ES2637918T3 - Métodos y conformaciones estructurales de preparaciones de anticuerpos con aumento de la resistencia a las proteasas - Google Patents

Abstract

Una preparación de proteína que contiene Fc de IgG glicosilada, en la que uno o más residuos de Fc en la región CH2 de la proteína que contiene Fc glicosilada se mutan para mantener o para aumentar las interacciones hidrófobas y disminuir las interacciones hidrófilas en las regiones CH2 o CH3 en que las mutaciones son Lys 246 Ala, Thr 260 Ala, y/o Arg 301 Ala.

Description

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puede ser de origen mamífero o puede ser seleccionado de COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mieloma, linfoma, levadura, células de insecto o vegetales, o cualquier derivado, células inmortalizadas o transformadas.

En otra realización, el método de suprimir o eliminar la actividad de la enzima necesaria para unión de oligosacárido puede seleccionarse del grupo que consiste de silenciamiento de genes, tal como mediante el uso de ARNsi, genéticos knock-out, o adición de un inhibidor de enzima, tal como por co-expresión de un Ab intracelular o péptido específico para la enzima que se une y bloquea su actividad enzimática, y otras técnicas de ingeniería genética conocidas. En otra realización, un método para mejorar la expresión o la actividad de una enzima que bloquea la unión de sacárido, o una enzima de sacaridasa que elimina los azúcares que ya están unidos, pueden seleccionarse de entre el grupo constituido por: transfecciones con genes de enzimas recombinantes, transfecciones de factores de transcripción que mejoran la síntesis de ARN de la enzima, y las modificaciones genéticas que mejoran la estabilidad de la enzima de ARN, todo lo cual conlleva una mayor actividad de las enzimas, tales como sialidasas, que resultan en niveles más bajos de ácido siálico en el producto purificado. En otra realización, los inhibidores enzimáticos específicos se pueden añadir al medio de cultivo celular. Alternativamente, la célula huésped se puede seleccionar de una especie u organismo incapaz de polipéptidos de glicosilación, por ejemplo, una célula procariota u organismo, tal como, por ejemplo, E. coli spp, Klebsiella spp., o Pseudomonas spp natural o diseñado.

Anticuerpos

Un anticuerpo descrito en esta solicitud puede incluir o ser derivado de cualquier mamífero, tal como, pero no limitado a, un ser humano, un ratón, un conejo, una rata, un roedor, un primate, o cualquier combinación de los mismos e incluye anticuerpos aislados humanizados y/o injertados con CDR, humanos, de primate, de roedores, de mamíferos, quiméricos, variantes de inmunoglobulinas, productos de escisión y otras partes especificadas. La invención también se refiere a la codificación de anticuerpo o ácidos nucleicos complementarios, vectores, células huésped, composiciones, formulaciones, dispositivos, animales transgénicos, plantas transgénicas, y métodos de fabricación y uso de los mismos, como se describe en el presente documento conjuntamente en combinación con lo que se conoce en el arte.

Los anticuerpos o proteínas de fusión Fc descritas en este documento se pueden derivar de varias maneras bien conocidas en la técnica. En un aspecto, los anticuerpos se obtienen convenientemente a partir de hibridomas preparados por inmunización de un ratón con los péptidos diana. Así, los anticuerpos se pueden obtener usando cualquiera de las técnicas de hibridoma bien conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, Ausubel, et al, ed, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY (1987-2001); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); Harlow y Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); Colligan, et al, eds, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, (1997-2001).

Los anticuerpos o proteínas de fusión Fc o componentes y dominios de los mismos también pueden ser obtenidos a partir de la selección de bibliotecas de tales dominios o componentes, por ejemplo, una biblioteca de fagos. Una biblioteca de fagos puede ser creada mediante la inserción de una biblioteca de oligonucleótidos aleatorios o una biblioteca de polinucleótidos que contienen secuencias de interés, tales como a partir de las células B de un animal o humano inmunizado (Smith, GP 1985. Science 228: 1315-1317). Bibliotecas de fagos de anticuerpos contienen pares de región de cadena variable pesada (H) y ligera (L) en un fago que permiten la expresión de fragmentos Fv de cadena única o fragmentos Fab (Hoogenboom, et al. 2000, Immunol. Today 21 (8) 371-8). La diversidad de una biblioteca de fagémidos puede ser manipulada para aumentar y/o alterar las inmunoespecificidades de los anticuerpos monoclonales de la biblioteca de producir y luego identificar anticuerpos humanos monoclonales adicionales deseables. Por ejemplo, lo genes que codifican moléculas de cadena pesada

(H) y cadena ligera (L) de inmunoglobulina pueden ser mezclados al azar (barajados) para crear nuevos pares de HL en una molécula de inmunoglobulina ensamblada. Además, cualquiera o ambos de los genes de codificación de cadena H y L pueden ser mutagenizadas en una región determinante de la complementariedad (CDR) de la región variable del polipéptido de inmunoglobulina, y posteriormente examinados para capacidades de afinidad y neutralización deseables. Bibliotecas de anticuerpos también pueden ser creadas sintéticamente mediante la selección de una o más secuencias de marco humano y la introducción de colecciones de casetes de CDR derivadas de repertorios de anticuerpos humanos o mediante la variación diseñada (Kretzschmar y von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13: 598-602). Las posiciones de diversidad no se limitan a CDR, pero también pueden incluir los segmentos de marco de las regiones variables o pueden incluir otras de regiones variables de anticuerpos, tales como péptidos.

Otras bibliotecas de componentes de unión diana que pueden incluir otras que las regiones variables de anticuerpos son muestras de ribosoma, muestras de levadura, y muestras bacterianas. Muestras de ribosoma son un método de la conmutación de ARNm en sus proteínas cognadas, manteniendo la proteína unida a la ARN. La secuencia de codificación de ácido nucleico se recupera por RT-PCR (Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91, 9022). Muestras de levadura se basan en la construcción de proteínas de fusión del receptor asociado a receptor de adhesión de levadura alfa-aglutinina asociado a membrana, aga1 y aga2, una parte del

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sistema de tipo de apareamiento (Broder, et al. 1997. Nature Biotechnology, 15: 553-7). Muestras bacterianas se basan en la fusión de la diana a las proteínas bacterianas exportadas que se asocian con la membrana celular o pared celular (Chen y Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79: 496-503).

En comparación con la tecnología del hibridoma, fago y otros métodos de muestras de anticuerpos permiten la posibilidad de manipular la selección contra el antígeno diana in vitro y sin la limitación de la posibilidad de efectos de acogida en el antígeno o viceversa.

También se describe un método para producir un anticuerpo o proteína de fusión con Fc, que comprende conmutar el ácido nucleico que se codifica bajo condiciones in vitro, in vivo o in situ, de tal manera que el péptido o el anticuerpo se expresa en cantidades detectables o recuperables.

Efecto de glicanos de Fc en la estructura del anticuerpo

Los fragmentos Fc de IgG humana de glicoformas G2 y G0 han sido co-cristalizados en la formación de complejos con el péptido MiniZ, una versión 2-hélice diseñada (Z34C) del dominio B de la proteína A, y sus estructuras cristalinas de rayos X se resolvieron en 1,65 y 2,3Å, respectivamente. El péptido MiniZ se utilizó para ayudar en el aumento de la resolución de la estructura cristalina de Fc, y que ayudaría en la creación de estructuras cristalinas de alta resolución de las glicoformas homogéneas de Fc (Kelley et al, 1992; Braisted et al, 1996; Starovasnik et al, 1997; Deisenhofer, 1981; Sauer et al, 1995).

Ambas estructuras cristalinas muestran que el fragmento Fc de IgG1 es un dímero unido a disulfuro de dos cadenas pesadas idénticas que consisten en dominios de CH2 y CH3. Cada porción de cadena pesada está relacionada por un eje de dos veces casi perfecto. El complejo G2 y G0 con MiniZ (G2-MiniZ) se cristalizó como un único fragmento Fc unido a una molécula MiniZ en la unidad asimétrica. La diferencia entre los dominios CH2 y CH3 resulta de los factores de alta temperatura asociados con dos bucles situados cerca de la parte inferior del dominio CH2, uno de los cuales está unido al resto de oligosacárido. El dominio de CH3 tiene un factor de temperatura global menor debido a su contacto de embalaje con una cadena relacionada con simetría, pero contiene dos regiones de bucle que están expuestas al disolvente y que tienen factores de alta temperatura.

Estructura de oligosacáridos G2

El complejo G2-MiniZ contiene dos oligosacáridos biantenarios complejos idénticos consistiendo cada uno de 4 GlcNAc, 3 Man, 2 Gal, y 1 Fuc. Los residuos de azúcar, de GlcNAc vinculado a Asn297 hasta el núcleo de manosa y a lo largo de la rama α 1 → 6-hasta el residuo Gal tienen factores de baja temperatura. Los residuos de GlcNAc y Gal en la rama α 1 → 3 no están tan bien resueltos como con Gal en la rama α 1 → 6. Los residuos de Gal y GlcNAc en la rama α 1 → 3 posiblemente tienen múltiples conformaciones. El Fuc unido a la GlcNAc que a su vez se vinculó a Asn297 también tiene factores de alta temperatura y también puede adoptar múltiples conformaciones. Se observó un total de seis enlaces de hidrógeno (enlaces de H) entre los residuos de azúcar y residuos de aminoácidos en el complejo G2-MiniZ (Fig. 11). El residuo núcleo de GlcNAc enlazado a Asn297 forma un enlace de H con el Arg 301. El segundo GlcNAc en la región del núcleo se enlaza de H con Lys246. El residuo Gal presente en la rama α 1 → 6 se enlaza de H con Lys 246 y Thr260 y el residuo GlcNAc que lleva residuo Gal en la rama α 1 → 6 se enlaza de H con Asp 265. Los azúcares de ambos monómeros Fc tienen muy poco contacto entre sí excepto que hay una interacción de tipo carbohidrato-carbohidrato entre los dos residuos de Man (Fig. 11) en la rama α 1 → 3 de dos oligosacáridos y están en la superficie enterrada.

Comparación de la estructura de carbohidratos de glicoformas G2 y G0

Cuando los dominios de CH2 o CH3 se superponen, la orientación relativa del núcleo y residuos de azúcar de rama α 1 → 6-permanece constante para los complejos G2 y G0 que sugieren muy poca libertad de movimiento. En las estructuras cristalinas, la rama de α 1 → 3 se mueve por tanto hasta 0,83Å al comparar el residuo GlcNAc en los complejos G2 y G0. La manosa de la cadena A en la rama α 1 → 3 tiene poco contacto hidrófobo con la manosa α 1 → 3 de la cadena B (Figs. 11 y 12). En la glicoforma G2, Gal 02 se enlaza de H a Thr 260 OG1 y también es 2,8A desde el oxígeno del carbonilo de Pro244. En la glicoforma G0, Lys 246 ya no se enlaza de hidrógeno a GlcNAc (Fig. 12). Dado que el Gal se ha ido en la rama α 1 → 6, el tramo desde Pro244 a Pro 247 sería desestabilizaría ligeramente en complejo GO-MiniZ. El agua ahora ocupa el espacio cerca de donde el Gal O-2 residía y ahora tiende un puente sobre el oxígeno del carbonilo de Pro244 a Thr 260, que proporciona parte de la energía de estabilización. En ausencia de residuos de Gal y GlcNAc, el complejo G-2-MiniZ también tiene propiedades estructurales similares al complejo GO-MiniZ.

En las estructuras de rayos X, a medida que la estructura de carbohidrato se trunca, la estructura terciaria de Fc parece estar afectada como lo demuestra la pérdida de resolución en la estructura de rayos X y el aumento uniforme en factores B (Krapp et al, 2003). El estudio de RMN usando etiquetado 13C selectivo de los glicanos en una IgG2b murina apoya los hallazgos de los datos de rayos X (Gilhespy et al, 1994; Yamaguchi et al, 1998). En este estudio de RMN, los investigadores concluyeron que la movilidad de la cadena de hidrato de carbono es comparable a la de la cadena de esqueleto del polipéptido con la excepción del residuo de galactosa en el extremo

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no reductor de la rama α 1 → 3 que es extremadamente móvil y que la agalactosilation no induce ningún cambio significativo en la movilidad (Yamaguchi et al, 1998).

La importancia de la glicosilación IgG en el Fc ha sido estudiada durante varias décadas y la literatura contiene mucha información sobre el impacto de los glicanos Fc sobre la actividad biológica de las IgG. Además de estos aspectos, en la presente memoria se discute un nuevo aspecto del impacto de glicanos Fc sobre la resistencia a anticuerpo a las proteasas. Ahora está claro que los glicanos de Fc de anticuerpos aumentan la resistencia a las proteasas (Raju y Scallon, 2006). Análisis estructurales de FC por rayos X y estudios de RMN muestran una interacción hidrófoba entre los dos residuos de núcleo Man de la rama α 1 → 3 de dos oligosacáridos complejos (véase Fig. 13) (Laskowski et al, 1996; Wormald et al, 1997; Yamaguchi et al, 1998; Krapp et al, 2003). Esta interacción hidrófoba parece ser necesaria para mantener la adecuada conformación Fc para proporcionar aumento de resistencia a las proteasas. La glicosilación Fc también es necesaria para que las IgG exhiban actividades ADCC y CDC que subraya la importancia de la interacción hidrófoba entre los dos residuos de Man. Sin esta interacción hidrófoba, la molécula de anticuerpo puede sobresalir un poco, lo que a su vez aumenta el volumen hidrodinámico alterando así la confirmación en el dominio CH2. Esta perturbación estructural puede ser responsable de la mayor sensibilidad de la proteasa, y la pérdida de las actividades ADCC y CDC de anticuerpos aglicosilados (o desglicosilados). Junto con los rayos X y el análisis estructural de RMN, los estudios de microcalorimetría de exploración diferencial de IgG2b glicosilada y aglicosilada de ratón-Fc reveló diferencias significativas en la estabilidad de los dominios CH2 y CH3 entre las formas glicosiladas y aglicosiladas (Tishchenko, 1998). La energía libre de estabilización del dominio aglicosilado CH2 disminuyó, lo que sugiere que sea menos estructurado, de acuerdo con la susceptibilidad incrementada observada a las proteasas (Tishchenko, 1998; Simonson y Brunger, 1992).

Curiosamente, conclusiones similares pueden extraerse de los estudios comparativos de glicoformas galactosiladas (G2) y agalactosiladas (G0) de fragmentos de IgG1-Fc humana, con una entalpía inferior para la glicoforma G0, en relación con la glicoforma G2, siendo evidente, posiblemente reflejando la pérdida de interacciones entre los oligosacáridos y dominios CH2 (Ghirlando et al, 1999; Tao y Morrison, 1989). Estos datos se han interpretado como el apoyo a la propuesta de que en la ausencia de un residuo de galactosa de rama α 1 → 6 de la cadena de oligosacárido es más móvil (Corper et al, 1997; Ghirlando et al, 1999). La contribución de Phe 241 y Phe 243, Asp 265 y Arg 301 puede proporcionar la mayor parte de la estabilización para interacción de oligosacáridos CH2 y la energía de estabilización restante proviene de las interacciones de Gal (en rama α 1 → 6) con residuos de Lys 246 y Thr 260 (véanse las Fig. 11-13). Estas interacciones hidrofílicas e hidrofóbicas entre los residuos de galactosa y de aminoácidos pueden jugar un papel en el aumento de la afinidad de unión de anticuerpos galactosilados a la proteína C1q. Sin embargo, tales interacciones también pueden aumentar la accesibilidad de los residuos de aminoácidos a las proteasas, disminuyendo así la resistencia de anticuerpos galactosilados a las proteasas.

Aunque ninguna solución ni datos de cristal están disponibles para anticuerpos sialilados, se cree que las interacciones moleculares entre residuos de ácido siálico y residuos de aminoácidos son las razones para la disminución de la resistencia de anticuerpos sialilados a las proteasas. El ácido siálico está cargado negativamente y más voluminoso que la mayoría de los monosacáridos que se encuentran en las glicoproteínas de origen animal. La carga y voluminosidad también podrían afectar la conformación Fc y por lo tanto afectar la estabilidad del anticuerpo y actividad biológica. Variaciones estructurales menores en glicanos Fc no sólo afectan a las funciones de anticuerpos, sino también afectan a la resistencia de anticuerpo a las proteasas y por lo tanto afectan a la estabilidad del anticuerpo.

Tras haber descrito la invención en términos generales, las realizaciones de la invención se describirán adicionalmente en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Aislamiento de dominio Fc de IgG

La papaína se obtuvo de Sigma y PNGasa F (péptido N-glucosidasa F) se obtuvo de New England Biolabs. Ácido sinápico se obtuvo de Fluka. Los análisis MALDI-TOF-MS se llevaron a cabo utilizando la estación de trabajo Voyager DE Biospectrometry (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Las muestras de anticuerpo se desglicosilaron por tratamiento con PNGasa F en tampón Tris-HCl de 20 mM, pH 7,0. Las muestras de anticuerpo desglicosiladas se purificaron en una columna de proteína A (cartuchos de proteína A HiTrap se obtuvieron de Amersham Biosciences) y se analizaron por MALDI-TOF-MS para la pureza.

Las muestras de anticuerpo (en ~ 1 mg/ml, antes y después de la desglicosilación) fueron tratadas con papaína (1:50, en peso) en tampón Tris-HCl de 20 mM, pH 7,0, que contenía 2 mM de L-cisteína y alícuotas se retiraron a intervalos de tiempo fijos (0, 15, 30, 60, 90 minutos, seguido de a 2, 3, 4, 5, 6, 8 y 24 horas). Las partes alícuotas (aproximadamente 2 µl) se mezclaron inmediatamente con 2 µl de solución de matriz (la solución matriz se preparó disolviendo 10 mg de ácido sinápico en 1,0 ml de 50% de acetonitrilo en agua que contiene 0,1% de ácido trifluoroacético) y 2 µl de esta solución se cargó en la placa diana MALDI y se dejó secar al aire antes del análisis.

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Para realizar el análisis de MALDI-TOF-MS de los glicanos Fc liberados, muestras de IgG (~ 50 µg), antes y después de reacciones de glicosilación in vitro, se digirieron con PNGasa F en tampón Tris-HCl de 10 mM (50 µl) pH 7,0 durante 4 horas a 37°C. La digestión se detuvo mediante la acidificación de la mezcla de reacción con 50% de ácido acético (~ 5 µl) y luego pasar a través de una columna de resina de intercambio catiónico como se describe previamente (Papac et al, 1996;. Papac et al, 1998;. Raju et al., 2000). Estas muestras que contienen una mezcla de oligosacáridos ácidos y neutros se analizaron por MALDI-TOF-MS en los modos de iones positivos y negativos, como se describe en otra parte (Papac et al, 1996; Papac et al, 1998; Raju et al., 2000) usando un instrumento Voyager DE a partir de Applied Biosystems (Foster City, CA).

El análisis por HPLC de glicanos Fc se hizo por la digestión de muestras de IgG (50 µg) en tampón Tris-HCl de 10 mM (50 µl) pH 7,0 con PNGasa F a 37°C durante 4-8 horas. La derivatización de los oligosacáridos liberados con ácido antranílico (ácido 2-aminobenzoico) se llevó a cabo como se describe (Anumula KR Anal Biochem 2000 Jul 15; 283 (1): 17-26). Brevemente, una solución de acetato de sodio 4% · 3H2 O (p/v) y 2% de ácido bórico (p/v) en metanol se preparó en primer lugar. El reactivo de derivatización fue entonces recién preparado mediante la disolución de ~ 30 mg de ácido antranílico (Aldrich) y ~ 20 mg de cianoboro-hidruro de sodio (Aldrich) en 1,0 ml de solución de acetato-borato de metanol-sodio. Oligosacáridos derivados por IgG (<3 nmol en 20-50 µl de agua) se mezclaron con 0,1 ml de la solución de reactivo de ácido antranílico (AA) en 1,6 ml de viales de congelación de tapón de rosca de polipropileno con anillos 'O" (Sigma) y se tapó herméticamente. Los viales se calentaron a 80°C en un bloque de horno o de calentamiento (Reacti-Therm, Pierce) durante 1-2 horas. Después de enfriar los viales a temperatura ambiente, las muestras se diluyeron con agua para llevar el volumen a ~ 0,5 ml. Oligosacáridos derivatizados fueron purificados usando columnas NAP-5.

Mediante el uso de una preparación que es al menos 90% en la glicoforma G2 o G2S2, un experimento de digestión con papaína como se describe en el ejemplo 1 se realiza y se analiza para demostrar el efecto de contenido de ácido siálico en la velocidad de escisión y la especificidad de la papaína. Los análisis adicionales de escisión se llevan a cabo con otras enzimas proteolíticas utilizando las muestras como se ha preparado en este ejemplo.

Ejemplo 3: Producción de fragmentos de anticuerpos mediante el uso de metaloproteinasa de la matriz 3

Las metaloproteinasas (MMPs) se purificaron a partir del sobrenadante de clones de células que expresan MMP humanos recombinantes. La enzima se activó con 1 mM de 4-acetato aminofenilmercúrico (APMA; Sigma) durante 1 hora a 37°C o por tratamiento con quimotripsina. La enzima activada se almacenó a -70°C. Preparaciones de inmunoglobulina (0,5-1,0 mg/ml) se incubaron con tampón de digestión (250 mM de Tris-HCl, pH 7,4, que contiene 1,5 M NaCl, 50 mM de CaCl2 que contiene 15-60 µg/ml de MMP activado) durante 0-24 horas a 37°C. Las alícuotas fueron retiradas a los 0, 15, 30, 45, 60, y 120 minutos, seguido de 3, 4, 5, 6, 8, 12, y 24 horas. Las alícuotas fueron (aproximadamente de 2 microlitros) con solución de matriz (aproximadamente 2 microlitros) y 2 microlitros de esta mezcla se cargó en la placa diana MALDI-TOF-MS y se analizaron por MALDI-TOF-MS usando un espectrómetro de Voyager DE.

Ejemplo 4: Escisión proteolítica de Fc purificada

La papaína se obtuvo de Sigma y PNGasa F (péptido de N-glucosidasa F) se obtuvo de New England Biolabs. Ácido sinápico se obtuvo de Fluka. Los análisis de MALDI-TOF-MS se llevaron a cabo utilizando estación de trabajo de Voyager DE Biospectrometry (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Muestras de anticuerpo (IgG) se desglicosilaron por tratamiento con PNGasa F en 20 mM de tampón de Tris-HCl, pH 7,0. Las muestras de anticuerpo desglicosiladas se purificaron en una columna de proteína A (cartuchos de proteína A HiTrap se obtuvieron de Amersham Biosciences) y se analizaron por MALDI-TOF-MS para la pureza. Se aislaron los fragmentos Fc de IgG y se purificaron como se describe en otro lugar.

Las muestras de fragmento Fc (aproximadamente 1 mg/ml, antes y después de desglicosilación) fueron tratadas con papaína (1:50, en peso) en 20 mM de tampón de Tris-HCl, pH 7,0, que contenía 2 mM de L-cisteína y alícuotas se retiraron a intervalos de tiempo fijos (0, 15, 30, 60, 90 minutos, seguido de a 2, 3, 4, 5, 6, 8 y 24 horas). Las partes alícuotas (aproximadamente 2 µl) se mezclaron inmediatamente con 2 µl de solución de matriz (la solución matriz se preparó disolviendo 10 mg de ácido sinápico en 1,0 ml de 50% de acetonitrilo en agua que contiene 0,1% de ácido trifluoroacético) y 2 µl de esta solución se cargó en la placa diana MALDI y se dejó secar al aire antes del análisis.

Los datos de MALDI-TOF-MS de digestos de IgG glicosilados y desglicosilados se analizaron para obtener los datos del área de pico % relativos de IgG intactas y fragmentos de Fc a todos los puntos de tiempo (Fig. 5). Para las muestras de IgG, los experimentos en función del tiempo indicaron que dentro de los 15 minutos de la digestión, más del 70% de la IgG desglicosilada fue convertida en Fab, Fc, y los fragmentos de Fc más pequeños (en m/z de fragmentos 10,5 KDa y 12 kDa), mientras que menos de 50% de la IgG glicosilada fue convertida en fragmentos. Después de 60 minutos de incubación, ninguna IgG desglicosilada era detectable, mientras que aproximadamente el 80% de IgG glicosilada estaba todavía intacta de acuerdo con el análisis de MALDI-TOF-MS. Para los fragmentos de

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