ES2689758T3 - Orientación hacia una diana in vivo mejorada de péptidos radiomarcados por medio de inhibidores de enzimas - Google Patents

Abstract

Inhibidor de la endopeptidasa neutra (NEP) para uso en el diagnóstico/tratamiento in vivo del cáncer en donde el uso comprende una administración conjunta con un péptido marcado radiactivamente, en donde el péptido marcado radiactivamente se selecciona de los grupos que consisten en somatostatinas, gastrinas, CCKs, neurotensinas, bombesinas, neuromedinas C, hormonas estimulantes de melanocitos y péptidos de la sustancia P.

Description

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DESCRIPCION

Orientación hacia una diana in vivo mejorada de péptidos radiomarcados por medio de inhibidores de enzimas Campo de la invención

La presente invención se refiere al aumento de la captación en el o los sitios de una enfermedad, de vectores de diagnóstico o terapéuticos específicos del sitio, en particular de ligandos peptídicos marcados radiactivamente, en el diagnóstico y/o el tratamiento de una enfermedad, especialmente del cáncer, mediante el uso de compuestos que inhiben enzimas que degradan tales vectores.

Antecedentes de la invención

Los sitios de una enfermedad, tales como las células cancerosas, (hiper)expresan biomoléculas de "huella digital", tales como antígenos o receptores, que pueden servir como sitios de reconocimiento para una amplia gama de vectores circulantes, tales como anticuerpos, hormonas peptídicas, factores de crecimiento, etc. Un enfoque para diagnosticar e identificar sitios de una enfermedad es aprovechar una interacción de ese tipo y utilizar un vector convenientemente modificado, tal como un análogo de péptido marcado con un radionucleido de diagnóstico, que se acumulará específicamente en el o los sitios de una enfermedad después de la administración al paciente. El tumor y las metástasis se localizan a continuación mediante la formación de imágenes del o de los sitios en donde se produce la desintegración radiactiva, usando un dispositivo de formación de imágenes externo.

Un razonamiento similar se sigue en la terapia dirigida a una diana, en la cual el vector servirá de nuevo como vehículo que entregará una carga citotóxica, tal como un metal radiactivo terapéutico, específicamente en los sitios de una enfermedad, por ejemplo, el tumor y las metástasis. El marcador radiactivo terapéutico se desintegrará después en el sitio de la enfermedad, liberando una radiación de partículas para destruir o reducir el crecimiento del tumor.

La eficacia del diagnóstico y el tratamiento dirigido a una diana se ve comprometida frecuentemente por una degradación del fármaco específico del sitio, administrado mediante enzimas endógenas. Una descomposición enzimática puede tener lugar en el torrente sanguíneo, inmediatamente después de la entrada en la circulación y hasta que el fármaco alcanza la diana. Un ataque metabólico se puede producir durante el tránsito a través de enzimas que circulan en el soluto de la sangre, pero lo más importante, a través de enzimas ancladas en la membrana de las células sanguíneas, en las paredes de los vasos y diversos tejidos del cuerpo humano (hígado, riñones y tracto gastrointestinal), incluyendo el tejido tumoral. Estas enzimas afectarán en gran medida la administración de los fármacos. Además, el microentorno alrededor de la diana, como por ejemplo el entorno peritumoral (células del estroma, vasos (nuevos) locales) y la matriz extracelular), es otro sitio de una degradación potencial de los fármacos para diagnóstico y terapéuticos, que probablemente afecta no solo a la acumulación sino también a la retención en la diana.

Desde hace tiempo se ha establecido que la acción de muchas sustancias endógenas, tales como las hormonas peptídicas, está regulada por enzimas, tanto en condiciones normales como durante la aparición de un cáncer y la propagación. Por lo tanto, parece que existe una relación "íntima", por ejemplo entre receptores acoplados a la proteína G (GPCRs), sus ligandos peptídicos y enzimas relacionadas que, por ejemplo, están presentes en el torrente sanguíneo, en la matriz extracelular o en la membrana celular que controla la acción de estos ligandos.

Está bien documentado que la acción proteolítica de las exopeptidasas es una de las principales vías de degradación para los péptidos. Con el fin de eludir el ataque de las exopeptidasas, se han intentado frecuentemente modificaciones químicas de los extremos de los péptidos. Este enfoque es relativamente simple, está ampliamente aplicado y por lo general conduce a péptidos más estables con una actividad biológica conservada. En consecuencia, una protección del extremo N-terminal contra las aminopeptidasas, tal como una acetilación o metilación, se ha aplicado comúnmente para prolongar la semivida biológica de muchos ligandos peptídicos.

Es interesante observar, que la mayoría de los ligandos peptídicos conjugados con restos de diagnóstico o terapéuticos, tales como (radio) ligandos peptídicos metálicos (como se describen en Nock et al., J. Med. Chem. 2006, 49, 4767-4776), diseñados para la formación de imágenes moleculares o aplicaciones de terapia dirigida, con mayor frecuencia se modifican en el extremo N-terminal. En general, un quelante bifuncional se acopla covalentemente a través de una funcionalidad carboxi a la amina N-terminal del ligando peptídico, con formación de un enlace peptídico. Si bien el objetivo original de este enfoque era introducir el quelato metálico (u otro resto médicamente relevante), en una posición lo más apartada posible del sitio de reconocimiento del receptor para evitar una interferencia durante la unión, esto ha conducido inadvertidamente a un bloqueo del extremo N-terminal. Es razonable suponer que tales ligandos peptídicos metálicos radiactivos (o conjugados de manera similar), seguirán por lo tanto una ruta metabólica diferente que sus homólogos con el extremo N-terminal libre y se procesarán en consecuencia con enzimas distintas de las aminopeptidasas.

De cara a lo anterior, los análogos de ligandos de receptores naturales, tales como conjugados peptídicos, en particular los péptidos marcados radiactivamente, se espera que muestren una orientación subóptima hacia una diana si no están suficientemente modificados para soportar un ataque enzimático rápido en el medio biológico. Y de

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hecho, esto se observa con mayor frecuencia durante la evaluación de muchos análogos de (radio) péptidos novedosos. Mediante el estudio de sangre de ratones ex vivo después de una administración de muchos ligandos peptídicos metálicos radiactivos que comprenden derivados de tipo somatostatina, gastrina, neurotensina y bombesina mediante HPLC, los inventores han observado que la mayoría de estos análogos eran degradados en cierta medida al cabo de 5 min in vivo, a pesar del quelato metálico acoplado en su extremo N-terminal. Este hallazgo es compatible con la hipótesis de los inventores de que una o varias enzimas proteolíticas distintas de las aminopeptidasas están involucradas en la rápida degradación in vivo de estas clases de tales conjugados peptídicos marcados radiactivamente.

Con el fin de superar los problemas impuestos por la insuficiente estabilidad metabólica de los conjugados peptídicos, por ejemplo, péptidos marcados radiactivamente, tales como una orientación subóptima hacia una diana y una farmacocinética mediocre, se ha realizado a nivel mundial una investigación laboriosa y se han dedicado recursos costosos para el desarrollo de vectores peptídicos estabilizados. Sin embargo, las modificaciones realizadas para estabilizar metabólicamente estructuras conductoras naturales han llevado a menudo a bioconjugados con una capacidad de interacción débil con sus receptores homólogos y/o con compuestos de perfil farmacológico no deseable y/o una farmacocinética subóptima.

Por lo tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar los medios para mejorar la administración de agentes de diagnóstico y terapéuticos, en particular de conjugados peptídicos no estabilizados o parcialmente estabilizados, opcionalmente marcados radiactivamente, en sitios de enfermedad.

Compendio de la invención

El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento, se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante una terapia (o para un diagnóstico). En la investigación que ha conducido a la invención se ha desarrollado una estrategia totalmente diferente, a saber, la administración combinada de un compuesto terapéutico o de diagnóstico con uno o varios otros compuestos. Más específicamente, se ha descubierto de acuerdo con la invención que la administración conjunta de compuesto(s) que inhibe(n) la actividad de cierta(s) enzima(s) junto con un compuesto terapéutico o de diagnóstico, en particular un conjugado peptídico, preferiblemente marcado radiactivamente, o un radioligando peptídico, mejora significativamente la orientación in vivo hacia una diana. De esta manera, la invención permite aprovechar plenamente la capacidad de orientación hacia una diana de conjugados peptídicos terapéuticos y de diagnóstico, potentes pero rápidamente biodegradables, tales como conjugados peptídicos marcados radiactivamente. Este hecho es particularmente relevante para la aplicación eficaz de motivos de ligandos peptídicos naturales para conjugar con restos de diagnóstico y/o terapéuticos adecuados, tales como a quelatos metálicos radiactivos. Estos se han optimizado evolutivamente para tener una interacción más eficiente con sus receptores homólogos, pero su aplicación en la medicina se ha excluido hasta ahora debido a su rápida degradación in vivo.

Un hallazgo más sorprendente de la presente invención es que la administración conjunta, incluso de un inhibidor para una única enzima - por ejemplo, fosforamidón (PA), un inhibidor muy potente de NEP (endopeptidasa neutra) - no solo era eficaz para estabilizar metabólicamente, o también para "proteger", una amplia gama de ligandos neuropeptídicos marcados radiactivamente in vivo, sino más importante, para provocar un fuerte aumento de la acumulación de radioligando en la diana. Una mejora importante inesperada de la estabilidad in vivo se evidenció mediante un análisis de sangre ex vivo mediante HPLC, 5 min después de la administración conjunta de fosforamidón (PA) junto con una amplia gama de diferentes clases de conjugados peptídicos marcados radiactivamente, biodegradables, obtenidos a partir de somatostatina, gastrina, neurotensina, bombesina, neuromedina C y antagonistas de GRPR.

Más importante aún, esta prolongación de la semivida in vivo se traduce en un marcado aumento de la captación de péptido radiactivo en los sitios diana.

La presente invención se refiere por tanto a un inhibidor de la endopeptidasa neutra (NEP) para uso en el diagnóstico/tratamiento del cáncer in vivo, en donde el uso comprende una administración conjunta con un péptido marcado radiactivamente, en donde el péptido marcado radiactivamente se selecciona a partir de los grupos que consisten en somatostatinas, gastrinas, CCKs, neurotensinas, bombesinas, neuromedinas C, hormonas estimulantes de melanocitos y péptidos de la sustancia P.

El inhibidor de la endopeptidasa neutra (NEP) comprende preferiblemente fosforamidón, particularmente en combinación con lisinopril o racecadotrilo.

El compuesto terapéutico o de diagnóstico puede ser cualquier compuesto que se utiliza para el tratamiento o el diagnóstico del cuerpo humano o animal, pero preferiblemente es un compuesto, en el que el péptido marcado radiactivamente se selecciona a partir de somatostatina-14, minigastrina(10-17), demotensina 1 y 6, demobesina 4, Pansarbesina 1, SAR-NCs tales como SAR-NC1 y SAR-NC6, demobesina 1, JMV4168, SP-1, SP-2, SP-3, MSH-1, MSH-2 y 111In-CTP-1.

Los compuestos terapéuticos y de diagnóstico, o los conjugados de ligando peptídico, que más se benefician de esta

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invención son compuestos no estabilizados metabólicamente que se degradan rápidamente en el cuerpo humano o animal. Ejemplos de tales compuestos son conjugados de somatostatinas, en particular somatostatina-14 y sus análogos, ligandos de CCK2/gastrina-R, tales como CCKs, gastrinas, minigastrinas y sus análogos, en particular minigastrina(10-17), de ligandos de receptores de neurotensina, en particular de receptores de neurotensina del subtipo 1, tales como neurotensina y sus análogos, demotensinas, de ligandos del receptor del péptido liberador de gastrina (GRPR), en particular, bombesina y sus análogos, en particular demobesina 4 y demobesina 1, pansarbesina 1, de neuromedina C (NMC) y sus análogos, en particular SAR-NCs tales como SAR-NC1 y SAR-NC6, o los compuestos JMV, en particular el compuesto JMV4168. Los análogos de bombesina marcados con radionucleidos de diagnóstico y terapéuticos, se describen por ejemplo en Maina T et al., 2006; Smith CJ et al., 2005; Lantry LE et al., 2006; Zhang H et al., 2004; Nock B et al., 2005; Schroeder RP et al., 2011; Ananias HJ et al., 2008; Wild D et al., 2011.

Todos estos compuestos se pueden marcar con una etiqueta (radiactiva) para uso en el diagnóstico/formación de imágenes o terapia. Los marcadores adecuados son Tc, In, Ga, Cu, F, Lu, Y, Bi, Ac y otros isótopos de radionucleidos. Preferiblemente, el radionucleido se selecciona a partir del grupo que comprende 111In, 99mTc, 94mTc, 67Ga, 66Ga, 68Ga, 52Fe, 69Er, 72As, 97Ru, 203Pb, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 186Re, 188Re, 86Y, 90Y, 51Cr, 52mMn, 157Gd, 177Lu,

161Tb, 169Yb, 175Yb, 105Rh, 166Dy, 166Ho, 153Sm, 149Pm, 151Pm, 172Tm, 121Sn, 177mSn, 213Bi, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 18F, 123I, 124I, 131I, 75Br, 76Br, 77Br y 82Br, entre otros.

El inhibidor enzimático usado en la presente invención se selecciona a partir de inhibidores de NEP (endopeptidasa neutra). Otros inhibidores enzimáticos descritos en este documento son los inhibidores de ECA (enzimas convertidoras de angiotensina), inhibidores de ECE (enzima convertidora de endotelina), inhibidores de la esterasa, y combinaciones de los mismos, así como inhibidores dobles o triples.

Un inhibidor enzimático de una cierta enzima se puede emplear solo o en combinación con otros inhibidores, en mezclas de inhibidores. También se pueden emplear inhibidores con una acción doble o triple que inhiben más de una enzima.

Los inhibidores de NEP son, por ejemplo, fosforamidón (PA), racecadotrilo (race) y otros conocidos por una persona experta en la técnica.

Los inhibidores de ECA son por ejemplo lisinopril (Lis), captopril y otros conocidos por una persona experta en la técnica.

En ciertas realizaciones de la descripción un compuesto que inhibe la actividad de una enzima degradante se utiliza en combinación con un compuesto terapéutico o de diagnóstico en el diagnóstico y/o el tratamiento de una enfermedad para mejorar la orientación del compuesto terapéutico o de diagnóstico hacia el sitio de una enfermedad. En particular, la enfermedad puede ser cáncer y/o infecciones. En ciertas realizaciones de la descripción, la enzima degradante es una hidrolasa seleccionada a partir de peptidasas, esterasas. En la presente invención, la enzima es una endopeptidasa neutra. En ciertas realizaciones de la descripción, la enzima es la enzima convertidora de angiotensina. En ciertas realizaciones, el compuesto terapéutico o de diagnóstico se selecciona a partir de conjugados de receptor ligando, en particular, de péptidos acoplados a quelantes de metales o a grupos prostéticos, más en particular, péptidos marcados radiactivamente. Preferiblemente, el compuesto terapéutico o de diagnóstico presente es un péptido conjugado con un resto. En ciertas realizaciones, el péptido marcado radioactivamente no está completamente estabilizado. En ciertas realizaciones, el péptido, es un antagonista. En ciertas realizaciones, el péptido es un agonista. En ciertas realizaciones, el compuesto es un conjugado peptídico y la parte peptídica es una somatostatina, en particular la somatostatina-14 y sus análogos, ligandos del receptor CCK2R, tales como CCKs, gastrinas, minigastrinas y sus análogos, en particular minigastrina(10 -17), ligandos del receptor de neurotensina, en particular receptores de neurotensina del subtipo 1, tales como neurotensina y sus análogos, demotensinas y sus análogos, en particular demotensina 1 o 6, ligandos del receptor del péptido liberador de gastrina (GRPR), en particular bombesina y sus análogos, en particular 99mTc-demobesina 4 y 99mTc-demobesina 1, neuromedina C (NmC) y sus análogos, en particular 99mTc-SAR-NCs tales como 99mTc-SAR-NC1 y 99mTc-SAR- NC6, o ligandos universales de bombesina, en particular, 111In-pansarbesina 1, o los compuestos JMV, en particular el compuesto 111In/177Lu/67/68Ga-JMV4168, sustancia neuropeptídica P, tal como SP-1, SP-2, hormona estimulante de los melanocitos (MSH), péptido quimiotáctico (CTP) o combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, el compuesto es un inhibidor de NEP, en particular, fosforamidón o racecadotrilo; un inhibidor de ECA, en particular lisinopril o captopril; un inhibidor de ECE o un inhibidor de esterasa.

En ciertas realizaciones, los compuestos que se utilizan en combinación con un vector de diagnóstico o terapéutico en el diagnóstico o el tratamiento de una enfermedad como el cáncer, aumentan la captación del vector en el o los sitios de la enfermedad, mediante una inhibición de la actividad de las enzimas degradantes.

Ciertas realizaciones de la invención describen un método de tratamiento y/o de diagnóstico de una enfermedad que comprende la administración conjunta de un compuesto terapéutico o de diagnóstico con uno o varios compuestos que inhiben la actividad de una o varias hidrolasas, en donde el compuesto terapéutico o de diagnóstico comprende un conjugado de ligando peptídico. En ciertas realizaciones, la hidrolasa es una peptidasa o una esterasa. La ventaja de un método de este tipo es que la orientación in vivo hacia una diana del compuesto terapéutico o de

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diagnóstico mejora en comparación con la orientación in vivo del compuesto terapéutico o de diagnóstico en ausencia de dicho o dichos compuestos que inhiben la actividad de dicha hidrolasa. En ciertas realizaciones, el conjugado de ligando peptídico es un conjugado de ligando peptídico natural. En ciertas realizaciones de métodos de la invención, el compuesto terapéutico o de diagnóstico es un radioligando peptídico. En ciertas realizaciones, se marca con una molécula fluorescente para la formación de imágenes ópticas. En ciertas realizaciones, el compuesto terapéutico o de diagnóstico es un conjugado de péptido marcado radiactivamente biodegradable obtenido a partir del grupo que consiste en somatostatina, gastrina, neurotensina, bombesina, neuromedina C y un antagonista del receptor del péptido liberador de gastrina, el neuropéptido sustancia P tal como SP-1, SP-2, hormona estimulante de melanocitos (MSH), y péptido quimiotáctico (CTP).

En ciertas realizaciones de métodos de la descripción, uno o varios compuestos que inhiben la actividad de una o varias hidrolasas se seleccionan a partir del grupo que consiste en inhibidores de la endopeptidasa neutra, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, inhibidores de la enzima convertidora de endotelina, inhibidores de la esterasa, y sus combinaciones. En la presente invención, uno o varios compuestos que inhiben la actividad de una hidrolasa son un inhibidor de la endopeptidasa neutra. Ejemplos representativos de inhibidores de la endopeptidasa neutra incluyen fosforamidón o racecadotrilo. En ciertas realizaciones, uno o varios compuestos que inhiben la actividad de una hidrolasa son un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina.

En ciertas realizaciones de métodos de la invención, el radioligando peptídico es un péptido metalizado radiactivo o halogenado radiactivo a través de un grupo prostético. En ciertas realizaciones, el radioligando peptídico comprende un metal de radionucleido seleccionado a partir del grupo que consiste en 133mIn, 99mTc, 67Ga, 52Fe, 68Ga, 72As, 111In, 97Ru, 203Pb, 62Cu, 64Cu, 51Cr, 52mMn, 157Gd, 123I, 124I, 131I, 75Br, 76Br, 77Br, 82Br, 153Sm, 161Tb, 90Y, 177Lu, y otros metales

de radionucleidos útiles en la radioterapia y/o la formación de imágenes.

En ciertas realizaciones de métodos de la descripción, la administración conjunta del compuesto terapéutico o de diagnóstico y uno o varios compuestos que inhiben la actividad de una hidrolasa comprende:

(i) la administración del compuesto terapéutico o de diagnóstico al mismo tiempo que uno o varios compuestos

que inhiben la actividad de una o varias hidrolasas;

(ii) primero la administración del compuesto terapéutico o de diagnóstico, seguida por la administración de uno

o varios compuestos que inhiben la actividad de una o varias hidrolasas; o

(iii) primero la administración de uno o varios compuestos que inhiben la actividad de una o varias hidrolasas,

seguida por la administración del compuesto terapéutico o de diagnóstico.

En ciertas realizaciones del método de la invención, la combinación de un compuesto terapéutico o de diagnóstico y uno o varios compuestos que inhiben la actividad de una o varias hidrolasas se selecciona a partir del grupo de combinaciones que consisten en: [(X-DOTA)Ala1]SS14 o [(X-DOTA)Ala1, DTrp8]SS14 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-DOTA-MG11 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-demotensina 6 o X- demotensina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-demotensina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra y/o un inhibidor de ECA; X-SAR-NC1 o X-SAR-NC6 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X- Demobesina 4 o X-Demobesina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-Pansarbesina 1 con un inhibidor de NEP; y X-JMV4168 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra, en donde X es un radionucleido útil para la radioterapia o la formación de imágenes. En ciertas realizaciones, la combinación de un compuesto terapéutico o de diagnóstico y uno o varios compuestos que inhiben la actividad de una o varias hidrolasas se selecciona a partir del grupo de combinaciones que consisten en: [(111In-DOTA)Ala1]SS14 o [(111In-DOTA)Ala1, DTrp8]SS14 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 111In-DOTA-MG11 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 99mTc- demotensina 6 o 99mTc-demotensina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 99mTc-demotensina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra y/o un inhibidor de ECA; 99mTc-SAR-NC1 o 99mTc-SAR-NC6 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 99mTc-Demobesina 4 o 99mTc-Demobesina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-Pansarbesina 1 con un inhibidor de NEP; y 111In-JMV4168 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra.

De acuerdo con un aspecto adicional de la descripción, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden un compuesto terapéutico o de diagnóstico que comprende un ligando peptídico, preferiblemente un péptido conjugado con un resto, y uno o varios compuestos que inhiben la actividad de una o varias hidrolasas. En ciertas realizaciones de la descripción, la hidrolasa es una peptidasa o una esterasa. La ventaja de tales composiciones es que la administración de la composición mejora la orientación hacia una diana in vivo del compuesto terapéutico o de diagnóstico, en comparación con la administración de solo el compuesto terapéutico o de diagnóstico solo. En ciertas realizaciones, el ligando peptídico es un ligando peptídico natural. En ciertas realizaciones, el ligando peptídico tiene una modificación N-terminal.

En ciertas realizaciones de una composición de la invención, el compuesto terapéutico o de diagnóstico es un radioligando peptídico. En ciertas realizaciones, está marcado con una molécula fluorescente para la formación de imágenes ópticas. En ciertas realizaciones, el compuesto terapéutico o de diagnóstico es un conjugado peptídico biodegradable, marcado radiactivamente obtenido a partir del grupo que consiste en somatostatina, gastrina, neurotensina, bombesina, neuromedina C, y un antagonista del receptor del péptido liberador de gastrina (GRPR).

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En ciertas realizaciones de una composición de la invención, uno o varios compuestos que inhiben la actividad de una hidrolasa, se seleccionan a partir del grupo que consiste en inhibidores de la endopeptidasa neutra, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, inhibidores de la enzima convertidora de endotelina, inhibidores de la esterasa, y sus combinaciones. En ciertas realizaciones, uno o varios compuestos que inhiben la actividad de la hidrolasa son un inhibidor de la endopeptidasa neutra. Ejemplos representativos de inhibidores de la endopeptidasa neutra incluyen fosforamidón o racecadotrilo. En ciertas realizaciones, uno o varios compuestos que inhiben la actividad de una hidrolasa es un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina.

En ciertas realizaciones de una composición de la invención, el radioligando peptídico es un péptido metalizado radiactivo N-terminal. En ciertas realizaciones, el radioligando peptídico, o el péptido conjugado con un resto, comprende un metal radionucleido seleccionado a partir del grupo que comprende 111In, 99mTc, 94mTc, 67Ga, 66Ga, 68Ga, 52Fe, 69Er, 72As, 97Ru, 203Pb, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 186Re, 188 Re, 86Y, 90Y 51Cr, 52mMn, 157Gd, 177Lu, 161Tb, 169Yb, 175Yb, 105Rh, 166Dy, 166Ho, 153Sm, 149Pm, 151Pm, 172Tm, 121Sn, 177mSn, 213Bi, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 18F, 123I, 124I, 131I, 75Br, 76Br, 77Br y 82Br, y otros metales de radionucleidos útiles en la radioterapia y/o la formación de imágenes.

En ciertas realizaciones de una composición de la invención, la composición comprende una combinación seleccionada a partir del grupo de combinaciones que consiste en: [(X-DOTA)Ala1]SS-14 o [(X-DOTA)Ala1, DTrp8]SS-14 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-DOTA-MG11 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-demotensina 6 o X-demotensina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-demotensina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra y/o lisinopril; X-SAR-NC1 o X-SAR-NC6 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-Demobesina 4 o X-Demobesina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; y X-JMV4168 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra, en donde X es un radionucleido útil para la radioterapia o la formación de imágenes.

En ciertas realizaciones, la composición comprende una combinación seleccionada a partir del grupo de combinaciones que consiste en: [(111In-DOTA)Ala1]SS-14 o [(111In-DOTA)Ala1, DTrp8]SS-14 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 111In-DOTA-MG11 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 99mTc-demotensina 6 o 99mTc- demotensina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 99mTc-demotensina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra y/o lisinopril; 99mTc-SAR-NC1 o 99mTc-SAR-NC6 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 99mTc-Demobesina 4 o 99mTc-Demobesina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; y 111In-JMV4168 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra.

Descripción detallada de la invención

El hallazgo más sorprendente de la invención (realizaciones relativas a NEP) y de la descripción es el inesperado papel prominente de dos vasopeptidasas principalmente, y en particular de la endopeptidasa neutra (NEP, EC 3.4.24.11, o neprilisina, o CD10) y de la enzima convertidora de angiotensina, ECA, EC 3.4.15.1) en el procesamiento in vivo de un gran número de péptidos conjugados con restos de diagnóstico o terapéuticos, en particular péptidos radiactivos. En particular, el papel de NEP en el procesamiento de péptidos radiactivos es compatible con su presencia ubicua y abundante en el organismo. La importancia de la participación de NEP en el catabolismo de todas estas clases de ligandos peptídicos radiactivos, no se ha aclarado de manera adecuada hasta ahora.

Es un resultado excepcional de esta invención, que la inhibición de NEP se aprovecha elegantemente para mejorar la estabilidad in vivo y la orientación hacia una diana in vivo de una amplia gama de ligandos peptídicos radiactivos biodegradables mediante la administración de inhibidor(es) de NEP. Como NEP desempeña un papel central para el catabolismo in vivo de muchos péptidos, entonces un inhibidor de NEP proporciona una solución común para toda esa inestabilidad peptídica. En unos pocos casos en los que ECA también está implicado en el uso de un inhibidor doble de NEP/ECA o una mezcla de un inhibidor de NEP y de ECA, puede provocar de forma sinérgica un efecto más completo.

Otro hallazgo inesperado de esta invención es que en muchos casos la administración de fosforamidón (PA) (u otro inhibidor enzimático) con el radioligando peptídico daba lugar a una mejora notable de los valores tumorales, sin embargo, sin un aumento de la radioactividad de fondo. Esto es particularmente importante para los valores de captación renal y hepática que en ciertos casos, sorprendentemente seguían sin estar afectados después de una prolongación de la semivida biológica de los péptidos radiactivos mediante la administración de inhibidor(es) enzimático(s), tales como fosforamidón (PA). Como resultado, se han alcanzado proporciones sin precedentes entre tumor-no diana y se han vuelto accesibles nuevas oportunidades prometedoras para la terapia con radionucleidos dirigidos.

Además, se constató que la farmacocinética de la combinación del péptido más el inhibidor o la combinación de inhibidores, lo más a frecuentemente es superior en comparación con el uso de péptidos estabilizados.

Otro aspecto de la función central de NEP en el destino metabólico de muchos péptidos radiactivos reside en la expresión y la función fisiológica de NEP en el microentorno, pero también sobre la membrana de las células de cáncer, de muchos tumores humanos, tales como cánceres de próstata, mama y colon. En consecuencia, la administración conjunta de un inhibidor de NEP prolongará la semivida de los péptidos radiactivos no solo en la

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corriente sanguínea, sino también en una proximidad directa de las células cancerosas. Esta estrategia es particularmente beneficiosa en la prolongación de la retención de antagonistas del receptor peptídico GRPR o de otros, marcados radiactivamente, no internalizados que permanecen unidos a la superficie de las células cancerosas y por lo tanto están expuestos más tiempo a enzimas extracelulares peritumorales que los agonistas marcados radiactivamente con internalización rápida.

La industria farmacéutica ha participado intensamente en el desarrollo de una amplia gama de inhibidores selectivos de la vasopeptidasa, con acción individual, doble y triple (para NEP, ECA y/o ECE) como nuevas herramientas terapéuticas. Estas peptidasas están implicadas en la salud y la enfermedad a través de la modulación de muchos péptidos bioactivos, tales como encefalina, bradicinina, sustancia P, endotelina, péptido natriurético atrial y muchos otros. Racecadotrilo, también conocido como acetorfán, es un profármaco que libera el compuesto activo tiorfán como una mezcla racémica. Tiorfán es un fármaco antidiarreico, que actúa como un inhibidor potente de NEP (Ki 1,7 nM (R-tiorfán) y 2,2 nM (S-tiorfán)). Además, racecadotrilo también puede inhibir ECA, pero con una potencia más baja (Ki 4800 nM (R-tiorfán) y 110 nM (S-tiorfán)).

Otro inhibidor de peptidasa adecuado para uso en la invención es fosforamidón (PA). El fosforamidón es un conocido potente inhibidor competitivo reversible de NEP (CI50 34 nM). El fosforamidón inhibe también la enzima convertidora de endotelina (ECE, 3.4.24.71) con una potencia moderada (CI50 3,5 jM) y con baja potencia la enzima convertidora de angiotensina (ECA, 3.4.15.1) (CI50 78 jM). Fue aislado por primera a partir de cultivos de Streptomyces tanashiensis (Umezawa S et al., 1972), pero los métodos para su síntesis conveniente están disponibles recientemente (Donahue MG et al., 2006).

Los efectos de una inyección de fosforamidón (PA) junto con péptidos radiactivos, representativos de somatostatina, gastrina, bombesina, neuromedina C, bombesina, neurotensina y antagonistas de GRPR en la prolongación in vivo de la semivida y la mejora de la orientación hacia un tumor, se presenta a continuación. Se encontró que el fosforamidón era igualmente eficaz cuando se administraba por vía intraperitoneal (i.p.) 40 - 60 min antes de la inyección de radioligando. Efectos análogos se observaron mediante una inyección intraperitoneal (i.p.) de una suspensión de 2,5 mg de racecadotrilo (en DMSO/agua v/v 5/95) 40 - 60 min antes de la inyección de radioligando.

Lisinopril (Lis) es un potente inhibidor de ECA (Ki = 0,1 nM) que se puede utilizar de acuerdo con la invención. Se ha obtenido a partir de los esfuerzos investigativos iniciados mediante el estudio del veneno de una serpiente de cascabel de Brasil (Bothrops jararaca). Lisinopril es históricamente el tercer inhibidor de ECA después de captopril y enalapril y de hecho es el análogo de lisina de este último. Es un fármaco aprobado, aplicado principalmente en el tratamiento de la hipertensión y la insuficiencia cardíaca congestiva (Prinivil®; Zestril®).

La administración conjunta del inhibidor enzimático y el compuesto terapéutico o de diagnóstico, tal como un péptido marcado radiactivamente, puede ser simultánea o posterior. En una realización, se administra el compuesto terapéutico o de diagnóstico al mismo tiempo que el inhibidor. En otra realización, el inhibidor se administra antes del compuesto terapéutico o de diagnóstico. En todavía una realización adicional, el compuesto terapéutico o de diagnóstico se administra en primer lugar seguido por el inhibidor. En la última situación, la administración del inhibidor es preferiblemente inmediatamente después de la administración del compuesto. En una realización adicional, es posible cargar o saturar al paciente con el inhibidor antes de la administración del compuesto terapéutico o de diagnóstico, por ejemplo, mediante una administración repetida por vía oral del inhibidor, por ejemplo, mediante una inyección en bolo del compuesto terapéutico o de diagnóstico.

El inhibidor y el compuesto terapéutico o de diagnóstico se pueden administrar de diversas maneras, tales como por vía oral, inhalación, por vía intranasal, intramuscular, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal o mediante infusión. No es necesario utilizar la misma vía de administración para el inhibidor y para el compuesto terapéutico o de diagnóstico. En el contexto de esta invención, el inhibidor y el compuesto terapéutico o de diagnóstico se utilizan en combinación, pero esto no significa necesariamente que se administran al mismo tiempo o por la misma vía.

Es posible, de acuerdo con la invención, el uso de combinaciones de inhibidores enzimáticos. Tales combinaciones de inhibidores se pueden dirigir a la misma enzima o a diferentes enzimas, tales como contra las peptidasas NEP y ECA o contra una peptidasa y una esterasa.

Los inventores han demostrado que la administración de PA y/u otros inhibidores enzimáticos junto con radioligandos peptídicos, conduce a una mejor estabilidad y una captación tumoral incrementada. Este hallazgo permite el uso de péptidos radiactivos considerados hasta ahora clínicamente "inútiles" debido a la extrema inestabilidad in vivo en el diagnóstico y la terapia.

En realizaciones particulares de la invención se utilizan las siguientes combinaciones:

- [(111In-DOTA)Ala1]SS-14 o [(111In-DOTA)Ala1, DTrp8]SS-14 con PAy/o race

- 111In-DOTA-MG11 con PAy/o race

- 99mTc-demotensina 6 o 99mTc-demotensina 1 con PA y/o lisinopril

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- análogos de 99mTc-NMC, tales como 99mTc-SAR-NC1 y 99mTc-SAR-NC6 con PA

- 99mTc-demobesina 4 o 111In-PanSarbesina 1 con PA

- 99mTc-demobesina 1 con PA o 111In-JMV4168 con PA.

En otra realización, el péptido radiactivo se administra conjuntamente con un sustrato enzimático de toxicidad reducida. Esto bloquea en parte o totalmente la orientación errónea hacia una diana. Cuando la actividad de la peptidasa es inhibida mediante la administración de un sustrato enzimático que compite, el sustrato enzimático que compite es por ejemplo un expansor del plasma proteico, tal como Haemaccel o Gelofusine®.

La invención se ilustrará adicionalmente en los Ejemplos que siguen a continuación y que no están destinados a limitar la invención de ninguna manera. En los ejemplos se hace referencia a las siguientes figuras:

Figura 1

A: Radiocromatograma de sangre de ratón ex vivo 5 min después de una inyección de [(111In- DOTA)Ala1]somatostatina-14 sola (panel superior) o con una inyección conjunta de fosforamidón (PA 30o |jg) (panel medio) o 45 min después de una inyección i.p. de racecadotrilo (race 2,5 mg) (panel inferior). El porcentaje de péptido parental que permanece intacto mediante el tratamiento con PA, aumentó de un 2% a 85% y con el pretratamiento con race hasta >65%.

B: Biodistribución de [(111In-DOTA)Ala1]somatostatina-14 en ratones SCID que eran portadores de tumores AR4-2J (rsst2+) a las 4 h de p.i. Las barras representan la captación promedio como % de dosis inyectada por gramo (% de Dl/g) de al menos 4 animales con desviación estándar (control a las 4 h, 2a barra); tres grupos adicionales de animales recibieron o bien un exceso de [Tyr3]octreotato (Tate, bloqueado - primera barra) o PA (3a barra), o 2,5 mg de race i.p. 40 min antes de la inyección de radioligando (race - 4a barra). Bl = sangre, Li = hígado, He = corazón, Ki = riñones, St = estómago, In = intestino, Sp = bazo, Mu = músculo, Lu = pulmones, Pa = páncreas, Fe = fémur, Ad = glándulas suprarrenales y Tu = tumor AR4-2J. En el grupo tratado con PA, los animales mostraban una captación de 13,87 ± 2,4% de DI/g en el tumor experimental frente a 0,67 ± 0,1% de DI/g en los controles no tratados, mientras que en el grupo de race estos valores eran 3,51 ± 0,2% de DI/g.

Figura 2

A: Radiocromatograma de sangre de ratón ex vivo 5 min después de la inyección de [(111In- DOTA)Ala1,DTrp8]Somatostatina-14 sola (panel superior) o con PA (300 jg, panel inferior). El porcentaje de péptido parental que permanece intacto mediante el tratamiento con PA se eleva de 6% a 95%.

B: Biodistribución de [(111In-DOTA)Ala1,DTrpB]Somatostatina-14 en ratones SCID que eran portadores de tumores AR4-2J (rsst2+) a las 4 h de p.i. Las barras representan la captación promedio como % de dosis media inyectada por gramo (% de DI/g) de al menos 4 animales con desviación estándar (control a las 4 h, 2a barra); dos grupos adicionales de animales recibieron o bien un exceso de Tate (100 jg, bloqueado - primera barra) o PA (300 jg de PA - 3a barra) o se les inyectó previamente i.p. 2,5 mg de race 1 h antes de la inyección del radiotrazador (race - 4a barra). Bl = sangre, Li = hígado, He = corazón, Ki = riñones, St = estómago, In = intestino, Sp = bazo, Mu = músculo, Lu = pulmones, Pa = páncreas, Fe = fémur y Tu = tumor AR4-2J. En el grupo tratado con PA, los animales mostraban una captación de 9,06 ± 3,57% de DI/g en el tumor experimental, mientras que en los animales tratados previamente con race, la captación tumoral esa de 4,18 ± 2,28% de DI/g frente a 1,82 ± 0,36% de DI/g en los controles sin tratar.

Figura 3

A: Radiocromatograma de sangre de ratón ex vivo 5 min después de la inyección de [(111In-DOTA) DGlu10] Minigastrina(10-17) (111In-DOTA-MG11), un análogo truncado de des-(Glu)s-minigastrina, solo (panel superior) o con PA (300 jg de PA - panel central), o se trataron previamente con race (2,5 mg i.p. 1 h antes - panel inferior). El porcentaje de péptido parental que permanecía intacto mediante un tratamiento con PA se eleva de <5% a >70%.

B: Biodistribución de 111In-DOTA-MG11 en ratones SCID que eran portadores de tumores AR4-2J (rCCK2R+) a las 4 h p.i. Las barras representan la captación promedio como % de dosis media inyectada por gramo (% de DI/g) de al menos 4 animales con desviación estándar (control a las 4 h, 1a barra); dos grupos adicionales de animales recibieron simultáneamente PA (600 jg - 2a barra) o se trataron previamente con race (2,5 mg i.p. 1 h antes - 4a barra). Bl = sangre, Li = hígado, He = corazón, Ki = riñones, St = estómago, In = intestino, Sp = bazo, Mu = músculo, Lu = pulmones, Pa = páncreas, Fe = fémur y Tu = tumor AR4-2J. En el grupo tratado con PA, los animales mostraron una captación de 11,12 ± 3,09% de DI/g en el tumor experimental y en el grupo tratado previamente con race, una captación de 6,79 ± 2,02% de DI/g frente a 1,22 ± 0,06% de DI/g en los controles sin tratar.

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Figura 4

A: Radiocromatograma de sangre de ratón ex vivo 5 min después de una inyección de [99mTc]Demotensina 6 ([(99mTc-N4)PAla7,Dab9,Tle12]NT (7-13), 99mTc-N4-pAla-Arg-Dab-Pro-Tyr-Tle-Leu-OH) sola (panel superior) o con PA (panel inferior). El porcentaje de péptido parental que permanece intacto mediante un tratamiento con PA se eleva de 52% a >90%; una reducción escalonada de la dosis desde 300 a 30 a 3 pg no afectaba significativamente a la acción protectora de PA sobre el péptido. Sin embargo, mediante una reducción de la dosis a 0,3 y 0,03 pg de PA, el porcentaje de péptido intacto se reducía a >60% y >55%, respectivamente. Es interesante observar que la inyección conjunta del inhibidor de NEP, PA (300 pg) y el inhibidor de ECA, Lisinopril (Lis - 250 pg) junto con el radioligando, no aumentaba adicionalmente la estabilidad frente a una inyección conjunta del radioligando con PA solo, lo que sugiere que ECA no está implicada en el catabolismo de [99mTc]Demotensina 6 parcialmente estabilizada.

B: Biodistribución de [99mTc]Demotensina 6 en ratones SCID que son portadores de tumores WiDr (hNTS1+) a las 4 h p.i. Las barras representan la captación promedio como % de dosis media inyectada por gramo (% de Dl/g) de al menos 4 animales con desviación estándar (control a las 4 h, 2a barra); tres grupos adicionales de animales recibieron o bien un exceso de NT (1-13) y PA (100 pg de bloqueador y 300 pg de PA - primera barra), o PA (300 pg de PA - 3a barra) o PA y Lis (300 pg de PA + 250 pg de Lis - 4a barra). Bl = sangre, Li = hígado, He = corazón, Ki = riñones, St = estómago, In = intestino, Sp = bazo, Mu = musculares, Lu = pulmones, Pa = páncreas, Fe = fémur y Tu = tumor WiDr. En el grupo tratado con PA, los animales mostraron una captación de 3,56 ± 0,38% de Dl/g en el tumor experimental, mientras que en los animales inyectados conjuntamente con PA + Lis la captación tumoral se mantenía a ese nivel 3,50 ± 0,4% de Dl/g frente a 1,61 ± 0,42% de Dl/g en los controles no tratados. Es interesante observar que el bloqueo era muy eficaz en presencia de PA (0,38 ± 0,15% de Dl/g).

Figura 5

A: Radiocromatograma de sangre de ratón ex vivo 5 min después de la inyección de [99mTc]Demotensina 1 ([(99mTc-N4)Gly7]NT(7-13), 99mTc-N4-Gly-Arg-Arg-Pro-Tyr-lle-Leu-OH) sola (panel superior) o con PA (600 pg o 300 pg de PA, paneles inferiores). El porcentaje de péptido parental que permanece intacto mediante un tratamiento con Pa se eleva de <1% a >25%; una reducción escalonada de la dosis de PA hasta 30 pg daba como resultado solo un 4,5% de péptido original que sobrevivía a los primeros 5 min después de la entrada en la circulación. Una inyección conjunta del péptido radiactivo con una mezcla del inhibidor de NEP, PA (300 pg) y el inhibidor de ECA, Lis (300 pg), elevaba este porcentaje al 56%, lo que implicaba un papel de ECA en el catabolismo. Una inyección conjunta de Lis (+300 pg) solo, aumentaba la cantidad de péptido radiactivo superviviente a únicamente justo por encima del 16%. Por otro lado, un tratamiento previo con race (2,5 mg i.p. 40 minutos antes de la inyección de radioligando) elevaba el porcentaje de péptido intacto a un 37%.

B: Biodistribución de [99mTc]Demotensina 1 en ratones SClD que eran portadores de tumores WiDr (hNTS1+) a las 4 h p.i. Las barras representan la captación promedio como % de dosis media inyectada por gramo (% de Dl/g) de al menos 4 animales con desviación estándar (control a las 4 h, 2a barra); tres grupos adicionales de animales recibieron o bien un exceso de NT y PA (100 pg y 300 pg de PA, respectivamente - primera barra), o PA (300 pg de PA - 3a barra) o PA y Lis (300 pg de PA + 300 pg de Lis - 4a barra). Bl = sangre, Li = hígado, He = corazón, Ki = riñones, St = estómago, ln = intestino, Sp = bazo, Mu = musculares, Lu = pulmones, Pa = páncreas, Fe = fémur y Tu = tumor WiDr. En el grupo tratado con PA, los animales mostraron una captación de 4,58 ± 0,47% de Dl/g en el tumor experimental, mientras que en los animales inyectados conjuntamente con PA + Lis, la captación tumoral se elevaba a 7,71 ± 1,19% de Dl/g frente a 1,20 ± 0,21% de Dl/g en los controles sin tratar. Es interesante observar que el bloqueo era muy eficaz en presencia de PA (0,23 ± 0,09% de Dl/g).

Figura 6

A: Radiocromatograma de sangre de ratón ex vivo 5 min después de la inyección de [99mTc]SAR-NC1 ([(99mTc- N4)Gly1]NMC, [(99mTc-N4-Gly-Asn-His-TrpAla-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2), sola (panel superior) o con PA (300 pg - panel inferior). El porcentaje de péptido parental que permanece intacto mediante un tratamiento con PA se eleva de 30% a 68%.

B: Biodistribución de [99mTc]SAR-NC1 en ratones SClD que son portadores de xenoinjertos de adenocarcinoma de próstata humano PC-3 (GRPR+) a las 4 h p.i. Las barras representan la captación promedio como % de dosis inyectada por gramo (% de Dl/g) de al menos 4 animales con desviación estándar (control a las 4 h, 2a barra); dos grupos adicionales de animales recibieron o bien PA (300 pg - 3a barra) o un exceso de [Tyr4] BBN (100 pg - primera barra) junto con el radioligando. Bl = sangre, Li = hígado, He = corazón, Ki = riñones, St = estómago, ln = intestino, Sp = bazo, Mu = músculo, Lu = pulmones, Pa = páncreas, Fe = fémur y Tu = tumor PC-3. En el grupo tratado con PA, los animales mostraron una captación de 28,34 ± 8,05% de Dl/g en el tumor experimental frente a 6,51 ± 1,91% de Dl/g en los controles sin tratar.

Figura 7

A: Radiocromatograma de sangre de ratón ex vivo 5 min después de la inyección de [99mTc]SAR-NC6 ([(99mTc-

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N4)Gly1,Sar7]NMC, [(99mTc-N4-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Sar-His-Leu-Met-NH2), sola (panel superior) o con PA (300 |jg - panel inferior). El porcentaje de péptido parental que permanecía intacto mediante el tratamiento con PA se eleva de 35% a 7o%.

B: Biodistribución de [99mTc]SAR-NC6 en ratones SCID que son portadores de xenoinjertos de adenocarcinoma de próstata humano PC-3 (GRPR+) a las 4 h p.i. Las barras representan la captación promedio como % de dosis inyectada por gramo (% de Dl/g) de al menos 4 animales con desviación estándar (control a las 4 h, 2a barra); dos grupos adicionales de animales recibieron o bien PA (300 jg - 3a barra) o un exceso de [Tyr4] BBN (100 jg - primera barra) junto con el radioligando. Bl = sangre, Li = hígado, He = corazón, Ki = riñones, St = estómago, In = intestino, Sp = bazo, Mu = músculo, Lu = pulmones, Pa = páncreas, Fe = fémur y Tu = tumor PC-3. En el grupo tratado con PA, los animales mostraron una captación de 27,58 ± 3,47% de Dl/g en el tumor experimental frente a 9,22 ± 1,40% de Dl/g en los controles sin tratar.

Figura 8

A: Radiocromatograma de sangre de ratón ex vivo 5 min después de la inyección de [99mTc]Demobesina 4 (99mTc-N4-Pro-Gln-Arg-Tyr-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Nle-NH2), sola (panel superior) o después de una inyección conjunta i.v. de PA (30, 3 y 0,3 jg) (siguientes paneles). El porcentaje de péptido parental que permanece intacto mediante un tratamiento con PA se eleva de 26% a >77%, >63% y 30%, respectivamente.

B: Biodistribución de [99mTc]Demobesina 4 en ratones SCID que son portadores de xenoinjertos de adenocarcinoma de próstata humano PC-3 (GRPR+) a las 4 h p.i. Las barras representan la captación promedio como % de dosis inyectada por gramo (% de Dl/g) de al menos 4 animales con desviación estándar (control a las 4 h, primera barra); un grupo adicional de animales recibió PA (300 jg - 2a barra) junto con el radioligando. Bl = sangre, Li = hígado, He = corazón, Ki = riñones, St = estómago, In = intestino, Sp = bazo, Mu = músculo, Lu = pulmones, Pa = páncreas, Fe = fémur y Tu = tumor PC-3. En el grupo tratado con PA, los animales mostraron una captación de 35,50 ± 7,50% de Dl/g en el tumor experimental frente a 11,26 ± 1,81% de Dl/g en los controles sin tratar.

Figura 9

A: Radiocromatograma de sangre de ratón ex vivo 5 min después de la inyección de [111ln]PanSarbesina 1 ([(111ln-DOTA-PEG2-DTyr-Gln-Trp-Ala-Val-l3Ala-H¡s-Phe-Nle-NH2) sola (panel superior) o con PA (300 jg - panel inferior). El porcentaje de péptido parental que permanece intacto mediante un tratamiento con PA se eleva del 13% al 80%.

B: Biodistribución de [111ln]PanSarbesina 1 en ratones SClD que son portadores de xenoinjertos de adenocarcinoma de próstata humano PC-3 (GRPR+) a las 4 h p.i. Las barras representan la captación promedio como % de dosis inyectada por gramo (% de Dl/g) de al menos 4 animales con desviación estándar (control a las 4 h, 2a barra); dos grupos adicionales de animales recibieron o bien PA (300 jg - 3a barra) o un exceso de [Tyr4] BBN (100 jg) además de PA (300 jg - primera barra) junto con el radioligando. Bl = sangre, Li = hígado, He = corazón, Ki = riñones, St = estómago, ln = intestino, Sp = bazo, Mu = músculo, Lu = pulmones, Pa = páncreas, Fe = fémur y Tu = tumor PC-3. En el grupo tratado con PA, los animales mostraron una captación de 20,96 ± 2,58% de Dl/g en el tumor experimental frente a 3,75 ± 0,73% de Dl/g en los controles sin tratar. Es interesante observar que con la inyección conjunta del bloqueador y PA (1a barra), los valores tumorales eran mínimos (0,69 ± 0,03% de Dl/g).

Figura 10

A: Radiocromatograma de sangre de ratón ex vivo 5 min después de una inyección de [99mTc]Demobesina 1 ([(99mTc-N4) (ácido p-aminobencil-diglicólico)-[DPhe6,LeuNHEt13]BBN (6-13), sola (panel superior) o después de una inyección conjunta i.v. de PA (300 jg - panel central) o 45 min después de la inyección i.p. de PA (600 jg - panel inferior). El porcentaje de péptido parental que permanece intacto mediante un tratamiento con PA (ya sea i.v. o i.p., con 45 min de antelación) se eleva de 61% a >85%. Un efecto similar se consigue mediante una inyección de [99mTc]Demobesina 1, 1 h después de una inyección i.p. de race (2,5 mg) (panel inferior, Fig. 10A- 2) frente a una inyección de [99mTc]Demobesina 1 sola (panel superior, Fig. 10A-2)

B: Biodistribución de [99mTc]Demobesina 1 en ratones SClD que son portadores de xenoinjertos de adenocarcinoma de próstata humano PC-3 (GRPR+) a las 4 h p.i. Las barras representan la captación promedio como % de dosis inyectada por gramo (% de Dl/g) de al menos 4 animales con desviación estándar (control a las 4 h, primera barra); un grupo adicional de animales recibió PA (300 jg - 2a barra) junto con el radioligando. Bl = sangre, Li = hígado, He = corazón, Ki = riñones, St = estómago, ln = intestino, Sp = bazo, Mu = músculo, Lu = pulmones, Pa = páncreas, Fe = fémur y Tu = tumor PC-3. En el grupo tratado con PA, los animales mostraron una captación de 18,59 ± 0,95% de Dl/g en el tumor experimental frente a 12,73 ± 0,93% de Dl/g en los controles sin tratar.

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Figura 11

A: Radiocromatograma de sangre de ratón ex vivo 5 min después de la inyección de [111In]JMV4168 ([111In]DOTA-pAla-pAla-JMV594, [111In]DOTA-pAla-pAla-DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2) sola

(panel superior) o con PA (panel inferior). El porcentaje de péptido parental que permanece intacto mediante un tratamiento con PA se eleva del 64% al 98%.

B: Biodistribución de [111In]JMV4168 en ratones SCID que son portadores de xenoinjertos de adenocarcinoma de próstata humano PC-3 (GRPR+) a las 4 h p.i. Las barras representan la captación promedio como % de dosis inyectada por gramo (% de Dl/g) de al menos 4 animales con desviación estándar (control a las 4 h, primera barra); un grupo adicional de animales recibió PA (300 |jg - 2a barra) junto con el radioligando. Bl = sangre, Li = hígado, He = corazón, Ki = riñones, St = estómago, In = intestino, Sp = bazo, Mu = músculo, Lu = pulmones, Pa = páncreas, Fe = fémur y Tu = tumor PC-3. En el grupo tratado con PA, los animales mostraron una captación de 23,31 ± 11,07% de Dl/g en el tumor experimental frente a 10,22 ± 2,40% de Dl/g en los controles sin tratar.

C: Una imagen estática SPECT-CT, 1 h (paneles superiores) y 4 h (paneles inferiores) después de la inyección de [111In]JMV4168 solo (imágenes a la izquierda) o junto con PA (imágenes a la derecha). El tumor hGRPR+ PC295 en el o los hombros están definidos de manera excelente en los animales tratados con PA, mientras que en los controles sin tratar, la captación es significativamente peor.

Figura 12

Control [111In]SP-1; + 300 jg de PA; + 300 jg de PA + 300 jg de Lis; SP-1: [(DOTA) Arg1]Sustancia P; SP-1: (DOTA) Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2.

Figura 13

Fig. 13: control [111In]SP-2; + 300 jg de PA; SP-2: [(DOTA) Arg1, Met (O2)11]Sustancia P; SP-2: (DOTA) Arg-Pro- Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met (O2)-NH2.

Figura 14

Figura 14: control [111In]SP-3; + 300 jg de PA; SP-3 [(DOTA) Arg1, Sar9, Met (O2)11]Sustancia P; SP-3: (DOTA) Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Sar-Leu-Met (O2)-NH2.

Figura 15

Figura 15: control [111In]MSH-1; + 300 jg de PA; MSH-1: [(DOTA) Ser1, Nle4]-MSH; MSH-1: (DOTA) Ser-Tyr-Ser- Nle-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2.

Figura 16

Figura 16: control [111In]MSH-2; + 300 jg de PA; MSH-2: [(DOTA) Ser1, Nle4, DPhe7]-MSH; MSH-2: (DOTA) Ser- Tyr-Ser-Nle-Glu-His-DPhe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2.

Figura 17

Figura 17: control [111 In]CTP-1; + 300 jg de PA; CTP-1: For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys (DOTA)-OH (péptido quimiotáctico 1).

EJEMPLO 1

Somatostatina-14

La somatostatina-14 natural provoca sus efectos fisiológicos después de la unión a receptores de somatostatina que comprenden cinco subtipos, sst-i-5. Debido a la expresión de alta densidad de sst2 en tumores neuroendocrinos, se han desarrollado radioligandos estables sintéticos, preferentemente sst2, mientras que la aplicación in vivo de SS14 se ha abandonado debido a su rápida degradación in vivo. Un interés hacia el desarrollo de un análogo de tipo pansomatostatina (uno que se une a las cinco sst-i-5 con alta afinidad) ha renacido por el hecho de que sst-i-5 se expresan por sí solas o en diversas combinaciones, en más tipos de tumores humanos. Los inventores han desarrollado recientemente análogos de SS14 derivatizados en el extremo N-terminal con DOTA para permitir la unión de metales radiactivos trivalentes, tales como 111ln.

Estabilidad in vivo

Para estudiar la estabilidad in vivo y el efecto de la inhibición de la vasopeptidasa sobre la prolongación de la semivida biológica de 111In[(DOTA)Ala1]SS14 y 111In[(DOTA)Ala1,DTrp8]SS14, cada péptido radiactivo se inyectó en la vena de la cola de ratones albinos Swiss, solos o con el inhibidor de NEP fosforamidón (PA, 300 jg). La sangre completa se recogió 5 min después de la inyección (p.i.), se retiraron las células sanguíneas y las proteínas

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principales precipitaron y después se analizó el material sobrenadante mediante RP-HPLC acoplada a un detector gamma.

Alternativamente, el inhibidor doble de NEP y ECA, racecadotrilo (race; 2,5 mg) se inyectó i.p. 45 - 60 min antes de la inyección de radioligando y se siguió el mismo procedimiento que el descrito anteriormente.

Los radiocromatogramas representativos se muestran en la Fig. 1A y la Fig. 2A. De hecho, ambos análogos marcados radiactivamente mostraban una estabilidad in vivo muy débil, a pesar de la modificación del extremo N- terminal común y la sustitución de Trp8 por DTrp8 en el segundo análogo, con unos porcentajes de péptidos intactos no superiores al 2% y 6%, respectivamente. Mediante una inyección conjunta de pA, estos porcentajes aumentaron espectacularmente por encima del 85% y 95%, respectivamente. El tratamiento previo con race provocaba efectos de estabilización similares, pero menos pronunciados, en donde los respectivos porcentajes aumentaban hasta >65%.

Captación tumoral

Es de gran importancia la traducción directa de la estabilización del péptido radiactivo inducida con PA (o race) en un aumento significativo e intenso de la captación tumoral en animales. De hecho, la captación en el tumor rsst2+ AR4-2J después de la inyección de 111In[(DOTA)Ala1]SS14 alcanzó 13,87 ± 2,4% de DI/g en el grupo tratado con PA a las 4 h p.i. frente a 0,67 ± 0,1% de DI/g en los controles sin tratar, mientras que en los ratones tratados previamente con race, los valores tumorales alcanzaban 3,51 ± 0,2% de DI/g, como se presenta en la Fig. 1B. Los valores correspondientes para el análogo DTrp8, mostrados en la Fig. 2B, alcanzaban 9,06 ± 3,57% de DI/g (grupo de PA), 4,18 ± 2,28% de DI/g (grupo de race) y 1,82 ± 0,36% de DI/g (controles sin tratar).

Los anteriores hallazgos inesperados son de gran importancia para la aplicabilidad de análogos de SS14 marcados radiactivamente como herramientas de diagnóstico y terapéuticas de tipo pansomatostatina. Más aún, de cara al hecho de que se conserva el carácter farmacológico de la hormona natural. Los recientes esfuerzos para desarrollar análogos sintéticos de tipo pansomatostatina, han conducido a radioligandos que se unen de manera diferente a algunos o todos los subtipos de sst, o que no se internalizan eficazmente o que muestran una farmacocinética decepcionantemente mediocre. Por consiguiente, la combinación de radioligandos basados en SS14 con PA, proporciona nuevas herramientas moleculares con una sensibilidad potencialmente mayor para el diagnóstico y una eficacia terapéutica, dada la capacidad inherente de SS14 por sí misma para interaccionar de manera más eficaz con las cinco sst-i-5.

Ejemplo 2

Gastrina

La hiperexpresión de los receptores de colecistocinina-2 (CCK2R) en muchos tumores humanos, tales como en el cáncer medular de tiroides (MTC), cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de ovario y otros, los vuelve dianas moleculares atractivas para el diagnóstico y la terapia dirigida a CCK2R con muestras radiomarcadas obtenidas a partir de CCK y gastrina. La mayoría de los radioligandos basados en gastrina muestran una afinidad elevada hacia CCK2R y estabilidad metabólica, pero muestran una acumulación renal indeseable. Por otro lado, las CCKs o gastrinas truncadas en des(Glu)5 radiomarcadas que no se acumulan en el riñón, sufren una degradación muy rápida in vivo y/o menor afinidad hacia CCK2R. Como resultado, la búsqueda de CCKs y gastrinas radiomarcadas clínicamente útiles para el diagnóstico y la terapia dirigida a CCK2R es actualmente intensa. (111In- DOTA)DGlu10] Minigastrina(10-17) (111In-DOTA-MG11) se ha identificado como uno de los radioligandos de des(Glu)5-minigastrina que se degrada más rápidamente, incapaz de lograr una orientación satisfactoria hacia CCK2R en modelos de ratón.

Estabilidad in vivo

Para someter a ensayo la estabilidad in vivo, 111In-DOTA-MG11, esta se inyectó en la vena de la cola de ratones albinos Swiss y 5 min después se recogió sangre, se retiraron las células sanguíneas y precipitaron las proteínas principales y después el material sobrenadante se analizó mediante RP-HPLC acoplada a un detector gamma. Como se muestra en el radiocromatograma de la Fig. 3A, la mayor parte de 111In-DOTA-MG11 se consumía durante este período (se detectaba todavía <5% de péptido intacto), de acuerdo con informes anteriores. Además, 111In- DOTA-MG11 se inyectó junto con PA o se inyectó 1 h después de una inyección i.p. de race (2,5 mg) en más ratones y se siguió el mismo protocolo que anteriormente. Sorprendentemente, el porcentaje de 111In-DOTA-MG11 que se encontraba intacto en la sangre de los ratones tratados con PA aumentó de <5% a 75% y en los ratones tratados previamente con race a 73%.

Orientación hacia un tumor

La "protección in vivo" impredecible de 111In-DOTA-MG11 transportada por PA o race, se tradujo aunque no de forma completa, en un aumento sorprendentemente elevado de la orientación hacia CCK2R en un tumor experimental en ratones. Los resultados de la biodistribución en ratones SCID que eran portadores de tumores rCCK2R+ AR4-2J, 4 h después de la inyección de 111In-DOTA-MG11 sola, o junto con PA, o 1 h después de la

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inyección i.p. de race, se muestran en la Fig. 3B. Lo más sorprendentemente, los valores tumorales alcanzaron 11,11 ± 3,09% de DI/g en el grupo que recibió PA frente a 1,22 ± 0,06% de DI/g en los controles sin tratar, mientras que en el grupo tratado con race este valor alcanzó 6,79 ± 2,02% de DI/g.

Captación renal

Es de particular relevancia el hecho de que la administración de PA, que aunque causaba un aumento asombroso de >9 veces en el tumor, no ejercía absolutamente ningún efecto sobre la captación renal. La misma observación se realizó también para el grupo de race. Como resultado, se lograron relaciones entre tumor-riñón sin precedentes después de la inyección de 111In-DOTA-MG11 mediante un tratamiento con PA o race.

Este hallazgo cumple un requisito previo importante para una terapia eficaz con radionucleidos de tumores CCK2R+. Esta perspectiva es especialmente relevante para los pacientes con MTC, que carecen de opciones terapéuticas en un estado avanzado y diseminado de la enfermedad.

Ejemplo 3

Neurotensina (NT)

La expresión del receptor de neurotensina del subtipo 1 (NTS1R) en cánceres humanos, tales como sarcomas de Ewing, carcinomas pancreáticos ductales exocrinos, cáncer colorrectal y meningiomas, está bien documentada. Especialmente para el cáncer de páncreas exocrino, existe una necesidad urgente de nuevas herramientas clínicas eficaces para su diagnóstico temprano y terapia debido a su alta prevalencia y pronóstico muy malo. En consecuencia, varios de los nuevos análogos de neurotensina (NT) se han desarrollado y marcado radiactivamente con 99mTc o con metales trivalentes (Maes V et al., 2006; Maina T et al., 2007; De Visser M et al 2003) con unos pocos ya evaluados en la práctica clínica. Sin embargo, los resultados han sido decepcionantes hasta el momento y una de las razones principales que se sospechosa para una orientación subóptima hacia la diana, es una mala estabilidad in vivo del radioligando.

Como la estabilidad se ha investigado hasta ahora exclusivamente en el plasma sanguíneo in vitro y las NT radiomarcadas "estabilizadas" tenían malos resultados en los pacientes, los inventores decidieron examinar la estabilidad in vivo usando un análogo de este tipo, [99mTc]Demotensina 6 (99mTc-N4-pAla-Arg-Dab-Pro-Tyr-Tle-Leu- OH). Este análogo, aunque era estable en el plasma de ratón y de pacientes in vitro, no consiguió definir cánceres NTS1R+ in vivo en el hombre, a pesar de su buena capacidad de afinidad e internalización.

Para un análisis sanguíneo ex vivo, [99mTc]Demotensina 6 se inyectó en la vena de la cola de ratones albinos Swiss y la sangre recogida 5 min después se analizó como se ha descrito previamente. El efecto de PA sobre la estabilidad se estudió mediante una inyección conjunta de PA junto con [99mTc]Demotensina 6. Además, un estudio de dosis de PA se realizó con una dosis de PA inyectada que variaba de 300 |jg a 0,03 |jg y los resultados se resumen en la Fig. 4A.

De forma inesperada y aunque la [99mTc]Demotensina 6 se encontró que era >90% estable durante una incubación in vitro con plasma de ratón y plasma humano (Maina T et al., 2007; Gabriel M et al., 2011), in vivo se degradaba a la mitad (52%) ya al cabo de 5 min. Más significativamente, los inventores pudieron observar un efecto directo de PA sobre el la estabilidad in vivo del radioligando, que variaba con la dosis de PA administrada, lo que implicaba un papel importante de NEP en su catabolismo.

Por lo tanto, el porcentaje de [99mTc]Demotensina 6 que permanecía intacto mediante una inyección conjunta de 300 jg de PA, se elevaba a >90% y se mantenía a ese nivel alto incluso reduciendo la dosis de PA a 30 jg inicialmente y luego a 3 jg. Sin embargo, al reducir aún más la dosis a 0,3 jg y, finalmente, a 0,03 jg de PA, el porcentaje de péptido intacto disminuía a >60% y >55%, respectivamente. Es interesante observar que la administración conjunta del inhibidor de ECA, Lis (300 jg) y PA (300 jg) mostraba unos resultados idénticos que cuando se inyectaba PA (300 jg) sola.

En la Fig. 4B se presentan los efectos de tales regímenes en ratones SCID que son portadores del tumor WiDr de adenocarcinoma de colon humano (un tumor hNTS1R+) en la mejoría de la orientación hacia un tumor in vivo. Por tanto, en el grupo que recibía 300 jg de PA junto con el radioligando, los animales mostraron una captación de 3,56 ± 0,38% de DI/g en el tumor experimental, mientras que la captación tumoral de animales inyectados conjuntamente con PA + Lis, se mantuvo a ese nivel 3,50 ± 0,34% de DI/g frente a 1,61 ± 0,42% de DI/g en los controles no tratados, lo que sugiere que NEP solamente está implicada en el catabolismo de [99mTc]Demotensina 6 y el péptido radiactivo es estable frente a la ECA. También es interesante observar que el bloqueo era muy eficaz en presencia de PA (0,38 ± 0,15% de DI/g), lo que muestra que el aumento inducido con PA en el tumor es específico y está mediado por NTS1R.

De manera similar al radiotrazador [99mTc]Demotensina 6 doblemente estabilizado, los inventores estaban interesados además en investigar los efectos de PA sobre [99mTc]Demotensina 1 ([(99mTc-N4) Gly7] NT(7-13), 99mTc- N4-Gly-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH), en donde se conservaba el fragmento peptídico original NT(8-13). Como se muestra en la Fig. 5A, menos del 1% de péptido intacto sobrevivía 5 min in vivo, en comparación con el 52%

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encontrado después de la administración de [99mTc]Demotensina 6, lo que demuestra el impacto claramente positivo de la sustitución estratégica de Arg9 e Ile12 por Dab y Tle, respectivamente, sobre la estabilidad in vivo de [99mTc]Demotensina 6. Una inyección conjunta de 600 |jg o 300 |jg de PA aumentaba el porcentaje de [99mTc]Demotensina 1 detectada en la sangre de ratón hasta un 28% y 25%, respectivamente.

En contraste con [99mTc]Demotensina 6, una inyección conjunta de [99mTc]Demotensina 1 y 30 jg de PA no conseguía estabilizar suficientemente el péptido radiactivo, encontrándose solo un 4,5% en la sangre de ratón. Este hallazgo sugiere que otras enzimas además de NEP están involucradas en el catabolismo in vivo de [99mTc]Demotensina 1.

Con el fin de aclarar esa participación, los inventores inyectaron conjuntamente 300 jg de PA y 300 jg de inhibidor de ECA, Lis, junto con el radioligando. Esta combinación con el inhibidor daba lugar a un 56% total de péptido intacto que sobrevivía en ratones durante 5 min, mientras que una inyección conjunta solo de 300 jg de PA daba lugar a solo un 25% de péptido intacto con el mismo protocolo experimental. Es interesante observar que Lis de forma aislada era capaz de "proteger" la [99mTc]Demotensina 1 solo hasta un 16%. Además, el patrón de metabolitos encontrados mediante el tratamiento con PA difiere significativamente del patrón metabólico después del tratamiento con Lis (Fig. 5A), lo que indica que las dos enzimas atacan diferentes enlaces de la cadena peptídica. Cuando se inyectaba previamente race i.p. (2,5 mg) a los animales antes de la inyección de [99mTc]Demotensina 1, un total de 37% de péptido permanece intacto en la circulación.

En la Fig. 5B se muestran los efectos de los regímenes anteriores sobre ratones SCID que eran portadores de tumores WiDr (hNTS1R+) en la mejora de la orientación hacia el tumor in vivo. Por tanto, en el grupo que recibía 300 jg de PA junto con el radioligando, los animales mostraban una captación tumoral de 4,58 ± 0,47% de Dl/g, mientras que en los animales a los que se inyectaba conjuntamente PA + Lis se elevaba a 7,71 ± 1,19% de Dl/g frente a 1,20 ± 0,21% de Dl/g en los controles sin tratar, lo que sugiere que ambas NEP y ECA están implicadas en el catabolismo del péptido radiactivo, en contraste con la [99mTc]Demotensina 6 que es estable frente a ECA. También es interesante observar que el bloqueo era muy eficaz en presencia de PAy Lis (0,23 ± 0,09% de Dl/g), mostrando que el aumento inducido por PA + Lis en el tumor, es específico y está mediado por NTS1R.

Ejemplo 4

Neuromedina C (NMC)

La expresión de alta densidad de los receptores de péptidos liberadores de gastrina (GRPRs) en muchos cánceres humanos que se producen con frecuencia, tales como el cáncer de próstata y de mama, gastrinomas, cánceres de pulmón de células pequeñas y otros, proporciona la oportunidad para su diagnóstico y terapia usando análogos marcados radiactivamente de tipo bombesina. La neuromedina C (NMC) es el fragmento C-terminal decapéptido (H- Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2), de GRP humana natural que se une con alta afinidad con GRPR. Los inventores han desarrollado recientemente una serie de análogos de NMC funcionalizados en el extremo N- terminal con tetraaminas acíclicas para la unión estable de 99mTc, SAR-NCs, como candidatos para la formación de imágenes de diagnóstico de tumores que expresan GRPR.

La estabilidad in vivo de [99mTc]SAR-NC1 ([(99mTc-N4) Gly1] NMC) y de [99mTc]SAR-NC6 ([(99mTc-N4) Gly1,Sar7] NMC) se sometió a ensayo tal y como se ha descrito anteriormente, recogiendo sangre 5 min después de una inyección de un radioligando solo o junto con 300 jg de PA en ratones albinos Swiss. Como se muestra en la Fig. 6Ay la Fig. 7A, respectivamente, la cantidad de péptido parental superviviente in vivo era del 30% y 35%. El tratamiento con PA (300 jg) duplicaba este porcentaje (>68% y 70%, respectivamente), lo que implicaba a NEP de nuevo en el catabolismo de estos análogos.

En la Fig. 6B y la Fig. 7B, se muestra la biodistribución de [99mTc]SAR-NC1 y [99mTc]SAR-NC6 en ratones SCID que son portadores de xenoinjertos PC-3 de adenocarcinoma de próstata humano (GRPR+), 4 h después, respectivamente, de la inyección de solo el radioligando o con una inyección conjunta de PA (300 jg). En el grupo tratado con PA, los animales mostraban una captación de 28,34 ± 8,05% de Dl/g en el tumor experimental frente a 6,51 ± 1,91% de Dl/g en los controles sin tratar para [99mTc]SAR-NC1. En el caso de [99mTc]SAR-NC6, el grupo tratado con PA, mostraba una captación tumoral de 27,58 ± 3,47% de Dl/g frente a 9,22 ± 1,40% de Dl/g en los controles sin tratar.

Ejemplo 5

Bombesina (BBN)

La orientación hacia tumores humanos GRPR+ se ha intentado a través de un buen número de análogos de bombesina marcados con radionucleidos de diagnóstico y terapéuticos (Maina T et al., 2006; Smith CJ et al., 2005; Lantry LE et al., 2006; Zhang H et al., 2004; Nock B et al., 2005; Schroeder RP et al., 2011; Ananias HJ et al., 2008; Wild D et al., 2011). La [99mTc]Demobesina 4 (99mTc-N4-Pro-Gln-Arg-Tyr-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Nle- NH2) es un análogo de bombesina marcado radiactivamente con 99mTc a través de un quelante acíclico acoplado a su extremo N-terminal Pro. La [99mTc]Demobesina 4 mostraba características prometedoras en las muestras de biopsias humanas y en ratones portadores de xenoinjertos de cáncer de próstata humano GRPR+, aunque su

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estabilidad in vitro en el plasma de ratón era muy alta. El valor clínico de [99mTc]Demobesina 4 como un radiotrazador de diagnóstico está actualmente en estudio en pacientes con cáncer de próstata.

Para someter a ensayo la estabilidad in vivo de [99mTc]Demobesina 4 en ratones, se aplicó el mismo protocolo que se ha descrito anteriormente. El radiotrazador se inyectó solo o junto con cantidades decrecientes de PA (30, 3 y 0,3 |jg) en ratones. Los resultados de un análisis de 5 min de sangre de ratón ex vivo mediante HPLC, se resumen en la Fig. 8A. Se observa muy claramente que el porcentaje de [99mTc]Demobesina 4 que permanece intacto mediante el tratamiento con PA aumenta desde 26% (control) hasta >77%, > 63% y 30%, respectivamente.

Este efecto se puede aprovechar elegantemente para mejorar la acumulación tumoral, y de este modo la sensibilidad del diagnóstico, de [99mTc]Demobesina 4, como se muestra en la Fig. 8B, por lo que la biodistribución de [99mTc]Demobesina 4 en ratones SClD que son portadores de xenoinjertos de PC- 3 se presenta 4 h después de la inyección del radioligando solo o con PA (300 jg). Es interesante observar, que en el grupo tratado con PA, los animales mostraban una captación tumoral de 35,50 ± 7,50% de Dl/g frente a 11,26 ± 1,81% de Dl/g en los controles sin tratar.

En un segundo ejemplo ilustrado en la Fig. 9A, [111In]PanSarbesina 1 ([(111ln-DOTA-PEG2-DTyr-Gln-Trp-Ala-Val- j6Ala-His-Phe-Nle-NH2) un análogo de BBN derivatizado en DOTA marcado con 111ln, con afinidad hacia todos los receptores de BBN humano (GRPR, NMBR y BB3R) se inyectó en ratones albinos Swiss solo o con PA (300 jg) y se recogió sangre 5 min después, siguiendo el protocolo descrito previamente. Los radiocromatogramas respectivos (radioligando solo - panel superior) o con PA (300 jg - panel inferior) muestran que el porcentaje de péptido parental que permanece intacto mediante el tratamiento con PA se eleva de 13% a 80%.

La traducción de este efecto en una mejora de la captación tumoral es bastante destacada, como se puede ver en la Fig. 9B, incluyendo la biodistribución de [111In]PanSarbesina 1 en ratones SCID portadores de xenoinjertos de PC-3 (GRPR+) a las 4 h p.i. (control) o con una inyección conjunta de PA (300 jg) o con una inyección conjunta de un exceso de [Tyr4]BBN (100 jg) además de PA (300 jg) junto con el radioligando. En el grupo tratado con PA, los animales mostraban una captación de 20,96 ± 2,58% de Dl/g en el tumor experimental frente a 3,75 ± 0,73% de Dl/g en los controles sin tratar. Es interesante observar que con la inyección conjunta del bloqueador y PA, los valores tumorales eran mínimos (0,69 ± 0,03% de Dl/g), lo que muestra que PA provocaba un aumento mediado por GRPR en la captación tumoral.

Ejemplo 6

Antagonistas de GRPR

Aunque los antagonistas de GRPR (y en los agonistas del receptor peptídico en general) se han preferido originalmente para la orientación de GRPR hacia tumores humanos debido a su capacidad de internalización en las células cancerosas, la creciente evidencia revela unas características superiores de los antagonistas de GRPR marcados radiactivamente (Nock B et al., 2003; Cescato R et al., 2008; Mansi R et al., 2009; Abd-Elgaliel WR et al., 2008). Dado que los antagonistas no provocan reacciones adversas indeseables después de la unión al GRPR, están mucho mejor tolerados después de una inyección i.v. en los seres humanos que los agonistas. Además, parece que sufren un aclaramiento mucho más rápido desde los tejidos del entorno, incluso desde el páncreas fuertemente GRPR+. Esta calidad conduce frecuentemente a relaciones elevadas entre el tumor y el ruido de fondo después de una inyección de antagonistas de GRPR marcados radiactivamente, lo que favorece de este modo la formación de imágenes de tumores de contraste elevado y alta eficacia terapéutica.

Los antagonistas son compuestos sintéticos y, en general se espera que muestren mayor estabilidad metabólica que los agonistas. Por tanto, los inventores decidieron someter a ensayo la estabilidad in vivo de [99mTc]Demobesina 1 ([(99mTc-N4) (ácido p-aminobencil-diglicólico) - [DPhe6, LeuNHEt13] BBN (6-13), el primer antagonista marcado radiactivamente que muestra una farmacocinética superior en comparación con agonistas modificados de manera similar. La [99mTc]Demobesina 1 ha mostrado una elevada estabilidad in vitro en plasma de ratón, pero mediante un análisis de sangre ex vivo de 5 min p.i., el porcentaje de péptido intacto era de 60-65% (Fig. 10A-1 y 10A-2).

Sin embargo, una inyección conjunta de 300 jg de PA aumentaba este porcentaje a >85% y se observó el mismo aumento cuando se administraban 600 jg de PA i.p., 45 minutos antes de la inyección de radioligando (Fig. 10A). Mediante una inyección i.p. de 2,5 mg de race 1 h antes de la inyección de [99mTc]Demobesina 1, los inventores observaron de nuevo el mismo aumento en el porcentaje de péptido parental (Fig. 10A-2).

El efecto de la estabilización inducida con PA de [99mTc]Demobesina 1 sobre la captación tumoral se ilustra en la Fig. 10B, que muestra la biodistribución 4 h después de la inyección p.i. de [99mTc]Demobesina 1 en ratones SClD que eran portadores de xenoinjertos de PC-3 humanos (GRPR+) (control), o con PA (300 jg). En el grupo tratado con PA, los animales mostraban una captación de 18,59 ± 0,95% de Dl/g en el tumor experimental frente a 12,73 ± 0,93% de Dl/g en los controles sin tratar.

Otro ejemplo característico de la estabilización metabólica del radioligando inducida por PA se muestra en la Fig. 11A. El radiotrazador recientemente sintetizado [111ln]JMV4168 ([111ln]DOTA-pAla-pAla-JMV594, [111ln]DOTA-pAla- pAla-DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2) basado en el potente antagonista de GRPR, JMV594, (Tokita K et

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al., 2001) se inyectó en ratones albinos Swiss solo o junto con PA y se recogió sangre después de 5 min mediante HPLC, se analizó como se ha detallado anteriormente.

[111In]JMV4168 mostraba una estabilidad más alta (64%) que los agonistas de GRPR, tales como [99mTc]SAR-NCs (30-35%), o [99mTc]Demobesina 4 (26%), y comparable a la del antagonista de GRPR [99mTc]Demobesina 1 (61- 65%), que se aprovechaba claramente del tratamiento con PA, con un 98% que permanecía estable.

Esta prolongación in vivo de la semivida se traducía en una captación tumoral mayor en los ratones portadores de xenoinjertos PC-3 GRPR+. Como se muestra en la Fig. 11B, los valores tumorales aumentaban desde 10,22 ± 2,40% de DI/g en los controles sin tratar a 23,31 ± 11,07% de DI/g en los ratones que recibían PA. Es de gran interés el hecho, que la captación en el páncreas seguía siendo muy baja.

En la Fig. 11C, se observó el efecto de una inyección conjunta de PA con [111In]JMV4168 sobre la definición de un tumor hGRPR+ implantado en una imagen SPECT/CT. Los tumores PC295 hGRPR+ en el o los hombros se definen de manera excelente en los animales tratados con PA, mientras que en los controles sin tratar, la captación es significativamente peor. Además, no se muestra ninguna evidencia de captación pancreática en ninguna de las imágenes, de acuerdo con los resultados de la respectiva biodistribución en ratones portadores de tumores PC-3 hGRPR+.

Este hallazgo tiene implicaciones dosimétricas en el tratamiento de tumores GRPR+ con antagonistas de GRPR marcados radiactivamente. De hecho, es una modalidad muy potente para mejorar selectivamente la captación en lesiones tumorales, pero no en tejidos que expresan GRPR, tales como el páncreas, evitando de este modo en los mismos, dosis de radiación nocivas. Dado que la degradación enzimática local difiere entre el páncreas y el tumor, es posible de acuerdo con la invención estabilizar selectivamente los radioligandos en el tumor y solo el medio peritumoral.

Ejemplo 7

Péptidos alternativos

Se han estudiado grupos adicionales de péptidos radiactivos con relevancia para aplicaciones de medicina nuclear por su estabilidad in vivo. Los péptidos radiactivos se inyectaron en la vena de la cola de ratones sanos, solos o con un inhibidor de NEP (PA - 300 |jg), o con una mezcla de inhibidor de NEP (PA - 300 |jg) y ECA (Lis - 300 |jg); alternativamente, otro profármaco inhibidor de NEP (race - 2,5 mg) se inyectó i.p. en los animales “45 min antes de la inyección de radioligando. La sangre se recogió 5 min después, y se analizó por RP-HPLC después de una preparación adecuada, como se ha descrito previamente.

Los péptidos se agrupan en las siguientes categorías:

Análogos de la sustancia P: SP-1 es la secuencia no modificada de SP con DOTA acoplado a su extremo N- terminal. El catabolismo in vivo de [111In]SP-1 (Fig. 12 - panel superior) es extremadamente rápido con solo un 7% de supervivencia en ese periodo. Mediante una inyección conjunta de PA (300 jg), este porcentaje aumenta a 32% (Fig. 12 - panel central), mientras que mediante una inyección conjunta de mezcla de inhibidor NEP y ECA (300 jg de PA + 300 jg de Lis), el porcentaje asciende a más del 60% (Fig. 12 - panel inferior), lo que implica la función combinada de NEP y ECA en el catabolismo de [111In]SP-1 in vivo.

En SP-2, Met11 se oxida a la correspondiente sulfona, descrita por su alta afinidad hacia el subtipo de receptor de neurocinina-1 (NK1R). En este caso, la inhibición de NEP mediante el tratamiento con PA aumenta el porcentaje de supervivencia de [111In]SP-2 desde un 24% (Fig. 13 - panel superior) hasta “80% (Fig. 13 - panel superior), lo que muestra que la oxidación de Met11 confiere una estabilidad extra, especialmente frente a ECA.

En SP-3, una modificación adicional en la cadena peptídica original, y, específicamente, la sustitución de Gly9 por Sar9, incrementa adicionalmente la estabilidad in vivo, con un 51% de supervivencia de [111In]SP-3 en la circulación (Fig. 14 - panel superior) y este porcentaje aumenta a casi un 90% mediante una inyección conjunta de PA (Fig. 14 - panel inferior)

Análogos de MSH: dos análogos de MSH para la orientación hacia el receptor de MSH (MSHR) están acoplados a DOTA en su extremo N-terminal y se estudia la estabilidad de los respectivos péptidos radiactivos 111In, como se ha descrito anteriormente. En la Fig. 15 (panel superior) se observa que el 52% de [111In]MSH-1 sobrevive en la corriente sanguínea de ratón y mediante una inyección conjunta de PA (panel inferior), este porcentaje se eleva por encima del 90%. La sustitución de Phe7 por DPhe7 aumenta sustancialmente la estabilidad en [111In]MSH-2 hasta un 77% (Fig. 16 - panel superior). Sin embargo, una inyección conjunta de PA estabiliza casi totalmente el análogo (97% de péptido intacto: Fig. 16 (panel inferior)).

Análogos de péptido quimiotáctico (CTP) dirigidos hacia una infección tal y como se ejemplifica con [111In]-CTP1. Como se muestra en la Fig. 17 (panel superior), solo el 2% del radioligando se mantiene intacto 5 min después de la entrada en la circulación en ratones sanos, mientras que mediante una inyección conjunta de PA sobrevive un “84%.

Referencias

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Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Inhibidor de la endopeptidasa neutra (NEP) para uso en el diagnóstico/tratamiento in vivo del cáncer en donde el uso comprende una administración conjunta con un péptido marcado radiactivamente, en donde el péptido marcado radiactivamente se selecciona de los grupos que consisten en somatostatinas, gastrinas, CCKs, neurotensinas, bombesinas, neuromedinas C, hormonas estimulantes de melanocitos y péptidos de la sustancia P.
2. 2. Inhibidor de la endopeptidasa neutra (NEP) para uso según la reivindicación 1, en donde el inhibidor de la endopeptidasa neutra comprende fosforamidón o racecadotrilo.
3. 3. Compuesto para uso según la reivindicación 2, en el que el fosforamidón se utiliza en combinación con lisinopril.
4. 4. Compuesto para uso según las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido marcado radiactivamente se selecciona a partir de somatostatina-14, minigastrina(10-17), demotensina 1 y 6, demobesina 4, Pansarbesina 1, SAR-NCs tales como SAR-NC1 y SAR -NC6, demobesina 1, JMV4168, SP-1, SP-2, SP-3, MSH-1, MSH-2 y 111In- CTP-1.
5. 5. Compuesto para uso según las reivindicaciones 1 a 4, en el que la administración conjunta comprende una administración intravenosa del péptido marcado radioactivamente.
6. 6. Una composición que comprende (i) un conjugado de péptido biodegradable marcado radiactivamente, y (ii) un inhibidor de la endopeptidasa neutra (NEP), en donde el conjugado de péptido biodegradable marcado radiactivamente se selecciona a partir de los grupos que consisten en somatostatinas, gastrinas, CCKs, neuromedinas C, hormonas estimulantes de melanocitos y péptidos de la sustancia P.
7. 7. La composición según la reivindicación 6, en la que el inhibidor de la endopeptidasa neutra (NEP) comprende fosforamidón o racecadotrilo.
8. 8. La composición según la reivindicación 7, en la que el fosforamidón es una combinación de fosforamidón con lisinopril.
9. 9. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que el ligando peptídico es un péptido metalizado radiactivo o un péptido halogenado radiactivo a través de un grupo prostético.
10. 10. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que el ligando peptídico comprende un metal o un halógeno radionucleido seleccionado a partir del grupo que comprende 111In, 99mTc, 94mTc, 67Ga, 66Ga, 68Ga, 52Fe, 69Er, 72As, 97Ru, 203Pb, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 186Re, 188Re, 86Y, 90Y, 51Cr, 52mMn, 157Gd, 177Lu, 161Tb, 169Yb, 175Yb, 105Rh, 166Dy, 166Ho, 153Sm, 149Pm, 151Pm, 172Tm, 121Sn, 177mSn, 213Bi, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 18F, 123I, 124I, 131I, 75Br, 76Br, 77Br y 82Br.
11. 11. Una composición que comprende (i) un ligando peptídico marcado radiactivamente, y (ii) un inhibidor de la endopeptidasa neutra (NEP), en donde la composición comprende una combinación seleccionada a partir del grupo de combinaciones que consiste en: [(X-DOTA)Ala1]SS-14 o [(X-DOTA)Ala1,DTrp8]SS-14 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-DOTA-MG11 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-demotensina 6 o X- demotensina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-SAR-NC1 o X-SAR-NC6 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; X-Demobesina 4 o X-Pansarbesina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; y X- Demobesina 1 o X-JMV4168 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra, o X-SP-1/2/3 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra, o X-MSH-1/2 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra, o X-CTP con un inhibidor de la endopeptidasa neutra, en donde X es un radionucleido útil para la radioterapia o la formación de imágenes.
12. 12. La composición según la reivindicación 11, en donde la composición comprende una combinación seleccionada a partir del grupo de combinaciones que consiste en: [(111In-DOTA)Ala1]SS14 o [(111In-DOTA)Ala1,DTrp8]SS14 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 111In-DOTA-MG11 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 99mTc- demotensina 6 o 99mTc-demotensina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 99mTc-SAR-NC1 o 99mTc-SAR- NC6 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 99mTc-Demobesina 4 o 111In-Pansarbesina 1 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 99mTc-Demobesina 1 o 111In-JMV4168 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; DOTA(111In)-SP-1/2/3 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; DOTA(111In)-MSH-1/2 con un inhibidor de la endopeptidasa neutra; 111In-CTP con un inhibidor de la endopeptidasa neutra.
13. 13. Una composición que comprende (i) un conjugado de péptido biodegradable marcado radiactivamente, y (ii) un inhibidor de la endopeptidasa neutra (NEP), en donde el conjugado de péptido biodegradable marcado radiactivamente se selecciona a partir de los grupos que consisten en somatostatinas, gastrinas, CCKs, neurotensinas, bombesinas, neuromedinas C, hormonas estimulantes de melanocitos y péptidos de la sustancia P para uso en un método de diagnóstico/tratamiento in vivo del cáncer.