ES2667725T3 - Variantes de lacasa con propiedades mejoradas - Google Patents

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ES2667725T3 ES15716530.9T ES15716530T ES2667725T3 ES 2667725 T3 ES2667725 T3 ES 2667725T3 ES 15716530 T ES15716530 T ES 15716530T ES 2667725 T3 ES2667725 T3 ES 2667725T3
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Abstract

Un polipéptido con actividad de lacasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es más del 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, en el que el polipéptido comprende un resto de aminoácido no polar seleccionado del grupo que consiste en metionina, leucina, isoleucina, valina, alanina, prolina y glicina y fenilalanina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1.

Description

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DESCRIPCION
Variantes de lacasa con propiedades mejoradas Campo de la invención
La presente invención se refiere a variantes de lacasa y a usos de las mismas como biocatalizadores respetuosos con el medioambiente en diversos procesos industriales.
Antecedentes de la invención
Las lacasas (EC 1.10.3.2) son enzimas que tienen una amplia distribución taxonómica y que pertenecen al grupo de las oxidasas multicobre. Las lacasas son catalizadores respetuosos con el medioambiente, que usan oxígeno molecular del aire para oxidar diversos compuestos relacionados con lignina fenólicos y no fenólicos, además de Estos catalizadores "verdes" naturales se usan para diversas aplicaciones industriales que incluyen la desintoxicación de efluentes industriales, principalmente de las industrias del papel y la pulpa, textiles y petroquímicas, se usan como agente de biorremediación para limpiar herbicidas, pesticidas y ciertos explosivos en la tierra. Las lacasas también se usan como agentes de limpieza para ciertos sistemas de purificación de agua. Además, su capacidad para eliminar sustancias xenobióticas y producir productos poliméricos hace que sean una herramienta útil para fines de biorremediación. Otra gran área de aplicación de las lacasas es el pretratamiento de biomasa en la industria del biocombustible y la pulpa y el papel.
Las moléculas de lacasa son normalmente monómeros que consisten en tres dominios de tipo cupredoxina consecutivamente conectados enrollados en un apretado glóbulo. El sitio activo de las lacasas contiene cuatro iones cobre: un ión cobre "azul" mononuclear (sitio T1) y una agrupación de tres cobres nucleares (sitio T2/T3) que consiste en un ión cobre T2 y dos iones cobre T3.
Las lacasas pueden aislarse de diferentes fuentes tales como plantas, hongos o bacterias y son muy diversas en las secuencias primarias. Sin embargo, tienen algunas regiones conservadas en las secuencias y ciertas características comunes en sus estructuras tridimensionales. Una comparación de secuencias de más de 100 lacasas ha revelado cuatro regiones conservativas cortas (no más de 10 aa cada una) que son específicas para todas las lacasas [7, 8]. Una cisteína y diez restos de histidina forman un entorno de ligando de iones cobre del sitio activo de lacasa presente en estas cuatro secuencias de aminoácidos conservativas.
La lacasa bacteriana mejor estudiada es la lacasa CotA. CotA es un componente de las capas de envoltura externas de endosporas de bacilo. Es una proteína de 65 kDa codificada por el gen CotA [1].
CotA pertenece a un diverso grupo de oxidasas "azules" multi-cobre que incluye las lacasas. Esta proteína demuestra alta termoestabilidad, y resistencia a diversos elementos peligrosos según las capacidades de supervivencia de la endospora.
La expresión recombinante de proteínas en hospedadores fácilmente cultivables puede permitir productividad más alta en tiempo más corto y reducir los costes de producción. Las posibilidades de versatilidad y aumento de escala de la producción de proteínas recombinantes abrieron nuevas oportunidades comerciales para sus usos industriales. Además, la producción de proteínas de especies productoras de patógenos o toxinas puede aprovecharse de hospedadores microbianos GRAS (considerados seguros) más seguros o uniformes. Además, puede emplearse ingeniería de proteínas para mejorar la estabilidad, actividad y/o especificidad de una enzima, así pueden producirse enzimas confeccionadas a medida para adecuarse a los requisito de los usuarios o del proceso.
Puede aumentarse la productividad de las enzimas usando múltiples copias génicas, promotores fuertes y secuencias señal eficientes, apropiadamente diseñadas para dirigir las proteínas al medio extracelular, simplificando así el procesamiento aguas abajo.
El rendimiento de las proteínas recombinantes en hospedadores bacterianos está frecuentemente limitado por la incapacidad de la proteína para plegarse en una estructura 3D correcta tras la biosíntesis de la cadena de polipéptidos. Esto puede producir la exposición de parches hidrófobos sobre la superficie del glóbulo de proteína y producir la agregación de proteínas. Los mecanismos de plegamiento heterólogo de proteínas in vivo son poco entendidos, y es impredecible la capacidad de plegamiento de diferentes proteínas en bacterias.
El rendimiento de proteína activa soluble puede ser algunas veces mejorado cambiando las condiciones de cultivo. Además, hay ejemplos cuando el rendimiento de proteínas mejoró introduciendo mutaciones puntuales individuales en la secuencia de proteínas. Sin embargo, no se ha identificado fundamento tras el hallazgo de mutaciones adecuadas. Se ha mostrado que la sustitución de un solo aminoácido potencia la expresión funcional de una lacasa bacteriana [9]. Se ha usado frecuentemente la expresión heteróloga de lacasa en Escherichia coli como una estrategia para sortear el problema de obtener lacasas que no son fácilmente producibles en hospedadores naturales. La expresión recombinante de CotA de Bacillus subtilis en E. coli ha permitido su profunda caracterización, resolución de estructura y evolución funcional [1, 2, 3]. Sin embargo, muy frecuentemente, el rendimiento de producción es bajo, debido a una fuerte tendencia de esta enzima a formar agregados que convierten
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la proteína en irreversiblemente inactiva [4]. Esta tendencia ha sido atribuida al hecho que en la naturaleza la lacasa COTA se integra en una estructura de la envoltura de la espora mediante la interacción con otros componentes de proteína, y es probable que el correcto plegamiento de la lacasa se potencie por la interacción con otras proteínas. Cuando esta lacasa se expresa recombinantemente como un polipéptido individual, faltan aquellas interacciones complementarias y muchas proteínas erróneamente plegadas forman agregados en células bacterianas. Cuando se expresan en microorganismos superiores tales como levadura, las moléculas de lacasa erróneamente plegadas son degradadas en gran parte.
Existe una necesidad en la materia de medios y métodos de mejora del rendimiento de las lacasas en sistemas de expresión heteróloga. Esto es particularmente cierto para lacasas bacterianas, tales como las lacasas cotA.
Sumario de la invención
La presente invención trata esta necesidad proporcionando lacasas de variante con propiedades mejoradas. Más en particular, la invención se refiere a un polipéptido con actividad de lacasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es más del 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según sEq ID NO: 1, en la que el polipéptido comprende un resto de aminoácido no polar, preferentemente un aminoácido no polar pequeño seleccionado del grupo que consiste en prolina, alanina, glicina y valina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1
Un resto de prolina en una posición correspondiente al aminoácido 113 de SEQ ID NO: 1 es el más preferido.
Además, la invención proporciona ácidos nucleicos, vectores y composiciones mejorados que codifican las enzimas de lacasa de variante según la invención.
La invención también proporciona sistemas de expresión heteróloga recombinantes tales como células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico, un vector o una composición según la invención.
También se proporcionan en el presente documento métodos de producción de un polipéptido según la invención, que comprenden las etapas de:
a. cultivar una célula hospedadora recombinante que comprende un polinucleótido según la invención en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido, y
b. recuperar el polipéptido obtenido, y
c. opcionalmente purificar dicho polipéptido.
La invención también se refiere al uso de un polipéptido según la invención en una aplicación seleccionada del grupo que consiste en deslignificación de pasta, degradación o disminución de la integridad estructural de material lignocelulósico, blanqueamiento de tintes textiles, destoxificación de aguas residuales, destoxificación xenobiótica, producción de un azúcar a partir de un material lignocelulósico y recuperación de celulosa de una biomasa.
La invención también se refiere a un método de mejora del rendimiento de un polipéptido con actividad de lacasa en un sistema de expresión heteróloga que comprende la etapa de alterar el aminoácido de ese polipéptido en una posición correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1 a un resto de aminoácido no polar, preferentemente un aminoácido no polar pequeño.
Realizaciones preferidas de estos aspectos se describirán más abajo en más detalle. Con el fin de claridad y una descripción concisa, las características se describen en el presente documento como parte de las mismas realizaciones o realizaciones separadas, sin embargo, se apreciará que el alcance de la invención puede incluir realizaciones que tienen combinaciones de todas o algunas de las características descritas.
Descripción detallada de la invención.
La presente invención se basa en la observación de los presentes inventores de que una sustitución de un único aminoácido en diferentes lacasas mejora el rendimiento de esa lacasa al menos el 50 % cuando se expresa en procariotas, además de en eucariotas. Los presentes inventores también encontraron que la lacasa de variante sigue siendo activa.
El término "sustitución de aminoácidos" se usa en el presente documento de la misma forma que se usa comúnmente, es decir, el término se refiere a una sustitución de uno o más aminoácidos en una proteína con otros. Sustituciones de aminoácidos artificiales también pueden denominarse mutaciones.
El término "aminoácido no polar", como se usa en el presente documento, pretende cubrir el grupo de los aminoácidos naturales con la excepción de los aminoácidos polares tirosina, triptófano, histidina, treonina, cisteína, lisina, arginina, asparagina, ácido glutámico, ácido aspártico, glutamina y serina. En otras palabras, el grupo de los aminoácidos no polares incluye los aminoácidos metionina, leucina, isoleucina, valina, alanina, prolina y glicina, y fenilalanina.
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El término "aminoácido no polar pequeño", como se usa en el presente documento, pretende cubrir un grupo de aminoácidos seleccionado del grupo de s no polares, que son normalmente considerados aminoácidos pequeños o minúsculos. Este grupo está limitado a los aminoácidos prolina, alanina, glicina y valina.
SEQ ID NO: 1 es una lacasa CotA de Bacillus subtilis recientemente desvelada en el presente documento, mientras que SEQ ID NO: 2 es una lacasa CotA que ha sido previamente desvelada en el documento WO 2013/038062. Los presentes inventores encontraron que las variantes de lacasa que tienen un resto de aminoácido no polar en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1 proporcionaron un rendimiento más alto cuando se expresaron en un sistema de expresión heteróloga. Esto se ilustra en la sección de ejemplos en la que aminoácidos no polares seleccionados del grupo que consiste en prolina, alanina, glicina y valina se introdujeron en la secuencia de varias lacasas. Todas estas variantes mostraron un rendimiento mejorado de lacasa soluble cuando se expresa en un sistema de expresión heteróloga.
Variantes que llevan un resto de prolina (Pro o P) en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1 son los más preferidos, ya que produjeron el mayor rendimiento de lacasa recombinantemente expresada.
SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 desvelan proteínas de la envoltura de esporas de B. subtilis con actividad de lacasa (lacasa CotA), que llevan una mutación 113P. En realidad, SEQ ID NO: 3 es una variante de SEQ ID NO: 1 en la que un resto de ácido aspártico en la posición 113 se ha sustituido por un resto de prolina. SEQ ID NO: 4 es una variante de SEQ ID NO: 2 en la que un resto de ácido aspártico en la posición 113 se ha sustituido por un resto de prolina.
Los presentes inventores realizaron una búsqueda de homología de proteínas homólogas a SEQ ID NO: 1 usando SEQ ID NO: 1 como la secuencia de búsqueda en el software "Standard protein BLAST", disponible en
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LI NK_LOC=biasthome. Más información sobre las versiones de software y de base de datos está disponible en el centro Nacional para Información Biotecnológica en la Biblioteca Nacional de Medicina en la página web del Instituto Nacional de Salud
www.ncbi.nlm.nih.gov. En ella, se encuentran varias herramientas de biología molecular que incluyen BLAST (Basic Logical Alignment Search Tool). BLAST hace uso de las siguientes bases de datos: Todas las traducciones de CDS de GenBank no redundantes+PDB+SwissProt+PIR+PRF excluyendo muestras ambientales de proyectos de WGS. La búsqueda como se informó en el presente documento se realizó en línea el 19 de febrero de 2014 y empleó la versión de BLASTP 2.2.29+.
La búsqueda reveló 31 secuencias con más del 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 (Tabla 1). Estas secuencias se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 31 a 61.
Tabla 1 Secuencias obtenidas de una búsqueda de BLAST que desvela 31 secuencias con más del 80 % de
identidad con SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO:
BLAST N.°: Descripción N.° de acceso: Identidad global (1) AA N.° corr. a la pos 113 (2) AA en la pos corr. a AA 113 (3)
1
1
CotA de lacasa de B. subtilis (secuencia de búsqueda) 100 % 113 Asp
31
2 lacasa [Bacillus subtilis] AGZ16504.1 98 % 113 Asp
32
3 lacasa dependiente de cobre de espora (envoltura externa) [Bacillus subtilis subsp. spizizenii str. W23] >ref|WP_003219376.1| oxidasa de cobre [Bacillus subtilis] >gb|EFG93543.1| lacasa dependiente de cobre de espora [Bacillus subtilis subsp. spizizenii ATCC 6633] >gb|ADM36695.1| lacasa dependiente de cobre de espora (envoltura externa) [Bacillus subtilis subsp. spizizenii str. W23] YP_003865004.1 98 % 113 Asp
33
4 lacasa dependiente de cobre de espora [Bacillus subtilis] WP_004397739.1 96 % 113 Asp
SEQ ID NO:
BLAST N.°: Descripción N.° de acceso: Identidad global (1) AA N.° corr. a la pos 113 (2) AA en la pos corr. a AA 113 (3)
>gb|ELS60660.1| lacasa dependiente de cobre de espora [Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429]
34
5 oxidasa de cobre [Bacillus subtilis] WP_019713492.1 96 % 113 Asp
35
6 lacasa [Bacillus vallismortis] AGR50961.1 95 % 113 Asp
36
7 proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis XF-1] >ref|WP_015382982.1| proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus] >gb|AGE62493.1| proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis XF-1] >gb|ERI42893.1| oxidasa de cobre [Bacillus sp. EGD-AK10] YP_007425830.1 96 % 113 Asp
37
8 lacasa dependiente de cobre de espora [Bacillus subtilis BSn5] >ref|YP_005559844.1| proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis subsp. natto BEST195] >ref|YP_007210655.1| Proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BSP1] >ref|WP_014479048.1| oxidasa de cobre [Bacillus subtilis] >dbj|BAI84141.1| proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis subsp. natto BEST195] >gb|ADV95614.1| lacasa dependiente de cobre de espora [Bacillus subtilis BSn5] >gb|ADZ57279.1| lacasa [Bacillus sp. lS02] >gb|ADZ57280.1| lacasa [Bacillus sp. LS03] >gb|ADZ57283.1| lacasa [Bacillus sp. WN01] >gb|ADZ57284.1| lacasa [Bacillus subtilis] >gb|AGA20638.1| Proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BSP1] YP_004206641.1 96 % 113 Asp
38
9 CotA [Bacillus sp. JS] >ref|WP_014663045.1| oxidasa de cobre [Bacillus sp. JS] >gb|AFI27241.1| CotA [Bacillus sp. JS] YP_006230497.1 95 % 113 Asp
39
10 oxidasa de cobre [Bacillus subtilis QH-1] EXF51833.1 95 % 113 Asp
40
11 oxidasa de cobre [Bacillus subtilis] >gb|EHA29133.1| espora lacasa dependiente de cobre [Bacillus subtilis subsp. subtilis str. SC-8] WP_003234000.1 95 % 115 Asp
SEQ ID NO:
BLAST N.°: Descripción N.° de acceso: Identidad global (1) AA N.° corr. a la pos 113 (2) AA en la pos corr. a AA 113 (3)
41
12 lacasa dependiente de cobre de la envoltura externa de la espora [Bacillus subtilis QB928] >ref|WP_011306195.1| oxidasa de cobre [Bacillus subtilis] >dbj|BAA22774.1| proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis] >gb|AFQ56549.1| lacasa dependiente de cobre de la envoltura externa de la espora [Bacillus subtilis QB928] YP_006628799.1 95 % 115 Asp
42
13 proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168] NP_388511.1 95 % 113 Asp
43
14 proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BAB-1] >ref|WP_015482891.1| proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis] >gb|AGI27890.1| proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BAB-1] YP_007661398.1 95 % 113 Asp
44
15 Cadena A, mutaciones en la vecindad del sitio trinuclear de lacasa Cota: mutante E498d 4AKQ_A 95 % 113 Asp
45
16 Cadena A, mutaciones en la vecindad del sitio trinuclear de lacasa Cota: mutante D116n 4A68_A 95 % 113 Asp
46
17 Cadena A, mutaciones en la vecindad del sitio trinuclear de lacasa Cota: mutante D116a 4A66_A 95 % 113 Asp
47
18 proteína de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis] ACS44284.1 95 % 113 Asp
48
19 proteína de la envoltura de la espora [Bacillus subtilis] AGK12417.1 95 % 113 Asp
49
20 Cadena A, estructura cristalina de Cota reconstituida 2X87_A 95 % 113 Asp
50
21 lacasa [Bacillus sp. ZW2531-1] AFN66123.1 95 % 113 Asp
51
22 Cadena A, mutaciones en la vecindad del sitio trinuclear de lacasa cotA: mutante D116e 4A67_A 95 % 113 Asp
52
23 Cadena A, mutaciones proximales en el sitio de Cu de tipo 1 de la lacasa Cota: mutante I494a 2WSD_A 95 % 113 Asp
53
24 Cadena A, mutaciones en la vecindad del sitio trinuclear de lacasa cotA: mutante e498t 4AKP_A 95 % 113 Asp
54
25 lacasa [Bacillus sp. HR03] ACM46021.1 94 % 113 Asp
SEQ ID NO:
BLAST N.°: Descripción N.° de acceso: Identidad global (1) AA N.° corr. a la pos 113 (2) AA en la pos corr. a AA 113 (3)
55
26 oxidasa de cobre [Bacillus vallismortis] WP_010329056.1 94 % 113 Glu
56
27 lacasa [Bacillus subtilis] AEK80414.1 92 % 113 Asp
57
28 oxidasa de cobre [Bacillus mojavensis] WP_010333230.1 91 % 113 Asp
58
29 Cadena A, mutaciones en la vecindad del sitio trinuclear de lacasa cotA: mutante E498I 4AKO_A 94 % 109 Asp
59
30 CotA [Bacillus subtilis] AAB62305.1 89 % 113 Asp
60
31 lacasa dependiente de cobre de espora [Bacillus atrophaeus 1942] >ref|WP_003328493.1| oxidasa de cobre [Bacillus atrophaeus] >gb|ADP31092.1| lacasa dependiente de cobre de espora (envoltura externa) [Bacillus atrophaeus 1942] >gb|EIM09308.1| lacasa dependiente de cobre de espora [Bacillus atrophaeus C89] YP_003972023.1 81 % 113 Tyr
61
32 Proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus atrophaeus] >gb|EOB38473.1| Proteína A de la envoltura de la espora [Bacillus atrophaeus UCMB-5137] WP_010787813.1 81 % 113 Tyr
(1) : Identidad global de la secuencia seleccionada con SEQ ID NO: 1, la secuencia de búsqueda (2) Número de posición de la secuencia seleccionada que se corresponde con la posición 113 en SEQ ID NO: 1. (3) Aminoácido en una posición de la secuencia seleccionada que se corresponde con la posición 113 en SEQ ID NO: 1
El análisis de las proteínas homólogas reveló que todas las proteínas con más del 80 % de identidad de secuencias con SEQ ID NO: 1 pertenecen a la especie de Bacillus. Todas fueron oxidasas dependientes de cobre (lacasas) y la mayoría de ellas fueron anotadas como proteínas de la envoltura de la espora. Así, los presentes inventores llegaron 5 a la conclusión de que esas secuencias con este grado (más del 80 %) de identidad con SEQ ID NO: 1 representan un grupo de proteínas funcionalmente y estructuralmente altamente relacionado que es probable que tenga rasgos estructurales similares y vías de plegamiento.
Los presentes inventores realizaron varias sustituciones de aminoácidos en una variedad de lacasas en una posición correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1 y encontraron que el rendimiento de la proteína lacasa 10 recombinante soluble podría mejorarse cuando el aminoácido polar original (Asp, Glu o Tyr) que se produce en esa posición se sustituyó con un resto de aminoácido no polar, preferentemente un aminoácido pequeño o minúsculo seleccionado del grupo que consiste en prolina, alanina, glicina y valina.
En otras palabras, la invención se refiere a un polipéptido de envoltura de la espora con actividad de lacasa en la que el polipéptido comprende un resto de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en prolina, alanina, 15 glicina y valina, en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1
Aunque se observaron algunas diferencias en el rendimiento entre las variantes que llevan los diferentes aminoácidos, variantes que llevan un resto de prolina en la posición 113 mostraron el rendimiento más alto. En una realización preferida, la invención, por tanto, se refiere a una proteína con actividad de lacasa como se ha descrito anteriormente con un resto de prolina en una posición correspondiente al aminoácido 113 de SEQ ID NO: 1.
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En una realización preferida adicional, el polipéptido según la invención es un polipéptido, mutado como se ha descrito anteriormente, en el que la secuencia natural está codificada por el genoma de una especie de Bacillus, tal como Bacillus subtilis.
Ninguna de las 32 lacasas de la Tabla 1 (31 secuencias de la búsqueda más SEQ ID NO: 1 usadas como la secuencia de búsqueda) tiene un aminoácido no polar o un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en prolina, alanina, glicina y valina en una posición correspondiente a la posición 113 de SEQ ID NO: 1. Así, puede llegarse a la conclusión de que una lacasa con más del 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 que comprende un aminoácido no polar o un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en prolina, alanina, glicina y valina en una posición correspondiente a la posición 113 de SEQ ID NO: 1 todavía no ha sido descrita en el estado de la técnica.
Es sorprendente que el aminoácido correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1 esté bastante bien conservado dentro del grupo de las 32 secuencias de la Tabla 1. Se produce un resto de ácido aspártico (Asp o D) en esa posición en 29 de los 32 casos (91 %). Pareció que dos secuencias tenían un resto de tirosina en esa posición (6 %), mientras que solo una secuencia tiene un resto de ácido glutámico en esa posición (3 %).
La introducción de una mutación específica en un gen recombinante está entre las habilidades rutinarias de un biólogo molecular. Puede obtenerse orientación específica de Methods in Molecular Biology Vol 182, "In vitro mutagenesis protocols", Eds Jeff Braman, Humana Press 2002. Están comercialmente disponibles kits para realizar la mutagénesis dirigida al sitio (por ejemplo, kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II XL, Cat N.° de Agilent Technologies 200521).
Los presentes inventores prepararon polipéptidos de variante 113P de 4 lacasas diferentes de la Tabla 1. Una variante D113P de SEQ ID NO: 1 se muestra como SEQ ID NO: 3, una variante D113P de SEQ ID NO: 2 se muestra como SEQ ID NO:4, una variante E113P de SEQ ID NO: 5 (correspondiente a SEQ ID NO: 55 de la búsqueda de BLAST) se muestra como SEQ ID NO: 6 y una variante Y113P de SEQ ID NO: 7 (correspondiente a SEQ iD NO: 60 de la búsqueda de BLAST) se muestra como SEQ ID NO: 8.
Cuando se expresa en E. coli, las 4 variantes mostraron un elevado rendimiento de enzima activa de entre el 200 y el 260 %, respectivamente (Figura 1). En otras palabras, la actividad volumétrica de las cuatro variantes aumentó a al menos el 200 %.
Como un experimento de control, los presentes inventores determinaron si la actividad volumétrica mejorada podría ser atribuible a una elevada actividad específica de la enzima. Esto no pareció ser el caso. El aumento en la cantidad de enzima mutada (113P) en la fracción soluble de lisado celular fue proporcional al aumento en la actividad volumétrica, por lo que tuvo que llegarse a la conclusión de que se ha recuperado más enzima de variante, representando así completamente el aumento en la actividad volumétrica. Por tanto, el rendimiento de la enzima lacasa es elevado en vez de su actividad específica.
Los aminoácidos que existen de forma natural D, E e Y en una posición correspondiente a la posición 113 de SEQ ID NO: 1 podrían también sustituirse con otros aminoácidos. Los presentes inventores prepararon variantes de lacasas representativas de la Tabla 1; SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 7. Los presentes inventores sustituyeron el ácido aspártico que existe de forma natural en SEQ ID NO: 1 y la tirosina que existe de forma natural en la posición 113 de SEQ ID NO: 7 con cualquiera de un resto de prolina, alanina, glicina o valina. Las variantes de SEQ ID NO: 1 se representan por SEQ iD NO: 3, 9, 10 y 11, respectivamente, mientras que las variantes de SEQ ID NO: 7 se representan por SEQ ID NO: 8, 12, 13 y 14, respectivamente (Tabla 2 y 3).
Secuencias de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 14 se muestran en la Tabla 5.
Cada una de estas variantes presentaron un rendimiento mejorado de al menos el 50 % cuando se expresaron en un sistema de expresión heteróloga (Figura 2).
Las variantes según SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 también se expresaron en Pichia pastoris. Según los datos obtenidos en un sistema de expresión en procariota (E. coli, véase anteriormente), la expresión en eucariota también mostró un elevado rendimiento. El rendimiento mejoró a al menos el 200 % cuando la expresión de las secuencias de variante se comparó con sus SEQ ID NO: 1 y sEq ID NO: 2 naturales, respectivamente (Figura 3).
Por consiguiente, la invención se refiere a un polipéptido con actividad de lacasa que consiste en una secuencia de aminoácidos que es más del 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, en la que el polipéptido comprende un resto de aminoácido no polar en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1.
En una realización preferida, la invención se refiere a un polipéptido con actividad de lacasa que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es más del 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, en la que el polipéptido comprende un resto de aminoácido no polar en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 113 en SEQ iD NO: 1.
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En una realización preferida adicional, la invención se refiere a un polipéptido con actividad de lacasa que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es más del 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, en la que el polipéptido comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en prolina, alanina, glicina y valina, en una posición correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1.
En una realización preferida adicional, la invención se refiere a un polipéptido con actividad de lacasa que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es más del 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, en la que el polipéptido comprende un resto de prolina en una posición correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1.
Esta lacasa de variante también se denomina en el presente documento variante de aminoácido 113Pro o 113P. En una realización preferida adicional, el polipéptido se aísla.
El hallazgo anterior de que las proteínas de la envoltura de la espora se producen en un grupo altamente conservado permite definir la invención en otra forma más, tal como la relación estructural entre el polipéptido según la invención y los polipéptidos de referencia según las secuencias proporcionadas en el presente documento. Por tanto, la invención también se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 94 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 31 - 61.
El término al menos el 94 % se usa en el presente documento para incluir al menos el 95 %, tal como el 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso el 100 %.
El término "variante de aminoácido", "variante de lacasa" o "variante de secuencia" o equivalente tiene un significado bien reconocido en la materia y se usa, por consiguiente, en el presente documento para indicar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una diferencia de aminoácidos en comparación con otra secuencia de aminoácidos, tal como la secuencia de aminoácidos de la que derivó.
El término más del 80 % se usa en el presente documento para incluir al menos el 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 88 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % o más, tal como el 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 99 %, 97 %, 98 %, 99 %, o incluso el 100 %.
El término "actividad de lacasa" se usa en el presente documento para significar la propiedad de un polipéptido para actuar de enzima lacasa, que puede expresarse como la máxima velocidad inicial de la reacción de oxidación específica. La actividad de lacasa puede determinarse por ensayos de oxidación convencionales conocidos en la técnica que incluyen tales como, por ejemplo, por medición de la oxidación de siringaldazina, según el protocolo en línea de Sigma, o según Cantarella et al. 2003 [7].
Un ejemplo de determinación de la actividad de lacasa relativa se presenta en el Ejemplo 4. Puede usarse cualquier sustrato adecuado para la enzima en cuestión en las mediciones de actividad. Un ejemplo no limitante de un sustrato adecuado para su uso en evaluar la actividad enzimática de variantes de lacasa es ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3- etilbenzotiazolina-6-sulfónico). Las lacasas son capaces de oxidar este sustrato.
Como se usa en el presente documento, el término "actividad de lacasa específica elevada (o mejorada)" se refiere a una actividad de lacasa superior a la de una enzima lacasa no mutada correspondiente en las mismas condiciones.
El término "rendimiento elevado" o equivalente significa que el rendimiento de la enzima activa del mismo volumen de cultivo obtenido en un protocolo de purificación o recuperación convencional mejora al menos el 50 % o un factor de 1,5. El aumento puede ser incluso más, tal como un factor de 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más.
La recuperación de una variante de lacasa producida por una célula hospedadora puede realizarse por cualquier técnica conocida para aquellos expertos en la materia. Posibles técnicas incluyen, pero no se limitan a, secreción de la proteína en el medio de expresión, y purificación de la proteína de biomasa celular. El método de producción puede comprender además una etapa de purificar la variante de lacasa obtenida. Para lacasas termoestables, ejemplos no limitantes de tales métodos incluyen calentar las células desintegradas y eliminar proteínas termolábiles coaguladas de la disolución. Para proteínas secretadas, ejemplos no limitantes de tales métodos incluyen cromatografía de intercambio iónico, y ultra-filtración del medio de expresión. Es importante que el método de purificación de elección sea tal que la proteína purificada retenga su actividad, preferentemente su actividad de lacasa.
Las variantes de lacasa según la presente invención pueden usarse en un amplio intervalo de diferentes procesos y aplicaciones industriales, tales como recuperación de celulosa a partir de biomasa lignocelulósica, disminución de la energía de refinado en el refinado de madera y preparación de pasta, en deslignificación de pasta, blanqueamiento de tintes textiles, destoxificación de aguas residuales, destoxificación xenobiótica y fabricación de detergentes.
Pueden introducirse variaciones de aminoácidos como se describe en el presente documento en cualquiera de las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento, u otras secuencias homólogas, por métodos
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convencionales conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio. De esta forma, puede mejorarse el rendimiento de las lacasas de un sistema de expresión heteróloga.
Kits para realizar la mutagénesis dirigida al sitio están comercialmente disponibles en la materia (por ejemplo, kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® II XL por Agilent Technologies). Métodos adecuados adicionales para introducir las mutaciones anteriores en un gen recombinante se desvelan, por ejemplo, en Methods in Molecular Biology, 2002 [8].
Así, algunas realizaciones de la presente invención se refieren a variantes de lacasa o mutantes que comprenden un resto de aminoácido no polar, preferentemente resto no polar pequeño tal como un resto de prolina (Pro) en una posición que se corresponde con la posición 113 de la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 1, y tienen un elevado rendimiento en comparación con el de un control no mutado correspondiente cuando se expresa en un sistema de expresión heteróloga.
El término "sistema de expresión heteróloga" o equivalente significa un sistema para expresar una secuencia de ADN de un organismo hospedador en un organismo receptor de una especie o género diferente del organismo hospedador. Normalmente se eligen receptores más prevalentes, conocidos como sistemas de expresión heteróloga, debido a que son fáciles de transferir en ADN o debido a que permiten una evaluación más simple de la función de proteínas. También se usan sistemas de expresión heteróloga, preferentemente debido a que permiten el aumento de escala de la producción de una proteína codificada por la secuencia de ADN en un proceso industrial. Organismos receptores preferidos para su uso como sistemas de expresión heteróloga incluyen organismos bacterianos, fúngicos y de levadura, tales como, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus, Corynebacterium, Pseudomonas, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, hongos filamentosos y muchos más sistemas muy conocidos en la técnica.
Como se usa en el presente documento, el grado de identidad entre dos o más secuencias de aminoácidos es equivalente a una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas dividido entre el número total de posiciones x 100), excluyendo huecos, que necesitan ser introducidos para el alineamiento óptimo de las dos secuencias, y nucleótidos protuberantes. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos o más secuencias pueden llevarse a cabo usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, un programa gratuito convencionalmente usado para este fin es la herramienta "Align" en el recurso de NCBI
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq
En una realización preferida, el alineamiento de dos secuencias va a realizarse a lo largo de la longitud completa de los polipéptidos.
Los presentes polipéptidos o proteínas de lacasa pueden fusionarse con secuencias adicionales, por unión o inserción, que incluyen, pero no se limitan a, marcas de afinidad, que facilitan la purificación de proteínas (S-tag, dominio de unión a maltosa, dominio de unión a quitina), dominios o secuencias que ayudan en el plegamiento (tales como dominio de tioredoxina, proteína SUMO), secuencias que afectan la localización de proteínas (señales de localización periplásmica, etc.), proteínas que llevan función adicional, tales como proteína verde fluorescente (GFP), o secuencias que representan otra actividad enzimática. Otros componentes de fusión adecuados para las presentes lacasas son conocidos para aquellos expertos en la materia.
La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican cualquiera de las variantes de lacasa desveladas en el presente documento. Medios y métodos para clonar y aislar tales polinucleótidos son muy conocidos en la técnica.
Además, la presente invención se refiere a un vector que comprende un polinucleótido según la invención, opcionalmente operativamente unido a una o más secuencias de control. Secuencias de control adecuados están fácilmente disponibles en la materia e incluyen, pero no se limitan a, secuencias de promotor, conductor, poliadenilación y señal.
Las variantes de lacasa según diversas realizaciones de la presente invención pueden obtenerse por métodos recombinantes convencionales conocidos en la técnica. Brevemente, un método tal puede comprender las etapas de i) cultivar una célula hospedadora recombinante deseada en condiciones adecuadas para la producción de una presente variante de polipéptido de lacasa, y ii) recuperar la variante de polipéptido obtenida. El polipéptido puede entonces opcionalmente purificarse adicionalmente.
Puede usarse un gran número de sistemas de vector-hospedador conocidos en la técnica para la producción recombinante de variantes de lacasa. Posibles vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados que se mantienen en la célula hospedadora como molécula de ADN autónoma o se integran en ADN genómico. El sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedadora usada como es muy conocido en la técnica. Ejemplos no limitantes de células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias (por ejemplo, E. coli, bacilos), levadura (por ejemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae), hongos (por ejemplo, hongos filamentosos), células de insecto (por ejemplo, Sf9).
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Un polipéptido según la invención puede ser ventajosamente usado en una aplicación seleccionada del grupo que consiste en deslignificación de pasta, degradación o disminución de la integridad estructural de material lignocelulósico, blanqueamiento de tintes textiles, destoxificación de aguas residuales, destoxificación xenobiótica, producción de un azúcar a partir de un material lignocelulósico y recuperación de celulosa de una biomasa.
En todavía otros términos, la invención se refiere a un método de mejora del rendimiento de un polipéptido con actividad de lacasa en un sistema de expresión heteróloga que comprende la etapa de alterar el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1 a un resto no polar tal como un aminoácido no polar pequeño, tal como prolina.
En una realización preferida adicional, la invención se refiere a un método de mejora del rendimiento de un polipéptido con actividad de lacasa en un sistema de expresión heteróloga, en la que el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos que es más del 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, comprendiendo el método la etapa de alterar la secuencia de aminoácidos del polipéptido en una posición correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1 a un resto no polar tal como un aminoácido no polar pequeño, tal como prolina.
En una realización preferida adicional, la invención se refiere a un método como se ha descrito anteriormente, en la que el polipéptido con actividad de lacasa es una proteína de la envoltura de la espora, preferentemente codificado por una especie de Bacillus, más preferentemente Bacillus subtilis.
Leyenda de las figuras
Figura 1: Aumento relativo de la actividad volumétrica.
Gráfico que muestra el aumento relativo de la actividad volumétrica en cultivos paralelos en E. coli de lacasas naturales (no mutadas) frente a de variante según SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7. La abreviatura SEQ seguida de un número se refiere a SEQ ID NO: del número respectivo; SEQ1 se refiere a SEQ ID NO: 1. SEQ 1 113P se refiere al polipéptido según SEQ ID NO: 1, en el que el aminoácido correspondiente a la posición 113 está sustituido por P (Pro o prolina).
Figura 2: Aumento relativo de la actividad volumétrica.
Gráfico que muestra el aumento relativo de la actividad volumétrica en cultivos paralelos en E. coli de lacasas naturales (no mutadas) frente a de variante según SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 7. La abreviatura SEQ seguida de un número se refiere a SEQ ID NO: del número respectivo; sEq1 se refiere a SEQ ID NO: 1. SEQ 1 113P se refiere al polipéptido según SEQ ID NO: 1, en el que el aminoácido correspondiente a la posición 113 está sustituido por P (Pro o prolina).
Figura 3: Aumento relativo de la actividad volumétrica.
Gráfico que muestra el aumento relativo de la actividad volumétrica en cultivos paralelos en Pichia pastoris de lacasas naturales (no mutadas) frente a de variante según SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. La abreviatura SEQ seguida de un número se refiere a SEQ ID NO: del número respectivo; SEQ1 se refiere a SEQ ID NO: 1. SEQ 1 113P se refiere al polipéptido según SEQ ID NO: 1, en el que el aminoácido correspondiente a la posición 113 está sustituido por P (Pro o prolina).
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de lacasas con propiedades mejoradas.
Se introdujeron mutaciones como se describe en el presente documento en diversos genes recombinantes por mutagénesis dirigida al sitio convencional esencialmente como se describe en el documento WO 2013/038062. En más detalle: Para introducir la mutación 113P en el gen de SEQ ID NO: 1, los presentes inventores llevaron a cabo dos PCR separadas:
(1) con los cebadores Cebador 1 GAAATTAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID NO: 15) y Cebador 2 (Seq1)
TGGCGTGACGCCTCCGTGTAAATGAACGAC (SEQ ID NO: 16),
(2) con Cebador 3 (Seq1)
TACACGGAGGCGTCACGCCAccgGATAGTGACGG (SEQ ID NO: 17) y Cebador 4
GGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTG (SEQ ID NO: 18).
En ambas reacciones, se usó gen recombinante sin la mutación como molde. Los Cebadores 1 y 4 se unen dentro de la secuencia de vector y no son específicos para el gen recombinante. Los Cebadores 2 y 3 se unen dentro del gen recombinante y solapan sus sitios de unión. El sitio de unión del Cebador 3 contiene el sitio de mutación. El Cebador 3 representa la secuencia mutada (deseada), que no es el 100% coincidente con el molde (fuente en minúscula en la secuencia de cebador indica los nucleótidos incompatibles), sin embargo, el cebador tiene afinidad y
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especificidad suficientes por el sitio de unión para producir el producto de PCR deseado. Se combinaron productos de PCR purificados de las reacciones (1) y (2) y se usaron como molde para la reacción de PCR con el Cebador 1 y Cebador 4. El producto de esta reacción, que contiene la secuencia mutante del gen, se clonó en un vector plasmídico para la expresión en E. coli.
Para introducir las mutaciones D113A, D113G y D113V en SEQ D NO: 1, los presentes inventores usaron los siguientes Cebadores 3:
Tabla 2: Cebadores 3 específicos usados para introducir mutaciones en SEQ ID NO: 1
Cebador 3 específico usado para introducir variaciones
Variante obtenida
Secuencia de Cebador 3
SEQ ID NO: Cambio de AA introducido en la posición 113 SEQ ID NO:
TACACGGAGGCGTCACGCCAccgGATAGTGACGG
17 Pro 3
TACACGGAGGCGTCACGCCAGcgGATAGTGACGG
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TACACGGAGGCGTCACGCCAGgcGATAGTGACGG
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TACACGGAGGCGTCACGCCAGtgGATAGTGACGG
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Similarmente, para introducir una mutación 113P en una lacasa según SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7, los presentes inventores usaron los mismos Cebador 1 y Cebador 4, mientras que el Cebador 2 fue específico para cada lacasa y el Cebador 3 contuvo la mutación deseada.
En el polipéptido que comprende la secuencia según SEQ ID NO: 2, hay un ácido aspártico en la posición 113, la posición correspondiente al aminoácido 113 en SEQ ID NO: 1. Para introducir la mutación D113P en el polipéptido que comprende la secuencia según SEQ ID NO: 2, se usaron los siguientes Cebadores 3 y 2:
Cebador 3 TACACGGAGGCGTCACGCCTccgGATAGTGACGG (SEQ ID NO: 22)
Cebador 2 AGGCGTGACGCCTCCGTGTAAATGAACAAC (SEQ ID NO: 23).
En el polipéptido que comprende la secuencia según SEQ ID NO: 5, hay un ácido glutámico (Glu o E) en la posición 113, la posición correspondiente al aminoácido 113 en SEQ ID NO: 1. Para introducir la mutación E113P en el polipéptido que comprende la secuencia según SEQ ID NO: 5, se usaron los siguientes Cebadores 3 y 2:
Cebador 3 TTTACACGGAGGCGTCACGCCAccGGATAGCGACG (SEQ ID NO: 24)
Cebador 2 TGGCGTGACGCCTCCGTGTAAATGAACGACG (SEQ ID NO: 25).
En el polipéptido que comprende la secuencia según SEQ ID NO: 7, hay una tirosina (Tyr o Y) en la posición 113, la posición correspondiente al aminoácido 113 en SEQ ID NO: 1. Para introducir las mutaciones Y113P, Y113A, Y113G y Y113V en el polipéptido que comprende la secuencia según SEQ ID NO: 7, se usó el siguiente Cebador 2 en combinación con los Cebadores 3 como se enumera en la Tabla 3.
Cebador 2 AGGCGTGGCGCCGCCATGTAAATGAACAAC (SEQ ID NO: 26).
Tabla 3: Cebadores 3 específicos usados para introducir mutaciones en SEQ ID NO: 7
Cebador 3 específico usado para introducir variaciones
Variante obtenida
Secuencia de Cebador 3
SEQ ID NO: Cambio de AA introducido en la posición 113 SEQ ID NO:
TACACGGAGGCGTCACGCCAccgGATAGTGACGG
27 Pro 8
TACACGGAGGCGTCACGCCAGcgGATAGTGACGG
28 Ala 12
TACACGGAGGCGTCACGCCAGgcGATAGTGACGG
29 Gly 13
TACACGGAGGCGTCACGCCAGtgGATAGTGACGG
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Ejemplo 2: Expresión heteróloga de lacasas de variante y no mutadas.
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Se expresaron lacasas de variante en E. coli y Pichia pastoris.
Para la expresión en Pichia pastoris, se clonaron genes recombinantes en un vector de expresión de Pichia pastoris comercial pPICZ-A disponible de Invitrogen (Life Technologies). Este vector proporciona expresión de proteínas secretadas bajo el control del promotor AOX1 inducible por metanol tras la integración de la construcción en ADN genómico de la célula de levadura.
Se introdujo ADN de plásmido linealizado en células de levadura por electroporación, y se seleccionaron clones con gen recombinante integrado en placas de medio de agar con zeocina (25 ug/ml). Se probaron diez colonias de cada construcción en cultivos líquidos pequeños (3 ml) con 72 horas de cultivo en agitador humidificado a 28 °C según el manual del fabricante de plásmidos (
http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/ppiczalpha_man.pdf). El medio recomendado por el fabricante se complementó con CuCl 1 mM, ya que la proteína lacasa contiene cobre como cofactor. Se midió la actividad en el medio por oxidación de ABTS (véase el Ejemplo 4), y se seleccionaron los 2 mejores clones productores para cada gen. Se cultivaron cultivos en paralelo de los clones seleccionados a escala de matraz según el manual del fabricante de plásmidos (véase anteriormente) a 28 °C durante 105 h. Las células se eliminaron por centrifugación, se recogió el medio que contenía la proteína recombinante. Estas preparaciones se usaron para la comparación de actividades volumétricas de genes de variante y no mutados.
Para la expresión recombinante en E. coli, se clonaron genes recombinantes en el vector de expresión comercial pET-28 bajo el control del promotor del bacteriófago T7. La producción de proteínas se llevó a cabo en la cepa BL21(DE3) de E. coli según el protocolo del fabricante de plásmidos
http://richsingiser.com/4402/Novagen%20pET%20system%20manual.pdf. El medio recomendado por el fabricante se complementó con CuCl 1 mM, ya que la proteína lacasa contiene cobre como cofactor. La temperatura de incubación para la producción de proteínas fue 30 °C, que se encontró óptima para el máximo rendimiento de la proteína activa. Las células se lisaron usando tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, 1 % de Triton X100, CuCl 1 mM) y se calentó a 70 °C durante 20 min. Se eliminó por centrifugación el residuo de células coaguladas. La lacasa recombinante que era una proteína termoestable quedó en la fracción soluble. La actividad enzimática fue detectable solo en la fracción soluble. El análisis de fracciones solubles e insolubles por electroforesis en gel revela que más del 90 % de la proteína recombinante está presente en forma inactiva insoluble como cuerpos de inclusión (según datos de la bibliografía).
Ejemplo 3: Medición del rendimiento.
Se determinó el rendimiento relativo de lacasas solubles mutadas y no mutadas por densitometría de bandas de proteína después de la electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. Para este fin, se analizaron muestras de proteínas solubles después del tratamiento térmico (véase el Ejemplo 2) obtenidas de cultivos en paralelo de clones mutados y no mutados por electroforesis en gel bajo condiciones desnaturalizantes (un método convencional muy conocido en la técnica de biología molecular). Después de la tinción del gel con azul brillante de Coomassie, el gel se barrió para obtener una imagen de mapa de bits, y se cuantificó la intensidad de la banda correspondiente a la lacasa recombinante por el software ImageJ (un programa gratuito público desarrollado en el Instituto Nacional de Salud y en línea disponible en
http://imagej.nih.gov/ij/)
Ejemplo 4. Medición de la actividad relativa de lacasa.
Como se ha establecido anteriormente, el término "actividad de lacasa" se usa en el presente documento para significar la capacidad para actuar como una enzima lacasa, que puede expresarse como la máxima velocidad inicial de la reacción de oxidación específica. Se midió la actividad relativa por oxidación de ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3- etilbenzotiazolina-6-sulfónico). La evolución de la reacción se monitorizó por cambio en la absorbancia a 405 nM (desarrollo de color verde). Se determinó el tiempo de reacción apropiado para proporcionar velocidades iniciales de oxidación cuando el desarrollo de color es lineal con el tiempo. La concentración de sustrato (ABTS) fue 5 mM para proporcionar velocidades iniciales máximas (condiciones de saturación de sustrato).
Normalmente, se llevaron a cabo reacciones en placas de fondo plano de 96 pocillos, cada pocillo contuvo 2 ul de preparación de enzima en 200 ul de ácido succínico 100 mM a pH 5, la reacción se inició por la adición simultánea del sustrato (22 ul de ABTS 50 mM) a cada pocillo. Después de transcurrir el tiempo de reacción, se determinó la absorbancia a 405 nm de las mezclas de reacción por un lector de placas (Multiscan Go, Thermo Scientific). Con el fin de determinar la actividad relativa de la lacasa mutada, se tomó la absorbancia de la muestra de lacasa de referencia para el 100 %, y se determinó la actividad relativa como la fracción de esta absorbancia.
Ejemplo 5: Identificación de la posición de aminoácido correspondiente a la posición 113.
Con el fin de identificar la posición de aminoácido que se corresponde con la posición 113 en SEQ ID NO: 1 en una secuencia X dada, la secuencia X se alinea con la secuencia de SEQ ID NO: 1 usando software convencional disponible en la materia, en este caso la herramienta "Align" en el recurso de NCBI
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2s eq&LINK_LOC=align2seq
Como un ejemplo, se alinearon las secuencias 31 - 61 con SEQ ID NO: 1. Solo un fragmento de ese alineamiento se muestra en la Tabla 4, es decir, el fragmento correspondiente a los aminoácidos 101 - 130 de SEQ ID NO: 1. Es
inmediatamente evidente que esta región particular está altamente conservada o es altamente homóloga, conduciendo a un alto grado de identidad en todas las secuencias examinadas. Por ejemplo, el resto de asparagina (D) en la posición 113 de SEQ ID NO: 1 se corresponde con un resto de asparagina en la posición 113 en SEQ ID NO: 31, con un resto de asparagina en la posición 115 en SEQ ID NO: 40, con un resto de asparagina en la 5 posición 109 en SEQ ID NO: 58 y con un resto de tirosina (Y) en la posición 113 en SEQ ID NO: 60. La posición del primer y último aminoácido de cada fragmento se muestra en la Tabla 4. El aminoácido correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1 está subrayado.
Las secuencias de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 14 se muestran en la Tabla 5.
Tabla 4: Alineamiento a lo largo de la longitud completa de SEQ ID NO: 1 con SEQ ID NO: 31 - 61, se muestran 10 fragmentos entre los aminoácidos 101-130. El aminoácido en la posición correspondiente al aminoácido 113 en
SEQ ID NO: 1 se muestra subrayado.
N.° de acceso:
Primer AA Secuencia correspondiente al aminoácido 101-130 de SEQ ID NO: 1. Último AA SEQ ID NO: Fragmento de SEQ ID NO: AA en la pos corr. a AA 113
SEQ ID NO:1
101 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 62 1 Asp
AGZ16504.1
101 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 63 31 Asp
YP_003865004.1
101 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 64 32 Asp
WP_004397739.1
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WP_019713492.1
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AGR50961.1
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101 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 70 38 Asp
EXF51833.1
101 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 71 39 Asp
WP_003234000.1
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YP_006628799.1
103 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 132 73 41 Asp
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4AKQ_A
101 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 76 44 Asp
4A68_A
101 KTVVHLHGGVTPDDSNGYPEAWFSKDFEQT 130 77 45 Asp
4A66_A
101 KTVVHLHGGVTPDDSAGYPEAWFSKDFEQT 130 78 46 Asp
ACS44284.1
101 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 79 47 Asp
AGK12417.1
101 RTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDLEQT 130 80 48 Asp
2X87_A
101 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 81 49 Asp
AFN66123.1
101 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 82 50 Asp
4A67_A
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2WSD_A
101 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 84 52 Asp
4AKP_A
101 KTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 85 53 Asp
N.° de acceso:
Primer AA Secuencia correspondiente al aminoácido 101-130 de SEQID NO: 1. Último AA SEQ ID NO: Fragmento de SEQ ID NO: AA en la pos corr. a AA 113
ACM46021.1
101 KTWHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 86 54 Asp
WP_010329056.1
101 KTVVHLHGGVTPEDSDGYPEAWFTKDFEQT 130 87 55 Glu
AEK80414.1
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WP_010333230.1
101 KTWHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 89 57 Asp
4AKO_A
97 KTWHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 126 90 58 Asp
AAB62305.1
101 KTWHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQT 130 91 59 Asp
YP_003972023.1
101 KTVVHLHGGATPYDSDGYPEAWFSKGFQET 130 92 60 Tyr
WP_010787813.1
101 KTVVHLHGGATPYDSDGYPEAWFSKGFQET 130 93 61 Tyr
Tabla 5: Secuencias de SEQ ID NO: 1 -14.
SEQ ID NO:
Nombre Organismo Secuencia
1
COT1 Bacillus subtilis MTLEKF^/DALPIPDTLKPVQQTTEKTYYZiVTMEECAHQLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTIEVKRNENVYVKKMNKL PSEHFLPIDHTIHH3DSQHEEPEVKTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDEEQTGPYFKREVYHYPNQQRGAILWY I]DIIAMALTRLNVYAGLVGAYII]IDPKEKRLKLPSGEYDVPLLITGRTINEGGSLFYPSGPEWPEPGLPKPSIVPAF CGDTlLVNGKVWPYLEVEPRKYRbTOlNASmm'ÍNLSljlAJGGEb'lCIGSPGGLLPRSVKLNSESLAPAERYDlll DFTAYEGE3IILAN3EGGGGDANPETDANIEGFRVTKPGAQKDESRKPKYLASYPSVQNERIQNIRTLKLAGTQDE YGRPVLLLNNKRWHDPVTEAFKAGTTEIWSIVNFTGGTHFIHLHLVSFRVLDRRPFCIARYQERGELSYTGPAVPF PPSEKGWKDTIQAPAGEVLRIAY^TEGPYSGRYVWHCHI AEHEDYAMRRPMDITDPPIK
2
Cot2 Bacillus subtilis MTLEKFVDALPIPDTLKPVQQSKEKTYYEVTMEECTHQLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTIEyKRNENVYVKKMNKL PSTHFLPIDHTIHP3DSQHEEPEVKTVVHLHGGVTPDDSDG’ÍPEAWFSPIDFEQTGPYFKREVYHYPNQQRGAILWY HDHAMALTRLNVYAGLVGAYFIHDPKEKRLKLP3EEYDVPLLITDRTINEPG3LFYPSGPENP3PSLPNP5IVPAF CGETPLVNGKVWPYLEVEPRKYRFRVINAENTRTYNLSEDNGGEFigiGSPGGLLPRSVKLTSFSLAPAERYDIII nFTAvEGQ3TTT,AN3AGGGGnWPRTnA.>JT|VQFRVTKP',AQKDRSRr<PKYT,ASYPSVQNF,RTQATPT_,KT,AGTQnR YGRPVLLLNNKRWEDPVTEAFKAGTTEIWSIINFTRGTHPIHLHLVSFRVIDRRPFDIAHYQESGALSYTGPAVPF PPSEKGWKDTIGAKAGEVLP.G AATFGPYSGRY'/WRCHIEEHEDYDMIYRPMPITDPHKSDPMSSSVDKLHRTRAPPP PPLR3GC
3
Cot1 113P Bacillus subtilis MTLEKFVDALPIPDTLKPVQQTTEKTYYEVTMEECAHQLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTIEVKRNENVYVKKMNKL PSEHFLPIDHTIHH3DSQHEEPEVKTVVHLHGGVT?PDSDGYPEAWF3KDFEQTGPYFKREVYHYPNGQRGAILTatY HDHAMAFTRLNVYAGLVGAYFIHDPKEKRLKLPSGEYDVPLLITDRTINEDGSLFYPSGPENPSPSLPKPSIVPAF CGDTPLVMGKVWPYLEVEPF.KYRFRVINASNTRTYNLSLDFIGGEFICIGSDGGLLPRSVKLNSFSLAPAERYDIII DFTAYRGESTTT.ANSRGCGGnANPRTDAMTYQFRVTKPT.AQFnFSRKPKYTASYPSVQKPRigNTPTLKTiAGTQDE YGRPVLLLMNKRWKDPVTEAPKAGTTEIWSIVNFTGGTHPIHLHLVSFRVLDRRPFCIARYQERGELSYTGFAVPP PPSEKGWKDTIQAPAGEVLRFAVTFGPYSGRY'/WHCHIEEHEDYDMKRPMDITDPHK
SEQ ID NO:
Nombre Organismo Secuencia
4
Cot2 113P Bacillus subtilis MTLEKFVDALPIPDTLKPVQQSKEKTYYEVTMEECTHQLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTEEVKRNENVYVKKMNKL PSTHFLPIDHTIHHSDSQHEEPEVKTWHLHGGVTPPDSDGYPEAWFSKDFEQTGPYFKREVYHYPNQQRGAILWY HDHAMALTRLNVYAGLVGAYIIHDPKEKRLKLPSEEYDVPLLIIDRTINEDGSLFYPSGPENPSPSLPNPSIVPAF CGETILVNGKVWPYLEVEPRKYRFRVINA.SNTRTYNLSEDEIGGEFIQIGSDGGLLPRSVKLTSFSLAPAERYDIII DFTAYEGQSIILAKSAGCGGDVNPSTDANIMQFRVTKPLAQKDESRKPKYLASYPSVQNERIQNIRTLKLAGTQDE YGRPVLLUNKRWEDPVTEAPKAGTTEIWSIINFTRGTHPIHLHLVSFRVIDRRPFDIAHYQESGALSYTGPAVPP PPSEKGWKDTIQAKAGEVLREAATFGPYSGRYVWHCHILEHEDYDMRRPMDITDPHKSDPNS53VDKLHRTPAPPP PPLR3GC
5
Seq55 WT Bacillus vallismortis MTLEKEVDALPIPETLKPVQQTKEKTYYEVTMEECAHKEHRDLPPTRLWGYNCQFPGPTIEVNRNENVYVKKMNH1 SSTHFLPVDHTIHH3DSQHEEPEVKTVVHLHGGVTPE DSDGYPEfiWFTKDFEQTGPYFKRETYHYPNGQRGAILWY HnHAMAETRT.NVYAGLI GAYTjIIIDPKEKRLKLPSCíE YDVPLLi rjP.TiNGDGSLFYPNGPENPSPSLPNPSIVPAF CGETILVNGKAWPYLEVEPRKI'RÍ'RVINASNTRTÍNLSGDNDGEFIQIGSDGGLLPRSVKLNSFSLAPAERYDIII DFTAYEGQSIILANSEGCGGDANPETDAPIIMQFRVTKPLAQXDESRKPKYLASYPSVQNERIHNIRTLKLAGTQDE YGRPVLLLNNKRWHDPVTETPKAGPTE3ISIINPTRGTHPIHLHLVSFRVLDRRPFDIARYQERGELSYPGPAVPF PPSEKGWKDTIQAFAGEVLR: .AATEGPYSGRYVWHCIIILEIIEDYDMMRPMPTTDPRK
6
SEQ 55 E113P Bacillus vallismortis MTLEKFVDALPIPETLKPVQQTKEKTYYEVTMEECAHKLHRDLPPTRLWGYNCQFPGPIIEVNRNE1WYVKWMNHL SSTHFLPVDHTIHHSDSQHEEPEVKTVVHLhGGVTPPDSPGYPEAWFTKDFEQTGPYFKREPYHYPNQQRGAILKY HDHAMALTRLH V YAC-LIGA Y_iIHDPKEKRLKLPSGEYDVPLLITDRTINGDG3LFYPNGPEKPSPSLPHPSIVPAF CGETILVNGKAWPYLEVEPRKYRFRVINASNGRTYNLSLDNDGEFIQIGSDGGLIPRSVKLNSFSLAPAERYDIII DFTAYEGQ3II LANSF,GCGGDAMT’F,TDA.NIMQFRVTKPLAQKDEERKPK YLAS YFSVQNER^HMIRTLKLA.GTQDE YGRPVLLLNNKRWHDFVTETPKAGTTEIWSI INPTRGTHPTHT.HT.VSFRVZjDRRPFDIARYQERGELSYTGPAVPP PPSEKGVJKDTIQAHAGEV1RIAATFGPY3GRYVWKCHILEHEDYDKMRPMDITDFIIK
7
SEQ 60 WT Bacillus atrophaeus MNLEKFADMLPIPEVLKPHQQTKESTYYEVTMKEFYQKLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTIEVNRNENVQIKKMNDL PDQHFLFIDHTIHKSEGHHQEPEVKTWHLHGGATPYDSPJGYPEAWFSKGFQETGPYFSREPYHYPNQQRGAILNY HDHAMA1TRLNVYAGLAGVYIIHDPKEKRLKLPAGEYDVPLMIHDRTINEDG3LFYPSGPENPSPTLPTPSIVPAF CGDTILVNGKAWPYIYEVEPRAYRFRIVICASNERTYMLSLGNGGEFLQVGSDGGLLPRSVKLSSISLAPAERFDIEI DFAAFEGQSIVIAWSEGCGGPAMPESAAmfl-lQFRVGKPLKEKDESRKPRFLTNLFPVTDEKlQHLRTLKLTGGQDE YGRPVLLLNNKRWSDPVTEAPKLGTSEIWSIINPTRGTHPIHLHLISFRVLDRRPFIITAKYAETGNVVFTGPAVPF PFSEKGWKDTVQSHAGEVIRIMAKFGPYSGRYYWHCniLEHEDYDMHRPMDWDFMQ
SEQ ID NO:
Nombre Organismo Secuencia
8
SEQ 60 Y113P Bacillus atrophaeus MNLEKFADMLPIPEVLKPHQQTKESTYYEVTMKEFYQKLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTIEVNRNENVQIKKMNDL PDGHFLPIDHTIHHSEGHHQEPEVKTVVHLKGGATPPDSPGYPEAWFSKGFQETGPYFSREIYHYPNQQRGAILKY hüHAMALTRLNVl'AGLAGVYlIHDPKEKRLKLPAGEYDVPLKIMDRTINEDGSLFYPSGPEKPSPPLPTPSIVPAF CGDTILyNGKAWPYREVEPRAYRFRIVKASNERTYPILSLENGGEFLQVGSDGGLLPRSVKLSSISLAPAERFDIPI DFAAFEGQSIVLANSF.GCGGPANPF.SnANVMQFRVIKPLRF.KDEKRKPRFLTNLFPVTGtíKIQIJLRTLKLTGTQDE YGRPVLLLNNKRWSDPVTEAPKLGTSEJWSIINPTRGTHPIHT.HT.TSFRVr.nRRPFETAKYAETGNVVFTCPAVPF PPSEKGWKDTVQ3HAGEVIRIMAKFGPY3GB:YVKECHILEHE DYDMMR PMDVVDPNQ
9
Cot1 113A Bacillus subtilis KTLEXFVDALPIPDTLKPVQQTFeKTYYEVTMEECAHQLHRDLPPTRLWGíMGLí'PGPTIEVKRWE.MVYvrwmnnl FSEHFLFTDHTTHHSnSQlHFF.PEVKTWHLHGGVTPADSDGYPEAWFSKDFEQTGPYFKREVYHY'FNQGRGAIUÍY HDHAMALTRLNVYAGLVGAY1IHDPKEKRLKLPSGEYDVPLI TTDRTTl'IEDGSLFYPSGPENPSPSLPKPSIVPAF CGDTILVNGKVWPYLEVEPRKYRFRVINAGNTRTYNLÜLDKGGEFlQlGSDGGLLPRSVKLNSFSLAPAERYDIII DFTAYEGESIILANSEGCGGDANPETDAKIMQFRVTKPLAQKDESRKFKYLASYPSVQNERIQNIRTLKLAGTQDE YGRPVLLLNNKRKHDPVTEAPKAGTTEIWSIVNPTGGTHPIHLHLVSFRVLDRRPFDIARYQERGELSYTGPAY'PF PPSEKGKKDTTQAHAGFVT.RTAVTFGPYSGRYVWHCHILEHEDYDMMRPMDITDPHK
10
Cot1 113G Bacillus subtilis MTLEKFVnAT.PTFnTT.KPVQQTTEKTYYEVTMEECAHQLHF,DLPPTRLKGYNGLFPGPTIEVKRNEÍJVYVKT/iMNNL PSEHFLPIDHTIHKSDSQHEEPEVKTWHLKGGVIPGDSDGYPEAWFSKDFEQTGPYFKREVYIIYPHQQRGA II.KY HDHAMALTRLNVYAGLVGAYI1HDPKEKRLKLPSGEYDVPLLITDRTINEDGSLFYPSGPEKPSPSLPKPSIVPAF cgdtilvhgkvwpyleveprkyrfrvinashtrtynlsldnc-gefiqigsdggllprsvklrsfslapaerydttt DFTAYEGEGIILANSEGCGGDAMPFTDANIMQFRVFKPLAQKDESRKPKYLASYPSVQNERIQNIRTIKLAGTQDE YGRPVLLLNNKRWHDPVTEAPKAGTTEIWSIVNPTQGTHPIHLHLVSFRVLDRRPFDIARYQERGELSYTGFAVPP PP3EKGWKDT 1 QAHAGEV] lí 1 A.VTFGPYSGRYVWhCHILEHEDYDMMRPMDITDPH"<
11
Cot1 113V Bacillus subtilis MTLEKFVDALPIPDTLKPVQQTTEKTYYEVTMEECAHQLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTIEVKRNENVYVKKMNR1 PSEHFLFIDHTIHESDSQHEEPEVKTWHLHGGVTPVDSDGYPEAWFSKDFEQTGPYFKREVYHYPNQQRGAILI/JY HnHAMALTRT.NVYAGLVGAY-I]IDPKEKALKLF3GE YDVFLL1 rjRTiNEDGSLFYPSGPENPSPSLPKPSIVPAF CGDTILVNGKVWPYLEVEPF.KYRFRVlNA.Sm'RTYÍTLSLDYIGGEFIGIGSDGGLLPRSVKLNSFSLAPAERYDIII DFTAYEGESIILAWSEGCGGDANPETDAAIIMQFRVTKPLAQKDESRKPKYLASYPSVQNERIQMIRTLKLAGTQDE YGRPVLLLNNKRKHDPVTEAPKAGETEPWSGVHPTQGIHPIHLHLYSFRVLDRRPFDIARYQERGELSYYGPAyPP PFSEKGWKDTIQAPAGEVLRIAPATFGPYSGRYVWHCniLEIIEDYDMMRPMPTTDPEK
SEQ ID NO:
Nombre Organismo Secuencia
12
SEQ60113A Bacillus atrophaeus MNLEKFADMLPIPEVLKPHQQTKESTYYEVTMKEFYQKLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTIEVNRNENVQIKWMHDL PDGHFLPIDHTIHHSEGHHQEPEVKTVVHLKGGATPADSEGYPEAWFSKGFQETGPYFSREPYHYPNQQRGAILKY hüHAMALTRiiNVl'AGLAGVYlIHDPKEKRLKLPAGEYDVPLMIMDRTINEDGSLFYPSGPEKPSPELPTPSIVPAF CGDTI LVNGKA.WPYREVEPRAYRFRIVKASN'IRTYYILSLGNGGEFLQVGSDGGLI.PRSVKLSSI SLAPAERFDIEI DFAAFEGQSIVLAT-ISF'GCGGPAN^F.SDANVMQFRVIKPLKEKDEKRKPRFL INLPPV'IEEK^QMLRTLKLTGTQDE YGRPVLLLNNKRWSDPVTEAPKLGTSEJWSIINPTRGTHPTHI.HT.TSFRVLDRRPFGTAKYAETCNVVFTCPAVPF PPSEKGVJKDT'/QSHAGEVIRIMAKFGPYSGRYVWECHILEHEDYDMMRPHDVVDPNQ
13
SEQ60113G Bacillus atrophaeus KNLEaFADMIPIPE’GLKPHQQTKESTYYEVTMKEFYQKLHRDLPPTRLWGYMGLFPGPTIEVWRJME.MVUIRWMNUL FDQHFLFTnHTTHHSEGHHQF.PEVKTWHLHGGATPGDSDGYPEAWFSKGFQETGPYFSREIYHYFNQQRGAILNY HCHAMAL i'R-LNV YAGEAGV Y i IHDPKEKRLKLPAGEY'DVPLYTMDRTTl'IEDGSLFYPSGPENPSPTLPTPSIVPA.F CGDTILVNGKAWPYMEVSPRAYRFRIVNASMTRTYNLGLDKGGEFLQVGSDGGLLPRSVKLSSISLAPAERFDIII DFAAFEGQSIVLANSEGCGGPANPESDAKVMQFRVIKPLKEKDESRKFRFLTNLPPVTDEKIQNLRTLKRTGTQnE YGRPVLLLNNKRKSGPVTEAPKLGTSElWSIINPTRGTHPIHLHLISFRyLDRRPFDTAKYAETGNVVFTGPAVPF P PSEKGKKDTVQS HAGEVT R T MflKFG PYS GRYVWH C HILEHE DYDMMRPMCVVDPNQ
14
SEQ60 113V Bacillus atrophaeus MNLEKFADMT.PT PEVI.KPHQQTKESTYYEVTMKEFYQKLHP.DLPPTRLSGYNGLFPGPTIEVNRHEI'JVOIKT/íMWDL PDQHFLPIDHTIHHSEGHHOEPEVKTVVHLhGGATPVDSDGYPEAWFSKGFQETGPYFSREPYIIYPHQQRGAII.KY HDHAMALTRLNVYAGLAGVYI1HDPKEKRLKLPAlGEYDVPLMIMDRTINEDG3LFYPSGPEKPSPELPTPSIVPA.F cgdtilvhgkawpymevefrayrfrivnashtrtynlsldnc-geflqvgsdggllpasvklssislapaerfdttt DFAAFEGQ31V1ANGEGCGGP’AYPESGA.NVPIQFRVPKPLKEKDESRKPRFETNLPP vrTDEKIQMLRTEKLTGTGDE YGRPVLLLNNKRVISDPVTEAPKLGTSEIWSIINPTRGTHPIHLHLISFRVLDRRPFDTAKYYAETGNVVFTGFAVPP PP5EKGWKI3TVQSHA3KV : lí 1 MAKFGPYSCRYVWECHILEHEDYDMMRPMDVVDPNQ
5
10
15
20
25
30
35
Referencias
1. Martins LO, Soares CM, Pereira MM, Teixeira M, Costa T, Jones GH, et al. Molecular and biochemical characterization of a highly stable bacterial laccase that occurs as a structural component of the Bacillus subtilis endospore coat. J Biol Chem 2002; 277:18849-59.
2. Bento I, Martins LO, Gato Lopes G, Armenia Carrondo M, Lindley PF. Dioxygen reduction by multi-copper oxidases; a structural perspective. Dalton Trans 2005; 21:3507-13.
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4. Suzuki T, Endo K, Ito M, Tsujibo H, Miyamoto K, Inamori Y. A thermostable laccase from Streptomyces lavendulae REN-7: purification, characterization, nucleotide sequence and expression. Biosci Biotechnol Biochem 2003; 67:2167-75.
5. Kumar et al., "Combined sequence and structure analysis of the fungal laccase family", Biotechnol. Bioeng., 83, 386-394, 2003;
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7. Cantarella et al., (Determination of laccase activity in mixed solvents: Comparison between two chromogens in a spectrophotometric assay", Biotechnology and Bioengineering V. 82 (4), pp 395-398, 2003).
8. Methods in Molecular Biology, Vol 182, "In vitro mutagenesis protocols", Eds Jeff Braman, Humana Press 2002).
9. Nasoohi N et al., Enhancement of catalysis and functional expression of a bacterial laccase by single amino acid replacement. Int J Biol Macromol 2013; 60:56-61
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Metgen OY
<120> VARIANTES DE LACASA CON PROPIEDADES MEJORADAS
<130> 283 WO
<160> 93
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1 <211> 513 <212> PRT <213> Bacillus subtilis
<400> 1

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    1. Un polipéptido con actividad de lacasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es más del 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, en el que el polipéptido comprende un resto de aminoácido no polar seleccionado del grupo que consiste en metionina, leucina, isoleucina, valina, alanina, prolina y glicina y fenilalanina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1.
  2. 2. Polipéptido según la reivindicación 1 que comprende un resto de aminoácido no polar seleccionado del grupo que consiste en prolina, alanina, glicina y valina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1.
  3. 3. Polipéptido según las reivindicaciones 1 o 2, en el que el resto de aminoácido no polar pequeño es un resto de prolina.
  4. 4. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que el polipéptido es una proteína de la envoltura de la espora, preferentemente codificada por el genoma de una especie de Bacillus, más preferentemente Bacillus subtilis.
  5. 5. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 94 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 31 -61.
  6. 6. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en la que el polipéptido es un polipéptido aislado.
  7. 7. Composición que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6.
  8. 8. Ácido nucleico que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7.
  9. 9. Vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 8.
  10. 10. Composición que comprende un ácido nucleico o un vector según las reivindicaciones 8 o 9.
  11. 11. Célula hospedadora recombinante que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 8, un vector según la reivindicación 9 o una composición según la reivindicación 10.
  12. 12. Célula hospedadora recombinante según la reivindicación 11 seleccionada del grupo que consiste en Escherichia coli, Bacillus, Corynebacterium, Pseudomonas, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, hongos filamentosos, levadura y células de insecto.
  13. 13. Método de producción de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, que comprende las etapas de:
    a. cultivar una célula hospedadora recombinante según la reivindicación 11 o 12 en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido, y
    b. recuperar el polipéptido obtenido, y
    c. opcionalmente purificar dicho polipéptido.
  14. 14. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6 en una aplicación seleccionada del grupo que consiste en deslignificación de pasta, degradación o disminución de la integridad estructural de material lignocelulósico, blanqueamiento de tintes textiles, destoxificación de aguas residuales, destoxificación xenobiótica, producción de un azúcar a partir de un material lignocelulósico y recuperación de celulosa de una biomasa.
  15. 15. Método de mejora del rendimiento de un polipéptido con actividad de lacasa en un sistema de expresión heteróloga que comprende la etapa de alterar el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 113 en SEQ ID NO: 1 a un resto de aminoácido no polar seleccionado del grupo que consiste en metionina, leucina, isoleucina, valina, alanina, prolina y glicina y fenilalanina.
  16. 16. Método según la reivindicación 15, en el que el aminoácido no polar es un aminoácido no polar pequeño seleccionado del grupo que consiste en prolina, alanina, glicina y valina, preferentemente prolina.
    138
    SEQ1 113P
    >
    O
    <’
    E
    a)
    o.
    (Q
    c
    SEQ2
    SEQ2 113P
    SEQ5
    SEQ5 113P
    SEQ7
    SEQ7 113P
    139

    N) N)

    O Ln

    O O
    SEQ1 113P
    SEQ1113A
    SEQ1113G ■
    SEQ1113V
    SEQ7
    SEQ7 113P
    SEQ7 113A
    SEQ7 113G
    "
    >
    O
    <’
    E
    a)
    Q.
    (Q
    c
    —I 0)
    IV)
    SEQ7 113V
    140

    l-> l-> N) N)

    Ln O in O in

    O O O O O O
    SEQ1 113P
    SEQ 2
    >
    o
    <’
    E
    &>
    Q.
    imagen1
    (Q
    c
    —I
    £D
    00
    SEQ 2 113P
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