roedor, una célula de ratón, una célula de rata, una célula de hámster o cualquier otra célula huésped, en comparación con la secuencia de ácido nucleico que se produce naturalmente. Las tablas de uso de codones están disponibles, por ejemplo, en la "Base de datos de uso de codones". Estas tablas se pueden adaptar de varias maneras. Véase Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28: 292. Los algoritmos informáticos para la optimización de codones de una secuencia particular para la expresión en un huésped particular también están disponibles (véase, por ejemplo, Gene Forge).

"Enlace operable" o que está "operativamente enlazado" incluye la yuxtaposición de dos o más componentes (por ejemplo, un promotor y otro elemento de secuencia) de modo que ambos componentes funcionen normalmente y permitan la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar una función que se ejerce sobre al menos uno de los otros componentes. Por ejemplo, un promotor puede estar unido operativamente a una secuencia de codificación si el promotor controla el nivel de transcripción de la secuencia de codificación en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores de la transcripción.

"Complementariedad" de ácidos nucleicos significa que una secuencia de nucleótidos en una cadena de ácido nucleico, debido a la orientación de sus grupos nucleobásicos, forma enlaces de hidrógeno con otra secuencia en una cadena opuesta de ácido nucleico. Las bases complementarias en el ADN son típicamente A con T y C con G. En el ARN, son típicamente C con G y U con A. La complementariedad puede ser perfecta o sustancial/suficiente. La perfecta complementariedad entre dos ácidos nucleicos significa que los dos ácidos nucleicos pueden formar un dúplex en el que cada base en el dúplex está unida a una base complementaria por el emparejamiento de Watson-Crick. Complementariedad "sustancial" o "suficiente" significa que una secuencia en una cadena no es completa y/o perfectamente complementaria a una secuencia en una cadena opuesta, pero que se produce una unión suficiente entre las bases en las dos cadenas para formar un complejo híbrido estable junto con las condiciones de hibridación

(p. ej., concentración de sal y temperatura). Dichas condiciones se pueden predecir utilizando las secuencias y los cálculos matemáticos estándar para predecir la Tm de las cadenas hibridadas, o mediante la determinación empírica de Tm utilizando métodos de rutina. Tm incluye la temperatura a la cual una población de complejos de hibridación formados entre dos cadenas de ácido nucleico está desnaturalizada al 50%. A una temperatura por debajo de la Tm, se favorece la formación de un complejo de hibridación, mientras que a una temperatura por encima de la Tm, se favorece la fusión o separación de las cadenas en el complejo de hibridación. La Tm puede estimarse para un ácido nucleico que tenga un contenido conocido de G + C en una solución acuosa de NaCl 1 M utilizando, por ejemplo, Tm = 81,5 + 0,41 (% de G + C), aunque otros cálculos de Tm conocidos tienen en cuenta las características estructurales del ácido nucleico.

La "condición de hibridación" incluye el entorno acumulativo en el que una cadena de ácido nucleico se une a una segunda cadena de ácido nucleico mediante interacciones complementarias de cadena y enlaces de hidrógeno para producir un complejo de hibridación. Tales condiciones incluyen los componentes químicos y sus concentraciones (por ejemplo, sales, agentes quelantes, formamida) de una solución acuosa u orgánica que contiene los ácidos nucleicos, y la temperatura de la mezcla. Otros factores, como la duración del tiempo de incubación o las dimensiones de la cámara de reacción pueden contribuir al medio ambiente. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, págs. 1.90-1.91, 9.47-9.51, 11.47-11.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque son posibles los desajustes entre las bases. Las condiciones apropiadas para la hibridación entre dos ácidos nucleicos dependen de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de complementación entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de la temperatura de fusión (Tm) para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. Para las hibridaciones

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como se usa en el presente documento, incluye una célula totipotente o pluripotente derivada de embrión que es capaz de contribuir a cualquier tejido del embrión en desarrollo tras la introducción en un embrión.

El término "animal", en referencia a células, células pluripotentes y/o totipotentes, células XY, células ES, células iPS, células donantes y/o embriones huésped, incluye mamíferos, peces y aves. Los mamíferos incluyen, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, monos, simios, perros, caballos, toros, venados, bisontes, ovejas, roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres, cobayas), ganado (por ejemplo, especies bovinas, por ejemplo, vacas, novillos, etc., especies ovinas, por ejemplo, ovejas, cabras, etc., y especies porcinas, por ejemplo, cerdos y jabalíes). Las aves incluyen, por ejemplo, pollos, pavos, avestruces, gansos, patos, etc. También se incluyen animales domesticados y animales agrícolas. La frase "animal no humano", en referencia a células, células XY, células ES, células donantes y/o embriones huésped, excluye a los humanos.

En realizaciones específicas, la célula pluripotente es una célula ES XY humana, una célula iPS XY humana, una célula ES XY adulta humana, una célula ES progenitora humana con desarrollo restringido, una célula ES XY no humana, una célula iPS XY no humana, una célula ES XY de roedor, una célula iPS XY de roedor, una célula ES XY de ratón, una célula iPS XY de ratón, una célula ES XY de rata, una célula iPS XY de rata, una célula ES XY de hámster, una célula iPS XY de hámster, una célula ES XY de mono, una célula iPS XY de mono, una célula ES XY de mamífero agrícola, una célula iPS XY agrícola, una célula ES XY de mamífero domesticado o una célula iPS XY domesticada. Además, la célula ES XY o la célula iPS XY pueden ser de una cepa consanguínea, una cepa híbrida

o una cepa exógama. Se reconoce además que las células XY pluripotentes y/o totipotentes pueden comprender un cariotipo XYY o un cariotipo XXY.

Las células de ratón pluripotentes y/o totipotentes (es decir, células ES XY o células iPS XY) pueden ser de una cepa 129, una cepa C57BL/6, una mezcla de 129 y C57BL/6, una cepa BALB/c, o una cepa Swiss Webster. En una realización específica, el ratón es 50% 129 y 50% C57BL/6. En una realización, el ratón es una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2. Véase, por ejemplo, Festinget al. (1999) Mammalian Genome10: 836). En una realización, el ratón es una cepa C57BL, y en una realización específica es de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/6NTac, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, o C57BL/Ola. En una realización específica, el ratón es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En otra realización específica, el ratón es una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En una realización específica, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En algunas realizaciones, la célula ES XY de ratón comprende un cromosoma Y derivado de la cepa 129.

En otra realización más, la célula ES de ratón XY es una célula ES de ratón VGF1. Las células ES de ratón VGF1 (también conocidas como F1H4) se derivaron de embriones híbridos producidos al cruzar un ratón hembra C57BL/6NTac con un ratón macho 129S6/SvEvTac. Por lo tanto, las células ES de VGF1 contienen un cromosoma Y del ratón 129S6/SvEvTac. Véase, por ejemplo, Auerbach, W. et al. (2000) Establishment and chimera analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-derived mouse embryonic stem cell lines. Biotechniques 29, 1024-1028, 1030, 1032.

Una célula pluripotente y/o totipotente de rata (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) puede ser de cualquier cepa de rata, incluida, entre otras, una cepa de rata ACI, una cepa de rata Dark Agouti (DA), una cepa de rata Wistar, una cepa de rata LEA, una cepa de rata Sprague Dawley (SD) o una cepa de rata Fischer tal como Fisher F344 o Fisher F6. Las células pluripotentes y/o totipotentes de rata (es decir, células ES XY o células iPS XY) también pueden obtenerse a partir de una cepa derivada de una mezcla de dos o más cepas citadas anteriormente. En una realización, la célula pluripotente y/o totipotente de rata (es decir, célula ES XY o célula iPS XY) se deriva de una cepa seleccionada de una cepa DA y una cepa ACI. En una realización específica, la célula pluripotente y/o totipotente de rata (es decir, célula ES XY o célula iPS XY) se deriva de una cepa ACI. La cepa de rata ACI se caracteriza por tener agutí negro, con vientre y patas blancas y un haplotipo RT1av1. Dichas cepas están disponibles a partir de una variedad de fuentes, incluidos los Laboratorios Harlan. En otras realizaciones, las diversas células pluripotentes y/o totipotentes de rata (es decir, célula ES XY o célula iPS XY) son de una cepa de rata Dark Agouti (DA), que se caracteriza por tener una capa de agutí y un haplotipo RT1av1. Tales ratas están disponibles en una variedad de fuentes, incluyendo Charles River y Harlan Laboratories. En una realización adicional, las células pluripotentes y/o totipotentes de rata (es decir, células ES XY o células iPS XY) son de una cepa de rata endogámica. En realizaciones específicas, la línea de células ES de rata es de una rata ACI y comprende la célula ES de rata ACI.G1. En otra realización, la línea de células ES de rata es de una rata DA y comprende la línea de células ES de rata DA.2B o la línea de células ES de rata DA.2C. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de utilidad de EE.UU. No. 14/185.703, presentada el 20 de febrero de 2014.

En diversas realizaciones, la célula pluripotente y/o totipotente (es decir, la célula ES XY o la célula iPS XY), la célula del donante y/o el embrión huésped no son de uno o más de los siguientes: Akodon spp., Myopus spp., Microtus spp., Talpa spp. En diversas formas de realización, la célula del donante y/o el embrión huésped no son de ninguna especie cuya característica normal de tipo silvestre sea la fertilidad femenina XY. En varias realizaciones, cuando una modificación genética está presente en la célula pluripotente y/o totipotente (es decir, célula ES XY o célula iPS XY), la célula del donante o el embrión huésped, la modificación genética no es una XYY o XXY, una inversión de

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documento para modificar el locus genómico en el cromosoma Y se pueden usar para introducir una modificación genética escogida en el gen Sry.

En otras realizaciones, la actividad y/o el nivel del polipéptido Sry se reducen o eliminan introduciendo en la célula un polinucleótido que inhibe el nivel o la actividad del polipéptido Sry. El polinucleótido puede inhibir la expresión del polipéptido Sry directamente, impidiendo la traducción del ARN mensajero de Sry, o indirectamente, codificando un polipéptido que inhibe la transcripción o traducción del gen que codifica una proteína Sry. En otras realizaciones, la actividad del polipéptido Sry se reduce o elimina introduciendo en la célula una secuencia que codifica un polipéptido que inhibe la actividad del polipéptido Sry.

En una realización, las células pluripotentes y/o totipotentes XY (es decir, células ES XY o células iPS XY) comprenden un alelo Sry condicional que reduce la actividad y/o el nivel de la proteína Sry. Un "alelo Sry condicional" incluye un gen Sry modificado manipulado para tener el nivel y/o actividad disminuidos de la proteína Sry en un tiempo de desarrollo deseado y/o dentro de un tejido de interés deseado. El nivel y/o la actividad reducidos se pueden comparar con una célula de control que carece de la modificación que da lugar al alelo condicional, o en el caso de una actividad reducida en un tiempo de desarrollo deseado con tiempos anteriores y/o posteriores, o en el caso de un tejido deseado, con una actividad media de todos los tejidos. En una realización, el alelo Sry condicional comprende un alelo condicional nulo de Sry que puede desconectarse en un punto de tiempo de desarrollo deseado y/o en tejidos específicos. Este alelo condicional se puede utilizar para crear hembras XY fértiles derivadas de cualquier clon de reconocimiento génico. Como se describe en otra parte en este documento, un método de este tipo permite la creación de una modificación genética homocigótica deseada en la generación F1. Dichos métodos proporcionan una mirada rápida al fenotipo sin tener que reproducirse hasta la generación F2.

En una realización no limitativa, el alelo Sry condicional es un alelo multifuncional, como se describe en el documento US 2011/0104799. En realizaciones específicas, el alelo condicional comprende: (a) una secuencia de actuación en orientación sentido con respecto a la transcripción de un gen objetivo, y un casete de selección de fármaco (DSC) en orientación sentido o antisentido; (b) en orientación antisentido una secuencia de nucleótidos de interés (NSI) y un módulo condicional por inversión (COIN, que utiliza un intrón que divide el exón y un módulo invertible de tipo trampa de genes; véase, por ejemplo, el documento US 2011/0104799); y (c) unidades recombinables que se recombinan tras la exposición a una primera recombinasa para formar un alelo condicional que (i) carece de la secuencia de activación y el DSC, y (ii) contiene la NSI en orientación sentido y el COIN en orientación antisentido.

El alelo condicional del gen Sry puede generarse en cualquier tipo de célula, y no está limitado a una célula pluripotente y/o totipotente XY. Dichos tipos de células, junto con métodos no limitantes para atacar un locus genómico en el cromosoma Y, se discuten con más detalle en otra parte de este documento.

Como se discutió en otra parte en este documento, la célula XY pluripotente y/o totipotente (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) que tiene modificación genética que disminuye el nivel y/o la actividad de la proteína Sry puede comprender además al menos una modificación genética adicional dirigida a un polinucleótido de interés. Al menos una modificación genética escogida adicional puede comprender una sustitución de uno o más ácidos nucleicos, un reemplazo de una secuencia endógena de ácido nucleico con una secuencia heteróloga de ácido nucleico, una inactivación y una activación. La modificación genética adicional dirigida puede estar en el cromosoma Y, el cromosoma X o en un autosoma. Se pueden usar varios métodos para generar la modificación genética escogida adicional, incluido el empleo de plásmidos de direccionamiento y vectores de direccionamiento grandes como se describe en otra parte del presente documento. Véanse, también, los documentos US20080092249, WO/1999/005266A2, US20040177390, WO/2008/017234A1, y la patente de EE. UU. No. 7.612.250, para métodos relacionados con la transferencia nuclear. Además, los diversos métodos descritos aquí para modificar el locus genómico en el cromosoma Y (es decir, el gen Sry) también se pueden usar para introducir modificaciones genéticas escogidas a polinucleótidos de interés que no están ubicados en el cromosoma Y.

B. Medios para cultivar las células XY pluripotentes y/o totipotentes que tienen una modificación que disminuye el nivel y/o la actividad de una proteína Sry

Los medios de cultivo empleados en los diversos métodos y composiciones que promueven a la hembra fértil XY en la generación F0 es tal que mantiene las células pluripotentes y/o totipotentes (es decir, células ES, células iPS, células ES XY, células iPS XY, etc.). Los términos "mantener", "que mantiene" y "mantenimiento" se refieren a la conservación estable de al menos una o más de las características o fenotipos de células pluripotentes y/o totipotentes descritas en el presente documento (incluidas las células ES o las células iPS). Tales fenotipos pueden incluir mantener la pluripotencia y/o la totipotencia, la morfología celular, los perfiles de expresión génica y las otras características funcionales de las células. Los términos "mantener", "que mantiene" y "mantenimiento" también pueden abarcar la propagación de las células, o un aumento en el número de células que se están cultivando. Los términos contemplan además las condiciones de cultivo que permiten que las células permanezcan pluripotentes, mientras que las células pueden o no continuar dividiéndose y aumentando en número.

En algunas realizaciones, las células XY que tienen la modificación genética que reduce el nivel y/o la actividad de la proteína Sry se mantienen mediante el cultivo en DMEM que es adecuado para su uso (con suplementos añadidos)

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L-Fenilalanina: 66 0,4

L-Serina: 42 0,4

L-Treonina: 95 0,798

L-Triptófano: 16 0,0784

Sal disódica dihidratada de L-Tirosina: 104 0,398

L-Valina: 94 0,803

Cloruro de colina: 4 0,0286

Pantotenato de calcio D: 4 8,39 x 10-3

Ácido fólico: 4 9,07 x 10-3

Niacinamida: 4 0,0328

Piridoxina•HCI: 4 0,0196

Riboflavina: 0,4 1,06 x 10-3

Tiamina•HCI: 4 0,0119

i-Inositol: 7,2 0,04

Cloruro de calcio (CaCl2) (anhidro): 200 1,8

Nitrato férrico (Fe(NO3)3.9H2O): 0,1 2,48 x 10-4

Sulfato de magnesio (MgSO4) (anhidro): 97,67 0,814

Cloruro de potasio (KCI): 400 5,33

D-Glucosa (Dextrosa): 4500 25

Rojo de fenol: 15 0,0399

Contenido de NaCl/NaHCO3 de DMEM

Bicarbonato de sodio (NaHCO3): 3700 44,05

Cloruro de sodio (NaCl): 6400 110,34

Contenido de NaCl/NaHCO3 de DMEM bajo en sales

Bicarbonato de sodio (NaHCO3): <3700 <44,05

Cloruro de sodio (NaCl): <6400 <110,34

El término "suplementos" o la frase "+ suplementos" incluye elementos agregados al medio base para hacer crecer o mantener células pluripotentes y/o totipotentes (es decir, células ES XY o células iPS XY) en cultivo, por ejemplo, para mantener pluripotencia o totipotencia de células donantes en cultivo. Por ejemplo, los suplementos de medios

5 adecuados para el crecimiento o el mantenimiento de células pluripotentes y/o totipotentes en cultivo incluyen, pero no se limitan a, suero fetal bovino (FBS), glutamina, antibiótico(s), penicilina y estreptomicina (por ejemplo, penstrep), sales piruvato (p. ej., piruvato de sodio), aminoácidos no esenciales (p. ej., MEM NEAA), 2mercaptoetanol y factor inhibidor de la leucemia (LIF).

En una realización, el medio base comprende uno o más suplementos adecuados para mantener células

10 pluripotentes en cultivo, incluyendo, por ejemplo, células ES XY o células iPS XY que tienen una capacidad reducida para contribuir al programa de desarrollo de la determinación del sexo masculino después de la inyección en una transferencia embrionaria e intrauterina a un ratón madre sustituto.

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En una realización específica, los uno o más suplementos adecuados para mantener la célula pluripotente en cultivo son FBS (90 mL de FBS/0,5 L de medio base), glutamina (2,4 mmoles/0,5 L de medio base), piruvato de sodio (0,6 mmoles/0,5 L de medio base), aminoácidos no esenciales (<0,1 mmol/0,5 L de medio base), 2-mercaptoetanol, LIF y uno o más antibióticos.

En otras realizaciones, los medios para mantener células pluripotentes en cultivo, incluyendo, por ejemplo, células ES XY o células iPS XY que tienen una capacidad reducida para contribuir al programa de desarrollo de la determinación del sexo masculino después de la inyección en un embrión y transferencia intrauterina a una ratón madre sustituto, comprende aproximadamente 500 mL de medio base en el que se agregan los siguientes suplementos: aproximadamente 90 mL de FBS (por ejemplo, Hylcone FBS Cat. No. SH30070.03), aproximadamente 2,4 milimoles de glutamina (por ejemplo, aproximadamente 12 mL de una solución de glutamina 200 mM, por ejemplo, Invitrogen Cat. No. 25030-081, penicilina:estreptomicina (por ejemplo, 60.000 unidades de penicilina G sódica y 60 mg de sulfato de estreptomicina, con aproximadamente 51 mg de NaCl; por ejemplo, aproximadamente 6 mL de pennstrep de Invitrogen, Cat. No. 15140-122), aproximadamente 0,6 milimoles de piruvato de sodio (por ejemplo, 6 mL de piruvato de sodio 100 mM, Invitrogen Cat. No. 1 1360-070), aproximadamente 0,06 milimoles de aminoácidos no esenciales (por ejemplo, aproximadamente 6 mL de MEM NEAA, por ejemplo, MEM NEAA de Invitrogen Cat. No. 1 1 140-050), aproximadamente 1,2 mL. 2-mercaptoetanol y aproximadamente 1,2 microgramos de LIF (por ejemplo, aproximadamente 120 microlitros de una preparación de LIF de 106 unidades/mL; por ejemplo, aproximadamente 120 microlitros de Millipore ESGROMR-LIF, Cat. No. ESG1 107). Al componer medios base para mantener las células ES XY o iPS XY para producir hembras XY fértiles, típicamente se emplean los mismos suplementos en aproximadamente las mismas cantidades, pero la composición del medio base diferirá (de DMEM, por ejemplo, del medio descrito en la tabla anterior) y la diferencia o diferencias corresponden a la diferencia o diferencias enseñadas aquí.

En algunas realizaciones, los suplementos incluyen medios acondicionados con Wnt, por ejemplo, medios acondicionados con Wnt-3a.

En una realización, la célula pluripotente, que incluye, por ejemplo, una célula ES XY o una célula iPS XY que tiene una capacidad reducida para contribuir al programa de desarrollo de la determinación del sexo masculino después de la inyección en un embrión y la transferencia intrauterina a un ratón madre sustituto, se mantiene en un cultivo in vitro en un medio que comprende medio base y suplementos, en donde el medio base exhibe una o más de las siguientes características: (a) una osmolalidad de aproximadamente 200 mOsm/kg a menos de aproximadamente 329 mOsm/kg; (b) una conductividad de aproximadamente 11 mS/cm a aproximadamente 13 mS/cm; (c) una sal de un metal alcalino y un haluro en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 110 mM; (d) una concentración de sal de ácido carbónico de aproximadamente 17 mM a aproximadamente 30 mM; (e) una concentración total de sal de haluro de metal alcalino y sal de ácido carbónico de aproximadamente 85 mM a aproximadamente 130 mM; y/o (f) una combinación de dos o más de los mismos. En otras realizaciones, las células pluripotentes y/o totipotentes XY (es decir, células ES XY o células iPS XY) se mantienen en un cultivo in vitro en un medio como se describe en el documento WO2011/156723.

En una realización, el medio base es un DMEM con bajo contenido de sal. En una realización específica, el DMEM bajo en sal tiene una concentración de NaCl de 85-130 mM. En una realización, el medio base es un DMEM de baja osmolalidad. En una realización específica, el DMEM de baja osmolalidad tiene una osmolalidad de 250-310 mOsm/kg. En una realización, el medio base es un DMEM de baja conductividad. En una realización específica, el DMEM de baja conductividad tiene una conductividad de 11-13 mS/cm.

En otras realizaciones, el medio base exhibe una osmolalidad de no más de aproximadamente 320, 310, 300, 290, 280, 275, 270, 260, 250 o 240 mOsm/kg. En una realización, el medio base o el medio que comprende el medio base y los suplementos exhiben una osmolalidad de no más de aproximadamente 240-320, 250-310, 275-295, o 260-300 mOsm/kg. En una realización específica, el medio base o el medio que comprende el medio base y los suplementos exhiben una osmolalidad de aproximadamente 270 mOsm/kg.

En otras realizaciones, el medio base exhibe una conductividad de no más de aproximadamente 10,0; 10,5; 11,0; 11,5; 12,0; 12,5; 13,0; 13,5 o 14,0 mS/cm. En una realización, el medio base exhibe una conductividad de no más de aproximadamente 10-14 mS/cm o 11-13 mS/cm. En una realización específica, el medio base exhibe una conductividad de aproximadamente 12-13 mS/cm.

En una realización específica, el medio base exhibe una conductividad de aproximadamente 12-13 mS/cm y una osmolalidad de aproximadamente 260-300 mOsm/kg. En una realización específica adicional, el medio base comprende cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 90 mM de NaCl. En una realización específica adicional, la concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 70-95 mM. En una realización específica adicional, el medio base comprende bicarbonato de sodio a una concentración de menos de aproximadamente 35 mM. En una realización específica adicional, la concentración de bicarbonato de sodio es de aproximadamente 20-30 mM.

En una realización, el medio base exhibe una concentración de una sal de un metal alcalino y un haluro de no más de aproximadamente 100 mM. En una realización, la sal del metal alcalino y el haluro es NaCl. En una realización, la

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complementaron con aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato de sodio 1 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, Lglutamina 2 mM, 50 µg/mL de cada uno de penicilina y estreptomicina (LifeTech), FBS al 15% (Hyclone) y 2.000 U/mL de LIF (Millipore).

C. Método para realizar modificaciones genéticas escogidas

Se pueden usar varios métodos para realizar modificaciones genéticas escogidas que disminuyen el nivel y/o la actividad de la proteína Sry. Por ejemplo, en un caso, la modificación genética escogida emplea un sistema que generará una modificación genética específica mediante un evento de recombinación homóloga. En otros casos, la célula animal puede modificarse utilizando agentes de nucleasa que generan una ruptura de cadena sencilla o doble en una ubicación genómica escogida. La ruptura de la cadena sencilla o doble se repara luego por la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ). Tales sistemas encuentran uso, por ejemplo, en la generación de una pérdida escogida de modificaciones genéticas funcionales. Los métodos no limitantes para generar dicha modificación genética escogida se discuten en detalle en otra parte del presente documento, que incluye, por ejemplo, el uso de plásmidos de direccionamiento, vectores de direccionamiento pequeños (TVEC pequeños) o vectores de direccionamiento grandes. Véase, también, Wang et al. (2013) Cell 153: 910-918, Mandalos et al. (2012) PLOS ONE

7: e45768: 1-9, y Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31: 530-532.

Se reconoce que en realizaciones específicas, la modificación genética escogida del gen Sry y/o la modificación genética escogida de cualquier otro polinucleótido de interés puede ocurrir mientras la célula pluripotente (es decir, la célula ES) se mantiene en los medios de cultivo descritos aquí (por ejemplo, un medio que promueve el desarrollo de las hembras fértiles F0 XY). Alternativamente, la modificación genética escogida del gen Sry y/o cualquier otro polinucleótido de interés puede ocurrir mientras la célula pluripotente (es decir, la célula ES) se mantiene en diferentes medios de cultivo, y luego se transfiere a los medios de cultivo descritos aquí (por ejemplo, un medio que promueve el desarrollo de las hembras fértiles F0 XY).

D. Método de cultivo y mantenimiento de una célula pluripotente y/o totipotente en cultivo

Se proporciona un método para mantener o cultivar una célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) en un cultivo in vitro en esta divulgación, en el que la célula comprende una modificación que disminuye el nivel y/o la actividad de una proteína Sry y la célula se mantiene en un cultivo in vitro en las condiciones descritas en este documento. Dichos métodos para mantener o cultivar una célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) en un cultivo in vitro promueven un aumento en el número de animales hembra fértiles F0 XY tras la introducción de las células ES XY de animales no humanos en un embrión huésped y después de la gestación de los embriones huésped.

Aunque cualquier medio divulgado en el presente documento puede emplearse para tales métodos de mantenimiento o cultivo, un ejemplo no limitante incluye el cultivo en un medio que comprende un medio base y suplementos adecuados para mantener o cultivar la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) en cultivo, en donde el medio base o el medio que comprende el medio base y los suplementos exhibe una osmolalidad de aproximadamente 200 mOsm/kg hasta menos de aproximadamente 329 mOsm/kg.

La presente divulgación establece que el medio base o el medio que comprende el medio base y los suplementos exhiben una o más de las siguientes características: una conductividad de aproximadamente 11 mS/cm a aproximadamente 13 mS/cm; una sal de un metal alcalino y un haluro en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 110 mM; una concentración de sal de ácido carbónico de aproximadamente 17 mM a aproximadamente 30 mM; una concentración total de sal de haluro de metal alcalino y de sal de ácido carbónico de aproximadamente 85 mM a aproximadamente 130 mM; y/o una combinación de dos o más de los mismos.

Esta divulgación establece que el método comprende mantener o cultivar la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) en un medio de cultivo adecuado que comprende un medio base y suplementos, en donde la base medio o el medio que comprende el medio base y los suplementos comprenden una osmolalidad de aproximadamente 240-320 mOsm/kg, una conductividad de aproximadamente 10-14 mS/cm, una concentración de sal de haluro de metal alcalino de aproximadamente 50-105 mM, una sal de concentración de ácido carbónico de 10-40 mM, y/o una concentración combinada de sal de metal alcalino y sal de ácido carbónico de aproximadamente 80-140 mM. Esta divulgación establece que la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) se mantiene en el medio (con suplementos para mantener células ES) durante un período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 días, o 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas antes de la introducción en un embrión huésped. Esta divulgación establece que la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) se mantiene en el medio (medio base bajo en sal con suplementos para mantener las células ES) durante aproximadamente 2-4 semanas antes a la introducción en el embrión huésped.

Esta divulgación establece que la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) se mantiene en un medio con un medio base bajo en sal durante al menos 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 días, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas antes de introducir la célula del donante en un embrión huésped. En una

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realización específica, la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) se mantiene en un medio con un medio base bajo en sal por lo menos 2-4 semanas antes de la introducción de la célula en el embrión huésped.

Esta divulgación establece que la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) se mantiene (por ejemplo, congelada) en un medio que promueve hembras F0 fértiles XY y la célula del donante se descongela. en y se mantiene en el medio que promueve las hembras F0 fértiles XY durante al menos 1, 2, 3 o 4 días o más antes de introducir la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) en el embrión huésped. En una realización específica, la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) se pasa al menos una vez en un medio que promueve hembras F0 fértiles XY, la célula se congela en el medio que promueve hembras F0 fértiles XY, y la célula se descongela en un medio que promueve hembras F0 fértiles XY y se cultiva durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas o más antes de la introducción en el embrión huésped.

Esta divulgación establece que la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) se mantiene en el medio que promueve hembras F0 fértiles XY durante un período de uno, dos, tres o cuatro días antes de la introducción en un embrión huésped. En una realización, la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) se mantiene en el medio que promueve hembras F0 fértiles XY durante un período de 3 días.

Esta divulgación establece que la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) mantiene el medio que promueve a las hembras F0 fértiles XY antes de la introducción en el embrión huésped durante aproximadamente 1, 2 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 días, 2 semanas, 3 semanas, o 4 semanas o más. En una realización específica, la célula del donante se mantiene en el medio que promueve hembras F0 fértiles XY durante al menos una semana antes de la introducción en el embrión huésped. En una realización específica, la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) se mantiene en el medio que promueve hembras F0 fértiles XY durante 2 a 4 semanas antes de la introducción en el embrión huésped.

Por lo tanto, en esta divulgación se proporciona un método para mantener o cultivar una célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY), en donde la célula se mantiene en condiciones que promueven o favorecer el desarrollo de un animal XY hembra después de la introducción de la célula XY en un embrión huésped y después de la gestación en un huésped hembra adecuado.

En un aspecto, se proporciona en esta divulgación un método para mantener o cultivar una célula pluripotente y/o totipotente XY donante (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) en cultivo, en las condiciones descritas en este documento, en las que luego de la introducción de la célula ES XY donante en un embrión huésped para formar un embrión F0 y la gestación del embrión F0 en un animal adecuado, el embrión F0 se convierte en un animal F0 que es al menos 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más XY y es una hembra que, al alcanzar la madurez sexual, es fértil.

E. Generación de embriones F0 y progenie F1 con una modificación genética específica

Los diversos métodos y composiciones que emplean la célula pluripotente y/o totipotente XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) que tienen un nivel y/o actividad disminuidos de la proteína Sry proporcionados en el presente documento pueden usarse para generar un animal genéticamente modificado. Varios métodos para introducir modificaciones genéticas se describen en detalle en otra parte de este documento.

i. Método para elaborar un animal no humano XY hembra fértil en una generación F0

En esta descripción se proporciona un método para elaborar un animal no humano XY hembra fértil en una generación F0. Tales métodos comprenden: (a) mantener o cultivar una célula pluripotente y/o totipotente XY de un animal no humana donante (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) que tiene una modificación que disminuye el nivel y/o la actividad de una proteína Sry en un medio que promueve el desarrollo de células ES hembra fértiles XY; (b) la introducción de la célula pluripotente y/o totipotente XY XY de animal no humano XY (es decir, una célula ES XY o una célula iPS XY) en un embrión huésped; (c) gestar el embrión huésped; y, (d) obtener un animal no humano hembra F0 XY, en donde, al alcanzar la madurez sexual, el animal no humano hembra F0 XY es fértil. En realizaciones específicas, la célula del donante XY animal no humana donante puede comprender al menos una modificación genética escogida adicional en un polinucleótido de interés. Tales modificaciones se discuten en detalle en otra parte de este documento.

Las células ES XY que tienen una modificación que disminuye el nivel y/o la actividad de una proteína Sry se pueden mantener sin un medio con bajo contenido de sal y pueden convertirse en una hembra fértil XY.

Esta divulgación establece que el medio que promueve el desarrollo de animales hembra F0 fértiles XY puede comprender un medio con bajo contenido en sal que comprende un medio base y suplementos adecuados para mantener o cultivar células ES de mamíferos no humanos en cultivo, en donde el medio base bajo en sal exhibe una característica que comprende uno o más de los siguientes: una osmolalidad de aproximadamente 200 mOsm/kg a menos de aproximadamente 329 mOsm/kg; una conductividad de aproximadamente 11 mS/cm a aproximadamente

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espera que una cuarta parte de la generación F1 sea homocigótica para la modificación escogida en el polinucleótido de interés. La progenie F1 puede seleccionarse para retener la modificación escogida para el gen Sry

o la progenie F1 puede seleccionarse para no retener la modificación escogida para el gen Sry.

En otra realización, la introducción de la modificación escogida del gen Sry empleando un vector de direccionamiento (y, en realizaciones específicas, nucleasas como Talen, Crispr o Zfn) puede ocurrir simultáneamente con el direccionamiento del vector para la modificación genética del polinucleótido de interés. Dichos métodos permiten la generación de una célula ES XY que tiene una modificación genética que disminuye el nivel y/o la actividad de la proteína Sry y además comprende la modificación escogida al polinucleótido de interés.

La divulgación describe que la progenie de la generación F1 comprende un genoma completamente derivado de la célula ES del donante. En otras realizaciones, la frecuencia de cruzamientos de ratones macho de generación F0 y hembra de generación F0 que dan lugar a ratones derivados completamente de células ES es del 100%.

II. Métodos y composiciones para modificar un locus genómico objetivo desafiante o un locus genómico objetivo en el cromosoma Y

Se proporcionan métodos y composiciones que permiten modificar un locus genómico objetivo en el cromosoma Y en una célula. Además, en esta divulgación se proporcionan métodos que permiten modificar un locus genómico "desafiante". El término "locus desafiante" incluye una región cromosómica que es difícil de identificar mediante las estrategias convencionales de selección de genes. Dichos loci pueden ubicarse en el cromosoma Y, el cromosoma X o un autosoma. Esta divulgación establece que los loci de ataque están ubicados dentro o cerca de regiones cromosómicas pobres en genes, ricas en repeticiones y/o en gran parte heterocromáticas. Véase, por ejemplo, Bernardini et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 111: 7600-7605 (2014). Esta divulgación establece que, un locus desafiante se encuentra dentro o en la proximidad a regiones cromosómicas en las que la accesibilidad del ADN cromosómico está limitada por la estructura de la cromatina. Esta divulgación establece que un locus desafiante se encuentra dentro o cerca de las regiones cromosómicas caracterizadas por un alto porcentaje de heterocromatina, tal como al menos aproximadamente -20%, al menos aproximadamente -30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente el 60%, o al menos aproximadamente el 70% de heterocromatina. Esta divulgación establece que un locus desafiante se ubica dentro o cerca de regiones cromosómicas que han sufrido duplicaciones y reordenamientos o que se caracterizan por la presencia de repeticiones o repeticiones invertidas. Véase, por ejemplo, Gubbay et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 89: 7953-7957 (1992).

El término "cromatina" incluye complejos de nucleoproteínas que compactan y organizan el material genético celular para contenerlo dentro de las células. El término "heterocromatina" incluye regiones en el genoma que se encuentran en un estado altamente condensado y generalmente son silenciosas transcripcionalmente. La heterocromatina generalmente se enrolla más estrechamente y generalmente tiene más secuencias de ADN repetitivas que la eucromatina. El término "eucromatina" incluye regiones en el genoma caracterizadas por dominios de cromatina más extensos y menos condensados que a menudo son transcripcionalmente activos y accesibles.

El término "exposición" incluye el uso de cualquier método por el cual los componentes deseados se ponen en proximidad inmediata o contacto directo.

Se proporcionan métodos y composiciones en esta divulgación que permiten modificar un locus genómico objetivo desafiante o un locus genómico objetivo en el cromosoma Y en una célula. Quizás debido a las características estructurales únicas del cromosoma Y, las estrategias convencionales de selección de genes en células madre embrionarias de ratón para generar mutaciones en los genes ligados a Y han tenido un éxito limitado. Por lo tanto, a menudo, la comprensión de las funciones de los genes murinos ligados a Y se limita a la información obtenida de los estudios de ratones que portan eliminaciones espontáneas, inserciones aleatorias de trampas de genes o transgenes autosómicos. Los métodos proporcionados en esta divulgación en el presente documento que permiten el direccionamiento de un locus genómico en el cromosoma Y empleando un vector de direccionamiento en ausencia o en combinación con un agente de nucleasa.

Algunos de estos métodos utilizan un vector de direccionamiento pequeño o TVEC pequeño. Un "TVEC pequeño" incluye un vector de direccionamiento que comprende brazos de homología corta. La longitud de un brazo de homología en un TVEC pequeño puede ser de aproximadamente 400-1.000 pb. Un brazo de homología del TVEC pequeño puede ser de cualquier longitud que sea suficiente para promover un evento de recombinación homóloga con un sitio objetivo correspondiente, que incluye, por ejemplo, de aproximadamente 400 pb a aproximadamente 500 pb, de aproximadamente 500 pb a aproximadamente 600 pb, de aproximadamente 600 pb a aproximadamente 700 pb, de alrededor de 700 pb a aproximadamente 800 pb, de aproximadamente 800 pb a aproximadamente 900 pb, o de aproximadamente 900 pb a aproximadamente 1.000 pb. Una longitud preferida de un brazo de homología en un TVEC pequeño es de aproximadamente 700 pb a aproximadamente 800 pb. En otra realización, la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del TVEC pequeño es de aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, aproximadamente 0,5 kb a aproximadamente 1 kb, aproximadamente 1 kb a aproximadamente 1,5 kb, aproximadamente 1,5 kb a aproximadamente 2 kb, aproximadamente 2 kb a aproximadamente 3 kb, aproximadamente 3 kb a aproximadamente 4 kb, aproximadamente 4 kb a

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aproximadamente 5 kb, aproximadamente 5 kb a aproximadamente 6 kb, aproximadamente 6 kb a aproximadamente 7 kb, aproximadamente 8 kb a aproximadamente 9 kb, o es al menos 10 kb. En tales métodos, la corta longitud de los brazos de homología aumenta la eficacia de focalización en comparación con un vector de direccionamiento con brazos de homología más largos. Debido a la naturaleza del cromosoma Y, que tiene secuencias altamente repetitivas, los brazos cortos de los TVEC pequeños permiten una focalización altamente específica en el cromosoma Y.

Se proporcionan métodos para modificar un locus genómico objetivo en el cromosoma Y en una célula que comprende: (a) proporcionar una célula que comprende un locus genómico objetivo en el cromosoma Y que comprende un sitio de reconocimiento para un agente de nucleasa, (b) introducir en la célula un primer vector de direccionamiento que comprende un primer polinucleótido de inserción flanqueado por un primer y un segundo brazo de homología que corresponde a un primer y un segundo sitio objetivo; y (c) identificar al menos una célula que comprende en su genoma el primer polinucleótido de inserción integrado en el locus genómico objetivo en el cromosoma Y. Esta divulgación establece que la suma total del primer brazo de homología y el segundo brazo de homología del vector de direccionamiento es de aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, aproximadamente 0,5 kb a aproximadamente 1 kb, aproximadamente 1 kb a aproximadamente 1,5 kb, aproximadamente 1,5 kb a aproximadamente 2 kb, aproximadamente 2 kb a aproximadamente 3 kb, aproximadamente 3 kb a aproximadamente 4 kb, aproximadamente 4 kb a aproximadamente 5 kb, aproximadamente 5 kb a aproximadamente 6 kb, aproximadamente 6 kb a aproximadamente 7 kb, aproximadamente 8 kb a aproximadamente 9 kb, o es al menos 10 kb o al menos 10 kb y menos de 150 kb. En algunas realizaciones, se emplea un TVEC pequeño. En realizaciones específicas, se emplea un LTVEC. Se pueden realizar métodos similares cuando se direcciona a un locus genómico objetivo desafiante. En una realización no limitativa, tales métodos se realizan empleando los medios de cultivo que promueven el desarrollo de hembras fértiles F0 XY divulgadas en el presente documento y generando así animales hembra fértiles F0 XY. En otro caso, los métodos descritos en el presente documento se emplean para producir una modificación genética escogida en el gen Sry, como se discute en otro lugar del presente documento.

Se proporcionan además métodos para modificar un locus genómico objetivo en el cromosoma Y en una célula que comprende: (a) proporcionar una célula que comprende un locus genómico objetivo en el cromosoma Y que comprende un sitio de reconocimiento para un agente de nucleasa, (b) introducción en la célula (i) del agente de nucleasa, en el que el agente de nucleasa induce un corte o rompimiento de la cadena doble en el primer sitio de reconocimiento; y, (ii) un primer vector de direccionamiento que comprende un primer polinucleótido de inserción flanqueado por un primer y un segundo brazo de homología que corresponde a un primer y un segundo sitio objetivo situados en proximidad suficiente del primer sitio de reconocimiento; y (c) identificar al menos una célula que comprende en su genoma el primer polinucleótido de inserción integrado en el locus genómico objetivo en el cromosoma Y. Esta divulgación describe que la suma total del primer brazo de homología y el segundo brazo de homología del vector de direccionamiento es de aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, aproximadamente 0,5 kb a aproximadamente 1 kb, aproximadamente 1 kb a aproximadamente 1,5 kb, aproximadamente 1,5 kb a aproximadamente 2 kb, aproximadamente 2 kb a aproximadamente 3 kb, aproximadamente 3 kb a aproximadamente 4 kb, aproximadamente 4 kb a aproximadamente 5 kb, aproximadamente 5 kb a aproximadamente 6 kb, aproximadamente 6 kb a aproximadamente 7 kb, aproximadamente 8 kb a aproximadamente 9 kb, o es al menos 10 kb o al menos 10 kb y menos de 150 kb. En algunas realizaciones, se emplea un TVEC pequeño. En realizaciones específicas, se emplea un LTVEC. Se pueden realizar métodos similares cuando se direcciona a un locus genómico objetivo desafiante. En una realización no limitativa, tales métodos se realizan empleando los medios de cultivo que promueven el desarrollo de hembras fértiles F0 XY divulgadas en el presente documento y generando así animales hembra fértiles F0 XY. En otro caso, los métodos descritos en el presente documento se emplean para producir una modificación genética escogida en el gen Sry, como se describe en otro lugar del presente documento.

Se reconoce que los diversos métodos descritos en este documento para generar una modificación escogida en un locus genómico del cromosoma Y (o cualquier locus genómico desafiante) que emplea un vector de direccionamiento, un TVEC pequeño o un LTVEC se pueden realizar en cualquier tipo de célula, y no se limita a una célula pluripotente y/o totipotente XY. Tales tipos de células incluyen, pero no se limitan a, una célula humana, una célula no humana, una célula de mamífero, una célula de mamífero no humano, una célula de roedor, una célula de ratón, una célula de rata, una célula de hámster, una célula de fibroblasto o cualquier otra célula huésped. Dichas células incluyen células pluripotentes, que incluyen, por ejemplo, células madre pluripotentes inducidas (iPS), células madre (ES) embrionarias de ratón, células madre (ES) embrionarias de rata, células (ES) embrionarias humanas o células progenitoras humanas con desarrollo restringido.

Los métodos se divulgan adicionalmente para generar una gran eliminación en el cromosoma Y empleando cualquiera de los diversos agentes de nucleasas proporcionados en el presente documento (por ejemplo, ARNg CRISPR en combinación con Cas9; ZFN o TALEN). Dicha eliminación en el cromosoma Y puede ser una eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico. La eliminación puede variar de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 10 kb, de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 20 kb, de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 40 kb, de aproximadamente 40 kb a aproximadamente 60 kb, de aproximadamente 60 kb a aproximadamente 80 kb, de aproximadamente 80 kb a aproximadamente 100 kb, de aproximadamente 100 kb a aproximadamente 150 kb, de aproximadamente 150 kb a aproximadamente 200 kb, de aproximadamente 200 kb a

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de 38 y 37 kb y con base en un BAC de la biblioteca de bMQ (129S7/SvEv Brd-Hprt b-m2). El LTVEC comprende en su brazo de homología todos los elementos de control conocidos para la expresión de Sry. Su beta-galactosidasa codificada por lacZ sirve como informador para la expresión específica del tejido y específica de la etapa de desarrollo del gen Sry. Las mutaciones inducidas por TALEN y CRISPR acompañadas por inserciones de LTVEC se

5 crearon tanto en las líneas de células ES de VGB6 (también conocida como B6A6) como en VGF1 (también conocida como F1H4).

Se obtuvo un TALEN (TALEN-1) diseñado para dirigir parte de la secuencia de codificación del motivo de unión al ADN de la caja HMG (secuencia de reconocimiento en sentido ascendente: 5'-TCCCGTGGTGAGAGGCAC-3' (SEQ ID NO: 72); secuencia de reconocimiento en sentido descendente: 5'-TATTTTGCATGCTGGGAT-3' (SEQ ID NO: 73)

10 en elgen Sry. TALEN-1 participó activamente en la creación de mutaciones NHEJ en el locus de Sry en múltiples experimentos.

Se crearon células ES de ratón tanto VGB6 como VGF1 con mutaciones inducidas por TALEN. La Tabla 1 contiene una lista de todos los clones y los tamaños de las mutaciones de eliminación que ellas portan. (ND en la Tabla 1 indica que se detectó una mutación mediante un ensayo de qPCR, pero no se determinó la naturaleza molecular

15 exacta de la mutación). Todos los clones también portan al menos una copia de LTVEC VG12778 del proyecto NIH KOMP.

Tabla 1

Mutaciones inducidas por TALEN y CRISPR en el gen Sry

Células ES: Clon Agente que induce mutación Eliminación (pb)

DE7: TALEN-1 9

DE11: TALEN-1 303*

DG5: TALEN-1 627

DH1: TALEN-1 ND

VGB6

EA2: TALEN-1 ND

ED4: TALEN-1 >1.200

EF4: TALEN-1 16

EG7: TALEN-1 >1.200

VGB6: RD3 TALEN-1 >1.200

RE9: TALEN-1 ND

RF3: TALEN-1 9

RG7: TALEN-1 15 3

SF7: TALEN-1 6

SG11: TALEN-1 >200

SH2: TALEN-1 2

SH11: TALEN-1

VGF1: TB1 TALEN-1 11

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TC2: TALEN-1

15

UA5: TALEN-1

1201

UB5: TALEN-1

9

UE12: TALEN-1

>1.200

WE11: TALEN-1

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VGB6: OG6 QE8 CRISPR-2 CRISPR-3 9 5

VGF1: AU-B6 AU-C12 AW-H5 CRISPR-4 CRISPR-4 CRISPR-5 5 8 22

*También contenía una inserción de 50 pb

Los resultados de las microinyecciones de los clones de mutantes se exponen en la Tabla 2 y los resultados de reproducción de hembras con inversión de sexo se exponen en la Tabla 3.

Tabla 2

VelociMice de generación F0 producida por microinyección de clones de células ES mutantes Sry en embriones de 8 células

Células ES: Clon Mutación Sry VM hembra VM macho

VGB6: ED4 Eliminación >1 kb 2 0

EG7: Eliminación >1 kb 19 0

GB4: Ninguna 0 3

GG1: Ninguna 0 5

DE11: Eliminación de 303 pb; inserción de 50 pb 1 0

DG5: Eliminación de 627 pb 11 0

VGF1: TA3 Ninguna 0 5

TA4: Ninguna 0 11

TB1: Eliminación de 11 pb 2 0

TC2: Eliminación de 5 pb 8 0

TH4: Ninguna 2 6

UB5: Eliminación de 1.201 pb 6 0

WE11: Eliminación >1.2 kb 7 0

UA5: Eliminación de 15 pb 4 0

UE12: Eliminación de 9 pb 8 0

Tabla 3

Resultados de reproducción de VelociMice hembra XY con mutaciones en el gen Sry

Células ES: Clon Eliminación de Sry (pb) ID # de la hembra XY Camadas producidas Cachorros nacidos

VGB6: EG7 >1.200 1460403 1460404 1460405 1460406 0 0 0 1 0*

50

1460408 1460409 1460410: 0 0 0

VGB6: DG5 627 1460428 0

1460429: 0

1460430: 0

1460431: 0

1460432: 0

1460436: 0

1460437: 0

1460438: 0

1460410: 0

VGF1: UB5 1.201 1525585 5 33

1525586: 5 25

1525587: 5 32

1525588: 3 35

1525589: 3 19

VGF1: WE11 >1.200 1525573 3 4

1525574: 5 21

1525575: 4 11

1525576: 4 14

1525577: 4 16

1525578: 2 4

1525579: 2 6

VGF1: TB1 11 1525700 1525701 5 4 30 28

VGF1: TC2 5 1525706 1 2

1525707: 5 10

1525708: 1 6

1525709: 4 17

1525710: 1 3

1525711: 3 9

1525712: 4 12

1525713: 2 7

VGF1: UA5 15 1594102 1594103 2 2 5 7

51

imagen39

fuertemente el direccionamiento correcto. La falla de LacZ/Neo para segregar conjuntamente con la mutación indica que el clon original contenía una mutación de eliminación de Sry (inducida por TALEN) acoplada con una inserción transgénica LacZ/Neo en otras partes del genoma.

Los descendientes de hembras XY con mutaciones de Sry exhibieron una variedad de cariotipos anormales con una

5 frecuencia alta (incluidos XXY, XYY y XO). El recuento de cromosomas sexuales se evaluó mediante el uso de perdida no relacionada de ensayos de alelos (LOA) para los genes en los cromosomas X e Y. El número de copias de Sry se determinó luego utilizando los ensayos de LOA. La presencia del alelo Sry mutante se infirió en ratones en los que el número de copias del cromosoma Y superó el número de copias de Sry (por ejemplo, 1 copia de Y y 0 copias de Sry, o 2 copias de Y y 1 copia de Sry). Finalmente, la presencia de LacZ y Neo se determinó mediante

10 ensayos TaqMan.

En el conjunto original de clones, que fueron creados por LTVEC de Sry junto con la nucleasa TALEN y cultivados en KO-DMEM, fue evidente que el casete LacZ/Neo no estaba segregándose conjuntamente con la mutación de Sry. Una camada de muestra de estos clones se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4: Selección de clones generados por LTVEC de Sry junto con la nucleasa TALEN

Ratón: Sexo Cromos. X Copia # Cromos. Y Copia # Sry Copia # LacZ Neo Genotipo Comentarios

1656721: M 1 1 1 0 0 X+Y+

1656722: M 1 1 1 1 1 X+Y+ LacZ/Neo presente pero mutación de Sry ausente

1656723: M 1 1 1 0 0 X+Y+

1656724: M 1 2 1 0 0 X+Y+YΔ Mutación de Sry presente pero LacZ/Neo ausente

1656725: F 2 0 0 1 1 X+X+ LacZ/Neo presente pero mutación de Sry ausente

1656726: F 2 1 0 0 0 X+X+ YΔ Mutación de Sry presente pero LacZ/Neo ausente

1656727: F 2 1 0 1 1 X+X+ YΔ

1656728: F 1 0 0 1 1 X+ LacZ/Neo presente pero mutación de Sry ausente

1656729: F 1 0 0 0 0 X+

15

En el siguiente conjunto de clones, que fueron creados por LTVEC de Sry junto con nucleasa TALEN y se cultivaron en DMEM, el casete LacZ/Neo se segregó conjuntamente completamente con la mutación de Sry, lo que indica el direccionamiento correcto. Una camada típica de estos clones se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5: Resultados de cribado para clones creados por LTVEC de Sry junto con nucleasa TALEN

20

Ratón: Sexo Cromos. X Copia # Cromos. Y Copia # Sry Copia # LacZ Neo Genotipo

1848360: M 1 1 1 0 0 X+Y+

1848361: M 1 1 1 0 0 X+Y+

1848362: M 1 1 1 0 0 X+Y+

1848363: M 1 1 1 0 0 X+Y+

53

imagen40

imagen41

imagen42

ES

del alelo

XY

hembra XY

fértiles

fertilidad (%) X-C4

VGF1

lacZ-neo

5

2

100 dirigido X-E10

VGF1

lacZ-neo

1

100 dirigido X0F3

VGF1

lacZ-neo

5

3

100 dirigido X-G3

VGF1

lacZ-neo

9

3

2

67 dirigido VGF1 Total

53

41

40

98

Ejemplo 5: Gran eliminación en el cromosoma Y mediada por las ZFN

Como se ilustra en la Figura 4, grandes eliminaciones, de 500 kb o más, se hicieron en el cromosoma Y utilizando las ZFN dirigidas a los genes Kdm5d y Usp9y. La Tabla 8 proporciona ejemplos de secuencias de dedo de cinc en el cromosoma Y.

Tabla 8: Secuencia de dedo de cinc en el cromosoma Y

Nombre objetivo: Placa cromosoma Y Secuencia de dedo de cinc ZFN # SEQ ID NO:

KDM5D: NM011419-r43102a1 ttAGGTAGGTAGACAGGGATgttttctg ZFN1 42

NM011419-43108a1: atCCAGTCtCTGAAGGAAGCTctgacta ZFN2 43

NM011419-r19880a1: caAAAGCTTCAGGGGGActcttacactc ZFN3 44

NM011419-19887a1: ttTGAGCAgGCTACACAGGAGtatactt ZFN4 45

NM011419-r17347a1: aaGCGGTGgCAATAGGCAaaagatgtgg ZFN5 46

NM011419-17353a1: ctGAAGTCCCCAAGGGAGTAtggagatg ZFN6 47

NM011419-r17350a1: agAAAGCGGTGGCAaTAGGCAaaagatg ZFN7 48

NM011419-17356a1: aaGTCCCCAAGGGAGTAtggagatgccc ZFN8 49

DDX3Y: NM012008-r8130al acTCCAACGACTATGACcactccgttca ZFN1 50

NM012008-8136a1: acAGATCAGATGAAGATgactggtcaaa ZFN2 51

NM012008-r7172a1: ctTTCAAGGAAAAAAAGaacaaaaccca ZFN3 52

NM012008-7178a1: ggTCTGTGATAAGGACAGTTcaggatgg ZFN4 53

NM012008-r20472a1: taAATCTGACTGAGAATGGGtagtagaa ZFN5 54

NM012008-20479a1: caGATGGTCCAGGAGAGGCTttgaaggc ZFN6 55

NM012008-r7267a1: at TGGGCTTCCcTCTGGAat cacgagat ZFN7 56

NM012008-7274a1: ttTCAGTGATCGTGGAAGTGgatccagg ZFN8 57

USP9Y: NM148943-r92561a1 ctGGTTTGGAAATCGTActgtaaaagac ZFN1 58

NM148943-92567a1: gcAAAGAGGTTGAGGATttggacatatt ZFN2 59

55

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Claims

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