ES2643498T3 - Ensayo de células presentadoras de antígenos de linfocitos B - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Ensayo de celulas presentadoras de antfgenos de linfocitos B Ambito de la divulgacion

Esta divulgacion hace referenda al campo de la inmunologfa y, en especial, a los metodos de diagnostico y/o prediccion de rechazo de un trasplante, por ejemplo, el rechazo celular agudo o el rechazo mediado por anticuerpos (humoral) de un trasplante de organos o la enfermedad del injerto contra huesped.

Antecedentes

Los organos y tejidos trasplantados son vulnerables al rechazo; el rechazo celular agudo (ACR) y el rechazo humoral (HR) son dos formas de rechazo al trasplante. Cualquiera de estos dos procesos comienza con la captacion de un antfgeno extrano por una celula presentadora de antfgeno (APC). Una APC presenta el antfgeno a las celulas efectoras, como linfocitos T y B. La forma en que las APC presentan el antfgeno a las celulas efectoras determina si el sistema inmunologico reacciona con una respuesta inflamatoria o el antfgeno es tolerado. La respuesta inflamatoria a un organo trasplantado se denomina alorespuesta. Una alorespuesta inflamatoria de linfodtos T efectores mediatiza la ACR, mientras que una alorespuesta inflamatoria de linfocitos B efectores incluye la maduracion en los linfocitos B de memoria segregadores de anticuerpos (tambien conocidos como celulas plasmaticas) que median el HR.

Con el fin de identificar a los pacientes con alto riesgo de rechazar un trasplante, se realizan previamente pruebas a los candidatos a un trasplante de organos o cardiaco de anticuerpos anti-HLA contra linfocitos de un grupo de personas representatives de los principales alotipos HLA que se conocen colectivamente como mediciones del panel de anticuerpos reactivos (PRA). Ademas de predear una mayor probabilidad de anticuerpos anti-HLA especfficos del donante y el consiguiente riesgo de fracaso precoz del injerto relacionados con el rechazo humoral, varios estudios han demostrado que los niveles elevados de PRA previos al trasplante en receptores de aloinjerto estan asociados con resultados adversos despues del trasplante, si se compara con pacientes con reactividad baja o negativa. Los niveles altos de PRA se han asoaado, en algunos estudios, con una mayor frecuenaa de rechazo celular agudo, disminucion de la supervivencia del injerto a largo plazo, y un aumento de la mortalidad. Ademas, la aparicion de la enfermedad arterial coronaria (CAD) acelerada en receptores de trasplantes cardfacos, la principal limitacion a la supervivencia del injerto a largo plazo, ha sido asociada con la presenaa de anticuerpos anti-HLA. Dado que la CAD acelerada en estos pacientes puede ser consecuencia de un cumulo de episodios de rechazo celular de alto grado, es posible que esta asociacion pueda reflejar realmente una relacion entre anticuerpos anti HLA y el rechazo celular agudo. Sin embargo, los PRA, y otras pruebas no son altamente sensibles y especfficas. Por tanto, sigue siendo necesario disponer de una prueba sensible y especffica para el rechazo humoral y celular agudo.

<Ashok Kumar et al, Surgery, vol 146, n° 2, 166-173, 2009 y la patente USA 2006/275752A describen la determinacion de un fndice de inmunoreactividad para la postulaaon de rechazos en trasplantes.

Resumen de la divulgacion

La invencion se define en las reivindicaciones.

El linfocito B se origina en las celulas progenitoras de la medula osea, que progresan a traves de varias etapas, como las etapas pro, pre y transicional en el linfocito B naive.

El linfocito B tiene muchas funciones. Puede servir como una celula presentadora de antfgeno, que activa los linfocitos T citotoxicos hacia la funcion efectora, puede activar los linfocitos Th1 naive o de memoria, o evolucionar a una celula de memoria de larga duraaon y transformarse en una celula plasmatica secretora de anticuerpos con ayuda del linfocito T y perpetuar las respuestas de anticuerpos a

autoantfgenos. El antfgeno es detectado por el linfocito B a traves del receptor de linfocitos B, o la molecula de inmunoglobulina.

El reconocimiento de antfgenos, la captacion y la presentacion son los primeros pasos en las muchas funciones que realiza el linfoato B. Los inventores han desarrollado metodos y ensayos para medir esta funcion presentadora de antfgeno para la deteccion temprana de actividad o gravedad de una serie de enfermedades inmunologicas producidas por antfgenos extranos y de otro tipo. Estos antfgenos incluyen, entre otros, tejidos y celulas y organos trasplantados,

patogenos infecciosos, alergenos, autoantfgenos (antfgenos propios, que normalmente no provocan una respuesta inmunitaria) y antfgenos tumorales.

De este modo, en el presente documento se describen metodos y ensayos para el diagnostico y la prediccion de la actividad de los linfocitos B, por ejemplo, el rechazo humoral o celular agudo. La monitorizacion de la captacion y presentacion de antfgenos por las APCs se utiliza para determinar si la respuesta de celulas efectoras dara como resultado ACR, HR, o una ausencia de las mismas. En varios ejemplos, el ensayo descrito se utiliza para diagnosticar o predecir el rechazo del organo trasplantado, la enfermedad injerto-contra-huesped (GVHD) o la inmunidad a un antfgeno. Por ejemplo, el ensayo se utiliza para diagnosticar o predecir la GVHD despues del

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trasplante de organos solidos, medula osea, celulas madre o una combinadon de los mismos. En otros ejemplos, el ensayo se utiliza para predecir la inmunidad contra antfgenos tumorales, autoantfgenos, antfgenos de un patogeno o una combinacion de los mismos.

Tambien se proporciona un metodo para evaluar el rechazo de organos que incluye el poner en contacto una primera muestra que incluye APCs obtenida de un sujeto que necesita o ha recibido un trasplante de organo de un donante, con un antfgeno donante del donante, en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno donante, y la medicion de la captacion del antfgeno donante. El metodo incluye tambien el poner en contacto una segunda muestra que incluye APCs obtenidas del sujeto que necesita o ha recibido un trasplante de organo, con un antfgeno tercero en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno tercero, y medir la captacion del antfgeno tercero. A continuacion, se determina la relacion de captacion del antfgeno donante en la primera muestra para captar el antfgeno tercero en la segunda muestra. Si la captacion del antfgeno donante supera la captacion del antfgeno tercero en forma de una relacion superior a uno entonces el sujeto experimenta el rechazo del organo o es probable que lo experimente. La preparacion de la APC puede consistir en leucocitos de sangre periferica. Las APC son linfocitos B.

En el presente documento se describe tambien un metodo para evaluar el rechazo de linfocitos B en un sujeto mediante la determinacion de un fndice presentador de antfgeno (API). El metodo incluye comparar la captacion de las APCs del receptor del antfgeno de un donante con la captacion de las APCs del receptor de un antfgeno tercero. Un API superior a uno predice con una sensibilidad de al menos el 90% y una especificidad de al menos el 90% un aumento del riesgo de rechazo humoral o celular agudo o la presencia de rechazo humoral o celular agudo.

Tambien se proporciona el metodo para evaluar la GVHD en un sujeto. El metodo incluye evaluar la GVHD poniendo en contacto una primera muestra que incluye APCs del donante obtenidas de una muestra de medula osea o celulas madre del donante antes del trasplante o del receptor que ha recibido medula osea o celulas madre del donante, con un antfgeno receptor de un sujeto del que ha recibido un trasplante de medula osea o un trasplante de celulas madre del receptor, en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno receptor y medir la captacion del antfgeno receptor. El metodo incluye tambien poner en contacto una segunda muestra que incluye APCs del donante obtenidas de una muestra de medula osea o celulas madre del donante antes del trasplante, del receptor que ha recibido medula osea o celulas madre del donante, con un antfgeno tercero en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno tercero, y medir la captacion del antfgeno tercero. A continuacion, se determina la relacion de la captacion del antfgeno receptor en la primera muestra con respecto a la captacion del antfgeno tercero en la segunda muestra. Una relacion superior a uno indica que el sujeto tiene, o es probable que desarrolle una GVHD. La preparacion de la APC puede consistir en leucocitos de sangre periferica. La preparacion de la APC puede consistir de un linfocito B, por ejemplo, un linfocito B del donante.

Ademas se proporcionan metodos para determinar la respuesta de los linfocitos B a otros antfgenos, incluyendo antfgenos de alergenos, agentes patogenos infecciosos, tumores o asociados con enfermedades o trastornos autoinmunes. Los patogenos infecciosos incluyen bacterias, hongos, protistas, priones y/o virus. Estos usos adicionales pueden realizarse aisladamente o ademas de diagnosticar o predecir el rechazo del organo trasplantado.

Las caracterfsticas anteriores y otras adicionales de la divulgacion seran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada de diversas realizaciones que se realizan con referenda a las figuras que acompanan al texto.

Breve descripcion de las figuras

La FIG. 1 es una serie de diagramas de dispersion de datos de citometrfa de flujo que muestran la captaaon de antfgenos en las personas que sufren un rechazo frente a las que no lo sufren. En la persona que sufre un rechazo (paneles superiores), el 23,6% de los linfocitos B del receptor presentan antfgeno donante (panel superior central), en comparacion con el 4,8% de linfocitos B del receptor que presentan antfgeno tercero (panel superior derecho) para un API de 4,91. En la persona que no sufre un rechazo (paneles inferiores), el 35,9% de linfocitos B del receptor presenta antfgeno tercero (panel inferior derecho), pero solo el 13,3% presentan antfgeno donante (panel central inferior). El API es 0,37 en este sujeto que no ha sufrido un rechazo.

La FIG. 2 es un grafico del API de 28 ninos con trasplante de hfgado o intestino en tres momentos diferentes. La mayorfa de los que no sufrieron un rechazo (panel inferior) se mantuvo por debajo del umbral de riesgo de rechazo del API < 1,11 en los tres momentos. La mayorfa de los que sufrieron un rechazo (lfneas negras, panel superior) se encontraban en el umbral de riesgo de rechazo IR de 1,11, o por encima, antes y durante los primeros 1 a 60 dfas despues del trasplante, pero por debajo de este umbral durante el perfodo de 61 a 200 dfas despues del trasplante. Las barras de error representan el error estandar de la media.

La FIG 3 es un conjunto de graficos del API de linfocitos B CD19+ obtenido usando leucocitos de sangre periferica (PBL) del donante «real» y del donante «subrogado» representado en un grafico para 7 ninos con trasplante de hfgado o intestino. El donante subrogado consta de leucocitos de sangre periferica de sujetos humanos sanos con HLA coincidente con el donante real, y por tanto se asemejan a este donante real. La correlacion entre el API obtenido con cualquier estimulador fue significativamente alta para cualquiera de las poblaciones receptoras (panel izquierdo). La asignacion del estado de rechazo (R) o no-rechazo (NR) basada en un API del umbral de riesgo de rechazo de >1,115 fue la misma con cualquier estimulador para cualquier poblacion receptora (panel derecho).

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Descripcion detallada de las diversas realizaciones

/. Abreviaturas

ACR:

APC:

API:

CD:

HR:

LTx:

MLR:

OVA:

PBL:

SBTx:

1.Terminos

Se facilitan las siguientes explicaciones de terminos y metodos para describir mejor la presente divulgacion y guiar al experto en la tecnica en la practica de la presente divulgacion. Las formas singulares «a», «una» y «el» se refieren a uno o mas de uno, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el termino «compuesto por una molecula de acido nucleico» incluye una unica o varias moleculas de acido nudeico y se considera equivalente a la frase «compuesto por al menos una molecula de acido nucleico». El termino «o» se refiere a un unico elemento de los elementos alternativos indicados o a una combinadon de dos o mas elementos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En el presente documento, «comprende» significa «induye». Por lo tanto, «compuesto por A o B», significa «incluyendo A B o A y B», sin excluir elementos adicionales.

Salvo que se indique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que suele entender el experto en la tecnica al que pertenece esta divulgacion. Aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento pueden ser utilizados en la practica o prueba de la presente divulgacion, y a continuacion, se describen metodos y materiales adecuados. Los materiales, metodos y ejemplos son unicamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Aloinjerto: Un trasplante de un organo, tejido, fluido corporal o celula de un individuo a otro individuo no identico geneticamente de la misma espece. En el presente documento, «alogenico» engloba un fenotipo geneticamente diferente presente en sujetos no identicos de la misma espede. Los ejemplos alogenicos incluyen fenotipos de grupo sangufneo y alotipos immunoantigeneticos. Un "aloantfgeno" abarca cualquier antfgeno reconocido por diferentes sujetos de la misma especie. Los organismos, celulas, tejidos, organos y similares, o derivados de un solo individuo, o de un individuo geneticamente identico son "'autologos." El «rechazo del trasplante» se refiere a una respuesta inmunitaria parcial o completa a un trasplante de celulas, tejidos, organos o similares en un receptor del trasplante debido a una respuesta inmunitaria a un injerto alogenico.

Animales: organismos vertebrados multi-celulares vivos, una categorfa que incluye, por ejemplo, mamfferos y aves. El termino mamffero incuye tanto mamfferos humanos como no humanos. De forma similar, el termino «sujeto» incluye tanto sujetos humanos como veterinarios.

Anticuerpo: un ligando polipeptido que incluye al menos una region variable de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada y que se une especfficamente a un epftopo de un antfgeno. Los anticuerpos pueden incluir anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, o fragmentos de anticuerpos.

El termino «se une especfficamente» se refiere, con respecto a un antfgeno, a la asociadon preferente de un anticuerpo o de otros ligandos, total o parcialmente, con un polipeptido especffico. Un agente de union especffico se une sustancialmente solo a un objetivo definido. Se reconoce que un menor grado de interaccion no especffica puede ocurrir entre una molecula, como un agente aglutinante especffico y un polipeptido no objetivo. Sin embargo, la union especffica se puede distinguir como mediada a traves del reconocimiento especffico del antfgeno. Aunque selectivamente los anticuerpos reactivos unen el antfgeno, pueden hacerlo con una afinidad baja. La union especffica generalmente da como resultado un aumento superior a 2 veces, superior a 5 veces, superior a 10 veces, o superior a 100 veces en la cantidad de anticuerpo unido u otro ligando (por unidad de tiempo) a un polipeptido

rechazo celular agudo celula presentadora de antfgeno fndice presentador de antfgeno cluster de diferenciacion rechazo humoral trasplante de hfgado respuesta de linfocitos mixta ovoalbumina

leucocitos de sangre periferica trasplante de intestino delgado

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objetivo, frente a un polipeptido no objetivo. Hay una serie de formatos de inmunoensayo adecuados para seleccionar anticuerpos especfficamente

inmunorreactivos con una protefna determinada. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA de fase solida son habitualmente utilizados para seleccionar anticuerpos monoclonales especfficamente inmunorreactivos con una protefna. Ver Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988), para obtener una descripcion de los formatos de inmunoensayos y las condiciones que se pueden utilizar para determinar la inmunorreactividad especffica.

Los anticuerpos pueden estar compuestos de una cadena pesada y una ligera, cada una de las cuales tiene una region variable, denominada la region pesada variable (VH) y la region ligera variable (VL). En conjunto, la region VH y la region VL son responsables de unir el antfgeno reconocido por el anticuerpo. Esto incluye las inmunoglobulinas intactas y las variantes y porciones de ellas que son bien conocidas en la tecnica, como fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2,

protefnas Fv de cadena simple («scFv») y protefnas Fv estabilizadas de disulfuro («dsFv»). Una protefna scFv es una protefna de fusion en la que una region variable de cadena ligera de una inmunoglobulina y una region variable de cadena pesada de una inmunoglobulina estan unidas por un enlace, mientras que en dsFvs, las cadenas han sido mutadas para introducir un enlace de disulfuro para estabilizar la asociacion de las cadenas. El termino tambien incluye formas recombinantes como anticuerpos quimericos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (como anticuerpos biespecfficos). Ver tambien, Pierce Catalog and Handbook, 19941995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, Immunology, 3a edicion, W.H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.

Un «anticuerpo monoclonal» es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B o por una celula en la que se han transfectado los genes de cadena ligera y pesada de un solo anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales son producidos por metodos conocidos para el experto en la tecnica, por ejemplo, creando celulas formadoras de anticuerpos hfbridas a partir de una fusion de celulas de mieloma con celulas inmunes del bazo. Estas celulas fusionadas y su progenie se denominan «hibridomas». Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados.

En algunos ejemplos, los anticuerpos estan marcados, por ejemplo con un marcador fluorescente que puede ayudar a detectarlos.

Antfgeno: Un compuesto, composicion o sustancia que puede estimular la produccion de anticuerpos o la respuesta de linfocitos T en un animal, incluyendo composiciones que son inyectadas o absorbidas en un animal. Un antfgeno reacciona con productos de inmunidad celular o humoral especffica, incluyendo aquellos inducidos por inmunogenos heterologos. El termino se utiliza indistintamente con el termino «inmunogenico». El termino «antfgeno» incluye todos los epftopos antigenicos relacionados. Un «polipeptido antigenico» es un polipeptido que puede estimular una respuesta inmune, por ejemplo, una respuesta de linfocitos T o una respuesta de anticuerpos. «Epftopo» o «determinante antigenico» se refiere a un punto en un antfgeno en el cual los linfocitos B y/o T responden. Los linfocitos T pueden responder al epftopo cuando el epftopo se presenta junto con una molecula MHC. Los epftopos pueden formarse tanto de aminoacidos contiguos (lineales) o aminoacidos no contiguos yuxtapuestos por plegado terciario de un polipeptido antigenico (conformacionales). Los epftopos formados a partir de aminoacidos contiguos normalmente son retenidos al exponerse a disolventes de desnaturalizacion mientras que los epftopos formados por plegado terciario tfpicamente se pierden en el tratamiento con disolventes de desnaturalizacion. Normalmente, un epftopo de linfocitos B incluira al menos 5 aminoacidos pero puede ser tan pequeno como 3-4 aminoacidos. Un epftopo de linfocitos T, como un epftopo CTL, incluira al menos 7-9 aminoacidos y un epftopo de linfocitos T colaborador al menos 12-20 aminoacidos. Normalmente, un epftopo incluira entre 5-15 aminoacidos, por ejemplo, 9, 10, 12 o 15 aminoacidos. Los aminoacidos se encuentran en una conformacion espacial unica. En un ejemplo concreto, el antfgeno es un antfgeno obtenido de un sujeto que es un donante, por ejemplo, de un organo o de medula osea, a otro individuo geneticamente diferente, dicho antfgeno se denomina antfgeno donante. En un ejemplo, el antfgeno donante incluye antfgenos de linfocitos, leucocitos, como leucocitos de sangre periferica o una combinacion de los mismos. En algunos ejemplos, el antfgeno donante incluye membranas celulares lisadas de los leucocitos de sangre periferica, celulas del bazo, o celulas de la medula osea del donante. En un ejemplo, el antfgeno donante puede ser proporcionado por un sujeto que tenia un perfil de loci HLA-A, HLA-B, o HLA-DR similar al donante. En otros ejemplos, el antfgeno es un antfgeno tercero (tambien conocido como antfgeno de referencia). Un antfgeno tercero es un antfgeno que no se ha obtenido del donante de organos o del receptor de organos y no tiene similitud con el receptor o el donante (como indica la medicion de loci HLA-A, HLA-B y HLA-DR). Entre los ejemplos de muestras de antfgenos de terceros se incluyen linfocitos, leucocitos, como los leucocitos de sangre periferica o una combinacion de los mismos. Por ejemplo, las muestras de antfgenos de terceros incluyen membranas de celulas lisadas de leucocitos de sangre periferica, celulas del bazo o celulas de la medula osea del donante. Un autoantfgeno es un antfgeno que en condiciones normales no serfa un objetivo del sistema inmune. Sin embargo, la tolerancia inmunologica normal para ese antfgeno se pierde en un sujeto que padece una enfermedad autoinmune especffica y estimula la produccion de autoanticuerpos.

Celulas presentadoras de antfgeno (APCs): celulas altamente especializadas que pueden procesar antfgenos y mostrar sus fragmentos de peptidos en la superficie celular junto con moleculas necesarias para la activacion de linfocitos. Por ejemplo, una APC es una celula que puede presentar antfgeno unido a moleculas MHC de clase I o

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clase II para linfocitos T. Las APCs incluyen, entre otras, monocitos, macrofagos, celulas dendrfticas, linfocitos B, linfocitos T y celulas de Langerhans. Un linfocito T que puede presentar antfgeno a otros linfocitos T (induyendo CD4+ y/o CD8+ linfocitos T) es un linfocito T presentador de antfgeno (T-APC).

Indice presentador de antfgeno (API): Una medida de la captaaon (por union o internalizacion) del antfgeno donante en APCs de un sujeto, expresada como una relaaon con la captacion del antfgeno tercero en APCs del sujeto. Un API > 1 indica un mayor riesgo de rechazo o presencia de rechazo en el sujeto. Un API < 1 indica un menor riesgo de rechazo o ausencia de rechazo en un sujeto. El API normaliza la captacion de antfgenos del donante para la captaaon de un antfgeno de referencia (de terceros) para cada persona. El API es unico para cada individuo, pero comparable entre individuos.

Linfocito B: uno de los dos tipos prinapales de linfocitos. Los linfocitos B se derivan de celulas progenitoras de la medula osea, que progresan a traves de varias etapas, como las etapas pro, pre y transiaonal en el linfocito B naive. El receptor de antfgenos en los linfoatos B es una molecula de inmunoglobulina de superficie celular. Tras la activacion por un antfgeno, los linfocitos B se diferencian en celulas productoras de anticuerpos de la misma especificidad que su receptor inicial. Los linfocitos B tambien son APCs.

Un «linfocito B inmaduro» es una celula que puede convertirse en un linfocito B maduro.

Generalmente, los linfocitos pro-B (que expresan, por ejemplo, CD10), realizan una reorganizacion de la cadena pesada de inmunoglobulina para convertirse en linfodtos pro B pre B y, ademas, reorganizan la restructuracion de la cadena ligera de inmunoglobulina para convertirse en linfocitos B inmaduros.

Los linfocitos B inmaduros incluyen linfocitos B T1 y T2. Por tanto, un ejemplo de un linfocito B inmaduro es un linfocito B T1 que es una celula AA41altaCD23baja. Otro ejemplo de un linfocito B inmaduro es un linfocito T2 B que es una celula AA41altaCD23alta. Por tanto, los linfocitos B inmaduros incluyen celulas de expresion B220 donde los genes de inmunoglobulinas de cadena ligera y pesada se reorganizan, y expresan AA41. Los linfoatos B inmaduros pueden convertirse en linfocitos B maduros, que pueden producir inmunoglobulinas (por ejemplo, IgA IgG o IgM). Los linfocitos B maduros expresan marcadores caracterfsticos como CD21 y CD23 (celulas CD23altaCD21baja ), pero no expresan AA41. En algunos ejemplos, un linfocito B es el que expresa CD179alta, CD24, CD38 o una combinacion de los mismos. Los linfocitos B pueden activarse mediante agentes como lipopolisacaridos (LPS) o IL-4 y anticuerpos para IgM.

Los linfocitos B tienen muchas funciones. Por ejemplo, un linfocito B puede servir como una APC (que activa los linfocitos T citotoxicos a la funcion efectora), activar los linfocitos Th1 naive o de memoria o evolucionar a una celula de memoria longeva y transformarse en una celula plasmatica secretora de anticuerpos con ayuda del linfocito T, y perpetuar las respuestas de anticuerpos a autoantfgenos. El antfgeno es detectado por el linfocito B a traves del receptor de linfocitos B o la molecula de inmunoglobulina.

CD5: Un marcador de linfoctos B, tambien conocido como «cluster de diferenciaaon 5».

Los linfoatos B CD5+ son una clase de linfocitos B atfpicos, auto-renovables que se encuentran principalmente en las cavidades pleurales y peritoneales en adultos y que tienen un repertorio en el receptor mucho menos diverso que los linfocitos B convencionales.

CD10: Un marcador de linfoctos B. CD 10 se expresa principalmente en los primeros linfocitos B y en los blastos de linfocitos B, asf como los precursores de linfocitos T y las celulas estromales de la medula osea. CD10 es un antfgeno, que es un marcador de superficie celular utilizado en el diagnostico de la leucemia linfocftica aguda humana (ALL). CD 10 tambien se conoce como membrana metalo- endopeptidasa (MME) y CALLA

CD27: Una protefna expresada en timoctos medulares, linfocitos T, celulas asesinas naturales (NK) y algunos linfocitos B. CD27 es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF. Este receptor esta implicado en la generacion y el mantenimiento a largo plazo de la inmunidad del linfocito T. Se une al ligando CD70, y desempena un papel importante en la regulacion de la activacion del linfoato B y la sfntesis de inmunoglobulina. CD27 transduce senales que llevan a la activacion de NF-kB y MAPK8/JNK.

CD154: Una protefna expresada en linfocitos T. CD 154 tambien se conoce como ligando CD40. CD 154 regula la funcion del linfocito B conectando CD40 en la superficie del linfocto B. Un defecto en este gen produce la incapacidad para realizar la conmutacion de las clases de inmunoglobulinas y se asocia con el sfndrome de hiper- IgM.

Contacto: Colocacion en asociacion ffsica directa; incluye la forma solida y lfquida.

Diagnostico: El proceso de identificar una enfermedad por sus senales, sfntomas y los resultados de distintas pruebas. La conclusion a la que se llega a traves de ese proceso tambien se denomina «un diagnostico». Los metodos de diagnostico realizados habitualmente incluyen analisis de sangre, diagnostico medico por la imagen, analisis geneticos, analisis de marcadores moleculares, analisis de orina, biopsia e histologfa. Los metodos de diagnostico difieren en su sensibilidad y especificidad. La «sensibilidad» de un ensayo diagnostico es el porcentaje de individuos enfermos (por ejemplo, aquellos que desarrollen un rechazo del organo trasplantado) que den positivo (porcentaje de verdaderos positivos). La «especificidad» de un ensayo diagnostico es 1 menos la tasa de falsos positivos, donde la tasa de falsos positivos se define como la proporcion de sujetos sin la enfermedad que dan

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positivo. Aunque un metodo de diagnostico determinado no puede proporcionar un diagnostico definitivo de un estado, es efectivo si el metodo proporciona una indicacion positiva que ayuda en el diagnostico. «Pronostico» es la probabilidad de desarrollo (o, por ejemplo, la probabilidad de gravedad) de un estado patologico, por ejemplo, el rechazo de organos.

Fluoroforo: un compuesto qufmico, que cuando se estimula por exposicion a un estfmulo determinado, como una longitud de onda de luz definida, emite luz (fluorescencia), por ejemplo, a una longitud de onda diferente (como una mayor longitud de onda de luz).

Los fluoroforos forman parte de una clase mas amplia de compuestos luminiscentes.

Los compuestos luminiscentes incluyen moleculas quimioluminiscentes, que no requieren una determinada longitud de onda de luz para emitir luz, sino que utilizan una fuente de energfa qufmica. Por tanto, el uso de moleculas quimioluminiscentes (como aequorina) puede eliminar la necesidad de una fuente externa de radiacion electromagnetica, como un laser.

Ejemplos de fluoroforos particulares que se pueden utilizar en los metodos divulgados se proporcionan en la Patente USA N° 5.866.366 concedida a Nazarenko et al., por ejemplo, acido 4-acetamido-4'- isotiocianatostilben-2,2' disulfonico, acridina y derivados como acridina y isotiocianato de acridina, acido 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1- sulfonico (EDANS), 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato (Lucifer Yellow VS), N-(4-anilino-1- naftil)maleimida, antranilamida, Amarillo brillante, cumarina y derivados como cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcumarina (Coumaran 151); cianosina; 4',6-diamino-2-fenilindol (DAPI); 5', 5"-dibromopirogalol- sulfonftalefna (rojo de bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'- 25 isotiocianatofenil)-4- metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; 4,4-

acido diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfonico; acido 4,4'-diisotiocianatostilbeno- 2,2'-disulfonico; 5- [dimetilamino]naftaleno-1-cloruro de sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados como eosina e isotiocianato de eosina; eritrosina y derivados como eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etidio; fluorescefna y derivados como 5-carboxifluoresceina (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin- 2ilo)aminofluorescefna (DTAF), 2'7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceina (JOE), fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna (FITC), y QFITC (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato de malaquita verde; 4- metilumbelliferona; orto cresolfaleina; nitrotirosina; pararosanilina; Rojo fenol; B-ficoeritrina; oftaldialdehfdo; pireno y derivados como pireno, butirato de pireno y sucinimidilo 1 -butirato de pireno; rojo reactivo 4 (Rojo brillante 3B-A Cibacron™); rodamina y derivados como 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxrodamina (R6G), cloruro de sulfonilo de lisamina rodamina B, rodamina (Rod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101 y cloruro de sulfonilo derivado de sulforodamina 101 (Rejo Texas); N,N,N',N'-tetrametil-6- carboxrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; acido rosolico y derivados de quelato de terbio; rojo de LightCycler 640; Cy5,5; y Cy56-carboxifluoresceina; 5- carboxfluoresceina (5-FAM); difluorido dipirrometeno de boro (BODIPY); N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxrodamina (TAMRA); acridina, estilbeno, -6-carboxi -fluoresce in a (HEX), TET (Tetrametil fluorescefna), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), Rojo Texas, 2',7'-dimetoxi-4',5'- dicloro-6-carboxifluorescefna (JOE), Cy3, Cy5, VIC® (Applied Biosystems), Rojo LC 640, Rojo LC 705, amarillo Yakima entre otros.

Otros fluorosforos adecuados incluyen aquellos conocidos por el experto en la tecnica, por ejemplo los comercializados por Molecular Probes (Eugene, Oregon). En ejemplos especfficos, un fluoroforo es carbosiflourescensucinimildiester.

Enfermedad de injerto contra huesped (GVHD): Una complicacion comun y grave de medula osea u otro trasplante de tejido en donde hay una reaccion de linfocitos inmunologicamente competentes donados contra el propio tejido del receptor del trasplante.

La GVHD es una posible complicacion de cualquier trasplante que utiliza o que contiene celulas madre de un donante emparentado o no emparentado.

Hay dos tipos de GVHD aguda y cronica. La GVHD aguda aparece durante los tres primeros meses despues de que se haya realizado el trasplante. Los signos de GVHD aguda incluyen una erupcion cutanea rojiza en las manos y en los pies, que puede propagarse y volverse mas grave y presentar descamacion o ampollas en la piel. La GVHD aguda tambien puede afectar al estomago e intestinos, en cuyo caso se producen colicos, nauseas y diarrea. La coloracion amarillenta de la piel y los ojos (ictericia) indica que la GVHD aguda ha afectado el hfgado. La GVHD cronica se clasifica segun su gravedad: la fase/grado 1 es leve; la fase/grado 4 es grave. La GVHD cronica se desarrolla una vez han pasado tres meses o mas despues del trasplante. Los sfntomas de la GVHD cronica son similares a los de la GVHD aguda, pero ademas, la GVHD cronica tambien puede afectar las glandulas mucosas de los ojos, las glandulas salivares de la boca y las glandulas que lubrican el revestimiento del estomago e intestinos.

IgA: Un isotipo de anticuerpo que desempena un papel crucial en la inmunidad de la mucosa. Se produce mas IgA en los revestimientos de la mucosa que en todos los otros tipos de anticuerpos combinados. Hay dos subclases de IgA (IgA1 e IgA2) y puede existir en una forma dimerica denominada IgA secretora (slgA). En su forma secretora, IgA es la principal inmunoglobulina que se encuentra en secreciones mucosas, incluyendo las lagrimas, la saliva, el calostro y secreciones del tracto genito-urinario, el tracto gastrointestinal, la prostata y el epitelio respiratorio.

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Tambien se encuentra en pequenas cantidades en la sangre. El componente secretorio de slgA protege la inmunoglobulina de que se degrade por las enzimas proteolfticas, por tanto, la slgA puede sobrevvr en el diffcil entorno del tracto gastrointestinal y proporcionar proteccion contra los microbios que se multiplican en las secreciones corporales.

IgD: Un isotipo de anticuerpo que representa alrededor del 1% de protemas en las membranas plasmaticas de linfocitos B inmaduros donde a menudo se expresa conjuntamente con otro anticuerpo de superficie celular llamado IgM. IgD tambien se produce en forma de secrecion que se encuentra en muy pequenas cantidades en el suero sangmneo. El IgD segregado se produce como un anticuerpo monomerico con dos cadenas pesadas de la clase delta (5) y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina.

IgM: Un isotipo de anticuerpo que esta presente en los linfocitos B. IgM es el tipo mas grande de molecula de anticuerpo en el sistema circulatorio humano. Se produce despues de que un animal ha sido expuesto a un antfgeno durante un periodo de tiempo prolongado o cuando un animal se expone a un antfgeno por segunda vez.

Respuesta inmunitaria: una respuesta de una celula del sistema inmunologico, por ejemplo, un linfocito B o un linfocito T, a un estimulo. En una realizacion, la respuesta es especfica para un antfgeno particular (una «respuesta especfica para el antfgeno»).

Un «parametro de una respuesta inmune» es cualquier aspecto mensurable espedfico de una respuesta inmunitaria, incluyendo sin limitacion, a la secrecion de citocinas (IL-6, IL-10, IFN-y, etc.), la produccion de inmunoglobulinas, la maduracion de las celulas dendnticas, y la proliferacion de una celula del sistema inmunologico. El experto en la tecnica puede determinar facilmente un aumento en cualquiera de estos parametros, utilizando ensayos de laboratorio conocidos. En un ejemplo espedfico no limitativo, para evaluar la proliferacion celular, se puede evaluar la incorporacion de 3H-timidina. Un aumento «sustancial» en un parametro de la respuesta inmunitaria es un aumento significativo de este parametro en comparacion con un control.

Ejemplos espedficos no limitativos de un aumento sustancial son, al menos, un aumento de aproximadamente el 50%, al menos un aumento de aproximadamente el 75%, al menos un aumento de aproximadamente el 90%, al menos un aumento de aproximadamente el 100%, al menos un aumento de aproximadamente el 200%, al menos un aumento de aproximadamente el 300%, y al menos un aumento de aproximadamente el 500%. De forma similar, la inhibicion o disminucion de un parametro de la respuesta inmunitaria es una disminucion significativa de este parametro en comparacion con un control. Ejemplos espedficos, no limitativos de una disminucion sustancial son al menos una disminucion de aproximadamente el 50%, al menos una disminucion de aproximadamente el 75%, al menos una disminucion de aproximadamente el 90%, al menos una disminucion de aproximadamente el 100%, al menos una disminucion de aproximadamente el 200%, al menos una disminucion de aproximadamente un 300%, y al menos una disminucion de aproximadamente el 500%. Se puede utilizar una prueba estadfstica, por ejemplo, una ANOVA no parametrica para comparer las diferencias en la magnitud de la respuesta inducida por un agente en comparacion con el porcentaje de muestras que responden utilizando un segundo agente. En algunos ejemplos, p < 0,05 es significativo, e indica un aumento o disminucion sustancial en el parametro de la respuesta inmune. El experto en la tecnica puede facilmente identificar otros ensayos estadfsticos de uso.

Sujeto con inmunidad comprometida: Un sujeto que es incapaz de desarrollar o que es improbable que desarrolle una respuesta inmunitaria firme, generalmente como resultado de una enfermedad, desnutricion, o terapia inmunosupresora. Un sistema inmunologico con inmunidad comprometida es un sistema inmunologico que funciona por debajo de lo normal.

Los sujetos con inmunidad comprometida son mas susceptibles a infecciones oportunistas, por ejemplo, infecciones por virus, hongos, protozoos, o infecciones bacterianas, enfermedades prionicas, y determinados tumores. Entre quienes se puede considerar con inmunidad comprometida se incluyen, entre otros, los sujetos con SIDA (o seropositivos), sujetos con inmunodeficiencia severa combinada (SCID), diabeticos, sujetos que han sufrido trasplantes y que esten tomando inmunosupresores, y aquellos que estan recibiendo quimioterapia para el cancer. Los individuos con inmunidad comprometida tambien incluyen sujetos con la mayoria de tipos de cancer (a excepcion del cancer de piel), anemia de celulas falciformes, fibrosis qrnstica, aquellos que no tienen bazo, sujetos con enfermedad renal en estado terminal (dialisis), y aquellos que han estado tomando corticoides de forma habitual en pastillas o mediante inyecciones durante el ultimo ano. Los sujetos con problemas graves de Idgado, pulmon o enfermedad cardfaca tambien pueden presentar la inmunidad comprometida.

Enfermedad infecciosa: Cualquier enfermedad producida por un agente infeccioso. Ejemplos de patogenos infecciosos incluyen, aunque sin limitacion: virus, bacterias, micoplasma y hongos. En un ejemplo espedfico, es una enfermedad causada por al menos un tipo de patogeno infeccioso. En otro ejemplo, es una enfermedad causada por al menos dos tipos diferentes de patogenos infecciosos. Las enfermedades infecciosas pueden afectar a cualquier sistema del cuerpo, ser agudas (duracion breve) o cronica y persistente (duracion prolongada), ocurren con o sin fiebre, atacan a cualquier grupo de edad, y se superponen entre sf Las enfermedades infecciosas pueden ser infecciones oportunistas, al producirse mas frecuentemente en sujetos con inmunidad comprometida.

Las enfermedades vrales ocurren comunmente despues de la inmunosupresion debido a la reactivacion de los virus presentes en el receptor. Ejemplos espedficos de infecciones virales induyen, entre otros, retinitis, enteritis y neumoma por citomegalovirus (CMV); enfermedad linfoproliferativa por virus Epstein-Barr (EBV); varicela/herpes

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(causada por el virus varicela zoster, VZV); mucositis HSV-1 y -2; encefalitis HSV-6, cistitis hemorragica de virus BK; gripe viral; neumoma por virus respiratorio sincitial (RSV) SIDA (producido por VIH); y hepatitis A B o C.

Las infecciones oportunistas se producen en un sujeto con el sistema inmunologico comprometido, como un sujeto que ha sido inmunodeprimido y ha recibido recientemente un trasplante de medula osea o un trasplante de celulas madre hematopoyeticas. Estas infecciones incluyen, aunque sin limitacion, citomegalovirus, Candida albicans, virus de inmunodeficiencia humana, Staphlococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Pseudomas aeruginosa Acinteobacterbaumanni, Toxoplasma gondii, Pneumocystitis carinii, o infecciones por Aspergillus.

Otros ejemplos de virus infecciosos incluyen: Retroviridae; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la poliomielitis, virus de la hepatitis A enterovirus, virus de Coxsackie humano, rinovirus, echovirus); Calciviridae (como cepas que producen gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola; Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del Ebola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de la parainfluenza, virus de las paperas, sarampion, virus respiratorio sincitial); Orthomyxovirdae (por ejemplo, virus de la gripe); Bungaviridae (por ejemplo, virus, Hantaan, virus bunga, flebovirus y nairovirus); Arena viridae (virus de la fiebre hemorragica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Bimaviridae; Hepadnaviridae Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del Papilloma, poliomavirus); Adenoviridae (la mayona de adenovirus); Herpesviridae (virus herpes simple (HSV) 1 y HSV-2, virus varicela zoster, citomegalovirus (CMV), virus herpes); Poxviridae (virus de la viruela, virus de la vacuna de la viruela, virus de la viruela); e Irdovridae (por ejemplo, virus de la peste porcina africana); y virus no clasificados (por ejemplo, agentes etiologicos de la encefalopatfa espongiforme, agente de la hepatitis delta (se cree que fue un satelite defectuoso del virus de la hepatitis B), agentes de hepatitis no-A y no-B (clase 1 = transmitida internamente; clase 2 = transmision parenteral (es decir, hepatitis C); virus Norwalk y afines, y astrovirus).

Los ejemplos de infecciones micoticas incluyen, entre otras: aspergilosis; aftas (producidas por Candida albicans)', criptococosis (producida por Cripto coccus)', e histoplasmosis. Por lo tanto, los ejemplos de hongos infecciosos incluyen, entre otros, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces deimatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.

Los ejemplos de bacterias infecciosas incluyen: Helicobacter pylons, Borelia Burgdorferi, Legionella pneumophilia, micobacterias sps (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae),

Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B) Streptococcus (grupo viridans ), Streptococcus faecalis,Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobico sps.), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter patogeno sp., Enterecococ sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, y Actinomyces israelii. Otros organismos infecciosos (como protistas) incluyen: Plasmodium falciparum y Toxoplasma gondii.

Aislado: Un componente biologico «aislado» (por ejemplo, acido nucleico, peptido o protema) ha sido sustancialmente separado, producido aparte, o purificado lejos de otros componentes biologicos en la celula del organismo en el cual el componente se produce naturalmente, es decir, otros ADN y ARN cromosomicos y extracromosomicos y protemas. Acidos nucleicos, peptidos y protemas que han sido «aislados», por lo que incluyen acidos nucleicos y protemas purificadas por metodos de purificacion estandar. El termino tambien abarca acidos nucleicos, peptidos y protemas preparados por expresion recombinante en una celula huesped asf como los acidos nucleicos sintetizados qumicamente. Del mismo modo, una celula «aislada» ha sido sustancialmente separada, producida aparte o purificada lejos de otras celulas del organismo en el que la celula se produce naturalmente. Las celulas aisladas pueden ser, por ejemplo, al menos un 99%, al menos un 98%, al menos un 95%, al menos un 90%, al menos un 85%, o al menos un 80% puras.

Etiqueta: Un agente con capacidad para la deteccion, por ejemplo, mediante ELISA espectrofotometria, espectrometna de masas, citometna de flujo o microscopfa. Por ejemplo, una etiqueta que se pueda adherir a una molecula y permita la deteccion de la molecula. En un ejemplo determinado, se adhiere una etiqueta a un anticuerpo. Entre los ejemplos de etiquetas se incluyen, entre otras, isotopos radiactivos, sustratos enzimaticos, cofactores, ligandos, agentes quimioluminescentes, fluoroforos, haptenos, enzimas, metales, isotopos metalicos y combinaciones de los mismos. Los metodos de etiquetado y gma en la eleccion de las etiquetas apropiadas para los distintos propositos se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) y Ausubel et al. (en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1998). En un ejemplo especfico, los antfgenos donante y tercero estan etiquetados con un fluoroforo, por ejemplo, carboxiflouresceina sucinimildiester para permitir la deteccion del antfgeno por citometna de flujo.

Leucocito: Las celulas en la sangre, tambien llamadas «globulos blancos», que intervienen en la defensa del cuerpo ante organismos infecciosos y sustancias extranas.

Los leucocitos se producen en la medula osea. Hay 5 tipos principales de globulos blancos, subdivididos entre 2 grupos principales: leucocitos polimorfonucleares (neutrofilos, eosinofilos y basofilos) y leucocitos mononucleares (monocitos y linfocitos).

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Linfocitos: Un tipo de globulos blancos que intervienen en las defensas del sistema inmunitario del cuerpo. Los tipos principales de linfocitos son: linfocitos B, linfocitos T y celulas asesinas naturales (celulas NK). Los «linfocitos T» o «celulas T» son linfocitos que no producen anticuerpos que constituyen una parte del sistema inmunitario que actua mediado por celulas. Los linfocitos T se derivan de linfocitos inmaduros que migran desde la medula osea al timo, donde sufren un proceso de maduracion, bajo la direccion de hormonas tfmicas. Aquf, los linfocitos maduros se dividen rapidamente aumentando en cantidades muy grandes. La maduracion de linfocitos T se convierte en inmunocompetente en base a su capacidad para reconocer y unirse a un antfgeno especffico. La activacion de los linfocitos T inmunocompetentes se desencadena cuando un antfgeno se une a los receptores de la superficie de los linfocitos. Los linfocitos T incluyen, entre otros, linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Un recuento de linfocitos T CD4+ es una celula inmunitaria que lleva un marcador en su superficie, conocido como «cluster de diferenciacion 4» (CD4). Estas celulas, tambien conocidas como linfocitos T col a bora do res, ayudan a organizar la respuesta inmunitaria, incluyendo las respuestas de anticuerpos, asf como las respuestas de los linfocitos T asesinos. Los linfocitos T CD8+ llevan el marcador «cluster de diferenciadon 8» (CD8).

En una realizacion, un linfocito T CD8 es un linfocito T citotoxico. En otra realizacion, un linfocito CD8 es un linfocito T supresor.

Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC): Una denominacion generica que pretende abarcar los sistemas de antfgenos de histocompatibilidad descritos en diferentes especes, incluyendo los antfgenos leucocitarios humanos («HLA»).

Rechazo de organos o rechazo del trasplante: deterioro funcional y estructural de un organo debido a una respuesta inmunitaria activa expresada por el receptor, e independiente de causas no inmunologicas de la disfunaon organica.

Muestra (o muestra biologica): una muestra biologica que contiene ADN, ARN genomico (incluyendo ARNm y microARN), protefnas, celulas, tejidos o combinaciones de los mismos, que se obtiene de un sujeto. Los ejemplos incluyen, entre otros, sangre periferica, orina, saliva, tejido de biopsia, muestras de aspiraaon con aguja fina, especfmenes quirurgicos y material de autopsia. En un ejemplo, una muestra es una muestra de sangre que incluye linfocitos, leucocitos, por ejemplo, leucoatos de sangre periferica, o una combinacion de los mismos, con o sin eritrocitos.

Sujeto: organismos vertebrados multicelulares vivos, una categorfa que induye mamfferos humanos y no humanos. En un ejemplo determinado, el sujeto es un nino. En el presente documento, un «nino» se refiere a una persona que tiene menos de 18 anos.

Linfocito T: un globulo blanco crftico en la respuesta inmunitaria. Los linfocitos T incuyen, aunque sin limitacion, linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Un linfocito T CD4+ es una celula inmunitaria que lleva un marcador en su superficie, conocido como «cluster de diferenciacion 4» (CD4). Estas celulas, tambien conocidas como linfocitos T colaboradores, ayudan a organizar la respuesta inmunitaria, incuyendo las respuestas de anticuerpos asf como las respuestas de los linfocitos T asesinos. Los linfocitos T CD8+ llevan el marcador «cluster de diferenciacion 8» (CD8). En una realizacion, un linfocito T CD8 es un linfocito T citotoxico. En otra realizacion, un linfocito CD8 es un linfocito T supresor.

Agente terapeutico: Un compuesto qufmico, pequena molecula, u otra composicion, como un compuesto antisentido, anticuerpo, inhibidor de la proteasa, hormona, quimiocina, citocina, agente radiactivo, o agente antiinflamatorio, que puede inducir un efecto terapeutico o profilactico deseado cuando se administra adecuadamente a un sujeto.

Cantidad terapeutica efectiva: La cantidad de un determinado agente terapeutico o farmaceutico suficiente para lograr el efecto deseado en el sujeto o una celula tratados con el agente. La cantidad efectiva del agente dependera de varios factores, induyendo sin limitacion, al sujeto o a las celulas tratadas, y la forma de administracion de la composidon terapeutica.

En condiciones suficientes para: Una frase que se utiliza para describir cualquier entorno que permita la actividad deseada. En un ejemplo, incluye condiciones suficientes para inducir la captacion de una molecula, por ejemplo, la union o la internalizacion de un antfgeno por una celula (por ejemplo, la union y/o la internalizacion del antfgeno donante por una APC.

2.Metodos para diagnosticar o prededr el rechazo del organo trasplantado o GVHD

En el presente documento se describe un ensayo para el diagnostico y la predicdon del rechazo de linfoatos B, como el rechazo al trasplante o GVHD. Este ensayo se basa en el hecho de que un linfocito B es una potente APC. La monitorizacion de la captacion y presentacion del antfgeno por las APCs sirve como un aviso previo de si la respuesta efectora favorece el ACR o HR, o un estado libre de rechazo. La prueba de presentacion de antfgeno de linfocitos B que se describe tiene varios usos en los trasplantes. En algunos ejemplos, el ensayo se utiliza para medir el riesgo de rechazo para administrar la terapia con medicamentos anti-rechazo. En algunos ejemplos, el ensayo se utiliza para calcular el tiempo de reduccion de riesgo de rechazo o API < 1 al estimar el tiempo de reduccion de farmacos inmunosupresores, incluyendo sin limitacion, esteroides, tacrolimus, etc., o comparar dos regfmenes de farmacos anti-rechazo diferentes, o dos tipos diferentes de receptores de trasplante. En algunos ejemplos, el ensayo

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se utiliza para estimar la gravedad del rechazo. Por ejemplo, el API es mayor con un rechazo de mayor gravedad que requiere una terapia de medicamentos anti-rechazo mas intensiva. En algunos ejemplos, el ensayo descrito se utiliza para estimar la probabilidad de perdida del injerto. En algunos ejemplos, el ensayo descrito se utiliza para establecer una estimacion del riesgo de rechazo personalizada en cualquier momento de un receptor individual en el que se utiliza el mismo estimulador del donante o del donante subrogado, y se utiliza el mismo antfgeno tercero como referenda para la presentacion del antfgeno donante para el mismo receptor del trasplante. En algunos ejemplos, el ensayo descrito se utiliza en combinacion con varios marcadores, que son unicos para las diferentes etapas del desarrollo de linfoatos B, la presentadon de antfgenos de linfocitos B se puede utilizar para determinar cuando los linfocitos B naive han transicionado a B IgG+ de memoria. Esta transicion de linfocitos B IgG+ de naive a memoria se caracteriza por la disminucion o perdida de la funcion de presentadon de antfgenos. Para esta funcion, se pueden utilizar varios marcadores especfficos de linaje de linfocitos B.

En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En ejemplos especfficos, el sujeto es un nino humano, por ejemplo, un nino de 0 a 5 anos, menos de 10 anos, menos de 13 anos, o menos de 18 anos. En otras realizaciones, el sujeto es un adulto, por ejemplo, un sujeto mayor de 18 anos, mayor de 20 anos o mayor de 25 anos. En otras realizaciones, el sujeto es un animal no humano, tal como un sujeto veterinario (por ejemplo, un animal domestico pequeno o grande).

El ensayo descrito en el presente documento tiene una sensibilidad y especificidad significativamente mayor que los ensayos descritos previamente. Por ejemplo, estudios previos han evaluado los linfoatos B y otras funciones de las APC incubando las APCs con un antfgeno no especffico, ovoalbumina (OVA) en el que se utilizo la captacion de OVA como una medida de la presentacion del antfgeno. La sensibilidad y especificidad de la OVA de linfocitos B fue de un 70-75% para la asodacion con el estado propenso al rechazo (persona que sufre el rechazo). Sin embargo, para la aplicacion clfnica, se necesita una prueba mas sensible y especffica.

En algunos ejemplos, se describe un metodo para evaluar el rechazo de organos. Se contempla la posibilidad de que el trasplante puede ser de cualquier organo, incluyendo organos solidos. En algunos ejemplos, el sujeto ha recibido el trasplante. En algunos ejemplos, el sujeto es un candidato a recibir el trasplante. Ejemplos de organos solidos incluyen, entre otros, el hfgado, el intestino, el rinon, el corazon, el pulmon, el pancreas y la piel. En el contexto de la presente divulgacion, un organo trasplantado no necesita ser todo el organo, puede ser una parte o seccion del organo. En ejemplos especfficos, el sujeto ha recibido, o necesita recibir varios organos o partes de varios organos. En algunos casos, el sujeto es un receptor del trasplante o un candidato a un trasplante de una combinacon de dos o mas de un organo solido, medula osea y celulas madre. En algunos casos, el sujeto esta siendo objeto de tratamiento, incluyendo terapia inmunosupresora.

En algunos ejemplos, el metodo incluye poner en contacto una primera muestra compuesta con las APCs obtenida de un sujeto que necesita o que ha recibido un trasplante de organos de un donante, con un antfgeno donante del donante, en condiciones suficientes para induar la captacion del antfgeno donante; poner en contacto una segunda muestra de las APCs obtenidas del sujeto que necesita o ha recibido un trasplante de organos, con un antfgeno tercero, en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno tercero; y determinar la relacion de la captacion del antfgeno donante en la primera muestra con la captaaon del antfgeno tercero en la segunda muestra. Una relacion superior a uno indica el rechazo del organo en el sujeto o una predisposicion al rechazo de organos. Las APC son linfocitos B.

En algunas realizaciones, los metodos son para evaluar el rechazo de un trasplante de organos solidos. Estos ensayos miden la captacion de antfgeno donante y la expresan como una relacion con la captacion del antfgeno tercero en las APCs, por ejemplo, como linfocitos B. Esta relaaon es el API. Un API > 1 indica un mayor riesgo de rechazo o de presencia de rechazo.

Por ejemplo, un API superior a 1,2, superior a 1,5, superior a 1,75, superior a 2, superior a 3, superior a 4, superior a 5, superior a 6, superior a 7, superior a 8, superior a 9, o superior a 10, como, por ejemplo, entre 1,2 y 10, 5 y 10, 1,2 y 3, 1,5 y 2,5, incluyendo 1,25, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4. 4,5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 o mas puede indicar un mayor riesgo de rechazo. Un API < 1 indica un menor riesgo de rechazo o el rechazo. Por ejemplo, un API inferior a 0,9, inferior a 0,8, inferior a 0,75, inferior a 0,6, inferior a 0,5, inferior a 0,1 o inferior a 0,01, por ejemplo, entre 0,2 y 0,9, 0,3 y 0,8, 0,4 y 0,7, 0,5 y 0,6, incluyendo 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,60, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 puede indicar un menor riesgo de rechazo. El API es unico en el sentido de que «normaliza» la captaaon de antfgeno donante para la captacion de un antfgeno de referenda (tercero) para cada persona. De esta forma, el API es unico para cada individuo y, sin embargo, se puede comparar entre individuos sobre la base de esta escala normalizada.

En este documento se proporciona tambien un metodo de evaluar la GVHD. En algunos ejemplos, el metodo incluye poner en contacto una primera muestra que contiene las APCs obtenidas de una muestra de donante de medula osea o celulas madre antes del trasplante, o del receptor que ha recibido medula osea o celulas madre del donante. El metodo incluye poner en contacto las APCs del sujeto tras el trasplante, con un antfgeno receptor del receptor, en condiaones sufiaentes para inducir la captacion del antfgeno receptor; poner en contacto una segunda muestra que contiene las APCs obtenidas de una muestra de medula osea o celulas madre del donante antes del trasplante, o del receptor que ha recibido medula osea o celulas madre del donante, con un antfgeno tercero, en condiciones suficientes para inducr la captacion del antfgeno tercero; y determinar la relacion de captacion del antfgeno receptor

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en la primera muestra de captacion del antfgeno tercero en la segunda muestra. Una proporcion mayor de uno indica GVHD en el sujeto o una predisposicion para la GVHD. Las APCs son linfocitos B.

En algunas realizaciones, los metodos para evaluar la GVHD incluyen la medicion de la captacion del antfgeno receptor y expresarla como una relacion con la captacion del antfgeno tercero en los linfocitos B para determinar el API. Un API > 1 indica un mayor riesgo de GVHD o la presencia de GVHD. Por ejemplo, y un API superior a 1,2, superior a 1,5, superior a 1,75, superior a 2, superior a 3, superior a 4, superior a 5, superior a 6, superior a 7, superior a 8, superior a 9, o superior a 10, por ejemplo, entre 1,2 y 10, 5 y 10, 1,2 y 3, 1,5 y 2,5, incluyendo 1,25, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4. 4,5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 o mas puede indicar un mayor riesgo de GVHD. Un API < 1 indica un menor riesgo de GVHD o GVHD. Por ejemplo, un API inferior a 0,9, inferior a 0,75, inferior a 0,5, inferior a 0,1 o inferior a 0,01, por ejemplo, entre 0,2 y 0,9, 0,3 y 0,8, 0,4 y 0,7, 0,5 y 0,6, incluyendo 0,01,0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,60, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 puede...

En algunos ejemplos, los ensayos descritos predicen el rechazo de linfocitos B con una sensibilidad de al menos un 90% y una especificidad de al menos un 90% para un aumento del riesgo de rechazo de linfocitos B o de la presencia de rechazo de linfocitos B. En algunos ejemplos, los metodos que se describen en el presente documento tienen una sensibilidad de al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%, incluido entre el 90% al 98%, entre el 92% al 96%, entre el 92% al 95%, entre el 93% y el 95%, entre el 94% y el 96%, incluyendo el 90%, 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%. En algunos ejemplos, los metodos que se describen en el presente documento tienen una especificidad de al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%, incluido entre el 90% al 98%, entre el 92% al 96%, entre el 92% al 95%, entre el 93% y el 95%, entre el 94% y el 96%, incluyendo el 90%, 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o el 99%.

En algunas realizaciones del metodo, un API superior a uno predice el rechazo con una sensibilidad de aproximadamente el 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% y/o una especificidad de aproximadamente el 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99%.

En algunas realizaciones, comparar la captacion del donante (o antfgeno receptor) con la captacion del antfgeno tercero incluye, ademas, el etiquetado de una muestra biologica que se compone de antfgeno donante (o receptor) y una muestra biologica que se compone de antfgeno tercero con una etiqueta de antfgenos detectables. Se puede utilizar cualquier tipo de etiqueta detectable para facilitar la deteccion. Entre los ejemplos especfficos, no lim itativos de etiquetas se incluyen etiquetas fluorescentes, enzimas e isotopos radiactivos. Los fluoroforos forman parte de una clase mas amplia de compuestos luminiscentes. Los compuestos luminiscentes incluyen moleculas quimioluminiscentes, que no requieren una determinada longitud de onda de luz para emitir luz, sino que utilizan una fuente de energfa qufmica. Por tanto, el uso de moleculas quimioluminiscentes (como aequorina) puede eliminar la necesidad de una fuente externa de radiacion electromagnetica, como un laser.

Ejemplos de fluoroforos especfficos que se pueden utilizar en los metodos divulgados en el presente documento se proporcionan en la Patente USA N° 5.866.366 concedida a Nazarenko et al por ejemplo, acido 4-acetamido-4'- isotiocianatostilben-2,2' disulfonico, acridina y derivados como acridina y isotiocianato de acridina, acido 5-(2'- aminoetil)aminonaftalen-1-sulfonico (EDANS), 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato (Lucifer Yellow VS), N-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, Amarillo brillante, cumarina y derivados como cumarina, 7- amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcumarina (Cumarina 151); cianosina; 4',6- diamino-2-fenilindol (DAPI); 5', 5"-dibromopirogalol- sulfonftalefna (rojo de bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'- isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; acido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'- disulfonico; acido 4,4'-diisotiocianatostilbeno- 2,2'-disulfonico; 5-[dimetilamino]naftaleno-1-cloruro de sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados como eosina e isotiocianato de eosina; eritrosina y derivados como eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etidio; fluorescefna y derivados como 5-carboxifluoresceina (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2ilo)aminofluorescefna (DTAF), 2'7'-dimetox-4'5'- dicloro-6-carboxifluoresceina (JOE), fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna (FITC), y QFITC (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato de malaquita verde; 4-metilumbelliferona; orto cresolfaleina; nitroti rosina; pararosanilina; Rojo fenol; B-ficoeritrina; oftaldialdehfdo; pireno y derivados como pireno, butirato de pireno y sucinimidilo 1 -butirato de pireno; Rojo reactivo 4 (Rojo brillante 3B-A Cibacron™); rodamina y derivados como 6- carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi rodamina (R6G), cloruro de sulfonilo de lisamina rodamina B, rodamina (Rod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X; sulforodamina B, sulforodamina 101 y cloruro de sulfonilo derivado de sulforodamina 101 (Rojo Texas); N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; acido rosolico y derivados de quelato de terbio; Rojo de LightCycler 640; Cy5,5; y Cy56-carboxifluoresceina; 5-carboxifluoresceina (5-FAM); difluorido dipirrometeno de boro (BODiPy); N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA); acridina, estilbeno, -6-carboxi-fluorescefna (HEX), TET (Tetrametil fluorescefna), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), Rojo Texas, 2',7'-dimetoxi-4',5'- dicloro-6-carboxifluorescefna (jOE), Cy3, Cy5, VIC® (Applied Biosystems), Rojo LC 640, Rojo LC 705, amarillo Yakima entre otros.

Otros fluorosforos adecuados incluyen aquellos conocidos por el experto en la tecnica, por ejemplo, los comercializados por Molecular Probes (Eugene, OR). En algunos ejemplos, la molecula fluorescente es carboxifluoresceina sucinimidil ester u otro compuesto similar.

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El metodo incluye determinar la relacion de absorcion del antfgeno donante (o receptor) en la primera muestra para la captacion del antfgeno tercero en la segunda muestra midiendo la fluorescencia de las dos muestras.

En una realizacion, la captacion se puede medir por clasificacion de las celulas activadas fluorescentes (FACS). La FACS emplea una pluralidad de canales de color, deteccion de dispersion de la luz obtusa y de angulo bajo y canales de impedancia, entre otros niveles de deteccion mas sofisticados, para separar o clasificar las celulas. Se puede emplear cualquier tecnica FACS siempre que no sea perjudicial para la viabilidad de las celulas deseadas (para los metodos ejemplares, ver la Patente USA N° 5. 061.620).

Por ejemplo, la muestra que incluye las APCs se obtiene de sangre, bazo o medula osea. En algunas realizaciones, la primera muestra y/o la segunda muestra que contienen las APCs son linfocitos de sangre periferica o leucocitos de sangre periferica.

El antfgeno puede ser un antfgeno purificado o aislado. Asf, el antfgeno se puede sintetizar o producir mediante tecnicas de biologfa molecular. El antfgeno donante puede ser cualquier antfgeno de interes del donante. Se puede utilizar un antfgeno aislado, o mas de un antfgeno aislado, por ejemplo, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10 o mas antfgenos aislados.

En algunos ejemplos, el antfgeno esta incluido en una muestra biologica compleja, como un lisado celular o fraccion. En algunos ejemplos, el antfgeno es un lisado celular de linfocitos y/o leucocitos. En algunas realizaciones, el antfgeno donante o el antfgeno tercero incluye celulas del donante, un peptido antigenico, un peptido antigenico etiquetado con un fluorocromo o cualquier combinacion de los mismos.

En algunas realizaciones, para evaluar el rechazo del trasplante, se utiliza un antfgeno en el loci de los HLA-A HLA- B o HLA-DR del donante en el metodo. En algunas realizaciones, se utiliza mas de un antfgeno en el loci de los HLA- A, HLA-B o HLA-DR del donante en el metodo. En realizaciones adicionales, se utiliza una combinacion de antfgenos del loci de los HLA-A, HLA-B y HLA-DR en los metodos. En un ejemplo, el antfgeno donante incluye antfgenos de linfocitos, leucocitos como leucocitos de sangre periferica o una combinacion de los mismos. En algunos ejemplos, el antfgeno donante incluye membranas celulares lisadas de los leucocitos de sangre periferica, celulas del bazo, o celulas de la medula osea del donante. En un ejemplo, el antfgeno donante procede de un sujeto que tiene el mismo perfil de loci de HLA-A, HLA-B, o HLA-DR o uno muy similar que el donante, pero no es el donante.

En otras realizaciones, para evaluar la GVHD se utiliza en el metodo un antfgeno en el loci de HLA-A, HLA-B o HLA- DR y otro HLA del receptor.

En otras realizaciones, se utiliza en el metodo mas de un antfgeno en el loci de HLA-A, HLA-B o HLA-DR del receptor para detectar GVHD. En otras realizaciones, se utiliza una combinacion de antfgenos del loci de HLA-A, HLA-B y HLA-DR y otro HLA en este metodo. En un ejemplo, el antfgeno receptor incluye antfgenos de linfocitos, leucocitos, por ejemplo, leucocitos de sangre periferica o una combinacion de los mismos. En algunos ejemplos, el antfgeno receptor incluye membranas celulares lisadas de los leucocitos de sangre periferica, celulas del bazo, o celulas de la medula osea del receptor. En un ejemplo, el antfgeno receptor procede de un sujeto que tenia el mismo perfil de loci o muy similar de HLA-A, HLA-B, o HLA-DR y otro HLA que el receptor, pero no es el receptor. En un ejemplo, se utilizan antfgenos de los HLA menores que no sean HLA-A, -B y -DR, o ademas de estos.

El antfgeno tercero puede ser de cualquier sujeto que sea alogenico tanto para el donante como para el receptor. Se puede utilizar un antfgeno o mas de un antfgeno. En algunas realizaciones, se utiliza en el metodo un antfgeno en el loci de los HLA-A, HLA-B o HLA-DR y otro HLA de un tercero. En otras realizaciones, se utiliza en el metodo mas de un antfgeno en el loci de los HLA-A, HLA-B o HLA-DR y otro HLA tercero. En otras realizaciones, se utiliza una combinacion de antfgenos del loci de los HLA-A, HLA-B y HLA-DR y otro HLA de terceros en los metodos. Entre los ejemplos de muestras de antfgenos terceros tambien se incluyen linfocitos, leucocitos, por ejemplo, leucocitos de sangre periferica o una combinacion de los mismos. Por ejemplo, las muestras de antfgenos terceros incluyen membranas de celulas lisadas de leucocitos de sangre periferica, celulas del bazo o celulas de la medula osea terceras.

En algunas realizaciones, el metodo se utiliza para valorar la dosis de un agente inmunosupresor que se proporciona al sujeto o evidenciar la eficacia de un regimen inmunosupresor para el tratamiento del rechazo del trasplante. Por ejemplo, a un sujeto se le administra un primer tratamiento con un regimen inmunosupresor. Se obtiene una primera muestra, que incluye las APCs, por ejemplo, linfocitos B de un sujeto que ha recibido un trasplante de organos de un donante y se pone en contacto con un antfgeno donante del donante, en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno donante. Se obtiene una segunda muestra, que incluye las APCs, como linfocitos B, del sujeto y se pone en contacto con un antfgeno tercero, en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno tercero. A continuacion, se determina la relacion de captacion del antfgeno donante en la primera muestra a captar del antfgeno tercero en la segunda muestra. Una proporcion mayor de uno indica el rechazo de organos en el sujeto e indica que deberfa aumentarse la inmunosupresion o que se deberfa utilizar un regimen inmunosupresor diferente. Una relacion inferior a uno indica la ausencia de rechazo de organos en el sujeto e indica que se puede mantener o disminuir la inmunosupresion, o indica que el regimen inmunosupresor es apropiado para el sujeto. Los metodos se pueden repetir de modo que el sujeto este controlado con regularidad. Por ejemplo, el metodo se puede repetir diariamente, cada dos semanas, semanalmente, cada dos meses o mensualmente. El agente

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inmunosupresor puede incluir, a tftulo meramente enunciativo, un esteroide, ciclosporina A anti-CD3 y anti-CD25 (como daclizumbab), citoquinas, rapamicina, o cualquier otro agente inmunosupresor de interes incluyendo, entre otros, tacrolimus,

bortezimib, alemtuzumab, globulina anti-timocftica humana, globulina anti-linfocitos, micofenolato mofetilo, etc.

En algunas realizaciones, el metodo se utiliza para evaluar el grado de rechazo del organo. Por ejemplo, un API mas alto esta asociado con un rechazo mas grave que con un rechazo leve. Para describirlo con mas detalle, un API mas alto esta asociado con un rechazo resistente a los esteroides en lugar de con un rechazo sensible a los esteroides.

En algunas realizaciones, el metodo se utiliza para valorar la dosis de un agente inmunosupresor que se administra al sujeto o evidenciar la eficacia de un regimen inmunosupresor para el tratamiento de la GVHD. Por ejemplo, se administra a un sujeto un primer tratamiento con un regimen inmunosupresor. Se obtiene una primera muestra que contiene las APCs, por ejemplo, linfocitos B de un sujeto que ha recibido un trasplante de organos de un donante y se pone en contacto con un antfgeno receptor del receptor, en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno receptor. Se obtiene una segunda muestra que contiene las APCs, por ejemplo, linfocitos B, del sujeto y se pone en contacto con un antfgeno tercero, en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno tercero, Se determina la relacion de la captacion del antfgeno receptor en la primera muestra con respecto a la captacion del antfgeno tercero en la segunda muestra. Una relacion mayor de uno indica GVHD en el sujeto e indica que se debe aumentar la inmunosupresion, o que se debe utilizar otro regimen inmunosupresor. Una relacion inferior a uno indica la ausencia de GVHD en el sujeto e indica que se puede mantener o disminuir la inmunosupresion, o indica que el regimen inmunosupresor es apropiado para el sujeto. Las cifras del API<0,9, o <0,1 indican una disminucion del riesgo, mientras que un API >1,2 o >2 o >3 indicarfa un aumento del riesgo de GVHD. Los metodos se pueden repetir de modo que el sujeto este controlado con regularidad. Por ejemplo, el metodo se puede repetir diariamente, cada dos semanas, semanalmente, cada dos meses o mensualmente. El agente inmunosupresor puede incluir, aunque sin limitacion, esteroides, ciclosporina A anti-CD4 y anti-CD25 (como daclizumbab), citoquinas, rapamicina, o cualquier otro agente inmunosupresor de interes incluyendo, entre otros, tacrolimus bortezimib, alemtuzumab, globulina anti-timocftica humana, globulina anti-linfocitos, micofenolato mofetilo, etc.

En algunas realizaciones del metodo para detectar el rechazo del trasplante, la determinacion de la relacion de captacion del antfgeno donante en la primera muestra en comparacion con la captacion del antfgeno tercero en la segunda muestra incluye la deteccion de una pluralidad de biomarcadores despues del tratamiento con el antfgeno donante con la primera muestra compuesta por las celulas presentadoras de antfgeno y el antfgeno tercero con la segunda muestra compuesta por las celulas presentadoras de antfgeno, y comparar la expresion de la pluralidad de biomarcadores tras el tratamiento con el antfgeno donante en la expresion de los biomarcadores tras el tratamiento con el antfgeno tercero para determinar el API. Por ejemplo, los marcadores clasifican un linfocito B como memoria o naive o como precursores de celulas plasmaticas, basado en si expresan CD27, IgA IgM, IgG, IgD, CD25, CD5,

CD 10, CD154, CD138, CD19, CD38, CD24, CTLA4, etc. En otras realizaciones, para detectar la GVHD, la determinacion de la relacion de captacion del antfgeno receptor en la primera muestra con la captacion del antfgeno tercero en la segunda muestra incluye la deteccion de una pluralidad de biomarcadores en las celulas presentadoras de antfgeno despues del tratamiento con el antfgeno receptor con la primera muestra compuesta por las celulas presentadoras de antfgeno y el antfgeno tercero con la segunda muestra compuesta por las celulas presentadoras de antfgeno, y comparar la expresion de la pluralidad de biomarcadores tras el tratamiento con el antfgeno receptor en la expresion de los biomarcadores tras el tratamiento con el antfgeno tercero para determinar el fndice presentador de antfgenos.

En algunos ejemplos, la pluralidad de biomarcadores incluye al menos uno de CD27, IgM, IgA IgD, CD5, CD10, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o los seis marcadores. En otros ejemplos, biomarcadores adicionales como marcadores de celulas de memoria, marcadores de celulas plasmaticas, marcadores de activacion de linfocitos B, marcadores de leucocitos/linfocitos, marcadores de viabilidad celular y otros marcadores conocidos por el experto en la tecnica por ser utiles para controlar el rechazo del organo trasplantado. En algunos ejemplos, marcadores adicionales incluyendo IgG (marcador de celulas de memoria), CD19, CD38 (marcador de celulas plasmaticas), CD138 (marcadores de activacion de celulas plasmaticas), CD 154 (marcador de activacion de linfocitos B), CTLA4 (marcador co-estimulador de linfocitos B negatives), CD45 (marcador de linfocitos/pan-leucocitos) o cualquier combinacion de los mismos. Por lo tanto, el metodo tambien puede incluir la medicion de linfocitos B y T, como linfocitos T de memoria que expresan linfocitos B CTLA4 o CD154 y/o CD154+CD19+.

En una realizacion, el metodo incluye la evaluacion del API y el numero de linfocitos B inflamatorios especfficos del donante que expresan CD 154. En otro ejemplo, el metodo incluye la evaluacion del API y el numero de linfocitos T de memoria citotoxicos CTLA4+T.

En otro ejemplo, el metodo incluye la medicion del API y el numero de linfocitos B CD154+CD19+. Por ejemplo, el API se correlaciona positivamente con linfocitos B inflamatorios especfficos del donante, que expresan CD154 y CD19. De este modo, un API superior a uno indica un aumento de linfocitos CD 154+ y CD 19 en la muestra receptora. En otro ejemplo, el API esta correlacionado negativamente con linfocitos de memoria citotoxicos T especfficos del donante antiinflamatorios que expresan CTLA4. En este ejemplo, un API superior a uno indica menos linfocitos CTLA4 T en la muestra donante.

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En otro ejemplo, el API se correlaciona negativamente con linfocitos B inflamatorios especfficos del donante que expresan el marcador CTLA4 en el que un fndice API superior a uno indica menos linfocitos B CTLA4 en la muestra donante. El metodo puede incluir la medicion de uno o mas de estos tipos de celulas.

En algunos ejemplos, la pluralidad de biomarcadores incluye al menos CD27, IgM, IgA, IgD, IgG, CD5 y CD 10. Se contempla la posibilidad de que tambien se puedan detectar biomarcadores adicionales, como primeros marcadores de linaje de linfocitos B, CD24 y CD 179b, marcadores de celulas de memoria adicionales (porejemplo, IgG), CD19, CD38 (marcador de celulas plasmaticas) y CD 138 (marcadores de activacion de celulas plasmaticas), CD 154 (marcador de activacion de linfocitos B), CTLA4 (marcador co-estimulador de linfocitos B negatives), CD45 (marcador de linfocitos/pan-leucocitos), CD25, CD3, 7-AAD, CD69, CD71, CD86 IFN- gamma, IL-2, TNF alfa, CD45RA CCR7 y CD54. Por tanto, en algunas realizaciones, el metodo incluye la medicion del numero de linfocitos B que expresan uno o mas de CD27, IgM, IgA IgG, IgD, CD5 y CD 10. En otras realizaciones, el metodo incluye la medicion del numero de linfocitos B de memoria, celulas plasmaticas, o linfocitos B activados. En algunos ejemplos, los linfocitos IgD+B se consideran linfocitos B naive. En otros ejemplos, un linfocito CD27+ o IgG+ B se considera que es un linfocito B de memoria. En algunos ejemplos, los biomarcadores adicionales incluyen uno o mas marcadores de linfocitos B que se describen en Linas etal. (Immunology Letters 134: 113- 121.2011).

En algunas realizaciones, los niveles de expresion de una pluralidad de biomarcadores se miden utilizando FACS. Se puede utilizar cualquier tecnica FACS (incluyendo las variantes basadas en principios de dtometrfa de flujo, por ejemplo, la visualizacion de espectrometrfa de masas de marcadores celulares con ligandos metalicos) o cualquier otra captacion de imagenes celulares siempre que no sea perjudicial para la viabilidad de las celulas deseadas (para ejemplos de metodos de FACS ver Patente UsA N° 5. 061.620).

Sin embargo, se pueden emplear otras tecnicas de distinta eficacia para aislar y enumerar las poblaciones de celulas deseadas. Las tecnicas de separacion empleadas deben maximizar la retencion de la viabilidad de la fraccion de las celulas que se van a recoger. La tecnica empleada dependera, por supuesto, de la eficiencia de la separacion, la citotoxicidad del metodo, la facilidad y velocidad de separacion, y el tipo de equipo y/o habilidad tecnica requeridos. Los procedimientos de separacion pueden incluir la separacion magnetica, utilizando perlas paramagneticas recubiertas de anticuerpos, cromatograffa de afinidad, agentes citotoxicos, o bien unidos a un anticuerpo monoclonal o utilizados conjuntamente con complemento y 'panning', que utiliza un anticuerpo monoclonal que se adhiere a una matriz solida u otra tecnica apropiada. Los anticuerpos adheridos a perlas paramagneticas y otras matrices solidas, como perlas de agarosa, perlas de poliestireno, membranas de fibra hueca y placas Petri de plastico, permiten la separacion directa. Las celulas que estan unidas por el anticuerpo se pueden retirar de la suspension celular simplemente separando ffsicamente el soporte solido de la suspension celular. Las condiciones exactas y la duracion de la incubacion de las celulas con los anticuerpos vinculados de la fase solida dependeran de varios factores especfficos del sistema empleado. Sin embargo, la seleccion de las condiciones apropiadas, entra dentro de los conocimientos generales del experto en la tecnica.

A continuacion, las celulas independientes se pueden eluir o lavar con un tampon fisiologico despues de que se haya dejado pasar el tiempo suficiente para que las celulas expresen un marcador de interes (como un antfgeno que una a uno o mas de los anticuerpos monoclonales que se aquf) para unirse a los anticuerpos vinculados a la fase solida. A continuacion, las celulas unidas se separan de la fase solida con cualquier metodo apropiado, dependiendo principalmente de la naturaleza de la fase solida y el anticuerpo empleado.

Por ejemplo, la presencia y cantidad de los diferentes marcadores biologicos se mide con el etiquetado de las celulas con colorantes especfficos del marcador que pueden ser detectados y diferenciados por citometrfa de flujo. Se pueden utilizar colorantes conocidos por el experto en la tecnica, como diacetato de carboxilofluorescefna ester succimidil (DCFES, Molecular Probes, Eugen, Oregon), EMA (colorante de viabilidad celular, 7-AAD (colorante de viabilidad celular) y puntos cuanticos que tengan, por ejemplo, espectros de emision entre 545 nm y 800 nm (Quantum Dot Corp. Hayward, California), para detectar los marcadores deseados.

Aunque se puede utilizar cualquier equipo y metodologfa adecuado para medir los multiples parametros, en un ejemplo se utiliza un citometro de flujo. Se utilizan citometros de flujo que pueden detectar y diferenciar al menos 4 (y mas preferiblemente al menos 7) marcadores de diferentes colores. En algunos ejemplos, se utiliza un citometro de flujo que puede detectar y diferenciar al menos 10, por ejemplo, al menos 15, al menos 20 o, al menos 30 marcadores de diferentes colores. En algunos ejemplos, se utiliza un citometro de flujo que puede medir y comparar al menos 25 parametros multiples o mas, por ejemplo mas de 50 parametros multiples o incluso mas de 100 parametros multiples. Estas funciones de citometrfa de flujo existen en las plataformas de espectrometrfa de masas nuevas que detectan las etiquetas con colorante metalicas. Los metodos de uso de una maquina de citometrfa de flujo son conocidos por el experto en la tecnica.

3.Metodos adicionales

Los metodos descritos tambien se pueden utilizar para determinar la respuesta del linfocito B a otros antfgenos, incluyendo antfgenos de alergenos, patogenos infecciosos, tumores o asociados con trastornos y enfermedades autoinmunes. Los patogenos infecciosos incluyen bacterias, hongos, protistas, priones y/o virus. Estos usos adicionales pueden realizarse aisladamente o ademas de diagnosticar o predecir el rechazo del organo trasplantado.

En algunas realizaciones, el metodo se utiliza para detectar la reactividad a un antfgeno de un patogeno. Por

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ejemplo, el metodo incluye la determinacion de un API comparando la captacion de un antfgeno de un primer patogeno con la captacion de un antfgeno de un segundo patogeno (de referenda) por las APCs de un sujeto de interes. Un API > 1 indica una mayor probabilidad de infeccion con el primer patogeno y una disminucion de la probabilidad de infeccion con el segundo patogeno. Por ejemplo, un API superior a 1,2, superior a 1,5, superior a 1,75, superior a 2, superior a 3, superior a 4, superior a 5, superior a 6, superior a 7, superior a 8, superior a 9 o superior a 10 puede indicar una mayor probabilidad de infecaon con el primer patogeno. Un API < 1, por ejemplo, entre 0,1 a 0,95 o 0,3 a 0,85, indica una disminudon de la probabilidad de infeccion con el primer patogeno, y una mayor probabilidad de infeccion con el segundo patogeno. Por ejemplo, un API inferior a 0,9, inferior a 0,75, inferior a

0. 5, inferior a 0,1 o inferior a 0,1 puede indicar un aumento de la probabilidad de infeccion por el segundo patogeno, y una disminucion de la probabilidad de infeccion por el segundo patogeno.

En algunas realizaciones del metodo, determinar el fndice presentador de antfgenos comprende poner en contacto una primera parte de la muestra biologica que contiene las APCs obtenidas de un sujeto en riesgo de contraer o que se conoce que padece una enfermedad o estado especffico, por ejemplo, una infeccion viral, micotica o bacteriana, con un primer antfgeno de un primer patogeno viral, micotico o bacteriano, en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno; poner en contacto una segunda porcion de la muestra biologica que contiene las APCs obtenidas del sujeto en riesgo de contraer o que se conoce que padece una enfermedad o estado especffico, con una segunda referencia o un antfgeno no patogeno de un patogeno diferente, en condiciones suficientes para inducir la captacion del segundo antfgeno; y determinar la relacion de captacion del primer antfgeno en la primera pordon de la muestra biologica con la captacion del segundo antfgeno en la segunda porcion de la muestra biologica. Un aumento en la captacion del primer antfgeno en comparacion con la captacion del segundo antfgeno (de referencia) indica que el sujeto tiene una infeccion con el primer patogeno. Un aumento en la captacion del segundo antfgeno en comparacon con la captacion del primer antfgeno indica que el sujeto tiene una infeccion con el segundo patogeno. Otra forma en que la captacion de un antfgeno patogeno puede indicar la gravedad de la enfermedad es si supera un umbral establecido en pacientes con diversos niveles de gravedad de la enfermedad.

Un API superior a uno indica la presenaa de un estado determinado, por ejemplo, una infeccion con el primer patogeno, con una sensibilidad de al menos el 90% e indica la presencia de infeccion con una espeaficidad de al menos el 90% para riesgo de infeccion o de contraer la enfermedad o la presencia de una infeccion o enfermedad. En algunos ejemplos, los metodos que se describen en el presente documento tienen una sensibilidad de al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. En algunos ejemplos, los metodos que se describen en el presente documento tienen una especificidad de al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%.

De forma similar, un API superior a uno indica la presencia de una condicion determinada, por ejemplo, una infeccion con el primer patogeno, con una sensibilidad de al menos un 90% indica la presencia de infeccion con una especificidad de al menos el 90% para el riesgo de infeccion o de contraer la enfermedad o la presencia de una infeccion o enfermedad. En algunos ejemplos, los metodos que se describen en el presente documento tienen una sensibilidad de al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. En algunos ejemplos, los metodos que se describen en el presente documento tienen una especificidad de al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%.

El primer y segundo patogeno de interes puede ser cualquier alergeno, bacteria, hongos o virus incluyendo los aquf descritos.

1. Patogenos virales

Ejemplos concretos de patogenos virales incluyen, sin limitacion, cualquiera (o cualquier combinacion) de uno o mas Arenavirus (como virus Guanarito, virus Lassa, virus Junin, virus Machupo y Sabia), Arterivirus, Ronivirus, Astrovirus,

Bunyavirus (como el virus de la fiebre hemorragica de Crimea-Congo y Hantavirus), Bamavirus, Bimavirus Bornavirus (como el virus de la enfermedad de Boma), Bromovirus, Calicivirus, Crisovirus, Coronavirus (como coronavirus y SARS), Cistovirus, Closterovirus, Comovirus, Dicistrovirus, Flavirus (como el virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental, virus de la hepatitis C y virus de la fiebre del dengue), Filovirus (como el virus Ebola y virus de Marburgo), Flexivirus, Hepevirus (como el virus de la hepatitis E), adenovirus humano (como adenovirus humano A-F), astrovirus humanos, poliomavirus BK humano, bocavirus humano, coronavirus humano (como un coronavirus humano HKU1, NL63 y OC43), enterovirus humanos (como enterovirus humanos A-D), eritrovirus humano V9, espumavirus humanos, herpesvirus humanos (como herpesvirus humanos 1 (virus del herpes simple tipo 1), herpesvirus humanos 2 (virus del herpes simple tipo 2), herpesvirus humanos 3 (virus varicela zoster), herpesvirus humanos 4 tipo 1 (virus de Epstein- Barr tipo 1), herpesvirus humano 4 tipo 2 (virus de Epstein-Barr tipo 2), herpesvirus humano 5 cepa AD 169, herpesvirus humano 5 cepa Merlin, herpesvirus humano 6A herpesvirus humano 6B, herpesvirus humano 7, herpesvirus humano 8 tipo M, herpesvirus humano 8 tipo P y Citomegalovirus humano), virus de inmunodeficienca humana (VIH) (como VIH 1 y VIH 2), metapneumovirus humanos, papilomavirus humanos, virus de la parainfluenza humanos (como los virus de la parainfluenza humanos 1 a 3), parechovirus humanos, parvovirus humanos (como parvovirus humano 4 y parvovirus humano B19), virus sincitiales

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respiratorios humanos, rinovirus humanos (como rinovirus humano A y rinovirus humano B), espumaretrovirus humanos, virus linfotroficos T humanos (como virus linfotrofico T humano y virus linfotrofico T humano 2), virus del polioma humanos, Hipovirus, Levivirus, Luteovirus, virus de la coriomeningitis linfocftica (LCM), Mamavirus, Namavirus, Nidovirales, Nodavirus, Ortomixovirus (como virus de la gripe), Partitivirus, Paramixovirus (como virus del sarampion y virus de las paperas), Picornavirus (como poliovirus, virus del resfriado comun, y virus de la hepatitis A), Potivirus, Poxvirus (como viruela), Sequivirus, Reovirus (como Rotavirus), Rhabdovirus (como virus de la rabia), Rhabdovirus (como virus de la estomatitis vesicular, Tetravirus, Togavirus (como virus de la Rubeola y virus del rfo Ross), Tombusvirus, Totivirus, Timovirus y Norovirus, entre otros.

Los antfgenos virales pueden proceder del virus de la hepatitis C (VHC). Los antfgenos de la VHC se pueden seleccionar de una o mas poliproteinas E1, E2, E1/E2, NS345, poliproteinas NS 345-core, core y/o peptidos de las regiones no estructurales (Houghton et al. (1991) Hepatology 14:381-388).

Los antfgenos virales pueden derivarse de un virus herpes humano, como virus herpes simple (VHS), virus de la varicela zoster (VVZ), virus de Epstein-Barr (VEB) o citomegalovirus (CMV). Los antfgenos del virus herpes humano se pueden seleccionar de protefnas tempranas inmediatas, protefnas tempranas y protefnas tardfas. Los antfgenos del VHS pueden derivarse de cepas VHS-1 o VHS-2. Los antfgenos del VHS se pueden seleccionar de glicoprotefnas gB, gC, gD y gH, o protefnas de escape del sistema inmune (gC, gE, o g1). Los antfgenos VZV se pueden seleccionar de protefnas del nucleo, de la nucleocapsida, del tegumento o de la envoltura.

Esta disponible comercialmente una vacuna VZV viva atenuada. Los antfgenos del VEB se pueden seleccionar de protefnas de antfgeno tempranas (EA), antfgeno de la capside viral (VCA) y glicoprotefnas del antfgeno de la membrana (MA). Los antfgenos de CMV se pueden seleccionar de protefnas de la capside, glicoprotefnas de la envoltura (como gB y gH), y protefnas del tegumento. Entre los ejemplos de antfgenos del herpes se incluyen (N° acceso GENBANK™ en parentesis) los derivados del herpesvirus humano 1 (virus Herpes simplex tipo 1) (NC_001806), herpesvirus humano tipo 2 (virus Herpes simplex tipo 2) (NC_001798), herpesvirus humano tipo 3 (virus varicela zoster) (NC_001348), herpesvirus humano 4 tipo 1 (virus de Epstein-Barr tipo 1) (NC_007605), herpesvirus humano 4 tipo 2 (virus de Epstein-Barr tipo 2) (Nc 009334), herpesvirus humano 5 cepa AD 169 (NC_001347), herpesvirus humano 5 cepa Merlin (NC_006273), herpes virus humano tipo 6A (NC 001664), herpes virus humano tipo 6B (NC 000898), herpesvirus humano 7 (NC_001716), herpesvirus humano 8 tipo M (NC_003409) y herpesvirus humano 8 tipo P (NC_009333).

Los antfgenos del virus del papiloma humano (VPH) son conocidos en la tecnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en la publicacion internacional de la Patente N° W096/19496, que describe las variantes de protefnas de VPH E6 y E7, especialmente las protefnas de fusion de E6/E7 con supresion de ambas protefnas de E6 y E7. Los antfgenos con base de VPH L1 se describen en la publicacion internacional de la Patente N° W094/00152, W094/20137, W093/02184 y W094/05792. Dicho antfgeno puede incluir el antfgeno L1 como un monomero, un capsomero o una partfcula similar a un virus. Dichas partfculas ademas pueden contener protefnas L2. Otros antfgenos de VPH son protefnas tempranas, como E7 o protefnas de fusion como L2-E7. Entre los ejemplos de antfgenos VPH se incluyen (N° acceso GENBANK™ en parentesis) los derivados del papilomavirus humano 1 (NC 001356), papilomavirus humano 18 (NC 001357), papilomavirus humano 2 (NC 001352), papilomavirus humano 54 (nC 001676), papilomavirus humano 61 (NC 001694), papilomavirus humano cand90 (NC 004104), papilomavirus humano RTRX7 (nC 004761), papilomavirus humano tipo 10 (NC 001576), papilomavirus humano tipo 101 (NC 008189), papilomavirus humano tipo 103 (NC 008188), papilomavirus humano tipo107 (NC 009239), papilomavirus humano tipo 16 (NC_001526), papilomavirus humano tipo 24 (NC_001683), papilomavirus humano tipo 26 (NC 001583), papilomavirus humano tipo 32 (NC 001586), papilomavirus humano tipo 34 (NC 001587), papilomavirus humano tipo 4 (NC_001457), papilomavirus humano tipo 41 (NC_001354), papilomavirus humano tipo 48 (NC 001690), papilomavirus humano tipo 49 (NC 001591), papilomavirus humano tipo 5 (NC 001531), papilomavirus humano tipo 50 (NC 001691), papilomavirus humano tipo 53 (NC 001593), papilomavirus humano tipo 60 (NC 001693), papilomavirus humano tipo 63 (NC 001458), papilomavirus humano tipo 6b (NC 001355), papilomavirus humano tipo 7 (NC 001595), papilomavirus humano tipo 71 (NC 002644), papilomavirus humano tipo 9 (NC 001596), papilomavirus humano tipo 92 (NC 004500), y papilomavirus humano tipo 96 (NC 005134).

Los antfgenos virales pueden derivarse de un retrovirus, por ejemplo, un oncovirus, ulentivirus o espumavirus. Los antfgenos de oncovirus pueden derivarse de HTLV-1, HTLV-2 o HTLV-5. Los antfgenos de entivirus pueden derivarse del VIH-1 o el VIH- 2.

Los antfgenos de retrovirus pueden seleccionarse de gag, pol, env, tax, tat, rex, rev, nef, vif, vpu y vpr. Los antfgenos para el VIH son conocidos en la tecnica, por ejemplo, los antfgenos del VIH pueden seleccionarse de gag (p24gag y p55gag), env (gpl60 y gp41), pol, tat, nef, rev vpu, miniprotefnas, (p55 gag y gpl40v). Los antfgenos del VIH pueden derivarse de una o mas de las siguientes cepas: HIVmb, HIV; HIVLAV, HIVLAI, HIVM N, HIV-1 CM235, HIV-1 US4. Se pueden encontrar ejemplos de antfgenos del VIH en la publicacion internacional de la Patente N° W009/089568, W009/080719, W008/099284 y WOOO/15255, y USA N° 7.531,181 y 6.225,443. Entre los ejemplos de antfgenos de VIH se incluyen aquellos que se derivan del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (Nc_001802), virus de la inmunodeficiencia humana 2 (NC_001722).

ii.Alergenos

Entre los ejemplos de alergenos (que son antfgenos no parasitos capaces de estimular una reaccion de

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hipersensibilidad de tipo 1) se incluyen aquellos que provienen de plantas, como arboles, por ejemplo, alergenos de Betula verrucosa Bet v 1, Bet v 2, y Bet v 4; Juniperous oxycedrus Jun o 2; Castanea sativa Cas s 2; y alergenos de Hevea brasiliensis Hev b 1, Hev b 3, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10 y Hev b 11; hierbas, como alergenos de Phleum pretense Ph1 p 1, Ph1 p 2, Ph1 p 4, Ph1 p 5 a, Ph1 p 5, Ph1 p 6, Ph1 p 7, Ph1 p 11 y Ph1 p 12; malas hierbas, como el alergeno de Parietaria judaica Par j 2,01011; y alergenos de Artemisia vulgaris Art v 1 y Art v 3; acaros, como alergenos de Dermatophagoides pteronyssinus Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 8 y Der p 10; Tyrophagu putrescentiae Tyr p 2; Lepidoglyphus destructor Lep d 2,01 y Lep d 13; y alergeno de Euroglyphus maynei Eur m 2,0101; animales, como gatos, por ejemplo, el alergeno de Felis domesticus Fel d 1; Penaeus aztecus Pen a 1; Cyprinus carpo Cyp c 1; y albumina de un gato, perro, ganado, raton, rata, cerdo, oveja, pollo, conejo, hamster, caballo, paloma y conejillo de Indias; hongos, como los alergenos de Penicillium citrinum Pen c 3 y Pen c 19; Penicillium notatum Pen n 13; Aspergillus fumigatus Asp f 1, Asp f3, Asp f 4, Asp f 6, Asp f 7 y Asp f 8; Alternaria alternata Alt a 1 y Alt a 5; Malassezia furfur Mai f 1, Mai f 5, Mai f 6, Mai f 7, Mai f 8 y Mai f 9; insectos, como alergenos de Blatella germanica Bla g 2, Bla g 4 y Bla g 5; Apis mellifera Api m 2 y Api m 1; Vespula vulgaris Ves v 5; Vespula germanica Ves g 5; y alergeno de Polstes annularis Pol a 5; alimentos, como alergenos de Malus domestica Mai d 1 y Mai d 2; Apium graveolens Api g 1 y Api g 1.0201; Daucus carota Dau c 1; y alergenos de Arachis hypogaea Ara h 2 y Ara h 5 y similares.

iii. Patogeno bacteriano

Ejemplos especfficos de patogenos bacterianos incluyen, sin limitacion, uno cualquiera o mas (o cualquier combinacion) de Acinetobacter baumanii, Actinobacillus, sp. Actinomycetes, Actinomyces sp. (como Actinomyces israelii y Actinomyces naeslundii), Aeromonas sp. (como Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria (Aeromonas sobria), y Aeromonas caviae), Anaplasma phagocytophilum, Alcaligenes xylosoxidans, Acinetobacter baumanii, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacillus sp. (como Bacillus anthracis, Bacillus ceieus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, y Bacillus stearothermophilus), Bacteroides sp. (como Bacteroides fragilis), Bartonella sp. (como Bartonella bacilliformis y Bartonella henselae, Bifidobacterium sp., Bordetella sp. (como Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, y Bordetella bronchiseptica), Borrelia sp. (como Borrelia recurrentis, y Borrelia burgdorferi), Brucella sp. (como Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melintensis y Brucella suis), Burkholderia sp. (como Burkholderia pseudomallei y Burkholderia cepacia), Campylobacter sp. (como Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari y Campylobacter fetus), Capnocytophaga sp., Cardiobacterium hominis, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Citrobacter sp. Coxella burnetii, Corynebacterium sp. (como, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium jeikeum y Corynebacterium), Clostridium sp. (como Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum y Clostridium tetani), Eikenella corrodens, Enterobacter sp. (como Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Enterob acter cloacae y Escherichia coli, incluidos Escherichia coli oportunistas, como E. coli enterotoxgenica, E. coli enteroinvasiva, E. coli enteropatogenica, E. coli enterohemorragica, E. coli enteroagregativa y E. coli uropatogena) Enterococcus sp. (como Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium) Ehrlichia sp. (como Ehrlichia chafeensia y Ehrlichia canis), Erysipelothrix rhusiopathiae, Eubacterium sp., Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis, Gemella moribillorum, Haemophilus sp. (como Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Haemophilus aegyptius, Haemophilus parainHuenzae, Haemophilus haemolyticus y Haemophilus parahaemolyticus, Helicobacter sp. (como Helicobacter pylori, Helicobacter cinaedi y Helicobacter fennelliae), Kingella kingii, Klebsiella sp. (como Klebsiella pneumoniae, Klebsiella granulomatis y Klebsiella oxytoca), Lactobacillus sp., Listeria monocytogenes, Leptospira interrogans, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Peptostreptococcus sp., Moraxella catarrhalis, Morganella sp., Mobiluncus sp., Micrococcus sp., Mycobacterium sp. (como Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, y Mycobacterium mannum), Mycoplasm sp. (como Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, y Mycoplasma genitalium), Nocardia sp. (como Nocardia asteroides, Nocardia

cyriacigeorgica y Nocardiablasiliensis), Neisseria sp. (como Neisseria

gonorrhoeae y Neisseria meningitidis), Pasteurella multocida, Plesiomonas

shigelloides. Prevotella sp., Porphyromonas sp., Prevotella melaninogenica,

Proteus sp. (como Proteus vulgaris y Proteus mirabilis), Providencia sp. (como Providencia alcalifaciens, Providencia rettgeri y Providencia stuartii), Pseudomonas aeruginosa, Propionibacterium acnes, Rhodococcus equi, Rickettsia sp. (como Rickettsia rickettsii, Rickettsia akari y Rickettsia prowazekii, Orientia tsutsugamushi (anteriormente: Rickettsia tsutsugamushi) y Rickettsia typhi), Rhodococcus sp., Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, Salmonella sp. (como Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella enteritidis, Salmonella cholerasuis y Salmonella typhimurium), Serratia sp. (como Serratia marcesans y Serratia liquifaciens), Shigella sp. (como Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y Shigella sonnei), Staphylococcus sp. (como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hemolyticus, Staphylococcus sapophyticus), Streptococcus sp. (como Streptococcus pneumoniae (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae resistente al cloranfenicol

del serotipo 4, Streptococcus pneumoniae resistente a la espectinomicina del serotipo 6B, Streptococcus pneumoniae resistente a la estreptomicina del serotipo 9V, Streptococcus pneumoniae resistente a la eritromicina del serotipo 14, Streptococcus pneumoniae resistente a la optocina seroptipo 14, Streptococcus pneumoniae resistentes

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a la rifampicina serotipo 18C, Streptococcus pneumoniae resistentes a tetraciclina serotipo 19F, Streptococcus pneumoniae resistentes a la penicilina serotipo 19F y Streptococcus pneumoniae resistentes a la trimetoprima serotipo 23F, Streptococcus pneumoniae resistentes al cloranfenicol serotipo 4, Streptococcus pneumoniae resistentes a la espectinomicina serotipo 6B, Streptococcus pneumoniae resistentes a la estreptomicina serotipo 9V, Streptococcus pneumoniae resistentes a la optoquina serotipo 14, Streptococcus pneumoniae resistentes a la rifampicina serotipo 18C, Streptococcus pneumoniae resistentes a la penicilina serotipo 19F o Streptococcus pneumoniae resistentes a la trimetoprima serotipo 23F), Streptococcus agalactiae, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, estreptococos del grupo A, Streptococcus pyogenes, estreptococos del grupo B, Streptococcus agalactiae, estreptooocos del grupo C, Streptococcus anginosus, Streptococcus equismilis, estreptococos del grupo D, Streptococcus bovis, estreptococos del grupo F, y Streptococcus anginosus, estreptococos del grupo G), Spirillum minus, Streptobacillus moniliformi, Treponema sp. (como Treponema carateum, Treponema petenue, Treponema pallidum y Treponema endemicum, Tropheryma whippelii, Uieaplasma urealyticum, Veillonella sp., Vibrio sp. (como Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio hollisae, Vibrio fluvialis, Vibrio metchnikovii, Vibrio damsela y Vibrio fumisii), Yersinia sp. (como sYersinia enterocolitica, Yersinia pestis, y Yersinia pseudotuberculosis) yXanthomonas maltophilia entre otros.

Los antfgenos bacterianos adecuados para el uso en los metodos descritos incluyen protefnas, polisacaridos, lipopolisacaridos y vesfculas de membrana externa que se pueden aislar, purificar o derivar de una bacteria. Ademas, los antfgenos bacterianos incluyen lisados bacterianos y formulaciones de bacterias inactivadas. Los antfgenos bacterianos se pueden producir por expresion recombinante. Los antfgenos bacterianos incluyen preferiblemente epftopos que se exponen en la superficie de las bacterias durante al menos una fase de su ciclo de vida. Los antfgenos bacterianos incluyen, entre otros, antfgenos derivados de una o mas de las bacterias indicadas anteriormente ademas de los ejemplos de antfgenos especfficos que se indican a continuacion.

Los antfgenos de la gonorrea por Neiserria incluyen protefna Por (o porina), como PorB (ver por ejemplo, Zhu et al. (2004) Vaccine 22:660-669), una transferencia de protefnas vinculantes, como TbpA y TbpB (ver por ejemplo Price et al. (2004) Infect. Immun. 71(1):277-283), una protefna de opacidad (como Opa), una protefna de reduccion modificable (Rpm) y preparados de vesfculas de membrana externa (OMV) (ver, por ejemplo, Plante et al. (2000) J. Infect. Dis. 182:848-855); WO/99/24578; WO/99/36544; WO/99/57280; y WO 02/079243).

Los antfgenos de Chlamydia trachomatis incluyen antfgenos derivados de los serotipos A B, Ba y C (agentes de tracoma, una causa de ceguera), serotipos Li, L3 (asociados con el linfogranuloma venereo) y serotipos, D-K. Los antfgenos de Clamidia trachomas tambien incluyen antfgenos identificados en WO 00/37494; WO/03/049762; WO/03/068811; y WO 05/002619, que incluyen PepA (CT045), LcrE (CT089), Art (CT381), DnaK (CT396), CT398, OmpH-like (CT242), L7/L12 (CT316), OmcA (CT444), AtosS (CT467), CT547, Eno (CT587), HrtA (CT823), MurG (CT761), CT396 y CT761, y combinaciones especfficas de estos antfgenos.

Los antfgenos de Treponemapallidum (sffilis) incluyen antfgeno TmpA

En algunas realizaciones, se puede utilizar un ensayo descrito para medir uno o mas antfgenos derivados de una enfermedad de transmision sexual (ETS). Tales antfgenos pueden proporcionar profilaxis o terapia de ETS como la clamidia, herpes genital, hepatitis (VHC), verrugas genitales, gonorrea, sffilis y/o chancro (ver WO 00/15255). Los antfgenos pueden derivarse de una o mas ETS bacterianas virales. Los antfgenos de ETS virales que se pueden utilizar en la invencion pueden derivarse, por ejemplo, del VHS, virus herpes simple (VHS-1 y VHS-2), papilomavirus humano (VPH), y hepatitis (VHC). Los antfgenos de ETS bacterianas que se pueden utilizar en la invencion pueden derivarse, por ejemplo, de Neiserria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis,Treponemapallidum, Haemophilus ducreyi, E. coli, y Streptococcus agalactiae.

iv. Hongos patogenos

Entre los ejemplos de hongos patogenos se incluyen uno o mas de los siguientes: Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Pityrosporum orbiculare (Malassezia furfur), Candida sp. (como Candida albicans), Aspergillus sp. (como Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus y Aspergillus clavatus), Cryptococcus sp. (como Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Cryptococcus laurentii y Cryptococcus albidus), Histoplasma sp. (como Histoplasma capsulatum), Pneumocystis sp. (como Pneumocystis jirovedi), y 5 Stachybotrys (como Stachybotrys chartarum).

v. Parasitos

Entre los ejemplos de organismos parasitarios figuran la malaria (Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae), esquistosomas, tripanosomas, Leishmania, Nematodos filarias, tricomoniasis, Sarcosporidiasis, Taenia (T. saginata, T. solium), Leishmania, Toxoplasma gondii, Trichinelosis (Trichinella spiralis) o Coccidiosis (especies de Eimeria).

vi. Antfgenos tumorales

Entre los ejemplos de antfgenos tumorales (antfgenos producidos por celulas tumorales que pueden estimular respuestas inmunitarias de linfocitos T especfficos del tumor) se incluyen uno o mas de los siguientes: RAGE-1, tirosinasa, MAGE-1, MAGE-2, N Y-ESO-1, Melan-A/MART-

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1, glucoprotefna (gp) 75, gp100, beta-catenina, antfgeno expresado preferentemente de melanoma (PRAME), MUM- 1, tumor de Wilms (WT)-1, antfgeno carcinoembrionario (CEA) y PR-1. En la tecnica se conocen tambien otros antfgenos tumorales adicionales (por ejemplo, ver Novellino et al., Cancer Immunol. Immunother. 54(3): 187-207, 2005) y se describen a continuacion. Los antfgenos tumorales tambien se conocen como «antfgenos del cancer». El antfgeno tumoral puede ser cualquier antfgeno asociado a un tumor, bien conocido por el experto en la tecnica, por ejemplo, el antfgeno carcinoembrionario (CEA), gonadotropina corionicap -humana, alfafetoprotefna (AFP), AFP reactiva a la lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptasa inversa de telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), esterasa carboxilo intestinal, mut hsp70-2, factor estimulante de colonias de macrofagos, prostasa, antfgeno pro especffico de estado (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prosteina, PSMA, Her2/neu, survivina y telomerasa, antfgeno tumoral de carcinoma de prostata 1, MAGE, ELF2M, elastasa de neutrofilos, efrinB2, CD22, factor de crecimiento de tipo insulfnico (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I y mesotelina. A continuacion, se detalla una lista de antfgenos tumorales seleccionados y sus tumores asociados.

Ejemplos de tumores y sus antfgenos tumorales

Tumor

Antlgenos objetivo asociados con el tumor

Leucemia mielogena aguda

Tumor de Wilms 1 (WT1), PRAME, PR1, proteinasa 3, elastasa, catepsia G

Leucemia mielogena cronica

WT1, PRAME, PR1, proteinasa 3, elastasa, catepsia G

Sfndrome mielodisplasico

WT1, PRAME, PR1, proteinasa 3, elastasa, catepsia G

Leucemia linfoblastica aguda

PRAME

Leucemia linfocftica cronica

Superviviente

Linfoma no Hodgkiniano

Superviviente

Mieloma multiple

NY-ESO-1

Melanoma maligno

MAGE, MART, Tirosinas a, PRAME GP100

Cancer de pecho

WT1, Herceptin, antfgeno de tumor epitelial (ETA)

Cancer de pulmon

WT1

Cancer de ovario

CA-125

Cancer de prostata

PSA

Cancer pancreatico

CA19-9, RCAS1

Cancer de colon

CEA

Cancer de cuello uterino

SCC, CA125, CEA Citoqueratinas (TPA TPS, Cyfra21-1)

Carcinoma de celulas renales (RCC)

Factor de crecimiento fibroblastico 5

Tumores de celula germinal

AFP

En algunas realizaciones, el ensayo es para detectar una infeccion con un patogeno en un sujeto con inmunidad comprometida. Los sujetos con inmunidad comprometida son mas susceptibles a infecciones oportunistas, por ejemplo, infecciones por virus, hongos, protozoos, o infecciones bacterianas, enfermedades prionicas, y determinados neoplasmas. Entre quienes se pueden considerar con inmunidad comprometida se incluyen, entre otros, sujetos con SIDA (o seropositivos), sujetos con inmunodeficiencia severa combinada (SCID), diabeticos, sujetos que han sufrido trasplantes y que esten tomando inmunosupresores, y aquellos que estan recibiendo quimioterapia para el cancer.

Los individuos con inmunidad comprometida tambien incluyen sujetos con la mayorfa de tipos de cancer (a excepcion del cancer de piel), anemia de celulas falciformes, fibrosis qufstica, aquellos que no tienen bazo, sujetos con enfermedad renal en estado terminal (dialisis), y aquellos que han estado tomando corticoides de forma habitual en pastillas o mediante inyecciones durante el ultimo ano.

Los sujetos con problemas graves de hfgado, pulmon o enfermedad cardfaca tambien pueden tener inmunidad comprometida.

En otras realizaciones, el sujeto con inmunidad comprometida esta infectado con un lentivirus. Los lentivirus incluyen, entre otros, virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), virus de la inmunodefidencia humana tipo 2 (VIH-2), virus de la inmunodeficiencia de simios agm (SIVagm), virus de la inmunodeficiencia de simios mnd (SlVmnd), virus de la inmunodeficiencia de simios syk (SIVsyk), virus de la inmunodefidenaa de simios col (SIVcol), virus Visna-Maedi (VMV), virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV), virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), virus de la artritis y encefalitis de las cabras (CAEV) y virus de la anemia infecciosa equina (EIAV). En algunas realizaciones, el lentivirus es un virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). En algunas realizaciones, el

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lentivirus es un virus de la inmunodeficiencia humana tipo 2 (VIH-2). Se contempla la posibilidad de que el antfgeno patogeno pueda ser un extracto del patogeno, o una protefna sintetica o un fragmento de peptido, o fragmentos sintetizados de una partfcula antigenica del patogeno con solapamiento de la secuencia nucleotida o de aminoacido.

En algunas realizaciones, el metodo incluye ademas la deteccion de un conjunto especffico de celulas inmunitarias como linfocitos B o T.

En una realizacion, el metodo incluye evaluar la captacion o el API de linfocitos B. En este ejemplo, el API esta positivamente correlacionado con la expresion CD154 de linfocitos T y B estimulados con el virus de la hepatitis o sus fragmentos. Un API superior a 1 (captacion de hepatitis B/fragmento/peptido > captacion del antfgeno de referencia) indica que un sujeto tiene un mayor riesgo de infeccion o presencia de hepatitis B. De forma alternativa, si se supera un numero mfnimo de linfocitos B, que componen la hepatitis B, entonces la persona tiene un mayor riesgo de contraer la hepatitis B.

En algunos ejemplos, la pluralidad de biomarcadores incluye uno o mas marcadores para uno o mas de los patogenos enumerados mas arriba.

En otros ejemplos, se describe un ensayo global que permite diagnosticar o predecir el rechazo del organo trasplantado como se describe en detalle en la seccion III en combinacion con el diagnostico o prediccion de la infeccion por patogenos, como una infeccion viral o bacteriana. Por ejemplo, se utilizan marcadores especfficos, conocidos por el experto en la tecnica para detectar un virus y/o infeccion bacteriana determinado y se utilizan al menos marcadores CD27, IgM, IgA, IgG, IgD, CD5 y CD 10 para diagnosticar o predecir el rechazo del organo trasplantado. Se contempla la posibilidad de que tambien se puedan detectar biomarcadores adicionales, como marcadores de celulas de memoria adicionales (porejemplo, IgG), CD19, CD38 (marcador de celulas plasmaticas) y CD138 (marcadores de activacion de celulas plasmaticas), CD154 (marcador de activacion de linfocitos B), CTLA4 (marcador co-estimulador de linfocitos B negativos) y CD45 (marcador de panleucocitos/linfocitos). En un ejemplo, cualquiera de los marcadores fenotfpicos que aquf se describen se utiliza solo o de forma combinada.

En algunas realizaciones, se miden los niveles de expresion de la pluralidad de biomarcadores utilizando citometrfa de flujo u otros metodos conocidos por el experto en la tecnica, incluyendo aquellos que se describen en el presente documento (ver seccion III y ejemplos).

La divulgacion se ilustra tambien mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

EJ EMPLOS Ejemplo 1

Ensayo de supervision del rechazo de linfocitos B

Este ejemplo describe un ensayo de supervision del rechazo de linfocitos B para identificar los receptores en riesgo de ACR y HR.

En estos conjuntos de datos, el receptor propenso al rechazo se etiqueto como “rechazante” y el receptor que no experimento rechazo como “no rechazante”. Un API significativamente mas alto distinguio sin solapamiento (100% de sensibilidad y especificidad) a los ninos que experimentaban un rechazo comprobado por biopsia (rechazantes) tras el trasplante de hfgado (LTx) o intestino delgado (SBTx), de aquellos que no experimentaron rechazo (no rechazantes). (Tabla 1). (Tabla 1).

Tabla 1

LTx------------------------

API (Media ±SEM)-------------- SBTx--------------------------------- API (Media ±SEM)--------------

NR n=20

0,750± 0,048 NR n=18 0,555 ±0,060

R n=15

1,794± 0,506 R n=11 1,781 ±0,255

valor p

0,0030 valor p 0,0003

Los datos adicionales mostraron que los diferentes tipos de receptores de trasplantes mostraron resultados similares. Por ejemplo, se observaron resultados similares en todos los compartimentos de linfocitos B, excepto el compartimento IgG-i-. Estos subconjuntos, excluyendo los subconjuntos IgG-i- se definen por la presencia o ausencia de CD27, IgM, IgA IgD, cD5 y CD 10. Las cantidades mfnimas de marcadores incluyen CD19 o CD20 para etiquetar una celula como linfocito B, IgG y CD27 para determinarlo como linfocito B de memoria, IgM o IgD para determinarlo como linfocito B naive. Estos estudios proporcionan respaldan el uso del API para diagnosticar el ACR y el HR y medir su riesgo.

El API produjo una correlacion positiva significativa con linfocitos B inflamatorios especfficos del donante, que expresaron el marcador inflamatorio CD154 (CD154+TcM aloespecffico) (linfocitos B CD154+ aloespecfficos). Estas correlaciones se vieron en poblaciones receptoras de trasplantes de hfgado o de intestino delgado (Tablas 2 y 3). Se observaron resultados similares en todos los compartimentos de linfocitos B excepto el compartimento IgG-i-. Estos subconjuntos, excluyendo los subconjuntos IgG-i- se definieron por la presencia o ausencia de CD27, IgM, IgA IgD,

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CD5 y CD10.

Tabla 2. Correlaciones para la captacion de antfgeno donante de linfocitos B (API) con linfocitos B de memoria citotoxicos T CD 154+ y CTLA-4+ en receptores de trasplantes de hfgado.

n=14NR, 10R

CD19+B-celulas

CD154:+TcM (Spearman r)

0,5600

valor p

0,0044

CTLA4+TcM (Spearman r)

-0,5316

valor p

0,0090

CD154:+CD19 (Spearman r)

0,6246

valor p

0,0019

CTLA4+CD19 (Spearman r)

-0,6084

valor p

0,0027

Tabla 3. Correlaciones para la captacion de antfgeno donante de linfocitos B (API) con linfocitos B de memoria citotoxicos T CD 154+ y CTLA-4+ en receptores de trasplantes de intestino delgado.

n=17NR, 14R----------------------------------------------------------------

CD19+B-celulas

CD154:+TcM (Spearman r)

0,7855

Valor p

0,00000017

CTLA4+TcM (Spearman r)

-0,3931

valor p

0,0349

CD154:+CD19 (Spearman r)

0,4347

valor p

0,0145

El API tenia una correlacion negativa significativa con linfocitos de memoria citotoxica T especfficos del donante antiinflamatorios que expresan el marcador antiinflamatorio CTLA4 (CTLA4+TcM aloespecffico). CTLA4+TcM se midieron en una mezcla de respuesta leucocitaria (MLR). CTLA4+TcM tambien se pudieron medir en el mismo estudio como el API, extendiendo la incubacion de 40 minutos a 6-8 horas. Estas correlaciones se vieron en las poblaciones receptoras de trasplante de hfgado o intestino delgado (Tablas 2 y 3). En los datos adicionales se pudo ver que todos los tipos de receptores de trasplantes mostrarfan resultados similares. Se observaron resultados similares en todos los compartimentos de linfocitos B, excepto el compartimiento IgG-i-. Estos subconjuntos, excluyendo los subconjuntos IgG+ se definieron por la presencia o ausencia de CD27, IgM, IgA IgD, CD5 y CD.

El compartimiento de memoria IgG+ de linfocitos B fue menos eficiente en la presentacion de antfgeno donante en presencia de rechazo humoral, lo cual podia producirse aisladamente o con rechazo celular agudo. En contraste, el API de los compartimentos de linfocitos B naive como los compartimentos de IgD+, o los compartimentos de IgD+CD27- siguio mostrando un API >1 cuando el ACR esta presente sin HR.

Estas observaciones se pueden utilizar para distinguir entre HR y ACR. Por ejemplo, el API de linfocitos B IgG+ (memoria) se expresa como una relacion con el API de linfocitos B IgD+ naive. Efectivamente, esta relacion es tambien una medida de captacion de antfgeno donante por los linfocitos B IgG+ de memoria, en relacion con la captacion de antfgeno donante por los linfocitos B IgD+ naive. La memoria resultante: la relacion del API del linfocito B naive es <1 si el rechazo humoral se encontro solo o con ACR y >1 si solo esta presente el ACR sin HR.

Estos estudios respaldan el uso del ensayo descrito utilizando un API para diagnosticar el ACR y el HR, ademas de medir su riesgo.

Ejemplo 2

Ensayo de supervision del trasplante de organos

Este ejemplo describe un ensayo para la identificacion de los receptores en riesgo de ACR y HR en el cual se

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proporcionan las siguientes indicaciones: (1) el analisis de linfocitos B que componen el antfgeno donante; (2) la caracterizacion de la alorespuesta de los linfocitos B (por ejemplo, si es inflamatoria o anti-inflamatoria), y la caracterizacion de la alorespuesta de los linfocitos T de memoria citotoxica (por ejemplo, ya sea inflamatoria o anti- inflamatoria).

El API de linfocitos B, sus compartimentos de memoria y naive y la produccion resultante de CD154 y CTLA4 en linfocitos T y B, que se describen en el Ejemplo 1 se combinan en una sola prueba de 6-8 horas, en la que el donante etiquetado con colorante y el antfgeno tercero actuan como estimuladores. La citometrfa de flujo policromatica se utiliza para medir la presentacion de antfgenos de linfocitos B, y la alorespuesta inflamatoria o anti- inflamatoria de linfocitos B y T simultaneamente. Este ensayo combinado proporciona un analisis completo de los linfocitos B, captan el antfgeno donante, el caracter de la alorespuesta del linfocito B, ya sea inflamatoria o anti- inflamatoria, y la alorespuesta de linfocitos T de memoria citotoxca, ya sea inflamatoria o anti-inflamatoria.

Ejemplo 3

Ensayo de presentacion de antfgeno de linfocito B

El ejemplo presenta un ensayo de presentacion de antfgeno de linfocitos B para detectar el riesgo de rechazo en sujetos con un organo trasplantado.

Sistema de ensayo: Los linfocitos obtenidos de un receptor de trasplante se mezclaron con antfgeno donante o antfgeno tercero. El antfgeno tercero inclufa los antfgenos de un indivduo antigenicamente diferente al receptor o al donante. La similitud o la disimilitud antigenica se determino en los loci HLA Estos loci de histocompatibilidad inclufan los loci de clase I principales (por ejemplo, HLA-A, -B y-C) y de clase II (por ejemplo, HLA-DR, -DP,- DQ, - DOA, -DOB y-DM). Si el antfgeno donante real no estaba disponible, se utilizaron antfgenos de sujetos humanos normales que se hicieron corresponder con los donantes reales en los loci HLA El API fue la relacion de presentacion y captacion de antfgeno donante con respecto a antfgeno tercero. Si la presentacion de antfgeno donante supero esto debido al tercero, el API fue generalmente >1 y el individuo tenia un mayor riesgo de rechazo. Si la presentacion de antfgeno donante fue superada por el antfgeno tercero, el API es generalmente < 1 y el individuo tiene un menor riesgo de rechazo. Como se muestra en la FIG. 1, en el rechazante (paneles superiores), el 23,6% de los linfocitos B receptores presento antfgeno donante (panel superior central), en comparacion con el 4,8% de linfocitos B receptores que presentaron antfgeno tercero (panel superior derecho) para un API de 4,91. En el caso del no rechazante (paneles inferiores), el 35,9% de los linfocitos B receptores presento el antfgeno tercero (panel inferior derecho), pero solo el 13,3% presento antfgeno donante (panel central inferior). El API es de 0,037 en este sujeto no rechazante.

La captacion y presentacion de antfgenos se midio colocando antfgeno donante o tercero en contacto o bien con linfocitos B purificados o leucocitos de sangre periferica (PBL) del receptor. Posteriormente, se utilizaron tecnicas de imagen (como la citometrfa de flujo, o diversas tecnicas microscopicas, por ejemplo, microscopfa confocal) para medir el antfgeno que ha sido recogido por el linfocito B.

Las tablas 4-7 resumen las diferencias en el API entre los rechazantes y los no rechazantes para algunos de los subconjuntos de linfocitos B en ninos que habfan recibido un trasplante de hfgado (Tabla 4) o de intestino (Tabla 5), o la poblacion combinada de trasplantes de hfgado o de intestino (Tabla 6) y receptores de trasplantes renales adultos (Tabla 7). Los linfocitos B se identificaron con el marcador CD19. Los subconjuntos de linfocitos B se etiquetaron con CD27, un marcador de memoria, e IgG+ otro marcador de memoria de linfocitos B. Se incluyo una medicion por sujeto, realizada o bien cerca de un rechazo comprobado por biopsia (estado del rechazante) o de una ausencia de rechazo establecida (estado del no rechazante). Dentro de la cohorte del trasplante de hfgado, o intestino, algunos sujetos solo fueron sometidos a una medicion, y otros habfan sido monitorizados en serie antes del trasplante, y 1 a 60 dfas y 61 a 200 dfas despues del trasplante. La unica medicion de pacientes con trasplante de hfgado o intestino monitorizados en serie que se ha incluido en las Tablas 4-6 fue la que se realizo durante el perfodo de 1 a 60 dfas despues del trasplante.

Tabla 4. Diferencias en el fndice de presentacion de antfgenos (API) media ±SEM entre no rechazantes y rechazantes tras el trasplante de hfgado. (Leyenda: linfocito B = CD 19+, linfocito B de memoria = CD19+CD27+, linfocito B naive = CD19+CD27-, linfocito B de memoria IgG+ = CD19+IgG+, linfocito B IgG naive = CD19+IgG-.).

Resultado

CD 19+ CD19+CD27+ CD19+CD27- CD19+IgG+ CD19+IgG-

No rechazantes (n=34)

0,512 + 0,057 0,589 + 0,083 0,433 + 0,177 0,843 + 0,108 0,738 + 0,305

Rechazantes

1,794 + 0,237 1,411 + 0,243 1,738 + 0,710 1,303 + 0,151 1,703 + 0,317

valor p

3,12E-07 0,0006 0,0015 0,011 0,005

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Tabla 5. Diferencias en el fndice de presentaaon de antfgenos (API) media ±SEM entre no rechazantes y rechazantes tras el trasplante de intestino. (Leyenda: ver Tabla 4).

Resultado

CD 19+ CD19+CD27+ CD19+CD27- CD19+IgG+ CD19+IgG-

No rechazantes (=34)

0,601 + 0,048 0,660 + 0,072 0,546 + 0,097 0,620 + 0,133 0,553 + 0,067

Rechazantes (n=22)

1,94 + 0,427 1,386 ± 0,218 2,586 + 0,957 0,968 + 0,396 2,333 + 0,980

valor p

4,38E-05 0,0001 0,001 0,042 0,014

Tabla 6. Diferencias en el fndice de presentacion de antfgenos (API) media ±SEM entre no rechazantes y rechazantes en la poblacion combinada de receptores de trasplantes de hfgado o intestino que se muestra en las Tablas 4 y 5. (Leyenda: ver Tabla 4).

Combinado

CDT9+-------------- CD19+CD27+------ CD19+CD27------- CDT9+lgG+------- CD19+IgG---------

No rechazantes (n=68)

0,543 ± 0,037 0,625 + 0,054 0,477 + 0,100 0,677 + 0,088 0,608 + 0,141

Rechazantes (n=48)

1,79 + 0,235 1,411 ± 0,164 2,058 + 0,578 1,208 + 0,197 1,898 + 0,470

valor p

2,86E-10 2,21E-07 4,1E-06 0,002 0,0002

Tabla 7. Diferencias en el fndice de presentacion de antfgenos (API) media ±SEM de linfocitos B CD19+ entre no rechazantes y rechazantes tras el trasplante renal.

Combinado

CD 19+API

No rechazantes (n=10)

0,624 + 0,14

Rechazantes (n=7)

1,49 + 3,6

valor p (una cola)

0,039

A continuacion, se evaluo el resultado del ensayo con pruebas de sensibilidad y especificidad utilizando la serie de datos ilustrativos que se resume en las Tablas 4-6 para ninos con un trasplante de hfgado (Tabla 4) o intestino (Tabla 5) o la cohorte combinada de receptores de trasplante de hfgado o intestino (Tabla 6). La sensibilidad fue la proporcion de rechazantes con un API que superaba el umbral de riesgo de rechazo. La especificidad fue la proporcion de no rechazantes con un API por debajo del umbral de riesgo de rechazo.

Los umbrales de riesgo de rechazo se identificaron y probaron para cada poblacion de sujetos utilizando la regresion logfstica y la realizacion de pruebas de replicadon de cribado. Los receptores de hfgado que aparecen en la Tabla 4 se dividieron en una cohorte de cribado de 43 receptores en los cuales estaba disponible una sola medicion del API (transversal) en proximidad con un rechazo comprobado por biopsia o un curso de no rechazante establecido. La sensibilidad y espeaficidad de este umbral fue luego confirmada en 17 receptores de hfgado restantes determinados como una cohorte de replicacion, en la cual se realizaron mediciones API longitudinalmente, antes del trasplante y en 1-60 y 61-200 dfas despues de un trasplante hepatico. Con fines de replicacion, se volvio a realizar una prueba de sensibilidad y especificidad del umbral de riesgo de rechazo identificado en la cohorte de cribado utilizando los datos previos al trasplante y el API de 1-60 dfas.

De forma similar a los receptores de hfgado, los paaentes de trasplante de intestino que se resumen en la Tabla 5 se componfan de 45 receptores supervisados transversalmente que componfan la cohorte de cribado, y los 11 receptores restantes supervisados longitudinalmente, que componfan la cohorte de replicacion.

La tabla 8 muestra a continuacion los umbrales de riesgo de rechazo para la presentacion de antfgeno de linfocito B (linfocitos CD19+) derivados de receptores de un hfgado, receptores de un intestino y la poblacion combinada que compone las cohortes de cribado (transversal es) respectivas. Los umbrales en o por encima de lo que se predijo en el estado del rechazante de hfgado, intestino o cohortes de cribado combinadas fueron de 1,115, 1,115 y 1,108, respectivamente. La sensibilidad y especificidad de estos umbrales se confirmo en las respectivas cohortes de replicacion, para dos de las tres mediciones API longitudinales, el API anterior al trasplante y el API despues del trasplante a 1-60 dfas. Para cada valor de sensibilidad, las cifras de rechazantes identificados correctamente, por ejemplo, en la tabla se muestran 11 de 13 receptores de hfgado con un API >1,115. Asimismo, tambien aparece el numero de no rechazantes identificados con un API por debajo del umbral de riesgo de rechazo.

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Tabla 8. Resumen de las pruebas de sensibilidad y especificidad del API del umbral de riesgo de rechazo en ninos con trasplante de hfgado o intestino o la poblacion combinada Cohorte de cribado

API del umbral Sensibilidad Especificidad

API en seccior transversal

Hfgado >1,115 84,6% (11 de 13) 96,7% (29 de 30)

Intestino

>1,115 100% (15 de 15) 96,7% (29 de 30)

Combinado >1,108 92,9% (26 de 28) 96,7% (58 de 60)

Cohorte de replicacion

API del umbral Sensibilidad Especificidad

API antes de

Hfgado >1,115 87,5% (7 de 8) 100% (2 de 2)

trasplante

Intestino >1,115 100% (3 de 3) 100% (3 de 3)

Combinado >1,108 90,9% (10 de 11) 100% (5 de 5)

API del umbral Sensibilidad Especificidad

API 1-60 dfas

Hfgado >1,115 100% (13 de 13) 100% (4 de 4)

despues del trasplante

Intestino >1,115 100% ((7 de 7) 100% (4 de 4)

Combinado >1,108 100% (20 de 20) 100% (8 de 8)

La naturaleza dinamica del API en el mismo individuo se ilustro para 28 ninos que habfan sido monitorizados en sene, antes del trasplante, y en los dfas 1-60 y 61-200 despues del trasplante de hfgado o intestino (FIG. 2). Estos resultados muestran que los rechazantes (que experimentan un rechazo dentro de los primeros 60 dfas despues del trasplante) muestran un mayor riesgo de rechazo en la forma de un API en o por encima del API >1,11 del umbral de riesgo de rechazo antes del trasplante. Los rechazantes tambien muestran un mayor riesgo de rechazo durante el perfodo propenso al rechazo de 1-60 dfas, pero muestran una reduccion en el riesgo de rechazo caracterizada por un API <1,11 durante la ultima parte del seguimiento. En contraste, la mayorfa de los no rechazantes son propensos a mostrar un menor riesgo de rechazo caracterizado por un API <1,11 pre-trasplante, que es probable que persista a lo largo del transcurso post-trasplante.

Una de las ventajas del ensayo presentador de antfgeno de linfocito B es su capacidad para utilizar un antfgeno «donante subrogado» en lugar del antfgeno donante real. El antfgeno donante real se compone de leucocitos de sangre periferica o celulas del bazo llamadas esplenocitos que se obtienen del donante y se consumen durante las pruebas de tipificacion de tejidos requeridas en cada uno de los muchos centros que reciben los distintos organos de un donante para trasplante. Por tanto, no es posible realizar una prueba permanente utilizando celulas donantes reales. Un estudio ilustrativo que se resume en la FIG. 3 muestra que si se ha utilizado el antfgeno donante real o si se utiliza el antfgeno donante subrogado, la asignacion de rechazante o del estado de rechazante no cambia si se utiliza un umbral de riesgo de rechazo de 1,115. En este estudio se han realizado pruebas simultaneamente en 4 no rechazantes y 2 rechazantes usando estimuladores de donante real y de donante subrogado. Para cada receptor, se utilizo el mismo estimulador tercero para calcular el API con el estimulador de donante real o donante subrogado.

Aunque esta divulgacion se ha descrito poniendo el enfasis en realizaciones especfficas, sera evidente para el experto en la tecnica que se pueden utilizar variaciones de realizaciones especfficas, y se pretende que la divulgacion se pueda practicar de un modo distinto al descrito especfficamente en el presente documento. Las funciones, caracterfsticas, compuestos o ejemplos descritos junto con un aspecto determinado, realizacion o ejemplo de la invencion se entiende que son aplicables a cualquier otro aspecto, realizacion o ejemplo de la invencion. En consecuencia, esta divulgacion incluye todas las modificaciones que se encuentran dentro del alcance de la divulgacion segun se define en las siguientes reivindicaciones. Por tanto, reivindicamos como nuestra invencion todo lo que se encuentra dentro del alcance de estas reivindicaciones.

Claims (21)

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   1. Un metodo para la evaluacion del rechazo celular agudo (ACR) y/o rechazo humoral (HR) en un sujeto, que comprende:

   la determinacion in vitro de un mdice presentador de antfgeno comparando la captacion de un antfgeno donante con la captacion de un antfgeno tercero en una muestra biologica compuesta por celulas presentadoras de antfgenos (APCs) obtenida del sujeto,

   donde el mdice presentador de antfgeno es una medida de la captacion del antfgeno donante en las APCs de la muestra, expresado como una relacion con la captacion del antfgeno tercero en las APCs del sujeto, en donde la captacion es la union o internalizacion de antfgeno por la APC,

   donde el mdice presentador de antfgeno superior a uno predice con una sensibilidad de al menos el 90% y una especificidad de al menos el 90% un mayor riesgo de ACR y/o HR o la presencia de ACR y/o HR, y en el que las APCs son linfocitos B.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, donde la determinacion in vitro del mdice presentador de antfgeno comprende

   (i) poner en contacto una primera parte de la muestra biologica compuesta por celulas presentadoras de antfgeno (APCs) obtenida de un sujeto que necesita o que ha recibido un trasplante de organos de un donante con un antfgeno donante de un donante en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno donante; (ii) poner en contacto una segunda porcion de la muestra biologica compuesta por APCs obtenida del sujeto que necesita o que ha recibido un trasplante de organo con un antfgeno tercero en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno tercero; y (iii) determinar la relacion de captacion del antfgeno donante en la primera porcion de la muestra biologica con la captacion del antfgeno tercero en la segunda porcion de la muestra biologica,donde las APCs son linfocitos B.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, donde la comparacion de la captacion de un antfgeno donante con la captacion de un antfgeno tercero comprende (i) detectar una pluralidad de biomarcadores despues del tratamiento del antfgeno donante con la primera porcion de la muestra biologica y el antfgeno tercero con la segunda porcion de la muestra biologica, en donde la pluralidad de biomarcadores incluye al menos CD27, IgM, IgA IgD, IgG, CD5 y CD10; y (ii) comparar la pluralidad de biomarcadores detectados despues del tratamiento con antfgeno donante con los detectados despues del tratamiento con el antfgeno tercero para determinar el mdice presentador de antfgeno.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, donde la comparacion de la captacion de antfgeno donante con la captacion de antfgeno tercero comprende ademas el etiquetado del antfgeno donante y el antfgeno tercero con una molecula fluorescente.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en donde la molecula fluorescente es ester de carboxfluoresceina succinimidil.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, donde los niveles de expresion de la pluralidad de biomarcadores se miden utilizando un citometro de flujo.
7. 7. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, donde el metodo se utiliza para diagnosticar o predecir la enfermedad de injerto contra huesped.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, donde el metodo se utiliza para diagnosticar o predecir la enfermedad de injerto contra huesped despues de un trasplante de organos solidos, medula osea o celulas madre, o una combinacion de los mismos.
9. 9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el metodo se utiliza para predecir la inmunidad.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que el metodo se utiliza para predecir la inmunidad a un autoantfgeno, antfgeno tumoral, antfgeno patogeno o una combinacion de los mismos.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 10, donde el antfgeno patogeno es un antfgeno bacteriano, antfgeno viral, antfgeno fungico, o una combinacion de los mismos.
12. 12. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, donde el sujeto es un receptor o un receptor candidato a un organo solido, medula osea, celulas madre, o una combinacion de los mismos.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, donde el organo es el hugado, el intestino, el rinon, el corazon, el pulmon, el pancreas, la piel o una combinacion de los mismos.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 12 o 13, donde el sujeto es un ser humano.
15. 15. El metodo de la reivindicacion 14, donde el sujeto es un nino.
16. 16. El metodo de la reivindicacion 1, para evaluar el rechazo de organos, comprende:

    poner en contacto una primera muestra compuesta por celulas presentadoras de antfgeno (APCs) obtenida de un sujeto que necesita o que ha recibido un trasplante de organos con un antfgeno donante de un donante en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno donante;

    poner en contacto una segunda muestra compuesta por APCs obtenida del sujeto que necesita o que ha recibido un trasplante de organos con un antfgeno tercero en condiciones suficientes para inducir la captacion del antfgeno tercero; y

    determinar un fndice presentador de antfgeno mediante la deteriminacion de una relacion de la captacion del 5 antfgeno donante en la primera muestra con la captacion del antfgeno tercero en la segunda muestra, donde una relacion superior a uno indica el rechazo de organos, donde las APCs son linfocitos B.
17. 17. El metodo de la reivindicacion 16, donde el organo es la medula osea o un organo solido.
18. 18. El metodo de la reivindicacion 17, donde el organo solido se selecciona del grupo compuesto por hfgado, intestino, rinon, corazon, pulmon, pancreas, piel y combinaciones de los mismos.

    10 19.El metodo de la reivindicacion 17, donde el sujeto es receptor de un organo.
19. 20. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde el metodo se utiliza para valorar la inmunosupresion en el sujeto.
20. 21. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde el metodo se utiliza para demostrar la eficacia de una terapia inmunosupresora.

    15 22. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde el metodo se utiliza para evaluar el grado de

    rechazo.
21. 23. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde el antfgeno donante o el antfgeno tercero incluye celulas del donante, un peptido antigenico, un peptido antigenico etiquetado con una etiqueta detectable, como un fluorocromo, un ligando metalico o una combinacion de los mismos.

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