ES2667210T3 - Uso de sangre del cordón umbilical en el tratamiento de complicaciones del parto prematuro - Google Patents

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Abstract

Sangre de cordón umbilical que comprende células madre placentarias para el uso en un método de tratamiento de un trastorno o afección en un neonato prematuro, en el que dicho trastorno o afección está provocado por o asociado a un desarrollo incompleto del cerebro, en el que dichas células madre placentarias comprenden células que son CD34-, CD73+, CD105+, y CD200+.

Description

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Un neonato se considera un neonato de peso extremadamente bajo al nacer (PEBN) si el neonato nace con un peso menor de 1 kg (aproximadamente 2,3 libras). En ciertas realizaciones, el neonato prematuro pesa 800 gramos o más al nacer. En ciertas realizaciones, el neonato prematuro pesa de 500 gramos a 800 gramos al nacer. En ciertas realizaciones, el neonato prematuro pesa menos de 500 gramos al nacer.
Tal como se usa en la presente memoria, los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren a la curación, remedio, o reducción o mejora de la progresión, gravedad, y/o duración de un trastorno o afección, en este caso uno provocado por o relacionado con un parto prematuro, o cualquier parámetro o síntoma de tal trastorno o afección.
El tratamiento de un neonato prematuro con sangre de cordón umbilical, y opcionalmente células madre placentarias, se puede considerar eficaz si el neonato prematuro sobrevive, o si el trastorno o afección provocado por o asociado a un parto prematuro mejora de manera medible de cualquier manera como resultado del tratamiento. Tal mejora se puede demostrar, p.ej., mediante uno o más indicadores medibles que incluyen, por ejemplo, cambios detectables en una afección fisiológica o grupo de afecciones fisiológicas asociadas a una enfermedad, trastorno o afección particular (que incluyen, pero sin limitación, tensión arterial, frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, recuentos de diversos tipos de células sanguíneas, niveles en sangre de ciertas proteínas, carbohidratos, lípidos o citocinas, o modulación de la expresión de marcadores genéticos asociados a la enfermedad, trastorno o afección).
El tratamiento de un neonato prematuro con sangre de cordón umbilical, y opcionalmente células madre placentarias, se considera eficaz si cualquiera de tales indicadores parece responder a tal tratamiento cambiando hasta un valor que está dentro, o más cerca, de un valor normal, p.ej. para los neonatos a término, de lo que se esperaría para tal(es) indicador(es) en ausencia de la administración de sangre de cordón umbilical y/o células madre placentarias. El valor normal puede ser un valor normal o un intervalo de valores normales que se conoce en la técnica para un indicador. Por ejemplo, uno o más indicadores metabólicos o bioquímicos mostrados por un neonato prematuro se pueden comparar con el intervalo normal para el/los indicador(es), en el que el tratamiento se considera eficaz si el tratamiento da como resultado que uno o más indicadores metabólicos o bioquímicos se aproximen más cerca, o se hallen dentro de, un intervalo de referencia para neonatos a término normales. Tal indicador incluye, pero sin limitación, los niveles, o valores, de 17-hidroxiprogesterona, 25-hidroxivitamina D (25(OH)D), acetoacetato, acidez (pH), albúmina, amoniaco, amilasa, ácido ascórbico, bicarbonato, bilirrubina, volumen sanguíneo, calcio, carbono, presión parcial de dióxido de carbono, monóxido de carbono, recuento de células CD4, ceruloplasmina, cloruro, cobre, creatina quinasa (CK o CPK), isoenzimas de creatina quinasa, creatinina, velocidad de sedimentación de eritrocitos (ESR o Velocidad-Sed), globulina, glucosa, hematocrito, hemoglobina, hierro, capacidad de unión de hierro, lactato (ácido láctico) (arterial), deshidrogenasa láctica, lipasa, magnesio, hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), volumen corpuscular medio (MCV), osmolalidad, presión parcial de oxígeno, saturación de oxígeno (arterial), fosfatasa, fósforo, recuento de plaquetas, potasio, proteína (total), protrombina (PTT), ácido pirúvico, recuento de eritrocitos (RBC), sodio, hormona estimulante del tiroides (TSH), transaminasa (alanina o aspartato), nitrógeno ureico (BUN) y proporción BUN/creatinina, ácido úrico, vitamina A, WBC (recuento de leucocitos), zinc, y similares.
La eficacia de la administración de sangre de cordón, o sangre de cordón y células madre placentarias, se puede estudiar mediante pruebas conductuales. Por ejemplo, la mejora del neurodesarrollo de un neonato prematuro se puede estudiar, p.ej., en los primeros 2-3 años desde el nacimiento mediante una o más pruebas tales como el Examen Neuroconductual Neonatal, Escala de Desarrollo Motor de Neonatos de Alberta, o Escala de Bayley de Desarrollo de Neonatos (3ª Edición), comparando una puntuación de tal prueba del neonato prematuro respecto de una puntuación, o intervalo de puntuaciones, para neonatos normales y prematuros de diferentes edades gestacionales, y determinando que tiene lugar una mejora si la puntuación es mayor que la puntuación esperada a la edad gestacional del neonato prematuro. En una realización específica, el neonato prematuro, que recibe sangre de cordón o una combinación de sangre de cordón y células madre placentarias, se considera que ha mejorado si la puntuación es mayor que una puntuación, o una media de puntuaciones, de neonatos prematuros de la misma edad gestacional tratados solamente con los tratamientos convencionales.
En una realización, se evalúa a un neonato prematuro poco después del parto (p.ej., en la primera semana) mediante el Examen Neuroconductual Neonatal (ENN) y se le adjudica una puntuación que representa el desarrollo de los rasgos conductuales, reflejos primitivos, y el tono y los patrones motores, en el que la puntuación máxima es
81. El neonato se vuelve a evaluar una o más veces en dos años desde el parto, preferiblemente de 18 a 22 meses. Una mejora significativa de la puntuación ENN durante este tiempo indica eficacia. En diversas realizaciones, la administración de sangre de cordón umbilical y células madre placentarias es eficaz si la puntuación mejora desde las puntuaciones medias, p.ej., de neonatos prematuros de una edad gestacional de 37-42 semanas (66,5) si el neonato prematuro nació a una edad gestacional de 37-42 semanas; neonatos prematuros de 34-36 semanas (60,7) si el neonato prematuro nació a una edad gestacional de 34-36 semanas, o neonatos que nacieron a una edad gestacional de 34 semanas o menos (51,1) si el neonato prematuro nació a una edad gestacional de 34 semanas o menos, comparado con neonatos prematuros no tratados con sangre de cordón o una combinación de sangre de cordón y células madre placentarias. Véase Morgan, "Neonatal Neurobehavioral Examination. A New Instrument For Quantitative Analysis of Neonatal Neurological Status," Phys. Ther. 68(9): 1352-1358 (1988).
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5.1.1 Trastornos o Afecciones Provocados por o Asociados a un Parto Prematuro
El trastorno o la afección a tratar con la presente invención puede ser cualquier trastorno o afección, provocado por o asociado a un parto prematuro, que se conoce en la técnica. En ciertas realizaciones, el trastorno o la afección es el Síndrome de Dificultad Respiratoria (SDR) o el Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (SDRA). En ciertas realizaciones, el trastorno o la afección es anemia. En ciertas realizaciones, el trastorno o la afección es hemorragia intraventricular, enterocolitis necrosante, retinopatía de la prematuridad, enfermedad pulmonar crónica (displasia broncopulmonar), una infección, conducto arterial persistente, apnea, tensión arterial baja, o hiperbilirrubinemia. En ciertas realizaciones, el trastorno o la afección está provocado por un desarrollo incompleto de un órgano, que incluye, pero sin limitación, pulmón, ojo, sistema inmunitario, cerebro, corazón, hígado o riñón.
El Síndrome de Dificultad Respiratoria (Aguda) (SDR/SDRA) o el Síndrome de Dificultad Respiratoria del Neonato (SDRN) (anteriormente denominado enfermedad de la membrana hialina) es un trastorno respiratorio en el que los sacos alveolares (alveolos) de los pulmones de un neonato no permanecen abiertos debido a la elevada tensión superficial que resulta de una producción insuficiente de tensioactivo. El síndrome de dificultad respiratoria afecta al 10% de los neonatos prematuros, y solamente afecta de manera poco frecuente a los nacidos a término. La enfermedad está provocada por una carencia de tensioactivo pulmonar, un producto químico que normalmente aparece en los pulmones maduros. El tensioactivo evita que los sacos alveolares se colapsen, y los permite inflarse más fácilmente con aire. En el síndrome de dificultad respiratoria, los sacos alveolares se colapsan e impiden que el niño respire de manera adecuada. Los síntomas aparecen normalmente poco después del parto, y se hacen progresivamente más graves. Los neonatos con SDR/SDRA normalmente necesitan soporte con oxígeno y un respirador, o se tratan con un fármaco tensioactivo.
La anemia es un trastorno caracterizado por un número insuficiente de eritrocitos o hemoglobina en la sangre para transportar una cantidad adecuada de oxígeno al organismo. Los neonatos prematuros pueden desarrollar anemia por varias razones, que incluyen la pérdida de sangre durante el parto, la carencia de contenido de hierro y una semivida más corta de los eritrocitos en comparación con los adultos. Las opciones de tratamiento actuales incluyen la transfusión de sangre (de un banco de sangre o la sangre de un donante directo obtenida de miembros de la familia), la suplementación de hierro y la prevención de la pérdida de sangre. Aunque sin pretender limitarse a ninguna teoría particular, se cree que la sangre de cordón umbilical puede ser una buena fuente de sangre para transfusión. La infusión autóloga de sangre de cordón umbilical tiene varias ventajas respecto de la sangre de un banco de sangre o de donantes familiares: 1) la sangre de cordón umbilical es una buena fuente de eritrocitos con una capacidad moderada de transportar oxígeno; 2) la sangre de cordón umbilical está disponible fácilmente y requiere ensayos mínimos; y 3) la sangre de cordón umbilical es una fuente rica de células madre y progenitoras capaces de mantener el desarrollo adicional de órganos inmaduros u órganos dañados debido a un parto prematuro.
La apnea es un trastorno en el que un neonato prematuro deja de respirar temporalmente, y se define normalmente como el cese de la respiración durante 15 a 20 segundos. La apnea se puede dar en neonatos nacidos antes de 34 semanas de embarazo, y la frecuencia se incrementa en los neonatos nacidos más prematuramente. Se cree que está provocada por la inmadurez de la parte del cerebro que controla la respiración. Los neonatos con apnea se tratan con fármacos (p.ej., aminofilina, cafeína, o doxapram), y/o se les proporciona una presión positiva continua en las vías respiratorias o un respirador.
La enfermedad pulmonar crónica (displasia broncopulmonar) es una afección que se desarrolla en neonatos prematuros con ventilación mecánica y/o niveles elevados de oxígeno durante periodos prolongados. La enfermedad pulmonar crónica se trata con oxígeno, fármacos y la retirada gradual de los neonatos del respirador.
La hiperbilirrubinemia, uno de los problemas más habituales hallados en los neonatos, es un nivel anormalmente elevado de bilirrubina en la sangre. Se define como un nivel de bilirrubina total en suero mayor de 5 mg/dL. La bilirrubina por encima de este nivel es neurotóxica/citotóxica. Resulta del depósito del pigmento de bilirrubina sin conjugar en la piel y las membranas mucosas. Una hiperbilirrubinemia leve no requiere tratamiento. Los niveles más elevados de bilirrubina se pueden tratar mediante fototerapia, en la que el neonato se coloca bajo luces de bilirrubina.
Los neonatos prematuros tienen un mayor riesgo de desarrollar infecciones que los bebés a término, debido a que sus sistemas inmunitarios son inmaduros. Las infecciones graves observadas en los bebés prematuros incluyen septicemia, neumonía y meningitis (infección de las membranas que rodean el cerebro). Actualmente, las infecciones se tratan con antibióticos o fármacos antivirales.
La hemorragia intraventricular es una hemorragia en el cerebro. Ocurre cuando los vasos sanguíneos pequeños que se hallan a lo largo de los ventrículos se rompen. La hemorragia intraventricular afecta con más frecuencia a los neonatos prematuros. La hemorragia grave puede provocar daño cerebral, y puede dar como resultado, p.ej., discapacidades del aprendizaje y/o problemas de comportamiento.
La enterocolitis necrosante es una afección en la que la superficie interna del intestino se lesiona e inflama; si es grave, una porción del intestino puede morir, lo que conduce a perforación intestinal y peritonitis. La enterocolitis necrosante se da principalmente en neonatos prematuros. Se desconoce la causa de este trastorno, pero se cree
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lo que reduce las complicaciones inmunológicas. En otra realización más específica, en la que dicho aditivo son eritrocitos alogénicos, dichas células se han desleucocitado, p.ej., mediante el uso de un filtro desleucocitador. Véase, p.ej., la patente de EE.UU. nº 5.728.306. En todas las realizaciones en las que se usan eritrocitos como aditivo sanguíneo, se prefiere que los eritrocitos se hayan almacenado durante como máximo cinco días antes de la administración. En una realización preferida, los eritrocitos comprenden anticoagulante de adenina-solución salina (AS-3).
En otra realización preferida, los eritrocitos son de unidades de sangre donada en las que se ha analizado la ausencia de al menos los siguientes patógenos, o la ausencia de anticuerpos hacia los siguientes patógenos: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-I, VIH-II, virus de la hepatitis C, virus linfotrópico T humano (HTLV)-I y HTLV-II, virus de la hepatitis B (HBV, como se demuestra, p.ej., mediante la ausencia del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg)), citomegalovirus, y sífilis.
5.1.4 Terapia de Combinación
En ciertas realizaciones de la sangre de cordón umbilical que comprende células madre placentarias para el uso en los métodos proporcionados en la presente memoria, la sangre de cordón umbilical, y las células madre placentarias, se usan como una primera terapia en combinación con una o más segundas terapias en el tratamiento de un trastorno o afección de un neonato prematuro. Tales segundas terapias incluyen, pero sin limitación, la cirugía, terapia hormonal, inmunoterapia, fototerapia o tratamiento con ciertos fármacos.
El uso de la expresión "terapia de combinación" no limita el orden en el que se administran los tratamientos a un neonato prematuro en los métodos proporcionados. Por ejemplo, los agentes de la terapia de combinación se pueden administrar de manera concurrente, secuencial en cualquier orden o cíclica a un neonato prematuro. En ciertas realizaciones, se administran dos componentes de una terapia de combinación de manera concurrente a un neonato prematuro.
Los componentes de la terapia de combinación se pueden administrar a un neonato prematuro en la misma composición farmacéutica. De manera alternativa, los componentes de las terapias de combinación se pueden administrar a un neonato prematuro en composiciones farmacéuticas diferentes, y estas composiciones diferentes se pueden administrar mediante la misma vía o mediante diferentes vías de administración, que incluyen, por ejemplo, la vía oral, parenteral (p.ej., la(s) vía(s) ocular, nasal, dérmica, muscular o peritoneal, y similares), o tópica, etc.
Las segundas terapias particulares se llevan a cabo según las respectivas dosis y calendarios de dosificación estándar o reconocidos en la técnica de las terapias.
En ciertas realizaciones, se selecciona un segundo agente terapéutico, y/o tercer agente terapéutico opcional, por sus efectos aditivos con la sangre de cordón umbilical y las células madre placentarias en el tratamiento de un trastorno o afección de un neonato prematuro.
En ciertas realizaciones, se selecciona un segundo agente terapéutico, y/o tercer agente terapéutico opcional, por sus efectos sinérgicos con la sangre de cordón umbilical y las células madre placentarias en el tratamiento de un trastorno o afección de un neonato prematuro.
Las terapias ejemplares que se pueden usar en combinación con la administración de sangre de cordón umbilical, y opcionalmente células madre placentarias, incluyen el control de la temperatura ambiental; el soporte con oxígeno; un respirador o un ventilador; transfusión de sangre periférica; suplementación de hierro; alimentación intravenosa; fototerapia; cirugía; agentes para el tratamiento de la apnea (p.ej., aminofilina, cafeína o doxapram, y similares); agentes para el tratamiento de SDRA o SDR (p.ej., un fármaco tensioactivo tal como, p.ej., CUROSURF® (Poractant Alfa; Douglas Pharmaceuticals)); antibióticos o fármacos antivirales, agentes antiinflamatorios (p.ej., compuestos antiinflamatorios esteroideos, compuestos antiinflamatorios no esteroideos (AINE)), óxido nítrico; antihistamínicos, inmunosupresores, compuestos inmunomoduladores (p.ej., un inhibidor de TNF-α); tratamiento láser (para tratar, p.ej., la retinopatía de la prematuridad); etc. El tratamiento de neonatos prematuros es muy conocido en la técnica, y las personas expertas en la técnica son capaces de seleccionar las terapias particulares, adecuadas para el uso en combinación con la administración de sangre de cordón, en función de cada caso.
5.2 SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL
La sangre de cordón umbilical se puede recoger de cualquier manera médicamente o farmacéuticamente aceptable. Se han descrito diversos métodos para la recogida de sangre de cordón. Véase, p.ej., la pat. de EE.UU. nº 6.102.871; pat. de EE.UU. nº 6.179.819 B1; y pat. de EE.UU. nº 7.147.626. La técnica convencional para la recogida de sangre de cordón se basa en el uso de una aguja o cánula, que se usa con la ayuda de la gravedad para drenar la sangre del cordón de la placenta. Véanse p.ej., las pat. de EE.UU. nºs 5.192.553; 5.004.681; 5.372.581, y
5.415.665. Normalmente la aguja o cánula se coloca en la vena umbilical y la placenta se masajea suavemente para facilitar el drenaje de la sangre de cordón de la placenta. La sangre de cordón se puede recoger, por ejemplo, en bolsas de sangre, bolsas de transfusión, o tubos de plástico estériles.
En ciertas realizaciones, la sangre de cordón umbilical se obtiene de un banco de sangre de cordón comercial (p.ej.,
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LifeBankUSA, etc.). En otras realizaciones, la sangre de cordón umbilical se recoge de una placenta mamífera puerperal y se usa inmediatamente (p.ej., en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 horas desde la recogida). En otras realizaciones, la sangre de cordón usada para tratar a un neonato prematuro es sangre de cordón que se ha crioconservado. La sangre de cordón umbilical se puede recoger de una única placenta o de una diversidad de placentas.
La sangre de cordón umbilical que se administra a un neonato prematuro puede ser autóloga o heteróloga. En las realizaciones particulares, la sangre de cordón umbilical se obtiene de la placenta del neonato prematuro a tratar. En ciertas realizaciones, la sangre de cordón umbilical se obtiene de una placenta mamífera puerperal de un parto a término. En otras realizaciones, la sangre de cordón umbilical se obtiene de una placenta mamífera puerperal de un parto prematuro, p.ej., la placenta del neonato prematuro. En ciertas realizaciones, la placenta es la placenta de un neonato nacido a las 23 a 25 semanas de gestación. En ciertas realizaciones, la placenta es la placenta de un neonato nacido a las 26 a 29 semanas de gestación. En ciertas realizaciones, la placenta es la placenta de un neonato nacido a las 30 a 33 semanas de gestación. En ciertas realizaciones, la placenta es la placenta de un neonato nacido a las 34 a 37 semanas de gestación.
La sangre de cordón o las células madre derivadas de ella se pueden almacenar tal como se recogen de un único individuo (es decir, como una única unidad) para la administración, o se pueden mezclar con otras unidades. Cuando la sangre de cordón umbilical se mezcla a partir de una diversidad de placentas, la sangre de cordón mezclada puede comprender sangre de cordón umbilical solamente de partos a término, sangre de cordón de una combinación de partos a término, o sangre de cordón solamente de partos prematuros. Por ejemplo, la sangre de cordón de la placenta del neonato prematuro se puede combinar, p.ej., con sangre de cordón de otros neonatos prematuros, sangre de cordón solamente de partos a término, o una combinación de sangre de cordón tanto de placentas prematuras como a término. La sangre de cordón, que incluye sangre de cordón autóloga o alogénica, también se puede combinar con sangre periférica. Es preferible la sangre de cordón de partos prematuros, ya que dicha sangre de cordón comprende un número relativamente elevado de células madre CD34+ por unidad de volumen, en comparación con la sangre de cordón de partos a término.
En ciertas realizaciones, las células nucleadas totales presentes en la sangre de cordón comprende al menos un 5%, 10%, 15%, 20%, o más de células CD38+CD45+. En las realizaciones adicionales, las células nucleadas totales presentes en la sangre de cordón comprenden al menos un 25%, 30%, 40%, 50%, o más de células CD38-CD45-. En ciertas realizaciones, la sangre de cordón se prepara a partir de placenta prematura. En otras realizaciones, la sangre de cordón se prepara a partir de placenta a término.
5.3 CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "célula madre placentaria" se refiere a una célula madre adherente en plástico de cultivo de tejidos (p.ej., una célula multipotente) que se obtiene o deriva de una placenta mamífera, o una porción de la misma (p.ej., amnios, corion, y similares) independientemente de la morfología, los marcadores de la superficie celular, etc. La frase abarca una célula madre obtenida directamente de una placenta, p.ej., como parte de una población de células placentarias en un perfundido placentario o tejido placentario digerido (digestión), o una célula madre que es parte de una población de células placentarias que se han expandido y/o sometido a pases una o más veces. La expresión no abarca, sin embargo, las células madre derivadas únicamente de otro tejido, p.ej., sangre placentaria o sangre de cordón umbilical. La placenta comprende poblaciones de células madre que tienen, y son distinguibles entre sí mediante, por ejemplo, diferentes grupos de marcadores. Las células madre placentarias, y los métodos para obtener las mismas, se describen con detalle en la pat. de EE.UU. nº 7.045.148; 7.255.879; y en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2007/0275362, presentada el 26 de diciembre de 2006.
Las células madre placentarias se pueden recuperar tras un parto con éxito y la expulsión placentaria, lo que da como resultado la recuperación de hasta mil millones de células nucleadas, que proporcionan 50-100 millones de células madre multipotentes y pluripotentes.
Las células madre placentarias útiles en los métodos y las composiciones de la invención incluyen, por ejemplo, células pluripotentes, células multipotentes, células progenitoras comprometidas, células progenitoras hematopoyéticas, y células madre de tipo mesenquimatoso de placenta. En una realización, las células madre placentarias están contenidas en, o derivan de, el perfundido placentario. En otras realizaciones, las células madre placentarias están contenidas en, o derivan de, el tejido placentario que se ha digerido con una o más enzimas de digestión de tejidos (p.ej., colagenasa, hialuronidasa, y similares).
Las células madre derivadas de placenta usadas en los métodos de la invención pueden derivar de una única placenta, o de una diversidad de placentas.
En ciertas realizaciones, las células madre placentarias se obtienen de una placenta de un parto a término. En ciertas realizaciones, las células madre placentarias se obtienen de una placenta de un parto prematuro. En ciertas realizaciones, la placenta es la placenta de un neonato nacido a las 23 a 25 semanas de gestación. En ciertas realizaciones, la placenta es la placenta de un neonato nacido a las 26 a 29 semanas de gestación. En ciertas
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realizaciones, la placenta es la placenta de un neonato nacido a las 30 a 33 semanas de gestación. En ciertas realizaciones, la placenta es la placenta de un neonato nacido a las 34 a 37 semanas de gestación.
Las células madre placentarias pueden ser autólogas o alogénicas respecto del neonato prematuro particular a tratar. En las realizaciones particulares, las células madre placentarias se obtienen del neonato prematuro a tratar.
Las células madre placentarias usadas en los métodos de la invención se pueden obtener mediante cualquier método. Las células madre placentarias se pueden obtener, por ejemplo, mediante perfusión, como se describió en la pat. de EE.UU. nº 7.045.148. Tal perfusión puede ser perfusión mediante el método de la bandeja, en el que el líquido de perfusión se hace pasar a través de la vasculatura placentaria y el fluido de perfusión que exuda de la placenta, en general en el lado materno, se recoge en una bandeja que contiene la placenta. La perfusión también puede ser una perfusión en circuito cerrado, en la que el fluido de perfusión se hace pasar a través, y se recoge, solamente de la vasculatura fetal de la placenta. En una realización específica, tal perfusión puede ser continua, es decir, el fluido de perfusión que se ha hecho pasar a través de la placenta, y que comprende una diversidad de células placentarias, se hace pasar una segunda vez, o una diversidad de veces, antes del aislamiento de las células placentarias.
Las células madre derivadas de placenta también se pueden obtener mediante disociación física o enzimática de la placenta mediante el uso, p.ej., de proteasas y/u otras enzimas de disociación de tejidos para disociar la estructura multicelular de la placenta. Tales proteasas pueden incluir proteasas neutras o metaloproteasas, p.ej., colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, y similares. Las células madre placentarias también se pueden obtener mediante la disociación física de la placenta con el uso, p.ej., de enzimas mucolíticas, por ejemplo, hialuronidasa.
La placenta perfundida aislada de la invención proporciona una fuente de grandes cantidades de células madre enriquecidas en células madre CD34+, p.ej., células madre CD34+CD38-, y células madre CD34-, p.ej., células madre CD34-CD38+. La primera recogida de sangre de la placenta se denomina sangre de cordón, que contiene de manera predominante células progenitoras hematopoyéticas CD34+CD38+. En las primeras veinticuatro horas de perfusión puerperal, se pueden aislar células progenitoras hematopoyéticas CD34+CD38-de la placenta, junto con células CD34-CD38+. Después de alrededor de veinticuatro horas de perfusión, se pueden aislar células CD34-CD38-de la placenta junto con las células anteriormente mencionadas. Una placenta aislada que se ha perfundido durante veinticuatro horas o más proporciona una fuente de grandes cantidades de células madre enriquecidas en células madre CD34-CD38-.
Al menos una clase de células madre placentarias humanas tiene características de las células madre o germinales embrionarias. Por ejemplo, las células madre de esta clase son SSEA3-(antígeno embrionario 3 específico de etapa), SSEA4-, OCT-4+ (un factor de transcripción de células madre) y/o ABC-p+ (proteína transportadora de casete de unión a ATP (ABC)), un perfil de marcadores exhibido por las células madre pluripotentes que todavía no han experimentado diferenciación. Así, en una realización, las células madre placentarias útiles en los métodos de la invención son SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y/o ABC-p+. En otra realización, las células madre similares a las embrionarias de la invención son OCT-4+ y ABC-p+. En otra realización, las células madre placentarias humanas no expresan antígenos de clase 2 del MHC.
La sangre de cordón umbilical que comprende células madre placentarias para el uso en los métodos de la invención son CD10+, CD38-, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y/o ABC-p.
La sangre de cordón umbilical preferida que comprende células madre placentarias para el uso en el método de la presente invención son CD34-, OCT-4+, CD73+, CD105+, CD200+ y HLA-G+. En ciertas realizaciones, las células madre placentarias comprenden células CD34-. En otras realizaciones, las células madre placentarias comprenden células OCT-4+. En otras realizaciones, las células madre placentarias comprenden células que son CD73+, CD105+ y CD200+. En otras realizaciones, las células madre placentarias comprenden células que son CD200+ o HLA-G+. En otras realizaciones, dichas células madre placentarias comprenden células que son CD200+ y OCT-4+. En otras realizaciones, las células madre placentarias comprenden células que son CD73+ y CD105+ y que facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en una población de células placentarias que comprende dichas células cuando dicha población se cultiva en condiciones que permiten la formación de un cuerpo de tipo embrioide. En otras realizaciones, las células madre placentarias comprenden células que son CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otras realizaciones, las células madre placentarias comprenden células que son OCT-4+ y que facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en una población de células placentarias que comprende la célula madre cuando dicha población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide.
Así, en una realización, la invención proporciona métodos para tratar a un neonato prematuro, que comprenden administrar al neonato prematuro sangre de cordón y células madre placentarias. En una realización específica, dichas células madre son CD200+ o HLA-G+. En una realización específica, las células madre también son CD200+ y HLA-G+. En una realización más específica, dichas células madre también son CD73+ y CD105+. En otra realización más específica, dichas células madre también son CD34-, CD38-o CD45-. En otra realización más específica, dichas células madre también son CD34-, CD38-y CD45-. En otra realización más específica, dichas células madre también son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realización específica, dichas células madre CD200+ o HLA-G+
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facilitan la formación de cuerpos de tipo embrioide en una población de células derivadas de placenta que comprende las células madre, en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide.
En otra realización específica, dichas células madre placentarias son CD73+, CD105+ y CD200+. En una realización más específica, dichas células madre también son HLA-G+. En otra realización más específica, dichas células madre también son CD34-, CD38-o CD45-. En otra realización más específica, dichas células madre también son CD34-, CD38-y CD45-. En una realización más específica, dichas células madre también son CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G+. En otra realización más específica, las células madre CD73+, CD105+, y CD200+ facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en una población de células derivadas de placenta que comprende la célula madre, cuando la población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide.
En otra realización específica, dichas células madre placentarias son CD200+ y OCT-4+. En una realización más específica, las células madre también son CD73+ y CD105+. En una realización más específica, dichas células también son HLA-G+. En otra realización específica, dicha célula madre es CD34-, CD38-o CD45-. En otra realización específica, dicha célula madre es CD34-, CD38-y CD45-. En una realización más específica, dicha célula madre es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra realización específica, las células madre placentarias facilitan la producción de uno o más cuerpos de tipo embrioide por una población de células derivadas de placenta que comprende las células madre, cuando la población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide.
En otra realización específica, dichas células madre placentarias son CD73+, CD105+ y HLA-G+. En una realización más específica, dichas células madre son CD34-, CD38-o CD45-. En una realización más específica, dichas células madre son CD34-, CD38-y CD45-. En otra realización más específica, dichas células madre CD73+, CD105+ y HLA-G+ son OCT-4+. En otra realización más específica, dicha célula madre es CD200+. En una realización más específica, dicha célula madre es CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realización más específica, dicha célula madre placentaria facilita la formación de cuerpos de tipo embrioide en una población de células placentarias que comprende dicha célula madre, cuando la población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide.
En otra realización específica, las células madre placentarias pueden ser una o más de SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+. En otra realización, las células madre placentarias son OCT-4+ y ABC-p+. En una realización, las células madre placentarias humanas no expresan antígenos de la clase II del MHC. En otras realizaciones, las células madre placentarias son una o más de CD10+, CD38-, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y/o ABC-p+.
En otra realización, las células madre placentarias son homogéneas y estériles. En otra realización específica, las células madre placentarias están presentes en una disolución de grado farmacéutico adecuada para la administración a un ser humano.
Los marcadores, tales como los marcadores de la superficie celular, se pueden determinar de manera rutinaria según métodos bien conocidos en la técnica, p.ej. mediante citometría de flujo o análisis de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) lavando y tiñendo con un anticuerpo anti-marcador de la superficie celular marcado con un fluoróforo adecuado. Por ejemplo, para determinar la presencia de CD34 o CD38, las células se pueden lavar en PBS y después aplicar una tinción doble con anti-CD34 ficoeritrina y anti-CD38 isotiocianato de fluoresceína (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Las células se analizarían después mediante el uso de un citómetro de flujo estándar. De manera alternativa, también se pueden examinar marcadores intracelulares por medio de la metodología habitual.
5.4 RECOGIDA Y CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS
Se pueden recoger y aislar células madre placentarias mediante cualquier método conocido para los expertos en la técnica. En las realizaciones preferidas, las células madre placentarias se aíslan y recogen como se describió en la patente de EE.UU. nº 7.045.148, o en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2007/0275362, presentada el 26 de diciembre de 2006. Los métodos de recogida de células madre placentarias se describen a continuación.
5.4.1 Aislamiento de Células Madre Placentarias mediante Perfusión
5.4.1.1 Pretratamiento de la Placenta
La recogida de células madre placentarias comienza con la recogida de una placenta, p.ej., una placenta humana. En ciertas realizaciones, se recupera una placenta humana poco después de su expulsión tras el parto y, en ciertas realizaciones, se recupera la sangre de cordón de la placenta. En realizaciones específicas, la placenta se somete a un proceso de recuperación de sangre de cordón convencional como complemento para el tratamiento del neonato prematuro, p.ej., la recuperación de sangre de cordón en respuesta a las necesidades del neonato prematuro particular. También se puede obtener sangre de cordón de un servicio comercial de banco de sangre de cordón, p.ej., LifeBankUSA, Cedar Knolls, N.J.
En general, la recogida de la sangre de cordón tiene lugar como sigue. Tras el parto (después de un parto por
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cesárea o parto natural), la placenta se exanguina, p.ej., se drena de la sangre de cordón. Antes de la recogida de la sangre de cordón, la placenta se puede almacenar en condiciones estériles y a una temperatura, p.ej., de 5 °C a 25 °C, o a alrededor de la temperatura ambiente. En ciertas realizaciones, se pinza el cordón umbilical proximal, preferiblemente a 4-5 cm (centímetros) desde la inserción en el disco placentario antes de la recuperación de la sangre de cordón. En otras realizaciones, se pinza el cordón umbilical proximal tras la recuperación de la sangre de cordón, pero antes del procesamiento adicional de la placenta. Se pueden usar técnicas convencionales para la recogida de sangre de cordón. En general, se usa una aguja o cánula, con la ayuda de la gravedad, para drenar la sangre de cordón (es decir, exanguinar) la placenta (véase, p.ej., Boyse et al., pat. de EE.UU. nº 5.192.553; Boyse et al., pat. de EE.UU. nº 5.004.681; Anderson, pat. de EE.UU. nº 5.372.581; Hessel et al., pat. de EE.UU. nº 5.415.665). La aguja o cánula se coloca normalmente en la vena umbilical y la placenta se masajea suavemente para facilitar el drenaje de la sangre de cordón de la placenta.
La placenta se puede almacenar después durante un periodo de 1 hora a 72 horas, preferiblemente 4 a 24 horas, antes de perfundir la placenta para retirar la sangre de cordón residual.
Después de la recogida de la sangre de cordón, la placenta se almacena preferiblemente en una disolución anticoagulante a una temperatura de 5 °C a 25 °C, p.ej., a alrededor de la temperatura ambiente. Se conocen bien en la técnica las disoluciones anticoagulantes adecuadas. Por ejemplo, se puede usar una disolución de heparina o warfarina sódica. En una realización preferida, la disolución anticoagulante comprende una disolución de heparina (1% p/p en una disolución 1:1000). La placenta drenada se almacena preferiblemente durante como máximo 36 horas antes de recoger las células madre placentarias, como se describe más adelante.
En general, una placenta se transporta desde la sala de partos o paritorio hasta otra localización, p.ej., un laboratorio, para la recogida de la sangre de cordón y/o el drenaje, y la recogida de células madre, p.ej., mediante perfusión o digestión enzimática del tejido placentario. La placenta se transporta preferiblemente en un dispositivo de transporte estéril, aislado térmicamente (manteniendo la temperatura de la placenta, p.ej., entre 20 °C y 28 °C), por ejemplo, colocando la placenta, con el cordón umbilical proximal pinzado, en una bolsa de plástico estéril con cierre de cremallera, que se coloca después en un recipiente aislado, como se muestra en las FIGS. 2a-e.
En una realización preferida, la placenta se recupera de una paciente mediante consentimiento informado, y también se obtiene un historial médico completo de la paciente antes, durante y después del embarazo, y se asocia con la placenta. Estos registros médicos se pueden usar para coordinar el uso posterior de la placenta o de las células madre recogidas de la misma. Por ejemplo, tales células madre placentarias humanas se pueden usar después fácilmente para la medicina personalizada del neonato prematuro a tratar.
5.4.1.2 Exanguinación de la Placenta y Extracción de las Células Residuales
Tras la recuperación de la sangre de cordón, las células madre placentarias se recuperan de la placenta, p.ej., mediante perfusión. En un aspecto, la placenta exanguinada se perfunde con un fluido acuoso de perfusión adecuado para extraer la sangre de cordón residual. La disolución de perfusión puede ser cualquier fluido isotónico acuoso en el que se disuelve preferiblemente un anticoagulante (p.ej., heparina, warfarina sódica). Tales fluidos isotónicos acuosos para perfusión son muy conocidos en la técnica, e incluyen, p.ej., medios nutritivos, soluciones salinas, p.ej., solución salina tamponada con fosfato o, preferiblemente, una disolución de cloruro sódico 0,9 N. El fluido de perfusión comprende preferiblemente el anticoagulante a una concentración que es suficiente para prevenir la formación de coágulos de la sangre de cordón residual. En una realización específica, se emplea una concentración de 1 a 100 unidades de heparina, preferiblemente se emplea una concentración de 1 a 10 unidades de heparina por ml. En una realización, se pueden usar inhibidores de la apoptosis, tales como depuradores de radicales libres, en particular depuradores de radicales libres de oxígeno, durante e inmediatamente después de la exanguinación, y después estos agentes se pueden eliminar mediante lavado de la placenta. De acuerdo con esta realización de la invención, la placenta aislada se puede almacenar en condiciones hipotérmicas para prevenir o inhibir la apoptosis.
Preferiblemente, antes de la recogida de las células madre placentarias, la placenta se lava, p.ej., con 10-100 mL de fluido de perfusión para retirar sustancialmente toda la sangre de cordón restante. En general, dicho lavado se lleva a cabo mediante el paso del fluido de perfusión a través de la arteria umbilical y/o la vena umbilical, mediante el uso de un flujo por gravedad en la placenta. La placenta se orienta preferiblemente (p.ej., se suspende) de tal manera que la arteria umbilical y la vena umbilical están localizadas en el punto más alto de la placenta. En una realización preferida, la arteria umbilical y la vena umbilical se conectan de manera simultánea, como se muestra en la FIG. 1, a una pipeta que se conecta por medio de un conector flexible a un depósito del fluido de perfusión. El fluido de perfusión se hace pasar a la vena y arteria umbilical y se recoge en un recipiente abierto adecuado desde la superficie de la placenta que estuvo fijada al útero de la madre durante la gestación. El fluido de perfusión también se puede introducir a través de la abertura del cordón umbilical y dejar que fluya o percole de las aberturas de la pared de la placenta que contactaba con la pared uterina materna.
En una realización preferida, el cordón umbilical proximal está pinzado durante la perfusión, y más preferiblemente, está pinzado a 4-5 cm (centímetros) de la inserción del cordón en el disco placentario.
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En una realización, se usa una cantidad suficiente de fluido de perfusión que dará como resultado la retirada de toda la sangre de cordón residual, y la recogida o recuperación posterior de las células placentarias, que incluyen, pero sin limitación, las células madre similares a las embrionarias y las células progenitoras, que permanecen en la placenta tras la retirada de la sangre de cordón.
Se ha observado que cuando se recoge primero el fluido de perfusión de una placenta durante el lavado, el fluido está coloreado con los eritrocitos residuales de la sangre de cordón. El fluido de perfusión tiende a aclararse a medida que transcurre la perfusión, y las células residuales de la sangre de cordón se eliminan mediante el lavado de la placenta. En general, son adecuados de 30 a 100 ml (mililitros) de fluido de perfusión para exanguinar la placenta y recuperar una población inicial de células similares a las embrionarias de la placenta, pero se puede usar más o menos fluido de perfusión dependiendo de los resultados observados.
5.4.1.3 Cultivo de la Placenta
En las realizaciones preferidas, la placenta se cultiva en condiciones asépticas en un recipiente u otro envase adecuado, y se perfunde con una disolución de perfundido (p.ej., una solución salina normal tal como solución salina tamponada con fosfato ("PBS"), o, preferiblemente, una solución salina 0,9 N) con o sin un anticoagulante (p.ej., heparina, warfarina sódica, cumarina, bishidroxicumarina), y/o con o sin un agente antimicrobiano (p.ej., βmercaptoetanol (0,1 mM); antibióticos tales como estreptomicina (p.ej., a 40-100 µg/ml), penicilina (p.ej., a 40 U/ml), anfotericina B (p.ej., a 0,5 µg/ml), o similares. Se pueden usar diversos medios como fluido de perfusión para cultivar la placenta, tales como DMEM, F-12 de Ham, M199, RPMI, Fisher, Iscove, McCoy y combinaciones de los mismos, complementados con suero bovino fetal (FBS), suero humano completo (WHS), o suero de cordón umbilical humano recogido en el momento de la expulsión de la placenta. El mismo fluido de perfusión usado para exanguinar la placenta de la sangre de cordón residual se puede usar para cultivar la placenta, sin la adición de agentes anticoagulantes.
El perfundido efluente comprende tanto el perfundido circulado, que ha fluido a través de la circulación placentaria, como el perfundido extravasado, que exuda desde o pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos en los tejidos circundantes de la placenta. El perfundido efluente, o perfundido circulado, o, preferiblemente, tanto el perfundido circulado como el extravasado, se recogen, preferiblemente en un receptáculo estéril. Se pueden hacer alteraciones en las condiciones en las que se mantiene la placenta y la naturaleza del perfundido para modular el volumen y la composición del perfundido efluente.
Después se aíslan los tipos celulares del perfundido recogido empleando métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo pero sin limitación, centrifugación en gradiente de densidad, separación magnética de células, clasificación de células mediante FACS, separación de células por afinidad o técnicas de adhesión diferencial.
En una realización, se coloca una placenta en un recipiente estéril y se lava con 500 ml de solución salina normal tamponada con fosfato. Después se descarta el fluido de lavado. Después se aplica una cánula a la vena umbilical, p.ej., una cánula de TEFLON® o de plástico, que se conecta a un dispositivo de conexión estéril, tal como un tubo estéril. El dispositivo de conexión estéril se conecta a un colector de perfusión, como se muestra en la FIG. 3. Después se cubre el recipiente que contiene la placenta, y la placenta se mantiene a temperatura ambiente (20-25 °C) durante un periodo deseado de tiempo, preferiblemente de 2 a 24 horas, y preferiblemente, como máximo 48 horas. La placenta se puede perfundir continuamente, usando volúmenes iguales de perfundido introducido y perfundido efluente retirado o recogido. De manera alternativa, la placenta se puede perfundir periódicamente, p.ej., cada 2 horas; a las 4, 8, 12, y 24 horas; o a otros intervalos durante el cultivo, con un volumen de perfundido, p.ej., de 100 ml de perfundido (solución salina normal estéril complementada con o sin 1000 u/l de heparina y/o EDTA y/o CPDA (fosfato de creatina-dextrosa)). En caso de perfusión periódica, preferiblemente se introducen volúmenes iguales de perfundido y se retiran del medio de cultivo de la placenta, de forma que un volumen estable de perfundido baña la placenta en todo momento.
El perfundido efluente que escapa de la placenta, p.ej., en la superficie opuesta de la placenta, se recoge y se procesa para aislar las células madre similares a las embrionarias, las células progenitoras u otras células de interés.
El número y tipo de células propagadas se puede monitorizar fácilmente midiendo los cambios en la morfología y los marcadores de la superficie celular mediante el uso de técnicas de detección de células habituales, tales como citometría de flujo, clasificación de células, inmunocitoquímica (p.ej., tinción con anticuerpos específicos de tejido o específicos de marcadores celulares), clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), clasificación de células por activación magnética (MACS), mediante examen de la morfología de las células con el uso de microscopía óptica o confocal, o midiendo los cambios en la expresión génica con el uso de métodos muy conocidos en la técnica, tales como PCR y caracterización de la expresión génica.
En una realización, las células madre placentarias se pueden clasificar mediante el uso de un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS). La clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) es un método muy conocido para separar partículas, lo que incluye células, basado en las propiedades fluorescentes de las partículas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). La excitación mediante láser de restos fluorescentes en las
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partículas individuales da como resultado una pequeña carga eléctrica que permite la separación electromagnética de las partículas positivas y negativas de una mezcla. En una realización, los anticuerpos o ligandos específicos de los marcadores de la superficie celular se marcan con diferentes marcadores fluorescentes. Las células se procesan a través del clasificador de células, lo que permite la separación de las células basándose en su capacidad de unirse a los anticuerpos usados. Las partículas clasificadas mediante FACS se pueden depositar directamente en pocillos individuales de placas de 96 pocillos o 384 pocillos para facilitar la separación y la clonación.
En otra realización, se pueden usar microesferas magnéticas para separar células. Las células se pueden clasificar mediante el uso de una técnica de clasificación de células activada magnéticamente (MACS), un método para separar partículas basándose en su capacidad de unirse a microesferas magnéticas (0,5-100 µm de diámetro). Se puede llevar a cabo una diversidad de modificaciones útiles en las microesferas magnéticas, que incluyen la adición covalente de un anticuerpo que reconoce de manera específica una molécula superficial o hapteno en fase sólida de una célula. Después se aplica un campo magnético para manipular físicamente las microesferas seleccionadas. Las microesferas se mezclan después con las células para permitir la unión. Las células se hacen pasar después a través de un campo magnético para separar las células que tienen marcadores de la superficie celular. Esta células se pueden aislar y volver a mezclar después con microesferas magnéticas acopladas a un anticuerpo hacia marcadores adicionales de la superficie celular. Las células se hacen pasar de nuevo a través de un campo magnético, que aísla las células que se han unido a ambos anticuerpos. Tales células se pueden diluir después en placas distintas, tales como placas de microtitulación para el aislamiento clonal.
En ciertas realizaciones de la invención, la placenta drenada exanguinada se cultiva como un biorreactor, es decir, un sistema ex vivo para la propagación de células madre placentarias. El número de células propagadas en el biorreactor placentario se puede mantener en un estado continuo de crecimiento equilibrado retirando periódicamente o continuamente una porción de un medio de cultivo o fluido de perfusión que se introduce en el biorreactor placentario, y del cual se pueden recuperar las células propagadas. Se introduce medio fresco o fluido de perfusión a la misma velocidad o en la misma cantidad. Para usar la placenta como biorreactor, se puede cultivar durante periodos de tiempo variables en condiciones estériles mediante perfusión con una disolución de perfundido, tal como se describe en la presente memoria. En las realizaciones específicas, la placenta se cultiva durante al menos alrededor de 12, 24, 36, o 48 horas, o durante 3-5 días, 6-10 días, o durante una a dos semanas. En una realización preferida, la placenta se cultiva durante alrededor de 48 horas. La placenta cultivada preferiblemente se "alimenta" periódicamente mediante la extracción del medio gastado y las células suspendidas en el medio, y la adición de medio fresco. La placenta cultivada se almacena preferiblemente en condiciones estériles para reducir la posibilidad de contaminación, y se mantiene con una presurización intermitente y periódica para crear condiciones que mantienen un suministro adecuado de nutrientes a las células de la placenta. La perfusión y el cultivo de la placenta se pueden automatizar y computerizar para obtener una eficacia y capacidad incrementada.
En ciertas realizaciones, las células madre placentarias se inducen a propagarse en el biorreactor de placenta mediante la introducción de nutrientes, hormonas, vitaminas, factores de crecimiento, o cualquier combinación de los mismos, en la disolución de perfusión. Se pueden añadir suero y otros factores de crecimiento a la disolución o medio de perfusión para la propagación. Los factores de crecimiento normalmente son proteínas, e incluyen, pero sin limitación: citocinas, linfocinas, interferones, factores estimulantes de colonias (CSFs), interferones, quimiocinas, e interleucinas. Otros factores de crecimiento que se pueden usar incluyen factores de crecimiento hematopoyéticos humanos recombinantes, que incluyen ligandos, factores de células madre, trombopoyetina (Tpo), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor inhibidor de leucemia, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento derivado de placenta y factor de crecimiento epidérmico.
5.4.1.4 Recogida de Células de la Placenta
Como se describió anteriormente, tras la exanguinación y la perfusión de la placenta, las células madre similares a las embrionarias migran hacia la microcirculación drenada, vacía, en la que, según los métodos de la invención, se recogen, preferiblemente mediante la recogida el perfundido efluente en un recipiente de recogida.
En las realizaciones preferidas, las células cultivadas en la placenta se aíslan del perfundido efluente mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, centrifugación en gradiente de densidad, separación magnética de células, clasificación mediante FACS, u otros métodos de separación o clasificación de células muy conocidos en la técnica, y se clasifican, por ejemplo, según el esquema mostrado en la FIG. 4.
En una realización específica, las células recogidas de la placenta se pueden recuperar del perfundido efluente mediante centrifugación, p.ej., a alrededor de 5000 X g durante alrededor de 15 minutos a temperatura ambiente, que separa las células de los restos y plaquetas contaminantes. Los sedimentos celulares se resuspenden, p.ej., en medio sin suero IMDM que contiene 2 U/ml de heparina y EDTA 2 mM (GibcoBRL, NY). La fracción total de células mononucleares se puede aislar mediante el uso de aféresis, preferiblemente mediante el uso de un kit comercial de recogida tal como LYMPHOPREP™ (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega). Las células se cuentan después mediante el uso, p.ej., de un hemocitómetro. La viabilidad se estudia en general mediante exclusión de azul tripán. El aislamiento de las células se consigue preferiblemente mediante "tripsinización diferencial", con el uso de una disolución, p.ej., del 0,05% de tripsina con un 0,2% de EDTA (Sigma, St. Louis, Mo.). La tripsinización diferencial es
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posible porque las células fibroblastoides tripsinizadas de esta manera se desprenden de las superficies de plástico del cultivo celular en alrededor de cinco minutos, mientras otras poblaciones adherentes requieren más de alrededor de 20-30 minutos de incubación con tripsina. Las células fibroblastoides desprendidas se recogen tras la tripsinización y la neutralización de la tripsina, mediante el uso de una disolución neutralizante de tripsina (TNS, BioWhittaker). Las células se pueden lavar después en un medio nutritivo tal como H.DMEM, y se resuspenden, p.ej., en MSCGM.
En otra realización, la placenta aislada se perfunde durante un periodo de tiempo sin recoger el perfundido, de forma que la placenta se puede perfundir durante 2, 4, 6, 8, 10, 12, 20 o 24 horas o incluso días antes de recoger el perfundido. En tales realizaciones, por ejemplo, se puede introducir el fluido de perfusión en la placenta y dejar que ocupe la vasculatura placentaria durante un tiempo antes de la recogida, o en el caso de un perfundido recirculado, se puede recircular el fluido de perfusión durante dicho tiempo.
En otra realización, las células cultivadas en el biorreactor de placenta se aíslan de la placenta diseccionando físicamente las células de la placenta.
En otra realización, las células cultivadas en el biorreactor de placenta se aíslan de la placenta disociando los tejidos de la placenta o una porción de la misma, y recuperando las células cultivadas mediante métodos de separación o clasificación de células conocidos en la técnica, tales como centrifugación en gradiente de densidad, separación magnética de células, clasificación mediante FACS, etc.
En una realización preferida, la perfusión de la placenta y la recogida del perfundido efluente se repite una vez o dos veces durante el cultivo de la placenta, hasta que el número de células nucleadas recuperadas cae por debajo de 100 células/ml. Los perfundidos se mezclan y se someten a centrifugación ligera para eliminar las plaquetas, los restos y las membranas celulares anucleadas. Las células nucleadas se aíslan después mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque y después de lavarlas se resuspenden en HDMEM. Para el aislamiento de las células adherentes, se colocan alícuotas de 5-10 x 106 células en varios matraces T-75 y se cultivan con medio de crecimiento de células madre mesenquimatosas (MSCGM) disponible comercialmente obtenido de BioWhittaker, y se colocan en un incubador de cultivo de tejidos (37 °C, 5% de CO2). Después de 10 a 15 días, las células no adherentes se retiran de los matraces lavando con PBS. El PBS se sustituye después por MSCGM. Los matraces preferiblemente se examinan diariamente con respecto a la presencia de diversos tipos de células adherentes y, en particular, para la identificación y expansión de agrupamientos de células fibroblastoides.
En otras realizaciones, las células recogidas de la placenta se crioconservan para el uso en un momento posterior. Los métodos para la crioconservación de células, tales como las células madre, son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, la crioconservación mediante el uso de los métodos de Boyse et al. (pat. de EE.UU. nº 5.192.553, expedida el 9 de marzo de 1993) o Hu et al. (documento WO 00/73421, publicado el 7 de dic. de 2000).
5.4.2 Aislamiento de Células Madre Placentarias Mediante Disociación Física
Las células madre placentarias se pueden recoger de una placenta mamífera mediante disociación física, p.ej., digestión enzimática, del órgano. Por ejemplo, la placenta, o una porción de la misma, se puede, p.ej., triturar, cortar, trocear, cortar en dados, picar, macerar o similares, aunque en contacto con la composición de recogida de célula madre de la invención, y el tejido posteriormente se digiere con una o más enzimas. La placenta, o una porción de la misma, también se puede disociar físicamente y digerirla con una o más enzimas, y el material resultante se sumerge después, o se mezcla, en la composición de recogida de células madre de la invención. Se puede usar cualquier método de disociación física, con tal de que el método de disociación proporcione una diversidad, más preferiblemente una mayoría, y más preferiblemente al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% de células viables de dicho órgano, tal como se determina, p.ej., mediante exclusión con azul tripán.
La placenta se puede diseccionar en componentes antes de la disociación física y/o la digestión enzimática y la recuperación de las células madre. Por ejemplo, las células madre derivadas de placenta se pueden obtener de la membrana amniótica, corion, cordón umbilical, cotiledones placentarios, o cualquier combinación de los mismos. Preferiblemente, las células madre derivadas de placenta se obtienen de tejido placentario que comprende amnios y corion. En general, las células madre derivadas de placenta se pueden obtener mediante disociación de un pequeño bloque de tejido placentario, p.ej., un bloque de tejido placentario que tiene un volumen de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100.200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 milímetros cúbicos.
Una composición preferida de recogida de células madre comprende una o más enzima(s) de disociación de tejidos. La digestión enzimática usa preferiblemente una combinación de enzimas, p.ej., una combinación de una metaloproteasa de la matriz y una proteasa neutra, por ejemplo, una combinación de colagenasa y dispasa. En una realización, la digestión enzimática del tejido placentario usa una combinación de una metaloproteasa de la matriz, una proteasa neutra, y una enzima mucolítica para la digestión de ácido hialurónico, tal como una combinación de colagenasa, dispasa, y hialuronidasa o una combinación de LIBERASE® (Boehringer Mannheim Corp., Indianápolis, Ind.) y hialuronidasa. Otras enzimas que se pueden usar para disociar el tejido placentario incluyen papaína, desoxirribonucleasas, serinproteasas, tales como tripsina, quimotripsina, o elastasa. Las serinproteasas se pueden inhibir mediante alfa 2 microglobulina del suero, y por lo tanto el medio usado para la digestión normalmente carece
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de EE.UU. nºs 5.709.854; 5.516.532; 5.654.381.
En otra realización, la invención proporciona el mantenimiento de cada población de células madre de la sangre de cordón umbilical y las células madre placentarias combinadas, antes de la administración a un individuo, en forma de composiciones farmacéuticas diferentes a administrar de manera secuencial o conjuntamente para crear la población de células madre combinadas in vivo. Cada componente se puede almacenar y/o usar en un recipiente diferente, p.ej., una única bolsa (p.ej., bolsa de almacenamiento de sangre de Baxter, Becton-Dickinson, Medcep, National Hospital Products, Terumo, etc.) o jeringa distinta, que contiene un único tipo de célula o población de células. En una realización específica, la sangre de cordón, o las células madre o células nucleadas derivadas de sangre de cordón, están contenidas en una bolsa, y el perfundido placentario, o las células madre placentarias del perfundido placentario, están contenidas en una segunda bolsa.
Se puede enriquecer una población de células madre placentarias. En una realización específica, se enriquece una población de células que comprende células madre placentarias mediante la retirada de eritrocitos y/o granulocitos según los métodos habituales, de forma que la población restante de células nucleadas se enriquece en células madre placentarias respecto de otros tipos de células del perfundido placentario. Tal población enriquecida de células madre placentarias se puede usar sin congelar, o se puede congelar para su uso posterior. Si la población de células se va a congelar, se añade un crioconservante habitual (p.ej., DMSO, glicerol, medio de congelación de células Epilife™ (Cascade Biologics) a la población enriquecida de células antes de congelarla.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender uno o más agentes que inducen la diferenciación celular. En ciertas realizaciones, un agente que induce la diferenciación incluye, pero sin limitación, Ca2+, EGF, α-FGF, β-FGF, PDGF, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), TGF-β, citocinas (p.ej., IL-1α, IL1β, IFN-γ, TFN), ácido retinoico, transferrina, hormonas (p.ej., andrógeno, estrógeno, insulina, prolactina, triyodotiroxina, hidrocortisona, dexametasona), butirato sódico, TPA, DMSO, NMF, DMF, elementos de la matriz (p.ej., colágeno, laminina, sulfato de heparano, Matrigel™), o combinaciones de los mismos.
En otra realización, la composición farmacéutica de la invención puede comprender uno o más agentes que inhiben la diferenciación celular. En ciertas realizaciones, un agente que inhibe la diferenciación incluye, pero sin limitación, los polipéptidos humanos Delta-1 y Serrate-1 (véase, Sakano et al., patente de EE.UU. nº 6.337.387), factor inhibitorio de leucemia (LIF), factor de células madre, o combinaciones de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden tratar antes de la administración a un individuo con un compuesto que modula la actividad de TNF-α. Tales compuestos preferidos se describen con detalle, p.ej., en la publicación de solicitud de EE.UU. nº 2003/0235909. Los compuestos preferidos se denominan IMiDs (compuestos inmunomoduladores) y SELCIDS® (fármacos inhibitorios selectivos de citocinas), y en particular los compuestos preferidos están disponibles con los nombres comerciales ACTIMID™, REVIMID™ y REVLIMID™.
6. Ejemplos
6.1 EJEMPLO 1: RECOGIDA DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL Y CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS
Este ejemplo ilustra la recogida de sangre de cordón umbilical y células madre placentarias.
6.1.1 Recogida de Sangre de Cordón Umbilical
Se recoge sangre de cordón umbilical mediante el uso de un kit de recogida de sangre de cordón umbilical tal como se describió en la publicación de solicitud de pat. de EE.UU. nº 2006/0060494, titulada "Kit de Recogida de Sangre de Cordón y Métodos de Uso del Mismo".
Se usan kits de recogida, que contienen compresas, gasas estériles, torundas con povidona yodada, almohadillas estériles con alcohol, pinzas de plástico para sangre de cordón umbilical, pinzas para portaobjetos o pinzas hemostáticas y recipientes o bolsas resellables herméticas estándar.
La recogida se puede llevar a cabo antes de la expulsión de la placenta (recogida in útero), tras la expulsión de la placenta (recogida ex útero) o durante una cesárea, antes de la expulsión de la placenta.
Brevemente, se esteriliza el sitio de venopunción en el sitio distal del cordón umbilical. Se pinza el tubo de recogida que conduce desde la bolsa grande de recogida, se retira el capuchón de la aguja, y se canula la vena umbilical con el bisel de la aguja hacia abajo hacia la vena umbilical. La pinza se retira para permitir que fluya la sangre, y la bolsa de recogida se coloca por debajo del sitio de canulación para permitir que la sangre llene la bolsa de recogida por gravedad.
Cuando el flujo sanguíneo se detiene, el sitio de venopunción se pinza y la aguja se extrae de la vena umbilical. La bolsa de recogida se etiqueta y se coloca en el recipiente de envío aislado.
La placenta con la sangre de cordón umbilical pinzada se coloca en la bolsa resellable hermética, y la bolsa se sella después de manera adecuada y se etiqueta.
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Tras la recogida, se determina la viabilidad de las células de sangre de cordón umbilical mediante un hemocitómetro tras tinción con azul tripán.
6.1.2 Aislamiento de las Células Madre Placentarias
Tras la exanguinación del cordón umbilical y la placenta, la placenta se colocó en un recipiente estéril, aislado, a temperatura ambiente y se transportó al laboratorio en 4 horas desde el parto. Las placentas se descartaron si, al inspeccionarlas, hubo indicios de daños físicos, tales como fragmentación del órgano o avulsión de los vasos umbilicales. Las placentas se mantuvieron a temperatura ambiente (23±2 °C) o refrigeradas (4 °C) en recipientes estériles durante 2 a 20 horas. Periódicamente, las placentas se sumergieron y se lavaron en solución salina estéril a 25±3 °C para eliminar cualquier sangre superficial o restos visibles. El cordón umbilical se cortó transversalmente aproximadamente a 5 cm de su inserción en la placenta, y los vasos umbilicales se canularon con catéteres de polímero TEFLON® o polipropileno conectados a una vía de fluido estéril que permitía la perfusión bidireccional de la placenta y la recuperación del fluido efluente. El sistema empleado en la presente invención posibilitó que todos los aspectos del acondicionamiento, la perfusión y la recogida del efluente se llevasen a cabo en condiciones atmosféricas de ambiente controlado, así como la monitorización en tiempo real de la presión intravascular y los caudales, las temperaturas del núcleo y del perfundido, y los volúmenes recuperados de efluente. Se evaluó una diversidad de protocolos de acondicionamiento a lo largo de un periodo puerperal de 24 hora, y se analizó la composición celular del fluido efluente mediante citometría de flujo, microscopía óptica y ensayos de unidades formadoras de colonias.
Acondicionamiento Placentario: La placenta se mantuvo en condiciones variables en un intento de simular y mantener un medio fisiológicamente compatible para la proliferación y la recuperación de las células residuales. La cánula se lavó con medio sin suero IMDM (GibcoBRL, NY) que contenía 2 U/ml de heparina (EJkins-Sinn, NJ). La perfusión de la placenta continuó a una velocidad de 50 mL por minuto hasta que se recogieron aproximadamente 150 mL de perfundido. Este volumen de perfundido se etiquetó como "fracción temprana". La perfusión continuada de la placenta a la misma velocidad dio como resultado la recogida de una segunda fracción de aproximadamente 150 mL, y se etiquetó como "fracción tardía". Durante el desarrollo del procedimiento, la placenta se masajeó suavemente para ayudar en el proceso de perfusión, y ayudar en la recuperación del material celular. El fluido efluente se recogió del circuito de perfusión mediante drenaje por gravedad y aspiración a través de la cánula arterial.
Las placentas se obtuvieron de la sala de partos junto con la sangre de cordón tras la obtención de un consentimiento parental por escrito, y se procesaron a temperatura ambiente en 12 a 24 horas tras el parto. Antes del procesamiento, las membranas se retiraron y el lado materno se lavó de sangre residual. Los vasos umbilicales se canularon con catéteres hechos de agujas de mariposa de 0,8 mm (20 gauge) usadas para la recogida de muestras de sangre. Las placentas se perfundieron después con medio de Eagle modificado por Dulbecco heparinizado (H.DMEM) (2 U/mL) a un caudal de 15 mL/minuto durante 10 minutos, y los perfundidos se recogieron de los lados maternos en una hora, y se contaron las células nucleadas. Los procedimientos de perfusión y recogida se repitieron una vez o dos veces, hasta que el número de células nucleadas recuperadas cayó por debajo de 100/mL. Los perfundidos se mezclaron y se sometieron a centrifugación ligera para eliminar las plaquetas, los restos y las membranas celulares anucleadas. Las células nucleadas se aislaron después mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque y después de lavarlas se resuspenden en H.DMEM. Para el aislamiento de las células adherentes, se colocaron alícuotas de 5-10x106 células en varios matraces T-75 y se cultivaron con medio de crecimiento de células madre mesenquimatosas (MSCGM) disponible comercialmente obtenido de BioWhittaker, y se colocaron en un incubador de cultivo de tejidos (37 °C, 5% de CO2). Después de 10 a 15 días, las células no adherentes se eliminaron lavando con PBS, que después se sustituyó por MSCGM. Los matraces se examinaron diariamente con respecto a la presencia de diversos tipos de células adherentes y, en particular, para la identificación y expansión de agrupamientos de células fibroblastoides.
Recuperación y Aislamiento de Células: Las células se recuperaron de los perfundidos mediante centrifugación a 100 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Este procedimiento sirvió para separar las células de los restos contaminantes y las plaquetas. Los sedimentos celulares se resuspendieron en medio sin suero IMDM que contenía 2 U/ml de heparina y EDTA 2 mM (GibcoBRL, NY). La fracción de células mononucleares totales se aisló mediante el uso de LYMPHOPREP™ (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) según el procedimiento recomendado por el fabricante, y se resuspendió la fracción de células mononucleares. Las células se contaron mediante el uso de un hemocitómetro. La viabilidad se estudió mediante exclusión de azul tripán. El aislamiento de las células mesenquimatosas se consiguió mediante tripsinización diferencial con el uso de una disolución del 0,05% de tripsina con un 0,2% de EDTA (Sigma). La tripsinización diferencial fue posible porque las células fibroblastoides, lo que incluye las células madre placentarias, se desprendieron de las superficies de plástico en alrededor de cinco minutos, mientras las otras poblaciones adherentes necesitaron más de 20-30 minutos de incubación. Las células fibroblastoides desprendidas se recogieron tras la tripsinización y la neutralización de la tripsina, mediante el uso de una Disolución Neutralizante de Tripsina (TNS, BioWhittaker). Las células se lavaron en H.DMEM y se resuspendieron en MSCGM. Se llevó a cabo una citometría de flujo mediante el uso de un instrumento FACSCalibur de Becton-Dickinson. Se adquirieron anticuerpos monoclonales marcados con FITC y PE, que incluyeron anticuerpos hacia CD10, CD 34, CD44, CD45, CD54, CD90, SSEA3, y SSEA4, de Becton-Dickinson y Caltag Laboratories (S. San Francisco, CA.), u otros proveedores, y se obtuvieron hibridomas productores de anticuerpos
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SH2, SH3 y SH4 de la American Type Culture Collection, y se detectaron las reactividades de los anticuerpos monoclonales en sus sobrenadantes cultivados mediante anticuerpos anti-ratón de cabra F(ab)'2 marcados con FITC o PE. La diferenciación del linaje se llevó a cabo mediante el uso de los medios de cultivo para la inducción y el mantenimiento disponibles comercialmente (BioWhittaker), usados según las instrucciones del fabricante.
Aislamiento de las Células Madre Placentarias: El examen microscópico de las células adherentes en los matraces de cultivo reveló tipos celulares morfológicamente diferentes, que incluyeron células fusiformes, células redondas con grandes núcleos y numerosas vacuolas pequeñas perinucleares, y células con forma de estrella con varias proyecciones, por medio de una de las cuales las células estaban unidas al matraz. Se observaron células similares distintas de las células madre en el cultivo de médula ósea, cordón y sangre periférica; por lo tanto, se consideró que estas células fueron de naturaleza distinta de las célula madre. Las células fibroblastoides, que aparecieron por último en forma de agrupamientos, fueron candidatos a ser células madre similares a mesenquimatosas, y se aislaron mediante tripsinización diferencial y se subcultivaron en matraces secundarios. La fase de microscopía de fases postripsinización de las células redondeadas reveló que las células estuvieron sumamente granuladas, y fueron similares a las MSC derivadas de médula ósea producidas en el laboratorio o adquiridas de fuentes comerciales. Cuando se subcultivaron, las células madre placentarias, en contraste con su fase anterior, se adhirieron en horas, asumiendo una forma fibroblastoide característica, y formaron un patrón de crecimiento idéntico a las MSC derivadas de médula ósea de referencia. Además, durante el subcultivo y la realimentación, las células mononucleares unidas débilmente se eliminaron mediante lavado, y los cultivos permanecieron homogéneos y desprovistos de cualquier contaminante visible de células no fibroblastoides.
Citometría de Flujo: La expresión de marcadores superficiales de células madre placentarias, que incluyen CD10, CD29, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD90, SSEA3 y SSEA4, se analizó mediante citometría de flujo. La expresión de OCT-4 y ABC-p se analizó mediante RT-PCR con el uso de cebadores conocidos de estos marcadores.
6.2 EJEMPLO 2: TRATAMIENTO DE NEONATOS PREMATUROS CON SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL Y CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS
Seis neonatos prematuros nacidos a una edad gestacional de entre 23 semanas y 36 semanas que exhibían Síndrome de Dificultad Respiratoria (SDR) o Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (SDRA), anemia, hemorragia intraventricular, enterocolitis necrosante, retinopatía de la prematuridad, enfermedad pulmonar crónica (displasia broncopulmonar), una infección, conducto arterial persistente, apnea, tensión arterial baja, hiperbilirrubinemia, desarrollo incompleto del pulmón, ojo, sistema inmunitario, cerebro, corazón, hígado o riñón se tratan con sangre de cordón umbilical y células madre placentarias.
La sangre de cordón umbilical se recoge como se describió en el Ejemplo 1, y las células madre placentarias se obtienen mediante perfusión o digestión enzimática, como se describió en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2007/0275362, presentada el 26 de diciembre de 2006. La sangre de cordón umbilical y las células madre placentarias se combinan en una proporción de 1:1. La sangre de cordón umbilical y las células madre placentarias se caracterizan mediante análisis FACS. Las células de cordón umbilical y las células madre placentarias se inyectan de manera intravenosa a los neonatos prematuros a dosis de 1 x 105 a 1 x 106 células CD34+ por kilogramo de peso corporal de los neonatos prematuros una semana después del parto y dos semanas después del parto.
Antes y después de la administración de la sangre de cordón umbilical y las células madre placentarias, se mide la tensión arterial, la frecuencia cardiaca, la frecuencia respiratoria, y recuentos de los diversos tipos de células sanguíneas de los neonatos prematuros.
6.3 EJEMPLO 3: CARACTERIZACIÓN DE LAS CÉLULAS DE SANGRE DE CORDÓN Y DE PERFUNDIDO PLACENTARIO
Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para demostrar la viabilidad de la producción de PPH y SCU combinadas a partir de una placenta prematura, y para determinar la composición celular del producto combinado en comparación con las células aisladas a partir de una placenta a término.
Los resultados en conjunto demuestran que (1) es viable recoger PPH y SCU de una placenta prematura; (2) el contenido de células nucleadas totales aisladas de una placenta prematura es comparable al de las aisladas de una placenta a término; (3) El contenido de CNT de PPH/SCU aislados de una placenta prematura es significativamente mayor que el mostrado en una placenta a término cuando se normaliza respecto de un peso similar; (4) la composición celular de las células sanguíneas de cordón umbilical aisladas de una placenta prematura es diferente que la de la placenta a término; la cantidad de células CD38+CD45+ es mayor de manera estadísticamente significativa en una placenta a término en comparación con una placenta prematura (valor de p 0,0146), mientras la cantidad de células CD38-CD45-es mayor de manera estadísticamente significativa en una placenta prematura (valor de p 0,0335); y (5) la composición celular del PPH aislado de una placenta prematura no es significativamente diferente de la de una placenta a término.
Es factible generar células madre de PPH y SCU a partir de una placenta prematura en cantidades que superan sustancialmente los métodos convencionales de aislamiento de células madre de SCU. El producto celular
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combinado debería ser útil para tratar las complicaciones asociadas al parto prematuro, ya que podría ser una fuente abundante de varias células progenitoras con capacidad trófica para proteger de la muerte celular endógena contra la hipoxia, y con capacidad de diferenciación para formar células sanguíneas, angiogénicas y neuronales in vivo.
6.3.1 Métodos:
Sujetos: Se incorporaron al estudio mujeres que esperaban cesáreas electivas en la clínica prenatal, y las que tenían partos espontáneos se incorporaron en la sala de partos.
Recogida de sangre de cordón y placenta: La placenta se recogió, y el cordón umbilical se cortó y se pinzó. Se drenó tanta sangre de cordón como fue posible del cordón umbilical. El cordón se pinzó después de nuevo para impedir la pérdida de más sangre, y la placenta y la sangre de cordón se enviaron inmediatamente al laboratorio.
Procesamiento de laboratorio: Al llegar al laboratorio, en 10-15 minutos desde el momento del parto), se pesó la placenta y se retiraron las membranas placentarias. La placenta y el cordón se analizaron para ver si son adecuadas para la perfusión, p.ej., que el cordón esté completamente unido a la placenta y que no haya signos de desgarros, y también que no haya desgarros profundos en la placenta. La placenta se cubre después con la disolución de conservación. La placenta se coloca después en un refrigerador durante 48 horas. Se utilizó inmediatamente una muestra de sangre de cordón en análisis Cell-Dyn y FACS.
Perfusión placentaria: Se perfundieron las placentas, y el perfundido se crioconservó. Se llevaron a cabo perfusiones con una presión controlada mediante el uso de una bomba peristáltica programable Masterflex L/S 7523. Se insertó un catéter umbilical en cada vena del cordón umbilical de la placenta, y se conectó a una válvula de tres vías. Este montaje se conectó después a un transductor de presión desechable DPT100 de Utah Medical, y después a un tubo de bomba peristáltica Masterflex L/S 16, que a su vez se conectó a una bolsa de solución salina de grado inyectable. Se insertó un tubo desde una bolsa de recogida de sangre en la vena umbilical para recoger la sangre placentaria. El programa informático Labview monitorizó la presión de la perfusión, y la bomba Masterflex se ajustó manualmente a la presión deseada. Las perfusiones se limitaron a 3 horas, con análisis de volumen y NOC completados después de cada hora de perfusión.
Ensayo de viabilidad de las células de perfundido de placenta: Las bolsas que contenían el perfundido placentario humano (PPH) se mezclaron cuidadosamente, y se retiró una alícuota pequeña del PPH de la bolsa. Después se lisaron los eritrocitos contaminantes tratando la muestra con ácido acético. Tras completarse la lisis celular de los eritrocitos, cada muestra se sometió a tinción con Azul Tripán o recuento mediante un aparato Cell Dyne 3200. Para determinar el porcentaje de células viables, se determinó el número de células intactas en un campo microscópico que excluían la captación de Azul Tripán por triplicado. El número de células viables se dividió por el número de células totales multiplicado por 100.
Citometría de Flujo: Se llevaron a cabo estudios de citometría de flujo mediante el uso de células de PPH o SCU o combinadas con el uso de los siguientes anticuerpos:
Tubo
FL1 -FITC o Alexa488 FL2 -PE FL3 PerCP FL4 APC o Alexa647 FL5 PE-CY7 APC-CY7 o APC Alexa750 FL6 Pacific Blue
1
PS 235a 7AAD 38 34 45
2
90 133 69 38 34 45
3
44 117 7AAD 105 34 45
Las células se lavaron con tampón, y después se resuspendieron a un intervalo de concentraciones ajustado (es decir, 1x106 células vivas por 100 µL) en tampón. Las células se tiñeron después con anticuerpos conjugados a restos fluorescentes, se incubaron, y después se lavaron con tampón para eliminar los anticuerpos en exceso. Las células teñidas se ensayaron en un citómetro de flujo para determinar la expresión positiva o negativa de los marcadores de interés.
6.3.2 Resultados
Se descubrió que las placentas prematuras y a término tuvieron pesos significativamente diferentes (medias de 345 g y 731 g, respectivamente; p = 0,0001). Se descubrió que la viabilidad de las células de placentas prematuras y a término no difirió significativamente (viabilidades del 93,13% y 90,84%, respectivamente; p = 0,0724). Sin embargo, las células de sangre de cordón nucleadas totales obtenibles de placentas prematuras sí difirieron significativamente (p = 0,0001). Se obtuvo una media de 5,277 x 107 células de las placentas prematuras, y se obtuvo una media de 1,9498 x 108 células de las placentas a término. De forma similar, las células de perfundido nucleadas totales obtenibles de placentas prematuras sí difirieron significativamente (p = 0,0016). Se obtuvo una media de 1,28 x 107 células de placentas prematuras, y se obtuvo una media de 3,76 x 107 células de placentas a término. Así, el número de células nucleadas obtenibles por gramo de tejido placentario fue significativamente mayor para las placentas prematuras que para las placentas a término (p = 0,0001). Las células nucleadas totales de perfundido + sangre de cordón que se pueden obtener de una placenta prematura es 1,79 x 108, comparado con 5,71 x 108 para una
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