ES2639224T3

ES2639224T3 - Células y procedimiento para la producción de acetona

Info

Publication number: ES2639224T3
Application number: ES10704577.5T
Authority: ES
Inventors: Ulrich Becker; Gerda Grund; Matthias Orschel; Kai Doderer; Gerd LÖHDEN; Gerd Brand; Peter DÜRRE; Simone Thum; Hubert Johannes Bahl; Ralf-Jörg FISCHER; Antje May
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2009-04-23
Filing date: 2010-02-23
Publication date: 2017-10-25
Anticipated expiration: 2030-02-23
Also published as: BRPI1013430A2; EP2421960A1; DE102009002583A1; US9453210B2; AU2010241185B2; AU2010241185A1; JP2012524529A; EP2421960B1; WO2010121849A1; CN102414314A; JP5805073B2; US20120101304A1

Abstract

Un procedimiento para la producción de acetona, que comprende los pasos de procedimiento: A) puesta en contacto de una célula acetógena, que es capaz de formar acetona, con un medio nutriente que contiene al menos una fuente de carbono seleccionada a partir del grupo que comprende dióxido de carbono y monóxido de carbono; B) cultivo de la célula bajo condiciones que posibiliten formar acetona a la célula; C) en caso dado aislamiento de la acetona formada, caracterizado por que la célula presenta una actividad acrecentada en comparación con su tipo salvaje de al menos uno de los siguientes enzimas mediante sobreexpresión: de un enzima E1, que cataliza la reacción de acetil-coenzima A para dar acetoacetil-coenzima A; de un enzima E2, que cataliza la reacción de acetoacetil-coenzima A para dar acetoacetato; de un enzima E3, que cataliza la reacción de acetoacetato para dar acetona, y por que la célula procedente de al menos una fuente de carbono seleccionada a partir del grupo que contiene dióxido de carbono y monóxido de carbono es capaz de formar acetona.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

5

10

15

20

25

30

células mediante cromatografía de gases. En este caso se mostró que, con la combinación de genes clostridianos (thlA y adc) con atoDA de E. coli se produjeron hasta 80 mM de acetona. Con genes puramente clostridianos (thlA, ctfAB, adc) se produjeron 5 mM de acetona y con las combinaciones genes clostridianos (thlA y adc) con teII de B. subtilis, o bien ybgC de H. influenzae se produjo 1 mM de acetona.

Ejemplo 3: producción de acetona acetógena

Según cepa de clostridio empleada se emplearon diferentes medios:

Para la producción de los medios para C. Carboxidivorans, o bien C. ljungdhalii se pesaron los productos químicos, se disolvieron en agua y a continuación se ajustó el valor de pH. Adicionalmente se añadió el indicador redox resazurina (1 mg/l), para poder examinar finalmente el potencial redox, y por consiguiente el contenido en oxígeno. A continuación se llevaron los medios a ebullición en una estufa y se enfriaron los mismos en baño de hielo. Entre tanto se efectuó la gasificación con nitrógeno para eliminar el oxígeno disuelto. A continuación se introdujeron los medios en la cámara anaerobia, se ajustó el volumen final con agua anaerobia, se envasó y se cerró herméticamente. Si hubo que emplear una fase gaseosa diferente a nitrógeno, a continuación se efectuó un intercambio de gas, gasificándose el medio con el correspondiente gas por medio de una cánula larga, y aplicándose en último término una ligera sobrepresión de alrededor de 0,8 bar.

Para el medio para C. aceticum se pesaron todos los componentes, se disolvieron y se envasaron. A continuación se añadió el indicador redox resazurina (1 mg/l), para poder examinar más tarde el potencial redox, y por consiguiente el contenido en oxígeno. A continuación se efectuó la gasificación a través de cánulas con una mezcla constituida por un 80 % de N2 y un 20 % de CO2, hasta que se alcanzó un pH de 7,4. También en este caso se aplicó una ligera sobrepresión. Tras el tratamiento en autoclave se añadió en medio estéril Na2CO3 en forma de una disolución de Na2CO3 anaerobia al 5 %, para alcanzar un pH de 8,2. Adicionalmente se añadió fructosa en medio estéril para dar una concentración final de un 1 %. Para crecimiento autótrofo se generó una atmósfera gaseosa de un 80 % de H2y un 20 % de CO2.

Todos los medios se trataron en autoclave a 121 °C y 1,2 bar durante 15 min. Algunos componentes de medio se trataron en autoclave por separado para impedir reacciones químicas de los componentes entre sí. Los componentes termolábiles se disolvieron, se filtraron en medio estéril y se añadieron al medio enfriado, tratado en autoclave, antes de la utilización.

Para la producción de medios sólidos se añadió un 1,5 % (w/v) de agar antes del tratamiento en autoclave, y directamente a continuación se vertieron éstos en placas de Petri en la cámara anaerobia. Tras el vertido se secaron las placas durante algunos días, y se almacenaron hasta empleo a 4ºC.

Medio para C. aceticum

NH4Cl: 1,00 g 18,7 mM

KH2PO4: 0,33 g 2,4 mM

K2HPO4: 0,45 g 2,6 mM

MgSO4 x 7 H2O: 0,10 g 0,4 mM

Disolución de oligoelementos (s.u.): 20, 00 ml 2 % (v/v)

Disolución de vitaminas de Wolfe (véase más abajo): 20, 00 ml 2 % (v/v)

Extracto de levadura: 2,00 g 0,2 % (w/v)

NaHCO3: 10,00 g 0,1 M

Cisteína-HCl x H2O: 0,50 g 2,8 mM

Na2S x 9 H2O: 0,50 g 2,1 mM

Agua: hasta 1000 ml imagen9

Tras el tratamiento en autoclave se añadieron en medio estéril 25 ml 1-1 de una disolución de Na2CO3 al 5 % en peso, para alcanzar un pH de 8,2. Adicionalmente se añadió fructosa en medio estéril para dar una concentración final de un 1 % en peso, referido al medio total. Para crecimiento autótrofo se generó antes del tratamiento en autoclave una atmósfera gaseosa de un 80 % en volumen de H2 y un 20 % en volumen de CO2.

Medio para C. carboxidivorans – medio de Wilkins-Chalgren

Caldo anaerobio de Wilkins-Chalgren (OXOID CM0643): 33 g 3,3 %

NaHCO3: 1 g 12 mM

Agua: hasta 1000 ml imagen10

El pH se ajustó a 5,6 antes de la ebullición y la anaerobización, y tras el tratamiento en autoclave se añadieron 10 ml de agente reductor 1 (véase más abajo), tras lo cual el pH se debía situar en 6,0.

10 Medio para C. ljungdahlii -ATCC 1754 (medio PETC)

NH4Cl: 1,0 g 19 mM

KCl: 0,1 g 1,35 mM

MgSO4 * 7 H2O: 0,2 g 0,8 mM

NaCl: 0,8 g 14 mM

KH2PO4: 0,1 g 0,7 mM

CaCl2 * 2 H2O: 20,0 mg 0,15 mM

Extracto de levadura: 1,0 g 0,1 % (w/v)

Disolución de oligoelementos: 10,0 ml 1 % (v/v)

Disolución de vitaminas de Wolfe: 10,0 ml 1 % (v/v)

NaHCO3: 2,0 g 24 mM

Agua: hasta 1000 ml pH 5,5

Antes de la ebullición y la anaerobización se ajustó el pH a 5,5. Tras el tratamiento en autoclave se añadieron 20 ml con una disolución de fructosa estéril (250 g/l) respectivamente 5 ml de agente reductor 1 y 2 (véase más abajo), a continuación el pH se debía situar en 5,9.

5 Agente reductor 1

Se disuelven 1,8 g de NaOH en 200 ml de agua, se llevan a ebullición y se enfrían bajo gasificación de nitrógeno. En la cámara anaerobia se disuelven en 100 ml de NaOH anaerobio en primer lugar 4 g de L-cisteína-HCl, y seguidamente 4 g de Na2S * 9 H2O, y a continuación se tratan los mismos en autoclave.

Agente reductor 2

10 Se disuelven 1,8 g de NaOH en 200 ml de agua, se llevan a ebullición y se enfrían bajo gasificación de nitrógeno. En la cámara anaerobia se disuelven en 100 ml de NaOH anaerobio 4 g de L-cisteína-HCl, y a continuación se tratan los mismos en autoclave.

Disolución de oligoelementos para el medio ATCC 1754 y para el medio C. aceticum

Ácido nitrilotriacético: 2 g 10,5 mM

MnSO4 * H2O: 1 g 6 mM

Fe (SO4)2(NH4 )2 * 6 H2O: 0,8 g 2 mM

CoCl2 * 6 H2O: 0,2 g 0, 86 mM

ZnSO4 * 7 H2O: 0,2 mg 0,7 µm

CuCl2 * 2 H2O: 20 mg 0,12 mM

NiCl2 * 6 H2O: 20 mg 80 µM

Na2MoO4 * 2 H2O: 20 mg 80 µM

Na2SeO4: 20 mg 80 µM

Na2WO4: 20 mg 60 µM

Agua: hasta 1000 ml imagen11

15 En primer lugar se disolvió el ácido nitrilotriacético en agua por completo, se ajustó el valor de pH con hidróxido potásico a 6,0 y despúes se disolvieron los otros componentes.

Disolución de vitaminas de Wolfe para el medio ATCC 1754 y para el medio C. aceticum

Biotina (Vitamina H): 2,0 mg 8 µM

Ácido fólico (Vitamina B9): 2,0 mg 4,5 µM

Piridoxina-HCl (Vitamina B6): 10,0 mg 49 µM

Tiamina-HCl (Vitamina B1): 5,0 mg 15 µM

Riboflavina (Vitamina B2): 5,0 mg 13 µM

Amida de ácido nicotínico (Vitamina PP): 5,0 mg 41 µM

Pantotenato de calcio D-(+): 5,0 mg 10,5 µM

Cianocobalmina (Vitamina B12): 0,1 mg 74 µM

Ácido p-aminobenzoico: 5,0 mg 36 µM

Ácido lipónico: 5,0 mg 24 µM

Agua: hasta 1000 ml pH 4,3

Los plásmidos construidos en E. coli X12-blue se introdujeron a continuación en clostridios acetógenos por medio de conjugación (Purdy et al., 2002), o bien transformación (Zhu et al., 2004), mediante lo cual la cepa recombinante adquiere la capacidad de producir acetona.

5 Para los experimentos de conjugación se cultivó la cepa donadora de E. coli CA434 con el plásmido a transferir en medio LB, en condiciones aerobias durante la noche. Se centrifugó una alícuota de 1 ml 1 min a 1000 x g, y el sedimento celular se suspendió cuidadosamente en la cámara anaerobia en 1 ml de tampón PBS estéril, anaerobio (1,5 mM KH2PO4, 4,2 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl), para impedir un corte de pilinas conjugativas. Las células se centrifugaron de nuevo y se absorbieron en 200 µl de un cultivo de clostridio cultivado en medio

10 correspondiente. En la cámara anaerobia se distribuyó esta mezcla sobre placas de agar convenientemente desecadas en gotas de 10 µl, y se incubó a 37ºC durante 6 horas en condiciones anaerobias. A continuación se lavaron las células 2 a 3 veces respectivamente con 0,5 ml de tampón PBS estéril, anaerobio, de la placa de agar. La mezcla de conjugación se plaqueó sobre placas de agar selectivas (claritromicina) y se incubó en condiciones anaerobias a 37ºC.

15 Para la transformación se cultivaron las células clostridianas en 50 ml de medio C. Aceticum con 40 mM DL-treonina a 30 °C hasta una densidad óptica de 0,3 -0,4. Los siguientes pasos se efectuaron en la cámara anaerobia. En ésta se cosecharon las células (6000 Upm, 10 min, RT), se lavaron dos veces con tampón SMP (270 mM Saccharose, 1 mM MgCl2, 7 mM NaH2PO4), y en último lugar se absorbieron en 500 a 700 µl de tampón SMP, y se emplearon las mismas en la transformación. A tal efecto se transfirieron las células a cubetas de electroporación (4 mm) y se

20 mezclaron con 0,5 a 1,5 µg de ADN plasmídico. Después de incubación de 5 minutos se efectuó la electroporación a 25 µF, 600 Ω y 2,5 kV en un pulsador génico (Bio-Rad Laboratories GmbH; Münich) con cubetas 4 mM (Biozym Scientific GmbH). A continuación se añadieron las células inmediatamente a 5 ml de medio precalentado. Siguió una incubación para el desarrollo de resistencia a 37ºC durante la noche hasta cuatro días, tras lo cual se inocularon 5 ml de medio con claritromicina (5 µg ml-1) y se incubaron durante 3 a 5 días a 37ºC.

25 Para verificar la transformación siguió un aislamiento de plásmidos por medio de "peqGOLD® Plasmid Miniprep Kit II" (Peqlab, Erlangen). La preparación se efectuó según los datos del fabricante, llevándose a cabo todos los pasos opcionales. A continuación se efectuó una “recuperación de plásmido“, empleándose la cepa de E. Coli XL2-blue y a continuación una digestión de restricción.

Claims

imagen1