ES2640587T3 - Composición mejorada de la perfusión en una zona de infarto - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento o reparación de una lesión en la zona de infarto en un sujeto revascularizado después de un infarto agudo de miocardio (IAM), donde la lesión de la zona de infarto comprende remodelado ventricular adverso, comprendiendo la composición: (a) una cantidad de mejora de la perfusión de la zona del infarto de un producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas aisladas estériles no expandidas, comprendiendo el producto una población enriquecida de al menos 10 x 106 células madre hematopoyéticas CD34+ autólogas aisladas que contienen una subpoblación de al menos 0,5 x 106 células CD34+/CXCR-4+ potentes que tienen actividad migratoria mediada por SDF-1/CXCR-4; (b) una cantidad estabilizante de suero a una concentración de al menos 10 % (v/v); y (c) opcionalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente compatible que estimula el crecimiento de cardiomiocitos; donde la población enriquecida de células CD34+ aisladas, cuando se pasa a través de un catéter y se analiza in vitro, comprende al menos 70 % de células CD34+; y donde la población enriquecida de células CD34+ aisladas, cuando se pasa a través de un catéter y se analiza in vitro: (1) retiene la actividad migratoria mediada por SDF-1/CXCR-4; (2) tiene una viabilidad de al menos un 70 %; y (3) es capaz de formar colonias hematopoyéticas in vitro durante al menos 24 horas después de la adquisición del sujeto de la población enriquecida de células CD34+; y donde la composición se administra al sujeto por vía parenteral a través de un catéter.

Description

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cuando se pasa a través de un catéter y se analiza in vitro:

(1) retiene la actividad migratoria mediada por SDF-1/CXCR-4;

5 (2) tiene una viabilidad de al menos un 70 %; y

(3) es capaz de formar colonias hematopoyéticas in vitro

durante al menos 24 horas después de la adquisición del sujeto de la población enriquecida de células CD34+; y donde la composición se administra al sujeto por vía parenteral a través de un catéter.

La composición farmacéutica puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente compatible que estimula el crecimiento de cardiomiocitos seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, un betabloqueante, un diurético, un agente antiarrítmico, un agente

15 antianginoso, un agonista del receptor tirosina quinasa, un agente vasoactivo, un agente anticoagulante, un agente fibrinolítico, un agente hipercolesterolémico, neuregulina 1, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, factor de crecimiento de la placenta ( PIGF), una catecolamina, por ejemplo norepinefrina, endotelina -1, una prostaglandina F2α, angiotensina II, un éster de forbol, neuropéptido Y, factor de crecimiento transformante activo β1 (TGF-1β), proteína Gq, diacilglicerol (DAG), salusina-α, salusina-β, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-I), miostatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), una tiazolidindiona, por ejemplo, rosiglitazona, y el inductor débil de apoptosis débil similar al factor de necrosis tumoral (TWEAK).

La población enriquecida de células madre hematopoyéticas CD34+ autólogas aisladas puede purificarse de los

25 componentes celulares de un aspirado de médula ósea adquirido del sujeto. La población enriquecida de células madre hematopoyéticas CD34+ autólogas aisladas puede purificarse a partir de sangre periférica.

La composición puede administrarse a través del catéter por vía intravascular a una arteria relacionada con el infarto. La composición puede administrarse a través del catéter dentro del miocardio.

La divulgación proporciona composiciones farmacéuticas para tratar una lesión de la zona del infarto y métodos de tratar o reparar la lesión de la zona del infarto en un sujeto revascularizado en el período posterior a un infarto agudo de miocardio resultante de un proceso de enfermedad natural administrando al sujeto por vía parenteral a través de un catéter una composición farmacéutica estéril que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un producto

35 de células madre hematopoyéticas quimiotácticas aisladas estériles no expandidas como primer agente terapéutico y, opcionalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segundo agente terapéutico compatible. La cantidad de mejora de la zona del infarto del producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas aisladas estériles comprende una población enriquecida de células CD34+ autólogas aisladas que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4, de tal manera que la población enriquecida de células madre hepatopoyéticas CD34+ autólogas aisladas proporciona al menos 0,5 x 106 células CD34+ potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4.

De acuerdo con un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar o reparar una lesión de la zona del

45 infarto en un sujeto revascularizado después de un infarto agudo de miocardio resultante de un proceso de enfermedad natural, comprendiendo el método las etapas: (a) administrar al sujeto por vía parenteral a través de un una composición farmacéutica estéril que comprende: (i) una cantidad de mejora de la perfusión de la zona del infarto de un producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas aisladas estériles no expandidas como primer agente terapéutico, donde la cantidad de mejora de la perfusión de la zona de infarto del producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas comprende una población enriquecida de células madre hematopoyéticas CD34+ autólogas aisladas que contienen una subpoblación de células CD34+ potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 de tal manera que la población enriquecida de células madre hematopoyéticas CD34+ autólogas aisladas proporciona al menos 0,5 x 106 células CD34+ potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4; (ii) una cantidad estabilizante de suero, donde la

55 cantidad estabilizante de suero es mayor que 20 % (v/v), y (iii) opcionalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segundo agente terapéutico compatible; y (b) mejorar la perfusión en al menos una zona de infarto, en relación con los controles, donde al menos el 70 % de las células en la población enriquecida de células CD34+ aisladas que contienen la subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad migratoria mediada por CXCR-4, cuando se pasan a través del catéter y cuando se prueban in vitro, son células CD34+, y donde la población enriquecida de células CD34+ aisladas que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 cuando se pasa a través el catéter y ensayado in vitro, (1) retiene la actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4; (2) tiene una viabilidad de al menos un 70 %; y (3) es capaz de formar colonias hematopoyéticas in vitro, durante al menos aproximadamente 24 horas después de la adquisición del sujeto de la población enriquecida de células CD34+ que contiene la subpoblación de

65 células potentes que expresan CXCR-4; y donde la etapa de administración (a) tiene lugar en una o más fechas de infusión y donde una primera fecha de infusión comprende un intervalo de tiempo específico definido por una

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra que la viabilidad funcional del producto de células hematopoyéticas quimiotácticas de la invención a las 72 horas es equivalente a la de 48 horas.

5 La Figura 2 muestra la eficacia migratoria del producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas formulado que comprende células CD34+ de la invención. La Figura 3 muestra la estabilidad mejorada de las células CD34+ formuladas en suero humano. La Figura 4(A) muestra el cambio en el tamaño del infarto como un porcentaje de la masa del LV en comparación con el producto (% de veces de la dosis de CD34+ de las células CD34+ móviles en un gradiente SDF). La Figura 4(B) muestra el cambio en el defecto de la perfusión (RTSS) frente al producto (% de veces de la dosis de CD34+ de las células CD34+ móviles en un gradiente SDF).

Descripción detallada

15 Tal como se define específicamente en las reivindicaciones adjuntas, la invención proporciona composiciones mejoradoras de la perfusión de una zona de infarto que comprenden un producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas aisladas estériles no expandidas para su uso en el tratamiento de una lesión en la zona de un infarto que comprende el remodelado ventricular adverso después de un infarto agudo de miocardio (IAM) resultante de un proceso de enfermedad natural en un sujeto revascularizado.

GLOSARIO

El término "factor transformante de crecimiento β1" (TGF-β1) se refiere a una proteína multifuncional que controla la proliferación, la diferenciación y otras funciones en muchos tipos de células. Muchas células sintetizan TGF-β1 y

25 tienen receptores específicos para ´él. Regula positiva y negativamente muchos otros factores de crecimiento y como potente estimulador de la formación de hueso osteoblástica, causando quimiotaxis, proliferación y diferenciación en los osteoblastos comprometidos, tiene un papel importante en el remodelado óseo (Schluter, K.D. y Piper, H.M. FASEB J. 13:S17-S-22 (1999)).

El término "administrar", tal como se utiliza en el presente documento, en sus diversas formas gramaticales, significa dar o aplicar. El término "administrar", tal como se utiliza en el presente documento, incluye la administración in vivo, así como la administración directa al tejido ex vivo. En general, las composiciones se pueden administrar sistémicamente de forma parenteral o tópica en formulaciones de unidad de dosificación que contienen transportadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales, según se desee,

35 o pueden administrarse localmente mediante medios tales como, pero sin limitaciones, inyección, implantación, injerto, aplicación tópica o parenteral. Un medio de administración de células puede incluir, pero sin limitaciones, infusión.

El término "resultado" tal como se usa en la presente memoria se refiere a una consecuencia o desenlace que resulta o sigue a un acontecimiento.

Tal como se usa en el presente documento, el término "angiogénesis" se refiere al proceso de formación y desarrollo de vasos sanguíneos.

45 El término "angiotensina II" se refiere a una hormona polipeptídica que se forma a partir de angiotensina I mediante la acción de la enzima convertidora de angiotensina (o ECA).

Las expresiones "apoptosis" o "muerte celular programada" se refieren a un proceso altamente regulado y activo que contribuye a la homeostasis biológica que comprende una serie de acontecimientos bioquímicos que conducen a diversos cambios morfológicos, incluyendo formación de burbujas, cambios en la membrana celular, tal como pérdida de asimetría y fijación de la membrana, retracción celular, fragmentación nuclear, condensación de la cromatina y fragmentación del ADN cromosómico, sin dañar al organismo.

La muerte celular apoptótica es inducida por muchos factores diferentes e implica numerosas vías de señalización,

55 algunas dependientes de las proteasas caspasas (una clase de cisteína proteasas) y otras que son caspasas independientes. Puede estar desencadenada por muchos estímulos celulares diferentes, incluyendo receptores de superficie celular, respuesta mitocondrial al estrés y células T citotóxicas, que dan como resultado la activación de las vías de señalización apoptóticas.

Las caspasas implicadas en la apoptosis transportan la señal apoptótica en una cascada proteolítica, con caspasas que escinden y activan otras caspasas que, a continuación, degradan otros objetivos celulares que conducen a la muerte celular. Las caspasas en el extremo superior de la cascada incluyen la caspasa-8 y la caspasa-9. La caspasa-8 es la caspasa inicial implicada en la respuesta a receptores con un dominio de muerte (DD) como Fas.

65 Los receptores en la familia de receptores del TNF están asociados a la inducción de la apoptosis, así como a la señalización inflamatoria. El receptor Fas (CD95) media la señalización apoptótica mediante el ligando de Fas que

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se expresa en la superficie de otras células. La interacción Fas-FasL desempeña un papel importante en el sistema inmunológico y la falta de este sistema conduce a la autoinmunidad, lo que indica que la apoptosis mediada por Fas elimina los linfocitos autorreactivos. La señalización de Fas también está implicada en la vigilancia inmunológica para eliminar las células transformadas y las células infectadas con virus. La unión de Fas al FasL oligimerizado en

5 otra célula activa la señalización apoptótica a través de un dominio citoplásmico denominado dominio de muerte (DD) que interacciona con los adaptadores de señalización, incluyendo FAF, FADD y DAX, para activar la cascada proteolítica de la caspasa. La caspasa-8 y la caspasa-10 primero se activan para, después, escindir y activar las caspasas aguas abajo y diversos sustratos celulares que conducen a la muerte celular.

Las mitocondrias participan en las vías de señalización apoptóticas a través de la liberación de proteínas mitocondriales en el citoplasma. El citocromo c, una proteína clave en el transporte de electrones, se libera de las mitocondrias en respuesta a las señales apoptóticas y activa la Apaf-1, una proteasa liberada por las mitocondrias. La Apaf-1 activada activa la caspasa-9 y el resto de la vía de la caspasa. Smac/DIABLO se libera de las mitocondrias e inhibe las proteínas IAP que normalmente interaccionan con la caspasa-9 para inhibir la apoptosis. La 15 regulación de la apoptosis por las proteínas de la familia Bcl-2 se produce cuando los miembros de la familia forman complejos que entran en la membrana mitocondrial, regulando la liberación del citocromo c y otras proteínas. Los receptores de la familia TNF que producen apoptosis activan directamente la cascada de las caspasas, pero también pueden activar la Bid, un miembro de la familia Bcl-2, que activa la apoptosis mediada por mitocondrias. Bax, otro miembro de la familia Bcl-2, es activado por esta vía para localizar la membrana mitocondrial y aumentar su permeabilidad, liberando el citocromo c y otras proteínas mitocondriales. Bcl-2 y Bcl-xL previenen la formación de poros, bloqueando la apoptosis. Al igual que el citocromo c, el AIF (factor inductor de la apoptosis) es una proteína que se encuentra en las mitocondrias que liberan las mitocondrias mediante estímulos apoptóticos. Mientras que el citocromo C está ligado a la señalización apoptótica dependiente de caspasa, la liberación de AIF estimula la apoptosis independiente de la caspasa, moviéndose hacia el núcleo donde se une al ADN. La unión del ADN por el

25 AIF estimula la condensación de la cromatina y la fragmentación del ADN, quizás mediante el reclutamiento de nucleasas.

La vía del estrés mitocondrial comienza con la liberación del citocromo c desde las mitocondrias, que, después, interacciona con la Apaf-1, causando la autoescisión y la activación de la caspasa-9. Las caspasas 3, 6 y 7 son caspasas aguas abajo que son activadas por las proteasas aguas arriba y actúan ellas mismas para escindir las dianas celulares.

La granzima B y las proteínas perforinas liberadas por células T citotóxicas inducen apoptosis en las células diana, formando poros transmembrana y desencadenando apoptosis, quizás a través de la escisión de las caspasas,

35 aunque se han sugerido mecanismos independientes de caspasa de la apoptosis mediada por la granzima B.

La fragmentación del genoma nuclear por múltiples nucleasas activadas por vías de señalización apoptóticas para crear una escalera nucleosómica es una respuesta celular característica de la apoptosis. Una nucleasa implicada en la apoptosis es el factor de fragmentación del ADN (DFF), una ADNasa activada por caspasa (CAD). El DFF/CAD se activa a través de la escisión de su inhibidor asociado ICAD por caspasas proteasas durante la apoptosis. DFF/CAD interacciona con componentes de la cromatina, tales como la topoisomerasa II y la histona HI, para condensar la estructura de la cromatina y tal vez reclutar CAD para la cromatina. Otra proteasa activada por apoptosis es la endonucleasa G (EndoG). La EndoG está codificada en el genoma nuclear pero se localiza en las mitocondrias de las células normales. La EndoG puede desempeñar un papel en la replicación del genoma mitocondrial, así como en

45 la apoptosis. La señalización apoptótica provoca la liberación de EndoG desde las mitocondrias. Las vías de EndoG y DFF/CAD son independientes, ya que la vía de la EndoG todavía se produce en células que carecen de DFF.

La hipoxia, así como la hipoxia seguida de la reoxigenación pueden desencadenar la liberación del citocromo c y la apoptosis. La glucógeno sintasa quinasa (GSK-3), una serina-treonina quinasa que expresa de forma ubicua en la mayoría de los tipos de células, parece mediar o potenciar la apoptosis debido a muchos estímulos que activan la vía de la muerte celular mitocondrial. Loberg, RD, et al., J. Biol. Chem. 277 (44): 41667-673 (2002). Se ha demostrado que induce la activación de la caspasa 3 y activa el gen supresor tumoral proapoptótico p53. También se ha sugerido que la GSK-3 estimula la activación y translocación del miembro de la familia Bap-2 proapoptótica, Bax, que, tras la agregación y la localización mitocondrial, induce la liberación del citocromo c. Akt es un regulador

55 crítico de la GSK-3 y la fosforilación y la inactivación de la GSK-3 puede mediar algunos de los efectos antiapoptóticos de Akt.

El término "biomarcador", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un indicador medido de forma objetiva del riesgo de enfermedad, los procesos patobiológicos subyacentes, el diagnóstico y la etapa de la enfermedad, el pronóstico, la respuesta al tratamiento, la recurrencia y los resultados clínicos. Un biomarcador puede tomar la forma de un gen, variaciones genéticas, proteínas de ARN y metabolitos. Los biomarcadores que reflejan de manera fiable o predicen la progresión o mejoría de una enfermedad pueden ayudar en el diagnóstico de la enfermedad y la evaluación de la gravedad de la enfermedad, el riesgo de aparición y la progresión.

65 El término "c-kit" se refiere a una proteína en la superficie de algunas células que se une al factor de células madre (una sustancia que hace que ciertos tipos de células crezcan). Las formas alteradas de este receptor pueden estar

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aproximadamente un tercio del hematocrito. "Hematocrito" (HCT) se refiere a la proporción de glóbulos rojos como un porcentaje de la volemia total. Un hematocrito normal para sujetos humanos es del 40 % al 55 % para varones y del 35 % a aproximadamente el 45 % para mujeres. "Recuento de glóbulos rojos" (RBC) se refiere al número total de glóbulos rojos en una cantidad de sangre. Los intervalos normales en sujetos humanos son aproximadamente 4,5

5 millones de células/mm3 a aproximadamente 6,0 millones de células/mm3 para varones y de aproximadamente 4,0 millones de células/mm3 a aproximadamente 5,5 millones de células/mm3 para mujeres. "Recuento de glóbulos blancos" (WBC) se refiere al número total de glóbulos blancos o leucocitos en una cantidad de sangre. Los intervalos normales en sujetos humanos son de aproximadamente 4,3 x 103 células/mm3 a aproximadamente 10,8 x 103 células/mm3.

El término "enfermedad" o "trastorno", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un deterioro de la salud o una afección de funcionamiento anormal. El término "síndrome", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un patrón de síntomas indicativos de alguna enfermedad o afección. El término "afección", tal como se usa en el presente documento, se refiere a diversos estados de salud y se pretende que incluya trastornos o

15 enfermedades causadas por cualquier mecanismo o trastorno subyacente, lesión y la estimulación de tejidos y órganos sanos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "inflamación" se refiere a una respuesta a la infección y a la lesión donde las células implicadas en la destoxificación y la reparación se movilizan al sitio comprometido por mediadores inflamatorios.

Independientemente del agente iniciador, los cambios fisiológicos que acompañan a la inflamación aguda abarcan cuatro características principales: (1) vasodilatación, que da como resultado un aumento neto del flujo sanguíneo, es una de las primeras respuestas físicas a la lesión tisular aguda; (2) en respuesta a estímulos inflamatorios, las

25 células endoteliales que recubren las vénulas se contraen, ensanchando las uniones intracelulares para producir huecos, lo que conduce a una mayor permeabilidad vascular, lo que permite la fuga de proteínas plasmáticas y células sanguíneas fuera de los vasos sanguíneos; (3) la inflamación se caracteriza a menudo por una fuerte infiltración de leucocitos en el sitio de la inflamación, particularmente neutrófilos (células polimorfonucleares). Estas células estimulan el daño tisular liberando sustancias tóxicas en la pared vascular o en tejidos no dañados; y (4) fiebre, producida por pirógenos liberados de leucocitos en respuesta a estímulos específicos.

Durante el proceso inflamatorio, los mediadores inflamatorios solubles de la respuesta inflamatoria trabajan junto con componentes celulares de una manera sistémica en un intento de contener y eliminar los agentes que causan el sufrimiento físico. Los términos "inflamatorio" o inmunoinflamatorio" tal como se usan en el presente documento con

35 respecto a mediadores, se refiere a los mediadores moleculares del proceso inflamatorio. Estas moléculas solubles y difundibles actúan tanto localmente en el sitio del daño tisular e infección como en sitios más distantes. Algunos mediadores inflamatorios son activados por el proceso inflamatorio, mientras que otros son sintetizados y/o liberados por fuentes celulares en respuesta a la inflamación aguda o por otros mediadores inflamatorios solubles. Ejemplos de mediadores inflamatorios de la respuesta inflamatoria incluyen, aunque no de forma limitativa, proteasas plasmáticas, complemento, cininas, proteínas coagulantes y fibrinolíticas, mediadores lipídicos, prostaglandinas, leucotrienos, factor de activación de las plaquetas (PAF), péptidos y aminas, incluyendo, pero sin limitaciones, histamina, serotonina y neuropéptidos, y citocinas proinflamatorias, incluyendo, pero sin limitaciones, interleucina -1, interleucina -4, interleucina -6, interleucina-S, Factor de necrosis tumoral (TNF), interferón-gamma e interleucina12.

45 El término "en fecha" se refiere al intervalo de tiempo entre la finalización de la adquisición por parte del sujeto de una preparación que comprende una población enriquecida de células CD34+ potentes en condiciones estériles y el inicio e la purificación en esterilidad de las células CD34+ potentes de la preparación. El término "fecha de salida" se refiere al intervalo de tiempo entre la finalización de la adquisición por parte del sujeto de una preparación que comprende una población enriquecida de células CD34+ potentes en condiciones estériles y la infusión de la composición farmacéutica formulada que comprende un producto de células hematopoyéticas quimiotácticas en el sujeto.

Los términos "infundir" o "infusión" tal como se utilizan en el presente documento se refieren a la introducción de un fluido distinto de la sangre en un vaso sanguíneo de un sujeto, incluyendo seres humanos, con fines terapéuticos.

55 La "solución de infusión" de la divulgación sin suero contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con 25 unidades/ml de heparina USP y 1 % de seroalbúmina humana (HSA). En algunas realizaciones, la solución de infusión se suplementa con suero. En algunas realizaciones, el suero es autólogo.

El término "lesión" se refiere al daño causado a la estructura o la función del cuerpo de un sujeto causado por un agente o fuerza, que puede ser físico o químico. El término "lesión vascular" se refiere a la lesión de la vasculatura (es decir, la red vascular, es decir, la red de vasos sanguíneos o conductos que transportan fluidos, tal como, sin limitaciones, sangre o linfa).

65 El término "límite" tal como se usa en el presente documento se refiere a restringir o limitar una extensión, grado o cantidad.

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miocardio en hibernación en al menos una zona periinfarto del tejido miocárdico, cuando se compara con los controles. En algunas realizaciones, la composición disminuye el área de infarto, cuando se compara con los controles. En algunas realizaciones, la composición disminuye la masa del infarto, cuando se compara con los controles.

5 De acuerdo con otra realización, la población enriquecida de células CD34+ aisladas que contiene una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tiene actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 se purifica de los componentes celulares de un aspirado de médula ósea adquirido del sujeto. De acuerdo con otra realización, la población enriquecida de células CD34+ aisladas que contiene una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tiene actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 se purifica a partir de sangre periférica. De acuerdo con una realización, la población enriquecida de células CD34+ que contiene una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 (a) es capaz de formar colonias hematopoyéticas in vitro y (b) retiene al menos 2 % de la actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4, durante al menos aproximadamente 48 horas después de la adquisición del sujeto de la población enriquecida de

15 células CD34+ que contiene la subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 en (a). De acuerdo con una realización, la población enriquecida de células CD34+ que contiene una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 (a) es capaz de formar colonias hematopoyéticas y (b) retiene al menos 2 % de la actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4, durante al menos aproximadamente 72 horas después de la adquisición del sujeto de la población enriquecida de células CD34+ que contiene la subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 en (a). De acuerdo con una realización, la población enriquecida de células CD34+que contiene una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tiene actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 retiene al menos 2 % de la actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 durante al menos 24 horas después de la adquisición del sujeto de la población enriquecida de células CD34+ que contiene la subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 en (a).

25 De acuerdo con una realización, el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas se prepara aislando o purificando la población enriquecida de células CD34+ aisladas que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 de la médula ósea cosechada del sujeto. De acuerdo con otra realización, el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas se prepara aislando o purificando la población enriquecida de células CD34+ aisladas que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 de sangre periférica.

De acuerdo con la invención y la divulgación descritas, el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas

35 enriquecido para células CD34+ contiene al menos aproximadamente 70 % de células CD34+ puras. En algunas realizaciones, el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas enriquecido para células CD34+ contiene al menos aproximadamente 75 % de células CD34+ puras. En algunas realizaciones, el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas enriquecido para células CD34+ contiene al menos aproximadamente 80 % de células CD34+ puras. En algunas realizaciones, el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas enriquecido para células CD34+ contiene al menos aproximadamente 85 % de células CD34+ puras. En algunas realizaciones, el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas enriquecido para células CD34+ contiene al menos aproximadamente 90 % de células CD34+ puras. En algunas realizaciones, el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas enriquecido para células CD34+ contiene al menos aproximadamente 95 % de células CD34+ puras.

45 En otra realización, al menos aproximadamente el 70 % de las células CD34+ son viables durante al menos aproximadamente 24 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En otra realización, al menos aproximadamente el 75 % de las células CD34+ son viables durante al menos aproximadamente 24 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En otra realización, al menos aproximadamente el 80 % de las células CD34+ son viables durante al menos 24 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En otra realización, al menos aproximadamente el 85 % de las células CD34+ son viables durante al menos 24 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 90 % de las células CD34+ son viables durante al menos 24 horas después de la adquisición de la población enriquecida de

55 células CD34+. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 95 % de las células CD34+ son viables durante al menos aproximadamente 24 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+.

En otra realización, al menos aproximadamente el 70 % de las células CD34+ son viables durante al menos aproximadamente 48 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En otra realización, al menos aproximadamente el 75 % de las células CD34+ son viables durante al menos aproximadamente 48 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En otra realización, al menos aproximadamente el 80 % de las células CD34+ son viables durante al menos 48 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En otra realización, al menos

65 aproximadamente el 85 % de las células CD34+ son viables durante al menos 48 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 90 % de las

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células CD34+ son viables durante al menos 48 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 95 % de las células CD34+ son viables durante al menos aproximadamente 48 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+.

5 En otra realización, al menos aproximadamente el 70 % de las células CD34+ son viables durante al menos aproximadamente 72 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En otra realización, al menos aproximadamente el 75 % de las células CD34+ son viables durante al menos aproximadamente 72 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En otra realización, al menos aproximadamente el 80 % de las células CD34+ son viables durante al menos 72 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En otra realización, al menos aproximadamente el 85 % de las células CD34+ son viables durante al menos 72 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 90 % de las células CD34+ son viables durante al menos 72 horas después de la adquisición de la población enriquecida de

15 células CD34+. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 95 % de las células CD34+ son viables durante al menos aproximadamente 72 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+.

En otra realización, las células CD34+ pueden formar colonias hematopoyéticas in vitro durante al menos aproximadamente 24 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En otra realización, las células CD34+ pueden formar colonias hematopoyéticas in vitro durante al menos aproximadamente 48 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+. En otra realización, las células CD34+ pueden formar colonias hematopoyéticas in vitro durante al menos aproximadamente 72 horas después de la adquisición de la población enriquecida de células CD34+.

25 De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende al menos aproximadamente 10 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 11 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 12 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra

35 realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 13 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 14 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 15 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos

45 aproximadamente 16 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 17 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 18 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 19 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células

55 potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 20 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 25 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 30 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4. De acuerdo con otra

65 realización, la composición mejoradora de la perfusión de la zona del infarto comprende además al menos aproximadamente 35 millones de células CD34+ adquiridas del sujeto y que contienen una subpoblación de células

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de la invención descrita es de aproximadamente el 1 % expresada como ml/100 cc de volumen de la composición. En algunas realizaciones, la albúmina es albúmina humana. En algunas realizaciones, la albúmina es albúmina humana recombinante.

5 Métodos de la divulgación

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para preparar una composición farmacéutica mejoradora de la perfusión de la zona del infarto que comprende un producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas para tratar a un sujeto que lo necesite. El método comprende las etapas de

(1)

adquirir una preparación que comprende una población enriquecida de células CD34+ potentes del sujeto en condiciones estériles mediante un proceso de adquisición de células quimiotácticas;

(2)

purificar en esterilidad las células CD34+ potentes que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 a partir de la preparación;

15 (3) formular en esterilidad las células CD34+ potentes para formar el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas;

(4)

formular en esterilidad el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas que contiene una subpoblación de células CD34+CXCR-4+ potentes que tienen actividad quimiotáctica para formar una composición farmacéutica;

(5)

evaluar la esterilidad de la composición farmacéutica;

(6)

liberar la composición farmacéutica estéril como elegible para la infusión en el sujeto;

(7)

cargar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica en un aparato de administración; y

(8)

transportar opcionalmente el aparato de administración que contiene la cantidad terapéuticamente eficaz de

25 la composición farmacéutica estéril que comprende el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas a una instalación de cateterismo cardíaco para infusión en el sujeto.

En una realización, la etapa (2) se inicia en un plazo de aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 24 horas de la finalización de la etapa de adquisición (1). En otra realización, la etapa de liberación (7) solo progresa si el producto celular formulado estéril ha de infundirse en el sujeto en un plazo de aproximadamente 48 horas a aproximadamente 72 horas desde la finalización de la etapa de adquisición (1). En otra realización, la etapa (2) se inicia en un plazo de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas de la finalización de la etapa de adquisición (1) y la etapa de liberación (6) solo progresa si el producto celular formulado estéril ha de infundirse en el sujeto en un plazo de aproximadamente 48 horas a aproximadamente 72 horas desde la finalización de la etapa de

35 adquisición (1).

En una realización, la etapa 5, es decir, la etapa de evaluar la esterilidad de la composición farmacéutica, comprende además las etapas de (i) centrifugar el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas que comprende células CD34+CXCR-4+ potentes para formar un sedimento celular y un sobrenadante, comprendiendo el sedimento celular las células CD34+CXCR-4+ potentes; (ii) eliminar en esterilidad el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular; y (iii) analizar si el sobrenadante está contaminado por un microbio determinando con ello la esterilidad del sedimento celular sin agotar su contenido celular.

En una realización, en la etapa (a), el proceso de adquisición de células quimiotácticas es una técnica de recogida

45 de médula ósea mini usada para adquirir una preparación que comprende una población enriquecida de células CD34+ potentes de la médula ósea del sujeto en condiciones estériles. Para la técnica de cosecha de médula ósea, la etapa (a) del método comprende además las etapas: (i) precargar jeringas de recolección con heparina antes de recoger médula ósea de un sujeto; (ii) aspirar la médula ósea de una cresta ilíaca posterior izquierda y una cresta ilíaca posterior derecha del sujeto usando las jeringas de recolección y una técnica de recogida de médula ósea mini para formar la médula ósea cosechada; e (iii) infundir la médula ósea cosechada en una bolsa colectora. En una realización, las jeringas de recolección en la etapa (i) y la bolsa colectora en la etapa (iii) contienen una solución heparinizada libre de conservante que comprende 0,9 % de solución salina normal. La concentración final de heparina en la solución salina heparinizada es de aproximadamente 20 unidades por ml a aproximadamente 25 unidades por ml.

55 Opcionalmente, en una realización del método, la médula ósea cosechada se transporta a una planta de procesamiento diferente de la instalación desde la cual se cosechó la médula ósea. En una realización, el método para transportar la médula ósea cosechada a la planta de procesamiento comprende las etapas (a) colocar la médula ósea cosechada en una bolsa colectora; (b) colocar la bolsa colectora en una bolsa secundaria; (c) colocar la bolsa secundaria que contiene la bolsa colectora en un recipiente para envío que comprende un compartimiento interior que contiene hielo húmedo congelado y al menos una hoja de papel de embalaje de burbujas; (d) fijar un monitor marcador de la temperatura al compartimento interior del recipiente para envío; (e) sellar el recipiente para envío; y (f) envío del recipiente para envío a la planta de procesamiento.

65 En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar o reparar una lesión de la zona de infarto en un sujeto revascularizado después de un infarto agudo de miocardio resultante de un proceso de enfermedad natural,

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Se aislaron las células CD34+ del producto de médula ósea cosechado. En una realización, las células CD34+ se aislaron usando el anticuerpo monoclonal anti-CD34 (Mab), IgG anti-ratón de oveja Dynabeads ® M-450 Sheep y componentes de agente liberador de células madre PR34+ (™) del sistema de selección celular magnético Isolex 300i (Baxter Healthcare Corp. Cat. No. 4R9734) como se describe en las patentes de Estados Unidos números

5 5.536.475, 5.035.994, 5.130.144, 4.965.204, 5.968.753, 6.017.719, 6.251.295, 5.980.887, 6.676.937, la solicitud publicada de Estados Unidos n.º 2003/0232050 y la ficha técnica 300i. Este sistema operativo se adaptó para el aislamiento de células CD34+ de la médula ósea de acuerdo con la invención descrita.

A su llegada al laboratorio de procesamiento, el producto cosechado de médula ósea (en la bolsa colectora) se inspeccionó inmediatamente y se comprobó que la bolsa no tuviera fugas. Lo recolectado debe ser fluido sin grumos aparentes y no debe estar hemolizado. Lo recolectado no se utilizó si la integridad de la bolsa estaba alterada de alguna manera.

El producto de médula ósea se procesó en un plazo de aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 24

15 horas desde la inspección. Se obtuvo un recipiente de embalaje para transferencia de 300 ml o 400 ml y se fijó un equipo de transferencia de plasma al puerto de obtención de muestras del recipiente. El producto de médula ósea se transfirió desde la bolsa colectora al recipiente de embalaje para transferencia. El producto de recogida de médula ósea agrupado se mezcló completamente invirtiendo el recipiente veinte (20) veces.

A continuación, se obtuvieron muestras del producto de médula ósea recolectado agrupada para su análisis. De acuerdo con una realización, se extrajo un volumen total de 2,0 ml del producto y se dividió en partes alícuotas de la siguiente manera: se usaron 0,3 ml para un ensayo duplicado de hemograma completo (CBC) utilizando un analizador de hematología; se dispensaron 0,2 m1 en un tubo de vidrio de 75x100 mm para la detección de bacterias grampositivas y gramnegativas mediante tinción de Gram (Kit de tinción de Gram, VWR, N.º de cat.

25 BB231401); como verificación de la esterilidad, se dispensaron 0,6 ml en un frasco con caldo de digerido de soja y caseína (TSB) (VWR, n.º de cat. 29446-184) para ensayo de crecimiento de bacterias aerobias, se dispensaron 0,6 ml en un frasco con medio fluido de tioglicolato (FTM, N.º de cat. 29446-138) para el ensayo de crecimiento de bacterias anaerobias y se usaron 0,3 ml en análisis de flujo para la enumeración de las células CD34+ y la viabilidad celular.

Se pesó lo recolectado en una balanza electrónica y se registró el peso de tara apropiado de la bolsa colectora. La relación entre el volumen del producto de médula ósea y el peso del producto se puede expresar como

Volumen (ml) = [Peso (g) del producto -Tara del peso de la bolsa (g)] ÷ 1,06 (g/ml) 35 (Fórmula 1)

El número de células nucleadas totales (TNC) en el producto de médula ósea se calculó usando el recuento de glóbulos blancos (WBC) obtenido del CBC de acuerdo con la siguiente relación:

TNC = WBC/μl x 1000 x volumen del producto (ml) (Fórmula 2)

El número de células CD34+ en el producto de médula ósea se calculó a partir de la siguiente relación:

45 Células CD34+ totales en el producto de médula ósea = Número de células CD34+/μl x 1.000 x volumen del producto (ml) (Fórmula 3)

El volumen de glóbulos rojos (RBC) del producto de recogida de médula ósea se calculó a partir de la siguiente relación:

Volumen de RBC (ml) = volumen del producto (ml) x Hematocrito (%)/100 (Fórmula 4),

Después de un cálculo inicial del volumen de glóbulos rojos, el producto de médula ósea se envasa y se centrifuga a 100 g durante 20 minutos a 20 ºC con el freno desactivado. Después de la centrifugación, el recipiente de la médula 55 ósea se retira cuidadosamente de la centrífuga y se cuelga dentro de un armario de seguridad biológica Clase 100 con los puertos de obtención de muestras hacia abajo. Un equipo de transferencia de plasma se coloca cuidadosamente en el puerto de obtención de muestras central de la bolsa y se extrae la fracción de RBC con una jeringa. Este procedimiento se repite con jeringas frescas adicionales hasta que los RBC restantes se eliminan de la MMH. La MMH se prepara a partir de un procedimiento de lavado, que comienza por centrifugación a 1.000 g durante diez (10) minutos a 20 ºC con el freno "desactivado" seguido de prensado de plasma, todo ello en preparación para un lavado en una solución tampón de lavado basado en PBS [HSA al 1 % y citrato sódico al 0,41 % (p/v) en PBS (sin Ca++ y Mg++)] preparado anteriormente en el proceso. Después de la adición del tampón de lavado, las células se centrifugan de nuevo a 1.000 g durante diez (10) minutos a 20 ºC con el freno en la posición "desactivado". Después de esta centrifugación (final), las células se expresan usando una prensa de plasma, se 65 extrae el sobrenadante y se transfieren 150 ml de solución de lavado de PBS a la bolsa de producto usando una jeringa de 60 ml. Las células concentradas se resuspenden mediante masaje manual. Después de este

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Tabla 14: Experiencia del producto clínico: Migración de células CD34+ mediada por SDF-1/CXCR-4 (% de células CD34+ migrantes en función del tiempo después de la MMH).

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5 * = (Y ÷ X) x 100% Todas las relaciones restantes se calcularon como en la Tabla 8 anterior. Tabla 15: Experiencia del producto clínico: Número de UFC por 100 células CD34+ viables sembradas en placas en 10 función del tiempo después de la MMH.

Tiempo (h) despuésde la MMH

N.º de UFC por 100 células CD34+ viables sembradas en placas

A

B C D Promedio (SD)

12.

98,14 33,30 24,00 22,50 44,49 (36,09)

33

- 16,50 - - 16,5

48

- 19,56 20,50 - 20,03 (0,66)

72

- 20,45 21,19 - 20,82 (1,10)

Según estos datos, la extensión de la entrada a 24 horas (desde 12 horas) y la salida a 72 horas (desde 48 horas) para el producto clínico de células CD34+ de la invención descrita está justificada.

15 La Figura 1 indica la equivalencia de la viabilidad funcional del producto de células hematopoyéticas quimiotácticas de la invención descrita a 72 horas con los mismos índices evaluados a 48 horas.

Estudio 3: Seguridad del catéter.

20 La viabilidad y la eficacia potencial del producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas de la invención descrita que comprende células CD34+depende de las células que mantienen su potencia a medida que pasan a través de un catéter. El catéter utilizado en los métodos de la invención descrita tiene un diámetro interno de al menos 0,36 mm. Cualquier tipo de catéter que tenga un diámetro interno de al menos 0,36 mm puede ser eficaz

25 para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención descrita.

En una realización, el catéter es un catéter con balón. Se llevaron a cabo estudios de seguridad del catéter con balón para determinar si las concentraciones altas de células y las perfusiones repetidas afectan negativamente a la viabilidad celular, a la recuperación celular o a la integridad del catéter. Se utilizaron progenitores de sangre

30 periférica no movilizados para obtener un número adecuado de células para realizar el análisis. Se evaluaron los catéteres para la infusión del producto celular de la invención descrita que comprende células CD34+ a través de la IRA. Ninguno de los catéteres de 0,36 mm de diámetro interno analizados afectó negativamente a la viabilidad celular seleccionada de CD34+, el crecimiento en cultivo o la movilidad en ensayos de CXCR-4.

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Estudio 5: Pruebas de esterilidad del producto final

Debido al rendimiento limitado de células CD34+ obtenidas a partir de 300 ml MMH, se evalúa la esterilidad final del producto celular utilizando el sobrenadante eliminado de la formulación del producto final con el fin de preservar el 5 producto celular para infusión. Las muestras de sobrenadantes se cargan en las jeringas de una manera idéntica a la utilizada para cargar el producto celular en las jeringas usadas para infusión (véase anteriormente).

Para demostrar que tal muestra es representativa de la formulación de producto celular final, se inocularon células CD34+ seleccionadas en solución de infusión antes de la centrifugación del producto final con C. sporogenes (13

10 UFC/ml), P. aeruginosa (2 UFC/ml), S. aureus (18 UFC/ml), A. niger (17 UFC/ml), C. albicans (3 UFC/ml) y B. subtilis (17 UFC/ml) (véase la Tabla 23). Después de la centrifugación, se evaluó la esterilidad de las fracciones de sedimento celular y de sobrenadante no celular utilizando ensayos aeróbicos y anaerobios según la USP.

Tabla 23: Bacterias y hongos utilizados para el estudio de la esterilidad. Cada vial de microorganismo de origen 15 preparado por entornos microbiológicos contenía 400 microbios por ml, pero el número de UFC derivadas de cada especie es variado.

Microbio

N.º total de microbios/ml UFC totales/ml UFC esperadas/ ml de muestrainoculada (21 ml)

C. sporogenes

400 279 13

P. aeruginosa

400 36 2

S. aureus

400 371 18

A. niger

400 356 17

C. albicans

400 62 3

B. subtilis

400 349 17

Como se muestra en la Tabla 24, tanto la fracción de sedimento celular como las fracciones de suspensión de todas

20 las muestras analizadas mostraron sobrecrecimiento de los microorganismos inoculados, mientras que los controles no inoculados no mostraron crecimiento. Adicionalmente, no se observó ninguna tasa de crecimiento diferencial aparente entre la prueba de las fracciones de sedimento celular y las fracciones de suspensión para todos los microorganismos analizados. Las muestras tomadas antes de cada etapa del procedimiento de procesamiento y después de la perfusión final a través de los catéteres resultaron todas negativas para la contaminación microbiana.

25 Tabla 24: Ensayo de esterilidad de 14 días de muestras de células nucleadas (NC) inoculadas con especies específicas de microorganismos (400 microbios en una muestra de NC de 21 ml).

Muestra con microbio inoculado

Tipo de medio Fracción de la muestra Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3

C. sporogenes

FTMa Sedimento celular Positivo Positivo Positivo

Suspensión

Positivo Positivo Positivo

S. aureus

FTM Sedimento celular Positivo Positivo Positivo

Suspensión

Positivo Positivo Positivo

P. aeruginosa

FTM Sedimento celular Positivo Positivo Positivo

Suspensión

Positivo Positivo Positivo

A. niger

TSBb Sedimento celular Positivo Positivo Positivo

Suspensión

Positivo Positivo Positivo

C. albicans

TSB Sedimento celular Positivo Positivo Positivo

Suspensión

Positivo Positivo Positivo

B. subtilis

TSB Sedimento celular Positivo Positivo Positivo

Suspensión

Positivo Positivo Positivo

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Muestra con microbio inoculado

Tipo de medio Fracción de la muestra Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3

Control positivo: C. sporogenes

FTM Suspensión celular Positivo

Control positivo: S. aureus

FTM Positivo

Control positivo: P. aeruginosa

FTM Positivo

Control positivo: A. niger

TSB Positivo

Control positivo: C. albicans

TSB Positivo

Control positivo: B. subtilis

TSB Positivo

Control negativo: Sin microbios

FTM Suspensión celular Negativo

Control negativo: Sin microbios

TSB Negativo

a Medio de tioglicolato fluidob Caldo de digerido de soja y caseína

Resumen del estudio preclínico

De manera colectiva, estos datos preclínicos indican que los procedimientos de fabricación y ensayo descritos son

5 capaces de generar un número adecuado de células viables con una estabilidad adecuada para soportar el envío y la perfusión a través del catéter de una manera que no plantee preocupaciones de seguridad adicionales al sujeto distintas de las asociadas con el uso rutinario de infusión de fluidos a través del catéter de balón.

Ejemplo 11. Datos de eficacia de la fase 1

10 Los siguientes datos de eficacia de fase I muestran que dentro de ≥ 10 x 106células CD34+ aisladas, existen suficientes células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 para producir un efecto biológico (paracrino y neoangiogénico), que evita la muerte de células cardiomiocíticas y cambios posteriores consistentes con remodelado ventricular.

15 De acuerdo con la divulgación en el Ejemplo 1, un total de 31 sujetos otorgaron su consentimiento, fueron elegibles y se les reclutó para el estudio. Los 31 pacientes inscritos en el estudio de fase I fueron asignados aleatoriamente a un grupo de tratamiento con recolección de células madre autólogas o a un grupo control cinco días después de un infarto de miocardio con elevación de ST (STEMI) caracterizado por un período prolongado de hipoperfusión (es

20 decir, bloqueo del riego sanguíneo). De los 31 sujetos inscritos, 16 estaban en el grupo de tratamiento y 15 en el grupo de control. El primer sujeto en cada centro fue asignado al azar al grupo de tratamiento o control, y se inscribió a cada paciente posterior a grupos de tratamiento o control alternados. Si se asignó al sujeto a tratamiento, continuaron a la fase de tratamiento siempre y cuando siguieran cumpliendo todos los criterios de inclusión/exclusión. Los sujetos asignados al grupo control pasaron a la fase de seguimiento. No hubo diferencias

25 significativas entre los grupos en ninguna de las características demográficas o clínicas basales. Los pacientes incluidos tenían de 34 a 71 años de edad, el 87 % eran varones, el 77 % de raza blanca, el 61 % pertenecía a la clase II o III de NYHA y el 49 % a la clase I de NYHA, el 74 % experimentó una arteria coronaria descendente anterior izquierda infartada y el 55 % recibió una endoprótesis vascular liberadora de fármaco. Las FEVI obtenidas en la ecocardiografía de detección variaron entre el 25 % y el 50 %.

30 Las células CD34+ se aislaron de la médula ósea mediante el procedimiento de recolección de médula ósea mini como se describe en el Ejemplo 3 en un plazo de 5-8 días después del reemplazo de la endoprótesis vascular. A continuación, la médula cosechada se envió a la planta de procesamiento de células cGMP como se describe en el Ejemplo 4 y se aisló como se describe en el Ejemplo 5.

35 Como se había planeado originalmente, y como se describe en el Ejemplo 8, en el estudio debía haber cuatro cohortes de dosificación (5 millones, 10 millones, 15 millones y 20 millones de células CD34+). Sin embargo, no se

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pudieron obtener más de 15 millones de células después de la selección de CD34+ de manera fiable. Por lo tanto, la inclusión terminó al final de la cohorte 3, siendo 15 x 106 la dosis celular más alta evaluada.

Tras la liberación del producto celular y la asignación de la cohorte, el producto de células CD34+ se envió al centro de cateterismo para su infusión directa en la arteria relacionada con el infarto. La infusión del tratamiento se produjo 6-9 días después del reemplazo de la endoprótesis vascular (y en un plazo de 48 horas de la recolección de la médula ósea mini). Únicamente se llevó a los sujetos al laboratorio de cateterismo después de que el producto de células CD34+ había llegado a la planta y habían recibido liberación final para infusión.

Las cohortes de dosificación consistieron en 5 sujetos en las cohortes 1 y 2, 6 sujetos en la cohorte 3 y 15 sujetos control. Para la cohorte 1, el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas de la invención comprendía 5 x 106 células madre hematopoyéticas CD34+ aisladas que contenían una subpoblación de al menos 0,5 x 106 células CD34+ potentes que expresan CXCR -4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 [representada como "5 M"}. Para la cohorte 2, el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas de la invención comprendía 10 x 106 células madre hematopoyéticas CD34+ aisladas que contenían una subpoblación de al menos 0,5 x 106 células CD34+ potentes que expresan CXCR -4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 [representada como "10 M"]. Para la cohorte 3, el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas de la invención comprendía 15 x 106 células madre hematopoyéticas CD34+ aisladas que contenían una subpoblación de al menos 0,5 x 106 células CD34+ potentes que expresan CXCR -4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 [representada como "15 M"}. No se esperaba que los sujetos control (es decir, aquellos que no recibían infusión de células CD34+) tuvieran mejoras significativas en la función cardíaca (fracción de expulsión, volúmenes telesistólicos y telediastólicos, índice de puntuación del movimiento de la pared ventricular)

o perfusión de la región infartada a los 6 meses de seguimiento.

La subpoblación de células potentes que (i) expresan CXCR-4 y (ii) tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4, expresaron VEGFR-2 a niveles muy bajos (media 0,84 %, intervalo 0 a 2,39 %). Debido a que la subpoblación de células potentes CD34+ coexpresa CXCR-4, {coexpresión de CXCR-4; media 60,63 %, mediana 52 %, intervalo 31-98 % de las células CD34+, capaces de migrar en un gradiente de SDF-1} mientras que menos del 2,5 % de las células CD34+ coexpresa VEGFR-2, funcionalmente, estas células son VEGFR-2-, es decir, VEGFR-2 no es lo que dirige las células a la zona periinfarto.

Se administró a cada sujeto de las cohortes 1, 2 y 3 una composición farmacéutica estéril de la invención descrita por vía parenteral mediante infusión a través de la arteria relacionada con el infarto mediante un catéter de siete a once días después del STEMI como se describe en el Ejemplo 9. La composición farmacéutica estéril comprendía:

(a) una cantidad terapéuticamente eficaz de un producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas estériles, comprendiendo el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas una población enriquecida de células CD34+ aisladas que contienen una subpoblación de células potentes que expresan CXCR-4 y que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4; que, cuando se pasan a través del catéter, siguen siendo potentes, y (b) una cantidad estabilizante de suero.

El seguimiento de la función cardíaca se realizó a los 3 y 6 meses después de la infusión. La perfusión de la región del infarto cardíaco se evaluó a los 6 meses después de la infusión. Tanto la perfusión como las pruebas de seguimiento funcionales fueron evaluadas por un laboratorio central enmascarado para el estado de tratamiento del estudio de cada sujeto. Se realizó una comparación de estos resultados con los índices basales. Las visitas de seguimiento a largo plazo se realizan a los 12 meses y la entrevista telefónica con los sujetos se realizará anualmente los años 2 a 5. En los ecocardiogramas de la visita de seguimiento de 12 meses, algunos de los sujetos presentaron anomalías segmentarias del movimiento de la pared, algo no infrecuente en esta población de pacientes y ninguno de los sujetos presentó derrames pleurales clínicamente significativos. Ninguno de los ecocardiogramas de seguimiento de 12 meses produjo un acontecimiento adverso grave. Para los sujetos que completaron la llamada telefónica de seguimiento de dos años, no se notificaron acontecimientos adversos graves y, por tanto, no se detectaron acontecimientos de seguridad a largo plazo en este momento.

Se evaluaron las medidas de funcionamiento cardíaco, puntuación de la gravedad total en reposo (RTSS), el porcentaje de infarto ("% de infarto"), el volumen telesistólico (VTS) y la fracción de expulsión ("FE") a los 3 meses del tratamiento y a los 6 meses después del tratamiento y en comparación con los controles para evaluar la eficacia de las composiciones en comparación con los controles.

EXPLORACIÓN SPECT. Tal como se usa en el presente documento, una exploración de tomografía computarizada de emisión de un solo fotón (SPECT) es un tipo de prueba de imagen nuclear, que utiliza una sustancia radiactiva y una cámara especial para crear imágenes tridimensionales del corazón para mostrar flujos de sangre al corazón. En general, la "puntuación de gravedad toral en reposo (RTSS) es una puntuación basada en la cantidad de tecnecio que no es captada en una EXPLORACIÓN SPECT. Los datos de la puntuación de gravedad toral en reposo representan la perfusión cardíaca, es decir, el flujo sanguíneo a nivel microvascular y la función del músculo. En resumen, el tecnecio utilizado en una EXPLORACIÓN SPECT es absorbido por el músculo cardíaco sano y perfundido. Por tanto, si el músculo cardíaco está sano y hay un flujo sanguíneo adecuado, el músculo absorberá el tecnecio. Si el músculo cardíaco está hibernando o es apoptótico, la absorción de tecnecio está disminuida o no se

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efecto umbral de la dosis a los 6 meses en comparación con el valor basal, se observó una tendencia en la mejora de la FEVI entre los pacientes que recibieron ≥ 10 millones de células CD34+ en comparación con los controles, los pacientes que recibieron 5 millones e células CD34+ y los grupos de control y de tratamiento con 5 millones combinados. El tamaño más grande del infarto después del implante de la endoprótesis vascular, en particular si 5 está asociado con un defecto de perfusión más extenso, da como resultado una mayor probabilidad de remodelado ventricular adverso que se manifiesta en una disminución de la FEVI y un aumento del VTSVI con el tiempo. En el estudio descrito, en el momento basal, los pacientes que recibieron ≥ 10 millones de células CD34+ tenían un mayor tamaño de infarto y mayor RTSS. Sin embargo, a pesar de ello, se observó una mayor reducción de la RTSS y una mejora (tendencia) en la FEVI en estos pacientes. Además, entre los pacientes de los grupos de tratamiento con 5 10 millones y control combinados, la FEVI media no mejoró a los 3 meses o a los 6 meses, y el VTSI aumentó de forma constante con respecto al valor basal, en consonancia con el remodelado ventricular adverso. Sorprendentemente, entre los pacientes que recibieron ≥ 10 millones de células CD34+, a pesar de comenzar con infartos y defectos de perfusión mayores, la FEVI mejoró a los 3 meses y, en mayor medid, a los 6 meses, mientras que el VTSVI mejoró de los 3 meses a los 6 meses después de empeorar durante los tres primeros meses, lo que en conjunto sugiere un

15 efecto terapéutico continuo.

Como se muestra en la Tabla 26, en la cohorte de 10 y 15 millones, ninguno de los pacientes presentó una disminución de la FEVI superior al 1 % (es decir, ninguno tuvo una disminución clínicamente relevante de la FEVI), frente al 30 % de los controles y el 40 % del grupo tratado con 5 millones (intervalo 2,9 a -17,4 %). Esto es

20 consistente con la conclusión de que el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas de la invención puede prevenir el remodelado ventricular (manifestado clínicamente en una disminución de la FEVI a los 6 meses).

Tabla 26. Cambio a 6 meses en la RTSS y la FEVI.

Paciente

Cambio en la RTSS a 6 meses Cambio en la FEVI a 6 meses

Cohorte 1

1

-71 18,2 %

2

164 5,2 %

3

46 1,6 %

4

-322 -12,7 %

5

222 -12,4 %

Cohorte 2

1

-859

2

-97 7,7 %

3

-427 6,0 %

4

-294 11,4 %

5

-137 1,8 %

Cohorte 3

1

2

263 0,8 %

3

-274

4

-287

5

-190 -0,4 %

Control

1

-210 -2,98 %

2

-99 4,60 %

3

342 2,12 %

4

0

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congelación se coloca horizontalmente dentro de un congelador mecánico de -86 ºC. El producto de MMH puede almacenarse en el congelador mecánico a -86 C para almacenamiento de corto plazo hasta seis (6) meses. Para almacenamiento a largo plazo, el (los) casete (s) se retiran del congelador mecánico de -86 ºC y se colocan en el congelador de nitrógeno líquido (LNF) para almacenamiento en la fase de vapor de nitrógeno líquido junto con la(s)

5 muestra(s) del producto de MMH para análisis.

Las muestras tanto de control (sin congelar) como crioconservadas (después de descongelar) se procesarán Isolex esencialmente como se describe en el Ejemplo 5 anterior. Las muestras en dos jeringas de 10 ml se prepararán a partir de las células CD34+ seleccionadas. La caracterización completa del producto se realizará en los siguientes 10 puntos temporales: ((i) Después de la perfusión del producto a través de un catéter 48 horas después de la MMH; y

(ii) después de la perfusión del producto a través de un catéter 72 horas después de la MMH. Para las muestras crioconservadas, el término "72 horas de recolección", por ejemplo, significa el tiempo desde la recolección hasta el momento de la prueba, excluyendo el tiempo transcurrido desde la congelación y el crioalmacenamiento de la médula ósea empobrecida en glóbulos rojos.

15 Los determinantes clave para la calidad de las células CD34+ del producto de células madre hematopoyéticas incluyen: (i) enumeración de células CD34+ y viabilidad con 7-AAD; (ii) actividad migratoria de las células CD34+ mediada por SDF-1/CXCR-4; (iii) expresión del antígeno de superficie celular CXCR-4 en células CD34+; y (iv) crecimiento de colonias de células progenitoras hematopoyéticas (UFC). Este experimento se repetirá tres veces.

20

Resumen de los resultados

El estudio se realizó de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. Todas las desviaciones de la metodología y los materiales utilizados se detallan en las secciones de resultados relacionadas que se presentan a continuación. 25 La Tabla 27 resume la información relevante sobre los donantes de la médula ósea utilizada en este estudio.

Tabla 27: Edad y sexo de los donantes de médula ósea para el estudio de crioconservación.

Exp. 1

Exp. 2 Exp. 3

Donante

1 2 3 4 5 6

Edad

26 26 22 62 32 24

Sexo

F F F F F F

30 La tabla 28 resume el volumen de la muestra, el contenido de RBC y el rendimiento, la viabilidad y la pureza de las células en la MMH preprocesada después de almacenar durante 24 horas en un refrigerador de 2-8 ºC.

Tabla 28: Almacenamiento de 24 horas a 2-8 ºC, volumen rendimiento celular y calidad de la MMH. 35

Exp. 1

Exp. 2 Exp. 3

Donante 1

Donante 2 Donante 3 Donante 4 Donante 5 Donante 6

Volumen (ml)

117 64 106 105 103 113

WBC por μl#

1,39E+04 1,26E+04 1,39E+04 1,44E+04 1,94E+04 2,45E+04

TNC#

1,62E+09 8,03E+08 1,47E+09 1,51E+09 1,99E+09 2,76E+09

HCT#

33,85 % 33,40 % 29,10 % 27,85 % 31,60 % 32,60 %

Vol. de RBC (ml)#

39,44 21,38 30,85 29,24 32,55 36,84

Viabilidad de las células CD45+*

91,13 % 91,72 % 90,58 % 93,17 % 94,11 % 95,8 %

Células CD34+ viables por μl*

149,18 148,38 140,89 114,45 150,80 203,76

Viabilidad de las células CD34+*

94,14 % 98,90 % 98,35 % 97,24 % 98,89 % 98,78 %

Pureza de células CD34+*

1,44 % 1,32 % 1,23 % 0,97 % 1,21 % 0,88 %

Células CD34+ que expresan CXCR4~

77,68 % 77,03 % 71,88 % 64,57 % 75,75 % 68,36 %

N.º total de células CD34+*

1,74E+07 9,50E+06 1,49E+07 1,20E+07 1,55E+07 2,30E+07

72

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Exp.

Fuente de MMH de la muestras de AMR001 Hora de la perfusión(Horas de MMH) Fabricación Longitud del balón/día. N.º de catálogo N.º de lote Comentarios

72 h

Sprinter 12/4,0 mm SPR4012W 254243 Obsoleto

Congelada

48 h Sprinter 15/3,0 mm SPR3015W 412090 Obsoleto

72 h

Voyager 15/3,0 mm 1009443-15 8111462 -

2

Sin congelar 48 h Sprinter 15/3,5 mm SPR3515W 443152 Obsoleto

72 h

Sprinter 15/3,5 mm SPR3515W 443152 Obsoleto

Congelada

48 h Voyager 15/3,0 mm 1009443-15 8111462 -

72 h

Voyager 15/3,0 mm 1009443-15 8092561 -

3

Sin congelar 48 h Voyager 15/3,0 mm 1009443-15 8111462 Reutilizado*

72 h

Sprinter 15/3,0 mm SPR3015W 476734 Obsoleto

Congelada

48 h Sprinter 15/3,0 mm SPR3015W 476734 Obsoleto

72 h

Sprinter 15/3,0 mm SPR3015W 476734 Obsoleto

* Antes de usar la 2ª vez, el catéter y la luz central se lavaron primero y se aclararon con alcohol isopropílico al 70 % y, después, con PBS estéril. La luz central se inyectó luego con aire para eliminar el líquido residual en el interior. El procedimiento de lavado se realizó dentro de un armario de seguridad biológica.

Discusión

El objetivo de este estudio fue evaluar la calidad del AMR-001 fabricado a partir de MMH criopreservada.

5 La recuperación de células CD34+ después de Isolex del AMR-001 fabricado a partir de MMH sin congelar (muestras de control) fue, en promedio, de 34,6 ± 4,35 % (intervalo 30,3 % a 39 %) que está dentro del intervalo de aceptación para la fabricación de AMR-001 para uso clínico. Debe observarse que los datos presentados anteriormente se estiman sin tener en cuenta las células eliminadas para las pruebas en proceso, por lo tanto, la recuperación de

10 células CD34+ real será ligeramente superior a la presentada.

La recuperación de células CD34+ después del catéter fue de 100,52 ± 4,39 % (95,65 % a 104,17 %) a 48 horas después de la MMH y 94,50 ± 6,67 % (89,20 % a 101,99 %) 72 horas después de la MMH. No hubo una reducción sustancial de la viabilidad (Tabla 32), la expresión de CXCR-4 (Tabla 33), la actividad migratoria (Tabla 34) y el

15 crecimiento de UFC (Tabla 35) de células CD34+ 72 horas después de la MMH en comparación con las monitorizadas a las 48 horas después de la MMH.

Para el ensayo de crioconservación, las muestras de MMH reducidas en RBC se crioconservaron de acuerdo con el protocolo para crioconservación de médula ósea para trasplante, donde las muestras de MMH se mezclaron con un

20 volumen igual de crioprotector con una concentración final de DMSO al 5 %, 2,5 % HSA y 2,1 % de Hetastarch (de la fuente de líquido, 6 % de Hetastarch, Hospira) se congelaron a -86 °C y, a continuación, se crioalmacenaron en la fase de vapor de un congelador de nitrógeno líquido (LNF).

Después de la crioconservación y descongelación, se mantiene la estabilidad, la viabilidad, la movilidad y el

25 crecimiento en cultivo de las células CD34+ seleccionadas con Isolex. Por tanto, las células congeladasdescongeladas cumplen los criterios de uso clínico. En algunas realizaciones, una segunda alícuota comprende el producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas congeladas. En algunas realizaciones, la alícuota se descongelará 30 días después de la primera fecha de infusión y se retirarán muestras del producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas descongeladas para su análisis para el recuento de WBC, mediante citometría de

30 flujo (para la enumeración de y viabilidad de las células CD34+), tinción de Gram y esterilidad. El producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas descongeladas se liberará para infusión 1 a 2 días después de la descongelación solo si cumple los siguientes criterios:

• pureza de células CD34+ de al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %; 35 • un resultado negativo en la tinción de Gram para la fracción positiva seleccionada;

•

niveles de endotoxina: menos de aproximadamente 0,5 unidades de endotoxina/ml;

•

el rendimiento de células CD34+ viables del "producto de células madre hematopoyéticas quimiotácticas" cumplió la dosificación requerida según la cohorte de tratamiento;

•

las células CD34+ tuvieron al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de viabilidad

76

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Claims (1)

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