ES2677327T3 - Método de administración de un agente anticanceroso a una célula - Google Patents

Método de administración de un agente anticanceroso a una célula Download PDF

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Abstract

Un nanocomplejo micelar que comprende: un agente anticanceroso que es un anticuerpo dirigido contra un marcador de la superficie de células tumorales; y un conjugado de: (i) polietilenglicol terminado en aldehído; y (ii) un flavonoide que es galato de (-)-epigalocatequina monomérico o galato de (-)-epigalocatequina oligomérico, teniendo el nanocomplejo micelar el polietilenglicol conjugado en la posición C6 y/o C8 del anillo A del flavonoide mediante la unión del polietilenglicol a través de la reacción del grupo aldehído libre con la posición C6 y/o C8 del anillo A del flavonoide, en el que cuando el flavonoide es galato de (-)-epigalocatequina monomérico, el nanocomplejo micelar comprende además galato de (-)-epigalocatequina oligomérico no conjugado en un núcleo interno del nanocomplejo micelar, en el que el agente anticanceroso está formando un complejo con el galato de epigalocatequina oligomérico conjugado o no conjugado, dependiendo del que esté presente, y en el que el nanocomplejo micelar exhibe un efecto anticanceroso sinérgico entre el agente anticanceroso y el flavonoide cuando se administra a una célula.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de administracion de un agente anticanceroso a una celula Referencia cruzada con una solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos N.° 60/960.969, presentada el 23 de octubre de 2007.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general a un metodo in vitro para administrar un agente anticanceroso a una celula, que incluye una celula tumoral en un sujeto.
Antecedentes de la invencion
Los flavonoides son uno de los grupos de polifenoles vegetales mas numerosos y mejor estudiados. Los flavonoides consisten en un grupo grande de sustancias polifenolicas de bajo peso molecular que se encuentran de forma natural en las frutas y verduras, y que forman parte integral de la dieta humana. Las hojas de te verde secas pueden contener hasta 30 % de flavonoides en peso, incluido un alto porcentaje de flavonoides conocidos como catequinas (derivados de flavan-3-ol o flavonoides a base de catequina), incluyendo (-)-epicatequina, (-)-epigalocatequina, (+)- catequina, galato de (-)-epicatequina y galato de (-)- epigalocatequina.
En los ultimos anos, estas catequinas del te verde han atrafdo mucha atencion porque se sabe que tienen propiedades biologicas y farmacologicas, que incluyen propiedades antibacterianas, antineoplasicas, antitromboticas, vasodilatadoras, antioxidantes, antimutagenicas, anticancerosas, hipercolesterolemicas, antivmcas y antiinflamatorias, que se han demostrado en numerosos estudios en seres humanos, animales e in vitro (Jankun J., et al. Nature 387, 561 (1997)); Bodoni A. et al. J. Nutr. Biochem. 13, 103-111 (2002); Nakagawa K. et al. J. Agric. Food Chem. 47, 3967-3973 (1999)). Estas propiedades biologicas y farmacologicas son potencialmente beneficiosas para prevenir enfermedades y proteger la estabilidad del genoma.
Se cree que muchos de los efectos beneficiosos de las catequinas estan relacionados con las acciones antioxidantes de las catequinas (Terao J., et al. Arch Biochem. Biophys. 308, 278-284 (1994)). Entre las catequinas, se cree que el galato de (-)-epigalocatequina (EGCG), que es un componente mayoritario del te verde, tiene la actividad mas alta, posiblemente debido al anillo trihidroxilo B y al resto ester de galato en la posicion C3 (Isemura M., et al. Biofactors 13, 81-85 (2000); Ikeda I., et al. J. Nutr. 135, 155 (2005); Lill G., et al. FEBS Letters 546, 265-270 (2003); Sakanaka S. and Okada Y. J. Agric. Food Chem. 52, 1688-1692 (2004)); Yokozawa T., et al., J. Agric. Food Chem. 48, 5068-5073 (2000)).
En general, la semivida de la actividad de los flavonoides se limita a unas pocas horas dentro del cuerpo; el metabolismo de estos compuestos aun no se ha establecido. A pesar de las favorables propiedades antioxidantes y anticancengenas de las catequinas, incluido el EGCG, no es practico alcanzar un nivel terapeutico de este compuesto en el cuerpo ingiriendo directamente una gran cantidad de te verde, debido a la restriccion de volumen inherente. Es decir, para obtener un beneficio terapeutico o farmacologico de los flavonoides a traves solo de la dieta, sena necesario ingerir una cantidad de alimentos y bebidas mayor de lo que es practico consumir. Ademas, se ha descrito actividad prooxidante de varios flavonoides, incluido el EGCG, por lo que la ingestion directa de te verde crudo es un medio menos eficaz de administrar EGCG (Yen G. C., et al. J. Agric. Food Chem. 45, 30-34 (1997)); Yamanaka N., et al. FEBS Lett. 401, 230-234 (1997)); Roedig-Penman A. y Gordon M. H. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 4267-4270).
Por otro lado, una fraccion de peso molecular relativamente alto de polifenoles vegetales extrafdos (procianidinas) y (+)-catequina y rutina sinteticamente oligomerizadas han demostrado tener propiedades fisiologicas mejoradas tales como actividad antioxidante y anticancengena en comparacion con los flavonoides de bajo peso molecular (Zhao J., et al. Carcinogenesis, 1999, 20, 1737-1745; Ariga T. and Hamano M. Agric. Biol. Chem. 54, 2499 - 2504 (1990)); Chung J. E., et al. Biomacromolecules 5, 113-118 (2004)); Kurisawa M., et al. Biomacromolecules 4, 1394-1399 (2003)); Hagerman A. E., et al. J. Agric. Food Chem. 46, 1887 (1998)) y sin efectos pro-oxidantes (Hagerman A. E., et al. J. Agric. Food Chem. 46, 1887 (1998)); Li C. y Xie B. J. Agric. Food Chem. 48, 6362 (2000)). Sin embargo, no se espera que los flavonoides de alto peso molecular naturales o sintetizados sean absorbidos y transportados a otros tejidos despues de la ingestion, ya que estos compuestos son generalmente grandes, forman complejos fuertes con protemas y son resistentes a la degradacion (Zhao J., et al. Carcinogenesis, 1999, 20, 1737-1745),
En los casos de flavonoides que se consumen a traves de la ingesta oral de alimentos y bebidas, los flavonoides pueden desempenar un papel como antioxidantes para proteger el tracto digestivo del dano oxidativo durante la digestion. Sin embargo, se puede esperar que los flavonoides permanezcan solo en el tracto digestivo y, por lo tanto, es probable que sus beneficiosas actividades fisiologicas no se utilicen en otros tejidos. Ademas, su fuerte hidrofobicidad asf como su tendencia a formar complejos con protemas dificulta la administracion parenteral de estos
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Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo de administracion in vitro de agentes anticancerosos bioactivos a una celula, incluida una celula tumoral, utilizando conjugados de flavonoides y vefnculos de administracion descritos previamente en la Solicitud internacional publicada WO 2006/124000 y en la solicitud de los Estados Unidos publicada 2008/102052. El agente anticanceroso es un anticuerpo dirigido contra un marcador de la superficie de celulas tumorales.
La presente invencion se basa en el sorprendente descubrimiento de que el uso de vefnculos de administracion a base de flavonoides para administrar agentes anticancerosos a una celula da como resultado un efecto sinergico entre el agente bioactivo anticanceroso y los flavonoides. Por lo tanto, estos conjugados y vefnculos de administracion combinan los efectos terapeuticos sinergicos asociados a la porcion de flavonoide que actua como vefnculo y el agente anticanceroso, que es un anticuerpo dirigido contra un marcador de la superficie de celulas tumorales que debe administrarse.
En un aspecto, se proporciona un nanocomplejo micelar definido en la reivindicacion 1 que comprende un agente anticanceroso que es un anticuerpo dirigido contra un marcador de la superficie de celulas tumorales y un conjugado de un agente de administracion que contiene un aldefndo libre y un flavonoide, teniendo el agente de administracion conjugado la posicion C6 y/o C8 del anillo A del flavonoide.
En otro aspecto, se proporciona un metodo de administracion in vitro de un agente anticanceroso a una celula que comprende poner en contacto los vefnculos de administracion como se describe en la presente memoria con la celula, como se define en la reivindicacion 7.
En otro aspecto, se proporciona una composicion farmaceutica, como se define en la reivindicacion 8, que comprende el vefnculo de administracion tal como se describe en la presente memoria.
En otro aspecto, se proporciona el uso del vefnculo de administracion tal como se describe en la presente memoria para administrar un agente anticanceroso a una celula en un sujeto, como se define en la reivindicacion 9.
Otros aspectos y caractensticas de la presente invencion seran evidentes para los expertos en la materia tras la revision de la siguiente descripcion de realizaciones espedficas de la invencion junto con las figuras adjuntas.
Breve descripcion de los dibujos
En las figuras, que ilustran, a modo de ejemplo solamente, realizaciones de la presente invencion,
La Figura 1 es un grafico que representa la citotoxicidad de (□) EGCG, (▲) OEGCG y (o) PEG-EGCG en HMEC. N = 5 para las muestras y N = 8 para el control;
La Figura 2 es un grafico que representa el tamano del complejo micelar en (o) ausencia y (•) presencia de suero. N = 3;
La Figura 3 es un grafico que representa la intensidad de fluorescencia de (□) sin BSA-FITC, (o) complejo FITC- BSA y OEGCG, (A) (FITC-BSA + OEGCG) en el complejo PEG-EGCG en presencia de proteinasa K; y (■) sin FITC- BSA en ausencia de proteinasa K. N = 3;
La Figura 4 es un grafico que representa la proliferacion celular in vitro de celulas SKBR-3 en presencia de (□) PEG- EGCG, (■) OEGCG, (A) Herceptin, (•) (Herceptin + OEGCG) en el complejo PEG-EGCG, (▲) (BSA + OEGCG) en el complejo PEG-EGCG, y (o) control (celulas no tratadas). N = 5 para las muestras y N = 8 para el control;
La Figura 5 es un grafico que representa el tamano de (Herceptin + OEGCG) en el complejo PEG-EGCG sometido a dilucion en suspension. N = 3.
La Figura 6 es un grafico que representa la proliferacion in vitro de celulas SKBR-3 en presencia de OEGCG, PEG- EGCG, Herceptin, (Herceptin + OeGCG) en el complejo PEG-EGCG, y (BSA + OEGCG) en el complejo PEG-EGCG (barras de izquierda a derecha en cada grupo). El porcentaje de proliferacion celular se normalizo con el control en cada punto de tiempo. N = 5 para las muestras y N = 8 para el control; y
La Figura 7 es un grafico que representa el tamano tumoral en ratones Balb/desnudo que contienen tumor tratados dos veces a la semana durante un mes con (A) complejo micelar mas Herceptin, (□) Herceptin solo, o (o) control con PBS.
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Descripcion detallada
Se sabe que los flavonoides tienen una variedad de propiedades biologicas, que incluyen efectos contra el cancer, que inhiben el crecimiento de las celulas cancerosas. Los vehmulos de administracion que comprenden flavonoides se describieron previamente en la solicitud internacional publicada WO 2006/124000 y en la solicitud de los Estados Unidos publicada 2008/102052.
Sorprendentemente, los inventores han descubierto que la combinacion del vehmulo de administracion de flavonoides y el agente anticanceroso bioactivo tiene un efecto anticanceroso sinergico mayor que los efectos combinados de cada uno de los vehmulos de administracion de flavonoides y el agente anticanceroso bioactivo cuando se usan solos. Por lo tanto, dichos vehmulos de administracion cargados con un agente anticanceroso proporcionan una forma eficaz de administrar agentes anticancerosos a una celula, aprovechando el efecto sinergico entre la actividad anticancerosa de la porcion de flavonoide del vehmulo de administracion y el efecto anticanceroso del agente anticanceroso. El agente anticanceroso en el nanocomplejo micelar de la invencion es un anticuerpo dirigido contra un marcador de la superficie de celulas tumorales.
Los inventores desarrollaron un vehmulo de administracion que contema un agente anticanceroso tal como una protema, acido nucleico o farmaco, por autoensamblaje usando flavonoides y conjugados de flavonoides tales como EGCG. Los vehmulos de administracion se formaron por autoensamblaje. Por ejemplo, los vehmulos de administracion se sintetizaron mediante (i) un proceso de autoensamblaje en dos etapas que implicaba el ensamblaje de (-)-epigailocatequina-3-O-galato oligomerico (OEGCG) y el agente anticancerosos y despues el ensamblaje del complejo OEGCG-agente anticanceroso preformado con un conjugado de poli(etilenglicol) (PEG) y EGCG (PEG-EGCG); y (ii) un proceso de autoensamblaje de una sola etapa que implica el ensamblaje de un conjugado de PEG y OEGCG (PEG-OEGCG) y el agente anticanceroso. Ambos vehmulos de administracion se formaron como complejos micelares estables y altamente orientados cargados con el agente anticanceroso mediante el autoensamblaje espontaneo en una solucion acuosa suave. Los nanocomplejos micelares resultantes muestran caractensticamente una cubierta externa de PEG, con un nucleo interno comprendido por un complejo de agente anticanceroso OEGCG. El vehmulo de administracion usado en la presente invencion se define en la reivindicacion 1.
Dado que la formacion de un nanocomplejo micelar se basa principalmente en la interaccion hidrofobica y el enlace de hidrogeno, los vehmulos de administracion descritos en la presente memoria pueden usarse para cargar una amplia variedad de agentes anticancerosos para una administracion mejorada a una celula.
Los vehmulos de administracion estan disenados para aprovechar el efecto mejorado de permeabilidad y retencion (EPR) y para evitar la absorcion del sistema reticuloendotelial (RES) cuando se administran in vivo, proporcionando la acumulacion selectiva en sitios de cancer. Idealmente, los vehmulos de administracion conservan la estabilidad tanto de las moleculas de flavonoides como del agente anticanceroso de la perdida de actividad y evitando la degradacion durante la administracion, ejerciendo un efecto terapeutico sinergico cuando se administran a una celula. El vehmulo de administracion puede enmascarar la actividad del flavonoide y la actividad del agente anticanceroso secuestrando estos restos dentro del nucleo interno del vehmulo de administracion hasta que se administra y libera con exito en la celula, restaurando las actividades respectivas solo despues de la disociacion del vehmulo de administracion al sitio de una celula.
Para demostrar los efectos terapeuticos sinergicos por el vehmulo de administracion, la protema anticancerosa Herceptin (trastuzumab) se cargo en el complejo micelar, como se describe en el Ejemplo 1 siguiente. El complejo micelar mantuvo su integridad y mostro buena estabilidad en presencia de suero sin cambio de tamano en funcion del tiempo, y la protema se protegio de forma segura de la proteolisis dentro del complejo micelar. Se demostro una mayor inhibicion con el vehmulo de administracion cargado con Herceptin en comparacion con los componentes individuales (OEGCG, PEG-EGCG y Herceptin).
Dado que la formacion del vehmulo de administracion esta principalmente determinada por la interaccion hidrofoba, puede ser disociada por competidores hidrofobos, tales como moleculas anfffilas. De este modo, el vehmulo de administracion puede disociarse mediante moleculas bioanfffilas (tales como lfpidos de membrana plasmatica) para liberar el flavonoide terapeutico contenido y compuestos anticancerosos cuando el vehmulo de administracion se acumula en el sitio celular diana.
Por lo tanto, se proporciona un metodo para administrar un agente anticanceroso a una celula. Se utiliza un vehmulo de administracion que contiene un flavonoide y un agente anticanceroso, como se describio previamente en la solicitud internacional publicada WO 2006/124000 y en la solicitud de los Estados Unidos publicada 2008/102052 y como se describe a continuacion. El vehmulo de administracion se pone en contacto a continuacion con la celula a la que se administra el agente anticanceroso.
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Conjugados de flavonoides y vehiculos de administracion
Para aumentar la disponibilidad de compuestos flavonoides beneficiosos, la conjugacion de flavonoides a varios agentes de administracion a traves de un grupo aldetndo libre en el agente de administracion al anillo A del flavonoide permite la modificacion de las propiedades ffsicas del flavonoide sin alterar la estructura del polifenol del flavonoide, al tiempo que aumentan las propiedades biologicas y farmacologicas del flavonoide.
Es decir, la conjugacion mediada por aldetndo de un agente de administracion al flavonoide da como resultado la union del agente de administracion en la posicion C6 y/o C8 del anillo de flavonoide A, y no altera ni afecta los anillos B y C del flavonoide ni a los diversos grupos hidroxilo en el flavonoide.
La conjugacion de un agente de administracion a un flavonoide puede proporcionar una composicion que es adecuada para la administracion a un sujeto incorporando el flavonoide en un vetnculo particular formado con el agente de administracion, y puede permitir la administracion de concentraciones mas altas de flavonoides que las que se pueden obtener a traves de la dieta. El agente de administracion puede proporcionar estabilidad a la composicion, dando como resultado una composicion que se metaboliza o degrada mas lentamente, y que de este modo puede tener una semivida mas larga en el cuerpo que el flavonoide no conjugado solo. Por ejemplo, el agente de administracion puede ser de tal naturaleza que el flavonoide se incorpore en una composicion que mejore la solubilidad en agua del flavonoide, lo que puede evitar la absorcion por el sistema reticuloendotelial y el posterior aclaramiento de los rinones, dando como resultado una semivida mas larga en el cuerpo La conjugacion de otros agentes de administracion puede proteger al flavonoide de la degradacion enzimatica. El conjugado usado en la presente invencion se define por las reivindicaciones adjuntas.
Un agente de administracion puede conjugarse con un flavonoide haciendo reaccionar el agente de administracion con el flavonoide en presencia de un catalizador acido, teniendo el agente de administracion un grupo aldetndo libre.
El flavonoide es galato de (-)-epigalocatequina monomerico u oligomerico. Se cree que galato de (-)- epigalocatequina (EGCG) tiene la mayor actividad entre los flavonoides a base de catequinas, posiblemente debido al anillo trihidroxilo B y al resto ester galato en la posicion C3 de este flavonoide.
El agente de administracion es un polietilenglicol terminado en aldetndo.
La siguiente descripcion se refiere a una realizacion en la que el flavonoide es un flavonoide a base de catequina y en el que el agente de administracion es un polfmero. Sin embargo, se entendera que la reaccion de condensacion de aldetndo entre un grupo qmmico que contiene aldetndo y un flavonoide es aplicable a la conjugacion de cualquier agente de administracion que tenga un grupo aldetndo libre, que incluye el consiguiente tratamiento acido del agente de administracion, con cualquier flavonoide, como se describe encima.
Por lo tanto, la reaccion puede implicar la conjugacion de un polfmero que contiene un grupo aldetndo libre o un grupo que puede convertirse en un grupo aldetndo libre en presencia de acido en un flavonoide a base de catequina.
El flavonoide a base de catequina puede ser una sola unidad monomerica de un flavonoide a base de catequina o puede ser un oligomero de uno o mas flavonoides a base de catequina. El flavonoide a base de catequina usado en la presente invencion es galato de (-)-epigalocatequina monomerico o galato de (-)-epigalocatequina oligomerico. Como se indico anteriormente, la conjugacion de un polfmero con un flavonoide da como resultado un aumento de las propiedades biologicas o farmacologicas del flavonoide. Ademas, un oligomero del flavonoide a base de catequina tiende a tener niveles amplificados o aumentados de las propiedades biologicas y farmacologicas asociadas con los flavonoides a base de catequina, e incluso puede tener efectos prooxidantes reducidos que a veces se asocian con flavonoides monomericos a base de catequina. Por lo tanto, el flavonoide a base de catequina es un flavonoide oligomerizado a base de catequina que tiene propiedades flavonoides amplificadas o aumentadas.
Se conocen oligomeros de flavonoides a base de catequina, que incluyen oligomeros preparados mediante acoplamiento oxidativo catalizado por enzima y mediante oligomerizacion mediada por aldetndo. Un proceso de oligomerizacion mediado por aldetndo da como resultado un oligomero no ramificado que tiene enlaces definidos, por ejemplo a traves de enlaces carbono-carbono tales como puentes CH-CH3 unidos desde la posicion C6 o C8 en el anillo A de un monomero tiasta la posicion C6 o C8 en el anillo A del proximo monomero, incluyendo en cualquiera de las posibles estereoconfiguraciones, cuando corresponda. Por lo tanto, el enlace CH-CH3 puede estar entre la posicion C6 del anillo A de un monomero y cualquiera de las posiciones C6 o C8 del siguiente monomero o puede estar entre la posicion C8 del anillo A del primer monomero y cualquiera de las posiciones C6 o C8 del proximo monomero.
El oligomero del flavonoide a base de catequina puede ser de 2 o mas unidades monomericas unidas entre st En ciertas realizaciones, el oligomero de flavonoide a base de catequina tiene de 2 a 100 unidades monomericas flavonoides, de 10 a 100, de 2 a 80, de 10 a 80, de 2 a 50, de 10 a 50, de 2 a 30, de 10 a 30, de 20 a 100, de 30 a 100 o de 50 a 100 unidades monomericas.
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El poUmero descrito en la presente memoria puede ser cualquier poUmero que tenga un grupo aldetndo libre antes de la conjugacion con el flavonoide a base de catequina, o que tenga un grupo que se convierta en un grupo aldetndo en presencia de acido, por ejemplo un grupo acetal. Ademas, se entendera que el polfmero debe ser no toxico, biocompatible y adecuado para uso farmacologico. El polfmero tambien puede tener otras propiedades deseables, por ejemplo, el polfmero puede tener baja inmunogenicidad, y puede ser biodegradable o no biodegradable dependiendo de la aplicacion biologica deseada de la composicion, por ejemplo, para la liberacion controlada de los flavonoides a base de catequina y el agente anticanceroso en un sitio particular en un cuerpo. En el nanocomplejo micelar de la invencion, el conjugado comprende un polietilenglicol terminado en aldetndo.
El polfmero se puede elegir en funcion de sus caractensticas particulares y su capacidad para formar ciertos tipos de vehfculos de administracion. Por ejemplo, el polfmero puede ser un poli(etilenglicol) terminado en aldetndo, o puede ser acido tiialuronico derivatizado con un grupo aldehfdo, o un derivado de tales polfmeros. Como alternativa, el polfmero puede ser un dendnmero de fenoximetil(metilhidrazono) (PMMH), por ejemplo, un nucleo de ciclotrifosfaceno PMMH o nucleo de tiofosforilo PMMH. El polfmero tambien puede ser cualquier polfmero biologico, modificado para que contenga un grupo aldetndo libre o un grupo que sea convertible en un aldetndo en presencia de acido, por ejemplo, una protema modificada con aldetndo, peptido, polisacarido o acido nucleico. En una realizacion particular, el polfmero es un poli(etilenglicol) terminado en aldetndo (PEG-CHO). En otra realizacion particular, el polfmero es acido tiialuronico derivatizado con aldetndo, acido tiialuronico conjugado con aminoacetilaldetndo dietilacetal o cualquiera de los polfmeros de acido tiialuronico mencionados anteriormente derivatizados con tiramina. El conjugado utilizado en la invencion comprende el siguiente polfmero: polietilenglicol terminado en aldetndo.
El grupo aldetndo libre en el polfmero permite la conjugacion del polfmero de una manera controlada en la posicion C6 o C8 del anillo A, o ambas, de la estructura flavonoide, evitando asf la alteracion de la estructura flavonoide, especialmente los anillos B y C del flavonoide, y asf conservar las propiedades biologicas y farmacologicas beneficiosas del flavonoide.
El polfmero se conjuga con el flavonoide a base de catequina a traves de una reaccion del grupo aldetndo del polfmero con la posicion C6 y/o C8 del anillo A del flavonoide a base de catequina.
El conjugado se sintetiza usando catalisis acida de una condensacion del grupo aldetndo del polfmero con el flavonoide a base de catequina, o usando acido para convertir un grupo funcional en el polfmero en un aldetndo libre antes de la condensacion del grupo aldetndo con el flavonoide a base de catequina.
Para conjugar el polfmero y el flavonoide a base de catequina, el polfmero y el flavonoide a base de catequina se pueden disolver por separado en un disolvente adecuado. El polfmero con el aldetndo libre se anade, por ejemplo, por adicion gota a gota, a la solucion que contiene el flavonoide a base de catequina, en presencia de un acido. La reaccion se deja completar. Despues de la reaccion de conjugacion, se puede eliminar el exceso de polfmero sin reaccionar o flavonoide a base de catequina de la composicion conjugada, por ejemplo mediante dialisis o mediante tamizado molecular.
La relacion entre flavonoide a base de catequina y polfmero puede variarse, de modo que solo tiay un resto polimerico unido a la porcion de flavonoide a base de catequina del polfmero, o de forma que tiay una porcion de
flavonoide a base de catequina unida en mas de una posicion en el polfmero, o de forma que la porcion de
flavonoide a base de catequina tenga dos porciones de polfmero unidas, una en una cualquiera de las posiciones C6 y C8 del flavonoide a base de catequina.
La relacion entre polfmero y flavonoide a base de catequina en la composicion final puede controlarse mediante la relacion entre reactivos de partida. Por ejemplo, cuando la relacion molar entre resto de polfmero y resto de
flavonoide a base de catequina es aproximadamente 1, se unira un unico resto de polfmero a un unico resto
flavonoide a base de catequina (pueden usarse monomericos u oligomericos). Sin embargo, a mayores concentraciones de polfmero, por ejemplo, en una relacion molar 10:1 entre polfmero y flavonoide a base de catequina, se puede obtener una composicion que tenga una estructura de tres bloques de polfmero-flavonoide- polfmero.
Tambien se contempla un conjugado de un polfmero que contiene un aldetndo libre y un flavonoide a base de catequina, que tiene el polfmero conjugado en la posicion C6 y/o C8 del anillo A del flavonoide.
La conjugacion del polfmero tambien permite la incorporacion de flavonoides a base de catequina en diversas composiciones o vetnculos. Mediante la seleccion del polfmero particular que contiene un grupo aldetndo libre basado en las propiedades ffsicas del polfmero, es posible incorporar flavonoides en una variedad de diferentes tipos de vetnculos, permitiendo la administracion de altas concentraciones de flavonoides en diferentes contextos a varias areas especfficas del cuerpo.
Por lo tanto, el conjugado resultante de la reaccion descrita anteriormente puede formarse en un vetnculo de administracion, dependiendo de la naturaleza de la porcion de polfmero del conjugado. El vetnculo de administracion
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se puede usar para administrar el flavonoide a base de catequina a un cuerpo, incluido un sitio espedfico en un cuerpo, dependiendo de la naturaleza del vehmulo de administracion.
Agentes anticancerosos
Se incluye un agente anticanceroso en el vehmulo de administracion, que luego se pone en contacto con una celula a la que se administrara el agente anticanceroso. Por tanto, se proporciona un vehmulo de administracion que comprende un flavonoide a base de catequina conjugado con un polfmero a traves de un grupo aldefudo libre en el polfmero, comprendiendo ademas el vehmulo de administracion un agente anticanceroso, que es un anticuerpo dirigido contra un marcador de la superficie de celulas tumorales.
El agente anticanceroso divulgado en la presente memoria puede ser cualquier agente que tenga un efecto anticanceroso sobre una celula, incluyendo un efecto antitumoral, tal como un efecto, citotoxico, apoptotico, antimitotico, anti-angiogenesis o de inhibicion del efecto de la metastasis. El efecto anticanceroso pretende incluir la inhibicion o reduccion del crecimiento de las celulas tumorales, la inhibicion o la reduccion de la carcinogenesis, la destruccion de las celulas tumorales o la inhibicion o reduccion de las propiedades carcinogenicas o tumorigenicas de una celula, incluida una celula tumoral. El agente anticanceroso usado en la invencion es un anticuerpo dirigido contra un marcador de la superficie de celulas tumorales.
Un agente contra el cancer incluye una protema, un acido nucleico, una molecula pequena o un farmaco. Un agente anticanceroso que es una protema puede ser un peptido, un anticuerpo, una hormona, una enzima, un factor de crecimiento o una citocina. Un agente anticanceroso que es un acido nucleico puede ser ADN o ARN monocatenario o bicatenario, un ARN corto en horquilla, un ARNsi, o puede comprender un gen que codifica un producto anticanceroso, un agente quimioterapeutico o un inhibidor de la angiogenesis. El agente anticanceroso usado en la invencion es un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo monoclonal, dirigido contra un marcador de la superficie de celulas tumorales. El agente anticanceroso puede ser Herceptin (trastuzumab) o TNP470.
Formacion del vehiculo de administracion que contiene un agente anticanceroso
El vehmulo de administracion es un nanocomplejo micelar, que es adecuado para administracion parenteral de un flavonoide a base de catequina y un agente anticanceroso a una celula, que incluye una celula localizada en un sitio particular dentro del cuerpo de un sujeto.
Para formar el vehmulo de administracion que contiene el agente anticanceroso, se elige que el polfmero tenga propiedades que le permitan ensamblarse con la porcion de flavonoide a base de catequina de la composicion, protegiendo al flavonoide del entorno de la solucion. Si se elige un disolvente adecuado en el que la porcion de polfmero del conjugado es soluble y es mas soluble que el flavonoide a base de catequina, el conjugado se autoensamblara, excluyendo la solucion del nucleo de flavonoide, permitiendo asf el ensamblaje de complejos micelares.
En el vehiculo de administracion de nanocomplejos micelares, el polfmero elegido es PEG terminado en aldefudo, o un derivado del mismo. El PEG es un polfmero, ampliamente utilizado como ingrediente farmacologico, y posee buenas caractensticas hidrofilas, no toxicas, no inmunogenicas y de biocompatibilidad con baja biodegradabilidad.
Al conjugar PEG-CHO con un flavonoide a base de catequina, se forma un conjugado que tiene fuertes tendencias de autoensamblaje. En una realizacion, el PEG se conjuga con un monomero de un flavonoide a base de catequina, para formar un PEG-flavonoide. El vehuculo de administracion se forma junto con flavonoides a base de catequina no conjugados y el agente anticanceroso. Por lo tanto, el nucleo central contiene concentraciones relativamente altas de un flavonoide y el agente anticanceroso, mientras que la cubierta externa del nanocomplejo micelar comprende el flavonoide PEG monomerico conjugado, y se ensambla en un proceso de dos etapas. En una realizacion particular, el nucleo central es EGCG oligomerico (OEGCG) y el nucleo externo esta constituido por un conjugado PEG-EGCG.
La formacion de este ensamblaje en dos etapas del vehuculo de administracion da como resultado el enmascaramiento parcial temporal o completo de las actividades biologicas del flavonoide oligomerico que se incorpora al nucleo del vehuculo de administracion, asf como la proteccion del agente anticanceroso de la degradacion antes de la administracion. administracion a la celula. Por ejemplo, mientras se ensamblan en el nucleo del vehiculo de administracion, las propiedades aumentadas del EGCG oligomerizado estan menos disponibles, debido a las interacciones ffsicas con otras moleculas en la porcion del nucleo ensamblado del vehuculo de administracion. Tras la liberacion del vehuculo de administracion, por ejemplo mediante fusion del vehuculo con una membrana celular de fosfolfpidos, los componentes de la administracion se disocian, desenmascarando las propiedades biologicas del flavonoide oligomerico a base de catequina, y liberando el agente anticanceroso para su administracion en la celula.
Esta realizacion del vehuculo de administracion es muy adecuada para administrar el agente anticanceroso. Dado que los flavonoides a base de catequina tienen una estructura central ngida de multiples anillos, estas moleculas se asocian bien con agentes anticancerosos como protemas y acidos nucleicos, asf como con otras moleculas que
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contienen estructuras de anillo, probablemente mediante el apilamiento de los anillos de catequina con el anillo o anillos en el agente anticanceroso. Por lo tanto, se puede usar un flavonoide oligomerico a base de catequina para asociarlo con el agente anticanceroso antes del ensamblaje en el nanocomplejo micelar.
La concentracion del agente anticanceroso se elige dependiendo de la cantidad total de agente anticanceroso que se administrara a un sitio particular en un cuerpo, y de la cantidad de agente anticanceroso que se puede incluir en el nanocomplejo micelar sin desestabilizar la estructura micelar. En ciertas realizaciones, el agente anticanceroso puede constituir hasta 50 %, o hasta 40 %, p/p del complejo micelar.
La actividad biologica del agente anticanceroso tambien se enmascara de forma temporalmente parcial o completamente mientras se incorpora en los presentes vetuculos de administracion. Al igual que con el flavonoide a base de catequina oligomerico, las propiedades biologicas del agente anticanceroso estan enmascaradas o secuestradas, lo que las hace menos disponibles mientras el agente anticanceroso se ensambla en el vehfculo de administracion, lo que significa que el agente anticanceroso no esta disponible para ejercer actividad anticancengena o interactuar con otras moleculas de forma bioactiva mientras esta contenido en el vetuculo de administracion, y tambien esta protegido contra la actividad de otras moleculas. Tras la liberacion del agente anticanceroso del vetuculo de administracion, las propiedades biologicas del agente anticanceroso estan nuevamente disponibles, y el agente anticanceroso puede ejercer un efecto anticanceroso una vez que se administra a la celula.
En otra realizacion, el PEG esta conjugado con un flavonoide a base de catequina oligomerico. Esta realizacion del agente de administracion tiene fuertes propiedades de autoensamblaje y puede autoensamblarse en un proceso de una sola etapa. Al igual que con el nanocomplejo micelar de ensamblaje en dos etapas anterior, el nanocomplejo micelar de ensamblaje en una sola etapa incluye el agente anticanceroso.
Los nanocomplejos micelares anteriores son de dimensiones nanometricas, y pueden ser de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 10.000 nm de diametro, o de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 4.000 nm de diametro, o de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm de diametro. El tamano de los nanocomplejos micelares se puede variar variando la longitud del flavonoide a base de catequina oligomerizado, la longitud del polfmero y la concentracion de flavonoide a base de catequina oligomerizado no conjugado. El tamano del nanocomplejo micelar puede depender del pH, dependiendo del polfmero utilizado. Por ejemplo, en nanocomplejos micelares en los que el polfmero conjugado es PEG, el diametro de las micelas tiende a disminuir al aumentar el pH.
Generalmente, los nanocomplejos micelares que contienen el agente anticanceroso se someten a autoensamblaje y, por lo tanto, se requiere poca smtesis. Para el proceso de dos etapas, los componentes que van a formar el nucleo, que incluyen el agente anticanceroso, se disuelven en un disolvente adecuado, por ejemplo en DMSO diluido o metanol, y se les permite ensamblar. El disolvente es un disolvente en el que los componentes del nucleo son solubles, y que pueden ser miscibles en agua, o que pueden ser volatiles, o a partir de los cuales las micelas ensambladas pueden aislarse o extraerse de otro modo. Como se indico anteriormente, los componentes del nucleo incluyen un agente anticanceroso y un flavonoide a base de catequina, por ejemplo un flavonoide oligomerico a base de catequina. El conjugado de flavonoide a base de catequina polimerico que forma la capa externa se anade posteriormente a la solucion y se permite la formacion del complejo micelar.
Para el proceso de autoensamblaje en una etapa, el conjugado de flavonoide a base de catequina polimerico junto con el agente anticanceroso, se disuelve en un tampon adecuado como se describe para el proceso en dos etapas y se permite el ensamblaje del nanocomplejo micelar.
Este sistema de nanocomplejo micelar proporciona la capacidad de lograr una biodistribucion controlada de flavonoides a base de catequina y una semivida de circulacion prolongada en el torrente sangumeo debido a la capa exterior de PEG, asf como actividades patologicas amplificadas del compuesto flavonoide a base de catequina, con el beneficio adicional de que tales compuestos pueden estar acompanados por el efecto terapeutico del agente anticanceroso cargado en el nucleo interno de la micela. Cuando el agente anticanceroso es una molecula sensible como una protema, las micelas a nanoescala ofrecen un vetuculo de administracion conveniente con la ventaja de un metodo suave de autoensamblaje que no implica los esfuerzos mecanicos, termicos y qrnmicos que pueden asociarse con las tecnicas de encapsulacion convencionales actualmente utilizadas, tecnicas convencionales que pueden conducir a la desnaturalizacion de agentes anticancerosos bioactivos sensibles tales como protemas.
En otra realizacion divulgada en la presente memoria, el vetuculo de administracion es un hidrogel, que puede usarse como un aposito, para la administracion de liberacion sostenida de un agente anticanceroso, o como un soporte para la regeneracion de tejido.
Se elige que el polfmero tenga buenas caractensticas de capacidad de hinchamiento y que tenga grupos apropiados disponibles para la reticulacion de los restos de polfmero, y que sea no toxicos y biocompatible y en algunas realizaciones sea biodegradable.
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En una realizacion particular del hidrogel, el poKmero, es acido hialuronico derivado de aldehndo, o un derivado de acido hialuronico tal como conjugado de acido hialuronico y aminoacetilaldehndo dietilacetal, o un derivado de tiramina de acido hialuronico derivatizado con aldehndo o conjugado de acido hialuronico y aminoacetilaldetHdo dietilacetal.
Los conjugados que comprenden un flavonoide a base de acido hialuronico-catequina se pueden reticular facilmente para formar un hidrogel, sin alteracion de las propiedades biologicas o farmacologicas del flavonoide. Dichos hidrogeles tambien comprenden un agente anticanceroso tal como se describio anteriormente, para la liberacion del agente anticanceroso a una celula en el sitio donde se aplica el hidrogel.
El conjugado acido hialuronico-flavonoide se sintetiza haciendo reaccionar el acido hialuronico con el flavonoide a base de catequina en condiciones acidas, por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o por ejemplo a un pH de aproximadamente 1. El polfmero-flavonoide conjugado se purifica a continuacion, por ejemplo mediante dialisis, y luego se mezcla con el agente anticanceroso, y un agente de reticulacion, tal como peroxido de hidrogeno. Se anade un catalizador de entrecruzamiento, por ejemplo peroxidasa de rabano picante, y el hidrogel puede luego verterse rapidamente en un molde para formar una forma deseada antes de que se complete la reaccion de entrecruzamiento. Por ejemplo, el hidrogel puede formarse en una porcion adecuada para su aplicacion como aposito para heridas.
Los componentes del hidrogel tambien se pueden inyectar y hacer reaccionar para formar el hidrogel in vivo, por ejemplo inyectando un conjugado no reticulado junto con un agente anticanceroso, junto con un agente de reticulacion, tal como peroxido de hidrogeno y un catalizador de reticulacion, por ejemplo, peroxidasa de rabano picante. Tal hidrogel es util para la administracion de farmacos a un sitio espedfico en un cuerpo, o para la ingeniena de tejidos.
Dado que el acido hialuronico tiene multiples sitios que pueden reaccionar con el flavonoide durante la reaccion de conjugacion, al variar la concentracion del flavonoide a base de catequina en la reaccion de partida, es posible variar el grado de conjugacion entre el polfmero de acido hialuronico y el flavonoide a base de catequina. Por ejemplo, la relacion entre reactivos puede ajustarse de modo que el conjugado resultante tenga de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 % de los sitios en el polfmero conjugado con el flavonoide. Como alternativa, puede anadirse acido hialuronico adicional que no se ha conjugado con la mezcla antes de la reticulacion del hidrogel de modo que algunas de las moleculas de polfmero en el hidrogel no se conjuguen con el flavonoide.
Administracion del agente anticanceroso a una celula
Para administrar el agente anticanceroso a una celula que usa el vehnculo de administracion que contiene flavonoides, el vehnculo de administracion que comprende el agente anticanceroso se pone en contacto con una celula, los que puede permitir la absorcion del agente anticanceroso en la celula.
Por lo tanto, la administracion del agente anticanceroso a una celula comprende poner en contacto el vehnculo de administracion que contiene el agente anticanceroso con la superficie de una celula. Sin limitarse a ninguna teona en particular, el sistema de administracion se disocia por moleculas anfffilas tales como lfpidos de membranas plasmaticas y, por lo tanto, el agente anticanceroso se libera en el sitio de la celula mediante seleccion pasiva y puede liberarse en la celula.
La celula a la que se enviara el agente anticanceroso puede ser cualquier celula, incluido una celula in vitro, una celula en cultivo, o una celula in vivo dentro de un sujeto. El termino “celula”, como se usa en la presente memoria, se refiere e incluye una sola celula, una pluralidad de celulas o una poblacion de celulas cuando el contexto lo permite, a menos que se especifique lo contrario. La celula puede ser una celula in vitro que incluye una celula explantada de un sujeto o puede ser una celula in vivo en un sujeto. De manera similar, la referencia a “celulas” tambien incluye una referencia a una sola celula cuando el contexto lo permite, a menos que se especifique lo contrario. La administracion a las celulas de acuerdo con la presente invencion se define en las reivindicaciones 7 y 9.
La celula puede derivar de cualquier organismo, por ejemplo, un animal que incluye un mairnfero que incluye un ser humano.
Cuando se administra a la celula, el agente anticanceroso conserva su funcion anticancerosa, como se describio anteriormente, y puede administrarse a la celula. Una persona experta puede determinar facilmente si el agente anticanceroso se ha administrado a la celula usando metodos y tecnicas conocidos, que incluyen metodos de deteccion de protemas, inmunoensayos y tecnicas de marcaje fluorescente.
Las composiciones y vehnculos de administracion descritos anteriormente son muy adecuados para la administracion controlada y dirigida de agentes anticancerosos junto con flavonoides a base de catequinas a sitios particulares dentro del cuerpo de un sujeto. Los flavonoides pueden proporcionar actividad antibacteriana, antineoplasica, antitrombotica, vasodilatadora, antioxidante, antimutagenica, anticancengena, hipercolesterolemica, antivmca y
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antiinflamatoria en el sitio objetivo. Ademas, los vehmulos de administracion incluyen un agente anticanceroso, lo que hace que los vehmulos de administracion sean utiles en el tratamiento del cancer. Por ejemplo, los peptidos y protemas inmunoreguladores que incluyen citocinas y factores de crecimiento se han convertido en una clase importante de farmacos para el tratamiento del cancer.
Por lo tanto, en la actualidad se divulga un metodo para administrar un agente anticanceroso a un sujeto que comprende administrar un vehmulo de administracion que comprende un conjugado de un polfmero que contiene un aldehndo libre y un flavonoide a base de catequina, teniendo el polfmero conjugado en la posicion C6 y/o C8 del anillo A del flavonoide, como se describio anteriormente. En ciertas realizaciones, el conjugado se forma en un vehmulo de administracion, tal como un nanocomplejo micelar o un hidrogel, como se describio anteriormente. Un aspecto relacionado de la presente invencion se define en la reivindicacion 9.
El sujeto es cualquier animal, incluido un ser humano, que necesite tratamiento con un agente anticanceroso.
Por lo tanto, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un vehmulo de administracion que contiene el agente anticanceroso y el flavonoide como se describio anteriormente. La composicion farmaceutica puede incluir ademas un diluyente o vehmulo farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica puede contener rutinariamente una concentracion de sales, agentes tamponantes, conservantes y varios vehmulos compatibles farmaceuticamente aceptables. Para todas las formas de administracion, el vehmulo de administracion puede formularse en una solucion salina fisiologica. La reivindicacion 8 define la composicion farmaceutica de la presente invencion.
La proporcion e identidad del diluyente o vehmulo farmaceuticamente aceptable se determina mediante la ruta de administracion elegida, la compatibilidad con protemas biologicamente activas, si corresponde, y la practica farmaceutica estandar.
La composicion farmaceutica puede prepararse por metodos conocidos para la preparacion de composiciones farmaceuticamente aceptables adecuadas para la administracion a sujetos, de modo que una cantidad eficaz del vehmulo de administracion y cualquier sustancia o sustancias activas adicionales se combinen en una mezcla con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Se administra una cantidad efectiva de vehmulo de administracion al sujeto. La expresion “cantidad efectiva” como se usa en la presente memoria significa una cantidad efectiva, a dosis y durante penodos de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado, por ejemplo, para administrar el agente anticanceroso a la poblacion de celulas o celulas diana dentro del sujeto, incluyendo un cantidad deseada del agente anticanceroso a la celula basado en factores que incluyen el efecto del agente anticanceroso, el efecto del flavonoide y el efecto sinergico del agente anticanceroso y el flavonoide juntos.
Vehmulos adecuados se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., EE. UU. 1985). Teniendo en cuenta esto, las composiciones incluyen, aunque no exclusivamente, soluciones del vehmulo de administracion, en asociacion con uno o mas vehmulos o diluyentes farmaceuticamente aceptables, y estan contenidas en soluciones tampon con un pH adecuado e isoosmotico con fluidos fisiologicos.
En condiciones normales de almacenamiento y uso, tales composiciones farmaceuticas pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos, y que mantendran cualquier actividad biologica del agente anticanceroso. Un experto en la materia sabna como preparar formulaciones adecuadas. Los procedimientos e ingredientes convencionales para la seleccion y preparacion de formulaciones adecuadas se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences y en la Farmacopea de los Estados Unidos: El Formulario Nacional (USP 24 NF19) publicado en 1999. Como alternativa, el vehmulo de administracion puede formularse en un tiempo suficientemente cercano para usar mezclando los componentes, sin la necesidad de conservantes. La reivindicacion 9 define el uso medico del nanocomplejo micelar de la invencion para administrar un agente anticanceroso a una celula en un sujeto.
El vehmulo de administracion divulgado en la presente memoria puede administrarse usando metodos conocidos, que dependeran de la forma del vehmulo de administracion. Se prefieren las rutas no orales. Si el vehmulo de administracion se formula como una solucion, o en forma de nanopartmulas micelares, el vehmulo de administracion puede administrarse por via parenteral, incluyendo por via intravenosa, intramuscular o mediante inyeccion directa en un tejido u organo seleccionado. Si el vehmulo de administracion se formula como un hidrogel, el conjugado se puede aplicar topicamente o mediante insercion quirurgica en el sitio de la herida.
Cuando se administra a un sujeto, el vehmulo de administracion se administra en una cantidad efectiva y en las dosis y durante un penodo de tiempo suficiente para lograr un resultado deseado. Por ejemplo, el vehmulo de administracion se puede administrar en cantidades y dosis necesarias para administrar un agente anticanceroso que pueda funcionar para aliviar, corregir, mitigar, mejorar, estabilizar, prevenir la diseminacion, ralentizar o retrasar la progresion o curar una enfermedad o trastorno, o para inhibir, reducir o alterar la actividad de una enzima relacionada con la enfermedad. Una enzima relacionada con una enfermedad es una enzima implicada en una ruta metabolica o bioqmmica, que cuando la via se interrumpe, o cuando el control regulatorio de la enzima o via se
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interrumpe o inhibe, la actividad de la enzima esta implicada en el inicio o progresion de una enfermedad o trastorno, por ejemplo, cancer.
La cantidad efectiva de velmculo de administracion a administrar a un sujeto puede variar dependiendo de muchos factores tales como las propiedades farmacodinamicas del velmculo de administracion, que incluyen el agente anticanceroso, el resto del polfmero y el resto flavonoide a base de catequina, el modo de administracion, la edad, la salud y el peso del sujeto, la naturaleza y el alcance del trastorno o estado de la enfermedad, la frecuencia del tratamiento y el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, y la concentracion y forma del velmculo de administracion.
Un experto en la materia puede determinar la cantidad apropiada en base a los factores anteriores. El velmculo de administracion se puede administrar inicialmente en una cantidad adecuada que se puede ajustar segun sea necesario, dependiendo de la respuesta clmica del sujeto. La cantidad efectiva de velmculo de administracion se puede determinar empmcamente y depende de la cantidad maxima del velmculo de administracion que se puede administrar de forma segura. Sin embargo, la cantidad de velmculo de administracion administrada debe ser la cantidad minima que produce el resultado deseado.
Tambien se proporciona un velmculo de administracion como se describio anteriormente que contiene el agente anticanceroso y el flavonoide.
Tambien se proporciona el uso del velmculo de administracion descrito anteriormente para administrar el agente anticanceroso a una celula, o el uso del velmculo de administracion descrito anteriormente para la fabricacion de un medicamento para administrar el agente anticanceroso a una celula, que incluye cuando la celda es una celula in vivo en un sujeto.
La invencion se ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo no limitante.
Ejemplos
Ejemplo 1: Efectos terapeuticos sinergicos del complejo micelar cargado de proteinas compuesto por derivados del te verde
Materiales y metodos
Sintesis de OEGCG y PEG-EGCG: El OEGCG se sintetizo mediante la reaccion de Baeyer de EGCG (Kurita Ltd.) y acetaldelmdo (pH 2). Para sintetizar PEG-EGCG, el PEG terminado en aldelmdo (Pm 5000, NOF Co.) y EGCG se hicieron reaccionar a pH = 2.
Los complejos micelares se formaron como se describio previamente en la solicitud internacional publicada WO 2006/124000 y en la solicitud de los Estados Unidos publicada 2008/102052.
Prueba de citotoxicidad: La citotoxicidad de los derivados de EGCG se examino con celulas epiteliales mamarias humanas normales (HMEC, Cambrex, EE. UU.) y se comparo con la del EGCG intacto. Las celulas se sembraron (1 x 104 celulas en medio de crecimiento epitelial mamario/ pocillo) por quintuplicado y octuplicado para muestras y control, respectivamente, en microplacas de 96 pocillos, y se dejaron adherir durante la noche. Despues de que las celulas se trataron con diferentes concentraciones de EGCG, OEGCG o PEG-EGCG durante 2 dfas, se estimo la viabilidad celular usando Alamar Blue, un colorante que se reducina por la actividad del citocromo c de las celulas.
Evaluacion de la proteolisis: La degradacion proteica se determino controlando el incremento de intensidad de fluorescencia en FlTC-BSA cuando las muestras se sometieron a proteinasa K (0,05 mg/ml), usando un espectrofotometro de fluorescencia (Hitachi, Japon, Aex = 490 nm y Aem = 530 nm). Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
Evaluacion de la proliferacion de celulas cancerosas: Se sembraron celulas SKBR-3 (ATCC, HTB3O, EE. UU.) (1 x 104 celulas en medio de McCoy 5A/pocillo) por quintuplicado y octuplicado para muestras y control, respectivamente, en microplacas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Los medios de cultivo fueron reemplazados por medios que conteman las muestras (OEGCG, PEG-EGCG, Herceptin (0,5 mg/ml), complejo micelar cargado con Herceptin y complejo micelar cargado con BSA), y las celulas se incubaron a 37 °C en 5 % de CO2. En los momentos indicados, los medios de cultivo fueron reemplazados por los medios libres de rojo de fenol que conteman 10 % de Alamar Blue. La proliferacion celular se determino a partir de la reduccion de la absorbancia del colorante a 570 y 600 nm despues de 4 h de incubacion.
Resultados
Los complejos micelares se sintetizaron mediante (i) el proceso de autoensamblaje en dos etapas que implica el ensamblaje de (-)-epigalocatequina-3-O-galato oligomerico (OEGCG), incluyendo la protema relevante (protema marcadora fluorescente o agente anticanceroso) cuando sea aplicable, y despues el ensamblaje del complejo
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OEGCG preformado (mas protema) con un conjugado de poli(etilenglicol) (PEG) y EGCG (PEG-EGCG); o (ii) un proceso de autoensamblaje en una sola etapa que implica el ensamblaje de un conjugado de PEG y OEGCG (PEG- OEGCG) (y la protema relevante cuando sea aplicable). En ambos casos, los complejos micelares se formaron inmediatamente como complejos micelares estables y altamente orientados, cargados con la protema relevante, mediante el autoensamblaje espontaneo en una solucion acuosa suave y exhibiendo una cubierta externa de PEG con un nucleo interno compuesto de un complejo de OEGCG (mas protema).
El PEG-EGCG no mostro citotoxicidad, mientras que el OEGCG y el EGCG mostraron una baja citotoxicidad para HMEC (ver Figura 1). El complejo micelar mantuvo su integridad y demostro buena estabilidad en presencia de suero sin cambio de tamano (ver Figura 2).
El complejo micelar se cargo con una protema marcada con fluorescencia (FITC-BSA) y se sometio a una proteasa (proteinasa K) para investigar la degradacion de la protema a lo largo del tiempo (Figura 3). La intensidad de la fluorescencia del FITC-BSA libre aumento significativamente con el tiempo, indicando la degradacion de la protema por la proteinasa K. Por el contrario, la intensidad de la fluorescencia de FITC-BSA cargada en los complejos micelares se mantuvo muy baja (incluso menor que la de FITC-BSA libre en la ausencia de proteinasa K), que ilustra que la protema estaba solidamente protegida de la proteolisis en estos sistemas.
Se exploro la inhibicion del crecimiento de celulas cancerosas in vitro para el complejo micelar cargado con Herceptin (trastuzumab), que es un anticuerpo monoclonal humanizado contra el receptor HER2/neu (erbB2) que induce la regresion de tumores de cancer de mama metastasico que sobreexpresan HER2 (Figura 4). El complejo micelar cargado con Herceptin no mostro reduccion de tamano, se probo hasta una dilucion de mil veces (Figura 5). Cuando SKBR-3 (lmea celular de cancer de mama humano que sobreexpresa HER2) se trato con Herceptin libre o los componentes del vehroulo (OEGCG o PEG-EGCG), se observo que se inhibfa el crecimiento celular. El complejo micelar cargado con BSA mostro mas efecto de inhibicion que OEGCG o PEG-EGCG solo (mientras que BSA por sf mismo no mostro ningun efecto). En particular, el complejo micelar cargado con Herceptin mostro un efecto de inhibicion impresionantemente mayor, en comparacion con los componentes individuales administrados (OEGCG, PEG-EGCG o Herceptin) y el complejo micelar cargado con BSA.
Dado que la formacion del nanocomplejo micelar se basa principalmente en la interaccion hidrofoba, el complejo se disociana por la competencia hidrofoba de los tensioactivos. El complejo podna gradualmente disociarse y liberar componentes mediante la interaccion con moleculas bioanfffilas, como los lfpidos de la membrana celular, mientras que el complejo se mantendna con las celulas. El complejo micelar mostro un retraso de tiempo antes de exhibir el efecto terapeutico (Figura 6), es decir, no se mostro ningun efecto en puntos de tiempo tempranos (por ejemplo, a las 10 h), mientras que la protema libre y los componentes de vehroulo individuales comenzaron a ejercer efectos anticancerosos inmediatamente. Esto ilustro la ventaja estructural del complejo micelar, que se cargo con protema dentro de una cubierta externa de PEG. Ademas de la liberacion retardada, el complejo micelar proporciono la liberacion sostenida de las moleculas terapeuticas (protemas y componentes vehroulo) por disociacion resultante de la interaccion con las celulas. Estas caractensticas senan particularmente utiles y ventajosas a la luz del hecho de que el vehroulo tendna que viajar desde el punto de administracion a los sitios diana pretendidos antes de ejercer las actividades terapeuticas.
Discusion
Se ha sintetizado un vehroulo nanocomplejo micelar de nucleo-cubierta con dos derivados del EGCG que se disenaron para unirse con protemas en una estructura ordenada espacialmente. Estos complejos formaron nanocomplejos micelares a traves del autoensamblaje espontaneo en una solucion acuosa (Figura 1). Los nanocomplejos micelares se obtuvieron mediante dos procesos de autoensamblaje: (i) a traves de la formacion de complejos entre el EGCG oligomerizado (OEGCG) y protemas para formar el nucleo, y (ii) a traves de la formacion de complejos de poli(etilenglicol)-EGCG (PEG-EGCG) que rodean el nucleo preformado para formar la cubierta. El nanocomplejo micelar resultante muestra una cubierta de PEG con un nucleo de complejo OEGCG-protema. Esta caractenstica estructural puede servir para reducir la inmunogenicidad proteica y prevenir el rapido aclaramiento renal y la proteolisis de la protema por la captacion del sistema reticuloendotelial, disminuyendo la necesidad de inyecciones frecuentes o terapia de infusion. La cubierta altamente soluble en agua de PEG y el tamano adaptado (<100 nm) pueden no solo prolongar la semivida en plasma, sino tambien proporcionar un efecto de permeabilidad y retencion mejorado, dando como resultado la acumulacion selectiva en tumores y sitios de infeccion e inflamacion.
La afinidad del EGCG por la protema se utilizo para cargar los complejos micelares con una protema anticancerosa. Los complejos cargados de protemas demostraron un efecto anticanceroso mucho mayor que la protema libre o el propio vehroulo. Este sistema micelar puede ofrecer una administracion mejorada de diversas moleculas biologicas, a fin de explotar las ventajas de los efectos terapeuticos sinergicos y los efectos de administracion asociados con el vehroulo derivado de flavonoides versatil.
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Ejemplo 2: Tratamiento de ratones Balb/desnudos con complejos micelares que contienen Herceptin
Se indujeron ratones Balb/desnudos con tumores de la siguiente manera. Se administro un granulo de 17p-estradiol (0,72 mg, 60 dfas de liberacion) a cada raton mediante inyeccion subcutanea. Al d^a siguiente, una suspension de celulas BT474 (8,1 X 106 celulas/100 pl de Matrigel) se inyectaron por via subcutanea en cada raton. Se permitio que los tumores se desarrollaran durante dos semanas.
Dos semanas despues de la inyeccion de las celulas BT474, los ratones se trataron mediante inyeccion intravenosa, dos veces por semana durante un penodo de un mes, con uno de los nanocomplejos micelares cargados con Herceptin, Herceptin solo o PBS como control. Despues del regimen de tratamiento, se evaluo el tamano del tumor. Los resultados se muestran en la Figura 7.
Como puede comprender un experto en la materia, son posibles muchas modificaciones a las realizaciones ilustrativas descritas en la presente memoria. La invencion pretende abarcar todas estas modificaciones dentro de su alcance, tal como se define en las reivindicaciones.
Aunque en la presente memoria se divulgan diversas realizaciones de la invencion, se pueden realizar muchas adaptaciones y modificaciones dentro del alcance de la invencion de acuerdo con el conocimiento general comun de los expertos en esta tecnica. Tales modificaciones incluyen la sustitucion de equivalentes conocidos para cualquier aspecto de la invencion con el fin de lograr el mismo resultado sustancialmente de la misma manera. Todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la materia de esta invencion, a menos que se defina lo contrario
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Claims (9)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un nanocomplejo micelar que comprende:
    un agente anticanceroso que es un anticuerpo dirigido contra un marcador de la superficie de celulas tumorales;
    y
    un conjugado de:
    (i) polietilenglicol terminado en aldehndo; y
    (ii) un flavonoide que es galato de (-)-epigalocatequina monomerico o galato de (-)-epigalocatequina oligomerico,
    teniendo el nanocomplejo micelar el polietilenglicol conjugado en la posicion C6 y/o C8 del anillo A del flavonoide mediante la union del polietilenglicol a traves de la reaccion del grupo aldehfdo libre con la posicion C6 y/o C8 del anillo A del flavonoide,
    en el que cuando el flavonoide es galato de (-)-epigalocatequina monomerico, el nanocomplejo micelar comprende ademas galato de (-)-epigalocatequina oligomerico no conjugado en un nucleo interno del nanocomplejo micelar, en el que el agente anticanceroso esta formando un complejo con el galato de epigalocatequina oligomerico conjugado o no conjugado, dependiendo del que este presente,
    y en el que el nanocomplejo micelar exhibe un efecto anticanceroso sinergico entre el agente anticanceroso y el flavonoide cuando se administra a una celula.
  2. 2. El nanocomplejo micelar de la reivindicacion 1, en el que el polietilenglicol esta conjugado con galato de (-)- epigalocatequina oligomerico.
  3. 3. El nanocomplejo micelar de la reivindicacion 1, en el que el polietilenglicol esta conjugado con galato de (-)- epigalocatequina monomerico y el nanocomplejo micelar comprende un nucleo interno que contiene galato de (-)- epigalocatequina oligomerico no conjugado.
  4. 4. El nanocomplejo micelar de la reivindicacion 2 o 3, en el que el galato de (-)-epigalocatequina oligomerico se forma a partir de monomeros de galato de (-)-epigalocatequina que se han oligomerizado a traves de: (i) acoplamiento oxidativo catalizado por enzima; (ii) oligomerizacion mediada por aldehudo; o (iii) un enlace carbono- carbono entre la posicion C6 o C8 en el anillo A de una primera unidad monomerica y la posicion C6 o C8 en el anillo A de una segunda unidad monomerica.
  5. 5. El nanocomplejo micelar de la reivindicacion 1, en el que el agente anticanceroso es un anticuerpo monoclonal dirigido contra un marcador de la superficie de celulas tumorales.
  6. 6. El nanocomplejo micelar de la reivindicacion 5, en el que el anticuerpo monoclonal dirigido contra un marcador de la superficie de celulas tumorales es trastuzumab.
  7. 7. Un metodo de administracion in vitro de un agente anticanceroso a una celula que comprende poner en contacto el nanocomplejo micelar de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 con la celula.
  8. 8. Una composicion farmaceutica que comprende el nanocomplejo micelar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  9. 9. El nanocomplejo micelar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la administracion de un agente anticanceroso a una celula en un sujeto.
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