ES2644220T3 - Bacteria láctica con expresión de galactoquinasa modificada para texturizar productos alimentarios por sobreexpresión de exopolisacáridos - Google Patents

Bacteria láctica con expresión de galactoquinasa modificada para texturizar productos alimentarios por sobreexpresión de exopolisacáridos Download PDF

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Description

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Bacteria lactica con expresion de galactoquinasa modificada para texturizar productos alimentarios por sobreexpresion de exopolisacaridos
Campo de invencion
[0001] La presente invencion se refiere a una celula bacteriana con propiedad texturizante, cultivos iniciadores que comprenden la celula y productos lacteos fermentados con el cultivo iniciador.
Antecedentes de la invencion
[0002] La industria alimentaria usa numerosas bacterias, en particular bacterias lacticas, para mejorar el sabor y la textura de los alimentos pero tambien para extender el tiempo de conservacion de estos alimentos. En el caso de la industria lactea, las bacterias lacticas se usan intensivamente para provocar la acidificacion de la leche (por fermentacion) pero tambien para texturizar el producto al que se incorporan.
[0003] Entre las bacterias lacticas usadas en la industria alimentaria, se puede mencionar los generos Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium. Las bacterias lacticas de las especies Streptococcus thermophilus se usan en gran parte solas o en combinacion con otras bacterias para la produccion de productos alimentarios, en particular productos fermentados. En particular se usan en la formulacion de fermentos usados para la produccion de leches fermentadas, por ejemplo yogures. Algunas de ellas desempenan un papel dominante en el desarrollo de la textura del producto fermentado. Esta caracterfstica esta estrechamente ligada a la produccion de polisacaridos. Entre las cepas de Streptococcus thermophilus es posible distinguir cepas texturizantes y no texturizantes.
[0004] Para cumplir los requisitos de la industria, se ha vuelto necesario proponer nuevas cepas texturizantes de bacterias lacticas, en particular de Streptococcus thermophilus.
[0005] WO2007095958A1 divulga cepas de Streptococcus thermophilus con propiedades texturizantes. En la figura 1 se puede observar que la cepa mas texturizante CHCC8833 (DSM17876) tiene un valor de tension de cizallamiento de alrededor de 59 Pa.
[0006] Robitaille it et al., J Dairy Sci. 92: 477-482 (2009) divulga un estudio que muestra que es posible aumentar la produccion de EPS por cepas de Streptococcus thermophilus filantes o "ropy" a traves de ingenierfa genetica mediante el aumento de la actividad de GalK, es decir, por transformacion con un plasmido que sobreexpresa GalK.
Se concluye que cuando tal cepa se usa en combinacion con Lactobacillus bulgaricus para la produccion de yogur, la sobreproduccion de EPS de la cepa recombinante no es significativa. Robitaille it et al., J Dairy Sci. 90(9):4051-4057 (2007) y Vaillancourt et al., App Envir Microbiol. 70(8):4596-4603 (2004) tambien revelan la produccion de derivados galactosa positivos de Streptococcus thermophilus por transformacion con un plasmido que sobreexpresa GalK de Strep. Salivarius. Las cepas modificadas o bien no mostraron un aumento significativo en la produccion de EPS en la leche (Robitaille) o la produccion de EPS no se analizo (Vaillancourt). De Vn et al., Appl Environ Microbiol. 71(7):3659-3667 (2005) divulga un analisis molecular y bioqufmico del fenotipo de galactosa de varias cepas de Streptococcus thermophilus de productos lacteos, entre otros de las secuencias de nucleotidos segun se encuentran en la region intergenica galR-galK que incluye la region -10.
[0007] Por lo tanto, el problema que la invencion propone resolver es proporcionar una cepa de bacteria lactica que tenga unas buenas propiedades de texturizacion de productos alimentarios, especialmente productos en los que la cepa texturizante de la bacteria lactica (tal como Streptococcus thermophilus) se usa junto con una cepa de una especie de Lactobacillus.
Resumen de la invencion
[0008] Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que las bacterias acido lacticas con mutaciones en el gen GalK (galactoquinasa) generan una viscosidad mas alta en leche fermentada que la cepa (madre) de tipo salvaje, especialmente cuando se usan para la fermentacion de leche junto con bacterias Lactob acillus.
[0009] Conforme a este hallazgo sorprendente, la presente invencion se refiere a cepas de bacterias acido lacticas supertexturizantes novedosas, tales como cepas de S. thermophilus, con mutaciones en el gen GalK, y un metodo para la produccion de estas cepas, y para fermentar productos lacteos fabricados utilizando tales cepas.
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[0010] En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para la fabricacion de una bacteria acido lactica (tal como una bacteria que genera una viscosidad mas alta en leche fermentada en comparacion con la cepa madre, o tal como una bacteria que genera una viscosidad en leche fermentada mayor de aproximadamente 70 Pa (por ejemplo mayor de 71 o mayor de 73 Pa, medida como tension de cizallamiento despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados C), que comprende:
a) Proporcionar una cepa bacteriana de acido lactico como cepa madre;
b) introducir una mutacion en el gen GalK de la cepa; y
c) seleccionar mediante cribado una cepa mutante que genere una viscosidad en leche fermentada superior a aproximadamente 70 Pa medida como tension de cizallamiento despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados.
[0011] De este modo, formas de realizacion del primer aspecto son:
- Un metodo para la fabricacion de una bacteria acido lactica que genera una viscosidad mas alta en leche fermentada en comparacion con la cepa madre (por ejemplo, medida como tension de cizallamiento, tal como despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados C) que comprende:
a) proporcionar una cepa bacteriana de acido lactico como cepa madre;
b) introducir una mutacion en el gen GalK de la cepa; y
c) seleccionar mediante cribado una cepa mutante que genere una viscosidad en leche fermentada superior a aproximadamente 70 Pa medida como tension de cizallamiento despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados.
- Un metodo para la fabricacion de una bacteria acido lactica que genera una viscosidad en leche fermentada mayor de aproximadamente 70 Pa (por ejemplo medida como tension de cizallamiento, tal como despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados C) que comprende:
a) proporcionar una cepa bacteriana de acido lactico como cepa madre;
b) introducir una mutacion en el gen GalK de la cepa;
c) seleccionar mediante cribado una cepa mutante que genere una viscosidad en leche fermentada superior a aproximadamente 70 Pa medida como tension de cizallamiento despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados.
[0012] En formas de realizacion preferidas actualmente, la viscosidad se mide como tension de cizallamiento despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados C, y/o como se mide en el ensayo descrito mas adelante. De este modo, una forma de realizacion actualmente preferida del primer aspecto de la invencion es un metodo para la fabricacion de una bacteria acido lactica que comprende:
a) proporcionar una cepa bacteriana de acido lactico como cepa madre;
b) introducir una mutacion en el gen GalK de la cepa;
c) seleccionar mediante cribado una cepa mutante que genere una viscosidad en leche fermentada superior a aproximadamente 70 Pa medida como tension de cizallamiento despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados.
[0013] El metodo de la invencion puede comprender ademas una o mas fase(s) seleccionada(s) del grupo consistente en:
c1) seleccion por cribado de una cepa mutante que genere textura, tal como una cepa que genere mas textura que la cepa madre, o que aumente la viscosidad de un sustrato de leche; y
c2) seleccion por cribado de una cepa mutante con fenotipo Gal+, tal como actividad de degradacion/fermentacion de galactosa mejorada en comparacion con la cepa madre.
[0014] La mutacion se puede introducir en la region promotora del gen, tal como en la region -10 (la caja de Pribnow) del gen.
[0015] En una forma de realizacion interesante del metodo de la invencion, la mutacion produce la sustitucion de una o ambas de C y G en la region de tipo salvaje -10 que tiene la secuencia de nucleotidos TACGAT con un nucleotido independientemente seleccionado del grupo consistente en A y T.
[0016] La mutacion puede suponer la sustitucion de C de la region de tipo salvaje -10 (TACGAT) con un nucleotido independientemente seleccionado del grupo consistente en A y T.
[0017] En una forma de realizacion, la mutacion resulta en la sustitucion de C de la region de tipo salvaje -10 que tiene la secuencia de nucleotidos TACGAT con T, y/o la mutacion resulta en una region -10 que tiene la secuencia de nucleotidos TATGAT, TATTAT o TACTaT.
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[0018] La mutacion se puede introducir usando tecnicas de ingenierfa genetica, y/o usando mutagenesis, por ejemplo por radiacion o tratamiento con una sustancia qufmica, opcionalmente seguida de un analisis del gen GalK para verificar la mutacion en dicho gen GalK.
[0019] La bacteria (la cepa madre) se puede seleccionar de un genero del grupo consistente en Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium. Una bacteria interesante pertenece a la especie Streptococcus thermophilus.
[0020] Tambien se describe una bacteria acido lactica que se puede obtener mediante el metodo de la invencion.
[0021] Asimismo, la invencion se refiere a una bacteria acido lactica que genera una viscosidad en leche fermentada mayor de aproxmadamente 70 Pa (por ejemplo mayor de 71 Pa o 73 Pa) medida como tension de cizallamiento despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados C. En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una bacteria acido lactica que lleva una mutacion en la region -10 del gen GalK (en comparacion con la region de tipo salvaje -10 que tiene la secuencia de nucleotidos TACGAT), donde la mutacion resulta en una region -10 que tiene la secuencia de nucleotidos TATTAT (SEC ID NO:3) o TaCTAT (SEC ID NO:4). Tambien se describe una bacteria acido lactica que lleva una mutacion en la region -10 del gen GalK, mutacion que produce la sustitucion de C en la region de tipo salvaje -10, que tiene la secuencia de nucleotidos TACGAT, con un nucleotido independientemente seleccionado del grupo consistente en A y T. La mutacion puede suponer la sustitucion de C en la region de tipo salvaje -10, que tiene la secuencia de nucleotidos TACGAT, con T.
[0022] En una forma de realizacion interesante, una bacteria acido lactica de la invencion comprende SEC ID NO:5, o la region promotora de la misma, incluyendo la region -35 y la region -10. La bacteria acido lactica pertenece preferiblemente a la especie Streptococcus thermophilus.
[0023] En otra forma de realizacion, la invencion se refiere a una cepa bacteriana de la especie Streptococcus thermophilus, seleccionada del grupo consistente en: CHCC11379 (DsM 22884), CHCC11342 (DSM 22932) y CHCC11976 (DSM 22934). Tambien se describen todas las cepas nuevas que se mencionan aquf, al igual que sus mutantes.
[0024] En otro aspecto, la invencion se refiere a una composicion que comprende bacterias acido lacticas de la invencion, tales como bacterias de la cepa CHCC11379 (DSM 22884). Se prefiere que tal composicion comprenda al menos 10exp10 UFC (unidades formadoras de colonias) de dichas bacterias.
[0025] La composicion puede comprender, o bien como una mezcla o como un conjunto de elementos,
- una cepa de una especie de Lactobacillus, tal como una cepa de L. Bulgaricus o L. Fermentum; y
- una cepa de una bacteria acido lactica de la invencion, tal como una cepa que pertenece a la especie Streptococcus thermophilus.
[0026] Ahora se prefiere que la cepa que pertenece a una especie de Lactobacillus sea una cepa de un polisacarido (tal como un heteropolisacarido, homopolisacarido) y/o una enzima fructosiltransferasa que produce especies de Lactobacillus.
[0027] La composicion puede comprender al menos 10exp10 UFC (unidades formadoras de colonias) de una cepa que pertenece a una especie de Lactobacillus; y al menos 10exp10 UFC de una cepa de la especie Streptococcus thermophilus.
[0028] La composicion preferiblemente se puede utilizar como cultivo iniciador, y esta en forma congelada, liofilizada o lfquida.
[0029] En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo para la produccion de un producto lacteo/derivado de leche fermentado, que comprende fermentar un sustrato de leche (tal como leche de vaca) con una bacteria acido lactica, una cepa, o una composicion de la invencion.
[0030] El metodo puede comprender ademas fermentar el sustrato de leche con una cepa que pertenece a una especie de Lactobacillus, tal como una cepa de L. Bulgaricus o L. Fermentum, por ejemplo una cepa seleccionada del grupo consistente en LB18, CHCC10019 (DSM19252), CHCC2008 (DSM22584) o CHCC3984 (DSM19251). Tambien se describen mutantes y variantes de cualquiera de estas cepas.
[0031] El sustrato de leche se puede fermentar con una cepa o bacteria de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, tal como una cepa perteneciente a la especie Streptococcus thermophilus antes, durante o despues de la fermentacion con una cepa perteneciente a una especie de Lactobacillus.
[0032] El metodo puede comprender anadir una enzima al sustrato de leche antes, durante y/o despues de la
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fermentacion, tal como una enzima seleccionada del grupo consistente en: una enzima capaz de entrecruzar protefnas, transglutaminasa, una proteasa aspartica, quimosina y cuajo.
[0033] En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un producto lacteo, tal como un producto lacteo fermentado (por ejemplo yogur o suero de mantequilla) o un queso (por ejemplo, queso fresco o pasta hilada), obtenible mediante el metodo de la invencion. El producto lacteo fermentado puede ser, por ejemplo, un producto de tipo batido o un producto de tipo firme.
[0034] El producto lacteo puede comprender opcionalmente un ingrediente seleccionado del grupo consistente en: un concentrado de fruta, un jarabe, un cultivo bacteriano probiotico, un agente de coloracion, un agente espesante, un agente aromatizante y un agente conservante; y/o que opcionalmente esta en forma de un producto de tipo batido, un producto de tipo firme o un producto bebible.
[0035] La invencion tambien se refiere a un producto lacteo, que se fabrica fermentando un sustrato de leche (tal como leche de vaca) con una bacteria acido lactica de la invencion (por ejemplo una cepa de la especie Streptococcus thenmophilus, tal como DSM 22884) y una bacteria acido lactica de una especie seleccionada de Lactobacillus bulganicus y Lactobacillus fenmentum (tal como CHCC10019 (DsMl9252), CHCC3984 (DSM19251) y CHCC2008 (DSM22584)).
[0036] Un producto lacteo interesante de la invencion tiene una viscosidad superior a 100 Pa (por ejemplo superior a 102 o superior a 104 Pa), medida como tension de cizallamiento, por ejemplo despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados C. En una forma de realizacion preferida actualmente, la viscosidad superior a 100 Pa se obtiene solo por el crecimiento de las celulas bacterianas, pero se pueden obtener valores de viscosidad mas altos mediante la adicion de compuestos qufmicos, tales como gelatina, una carragenina, etc.
Definiciones
[0037] Como se utiliza en este caso, el termino "bacteria acido lactica" designa una bacteria grampositiva microaerofflica o anaerobica que fermenta azucares con la produccion de acidos incluyendo acido lactico como el acido predominantemente producido, acido acetico y acido propionico. Las bacterias acido lacticas mas utiles desde el punto de vista industrial se encuentran en el orden "Lactobacillales", que incluye Lactococcus, spp. Streptococcus, spp. Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium, spp. Enterococcus spp. y Propionibacterium spp. Adicionalmente, las bacterias productoras de acido lactico del grupo de las bacterias anaerobicas estrictas, las bifidobacterias, por ejemplo Bifidobacterium spp., generalmente se incluyen en el grupo de las bacterias acido lacticas. Estas se usan frecuentemente como cultivos alimentarios solas o en combinacion con otras bacterias acido lacticas. Las bacterias acido lacticas, incluyendo bacterias de las especies Lactobacillus spp. y Streptococcus thermophilus, normalmente se suministran a la industria lactea o bien como cultivos congelados o liofilizados para la propagacion de iniciadores a granel o como cultivos denominados "Direct Vat Set" (SVD), destinados a la inoculacion directa en una cuba de fermentacion o tina para la produccion de un producto lacteo, tal como un producto de leche fermentado. A tales cultivos en general se les denomina "cultivos iniciadores" o "iniciadores".
[0038] El termino "leche" se debe entender como la secrecion lactea obtenida por el ordeno de cualquier mamifero, tal como vacas, ovejas, cabras, bufalas o camellas. En una forma de realizacion preferida, la leche es leche de vaca.
El termino leche tambien incluye soluciones de protefna/grasa obtenidas a partir de materiales vegetales, por ejemplo leche de soja.
[0039] El termino "sustrato de leche" puede ser cualquier material de leche crudo y/o procesado que se pueda someter a fermentacion segun el metodo de la invencion. De este modo, los sustratos de leche utiles incluyen, pero de forma no limitative, soluciones/suspensiones de cualquier leche o productos lacteos que comprenden protefnas, tales como leche de grasa entera o leche con bajo contenido en grasa, leche desnatada, suero de mantequilla, leche en polvo reconstituida, leche condensada, leche seca, suero de leche, permeato de suero de leche, lactosa, lfquido madre de cristalizacion de lactosa, concentrado de protefna de suero de leche, o nata. Obviamente, el sustrato de leche puede proceder de cualquier mamifero, por ejemplo leche de mamifero sustancialmente pura, o leche en polvo reconstituida.
[0040] Antes de la fermentacion, el sustrato de leche se puede homogeneizar y pasteurizar segun metodos conocidos en la tecnica.
[0041] "Homogenizacion" como se utiliza en este caso significa una mezcla intensiva para obtener una suspension o emulsion soluble. Si la homogeneizacion se realiza antes de la fermentacion, se puede realizar para descomponer la grasa lactea en tamanos menores de modo que ya no se separe de la leche. Esto se puede lograr haciendo pasar la leche a traves de unos pequenos orificios a alta presion.
[0042] "Pasteurizar" como se utiliza en este caso significa tratar el sustrato de leche para reducir o eliminar la
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presencia de organismos vivos, tales como microorgan ism os. Preferiblemente, la pasteurizacion se logra manteniendo una temperatura especfica durante un periodo de tiempo especfico. La temperatura especfica normalmente se logra mediante calentamiento. La temperatura y la duracion se pueden seleccionar de modo que maten o inactiven determinadas bacterias, tales como bacterias nocivas. Un paso de enfriamiento rapido se puede realizar a continuacion.
[0043] "Fermentacion" en los metodos de la presente invencion significa la conversion de carbohidratos en alcoholes o acidos mediante la accion de un microorganismo. Preferiblemente, la fermentacion en los metodos de la invencion comprende la conversion de lactosa en acido lactico.
[0044] Los procesos de fermentacion para ser usados en la produccion de productos lacteos fermentados son conocidos y el experto en la tecnica sabra seleccionar las condiciones del proceso adecuadas, tales como temperatura, oxfgeno, cantidad y caractensticas de los microorganismo(s) y tiempo de proceso. Obviamente, las condiciones de fermentacion se seleccionan de modo que ayuden a lograr la presente invencion, es decir, obtener un producto lacteo en forma solida o lfquida (producto lacteo fermentado).
[0045] El termino "producto de tipo batido" se refiere espedficamente a un producto lacteo fermentado que se somete un tratamiento mecanico despues de la fermentacion, dando como resultado una desestructuracion y licuefaccion de la cuajada formada en la fase de fermentacion. El tratamiento mecanico se obtiene tfpica pero no exclusivamente por agitacion, bombeo, filtrado u homogenizacion del gel, o mezclandolo con otros ingredientes. Los productos de tipo batido tienen tfpica pero no exclusivamente un contenido solido no graso de leche del 9 al 15%.
[0046] El termino "producto de tipo firme" incluye un producto basado en leche al que se ha inoculado un cultivo iniciador, por ejemplo un cultivo iniciador, y que se ha envasado tras el paso de inoculacion y luego fermentado en el envase.
[0047] En el presente contexto, el termino "mutante" debena entenderse como una cepa derivada de una cepa de la invencion mediante, por ejemplo, ingeniena genetica, radiacion y/o tratamiento qmmico. Se prefiere que la mutante sea una mutante equivalente funcionalmente, por ejemplo una mutante que tiene sustancialmente las mismas propiedades, o mejoradas (por ejemplo con relacion a la textura, tension de cizallamiento, viscosidad, rigidez del gel, recubrimiento de la boca, sabor, post-acidificacion, velocidad de acidificacion, y/o robustez de fago), que la cepa madre. Segun la invencion, la mutante genera una viscosidad en la leche fermentada superior a aproximadamente 70 Pa medida como la tension de cizallamiento despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados. Dicha mutante forma parte de la presente invencion. Especialmente, el termino "mutante" se refiere a una cepa obtenida sometiendo a una cepa de la invencion a cualquier tratamiento de mutagenizacion usado de forma convencional incluyendo un tratamiento con un mutageno qmmico tal como etano metano sulfonato (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV o a una mutante originada de forma espontanea. Una mutante se puede someter a mas tratamientos de mutagenizacion (un unico tratamiento debena entenderse como una etapa de mutagenizacion seguida de una etapa de cribado/seleccion), pero actualmente se prefiere que no se realicen mas de 20, o no mas de 10, o no mas de 5 tratamientos (o pasos de cribado/seleccion). En una mutante descrita, menos del 5%, o menos del 1% o incluso menos del 0,1% de los nucleotidos en el genoma bacteriano se han cambiado por otro nucleotido, o eliminado, en comparacion con la cepa madre. En el presente contexto, el termino "variante" debena entenderse como una cepa que es funcionalmente equivalente a una cepa de la invencion, por ejemplo que tiene sustancialmente las mismas propiedades, o mejoradas, por ejemplo con relacion a la textura, tension de cizallamiento, viscosidad, rigidez del gel, recubrimiento de la boca, sabor, post- acidificacion, velocidad de acidificacion, y/o robustez de fago). Tales variantes, que se puede identificar utilizando las tecnicas de seleccion apropiadas, se describen en este documento.
[0048] En el presente contexto, la "textura" se mide como la tension de cizallamiento despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados C. Un ensayo para utilizar para realizar un analisis de la textura:
El dfa despues de la incubacion, la leche fermentada se puso a 13°C y se agito suavemente con una varilla equipada con un disco perforado hasta que se logro la homogeneidad de la muestra. Las propiedades reologicas de la muestra se evaluaron en un reometro (StressTech, Reologica Instruments, Suecia) equipado con un sistema de medicion coaxial C25. La prueba de viscosimetna se hizo con indices de cizallamiento variables de 0,27 a 300 1/s en 21 pasos. Los indices de cizallamiento se aumentaron y luego se redujeron y se registraron las curvas ascendentes y descendentes de tension de cizallamiento y viscosidad aparente. El retraso y los tiempos de integracion fueron 5 s y 10 s, respectivamente.
[0049] El uso de los terminos "un/a" y "el/la/los/las" y referentes similares en el contexto de cuando se describe la invencion (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se debe interpretar teniendo en cuenta que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario de manera espedfica o el contexto lo contradiga claramente. Los terminos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" se deben interpretar como terminos abiertos (es decir, con el significado de "que incluye, pero no esta limitado a") a menos que se especifique lo contrario. La enumeracion de rangos de valores en este documento esta
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meramente destinada a servir como un metodo abreviado para referirse individualmente a cada valor separado decreciente dentro del rango, a menos que se indique lo contrario de manera explicita, y cada valor separado se incorpora a la especificacion como si hubiera sido mencionado individualmente. Todos los metodos aqui descritos se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquier ejemplo y de todos los ejemplos, o de expresiones de ejemplificacion (por ejemplo, "tal(es) como" ), proporcionados en este documento esta destinado meramente a aclarar mas la invencion y no plantea una limitacion del alcance de la invencion a menos que se indique lo contrario. No se debe interpretar que ninguna expresion de la especificacion indique que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la practica de la invencion.
Leyendas
[0050] La Figura 1 representa la tension de cizallamiento de CHCC11379 medida con el reometro StressTech. Los resultados muestran una textura mejorada (tension de cizallamiento) en leche coagulada con CHCC11379 despues de crecimiento durante una noche a 43 grados C. La textura se cuantifico mediante la evaluacion de la tension de cizallamiento medida en pascales (Pa) usando un reometro StressTech como se describe en "Analisis de la textura en leche fermentada"
Ejemplos
Ejemplo 1 Preparacion de una mutante galactosa postiva de una cepa de Streptococcus Aislamiento de la cepa fermentadora de galactosa
[0051] Se aislaron mutantes como la mutante fermentadora de galactosa de la cepa de S. thermophilus CHCC6008 (=ST6008, DSM18111). Las celulas de CHCC6008 no se mutagenizaron con ningun compuesto mutagenico ni por luz UV antes del paso de aislamiento de mutantes. Las cepas aisladas, por lo tanto, se parecen a mutantes galactosa positives espontaneas de CHCC6008.
[0052] Antes del aislamiento de las mutantes, CHCC6008 se sembro por estriado en placas de agar M17 con 2% de galactosa (placas M17-gal). CHCC6008 no crecio en la galactosa como unica fuente de carbohidrato.
[0053] Despues de una noche, los cultivos de CHCC6008 se colocaron en placas M17-gal y se pudieron aislar varias colonias despues de dos dfas de crecimiento a 37°C. Varias mutantes se purificaron en placas M17-gal y se volvieron a evaluar en caldo M17 que contenfa 2% de galactosa como el unico carbohidrato.
[0054] Mientras que CHCC6008 no disminuyo el pH del caldo M17-gal significativamente, CHCC11379, una de las mutantes purificadas, alcanzo un pH de 5.3 despues de 10 horas a 37 °C, y por lo tanto se la considero una mutante de CHCC6008 fermentadora de galactosa.
[0055] Las cepas CHCC11342 y CHCC11976 se aislaron de la misma manera.
Aislamiento de mutantes por ingenieria genetica
[0056] Las mutantes galactosa positivas tambien pueden ser generadas por mutagenesis dirigida. Se utilizan oligonucleotidos que llevan el nucleotido mutado dentro de la caja promotora de galK -10 para amplificar un fragmento de ADN especifico por PCR. El fragmento de PCR que lleva la mutacion deseada se clona en un plasmido vector y se transforma en la cepa de S. thermophilus deseada, y la mutacion se integra en el cromosoma y se intercambia la region promotora de galK de tipo salvaje por recombinacion. El aislamiento de cepas se realiza como se ha descrito antes.
Analisis de la textura en leche fermentada
[0057] El dfa despues de la incubacion, la leche fermentada se puso a 13°C y se agito suavemente mediante una varilla equipada con un disco perforado hasta que se alcanzo la homogeneidad de la muestra. Las propiedades reologicas de la muestra se evaluaron en un reometro (StressTech, Reologica Instruments, Suecia) equipado con un sistema de medicion coaxial C25.
[0058] La prueba de viscosimetria se hizo con unos indices de cizallamiento variables de 0,27 a 300 1/s en 21 pasos.
Los indices de cizallamiento se aumentaron y se redujeron y se registraron las curvas ascendentes y descendentes de tension de cizallamiento y viscosidad aparente.
[0059] Los tiempos de retraso e integracion fueron 5 s y 10 s, respectivamente. Para posteriores analisis, se eligio una tension de cizallamiento a 300 s-1. Los resultados del reometro mostraron que CHCC11379 tenia una tension de cizallamiento mejorada en un 10% en comparacion con CHCC6008 (valor de tension de cizallamiento
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de 74,0 Pa (pascales) para CHCC11379 en comparacion con 67,5 Pa para la cepa madre CHCC6008, vease Fig. 1).
Analisis de la textura en leche
[0060] En otro experimento se uso CHCC11379 como parte de un cultivo de yogur donde se cocultivaron cepas de S. thermophilus en leche desnatada a 43 °C junto con una cepa de la especie Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaiicus.
Cuando la unica diferencia en la produccion de yogur fue el uso de CHCC11379 en vez de CHCC6008 de tipo salvaje, la tension de cizallamiento tambien aumento en un 10% (105,0 Pa para el cultivo de yogur que contenfa CHCC11379 en comparacion con 94,7 Pa para el cultivo de yogur que contenfa CHCC6008).
Secuenciacion de la region promotora de galK de CHCC11379
[0061] Para revelar el tipo de mutacion para la mutante gal positiva de CHCC11379 se secuencio el principio del gen galK (que codifica la galactoquinasa de S. thermophilus).
[0062] Para CHCC11379 se identifico una mutacion en la region promotora de galK (vease a continuacion). La mutacion respectiva muy probablemente llevara a una actividad promotora mas fuerte en comparacion con la cepa madre 6008, lo que explica el fenotipo gal positivo observado. Esto se basa en el hecho de que la secuencia de consenso para la caja promotora-10 es "TATAAT", y de que una mutacion en el nucleotido 3 de la caja (region) -10 para CHCC6008 ("TACGAT") lleva a una caja -10 con una similitud mayor a la secuencia de consenso en CHCC11379 ("TATGAT").
CHCC11379
CHCC6008
AY704368
Consenso
AAAATATTGATT "TCCATGTGAAAGGGGTTAjjjjGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC AAAAT ATTGATT rTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGAYACATC
AAAAT ATTGATTTTCCArGTGAAAGGGGTTACGAT r rCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATACATC -35 -10 RBS
SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8
[0063] Region promotora del gen galK de CHCC11379. La mutacion puntual en el promotor de galK de CHCC11379 se indica con el codigo de color gris. La secuencia de galK de S. thermophilus ST111 publicada (numero de deposito Genbank. AY704368) se indica para comparacion. -35: region promotora -35; -10: region promotora -10; RBS: sitio de union al ribosoma.
[0064] En este documento se describen formas de realizacion preferidas de esta invencion, incluyendo la mejor manera conocida por los inventores de realizar la invencion. Puede que a los expertos en la tecnica se les ocurran variaciones de esas formas de realizacion preferidas al leer la descripcion precedente. Los inventores esperan que los expertos empleen tales variaciones segun sea apropiado, y es la intencion de los inventores que la invencion se ponga en practica de formas distintas a las especfficamente descritas en este documento. Por consiguiente, esta invencion incluye todas las modificaciones y equivalentes del objeto nombrado en las reivindicaciones anexas del presente documento segun lo permita la ley aplicable. Ademas, cualquier combinacion de los elementos descritos anteriormente en todas las variaciones posibles de la misma estan incluidos por la invencion a menos que se indique lo contrario aquf o que el contexto lo contradiga claramente.
Depositos y solucion experta
[0065] La cepa Streptococcus thermophilus CHCC11379 se deposito en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania) con el numero de deposito DSM22884, el 26 de agosto de 2009.
[0066] Una muestra de la cepa de Streptococcus thermophilus (ST) ST6008 (tambien llamada CHCC6008) se deposito en la DSMZ con el numero de deposito DSM 18111 con la fecha de deposito 29 de marzo de 2006. CHCC11342 (DSM 22932) y CHCC11976 (DSM 22934) se depositaron el 8 de septiembre de 2009 en la DSMZ.
[0067] Otros depositos en DSMZ:
CHCC10019 (DSM19252), CHCC3984 (DSM19251): fecha de deposito 3 de abril de 2007,
CHCC2008 (DSM22584): fecha de deposito 19 de mayo de 2009,
[0068] Los depositos se hicieron bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.
[0069] El solicitante pide que una muestra de los microorganismos depositados se ponga a disponibilidad unicamente de un experto aprobado por el solicitante.
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Referencias
[0070]
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LISTADO DE SECUENCIAS
[0071]
<110> Chr. Hansen A/S
<120> Bacterias
<130> P3652PC00
<150> DK 2009 00984 <151> 2009-09-01
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1 <211> 6 <212> ADN
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 1 tacgat 6
<210> 2 <211> 6 <212> ADN
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 2 tatgat 6
<210> 3 <211> 6 <212> ADN
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 3 tattat 6
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<212> ADN
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 4 tactat 6
<210> 5 <211> 70 <212> ADN
<213> Streptococcus thermophilus <400> 5
aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt atgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60
gagatacatc 7 0
<210> 6 <211> 70 <212> ADN
<213> Streptococcus thermophilus <400> 6
aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt acgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60 gagatacatc 7 0
<210> 7 <211> 70 <212> ADN
<213> Streptococcus thermophilus <400> 7
aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt acgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60
gagatacatc 7 0
<210> 8 <211> 70 <212> ADN
<213> Streptococcus thermophilus <400> 8
aaaatattga ttttccatgt gaaaggggtt acgatttcag tataaacaaa aagaataagt 60 gagatacatc 70

Claims (11)

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    REIVINDICACIONES
    1. Metodo para la fabricacion de una bacteria acido lactica que comprende:
    a) proporcionar una cepa bacteriana de acido lactico como la cepa madre;
    b) introducir una mutadon en el gen GalK de la cepa; y
    c) seleccionar por cribado una cepa mutante que genere una viscosidad mas alta en leche fermentada en comparacion con la cepa madre medida como tension de cizallamiento despues de 12 horas de crecimiento a 37 grados C.
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, donde la mutacion produce la sustitucion de una o ambas de C y G en la region de tipo salvaje -10 que tiene la secuencia de nucleotidos TACGAT (SEC ID NO:1) con un nucleotido independientemente seleccionado del grupo consistente en A y T.
  3. 3. Metodo segun la reivindicacion 2, donde la mutacion resulta en una region -10 que tiene la secuencia de nucleotidos TATGAT (SEC ID NO:2), TATTAT (SEC ID NO:3) o TACTAT (SEC ID NO:4).
  4. 4. Metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la bacteria pertenece a la especie Streptococcus thermophilus.
  5. 5. Bacteria acido lactica que lleva una mutacion en la region -10 del gen GalK, donde la mutacion resulta en una region -10 que tiene la secuencia de nucleotidos TATTAT (SEC ID NO:3) o TACTAT (SEC ID NO:4).
  6. 6. Cepa bacteriana de la especie Streptococcus thermophilus, seleccionada del grupo que consiste en: CHCC11379 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el numero de deposito DSM 22884; CHCC11342 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el numero de deposito DSM 22932, y CHCC11976 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el numero de deposito DSM 22934.
  7. 7. Composicion que comprende una bacteria acido lactica segun la reivindicacion 5 o una cepa bacteriana segun la reivindicacion 6.
  8. 8. Composicion que comprende, o bien como una mezcla o como un conjunto de elementos,
    - una cepa de una bacteria acido lactica segun la reivindicacion 5 o una cepa bacteriana segun la reivindicacion 6; y
    - una cepa de una especie de Lactobacillus.
  9. 9. Metodo para la produccion de un producto lacteo/derivado de la leche, que comprende fermentar un sustrato de leche con una bacteria acido lactica segun la reivindicacion 5, una cepa bacteriana segun la reivindicacion 6, o una composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 7-8.
  10. 10. Metodo segun la reivindicacion 9, donde dicha especie de Lactobacillus es una cepa de L. Bulgaricus o L. Fermentum, preferiblemente una cepa seleccionada del grupo consistente en LB18; CHCC10019 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el numero de deposito DSM19252; CHCC2008 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el numero de deposito DSM22584, o CHCC3984 depositada en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el numero de deposito DSM19251.
  11. 11. Producto lacteo o producto de leche fermentado que comprende la bacteria acido lactica segun la reivindicacion 5 o la cepa bacteriana segun la reivindicacion 6.
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