ES2657875T3

ES2657875T3 - Partículas tipo virus que comprenden una proteína de la matriz de un virus encapsulado de plantas y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2657875T3
Application number: ES13712662.9T
Authority: ES
Inventors: Alexei PROKHNEVSKY; Vidadi Yusibov
Original assignee: Fraunhofer USA Inc
Current assignee: Fraunhofer USA Inc
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2018-03-07
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: BR112014019755A2; EP2827893A1; CA2864733A1; CA2864733C; EP2827893B1; WO2013142329A1; CN104203273B; IN2014DN07152A; US9364530B2; CN104203273A; US20150086589A1; BR112014019755B1

Abstract

Una partícula tipo virus que comprende una proteína de la matriz de un primer rhabdovirus de plantas y un polipéptido de superficie, en la que el polipéptido de superficie comprende (a) una parte expuesta a la superficie de un polipéptido diana, en la que el polipéptido diana es de un virus animal, bacteria, parásito u hongo y en la que la parte expuesta a la superficie del polipéptido de superficie es antigénica (b) un dominio transmembrana, y (c) una cola citosólica de una proteína transmembrana de un segundo rhabdovirus de plantas.

Description

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produce una VLP.

Las VLP que se producen por un procedimiento de acuerdo con la presente invención pueden ser de cualquier tamaño. Por ejemplo, las VLP pueden tener un diámetro en el intervalo de aproximadamente 5-350 nm, incluyendo de aproximadamente 40-60 nm. Preferentemente las VLP son de un tamaño sustancialmente uniforme. La expresión “de un tamaño sustancialmente uniforme” que se utiliza en el presente documento significa que al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %, preferentemente al menos aproximadamente un 80 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 95 %, de las VLP tienen un diámetro con menos de aproximadamente un 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, o 5 %, preferentemente menos de aproximadamente un 30 %, más preferentemente menos de aproximadamente un 20 %, más preferentemente menos de un 10 %, del diámetro medio de todas las VLP. El diámetro de una VLP puede estar en el intervalo o valor medio de una o más mediciones del diámetro de las VLP. El diámetro de una VLP se puede determinar por técnicas convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, por observación utilizando un microscopio electrónico, fraccionamiento en gradiente de sacarosa, cromatografía de exclusión por tamaño, y dispersión de luz dinámica. Los valores del diámetro de la VLP se pueden analizar utilizando distintos software, por ejemplo el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD) y otros software disponibles en el mercado.

La una o más moléculas de ácido nucleico puede comprender adicionalmente una región reguladora unida operativamente a la primera o segunda secuencia de nucleótidos. La región reguladora se puede activar en una célula vegetal por la expresión de la proteína codificada por la primera o segunda secuencia de nucleótidos. La región reguladora puede incluir un promotor, por ejemplo, un promotor vírico de plantas. Preferentemente, la primera y segunda secuencias de nucleótidos están en la misma molécula de ácido nucleico, pero unidas a regiones reguladoras diferentes. La una o más moléculas de ácido nucleico pueden comprender adicionalmente una tercera secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido de superficie adicional.

Para cada molécula de ácido nucleico, se proporciona un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico. El vector puede incluir una secuencia limítrofe de una secuencia de un ADN de transferencia bacteriano en cualquier extremo, situado en un ADN de transferencia bacteriano para permitir el suministro del ácido nucleico en una célula vegetal. Específicamente, el vector puede comprender una o más secuencias de ácido nucleico a partir de un plásmido Ti de un vector binario, y puede comprender también una secuencia vírica de plantas. Dicho vector, incluyendo los elementos de un plásmido Ti y un vector vírico, se denomina también un vector lanzadera. Este vector también se puede utilizar para la co-expresión de la proteína o polipéptido de interés (por ejemplo, la proteína de la matriz y/o el polipéptido de superficie) con una proteína tal como un supresor de silenciamiento o una enzima de modificación post-traduccional tal como la PNGasaF, para modificar, afectar a la expresión y/o aumentar la producción de la proteína de interés, por ejemplo, facilitando la maduración o acumulación de la proteína.

Cada molécula de ácido nucleico se puede introducir en la célula vegetal, la planta o la parte de una planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, tejido floral, semillas o peciolos) utilizando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se puede suministrar mediante infiltración, bombardeo de partículas, o inoculación. La molécula de ácido nucleico se podría utilizar como parte de un sistema inducible activado, por ejemplo, por agentes químicos, luz o choque térmico. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico se introduce en la célula vegetal mediante infiltración. La molécula de ácido nucleico puede introducirse de manera transitoria o estable.

Se proporciona una célula vegetal recombinante que comprende una o más moléculas de ácido nucleico. La una o más moléculas de ácido nucleico comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la matriz y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de superficie. Preferentemente, la primera y segunda secuencias de nucleótidos están en una molécula de ácido nucleico. La proteína de la matriz es de un primer rhabdovirus de plantas. El polipéptido de superficie comprende una parte expuesta a la superficie de un polipéptido diana, en el que el polipéptido diana es de un virus animal, bacteria, parásito u hongo y en el que la parte expuesta a la superficie del polipéptido de superficie es antigénica, un domino transmembrana y una cola citosólica. La cola citosólica se deriva de una proteína transmembrana (por ejemplo, una glicoproteína) de un segundo rhabdovirus de plantas. El primer y segundo rhabdovirus de plantas puede ser en mismo o diferentes, preferentemente el mismo. El domino transmembrana se puede derivar o no del polipéptido diana. La cola citosólica es de una glicoproteína de un rhabdovirus de planas. Por ejemplo, la cola citosólica se puede derivar de una glicoproteína de rhabdovirus. La primera o segunda secuencia de nucleótidos puede estar unida a un promotor capaz de activarse en la célula vegetal para la co-expresión de la proteína de la matriz o el polipéptido de superficie, respectivamente. También se proporciona una planta o una parte de la misma que comprende la célula vegetal de la presente invención.

Para la producción de las VLP de la presente invención, se puede mantener una célula vegetal, o una planta o una parte de la misma en condiciones que permitan la expresión de la proteína de la matriz y el polipéptido de superficie, dando como resultado la producción de las VLP. Dichas condiciones incluyen una temperatura, humedad, presión, ciclo de luz/oscuridad, e iluminación adecuadas. Preferentemente, la proteína de la matriz y el polipéptido de superficie se co-expresan en las mismas células vegetales.

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preferentemente ±5 %, más preferentemente ±1 % y aún más preferentemente ±0,1 % del valor especificado, según sean apropiadas dichas variaciones.

Ejemplo 1. Construcción de vectores mino-BYV

Para demostrar la fiabilidad del ensamblaje de VLP utilizando proteínas de la matriz (proteínas M) de diferentes virus encapsulados de plantas, se modificaron una proteína M rhabdovírica y un antígeno diana que contenía un domino transmembrana (TM) y una cola citosólica de una glicoproteína LNYV (proteína G) para la co-expresión en células vegetales. Para la co-expresión de estas proteínas se utilizó un vector miniBYV (Fig. 2). El vector miniBYV contiene un mini-replicón derivado de un virus Closteroviridae (por ejemplo, virus de amarilleamiento de la remolacha), que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica solamente las proteínas necesarias para la replicación del virus Closteroviridae. Específicamente, la proteína M del LNYV o NCMV se co-expresaban con una hemaglutinina (HAi) del virus de gripe aviar H5N1 (A/Indonesia/05/2005).

En resumen, un gen que codifica la proteína HAi que tiene su dominio TM nativo (HAi-TM) se clonó en un vector miniBYV para generar el plásmido miniBYV-HAi-TM. La proteína HAi-TM (SEQ ID NO: 1) incluía un péptido de señal PR1a de Nicotiana tabacum (subrayado), un ectodominio HAi, un domino transmembrana HAi nativo (en negrita), y una cola citosólica de HAi nativa (en cursiva) (Fig. 11A). Posteriormente, un gen que codifica la proteína M del LNYV (proteína MLNYV) o NCMV (proteína MNCMV) se introdujo en el plásmido miniBYV-HAi-TM bajo el control del promotor de la proteína homóloga de revestimiento closterovírica (CP) para generar un plásmido miniBYV-HAi-TM/ MLNYV o miniBYV-HAi-TM MNCMV (Fig. 3). Para la evaluación de la VLP, los clones positivos se transformaron en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefasciens y entonces se introdujo en plantas de Nicotiana benthamiana para producir las VLP.

En paralelo, se modificó el gen HAi para codificar una hemaglutinina proteica recombinante (HAi-TM(G)), en la que el TM nativo y la cola citosólica de HAi se sustituyen con un dominio transmembrana y cola citosólica de una glicoproteína de LNYV, respectivamente. Se introdujeron una secuencia de nucleótido que codifica la proteína HAiTM(G) (SEQ ID NO: 2), que incluía un péptido de señal PR1a de Nicotiana tabacum (subrayado), un ectodominio HAi, un domino proteico transmembrana de LNYV (en negrita), y una cola citosólica glicoproteica de LNYV (en cursiva) (Fig. 11B), en el vector miniBYV que contenía la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína M de LNYV (MLNYV) (SEQ ID NO: 3) (Fig. 12A). La construcción resultante, miniBYV-HAi-TM(G)/ MLNYV (Fig. 3), se secuenció, y los clones positivos se transformaron en A. tumefasciens y entonces se introdujeron en plantas de Nicotiana benthamiana para producir VLP HAi-TM(G)-MLNYV.

Como control, se introdujo un gen que codifica la proteína de la matriz (proteína M1) del virus de gripe aviar H5N1 (A/indonesia/05/2005) (SEQ ID NO: 4) (Fig. 12B) en el plásmido miniBYV-HAi-TM bajo el control del promotor closterovírico heterólogo de proteína de revestimiento (CP) para generar el plásmido miniBYV-HAi-TM/M1. Como se ha descrito anteriormente, se utilizó el PR1a como péptido de señal. Los clones positivos se transformaron en A. tumefaciens y entonces se introdujeron en plantas de Nicotiana benthamiana para producir VLP HAi-TM/M1.

Ejemplo 2. Optimización del procedimiento de infiltración

Para evaluar el nivel de expresión de HAi y desarrollar las condiciones de infiltración al vacío, se utilizaron plantas de

N. benthamiana cultivadas hidropónicamente. Para analizar la expresión de HAi-TM, se llevaron a cabo la infiltración manual y la infiltración al vacío de miniBYV-HAi-TM utilizando el mismo tampón. Se utilizaron plantas de Nicotiana benthamiana de cinco semanas de edad cultivadas en lana mineral en envases bivalvos para la infiltración al vacío y manual. Se cultivaron las agrobacterias en medio LB, que se suplementó con 50 ng/ml de Kanamicina y 50 ng/ml de Higromicina. Se cultivaron los cultivos de un litro durante una noche a 28 ºC, agitando a 220 rpm durante 18-24 horas.

Se determinó la concentración de una noche midiendo la DO600 de cada cultivo. Las agrobacterias se aglomeraron por centrifugación a 4000 g durante 15 min a 4 ºC. Los aglomerados bacterianos se re-suspendieron en 100 ml de medio MMA reciente (10 nM de MgCl2; 10 mM de MES, pH 5,85; y 20 mM de acetosiringona). La concentración final de cada cultivo se registró después de balancearlo durante 2 horas a temperatura ambiente. Los cultivos que contenían miniBYV y el supresor de silenciamiento P1/HcPro (el miniBYV necesita el uso de un supresor de silenciamiento para conseguir niveles de expresión de la diana buenos) se mezclaron a relaciones de DO600 1,0:0,2, respectivamente. Para la infiltración al vacío se infiltraron los envases bivalvos con agrobacterias que contenían el miniBYV: P1/HcPro. Las plantas infiltradas se alimentaron con 50 ppm de hidrosol y se colocaron en una sala de cultivo durante 5-8 días.

Para la infiltración manual, se infiltraron manualmente 3-5 hojas de Nicotiana benthamiana cultivada hidropónicamente utilizando una jeringa de 10 cc sin aguja. Las plantas se alimentaron con 50 ppm de hidrosol y se mantuvieron en la sala de post infiltración durante 5-8 días.

Los niveles de expresión de HAi-TM se determinaron basándose en la cantidad de proteína HAi-TM detectada por un anticuerpo monoclonal anti-HAi-5G6 en el análisis de transferencia de Western (Fig. 5). La expresión de HAi-TM era mayor en las hojas infiltradas al vacío a los 6 días después de las infiltraciones (dpi) y 7 dpi en comparación con las hojas infiltradas manualmente (Tabla 1). Por ejemplo, a los 6 dpi, la proteína HAi-TM se expresó a 249 mg/kg en

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hojas infiltradas al vacío, que representaban un aumento del 43 % en la expresión en comparación con las hojas infiltradas manualmente.

Tabla 1. Transcurso de los niveles de expresión para HAi-TM

Días post infiltración: Infiltración manual (mg/kg) Infiltración al vacío (mg/kg)

5: 73 46

6: 174 249

7: 120 123

8: 180 105

Ejemplo 3. VLP HAi-TM producidas en plantas

Para caracterizar la formación de VLP HAi-TM se clonaron en el vector miniBYV utilizando los sitios de restricción PacI/NheI. El plásmido resultante miniBYV-HAi-TM se transformó con la cepa GV3101 de Agrobacterium. Se recolectaron las hojas infiltradas de Nicotiana benthamiana a los 7 días después de la infiltración y se purificaron las VLP. La distribución de las VLP HAi-TM sin proteína de la matriz a lo largo de un gradiente de un 10 %-40 % de sacarosa detectándose los picos de las fracciones 9 y 10 por un anticuerpo monoclonal de ratón anti-HAi 5G6 (desarrollado por el grupo de inmunología en Fraunhofer -USA Center for Molecular Biotechnology) (Fig. 6A). Para evaluar la morfología de las VLP-HAi en la fracción 10, se analizaron las VLP de esta fracción por tinción negativa utilizando microscopía de transmisión de electrones (TEM). Se observaron VLP HAi-TM con diferentes tamaños y formas (Fig. 6B).

Las VLP HAi-TM/M1 que tienen la proteína HAi con su dominio transmembrana nativo y la cola citosólica coexpresados con M1 del virus de la gripe A/05/05 se produjeron expresando el miniBYV-HAi-TM/M1 en plantas utilizando la infiltración al vacío como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se purificaron las VLP HAi-TM/M1 utilizando un gradiente de sacarosa, y se caracterizaron por análisis de transferencia de Western y microscopía electrónica utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón anti-HAi 5G6, y se descubrió que se distribuían a través del gradiente de sacarosa del 105-50 % con fracciones pico 9 y 10 (Fig. 7A). No se detectó la incorporación de la proteína M1 en las mismas VLP HAi-TM/M1 a través del gradiente de sacarosas 10-40 % (Fig. 8A) utilizando un anticuerpo policlonal anti-M1 de cabra de Meredian Life science, Inc. EE. UU. Entretanto, se confirmó la expresión de proteína M1 por transferencia de Western utilizando un anticuerpo policlonal de cabra anti-proteína M1 (Fig. 8B). No se detectaron VLP uniformadas después de la co-expresión de HAi-TM y la proteína M1 de la matriz de gripe (Fig. 7B).

Ejemplo 4. VLP HAi-TM/MLNYV producidas en plantas

Se produjeron VLP HAi-TM/MLNYV que tiene la proteína HAi-TM (es decir, la proteína HAi con su dominio transmembrana y cola citosólica nativos) y la proteína M de LNYV (proteína MLNYV) expresando el miniBYV-HAi-TM/ MLNYV en planas utilizando la infiltración al vacío como se ha descrito en el Ejemplo 2. Las VLP HAi-TM/ MLNYV se purificaron utilizando un gradiente de sacarosa 10 %-40 % y se caracterizaron por SDS-PAGE, análisis de transferencia de Western y microscopía electrónica. La presencia del determinante inmunológico HAi de la superficie de estas VLP se confirmó con marcado Inmunogold utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón anti-HAi 5G6 (Fig. 9B). También se utilizó este anticuerpo para detectar la distribución de las VLP en un gradiente de sacarosa 10 %40 % con un pico en la fracción 10 (Fig. 9A). La distribución de las VLP HAi-TM/ MLNYV era similar a la observada en las VLP HAi-TM/M1 (Fig. 7A y 9A). No había una diferencia perceptible en la morfología de la VLP (por ejemplo, forma y tamaño) (Fig. 7B y 9B).

Ejemplo 5. VLP HAi-TM(G)/MLNYV uniformes producidas en plantas

Se produjeron VLP HAi-TM(G)/ MLNYV que tenía la proteína HAi-TM(G) (es decir, la proteína HAi con un domino transmembrana y una cola citosólica de una glicoproteína rhabdovírica (G)) y la proteína M de LNYV (proteína MLNYV) expresando el miniBYV-HAi-TM(G)/ MLNYV en plantas utilizando la infiltración al vacío como se describe en el Ejemplo 2. Después de la separación de las VLP HAi-TM(G)/ MLNYV por un gradiente de sacarosa del 10 %-40 %, se recolectó 1 ml de las fracciones y se analizaron por análisis de transferencia de Western utilizando el anticuerpo monoclonal anti-HAi 5G6. Se observó un cambio en el pico de recolección diana. A diferencia de las VLP HAi-TM/ MLNYV, las VLP HAi-TM(G)/ MLNYV se detectaban en las fracciones 6, 7 y 8 con un pico agudo en la fracción 7 (Fig. 10A). El marcado Inmunogold después del TEM presentaba unas VLP HAi-TM(G)/ MLNYV) redondeadas (Fig. 10B). El tamaño de las VLP HAi-TM(G)/ MLNYV determinado por el software ImageJ (NIH Bethesda, MD) será de 50,5615 nm. Las VLP HAi-TM(G)-MLNYV tenían un tamaño y forma sustancialmente uniformes. Otras realizaciones de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica en consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la invención desvelada en el presente documento. Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren solamente como ejemplos, estando indicados el ámbito real y el espíritu de la invención por las siguientes reivindicaciones.

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Claims

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