ES2666351T3 - Composition and method of stem cells for the preservation of heart tissue - Google Patents
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Abstract
Método para mejorar la supervivencia de células madre hematopoyéticas en condiciones hipóxicas y privadas de suero cultivando las células en un medio que contiene ácido lisofosfatídico.Method to improve the survival of hematopoietic stem cells in hypoxic and serum-deprived conditions by culturing the cells in a medium containing lysophosphatidic acid.
Description
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DESCRIPCIONDESCRIPTION
Composición y método de células madre para la preservación del tejido cardíaco Campo técnicoComposition and method of stem cells for the preservation of heart tissue Technical field
La divulgación se refiere a una composición y método de células madre hematopoyéticas humanas tratadas con ácido lisofosfatídico que mejora la supervivencia en hipoxia y condiciones privadas de suero y preserva el tejido cardíaco después de un infarto de miocardio.The disclosure refers to a composition and method of human hematopoietic stem cells treated with lysophosphatidic acid that improves survival in hypoxia and deprived serum conditions and preserves heart tissue after myocardial infarction.
Antecedentes de la invenciónBackground of the invention
La enfermedad cardíaca es la principal causa de muerte y discapacidad tanto en las naciones industrializadas como en el mundo en desarrollo, y representa aproximadamente el 40% de toda la mortalidad humana. Muchos pacientes que sobreviven desarrollan una forma crónica de enfermedad cardíaca llamada insuficiencia cardíaca congestiva (CHF), que se asocia con un deterioro progresivo del músculo cardíaco, formación de cicatriz, dilatación y disfunción del ventrículo izquierdo (LV). Los pacientes con insuficiencia cardíaca isquémica severa tienen una alta morbilidad y mortalidad, siendo el trasplante cardíaco la única terapia definitiva disponible.Heart disease is the leading cause of death and disability in both industrialized nations and in the developing world, and accounts for approximately 40% of all human mortality. Many surviving patients develop a chronic form of heart disease called congestive heart failure (CHF), which is associated with progressive deterioration of the heart muscle, scar formation, dilation and left ventricular dysfunction (LV). Patients with severe ischemic heart failure have high morbidity and mortality, with heart transplantation being the only definitive therapy available.
Recientemente, se han probado diferentes fuentes de células madre en pacientes humanos que padecieron un MI (infarto de miocardio), incluyendo células madre adultas de sangre periférica (APBSC) y células madre derivadas de médula ósea (BMDSC) (Losordo, DW, et. al., Intrarnyocardial Transplantation of autologous CD34+ stem cells for intractable angina: a phase I/IIa double-blind, randomized Controlled trial. Circulation, 2007. 115 (25): páginas 316572; Schachinger, V., et al., Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med, 2006. 355 (12): páginas 1210-21). La mejora en la fracción de eyección del LV se ha informado en la mayoría de los ensayos (Schachinger, V., et al., Intracoronary bone marrowderived progenitor cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med, 2006. 355 (12): páginas 1210-21, Passier, R., LW van Laake, y CL Mummery, Stem-cell- based therapy and lessons from the heart. Nature, 2008. 453 (7193): páginas 322-9); sin embargo, la mejoría funcional es aún modesta (fracción de eyección por debajo del 5%). Por lo tanto, existe la necesidad de enfoques alternativos para (i) aumentar el efecto terapéutico de las células madre y para (ii) tratar a los pacientes viejos que tienen células madre adultas con actividad biológica deteriorada (por ejemplo, pacientes diabéticos, etc.) (Passier, R., LW van Laake, y CL Mummery, Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature, 2008. 453 (7193): página 322-9).Recently, different sources of stem cells have been tested in human patients who suffered an MI (myocardial infarction), including adult peripheral blood stem cells (APBSC) and bone marrow derived stem cells (BMDSC) (Losordo, DW, et. al., Intrarnyocardial Transplantation of autologous CD34 + stem cells for intractable angina: a phase I / IIa double-blind, randomized Controlled trial Circulation, 2007. 115 (25): pages 316572; Schachinger, V., et al., Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction.N Engl J Med, 2006. 355 (12): pages 1210-21). The improvement in the ejection fraction of the LV has been reported in most trials (Schachinger, V., et al., Intracoronary bone marrowderived progenitor cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med, 2006. 355 (12): pages 1210-21, Passier, R., LW van Laake, and CL Mummery, Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature, 2008. 453 (7193): pages 322-9); however, the functional improvement is still modest (ejection fraction below 5%). Therefore, there is a need for alternative approaches to (i) increase the therapeutic effect of stem cells and to (ii) treat older patients who have adult stem cells with impaired biological activity (eg, diabetic patients, etc.). ) (Passier, R., LW van Laake, and CL Mummery, Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature, 2008. 453 (7193): page 322-9).
Las células CD34+ aisladas de sangre de cordón umbilical humano pueden ser una terapia celular promisoria para la regeneración del corazón. Estas células madre pueden usarse en forma autóloga, pueden diferenciarse en células vasculares in vitro o in vivo (Le Ricousse-Roussanne, S., et al., Ex vivo differentiated endothelial and smooth muscle cells from human cordblood progenitors home to the angiogenic tumor vasculature. Cardiovasc Res, 2004. 62 (1): páginas 176-84) y aumentan la neovascularización en modelos animales de isquemia miocárdica (Ma, N., et al., Human cord blood cells induce angiogenesis following myocardial infarction in NOD/scid-mice. Cardiovasc Res, 2005. 66 (1): páginas 45-54; Hirata, Y., et al., Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 327 (2): páginas 609-14). Las células CD34+ aisladas de sangre de cordón umbilical humano tienen varias ventajas en comparación con APBSC y BMDSC, incluida una mayor tasa de proliferación, riesgo relativamente bajo de producción de células no deseadas in vivo (en oposición a los riesgos descritos para BMDSC), y una terapia celular adecuada para pacientes que padecieron un MI y tienen células CD34+ de sangre periférica humana con función alterada [5, 10]. Para la eficacia clínica, es imperativo que las células madre o sus progenies sobrevivan e injerten en el tejido del huésped. Desafortunadamente, muchas células mueren pocos días después del injerto (Ma, N., et al., Human cord blood cells induce angiogenesis following myocardial infarction in NOD/scid-mice. Cardiovasc Res, 2005. 66 (1): página 45- 54; Hirata, Y., et al., Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 327 (2): páginas 609-14; Henning, RJ, et al., Human umbilical cord blood progenitor cells are attracted to infarcted myocardium and significantly reduce myocardial infarction size. Cell Transplant, 2006. 15 (7): páginas 647-58).CD34 + cells isolated from human umbilical cord blood can be a promising cell therapy for heart regeneration. These stem cells can be used autologously, they can differentiate into vascular cells in vitro or in vivo (Le Ricousse-Roussanne, S., et al., Ex vivo differentiated endothelial and smooth muscle cells from human cordblood progenitors home to the angiogenic tumor vasculature Cardiovasc Res, 2004. 62 (1): pages 176-84) and increase neovascularization in animal models of myocardial ischemia (Ma, N., et al., Human cord blood cells induces angiogenesis following myocardial infarction in NOD / scid- mice Cardiovasc Res, 2005. 66 (1): pages 45-54; Hirata, Y., et al., Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 327 (2): pages 609-14). CD34 + cells isolated from human umbilical cord blood have several advantages compared to APBSC and BMDSC, including a higher proliferation rate, relatively low risk of unwanted cell production in vivo (as opposed to the risks described for BMDSC), and an adequate cell therapy for patients who suffered an MI and have human peripheral blood CD34 + cells with impaired function [5, 10]. For clinical efficacy, it is imperative that the stem cells or their progeny survive and graft into the host tissue. Unfortunately, many cells die a few days after grafting (Ma, N., et al., Human cord blood cells induces angiogenesis following myocardial infarction in NOD / scid-mice. Cardiovasc Res, 2005. 66 (1): page 45-54 ; Hirata, Y., et al., Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 327 (2): pages 609-14; Henning, RJ, et al., Human umbilical cord blood progenitor cells are attracted to infarcted myocardium and significantly reduce myocardial infarction size.Cell Transplant, 2006. 15 (7): pages 647-58).
Descripción generalGeneral description
Un aspecto de la presente divulgación describe un método para potenciar la supervivencia de células madre hematopoyéticas, preferiblemente CD34+ derivadas de cordón umbilical humano o sangre periférica, en condiciones hipóxicas y privadas de suero cultivando las células en medio que contiene ácido lisofosfatídico, preferiblemente que comprende además un gel, a saber, un gel biomimético.One aspect of the present disclosure describes a method to enhance the survival of hematopoietic stem cells, preferably CD34 + derived from human umbilical cord or peripheral blood, under hypoxic and serum-deprived conditions by culturing the cells in medium containing lysophosphatidic acid, preferably further comprising a gel, namely a biomimetic gel.
Esta combinación mejoró sorprendentemente la supervivencia en condiciones de hipoxia y privación de suero y conserva el tejido cardíaco después de un infarto de miocardio. Esta mezcla, especialmente CD34+ derivadas de sangre de cordón umbilical humano tratadas con ácido lisofosfatídico en fibrina, mostró mejores resultados.This combination surprisingly improved survival in hypoxia and serum deprivation conditions and preserves heart tissue after myocardial infarction. This mixture, especially CD34 + derived from human umbilical cord blood treated with lysophosphatidic acid in fibrin, showed better results.
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En una realización del método divulgado, el gel biomimético puede ser al menos uno de los siguientes: fibrina, ácido hialurónico, alginato, agarosa, colágeno, derivados de PEG y sus mezclas. Preferiblemente, gel de fibrina, más preferiblemente, el gel de fibrina comprende un fibrinógeno a una concentración final de 1-100 mg/mL y trombina a una concentración final de 1-500 U/mL. Incluso más preferiblemente, el gel de fibrina comprende un fibrinógeno a una concentración final de 10-30 mg/mL y trombina a una concentración final de 2-50 U/mL.In one embodiment of the disclosed method, the biomimetic gel may be at least one of the following: fibrin, hyaluronic acid, alginate, agarose, collagen, PEG derivatives and mixtures thereof. Preferably, fibrin gel, more preferably, the fibrin gel comprises a fibrinogen at a final concentration of 1-100 mg / mL and thrombin at a final concentration of 1-500 U / mL. Even more preferably, the fibrin gel comprises a fibrinogen at a final concentration of 10-30 mg / mL and thrombin at a final concentration of 2-50 U / mL.
En una realización del método divulgado, la concentración de lisofosfatídico varía entre 1 y 1.000 pM, preferiblemente 100 mM.In one embodiment of the disclosed method, the concentration of lysophosphatidium varies between 1 and 1,000 pM, preferably 100 mM.
Un aspecto de la presente divulgación describe una composición que comprende: células madre hematopoyéticas, preferiblemente CD34+ derivadas de cordón umbilical humano o sangre periférica; con ácido lisofosfatídico 100 pM, preferiblemente que comprende además un gel, concretamente un gel biomimético.One aspect of the present disclosure describes a composition comprising: hematopoietic stem cells, preferably CD34 + derived from human umbilical cord or peripheral blood; with 100 pM lysophosphatidic acid, preferably further comprising a gel, specifically a biomimetic gel.
Esta combinación mejoró sorprendentemente la supervivencia en condiciones de hipoxia y privación de suero y conserva el tejido cardíaco después de un infarto de miocardio. Esta mezcla, especialmente CD34+ derivadas de sangre de cordón umbilical humano tratadas con ácido lisofosfatídico en fibrina, mostró mejores resultados.This combination surprisingly improved survival in hypoxia and serum deprivation conditions and preserves heart tissue after myocardial infarction. This mixture, especially CD34 + derived from human umbilical cord blood treated with lysophosphatidic acid in fibrin, showed better results.
En una realización de la composición divulgada, el gel biomimético puede ser al menos uno de los siguientes: fibrina, ácido hialurónico, alginato, agarosa, colágeno, derivados de PEG y sus mezclas. Preferiblemente, gel de fibrina, más preferiblemente, el gel de fibrina comprende un fibrinógeno a una concentración final de 1-100 mg/mL y trombina a una concentración final de 1-500 U/mL. Incluso más preferiblemente, el gel de fibrina comprende un fibrinógeno a una concentración final de 10-30 mg/mL y trombina a una concentración final de 2-50 U/mL.In one embodiment of the disclosed composition, the biomimetic gel may be at least one of the following: fibrin, hyaluronic acid, alginate, agarose, collagen, PEG derivatives and mixtures thereof. Preferably, fibrin gel, more preferably, the fibrin gel comprises a fibrinogen at a final concentration of 1-100 mg / mL and thrombin at a final concentration of 1-500 U / mL. Even more preferably, the fibrin gel comprises a fibrinogen at a final concentration of 10-30 mg / mL and thrombin at a final concentration of 2-50 U / mL.
Una realización de la composición divulgada puede comprender 1 x 105-1 x 106 células CD34+; y 100 pM de ácido lisofosfatídico; y 100 - 200 mL de gel biomimético.An embodiment of the disclosed composition may comprise 1 x 105-1 x 106 CD34 + cells; and 100 pM lysophosphatidic acid; and 100-200 mL of biomimetic gel.
En otro aspecto, la composición divulgada se puede usar en medicina o aplicación cosmética, concretamente una composición farmacéutica, médica o cosmética, concretamente con células CD34+ y componentes anteriores de LPA están en una cantidad terapéuticamente eficaz y pueden comprender además cantidades adecuadas de excipiente. En particular, en el tratamiento del tejido cardíaco y/o enfermedades cardíacas, y/o en el tratamiento de la cicatrización de heridas, concretamente, la curación de heridas diabéticas.In another aspect, the disclosed composition can be used in medicine or cosmetic application, specifically a pharmaceutical, medical or cosmetic composition, specifically with CD34 + cells and previous components of LPA are in a therapeutically effective amount and may further comprise adequate amounts of excipient. In particular, in the treatment of cardiac tissue and / or heart disease, and / or in the treatment of wound healing, namely, healing of diabetic wounds.
En una realización, la composición de divulgación puede ser una formulación inyectable.In one embodiment, the disclosure composition may be an injectable formulation.
En la presente divulgación se muestra que las células madre hematopoyéticas, concretamente las células CD34+, tratadas con ácido lisofosfatídico (LPA) y cultivadas bajo hipoxia y condiciones privadas de suero duplican su supervivencia con respecto a las células no tratadas. Sorprendentemente, las células proliferan y secretan altos niveles de citoquinas tales como IL-4, IL-8 y TNF-a en comparación con los controles. Finalmente, las células tratadas con LPA, pero no las células no tratadas, preservan la función cardíaca después de un infarto de miocardio.In the present disclosure it is shown that hematopoietic stem cells, specifically CD34 + cells, treated with lysophosphatidic acid (LPA) and cultured under hypoxia and deprived serum conditions double their survival with respect to untreated cells. Surprisingly, cells proliferate and secrete high levels of cytokines such as IL-4, IL-8 and TNF-a compared to controls. Finally, cells treated with LPA, but not untreated cells, preserve cardiac function after myocardial infarction.
Descripción de las figurasDescription of the figures
Las siguientes figuras proporcionan formas de realización preferidas para ilustrar la descripción y no deben verse como limitativas del alcance de la invención.The following figures provide preferred embodiments to illustrate the description and should not be seen as limiting the scope of the invention.
Figura 1: Estructura química de LPA. Supervivencia, apoptosis y necrosis de células CD34+ cultivadas en hipoxia durante 24 h en medio libre de suero con o sin fármacos. Los resultados son el promedio ± SEM (n = 2-13).Figure 1: LPA chemical structure. Survival, apoptosis and necrosis of CD34 + cells cultured in hypoxia for 24 h in serum-free medium with or without drugs. The results are the average ± SEM (n = 2-13).
Figura 2: El LPA mejora la supervivencia de células CD34+ en células cultivadas en condiciones de hipoxia y privación de suero. (A) Supervivencia, apoptosis y necrosis de células CD34+ cultivadas en medio libre de suero durante 24 h en normoxia, hipoxia e hipoxia con tratamiento con LPA. (B) Efecto de la concentración de LPA en la supervivencia de las células CD34+ cultivadas en medio libre de suero durante 24 h en hipoxia o normoxia. (C) Efecto de LPA en la supervivencia de células cultivadas en hipoxia durante 1 (H1) o 3 días (H3), en hipoxia durante 1 día y 3 días en normoxia (H1 + N3), o normoxia durante 1 (N1) o 4 días (N4). En todos los gráficos, las células se cultivaron con o sin LPA (100 pM). Los resultados son el promedio ± SEM (n = 4-50). En todas las figuras, * denota significancia estadística: * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.Figure 2: LPA improves the survival of CD34 + cells in cells grown under conditions of hypoxia and serum deprivation. (A) Survival, apoptosis and necrosis of CD34 + cells grown in serum-free medium for 24 hours in normoxia, hypoxia and hypoxia with treatment with LPA. (B) Effect of the concentration of LPA on the survival of CD34 + cells grown in serum-free medium for 24 h in hypoxia or normoxia. (C) Effect of LPA on the survival of cells grown in hypoxia for 1 (H1) or 3 days (H3), in hypoxia for 1 day and 3 days in normoxia (H1 + N3), or normoxia for 1 (N1) or 4 days (N4). In all graphs, cells were cultured with or without LPA (100 pM). The results are the average ± SEM (n = 4-50). In all figures, * denotes statistical significance: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
Figura 3: El LPA afecta la proliferación celular y tiene un impacto mínimo en la diferenciación celular en condiciones de hipoxia y privación de suero. (A) Número de total de células después de 1 día en hipoxia y 3 o 6 días en normoxia. (B) Diferenciación celular medida por citometría de flujo (n = 1). Las células se cultivaron en hipoxia durante 1 día seguido o no por 6 días en normoxia. En todos los gráficos, las células se cultivaron con o sin LPA (100 pM).Figure 3: LPA affects cell proliferation and has a minimal impact on cell differentiation under conditions of hypoxia and serum deprivation. (A) Total number of cells after 1 day in hypoxia and 3 or 6 days in normoxia. (B) Cell differentiation measured by flow cytometry (n = 1). The cells were grown in hypoxia for 1 day or not for 6 days in normoxia. In all graphs, cells were cultured with or without LPA (100 pM).
Figura 4: El LPA afecta la supervivencia celular en células CD34+ encapsuladas en gel de fibrina y cultivadas en hipoxia y condiciones privadas de suero. (A.1) Las células se cultivaron en medio sin suero con o sin LPA (100 pM) y en hipoxia durante 1 día. (A.2) Las células se cultivaron en medio sin suero con o sin LPA (100 pM) y en hipoxia durante 3 días. En todos los gráficos, los resultados son el promedio ± SEM (n = 3-6). En todas las figuras, * denota 5 significancia estadística: * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.Figure 4: LPA affects cell survival in CD34 + cells encapsulated in fibrin gel and cultured in hypoxia and deprived serum conditions. (A.1) The cells were grown in serum free medium with or without LPA (100 pM) and in hypoxia for 1 day. (A.2) The cells were grown in serum free medium with or without LPA (100 pM) and in hypoxia for 3 days. In all graphs, the results are the average ± SEM (n = 3-6). In all figures, * denotes 5 statistical significance: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
Figura 5: El LPA induce la supervivencia de células CD34+ principalmente a través del receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR). Las células se cultivaron en medio libre de suero con LPA. Las células se trataron previamente con inhibidor de Rho quinasa (Y-2762, 50 pM), inhibidor de proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) (PD98059, 60 pM), inhibidor específico de LPA1 y LPA3 (Ki16425, 10 pM) o inhibidor del receptor 10 gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPARg) (GW9662, 50 pM) durante 1 hora antes de la hipoxia y medio celular que contiene LPA (100 pM) durante 24 h. Las células sin ningún pretratamiento y cultivadas en medio libre de suero con o sin LPA, en hipoxia durante 24 h, se usaron como controles positivo y negativo, respectivamente. Los resultados son el promedio ± SEM (n = 3-6). * Denota significancia estadística: * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.Figure 5: LPA induces the survival of CD34 + cells primarily through the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR). The cells were grown in serum free medium with LPA. Cells were previously treated with Rho kinase inhibitor (Y-2762, 50 pM), mitogen-activated protein kinase inhibitor (MAPK) (PD98059, 60 pM), specific inhibitor of LPA1 and LPA3 (Ki16425, 10 pM) or inhibitor of the 10 gamma receptor activated by the peroxisome proliferator (PPARg) (GW9662, 50 pM) for 1 hour before hypoxia and cellular medium containing LPA (100 pM) for 24 h. Cells without any pretreatment and cultured in serum-free medium with or without LPA, in hypoxia for 24 h, were used as positive and negative controls, respectively. The results are the average ± SEM (n = 3-6). * Denotes statistical significance: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
15 Figura 6: Las células CD34+ tratadas con LPA preservan la función cardíaca después de un infarto de miocardio. Los infartos de miocardio fueron inducidos por la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD). (A) Acortamiento fraccional cardíaco en animales con (células simuladas, gel + células CD34+, células CD34+ tratadas con LPA + gel) o sin ligadura de LAD (normal). En células CD34 tratadas con LPA, las células se trataron con 100 pM de LPA, 1 h antes del trasplante. Se administraron células (1 x 106 células) en una 20 solución precursora de gel de fibrina (100 mL) en el corazón infartado de ratas desnudas. (B) Acortamiento fraccional cardíaco en la semana 3 normalizado en la semana 1. En todos los gráficos, los resultados son los promedios ± SEM (n = 6-10). * Denota significancia estadística: * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,00115 Figure 6: CD34 + cells treated with LPA preserve cardiac function after myocardial infarction. Myocardial infarctions were induced by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). (A) Cardiac fractional shortening in animals with (simulated cells, gel + CD34 + cells, CD34 + cells treated with LPA + gel) or without LAD ligation (normal). In CD34 cells treated with LPA, cells were treated with 100 pM LPA, 1 h before transplantation. Cells (1 x 10 6 cells) were administered in a fibrin gel precursor solution (100 mL) in the infarcted heart of naked rats. (B) Cardiac fractional shortening in week 3 normalized in week 1. In all the graphs, the results are averages ± SEM (n = 6-10). * Denotes statistical significance: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001
Descripción detalladaDetailed description
En la presente divulgación se muestra que las células madre hematopoyéticas, concretamente las células CD34+ 25 tratadas con ácido lisofosfatídico (LPA) cultivadas bajo hipoxia y condiciones privadas de suero, sorprendentemente duplican su supervivencia con respecto a las células no tratadas. Preferiblemente, las células proliferan y secretan altos niveles de citoquinas tales como IL-4, IL-8 y TNF-a en comparación con los controles. Los resultados muestran que la supervivencia de las células CD34+ está mediada principalmente por el receptor activado por el proliferador de peroxisomas. Finalmente, la presente divulgación muestra que las células tratadas con LPA, pero no las células 30 no tratadas preservan la función cardíaca después de un infarto de miocardio.In the present disclosure it is shown that hematopoietic stem cells, specifically CD34 + 25 cells treated with lysophosphatidic acid (LPA) grown under hypoxia and deprived serum conditions, surprisingly double their survival with respect to untreated cells. Preferably, cells proliferate and secrete high levels of cytokines such as IL-4, IL-8 and TNF-a compared to controls. The results show that the survival of CD34 + cells is mainly mediated by the receptor activated by the peroxisome proliferator. Finally, the present disclosure shows that cells treated with LPA, but not untreated cells preserve heart function after myocardial infarction.
La presente invención permite el sorprendente aumento de la supervivencia de las células madre hematopoyéticas, concretamente las células CD34+, (en número y magnitud) la proliferación celular y el efecto terapéutico sobre la regeneración tisular y mantienen el efecto del ácido lisofosfatídico.The present invention allows the surprising increase in the survival of hematopoietic stem cells, specifically CD34 + cells, (in number and magnitude) cell proliferation and the therapeutic effect on tissue regeneration and maintain the effect of lysophosphatidic acid.
Este efecto se observó inesperadamente en condiciones de hipoxia y privación de suero, y se observó también 35 sorprendentemente que las células madre hematopoyéticas, en particular las células CD34+ expresan RLPA (receptores de LPA) y los efectos enumerados anteriormente se logran tratando a CD34+ con ácido lisofosfatídico (LPA).This effect was unexpectedly observed under conditions of hypoxia and serum deprivation, and it was also surprisingly observed that hematopoietic stem cells, in particular CD34 + cells express RLPA (LPA receptors) and the effects listed above are achieved by treating CD34 + with acid lysophosphatid (LPA).
RealizacionesRealizations
Aislamiento de células CD34+ de UCB. En una realización, se recogieron todas las muestras de sangre de cordón 40 umbilical (UCB) humano de los donantes, que firmaron un formulario de consentimiento informado, de conformidad con la legislación portuguesa. La recolección fue aprobada por el comité de ética de Maternidade Daniel de Matos. Las muestras se almacenaron en bolsas estériles que contenían 35 mL de solución anticoagulante de citrato-fosfato- dextrosa. Las células CD34+ se aislaron a partir de células mononucleares, obtenidas de muestras de UCB después de separación por gradiente de densidad Ficoll (preferiblemente, Histopaque-1077 Hybri Max, preferiblemente, 45 Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.). Las células CD34+ se seleccionaron positivamente (2 veces) usando el sistema de separación inmunomagnética mini-MACS (preferiblemente, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania,
http://www.miltenyibiotec.com), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células CD34+ se usaron inmediatamente para estudios de encapsulación celular o experimentos in vivo sin tratamiento adicional. Las células aisladas tenían una pureza superior al 95% para el antígeno CD34 según lo confirmado por FACS. Estas células son 50 CD34+CD45+CD31+KDR-vWF-CD14 (Pedroso, D.C., et al., Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells. PLoS One, 2011. 6 (1): página E16114).Isolation of CD34 + cells from UCB. In one embodiment, all human umbilical cord (UCB) blood samples were collected from donors, who signed an informed consent form, in accordance with Portuguese legislation. The collection was approved by the ethics committee of Maternidade Daniel de Matos. The samples were stored in sterile bags containing 35 mL of citrate phosphate dextrose anticoagulant solution. CD34 + cells were isolated from mononuclear cells, obtained from UCB samples after Ficoll density gradient separation (preferably, Histopaque-1077 Hybri Max, preferably, 45 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). CD34 + cells were positively selected (2 times) using the mini-MACS immunomagnetic separation system (preferably, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany,
http://www.miltenyibiotec.com), according to the manufacturer's recommendations. CD34 + cells were used immediately for cell encapsulation studies or in vivo experiments without further treatment. The isolated cells had a purity greater than 95% for the CD34 antigen as confirmed by FACS. These cells are 50 CD34 + CD45 + CD31 + KDR-vWF-CD14 (Pedroso, DC, et al., Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells. PLoS One, 2011. 6 ( 1): page E16114).
Tratamiento celular. En una realización, se incubaron células CD34+ de UCB (1x106 células/mL) en medio X-Vivo (Lonza) en una cámara de hipoxia durante 24 h (0,5% de O2 y 5% de CO2), en presencia o ausencia de medicamentos farmacológicos, para una evaluación adicional de la supervivencia/apoptosis celular y necrosis 55 mediante análisis FACS de la expresión de anexina V y PI, respectivamente. Preferiblemente, las células se trataronCellular treatment In one embodiment, UC34 CD34 + cells (1x106 cells / mL) were incubated in X-Vivo medium (Lonza) in a hypoxia chamber for 24 h (0.5% O2 and 5% CO2), in the presence or absence of pharmacological drugs, for further evaluation of cell survival / apoptosis and necrosis 55 by FACS analysis of the expression of annexin V and PI, respectively. Preferably, the cells were treated.
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previamente con los fármacos respectivos durante 1 hora antes de la hipoxia, y el tratamiento se mantuvo durante la hipoxia.previously with the respective drugs for 1 hour before hypoxia, and the treatment was maintained during hypoxia.
Inmunotinción. En una realización, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% (v/v) (preferiblemente, EMS, Hatfield, EE.UU.) durante 15-20 minutos a temperatura ambiente. Después de bloquear durante 30 minutos con solución de albúmina de suero bovino (BSA) al 1% (p/v) (preferiblemente, Sigma-Aldrich), las células se tiñeron durante 1 h con anticuerpos monoclonales antihumanos PPARg y CD34. En cada experimento de inmunofluorescencia, se usó un control de IgG de isotipo coincidente. La unión de anticuerpos primarios a células específicas se detectó con UN conjugado Cy3 de IgG antirratón (preferiblemente, Sigma-Aldrich). El núcleo de las células se tiñó con 4',6-diamidino-2-fenilindol (preferiblemente, DAPI, Sigma-Aldrich). Después de marcación indirecta, las células se examinaron preferiblemente con un microscopio de fluorescencia Zeiss.Immunostaining In one embodiment, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde (v / v) (preferably, EMS, Hatfield, USA) for 15-20 minutes at room temperature. After blocking for 30 minutes with 1% (w / v) bovine serum albumin solution (BSA) (preferably, Sigma-Aldrich), the cells were stained for 1 h with PPARg and CD34 anti-human monoclonal antibodies. In each immunofluorescence experiment, a matching isotype IgG control was used. The binding of primary antibodies to specific cells was detected with a Cy3 conjugate of anti-mouse IgG (preferably, Sigma-Aldrich). The cell nucleus was stained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (preferably, DAPI, Sigma-Aldrich). After indirect labeling, the cells were preferably examined with a Zeiss fluorescence microscope.
Citometría de flujo. En una realización, se realizó un análisis multicolor para fenotipado de células madre y progenitoras en un citómetro FACS Calibur (preferiblemente, Becton Dickinson). Las células se tiñeron durante 1 h APC o CD45 antihumano con azul pacífico (preferiblemente, e-Bioscience), CD45 antirratón con FITC (preferiblemente, -eBioscience), CD33 antihumano con PeCy7 (preferiblemente, BD Bioscience), CD11b antihumano con PE (preferentemente, BD eBioscience), antihumano CD19 con FITC (preferentemente, BD Bioscience), CD3 antihumano con PeCy7 (preferentemente, BD Bioscience), Glicoforina A antihumana con PE (preferiblemente, BD Bioscience), CD41 antihumano con FITC (preferiblemente, e-Bioscience), y CD56 antihumana con PeCy7 (preferiblemente, BD Bioscience), se lavó con medio de tinción y se analizó.Flow cytometry. In one embodiment, a multicolored analysis was performed for stem cell and progenitor phenotyping on a FACS Calibur cytometer (preferably, Becton Dickinson). Cells were stained for 1 h APC or anti-human CD45 with Pacific blue (preferably, e-Bioscience), anti-mouse CD45 with FITC (preferably, -eBioscience), anti-human CD33 with PeCy7 (preferably, BD Bioscience), anti-human CD11b with PE (preferably , BD eBioscience), anti-human CD19 with FITC (preferably, BD Bioscience), anti-human CD3 with PeCy7 (preferably, BD Bioscience), anti-human Glycoforin A with PE (preferably, BD Bioscience), anti-human CD41 with FITC (preferably, e-Bioscience) , and anti-human CD56 with PeCy7 (preferably, BD Bioscience), was washed with staining medium and analyzed.
Preparación de geles de fibrina. En una realización, los geles de fibrina se formaron mediante entrecruzamiento de fibrinógeno en presencia de trombina (ambos de Sigma-Aldrich). La solución de fibrinógeno se preparó disolviendo fibrinógeno humano en solución salina regulada con Tris (TBS) (preferiblemente, Sigma-Aldrich), pH 7,4 (20 mg/mL), y luego se esterilizó filtrando a través de un filtro de jeringa de 0,22 pm (Acrodisc, Pall, NY, EE.UU.). Se prepararon soluciones de trombina frescas disolviendo trombina humana en TBS a pH 7,4 a una concentración de 50 U/mL. Se prepararon geles de fibrina (200 pL, a menos que se indique lo contrario) mezclando tres componentes diferentes: fibrinógeno (10 mg/mL), CaCl2 (preferiblemente, Merck, NJ, EE.UU.) (2,5 pM) y trombina (0,2 U/mL). Esta solución se dejó gelificar a 37°C y 100% de humedad relativa.Preparation of fibrin gels. In one embodiment, fibrin gels were formed by crosslinking fibrinogen in the presence of thrombin (both from Sigma-Aldrich). The fibrinogen solution was prepared by dissolving human fibrinogen in Tris-regulated saline (TBS) (preferably, Sigma-Aldrich), pH 7.4 (20 mg / mL), and then sterilized by filtering through a syringe filter. 0.22 pm (Acrodisc, Pall, NY, USA). Fresh thrombin solutions were prepared by dissolving human thrombin in TBS at pH 7.4 at a concentration of 50 U / mL. Fibrin gels (200 pL, unless otherwise indicated) were prepared by mixing three different components: fibrinogen (10 mg / mL), CaCl2 (preferably, Merck, NJ, USA) (2.5 pM) and thrombin (0.2 U / mL). This solution was allowed to gel at 37 ° C and 100% relative humidity.
Degradación de geles de fibrina. En una realización, la solución de precursor de gel se preparó mezclando conjugado de fibrinógeno humano Alexa Fluor® 488 (preferiblemente, Invitrogen) (0,156 mg) con fibrinógeno no marcado (9,844 mg) en 1 mL de TBS. La tasa de degradación de geles de fibrina con o sin células a lo largo del tiempo se estimó indirectamente mediante la disminución de su fluorescencia. Su fluorescencia se midió inmediatamente en el tiempo cero y en los puntos de tiempo deseados. La degradación completa de los geles se indujo mediante incubación con 200 pL de una solución de plasmina humana (preferiblemente, Sigma-Aldrich) en TBS (0,006 U por gel) durante la noche a 37°C. Después de la centrifugación, la fluorescencia de las fracciones de sobrenadante se midió a 520 nm en un lector de microplacas de fluorescencia SPECTRAmax Gemini EM (preferiblemente, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.,
www.moleculardevices.com).Degradation of fibrin gels. In one embodiment, the gel precursor solution was prepared by mixing Alexa Fluor® 488 human fibrinogen conjugate (preferably, Invitrogen) (0.156 mg) with unlabeled fibrinogen (9,844 mg) in 1 mL of TBS. The degradation rate of fibrin gels with or without cells over time was indirectly estimated by decreasing their fluorescence. Its fluorescence was measured immediately at zero time and at the desired time points. Complete degradation of the gels was induced by incubation with 200 pL of a solution of human plasmin (preferably, Sigma-Aldrich) in TBS (0.006 U per gel) overnight at 37 ° C. After centrifugation, the fluorescence of the supernatant fractions was measured at 520 nm in a SPECTRAmax Gemini EM fluorescence microplate reader (preferably, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA,
www.moleculardevices.com).
Análisis de secreción de citoquina. En una realización, se evaluaron los sobrenadantes del cultivo celular para determinar la presencia y las concentraciones de citoquinas usando un ensayo de panel Bio-Plex Pro Human Cytokine 17-Plex (preferiblemente, Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en un Sistema Bio-Plex 200 (Bio-Rad,
www.bio-rad.com). El panel 17-Plex del Grupo I humano consistió en los siguientes analitos: interleuquina-1p (IL-1P), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8; IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM- CSF), interferón-g (IFN-g ), proteína quimiotáctica de monocitos (factor activador quimiotáctico de monocitos [MCP-1 (MCAF)], proteína p inflamatoria de macrófagos (MIP-1p) y factor a de necrosis tumoral (TNF-a). Se recogieron muestras del medio sobrenadante, se centrifugaron para eliminar los precipitados y congelar. Se usó un intervalo estándar de 0,2 a 3.200 pg/mL. Las muestras y controles se corrieron por triplicado, estándares y blancos por duplicado.Cytokine secretion analysis. In one embodiment, cell culture supernatants were evaluated to determine the presence and concentrations of cytokines using a Bio-Plex Pro Human Cytokine 17-Plex panel assay (preferably, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) , according to the manufacturer's instructions, in a Bio-Plex 200 System (Bio-Rad,
www.bio-rad.com). Panel 17-Plex of human Group I consisted of the following analytes: interleukin-1p (IL-1P), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8; IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), interferon-g (IFN -g), monocyte chemotactic protein (monocyte chemotactic activating factor [MCP-1 (MCAF)], macrophage inflammatory p protein (MIP-1p) and tumor necrosis factor a (TNF-a). Samples of the medium were collected supernatant, centrifuged to remove precipitates and freeze A standard range of 0.2 to 3,200 pg / mL was used Samples and controls were run in triplicate, standards and duplicate blanks.
Análisis de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR). En una realización, el ARN total en las células se extrajo usando el Kit RNeasy Mini (preferiblemente, Qiagen, Valencia, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se centrifugaron inicialmente y se homogeneizaron en Trizol. En todos los casos, se preparó ADNc a partir de 1 pg de ARN total usando reactivos de transcripción inversa Taqman (preferiblemente, Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). La PCR cuantitativa (qPCR) se realizó utilizando Power SYBR Green PCR Master Mix (preferiblemente, Applied Biosystems) y la se llevó a cabo detección en un sistema 7500 de PCR rápida en tiempo real (preferiblemente, Applied Biosystems,
www.appliedbiosystems.com). La cuantificación de los genes objetivo se realizó con respecto a la referencia (humano o ratón, dependiendo del tipo de células bajo análisis) Gen GAPDH: expresión relativa = 2[-(Ctmuestra- CtGADPH)]. Los valores medios mínimos del umbral del ciclo (Ct) se calcularon a partir de cuatro reacciones independientes. Las secuencias de cebadores se publican como información de apoyo (Tabla S1).Analysis of quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). In one embodiment, the total RNA in the cells was extracted using the RNeasy Mini Kit (preferably, Qiagen, Valencia, USA), according to the manufacturer's instructions. The cells were initially centrifuged and homogenized in Trizol. In all cases, cDNA was prepared from 1 pg of total RNA using Taqman reverse transcription reagents (preferably, Applied Biosystems, Foster City, USA). Quantitative PCR (qPCR) was performed using Power SYBR Green PCR Master Mix (preferably Applied Biosystems) and detection was performed in a 7500 real-time rapid PCR system (preferably Applied Biosystems,
www.appliedbiosystems.com). The quantification of the target genes was performed with respect to the reference (human or mouse, depending on the type of cells under analysis) GAPDH gene: relative expression = 2 [- (Ctsample- CtGADPH)]. The minimum average values of the cycle threshold (Ct) were calculated from four independent reactions. The primer sequences are published as supporting information (Table S1).
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Modelo animal de infarto de miocardio. En una realización, se anestesiaron ratas sin pelo con ketamina (75 mg/kg, IP) y dexmedetomidina (0,375 mg/kg, IP). Se anestesiaron con isofluorano al 2-3% en equilibrio con oxígeno. El abdomen y el tórax anterior se frotaron con betadina y se enjuagaron con alcohol al 70% (con varios ciclos de frotamiento de betadina seguido por enjuague con alcohol y aplicación de solución de betadina). El corazón fue abordado por una incisión abdominal transversal (incisión diafragmática) con la espalda del animal extendida suavemente sobre una toalla suave o lateralmente a través del espacio intercostal 4-5. Los instrumentos fueron esterilizados por autoclave. Se realizó una pequeña incisión diafragmática para crear una ventana pericárdica. Se realizó una incisión de 5 mm en el pericardio con un bisturí 11-0. El infarto de miocardio fue inducido por la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda con una sutura de prolina 6-0, 2-3 mm por debajo del origen de la arteria. La palidez y la anomalía del movimiento de la pared regional del ventrículo izquierdo confirmaron la oclusión. El pericardio se dejó abierto o se retiró para evitar el taponamiento. El espacio pleural se evacuó con una aguja estéril de calibre 18 y una jeringa de 3 mL después del cierre de la cavidad pleural. La pared abdominal y el tejido subcutáneo se cerraron con Vicryl 4-0 seguido por el cierre subcuticular con Vicryl 4-0. El animal fue extubado y luego se le permitió recuperarse. Cada animal se mantuvo durante los procedimientos quirúrgicos y la recuperación bajo almohadillas de calentamiento hasta que estuvo despierto y capaz de caminar. Dos días después de la recuperación de este procedimiento, los animales se sometieron a evaluación ecocardiográfica bajo anestesia con ketamina/midazolam. Los animales que cumplían el criterio de inclusión ecocardiográfica (acortamiento fraccional por debajo del 50%) se estratificaron en uno de 4 grupos. Las ratas se sometieron luego a una segunda toracotomía seguida por inyección directa de 100 pL de agente terapéutico usando una jeringa Hamilton (preferiblemente Hamilton Company) y una aguja de calibre 30. Al día siguiente, los animales fueron monitoreados por ecocardiografía. Dos semanas después de la implantación, las ratas supervivientes se analizaron de nuevo mediante ecocardiografía. En la semana 3, los animales fueron sacrificados por eutanasia. Se recogieron el corazón y varios órganos, se fijaron en solución de metil Carnoy y se procesaron para análisis histológico.Animal model of myocardial infarction. In one embodiment, hairless rats were anesthetized with ketamine (75 mg / kg, IP) and dexmedetomidine (0.375 mg / kg, IP). They were anesthetized with 2-3% isofluorane in equilibrium with oxygen. The abdomen and anterior chest were rubbed with betadine and rinsed with 70% alcohol (with several cycles of betadine rub followed by alcohol rinse and application of betadine solution). The heart was approached by a transverse abdominal incision (diaphragmatic incision) with the animal's back extended gently on a soft towel or laterally through the intercostal space 4-5. The instruments were sterilized by autoclave. A small diaphragmatic incision was made to create a pericardial window. A 5 mm incision was made in the pericardium with an 11-0 scalpel. Myocardial infarction was induced by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery with a 6-0 proline suture, 2-3 mm below the origin of the artery. Paleness and abnormal movement of the regional wall of the left ventricle confirmed occlusion. The pericardium was left open or removed to prevent plugging. The pleural space was evacuated with a sterile 18 gauge needle and a 3 mL syringe after the closure of the pleural cavity. The abdominal wall and subcutaneous tissue were closed with Vicryl 4-0 followed by subcuticular closure with Vicryl 4-0. The animal was extubated and then allowed to recover. Each animal was maintained during surgical procedures and recovery under heating pads until he was awake and able to walk. Two days after the recovery of this procedure, the animals underwent echocardiographic evaluation under anesthesia with ketamine / midazolam. Animals that met the echocardiographic inclusion criteria (fractional shortening below 50%) were stratified into one of 4 groups. The rats were then subjected to a second thoracotomy followed by direct injection of 100 pL of therapeutic agent using a Hamilton syringe (preferably Hamilton Company) and a 30 gauge needle. The next day, the animals were monitored by echocardiography. Two weeks after implantation, the surviving rats were analyzed again by echocardiography. In week 3, the animals were sacrificed for euthanasia. The heart and various organs were collected, fixed in methyl Carnoy solution and processed for histological analysis.
LPA induce la supervivencia de células CD34+ en condiciones de hipoxia y privación de sueroLPA induces the survival of CD34 + cells under conditions of hypoxia and serum deprivation
En una realización preferida, para identificar moléculas que promueven la supervivencia de células CD34+ en condiciones de hipoxia y privación de suero, se desarrolló un ensayo que utiliza células CD34+ derivadas de sangre de cordón umbilical humano (2x105 células por pozo de una placa de 96 pozos) suspendidas en medio X-Vivo (utilizado en ensayos clínicos (Schachinger, V., et al., Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med, 2006. 355 (12): páginas 1210-21)) y se incubaron en una cámara de hipoxia con 0,5% de O2, a 37°C, durante 24 h. Algunos de los medicamentos seleccionados han sido aprobados por la FDA para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, Nebivolol Lombardo, R.M., et al., Effects of nebivolol versus carvedilol on left ventricular function in patients with chronic heart failure and reduced left ventricular systolic function. J Cardiovasc Drugs, 2006. 6 (4): páginas 259-63; IbersatanMassie, B.M., et al., Irbesartan in patients with heart failure and preserved ejection fraction. N Engl J Med, 2008. 359 (23): páginas 2456-67), otros se están evaluando en ensayos preclínicos/clínicos para mejorar la función cardíaca en pacientes/modelos con insuficiencia cardíaca (por ejemplo, INO-1001 a novel poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor improves cardiac and pulmonary function after crystalloid cardioplegia and extracorporal circulation. Shock, 2004. 21 (5): páginas 426-32); eritropoyetina (Belonje, A.M., et al., Effects of erythropoietin after an acute myocardial infarction: rationale and study design of a prospective, randomized, clinical trial (HEBE III). Am Heart J, 2008. 155(5): páginas 817-22); melatonina (Chen, Z., et al., Protective effect of melatonin on myocardial infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003. 284(5): páginas H1618-24); VX-702 (Ma, X.L., et al., Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase decreases cardiomyocyte apoptosis and improves cardiac function after myocardial ischemia and reperfusion. Circulation, 1999. 99(13): páginas 1685-91)), otros son sustancias naturales que se encuentran en el cuerpo humano (LPA). La viabilidad celular se evaluó mediante citometría de flujo usando tinción con anexina V/yoduro de propidio (PI). La anexina V es una proteína de unión a fosfolípidos con especificidad por la fosfatidil serina, uno de los primeros marcadores de transición celular a un estado apoptótico. Este fosfolípido se transloca desde la valva interna a la externa de la membrana plasmática (Koopman, G., et al., Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, 1994. 84(5): páginas 1415-20). El PI entra en las células necróticas y se une a los ácidos nucleicos de doble cadena, pero se excluye de las células con integridad normal [20]. De acuerdo con la Figura 1, las células CD34+ no tratadas muestran una supervivencia muy pobre, con solo ~31% de células viables, ~31% de células apoptóticas (Annexin V +/PI-) estando la mayoría de las células ~39% en la etapa necrótica (PI+). De los diez fármacos analizados, el LPA, prostaglandina E2 (PGE2) y eritropoyetina mejoraron significativamente la supervivencia celular (P <0,001). LPA (10 pM) fue el fármaco con el mayor efecto en favor de la supervivencia (~69% de las células viables) y, por lo tanto, se estudió adicionalmente (Figuras 1 y 2A). Sorprendentemente, LPA mejora la supervivencia celular al revertir la necrosis y la apoptosis de las células CD34+ especialmente en condiciones hipóxicas y privadas de suero.In a preferred embodiment, to identify molecules that promote the survival of CD34 + cells under conditions of hypoxia and serum deprivation, an assay was developed using CD34 + cells derived from human umbilical cord blood (2x105 cells per well of a 96-well plate ) suspended in X-Vivo medium (used in clinical trials (Schachinger, V., et al., Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med, 2006. 355 (12): pages 1210-21 )) and incubated in a hypoxia chamber with 0.5% O2, at 37 ° C, for 24 h. Some of the selected medications have been approved by the FDA for the treatment of cardiovascular diseases (for example, Nebivolol Lombardo, RM, et al., Effects of nebivolol versus carvedilol on left ventricular function in patients with chronic heart failure and reduced left systolic ventricular J Cardiovasc Drugs, 2006. 6 (4): pages 259-63; IbersatanMassie, BM, et al., Irbesartan in patients with heart failure and preserved ejection fraction.N Engl J Med, 2008. 359 (23): pages 2456-67), others are being evaluated in preclinical / clinical trials to improve heart function in patients / models with heart failure (for example, INO-1001 to novel poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor improves cardiac and pulmonary function after crystalloid cardioplegia and extracorporal circulation Shock, 2004. 21 (5): pages 426-32); erythropoietin (Belonje, AM, et al., Effects of erythropoietin after an acute myocardial infarction: rationale and study design of a prospective, randomized, clinical trial (HEBE III). Am Heart J, 2008. 155 (5): pages 817- 22); melatonin (Chen, Z., et al., Protective effect of melatonin on myocardial infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003. 284 (5): pages H1618-24); VX-702 (Ma, XL, et al., Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase decreases cardiomyocyte apoptosis and improves cardiac function after myocardial ischemia and reperfusion. Circulation, 1999. 99 (13): pages 1685-91)), others they are natural substances found in the human body (LPA). Cell viability was assessed by flow cytometry using annexin V / propidium iodide (PI) staining. Annexin V is a phospholipid binding protein with specificity for phosphatidyl serine, one of the first markers of cell transition to an apoptotic state. This phospholipid translocates from the inner leaflet to the outer leaflet of the plasma membrane (Koopman, G., et al., Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, 1994. 84 (5): pages 1415-20). PI enters necrotic cells and binds to double-stranded nucleic acids, but is excluded from cells with normal integrity [20]. According to Figure 1, untreated CD34 + cells show very poor survival, with only ~ 31% of viable cells, ~ 31% of apoptotic cells (Annexin V + / PI-) with the majority of cells being ~ 39% in the necrotic stage (PI +). Of the ten drugs analyzed, LPA, prostaglandin E2 (PGE2) and erythropoietin significantly improved cell survival (P <0.001). LPA (10 pM) was the drug with the greatest effect in favor of survival (~ 69% of viable cells) and, therefore, was studied further (Figures 1 and 2A). Surprisingly, LPA improves cell survival by reversing the necrosis and apoptosis of CD34 + cells especially in hypoxic and serum-deprived conditions.
El efecto en favor de la supervivencia de LPA fue dependiente de la concentración (de 1-100 pM) siendo la supervivencia de las células CD34+ ya estadísticamente significativas (P <0,001, n = 6) en comparación con el control (células no tratadas) a 1 pM de LPA (Fig. 2B). De manera importante, el porcentaje de células viables en CD34+ tratadas con 1 pM de lPa y cultivadas bajo condiciones de hipoxia es similar a las células no tratadas cultivadas en condiciones de normoxia. El efecto en favor de la supervivencia de LPA disminuye en función delThe effect in favor of LPA survival was concentration dependent (from 1-100 pM), with the survival of already statistically significant CD34 + cells (P <0.001, n = 6) compared to the control (untreated cells) at 1 pM of LPA (Fig. 2B). Importantly, the percentage of viable cells in CD34 + treated with 1 pM of lPa and cultured under hypoxia conditions is similar to untreated cells grown under normoxia conditions. The effect in favor of LPA survival decreases depending on the
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tiempo de hipoxia (Figura 2C). El porcentaje de células viables en células CD34+ tratadas con LPA disminuyó del 78% en el día 1 al 40% en el día 3. En conjunto, los resultados obtenidos indican sorprendentemente que LPA es una molécula en favor de la supervivencia de células CD34+ y su efecto es dependiente del tiempo y de la concentración.hypoxia time (Figure 2C). The percentage of viable cells in CD34 + cells treated with LPA decreased from 78% on day 1 to 40% on day 3. Overall, the results obtained surprisingly indicate that LPA is a molecule in favor of the survival of CD34 + cells and their effect is dependent on time and concentration.
El LPA induce la proliferación celular sin la expansión de células progenitoras multipotentes tempranasLPA induces cell proliferation without the expansion of early multipotent progenitor cells
El LPA es altamente mitogénico para las células quiescentes [21]. La acción mitogénica de LPA implica la activación de una proteína G insensible a la toxina pertussis con posterior movilización de Ca2+ y estimulación de la proteína quinasa C, liberación de ácido araquidónico de manera dependiente de GTP y activación de una proteína Gi sensible a la toxina pertussis que media la inhibición de adenilato ciclasa (van Corven, EJ, et al., Lysophosphatidate- induced cell proliferation: identification and dissection of signaling pathways mediated by G proteins. Cell, 1989. 59 (1): páginas 45-54). Para determinar si el LPA puede inducir la proliferación de células CD34+, se expuso una suspensión de células sin tratar o tratadas con LPA (2x105 células en 200 pl de medio X-vivo) a hipoxia durante 24 h y luego se cultivó en condiciones de normoxia durante 6 días adicionales. Las células tratadas con LPA aumentaron su número aproximadamente 3 veces durante el período de 7 días mientras que las células no tratadas disminuyeron a la mitad de su número inicial (Fig. 3A).LPA is highly mitogenic for quiescent cells [21]. The mitogenic action of LPA involves the activation of a pertussis toxin insensitive G protein with subsequent mobilization of Ca2 + and stimulation of protein kinase C, release of arachidonic acid in a GTP-dependent manner and activation of a pertussis toxin-sensitive Gi protein which mediates the inhibition of adenylate cyclase (van Corven, EJ, et al., Lysophosphatidate-induced cell proliferation: identification and dissection of signaling pathways mediated by G proteins. Cell, 1989. 59 (1): pages 45-54). To determine whether LPA can induce proliferation of CD34 + cells, a suspension of untreated or LPA-treated cells (2x105 cells in 200 pl of X-vivo medium) was exposed to hypoxia for 24 h and then cultured under normoxia conditions during 6 additional days Cells treated with LPA increased their number approximately 3 times during the 7-day period while untreated cells decreased to half of their initial number (Fig. 3A).
Para examinar el efecto del LPA en la autorrenovación/diferenciación de células CD34+, las células CD34+ no tratadas y tratadas con LPA se cultivaron en medio X-vivo en condiciones de hipoxia durante 1 día seguido o no por 6 días en normoxia y finalmente se caracterizaron por FACS. Después de 1 día de hipoxia, tanto las células CD34+ no tratadas como las tratadas con LPA comenzaron a diferenciarse en mastocitos (entre 14 y 17%) y neutrófilos (entre 5 y 8%) (Figura 3B). Solo el 78% y el 72% de las células CD34+ no tratadas o tratadas con LPA expresan el marcador CD34. La expresión de CD34 es mayor en las células que han estado expuestas a la hipoxia que en las condiciones de normoxia ya que solo el 6% de las células cultivadas en condiciones de normoxia durante 24 horas expresan el marcador CD34. Las células cultivadas durante 1 día en hipoxia y luego 6 días en normoxia se diferencian adicionalmente en varios linajes celulares que incluyen células dendríticas (CD), basófilos, monocitos, neutrófilos y mastocitos. Se observaron perfiles de diferenciación similares para las células no tratadas y tratadas con LPA.To examine the effect of LPA on the self-renewal / differentiation of CD34 + cells, CD34 + cells not treated and treated with LPA were grown in X-live medium under hypoxic conditions for 1 day or not for 6 days in normoxia and finally characterized by FACS. After 1 day of hypoxia, both untreated CD34 + cells and those treated with LPA began to differentiate into mast cells (between 14 and 17%) and neutrophils (between 5 and 8%) (Figure 3B). Only 78% and 72% of CD34 + cells not treated or treated with LPA express the CD34 marker. CD34 expression is higher in cells that have been exposed to hypoxia than in normoxia conditions since only 6% of cells grown under normoxia conditions for 24 hours express the CD34 marker. Cells grown for 1 day in hypoxia and then 6 days in normoxia are further differentiated into several cell lineages that include dendritic cells (CD), basophils, monocytes, neutrophils and mast cells. Similar differentiation profiles were observed for untreated and LPA treated cells.
El LPA induce la supervivencia de células CD34+ en células encapsuladas en geles de fibrina y se cultivan en condiciones de hipoxia y de privación de sueroLPA induces the survival of CD34 + cells in cells encapsulated in fibrin gels and are grown under conditions of hypoxia and serum deprivation.
Las estructuras inyectables son vehículos muy prometedores para administrar células madre para la medicina regenerativa ya que proporcionan un soporte estructural favorable para la supervivencia y proliferación celular (Pedroso, D.C., et al., Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co- cultured with endothelial cells. PLoS One, 2011. 6(1): página e16114; Kraehenbuehl, T.P., R. Langer, y L.S. Ferreira, Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nat Methods, 2011. 8(9): páginas 7316; Nakamuta, J.S., et al., Cell therapy attenuates cardiac dysfunction post myocardial infarction: effect of timing, routes of injection and a fibrin scaffold. PLoS One, 2009. 4(6): página e6005). Varios estudios han demostrado que las células trasplantadas con estructuras en el contexto cardíaco mejoraron la supervivencia celular, indujeron la angiogénesis y preservaron la función cardíaca después del infarto (Nakamuta, J.S., et al., Cell therapy attenuates cardiac dysfunction post myocardial infarction: effect of timing, routes of injection and a fibrin scaffold. PLoS One, 2009. 4(6): página e6005; Christman, K.L., et al., Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng, 2004. 10(3-4): páginas 403-9; Kraehenbuehl, T.P., et al., Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials, 2011. 32(4): páginas 1102-9; Kutschka, I., et al., Collagen matrices enhance survival of transplanted cardiomyoblasts and contribute to functional improvement of ischemic rat hearts. Circulation, 2006. 114(1 Suppl): páginas 1167-73). Recientemente, se demostró que las células CD34+ tienen una mayor adhesión inicial a geles de fibrina que a placas de poliestireno, colágeno y fibronectina (Pedroso, DC, et al., Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells cocultured with endothelial cells. PLoS One, 2011. 6 (1): página e16114). Además, se muestra que los geles de fibrina soportan la supervivencia de las células CD34+ durante al menos 10 días y los geles resisten a la degradación de las enzimas metaloproteasas (Pedroso, D.C., et al., Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells cocultured with endothelial cells. PLoS One, 2011. 6 (1): página e16114). En una realización preferida, para examinar si los geles de fibrina soportan la supervivencia de las células CD34+ en condiciones de hipoxia y de privación de suero se encapsularon células no tratadas o tratadas con LPA (2x105) en gel de fibrina (200 pL) y se incubaron en una cámara de hipoxia al 0,5% de O2, a 37°C, durante 1 y 3 días. La viabilidad celular se evaluó mediante citometría de flujo usando tinción con anexina V/yoduro de propidio (PI). Las células CD34+ no tratadas tienen poca supervivencia en geles de fibrina (23,2 ± 2,8% de células viables, n = 3, en el día 1, 12,6 ± 1,2% de células viables, n = 5, en el día 3) que muestran que la matriz sola no tiene ningún en favor de la supervivencia (Fig. 4). Por el contrario, las células CD34+ tratadas con LPA encapsuladas en geles de fibrina presentan alta supervivencia, comparable a los valores observados en células tratadas con LPA no encapsuladas en geles de fibrina (día 1: 69,0 ± 0,7% frente a 76,7 ± 1,5% para encapsuladas y no encapsuladas; respectivamente, día 3: 51,1 ± 0,8% frente a 37,2 ± 6,6% para encapsuladas y no encapsuladas, respectivamente).Injectable structures are very promising vehicles for administering stem cells for regenerative medicine as they provide favorable structural support for cell survival and proliferation (Pedroso, DC, et al., Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co - cultured with endothelial cells. PLoS One, 2011. 6 (1): page e16114; Kraehenbuehl, TP, R. Langer, and LS Ferreira, Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nat Methods, 2011. 8 (9): pages 7316; Nakamuta, JS, et al., Cell therapy attenuates cardiac dysfunction post myocardial infarction: effect of timing, routes of injection and a fibrin scaffold. PLoS One, 2009. 4 (6): page e6005). Several studies have shown that transplanted cells with structures in the cardiac context improved cell survival, induced angiogenesis and preserved cardiac function after infarction (Nakamuta, JS, et al., Cell therapy attenuates cardiac dysfunction post myocardial infarction: effect of timing, routes of injection and a fibrin scaffold PLoS One, 2009. 4 (6): page e6005; Christman, KL, et al., Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction. , 2004. 10 (3-4): pages 403-9; Kraehenbuehl, TP, et al., Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials, 2011. 32 (4): pages 1102 -9; Kutschka, I., et al., Collagen matrices enhance survival of transplanted cardiomyoblasts and contribute to functional improvement of ischemic rat hearts. Circulation, 2006. 114 (1 Suppl): pages 1167-73). Recently, it was shown that CD34 + cells have a higher initial adhesion to fibrin gels than to polystyrene, collagen and fibronectin plates (Pedroso, DC, et al., Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells cocultured with endothelial cells. PLoS One, 2011. 6 (1): page e16114). In addition, it is shown that fibrin gels support the survival of CD34 + cells for at least 10 days and the gels resist degradation of metalloprotease enzymes (Pedroso, DC, et al., Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells cocultured with endothelial cells PLoS One, 2011. 6 (1): page e16114). In a preferred embodiment, to examine whether fibrin gels support the survival of CD34 + cells under conditions of hypoxia and serum deprivation, cells untreated or treated with LPA (2x105) were encapsulated in fibrin gel (200 pL) and incubated in a 0.5% O2 hypoxia chamber, at 37 ° C, for 1 and 3 days. Cell viability was assessed by flow cytometry using annexin V / propidium iodide (PI) staining. Untreated CD34 + cells have poor survival in fibrin gels (23.2 ± 2.8% of viable cells, n = 3, on day 1, 12.6 ± 1.2% of viable cells, n = 5, on day 3) that show that the matrix alone has none in favor of survival (Fig. 4). In contrast, CD34 + cells treated with LPA encapsulated in fibrin gels have high survival, comparable to the values observed in cells treated with LPA not encapsulated in fibrin gels (day 1: 69.0 ± 0.7% vs. 76 , 7 ± 1.5% for encapsulated and non-encapsulated; respectively, day 3: 51.1 ± 0.8% versus 37.2 ± 6.6% for encapsulated and non-encapsulated, respectively).
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
4040
45Four. Five
50fifty
5555
6060
El LPA induce la supervivencia de células CD34+ principalmente a través del receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR)LPA induces survival of CD34 + cells primarily through the peroxisome proliferator activated receptor (PPAR)
Los papeles biológicos de LPA son diversos e incluyen efectos de desarrollo, fisiológicos y fisiopatológicos (Lin, ME, DR Herr y J. Chun, Lysophosphatidic acid (LPA) receptors: signaling properties and disease relevance. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 2010. 91(3-4): páginas 130-8). Hasta la fecha se han identificado hasta cinco receptores de LPA (LPAR): LPA1-LPAS (Choi, J.W., et al., LPA receptors: subtypes and biological actions. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2010. 50: páginas 157-86). Los receptores son receptores acoplados a proteína G (GPCR) y su presencia puede encontrarse en múltiples tejidos. LPA1, LPA2 y LPA3 se expresan ampliamente en la mayoría de los tejidos (Ishii, I., et al., Functional comparisons of the lysophosphatidic acid receptors, LP(A1)/VZG-1/EDG-2, LP(A2)/EDG-4, and LP(A3)/EDG-7 in neuronal cell lines using a retrovirus expression system. Mol Pharmacol, 2000. 58(5): páginas 895-902). LP4 se expresa en órganos específicos, como el páncreas, los ovarios y el timo (Lee, CW, et al., LPA(4)/GPR23 is a lysophosphatidic acid (LPA) receptor utilizing G(s)-, G(q)/G(i)-mediated calcium signaling and G(12/13)-mediated Rho activation. J Biol Chem, 2007. 282(7): páginas 4310-7). LPA5 se expresa en bajos niveles en multiples tejidos (Lee, C.W., et al., GPR92 as a new G12/13- and Gq-coupled lysophosphatidic acid receptor that increases cAMP, LPA5. J Biol Chem, 2006. 281(33): páginas 23589-97). Para identificar el receptor que está mediando el efecto en favor de la supervivencia de LPA (100 pM), se utilizó Ki16425 (10 pM), un antagonista específico de LPA1 y LPA3, y GW9662 (50 pM), un antagonista del receptor y activado por el proliferador de peroxisoma (PPARy). Los estudios indican que el LPA tiene una alta afinidad por este último receptor (Mclntyre, T.M., et al., Identification of an intracellular receptor for lysophosphatidic acid (LPA): LPA is a transcellular PPARgamma agonist. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(1): páginas 131-6; Gustin, C., M. Van Steenbrugge, y M. Raes, LPA modulates monocyte migration directly and via LPA-stimulated endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol, 2008. 295(4): páginas C905-14). Este enfoque se complementó, inhibiendo los objetivos más adelante de los receptores, incluyendo la Rho quinasa y la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) usando antagonistas de Y-2762 (50 pM) y PD98059 (60 pM), respectivamente. Se sabe que todas las LPAR se acoplan con y activan proteínas G, que a su vez activan MAPK (LPA1, LPA2, LPA3 y LPA4) y Rho quinasa (LPA1, LPA2, LPA4 y LPA5) (Choi, JW, et al., LPA receptors: subtypes and biological actions. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2010. 50: páginas 157-86). Las células se trataron durante 1 h en medio X-Vivo que contenía un antagonista específico seguido de cultivo en condiciones de hipoxia durante 24 h. La supervivencia celular se evaluó mediante análisis FACS después de la tinción con anexina V/PI. Los resultados indican que, bajo las condiciones analizadas, PPARy media principalmente el efecto en favor de la supervivencia de LPA (Fig. 5B). El antagonista de PPARy disminuyó significativamente (P <0,001, n = 11) el número de células viables inducidas por LPA desde ~77% hasta ~ 53%; sin embargo, no bloqueó totalmente el efecto en favor de la supervivencia del LPA, ya que las células sin LPA tienen una supervivencia del 39% (P <0,01). La inhibición de LPA1 y LPA3 por Ki16425 tuvo un efecto relativamente pequeño en la supervivencia de las células CD34+ (Fig. 5B). El número de células viables disminuyó desde 77% (+ LPA) hasta 67% (P <0,01, n = 19). Es importante destacar que la inhibición de la ruta de señalización de MAPK suprimió a niveles más altos el efecto en favor de la supervivencia de LPA que la inhibición de la ruta de señalización de Rho quinasa. Debido a que las dos rutas de señalización son los objetivos posteriores de diferentes LPAR (véase más arriba), esto podría indicar diferentes contribuciones de LPAR en la supervivencia de células CD34+. Tomados en conjunto, los datos muestran que el LPA puede promover la supervivencia de células CD34+ en condiciones hipóxicas y privadas de suero principalmente a través de la activación de PPARy.The biological roles of LPA are diverse and include developmental, physiological and pathophysiological effects (Lin, ME, DR Herr and J. Chun, Lysophosphatidic acid (LPA) receptors: signaling properties and disease relevance. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 2010. 91 ( 3-4): pages 130-8). To date, up to five LPA receptors (LPAR) have been identified: LPA1-LPAS (Choi, J.W., et al., LPA receptors: subtypes and biological actions. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2010. 50: pages 157-86). The receptors are G-protein coupled receptors (GPCR) and their presence can be found in multiple tissues. LPA1, LPA2 and LPA3 are widely expressed in most tissues (Ishii, I., et al., Functional comparisons of the lysophosphatidic acid receptors, LP (A1) / VZG-1 / EDG-2, LP (A2) / EDG-4, and LP (A3) / EDG-7 in neuronal cell lines using a retrovirus expression system, Mol Pharmacol, 2000. 58 (5): pages 895-902). LP4 is expressed in specific organs, such as the pancreas, ovaries and thymus (Lee, CW, et al., LPA (4) / GPR23 is a lysophosphatidic acid (LPA) receptor utilizing G (s) -, G (q) / G (i) -mediated calcium signaling and G (12/13) -mediated Rho activation. J Biol Chem, 2007. 282 (7): pages 4310-7). LPA5 is expressed at low levels in multiple tissues (Lee, CW, et al., GPR92 as a new G12 / 13- and Gq-coupled lysophosphatidic acid receptor that increases cAMP, LPA5. J Biol Chem, 2006. 281 (33): pages 23589-97). To identify the receptor that is mediating the effect in favor of the survival of LPA (100 pM), Ki16425 (10 pM), a specific antagonist of LPA1 and LPA3, and GW9662 (50 pM), a receptor antagonist and activated was used by the peroxisome proliferator (PPARy). Studies indicate that LPA has a high affinity for this last receptor (Mclntyre, TM, et al., Identification of an intracellular receptor for lysophosphatidic acid (LPA): LPA is a transcellular PPARgamma agonist. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100 (1): pages 131-6; Gustin, C., M. Van Steenbrugge, and M. Raes, LPA modulates monocyte migration directly and via LPA-stimulated endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol, 2008. 295 (4) : pages C905-14). This approach was complemented by inhibiting the targets of the receptors later, including Rho kinase and mitogen-activated protein kinase (MAPK) using Y-2762 (50 pM) and PD98059 (60 pM) antagonists, respectively. It is known that all LPARs are coupled with and activate G proteins, which in turn activate MAPK (LPA1, LPA2, LPA3 and LPA4) and Rho kinase (LPA1, LPA2, LPA4 and LPA5) (Choi, JW, et al., LPA receptors: subtypes and biological actions, Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2010. 50: pages 157-86). The cells were treated for 1 h in X-Vivo medium containing a specific antagonist followed by culture under hypoxia conditions for 24 h. Cellular survival was evaluated by FACS analysis after annexin V / PI staining. The results indicate that, under the conditions analyzed, PPAR and mainly mediates the effect in favor of LPA survival (Fig. 5B). The PPARy antagonist significantly decreased (P <0.001, n = 11) the number of viable cells induced by LPA from ~ 77% to ~ 53%; however, it did not completely block the effect in favor of LPA survival, since non-LPA cells have a 39% survival (P <0.01). The inhibition of LPA1 and LPA3 by Ki16425 had a relatively small effect on the survival of CD34 + cells (Fig. 5B). The number of viable cells decreased from 77% (+ LPA) to 67% (P <0.01, n = 19). Importantly, the inhibition of the MAPK signaling pathway suppressed the effect in favor of LPA survival at higher levels than the inhibition of the Rho kinase signaling pathway. Because the two signaling pathways are the later targets of different LPARs (see above), this could indicate different LPAR contributions in the survival of CD34 + cells. Taken together, the data shows that LPA can promote the survival of CD34 + cells in hypoxic and serum-deprived conditions primarily through the activation of PPARy.
LPA modula la liberación de citoquinas de células CD34+LPA modulates the release of cytokines from CD34 + cells
Para determinar el efecto de LPA en la liberación de citoquinas de señalización y factores de crecimiento por células CD34+, se usó una matriz de perlas de citoquina. Las células se incubaron en medio libre de suero X-Vivo durante 24 h en condiciones de normoxia o hipoxia, en presencia o ausencia de LPA (100 pM). Las células CD34+ no tratadas en normoxia expresan altos niveles (> 100 pg/mL) de IL-8 y MIP-1 b, niveles medios (entre 100 y 1 pg/mL) de IL-6, TNF-a y GM-CSF, y niveles bajos (<1 pg/mL) de IL-1 p, IL-4 e IL-17 (Fig. 5C). Las células CD34+ cultivadas en condiciones de hipoxia y privadas de suero expresan niveles significativamente más altos de IL-1 p (~8 veces), IL- 4 (~2 veces), IL-6 (~1,2 veces), IL-8 (~10 veces), IL-17 (~4 veces) y GM-CSF (~2 veces), que en condiciones de normoxia. Curiosamente, las células CD34+ cultivadas en condiciones hipoxia y de privación de suero pero en presencia de LPA aumentan la secreción de IL-4 (de ~0,9 a ~2,7 pg/mL), IL-8 (de ~10,000 a ~17,000 pg/mL) y TNF- a de ~3 a ~15 pg/mL) y disminuyen la secreción de IL-1 p (de ~9 a ~2 pg/mL), IL-6 (de ~4 a ~2 pg/mL) y gM -CSF (de ~4 a ~1 pg/mL) en comparación con las células cultivadas en las mismas condiciones pero en ausencia de LPA.To determine the effect of LPA on the release of signaling cytokines and growth factors by CD34 + cells, a matrix of cytokine beads was used. The cells were incubated in serum-free medium X-Vivo for 24 h under conditions of normoxia or hypoxia, in the presence or absence of LPA (100 pM). Untreated CD34 + cells in normoxia express high levels (> 100 pg / mL) of IL-8 and MIP-1 b, medium levels (between 100 and 1 pg / mL) of IL-6, TNF-a and GM-CSF , and low levels (<1 pg / mL) of IL-1 p, IL-4 and IL-17 (Fig. 5C). CD34 + cells grown under hypoxia and serum-deprived conditions express significantly higher levels of IL-1 p (~ 8 times), IL-4 (~ 2 times), IL-6 (~ 1.2 times), IL- 8 (~ 10 times), IL-17 (~ 4 times) and GM-CSF (~ 2 times), which under normoxia conditions. Interestingly, CD34 + cells grown under hypoxia and serum deprivation conditions but in the presence of LPA increase the secretion of IL-4 (from ~ 0.9 to ~ 2.7 pg / mL), IL-8 (from ~ 10,000 to ~ 17,000 pg / mL) and TNF- a from ~ 3 to ~ 15 pg / mL) and decrease the secretion of IL-1 p (from ~ 9 to ~ 2 pg / mL), IL-6 (from ~ 4 to ~ 2 pg / mL) and gM -CSF (from ~ 4 to ~ 1 pg / mL) compared to cells grown under the same conditions but in the absence of LPA.
Las células CD34+ tratadas con LPA conservan la función cardíaca después de un infarto de miocardioCD34 + cells treated with LPA retain cardiac function after myocardial infarction
Se ha demostrado que el trasplante de células CD34+ humanas en el corazón después del infarto mejora la fracción de eyección del ventrículo izquierdo y preserva el tejido cardíaco. Para evaluar el potencial terapéutico de células CD34+ tratadas con LPA, las células se administraron (1x106 células) tratadas con LPA (100 pM) en una solución de precursor de gel de fibrina (100 pL) en el corazón infartado de ratas sin pelo. Infartos de miocardio fueron inducidos por la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD). Los corazones infartados sin ningún tratamiento (simulado) o tratados con células CD34+ suspendidas en una solución de precursor de gel de fibrina se usaron como controles. Después de 2 semanas después de la implantación, las propiedades funcionalesIt has been shown that transplantation of human CD34 + cells in the heart after infarction improves left ventricular ejection fraction and preserves heart tissue. To assess the therapeutic potential of CD34 + cells treated with LPA, the cells were administered (1x106 cells) treated with LPA (100 pM) in a fibrin gel precursor solution (100 pL) in the infarcted heart of hairless rats. Myocardial infarctions were induced by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). Hearts infarcted without any treatment (simulated) or treated with CD34 + cells suspended in a fibrin gel precursor solution were used as controls. After 2 weeks after implantation, the functional properties
del corazón se evaluaron mediante ecocardiografía. El ventrículo izquierdo de la rata de control tuvo un acortamiento fraccional medio de 42,7 ± 1,6 (n = 10) y 41,6 ± 3,8 (n = 10) a 1 día y 2 semanas, respectivamente; las ratas tratadas con células CD34+ encapsuladas en una solución de precursor de gel de fibrina tenían un acortamiento fraccional medio de 36,7 ± 3,4 (n = 6) y 44,5 ± 3,0 (n = 6) a 1 día y 2 semanas, respectivamente; y finalmente las ratas tratadas 5 con células CD34+ tratadas con LPA y encapsuladas en una solución de precursor de gel de fibrina tuvieron un acortamiento de fraccional medio de 37,5 ± 1,2 (n = 6) y 47,0 ± 2,0 (n = 6) a 1 día y 2 semanas, respectivamente (Fig. 6A). Debido a que el acortamiento fraccional inicial es diferente entre los grupos experimentales, se utilizó la diferencia de los acortamientos fraccionales a las 2 semanas y el día 1 para comparar la efectividad terapéutica de los tratamientos (Fig. 6B). La mediana de las diferencias en los acortamientos fraccionales fue de 7,5 y 2,6 en las 10 células tratadas con LPA + gel y los grupos simulados, respectivamente, siendo las diferencias estadísticamente significativas (P <0,05). No se observaron diferencias estadísticas entre corazones tratados con células CD34+ y simulaciones (P> 0,05). Tomados en conjunto, la administración de células CD34+ tratadas con LPA en el corazón infartado mejora el acortamiento fraccional cardíaco, y el efecto fue superior a las células CD34+ no tratadas.of the heart were evaluated by echocardiography. The left ventricle of the control rat had a mean fractional shortening of 42.7 ± 1.6 (n = 10) and 41.6 ± 3.8 (n = 10) at 1 day and 2 weeks, respectively; rats treated with CD34 + cells encapsulated in a fibrin gel precursor solution had a mean fractional shortening of 36.7 ± 3.4 (n = 6) and 44.5 ± 3.0 (n = 6) at 1 day and 2 weeks, respectively; and finally rats treated with CD34 + cells treated with LPA and encapsulated in a fibrin gel precursor solution had a mean fractional shortening of 37.5 ± 1.2 (n = 6) and 47.0 ± 2.0 (n = 6) at 1 day and 2 weeks, respectively (Fig. 6A). Because the initial fractional shortening is different between the experimental groups, the difference in fractional shortening at 2 weeks and on day 1 was used to compare the therapeutic effectiveness of the treatments (Fig. 6B). The median of the differences in fractional shortening was 7.5 and 2.6 in the 10 cells treated with LPA + gel and the simulated groups, respectively, the differences being statistically significant (P <0.05). No statistical differences were observed between hearts treated with CD34 + cells and simulations (P> 0.05). Taken together, the administration of CD34 + cells treated with LPA in the infarcted heart improves cardiac fractional shortening, and the effect was superior to untreated CD34 + cells.
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