ES2645443T3 - Oligonucleótidos que comprenden una estructura secundaria y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un oligonucleótido monocatenario que tiene un extremo 5' y un extremo 3', comprendiendo dicho oligonucleótido una primera y una segunda secciones, estando la primera sección situada 5' de la segunda sección, en el que: (i) la primera sección está marcada internamente con al menos dos marcas detectables, siendo las al menos dos marcas detectables iguales, y es capaz de hibridarse con un polinucleótido diana; y (ii) la segunda sección no es capaz de hibridarse con un polinucleótido diana; comprendiendo dicha segunda sección una estructura de tallo-bucle que comprende una primera porción, una segunda porción y una tercera porción y en donde la segunda porción está situada entre las porciones primera y tercera, y las porciones primera y tercera son complementarias entre sí, no estando la estructura de tallo-bucle marcada con una marca detectable; y adicionalmente en el que el oligonucleótido (a) no se escinde por una exonucleasa 3'-5' y (b) no se extiende por una polimerasa, cuando se usa en un método de detección de un polinucleótido diana.

Description

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DESCRIPCION
Oligonucleotidos que comprenden una estructura secundaria y usos de los mismos
La presente invencion se refiere a oligonucleotidos, y en particular a sus usos como sondas en la deteccion de eventos de hibridacion y deteccion y/o discriminacion de acidos nucleicos usando marcas detectables (tales como marcas visualmente detectables).
Las tecnologlas de sondas basadas en oligonucleotidos marcados con marcas detectables (tales como fluoroforos) son tradicionales, especialmente con el fluoroforo como una adicion en el extremo de fosfato 5'. Tal marcado terminal es barato y de ahl que el desarrollo y la aplicacion de tales sondas sean generalizados traves de las aplicaciones de biologla molecular. A diferencia, un diseno ventajoso de sondas en el que multiples fluoroforos pueden unirse a las bases de nucleosido o azucares dentro de la secuencia de oligonucleotidos (es decir, marcarse internamente), tal como sondas HyBeacon (French et al. (2001), documentos WO 01/73118, WO 07/010268), ha sido menos ampliamente aplicado debido a la naturaleza inherentemente mas cara de tales adiciones de fluoroforos internos. En oligonucleotidos terminalmente marcados, normalmente existe la necesidad de una molecula extintora separada para que tambien este presente con el fin de prevenir una senal antes de que el oligonucleotido se hibride con un polinucleotido diana. Los oligonucleotidos internamente marcados (tales como aquellos descritos en los documentos WO 01/73118, WO 07/010268) normalmente no requieren la presencia de un extintor separado debido a que la secuencia monocatenaria de la sonda de oligonucleotidos sirve para actuar de extintor para la marca (extincion de ADN).
El campo tradicional de uso de los oligonucleotidos de acido nucleico marcados como indicador de la presencia de una secuencia de acidos nucleicos diana (ADN o ARN) utiliza la complementariedad de secuencias de nucleotidos directa de una sonda basada en oligonucleotidos con su secuencia de acidos nucleicos diana y su correspondencia unica lograda por la suficiente secuencia compartida en comparacion con los antecedentes genomicos.
La hibridacion de oligonucleotidos con secuencias de acidos nucleicos elimina la extincion de ADN e interacciones colorante-colorante y produce elevada emision de fluorescencia (documentos WO 01/73118, WO 07/010268). Cambios en la emision de fluorescencia permiten la deteccion de secuencias de acidos nucleicos especlficas y la estabilidad de las interacciones entre sondas y dianas permite que secuencias polimorficas sean discriminadas basandose en la longitud y secuencia (French et al. 2001, French et al. 2002, French et al. 2007, French et al. 2008).
El uso deliberado de cualquier complementariedad de secuencias parcial o el uso de oligonucleotidos adicionales que proporcionan eventos de hibridacion intermedios entre la sonda y su diana es innecesario, a menos que se desee lograr un punto del extremo molecular adicional particular junto con la interaccion sonda-diana.
En el ejemplo de una sonda de oligonucleotidos fluorescente, el importante beneficio progresivo de la complementariedad de secuencias directa encontrada en el par hibridado sonda-diana convencional es que cualquier variacion de secuencia en la diana, tal como un polimorfismo de un solo nucleotido (SNP), es directamente perturbador para esa hibridacion y de ahl la salida fluorescente de la sonda.
Las secuencias de tallo-bucle de ADN en sondas de oligonucleotidos ya son conocidas por ser utiles en la generacion de senales y la deteccion de dianas, predominantemente de forma que la estructura de tallo-bucle se pierde cuando el oligonucleotido se hibrida con un polinucleotido diana (es decir, el oligonucleotido ya no posee una estructura secundaria).
"Sondas fluorescibles" son oligonucleotidos monocatenarios que forman estructura de tallo-bucle (Tyagi & Kramer, 1996; Tyagi et al. 1998). El tallo comprende dos secuencias de acidos nucleicos complementarias que estan situadas en cualquier lado de una secuencia de sondeo. Una de las secuencias de tallo normalmente esta marcada con un fluoroforo y la otra normalmente esta marcada con un extintor no fluorescente. La estructura de tallo-bucle pone los restos de fluoroforo y de extintor en estrecha proximidad para extinguir eficientemente la emision de fluorescencia. Los componentes de bucle de los oligonucleotidos de sonda fluorescible son complementarios a los acidos nucleicos diana y la hibridacion produce la disociacion del tallo-bucle, ya que la hibridacion sonda/diana intermolecular es mas estable que la interaccion intramolecular entre las secuencias de tallo de oligonucleotidos. La separacion de marcas de fluoroforo y de extintor tras la hibridacion de sondas debido a la disociacion de la estructura de tallo-bucle produce elevada emision de senal. Los oligonucleotidos de sonda fluorescible pueden usarse para PCR en tiempo real y analisis de curvas de fusion.
Similar a las sondas fluorescibles, Knemeyer et al. (2000) describen oligonucleotidos (sondas Smart) que tienen estructura de tallo-bucle, pero logran extincion de la fluorescencia por transferencia de electrones intramoleculares fotoinducida a restos de guanina en una de las secuencias de tallo de oligonucleotidos. Un fluoroforo (tal como el colorante de oxazina JA242) unido al extremo de una secuencia de tallo de oligonucleotidos se pone en estrecha proximidad con la secuencia rica en G en la secuencia de tallo complementaria de la horquilla. La hibridacion de sondas con las secuencias diana separa el fluoroforo de la secuencia rica en G, causando el potenciamiento de la fluorescencia.
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Los cebadores Scorpion™ comprenden una secuencia de sondeo que esta situada dentro de una estructura de tallo- bucle, con secuencias de tallo complementarias situadas en cualquier lado de la secuencia de sondeo (Whitcombe et al. 1999; Thelwell et al. 2000). Un resto de fluoroforo unido al extremo 5' del oligonucleotido se inactiva por una modification de extintor interna unida al extremo 3' del tallo-bucle. La secuencia de tallo-bucle esta unida al extremo 5' de un cebador de PCR mediante un detenedor de PCR tal como hexaetilenglicol (HEG). La extension del primer componente genera la secuencia diana para el componente de sondeo del oligonucleotido. La hibridacion de sondas intramoleculares con la diana amplificada produce la disociacion de la estructura de tallo-bucle y elevada emision de fluorescencia.
Sondas fluorescibles, sondas Smart y cebadores Scorpion™ usan estructuras de horquilla con secuencias de tallo localizadas en ambos extremos de una secuencia de sondeo. Los bucles se unen al polinucleotido diana, pero las secuencias de tallo no interaccionan con la diana.
Satterfield et al. (2007) y el documento US2009/0305264 describen oligonucleotidos (sondas Tentacle™) que tienen secuencias de tallo-bucle similares a sondas fluorescibles (con restos de fluoroforo y de extintor puestos en estrecha proximidad en una horquilla) unidas a una secuencia de sonda de captura mediante un conector. El componente de sonda de captura se une a la secuencia diana y pone el componente de tallo-bucle en estrecha proximidad con la diana en la direction 3'. La secuencia de sonda de la horquilla se une entonces a la secuencia diana para separar las marcas de fluoroforo y de extintor y aumentar la emision de fluorescencia. Se informa que la adicion de la secuencia de sonda de captura mejora la cinetica de hibridacion.
El documento WO 2010/101947 tambien describe oligonucleotidos de tallo-bucle usados para detectar la secuencia de acidos nucleicos (tambien una forma de sonda Tentacle™). Las estructuras de horquilla se forman en los extremos 5' o 3' para poner dos marcas en estrecha proximidad en ausencia de diana (para la extincion de colorante o FRET). Uno de los extremos de oligonucleotido (5' o 3') es complementario a una region interna de la secuencia de sonda y el bucle de la horquilla es complementario a un acido nucleico diana. El otro extremo de oligonucleotido (3' o 5') se extiende mas alla de la horquilla para iniciar la hibridacion de diana y ayudar en la hibridacion de la secuencia de sondeo dentro de la estructura de tallo-bucle. La secuencia de sondeo adicional fuera de la horquilla mejora la cinetica de hibridacion. La hibridacion de diana hace que las marcas de oligonucleotido se separen para la elimination de extincion de fluorescencia o interacciones FRET.
Nazarenko et al. (1997) describen oligonucleotidos (cebadores Sunrise o Amplifluor™) que tienen una estructura de tallo-bucle unida al extremo 5' de un cebador. Un fluoroforo esta unido al extremo 5' del oligonucleotido y un extintor esta situado proximo al extremo 3' del cebador. La formation de la estructura de tallo-bucle pone los restos de fluoroforo y de extintor en estrecha proximidad sobre el tallo causando la eficiente extincion de fluorescencia. La amplification por PCR hace que los cebadores Sunrise se incorporen en productos de amplification, previniendo la formacion del tallo-bucle y causando la separation de restos de fluoroforo y de extintor. La emision de fluorescencia es elevada en presencia de secuencias diana amplificadas. Sin embargo, la amplificacion no especlfica que surge de los dlmeros de cebador tambien puede producir emision de fluorescencia potenciada.
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Nazarenko et al. (2002) describen oligonucleotidos (cebadores LUX ) que estan marcados con un unico fluoroforo situado proximo al extremo 3' de un cebador. Una secuencia de 5-7 nucleotidos esta situada en el extremo 5' del oligonucleotido que es complementario al extremo 3' del cebador para crear una horquilla. Los oligonucleotidos no comprenden una modificacion de extintor, pero usan extincion de ADN en la horquilla para reducir la emision de senal en ausencia de diana. La amplificacion por PCR produce oligonucleotidos que van a incorporarse en productos de amplificacion, previniendo la formacion de la estructura de tallo-bucle y eliminando el extintor de ADN impuesto por la horquilla.
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Las sondas Tentacle , los cebadores Sunrise y los cebadores LUX usan todos secuencias de tallo-bucle para la detection de dianas usando estructuras de horquilla para poner dos marcas (o una secuencia de nucleotidos de marca y extintora) en estrecha proximidad en ausencia de diana. La hibridacion de sondas con acidos nucleicos diana produce marcas de oligonucleotidos que van a separarse permitiendo la medicion de emision de fluorescencia alterada. En cada una, la secuencia de nucleotidos especlfica de diana se incorpora en la estructura de horquilla.
El documento US 2007/0015176 ensena sondas de detector con estructuras secundarias variables, cada una de las cuales incluye al menos una estructura de tallo-bucle. Las sondas de detector del documento US 2007/0015176 requieren todas que haya una estructura de nucleotidos bicatenaria que comprende dos oligonucleotidos separados.
El documento US 2006/0216692 describe construcciones de acidos nucleicos marcadas con tanto una marca fluorescente como una molecula extintora. Los oligonucleotidos marcados incluyen al menos una estructura de tallo- bucle y sirven de construcciones conmutables que conmutan entre dos estructuras secundarias alternativas. La primera estructura secundaria comprende dos estructuras de tallo-bucle y pone el extintor y el fluoroforo en estrecha proximidad entre si, la estructura secundaria alternativa, que se forma con la hibridacion de una conformation de diana es una estructura de tallo-bucle extendida (con un tallo alargado) de forma que el fluoroforo y el extintor ya no estan en estrecha proximidad y una senal es detectable. La portion de oligonucleotido que se hibrida con una diana esta situada en la porcion de bucle de una de la estructuras de tallo-bucle (en la conformacion de tallo-bucle doble) y
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en el tallo de la estructura de tallo-bucle unica extendida.
Tambien ha habido estudios que buscaban prevenir que los oligonucleotidos de cebadores participaran en la extension de cebadores de ADN polimerasa hasta que se proporcionaran temperaturas de extension de ADN monocatenario adecuadas dentro de una mezcla de reaccion. Un enfoque es contener el extremo 3' del cebador en una configuracion bicatenaria corta con una secuencia en el extremo 5' del cebador que se fundira separada para cebar a una temperatura adecuada. La configuracion del cebador puede ser como un bucle (Ailenberg y Silverman (2000), o como una horquilla (Kaboev et al. 2000; Nazarenko et al. 2002). Estas estructuras estan previstas para permitir la extension de 3' a la temperatura de extension de la polimerasa. Nazarenko et al. (2002) observan que los artefactos de dlmeros de cebador pueden afectar los metodos basados en sonda debido a que la formacion de dlmeros de cebador suprime la formacion del amplicon especlfico.
El documento US 2006/0088856 describe oligonucleotidos que son marcados con un fluoroforo y un extintor, con o bien el fluoroforo o bien el extintor unido al nucleotido de 3'. Los oligonucleotidos del documento US 2006/0088856 presentan niveles sustancialmente constantes de emision de senal cuando ambos son monocatenarios y se unen a acidos nucleicos diana. Los oligonucleotidos se hibridan durante la amplificacion de dianas y se escinden por la funcionalidad de procesividad directa 5'-3' de ADN polimerasas estandar para separar las marcas de fluoroforo y de extintor. La escision para separar el fluoroforo y el extintor es la accion que genera una senal detectable. El documento US 2006/0088856 ejemplifica oligonucleotidos con una horquilla en 5' que mejora la amplificacion en tiempo real y la deteccion de dianas (reduciendo los Ct de deteccion 2-3 ciclos) cuando se comparan con sondas de hidrolisis 5'-3' lineales estandar. Las estructuras de horquilla descritas estan previstas para mejorar la velocidad y eficiencia de amplificacion en tiempo real que pueden, por consiguiente, aumentar la sensibilidad de la prueba con ciclado termico de PCR rapido.
El documento WO 2006/020933 describe una horquilla que contiene la sonda que utiliza un fluoroforo extintor para que pueda solo detectarse despues de la escision de la sonda. El documento WO 2005/007818 describe una sonda marcada que contiene una horquilla en la que la sonda se extiende en el extremo 3' en la PCR. Los documentos WO 99/24621, EP 0 881 302 y WO 98/02449 describen todos sondas que contienen una horquilla marcada, desvelando los documentos EP 0 881 302 y WO 98/02449 tambien utilizar un fluoroforo extintor para que pueda solo detectarse despues de su separacion. Ademas, el documento WO 98/02449 requiere que la sonda sea extendida en el extremo 3' en la PCR.
Las sondas de oligonucleotidos normalmente estan incluidas dentro de la PCR o reacciones de amplificacion isotermica para detectar las secuencias diana amplificadas, mientras que no interaccionan directamente en el proceso de amplificacion. A este respecto, es practica habitual anadir una tapa protectora por modificacion del extremo 3' del oligonucleotido para reducir la extension de polimerasas de sondas. Sin embargo, las polimerasas con fuerte actividad de exonucleasa 3'-5' pueden producir estas modificaciones en 3' para ser eliminadas de forma que las sondas de oligonucleotidos puedan ser extendidas y actuen de cebadores. Esta actividad de exonucleasa y/o la extension de la sonda de oligonucleotidos pueden reducir la eficacia de la(s) marca(s) visualmente detectable(s).
En el presente documento se describe una novedosa variacion en el diseno de sondas de oligonucleotidos marcadas con el fin de mejorar la funcion de sondas de oligonucleotidos, previniendo la escision por exonucleasas 3'-5' y la extension mediada por polimerasa de sondas de oligonucleotidos.
En un primer aspecto de la invencion se proporciona un oligonucleotido monocatenario que tiene un extremo 5' y un extremo 3', comprendiendo dicho oligonucleotido una primera y una segunda secciones, estando la primera seccion situada 5' de la segunda seccion; y en el que:
(i) la primera seccion esta marcada internamente con al menos dos marcas detectables, en la que las al menos dos marcas detectables son iguales, y es capaz de hibridarse con un polinucleotido diana; y
(ii) la segunda seccion no es capaz de hibridarse con el polinucleotido diana; comprendiendo dicha segunda seccion una estructura de tallo-bucle que comprende una primera porcion, una segunda porcion y una tercera porcion y en el que la segunda porcion esta situada entre las porciones primera y tercera, y las porciones primera y tercera son complementarias entre si, en el que la estructura de tallo-bucle no esta marcada con una marca detectable;
y adicionalmente en el que el oligonucleotido (a) no se escinde por una exonucleasa 3'-5' y (b) no se extiende por una polimerasa, cuando se usa en un metodo de deteccion de un polinucleotido diana.
La segunda porcion de la segunda seccion (el bucle) sirve para permitir el plegamiento de 360° de nuevo de las porciones primera y tercera (las secuencias de tallo). Las estructuras de tallo-bucle de 3' son usadas por los oligonucleotidos de la presente invencion para disuadir del emparejamiento con otros oligonucleotidos en mezclas de PCR o de amplificacion (en particular formulaciones multiplex con multiples secuencias de cebadores presentes) y para prevenir la escision por exonucleasas 3'-5' de la modificacion del bloqueo de PCR en 3'. Las estructuras de
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tallo-bucle de 3' tambien se usan para prevenir la escision por exonucleasas 3'-5' que se produce independientemente de la formation de dimeros de oligonucleotidos, por ejemplo cuando las sondas se hibridan con acido nucleico diana durante la amplification. Las estructuras de tallo-bucle de 3' evitan la extension de sondas y la generation de picos de fusion de Tm mas alta adicionales que pueden prevenir la detection de secuencias diana amplificadas. Las secuencias de tallo-bucle de la invention estan unidas a los extremos 3' de los oligonucleotidos de sonda, opcionalmente mediante modificaciones de conector o de espaciador, y no se hibridan con secuencias diana de acidos nucleicos amplificadas.
Las estructuras de tallo-bucle poseen dos secuencias de nucleotidos que tienen complementariedad considerable entre si separadas por una secuencia no complementaria. Las secuencias complementarias forman un "tallo" bicatenario mediante auto-hibridacion intramolecular y la secuencia no complementaria intermedia crea un "bucle". Estructuras secundarias de tallo-bucle de ADN tambien se denominan comunmente "horquillas".
Las secuencias de tallo-bucle deben preferentemente formar estructuras de horquilla durante la fase de extension de la PCR para prevenir la elimination de la modification de sondas en 3' por la actividad de exonucleasa 3'-5'. Las fases de extension de los protocolos de PCR de 3 etapas y de 2 etapas normalmente son entre 55 °C y 72 °C. Las temperaturas de fusion de las horquillas deben, por tanto, ser superiores a 55 °C y son preferentemente superiores a 65 °C. Temperaturas de fusion adecuadas pueden lograrse mediante la hibridacion intramolecular de secuencias de tallo corto que son ricas en GC. El bucle intermedio es preferentemente rico en AT, pero puede comprender cualquier combination de nucleotidos en tanto que la secuencia no comparta homologia con el tallo, sonda o secuencia diana. Las porciones de oligonucleotidos que constituyen el tallo del tallo-bucle deben generalmente ser una secuencia complementaria rica en GC.
Cuando se disenan sondas de oligonucleotidos, las temperaturas de fusion se determinan usando los calculos termodinamicos del vecino mas proximo (Breslauer et al. 1986; SantaLucia, 1998). Las temperaturas de fusion de sondas representan la estabilidad de la hibridacion intermolecular con las secuencias de ADN diana. Tambien es posible usar la termodinamica del vecino mas proximo para determinar la estabilidad intramolecular de estructuras secundarias de oligonucleotidos.
El AG de oligonucleotidos (energia libre de Gibbs) se define como el intercambio neto de energia entre el sistema y el entorno. Puede usarse el siguiente calculo para determinar el AG de oligonucleotidos:
AG = AH - T.AS
donde AH es la entalpia (intercambio de energia total entre el sistema y el entorno), AS = entropia (la energia gastada por el sistema para organizarse a si mismo) y T = temperatura (grados Kelvin). Para oligonucleotidos, valores de AG positivos indican que el sistema se movera en la direction de la hebra unica, mientras que valores de AG negativos indican que el sistema se movera en la direccion del producto (es decir, duplex sonda/diana o estructura secundaria de oligonucleotidos). El sistema esta en equilibrio cuando AG = 0 kcal/mol y esto es generalmente la Tm del sistema donde el 50 % del oligonucleotido es monocatenario y el 50 % esta hibridado. Valores de AG negativos proporcionan una indication de estructura secundaria de oligonucleotidos y la magnitud puede determinar el rendimiento de cebadores y sondas.
La capacidad de las secuencias de oligonucleotidos para formar estructuras de tallo-bucle puede evaluarse usando el programa mfold™ (Zuker, 2003). Los valores de AG y Tm para estructuras secundarias tambien pueden determinarse con mfold calculados usando energias libres basandose en la termodinamica del vecino mas proximo (SantaLucia, 1998). La estabilidad de las estructuras de horquilla depende de la longitud y la secuencia del tallo y componentes de bucle (vease la Tabla 6 de los ejemplos).
Los oligonucleotidos del sistema de sonda tienen una secuencia complementaria a una secuencia de polinucleotidos diana. Asi, el oligonucleotido es capaz de hibridarse con la secuencia de polinucleotidos diana bajo condiciones apropiadas. Asi, a menos que el contexto indique de otro modo, por "complementario" los presentes inventores incluyen el significado que el oligonucleotido es capaz de hibridarse con una secuencia de polinucleotidos diana. El oligonucleotido puede ser completamente complementario a la secuencia de polinucleotidos diana (es decir, hay un apareamiento perfecto en terminos de apareamiento de bases entre el oligonucleotido), o el oligonucleotido puede ser parcialmente complementario a la secuencia de polinucleotidos diana (es decir, hay uno o mas desapareamientos entre el oligonucleotido y la secuencia de polinucleotidos diana, pero el oligonucleotido es todavia capaz de hibridarse). Normalmente, cuando el oligonucleotido es parcialmente complementario con el polinucleotido diana, hay menos de 5 desapareamientos, preferentemente 1 o 2 o 3 o 4 desapareamientos, mas preferentemente un desapareamiento.
Donde se hace referencia a "hibridacion" o la capacidad de un oligonucleotido y/o cebador para "hibridarse" con otra secuencia de nucleotidos, el experto entendera que tal hibridacion es capaz de producirse en las condiciones usadas para el analisis de curvas de fusion o de hibridacion, normalmente realizadas entre 15 °C y 95 °C, preferentemente entre 35 °C y 75 °C.
Los primeros dos nucleotidos (5') de la secuencia de tallo (y/o conector) no deben ser complementarios a la diana, para evitar el aumento de la longitud de hibridacion de sondas. Preferentemente, la secuencia de tallo de 5' entera
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(y/o conector) no debe ser complementaria a nucleotidos diana para evitar el aumento de la longitud de hibridacion de sondas. Ademas, la secuencia de las secuencias de conector, tallo y bucle no debe ser complementaria a la secuencia de sondeo, donde tres o menos nucleotidos consecutivos deben ser complementarios para garantizar la formacion de la horquilla y la correcta hibridacion de sondas con dianas de acido nucleico.
El polinucleotido diana puede ser cualquier polinucleotido o variacion de secuencia en el de interes. El polinucleotido diana puede, por tanto, derivarse de cualquier fuente, dependiendo de la aplicacion para la que la deteccion este siendo realizada, donde tales fuentes incluyen organismos que comprenden acidos nucleicos, es decir, virus; procariotas, por ejemplo bacterias, arqueas y cianobacterias; y eucariotas, por ejemplo miembros del reino protista, tales como flagelados, amebas y sus familiares, parasitos ameboides, ciliados y similares; miembros del reino de los hongos, tales como mohos del limo, mohos del limo acelulares, mohos del limo celulares, mohos del agua, mohos verdaderos, hongos de conjugacion, hongos de saco, hongos baston, hongos imperfectos y similares; plantas, tales como algas, musgos, hepaticas, antocerotes, musgos baston, colas de caballo, helechos, gimnospermas y plantas en florecimiento, tanto monocotiledoneas como dicotiledoneas; y animales, que incluyen esponjas, miembros del filo cnidaria, por ejemplo medusa, corales y similares, ctenoforos , gusanos, rotlferos, ascarides, anelidos, moluscos, artropodos, equinodermos, gusanos de bellota y vertebrados, que incluyen reptiles, peces, aves, serpientes, y mamlferos, por ejemplo roedores, primates, que incluyen seres humanos. En algunas realizaciones, el polinucleotido diana puede ser de una fuente sintetica.
Como se usa en el presente documento, "acido nucleico" significa o bien ADN, ARN, monocatenario o bicatenario, o bien cualquier modificacion qulmica de los mismos. Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a, aquellas que proporcionan otros grupos qulmicos que incorporan carga adicional, polarizabilidad, enlace de hidrogeno, interaccion electrostatica y funcionalidad al acido nucleico. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de azucar en la posicion 2', modificaciones de pirimidina en la posicion 5, modificaciones de purina en la posicion 8, modificaciones en aminas exoclclicas, sustitucion de 4-tiouridina, sustitucion de 5-bromo o 5-yodo-uracilo; modificaciones del esqueleto, metilaciones, combinaciones de apareamiento de bases poco usuales tales como las isobases isocitidina e isoguanidina, y similares. Las modificaciones tambien pueden incluir modificaciones en 3' y 5' tales como terminacion.
Como se usa en el presente documento, una marca detectable es cualquier marca que pueda ser detectada mediante cualquier medio. Por ejemplo, la marca puede ser visualmente detectable, qulmicamente detectable, o flsicamente detectable.
En un segundo aspecto de la invencion se proporciona un metodo de deteccion de la presencia de un polinucleotido diana y/o variaciones de secuencia dentro del polinucleotido diana en una muestra de interes, que comprende las etapas de:
(i) proporcionar un oligonucleotido monocatenario que tiene un extremo 5' y un extremo 3', comprendiendo dicho oligonucleotido una primera y una segunda secciones, estando la primera seccion situada 5' de la segunda seccion; y en el que:
la primera seccion esta marcada internamente con al menos dos marcas detectables, en la que las al menos dos marcas detectables son iguales, y es capaz de hibridarse con un polinucleotido diana; y
la segunda seccion no es capaz de hibridarse con un polinucleotido diana; comprendiendo dicha segunda seccion una estructura de tallo-bucle una primera porcion, una segunda porcion y una tercera porcion y en la que la segunda porcion esta situada entre las porciones primera y tercera, y las porciones primera y tercera son complementarias entre si, y en la que la estructura de tallo-bucle no esta marcada con una marca detectable;
(ii) exponer la muestra de interes al oligonucleotido de (i);
(i) detectar un cambio en la marca detectable, en el que un cambio en la marca detectable indica la presencia del polinucleotido diana y/o las variaciones de secuencia dentro del polinucleotido diana; y en el que hay una ausencia de (a) escision del oligonucleotido por una exonucleasa 3'-5' y (b) extension del oligonucleotido por una polimerasa cuando se realiza el metodo.
La "muestra de interes" puede ser cualquier muestra derivada de cualquier fuente e incluye tanto muestras in vitro como in vivo. La muestra puede ser directamente derivada de un organismo vivo, tal como muestra de tejido, celula o de sangre, o puede alternativamente ser una muestra ambiental que puede o puede no comprender al menos un organismo (bien vivo o bien muerto), por ejemplo, un microorganismo.
Por "exonucleasa 3'-5'" los presentes inventores incluyen enzimas exonucleasas especlficas, ademas de otras moleculas que poseen actividad de exonucleasa 3'-5', ademas de su funcion primaria, por ejemplo ADN polimerasa. Por ejemplo, se disenan especlficamente varias enzimas ADN polimerasa para incluir actividad de exonucleasa 3'-5' activa debido a que esto impone fidelidad de secuencia (es decir, eliminacion de la secuencia de elongacion de ADN desapareada en comparacion con la secuencia molde diana). Estas enzimas tambien pueden tener procesividad alta ventajosa, de manera que el proceso de amplificacion sea rapido. Ejemplos de tales enzimas son Platinum Taq High
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™ ™
Fidelity (Invitrogen), Phusion Hot Start High Fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific), Q5 Hot Start High
TM TM
Fidelity DNA polymerase (New England Biolabs), AccuPrime DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen), Hot Start
TM TM
Hi Fidelity (Qiagen) y AccuTaq LA DNA polymerase (Sigma Aldrich).
Con respecto a tanto el oligonucleotido del primer aspecto como el metodo del segundo aspecto, se aplican las siguientes caracterlsticas al oligonucleotido en si mismo y/o al oligonucleotido usado como parte del metodo.
En una realizacion, el oligonucleotido solo incluye una estructura de tallo-bucle, es decir, aquella que esta presente en la segunda seccion del oligonucleotido, y como tal no hay estructura de tallo-bucle en la primera seccion. En una realizacion adicional, no hay estructuras secundarias en la primera seccion del oligonucleotido.
En una realizacion, la primera seccion del oligonucleotido esta marcada internamente con las al menos dos marcas detectables. Es preferible si las marcas detectables estan presentes sin un extintor asociado. Tambien es preferible si las al menos dos marcas detectables son iguales en cualquier oligonucleotido dado de la invention.
En una realizacion preferida, la marca detectable es una marca visualmente detectable. Como se usa en el presente documento, el termino marca visualmente detectable incluye cualquier marca que excite cualquier parte en el espectro electromagnetico (incluyendo porciones no visibles y visibles del espectro electromagnetico). Marcas visualmente detectables tambien incluyen marcas que pueden ser visualizadas indirectamente, tal como por radiomarcas que causan un cambio visual en un material radio-sensible (por ejemplo, pellcula). Ejemplos de metodologlas visualmente detectables incluyen visualization manual de una senal de fluoroforo en el espectro de luz visible, fluorescencia de infrarrojo cercano (tales como aquellas comercializados por Lumiprobe™ - vease
http://www.lumiprobe.com/c/nir-infrared-dyes?gclid=COvg3ZiEjLkCFYOWtAodXSUA_g), sondas Raman™ potenciadas en la superficie (por ejemplo Sun (2007)) y detection de sensor de ADN usando modulation de conductancia ionica (por ejemplo, Wang (2009)).
Convenientemente, la segunda seccion del oligonucleotido no es capaz de hibridarse con la primera seccion del oligonucleotido.
Se prefiere que la estructura de tallo-bucle no se disocie cuando el oligonucleotido se hibride con el polinucleotido diana.
La primera seccion del oligonucleotido puede ser entre 15 y 40 o entre 18 y 30 restos de nucleotidos de longitud; y/o la segunda seccion del oligonucleotido puede ser entre 7 y 40 o entre 12 y 22 restos de nucleotidos de longitud.
La longitud de los oligonucleotidos es preferentemente tal que sea adecuada para hibridarse con el polinucleotido diana, para proporcionar un hlbrido estable cuya temperatura de fusion dependa de la secuencia exacta de la diana. Oligonucleotidos que contienen menos de 15 restos de nucleotidos en muchos casos no forman hlbridos suficientemente estables a temperaturas que oscilan entre 35 °C y 70 °C, particularmente donde las dos secuencias de hibridacion no son completamente complementarias, aunque pueden usarse en algunos circunstancias. Oligonucleotidos lineales, que son mas largos de aproximadamente 30 restos de nucleotidos, pueden formar hlbridos cuya temperatura de fusion es relativamente insensible a la posible presencia de un desapareamiento de un unico nucleotido, aunque pueden usarse en algunas circunstancias.
Cada una de las porciones primera y tercera de la estructura de tallo-bucle puede comprender entre 2 y 10 nucleotidos o entre 4 y 8 nucleotidos. Las porciones primera y tercera no necesitan incluir un numero identico de nucleotidos. La segunda portion de la estructura de tallo-bucle puede comprender entre 3 y 20 nucleotidos o entre 4 y 6 nucleotidos.
El oligonucleotido tambien puede modificarse en el extremo 3' con al menos una modification para prevenir la extension por una polimerasa y/o formation de dlmero, por ejemplo en la amplification de acido nucleico diana o mediante homologla parcial con secuencias de cebador para crear una par de sonda-cebador adecuado para el cebado de una extension de hebra de ADN polimerasa durante la reaction de amplificacion. El uso de restos de bloqueo en 3' en reacciones de PCR se describe en (French et al. 2001, Ben Gaied et al. 2010). Las modificaciones en 3' incluyen, pero no se limitan a, 3' fosfato, 3' propanol, 3' amino C7, 3'-espaciador C3 CPG, hexanodial, 2',3'- didesoxinucleosido, 3'-desoxinucleosido CPG, 3' biotina pireno dU y 3' pireno dT. Pueden usarse multiples modificaciones en 3' para potenciar la capacidad para prevenir la extension por PCR, por ejemplo combinar 3' propanol con hexaetilenglicol (HEG) o pireno dU combinado con el espaciador C3.
La estructura de tallo-bucle del oligonucleotido actua previniendo (i) la escision del oligonucleotido por una exonucleasa 3'-5' y/o (ii) la extension del oligonucleotido por una polimerasa. Esta actividad (ademas de cualquier modificacion en 3' adicional que este presente) produce preferentemente deteccion mejorada de las secuencias diana de acidos nucleicos en comparacion con un metodo de control que utiliza un oligonucleotido sin la segunda seccion.
En una realizacion, la primera seccion y la segunda seccion del oligonucleotido estan separadas por una modificacion de conector o de espaciador. Una modificacion de conector o de espaciador puede usarse para permitir la formacion de horquillas sin causar interferencia para la hibridacion de sondas con acidos nucleicos diana. Puede formarse un conector de acidos nucleicos y puede comprender 1-20 nucleotidos, normalmente 1-10 nucleotidos,
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preferentemente 1-5 nucleotidos. Modificaciones de espaciador adecuadas incluyen, pero no se limitan a, fosforamiditos espaciadores C3, dSpacer CE fosforamidito (1'2'-didesoxirribosa), pirrolidina-CE fosforamidito, hexanodiol, trietilenglicol y hexaetilenglicol.
Preferentemente, la temperatura de fusion (Tm) de la segunda seccion de oligonucleotidos es mayor que 55 °C, por ejemplo entre 55 °C y 95 °C o entre 65 °C y 95 °C, o entre 80 °C y 95 °C.
La temperatura de fusion (Tm) de un oligonucleotido es la temperatura en °C a la que el 50 % de las moleculas en una poblacion de un oligonucleotido monocatenario se hibridan con su secuencia complementaria y el 50 % de las moleculas en la poblacion no se hibridan con dicha secuencia complementaria. La Tm puede determinarse emplricamente, por ejemplo, la Tm puede medirse usando analisis de curvas de fusion o de hibridacion, por ejemplo usando un instrumento Bio-Rad CFX en una placa blanca de 96 pocillos. La Tm de una sonda de oligonucleotidos es el punto de temperatura de mayor tasa de cambio de fluorescencia con la temperatura entre los estados hibridados y no hibridados en la sonda. Los picos de fusion pueden generarse a partir de datos de la curva de fusion por (-dF/dT). La temperatura de fusion se determina fundamentalmente por la temperatura de una solucion que contiene los oligonucleotidos que se aumenta lentamente, mientras que se observa continuamente una senal de fluorescencia, con el fin de construir un grafico de la derivada negativa de la intensidad de la senal de fluorescencia con respecto a la temperatura (-dF/dT) frente a la temperatura. La temperatura de fusion (Tm) del hlbrido aparece como un pico, y proporciona informacion sobre la secuencia del polinucleotido diana. Las Tm generadas mediante el analisis de fusion del oligonucleotido pueden usarse para distinguir dianas polimorficas.
Donde se hace referencia a una Tm para la hibridacion que implica parte de un oligonucleotido, la Tm relevante se considera que es la Tm que puede calcularse a partir de un analisis del vecino mas proximo de la secuencia implicada.
Como alternativa, el analisis puede realizarse enfriando la solucion lentamente desde alta temperatura y determinando la temperatura de hibridacion (Ta). La temperatura de hibridacion normalmente esta entre 30 °C y 70 °C. Las temperaturas de hibridacion preferidas de oligonucleotidos con secuencias diana completamente complementarias estan entre 40 °C y 65 °C, preferentemente entre 41 °C y 65 °C, y mas preferentemente entre 45 °C y 65 °C.
Ademas, la estabilidad de la segunda seccion de oligonucleotidos puede estar entre - 1 kcal/mol y -10 kcal/mol o entre -2 kcal/mol y -6 kcal/mol como se calculo usando (y como se trata anteriormente):
AG = AH -T,AS
En una realizacion, la marca visualmente detectable es un fluoroforo o un colorante.
La marca detectable es preferentemente un fluoroforo o un colorante. Fluoroforos de interes incluyen, pero no se limitan a, colorantes de fluorescelna (por ejemplo, fluorescelna dT, 5-carboxifluorescelna (5-FAM), 6- carboxifluorescelna (6-FAM), 2',4',1,4,-tetraclorofluorescelna (TET), 2',4',5',7',1,4-hexaclorofluorescelna (HEX) y 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluorescelna (JOE)), colorantes de cianina tales como Cy5™, derivados de dansilo, colorantes de rodamina (por ejemplo, tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), colorantes ATTO (tales como ATTO 647N) y tetrapropano-6-carboxirrodamina (ROX)), DABSYL, DABCYL, cianina, tal como Cy3™, compuestos de antraquinona, nitrotiazol y nitroimidazol, u otros colorantes no intercalantes. Fluoroforos de interes se describen ademas en las solicitudes de patente internacional WO 01/42505 y WO 01/86001.
Como se usa en el presente documento, "fluoroforo" (tambien denominado grupo fluorescente) se refiere a una molecula que, cuando se excita con luz que tiene una longitud de onda seleccionada, emite luz de una longitud de onda diferente. Ejemplos de oligonucleotidos que contienen fluoroforos incluyen las sondas HyBeacon II® descritas en el documento WO 2007/010268.
Los oligonucleotidos marcados pueden contener bases modificadas tales como bases modificadas con fosforotioato. El numero de enlaces fosfodiester sustituidos por los fosforotioatos en cualquier oligonucleotido/cebador dado puede oscilar de ninguno a todos de los enlaces fosfodiester que se sustituyen por fosfotioatos, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro o mas. El (Los) oligonucleotido(s) contienen preferentemente fosforotioatos en, al menos una, al menos o al menos tres de las bases internas del oligonucleotido. En una realizacion, las bases modificadas con fosforotioato (donde hay mas de una) estan separadas por al menos una, por ejemplo una a tres, bases no modificadas (fosforodiester), por ejemplo bases alternas dentro del (de los) oligonucleotido(s)/cebador(es) pueden ser fosforotioatos. Vease, por ejemplo, el documento PCT/GB2012/050645, para una discusion de patrones de incorporacion de fosforotioato que tambien se considera que son utiles en relacion con la presente description. Normalmente, las sondas de la descripcion presentan detectabilidad potenciada (tal como emision de fluorescencia) cuando se hibridan con secuencias diana. Sin embargo, en principio, la detection de secuencias diana puede lograrse por tanto un potenciamiento de la detectabilidad (por ejemplo, emisiones fluorescentes) como por una reduction de una detectabilidad (por ejemplo, extincion de emisiones fluorescentes). La magnitud de cambio por el potenciamiento o extincion tras la hibridacion es al menos el 10 % mas alta o mas baja que la senal detectada
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observada con la sonda monocatenaria, respectivamente. Preferentemente, el porcentaje de cambio es mayor que el 20 %. Mas preferentemente, el porcentaje de cambio es mayor que el 50 %.
En el caso de marcas de fluoroforo, el potenciamiento de la fluorescencia puede producirse tras la hibridacion de dianas cuando los restos marcados con fluoroforo se colocan en todos los entornos de secuencia. La colocacion de restos marcados con fluoroforo adyacentes a G puede producir los niveles mas altos de potenciamiento de la fluorescencia en el estado de duplex. Sin embargo, el potenciamiento de la fluorescencia tras la hibridacion de dianas tambien se producira cuando restos marcados con fluoroforo esten localizados dentro de regiones de alta abundancia de C.
Todas las bases de ADN son capaces de extinguir la fluorescencia de algun modo, donde G tiene la mayor de tal capacidad. Para evitar dudas, el termino "extintor asociado" no incluye bases de ADN que forman parte del oligonucleotido. Los fluoroforos en los oligonucleotidos de la descripcion pueden interaccionar con las bases de ADN monocatenario de forma que se inactive la fluorescencia. G puede modular la intensidad de fluorescencia, pero todos restablecen una fluorescencia extinguida significativamente con la hibridacion. La fluorescencia de los fluoroforos internamente unidos de los oligonucleotidos se potencia tras la formation del duplex independientemente de la localization y abundancia de guaninas en la sonda y hebra diana. Las interacciones colorante-colorante tambien producen extincion de fluorescencia en el estado monocatenario. Normalmente, la hibridacion de sondas elimina estas interacciones colorante-colorante, causando el potenciamiento de la fluorescencia que permite la deteccion de dianas.
Los oligonucleotidos marcados emiten cantidades significativamente mayores de fluorescencia cuando se hibridan con secuencias de acidos nucleicos complementarias en comparacion con la conformation monocatenaria (no hibridada) a pesar de la ausencia de un componente extintor.
En realizaciones alternativas, la primera section del oligonucleotido puede estar marcada con tres o mas; o cuatro o mas marcas detectables.
En el segundo aspecto de la invention, la etapa de metodo (iii) se realiza usando o bien analisis de curvas de fusion o bien analisis de curvas de hibridacion con el fin de analizar el cambio en la marca detectable.
La optimization de las longitudes y Tm de oligonucleotidos se realiza por el analisis del vecino mas proximo para disenar sondas con Tm entre 30 °C y 75 °C, preferentemente entre 50 °C y 65 °C, cuando se hibridan con secuencias diana completamente complementarias.
En una realization, los metodos pueden usarse para detectar la presencia de polimorfismos conocidos especlficos. Por ejemplo, polimorfismos conocidos que son indicativos de la presencia de un fenotipo particular, estado de enfermedad, susceptibilidad a enfermedad, respuesta a medication predicha o cepas especlficas de microorganismos. Los polimorfismos conocidos pueden detectarse realizando un analisis de fusion o de hibridacion que genera un pico de fusion definido Tm o un pico de hibridacion definido Ta que puede hacer una referencia cruzada para identificar la presencia de los polimorfismos conocidos. Los metodos pueden, por tanto, usarse en diversos campos que incluyen, pero no se limitan a, diagnosticos, ciencia forense, pruebas de paternidad y de parentesco, mapeo de enlaces, tipificacion microbiana o trazabilidad dentro de la cadena alimentaria.
Los metodos de la descripcion no se limitan a detectar polimorfismos conocidos y pueden usarse para detectar un polimorfismo desconocido. Esto puede lograrse generando un pico de fusion previamente desconocido Tm o pico de hibridacion Ta.
Los metodos de la descripcion pueden usarse en detection de dianas, genotipificacion de SNP o detection de polimorfismos de longitud y secuencias repetitivas (French et al. 2001, French et al. 2002, French et al. 2007, French et al. 2008).
En una realizacion del metodo, la etapa de deteccion se usa en deteccion de dianas, genotipificacion de SNP o deteccion de polimorfismos de longitud y secuencias repetitivas.
Las dianas de polinucleotido que pueden ser identificados usando los metodos de la descripcion incluyen cualquier diana que incluya acidos nucleicos, tales como ADN o ARN nativo. Los acidos nucleicos pueden, cuando corresponda, incluir secuencias que incluyen cualquiera de los analogos de base conocidos de ADN y ARN tales como 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxil- metil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7- metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N-isopenteniladenina, ester metllico de acido uracil-5- oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2- tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ester metllico de acido N-uracil-5-oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico,
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pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina; o pueden contener PNA.
Los oligonucleotidos usados en el metodo de la description pueden incluir tales analogos de base o PNA segun convenga, aunque esto puede no ser tlpico.
El metodo de la descripcion tambien puede usarse conjuntamente con una metodologla 'isotermica' de amplification nucleica tal como un metodo de amplificacion isotermica mediada por bucle (LAMP), en el que una section de la sonda constituye un cebador de LAMP (vease Notomi et al. (2000)).
En un tercer aspecto de la invention se proporciona un uso de un oligonucleotido como se define en el primer aspecto en un metodo de detection de la presencia de un polinucleotido diana y/o variaciones de secuencia dentro del polinucleotido diana en una muestra de interes.
El uso puede ser para la deteccion de dianas, genotipificacion de SNP, o deteccion de polimorfismos de longitud y secuencias repetitivas.
En un cuarto aspecto de la invencion se proporciona un metodo de production de un oligonucleotido como se define en el primer aspecto, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un primer oligonucleotido marcado con al menos dos marcas detectables y es capaz de hibridarse con un polinucleotido diana;
(b) proporcionar un segundo oligonucleotido que no es capaz de hibridarse con un polinucleotido diana; siendo dicho segundo oligonucleotido capaz de formar una estructura de tallo-bucle que comprende una primera portion, una segunda portion y una tercera portion y en el que la segunda portion esta situada entre las porciones primera y tercera, y las porciones primera y tercera son complementarias entre si;
(c) ligar el primer y el segundo oligonucleotidos para formar un unico oligonucleotido, estando el primer oligonucleotido situado 5' del segundo oligonucleotido.
La ligation de dos oligonucleotidos puede realizarse usando cualquier metodo de la materia para unir dos oligonucleotidos monocatenarios para formar un unico oligonucleotido. Por ejemplo, las dos secciones de oligonucleotidos pueden conectarse juntas en una reaction de cicloadicion azida-alquino promovida por tension anular (reaccion SPAAC) simplemente mezclando los dos oligonucleotidos en tampon acuoso. Alternativamente, la azida puede localizarse en uno de los oligonucleotidos para unirse juntos y el cicloalquino puede estar en el otro oligonucleotido para unirse juntos (vease Shelbourne (2012); Gerrard (2012); Shelbourne (2011)). Como una alternativa a la reaccion de SPAAC, puede usarse la reaccion de CuAAC (reaccion de cicloadicion alquino-azida catalizada por cobre), en la que el cicloalquino esta sustituido con un alquino terminal y la reaccion se cataliza por Cu(I) (vease EI-Sagheer (2012) (2011a) (2009) y Kumar (2007)). Otra alternativa es usar la reaccion de Diels-Alder para ligar los dos oligonucleotidos en la que un oligonucleotido esta marcado con un dieno y el otro con un dienofilo (vease EI-Sagheer (2011b)). Las reacciones de conexion anteriores entre dos oligonucleotidos pueden ser asistidas por una ferula de oligonucleotidos complementarios para mejorar la eficiencia y velocidad de la reaccion, pero esto no es esencial.
Las secciones primera y segunda de oligonucleotidos pueden producirse por cualquier metodo de slntesis de oligonucleotidos. La slntesis de oligonucleotidos normalmente avanza por la adicion escalonada de nucleotidos activados por fosforamidito u otros derivados de fosforo a una cadena de oligonucleotidos en crecimiento en un soporte solido escindible. Este proceso continua hasta que se ensambla el oligonucleotido completo y entonces se escinde del soporte solido. La slntesis de oligonucleotidos se lleva a cabo convencionalmente en la direction 3' a 5' en vez de la direccion 5' a 3' debido al hecho de que los monomeros requeridos son mas faciles de sintetizar, pero ambas direcciones de slntesis son posibles. El proceso descrito mas adelante se aplica a ambas direcciones de la slntesis de oligonucleotidos sobre soporte solido. Es un metodo por el que grandes numeros de oligonucleotidos pueden sintetizarse en dos o mas etapas (gran escala seguido de pequena escala) usando escalas diferentes para lograr beneficios en el coste.
La slntesis de oligonucleotidos a gran escala (por ejemplo, 15 micromoles o mayor) permite usar sintetizadores de oligonucleotidos altamente eficientes con condiciones de ciclado de slntesis optimizadas y mayores economlas de escala resultantes del uso mas eficiente de reactivos y disolventes. Es particularmente rentable la slntesis a gran escala de un oligonucleotido que contiene modificaciones caras tales como nucleobases marcadas con colorante o aminoalquilo protegido, nucleobases marcadas con alquino o cicloalquino (bien la porcion de 5' o la porcion de 3' del oligonucleotido). El oligonucleotido que ha sido ensamblado en la slntesis a gran escala inicial se deja unido al soporte solido, con todos sus grupos protectores de nucleobase, fosfato e hidroxilo terminales unidos. El soporte solido se subdivide entonces en porciones pequenas y pueden realizarse slntesis de oligonucleotidos adicionales en cada porcion por separado. Despues del ensamblaje y antes de (o despues de) la etapa de subdivision, el oligonucleotido de "gran escala" unido al soporte solido puede (si se requiere) modificarse por metodos que incluyen, pero no se limitan a, formation de amida, qulmica clic, Diels-Alder y marcado de maleimida, que dan lugar a varios posibles productos finales modificados. Este metodo puede usarse para anadir colorantes fluorescentes, haptenos, marcas SERS u otros grupos indicadores o ligandos. El marcado del oligonucleotido mientras esta sobre el soporte solido permite usar disolventes anhidros, aumentar la vida de algunos reactivos de marcado (por ejemplo, esteres
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activos, maleimidas) durante el marcado, mejorandose as! la eficiencia de la reaccion de marcado. Ademas, el usar grandes escalas y sintetizadores a gran escala altamente eficientes tales como AKTA OligoPilot™ (GE Healthcare) con reactivos de recirculacion en el procedimiento de marcado facilita el eficiente uso de los reactivos.
Una vez se ha dividido el soporte solido y se ha realizado cualquier modificacion de marcado (si se requiere), las cantidades individuales mas pequenas de soporte solido pueden tratarse individualmente, y someterse a rondas adicionales de slntesis de oligonucleotidos. Cada lote individual puede entonces tener una secuencia diferente ensamblado sobre el (el elemento especlfico de diana variable) y esta segunda fase de slntesis puede hacerse en varias escalas desde 1,0 micromol hasta 10 nanomoles o mas pequenas. Pueden usarse muchos sintetizadores de ADN de escala pequena diferentes para esta segunda fase de slntesis de oligonucleotidos (por ejemplo, ABI 3400™,
TM TM __ __ __ __
ABI 3900 , ABI 394 , PerSeptive Expedite™, Dr Oligo 96/193™, Bioautomation MerMade™). Estas slntesis posteriores mas pequenas pueden entonces desprotegerse usando condiciones estandar que dan productos a pequena escala a coste muy bajo. Este proceso es tan eficiente como la slntesis de oligonucleotidos en fase unica estandar, dando oligonucleotidos de alta calidad. La purification de oligonucleotidos por electroforesis en gel o HPLC es innecesaria para aplicaciones que usan las sondas (tales como aquellas de la description) sintetizadas por este metodo debido a la alta calidad de la slntesis.
En un quinto aspecto de la invention se proporciona una biblioteca de oligonucleotidos que comprende una pluralidad de oligonucleotidos como se define en el primer aspecto.
En una realization, la pluralidad de oligonucleotidos puede cada una comprender una marca detectable diferente. La pluralidad de oligonucleotidos esta unida a un soporte solido.
En un sexto aspecto de la invencion se proporciona un kit de partes que comprende:
(a) un oligonucleotido como se define en el primer aspecto; e
(b) instrucciones para su uso.
Un kit de partes alternativo puede comprender:
(a) la primera section de un oligonucleotido como se define en el primer aspecto;
(b) la segunda seccion de un oligonucleotido como se define en el primer aspecto;
(c) instrucciones para su uso.
El kit alternativo puede comprender ademas medios para conjugar las secciones primera y segunda para formar un unico oligonucleotido. Tales medios incluyen los reactivos y aparatos para realizar la slntesis de oligonucleotidos de dos fases y los metodos de qulmica clic como se trata en relation con el cuarto aspecto.
Los kits de la descripcion tambien pueden comprender uno o mas seleccionados de tampon de reaccion (para PCR o amplification isotermica), dNTP, cebadores de oligonucleotidos, enzima y aditivos adicionales que incluyen, pero no se limitan a, MgCh, albumina de suero bovino (BSA), sulfoxido de dimetilo (DMSO), betalna, Tween-20 y ARN portador.
Los kits pueden proporcionarse en una forma llquida o como reactivos estabilizados (usando una tecnica que incluye, pero no se limita a, liofilizacion y gelificacion)
La presente descripcion proporciona una modificacion de sonda de oligonucleotidos novedosa que se explica en mas detalle en la siguiente descripcion y ejemplos.
Ejemplos y figuras
La invencion se describira ahora en mas detalle con referencia a las siguientes figuras y ejemplos.
La invencion se demuestra mediante un numero de los ejemplos. Estos muestran:
(i) Los resultados de la actividad de exonucleasa 3'-5' de ADN polimerasa que causa la extension por PCR de oligonucleotidos de sonda y la generation de picos de elevada temperatura de fusion (Tm), donde las Tm son mayores que las esperadas para la hibridacion de sondas de longitud completa.
(ii) La reduction de esta extension de sondas usando diferentes modificaciones de la termination de 3' y polimerasas.
(iii) Prevention de la extension de sondas usando secuencias de tallo-bucle unidas a los extremos 3' de los oligonucleotidos.
(iv) La generacion y prevencion de la extension de sondas usando el analisis de curvas de fusion y de hibridacion.
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Leyendas de las figuras
Figura 1 - Representacion esquematica de oligonucleotidos
A) Deteccion de secuencias diana amplificadas usando una sonda HyBeacon estandar (documentos WO 01/73118, WO 07/010268).
B) La actividad de exonucleasa 3'-5' de ADN polimerasa elimina la modificacion de bloqueo por PCR de 3' permitiendo la extension de la sonda HyBeacon y la amplificacion de una diana truncada.
C) Se usa un oligonucleotido con una estructura de tallo-bucle en 3' para prevenir la eliminacion de la exonucleasa 3'-5' de la modificacion en 3' y evitar la expresion de sondas.
Las ilustraciones de figuras presentan un cebador directo en exceso (1), cebador inverso limitante (2), sonda HyBeacon marcada doblemente (3), modificacion de bloqueo por PCR de 3' (4), extension de una sonda no bloqueada (5) y una secuencia de tallo-bucle de 3' para prevenir la extension de sondas.
Figura 2: Amplificacion multiplex de secuencias de P2 y G1 usando la polimerasa Phire y deteccion de dianas usando las sondas A) P2-FL y B) G1-TxR. Se indican la deteccion de dianas y los picos de extension de sondas.
Figura 3: Amplificacion multiplex de secuencias de P2 y G1 usando la enzima Q5 y deteccion de dianas usando las sondas A) P2-FL y B) G1-TxR. Se indican la deteccion de dianas y los picos de extension de sondas.
Figura 4: Analisis de picos de fusion usando la sonda P2-PYR en formulaciones de PCR multiplex que contienen las enzimas A) Phire y B) Q5. Se indican la deteccion de dianas y los picos de extension de sondas.
Figura 5: Analisis de picos de fusion usando la sonda P2-3SL en formulaciones de PCR multiplex que contienen las enzimas A) Phire y B) Q5. La secuencia de tallo-bucle de 3' previene claramente la extension de sondas y la generacion del pico de fusion de Tm mas alta.
Figura 6: Analisis de picos de fusion usando la sonda P2-3SLPYR en formulaciones de PCR multiplex que contienen las enzimas A) Phire y B) Q5. La secuencia de tallo-bucle de 3' previene claramente la extension de sondas y la generacion del pico de fusion de Tm mas alta.
Figura 7: Analisis de picos de fusion usando la sonda P2-14nt en formulaciones de PCR multiplex que contienen las enzimas A) Phire y B) Q5. La secuencia de tallo-bucle de 3' previene la extension de sondas con la polimerasa Phire pero el pico de extension de Tm mas alta se observa todavla con la enzima Q5.
Figura 8: Analisis de picos de fusion usando la sonda P2-2nt en formulaciones de PCR multiplex que contienen las enzimas A) Phire y B) Q5. Dos nucleotidos de secuencia no hibridada anadida al extremo 3' de la sonda no son suficientes para prevenir la extension de sondas.
Figura 9: Analisis de curvas de fusion realizado con las sondas A) P2-5SL y B) P2-IL que tienen
secuencias de tallo-bucle de 5' e internas, respectivamente. Se indican reacciones que contienen diana (+va) y sin controles de molde (NTC).
Figura 10: Analisis de curvas de A) hibridacion y de B) fusion de la sonda CXCL12-PYR con deteccion de dianas y picos de extension de sondas indicados. Se presentan dos muestras de genotipo C/C y dos muestras de genotipo C/T, con solo el alelo C generando un pico de fusion en presencia de la extension de sondas.
Figura 11: Analisis de curvas de A) hibridacion y de B) fusion de la sonda CXCL12-3SLPYR. La secuencia de tallo-bucle de 3' previene claramente la extension de sondas y la generacion del pico de fusion de Tm mas alta. Los datos de picos demuestran la deteccion simultanea de alelos C y T en ausencia de extension de sondas.
Materiales y metodos para los ejemplos
Diseno y sfntesis de sondas de oligonucleotidos
Se compraron fosforamiditos de ADN estandar, soportes solidos y reactivos adicionales de Link Technologies o Applied Biosystems Ltd. Todos los oligonucleotidos se sintetizaron en un sintetizador de ADN/ARN automatizado 394 de Applied Biosystems usando un ciclo de fosforamidito de 0,2 pmoles de destritilacion catalizada por acido, acoplamiento, terminacion y oxidacion con yodo. Se dejo que monomeros normales (A, G, C y T) se acoplaran durante 25 segundos y todos los otros monomeros durante 300 segundos adicionales. Se determinaron las eficiencias de acoplamiento escalonado y los rendimientos globales de monomeros con proteccion de DMT midiendo la conductividad del cation tritilo y en todos los casos fueron >98,0 %. La escision de los oligonucleotidos del soporte solido se llevo a cabo en amoniaco acuoso concentrado (33 %) a 55 °C durante 5 horas en un tubo cerrado. Los
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fluoroforos se unieron a restos internos en la secuencia de sonda usando union de fluorescelna dT (Glen Research, Sterling, VA) o Texas Red usando 2' aminoetoxi T (Richardson et al. 2010). Los oligonucleotidos de los ejemplos poseen un agente de bloqueo de 3'-fosfato, 3' propanol, 3'-pireno u otro previsto para prevenir la extension mediada por Taq cuando las sondas se incorporan en ensayos de pCr.
Una vez se completo la slntesis de la secuencia especlfica de diana, el oligonucleotido se escindio de la resina y se desprotegio usando amoniaco acuoso concentrado a temperatura ambiente durante una hora, seguido de 5 horas a 55 °C en un tubo cerrado. Se elimino cualquier impureza de la slntesis/desproteccion y el oligonucleotido se desalo usando columnas de filtracion en gel Illustra NAP-10 (GE Healthcare) segun las instrucciones del fabricante. Las sondas de oligonucleotidos se purificaron por HPLC.
La cantidad de oligonucleotido obtenida a partir de la slntesis se determino disolviendo una allcuota en un volumen de agua especlfico y midiendo la absorbancia UV a 260 nm. La concentracion se calculo usando la absorbancia UV del oligonucleotido y su coeficiente de extincion a 260 nm. El coeficiente de extincion del oligonucleotido se calculo a partir de la suma de los coeficientes de extincion individuales de los nucleosidos no modificados y fluorescentemente marcados de los que esta compuesto.
Reaccion en cadena de la polimerasa
Los volumenes de PCR fueron normalmente 20 pl, comprendiendo generalmente 2 pl de muestra, 1x tampon de PCR, cebador en exceso 1 pM, cebador limitante 0,222 pM, 0,4-0,8 pl de ADN polimerasa, MgCl2 total 3 mM, dNTP 1 mM (GE Healthcare), 30-150 ng/pl de BSA (Roche Diagnostic) y 100-300 nM de sonda de oligonucleotidos. Formulaciones de PCR especlficas de diana se describen en los ejemplos mas adelante.
Se realizo amplificacion homogenea y deteccion de dianas con un sistema de deteccion de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad), con analisis de las curvas de fusion o de hibridacion realizado inmediatamente despues de la amplificacion por PCR. Los protocolos termicos se describen en los ejemplos a continuation. Se construyeron picos de fusion y de hibridacion usando el software CFX (Bio-Rad) representando la derivada negativa de fluorescencia con respecto a la temperatura (-dF/dT en el eje y) frente a la temperatura (eje x).
Ejemplo 1
Se realizo PCR multiplex para amplificar simultaneamente secuencias diana de G1 y P2 usando la ADN polimerasa Phire Hot Start II™ (Fisher Scientific). Se detectaron dianas de G1
(GCG GACT G CAAGAAGATT GT AAAGAAAACTTTTT C GAAGCT CTTGCTGTT AT GGAACGT GAAGGCAGTCGCATT ATT GAT GTAGAT CT CAGT GTTTT GAAACAT GCGGTA) y P2
(CATATTACGAGCTTTTTATAAACCTCCCCAACCAAACTCTACAAAAAGAGTTT
CAATCGATCCCCTATAAATCCGCATATATTTTGGCCGC)
amplificadas (Chlamydia trachomatis) con las sondas G1-TxR marcadas con Texas Red y P2-FL marcadas con fluorescelna, respectivamente (Tabla 1).
Los volumenes de reaccion de PCR fueron 20 pl, que comprendlan 2 pl de muestra, 1x tampon Phire™ (Fisher Scientific, RU), dNTP 1 mM, cloruro de magnesio total 3 mM, 100 ng/pl de ARN portador, 150 ng/pl de BSA, cebador directo G1 1 pM (G1-LFx), cebador inverso G1 222 nM (G1-LRx), cebador directo P2 1 pM (P2-F), cebador inverso P2 500 nM (P2-R2), sonda G1-TxR 150 nM, sonda P2-FL 112,5 nM y 0,8 pl de ADN polimerasa Phire Hot Start II™ (Fisher Scientific, Loughborough, RU). Las secuencias de cebador y de sonda se detallan en la Tabla 1.
Se realizo amplificacion por PCR usando un protocolo termico CFX96™, donde despues de una etapa de desnaturalizacion inicial (95 °C 15 segundos) las dianas se amplificaron usando 10 ciclos que comprendlan desnaturalizacion (95 °C 1 segundo) e hibridacion/extension (65 °C 1 segundo) seguido de 40 ciclos que comprendlan desnaturalizacion (85 °C 1 segundo) e hibridacion/extension (65 °C 1 segundo). Se realizo el analisis de curvas de fusion inmediatamente despues de la amplificacion desnaturalizando brevemente (95 °C 30 segundos) y enfriando (30 °C 30 segundos) muestras antes de aumentar la temperatura de 30 °C a 95 °C en etapas de 0,5 °C. La adquisicion de fluorescencia se realizo en canales de fluorescelna y colorante Texas Red para la deteccion multiplex de dianas amplificadas.
Se amplificaron dianas usando 200 fg (18 copias genomicas) de ADN de Chlamydia trachomatis extraldo. El ejemplo tambien puede realizarse usando dianas que se amplificaron a partir de secuencias de ADN sintetico construido usando slntesis genica (GenScript, Hong Kong). Las construcciones sinteticas comprendieron regiones de cebador y de sonda que se clonaron en vectores pUC57 y se secuenciaron para el control de calidad.
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Tabla 1: Oligonucleotido y secuencias diana de oligonucleotidos, donde F, X, 5 y 3 representan fluorescelna dT,
Texas Red, 5' trimetoxiestilbeno y 3' propanol, respectivamente.
OLIGO
SECUENCIA
G1-LFx
GCGGACT GCAAGAAGATT GT AAAGAAAAC
G1-LRx
TACCGCAT GTTT CAAAACACT GAGAT CTAC
G1-TxR
5CTTCACGXTC CAXAACAG CAAGAG3
P2-F
CATATTACGAGCTTTTTATAAACCT CCCCAAC
P2-R2
GCGGCCAAAATATATGCGGATT
P2-FL
5GGATCGATF GAAAC FCTTTTTGTAGA3
La deteccion de secuencias diana de G1 y P2 amplificadas produce picos de fusion con Tm de 55,5 °C y 59,0 °C, respectivamente (Figura 2).
Las sondas usaron modificaciones de 3' propanol para prevenir la extension de sondas durante la amplificacion por PCR. Sin embargo, se genero un pico de fusion de Tm mas alta adicional usando la sonda P2-FL marcada con fluorescelna causado por la elimination de la modification de bloqueo en 3' (mediante actividad de exonucleasa 3'5') y extension por PCR del oligonucleotido (Figura 1).
La eliminacion de la modificacion en 3' permite que la sonda actue de cebador, de forma que pueda generarse un producto de 63 pb con el cebador P2-F y la sonda P2-FL. La extension de sondas incorpora el oligonucleotido P2-FL en el producto de 63 pb falso, generando as! un pico de fusion de Tm mas alta que cuando la sonda de 26 nucleotidos intacta se hibrida con el amplicon de 91 pb. La extension de la sonda P2-FL genera un pico a 73,5 °C, ademas del pico de hibridacion diana P2 a 58,5 °C (Figura 2A).
La extension de la sonda P2-FL se produce posiblemente mediante un evento de cebado habilitado por la actividad de exonucleasa 3'-5' que revela una secuencia terminal con homologla parcial por otro oligonucleotido en el multiplex. No se observaron los 73,5 °C adicionales en una PCR singleplex en ausencia de oligonucleotidos G1 (datos no mostrados). Se uso la herramienta PrimerList™ (Kalendar et al. 2001) para investigar las posibilidades de formation de dlmeros usando los oligonucleotidos enumerados en la Tabla 1. La unica interaction de oligonucleotidos obvia que implica a la sonda P2-FL es un dlmero cruzado formado con la sonda G1-TxR.
Se observo un pico de extension muy pequeno con la sonda G1-TxR a 74,0 °C usando la polimerasa Phire (Figura 2B).
Ejemplo 2
Tambien se realizo la amplificacion multiplex de secuencias diana de G1 y P2 usando la ADN polimerasa Q5 Hot Start High-Fidelity™ (New England Biolabs). La enzima tiene una tasa de error extremadamente baja, que se informo que era 100 veces mas baja que la ADN polimerasa Taq. Se probo la fuerte actividad de correction de 3'-5' de la enzima Q5 para examinar la extension de sondas G1-TxR y P2-FL.
Los volumenes de reaction de PCR fueron 20 pl, que comprendlan 2 pl de muestra, 1x tampon Q5™ (New England Biolabs, Herts, RU), dNTP 1 mM, cloruro de magnesio total 3 mM, 100 ng/pl de ARN portador, 150 ng/pl de BSA, cebador directo G1 1 pM (G1-LFx), cebador inverso G1 222 nM (G1-LRx), cebador directo P2 1 pM (P2-F), cebador inverso P2 500 nM (P2-R2), sonda G1-TxR 150 nM, sonda P2-FL 112,5 nM y 0,4 pl de ADN polimerasa Q5 Hot Start™ (New England Biolabs, Herts, RU). La amplificacion multiplex de dianas uso el protocolo termico detallado en el Ejemplo 1.
La enzima Q5 aumento la magnitud del pico de extension de 74,0 °C observado con la sonda P2-FL. La extension de sondas se produce a un grado tal con la enzima Q5 que casi previno completamente la deteccion de la secuencia diana de P2
(Figura 3A)
Mientras que la enzima Phire™ del Ejemplo 1 solo genero un pico de pequena extension con la sonda G1-TxR, la enzima Q5 genero un gran pico a 75,5 °C con la sonda G1-TxR (Figura 3A) producida por la escision por exonucleasas 3'-5' de la modificacion de 3' propanol y posterior extension por PCR del oligonucleotido. Parece que la enzima Q5 presenta actividad de exonucleasa 3'-5' mas agresiva en comparacion con Phire, aumentando la magnitud del pico de extension de sondas G1-TxR.
Ejemplo 3
La sonda P2-PYR (Tabla 2) tiene la misma secuencia que P2-FL, pero usa una modificacion 3' pireno dT Long (ATDBio, Southampton, RU) en lugar de 3' propanol. La sonda P2-PYR se uso en las formulaciones de PCR multiplex descritas en los Ejemplos 1 y 2 en lugar de P2-FL.
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La modificacion pireno dT redujo considerablemente la formacion de los productos de extension generados con las enzimas Phire y Q5 (Figura 4), pero los picos de fusion de 73,5 °C y 74,0 °C fueron todavla observados junto con los picos de hibridacion de sondas especlficas de diana. La sonda P2-PYR genero picos diana a Tm ligeramente mas altas (60,5 °C con Phire™) que el oligonucleotido P2-FL terminado con 3' propanol ya que las modificaciones de pireno dT son conocidas por ser estabilizantes (Ben Gaied et al. 2010).
El pireno dT puede ser mas resistente a la escision por exonucleasas 3'-5', pero todavla se elimina una proporcion del bloqueante de PCR, permitiendo la extension de sondas (Figura 4).
Tabla 2: Oligonucleotido y secuencias diana de oligonucleotidos, donde F, 5, 3 e Y representan fluorescelna dT, 5' trimetoxiestilbeno, 3' propanol y 3' pireno dT Long, respectivamente. Los nucleotidos en minuscula representan las
secuencias de tallo de estructuras de de tallo-bucle.
OLIGO
SECUENCIA
P2-PYR
5GGATCGAT F GAAAC FCTTTTTGTAGAY
P2-3SL
5GGATCGATFGAAACFCTTTTTGTAGAggtgTTTTTTc acc3
P2-3SLPYR
5GGATCGATFGAAACFCTTTTTGTAGAggtgTTTTTTc accY
Ejemplo 4
Se anadio una secuencia de nucleotidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle al extremo 3' de la sonda P2- FL para disuadir de la formacion de dlmeros con otros oligonucleotidos en la formulacion de PCR multiplex y prevenir la eliminacion de exonucleasas 3'-5' de las modificaciones de bloqueo por PCR en 3' (Figura 1C). La estructura de tallo-bucle se formo con la secuencia 5'(ggtgTTTTTTcacc)3', donde nucleotidos en minusculas y mayusculas forman el tallo y el bucle, respectivamente. Esta secuencia se eligio como una que no tenia homologla con la secuencia de sonda, pero que era capaz de lograr una estructura de tallo-bucle estable (vease el Ejemplo 9). Los oligonucleotidos de P2-3SL y P2-3SLPYR poseen modificaciones de propanol en 3' y pireno dT Long en 3' para prevenir la extension de sondas de PCR (Tabla 2). Estas sondas se usaron en las formulaciones de PCR multiplex descritas en los Ejemplos 1 y 2 sustituyendo el oligonucleotido P2-FL.
Con la polimerasa Phire™, el oligonucleotido P2-3SL solo genero el pico de hibridacion especlfico de diana, sin observarse evidencia de la extension de sondas (Figura 5A). La hibridacion de la sonda P2-3SL con dianas amplificadas genero picos a las mismas temperaturas de fusion (59,0 °C) que la sonda P2-FL que carecla de la estructura de tallo-bucle en 3', que indica que la horquilla 5'(ggtgTTTTTTcacc)3' no esta desestabilizando la hibridacion de sondas con oligonucleotidos diana.
Con la enzima Q5™, la estructura de tallo-bucle en 3' del oligonucleotido P2-3SL previno la mayor parte de la extension previamente observada con la sonda P2-FL. Se genero un pico de hibridacion especlfico de diana grande a 59,0 °C y un pico de extension muy pequeno a 74,0 °C (Figura 5B).
Similarmente, con la polimerasa Phire™, el oligonucleotido P2-3SLPYR solo genero el pico de hibridacion especlfico de diana, sin observarse pruebas de la extension de sondas (Figura 6A). La hibridacion de la sonda P2-3SLPYR con dianas amplificadas genero picos a 57,5 °C. Estos picos son 3 °C mas bajos que la sonda P2-PYR sin la estructura de tallo-bucle y 1,5 °C mas bajos que los oligonucleotidos P2-FL y P2-3SL terminados con propanol en 3'. Esto sugiere que la modificacion 3' pireno dT Long esta estabilizando la estructura de tallo-bucle y por consiguiente desestabilizando la hibridacion de sondas ligeramente.
Con enzima Q5™, el oligonucleotido P2-3SLPYR solo genero el pico de hibridacion especlfico de diana, sin observarse evidencia de la extension de sondas (Figura 6B). El aumento de la estabilidad de la estructura de tallo- bucle proporcionada por la modificacion de pireno dT previno la pequena cantidad de extension de sondas observada con el oligonucleotido P2-3SL.
La estructura de tallo-bucle en 3' proporciona proteccion contra la eliminacion de exonucleasa 3'-5' de las modificaciones de bloqueo por PCR para prevenir la extension de oligonucleotidos de sondas y garantizar la deteccion de secuencias diana de P2 amplificadas. En uso de la secuencia de tallo-bucle en 3' en oligonucleotidos P2 no altera las caracteristicas de rendimiento de la sonda G1-TxR en el multiplex, con picos similares a aquellos presentados en la Figura 2B y Figura 3B generados con las enzimas Phire y Q5, respectivamente.
Ejemplo 5
Se uso el oligonucleotido P2-14nt (Tabla 3) para determinar si el beneficio proporcionado por los oligonucleotidos P2-3SL y P2-3SLPYR era producido por la estructura de tallo-bucle o la presencia de catorce nucleotidos no hibridados en el extremo 3' de la sonda. Los catorce nucleotidos no hibridados carecen de estructura secundaria y no interaccionan con la secuencia de sonda que se une a diana. Esta sonda se uso en las formulaciones de PCR multiplex descritas en los Ejemplos 1 y 2 sustituyendo el oligonucleotido P2-FL.
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Con la polimerasa Phire™, el oligonucleotido P2-14nt genero solo el pico de hibridacion especlfico de diana, sin observarse evidencia de la extension de sondas (Figura 7A). La hibridacion de la sonda P2-14nt con dianas amplificadas genero picos de fusion con Tm de 57,0 °C, que indica que los nucleotidos protuberantes de catorce bases de nucleotidos no hibridados estaban desestabilizando la union a la sonda.
Mientras que los catorce nucleotidos no hibridados fueron suficientes para prevenir la extension de sondas con
__ jfyl TM
Phire , no previnieron la eliminacion de la modificacion de 3' propanol usando la enzima Q5 . El pico de hibridacion especlfico de diana y el pico de extension de sondas fueron ambos observados cuando el oligonucleotido P2-14nt se uso en la PCR multiplex con ADN polimerasa Q5 Hot Start High-Fidelity™ (Figura 7B).
La secuencia no hibridada en el extremo 3' de la sonda no proporciona proteccion alguna contra la actividad de exonucleasa 3'-5', pero no previene completamente la eliminacion de la modificacion del bloqueo de PCR (con la enzima Q5). Esto demuestra el valor de la estructura de tallo-bucle descrita en el Ejemplo 4.
El oligonucleotido P2-2nt (Tabla 3) tiene dos bases no hibridadas en el extremo 3' de la sonda. Esto no parecio proporcionar ningun beneficio en la PCR multiplex, produciendo grandes picos de extension de sondas con ambas enzimas, Phire™ y Q5™ (Figura 8).
Tabla 3: Oligonucleotido y secuencias diana de oligonucleotidos, donde F y 3 representan fluorescelna dT y 3' propanol, respectivamente. Los nucleotidos en minuscula representan nucleotidos no hibridados que no son _______________________complementarios a secuencias diana._______________________
OLIGO
SECUENCIA
P2-14nt
GGATCGATF GAAAC FCTTTTTGTAGAttttttttttcacc3
P2-2nt
GGATCGATF GAAAC FCTTTTTGTAGAag3
Ejemplo 6
Se usaron los oligonucleotidos P2-5SL y P2-IL (Tabla 4) para evaluar el rendimiento de sondas con estructuras de tallo-bucle en 5' e internas, respectivamente. Estas sondas se probaron en el multiplex de enzima Q5™ descrito en el Ejemplo 2 sustituyendo el oligonucleotido P2-FL.
El oligonucleotido P2-5SL genero grandes picos de extension a 76,0 °C, pero no se observaron picos de fusion a 59,0 °C indicativos de hibridacion de sondas especlficas de diana (Figura 9A). Como era de esperar, la estructura de tallo-bucle en 5' no proporciona proteccion contra la eliminacion de exonucleasa 3'-5' de la modificacion de propanol en 3' de bloqueo de PCR. La extension de la sonda previene la deteccion y/o amplificacion suficiente de la secuencia diana de P2 de longitud completa.
La presencia del tallo-bucle interno en el oligonucleotido P2-IL redujo la estabilidad de la hibridacion de sondas considerablemente. Tambien aumento la separacion entre las bases marcadas con fluoroforo a 19 nucleotidos. No se generaron picos obvios por analisis de curvas de fusion, pero la presencia de diana pudo determinarse, con muestras positivas que generan perfiles de picos de fusion, que fueron claramente diferentes de Controles sin molde (NTC) a bajas temperaturas (Figura 9B). La inclusion del tallo-bucle en una localizacion de secuencia 'interna' parece ser tan perjudicial para la funcionalidad de hibridacion sonda-diana que no es posible evaluar ningun bloqueo de actividad de exonucleasa 3'-5'.
Tabla 4: Oligonucleotido y secuencias diana de oligonucleotido, donde F y 3 representan fluorescelna dT y 3' propanol, respectivamente. Los nucleotidos en minuscula representan las secuencias de tallo de estructuras de tallo-
bucle.
OLIGO
SECUENCIA
P2-5SL
ggtgTTTTTTcaccGGATCGATFGAAACFCTTTTTGTAG A3
P2-IL
GGATCGATFGAggtgTTTTTTcaccAACFCTTTTTGTAG A3
Ejemplo 7
Se amplifico una diana del gen CXCL12 (humano) polimorfico que comprende el SNP rs1746048 C>T usando los cebadores CXCL12-F y CXCL12-R (Tabla 5). La amplificacion de la secuencia diana de 88 pb se realizo usando ADN polimerasa Phire Hot Start II™ y se genotipificaron muestras de ADN humano con respecto al polimorfismo rs1746048 usando la sonda HyBeacon™ marcada con fluorescelna CXCL12-PYR (Tabla 5).
Los volumenes de reaccion de PCR fueron 20 pl, que comprendlan 2 pl de muestra, 1x tampon Phire™, dNTP 1 mM, cloruro de magnesio total 3 mM, 30 ng/pl de BsA, cebador directo CXCL12-F 222 nM, cebador inverso CXCL12-R 1 pM, sonda CXCL12-PYR 300 nM y 0,4 pl de ADN polimerasa Phire Hot Start II™. Las dianas se amplificaron usando 2 ng de ADN extraldo (panel 5 de ADN de control aleatorio humano, Sigma/ECACC).
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La amplification por PCR se realizo usando un protocolo termico CFX96™, donde despues de una etapa de desnaturalizacion inicial (95 °C 1 minuto) las dianas se amplificaron usando 50 ciclos que comprendlan desnaturalizacion (95 °C 5 segundos) e hibridacion/extension (65 °C 10 segundos). Las reacciones se desnaturalizaron inmediatamente despues de la amplification (95 °C 30 segundos) antes de realizar el analisis de curvas de fusion o de curvas de hibridacion. El analisis de curvas de fusion comprende una etapa de enfriamiento (35 °C 30 segundos) antes de aumentar la temperatura de 35 °C a 85 °C en etapas de 0,5 °C. El analisis de curvas de hibridacion se realizo reduciendo la temperatura de 85 °C a 35 °C en etapas de 0,5 °C. La adquisicion de fluorescencia se realizo en el canal de fluorescelna de un instrumento CFX.
Tabla 5: Oligonucleotido y secuencias diana de oligonucleotidos, donde F e Y representan fluorescelna dT y 3' pireno dT Long, respectivamente. Los nucleotidos en minusculas representan las secuencias de tallo de estructuras
de tallo-bucle.
OLIGO
SECUENCIA
CXCL12-F
GATTT CAG GACT GAACAGAGACT GAG
CXCL12-R
GTCAT GGT AGCT AACT AGAGGTTT CT G
CXCL12-PYR
GTGGFAGGATFGAGCGAGTCAGGY
CXCL12-3SL
GTGGFAGGATFGAGCGAGTCAGGggccgAAAAcggccY
La hibridacion de sondas con secuencias diana completamente complementarias, que comprenden el alelo C del polimorfismo rs1746048, genera hibridacion y picos de fusion a 65,5 °C y 64,5 °C (Figura 10A y B, respectivamente). Se observan hibridacion y picos de fusion adicionales a 76,5 °C, que surgen de la extension de la sonda CXCL12- PYR. Se observaron grandes picos de extension con CXCL12-PYR, incluso cuando se termino con la modification 3' pireno dT Long.
La elimination de la modification 3' pireno mediante la actividad de exonucleasa 3'-5' permite que la sonda actue de cebador, de forma que puede generarse un producto de 51 pb con el cebador CXCL12-R y la sonda CXCL12-PYR. La extension de sondas incorpora el oligonucleotido CXCL12-PYR en el producto de 51 pb falso, generando as! un pico de fusion de Tm mas alta que cuando la sonda de 23 nucleotidos intacta se hibrida con el amplicon de 88 pb.
La extension del oligonucleotido CXCL12-PYR y la incorporation de la sonda en dianas amplificadas previene la detection del alelo T erroneamente apareado del polimorfismo rs1746048 (Figura 10) que se espera aparezca a 52 °C (vease la Figura 11). Cualquier sonda libre disponible para la hibridacion de dianas se une preferencialmente al alelo C completamente complementario. La disminucion de la concentration de cloruro de magnesio a 1,5 mM reduce la magnitud del pico de extension, permitiendo que las muestras de genotipo C/C, C/T y T/T sean claramente identificadas por el analisis de curvas de fusion (datos no mostrados).
El oligonucleotido CXCL12-PYR proporciona un segundo ejemplo de extension de sondas. En este caso, la escision por exonucleasas 3'-5' de la modification 3' pireno se produce en una PCR singleplex. Se generaron resultados comparables con la ADN polimerasa Q5 Hot Start High-Fidelity™ (datos no mostrados).
Se uso la herramienta PrimerLisf™ (Kalendar et al. 2001) para investigar la significativa complementariedad de secuencias entre los oligonucleotidos enumerados en la Tabla 5 (para buscar hlbridos potenciales que se forman a las temperaturas de la reaction de amplification). No se revelo un par de oligonucleotidos que implicara al oligonucleotido CXCL12-PYR, sugiriendo que la elimination de la elimination del bloqueo por PCR por actividad de exonucleasa 3'-5' y posterior extension de sondas podrla producirse independientemente de la formation de dlmeros de oligonucleotidos.
Se realizo el analisis experimental de la extension de sondas eliminando o bien el cebador directo o bien el inverso de la PCR para buscar interacciones con el oligonucleotido de sonda. La elimination del cebador directo CXCL12-F dio picos de fusion de 76,5 °C en presencia de molde de ADN o 73,5 °C con controles sin molde.
El pico de fusion de 76,5 °C se genera cuando se elimina la termination de la sonda de 3' y el oligonucleotido CXCL12-PYR actua de cebador para amplificar un producto de 51 pb con el cebador inverso CXCL12-R. La elimination del cebador CXCL12-R genero el pico de fusion de 73,5 °C en presencia de ADN molde y con NTC.
No se generaron picos de fusion cuando se eliminaron tanto los cebadores directos como inversos. La extension de sondas se produce en ausencia de acido nucleico de molde y no se ha encontrado una interaction de oligonucleotidos obvia.
Ejemplo 8
Se anadio una secuencia de nucleotidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle al extremo 3' de la sonda CXCL12-PYR para prevenir la elimination de exonucleasa 3'-5' de la modification de bloqueo por PCR en 3'. La estructura de tallo-bucle se formo con la secuencia 5'(ggccgAAAAcggcc)3', donde nucleotidos en minusculas y mayusculas forman el tallo y el bucle, respectivamente. El oligonucleotido CXCL12-3SL tiene una modification 3'
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35
pireno dT Long para prevenir la extension por PCR de la sonda (Tabla 5). Esta sonda se probo con la formulacion de PCR y el protocolo termico descrito en el Ejemplo 7, sustituyendo el oligonucleotido CXCL12-PYR.
La secuencia de tallo-bucle anadida al extremo 3' del oligonucleotido CXCL12-3SL previene la eliminacion de la modificacion de pireno y la posterior extension de la sonda. No se observaron picos de extension a 76,5 °C con analisis de curvas de hibridacion y de fusion, permitiendo la clara deteccion de los alelos diana T y C con picos generados a 52 °C y 61 °C, respectivamente (Figura 11).
Ejemplo 9
Se evaluo la capacidad de secuencias de oligonucleotidos sinteticas para formar estructuras de tallo-bucle usando el programa mfold™ (Zuker, 2003). Los valores de AG y Tm para estructuras secundarias tambien se determinaron con mfold calculados usando energlas libres basadas en la termodinamica del vecino mas proximo (SantaLucia, 1998). La estabilidad de las estructuras de horquilla depende de la longitud y secuencia de los componentes de tallo y bucle (Tabla 6).
Tabla 6: Analisis de secuencias usando mfold para determinar la capacidad para formar estructuras de tallo-bucle. Los valores de AG se determinaron a 37 °C y los valores de Tm se calcularon con cloruro de magnesio 3 mM suponiendo un modelo de dos estados. Los nucleotidos que forman los componentes de tallo y bucle de la __________secuencia se presentan en minuscula y mayuscula, respectivamente.___________
Secuencia de tallo-bucle
AG (Kcal/mol) Tm ( °C)
ggtgTTTTTTT cacc
-1,39 51,5
ggtgTTTTTT cacc*
-1,69 54,8
ggtgTTTTT cacc
-2,39 62,9
ggtgTTTT cacc
-2,69 65,9
ggtgTTT cacc
-1,29 53,9
ggtGTTCacc
-0,02 37,2
ggccgAAAAAAAcggcc
-4,87 77,2
ggccgAAAAAAcggcc
-5,17 80,0
ggccgAAAAAcggcc
-5,87 86,8
ggccgAAAAcggcc*
-4,17 75,9
ggccgAAAcggcc
-4,67 82,6
ggccGAACggcc
-3,48 73,8
tgcgTTTTTTT cgca
-2,50 59,2
tgcgTTTTTT cgca
-2,80 62,1
tgcgTTTTT cgca
-3,50 69,1
tgcgTTTTcgca
-3,80 71,6
tgcgTTTcgca
-2,40 62,8
tgcGTTCgca
-0,41 41,8
caggcAAATTAAgcctg
-3,59 70,4
caggcAATTAAgcctg
-3,89 73,5
caggcATTAAgcctg
-4,59 81,0
caggcATTAgcctg
-4,39 78,8
caggcATAgcctg
-3,39 71,2
caggCTAGcctg
-2,13 59,6
* = usados en los ejemplos. Por favor, observese que la secuencia 5'(TTTTTTTTTTCACC)3'
de P2-14nt (Ejemplo 5) no pudo formar una estructura estable usando mfold.
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Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
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    REIVINDICACIONES
    1. Un oligonucleotido monocatenario que tiene un extremo 5' y un extremo 3', comprendiendo dicho oligonucleotido una primera y una segunda secciones, estando la primera seccion situada 5' de la segunda seccion, en el que:
    (i) la primera seccion esta marcada internamente con al menos dos marcas detectables, siendo las al menos dos marcas detectables iguales, y es capaz de hibridarse con un polinucleotido diana; y
    (ii) la segunda seccion no es capaz de hibridarse con un polinucleotido diana; comprendiendo dicha segunda seccion una estructura de tallo-bucle que comprende una primera porcion, una segunda porcion y una tercera porcion y en donde la segunda porcion esta situada entre las porciones primera y tercera, y las porciones primera y tercera son complementarias entre si, no estando la estructura de tallo-bucle marcada con una marca detectable;
    y adicionalmente en el que el oligonucleotido (a) no se escinde por una exonucleasa 3'-5' y (b) no se extiende por una polimerasa, cuando se usa en un metodo de deteccion de un polinucleotido diana.
  2. 2. Un metodo de deteccion de la presencia de un polinucleotido diana y/o variaciones de secuencia dentro del polinucleotido diana en una muestra de interes, que comprende las etapas de:
    (i) proporcionar un oligonucleotido monocatenario que tiene un extremo 5' y un extremo 3', comprendiendo dicho oligonucleotido una primera y una segunda secciones, estando la primera seccion situada 5' de la segunda seccion; y en el que:
    la primera seccion esta internamente marcada con al menos dos marcas detectables, en donde las al menos dos marcas detectables son iguales, y es capaz de hibridarse con un polinucleotido diana; y la segunda seccion no es capaz de hibridarse con un polinucleotido diana; comprendiendo dicha segunda seccion una estructura de tallo-bucle que comprende una primera porcion, una segunda porcion y una tercera porcion y estando la segunda porcion situada entre las porciones primera y tercera, y siendo las porciones primera y tercera complementarias entre si, y no estando la estructura de tallo-bucle marcada con una marca detectable;
    (ii) exponer la muestra de interes al oligonucleotido de (i);
    (iii) detectar un cambio en la marca detectable, en donde un cambio en la marca detectable indica la presencia del polinucleotido diana y/o las variaciones de secuencia dentro del polinucleotido diana;
    y en el que hay una ausencia de (a) escision del oligonucleotido por una exonucleasa 3'-5' y (b) extension del oligonucleotido por una polimerasa, cuando se realiza el metodo.
  3. 3. El oligonucleotido de la reivindicacion 1 o el metodo de la reivindicacion 2, en donde las marcas detectables son marcas visualmente detectables, opcionalmente estando las marcas detectables presentes sin un extintor asociado.
  4. 4. El oligonucleotido de las reivindicaciones 1 o 3 o el metodo de las reivindicaciones 2 o 3, en donde la segunda seccion no es capaz de hibridarse con la primera seccion, opcionalmente, en donde la estructura de tallo-bucle no se disocia cuando el oligonucleotido se hibrida con el polinucleotido diana y/o en donde la primera seccion es entre 15 y 40 o entre 18 y 30 restos de nucleotidos de longitud; y/u opcionalmente siendo la segunda seccion entre 7 y 40 o entre 12 y 22 restos de nucleotidos de longitud.
  5. 5. El oligonucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4 o el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde cada una de las porciones primera y tercera de la estructura de tallo-bucle comprende entre 2 y 10 nucleotidos o entre 4 y 8 nucleotidos, opcionalmente comprendiendo la segunda porcion de la estructura de tallo- bucle entre 3 y 20 nucleotidos o entre 4 y 6 nucleotidos.
  6. 6. El oligonucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 5 o el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde el oligonucleotido se modifica en el extremo 3' con al menos una modificacion para prevenir la extension por una polimerasa y/o la formacion de dlmero.
  7. 7. El oligonucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 6 o el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde la estructura de tallo-bucle previene (i) la escision del oligonucleotido por una exonucleasa 3'-5' y/o (ii) la extension del oligonucleotido por una polimerasa, opcionalmente en donde la estructura de tallo-bucle y/o la al menos una modificacion del extremo 3' mejoran la deteccion de secuencias diana de acido nucleico en comparacion con un metodo de control usando un oligonucleotido sin la segunda seccion y/u, opcionalmente, en donde la primera seccion y la segunda seccion del oligonucleotido estan separadas por una modificacion de conector o de espaciador.
  8. 8. El oligonucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 7 o el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde la temperatura de fusion (Tm) de la segunda seccion de oligonucleotidos esta entre 55 °C y 95 °C, opcionalmente en donde la estabilidad de la segunda seccion de oligonucleotidos esta entre -1 kcal/mol y -
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    10 kcal/mol o entre -2 kcal/mol y -6 kcal/mol.
  9. 9. El oligonucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 8 o el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en donde la marca detectable es un fluoroforo o un colorante, opcionalmente en donde la marca detectable es fluorescelna dT, SIMA dT, TAMRA dT, Texas Red o ATTO 647N, y/u, opcionalmente, en donde la primera seccion esta marcada con tres o mas; o cuatro o mas marcas detectables.
  10. 10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en donde la etapa (iii) se realiza usando o bien analisis de curvas de fusion o bien analisis de curvas de hibridacion, opcionalmente en donde la etapa (iii) se usa en detection de dianas, genotipificacion de SNP o deteccion de polimorfismos de longitud y de secuencias repetitivas, y/u opcionalmente en donde el metodo es para su uso conjuntamente con una metodologla de amplification isotermica de acidos nucleicos, tal y como el metodo de amplificacion isotermica mediada por bucles (LAMP).
  11. 11. Uso de un oligonucleotido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 9 en un metodo de deteccion de la presencia de un polinucleotido diana y/o variaciones de secuencia dentro del polinucleotido diana en una muestra de interes, opcionalmente en donde el uso es para la deteccion de dianas, genotipificacion de SNP o deteccion de polimorfismos de longitud y de secuencias repetitivas.
  12. 12. Un metodo de production de un oligonucleotido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 9, que comprende las etapas de:
    (a) proporcionar un primer oligonucleotido marcado con al menos dos marcas detectables y que es capaz de hibridarse con un polinucleotido diana;
    (b) proporcionar un segundo oligonucleotido que no es capaz de hibridarse con un polinucleotido diana; siendo dicho segundo oligonucleotido capaz de formar una estructura de tallo-bucle que comprende una primera porcion, una segunda porcion y una tercera porcion y estando la segunda porcion situada entre las porciones primera y tercera, y siendo las porciones primera y tercera complementarias entre si;
    (c) ligar los oligonucleotidos primero y segundo para formar un unico oligonucleotido, estando el primer oligonucleotido situado 5' del segundo oligonucleotido.
  13. 13. Una biblioteca de oligonucleotidos que comprende una pluralidad de oligonucleotidos como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 9, opcionalmente en donde la pluralidad de oligonucleotidos puede cada una comprender una marca detectable diferente, y/u, opcionalmente, estando la pluralidad de oligonucleotidos unidos a un soporte solido.
  14. 14. Un kit de partes que comprende:
    (a) un oligonucleotido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 11; y
    (b) instrucciones para su uso;
    opcionalmente en donde el kit comprende ademas uno o mas seleccionados de tampon de reaction (para PCR o amplificacion isotermica), dNTP, cebadores de oligonucleotidos, enzima y aditivos adicionales que incluyen, pero no se limitan a, MgCl2, albumina de suero bovino (BSA), sulfoxido de dimetilo (DMSO), betalna, Tween-20 y ARN portador.
  15. 15. Un kit de partes que comprende:
    (a) la primera seccion de un oligonucleotido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 9;
    (b) la segunda seccion de un oligonucleotido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 9; y
    (c) instrucciones para su uso;
    opcionalmente en el que el kit comprende ademas medios para conjugar las secciones primera y segunda para formar un unico oligonucleotido, y/u, opcionalmente, en el que el kit comprende ademas uno o mas seleccionados de tampon de reaccion (para PCR o amplificacion isotermica), dNTP, cebadores de oligonucleotidos, enzima y aditivos adicionales que incluyen, pero no se limitan a, MgCh, albumina de suero bovino (BSA), sulfoxido de dimetilo (DMSO), betalna, Tween-20 y ARN portador.
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