ES2625654T3 - A method of producing native components, such as growth factors or extracellular matrix proteins, by cell culture of tissue samples for tissue repair - Google Patents
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Abstract
Un método de producción de una mezcla de componentes nativos, incluidos en el grupo que consiste en factores de crecimiento, proteínas de la matriz extracelular y otras sustancias producidas por muestras de células durante condiciones normales, que comprende las etapas de: - añadir una o varias muestras de células diferentes de origen humano o animal y en el que dichas muestras de células son o se originan de una biopsia de tejido de uno o más de los siguientes tejidos músculo, grasa, cartílago, piel, hueso, nervios, hígado y/o dientes, a un biorreactor que contiene un medio nutritivo, en el que se obtiene un medio de cultivo; - cultivar las células durante condiciones normales, en el que el cultivo se lleva a cabo bajo condiciones rotatorias; - extraer al menos una vez el medio de cultivo que incluye componentes nativos producidos durante el cultivo celular; - separar los componentes nativos del medio de cultivo obteniendo así una mezcla de componentes nativos, en el que dicho biorreactor tiene dos cámaras interconectadas separadas por un filtro millipore que permite que los componentes nativos producidos difundan a la segunda cámara y la separación de las células del medio de cultivo que contiene componentes nativos en el biorreactor, y en el que la extracción del medio de cultivo que incluye componentes nativos producidos tiene lugar a intervalos predeterminados y el medio de cultivo extraído se sustituye por medio nutritivo nuevo.A method of producing a mixture of native components, included in the group consisting of growth factors, extracellular matrix proteins and other substances produced by cell samples during normal conditions, comprising the steps of: - adding one or more samples of different cells of human or animal origin and in which said cell samples are or originate from a tissue biopsy of one or more of the following muscle, fat, cartilage, skin, bone, nerves, liver and / or tissues teeth, to a bioreactor that contains a nutritive medium, in which a culture medium is obtained; - culturing the cells during normal conditions, in which the culture is carried out under rotary conditions; - extract at least once the culture medium that includes native components produced during cell culture; - separating the native components from the culture medium thus obtaining a mixture of native components, in which said bioreactor has two interconnected chambers separated by a millipore filter that allows the produced native components to diffuse into the second chamber and the separation of the cells from the culture medium containing native components in the bioreactor, and in which the extraction of the culture medium that includes produced native components takes place at predetermined intervals and the extracted culture medium is replaced by new nutrient medium.
Description
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DESCRIPCIONDESCRIPTION
Un metodo de produccion de componentes nativos, tales como factores de crecimiento o protemas de la matriz extracelular, mediante cultivo celular de muestras de tejido para la reparacion de tejidoA method of producing native components, such as growth factors or extracellular matrix proteins, by cell culture of tissue samples for tissue repair
Campo tecnico de la invencionTechnical field of the invention
La presente invencion se refiere a una composicion medica, a un metodo de produccion de una mezcla de componentes nativos, a un metodo de produccion de dicha composicion medica, a un metodo de tratamiento de un sujeto en necesidad de reparacion de tejido, y al uso de dicha mezcla de componentes nativos para la produccion de dicha composicion medica para la reparacion de tejido mediante inyeccion.The present invention relates to a medical composition, a method of producing a mixture of native components, a method of producing said medical composition, a method of treating a subject in need of tissue repair, and the use of said mixture of native components for the production of said medical composition for tissue repair by injection.
Tecnica anteriorPrior art
La sustitucion o reparacion de tejido danado o perdido esta entre las terapias medicas mas caras y cuesta billones de dolares al ano en todo el mundo. Hay una demanda cada vez mayor de nuevos metodos y materiales que puedan aplicarse en la ingeniena de tejido.The replacement or repair of damaged or lost tissue is among the most expensive medical therapies and costs billions of dollars a year worldwide. There is a growing demand for new methods and materials that can be applied in tissue engineering.
La experiencia de trasplantar celulas madre multiplicadas o celulas madre de donante espedfico en el cuerpo humano, por ejemplo en articulaciones, corazon, cerebro y organos endocrinos, no ha sido satisfactoria en mostrar supervivencia a largo plazo significativa de las celulas trasplantadas. En algunos estudios, sin embargo, se ha informado de algun impacto sobre el crecimiento hacia adentro vascular y la reparacion con reclutamiento celular y mejora clmica menor.The experience of transplanting multiplied stem cells or specific donor stem cells in the human body, for example in joints, heart, brain and endocrine organs, has not been satisfactory in showing significant long-term survival of the transplanted cells. In some studies, however, some impact on vascular inward growth and repair with cellular recruitment and minor weather improvement has been reported.
El motivo mas obvio para el efecto a corto plazo informado de celulas madre trasplantadas sobre la reparacion local (Gazit et al. 2006) es en opinion de los presentes inventores que las celulas trasplantadas durante su corto tiempo de supervivencia actuan de fabrica local de celulas que produce una cascada de factores de crecimiento y protemas de la matriz extracelular capaces de reclutar celulas madre progenitoras. Estudios recientes usando factores estimulantes de colonias para potenciar la generacion de tejido local que recluta celulas madre locales o circulantes existentes fortalecen esta hipotesis. Se ha demostrado que el cerebro humano contiene celulas con propiedades similares a las celulas madre y una capacidad para generar nuevas neuronas a partir de celulas madre generadoras (Brederlau et al 2004). Tambien se ha mostrado recientemente que la combinacion de trasplantar celulas neuroprecursoras junto con factores de crecimiento individuales en medula espinal de rata lesionada en una fase aguda mejorara ligeramente la funcion nerviosa. No se observo el mismo efecto si el trasplante se llevo a cabo despues de 8 semanas (Karima et al. 2006).The most obvious reason for the reported short-term effect of transplanted stem cells on local repair (Gazit et al. 2006) is in the opinion of the present inventors that the transplanted cells during their short survival time act as a local cell factory that It produces a cascade of growth factors and extracellular matrix proteins capable of recruiting progenitor stem cells. Recent studies using colony stimulating factors to enhance the generation of local tissue that recruits existing local or circulating stem cells strengthen this hypothesis. It has been shown that the human brain contains cells with properties similar to stem cells and an ability to generate new neurons from generating stem cells (Brederlau et al 2004). It has also recently been shown that the combination of transplanting neuroprecursor cells together with individual growth factors in spinal cord of an injured rat in an acute phase will slightly improve nerve function. The same effect was not observed if the transplant was carried out after 8 weeks (Karima et al. 2006).
Se ha usado satisfactoriamente tejido de bio-ingeniena para fines de sustitucion en un numero limitado de aplicaciones clmicas, por ejemplo, en el tratamiento de defectos oseos, ulceras diabeticas y para roturas de tendones. El enfoque mas satisfactorio ha sido seleccionar diferentes tipos de celulas que presentan la funcion y caractensticas del tejido de interes. Se ha informado de los mejores resultados a largo plazo en la rodilla para defectos condrales aislados usando autoinjertos, es decir, condrocitos cultivados en un biorreactor sobre un armazon usando, por ejemplo, una matriz tridimensional, un vellon de colageno o hialuronano. Sin embargo, el triturar cartflago y distribuirlo sobre una matriz similar en un procedimiento de una etapa sin cultivo previo da resultados tan buenos como con la implantacion de condrocitos autologos. En ambos casos, un cartflago similar a hialino sera el resultado. El implante se integrara frecuentemente mal con el cartflago de alrededor. Esto casi siempre da un tejido cicatricial que deja una fisura, en el area entre el cartflago sano y el trasplante (Yiling et al 2006).Bio-engineering tissue has been successfully used for replacement purposes in a limited number of clinical applications, for example, in the treatment of bone defects, diabetic ulcers and for tendon ruptures. The most satisfactory approach has been to select different types of cells that present the function and characteristics of the tissue of interest. The best long-term results in the knee have been reported for isolated chondral defects using autografts, that is, chondrocytes grown in a bioreactor on a frame using, for example, a three-dimensional matrix, a collagen or hyaluronan fleece. However, shredding cartilage and distributing it on a similar matrix in a one-stage procedure without previous culture gives results as good as with the implantation of autologous chondrocytes. In both cases, a cartilage similar to hyaline will be the result. The implant will frequently integrate poorly with the surrounding cartilage. This almost always gives a scar tissue that leaves a fissure, in the area between the healthy cartilage and the transplant (Yiling et al 2006).
En el documento WO2002/067762 A2 se describe una construccion de polfmero de musculo para la ingeniena de tejido oseo, en la que se prepara un material de injerto de hueso que comprende un armazon de polfmero cargado con protemas morfogeneticas oseas y poblado con celulas de musculo para sintetizar tejido oseo.WO2002 / 067762 A2 describes a muscle polymer construction for bone tissue engineering, in which a bone graft material is prepared comprising a polymer shell loaded with bone morphogenetic protections and populated with muscle cells. to synthesize bone tissue.
En el documento US20050019419 se describe una composicion de injerto de tejido que comprende membrana basal de hugado y un metodo de preparacion de esta composicion de injerto de tejido. La composicion de injerto puede implantarse para sustituir o inducir la reparacion de tejidos danados o enfermos.In US20050019419 a tissue graft composition comprising basal membrane of escape and a method of preparing this tissue graft composition is described. The graft composition can be implanted to replace or induce repair of damaged or diseased tissues.
El documento US 6 096 347 describe el uso de tejido submucoso de un vertebrado de sangre caliente para fabricar una composicion de injerto de tejido que induce la formacion de tejidos cardfacos endogenos in vivo tras el contacto de los tejidos cardfacos con la composicion fabricada.US 6 096 347 describes the use of submucous tissue of a warm-blooded vertebrate to make a tissue graft composition that induces the formation of endogenous cardiac tissues in vivo after contact of the cardiac tissues with the manufactured composition.
El documento WO 01/14527 se refiere a una composicion de medio acondicionado que contiene agentes de piel producidos de celulas cultivadas de piel y un agente de vehmulo para administracion topica sobre la piel.WO 01/14527 refers to a composition of conditioned medium containing skin agents produced from cultured skin cells and a vehicle agent for topical administration on the skin.
El documento US 2002/0049422 A1 desvela una composicion topica que comprende diferentes factores de crecimiento.US 2002/0049422 A1 discloses a topical composition comprising different growth factors.
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El documento WO 02/24219 se refiere a un complejo de protema aislada que comprende una protema de union a factor de crecimiento, vitronectina y un factor de crecimiento, ademas de un implante quirurgico y un medicamento de regeneracion de piel que comprende dicho complejo.WO 02/24219 refers to an isolated protein complex comprising a growth factor binding protein, vitronectin and a growth factor, in addition to a surgical implant and a skin regeneration medicament comprising said complex.
El documento WO 00/69449 se refiere a productos que comprenden composiciones de medio de cultivo celular acondicionado y metodos de uso de los mismos. Las composiciones de medio celular acondicionado del documento pueden estar comprendidas de cualquier medio definido conocido y pueden ser acondicionadas usando cualquier tipo de celula eucariota.WO 00/69449 refers to products comprising compositions of conditioned cell culture medium and methods of use thereof. Compositions of conditioned cell media of the document can be comprised of any known defined medium and can be conditioned using any type of eukaryotic cell.
Bilodeau, K., et al., Tissue Engineering, 2006, 12(8), pp. 2367-2383, se refiere a los principales tipos de biorreactores usados para la ingeniena de tejido y la regeneracion, ademas de sus aplicaciones mas comunes.Bilodeau, K., et al., Tissue Engineering, 2006, 12 (8), pp. 2367-2383, refers to the main types of bioreactors used for tissue engineering and regeneration, in addition to their most common applications.
En vista del estado de la tecnica todavfa queda la necesidad de mejorar la sustitucion y reparacion de tejido danado o perdido dentro del cuerpo de sujetos humanos y animales. Las solicitudes de reparacion y sustitucion de tejido danado o perdido son amplias y las afecciones que va a tratarse son muchas.In view of the state of the art, there is still a need to improve the replacement and repair of damaged or lost tissue within the body of human and animal subjects. The requests for repair and replacement of damaged or lost tissue are wide and the conditions to be treated are many.
Como sera evidente de lo siguiente, la presente invencion se refiere a resolver tales necesidades.As will be apparent from the following, the present invention relates to solving such needs.
Sumario de la invencionSummary of the invention
La presente invencion se refiere a un metodo de produccion de una mezcla de componentes nativos, incluidos en el grupo que consiste en factores de crecimiento, protemas de la matriz extracelular y otras sustancias producidas por muestras de celula durante condiciones normales, que comprende las etapas de:The present invention relates to a method of producing a mixture of native components, included in the group consisting of growth factors, extracellular matrix proteins and other substances produced by cell samples during normal conditions, comprising the steps of :
- anadir una o varias muestras de celulas diferentes de origen humano o animal y, en el que dichas muestras de celulas son o se originan de una biopsia de tejido de uno o mas de los siguientes tejidos musculo, grasa, cartflago, piel, hueso, nervios, hngado y/o dientes, a un biorreactor que contiene un medio nutritivo, en el que se obtiene un medio de cultivo;- add one or several different cell samples of human or animal origin and, in which said cell samples are or originate from a tissue biopsy of one or more of the following muscle, fat, cartilage, skin, bone tissues, nerves, liver and / or teeth, to a bioreactor containing a nutrient medium, in which a culture medium is obtained;
- cultivar las celulas durante condiciones normales, en el que el cultivo se lleva a cabo bajo condiciones rotatorias;- culturing the cells during normal conditions, in which the culture is carried out under rotary conditions;
- extraer al menos una vez el medio de cultivo que incluye componentes nativos producidos durante el cultivo celular;- extract at least once the culture medium that includes native components produced during cell culture;
- separar los componentes nativos del medio de cultivo obteniendo asf una mezcla de componentes nativos,- separating the native components from the culture medium thus obtaining a mixture of native components,
en el que dicho biorreactor tiene dos camaras interconectadas separadas por un filtro millipore que permite que los componentes nativos producidos difundan en la segunda camara y para la separacion de las celulas del medio de cultivo que contiene componentes nativos en el biorreactor, y en el que la extraccion del medio de cultivo que incluye los componentes nativos producidos tiene lugar a intervalos predeterminados y el medio de cultivo extrafdo se sustituye por medio nutritivo nuevo.wherein said bioreactor has two interconnected chambers separated by a millipore filter that allows the native components produced to diffuse in the second chamber and for the separation of the cells from the culture medium containing native components in the bioreactor, and in which the Extraction of the culture medium that includes the native components produced takes place at predetermined intervals and the extracted culture medium is replaced by new nutrient medium.
Breve descripcion de los dibujosBrief description of the drawings
La Fig. 1 representa una realizacion del metodo segun la invencion, en la que las celulas se toman de un cierto tipo de tejido y a partir de aqrn se cultivan en uno o mas biorreactores. Los componentes nativos producidos, tales como los factores de crecimiento y las protemas de la matriz extracelular (GECM), se combinan entonces con un vehmulo qmmicamente y mecanicamente optimizado, en el que se forma una composicion medica. Esto se inyecta entonces en el tejido del huesped donde las celulas son reclutadas y se potencian la proliferacion y diferenciacion.Fig. 1 represents an embodiment of the method according to the invention, in which the cells are taken from a certain type of tissue and from here they are grown in one or more bioreactors. The native components produced, such as growth factors and extracellular matrix proteins (GECM), are then combined with a chemically and mechanically optimized vehicle, in which a medical composition is formed. This is then injected into the host tissue where cells are recruited and proliferation and differentiation are enhanced.
La Fig. 2 representa un vehmulo con diferentes modulos de elasticidad que se impregnan o precargan con los componentes nativos, tales como GECM producidos segun la invencion.Fig. 2 depicts a vehicle with different moduli of elasticity that are impregnated or preloaded with native components, such as GECM produced according to the invention.
Descripcion de realizaciones preferidas de la invencionDescription of preferred embodiments of the invention
En una realizacion, el metodo segun la invencion comprende ademas la liofilizacion de los componentes nativos separados tales como GECM. Puede usarse cualquier metodo de liofilizacion convencional conocido para un experto en la materia.In one embodiment, the method according to the invention further comprises lyophilization of separate native components such as GECM. Any conventional lyophilization method known to a person skilled in the art can be used.
Segun la presente invencion, cada muestra de celulas es o se origina de una biopsia de tejido de un sujeto humano o animal. Ejemplos de sujetos animales de los que puede tomarse la biopsia de tejido son preferentemente cerdos, vacas y cabra. La biopsia de tejido se toma preferentemente de, pero no se limita a, uno o mas de los siguientes tejidos: musculo, grasa, cartflago, piel, nervios, hngado, hueso y/o dientes.According to the present invention, each cell sample is or originates from a tissue biopsy of a human or animal subject. Examples of animal subjects from which tissue biopsy can be taken are preferably pigs, cows and goat. Tissue biopsy is preferably taken from, but not limited to, one or more of the following tissues: muscle, fat, cartilage, skin, nerves, liver, bone and / or teeth.
En el presente contexto, la expresion "biopsia de tejido" pretende ser una biopsia tomada de cualquier tejido en el cuerpo eliminando directamente la muestra deseada y anadiendo la muestra directamente al biorreactor. Preferentemente, la biopsia de tejido puede ser picada, degradada enzimaticamente, tratada o enriquecida antes de anadirla al biorreactor.In the present context, the expression "tissue biopsy" is intended to be a biopsy taken from any tissue in the body by directly removing the desired sample and adding the sample directly to the bioreactor. Preferably, the tissue biopsy can be chopped, enzymatically degraded, treated or enriched before adding it to the bioreactor.
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En el presente contexto, la expresion "muestra de celulas de origen humano o animal" pretende significar una muestra de celulas tomada de un ser humano o animal. Las celulas que van a cultivarse podnan ser espedficas para diana para, por ejemplo, un articulacion, cartflago elastico en la oreja, nervios, musculos abductores de la cadera, tendones de la fascia lata, piel de la parte superior del brazo y celulas mesenquimatosas de la cresta ilfaca, etc.In the present context, the expression "sample of cells of human or animal origin" is intended to mean a sample of cells taken from a human or animal being. The cells to be cultured may be specific for the target for, for example, an articulation, elastic cartilage in the ear, nerves, abductor muscles of the hip, tendons of the fascia lata, skin of the upper arm and mesenchymal cells of the illustrious crest, etc.
En el presente contexto, la expresion "una o varias muestras de celulas diferentes" significa que puede usarse una muestra de celulas espedfica de un cierto tejido en la etapa de cultivo celular posterior. Tambien puede usarse mas de una muestra de celulas, es decir, dos o mas muestras de celulas de tejidos diferentes, por ejemplo una muestra de celulas de musculo y una muestra de celulas de cartflago, etc., pero solo en situaciones espedficas o cuando los tejidos diferentes tengan efectos estimulantes adicionales.In the present context, the expression "one or several different cell samples" means that a specific cell sample of a certain tissue can be used in the subsequent cell culture stage. More than one sample of cells can also be used, that is, two or more samples of cells from different tissues, for example a sample of muscle cells and a sample of cartilage cells, etc., but only in specific situations or when Different tissues have additional stimulating effects.
En el presente contexto, la palabra "biorreactor" pretender ser un biorreactor convencional disponible para cultivar celulas. Un experto en la materia puede seleccionar facilmente un reactor conocido que va a usarse en el metodo de la invencion.In the present context, the word "bioreactor" pretends to be a conventional bioreactor available to grow cells. A person skilled in the art can easily select a known reactor to be used in the method of the invention.
En una realizacion, se hace uso de un biorreactor con dos o mas camaras interconectadas separadas por un filtro millipore que permite que los componentes nativos producidos, tales como factores de crecimiento y protemas de la matriz extracelular (ECM), difundan en la segunda camara o tercera camara, etc. A intervalos predeterminados, se extrae el medio de cultivo y los componentes nativos se separan y se liofilizan bajo condiciones esteriles.In one embodiment, a bioreactor is used with two or more interconnected chambers separated by a millipore filter that allows the native components produced, such as growth factors and extracellular matrix (ECM) protections, to diffuse into the second chamber or third camera, etc. At predetermined intervals, the culture medium is removed and the native components are separated and lyophilized under sterile conditions.
Los componentes nativos producidos pueden esterilizarse usando una cualquiera de varias tecnicas de esterilizacion, por ejemplo por radiacion p o y a al menos 1,2 MRad; por filtracion esteril, en la que el proceso completo incluyendo la liofilizacion y el envasado se realizan en un banco esteril; o usando gasificacion con oxido de etileno (OE). Durante la operacion de gasificacion del envase, por ejemplo una bolsa, en la que se pone el producto medico tratado para el almacenamiento despues de la liofilizacion, tiene que desgasificarse durante varias semanas, normalmente aproximadamente 4-6 semanas, en la que el oxido de etileno dentro del envase se fuga lentamente de las paredes del envase.The native components produced can be sterilized using any one of several sterilization techniques, for example by radiation p and at at least 1.2 MRad; by sterile filtration, in which the complete process including lyophilization and packaging are carried out in a sterile bank; or using gasification with ethylene oxide (OE). During the gasification operation of the container, for example a bag, in which the treated medical product is placed for storage after lyophilization, it has to be degassed for several weeks, usually approximately 4-6 weeks, in which the oxide of Ethylene inside the container leaks slowly from the walls of the container.
En el presente contexto, la expresion "medio de cultivo" debe distinguirse de "medio nutritivo". El medio nutritivo es el medio fresco con todos los nutrientes necesarios requeridos para el crecimiento de las celulas, antes de que se hayan anadido las celulas. Una vez se han anadido las celulas al medio nutritivo, el medio se considerara un medio de cultivo con las celulas incluidas, ademas de los componentes nativos producidos durante el cultivo celular. Cuando se extrae el medio de cultivo que incluye los componentes nativos, las celulas normalmente no estan presentes en el medio de cultivo, ya que ya han sido separadas del medio de cultivo en el biorreactor con las dos camaras interconectadas. Sin embargo, es posible que partes de las celulas y un pequeno numero de celulas esten incluidos en el medio de cultivo despues de la filtracion. Alternativamente, en otra realizacion, las celulas estan incluidas en el medio de cultivo cuando se extraen del biorreactor y a partir de aqrn se separan del medio de cultivo por cualquier medio convencional.In the present context, the expression "culture medium" must be distinguished from "nutritive medium". The nutrient medium is the fresh medium with all the necessary nutrients required for cell growth, before the cells have been added. Once the cells have been added to the nutrient medium, the medium will be considered a culture medium with the cells included, in addition to the native components produced during cell culture. When the culture medium that includes the native components is removed, the cells are normally not present in the culture medium, since they have already been separated from the culture medium in the bioreactor with the two interconnected chambers. However, it is possible that parts of the cells and a small number of cells are included in the culture medium after filtration. Alternatively, in another embodiment, the cells are included in the culture medium when they are removed from the bioreactor and from here they are separated from the culture medium by any conventional means.
En el presente contexto, la expresion "medio nutritivo" significa un medio nutritivo como se usa en su contexto convencional, es decir, un medio tal como DMEM o medios de crecimiento espedficos adecuados para diferentes celulas y lmeas celulares, que permite el crecimiento de celulas y para la produccion de los componentes nativos. El medio nutritivo debe proporcionar ciertas condiciones, tales como hormonas o factores de crecimiento que normalmente se producen in vivo. La eleccion del medio nutritivo depende de la direccion deseada de crecimiento celular y las celulas usadas. Sustancias que pueden estar presentes en el medio nutritivo son factores de crecimiento, nutrientes tales como glucosa u otros azucares segun se necesite. Otras sustancias que pueden incluirse en el medio nutritivo son, por ejemplo, antibioticos.In the present context, the expression "nutritive medium" means a nutritive medium as used in its conventional context, that is, a medium such as DMEM or specific growth media suitable for different cells and cell lines, which allows cell growth. and for the production of native components. The nutrient medium must provide certain conditions, such as hormones or growth factors that normally occur in vivo. The choice of the nutrient medium depends on the desired direction of cell growth and the cells used. Substances that may be present in the nutrient medium are growth factors, nutrients such as glucose or other sugars as needed. Other substances that may be included in the nutritive medium are, for example, antibiotics.
En el presente contexto, la expresion "condiciones normales" se usa para definir el entorno en el que las celulas proliferan y permanecen viables en el mismo o esencialmente el mismo modo que en su entorno natural tal como en el cuerpo humano o animal. Un experto en la materia esta familiarizado con lo que se indica por condiciones normales y es capaz de fijarlas durante el cultivo. En otra realizacion, la muestra de celulas es una lmea celular espedfica. La lmea celular puede estar comercialmente disponible. Cualquier lmea celular conocida que este comercialmente disponible puede usarse segun la invencion y un experto en la materia puede seleccionar facilmente cualquier lmea celular adecuada para producir los componentes nativos segun se requiera por la aplicacion definitiva. La ventaja de uso de una lmea celular comercialmente disponible es que los muchos componentes nativos diferentes de origen diferente pueden producirse y guardarse. Por ejemplo, cuando un paciente necesita sustitucion o reparacion de tejido inmediata debido a tejido danado o perdido, tal como infarto cardfaco o hemorragia cerebral, los componentes nativos guardados producidos por las lmeas celulares comercialmente disponibles pueden usarse directamente inyectando la composicion medica que comprende los componentes nativos con el vehmulo deseado, si se necesita. En algunos casos, el acceso inmediato a los componentes nativos y el vehmulo se requiere dentro de los primeros dfas o semanas tras una emergencia o lesion aguda. Hoy en dfa hay lmeas celulares comerciales que podnan usarse para la extraccion repetitiva de los componentes nativos, proporcionandolos asf instantaneamente en situaciones de emergencia. Podnan usarse marcadores espedficos, tales como TGF-beta y IGF-1 y protemas de la matriz extracelular, como protemas marcadoras para establecer la concentracion. En estos casos, los componentesIn the present context, the expression "normal conditions" is used to define the environment in which cells proliferate and remain viable in the same or essentially the same way as in their natural environment such as in the human or animal body. A person skilled in the art is familiar with what is indicated by normal conditions and is able to fix them during cultivation. In another embodiment, the cell sample is a specific cell line. The cell line may be commercially available. Any known cell line that is commercially available can be used according to the invention and one skilled in the art can easily select any suitable cell line to produce the native components as required by the definitive application. The advantage of using a commercially available cell line is that the many different native components of different origin can be produced and stored. For example, when a patient needs immediate tissue replacement or repair due to damaged or lost tissue, such as heart attack or brain hemorrhage, the saved native components produced by commercially available cell lines can be used directly by injecting the medical composition comprising the components. natives with the desired vehicle, if needed. In some cases, immediate access to the native components and the vehicle is required within the first few days or weeks after an emergency or acute injury. Today there are commercial cell lines that can be used for the repetitive extraction of native components, providing them instantly in emergency situations. Specific markers, such as TGF-beta and IGF-1 and extracellular matrix proteins, may be used as marker proteins to establish concentration. In these cases, the components
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nativos son de un tipo aloinjerto, es dedr, no los propios componentes nativos del paciente.natives are of an allograft type, that is, not the patient's own native components.
En el presente contexto, la expresion "componentes nativos" pretende comprender todos los factores de crecimiento, todas las protemas de la matriz extracelular (ECM) y todas las sustancias adicionales que se producen por las celulas en su entorno natural que incluyen polfmeros nativos y otras protemas. En el presente contexto, exactamente los mismos componentes se producen en un biorreactor como en el entorno natural de la celula espedfica. Dependiendo de los tejidos de los que se toman las celulas para el cultivo, hay probablemente cientos de diferentes protemas, biopolfmeros, y otras sustancias y moleculas, que se producen. Las protemas de la matriz extracelular son, por ejemplo, pero no se limitan a, fibronectina, vitronectina, condroadherina y agrecanos.In the present context, the expression "native components" is intended to include all growth factors, all extracellular matrix (ECM) proteins and all additional substances that are produced by cells in their natural environment that include native and other polymers. Protect In the present context, exactly the same components are produced in a bioreactor as in the natural environment of the specific cell. Depending on the tissues from which the cells are taken for culture, there are probably hundreds of different proteins, biopolymers, and other substances and molecules, which are produced. Proteins of the extracellular matrix are, for example, but not limited to, fibronectin, vitronectin, condroadherin and aggrecans.
En una realizacion, es de interes producir y aislar solo factores de crecimiento y protemas de la matriz extracelular (ECM). La combinacion de estos tambien se llama GECM (factores de crecimiento y protemas de la matriz extracelular). Estos son los mas importantes de los componentes nativos, ya que proporcionan un equilibrio optimo entre la regulacion por disminucion y la regulacion por incremento del proceso de regeneracion de tejido en el que van a implicarse. Sin embargo, en la practica, todas las moleculas definidas por la expresion "componentes nativos" estan automaticamente presentes en la mezcla o combinacion obtenida y son eficaces para el posterior proceso de regeneracion dentro del cuerpo, aunque tambien se obtienen resultados altamente satisfactorios con solo la mezcla de GECM.In one embodiment, it is of interest to produce and isolate only growth factors and proteins from the extracellular matrix (ECM). The combination of these is also called GECM (growth factors and extracellular matrix proteins). These are the most important of the native components, since they provide an optimal balance between the regulation by decrease and the regulation by increase of the tissue regeneration process in which they will be involved. However, in practice, all molecules defined by the expression "native components" are automatically present in the mixture or combination obtained and are effective for the subsequent regeneration process within the body, although highly satisfactory results are also obtained with only the GECM mix.
Una realizacion adicional de la invencion es proporcionar un vehmulo, que retiene componentes nativos tales como GECM y los libera lentamente durante un periodo de tiempo prolongado (es decir, dfas, semanas o meses) y que produce la composicion medica que incluye los componentes nativos y el vehmulo inyectable en el cuerpo humano y animal. Como se ha establecido antes, el vehmulo se selecciona segun la aplicacion definitiva, es decir, el organo o sitio en el cuerpo donde va a inyectarse el vehmulo.A further embodiment of the invention is to provide a vehicle, which retains native components such as GECM and slowly releases them for a prolonged period of time (i.e., days, weeks or months) and that produces the medical composition that includes the native components and the injectable vehicle in the human and animal body. As stated above, the vehicle is selected according to the definitive application, that is, the organ or site in the body where the vehicle is to be injected.
En el presente contexto, el termino "nativo" significa que los componentes nativos, de los que varios son proteinaceos, estan en su estado no desnaturalizado. Asf, se permite cualquier modificacion qmmica del componente en tanto que se retenga la actividad biologica.In the present context, the term "native" means that the native components, of which several are proteinaceous, are in their undenatured state. Thus, any chemical modification of the component is allowed as long as the biological activity is retained.
Ejemplos de componentes proteinaceos son una hormona paratiroidea, una prostaglandina (por ejemplo, PGE2), una osteoprotegrina (OPG), activador de Indian hedgehog, un ligando de NF-kappa B (RANKL), un esteroide sexual y una citocina.Examples of proteinaceous components are a parathyroid hormone, a prostaglandin (for example, PGE2), an osteoprotegrin (OPG), activator of Indian hedgehog, an NF-kappa B ligand (RANKL), a sex steroid and a cytokine.
Un factor de crecimiento es, en el presente contexto, un termino general para peptidos o protemas espedficos, que son liberados por ciertas celulas y se unen a sitios de receptor de la membrana celular espedficos para influir en que las celulas se dividan. Por ejemplo, los condrocitos producen varios factores de crecimiento, que incluyen, por ejemplo, factor de crecimiento transformante (TGF-p3), protema morfogenica osea (BMP-2), PTHrP, osteoprotegrina (OPG), activador de Indian hedgehog, RANKL, factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) y factor de crecimiento similar a la insulina (IgF). El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es una glucoprotema que estimula la proliferacion celular y la quimiotaxia en cartflago, hueso, y muchos otrostipos de celulas despues de ser producido por celulas mesenquimatosas. Asimismo, el factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) se produce localmente en hueso durante la fase inicial de la consolidacion de fracturas y se sabe que estimula las celulas formadoras de cartflago y de hueso.A growth factor is, in the present context, a general term for specific peptides or proteins, which are released by certain cells and bind to specific cell membrane receptor sites to influence the cells to divide. For example, chondrocytes produce several growth factors, including, for example, transforming growth factor (TGF-p3), bone morphogenetic protein (BMP-2), PTHrP, osteoprotegrin (OPG), Indian hedgehog activator, RANKL, Basic fibroblast growth factor (bFGF) and insulin-like growth factor (IgF). Platelet-derived growth factor (PDGF) is a glycoprotem that stimulates cell proliferation and chemotaxis in cartilage, bone, and many other types of cells after being produced by mesenchymal cells. Likewise, the basic fibroblast growth factor (bFGF) is produced locally in bone during the initial phase of fracture consolidation and is known to stimulate cartilage and bone-forming cells.
La superfamilia de factores de crecimiento transformantes (TGFs) es el factor de crecimiento mas ampliamente estudiado en el campo de la biologfa osea. Comprende una familia entera de sustancias que incluye las protemas morfogeneticas oseas (BMP). Estas son sustancias de senalizacion celula-celula importantes, que inducen la formacion de cartflago y hueso, ademas de promover la diferenciacion de celulas precursoras osteogenicas en osteoblastos. Debe observarse que formas puras de BMP, algunas producidas por ingeniena genetica, son no inmunogenicas y no espedficas de especie.The transforming growth factor superfamily (TGFs) is the most widely studied growth factor in the field of bone biology. It comprises an entire family of substances that includes bone morphogenetic proteins (BMP). These are important cell-cell signaling substances, which induce the formation of cartilage and bone, in addition to promoting the differentiation of osteogenic precursor cells in osteoblasts. It should be noted that pure forms of BMP, some produced by genetic engineering, are non-immunogenic and non-species specific.
El factor de crecimiento tambien puede ser un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) o un factor de crecimiento endotelial vascular.The growth factor can also be a fibroblast growth factor (FGF) or a vascular endothelial growth factor.
Una mezcla de factores de crecimiento autologos, que se deriva de la capa leucodtica de celulas recogidas durante la cirugfa, se produce por Interpore Cross International Inc., Irvine, EE.UU. Se dice que estos leucocitos son especialmente ricos en TGF-p y PDGF. Una mezcla de factores de crecimiento de un extracto de protema morfogenetica osea derivada de bovino tambien se produce por NeOsteo, Intermedics Orthopaedics, Denver, EE.UU.A mixture of autologous growth factors, which is derived from the leukodotic layer of cells collected during surgery, is produced by Interpore Cross International Inc., Irvine, USA. It is said that these leukocytes are especially rich in TGF-p and PDGF. A mixture of growth factors of a bovine-derived bone morphogenetic protein extract is also produced by NeOsteo, Intermedics Orthopedics, Denver, USA.
Las cantidades de diferentes componentes en la composicion medica dependen de la celula y el origen de tejido de los componentes nativos producidos, ademas de la aplicacion final prevista, es decir, el tipo de tejido u organo que va a repararse.The amounts of different components in the medical composition depend on the cell and the tissue origin of the native components produced, in addition to the intended final application, that is, the type of tissue or organ to be repaired.
Normalmente, la proporcion entre los componentes nativos y el vehmulo en la composicion medica final es aproximadamente 1:10 basado en partes en peso, pero esta proporcion puede variar algo.Normally, the ratio between the native components and the vehicle in the final medical composition is approximately 1:10 based on parts by weight, but this ratio may vary somewhat.
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Preferentemente, las celulas de origen humano se usan como "fabricas" para producir los componentes nativos. Una mezcla adecuada o combinacion de factores de crecimiento, obtenida de condrocitos cultivados, puede tener hasta, por ejemplo, 100 kDa de tamano o mas, tal como entre aproximadamente 70 kDa y 10 kDa, preferentemente entre aproximadamente 60 kDa y 20 kDa, mas preferentemente entre 50 kDa y 30 kDa. El tamano de los componentes no esta naturalmente limitado a los anteriores, ya que estos son solo a modo de ejemplo.Preferably, cells of human origin are used as "factories" to produce the native components. A suitable mixture or combination of growth factors, obtained from cultured chondrocytes, may have up to, for example, 100 kDa in size or more, such as between about 70 kDa and 10 kDa, preferably between about 60 kDa and 20 kDa, more preferably between 50 kDa and 30 kDa. The size of the components is not naturally limited to the previous ones, since these are only by way of example.
Las expresiones "mezcla de componentes nativos" y "combinacion de componentes nativos" usadas en el presente documento pretenden significar un conjunto de todos o una parte de los componentes nativos como se han definido anteriormente producidos a partir de una cierta celula, lmea celular o tejido, es decir, todos los componentes producidos en su entorno natural. Si se desea, algunos de dichos componentes nativos podnan eliminarse del medio despues de cultivar en vista de mantener solo el componente nativo mas importante para la aplicacion posterior, por ejemplo factores de crecimiento y protemas de la matriz extracelular (GECM). Como se ha establecido anteriormente, los componentes nativos que se originan de diferentes celulas, lmeas celulares y tejidos pueden estar presentes en la misma mezcla o combinacion de componentes nativos. Tales mezclas tambien pretenden entrar dentro del alcance de la expresion "mezcla o combinacion de componentes nativos".The terms "mixture of native components" and "combination of native components" used herein are intended to mean a set of all or a part of the native components as defined above produced from a certain cell, cell line or tissue. , that is, all the components produced in their natural environment. If desired, some of said native components may be removed from the medium after cultivation in order to maintain only the most important native component for subsequent application, for example growth factors and extracellular matrix protections (GECM). As stated above, native components that originate from different cells, cell lines and tissues may be present in the same mixture or combination of native components. Such mixtures are also intended to fall within the scope of the expression "mixture or combination of native components".
En una realizacion de la invencion, el cultivo de las celulas se lleva a cabo bajo condiciones rotatorias. La rotacion produce un mejor flujo nutricional, que hace que las celulas proliferen y produzcan GECM. La rotacion puede implementarse por cualquier medio de rotacion convencional usado en el cultivo celular convencional. En ciertas realizaciones, la rotacion puede naturalmente excluirse. Es ademas adecuado, pero no necesario, que una matriz tridimensional este presente bajo el cultivo celular con el fin de aumentar la produccion de los componentes nativos. Es beneficioso si la matriz es esferica, por ejemplo perlas de almidon, que tienen un sistema de poros interconectados para el flujo nutricional dinamico. La matriz puede elegirse de, pero no se limita a, perlas, perlas de almidon, perlas de polfmero y perlas de alginato, colageno, acido hialuronico y quitosano. Cualquier matriz conocida tal como las matrices tridimensionales que son adecuadas para su uso en el cultivo de las celulas puede usarse naturalmente segun la invencion. Un experto en la materia se da cuenta de que tipo de matrices pueden usarse para el crecimiento beneficioso.In one embodiment of the invention, cell culture is carried out under rotational conditions. Rotation produces a better nutritional flow, which causes cells to proliferate and produce GECM. The rotation can be implemented by any conventional rotation means used in conventional cell culture. In certain embodiments, rotation can of course be excluded. It is also suitable, but not necessary, for a three-dimensional matrix to be present under cell culture in order to increase the production of the native components. It is beneficial if the matrix is spherical, for example starch pearls, which have an interconnected pore system for dynamic nutritional flow. The matrix can be chosen from, but not limited to, pearls, starch beads, polymer beads and alginate beads, collagen, hyaluronic acid and chitosan. Any known matrix such as three-dimensional matrices that are suitable for use in cell culture can naturally be used according to the invention. One skilled in the art realizes what kind of matrices can be used for beneficial growth.
En una realizacion de la invencion, la extraccion del medio de cultivo que incluye componentes nativos tiene lugar continuamente y el medio de cultivo extrafdo se sustituye por medio nutritivo nuevo. En una realizacion, pueden usarse dos camaras interconectadas separadas por un filtro millipore para el cultivo celular, que permite que los componentes nativos, por ejemplo factores de crecimiento y moleculas de protemas ECM, difundan en la segunda camara. A intervalos predeterminados, los medios de cultivo podnan extraerse y los componentes nativos separarse y liofilizarse bajo condiciones esteriles, vease la Fig. 1. El cultivo celular se lleva a cabo durante al menos 7 semanas, preferentemente al menos 5 semanas, mas preferentemente al menos 3 semanas, y lo mas preferentemente al menos 1 semana, o menos, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 dfas, antes de realizar la etapa de extraccion.In one embodiment of the invention, the extraction of the culture medium that includes native components takes place continuously and the extracted culture medium is replaced by new nutrient medium. In one embodiment, two interconnected cameras separated by a millipore filter can be used for cell culture, which allows native components, for example growth factors and ECM protein molecules, to diffuse in the second chamber. At predetermined intervals, the culture media can be extracted and the native components separated and lyophilized under sterile conditions, see Fig. 1. Cell culture is carried out for at least 7 weeks, preferably at least 5 weeks, more preferably at least 3 weeks, and most preferably at least 1 week, or less, for example 1, 2, 3, 4, 5 or 6 days, before performing the extraction stage.
En una realizacion de la invencion, los componentes nativos producidos se separan del medio de cultivo por su tamano o peso o por afinidad, por ejemplo por centrifugacion o se separan en una columna.In one embodiment of the invention, the native components produced are separated from the culture medium by their size or weight or by affinity, for example by centrifugation or separated on a column.
Despues de la separacion, los componentes nativos individuales separados pueden combinarse en una mezcla o combinacion antes de la liofilizacion, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, cada uno de los componentes nativos separados se enriquece adicionalmente antes de la liofilizacion. Despues de la liofilizacion, la mezcla o combinacion liofilizada puede almacenarse en una bolsa hasta uso. Como se ha establecido anteriormente, tambien es posible enriquecer cualquiera de los componentes separados, combinarlos en una combinacion y entonces liofilizar los mismos. Asf, es posible obtener uno o mas componentes nativos de biopsias de diferente origen (es decir, de diferentes tejidos) y entonces combinar los componentes obtenidos despues de cultivar en una combinacion novedosa y entonces opcionalmente liofilizar la combinacion.After separation, the separated individual native components may be combined in a mixture or combination before lyophilization, as described above. Alternatively, each of the separated native components is further enriched before lyophilization. After lyophilization, the lyophilized mixture or combination can be stored in a bag until use. As stated above, it is also possible to enrich any of the separate components, combine them in a combination and then lyophilize them. Thus, it is possible to obtain one or more native biopsy components of different origin (ie, from different tissues) and then combine the components obtained after culturing in a novel combination and then optionally lyophilize the combination.
Segun la presente invencion, se anade un vehmulo a los componentes nativos separados antes o despues de la liofilizacion. En otra realizacion, la liofilizacion no es necesaria, por ejemplo en situaciones agudas en las que una inyeccion va a prepararse inmediatamente. Asf, depende de la aplicacion definitiva si un vehmulo va a incluirse o no antes de la liofilizacion. El vehmulo tiene que ser inyectable en el cuerpo humano y animal cuando se mezcla con los componentes nativos, y se elige en vista de la aplicacion definitiva, de otro modo el cuerpo del paciente humano o animal podna tener dificultades en aceptar el producto de vehmulo de componente nativo. El termino "inyectable" usado en el presente documento significa que la composicion medica, es decir, la mezcla de componentes nativos y el vehmulo, y cualquier componente auxiliar farmaceuticamente aceptable adicional, por ejemplo antibioticos y componentes de mejora de la reologfa necesarios, que van a introducirse en el cuerpo humano o animal, pueden inyectarse en el cuerpo mediante una aguja o tubo que tiene un diametro interno de 0,2-6 mm, preferentemente 0,42 mm. Esto significa que parametros tales como la viscosidad y el tamano de material de vehmulo de la composicion medica segun la presente invencion debe optimizarse para cumplir este fin, que es familiar para un experto en la materia. Ciertos vehuculos son solo adecuados para ciertas aplicaciones, que es obvio para un experto en la materia. El vehmulo debe, por supuesto, ser aceptable por el cuerpo humano y animal y se elige del grupo que consiste en polfmeros naturales o sinteticos, y materiales ceramicos que son muy conocidos en la tecnica por ser inyectables. El vehmulo puede elegirse de acido hialuronico, cola de fibrina, quitosano, dextrano, colageno, alginato y biopolfmerosAccording to the present invention, a vehicle is added to the separated native components before or after lyophilization. In another embodiment, lyophilization is not necessary, for example in acute situations in which an injection is to be prepared immediately. Thus, it depends on the definitive application if a vehicle is to be included or not before lyophilization. The vehicle has to be injectable in the human and animal body when mixed with the native components, and it is chosen in view of the definitive application, otherwise the body of the human or animal patient may have difficulty in accepting the vehicle product of native component The term "injectable" used herein means that the medical composition, that is, the mixture of native components and the vehicle, and any additional pharmaceutically acceptable auxiliary components, for example antibiotics and necessary rheology improvement components, which are to be introduced into the human or animal body, they can be injected into the body by a needle or tube having an internal diameter of 0.2-6 mm, preferably 0.42 mm. This means that parameters such as the viscosity and the size of the vehicle material of the medical composition according to the present invention should be optimized to accomplish this purpose, which is familiar to a person skilled in the art. Certain vehicles are only suitable for certain applications, which is obvious to a person skilled in the art. The vehicle must, of course, be acceptable to the human and animal body and is chosen from the group consisting of natural or synthetic polymers, and ceramic materials that are well known in the art for being injectable. The vehicle can be chosen from hyaluronic acid, fibrin glue, chitosan, dextran, collagen, alginate and biopolymers
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de diferentes materiales que tienen diferentes modulos de elasticidad. El biopoKmero de diferentes materiales que tienen diferentes modulos de elasticidad puede prepararse soldando/uniendo juntos dos materiales diferentes, por ejemplo un metal y un plastico, o un material polimerico natural y sintetico. Otros materiales que pueden usarse en este biopolfmero son, por ejemplo, cualquier material organico e inorganico. Tambien es posible que el biopolfmero sea un biopolfmero con un gradiente de elasticidad dentro del mismo material.of different materials that have different moduli of elasticity. The biopoimer of different materials having different moduli of elasticity can be prepared by welding / joining together two different materials, for example a metal and a plastic, or a natural and synthetic polymeric material. Other materials that can be used in this biopolymer are, for example, any organic and inorganic material. It is also possible that the biopolymer is a biopolymer with a gradient of elasticity within the same material.
En una realizacion de la invencion se preparara el desarrollo de modificaciones de polfmeros naturales, polfmeros sinteticos y/o materiales ceramicos con diferentes propiedades elasticas y viscoelasticas, vease la Fig. 2. Los vehmulos podnan ser empapados o pre-cargados o fabricados con componentes nativos preparados tales como GECM y/o combinarse con otros factores tales como bisfosfonatos o antibioticos y con el tiempo combinarse con la administracion sistemica de factores estimulantes de colonias o farmacos para potenciar el reclutamiento de celulas progenitoras circulantes y protemas de union a celula.In one embodiment of the invention, the development of modifications of natural polymers, synthetic polymers and / or ceramic materials with different elastic and viscoelastic properties will be prepared, see Fig. 2. The vehicles may be soaked or pre-loaded or manufactured with native components. preparations such as GECM and / or combined with other factors such as bisphosphonates or antibiotics and over time combined with the systematic administration of colony stimulating factors or drugs to enhance the recruitment of circulating progenitor cells and cell binding proteins.
El (Los) componente(s) nativo(s) producido(s) segun el metodo de la invencion son de un caracter de autoinjerto o aloinjerto o ambos. Se realizan las ventajas de los autoinjertos para un paciente, ya que estos son los componentes nativos propios de los pacientes que se usan, por lo que se evita, por ejemplo, el rechazo. Otros problemas que se evitan son infecciones debido a diferentes virus que se transfieren al huesped, aunque se esterilice el implante transferido. Asf, pueden evitarse infecciones por virus tales como el VIH e infecciones producidas por priones o cualquier otra especie cuando el implante es un tipo de autoinjerto.The native component (s) produced according to the method of the invention are of an autograft or allograft character or both. The advantages of autografts are realized for a patient, since these are the native components of the patients used, so that rejection is avoided, for example. Other problems that are avoided are infections due to different viruses that are transferred to the host, even if the transferred implant is sterilized. Thus, virus infections such as HIV and infections caused by prions or any other species can be avoided when the implant is a type of autograft.
La reparacion de tejido podna tener lugar, por ejemplo, en articulaciones, partes vasculares, musculos, tendones, la medula espinal, nervios, tejido oseo, tejido adiposo, corazon, cerebro y organos endocrinos. Se preve que los componentes nativos espedficos preparados puedan inyectarse a vehmulos biologicos como acido hialuronico que va a usarse para lesiones de articulaciones, cola de fibrina para lesiones del tendon de Aquiles, fosfato de a-tricalcio bi-fasico (sustituto oseo inyectable) para fracturas vertebrales y fusion espinal, dextrano para lesiones de la medula espinal, etc., a condicion de que el vehmulo se haya implantado de antemano en el sitio del proceso de reparacion de tejido. Otras areas donde los componentes nativos podnan usarse son accidente cerebrovascular, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer usando vehmulos biologicos comprobados disponibles.Tissue repair may take place, for example, in joints, vascular parts, muscles, tendons, spinal cord, nerves, bone tissue, adipose tissue, heart, brain and endocrine organs. It is envisioned that the specific native components prepared can be injected into biological vehicles such as hyaluronic acid to be used for joint injuries, fibrin glue for Achilles tendon lesions, bi-fasic a-tricalcium phosphate (injectable bone substitute) for fractures vertebral and spinal fusion, dextran for spinal cord injuries, etc., provided that the vehicle has been implanted beforehand at the site of the tissue repair process. Other areas where native components may be used are stroke, Parkinson's disease and Alzheimer's disease using available proven biological vehicles.
EjemplosExamples
Se han realizado estudios preliminares (veanse los detalles a continuacion) con condrocitos como muestras de celulas tomadas de seis rodillas humanas en cirugfa, se cultivaron en un biorreactor con los medios de cultivo obtenidos y la GECM producida se separo de las celulas a las 3 semanas. Se incorporaron tres concentraciones diferentes de la combinacion de GECM en un material inyectable y se implantaron en musculo abdominal de rata. Se uso un sustituto de hueso ceramico bifasico como vehmulo, y las mediciones con TGF-beta e IGF-1 como marcadores mostraron una clara curva de respuesta a dosis. Podna demostrarse crecimiento hacia adentro vascular y nuevo hueso en el material sintetico en un musculo. Esto es solo posible por el reclutamiento de celulas madre de celulas progenitoras circulantes o locales - que diferenciaron celulas de musculo en hueso.Preliminary studies have been carried out (see details below) with chondrocytes as samples of cells taken from six human knees in surgery, grown in a bioreactor with the culture media obtained and the GECM produced separated from the cells at 3 weeks . Three different concentrations of the GECM combination were incorporated into an injectable material and implanted in rat abdominal muscle. A biphasic ceramic bone substitute was used as a vehicle, and measurements with TGF-beta and IGF-1 as markers showed a clear dose response curve. Vascular inward growth and new bone in the synthetic material in a muscle could be demonstrated. This is only possible by recruiting stem cells from circulating or local progenitor cells - which differentiated muscle cells into bone.
En otro estudio (veanse los detalles a continuacion), los presentes inventores han probado si un tipo de ECM, condroadherina, una protema de cartflago no colagenoso con propiedades de union a celula, podna usarse en el mismo sustituto de hueso bifasico ceramico para inducir hueso.In another study (see details below), the present inventors have tested whether a type of ECM, condroadherin, a non-collagenous cartilage protein with cell binding properties, could be used in the same biphasic ceramic bone substitute to induce bone .
Se ha llegado a la conclusion temprana que la condroadherina puede desempenar una funcion en mantener las celulas de hueso sobre matrices de colageno. Los presentes inventores usaron un sustrato de hueso de fosfato de a-tricalcio y sulfato de calcio en un modelo animal de conejo con una camara de recogida de hueso bien descrita. Se estudio la farmacocinetica, que muestra una liberacion significativa de condroadherina y aumento durante las dos primeras dos semanas. Sin embargo, no fue posible mostrar ningun aumento significativo en hueso nuevo tanto como aposicion como crecimiento en el material. Mirando la actividad espedfica que cuenta, por ejemplo, el numero de osteoclastos sobre el material otra vez, no se mostro diferencia con el sustituto de hueso simple.It has been concluded early that chondroadherin can play a role in maintaining bone cells on collagen matrices. The present inventors used an a-tricalcium phosphate and calcium sulfate bone substrate in a rabbit animal model with a well-described bone collection chamber. Pharmacokinetics were studied, which shows a significant release of condroadherin and increased during the first two weeks. However, it was not possible to show any significant increase in new bone as much as apposition as growth in the material. Looking at the specific activity that counts, for example, the number of osteoclasts on the material again, no difference was shown with the simple bone substitute.
Podna especularse que un vehmulo diferente o ECM marcana la diferencia. Sin embargo, es mas probable que tanto la concentracion de condroadherina fuera demasiado baja para mostrar cualquier efecto o que una combinacion de protemas de la matriz extracelular y factores de crecimiento fuera necesaria para aumentar significativamente el reclutamiento de celulas progenitoras circulantes o locales para transformar e inducir hueso.It could be speculated that a different vehicle or ECM makes a difference. However, it is more likely that both the concentration of condroadherin was too low to show any effect or that a combination of extracellular matrix proteins and growth factors was necessary to significantly increase the recruitment of circulating or local progenitor cells to transform and induce bone.
Descripcion detallada del experimento preliminar 1Detailed description of the preliminary experiment 1
Mezcla de factores de crecimientoMixture of growth factors
Se produjo una combinacion de condrocitos de factores de crecimiento autologos (AGFCC) a partir de celulas de carrtlago humano cultivado ex vivo. Durante el examen artroscopico, el cirujano tomo una biopsia del area que no porta peso de la parte proximal del condilo medial o lateral. La esquirla de cartflago tuvo 8 a 10 mm de largo y se extendio hacia la placa de hueso subcondral. La biopsia contuvo aproximadamente 200-300 mg de cartflago. El material de biopsia se coloco inmediatamente en el medio nutritivo y se remitio a un laboratorio de celulas y se pusoA combination of autologous growth factor chondrocytes (AGFCC) was produced from human cartilage cells cultured ex vivo. During the arthroscopic examination, the surgeon took a biopsy of the area that does not carry weight of the proximal part of the medial or lateral condyle. The cartilage splinter was 8 to 10 mm long and extended to the subchondral bone plate. The biopsy contained approximately 200-300 mg of cartflage. The biopsy material was immediately placed in the nutrient medium and sent to a cell laboratory and placed
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en una solucion de nutriente especial (DMEM F-12).in a special nutrient solution (DMEM F-12).
Produccion de mezcla de factores de crecimientoProduction of mixture of growth factors
El medio nutritivo de celulas consistio en DMEM F-12. Las celulas se cultivaron en un medio durante aproximadamente 2 semanas, donde despues se recogio el medio de cultivo y se guardo como una porcion 100 x. TGF-p e IGF-1 sirvieron como protemas marcadoras para establecer la concentracion de la combinacion de factores de crecimiento. La cantidad de TGF-p en la concentracion mas alta del medio fue aproximadamente 50-300 ng/ml y la de IGF-1 fue aproximadamente 100-300 ng/ml. Las combinaciones se produjeron de 7 pacientes.The nutrient medium of cells consisted of DMEM F-12. The cells were grown in a medium for about 2 weeks, where the culture medium was then collected and stored as a 100 x portion. TGF-p and IGF-1 served as marker proteins to establish the concentration of the growth factor combination. The amount of TGF-p in the highest concentration of the medium was approximately 50-300 ng / ml and that of IGF-1 was approximately 100-300 ng / ml. The combinations occurred from 7 patients.
Mezcla de sustituto de huesoBone substitute mix
Se mezclo el a-TCP con 20 % de CaS con las combinaciones respectivas, la combinacion de alta concentracion (100 veces) se diluyo 10 veces y 100 veces con 1 % de BSA-PBS. Con las concentraciones, los materiales se dividieron por IBS-GF1 (concentracion alta), IBS-GF3 (concentracion baja). Despues de mezclar el material se inyecto en un molde (5 mm de diametro x 4 mm de espesor) y se dejo hasta que fraguo (12 h). Los pellets asentados hechosdel material inyectable se implantaron en musculos de rata.The a-TCP was mixed with 20% CaS with the respective combinations, the high concentration combination (100 times) was diluted 10 times and 100 times with 1% BSA-PBS. With the concentrations, the materials were divided by IBS-GF1 (high concentration), IBS-GF3 (low concentration). After mixing the material was injected into a mold (5 mm in diameter x 4 mm thick) and left until it set (12 h). Seated pellets made of injectable material were implanted in rat muscles.
Experimentos en animalesAnimal experiments
Se usaron 64 ratas Sprague-Dawley hembra con pesos corporales de 200-230 g para el experimento. La operacion se realizo con anestesia con hidrato de cloral (300 mg/kg, B.W. intraperitoneal). Los espedmenes preparados hechos del material inyectable se implantaron en bolsas de musculo abdominal de ratas. Se sacrificaron 8 ratas en cada grupo en cada uno de los siguientes intervalos de tiempo; 3, 6, 12 y 24 semanas.64 female Sprague-Dawley rats with body weights of 200-230 g were used for the experiment. The operation was performed under anesthesia with chloral hydrate (300 mg / kg, intraperitoneal B.W.). Prepared spices made of the injectable material were implanted in rat abdominal muscle bags. Eight rats were sacrificed in each group at each of the following time intervals; 3, 6, 12 and 24 weeks.
Preparacion y evaluacion de espedmenesPreparation and evaluation of spices
Se recogieron los sustitutos de hueso con musculos de alrededor. Los espedmenes de muestra con tejido y materiales se fijaron en 4 % de formalina en tampon, se descalcificaron y se incorporaron en parafina. Se cortaron en secciones de 5 p y se tineron con tincion H&E. El analisis histologico se hizo observando osteoblastos, mineralizacion y hueso trabecular en y alrededor de los materiales.Bone substitutes with surrounding muscles were collected. Sample specimens with tissue and materials were fixed in 4% formalin in buffer, decalcified and incorporated into paraffin. They were cut into 5 p sections and stained with H&E staining. Histological analysis was done by observing osteoblasts, mineralization and trabecular bone in and around the materials.
Se conto el tamano del area de formacion de hueso nuevo usando un microscopio con un sistema de obtencion de imagenes por ordenador (Kontron Bildanalyse, Alemania). La puntuacion de la induccion osea se hizo por un patron de puntuacion bajo microscopio.The size of the new bone formation area was counted using a microscope with a computer imaging system (Kontron Bildanalyse, Germany). The bone induction punctuation was done by a scoring pattern under a microscope.
Se combinaron el experimento de ECM individual, biomaterial de condroadherina como vehfculo y condroadherina como componente nativo con la ayuda de una solucion acuosa al 2,5 % de hidrogenofosfato de disodio formando una pasta. La pasta se distribuyo entonces en moldes para formar pequenos pellets cilmdricos cada uno de 1 mm de diametro y altura. Durante las pruebas in vitro, una vez secados, los pellets se sumergieron en 100 microlitros de solucion salina tamponada con solucion de fosfato y se dejaron disolver a temperatura ambiente. A intervalos periodicos que oscilaban de 15 minutos a 2 semanas, la solucion de bano se saco, se centrifugo y se ensayo en un espectrofotometro de UV-Vis (a 280 nm) para registrar las lecturas de absorbancia.The individual ECM experiment, the biomaterial of condroadherin as a vehicle and condroadherin as a native component, was combined with the aid of a 2.5% aqueous solution of disodium hydrogen phosphate forming a paste. The paste was then distributed in molds to form small cylindrical pellets each 1 mm in diameter and height. During the in vitro tests, once dried, the pellets were immersed in 100 microliters of phosphate buffered saline solution and allowed to dissolve at room temperature. At periodic intervals ranging from 15 minutes to 2 weeks, the bath solution was removed, centrifuged and tested in a UV-Vis spectrophotometer (at 280 nm) to record absorbance readings.
Cada solucion se volvio a poner entonces en el vial apropiado y se dejo que continuara el proceso de disolucion. Se espero que las lecturas de absorbancia reflejaran la proporcion y posterior velocidad de liberacion de condroadherina en la solucion de alrededor como pellets gradualmente disueltos. Durante las pruebas llevadas a cabo in vivo, un unico pellet hecho del material inyectable se implanto bilateralmente en las tibias proximales de 6 conejos con la ayuda de una camara de hueso. Un lado contuvo un pellet con condroadherina incorporada mientras que el otro sirvio de control. El crecimiento hacia adentro del hueso se evaluo entonces mediante analisis histologico tras la recogida a intervalos de 2 y 3 semanas. No se observo crecimiento hacia adentro de hueso.Each solution was then put back in the appropriate vial and the dissolution process was allowed to continue. It was expected that the absorbance readings would reflect the proportion and subsequent rate of release of condroadherin in the surrounding solution as gradually dissolved pellets. During the tests carried out in vivo, a single pellet made of the injectable material was implanted bilaterally in the proximal tibiae of 6 rabbits with the help of a bone chamber. One side contained a pellet with built-in condroadherin while the other served as a control. Inward bone growth was then assessed by histological analysis after collection at intervals of 2 and 3 weeks. No bone inward growth was observed.
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