ES2682356T3 - Aptámero para IL-17 y uso del mismo - Google Patents

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Zenyaku Kogyo KK
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Abstract

Un aptámero que comprende una secuencia representada (i) por la siguiente fórmula (Ia), que se une a IL-17 para inhibir la unión de IL-17 y el receptor de IL-17: g(M)g(M)g(M)u(M)a'(M)g'(X1)c(M)c(M)g'g(M)a'(X4)g(X5)g(M)a(M)g(X5)u'(F)c(X7)a'(X2)g(X6)u'(F)r(X3)a'(X3)u( M)c(M)g(M)g(M)u'(X7)a'(M)c'(M)c'(M)c'(M) en donde a, g, c y u son cada uno un ARN en donde la base es adenina, guanina, citosina y uracilo, respectivamente, r es un ARN en donde la base es adenina o guanina, a', g' y c' son cada uno un ARN o ADN en donde la base es adenina, guanina y citosina, respectivamente, u' es un ARN en donde la base es uracilo, un ADN en donde la base es uracilo o un ADN en donde la base es timina, los paréntesis en un nucleótido indican modificación del nucleótido, (M) indica que, cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa en el mismo está sustituido por un grupo O-metilo, (F) indica que, cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa en el mismo está sustituido por un átomo de flúor, (X1) indica que el nucleótido está sin modificar o fosforotioado, o cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa en el mismo está sustituido por un átomo de flúor, (X2) indica que el nucleótido está sin modificar, o cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa en el mismo está sustituido por un átomo de flúor, (X3) indica que el nucleótido está sin modificar, o cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa en el mismo está sustituido por un grupo O-metilo, (X4) indica que el nucleótido está sin modificar, o cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa en el mismo está sustituido por un átomo de flúor o un grupo O-metilo, (X5) indica que el nucleótido está sin modificar o fosforotioado, (X6) indica que el nucleótido está sin modificar o fosforotioado, o cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa en el mismo está sustituido por un grupo O-metilo, y (X7) indica que cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa en el mismo está sustituido por un átomo de flúor o un grupo O-metilo; o (ii) por la siguiente fórmula (II), que se une a IL-17 para inhibir la unión de IL-17 y el receptor de IL-17: g(x1)g(x1)g(x1)u(F)ag(S)c(F)c(F)g'(S)g(x2)aggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)ac'(x3)c'(x3)c'(x3) en donde a, g, c y u son cada uno un ARN en donde la base es adenina, guanina, citosina y uracilo, respectivamente, g' y c' son cada uno un ARN o ADN en donde la base es guanina o citosina, respectivamente, los paréntesis en un nucleótido indican modificación del nucleótido, (F) indica que un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa en el nucleótido está sustituido por un átomo de flúor, (S) indica que, cuando el nucleótido es ARN, está fosforotioado, (x1) indica que el nucleótido está modificado con ácido nucleico bloqueado (ANB), o cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa en el mismo está sustituido por un grupo Ometilo, (x2) indica que un nucleótido está sin modificar, o cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa en el mismo está sustituido por un grupo O-metilo, y (x3) indica que un nucleótido está sin modificar, o modificado con ANB.

Description

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En una forma de realización preferible, la presente invención proporciona un aptámero que comprende una secuencia representada por la siguiente fórmula (I), que se une a IL-17 para inhibir la unión de IL-17 y el receptor de IL-17:
g(M)g(M)g(M)u(M)a'(M)g'(X1)c(M)c(M)g'g(M)a'(X2)gg(M)a(M)gu'(F)c(F)a'(X2)gu'(F)a(X3)a'(X3)u(M)c(M)g(M)g(M)u'(F)a' (M)c'(M)c'(M)c'(M)
en donde a, g, c, y u, a’, g’, c’ y u’, así como (M), (F) y (X1)-(X3) son como se han definido para la fórmula (Ia).
En una forma de realización preferible, además, la presente invención proporciona un aptámero que comprende una secuencia representada por la siguiente fórmula (Ia’’), que se une a IL-17 para inhibir la unión de IL-17 y el receptor de IL-17:
g(M)g(M)g(M)u(M)a'(M)g(X5)c(M)c(M)Gg(M)a(X7)g(X5)g(M)a(M)g(X5)u'(F)c(X7)a(F)g(X6)u'(F)r(X3)a(X3)u(M)c(M)g(M)g (M)u(X7)a'(M)c'(M)c'(M)c'(M)
en donde a, g, c, u y r, a’, c’ y u’, así como (M), (F), (X3) y (X5)-(X7) son como se han definido para la fórmula (Ia), y G es un ADN en donde la base es guanina.
En una forma de realización preferible, además, la presente invención proporciona un aptámero que se une a IL-17 para inhibir la unión de IL-17 y el receptor de IL-17, en donde, en la fórmula (Ia’’), c'(M)c'(M)c'(M) en el lado 3’ terminal es c(M)c(M)c(M).
Un aptámero se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una actividad de unión para una molécula diana particular. El aptámero puede inhibir la actividad de una molécula diana particular uniéndose a la molécula diana particular. El aptámero de la presente divulgación puede ser un ARN, un ADN, un ácido nucleico modificado o una mezcla de los mismos. El aptámero de la presente divulgación también puede estar en una forma lineal o cíclica.
IL-17 se refiere a una citoquina secretada por células Th17 y similares, y es, por ejemplo, una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada por el código de acceso AAH67505 o NP002181. IL-17 algunas veces se denomina IL-17A o CTLA-8. Además de ser producida en cuerpos animales, IL-17 como se usa en la presente divulgación se puede producir usando células de ratón y otros mamíferos, células de insecto, células de Escherichia coli y similares, y también se puede preparar por síntesis química. Cuando IL-17 se prepara por cultivo celular o síntesis química, se puede preparar fácilmente un mutante. Aquí, un mutante significa una secuencia en donde varios aminoácidos se han sustituido o una secuencia parcial de aminoácidos, y significa una proteína o péptido que tiene al menos una de las actividades esencialmente poseídas por IL-17. Cuando se sustituye un aminoácido, el aminoácido sustituyente puede ser un aminoácido natural, o puede ser un aminoácido no natural. Como se menciona en el presente documento, IL-17 incluye estos mutantes.
Un receptor de IL-17 significa una proteína de superficie celular a la que se une IL-17 y una proteína que media la señalización intracelular. Como miembros de la familia del receptor de IL-17, se conocen IL-17RA, IL-17RB, IL17RC, IL-17RD e IL-17RE. Como se ha mencionado en el presente documento, el receptor de IL-17 puede ser una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos naturales, o puede ser un mutante de la misma. Aquí, un mutante significa una secuencia en donde varios aminoácidos se han sustituido o una secuencia parcial de aminoácidos, y significa una proteína o péptido que posee actividad de unión para IL-17. El aptámero proporcionado en el presente documento inhibe la unión de IL-17 y el receptor de IL-17.
Si el aptámero de la presente divulgación inhibe la unión de IL-17 y el receptor de IL-17 se puede evaluar, por ejemplo, mediante la siguiente prueba.
Para la medida se usa BIAcore2000 o T100 fabricado por BIAcore. Se inmoviliza proteína A (21181, PIERCE) en un chip sensor CM5, y una proteína en donde el receptor de IL-17 y la parte Fc de IgG están fusionadas (por ejemplo, quimera IL-17R recombinante humano-Fc (177-IR, R&D systems)) se inmoviliza sobre la misma. La cantidad que se va a inmovilizar es aproximadamente 20 (para 2000) o aproximadamente 1200RU. Como analito, se mezclan IL-17 (aproximadamente 100 o 150 nM) y un aptámero (aproximadamente 50 o 100 nM), se mantienen durante 15 min y la mezcla se inyecta en BIAcore2000. Se detecta la unión de IL-17 al receptor de IL-17.
Según se vuelve más bajo el valor, se juzga que el aptámero inhibe más fuertemente la unión de IL-17 y el receptor de IL-17.
En una forma de realización preferible, el aptámero proporcionado en el presente documento se une a IL-17 para inhibir la unión de IL-17 y el receptor de IL-17, por lo cual puede inhibir la actividad de señalización de IL-17 derivada de cualquier mamífero. Los ejemplos del mamífero incluyen primates (por ejemplo, seres humanos, monos), roedores (por ejemplo, ratones, ratas, cobayas), y animales de compañía, animales domésticos y animales de trabajo (por ejemplo, perros, gatos, caballos, ganado, cabras, ovejas, cerdos).
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La inhibición de la actividad de señalización de IL-17 significa una capacidad inhibidora contra cualquier actividad de señalización que tenga IL-17. Por ejemplo, se sabe que IL-17 se une al receptor de IL-17, y activa la ruta de NF-κB y la ruta de MAP quinasa a través de TRAF6 y similar, y después se induce la producción de varias citoquinas y quimioquinas a través de tales rutas de transducción de señales. Por tanto, la actividad inhibidora de la señalización de IL-17 se refiere a una actividad que inhibe la producción de estas citoquinas, quimioquinas y similares, que están presentes al final de la ruta de transducción de señales de IL-17. Puesto que la expresión de estas citoquinas y quimioquinas induce la migración y activación de células inflamatorias, la actividad inhibidora de la señalización contra IL-17 también significa inhibición de las actividades de las mismas.
En el aptámero de la presente divulgación, una parte del nucleótido se modifica como se muestra en las fórmulas mencionadas anteriormente (Ia), (Ia’), (I) y (Ia’’) para aumentar la propiedad de unión a IL-17, actividad inhibidora de unión contra IL-17 y el receptor de IL-17, y similar.
En la presente especificación, nucleótido que está sin modificar significa que un grupo hidroxilo en la posición 2’ de la ribosa en un ribonucleótido, o hidrógeno en la posición 2’ de la ribosa en un desoxirribonucleótido no está sustituido por otro elemento, y nucleótido que está modificado significa, por ejemplo, que un grupo hidroxilo en la posición 2’ de la ribosa en un ribonucleótido está sustituido por un átomo de flúor o un grupo O-metilo, el nucleótido está fosforotioado, modificado con un ácido nucleico bloqueado (ANB), y similar. El “nucleótido está fosforotioado” significa que un grupo ácido fosfórico en un sitio de unión entre nucleótidos adyacentes está sulfurado, es decir, un enlace fosfodiéster se convierte a un enlace fosforotioato, y que está modificado con ANB significa que un átomo de oxígeno en la posición 2’ de la ribosa y un átomo de carbono en la posición 4’ del nucleótido están entrecruzados con metileno.
Se pueden realizar varias modificaciones mostradas en las fórmulas (Ia), (Ia’), (I) y (Ia’’) según un método conocido por sí (por ejemplo, Sproat et al., (1991), Nucl. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991), Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973), Biochemistry 12, 5138-5145 y similares).
La presente invención también proporciona un aptámero que se une a IL-17 para inhibir la unión de IL-17 y el receptor de IL-17, que comprende una secuencia en donde un nucleótido en donde, cuando es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2’ de la ribosa en el mismo está opcionalmente sustituido por un grupo O-metilo y la base es guanina se añade al extremo 5’ de la secuencia representada por la fórmula (Ia), (Ia’), (I) o (Ia’’) y/o un nucleótido en donde la base es citosina se añade al extremo 3’ del mismo.
Preferiblemente, el aptámero de la presente invención puede ser un aptámero que comprende una secuencia seleccionada de los aptámeros No. 3-49 y 52-94 mostrados posteriormente. También se proporciona en el presente documento un conjugado de una pluralidad de tales aptámeros siempre que se una a IL-17 e inhiba la unión de IL-17 y el receptor de IL-17.
En el conjugado mencionado anteriormente de una pluralidad de tales aptámeros, la conjugación se puede lograr por unión en tándem. En la conjugación, se puede utilizar un enlazador. Como el enlazador, se pueden mencionar cadenas de nucleótidos (por ejemplo, de 1 a aproximadamente 20 nucleótidos) y cadenas no nucleotídicas (por ejemplo, enlazador -(CH2)n-, enlazador -(CH2CH2O)n-, enlazador hexaetilenglicol, enlazador TEG, enlazador que contiene péptido, enlazador que contiene enlace -S-S-, enlazador que contiene enlace -CONH-, enlazador que contiene enlace -OPO3-). La pluralidad como se ha mencionado en los conjugados plurales descritos anteriormente no está particularmente limitada, siempre que sea dos o más, y la pluralidad puede ser, por ejemplo, 2, 3 o 4.
La longitud del aptámero de la presente divulgación no está particularmente limitada, y habitualmente puede ser no más de aproximadamente 200 nucleótidos. Cuando el número total de nucleótidos es menor, la síntesis química y producción en masa será más fácil, y hay una ventaja principal en términos de coste. También se considera que la modificación química es fácil, y la estabilidad en el cuerpo es alta. Por tanto, desde los aspectos de aplicación al uso de un producto farmacéutico, el aptámero de la presente invención más deseablemente tiene una longitud de bases más corta de 70 nucleótidos, preferiblemente no más de aproximadamente 50 nucleótidos, más preferiblemente no más de aproximadamente 40 nucleótidos (por ejemplo, no más de 40 nucleótidos, no más de 39 nucleótidos, no más de 38 nucleótidos, no más de 37 nucleótidos, no más de 36 nucleótidos), lo más preferiblemente no más de aproximadamente 35 nucleótidos (por ejemplo, no más de 35 nucleótidos, no más de 34 nucleótidos, no más de 33 nucleótidos).
En otra forma de realización, además, la presente invención proporciona un aptámero que comprende una secuencia representada por la siguiente fórmula (II), que se une a IL-17 para inhibir la unión de IL-17 y el receptor de IL-17:
g(x1)g(x1)g(x1)u(F)ag(S)c(F)c(F)g'(S)g(x2)aggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)ac'(x3)c'(x3)c'(x3)
en donde a, g, c y u son cada uno un ARN en donde la base es adenina, guanina, citosina y uracilo, respectivamente, g’ y c’ son cada uno un ARN o ADN en donde la base es guanina o citosina, respectivamente,
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los paréntesis en un nucleótido indican modificación del nucleótido,
(F)
indica que un grupo hidroxilo en la posición 2’ de la ribosa en el nucleótido está sustituido por un átomo de flúor,
(S)
indica que, cuando el nucleótido es ARN, está fosforotioado, (x1) indica que el nucleótido está modificado con ANB, o cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2’ de la ribosa en el mismo está sustituido por un grupo O-metilo, (x2) indica que un nucleótido está sin modificar, o cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2’ de la ribosa en el mismo está sustituido por un grupo O-metilo, y (x3) indica que un nucleótido está sin modificar, o modificado con ANB.
Además, en un aptámero que contiene una secuencia representada por la anteriormente mencionada fórmula (II), el nucleótido está parcialmente modificado como en el aptámero que contiene una secuencia representada por la anteriormente mencionada fórmula (Ia), (Ia’), (I) o (Ia’’). La modificación mostrada en la fórmula (II) se puede realizar según un método conocido por sí como se ha mencionado anteriormente.
Preferiblemente, el aptámero de la presente invención puede ser un aptámero que contiene una secuencia seleccionada de los aptámeros No. 1 o 2 mostrados posteriormente. También se proporciona en el presente documento un conjugado de una pluralidad de tales aptámeros siempre que se una a IL-17 e inhiba la unión de IL-17 y el receptor de IL-17.
En el conjugado mencionado anteriormente de una pluralidad de tales aptámeros, la conjugación se puede lograr por unión en tándem. En la conjugación, se puede utilizar un enlazador. Como el enlazador, se pueden mencionar cadenas de nucleótidos (por ejemplo, de 1 a aproximadamente 20 nucleótidos) y cadenas no nucleotídicas (por ejemplo, enlazador -(CH2)n-, enlazador -(CH2CH2O)n-, enlazador hexaetilenglicol, enlazador TEG, enlazador que contiene péptido, enlazador que contiene enlace -S-S-, enlazador que contiene enlace -CONH-, enlazador que contiene enlace -OPO3-). La pluralidad como se ha mencionado en los conjugados plurales descritos anteriormente no está particularmente limitada, siempre que sea dos o más, y la pluralidad puede ser, por ejemplo, 2, 3 o 4.
En el aptámero de la presente divulgación, la base del ácido nucleico se puede alterar adicionalmente (por ejemplo, sustitución química) para aumentar la propiedad de unión a IL-17, actividad inhibidora de unión contra IL-17 y el receptor de IL-17, estabilidad, y similares. Tal alteración incluye la del extremo 3’ y el extremo 5’ tal como formación de caperuza.
Se puede realizar adicionalmente una alteración añadiendo a un extremo un polietilenglicol, aminoácido, péptido, dT invertida, ácido nucleico, nucleósidos, polinucleótido, miristoilo, oleilo litocólico, docosanilo, lauroilo, estearoilo, palmitoilo, oleoilo, linoleoilo, otros lípidos, esteroides, colesterol, cafeína, vitaminas, pigmentos, sustancias fluorescentes, agente anticáncer, toxina, enzimas, sustancia radioactiva, biotina y similar. Para tales alteraciones, véase, por ejemplo, las patentes en EE UU 5.660.985 y 5.756.703.
En particular, cuando se realiza una alteración por adición terminal de PEG, el peso molecular del PEG no está particularmente limitado, y es preferiblemente 1000-100000, más preferiblemente 20000-9000. El PEG puede ser lineal o ramificado en dos o más cadenas (PEG multibrazo). En relación a la adición terminal de PEG, se puede añadir solo a uno del extremo 3’ y el extremo 5’, o a ambos del extremo 3’ y el extremo 5’.
Tal PEG no está particularmente limitado, y los expertos en la materia puede seleccionar y usar apropiadamente PEG comercialmente disponible o conocido (por ejemplo, http://www.peg-drug.com/peg_product/branched.htlm). Ejemplos preferibles específicos de PEG que se va a aplicar al aptámero proporcionado en el presente documento incluyen PEG de tipo CS y PEG de tipo GS (SUNBRIGHT ME-200GS fabricado por NOF CORPORATION) que tiene un peso molecular de 20000, PEG de tipo GS con dos ramificaciones que tiene un peso molecular de 40000 (SUNBRIGHT GL2-400GS2 fabricado por NOF CORPORATION), PEG de tipo TS con dos ramificaciones que tiene un peso molecular de 40000 (SUNBRIGHT GL2-400TS fabricado por NOF CORPORATION), PEG de tipo TS con 4 ramificaciones que tiene un peso molecular de 40000 (SUNBRIGHT GL4-400TS fabricado por NOF CORPORATION), PEG de tipo TS con 2 ramificaciones que tiene un peso molecular de 80000 (SUNBRIGHT GL2800TS fabricado por NOF CORPORATION), PEG de tipo TS con 4 ramificaciones que tiene un peso molecular de 80000 (SUNBRIGHT GL4-800TS fabricado por NOF CORPORATION) y similares.
En este caso, en el aptámero proporcionado en el presente documento, el PEG se puede añadir directamente al extremo. Es más preferible que un enlazador que tiene un grupo que se puede unir a PEG y similar se deba añadir al extremo del mismo, y el PEG se debe añadir al aptámero proporcionado en el presente documento a través del enlazador.
El enlazador para PEG y el aptámero proporcionado en el presente documento no está particularmente limitado, y el número de cadena de carbono, grupo funcional y similar se puede seleccionar apropiadamente según el sitio de unión, el tipo de PEG y similar. Los ejemplos de tal enlazador incluyen un enlazador que tiene un grupo amino. Específicamente, cuando se añade al extremo 5’, se pueden mencionar enlazador ssH (SAFC) o DMS(O)MT-AMINO-MODIFIER (GLEN RESEARCH), y cuando se añade al extremo 3’, se puede mencionar TFA amino C-6 lcaa CPG (ChemGenes) y similar. Cuando este enlazador se selecciona, por ejemplo, se añade un grupo activo de N
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hidroxisuccinimida al PEG, y se hace reaccionar con el grupo amino en el lado del enlazador, mediante lo cual el aptámero proporcionado en el presente documento se puede unir a PEG a través del enlazador.
Como PEG y enlazador, se pueden usar preferiblemente productos comercialmente disponibles. Las condiciones de reacción y similar respecto a la unión de PEG, un enlazador y el aptámero proporcionado en el presente documento las pueden determinar apropiadamente los expertos en la materia.
El aptámero proporcionado en el presente documento se puede sintetizar químicamente como se divulga en el presente documento y por un método conocido por sí en la técnica. Un aptámero se une a la molécula diana en una amplia variedad de modos de unión, tal como enlaces iónicos basados en la carga negativa del grupo fosfato, enlaces hidrofóbicos y enlaces de hidrógeno basados en la ribosa, y enlaces de hidrógeno e interacción de apilamiento basado en bases de ácidos nucleicos. En particular, los enlaces iónicos basados en la carga negativa del grupo fosfato, que están presentes en el mismo número que el número de nucleótidos constituyentes, son fuertes y se unen a lisina y arginina que están presentes en la superficie de la carga positiva de la proteína. Por esta razón, las bases de ácido nucleico no implicadas en la unión directa a la molécula diana se pueden sustituir. En particular, puesto que la región de la estructura de tallo ya ha formado pares de bases y se enfrenta al interior de la estructura de doble hélice, es poco probable que las bases del ácido nucleico se unan directamente a la molécula diana. Por tanto, incluso cuando un par de bases se sustituye con otro par de bases, la actividad del aptámero con frecuencia no disminuye. En estructuras en donde no se forman pares de bases, tal como estructuras en bucle, siempre que la base del ácido nucleico no esté implicada en la unión directa a la molécula diana, la sustitución de la base es posible. Respecto a las modificaciones de la posición 2’ de la ribosa, el grupo funcional en la posición 2’ de la ribosa con poca frecuencia interacciona directamente con la molécula diana, pero en muchos casos, no tiene relevancia, y se puede sustituir por otra molécula modificada. Por tanto, un aptámero, a menos que el grupo funcional implicado en la unión directa a la molécula diana se sustituya o suprima, con frecuencia retiene la actividad del mismo. También es importante que la estructura tridimensional global no cambie mucho.
Un aptámero se puede preparar utilizando el método SELEX o una versión mejorada del mismo (por ejemplo, Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510). En el método SELEX, al aumentar el número de rondas o usar una sustancia competidora, un aptámero que muestra un potencial de unión más fuerte para la molécula diana se concentra y selecciona. Por tanto, ajustando el número de rondas de SELEX y/o cambiando la condición competitiva, se pueden obtener en algunos casos aptámeros con diferentes fuerzas de unión, aptámeros con diferentes formas de unión, y aptámeros con la misma fuerza de unión o modo de unión, pero diferentes secuencias de bases. El método SELEX comprende un proceso de amplificación por PCR; al producir una mutación usando iones manganeso y similares en el proceso, es posible realizar SELEX con mayor diversidad.
Los aptámeros obtenidos por SELEX son ácidos nucleicos que muestran alta afinidad por la molécula diana, pero esto no significa unión a un sitio bioactivo de la molécula diana. Por tanto, los aptámeros obtenidos por SELEX no actúan necesariamente sobre la función de la sustancia diana. IL-17 es una proteína básica, y se piensa que es probable permitir que los ácidos nucleicos se unan a misma de forma no específica. Un aptámero que no se une a un sitio activo no afecta la actividad de la sustancia diana. De hecho, el ARN usado para control no inhibió la unión de IL-17 y el receptor de IL-17.
El aptámero activo así seleccionado se puede someter a optimización por SELEX para alcanzar alta función. Para la optimización por SELEX, se prepara un molde en donde un aptámero con una secuencia determinada se aleatoriza parcialmente o un molde dopado con aproximadamente del 10 al 30% de secuencias aleatorias, y se realiza SELEX otra vez.
Un aptámero obtenido por SELEX tiene una longitud de aproximadamente 70 nucleótidos, y esto no es fácil de preparar como un medicamento como está. Por tanto, es necesario repetir esfuerzos de ensayo y error para acotar el aptámero a una longitud de aproximadamente 50 nucleótidos o menos que permita la síntesis química fácil.
Dependiendo del diseño de los cebadores para un aptámero obtenido por SELEX, la facilidad de la posterior operación de minimización cambia. A menos que se diseñe un cebador apropiado, el posterior desarrollo será imposible incluso si un aptámero con actividad se selecciona por SELEX. En la presente divulgación, se puede obtener un aptámero capaz de mantener la actividad incluso con 31 nucleótidos (aptámeros No. 1-4, 6-15, 19-49 y 52-94) o 33 nucleótidos (aptámeros No. 5 y 16-18).
Los aptámeros son fácilmente modificables porque permiten la síntesis química. Para los aptámeros, al predecir la estructura secundaria usando el programa MFOLD, o al predecir la conformación por análisis de rayos X o análisis de RMN, es posible predecir a algún nivel qué nucleótido se puede sustituir o suprimir, y dónde insertar un nuevo nucleótido. Un aptámero predicho con la nueva secuencia se puede sintetizar químicamente con facilidad, y se puede determinar si el aptámero retiene o no la actividad usando un sistema de ensayo existente.
Cuando una región importante para la unión del aptámero obtenido con la molécula diana se identifica por esfuerzos repetidos de ensayo y error como se ha descrito anteriormente, la actividad permanece sin cambios en muchos
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casos incluso cuando se añade una nueva secuencia a ambos extremos de la secuencia. La longitud de la nueva secuencia no está particularmente limitada.
Las modificaciones, como secuencias, dan una amplia gama de diseño o alteraciones.
Como se ha manifestado anteriormente, los aptámeros permiten una amplia gama de diseño o alteraciones. La presente divulgación también proporciona un método de producción de aptámero que permite una amplia gama de diseño o alteración de un aptámero que comprende una secuencia especificada (por ejemplo, una secuencia que corresponde a una parte seleccionada de entre regiones tallo, regiones bucle internas, regiones bucle en horquilla y regiones monocatenarias: de aquí en adelante, abreviado como secuencia fija según se requiera).
Por ejemplo, el método de producción de tal aptámero incluye la producción de un aptámero que comprende una secuencia fija usando un único tipo de molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos mostrada por:
Tabla 1 Secuencia cebadora (i)
-(N)a -secuencia fija-(N)b
Secuencia cebadora (ii) -
en donde (N)a representa una cadena de nucleótidos que consiste en “a” unidades de N; (N)b representa una cadena de nucleótidos que consiste en “b” unidades de N; cada una de las unidades de N, ya sean idénticas o diferentes, es un nucleótido seleccionado del grupo que consiste en A, G, C, U y T (preferiblemente A, G, C y U). Cada uno de “a” y “b”, sean idénticos o diferentes, puede ser cualquier número, y puede ser, por ejemplo, de 1 hasta aproximadamente 100, preferiblemente de 1 hasta aproximadamente 50, más preferiblemente de 1 hasta aproximadamente 30, aún más preferiblemente de 1 hasta aproximadamente 20 o de 1 hasta aproximadamente 10,
o tipos plurales de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, genoteca de moléculas de ácido nucleico diferente en el número de a, b, etc.), y pares de cebadores correspondientes a las secuencias de cebadores (i) y (ii), respectivamente.
La presente invención también proporciona un complejo que comprende el aptámero de la presente invención y una sustancia funcional unida al mismo. La unión entre el aptámero y la sustancia funcional en el complejo puede ser un enlace covalente o un enlace no covalente. El complejo de la presente divulgación puede ser uno en donde el aptámero de la presente divulgación y una o más (por ejemplo, 2 o 3) de sustancias funcionales del mismo tipo o tipos diferentes están unidos. La sustancia funcional no está particularmente limitada, siempre que nuevamente añada una cierta función a un aptámero de la presente divulgación, o sea capaz de cambiar (por ejemplo, mejorar) una cierta característica que un aptámero de la presente divulgación pueda poseer. Como ejemplos de la sustancia funcional se pueden mencionar proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos, azúcares, monosacáridos, polinucleótidos, y nucleótidos. Como ejemplos de la sustancia funcional, se pueden mencionar sustancias de afinidad (por ejemplo, biotina, estreptavidina, polinucleótidos que poseen afinidad para una secuencia complementaria diana, anticuerpos, glutatión Sepharosa, histidina), sustancias para marcaje (por ejemplo, sustancias fluorescentes, sustancias luminiscentes, radioisótopos), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina), vehículos de administración de fármacos (por ejemplo, liposoma, microesferas, péptidos, polietilenglicoles), fármacos (por ejemplo, los usados en terapia de misiles tal como caliqueamicina y duocarmicina; análogos de mostaza de nitrógeno tal como ciclofosfamida, melfalán, ifosfamida o trofosfamida; etileniminas tal como tiotepa; nitrosoureas tal como carmustina; agentes alquilantes tal como temozolomida o dacarbacina; antagonistas metabólicos de tipo folato tal como metotrexato o raltitrexed; análogos de purina tal como tioguanina, cladribina, o fludarabina; análogos de pirimidina tal como fluorouracilo, tegafur o gemcitabina; alcaloides de la vinca tal como vinblastina, vincristina o vinorelbina y análogos de los mismos; derivados de podofilotoxina tal como etopósido, taxanos, docetaxel o paclitaxel; antraciclinas tal como doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina y mitoxantrona, y análogos de las mismas; otros antibióticos citotóxicos tal como bleomicina y mitomicina; compuestos de platino tal como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino; pentostatina, miltefosina, estramustina, topotecano, irinotecano y bicalutamida), y toxinas (por ejemplo, toxina ricina, liatoxina y toxina Vero). Estas moléculas funcionales por último se eliminan en algunos casos. Además, las moléculas pueden ser péptidos que son reconocidos y cortados por enzimas tal como trombina, metaloproteinasa de matriz (MMP), y factor X, y pueden ser polinucleótidos que pueden ser cortados por nucleasas
o enzimas de restricción.
El aptámero o complejo de la presente divulgación se puede usar como, por ejemplo, un medicamento, fármaco diagnóstico, fármaco de examen, o reactivo. El mismo es particularmente útil como un medicamento, fármaco diagnóstico, fármaco de examen, o reactivo para enfermedades de inflamación, enfermedades autoinmunitarias y similares.
Los ejemplos de enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias y similares incluyen esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), espondilitis anquilosante (EA), síndrome de Sjögren, polimiositis (PM), dermatomiositis (DM), artritis reumatoide (AR), artrosis, enfermedad intestinal inflamatoria (enfermedad de Crohn y similar), esclerosis sistémica (PSS), esclerodermia, periarteritis nodosa (PN), enfermedad de la glándula tiroides (enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, y similares), síndrome de Guillain-Barré, cirrosis biliar
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primaria (CBP), purpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica autoinmunitaria, miastenia grave (MG), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), diabetes mellitus de tipo I, psoriasis en placa, psoriasis pustular, asma, anomalías funcionales de neutrófilos, neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática, neumonía hipersensible, cáncer (por ejemplo, cáncer esofágico, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga urinaria, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de pecho, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama, neuroblastoma, glioblastoma, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer ovárico, tumor de Wilms, cáncer de próstata, osteosarcoma), enfermedad de trasplante (por ejemplo, rechazos a injertos, enfermedad del injerto contra el huésped), alergia (por ejemplo, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimentaria, urticaria, neumonitis de hipersensibilidad), enfermedades asociadas a ANCA, distrofia muscular de Duchenne, enfisema, edema pulmonar, tuberculosis pulmonar, proteinosis alveolar pulmonar, linfangioleiomiomatosis pulmonar (LAM), neumotórax, pleuritis, adhesión posoperatoria, endometriosis, periodontitis adulta, bronquitis, enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (EPOC), infecciones, degeneración macular senil, retinopatía, glaucoma, cataratas, uveítis, enfermedad de Behcet, hepatitis, cirrosis, insuficiencia hepática, infarto renal, nefritis, insuficiencia renal, cistitis, infarto cerebral, hemorragia cerebral, hemorragia intracraneal, hemorragia subaracnoide, encefalopatía hipersensible, embolia cerebral, ataque isquémico cerebral transitorio, osteomielitis, artritis piogénica, osteoporosis, hernia de disco intervertebral, gota y similares.
El aptámero o complejo de la presente divulgación también se puede usar como un vehículo de administración de fármacos, una sonda para imagenología in vivo, una sonda para la determinación de concentraciones en sangre de IL-17, una sonda para tinción histológica, una sonda para ELISA, y un ligando para la separación y purificación de IL-17.
Se sabe que IL-17 actúa en varias células como fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales, condrocitos, osteoblastos, progenitores de células dendríticas, células intersticiales derivadas de la médula, células T, macrófagos, y neutrófilos. IL-17 induce la producción y expresión de varias citoquinas, quimioquinas, receptores, moléculas de adhesión, enzimas y similar actuando sobre estas células. Específicamente, se pueden mencionar CXCL1 (KC o Groα), CXCL2 (MIP2 o Groβ), CXCL5 (LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL8 (IL-8), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP10), CXCL11 (I-TAC), CCL2 (MCP-1), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL11 (Eotaxina), CXCL12 (SDF-1), CCL20 (MIP3α), IL-1, IL-6, IL-19, TNF, CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), ICAM-1, VCAM-1, PTGS2 (COX2), NOS2 (iNOS), LCN2 (24p3), DEFB4 (BD2), S100A7 (Psoriasina), S100A8 (Calgranulina A), S100A9 (Calgranulina B), MUC5AC, MUC5B, EREG, SOCS3, TNFSF11 (RANKL), MMP1, MMP3, MMP9, MMP13, TIMP1, ADAMTS4, PGE2, SCF, CD80, CD86, MHC y similares. Por tanto, el aptámero o complejo de la presente divulgación se puede usar como un medicamento, fármaco diagnóstico, fármaco de examen, o reactivo para enfermedades asociadas con estas células y citoquinas, quimioquinas y similares.
Al unirse a un receptor de IL-17, IL-17 activa Act1 y TRAF6, y activa la ruta de NF-κB, la ruta de MAP quinasa, la ruta de C/EBP y similares. Por tanto, el aptámero o complejo de la presente divulgación se puede usar como un medicamento, fármaco diagnóstico, fármaco de examen, o reactivo para enfermedades asociadas con estas rutas de transducción de señales.
El aptámero de la presente divulgación o complejo se puede usar para la profilaxis o tratamiento de enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias y similares (por ejemplo, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), espondilitis anquilosante (EA), síndrome de Sjögren, polimiositis (PM), dermatomiositis (DM), artritis reumatoide (AR), artrosis, enfermedad intestinal inflamatoria (enfermedad de Crohn y similar), esclerosis sistémica (PSS), esclerodermia, periarteritis nodosa (PN), enfermedad de la glándula tiroides (enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, y similares), síndrome de Guillain-Barré, cirrosis biliar primaria (CBP), purpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica autoinmunitaria, miastenia grave (MG), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), diabetes mellitus de tipo I, psoriasis en placa, psoriasis pustular, asma, anomalías funcionales de neutrófilos, neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática, neumonía hipersensible), cáncer (por ejemplo, cáncer esofágico, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga urinaria, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de pecho, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama, neuroblastoma, glioblastoma, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer ovárico, tumor de Wilms, cáncer de próstata, osteosarcoma), enfermedad de trasplante (por ejemplo, rechazos a injertos, enfermedad del injerto contra el huésped), alergia (por ejemplo, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimentaria, urticaria, neumonitis de hipersensibilidad), enfermedades asociadas a ANCA, distrofia muscular de Duchenne, enfisema, edema pulmonar, tuberculosis pulmonar, neumonitis de hipersensibilidad, proteinosis pulmonar, linfangioleiomiomatosis pulmonar (LAM), neumotórax, pleuritis, adhesión posoperatoria, endometriosis, periodontitis adulta, bronquitis, enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (EPOC), infecciones, degeneración macular senil, retinopatía, glaucoma, cataratas, uveítis, enfermedad de Behcet, hepatitis, cirrosis, insuficiencia hepática, infarto renal, nefritis, insuficiencia renal, cistitis, infarto cerebral, hemorragia cerebral, hemorragia intracraneal, hemorragia subaracnoide, encefalopatía hipersensible, embolia cerebral, ataque isquémico cerebral transitorio, osteomielitis, artritis piogénica, osteoporosis, hernia de disco intervertebral, y gota.
El medicamento de la presente divulgación puede ser uno formulado con un soporte farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos del soporte farmacéuticamente aceptable incluyen, pero no están limitados a, excipientes tal como sacarosa, almidón, manitol, sorbitol, lactosa, glucosa, celulosa, talco, fosfato de calcio, y carbonato de calcio; aglutinantes tal como celulosa, metilcelulosa, hidroxilpropilcelulosa, polipropilpirrolidona, gelatina, goma arábiga,
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142c, clorofluorocarbono-134a, clorofluorocarbono-227, clorofluorocarbono-C318, y 1,1,1,2.tetrafluoroetano, hidrocarburos tal como propano, isobutano y n-butano, éteres tal como éter dietílico, gases comprimidos tal como gas nitrógeno y gas dióxido de carbono y similares.
La dosis del fármaco de la presente divulgación varía dependiendo del tipo y actividad del principio activo, gravedad de la enfermedad, especie animal que es el sujeto de administración, tolerancia al fármaco del sujeto de administración, peso corporal, edad y similares, y la dosis habitual, basada en la cantidad de principio activo por día para un adulto, puede ser de aproximadamente 0,0001 hasta aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 hasta aproximadamente 10 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,005 hasta aproximadamente 1 mg/kg.
La presente divulgación también proporciona un soporte de fase sólida que tiene el aptámero o el complejo de la presente divulgación inmovilizado en el mismo. Como ejemplos del soporte de fase sólida, se pueden mencionar un sustrato, una resina, una placa (por ejemplo, placa multipocillo), un filtro, un cartucho, una columna, y un material poroso. El sustrato puede ser uno usado en matrices de ADN, matrices de proteína y similares; por ejemplo, se pueden mencionar sustratos de níquel-PTFE (politetrafluoroetileno), sustratos de vidrio, sustratos de apatita, sustratos de silicio, sustratos de alúmina y similares, y sustratos preparados recubriendo estos sustratos con un polímero y similar. Como ejemplos de la resina, se pueden mencionar partículas de agarosa, partículas de sílice, un copolímero de acrilamida y N,N’-metilenbisacrilamida, partículas de divinilbenceno entrecruzado con poliestireno, partículas de dextrano entrecruzado con epiclorohidrina, fibra de celulosa, polímeros entrecruzados de alildextrano y N,N’-metilenbisacrilamida, polímeros sintéticos monodispersados, polímeros hidrofílicos monodispersados, Sepharosa, Toyopearl y similares, y también se incluyeron resinas preparadas uniendo varios grupos funcionales a estas resinas. El soporte de fase sólida de la presente divulgación puede ser útil en, por ejemplo, purificar, detectar y cuantificar IL-17.
El aptámero o complejo de la presente divulgación se puede inmovilizar sobre un soporte de fase sólida por un método conocido por sí. Por ejemplo, se puede mencionar un método que introduce una sustancia de afinidad (por ejemplo, las descritas anteriormente) o un grupo funcional predeterminado en el aptámero o el complejo de la presente divulgación, y después inmovilizar el aptámero o complejo sobre el soporte de fase sólida a través de la sustancia de afinidad o grupo funcional predeterminado. La presente divulgación también proporciona tales métodos. El grupo funcional predeterminado puede ser un grupo funcional que se puede someter a una reacción de acoplamiento; por ejemplo, se puede mencionar un grupo amino, un grupo tiol, un grupo hidroxilo, y un grupo carboxilo. La presente divulgación también proporciona un aptámero que tiene tal grupo funcional introducido en el mismo.
La presente divulgación también proporciona un método de purificar y concentrar IL-17. En particular, la presente divulgación hace posible separar IL-17 de las proteínas de otras proteínas de la familia.
Por tanto, en una forma de realización, la presente divulgación proporciona un método de purificación de IL-17, que comprende (a) una etapa de poner en contacto el aptámero o complejo de la presente divulgación con una muestra que contiene IL-17 para permitir la unión de IL-17 en la muestra al aptámero o complejo, y (b) una etapa de separar la IL-17 unida al aptámero o complejo de la muestra.
El método de purificación y concentración de la presente divulgación puede comprender adsorber IL-17 al soporte de fase sólida de la presente divulgación, y eluir la IL-17 adsorbida con un eluyente. La adsorción de IL-17 al soporte de fase sólida de la presente divulgación se puede lograr por un método conocido por sí. Por ejemplo, una muestra que contiene IL-17 (por ejemplo, cultivo bacteriano o celular, sobrenadante de cultivo, o sangre) se introduce en el soporte de fase sólida de la presente divulgación o una composición que contiene el mismo. IL-17 se puede eluir usando un eluyente tal como una solución neutra. No hay limitación sobre el eluyente neutro, que puede tener un pH, por ejemplo, de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, preferiblemente de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5, y más preferiblemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 8. La solución neutra también puede comprender, por ejemplo, una sal de potasio (por ejemplo, KCl), una sal de sodio (por ejemplo, NaCl), una sal de magnesio (por ejemplo, MgCl2), un tensioactivo (por ejemplo, Tween 20, Triton, NP40), y glicerina. El método de purificación y concentración de la presente divulgación puede comprender además lavar el soporte de fase sólida usando una solución de lavado después de la adsorción de IL-17. Los ejemplos de la solución de lavado incluyen las que contienen urea, un agente quelante (por ejemplo, EDTA), Tris, un ácido, un álcali, ARN de transferencia, ADN, tensioactivos tal como Tween 20, sales tal como NaCl y similares. El método de purificación y concentración de la presente divulgación puede aún comprender además calentar el soporte de fase sólida. Esta etapa permite la regeneración y esterilización del soporte de fase sólida.
El aptámero o complejo de la presente invención se puede utilizar como una sonda de detección, particularmente como una sonda para la detección de IL-17. El método de marcar el aptámero no está particularmente limitado; se pueden aplicar métodos conocidos por sí. Tales métodos incluyen, por ejemplo, marcaje con un radioisótopo, marcaje con un colorante fluorescente o proteína fluorescente, y similares.
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aptámero No. 49: g(M)g(M)g(M)u(M)Agc(M)c(M)Gg(M)Agg(M)a(M)gTc(F)agTaau(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)CCC
5 Se evaluó si los aptámeros mostrados por los aptámeros No. 1-49 inhiben la unión de IL-17 y el receptor de IL-17 por el método de resonancia de plasmón de superficie.
Para la medida, se usó BIAcore2000 fabricado por BIAcore. Se inmovilizó proteína A (21181, PIERCE) en un chip sensor CM5, y una quimera IL-17R recombinante humana-Fc (177-IR, R&D systems) en donde la parte Fc de IgG se
10 fusionó se inmovilizó sobre la misma a aproximadamente 20 RU. Como analito, se mezclaron IL-17 (100 o 150 nM) y un aptámero (50 o 100 nM) mostrado por el aptámero No. 1-49, se mantuvieron durante 15 min y después de eso la mezcla se hizo fluir.
Los resultados de la capacidad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17 se muestran en la tabla 2 a continuación. En
15 la tabla 2, se muestra un efecto del aptámero de la presente invención sobre la capacidad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17 como un valor relativo respecto a la cantidad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17 como 100. Además, se produjo el aptámero contra IL-17 descrito en la referencia del estado de la técnica WO 2010/008001 y se usó para comparación con el aptámero de la presente invención. La secuencia del aptámero producido es como se describe a continuación.
20 aptámero No. 50 (SEQ ID NO: 3): ggu(F)c(F)u(F)agc(F)c(F)ggaggagu(F)c(F)agu(F)aau(F)c(F)ggu(F)agac(F)c(F).
Los valores mostrados en la tabla 2 indican que el aptámero se une más fuertemente a IL-17 según el valor se 25 vuelve menor, es decir, el aptámero tiene una alta actividad inhibidora de unión contra IL-17 y el receptor de IL-17.
[Tabla 2-1] Actividad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17
Capacidad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17 (%)
IL-17
100
aptámero No. 50
37,12
aptámero No. 1
28,63
aptámero No. 2
32,02
aptámero No. 3
25,26
aptámero No. 4
26,78
aptámero No. 5
32,31
aptámero No. 6
25,31
aptámero No. 7
18,37
aptámero No. 8
15,35
aptámero No. 9
8,94
aptámero No. 10
25,23
aptámero No. 11
16,75
aptámero No. 12
24,38
aptámero No. 13
13,75
aptámero No. 14
16,50
aptámero No. 15
14,22
aptámero No. 16
27,95
aptámero No. 17
4,21
aptámero No. 18
13,62
aptámero No. 19
8,46
aptámero No. 20
18,53
aptámero No. 21
22,75
aptámero No. 22
11,58
aptámero No. 23
13,44
aptámero No. 24
15,23
aptámero No. 25
11,73
aptámero No. 26
13,60
aptámero No. 27
13,35
aptámero No. 28
13,24
aptámero No. 29
13,30
aptámero No. 30
14,08
aptámero No. 31
16,18
aptámero No. 32
13,16
aptámero No. 33
15,95
aptámero No. 34
19,52
aptámero No. 35
14,96
aptámero No. 36
18,59
aptámero No. 37
15,53
aptámero No. 38
15,09
aptámero No. 39
14,76
aptámero No. 40
15,49
aptámero No. 41
13,19

[Tabla 2-2] Actividad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17 (continuación)
Capacidad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17 (%)
aptámero No. 42
12,99
aptámero No. 43
15,24
aptámero No. 44
17,88
aptámero No. 45
19,21
aptámero No. 46
20,03
aptámero No. 47
17,65
aptámero No. 48
19,24
aptámero No. 49
19,04
5 Como resultado de la medida, todos los aptámeros alterados-modificados de nuevo mostraron una actividad inhibidora de unión aumentada comparados con el aptámero convencionalmente conocido (aptámero No. 50). Un aptámero que tenía una alta actividad inhibidora mostró aproximadamente 8 veces mayor actividad inhibidora de unión.
10 De lo anterior, se ha mostrado que el aptámero de la presente invención tiene una mayor actividad inhibidora de unión contra la unión de IL-17 y el receptor de IL-17, comparado con aptámeros convencionalmente conocidos.
Ejemplo 1-2: Preparación de aptámero que inhibe la unión de IL-17 y el receptor de IL-17 – 2
15 Los aptámeros representados por los aptámeros No. 52-94 descritos posteriormente se sintetizaron por el mismo método que en el ejemplo 1-1 y usando un sintetizador automático.
La secuencia de nucleótidos de cada uno de los aptámeros obtenidos se muestra posteriormente. Nótese que a, g, c, u son cada uno un ARN en donde la base es adenina, guanina, citosina y uracilo, respectivamente, A, G, C, T son
20 cada uno un ADN en donde la base es adenina, guanina, citosina y timina, respectivamente, mc es un ARN en donde la base es metilcitosina. Los paréntesis en nucleótidos indican modificación del nucleótido, (M) indica que, cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2’ de la ribosa en el mismo está sustituido con un grupo O-metilo, y (F) indica que, cuando el nucleótido es un ARN, un grupo hidroxilo en la posición 2’ de la ribosa en el mismo está sustituido con un átomo de flúor. (S) indica que el nucleótido está fosforotioado, y (L) indica
25 modificación con ANB. Por ejemplo, c(F) es citidina en donde un grupo hidroxilo en la posición 2’ de la ribosa está sustituido por un átomo de flúor, a(M) es adenosina en donde la posición 2’ de la ribosa está sustituida por un grupo O-metilo, y g(M) es guanosina en donde la posición 2’ de la ribosa está sustituida por un grupo O-metilo (de aquí en adelante se va a describir de forma similar).
30 Cada secuencia empieza con el extremo 5’, y el terminal es el extremo 3’.
aptámero No. 52:
g(M)g(M)g(M)u(M)Ag(S)c(M)c(M)Gg(M)a(F)gg(M)a(M)g(S)Tc(F)a(F)gTa(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)CCC
35 aptámero No. 53: g(M)g(M)g(M)u(M)Ag(S)c(M)c(M)Gg(M)a(F)gg(M)a(M)gTc(F)a(F)g(S)Ta(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)CCC
aptámero No. 54:
g(M)g(M)g(M)u(M)Ag(S)c(M)c(M)Gg(M)a(F)gg(M)a(M)gUc(F)a(F)gUa(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)CCC
40 aptámero No. 55: g(M)g(M)g(M)u(M)Ag(S)c(M)c(M)Gg(M)a(F)gg(M)a(M)gTc(F)a(F)gTgau(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)CCC
aptámero No. 56: 45 g(M)g(M)g(M)u(M)Ag(S)c(M)c(M)Gg(M)a(F)gg(M)a(M)g(S)Tc(F)a(F)g(S)Ta(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)CCC
aptámero No. 57: g(M)g(M)g(M)u(M)Ag(S)c(M)c(M)Gg(M)a(F)gg(M)a(M)g(S)Tc(F)a(F)g(M)Ta(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)CCC
imagen10
15
25
35
45
55
65
g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)gc(M)c(M)Gg(M)a(F)gg(M)a(M)gTc(F)a(F)gTa(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)c(M)c(M)c(M )
aptámero No. 75: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)gc(M)c(M)gg(M)a(F)gg(M)a(M)gTc(F)a(F)gTa(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)c(M)c(M)c(M )
aptámero No. 76: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)gc(M)c(M)Gg(M)a(F)gg(M)a(M)gu(F)c(F)a(F)gu(F)a(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)Ac(M)c(M)c
(M)
aptámero No. 77: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)gc(M)c(M)gg(M)a(F)gg(M)a(M)gu(F)c(F)a(F)gu(F)a(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)Ac(M)c(M)c( M)
aptámero No. 78: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)gc(M)c(M)Gg(M)a(F)gg(M)a(M)gTc(F)a(F)gTa(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(M)a(M)c(M)c(M)c( M)
aptámero No. 79: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)gc(M)c(M)gg(M)a(F)gg(M)a(M)gu(F)c(F)a(F)gu(F)a(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(M)a(M)c(M)c( M)c(M)
aptámero No. 80: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(F)gg(M)a(M)gu(F)c(F)a(F)gu(F)a(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)Ac(M)c( M)c(M)
aptámero No. 81: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)Tc(M)a(F)g(S)Ta(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(M)a(M)c( M)c(M)c(M)
aptámero No. 82: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)Tc(F)a(F)g(S)Ta(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(M)a(M)c( M)c(M)c(M)
aptámero No. 83: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)u(F)c(M)a(F)g(S)u(F)a(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a (M)c(M)c(M)c(M)
aptámero No. 84: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)u(F)c(F)a(F)g(S)u(F)a(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(M)a (M)c(M)c(M)c(M)
aptámero No. 85: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)u(F)c(F)a(F)g(S)u(F)a(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a( M)c(M)c(M)c(M)
aptámero No. 86: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)Tc(M)a(F)g(S)Tg(M)a(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(M)a(M)c( M)c(M)c(M)
aptámero No. 87: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)Tc(M)a(F)g(S)Tga(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(M)a(M)c(M)c (M)c(M)
aptámero No. 88: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)u(F)c(M)a(F)g(S)u(F)ga(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M) c(M)c(M)c(M)
aptámero No. 89: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)Tc(M)a(F)g(S)Taa(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(M)a(M)c(M)c (M)c(M)
aptámero No. 90: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)Tc(M)a(F)g(S)Ta(M)au(M)c(M)g(M)g(M)u(M)a(M)c(M)c (M)c(M)
aptámero No. 91: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)Tc(M)a(F)g(S)Taau(M)c(M)g(M)g(M)u(M)a(M)c(M)c(M) c(M)
5 aptámero No. 92: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)u(F)c(F)a(F)g(S)u(F)aa(M)u(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)c (M)c(M)c(M)
10 aptámero No. 93: g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)u(F)c(F)a(F)g(S)u(F)a(M)au(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)c (M)c(M)c(M)
aptámero No. 94: 15 g(M)g(M)g(M)u(M)a(M)g(S)c(M)c(M)Gg(M)a(M)gg(M)a(M)g(S)u(F)c(F)a(F)g(S)u(F)aau(M)c(M)g(M)g(M)u(F)a(M)c(M) c(M)c(M)
Se evaluó si los aptámeros sintetizados inhiben la unión de IL-17 y el receptor de IL-17 por el método de resonancia de plasmón de superficie.
20 Para la medida, se usó BIAcore T100 fabricado por GE Healthcare Bio Sciences. Se inmovilizó proteína A (21181, PIERCE) en un chip sensor CM5, y una quimera IL-17R recombinante humana-Fc (177-IR, R&D systems) en donde la parte Fc de IgG se fusionó se inmovilizó sobre la misma a aproximadamente 750 RU. Como analito, se mezclaron IL-17 (150 nM) y cada aptámero (12,5 o 50 nM) mostrado en la tabla 3, se mantuvieron durante 15 min y después de
25 eso la mezcla se hizo fluir.
Los resultados de la capacidad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17 se muestran en la tabla 3 a continuación. En la tabla 3, se muestra un efecto del aptámero de la presente invención sobre la capacidad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17 como un valor relativo respecto a la cantidad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17 como 100.
30 Para comparación con el aptámero de la presente invención se usó un aptámero convencionalmente conocido (aptámero No. 50) contra IL-17.
Los valores mostrados en la tabla 3 indican que el aptámero se une más fuertemente a IL-17 según el valor se vuelve menor, es decir, el aptámero tiene una alta actividad inhibidora de unión contra IL-17 y el receptor de IL-17.
35 [Tabla 3] Actividad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17
Capacidad de unión de IL-17 y el receptor de IL-17 (%)
IL-17
100
aptámero No. 50
37,12
aptámero No. 52
27,55
aptámero No. 53
22,65
aptámero No. 54
25,15
aptámero No. 55
18,99
aptámero No. 56
26,96
aptámero No. 58
33,72
aptámero No. 59
36,54
aptámero No. 60
31,88
aptámero No. 62
25,92
aptámero No. 63
27,10
aptámero No. 64
29,32
aptámero No. 65
20,29
aptámero No. 66
28,71
aptámero No. 68
37,00
aptámero No. 69
18,44
aptámero No. 70
34,97
aptámero No. 72
26,12
aptámero No. 73
31,96
aptámero No. 75
21,57
aptámero No. 76
24,12
aptámero No. 77
23,95
aptámero No. 78
23,28
aptámero No. 79
28,23
imagen11
aptámero No. 23
1,34
aptámero No. 24
1,77
aptámero No. 25
1,64
[Tabla 5] Acción inhibidora contra IL-17 de varios aptámeros en la línea celular de ratón NIH3T3 (continuación)
CI50 (nM)
aptámero No. 26
0,78
aptámero No. 27
2,45
aptámero No. 28
2,11
aptámero No. 29
2,53
aptámero No. 30
1,49
aptámero No. 31
0,30
aptámero No. 32
4,62
aptámero No. 33
4,31
aptámero No. 34
2,41
aptámero No. 35
2,47
aptámero No. 37
1,64
aptámero No. 38
0,31
aptámero No. 39
3,91
aptámero No. 40
3,75
aptámero No. 41
0,40
aptámero No. 42
0,51
aptámero No. 43
0,49
aptámero No. 44
1,83
aptámero No. 45
0,76
aptámero No. 46
1,13
aptámero No. 47
0,59
aptámero No. 48
0,30
aptámero No. 49
0,65
5 Como resultado de la medida, los aptámeros nuevamente alterados-modificados mostraron una actividad aumentada aproximadamente de 2 veces a 50 veces comparados con el aptámero convencionalmente conocido (aptámero No. 50).
10 De lo anterior, se ha mostrado que el aptámero de la presente invención inhibe la actividad fisiológica de IL-17 de una manera extremadamente fuerte comparado con aptámeros convencionalmente conocidos.
Ejemplo 2-2: Acción inhibidora del aptámero de la presente invención usando la línea celular NIH3T3 de fibroblastos de ratón –2
15 En primer lugar, IL-17 humana y el aptámero producido en el ejemplo 1-2 se preincubaron a 37ºC durante 30 min, y se añadieron a células NIH3T3 (ATCC, CRL1658) junto con TNFα de ratón (2 ng/ml). A continuación. después de incubación durante 24 horas, el sobrenadante del cultivo se recogió, y la cantidad de producción de IL-6 se midió por el método de ELISA descrito a continuación. La acción inhibidora contra IL-17 de cada aptámero se determinó a
20 partir de la cantidad de producción de IL-6. Se muestra la concentración inhibidora del 50% (valor CI50) en la siguiente tabla 6. Para comparación con el aptámero de la presente invención, se usó un aptámero convencionalmente conocido (aptámero No. 50) contra IL-17.
Método ELISA para verificar la acción inhibidora contra IL-17 del aptámero: Una placa de microtitulación para ELISA
25 se recubrió con anticuerpo de rata anti-IL-6 de ratón (BD Biosciences, 2 µg/ml; 100 µl/pocillo) diluido con PBS, y se incubó a 4ºC durante la noche. Al día siguiente, la placa de microtitulación se lavó 3 veces con PBS/Tween 20 al 0,05%, y se aplicó bloqueo con PBS/BSA al 1% (200 µl/pocillo) a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, la placa se lavó 3 veces con PBS/Tween 20 al 0,05%. Se añadieron a la placa IL-6 de ratón recombinante (BD Biosciences; 100 µl/pocillos) diluida en serie con PBS/BSA al 1%/Tween 20 al 0,05% o
30 sobrenadantes de cultivo (100 µl/pocillo). Después de incubación a temperatura ambiente durante 2 horas, la placa se lavó 3 veces con PBS/Tween 20 al 0,05%. A continuación, se añadieron a la placa 100 µl/pocillo de anticuerpo de rata anti-IL-6 de ratón conjugado a biotina (BD Biosciences) a una dilución final de 1/500, y la mezcla se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar 3 veces con PBS/Tween 20 al 0,05%, se añadieron 100 µl/pocillo de estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina a una dilución final de 1/1000. Después
35 de 30 min a temperatura ambiente, la placa se lavó de nuevo 4 veces con PBS/Tween 20 al 0,05%, y se añadió un sustrato (1-Step PNPP; Thermo Fisher Scientific Inc; 100 µl/pocillo). Después de 15 min, se añadió solución acuosa
de hidróxido de sodio (2N: 50 µl/pocillo) para parar la reacción, y la placa se leyó en un lector de microtitulación (Bio-Rad) usando un filtro de 405 nm.
[Tabla 6] Acción inhibidora contra IL-17 de varios aptámeros en la línea celular de ratón NIH3T3
CI50 (nM)
aptámero No. 50
8,63
aptámero No. 52
1,11
aptámero No. 53
1,67
aptámero No. 55
0,11
aptámero No. 56
0,52
aptámero No. 57
2,36
aptámero No. 59
1,19
aptámero No. 60
2,35
aptámero No. 61
3,41
aptámero No. 62
0,69
aptámero No. 63
0,81
aptámero No. 64
4,64
aptámero No. 65
0,67
aptámero No. 66
1,21
aptámero No. 67
5,95
aptámero No. 68
2,40
aptámero No. 69
1,73
aptámero No. 70
3,28
aptámero No. 71
5,54
aptámero No. 72
2,24
aptámero No. 73
3,46
aptámero No. 74
1,06
aptámero No. 75
1,33
aptámero No. 76
1,70
aptámero No. 77
4,66
aptámero No. 78
1,36
aptámero No. 79
2,25
aptámero No. 80
1,52
aptámero No. 81
2,26
aptámero No. 82
0,48
aptámero No. 84
1,04
aptámero No. 85
0,96
aptámero No. 86
5,16
aptámero No. 87
3,23
aptámero No. 88
2,88
aptámero No. 89
6,21
aptámero No. 90
1,08
aptámero No. 91
3,86
aptámero No. 92
2,60
aptámero No. 93
0,22
aptámero No. 94
0,29
Como resultado de la medida, todos los aptámeros nuevamente alterados-modificados mostraron una actividad aumentada comparados con el aptámero convencionalmente conocido (aptámero No. 50). Un aptámero que tiene 10 una alta actividad inhibidora mostró aproximadamente 80 veces mayor actividad.
De lo anterior, se ha mostrado que el aptámero de la presente invención inhibe la actividad fisiológica de IL-17 de una manera extremadamente fuerte comparado con aptámeros convencionalmente conocidos.
15 Ejemplo 3: Acción inhibidora contra IL-17 del aptámero de la presente invención contra células derivadas de tejido conjuntivo
Los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) liberan extracelularmente IL-6 por estimulación celular con IL
17. Por tanto, usando NHDF como ejemplo de una célula derivada de tejido conjuntivo, la acción inhibidora contra IL20 17 de cada aptámero se determinó según el método descrito en Arthritis Rheum. 63, 455-466 (2011).
En primer lugar, se sembraron NHDF (Lonza Japan Ltd) en una microplaca de 48 pocillos y se incubó durante 24 horas. A continuación, IL-17 humana (1 o 2 ng/ml) y un aptámero pegilado (5 o 10 ng/ml) modificado por el método descrito en el ejemplo 5 mencionado posteriormente, se preincubaron a 37ºC durante 60 min, y se añadieron a NHDF. Después de incubación adicional durante 24 horas, el sobrenadante del cultivo se recogió, y la cantidad de
5 producción de IL-6 se midió por el método de inmunoensayo enzimático (ELISA) (Kit de ELISA de IL-6 humana endógena: Thermo Scientific). La capacidad inhibidora contra IL-17 se calcula de la cantidad de producción de IL-6, y los resultados se muestran en la tabla 7 como una proporción relativa respecto a la capacidad inhibidora de IL-17 del aptámero convencionalmente conocido (aptámero No. 50) contra IL-17 como 1.
10 [Tabla 7] Acción inhibidora de IL-17 de varios aptámeros en fibroblastos de piel humanos normales
capacidad inhibidora contra IL-17
aptámero No. 50
1,00
aptámero No. 1
1,19
aptámero No. 3
1,13
aptámero No. 4
1,21
aptámero No. 5
1,17
aptámero No. 7
1,37
aptámero No. 8
1,38
aptámero No. 9
1,33
aptámero No. 10
1,30
aptámero No. 11
1,37
aptámero No. 12
1,36
aptámero No. 13
1,32
aptámero No. 14
1,12
aptámero No. 16
1,32
aptámero No. 17
1,34
aptámero No. 18
1,34
aptámero No. 19
1,28
aptámero No. 20
1,33
aptámero No. 21
1,73
aptámero No. 22
1,66
aptámero No. 23
1,82
aptámero No. 24
1,70
aptámero No. 25
1,62
aptámero No. 26
1,67
aptámero No. 27
1,78
aptámero No. 28
1,78
aptámero No. 29
1,39
aptámero No. 30
1,46
aptámero No. 31
1,80
aptámero No. 32
1,25
aptámero No. 33
1,30
aptámero No. 34
1,14
aptámero No. 37
1,87
aptámero No. 38
1,84
aptámero No. 39
1,29
aptámero No. 40
1,34
aptámero No. 41
1,53
aptámero No. 42
1,57
aptámero No. 43
1,40
aptámero No. 45
1,79
aptámero No. 46
1,88
aptámero No. 47
1,91
aptámero No. 48
1,78
aptámero No. 49
1,72
Como resultado de la medida, los aptámeros nuevamente alterados-modificados mostraron una capacidad inhibidora 15 contra IL-17 aumentada comparados con el aptámero convencionalmente conocido (aptámero No. 50).
De lo anterior, se ha mostrado que el aptámero de la presente invención inhibe la actividad fisiológica de IL-17 de una manera extremadamente fuerte contra células derivadas de tejido conjuntivo comparado con aptámeros convencionalmente conocidos.
imagen12
imagen13
-: no realizado
La acción inhibidora contra IL-17 de varios aptámeros sobre HRPTEC se muestra a continuación. Para comparación con el aptámero de la presente invención, se usó un aptámero convencionalmente conocido (aptámero No. 50) contra IL-17.

[Tabla 11] Proporción de la inhibición de la producción de IL-6
Proporción de la inhibición de la producción de IL-6 (%)
cantidad de aptámero añadida
300 nM 30 nM
aptámero No. 50
47,4 17,5
aptámero No. 8
- 53,5
aptámero No. 25
- 33,1
aptámero No. 28
- 42,8
aptámero No. 37
- 30,7
aptámero No. 38
- 42,7
aptámero No. 41
- 58,9
aptámero No. 45
- 48,2
aptámero No. 47
- 47,1
aptámero No. 48
- 53,8
10 -: no realizado
[Tabla 12] Proporción de la inhibición de la producción de IL-8
Proporción de la inhibición de la producción de IL-8 (%)
cantidad de aptámero añadida
300 nM 30 nM
aptámero No. 50
63,6 40,3
aptámero No. 8
- 73,1
aptámero No. 25
- 56,5
aptámero No. 28
- 60,8
aptámero No. 37
- 55,4
aptámero No. 38
- 64,3
aptámero No. 41
- 79,7
aptámero No. 45
- 70,6
aptámero No. 47
- 71,7
aptámero No. 48
- 72,7

[Tabla 13] Proporción de la inhibición de la producción de MCP1
15 -: no realizado
Proporción de la inhibición de la producción de MCP1 (%)
cantidad de aptámero añadida
300 nM 30 nM
aptámero No. 50
67,9 36,5
aptámero No. 8
- 69,6
aptámero No. 25
- 53,2
aptámero No. 28
- 62,7
aptámero No. 37
- 56,9
aptámero No. 38
- 64,8
aptámero No. 41
- 74,1
aptámero No. 45
- 63,8
aptámero No. 47
- 69,8
aptámero No. 48
- 70,6
20 -: no realizado
Como resultado de la medida, los aptámeros nuevamente alterados-modificados suprimieron más fuertemente la producción de citoquinas (IL-6, IL-8) y quimioquinas (CCL20, MCP1) inducida por IL-17 que el aptámero convencionalmente conocido (aptámero No. 50).
25
imagen14
mediante MOLECULAR IMAGER FX (BIO-RAD). De las imágenes obtenidas, se cuantificó la banda del aptámero intacto usando Science Lab 2005 Multi Gauge ver3.0 fabricado por Fujifilm para la banda correspondiente al aptámero residual, y la cantidad residual de cada analito en el suero se midió basada en los resultados obtenidos con tampón fosfato como el 100%.
[Tabla 15]
Cantidad residual en suero de ratón (%) 24 horas después
aptámero No. 50
7,3
aptámero No. 51
5,5
aptámero No. 8
17,1
aptámero No. 48
17,3
aptámero No. 56
17,0
aptámero No. 57
14,6
aptámero No. 58
28,4
aptámero No. 59
59,4
aptámero No. 60
43,4
aptámero No. 61
22,3
aptámero No. 62
81,5
aptámero No. 63
49,5
aptámero No. 64
94,7
aptámero No. 65
48,6
aptámero No. 66
49,1
aptámero No. 67
87,0
aptámero No. 68
63,9
aptámero No. 69
76,8
aptámero No. 70
89,0
aptámero No. 71
83,7
aptámero No. 72
32,3
aptámero No. 73
65,3
aptámero No. 74
33,9
aptámero No. 75
44,4
aptámero No. 76
66,6
aptámero No. 77
50,8
aptámero No. 78
36,6
aptámero No. 79
26,8
aptámero No. 80
66,2
aptámero No. 81
86,8
aptámero No. 82
67,7
aptámero No. 83
76,9
aptámero No. 84
82,9
aptámero No. 85
86,1
aptámero No. 86
79,9
aptámero No. 87
81,1
aptámero No. 88
84,2
aptámero No. 89
92,4
aptámero No. 90
95,4
aptámero No. 91
78,6
aptámero No. 92
79,9
aptámero No. 93
66,8
aptámero No. 94
64,4
[Tabla 16]
Cantidad residual en suero humano (%) 24 horas después
aptámero No. 50
24,9
aptámero No. 51
29,0
aptámero No. 8
76,6
aptámero No. 48
57,7
aptámero No. 56
48,4
aptámero No. 58
37,2
aptámero No. 59
57,1
aptámero No. 60
48,4
aptámero No. 61
52,1
aptámero No. 62
59,6
aptámero No. 63
57,8
aptámero No. 64
90,4
aptámero No. 65
68,2
aptámero No. 66
57,9
aptámero No. 67
107,9
aptámero No. 68
90,1
aptámero No. 69
36,1
aptámero No. 71
79,7
aptámero No. 73
91,4
aptámero No. 76
31,7
aptámero No. 80
52,7
aptámero No. 81
98,9
aptámero No. 82
51,1
aptámero No. 83
81,3
aptámero No. 84
89,1
aptámero No. 85
80,8
aptámero No. 86
94,8
aptámero No. 87
98,5
aptámero No. 88
73,3
aptámero No. 89
99,0
aptámero No. 90
106,8
aptámero No. 91
94,8
aptámero No. 92
92,9
aptámero No. 93
90,6
aptámero No. 94
101,1
Como resultado de la medida, todos los aptámeros nuevamente alterados-modificados mostraron cantidad residual aumentada 24 después comparados con los aptámeros convencionalmente conocidos (aptámeros No, 50 y 51). El aptámero más estable mostró una cantidad residual aumentada en suero 24 después de aproximadamente 15
5 veces.
De lo anterior, se ha mostrado que el aptámero de la presente invención mejora significativamente la estabilidad en suero comparado con aptámeros convencionalmente conocidos.
10 Ejemplo 7: Prueba farmacocinética en ratón
Se disolvió un aptámero en solución salina a 1 mg/ml, y se administró por vía intravenosa a un ratón C57BL/6 macho (8 semanas de edad, Charles River) a la dosis de 1 mg/kg. Se recogió la sangre 5, 15, 30 min después, 1, 2, 4, 6, 8, 24 horas después, o 48, 72, 96 horas después. El plasma se separó y conservó a -70ºC y, respecto al aptámero de
15 la presente invención, la concentración de ácido nucleico residual en plasma se midió según el método descrito por Judith M. Healy et al., (Pharmaceutical Research, Diciembre 2004, Volumen 21, Número 12, pp 2234-2246) y usando el método de ELOSA (método de hibridación).

[Tabla 17] 20 Semivida en sangre de ratón
t1/2 (h)
aptámero No. 50
1,79
aptámero No. 51
0,85
aptámero No. 8
6,38
aptámero No. 48
4,29
aptámero No. 9
3,50
aptámero No. 57
3,12
aptámero No. 58
4,24
aptámero No. 64
9,26
Como resultado de la medida, todos los aptámeros nuevamente alterados-modificados mostraron semivida aumentada aproximadamente 2-5 veces comparada con aptámeros convencionalmente conocidos (aptámeros No. 25 50 y 51).
De lo anterior, se ha mostrado que la estabilidad del aptámero de la presente invención en sangre mejoró significativamente comparado con aptámeros convencionalmente conocidos.
Ejemplo 8: Efecto inhibidor contra IL-17 del aptámero de la presente invención en el modelo de inflamación de bolsa de aire en ratón
5 Si un aptámero alterado-modificado puede inhibir la actividad biológica de IL-17 in vivo se confirmó con el modelo de inflamación de bolsa de aire en ratón mediante referencia a Biochemical Pharmacology 77, 878-887 (2009).
En el modelo de inflamación de bolsa de aire en ratón, se usaron ratones C57BL/6J macho (7 semanas de edad, Charles River) (n = 4 o 5). Se afeitó el lomo y, al día siguiente y 4 días después, se inyectó aire (2,5 ml) por vía 10 subcutánea en el lomo. A los 3 días desde la segunda inyección de aire, un aptámero pegilado de la presente invención se administró por vía intraperitoneal por el método descrito en el ejemplo 5 y, 1 hora después, se inyectó una solución acuosa de carboximetilcelulosa al 2% que contenía IL-17 (0,5 mg) en la bolsa de aire para inducir la producción de IL-6. El exudado en la bolsa de aire se recogió 24 horas después de la inyección de IL-17, y la cantidad de IL-6 en el exudado se midió por ELISA. Se calcula la proporción de inhibición de la producción de IL-6
15 (%), y los resultados se muestran en las tablas 18 y 19 a continuación. En las tablas 18 y 19, se usaron aptámeros convencionalmente conocidos contra IL-17 (aptámeros No. 50 y 51) para comparación con el aptámero de la presente invención.

[Tabla 18] 20 Efectos inhibidores de varios aptámeros en la producción de IL-6 a la dosis de 10 mg/kg
administración de 10 mg/kg
proporción de inhibición de la producción de IL-6 (%)
aptámero No. 50
50,20
aptámero No. 51
42,86
aptámero No. 8
88,16

[Tabla 19] Efectos inhibidores de varios aptámeros en la producción de IL-6 a la dosis de 1 mg/kg
administración de 1 mg/kg
proporción de inhibición de la producción de IL-6 (%)
aptámero No. 50
17,48
aptámero No. 51
22,74
aptámero No. 8
70,05
aptámero No. 9
42,77
aptámero No. 16
49,20
aptámero No. 21
36,20
aptámero No. 22
40,98
aptámero No. 23
47,33
aptámero No. 24
32,45
aptámero No. 25
41,94
aptámero No. 26
56,05
aptámero No. 27
52,97
aptámero No. 28
33,29
aptámero No. 37
36,68
aptámero No. 38
45,28
aptámero No. 45
81,74
aptámero No. 46
72,84
aptámero No. 47
63,03
aptámero No. 48
67,50
aptámero No. 49
32,21
Como resultado de la medida, se confirmó que todos los aptámeros nuevamente alterados-modificados tenían mayor proporción de inhibición de la producción de IL-6 de aproximadamente 2-5 veces, comparados con los aptámeros convencionalmente conocidos (aptámeros No. 50 y 51) cuando se habían administrado a la misma
30 concentración. Además, se confirmó que incluso cuando la concentración de administración de los aptámeros convencionalmente conocidos (aptámeros No. 50 y 51) se aumentó 10 veces, la proporción de inhibición de la producción de IL-6 de aptámero alterado-modificado era mayor y la actividad inhibidora contra IL-17 del aptámero de la presente invención aumentó notablemente también in vivo.
35 Ejemplo 9-1: Efecto antiinflamatorio en modelo de psoriasis inducida por IL-23 en ratones – 1
Según el método descrito por Heather L. Rizzo et al., (J Immunol. 186, 1495-1502 (2011)), se examinó un efecto supresor del aptámero de la presente invención en el modelo de psoriasis inducida por IL-23.
imagen15

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  1. imagen1
    imagen2
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