ES2624450T3 - Método rápido y sensible para la detección de dianas biológicas - Google Patents

Abstract

Método de deposición de un indicador en un sitio diana, en el que el sitio diana comprende actividad enzimática peroxidasa, y el método comprende una etapa de incubar dicho sitio diana en un medio acuoso que comprende el indicador, un compuesto de peroxidasa y un agente de reticulación, que es 3,3'- diaminobencidina (DAB), en el que dicho método se caracteriza porque el indicador es una molécula de conjugado que comprende al menos un polímero de estructura principal y al menos un marcador detectable, en el que dicho al menos un marcador detectable está unido al al menos un polímero de estructura principal por medio de un enlace químico o por medio de una molécula de ligado, en el que el al menos un marcador detectable no es DAB.

Description

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DESCRIPCION

Metodo rapido y sensible para la deteccion de dianas biologicas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo de marcaje biologico que se produce por medio de una reaccion en cadena de radicales libres. La reaccion de marcaje descrita en el presente documento puede usarse generalmente para detectar dianas en una multitud de esquemas experimentales para detectar y visualizar una diana biologica o qmmica, incluyendo inmunohistoqmmica (IHC), hibridacion in situ (ISH), metodos de tincion basados en anticuerpos tales como ELISA, transferencia de tipo Southern, Northern y Western, y otros.

Antecedentes

La deteccion de dianas biologicas o qmmicas en una muestra usando un marcador detectable es un procedimiento en el corazon de muchos metodos de deteccion y diagnostico biologicos. En algunos casos la diana puede ser una secuencia de polinucleotido particular o un gen, una mutacion de un gen, un patron de expresion genetica, detectado a nivel de ADN o ARN, o bien in situ o bien tras extraccion o aislamiento. En otros casos, la diana puede ser un peptido, una protema, un antfgeno u otra sustancia, de nuevo detectada in situ o tras el aislamiento o la manipulacion en laboratorio. La diana tambien puede ser una partfcula o residuo de origen organico.

Muchos metodos de deteccion convencionales, por ejemplo IHC, ISH, ELISA o transferencia, emplean esquemas de marcaje para detectar las dianas deseadas (veanse, por ejemplo, el documento US 7.252.955; Piris J., & Whitehead R. 1974 J. Clin. Path, 27:798-799; documento W02007/015168; Caldwell JP et ai, 2002 J Forensic Sci. 45:785-794; documento US 7.183.072; documento W099/43846). Normalmente, estos esquemas implican incubar una muestra experimental que contiene potencialmente la diana detectable con una sonda, luego detectar la union entre sonda y diana con un marcador detectable que puede emitir un color, una senal fluorescente, o radioactividad, por ejemplo. Una o muchas moleculas de sonda pueden unirse a cada diana, dependiendo de los detalles del esquema usado. En algunos casos, especialmente cuando la diana esta presente en baja concentracion, es necesario amplificar la senal de la union diana-sonda anadiendo una o mas capas de amplificacion al sistema. Por ejemplo, si la sonda es un anticuerpo primario que reconoce la diana, puede anadirse un anticuerpo secundario que reconoce a la sonda de anticuerpo primario de manera que muchos anticuerpos secundarios se unen a cada anticuerpo primario. Si los anticuerpos secundarios se unen a un marcador detectable tal como un fluroforo o cromoforo, entonces, por medio de amplificacion, cada molecula diana en la muestra puede unirse eficazmente a multiples fluroforos o cromoforos en lugar de solo a uno o unos pocos fluroforos o cromoforos. Por tanto, la diana producira una senal de deteccion mas fuerte tras la amplificacion. Sin embargo, algunos experimentos de deteccion tienen una tendencia a producir senales de aspecto relativamente difuso, especialmente si se permite que la muestra repose durante un periodo de tiempo antes del analisis. Por ejemplo, la una o mas sondas y/o marcadores detectables unidos a una diana pueden difundirse lentamente de la diana, o entre sf a lo largo del tiempo. En algunos casos cambios de tampon que afectan a la afinidad de union de la diana, sonda y capas de amplificacion tambien pueden provocar difusion de la senal. Muchos marcadores detectables se unen a las dianas mediante interacciones no covalentes tales como union de protema-ligando o hibridacion de polinucleotidos. Los cambios de tampon tras el marcaje pueden reducir la afinidad entre la diana, la sonda y el marcador detectable, provocando que los diversos componentes se disocien. La difusion simple a lo largo de un periodo de tiempo, tal como varios dfas, tambien puede provocar disociacion entre la diana, la sonda y el marcador detectable, haciendo que la senal sea difusa.

La tecnica anterior describe solo muy pocas tecnicas que permiten superar los problemas mencionados anteriormente, aunque aun solo parcialmente. Un ejemplo de tales tecnicas es un metodo de deposicion de indicador catalizada (CARD) descrito en los documentos WO 03002733, US 5.863.748; 5.688.966; 5.767.287; 5.731.158; 5.583.001, 5.196.306, 6.372.937 o 6.593.100. Este metodo utiliza el denominado “sistema de activacion de enzimas dependiente de analito” (ADEAS) para catalizar la deposicion de un marcador detectable sobre la fase solida de una plataforma de ensayo. En el formato de ensayo, una enzima comprendida por el ADEAS reacciona con un conjugado que consiste en un sustrato marcado de manera detectable espedfico para la enzima. Cuando la enzima y el conjugado reaccionan, se forma un conjugado activado que se deposita covalentemente en un sitio en donde esta inmovilizado un receptor espedfico para el conjugado activado. Por tanto, debido a que el conjugado comprende un marcador, desempena el papel de un indicador que indica la presencia de una diana en el sitio. Pueden detectarse marcadores depositados enzimaticamente directa o indirectamente. El metodo da como resultado amplificacion de la senal y lfmites de deteccion mejorados.

Puede usarse el metodo de CARD en formatos de ensayos, en donde la diana que va a detectarse es un receptor inmovilizado sobre un soporte solido, por ejemplo una membrana. Tales formatos de ensayo incluyen inmunoensayos de tipo “sandwich” y ensayos de hibridacion de acidos nucleicos basados en membrana. El metodo de CARD tambien puede aplicarse a la deteccion de dianas biologicas por ejemplo mediante inmunohistoqmmica (IHC), tal como se describe en el documento US 6.593.100. El metodo descrito en el documento US 6.593.100 utiliza una reaccion de peroxidasa de rabano picante (HRP) con un conjugado marcado que comprende un sustrato de HRP en presencia de un potenciador. Tanto el sustrato de HRP como el potenciador son derivados de fenol. Tras la reaccion con HRP el sustrato de HRP se activa y se une a los sitios de receptor de la muestra, por ejemplo

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protemas. A pesar de tener algunas caractensticas ventajosas, por ejemplo un aumento de la sensibilidad de deteccion, el metodo se limita a moleculas de indicador que son sustratos de HRP marcados seleccionados o bien de tiramida o acido p-hidroxicinnamico o derivados de los mismos.

La presente invencion supera las limitaciones del metodo de CARD descrito anteriormente y proporciona un metodo novedoso para una deteccion rapida y sensible de marcadores biologicos y qmmicos. El metodo comprende tanto caractensticas valiosas del metodo de CARD como nuevas caractensticas que lo hacen aplicable a una gama mas amplia de los formatos de ensayo e independiente de una seleccion estrecha de moleculas de indicador y permiten una deteccion rapida, precisa y sensible de una variedad de dianas biologicas o qmmicas.

Sumario de invencion

La presente invencion se basa en el hallazgo de que una variedad de moleculas pueden depositarse a partir de una disolucion que comprende una sustancia que comprende al menos dos restos de un sustrato de enzima peroxidasa (denominado en el presente documento “agente de reticulacion”) en un sitio que comprende una actividad peroxidasa, por ejemplo en un sitio que comprende un resto de una enzima peroxidasa, por ejemplo HRP. La molecula que se deposita puede ser una molecula detectable, por ejemplo una molecula que por sf misma puede emitir un color, una senal fluorescente o radioactividad o que comprende un marcador detectable que puede emitir un color, una senal fluorescente o radioactividad, por consiguiente, el sitio de deposicion de esta molecula detectable puede detectarse, y si el sitio de deposicion comprende un marcador biologico o qmmico, puede detectarse tambien la presencia de este marcador biologico o qmmico. La molecula que se deposita “notificara” por tanto la presencia del marcador biologico en el sitio de su deposicion. Por consiguiente, tales moleculas que se depositan detectables se denominan en el presente documento “indicadores”.

Un posible motivo de que la molecula de indicador se deposite a partir de un medio que comprende el agente de reticulacion en presencia de actividad peroxidasa es que este teniendo lugar en el medio una reaccion en cadena de radicales libres iniciada por la reaccion entre la peroxidasa y el agente de reticulacion. Los radicales libres de las moleculas de agente de reticulacion formados en el transcurso de esta reaccion pueden cebar las moleculas de indicador presentes en el mismo medio; las moleculas de indicador cebadas pueden reaccionar adicionalmente entre sf y formar agregados insolubles grandes que se depositan en o alrededor de los sitios que comprenden actividad peroxidasa (denominados en el presente documento “sitios diana”). Debido a que la actividad peroxidasa esta estrictamente localizada en sitios diana, el resultado de esta reaccion en cadena es que las moleculas de indicador se depositan solo en los sitios diana o en una proximidad muy estrecha a estos sitios. Si tales sitios diana comprenden un marcador biologico o qmmico, por ejemplo una protema o acido nucleico, el marcador puede detectarse por tanto detectando el indicador depositado.

Se encontro sorprendentemente que moleculas que comprenden al menos dos restos de un sustrato de enzima peroxidasa pueden desempenar el papel de agente de reticulacion en el metodo de la invencion. Por consiguiente, el termino “agente de reticulacion” se usa en el presente documento para designar una molecula que comprende al menos dos restos de una molecula (o al menos dos restos de dos moleculas diferentes) que pueden servir como sustrato de una peroxidasa (el termino “peroxidasa” se usa de manera intercambiable en el presente documento con el termino “enzima peroxidasa” o “actividad peroxidasa”), y que puede producir actividad de reticulacion cuando se activa por la peroxidasa. Los agentes de reticulacion de la presente invencion pueden reticular al menos dos moleculas de indicador.

Se encontro que la deposicion del indicador mediada por la reaccion de un agente de reticulacion y peroxidasa es muy rapida y dirigida al sitio, es decir el indicador se deposita no aleatoriamente sino espedficamente en un sitio diana que comprende actividad peroxidasa, por ejemplo un resto de HRP. El indicador depositado se une fuertemente al sitio diana y no se difunde del sitio a lo largo del tiempo. Por consiguiente, la senal asociada con el indicador depositado se localiza de manera precisa y permanece mtida a lo largo del tiempo.

Realizaciones de la invencion son:

1. Un metodo de deposicion de un indicador en un sitio diana, en el que el sitio diana comprende actividad enzimatica peroxidasa, y el metodo comprende una etapa de incubar dicho sitio diana en un medio acuoso que comprende el indicador, un compuesto de peroxidasa y un agente de reticulacion, que es 3,3'-diaminobencidina (DAB),

en el que dicho metodo se caracteriza porque el indicador es una molecula de conjugado que comprende al menos un polfmero de estructura principal y al menos un marcador detectable, en el que al menos un marcador detectable esta unido al al menos un polfmero de estructura principal por medio de un enlace qmmico o por medio de una molecula de ligado, en el que el al menos un marcador detectable no es DAB.

2. El metodo segun la realizacion 1, en el que el al menos un marcador detectable se selecciona de una sustancia fluorescente o cromogenica, sustrato enzimatico o miembro de un par de union espedfica.

3. El metodo segun la realizacion 2, en el que el al menos un marcador detectable es una sustancia fluorescente.

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4. El metodo segun la realizacion 2, en el que el al menos un marcador detectable es un hapteno.

5. El metodo segun la realizacion 2, en el que el al menos un marcador detectable es un sustrato de peroxidasa de rabano picante (HRP).

6. El metodo segun cualquiera de las realizaciones 1 a 5, en el que el indicador comprende una combinacion de dos o mas marcadores detectables diferentes.

7. El metodo segun la realizacion 1 o 6, en el que el al menos un polfmero de estructura principal del indicador comprende dextrano.

8. El metodo segun cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la actividad peroxidasa esta asociada con al menos un resto de una enzima peroxidasa presente en el sitio diana.

9. El metodo de la realizacion 8, en el que la enzima peroxidasa se selecciona de peroxidasa del rabano (HRP) o peroxidasa de soja (SP).

10. El metodo segun cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que el sitio diana comprende un marcador biologico.

11. Un metodo de deteccion de un marcador biologico en un sitio diana de una muestra biologica in vitro, en el que el sitio diana comprende el marcador biologico y actividad enzimatica peroxidasa, en el que el metodo se caracteriza porque comprende la etapa de deposicion de un indicador en el sitio diana segun el metodo de cualquiera de las realizaciones 1-10.

12. El metodo de realizacion 11, que comprende etapas de

a) incubar la muestra biologica que presumiblemente comprende el marcador biologico con una o mas sondas, en el que (i) al menos una de la una o mas sondas comprende al menos un resto de peroxidasa de rabano picante (HRP), y (ii) al menos una de la una o mas sondas reconoce y se une espedficamente al marcador biologico, formando de ese modo un complejo del marcador biologico con la una o mas sondas, en el que al menos una sonda comprende al menos un resto de HRP, formando de ese modo un sitio diana;

b) incubar la muestra que comprende el sitio diana de (a) en un medio acuoso que comprende DAB, un indicador y un compuesto de peroxido, depositando de ese modo el indicador en el sitio diana;

c) detectar el indicador depositado de (b) y de ese modo detectar el marcador biologico.

13. El metodo de la realizacion 11 o 12, en el que el marcador biologico es una molecula biologica, estructura, tal como una membrana o estructura cromosomica, complejo molecular o partfcula, tal como una partfcula de virus.

14. El metodo de realizacion 12 o 13, en el que la una o mas sondas son miembros de un(os) par(es) de union espedfica.

15. El metodo de la realizacion 14, en el que los miembros de pares de union espedfica se seleccionan de pares de union espedfica de receptor-ligando, anticuerpo-anticuerpo, dos acidos nucleicos o dos analogos de acido nucleico.

16. El metodo de cualquiera de las realizaciones 11-15, en el que el metodo se usa para la deteccion por inmunocitoqmmica (IHC) o hibridacion in situ (ISH) de un marcador biologico en una molecula diana comprendida por una celula.

17. El metodo de la realizacion 16, en el que el metodo esta automatizado o semiautomatizado.

Descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra ejemplos de las moleculas de agente de reticulacion de la invencion.

La figura 2 muestra ejemplos de las moleculas de indicador de la invencion.

La figura 3 muestra una presentacion esquematica del metodo de deteccion de un marcador biologico de la invencion aplicado para la deteccion de dos marcadores diferentes.

Descripcion detallada de la invencion

1. Metodo de deposicion dirigida al sitio de un indicador

En un aspecto la presente invencion se refiere a un metodo de deposicion de un indicador en un sitio diana, comprendiendo dicho metodo incubar un sitio diana en un medio que comprende un indicador y un agente de reticulacion, en el que dicho sitio diana comprende una actividad peroxidasa, en el que dicho indicador es un molecula detectable, y en el que dicho agente de reticulacion es un molecula que comprende al menos dos restos de

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un sustrato de enzima peroxidasa (ver reivindicacion 1).

Agente de reticulacion

El termino “agente de reticulacion” se usa en el presente documento para referirse a una molecula que puede unir entre sf al menos dos moleculas, por ejemplo al menos dos moleculas de indicador. El agente de reticulacion de la invencion comprende al menos dos restos de un sustrato de enzima peroxidasa, en el que dichos dos restos pueden enlazarse entre sf mediante un enlace qmmico, o pueden unirse por medio de una agrupacion o molecula de union. En las reivindicaciones, el agente de reticulacion es 3,3'diaminobencidina (DAB). DAB comprende dos restos de sustrato de peroxidasa de rabano picante (HRP) o-fenilendiamina (OPD) (es decir R1 y R2 son los restos de OPD) que estan unidos entre sf por medio de un enlace covalente.

Indicador

El termino “indicador” se usa en el presente documento para referirse a cualquier molecula detectable, en el que la molecula detectable es un molecula seleccionada de una molecula que puede emitir un color, una senal fluorescente o radioactividad, o es un miembro de un par de union espedfica, o es un conjugado que comprende un resto detectable, tal como un resto cromogenico, fluorescente, quimioluminiscente, de marcador radiactivo, enzimatico, sustrato enzimatico, partfcula detectable, etc., o es un molecula que puede depositarse a partir del medio que comprende un agente de reticulacion (se describieron anteriormente realizaciones del agente de reticulacion) en presencia de actividad peroxidasa y que se marca a medida que se deposita.

Una sustancia que tiene la capacidad de reticulacion segun la invencion puede usarse en una realizacion como agente de reticulacion o indicador; sin embargo, puede no usarse la misma molecula en la misma realizacion tanto como agente de reticulacion como indicador.

Un agente de reticulacion de formula

(R1)n-(X)q-(R2)m,

en la que R1 y R2 son restos de o-fenilendiamina,

X es un enlace covalente, y m, n y q son 1,

puede no usarse como indicador en ninguna realizacion de la invencion.

Ejemplos no limitativos de moleculas que pueden usarse como agente de reticulacion en una realizacion e indicador en otra realizacion son las moleculas D17120 y D17140 descritas anteriormente (veanse tambien los ejemplos 1.1 a 1.8).

La molecula de indicador segun la invencion es una molecula que es soluble en el medio que comprende un agente de reticulacion en ausencia de actividad peroxidasa. La concentracion del indicador en el medio puede variar desde aproximadamente 10-9 M hasta aproximadamente 10-4 M, por ejemplo desde aproximadamente 10-9 M hasta aproximadamente 10-8 M, tal como desde aproximadamente 10-8 M hasta aproximadamente 10-7 M, desde aproximadamente 10-7 M hasta aproximadamente 10-6 M, o desde aproximadamente 10-6 M hasta aproximadamente 10-5 M, o desde aproximadamente 10-6 M hasta aproximadamente 10-4 M.

El indicador en una realizacion puede ser una molecula detectable pequena, por ejemplo seleccionada de una sustancia fluorescente o cromogenica, un hapteno o un sustrato enzimatico, o en otra realizacion el indicador puede ser una molecula grande, por ejemplo un conjugado que comprende un polfmero de estructura principal y al menos una sustancia detectable, en el que la sustancia detectable, es decir el marcador detectable, esta unido al polfmero de estructura principal a traves de un enlace qmmico o a traves de una molecula de ligado. Por tanto, el indicador puede ser un conjugado que comprende dos o mas moleculas, al menos una de las cuales es detectable, o el indicador puede ser una molecula pequena, tal como una molecula que tiene una masa molecular que no es mayor de 500-2000 Da, por ejemplo aproximadamente 1000 Da. El indicador-conjugado puede ser una molecula grande, normalmente una molecula de polfmero a la que se une un marcador detectable. El tamano de tales moleculas de indicador puede ser muy diferente y variar desde 3x103 Da hasta 3x106 Da o mas.

El indicador segun la invencion puede ser tambien una molecula que no es “detectable”. Tal molecula no puede generar una senal que pueda detectarse, por ejemplo por medio de deteccion de color, fluorescencia o radioactividad. Tal molecula de indicador puede detectarse cuando se deposita mediante la aplicacion de medios secundarios que permiten la deteccion, por ejemplo moleculas que no son de indicador detectable que pueden unirse espedficamente al indicador depositado. Tal deteccion puede comprender varias etapas en las que se aplicaran una o mas sustancias detectables para unirse a esta molecula de indicador “no detectable” depositada y por tanto hacer que sea visualmente detectable.

El indicador es una molecula detectable. Puede ser una molecula detectable pequena, o puede ser una molecula detectable grande. La molecula detectable pequena es normalmente una molecula directamente detectable (algunas realizaciones de moleculas pequenas detectables se describen en esta seccion y en las siguientes secciones a

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continuacion). La molecula detectable grande esta representada normalmente por una molecula grande, normalmente, no directamente detectable que se hace detectable tras el acoplamiento de esta molecula con una molecula directamente detectable pequena, u otro marcador detectable. Una molecula de indicador grande que comprende un marcador se denomina en el presente documento “conjugado detectable”. El conjugado detectable segun la invencion puede comprender dos o mas moleculas diferentes, al menos una de las cuales es un marcador detectable.

Tanto una molecula detectable pequena como un marcador compuesto por una molecula de indicador grande pueden seleccionarse de una sustancia fluorescente, luminescente, bioluminescente, radiactiva o cromogenica.

Pueden usarse varios marcadores fluorescentes, luminiscentes, bioluminiscentes, radiactivos o cromogenicos. Muchos de ellos estan disponibles comercialmente, por ejemplo las tinciones fluorescentes Alexa Fluors (Molecular Probes) y Dilight Fluors (Thermo Fisher Scientific). Otros ejemplos no limitados de marcadores y moleculas de indicador pequenas pueden ser las moleculas del grupo que consiste en 5-(y 6)-carboxifluorescema, 5- o 6- carboxifluorescema, acido 6-(fluorescema)-5-(y 6)-carboxamidohexanoico, isotiocianato de fluorescema, rodamina, tetrametilrodamina, Cy2, Cy3, Cy5, AMCA, PerCP, R-ficoeritrina (RPE), aloficoeritrina (APC), rojo Texas, rojo Princeton, unidades nanocristalinas de CdSe recubiertas con protema fluorescente verde (GFP), DNP, digoxiginina, derivados de rutenio, luminol, isoluminol, esteres de acridinio, 1,2-dioxetanos y piridopiridazinas, isotopos radiactivos de hidrogeno, carbono, azufre, yoduro, cobalto, selenio, tritio o fosforo.

En otra realizacion una molecula detectable pequena o marcador puede ser una sustancia que es un sustrato enzimatico. Un sustrato enzimatico puede seleccionarse del grupo que consiste en sustratos de peroxidasa de rabano picante (HRP), excluyendo DAB, fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (GAL), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, beta-N-acetilglucosaminidasa, p-glucuronidasa, invertasa, xantina oxidasa, luciferasa de luciernaga, glucosa oxidasa (GO). En una realizacion preferida el marcador de sustrato enzimatico puede ser un sustrato de HRP, en otra realizacion preferida el marcador enzimatico puede ser un sustrato de AP.

Los ejemplos de sustratos de HRP utiles incluyen 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), diclorhidrato de bencidina (BDHC), reactivo de Hanker-Yates (HYR), azul de indofano (IB), tetrametilbencidina (TMB), 4-cloro-1-naftol (CN), a- naftolpironina (a-NP), o-dianisidina (OD), 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP), azul de nitrotetrazolio (NBT), cloruro de 2-(p-yodofenil)-3-p-nitrofenil-5-feniltetrazolio (INT), azul de tetranitrotetrazolio (TNBT), 5-bromo-4-cloro-3- indoxil-beta-D-galactosido/ferro-ferricianuro (BCIG/FF), 5-amino-2-[3-[5-amino-1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-(4sulfobutil)- 2Hindol-2-iliden]-1-propenil]-3,3dimetil-1-(4sulfobutil)-3H-indolio. En una realizacion preferida la molecula pequena puede ser 5-amino-2-[3-[5-amino-1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-(4sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1-propenil]-3,3dimetil-1- (4sulfobutil)-3H-indolio.

Los ejemplos de sustratos de AP utiles incluyen naftol-AS-BI-fosfato/rojo rapido TR (NABP/FR), naftol-AS-MX- fosfato/rojo rapido TR (NAMP/FR), naftol-AS-BI-fosfato/rojo rapido TR (NABP/Fr), naftol-AS-MX-fosfato/rojo rapido TR (NAMP/fR), naftol-AS-BI-fosfato/fucsina nueva (NAbP/NF), fosfato de bromocloroindolilo/azul de nitrotetrazolio (BCIP/NBT), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-d-galactopiranosido (BClG).

El marcado o una molecula de indicador pequena puede ser una enzima. Ejemplos no limitativos de marcadores enzimaticos pueden ser fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (GAL), glucosa-6-fosfato dehidrogenasa, beta-N- acetilglucosaminidasa, p-glucuronidasa, invertasa, xantina oxidasa, luciferasa de luciernaga, glucosa oxidasa (GO) En una realizacion preferida el marcador enzimatico es AP.

Ademas, el marcador detectable de una molecula de indicador de conjugado molecula de indicador pequena puede ser un miembro de un par de union espedfica. Miembros de pares de union espedfica adecuados para su uso en la puesta en practica de la invencion pueden ser del tipo inmunitario o no inmunitario. Pares de union espedfica inmunitarios se ejemplifican por sistemas de antfgeno/anticuerpo o sistemas de hapteno/anti-hapteno.

Los haptenos son moleculas pequenas que permiten por tanto que se unan multiples copias a una unica molecula de polfmero, en el caso de que el indicador comprenda tanto un marcador detectable como polfmero. Los haptenos proporcionan moleculas diana convenientes para formatos de ensayo en los que es necesario o ventajoso amplificar una senal. Por tanto, las multiples copias unidas de un hapteno proporcionan una sensibilidad potenciada, por ejemplo fuerza de senal potenciada. Los ejemplos de haptenos adecuados incluyen FITC, DNP, myc, digoxigenina, nitrotirosina, biotina, avidina, estreptavidina y anticuerpos anti-colorante frente a por ejemplo los fluoroforos tetrametilrodamina, rojo Texas, dansilo, Alexa Fluor 488, BODIPY FL1, amarillo lucifer y Alexa Fluor 405/Cascade Blue.

El miembro de anticuerpo, ya sea policlonal, monoclonal o un fragmento inmunorreactivo del mismo, del par de union puede producirse mediante metodos habituales familiares para los expertos en la tecnica. Los terminos fragmento de anticuerpo inmunorreactivo o fragmento inmunorreactivo significan fragmentos que contienen la region de union del anticuerpo. Tales fragmentos pueden ser fragmentos de tipo Fab que se definen como fragmentos que carecen de la parte Fc, por ejemplo fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2, o pueden ser los denominados fragmentos de “media molecula” obtenidos mediante escision reductora de los enlaces disulfuro que conectan los componentes de cadena pesada del anticuerpo intacto. Si el miembro de antfgeno del par de union espedfica no es inmunogenico,

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por ejemplo un hapteno, puede acoplarse covalentemente a una protema portadora para hacerlo inmunogenico.

Los pares de union espedfica no inmunitarios incluyen sistemas en los que los dos componentes comparten una afinidad natural entre sf pero no son anticuerpos. Pares de union no inmunitarios a modo de ejemplo son biotina- avidina o biotina-estreptavidina, protema de union a acido folico-folato, acido nucleicos complementarios, receptor- ligando, etc. La invencion tambien incluye pares de union no inmunitarios que forman un enlace covalente entre sff Los pares de union covalente a modo de ejemplo incluyen grupos reactivos sulfhidrilo tales como maleimidas y derivados de haloacetilo y grupos reactivos de amina tales como isotiocianatos, esteres de succinimidilo, haluros de sulfonilo y colorantes acopladores tales como 3-metil-2-benzotiazolinonahidrazona (MBTH) y acido 3-(dimetil- amino)benzoico (DMAB), etc.

En algunas realizaciones, puede preferirse que los marcadores unidos a una molecula de poffmero sean diferentes. En algunas realizaciones puede preferirse usar un indicador que comprende dos o mas marcadores diferentes. Puede hacerse cualquier combinacion de diferentes marcadores seleccionados de cualquiera de los grupos identificados anteriormente, por ejemplo un indicador puede comprender una combinacion de un marcador fluorescente y un marcador enzimatico, una combinacion de un miembro de un par de union espedfica, enzima y/o sustrato enzimatico, etc.

Si el indicador esta representado por un conjugado de un poffmero con una o mas moleculas detectables, en una realizacion el conjugado puede comprender al menos un poffmero y al menos un marcador, en el que el al menos un marcador esta unido al al menos un poffmero por medio de un enlace qrnmico o por medio de una agrupacion de ligado, por ejemplo L30. Se describen ejemplos no limitados de tal indicador en los ejemplos, vease por ejemplo el ejemplo 1.9. Si el conjugado comprende mas de un poffmero, cada uno de los poffmeros puede estar unido a uno o mas marcadores detectables. Los marcadores pueden ser iguales o diferentes. Pueden seleccionarse diferentes marcadores de cualquier grupo de los descritos anteriormente y usarse en cualquier combinacion deseada.

Moleculas de indicador que comprenden poffmeros

Una molecula de indicador grande puede comprender un poffmero. El poffmero comprendido por una molecula de indicador grande puede ser cualquier molecula polimerica. Puede ser soluble o insoluble en agua por sf misma, pero cuando sirve como parte de un conjugado de indicador, es soluble o puede hacerse soluble en un medio acuoso o al menos en el medio de la invencion descrito mas adelante. El poffmero se selecciona preferiblemente de moleculas que pueden depositarse a partir del medio que comprende un agente de reticulacion en presencia de actividad peroxidasa.

Los ejemplos de poffmeros adecuados incluyen polisacaridos tales como dextranos, carboximetildextrano, polialdetffdo de dextrano, carboximetildextranolactona, y ciclodextrinas; pululanos, esquizofilano, escleroglucano, xantana, gelan, O-etilaminoguaran, quitinas y quitosanos tales como 6-O-carboximetilquitina y N- carboximetilquitosano; materiales celulosicos derivatizados tales como carboximetilcelulosa, carboximetilhidroxietilcelulosa, hidroxietilcelulosa, 6-amino-6-desoxicelulosa y O-etilaminacelulosa; almidon hidroxilado, hidroxipropilalmidon, hidroxietilalmidon, carragenanos, alginatos, y agarosa; polisacaridos sinteticos tales como ficol y ficol carboximetilado; poffmeros de vinilo incluyendo poli(acido acnlico), poli(acrilamidas), poli(esteres acnlicos), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(acido maleico), poli(antffdrido maleico), poli(acrilamida), poli(etilo-co-acetato de vinilo), poli(acido metacnlico), poli(alcohol vimlico), poli(alcohol vimlico)-co-cloroacetato de vinilo), poli(alcohol vimlico) aminado), y copoffmeros de bloque de los mismos; estructuras principales de poffmero que contienen polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol o poli(oxido de etileno-co- oxidos de propileno) incluyendo poffmeros y dendnmeros lineales, con forma de peine o hiperramificados, incluyendo dendnmeros de PAMAm ramificados; poliaminoacidos incluyendo polilisinas, poli(acido glutamico), poliuretanos, poli(etileniminas), pluriol; protemas incluyendo albuminas, inmunoglobulinas, y protemas de tipo virus (VLP), y polinucleotidos, ADN, PNA, LNA, oligonucleotidos y constructos de oligonucleotido-dendnmero. Tambien se contempla el uso de poffmeros mixtos, es decir, un poffmero compuesto por uno o mas de los ejemplos anteriores incluyendo cualquiera de los poffmeros, los copoffmeros de bloque y copoffmeros al azar.

La eleccion del poffmero puede depender de la aplicacion particular en la que se usa el metodo de la invencion. Pueden seleccionarse propiedades ffsicas del poffmero dependiendo de aplicaciones particulares del metodo para optimizar el rendimiento. Los ejemplos de estas propiedades ffsicas incluyen la longitud y ramificacion del poffmero. Ademas, el poffmero puede llevar diversos sustituyentes. Los sustituyentes pueden estar qmmicamente protegidos y/o activados, permitiendo que el polfmero se derivatice adicionalmente. Por ejemplo en una realizacion el poffmero puede ser un acido nucleico, en otra realizacion puede ser un analogo de acido nucleico, en otra realizacion puede ser un polipeptido, en otra realizacion puede ser un polisacarido, en otras realizaciones puede ser cualquier variante de los mismos.

Mediante el termino “acido nucleico” quiere decirse un poffmero compuesto por una(s) cadena(s) de monomeros de nucleotido. Los acidos nucleicos mas comunes son acido desoxirribonucleico (ADN) y acido ribonucleico (ARN). Un nucleotido es un compuesto que consiste en una base heterodclica (nucleobase), un azucar y uno o mas grupos fosfato. En los nucleotidos mas comunes la base es un derivado de purina o pirimidina, y el azucar es la pentosa (azucar de cinco carbonos) desoxirribosa o ribosa. Tal como se menciona, los nucleotidos son los monomeros de los

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acidos nucleicos. Las nucleobases son las partes del nucleotido que pueden estar implicadas en el apareamiento de moleculas de ARN y ADN. Las nucleobases incluyen citosina, guanina, adenina, timina (ADN), uracilo (ARN).

Mediante el termino “analogo de acido nucleico” quiere decirse un poUmero, que es un homopolfmero compuesto por monomeros de nucleotido, en el que las nucleobases pueden ser naturales, modificadas y/o sinteticas, o que es un heteropolfmero compuesto por monomeros de nucleobases, aminoacidos y otros tipos de monomeros naturales, modificados y sinteticos. “Homo-” y “hetero-” con respecto a un polfmero indican que el polfmero esta compuesto por un monomero de origen qmmico diferente, por ejemplo un polfmero compuesto por monomeros de nucleobase solo es un homopolfmero, un polfmero compuesto por monomeros de nucleobase y aminoacido es un heteropolfmero. Un ejemplo de un homopolfmero puede ser una molecula de ADN o ARN, un ejemplo de un heteropolfmero puede ser una molecula de PNA. El acido nucleico peptfdico (PNA) es un producto qmmico similar al ADN o ARN. El PNA es un compuesto sintetizado artificialmente. ADN y ARN tienen una estructura principal de azucar desoxirribosa y ribosa, respectivamente, mientras que la estructura principal del PNA esta compuesta por unidades de repeticion de N-(2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces peptfdicos. Las diversas bases de purina y pirimidina se unen a la estructura principal mediante enlaces de carbonilo. Los PNA se representan como peptidos, con el extremo N- terminal en la primera posicion (izquierda) y el extremo C-terminal a la derecha. Puesto que la estructura principal de PNA no contiene grupos fosfato cargados, la union entre las hebras de PNA/ADN es mas fuerte que entre las hebras de ADN/ADN debido a la falta de repulsion electrostatica. Las moleculas de PNA de base mixta son mimeticos verdaderos de moleculas de ADN en cuanto al reconocimiento de pares de bases. La union PNA/PNA es mas fuerte que la union PNA/ADN.

El termino “protema” se usa en el presente documento de manera intercambiable con el termino “polipeptido” y se refiere a al menos un polfmero compuesto por aminoacidos naturales o artificiales.

El polfmero comprendido por una molecula de indicador puede seleccionarse tambien de un polisacarido, pululano, esquizofilano, escleroglucano, xantana, gelan, O-etilaminoguaran, quitina, quitosano, materiales celulosicos derivatizados, almidon hidroxilado, carragenanos, alginato, agarosa, polisacarido sintetico, polfmero de vinilo, polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol o poli(oxido de etileno-co-oxidos de propileno) que contienen estructuras principales de polfmero incluyendo dendnmero lineal, con forma de peino o ramificado, poliaminoacido, poli(etilenimina) o pluriol.

En algunas realizaciones el polfmero puede ser un polfmero mixto compuesto por dos o mas polfmeros diferentes descritos anteriormente.

En algunas realizaciones preferidas el polfmero puede comprender dextrano. En otras realizaciones preferidas el polfmero puede comprender al menos un acido nucleico. En otras realizaciones preferidas el polfmero puede comprender al menos un analogo de acido nucleico. En otra realizacion preferida el polfmero puede consistir en o comprender la molecula L30. En otras realizaciones preferidas el polfmero puede comprender al menos un polipeptido.

Tal como ya se menciono, el polfmero puede conjugarse con un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable puede conjugarse con el polfmero directamente, es decir unirse covalentemente al polfmero, en otras realizaciones el marcador detectable puede conjugarse con el polfmero indirectamente a traves de un ligador. Se conocen en la tecnica muchos de tales ligadores. Los ejemplos no limitados incluyen polietilenglicol y poliamidas. Una molecula de ligado en una realizacion puede comprender 5-15 atomos, en otra realizacion puede comprender 15-30 atomos, en otra realizacion puede comprender mas de 35 atomos, por ejemplo 36-45, en algunas realizaciones el ligador puede comprender mas de 45 atomos. Una realizacion preferida de tal molecula de ligado es L30 descrita anteriormente.

Tal como se menciono anteriormente, L30 en algunas realizaciones puede servir como polfmero de estructura principal de la molecula de conjugado de indicador. Algunas de tales realizaciones se describen a continuacion en los ejemplos proporcionados (ejemplos 1.1-1.8) y se muestran en la figura 2. En algunas otras realizaciones L30 puede servir como agrupacion de ligado para la union de marcadores detectables al polfmero.

En algunas realizaciones, 1-500 moleculas de marcador detectable pueden unirse directa o indirectamente a una molecula de polfmero. En algunas realizaciones, el marcador detectable es una enzima y el numero de moleculas de enzima unidas a cada molecula de polfmero es de 1-200, 2-50, 2-25. En algunas realizaciones, el marcador detectable es un una partmula de oro, un colorante, un fluorocromo de bajo peso molecular y el numero de sustancias detectables unidas a cada molecula de polfmero es de 1-500, 1-200, 1-100, 10-100, 20-50, 50-100, 1-50, 2-30, 10-20. En algunas realizaciones, el marcador detectable es un fluorocromo de protema, y el numero de moleculas detectables unidas a una molecula de polfmero es de 1-50, 2-20. En algunas otras realizaciones el marcador detectable es un acido nucleico o analogo de acido nucleico, por ejemplo una molecula de PNA u oligonucleotido, y el numero de moleculas detectables unidas a un polfmero es de 1-200, 2-50, 2-25.

Se conocen en la tecnica muchos metodos de formacion de conjugados polimericos y pueden usarse para preparar los conjugados polimericos de la invencion. En algunas realizaciones una sustancia detectable, si se desea, puede unirse qmmicamente, o conjugarse, con una estructura principal polimerica. En algunas realizaciones, el conjugado

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de poUmero se forma mediante acoplamiento covalente de grupos aminos a dobles enlaces conjugados. El poUmero puede activarse con vinilsulfona y mezclarse con una sustancia detectable para formar el conjugado de polfmero. En otras realizaciones, se usan aldetndos para activar una estructura principal polimerica, por ejemplo, dextranos que entonces se mezclan con una sustancia detectable. Aun otro metodo de preparacion de conjugados polimericos es usando los denominados esquemas de acoplamiento quimioselectivos para acoplar los componentes entre sf, por ejemplo, pueden derivatizarse enzimas u otras moleculas con grupos maleimida reactivos con tiol antes de acoplarse covalentemente con una estructura principal o portador polimerico modificado con tiol. Otras realizaciones descritas a continuacion permiten que los propios reactivos formen conjugados, por ejemplo la sustancia detectable.

Tal como se menciono anteriormente, el polfmero puede servir por sf mismo como molecula de indicador y no comprende ningun marcador detectable. Ejemplos no limitados de tales polfmeros pueden ser acidos nucleicos, analogos de acidos nucleicos y protemas.

Moleculas de indicador pequenas

Tal como ya se comento anteriormente, el indicador puede ser una molecula pequena. Por “molecula pequena” quiere decirse una molecula no polimerica de no mas de 3000 Da, normalmente, de desde alrededor de 200 hasta alrededor de 1000 Da, por ejemplo alrededor de 500 Da. Normalmente tal molecula de indicador pequena es soluble en el medio de la invencion que comprende un agente de reticulacion. La invencion se refiere a cualquier clase de molecula pequena que pueda depositarse a partir del medio en presencia de una peroxidasa.

La molecula pequena puede ser una sustancia directamente detectable. Los ejemplos de tales sustancias incluyen pero no se limitan a 5-(y 6)-carboxifluorescema, 5- o 6-carboxifluorescema, acido 6-(fluorescema)-5-(y 6)- carboxamidohexanoico, isotiocianato de fluorescema, rodamina, tetrametilrodamina, Cy2, Cy3, Cy5, AMCA, PerCP, R-ficoeritrina (RPE), aloficoeritrina (APC), rojo Texas, rojo Princeton, unidades nanocristalinas de CdSe recubiertas con protema fluorescente verde (GFP), DNP, digoxiginina, luminol, isoluminol, esteres de acridinio, 1,2-dioxetanos y piridopiridazinas, e isotopos radiactivos de hidrogeno, carbono, azufre, yoduro, cobalto, selenio, tritio y fosforo. La sustancia cromogenica puede seleccionarse de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina (ADHP), 3-amino-9-etilcarbazol, 4-cloro-1-naftol (AEC), o-fenilendiamina (OPD), acido 2,2'-azido-bis(3)- etilbenztiazolin-6-sulfonico, 5-amino-2-[3-[5-amino-1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-(4sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1-propenil]- 3,3dimetil-1-(4sulfobutil)-3H-indolio. En una realizacion, la molecula detectable pequena pude ser un sustrato para una peroxidasa, preferiblemente peroxidasa de rabano picante (HRP). En una realizacion preferida la molecula detectable pequena es 5-amino-2-[3-[5-amino-1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-(4sulfobutil)-2H-indol-2-iliden]-1-propenil]- 3,3dimetil-1-(4sulfobutil)-3H-indolio.

En algunas realizaciones la molecula pequena puede ser una molecula que no puede detectarse directamente, por ejemplo una sustancia que no puede convertirse en coloreada, fluorescente o quimioluminiscente, por ejemplo biotina, o un sustrato de una enzima peroxidasa tal como acido ferulico o tirosina. En tales realizaciones puede acoplarse una sustancia detectable a esta clase de molecula pequena. Por ejemplo la molecula pequena y la sustancia detectable pueden derivatizarse, por ejemplo, con grupos vinilo. La polimerizacion se produce mediante la adicion de un radical, que da como resultado polimerizacion de los grupos vinilo para formar un conjugado polimerico. El conjugado por tanto contendra una estructura principal de polivinilo o bloques de polivinilo. Pueden usarse esteres activos de acido acnlico para activar las moleculas. La generacion de radicales libres puede polimerizar las moleculas derivatizadas. Pueden anadirse adicionalmente ligadores de molecula pequena con mas de un grupo vinilo para ayudar a formar un conjugado polimerico de una molecula pequena y una sustancia detectable. En algunas otras realizaciones, la molecula pequena y la sustancia detectable pueden derivatizarse con un aglutinante cruzado. Los ejemplos de este metodo incluyen el uso de aglutinantes cruzados homobifuncionales tales como dialdetndo glutarico, diisocianato de hexano, dimetilapimidato, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno, aglutinantes cruzados heterobifuncionales como por ejemplo ester de N-gamma-maleimidobitiroloxisuccinimida, y aglutinantes cruzados de longitud cero tales como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Eligiendo las condiciones de reaccion correctas, los aglutinantes cruzados pueden formar puentes entre diversos grupos funcionales en, por ejemplo, las sustancias detectables y los agentes detectables para formar una molecula de indicador polimerica.

Peroxidasa

Cualquier enzima que pueda tener actividad peroxidasa es adecuada para poner en practica la presente invencion.

Segun la invencion esta presente actividad peroxidasa en un sitio diana. El termino “sitio diana” se refiere a un sitio en el que la molecula de indicador va a depositarse, por ejemplo un sitio que comprende un marcador biologico o qrnmico. Segun la invencion la actividad peroxidasa esta asociada con al menos un resto de una enzima peroxidasa presente en el sitio diana. El termino “un resto” significa que la peroxidasa puede ser una protema natural o recombinante o un derivado de la misma, por ejemplo un fragmento de la misma que puede presentar actividad peroxidasa. En particular, la peroxidasa puede seleccionarse de peroxidasa de rabano picante (HRP) o peroxidasa de soja (SP), fragmentos, protemas recombinantes o de fusion de las mismas. En una realizacion preferida la peroxidasa es HRP.

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En una realizacion el sitio diana puede ser un sitio de cualquier soporte solido que comprende actividad peroxidasa. Los soportes adecuados incluyen soportes de polfmero sintetico, tales como poliestireno, polipropileno, poliestireno sustituido, por ejemplo, poliestireno amidado o carboxilado; poliacrilamidas; poliamidas; poli(cloruro de vinilo), etc.; perlas de vidrio; agarosa; nitrocelulosa; nailon; poli(fluoruro de vinilideno); nailon modificado en la superficie, etc. Una molecula de peroxidasa puede inmovilizarse directa o indirectamente sobre estos soportes.

El sitio diana puede ser un sitio de una muestra biologica, por ejemplo un sitio de una membrana celular, organulo celular, en el caso de que la muestra biologica comprenda una celula, puede ser tambien un sitio de una muestra biologica libre de celulas, por ejemplo muestra de plasma o lisado o extracto celular que se inmoviliza sobre un soporte solido tal como se describio anteriormente. Tal sitio comprendera normalmente un marcador biologico que puede ser una estructura o molecula diana. La actividad peroxidasa normalmente estara asociada con la molecula diana indirectamente, por ejemplo como parte de una sonda espedfica unida a la molecula diana.

Medio

El medio usado en el metodo de la invencion es un medio a partir del cual puede depositarse una molecula de indicador soluble en presencia de actividad peroxidasa. Es una disolucion tamponada acuosa con un pH de desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 9, que comprende esencialmente

(i) un compuesto que puede reticular al menos dos moleculas de indicador en presencia de actividad peroxidasa, en el que dicho compuesto es una molecula que comprende al menos dos restos de un sustrato de enzima peroxidasa, y en el que al menos una de dichas dos moleculas de indicador es un molecula detectable, y

(ii) un compuesto de peroxido.

Se comentaron en detalle anteriormente moleculas de indicador solubles adecuadas comprendidas en el medio.

Tambien se comentaron en detalle anteriormente compuestos adecuados que pueden reticular al menos dos moleculas de indicador en presencia de actividad peroxidasa segun la invencion. En una realizacion preferida el compuesto de reticulacion es DAB.

La cantidad del compuesto de reticulacion en el medio puede variar de desde aproximadamente 10-5 hasta aproximadamente 10-2 M, tal como desde aproximadamente 10-5 hasta aproximadamente 10-3 M, o desde aproximadamente 10-4 hasta aproximadamente 10-2 M, o desde aproximadamente 10-5 hasta aproximadamente 10-4 M, o desde aproximadamente 10-4 hasta aproximadamente 10-3 M. La concentracion del agente de reticulacion puede optimizarse para diferentes realizaciones, por ejemplo cuando se pretende la deposicion de diferentes indicadores.

El medio segun la invencion comprende un compuesto de peroxido. El compuesto de peroxido puede seleccionarse de peroxidos organicos tales como peroxido de terc-butilo, peroxido de diterc-butilo, acido peracetico, o puede ser un aducto de peroxido de hidrogeno, tal como aducto de peroxido de hidrogeno-urea. En algunas realizaciones el peroxido de hidrogeno (H2O2) puede ser el peroxido preferido. La cantidad del compuesto de peroxido en el medio vana de desde aproximadamente 10"4 hasta aproximadamente 10"2 M en diferentes realizaciones.

El medio puede comprender ademas un modificador organico y un modificador organico y sal organica o inorganica.

La sal inorganica puede seleccionarse por ejemplo de cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, fosfato de sodio o sulfato de amonio.

En otras realizaciones el medio puede comprender una sal organica, tal como sales de acetato de sodio, acetato de amonio o imidazol, por ejemplo clorhidrato de imidazol.

La concentracion de sal en el medio puede oscilar entre aproximadamente 10"3 M y la saturacion, por ejemplo entre aproximadamente 20 mM y aproximadamente 200 mM, o entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 500 mM. En una realizacion preferida, el medio puede comprender sal en la cantidad de desde aproximadamente 10 mM hasta 500 mM. En otra realizacion preferida el medio puede estar libre de sal.

Normalmente el valor de pH del medio puede variar desde alrededor de 4 hasta alrededor de 9. Puede usarse cualquier tampon con una capacidad de tamponamiento adecuada, por ejemplo solucion salina tamponada con fosfato (PBS), tampon imidazol. Otros tampones adecuados pueden encontrarse en Good, NE., et al (1966) Hydrogen ion buffers for biological research. Biochem. 5(2), 467-477. El valor de pH del medio puede ser esencial para depositar el indicador; puede optimizarse dependiendo de la naturaleza del indicador.

El medio puede comprender ademas en diferentes realizaciones:

(i) un modificador organico y/o

(ii) un potenciador enzimatico, y/o

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(iii) un quelante de hierro, y/o

(iv) un detergente, y/o

(v) un agente antimicrobiano

Mediante el termino “modificador organico” quiere decirse cualquier disolvente no acuoso que potencia la solubilidad del indicador. En tales realizaciones es suficiente que el modificador este presente en el medio en la cantidad de alrededor del 1% (v/v o p/v), sin embargo, en algunas realizaciones pueden requerirse concentraciones superiores del modificador organico. El modificador organico puede ser por ejemplo polietilenglicol (PEG). Otros ejemplos incluyen pero no se limitan a modificadores organicos seleccionados del grupo que consiste esencialmente en alcoholes inferiores, N-metilpirrolidona (NMP), dimetilsulfoxido (DMSO), mono- y dietilenglicol, sulfolano, N,N- dimetilformamida (DMF). En algunas realizaciones puede ser ventajoso usar polietilenglicol (PEG), por ejemplo PEG2000. La concentracion de polietilenglicol en el medio en estos casos puede variar desde aproximadamente el 0,1% (v/v) hasta aproximadamente el 20% (v/v), por ejemplo desde aproximadamente el 1% (v/v) hasta aproximadamente el 15%, tal como el 5-10% (v/v).

Mediante el termino “potenciador enzimatico” quiere decirse cualquier compuesto que potencie la actividad catalftica de la peroxidasa. Tal potenciador enzimatico puede seleccionarse del grupo que consiste esencialmente en derivados de acido fenilboronico e iones de metales divalentes tales como mquel o calcio. La concentracion del

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potenciador enzimatico puede variar desde aproximadamente 10' hasta aproximadamente 10' M.

El quelante de hierro puede ser acido etilendiaminatetraacetico (EDTA) o un quelante de tipo acido etilendiaminahidroxilfenilacetico (EDHPA). La concentracion del quelante de hierro puede variar de desde aproximadamente 10'6 hasta aproximadamente 10'2 M.

El detergente puede seleccionarse de polietilenglicol-p-isooctifenil eter (NP-40), un tensioactivo seleccionado de los tensioactivos basados en monolaurato de polioxietilen-sorbitano (Tween), o un tensioactivo basado en copolfmeros de bloque (Pluronic, etc.). La concentracion del detergente puede variar de desde aproximadamente el 0,001% hasta aproximadamente el 5%.

Segun la invencion la composicion del medio es una disolucion estable. El termino “estable” en el presente contexto significa que la capacidad del medio para servir como medio de reaccion para la deposicion de indicador mediada por peroxidasa sigue estando esencialmente sin cambios durante periodos de tiempo sustanciales; de manera que el medio puede retener su capacidad reactiva sin afectar durante al menos 4 horas a temperatura ambiente.

El medio tambien puede conservarse durante periodos de tiempo mas largos. Para prolongar la semivida del medio, puede recomendarse almacenar el medio a temperaturas por debajo de 20°C, por ejemplo a 4- 10°C, y/o anadir al medio un compuesto antimicrobiano. El compuesto antimicrobiano puede ser cualquier compuesto antimicrobiano comunmente usado para tal fin, por ejemplo azida de sodio, Proclin™ o Bronidox®.

El medio descrito anteriormente es un medio de reaccion para depositar un indicador en un sitio diana que comprende actividad peroxidasa, por ejemplo un sitio que comprende un marcador biologico.

2. Metodo de deteccion de una diana en una muestra biologica

El metodo de deposicion de un indicador en un sitio diana descrito anteriormente puede usarse ventajosamente para detectar marcadores biologicos asociados con este sitio diana, por ejemplo moleculas biologicas tales como acidos nucleicos, protemas, etc. porque el sitio diana puede ser un sitio de una muestra biologica, por ejemplo un sitio de una membrana celular, organulo celular, en el caso de que la muestra biologica comprenda una celula, o puede ser un sitio de una muestra biologica libre de celulas cargada sobre un soporte solido, por ejemplo muestra de plasma o lisado celular o extracto celular que se inmoviliza sobre un soporte solido tal como se describio anteriormente. El termino “marcador biologico” significa en el presente contexto una molecula, complejo molecular o estructura que es espedfico para una especie biologica, tipo de celula, compartimento celular, estado fisiologico, etc. Los ejemplos no limitados de tal marcador biologico incluyen pero no se limitan a una secuencia genetica, protema particular u otra molecula biologica, estructura de membrana o cromosomica, virus etc. que esta asociada con una enfermedad particular. Se usan comunmente marcadores biologicos en diagnostico medico como marcadores de enfermedades y dianas terapeuticas particulares.

Por consiguiente, un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo de deteccion de un marcador biologico in vitro tal como se expone en las reivindicaciones 14 y 15.

Etapa (a) de la reivindicacion 15

La muestra biologica que comprende un marcador biologico puede ser cualquier muestra biologica que comprenda celulas intactas o danadas, por ejemplo una muestra de tejido corporal o lisado celular.

Los ejemplos no limitativos de la muestra biologica de la invencion incluyen:

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- una muestra de medio Ifquido que comprende celulas suspendidas, por ejemplo muestra de sangre, suspension de celulas clonales o suspension de celulas disociadas de un tejido corporal;

- una muestra de un tejido corporal, por ejemplo una muestra de biopsia; la muestra de tejido puede ser una muestra de tejido reciente, o puede ser una muestra de tejido conservado, por ejemplo una muestra de tejido fijada en formalina e incrustada en parafina,

- una muestra de un tumor;

- una muestra derivada de cualquier organismo vivo, por ejemplo, animal, planta, bacterias, etc. Puede comprender celulas eucariotas o celulas procariotas o ambas. Puede ser un frotis celular,

- una muestra que comprende partfculas virales, residuos de las mismas o productos virales, por ejemplo, acidos nucleicos, protemas, peptidos virales, etc.

La muestra biologica que presumiblemente comprende un marcador biologico se incuba segun el metodo de la invencion con al menos una sonda que comprende al menos un resto de HRP o resto de otra enzima peroxidasa.

El termino “incubar” significa que la muestra se mantiene en un medio que comprende una sonda (o un medio que comprende un agente de reticulacion y un indicador (etapa (b)) durante un determinado periodo de tiempo. Este periodo de tiempo puede variar desde 1-3 min hasta 1-2 horas o mas, por ejemplo durante la noche. La incubacion puede realizarse a diferentes temperaturas dependiendo de las diferentes realizaciones, por ejemplo el tipo de molecula de marcador biologico que va a detectarse o el tipo de sonda y/o indicador usado para la deteccion.

Una sonda o mas sondas con las que la muestra esta incubandose reconocen y se unen espedficamente a un marcador biologico presente en la muestra.

Las sondas que reconocen el marcador biologico pueden unirse espedficamente a este marcador y solo a este marcador. Normalmente tales sondas son miembros de pares de union espedfica.

Se conocen en la tecnica varios pares de union espedfica diferentes. En una realizacion los miembros de un par de union espedfica pueden ser dos moleculas de anticuerpo. En otra realizacion, los miembros de un par de union espedfica pueden ser dos acidos nucleicos complementarios. En otra realizacion, los miembros de un par de union espedfica pueden ser dos moleculas de analogo de acido nucleico. En otra realizacion el miembro de un par de union espedfica puede ser un miembro de pares de union de receptor-ligando particulares.

Una sonda que puede unirse espedficamente al marcador biologico y es el miembro de un par de union espedfica, por ejemplo una sonda de anticuerpo primario sonda, se disena en el presente documento como primera sonda. La primera sonda puede marcarse opcionalmente con un resto de enzima peroxidasa.

En una realizacion la primera sonda puede comprender al menos un resto de HRP u otra enzima peroxidasa, por ejemplo peroxidasa de soja (SP). Un ejemplo no limitativo de tal sonda puede ser una molecula de anticuerpo primario marcado con HRP o un derivado del mismo, o una sonda de acido nucleico marcado con HRP. Tales primeras sondas se unen espedficamente a los marcadores biologicos correspondientes y marcan estos marcadores biologicos con actividad peroxidasa y forman de ese modo sitios diana.

En otra realizacion la primera sonda puede no estar marcada, es decir no comprender un resto de una peroxidasa. En esta realizacion, pude unirse un resto de peroxidasa a un sitio diana a traves de una segunda sonda. La segunda sonda es una sonda que puede unirse espedficamente a la primera sonda, por ejemplo es el otro miembro de un par de union espedfica. Ejemplos no limitativos de tales sondas pueden ser moleculas de anticuerpos secundarios de derivados de los mismos, sondas de acido nucleico o miembros de pares de union de receptor-ligando. Tal segunda sonda puede comprender al menos un resto de HRP u otra enzima peroxidasa por ejemplo peroxidasa de soja (SP). Uniendose a la primera sonda, la segunda sonda que comprende actividad peroxidasa marcara el sitio en donde se encuentra el marcador biologico con esta actividad peroxidasa y formara de ese modo un sitio diana.

En otra realizacion, tanto la primera como la segunda sonda pueden comprender al menos un resto de enzima peroxidasa, por ejemplo HRP y/o SP.

La etapa (a) puede incluir en algunas realizaciones varias subetapas en las que se usan sondas tercera y cuarta. Por ejemplo, antes de avanzar a la etapa (b) del procedimiento, la muestra que comprende un marcador biologico puede incubarse secuencialmente con multiples sondas, de las cuales las primeras sondas pueden unirse al marcador biologico, mientras que las sondas segunda, tercera y las otras pueden unirse entre sf, es decir las segundas sondas con las primeras sondas, las terceras sondas con las segundas sondas, etc., y por tanto una molecula de marcador se asociara con muchas sondas diferentes. Cada sonda puede comprender uno o mas restos de una enzima peroxidasa. Tal marcaje con multiples sondas de un unico marcador biologico puede usarse cuando es deseable una alta acumulacion de actividad peroxidasa en un unico sitio diana. Esto puede ser util para la potenciacion de la deposicion de indicador en un unico sitio diana.

Antes de avanzar a la etapa (b) del metodo, puede repetirse la etapa (a) tantas veces como se desee con el fin de

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aumentar la acumulacion de actividad peroxidasa en el sitio diana.

Etapa (b) en la reivindicacion 15:

La muestra que comprende un sitio diana formado en la etapa (a) se incuba ademas en un medio que comprende un agente de reticulacion y un indicador segun la invencion.

Se comentaron anteriormente detalles de la composicion del medio adecuado para la incubacion de la etapa (b). La composicion del medio puede variar dependiendo de la especie de moleculas de indicador y agente de reticulacion usadas y la naturaleza de un marcador biologico particular que va a detectarse. Por ejemplo, el medio puede comprender DAB como agente de reticulacion cuando el indicador es un indicador que comprende una estructura principal de polfmero a la que se unen varios marcadores fluorescentes (por ejemplo moleculas de indicador descritas en el ejemplo 6 o 7).

La incubacion de la etapa (b) segun la invencion da como resultado que las moleculas de indicador presentes en el medio de incubacion se depositen en los sitios diana, es decir los sitios de una muestra biologica que comprenden un marcador biologico marcado con actividad peroxidasa. Debido a que el indicador se deposita solo en o alrededor del sitio de la presencia de actividad peroxidasa, el sitio de su deposicion es el sitio en donde el marcador biologico esta presente.

En una realizacion, la etapa (b) puede comprender al menos dos incubaciones:

(i) incubacion de la muestra en el medio que comprende un agente de reticulacion (es decir sin un indicador); seguido por

(ii) incubacion de la muestra en el medio que comprende tanto agente de reticulacion como indicador.

La etapa (b) puede repetirse opcionalmente.

Etapa (c) en la reivindicacion 15:

Tal como se comento anteriormente, la molecula de indicador es una molecula detectable. Se describieron anteriormente diferentes realizaciones de moleculas de indicador detectables.

La deteccion del indicador puede ser “directa” (la deteccion en una etapa en el caso de que el indicador depositado pueda emitir una senal cromogenica, radiactiva o fluorescente que puede detectarse por medios adecuados).

La deteccion puede ser “indirecta” (comprende varias etapas de deteccion, por ejemplo cuando el indicador depositado es un miembro no marcado de un par de union espedfica, por ejemplo sonda de anticuerpo o acido nucleico. Tal indicador puede detectarse mediante un procedimiento que comprende varias etapas de deteccion, etapas en las que pueden usarse varias sondas detectables diferentes. Cada sonda usada en cada etapa puede comprender multiples marcadores detectables. Los marcadores tambien pueden ser marcadores enzimaticos, por ejemplo restos de HRP. Tal deteccion indirecta del indicador depositado en algunas realizaciones puede preferirse, por ejemplo cuando es deseable amplificar la senal asociada con el indicador depositado en un sitio diana.

Una muestra que comprende el indicador depositado al que se une una sonda que reconoce el indicador puede incubarse adicionalmente en el medio que comprende un agente de reticulacion y otro indicador. En el caso de que la sonda unida al indicador comprenda un resto de una peroxidasa, esta incubacion adicional puede usarse para la deposicion de otro indicador en el mismo sitio diana; esto puede usarse para la amplificacion de la senal inicial que emana del sitio diana y por tanto para la potenciacion de la sensibilidad de la deteccion, o puede usarse para el marcaje del sitio diana con un marcador detectable que es diferente del marcador usado en la deposicion inicial. Tal incubacion adicional puede repetirse varias veces.

El metodo de deteccion de dianas biologicas descrito anteriormente puede usarse en una variedad de formatos de ensayo. Algunas realizaciones de estos formatos de ensayo se describen a continuacion y se ilustran mediante ejemplos de trabajo no limitativos de la invencion.

Formatos de ensayo

Pueden detectare moleculas diana comprendidas por celulas de una suspension celular empleando el metodo descrito anteriormente en cualquier formato de ensayo adecuado, por ejemplo en citometna de flujo (FC), o ELISA, o inmunohistoqmmica (IHC) o hibridacion in situ (ISH).

En una realizacion la muestra biologica puede ser una suspension de celulas. Pueden detectarse moleculas diana o estructuras de celulas en suspension usando FC, ELISA, IHC o ISH. Cuando se usan ELISA, IHC o ISH para la deteccion, celulas de la suspension han de unirse a un soporte solido, por ejemplo placa de ELISA o portaobjetos de ICH.

En otra realizacion la muestra biologica puede ser un corte de un tejido corporal. Moleculas diana o estructuras de

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celulas de tales muestras se detectaran normalmente usando IHC o ISH.

Los formates de ensayo de IHC e ISH requieren habitualmente una serie de etapas de tratamiento realizadas sobre una seccion de tejido montada sobre un soporte solido adecuado para inspeccion microscopica, o la produccion de fotomicrograffas, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio u otro soporte plano, para resaltar mediante tincion selectiva determinados indicadores morfologicos de estados patologicos o la deteccion de marcadores biologicos. Por tanto, por ejemplo en IHC, se toma una muestra de un individuo, se fija y se expone a anticuerpos que se unen espedficamente al marcador biologico de interes. Las etapas de procesamiento de la muestra pueden incluir, por ejemplo, recuperacion de antfgenos, exposicion a un anticuerpo primario, lavado, exposicion a un anticuerpo secundario (opcionalmente acoplado a un resto de HRP), lavado y exposicion a un anticuerpo terciario unido a uno o mas restos de HRP. Las etapas de lavado pueden realizarse con cualquier disolvente o tampon adecuado, por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato (PBS), solucion salina tamponada con tris (TBS), agua destilada. El tampon de lavado puede contener opcionalmente un detergente, por ejemplo, Tween 20.

Tal como se menciono anteriormente, hay en general dos categonas de muestras histologicas: (1) preparaciones que comprenden tejidos y/o celulas recientes, que generalmente no estan fijados con fijadores a base de aldehndo, y

(2) espedmenes de tejido fijados e incrustados, a menudo material archivado.

Antes de realizar la deteccion de una diana en el formato de ensayo de IHC, ha de realizarse un procedimiento antes de la deteccion. Puede implicar las etapas de: cortar y recortar el tejido, fijacion, deshidratacion, infiltracion de parafina, cortar en secciones finas, montar sobre portaobjetos de vidrio, hornear, desparafinacion, rehidratacion, recuperacion de antfgenos, etapas de bloqueo, aplicar un anticuerpo primario, lavar, aplicar conjugado de anticuerpo secundario - enzima y lavar.

En ISH, se toma una muestra de un individuo, se fija y se expone a una sonda de acido nucleico que se hibrida en virtud de apareamiento de bases complementarias con el acido nucleico de interes. La muestra biologica comprende normalmente un acido nucleico detectable, tal como ADN y ARN, incluyendo ARN mensajero. La deteccion de los niveles de ADN/ARN puede indicar el nivel de expresion de un gen particular, y por tanto puede usare para detectar un estado (tal como un estado patologico) de una celula, un tejido, un organo o un organismo. El acido nucleico en la muestra se desnaturaliza normalmente para exponer sitios de union. La sonda es normalmente un acido nucleico mono o bicatenario, tal como un ADN o ARN, o un analogo de acido nucleico, tal como PNA. La cantidad de la protema o acido nucleico diana relevante detectada mediante tales tecnicas se evalua entonces para determinar si esta por encima de un cierto umbral mmimo predeterminado o se compara con un patron conocido, y por tanto, relevante para el diagnostico. Entonces puede planearse el tratamiento adecuado para el individuo si es necesario.

Se conocen muchos metodos de fijacion e incrustacion de espedmenes de tejido, por ejemplo, fijacion con alcohol y fijacion con formalina e incrustacion en parafina posterior (FFPE).

Son necesarios fijadores para conservar celulas y tejidos de una manera reproducible y similar a la vida. Para lograr esto, se sumergen bloques, secciones o frotis de tejido en un fluido fijador, o en el caso de frotis, se secan. Los fijadores estabilizan las celulas y tejidos protegiendolos de ese modo de los rigores de las tecnicas de procesamiento y tincion.

Puede usarse cualquier agente de fijacion adecuado, por ejemplo, etanol, acido acetico, acido pterico, 2-propanol, tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina dihidratado, acetoma (mezcla de monomero) y dfmero, acrolema, crotonaldehndo (cis+trans), formaldelddo, glutaraldehfdo, glioxal, dicromato de potasio, permanganato de potasio, tetroxido de osmio, paraformaldetHdo, cloruro mercurico, 2,4-diisocianato de tolileno, acido tricloroacetico, acido tungstico. Otros ejemplos incluyen formalina (formaldetHdo acuoso) y formalina tamponada neutra (NBF), glutaraldehndo, acrolema, carbodiimida, imidatos, benzoequinona, acido osmico y tetroxido de osmio.

Espedmenes de biopsia recientes, preparaciones citologicas (incluyendo implantes y frotis de sangre), secciones y tejidos congelados para analisis inmunohistoqmmico se fijan comunmente en disolventes organicos, incluyendo etanol, acetico acido, metanol y/o acetona.

Para facilitar el reconocimiento espedfico en tejido fijado, a menudo es necesario recuperar o desenmascarar las dianas, es decir, los marcadores biologicos de interes, a traves de tratamiento previo de los espedmenes para aumentar la reactividad de la mayona de las dianas. Este procedimiento se denomina “recuperacion de antfgenos”, “recuperacion de dianas” o “recuperacion de epftopos”, “desenmascaramiento de dianas” o “desenmascaramiento de antfgenos”. Puede encontrarse una revision extensa de la recuperacion de antfgenos (desenmascaramiento de antfgenos) en Shi et al. 1997, J Histochem Cytochem, 45(3):327.

La recuperacion de antfgenos incluye una variedad de metodos mediante los cuales se maximiza la disponibilidad de la diana para su interaccion con un reactivo de deteccion espedfico. Las tecnicas mas comunes son digestion enzimatica con una enzima proteolttica (por ejemplo proteinasa, pronasa, pepsina, papama, tripsina o neuraminidasa) en un tampon apropiado o recuperacion de epftopos inducida por calor (HIER) usando irradiacion con microondas, calentamiento en un bano de agua, una caldera, un horno normal, un autoclave o una olla a presion en un tampon de pH estabilizado apropiadamente, que contiene habitualmente EDTA, EGTA, Tris-HCI, citrato, urea, glicina-HCI o acido borico. Pueden anadirse detergentes al tampon de HIER para aumentar la recuperacion de

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epttopos o anadirse al medio de dilucion y/o tampones de aclarado para disminuir la union no espedfica.

El tampon de recuperacion de antfgenos es lo mas a menudo acuoso, pero tambien puede contener otros disolventes, incluyendo disolventes con un punto de ebullicion por encima del del agua. Esto permite el tratamiento del tejido a mas de 100°C a presion normal.

Adicionalmente, la razon de senal con respecto a ruido puede aumentarse mediante diferentes metodos ffsicos, incluyendo la aplicacion de vado y ultrasonidos, o congelando y descongelando las secciones antes o durante la incubacion de los reactivos.

Pueden eliminarse sitios de union a biotina endogenos o actividad enzimatica endogena (por ejemplo fosfatasa, catalasa o peroxidasa) como etapa en el procedimiento de deteccion, por ejemplo, la actividad peroxidasa y de biotina endogena puede eliminarse mediante tratamiento con peroxidos. La actividad fosfatasa endogena puede eliminarse mediante tratamiento con levamisol. Las fosfatasas y esterasas endogenas pueden destruirse mediante calentamiento.

Puede usarse el bloqueo de sitios de union no espedfica con protemas inertes como albumina serica equina (HSA), casema, albumina serica bovina (BSA) y ovoalbumina, suero de ternera fetal u otros sueros, o detergentes como Tween20, Triton X-100, Saponin, Brij o Pluronics. Tambien puede usarse el bloqueo de sitios de union no espedfica en el tejido o las celulas con versiones no marcadas y no espedficas de diana de los reactivos espedficos.

Tambien pueden prepararse muestras y detectarse moleculas diana usando la tecnica de flotacion libre. En este metodo se pone en contacto una seccion de tejido con diferentes reactivos y tampones de lavado en suspension o flotando libremente en recipientes apropiados, por ejemplo tubos de microcentnfuga.

Las secciones de tejido pueden transferirse de tubo a tubo con diferentes reactivos y tampones durante el procedimiento de tincion usando por ejemplo un dispositivo “similar a un anzuelo”, una espatula o un anillo de vidrio. Los diferentes reactivos y tampon tambien pueden cambiarse mediante decantacion suave o succion a vado. Alternativamente, los recipientes con las secciones de tejido pueden vaciarse en una red de tincion especial, como la “Netwell” de Corning (Corning,) y la seccion de tejido lavarse antes de transferirse de nuevo al tubo para la siguiente etapa de tincion.

Todas las etapas, incluyendo por ejemplo fijacion, recuperacion de antfgenos, lavado, incubacion con reactivos de bloqueo, reactivos inmunoespedficos y la deposicion de indicador mediada por peroxidasa, se realizan mientras que la seccion de tejido esta flotando libremente o retenida sobre redes. Tras la deposicion del indicador, la seccion de tejido se monta sobre portaobjetos, el indicador se detecta y el portaobjetos se cubre con un cubreobjetos antes de analizarse, por ejemplo, mediante microscopfa optica o fluorescente.

En algunas realizaciones, la seccion de tejido puede montarse sobre portaobjetos tras la incubacion cntica con los reactivos inmnoespedficos siguiendo el procedimiento (a) del metodo. El resto del procedimiento de deteccion se realiza entonces sobre las secciones de tejido montadas en portaobjetos.

Marcadores biologicos detectables

Detectable mediante el metodo, el marcador biologico puede ser cualquier molecula o estructura presente en una muestra, preferiblemente en una muestra biologica, por ejemplo una protema, glicoprotema, lipoprotema, fosfoprotema, protema metilada, o un fragmento de protema, por ejemplo, un peptido o un acido nucleico, por ejemplo, ADN, ARN, es un lfpido, un glicolfpido, o un azucar, un polisacarido, o un almidon. El marcador biologico puede expresarse sobre la superficie de la muestra biologica, por ejemplo, unido a la membrana. El marcador puede estar contenido en el interior de la muestra biologica, es decir, dentro de la membrana celular, por ejemplo, dentro del citoplasma, dentro del nucleo, dentro de compartimento intracelular u organulo. El marcador biologico puede ser una estructura celular, tal como un microdominio de membrana, canal ionico, estructura cromosomica, etc., o puede ser un complejo molecular, por ejemplo complejo de ARN-protema, etc. Un marcador biologico es preferiblemente un marcador biologico espedfico, por ejemplo es un marcador de un estado normal o patologico, o es espedfico para una celula o tejido particular, o es espedfico para una especie biologica particular. La deteccion de tal marcador biologico puede ser util en el diagnostico y tratamiento de estados patologicos.

La invencion se refiere a la deteccion al menos un marcador biologico en una muestra biologica. Por consiguiente la invencion tambien proporciona la deteccion de multiples marcadores biologicos, por ejemplo, dos, tres, en una muestra dada y por tanto proporciona un metodo de obtencion de datos, por ejemplo, informacion de diagnostico, referencia a la expresion de marcadores biologicos, paneles de protemas, genes o combinaciones de una o mas protemas y uno o mas genes. Como ejemplo, pero no como limitacion, pueden examinarse la protema HER2 y el gen de HER2 simultaneamente en un ensayo de diagnostico de cancer, por ejemplo, un ensayo para detectar cancer de mama. Otro ejemplo no limitativo puede incluir el examen de tres marcadores, por ejemplo, para detectar cancer de cuello uterino. Los marcadores pueden incluir Ki67/mib-1, asf como el marcador de proliferacion celular, p16(INK4a), junto con un marcador, por ejemplo, una protema o un acido nucleico, para el virus del papiloma humano. Aun otro ejemplo no limitativo incluye el examen de multiples marcadores asociados con cancer de prostata. Estos marcadores pueden incluir AMACR P504S, citoqueratina de alto peso molecular (HMW-CK) y p63. El

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examen de esta combinacion de marcadores proporciona un metodo para distinguir tumores de prostata benignos de los malignos.

Es deseable minimizar la reactividad cruzada entre agentes de union, por ejemplo cuando se detectan multiples marcadores. Esto puede lograrse usando diferentes sondas y diferentes moleculas de indicador en los procedimientos de deteccion. Un ejemplo de un sistema de este tipo se representa en la figura 3 en donde se detectan dos marcadores biologicos diferentes, por ejemplo dos receptores celulares diferentes, usando las siguientes etapas:

(1) . incubar la muestra con la primera sonda 1 (1 P1) (por ejemplo un anticuerpo conjugado con HRP AB1)

(2) . incubar la muestra (1) con el indicador 1 (R1) (por ejemplo conjugado de acido ferulico-PNA1) en presencia de un agente de reticulacion (por ejemplo DAB)

(3) . incubar la muestra (2) con peroxido de hidrogeno (> 3% v/v)

(4) . incubar la muestra (3) con la primera sonda 2 (1P2) (por ejemplo anticuerpo conjugado con HRP AB2)

(5) . incubar la muestra (4) con el indicador 2 (R2) (por ejemplo conjugado de acido ferulico-PNA2

(6) incubar la muestra (5) con la segunda sonda 1 (2P1) (por ejemplo PNA1'-FITC) y con la segunda sonda 2 (2P2) (por ejemplo PNA2'-rojo Texas)

Como resultado, la senal fluorescente verde (que emana de PNA1'-FITC) se detecta a partir del sitio diana en donde se deposita R1, la senal fluorescente roja (que emana de PNA2'-rojo Texas) se detecta a partir del sitio diana de deposicion de R2, y la senal amarilla en donde se depositan tanto R1 como R2, es decir a partir del sitio en donde ambas dianas A1 y A2 estan presentes. Todas las etapas del metodo (desde (a) hasta (c)) pueden completarse en el plazo de 2-20 min. Tal deteccion rapida puede usarse ventajosamente para la deteccion automatizada o semiautomatizada de marcadores biologicos diana. Se conocen dispositivos de tincion automatizada en el campo y el metodo puede adaptarse para estos dispositivos.

Pueden usarse dispositivos de tincion automatizados en diversas realizaciones de la invencion, por ejemplo para la deteccion de multiples marcadores biologicos. La deteccion de multiples marcadores requiere frecuentemente equilibrar las senales que emanan de las diferentes sustancias detectables. El procedimiento automatizado puede incluir multiples etapas de amplificacion de las senales que emanan de marcadores biologicos diana. Es especialmente ventajoso cuando van a detectarse multiples marcadores.

Sondas de anticuerpo

El termino “sonda” designa una sustancia que puede unirse espedficamente a una diana, en el que la diana puede ser un marcador biologico, otra sonda, un indicador, o cualquier molecula asociada con dicho marcador biologico, otra sonda o indicador.

En una realizacion la sonda es una sonda de anticuerpo.

Anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, significa una inmunoglobulina o una parte de la misma, y abarca cualquier polipeptido que comprende un sitio de union a antfgeno independientemente de la fuente, el metodo de produccion y otras caractensticas. El termino incluye por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespedficos, poliespedficos, humanizados, de cadena sencilla, quimericos, sinteticos, recombinantes, Idbridos, mutados e injertados con CDR. Una parte de un anticuerpo puede incluir cualquier fragmento que todavfa pueda unirse a un antfgeno, por ejemplo, un Fab, F(ab')2, Fv, scFv. El origen del anticuerpo esta definido por la secuencia genomica independientemente del metodo de produccion.

Anticuerpo primario, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se une espedficamente a un marcador biologico de interes presente dentro de la muestra biologica. En determinadas realizaciones el anticuerpo primario puede polimerizarse. Los anticuerpo primarios pueden derivarse de cualquier especie de sangre caliente, por ejemplo mairnferos, aves. Anticuerpo secundario, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que tiene un dominio de union a antfgeno que se une espedficamente a una primera sonda, por ejemplo, un anticuerpo primario, o un hapteno depositado en el sitio diana, o hapteno unido directa o indirectamente a una primera sonda.

Anticuerpo terciario, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que tiene un dominio de union a antfgeno que se une espedficamente a una segunda sonda (por ejemplo, un anticuerpo secundario) o un hapteno unido a una segunda sonda o un hapteno unido a polfmero conjugado con una segunda sonda, o hapteno depositado en el sitio diana.

Algunas veces un anticuerpo puede funcionar como anticuerpo tanto secundario como terciario.

Los anticuerpos usados en la invencion, incluyendo anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios y anticuerpos

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terciarios, pueden derivarse de cualquier especie de mai^ero, por ejemplo, una rata, un raton, una cabra, una cobaya, un asno, un conejo, un caballo, una llama, un camello, o cualquier especie aviar por ejemplo, pollo, pato. Derivado de cualquier especie de mairnfero o aviar, tal como se usa en el presente documento, significa que al menos una parte de la secuencia de acido nucleico que codifica para un anticuerpo particular se originaba a partir de la secuencia genomica de un mai^ero espedfico, por ejemplo, una rata, un raton, una cabra o un conejo o un ave espedfica por ejemplo, pollo, pato. El anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE o cualquier subclase, por ejemplo, IgG1, lgG2, lgG3, lgG4.

En determinadas realizaciones el anticuerpo primario contiene una region de union a antfgeno que puede unirse espedficamente a un marcador biologico expresado por celulas que comprenden una muestra biologica. El marcador puede expresarse sobre la superficie celular o dentro de la membrana celular, es decir, en el interior de la celula, por ejemplo, dentro del citoplasma, dentro del nucleo, dentro del retfculo endoplasmatico. En algunas realizaciones el marcador biologico se secreta de la celula y por tanto esta presente en disolucion, por ejemplo, en medios de cultivo celular, en sangre o plasma.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo secundario contiene una region de union a antfgeno que se une espedficamente al anticuerpo primario, por ejemplo, la region constante del anticuerpo primario. En determinadas realizaciones, el anticuerpo secundario se conjuga con un polfmero. En algunas realizaciones, el polfmero se conjuga con 2-20 anticuerpos secundarios. En otras realizaciones, el polfmero se conjuga con 2-10 anticuerpos secundarios.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo terciario contiene una region de union a antfgeno que se une espedficamente al anticuerpo secundario, por ejemplo, una region constante del anticuerpo secundario, o un hapteno unido al anticuerpo secundario o un polfmero conjugado al anticuerpo secundario. En determinadas realizaciones, el anticuerpo terciario esta conjugado con un polfmero. En algunas realizaciones, el polfmero esta conjugado con 1-20 anticuerpos terciarios. En otras realizaciones, el polfmero esta conjugado con 1-5 anticuerpos terciarios.

Los anticuerpos que pueden usarse en los metodos y las composiciones de la invencion incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos modificados por ingeniena genetica incluyendo anticuerpos quimericos, injertados con CDr y seleccionados artificialmente producidos usando presentacion en fago o tecnicas alternativas.

Se han descrito diversas tecnicas para producir anticuerpos, vease, por ejemplo, Kohler y Milstein, (1975) Nature 256:495; Harlow y Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Se describen tecnicas para la preparacion de moleculas de anticuerpo recombinantes en las referencias anteriores y tambien en, por ejemplo, los documentos EP 0623679; EP 0368684; y EP 0436597.

Pueden producirse anticuerpos de manera recombinante o sintetica. Pueden aislarse acidos nucleicos que codifican para anticuerpos a partir de una biblioteca de ADNc. Pueden aislarse acidos nucleicos que codifican para anticuerpos de una biblioteca de fagos (veanse por ejemplo McCafferty et al. 1990, Nature 348:552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363; documento EP 0 589 877 B1). Pueden obtenerse acidos nucleicos que codifican para anticuerpos mediante intercambio genico de secuencias conocidas (Mark et al. 1992, Bio/Technol. 10:779). Pueden aislarse acidos nucleicos que codifican para anticuerpos mediante recombinacion In vivo (Waterhouse et al. 1993, Nucl. Acid Res. 21:2265). Los anticuerpos usados en los metodos y las composiciones de la invencion incluyen inmunoglobulinas humanizadas (patente estadounidense n.° 5.585.089, Jones et al. 1986, Nature 332/323).

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos alterados que comprenden una protema efectora tal como una toxina o un marcador, por ejemplo, una sustancia detectable.

Pueden obtenerse anticuerpos del suero de un animal, o, en el caso de anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, producirse en cultivo celular. Puede usarse tecnologfa de ADN recombinante para producir los anticuerpos segun un procedimiento establecido, en cultivo de celulas bacterianas, de levadura, de insecto o de mai^ero. En determinadas realizaciones, el sistema de cultivo celular seleccionado secreta preferiblemente el producto de anticuerpo.

Sondas de acido nucleico

En otra realizacion una primera sonda puede ser o comprender una molecula de acido nucleico o analogo de acido nucleico, por ejemplo, una molecula aDn, una molecula de ARN, una molecula de PNA, para su uso en hibridacion In situ. Pueden sintetizarse sondas de acido nucleico qmmicamente o producirse de manera recombinante en celulas (vease por ejemplo Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Press). En algunas realizaciones, la sonda esta compuesta por un acido nucleico peptfdico(PNA). Un acido nucleico peptfdico es una molecula de acido nucleico en la que la estructura principal de azucar de desoxirribosa o ribosa, habitualmente presente en ADN y ARN se reemplaza por una estructura principal peptfdica. Se conocen en la tecnica metodos de preparacion de PNA (vease por ejemplo Nielsen, 2001, Current Opinion in Biotechnology 12:16). En otras realizaciones, la sonda esta compuesta por acidos nucleicos bloqueados (LNA) (Sorenson et al. 2003, Chem. Commun. 7(17):2130). En algunas realizaciones, la sonda de acido nucleico se une espedficamente al

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marcador biologico, por ejemplo, una molecula de acido nucleico contenida dentro de la muestra biologica.

La sonda de acido nucleico, en realizaciones particulares, comprende al menos una secuencia que se hibrida espedficamente con una secuencia diana en la muestra biologica, por ejemplo una secuencia de acido nucleico tal como una secuencia de ADN genomico o una secuencia de ARNm, en condiciones espedficas de rigurosidad. Tal como se usa en el presente documento, el termino “hibridacion en condiciones rigurosas” pretende describir condiciones para la hibridacion y lavados en las que secuencias de nucleotidos que son significativamente complementarias entre sf permanecen unidas entre sf. Las condiciones son tales que secuencias al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85-90% complementarias permanecen unidas entre sl El porcentaje de complementariedad se determina tal como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

Se conocen en la tecnica condiciones de rigurosidad especificadas y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ausubel et al. 1995 eds.), secciones 2, 4 y 6.. Adicionalmente, se describen condiciones rigurosas especificadas en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Press, capftulos 7, 9 y 11. En algunas realizaciones, las condiciones de hibridacion son condiciones de alta rigurosidad. Un ejemplo de condiciones de hibridacion de alta rigurosidad es hibridacion en 4X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 65-70°C o hibridacion en 4X SSC mas formamida al 50% a 42-50°C, seguido por uno o mas lavados en 1X SSC, a 65-70°C. Se entendera que pueden anadirse reactivos adicionales a los tampones de hibridacion y/o lavado, por ejemplo, agentes de bloqueo (BSA o ADN de esperma de salmon), detergentes (SDS), agentes quelantes (EDTA), Ficoll, PVP, etc.

En algunas realizaciones, las sondas de acido nucleico se hibridan a una secuencia diana en una muestra en condiciones moderadamente rigurosas. La rigurosidad moderada, tal como se usa en el presente documento, incluye condiciones que pueden determinar facilmente los expertos habituales en la tecnica basandose en, por ejemplo, la longitud del ADN. Se exponen condiciones ejemplificadas por Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. vol. 1, pags. 1,101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), e incluyen el uso de una disolucion de prelavado de 5X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridacion de formamida al 50%, 6X SSC a 42°C (u otra disolucion de hibridacion similar, tal como disolucion de Stark, en formamida al 50% a 42°C), y condiciones de lavado de 60°C, 0,5X SSC, SDS al 0,1%.

En algunas realizaciones, las sondas de acido nucleico se hibridan con una secuencia diana en una muestra en condiciones de baja rigurosidad. Las condiciones de baja rigurosidad pueden incluir, tal como se usa en el presente documento, condiciones que pueden determinar facilmente los expertos habituales en la tecnica basandose en, por ejemplo, la longitud del aDn. Baja rigurosidad puede incluir, por ejemplo, tratar previamente el ADN durante 6 horas a 40°C en una disolucion que contiene formamida al 35%, 5 x SSC, Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP al

0. 1%, Ficoll al 0,1%, BSA al 1% y ADN de esperma de salmon desnaturalizado 500 |ig/ml. Se llevan a cabo hibridaciones en la misma disolucion con las siguientes modificaciones: PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, ADN de esperma de salmon 100 |ig/ml, sulfato de dextrano al 10% (p/vol) y se usa sonda de 5-20x106 CPM. Se incuban las muestras en la mezcla de hibridacion durante 18-20 horas a 40°C, y luego se lava durante 1,5 h a 55°C en una disolucion que contiene 2 x SSC, Tris-HCI 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM y SDS al 0,1%. Se reemplaza la disolucion de lavado por disolucion nueva y se incuba 1,5 h adicionales a 60°C.

Otras realizaciones de las sondas incluyen secuencias peptfdicas, por ejemplo secuencias peptfdicas derivadas de dominios de union a protema o acido nucleico de diferentes protemas, ligandos de diferentes receptores celulares y nucleares y sus derivados, moleculas pequenas que pueden unirse espedficamente a determinadas unidades estructurales de moleculas biologicas grandes, sin embargo, esto es tan solo una lista de ejemplos no limitativos de sustancias que pueden usarse como sondas para los fines de la presente invencion.

Ejemplos

1. Ejemplos de moleculas de indicador de la invencion.

Abreviaturas

MBHA 4-Metilbenzhidrilamina

NMP N-metilpirrolidona

HATU hexafluorofosfato de 2-(1h-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3tetrametiluronio; metenaminio

DIPEA Diisopropiletilamina

DCM Diclorometano

TFA Acido trifluoroacetico

TFMSA Acido trifluorometilsulfonico

Fer Acido ferulico

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40

45

50

FLU

Fluorescema

Tyr

Tirosina

Lys

Lisina

Dex

Dextrano

HPLC

Cromatograffa de lfquidos de alta resolucion

equi.

equivalente

1.1. Fer-L30-Lys(Flu)-NH2 (D17158)

Se descargo la resina MBHA con Fmoc-Lys(ivDDE) hasta una carga de 150 micromol/g. Se elimino Fmoc de 200 mg de resina con piperidina al 20% en NMP, luego se sometio a un acoplamiento con Boc-L30-OH (1,5 ml 0,26 M en NMP, preactivado con 0,9 equi. de HATU, 2 equivalentes de DIPEA durante 2 min) durante 20 min. Se elimino el grupo ivDDE con hidracina al 5% en NMP, y se marco la cadena lateral de lisina con carboxifluorescema (Flu) (1,5 ml 0,2 M en NMP, preactivado durante 2 min con 0,9 equi. de HATU, 2 equi. de DIPEA) durante 2x20 min. Se trato la resina con piperidina al 20% en NMP, NMP, DCM, luego DCM. Se escindio el producto intermedio H-L30- Lys(Flu)-NH2 de la resina con TFA:TFMSA:mCresol (7:2:1, 1,5 ml durante 1 h), se precipito con dietileter, se resuspendio en TFA, se precipito con dietileter, se resuspendio en NMP y se precipito de nuevo con dietileter. Se basifico con 100 microlitros de DIPEA y se disolvio directamente en 0,5 ml de acido ferulico 0,3 M preactivado con 0,9 equi. de HATU y 2 equi. de DIPEA. Tras 25 min se precipito el producto en bruto con dietileter, se disolvio en 450 microlitros de NMP y 50 microlitros de etilendiamina. Tras 5 min se precipito el producto con dietileter, se disolvio en acetonitrilo al 15% en agua (8 ml) y se acidifico con 100 microlitros de TFA y se sometio a purificacion mediante RP-HPLC.

1.2. Fer-L150-Lys(FIu)-NH2 (D17157)

Se descargo la resina MBHA con Boc-Lys(Fmoc) hasta una carga de 100 micromol/g. Se sometieron 100 mg de resina a 5 ciclos de acoplamiento con Boc-L30-OH (a. Acoplar con Boc-L30-OH como en 1. b. Ocupar los extremos con anhudrido acetico al 2% en NMP:piridina 1:1, 2 min. c. Eliminar Boc con mCresol al 5% en tFa 2x5 min.). Se elimino Fmoc de la cadena lateral de lisina y se marco con carboxifluorescema, como en 1. Se escindio el producto intermedio H-L150-Lys(Flu)-NH2 de la resina, y se marco de manera N-terminal con acido ferulico y se purifico como en 1.1.

1.3. betaala-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2 (D16127)

Se preparo Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc) sobre 0,5 g de resina MBHA con qmmica en fase solida convencional (como en 1.1. y 1.2). Se eliminaron los grupos Fmoc de las cadenas laterales de lisina con piperidina al 20% en NMP y se sometio el compuesto a marcaje con carboxifluorescema repetido (3x30 min). Tras la eliminacion de los grupos Boc con TFA, se marco el extremo N-terminal en fase solida con ester terc-butflico del acido betaalanina-N,N-diacetico (betaala). Tras la escision de la resina y la purificacion mediante HPLC, se aislo betaala-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2.

1.4. H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2 (D16126)

Se preparo la resina Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc) y se marco con fluorescema usando el procedimiento descrito en 1.3. Tras la eliminacion de los grupos Boc se marco el extremo N-terminal con N-Boc-S(4- metoxibencil)-Cys-OH. Se escindio el compuesto de la columna y se purifico mediante HPLC:

Las moleculas 1.1, 1.2, 1.3 y 1.4 son realizaciones no limitadas de indicadores que comprenden residuos de fluorescema.

1.5. Fer-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30Lys(NH2)-NH2 (D17120)

A la resina MBHA se le acoplo secuencialmente Boc-Lys(Fmoc) (2 ciclos), Boc-L30-OH (5 ciclos) y Boc-lys(2CIZ)- OH. Se escindio el producto intermedio de la resina en presencia de un eliminador de tianisol al 10% para eliminar los grupos 2CIZ. Se marcaron el extremo N-terminal y las 5 cadenas laterales de lisina desprotegidas con acido ferulico como en 1-1 (2x30 min.). Se elimino luego el grupo Fmoc del N de los residuos de lisina C-terminales con etilendiamina al 10% en NMP antes de la purificacion.

1.6. Fer-(Lys(Fer)-L30)5-Lys(NH-betala((L90-Lys(Flu))3-NH2)-NH2 (D17134)

Se disolvio betaala-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2 (compuesto 1.4) 500 nmol en 88 microlitros de NMP y 2 microlitros de piridina, y se convirtio en un anhudrido dclico por reaccion con 10 microlitros de diisopropilcarbodiimida durante 10 min. Se precipito el anhudrido con dietileter, y se disolvio el sedimento en 100 microlitros de NMP que comprendfa Fer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)-NH2 250 nmol. Tras 20 min se anadieron

5 microlitros de etilendiamina, y tras 5 min se precipito el producto con dietileter, se acidifico y se purifico mediante HPLC.

1.7. Ac-(Tyr(OH)-L30)6-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-Lys(Flu)-NH2 (D18044)

Se preparo Ac-(Tyr(2BrZ)-L30)6-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc) sobre resina MBHA. Se eliminaron en 5 fase solida los grupos Fmoc, y se marcaron las cadenas laterales de lisina con carboxifluorescema. Tras la escision de la resina, se purifico el producto mediante HPLC.

1.8. Fer-Lys(Fer)-L60-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L60-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L30Lys(NH2)-NH2 (D17140)

Se preparo Boc-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L30-Lys(Fmoc) sobre resina MBHA. Tras la escision de la resina, se aislo el producto intermedio H-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)- 10 Lys(NH2)-L30-Lys(Fmoc) mediante precipitacion, y se marco con acido ferulico como en 1.1. Se aislo el producto

final mediante HPLC.

Los ejemplos 1.5.-1.8. Son los ejemplos de moleculas de agente de reticulacion de formula

(R1)n-(X)q-R2(m),

en la que

15 R1 y R2 son dos restos diferentes de sustrato(s) de HRP (por ejemplo Fer o Tyr)

X es una molecula de ligado de la siguiente formula

imagen1

en la que R3 y R4 son residuos de Lys, y m, n y q son de desde 1 hasta 6.

20 Agentes de reticulacion de polfmeros lineales (por ejemplo moleculas 1.6 y 1.7 descritas anteriormente) que llevan varios residuos de fluorescema, acido ferulico (1.6) y/o tirosina (1.7) tambien son realizaciones de indicadores que pueden depositarse por HRP en presencia de otro agente de reticulacion, por ejemplo, DAB. Tales indicadores/agentes de reticulacion lineales de peso molecular relativamente bajo (PM<15 kDa) pueden ser particularmente utiles cuando los restos de enzima HRP se unen a sitios diana que no son facilmente accesibles o 25 no estan expuestos, por ejemplo en nucleos celulares tal como ADN. Moleculas indicadoras mas grandes, por ejemplo indicadores que comprenden moleculas de dextrano conjugadas con decenas y cientos de marcadores (por ejemplo Flu y/o Fer y/o Tyr), tal como por ejemplo la molecula 1.9 (descrita anteriormente), pueden usarse cuando los restos de enzima peroxidasa estan ubicados en sitios diana mas facilmente accesibles.

1.9. Dex70 conjugado con agente de reticulacion 1.5 y agente de reticulacion 1.4 (D17128)

30 Se hizo reaccionar dextrano de PM de 70 kDa, activado con divinilsulfona, 10 nmol, con Fer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)- NH2 (compuesto 1.5) 500 nmol, en un volumen total de 300 microlitros de NaHCO3 0,16 M pH 9,5 durante 30 min a 40°C. Tras observarse una ligera precipitacion, se anadieron adicionalmente 100 microlitros de agua y se permitio que la reaccion avanzara durante otros 30 min. Se anadieron adicionalmente 200 microlitros de NaHcO3 0,15 M junto con H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2 (compuesto 1.4) 500 nmol. Tras 1 h a 40°C, se 35 extinguio la mezcla de reaccion mediante la adicion de 50 microlitros de cistema 0,165 M durante 30 min, se filtro la disolucion, y se purifico el producto mediante FPLC en superdex 200 con EtOH al 20% en disolucion acuosa que contiene cHeS 10 mM, pH 9,0 y NaCI 0,1 M. El producto eluido era un conjugado de dextrano que comprendfa alrededor de 56 residuos de fluorescema y 113 de acido ferulico.

1.5. Anticuerpo de cabra-anti-raton-Dex70-HRP (D18033)

40 Se hicieron reaccionar dextrano de PM de 70 kDA y HRP 602 nmol activados con divinilsulfona 13,7 nmol en 600 microlitros de tampon (NaCl 100 mM, NaHCO3 25 mM, pH 9,5) durante 3 h a 30°C. Luego se anadio anticuerpo de cabra anti-F(ab)2 de raton en 105 microlitros de agua, y se continuo la reaccion durante 16 h adicionales. Se inactivo la mezcla de reaccion mediante la adicion de 70 microlitros de cistema 0,165 M durante 30 min y se purifico el producto en superdex 200 en NaCl 100 mM, HEPES 10 mM pH 7,2. El producto eluido era un conjugado de 45 dextrano que comprendfa anticuerpo de cabra-anti-raton (GaM) y HRP (razon dex:GaM:HRP=1:1:1).

1.6. Anticuerpo anti-FITC-Dex70-HRP (D18058)

Se hicieron reaccionar dextrano de PM de 70 kDA y HRP 440 nmol activados con divinilsulfona 10 nmol en 400

5

10

15

20

25

30

35

microlitros de tampon (NaCI 100 mM, NaHCO3 25 mM, pH 9,5) durante 3 h a 30°C. Luego, se anadio anticuerpo anti- F(ab)2 de raton 30 nmol en 80 microlitros de agua, y se continuo la reaccion durante 90 min adicionales a 40°C. Se extinguio la mezcla de reaccion mediante la adicion de 50 microlitros de cistema 0,165 M durante 30 min y se purifico el producto en superdex 200 en NaCl 100 nM, HEPES 10 mM pH 7,2. El producto eluido era un conjugado de dextrano con anticuerpo anti-FITC y HRP (razon de Dex/anti-FITC/HRp = 1/2/9).

1.7. Anticuerpo anti-FITC-Dex70-HRP (D17030)

Se hicieron reaccionar dextrano de PM de 70 kDA; HRP 440 nmol y F(ab)2 anti-FITC 25 nmol activados con divinilsulfona 10 nmol en 374 microlitros de tampon (NaCl 100 mM, NaHCO3 25 mM, pH 9,5) durante 16 a 30°C. Se extinguio la mezcla de reaccion mediante la adicion de 50 microlitros de cistema 0,165 M durante 30 min y se purifico el producto en superdex 200 en NaCl 100 nM, HEPES 10 mM pH 7,2. El producto eluido era un conjugado de dextrano que comprendfa anti-FITC y HRP (razon 1:1:1).

Las moleculas 1.10, 1.11 y 1.12 representan realizaciones de conjugados de anticuerpo-dextrano-HRP que pueden ser utiles como sondas para la deteccion de moleculas de indicador depositadas. El conjugado 1.10. tambien puede ser util como sonda adicional para la deteccion de las sondas unidas al indicador depositado (por ejemplo en la etapa (b) del metodo para detectar un marcador en el sitio diana descrito anteriormente).

3. Ejemplo de tinciones de IHC usando el metodo de la invencion.

Se llevo a cabo la IHC en airngdalas incrustadas en parafina fijadas con formalina. Se cortaron secciones de 3-5 micrometres, se hornearon y se almacenaron a 4°C, hasta su uso. Se elimino luego la parafina con xileno (2x5 min); etanol al 99% (2x2 min); etanol al 70% (2x2 min) y finalmente agua. Se pusieron los portaobjetos en la disolucion de recuperacion de dianas, pH 9, (DAKO S2367) y luego se calentaron en un horno microondas (se sometieron a ebullicion durante 10 min). Despues de eso, se permitio que los portaobjetos se enfriaran y luego se transfirieron al tampon de lavado (DAKO S3006). Al procedimiento le siguio una etapa de bloqueo de actividad peroxidasa endogena con peroxido de hidrogeno al 3% durante 5 min, luego se transfirieron de nuevo los portaobjetos al tampon de lavado y luego se tineron. Para minimizar la variacion de portaobjeto a portaobjeto, cada experimento comparativo se llevo a cabo con secciones cortadas consecutivamente durante el mismo dfa. Se puntuaron las senales espedficas, asf como las de fondo usando una escala de puntuacion de desde 0 hasta 4 en el que 0 representa ausencia de tincion en absoluto, 1 - tincion debil, 2 - tincion moderada, 3 - tincion fuerte, 4 - sobretincion.

Experimento de IHC 1.

Se diluyeron citoqueratina, anticuerpo de cabra-anti-raton-HRP y anticuerpo anti-FITC-HRP en BSA al 2%, casema al 0,2%, PEG al 2%, Tween20 al 0,1%, NaCl 0,1 M, HEPES 10 mM, pH 7,2 (tampon BCPT). Se diluyeron indicador D17128 y DAB (DAKO K5007 C) en tampon de sustrato de DAB (DAKO K5007 B). Todas las incubaciones duraron 5 min, seguido por 2 min de lavado en tampon de lavado de DAKO S3006, excepto tras la incubacion con D17128, en donde los lavados se realizaron en CHES 10 mM a pH 9 + Tween20 al 0,1%.

La tabla y el texto siguientes resumen las realizaciones del experimento:

Sonda de anticuerpo primario Sonda de anticuerpo secundario Agente de reticulacion e indicador Sonda de deteccion de indicador Agente de reticulacion e indicador Sonda de deteccion de indicador Disolucion de revelado

Portaobjetos 1

Citoqueratina (DAKO M5315) 15 nM GaM-HRP, D18033, 125 nM, DAB (DAKO K5007 C) sin indicador

Portaobjetos 4

Como portaobjetos 1 GaM-HRP, D18033 5 nM D17128 100 nM + DAB 1:150 D17030 50 nM DAB

Portaobjetos 7

Como portaobjetos 1 GaM-HRP, D18033 0,5 nM Como porta- objetos 4 Como porta- objetos 4 D17128 100 nM + DAB 1:150 D17030 50 nM DAB

Portaobjetos 9

Como portaobjetos 1 GaM-HRP, D18033 0,5 nM D17128 20 nM+ DAB 1:150 Como portaobjetos 4 Como portaobjetos 7 Como portaobjetos 7 DAB

Portaobjetos 1 - tincion de DAB-HRP convencional (sin amplificacion). El reactivo DAB DAKO convencional (K7005 C) contiene DAB 3 mM.

5

10

15

20

25

30

Portaobjetos 4 - deposicion de indicador D17128 en presencia de conjugado de DAB-GaM-HRP 1 mM D18033 diluido 25 veces en comparacion con el portaobjetos 1 - amplificacion de una etapa.

Portaobjetos 7 y portaobjetos 9 - dilucion adicional del conjugado de GaM-HRP D18033 en comparacion con el portaobjetos 1 y etapa adicional de deposicion de indicador.

Los portaobjetos 1, 4 y 7 se tineron todos espedficamente con puntuaciones de desde 2,5 hasta 3. Se logro una amplificacion de 250 veces de la senal (portaobjetos 9 en comparacion con portaobjetos 1) debido a la deposicion del indicador D17128 en presencia de dAb seguido por el reconocimiento del indicador por la sonda de anticuerpo anti-FITC-HRP D17030. Notablemente, las tinciones de ambos portaobjetos 7 y 9 segman siendo claras (es decir, no difusas), con bordes mtidos entre zonas tenidas y no tenidas indicando que tiene lugar muy poca difusion en los sitios de deposicion.

Experimento de IHC 2.

Se diluyeron citoqueratina, GaM-HRP y anticuerpo anti-FITC-HRP en BSA al 2%, casema al 0,2%, PEG al 2%, Tween20 al 0,1%, NaCl 0,1 M, HEPES 10 mM, pH 7,2 (tampon BCPT). Se diluyeron D17128 y DAB (DAKO K5007 C) en tampon de sustrato de DAB (DAKO K5007 B). Todas las incubaciones fueron de 5 min, seguido por 2 min de lavado en DAKO S3006, excepto tras la incubacion con indicador D17128, en el que los lavados se realizaron en CHES 10 mM pH 9 + Tween20 al 0,1%.

La tabla y el texto siguientes resumen las realizaciones del experimento:

Sonda de anticuerpos primario y secundario Agente de reticulacion e indicador Sonda de indicador Disolucion de revelado

Portaobjetos 9

Citoqueratina DAKO M5315 15 nM + GaM-HRP, D18033, 10 nM D17128 25 nM sin agente de reticulacion D18058 anti- FITC-HRP 25 nM DAB (DAKO K5007 C)

Portaobjetos 12

Como portaobjetos 9 D17128 25 nM + D17140 100 microM Como portaobjetos 9 DAB (DAKO K5007 C)

Portaobjetos 14

Como portaobjetos 9 D17128 25 nM+ DAB 1:150 Como portaobjetos 9 DAB (DAKO K5007 C)

Los portaobjetos 12 y 14 se tineron fuerte y espedficamente (ambos con puntuacion de 2), mientras que el portaobjetos 9 no se tino (puntuacion de 0). Los resultados muestran que el indicador no se precipito mediante HRP en el medio sin un agente de reticulacion (por ejemplo DAB (portaobjetos 14) o D17140 (portaobjetos 12)).

El experimento ilustra adicionalmente la posibilidad de reducir el numero de etapas mediante la preincubacion (durante 10 min) del anticuerpo primario con el conjugado de anticuerpo secundario-HRP.

Experimento de IHC 3.

Se diluyeron citoqueratina, GaM-HRP y anticuerpo anti-FITC-HRP en BSA al 2%, casema al 0,2%, PEG al 2%, Tween20 al 0,1%, NaCl 0,1 M, HEPES 10 mM, pH 7,2 (tampon BCPT). Se diluyeron D17128 y DAB (DAKO K5007 C) en tampon de sustrato de DAB (DAKO K5007 B). Todas las incubaciones fueron de 5 min, seguido por 2 min de lavado en DAKO S3006, excepto tras las incubacion con D17128 y D18044, en el que los lavados se realizaron en CHES 10 mM pH 9 + Tween20 al 0,1%. Cuando se aplico la tercera etapa de incubacion de los portaobjetos con DAB en tampon sustrato (portaobjetos 3 y 5), el tiempo de incubacion fue de 1 min.

La tabla y el texto siguientes resumen las realizaciones del experimento:

Sonda de Sondas de Agente de Agente de Sonda de Disolucion de

anticuerpo anticuerpo reticulacion e reticulacion indicador revelado

primarios secundario indicador e indicador

Portaobjetos 2

Citoqueratina DAKO M5315 15 nM GaM-HRP, D18033, 3 nM, D17128 50 nM + DAB 1:150 D18058 anti-FICT- HRP50 nM DAB

Portaobjetos 3

Como portaobjetos 2 Como portaobjetos 2 DAB sin indicador D17128 50 nM + DAB 1:150 D18058 anti- FICT- HRP 50 nM DAB

Portaobjetos 4

Como portaobjetos 2 Como portaobjetos 2 D17128 50 nM sin agente de reticulacion D18058 anti-FICT- HRP50 nM DAB

Portaobjetos 5

Como portaobjetos 2 Como portaobjetos 2 DAB sin indicador D17128 50 nM sin agente de reticulacion D18058 anti- FICT- HRP 50 nM DAB

El portaobjetos 2 fue el portaobjetos mas intensamente tenido (puntuacion de 3), mostrando que el minuto de aplicacion extra de DAB de la tercera etapa en el portaobjetos 3 (puntuacion de 2,5) no mejoro mucho, sino que redujo ligeramente la intensidad de la tincion. La falta de tincion en ausencia de agente de reticulacion en el portaobjetos 4 (puntuacion de 0) es acorde a los resultados obtenidos en el experimento de IHC 2 (descrito 5 anteriormente). En el portaobjetos 5, cuando se aplico DAB antes de la aplicacion del conjugado de indicador D17128, se observo una tincion (puntuacion de 2), aunque no tan intensa como en el portaobjetos 3.

Estos resultados muestran que puede aplicarse un agente de reticulacion en primer lugar en una etapa separada antes de la incubacion del portaobjetos con tanto indicador como agente de reticulacion (es decir, en una etapa de preincubacion). Otro efecto positivo de aplicar DAB antes de la deposicion del indicador marcado fue una notable

10 reduccion de la tincion de fondo (puntuacion de 0,5-1 en el portaobjetos 2, y puntuacion de 0 en el portaobjetos 3), mientras que la intensidad de senales espedficas no disminuyo mucho. La tincion de fondo difusa particularmente debil asociada con union no espedfica de conjugados de cabra-anti-raton-HRP, en muchos casos se elimino practicamente mediante la etapa de 1 min extra de DAB antes de la deposicion.

Experimento de IHC 4.

15 Se diluyeron citoqueratina, GaM-HRP y anticuerpo anti-FITC-HRP en BSA al 2%, casema al 0,2%, PEG al 2%, Tween20 al 0,1%, NaCl 0,1 M, HEPES 10 mM, pH 7,2 (tampon BCPT). Se diluyeron D17128, D 18044 y DAB (DAKO K5007 C) en tampon de sustrato de DAB (DAKO K5007 B). Todas las incubaciones fueron de 5 min, seguido por 2 min de lavado en DAKO S3006, excepto tras las incubaciones con D17128 y D18044, en el que los lavados se realizaron en CHES 10 mM pH 9 + Tween20 al 0,1%.

20 La tabla y el texto siguientes resumen las realizaciones del experimento:

Sondas de anticuerpos primario y secundario Preincubacion con agente de reticulacion (DAB) Agente de reticulacion (DAB) e indicador

Portaobjetos 8

Citoqueratina DAKO M5315 15 nM + GaM-HRP, D18033, 10 nM DAB 1:150 en tampon de sustrato (DAKO K5007 C) 1 min D17128 50nM+ DAB 1:150 (DAKO K5007 C) D18058 50 nM DAB

Portaobjetos 9

Como portaobjetos 8 Como portaobjetos 8 D17128 50 nM+ DAB 1:150 Como portaobjetos 8 Como portaobjetos 8

Portaobjetos 10

Como portaobjetos 8 Como portaobjetos 8 D17128 50 nM+ DAB 1:500 Como portaobjetos 8 Como portaobjetos 8

Portaobjetos 11

Como portaobjetos 8 Como portaobjetos 8 D18044 5 microM + DAB 1:150 Como portaobjetos 8 Como portaobjetos 8

5

10

15

20

25

30

35

Portaobjetos 12

Como portaobjetos 8 Como portaobjetos 8 D18044 5 microM + DAB 1:150 Como portaobjetos 8 Como portaobjetos 8

Portaobjetos 13

Como portaobjetos 8 Como portaobjetos 8 D18044 5 microM + DAB 1:500 Como portaobjetos 8 Como portaobjetos 8

Este experimento ilustra el efecto de la concentracion de agente de reticulacion sobre la deposicion de dos tipos diferentes de indicadores. El portaobjetos 9 fue el portaobjetos mas intensamente tenido (puntuacion de 4). Se aplico DAB como agente de reticulacion en el portaobjetos 9 a una dilucion 1:150 (1 mM). Concentraciones mas altas (1:50 (3 mM), portaobjetos 8) o mas bajas (1:500 (30 mM), portaobjetos 10) de DAB dieron una tincion ligeramente menos intensa (puntuacion de 3,5). Tambien se observo el efecto de reduccion del fondo de la preincubacion con DAB; ninguno de los seis portaobjetos (de la tabla anterior) tema una tincion de fondo significativa.

Se depositaron mejor los indicadores de bajo peso molecular (por ejemplo indicador 18044 descrito anteriormente) a concentraciones mas bajas de DAB (portaobjetos 13; puntuacion de 3); la intensidad de tincion disminuyo con el aumento de las concentraciones de dAb (portaobjetos 12, puntuacion de 2,5; portaobjetos 11, puntuacion de 2).

Este experimento tambien ilustra que pueden usarse moleculas de indicador mas grandes que comprenden muchos restos de sustrato de peroxidasa en cantidades mas bajas (por ejemplo conjugado de fluorescema-acido ferulico dextrano D17128, 50 nM) en comparacion con moleculas de indicador mas pequenas que comprenden lo mismo pero menos restos de sustrato de peroxidasa (por ejemplo D 18044,t 5 microM) para obtener los mismos o incluso mejores resultados de tincion.

4. Ejemplo de amplificacion de una senal de sonda de acido nucleico usando el metodo de la invencion.

Procesando muestras con y sin el uso de DAB en la disolucion de cromogeno y la disolucion potenciadora de senal, puede ilustrarse el efecto precipitante de DAB. Puede obtenerse una ilustracion adicional de la amplificacion de senal de la invencion por la dilucion adicional de o bien la sonda, el anticuerpo o bien omitiendo la segunda etapa de bloqueo de peroxidasa.

Tejido: Airngdala incrustada en parafina fijada con formalina.

Sonda marcada con fluorescema dirigida contra el centromero del cromosoma 11.

Se usan las siguientes disoluciones en el ejemplo:

Recuperacion antfgenos/pretratamiento Tampon de lavado 1 Tampon de lavado 2 Pepsina RTU

Tampon de lavado riguroso R-a-Fitc/HRP, F(ab)

Diluyente de anticuerpo Sonda

Disolucion de bloqueo de peroxidasa Rojo nuclear rapido Tampon de cromogeno

(Dako K5599) (Dako K5331) (Dako S 3006) (Dako K5331) (Dako K 5331 ) (Dako P 5100) (Dako S 2022) (Dako Y 5505) (Dako S 2023) (Dako S1968) (Dako K5007)

Se uso un agente de hibridacion (Dako S2451) para hibridar las sondas Preparacion de la disolucion de cromogeno y la disolucion potenciadora de senal: Disolucion A:

Se disuelven 102,5 mg de 5-amino-2-[3-[5-amino-1,3-dihidro-3,3-dimetil-1-(4sulfobutil)-2Hindol-2-iliden]-1-propenil]- 3,3dimetil-1-(4sulfobutil)-3H-indolio, ter-trifluoroacetato en 4,525 ml de propanodiol/agua 8:2

Disolucion B:

5

10

15

20

25

Se disuelven 59,6 mg de diclorhidrato de 3,3'-Di-aminobencidina en 5,96 ml de propanodiol/agua 8:2. Se anaden 13,7 |il de acido clorhndrico 12 M.

Disolucion C:

Se mezclan la disolucion A y la disolucion B a una razon de 1 ml de A: 9 ml de B.

Disolucion de cromogeno:

Para la tincion, se diluyeron estas disoluciones madre en el tampon de cromogeno de los kits obtenidos de Dakocytomation n.° de codigo K5007.

Se mezcla 1 ml de disolucion C con 19 ml de tampon de cromogeno Disolucion D:

Se diluye 1 ml de disolucion B con 499 ml de tampon de cromogeno.

Disolucion potenciadora de senal:

Esta es una disolucion de D1734 en etanol al 20%, NaCI 0,1 M, CHES 10 mM pH 9,0 diluido con disolucion D hasta una concentracion de 250 nM o 50 nM de Fer-L30-FITC. En el caso de ausencia de DAB en la disolucion, se realizo la dilucion directamente en el tampon de cromogeno

Procedimiento para tincion de tejido:

Se desparafinizaron portaobjetos de tejido de airngdalas humanas, se lavaron y se realizo la recuperacion de antfgenos en 10 min en un horno microondas. Tras otro lavado, tratamiento con pepsina a 37°C y lavado, se deshidrataron los portaobjetos y se incubaron con la sonda de PNA. Tras 5 min de desnaturalizacion de la muestra a 85°C, se hibridaron las sondas durante 1 hora a 45°C. Se lavaron rigurosamente los portaobjetos a 65°C durante 10 min. Se bloqueo la peroxidasa durante 3 min, se lavaron los portaobjetos y se incubaron con un anticuerpo de conejo-anti-FITC/HRP diluido 1:20. Tras 30 min se lavaron los portaobjetos y se incubaron con la disolucion potenciadora de senal. Tras 30 min se lavaron los portaobjetos, se bloqueo la peroxidasa durante 3 min, se lavaron de nuevo y se incubaron los portaobjetos con un anticuerpo de conejo-anti-FlTc/HRP diluido 1/20. Tras 30 min se lavaron los portaobjetos y se incubaron con una disolucion de cromogeno. Tras el lavado con agua se contratineron los portaobjetos con rojo nuclear rapido, se lavaron y se montaron.

Se ilustran la configuracion experimental y los resultados de la tincion en la siguiente tabla:

Portaobjetos n.°

Sonda 1, veces Anticuerpo anti- FITC/HRP 30 min Disolucion potenciadora de senal 30 min Anticuerpo Anti- FITC/HRP 30 min Resultado

Intensidad de senal

Comentarios

1

Tampon Anti- FITC/HRP 1:50 Fer6-Flu3 50 nM con DAB 1:20 0

2

Y5505 diluido 10x 1:100 Fer6-Flu3 50 nM 1:20 0

3

Y5505 Fortyndet 50x 1:100 Fer6-Flu3 50 nM con DAB 1:20 1/ Sin DAB en la disolucion de cromogeno

4

Y5505 diluido 10x 1:100 Fer6-Flu3 50 nM con DAB 1:20 2/

5

Y5505 diluido 10x 1:100 Fer6-Flu3 250 nM con DAB 1:20 4 Sobretincion/dema siada senal

6

Y5505 diluido 10x 1:100 Fer6-Flu3 250 nM 1:20 0-/

7

Y5505 Fortyndet 50x 1:100 Sin amplificacion tenida directamente tras la primera incubacion con anticuerpo anti-FITC/HRP 0

El portaobjetos 1 es un control que muestra que se necesita la sonda para obtener una senal

El portaobjetos 2 muestra que sin un agente de reticulacion en la disolucion potenciadora de senal no se obtiene ninguna senal espedfica.

El portaobjetos 3 muestra que la adicion de un agente de reticulacion (DAB) a la disolucion potenciadora de senal da como resultado una alta amplificacion de la senal. Este es el unico portaobjetos que no tema DAB en la disolucion de cromogeno.

El portaobjetos 4 muestra que la adicion de un agente de reticulacion a la disolucion de cromogeno potencia 5 adicionalmente la senal (en comparacion con el portaobjetos 3)

El portaobjetos 6 muestra que al aumentar la concentracion del potenciador de senal (D17134) puede obtenerse una senal debil sin un agente de reticulacion. Sin embargo, la adicion de un agente de reticulacion da una fuerte amplificacion de esta senal (tal como se ilustra mediante el portaobjetos 5)

Claims (10)

10 2.

3.

4.

15 5.

6.

7.

20

8. 9.

25 10.

11.

30

12.

35

40 13.

14.

45 15.

REIVINDICACIONES

Metodo de deposicion de un indicador en un sitio diana, en el que el sitio diana comprende actividad enzimatica peroxidasa, y el metodo comprende una etapa de incubar dicho sitio diana en un medio acuoso que comprende el indicador, un compuesto de peroxidasa y un agente de reticulacion, que es 3,3'- diaminobencidina (DAB),

en el que dicho metodo se caracteriza porque el indicador es una molecula de conjugado que comprende al menos un polfmero de estructura principal y al menos un marcador detectable, en el que dicho al menos un marcador detectable esta unido al al menos un polfmero de estructura principal por medio de un enlace qmmico o por medio de una molecula de ligado, en el que el al menos un marcador detectable no es DAB.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el al menos un marcador detectable se selecciona de una sustancia fluorescente o cromogenica, sustrato enzimatico o miembro de un par de union espedfica.

Metodo segun la reivindicacion 2, en el que el al menos un marcador detectable es una sustancia fluorescente.

Metodo segun la reivindicacion 2, en el que el al menos un marcador detectable es un hapteno.

Metodo segun la reivindicacion 2, en el que el al menos un marcador detectable es un sustrato de peroxidasa de rabano picante (HRP).

Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el indicador comprende una combinacion de dos o mas marcadores detectables diferentes.

Metodo segun la reivindicacion 1 o 6, en el que el al menos un polfmero de estructura principal del indicador comprende dextrano.

Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la actividad peroxidasa esta asociada con al menos un resto de una enzima peroxidasa presente en el sitio diana.

Metodo segun la reivindicacion 8, en el que la enzima peroxidasa se selecciona de peroxidasa de rabano picante (HRP) o peroxidasa de soja (SP).

Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sitio diana comprende un marcador biologico.

Metodo de deteccion de un marcador biologico en un sitio diana de una muestra biologica in vitro, en el que el sitio diana comprende el marcador biologico y actividad enzimatica peroxidasa; en el que el metodo se caracteriza porque comprende la etapa de deposicion de un indicador en el sitio diana segun el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

Metodo segun la reivindicacion 11, que comprende etapas de

a) incubar la muestra biologica que presumiblemente comprende el marcador biologico con una o mas sondas, en el que (i) al menos una de la una o mas sondas comprende al menos un resto de peroxidasa de rabano picante (HRP), y (ii) al menos una de la una o mas sondas reconoce y se une espedficamente al marcador biologico, formando de ese modo un complejo del marcador biologico con la una o mas sondas, en el que al menos una sonda comprende al menos un resto de HRP, formando de ese modo un sitio diana;

b) incubar la muestra que comprende el sitio diana de (a) en un medio acuoso que comprende DAB, un indicador y un compuesto de peroxido, depositando de ese modo el indicador en el sitio diana;

c) detectar el indicador depositado de (b) y de ese modo detectar el marcador biologico.

Metodo segun la reivindicacion 11 o 12, en el que el marcador biologico es una molecula biologica, estructura, tal como una membrana o estructura cromosomica, complejo molecular o partfcula, tal como una partfcula de virus.

Metodo segun la reivindicacion 12 o 13, en el que la una o mas sondas son miembros de un(os) par(es) de union espedfica.

Metodo segun la reivindicacion 14, en el que los miembros de pares de union espedfica se seleccionan de de pares de union espedfica de receptor-ligando, anticuerpo-anticuerpo, dos acidos nucleicos o dos analogos de acido nucleico.

Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en el que el metodo se usa para la deteccion por inmunocitoqmmica (IHC) o hibridacion in situ (ISH) de un marcador biologico en una molecula diana comprendida por una celula.

17.

Metodo segun la reivindicacion 16, en el que el metodo esta automatizado o semiautomatizado.

imagen1

Los residuos L30 y L60 son dos residuos consecutivos tales

imagen2

Diaminobencidina, un agente de reticulacion que comprende dos restos de fenilendiamina

imagen3

ortofenilendiamina

Figura 1