ES2622998T3

ES2622998T3 - Nuevos complejos basados en iridio para EQL

Info

Publication number: ES2622998T3
Application number: ES13744980.7T
Authority: ES
Inventors: Frank Bergmann; Robert CYSEWSKI; Luisa De Cola; Sebastian Dziadek; Jesus Miguel FERNANDEZ HERNANDEZ; Hans-Peter Josel; Elena LONGHI; Christoph Seidel
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2017-07-10
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: EP2880042B1; CA2879094C; CN104822696B; EP2880042A1; US20150147752A1; JP2015526427A; US9499573B2; HK1213265A1; CN104822696A; WO2014019711A1; CA2879094A1

Abstract

un compuesto quimioluminiscente basado en iridio de fórmula I**Fórmula** en el que X e Y son C-R18 y C-R19, respectivamente, o donde X es N e Y es C-R19, o donde Y es N y X es C-R18, en el que cada R1-R19 es independientemente hidrógeno, haluro, grupo ciano o nitro, amino, amino sustituido, alquilamino, alquilamino sustituido, arilamino, arilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, carboxilato, éster de ácido carboxílico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo sustituido o no sustituido, arilsulfonilo sustituido o no sustituido, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonato, sulfinato, sulfenato, sulfamoilo, sulfóxido, fosfono, hidroxifosfinoilo, hidroxialquilfosfinoilo, fosfonato, fosfinato o R20, donde R20 es arilo, arilo sustituido, alquilo, alquilo sustituido, alquilo ramificado, alquilo ramificado sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, aminoalquilo, aminoalquilo sustituido, aminoalcoxi, aminoalcoxi sustituido, aminoarilo, aminoarilo sustituido, aminoariloxi, aminoariloxilo sustituido, en el que dentro de R1-R12, o/y dentro de R13-R16, o/y dentro de R17-R19, o/y entre R16 y R19, respectivamente, dos R adyacentes pueden formar un anillo aromático o un anillo aromático sustituido, un grupo hidrofílico, tal como amino, amino sustituido, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, carboxilato, éster de ácido carboxílico, carbamoílo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo sustituido o no sustituido, arilsulfonilo sustituido o no sustituido, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonato, sulfinato, sulfenato, sulfamoilo, sulfóxido, fosfono, hidroxifosfinoilo, hidroxialquilfosfinoilo, fosfonato, fosfinato o, en el que dentro de R1-R12, o/y dentro de R13-R16, o/y dentro de R17-R19, o/y entre R16 y R19, respectivamente, dos R adyacentes pueden formar un anillo aromático o un anillo aromático sustituido, un grupo hidrofílico, tal como amino, amino sustituido, alquilamino, alquilamino sustituido, alquilamonio, alquilamonio sustituido, carboxi, carboxilato, éster de ácido carboxílico, carbamoílo, hidroxi, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, sulfanilo, alquilsulfonilo sustituido o no sustituido, arilsulfonilo sustituido o no sustituido, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonato, sulfinato, sulfenato, sulfamoilo, sulfóxido, fosfono, hidroxifosfinoilo, hidroxialquilfosfinoilo, fosfonato, fosfinato, en donde, si en cualquiera de R1-R19 está presente una sustitución, el sustituyente en R1-R19 se selecciona cada uno independientemente entre un haluro, un grupo ciano o nitro, un grupo hidrofílico, como un amino, alquilamino, alquilamonio, carboxi, carboxilato, éster de ácido carboxílico, carbamoilo, hidroxi, alquiloxi, arilalquiloxi, ariloxi, alquilariloxi, polietilenoxi, polipropilenoxi, sulfanilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfo, sulfino, sulfeno, sulfonato, sulfinato, sulfenato, sulfamoilo, sulfóxido, fosfono, hidroxifosfinilo, hidroxilalquilfosfinoilo, fosfinato, en el que alquilo tal como se usa aquí es una cadena alquílica lineal o ramificada con una longitud de 1-20 átomos de carbono o una cadena de heteroalquilo con la longitud de 1-20 átomos que comprende 1-4 heteroátomos seleccionados entre O, N, P y S, en el que arilo es un sistema de anillo arilo de 5, 6 o 7 miembros o un sistema de anillo heteroarilo de 5, 6 o 7 miembros que comprende 1-3 heteroátomos seleccionados entre O, S y N, en el que al menos uno de R13-R19 es -Q-Z, en el que Q es un enlazador o un enlace covalente, y en el que Z es un grupo funcional.

Description

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de carbono sustituidos y/o uno o más átomos seleccionados entre O, N, P y S o átomos de N, P o S sustituidos, o una cadena de 1 a 20 átomos de carbono, o con un esqueleto que consta de átomos de carbono, átomos de carbono sustituidos y uno o más átomos seleccionados entre O, N, P y S o átomos de N, P o S sustituidos que comprenden al menos un grupo arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido (en el que, por ejemplo, un

5 anillo de fenileno representa una longitud de cuatro átomos).

En una realización Q, por ejemplo, el enlazador Q, en un compuesto de acuerdo con la presente invención, es una cadena alquilo C1-C12 saturada, o una cadena arilalquilo C1-C12, o una cadena de 1 a 12 átomos con un esqueleto que consta de átomos de carbono, átomos de carbono sustituidos y uno o más átomos seleccionados de O, N, P y

10 S, o átomos de N, P o S sustituidos, o una cadena de 1 a 12 átomos de carbono con un esqueleto que consta de átomos de carbono, átomos de carbono sustituidos y uno o más átomos seleccionados de O, N, P y S o átomos de N, P o S sustituidos que comprenden al menos un grupo arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido (en el que, por ejemplo, un anillo de fenileno representa una longitud de cuatro átomos):

15 En una realización, Q es un enlace covalente. En el caso de que Q sea un enlace covalente, el grupo funcional Z es al menos uno de R13 a R20. En una realización, uno de R13 a R20 es Z.

En una realización, Q-Z es maleimida.

20 En una realización, el enlazador Q comprende uno o más aminoácidos.

En una realización, el enlazador Q comprende uno o más nucleótidos.

En una realización, tanto X como Y en la fórmula I son N.

25 En una realización, el grupo funcional Z comprendido en el complejo basado en iridio de fórmula I de acuerdo con la presente invención se selecciona del grupo que consiste en aldehído, ácido carboxílico, éster de ácido carboxílico, epóxido, éster de N-hidroxisuccinimida, grupo amino, halógeno, hidrazina, hidroxilo, sulfhidrilo, maleimido, alquinilo, azida, isocianato, isotiocianato y fosforamidito.

30 En una realización, el grupo funcional Z comprendido en el complejo basado en iridio de fórmula I de acuerdo con la presente invención se selecciona del grupo que consiste en ácido carboxílico, éster de N-hidroxisuccinimida, grupo amino, halógeno, sulfhidrilo, maleimido, alquinilo, azida, isocianato, isotiocianato y fosforamidita.

35 En una realización preferida particular, el grupo funcional Z comprendido en el complejo basado en iridio de fórmula I de acuerdo con la presente invención se selecciona del grupo que consiste en ácido carboxílico, éster de Nhidroxisuccinimida y maleimido.

En una realización preferida particular, el grupo funcional Z comprendido en el complejo basado en iridio de fórmula I

40 de acuerdo con la presente invención se selecciona del grupo que consiste en éster de N-hidroxisuccinimida y maleimido.

En una realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, en el que de uno a tres de R1 a R12 de los residuos fenilfenantridina son independientemente sulfo-alquilo, sulfo-arilo, sulfo-alcoxi, sulfo-ariloxi, sulfo

45 o una sal de los mismos (= sulfonato), en el que el contraión es preferiblemente un catión del grupo de metales alcalinos y los otros grupos R1 a R12 son hidrógeno, en el que uno de R13-R19 es -Q-Z, en el que Q es un enlazador o un enlace covalente, y en el que Z es un grupo funcional y los otros grupos R13 a R19 en la fórmula I son hidrógeno o R20, en el que R20 es alquilo y en el que X e Y son N.

50 En una realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, en el que los residuos de fenilfenantridina comprendidos en la fórmula I se seleccionan de entre las siguientes fenilfenantridinas sustituidas,

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En el que uno de R13-R19 es -Q-Z, en el que Q es un enlazador o un enlace covalente y en el que Z es un grupo funcional y los otros grupos R13 a R19 en la fórmula I son hidrógeno o R20, en el que R20 es alquilo y en el que X e Y son N.

5 En una realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, en el que R1 a R12 son hidrógeno, en el que uno de R13-R20 es -Q-Z, en el que Q es un enlace o un enlace covalente, y en el que Z es un enlace, preferiblemente ácido carboxílico, y los otros grupos R13 a R20 en la fórmula I son hidrógeno o R21, en el que R21 es alquilo, y en el que X e Y son N.

10 Se considera que todas las combinaciones de cualesquiera realizaciones de los compuestos de fórmula I como se han definido anteriormente están dentro del alcance de la invención.

Se acaba de descubrir de manera sorprendente e inesperada que los compuestos quimioluminiscentes basados en iridio de fórmula I son adecuados como marcadores para futuros métodos de detección basados en EQL de alta

15 sensibilidad.

Procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula I

La invención, en un aspecto, se refiere a un procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula I.

20 Los compuestos de acuerdo con la fórmula I pueden sintetizarse, por ejemplo como sigue y por ejemplo, como se muestra en el ejemplo 3.

Los compuestos de fórmula I se sintetizan generando primero un carbeno a partir de un precursor de un compuesto

25 de fórmula III (a) o fórmula III (b), en la que R13-R17, X, Y, Z y Q son como se han definido anteriormente a través de las definiciones para el compuesto de fórmula I, ya sea por calentamiento o usando, por ejemplo, óxido de plata.

Los precursores se basan en las estructuras generales III (a) y III (b):

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en la que R13-R17, X, Y, Z y Q son como se han definido anteriormente a través de las definiciones para el compuesto de fórmula I.

35 El derivado de carbeno se hace reaccionar adicionalmente con un complejo de dímero de iridio (complejo bis-iridio). Así, en un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I que comprende las siguientes etapas:

40 (a) preparar un carbeno de un compuesto de fórmula III (a) o de fórmula III (b) y

(b) hacer reaccionar el carbeno así obtenido con un complejo dímero de iridio (complejo de bis-iridio de fórmula IV)

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átomos).

En una realización, el enlazador Q1 en un compuesto de acuerdo con la presente invención es una cadena alquilo C1-C12 saturada, o una cadena arilalquilo C1-C12, o una cadena de 1 a 12 átomos con un esqueleto constituido por átomos de carbono, átomos de carbono sustituido y uno o más átomos seleccionados de O, N, P y S, o átomos de N, P o S sustituidos, o una cadena de 1 a 12 átomos con un esqueleto constituido por átomos de carbono, átomos de carbono sustituidos y uno o más átomos seleccionado de O, N, P y S, o átomos de N, P o S sustituidos, que comprenden al menos un grupo arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido (en el que, por ejemplo, un anillo de fenileno representa una longitud de cuatro átomos).

La fórmula I (b) y Q2 están presentes (n) veces en un compuesto de acuerdo con la fórmula II siendo (n) un número entero de 1-50. Cada uno de estos (n) Q2 es independientemente un enlace covalente o un enlazador que tiene como esqueleto una cadena alquilo C1-C200 saturada, insaturada, no sustituida o sustituida lineal o ramificada, o una cadena de 1 a 200 átomos constituida por átomos de carbono, átomos de carbono sustituidos y/o uno o más átomos seleccionados de O, N, P y S o átomos de N, P, S sustituidos o una cadena como se describió anteriormente con el esqueleto que contiene uno o más sistemas de anillo aromáticos o no aromáticos cíclicos o heterocíclicos .

En una realización, cada Q2 de fórmula II es independientemente un enlace covalente o un enlazador que tiene como esqueleto una cadena alquilo C1-C100 saturada, insaturada, no sustituida o sustituida, lineal o ramificada, o una cadena de 1 a 100 átomos que consiste en átomos de carbono, átomos de carbono sustituidos y/o uno o más átomos seleccionados de O, N, P y S o átomos de N, P o S sustituidos, o una cadena como se describió anteriormente con el esqueleto que contiene uno o más sistemas de anillo aromáticos o no aromáticos, cíclicos o heterocíclicos.

En una realización cada Q2 de fórmula II es independientemente un enlace covalente o un enlazador que tiene como esqueleto una cadena alquilo C1-C50 saturada, insaturada, no sustituida o sustituida lineal o ramificada, o una cadena de 1 a 50 átomos que consiste en átomos de carbono, átomos de carbono sustituidos y/o uno o más átomos seleccionados de O, N, P y S o átomos de N, P o S sustituidos, o una cadena como se describió anteriormente con el esqueleto que contiene uno o más sistemas de anillo aromáticos o no aromáticos, cíclicos o heterocíclicos.

En una realización, cada Q2 de fórmula II es independientemente es un enlace covalente o un enlazador que tiene como esqueleto una cadena de alquilo C1-C20 saturada, insaturada, no sustituida o sustituida, lineal o ramificada, o una cadena de 1 a 20 átomos que consiste en átomos de carbono, átomos de carbono sustituidos y/o uno o más átomos seleccionados de O, N, P y S o átomos de N, P o S sustituidos, o una cadena como se describió anteriormente con el esqueleto que contiene uno o más sistemas de anillo aromáticos o no aromáticos, cíclicos o heterocíclicos.

En una realización, cada Q2 de fórmula II es independientemente un enlace covalente o un enlazador que tiene como esqueleto una cadena alquilo C1-C12 saturada, insaturada, no sustituida o sustituida, lineal o ramificada, o una cadena de 1 a 12 átomos que consiste en átomos de carbono, átomos de carbono sustituidos y/o uno o más átomos seleccionados de O, N, P y S o átomos de N, P o S sustituidos, o una cadena como se describió anteriormente con el esqueleto que contiene uno o más sistemas de anillo aromáticos o no aromáticos, cíclicos o heterocíclicos.

En una realización, cada Q2 de fórmula II es independientemente un enlace covalente o un enlazador que tiene como esqueleto una cadena alquilo C1-C12 saturada o una cadena de 1 a 12 átomos con una esqueleto que consiste en átomos de carbono, átomos de carbono sustituidos y/o uno o más átomos seleccionados de O, N, P y S,

o átomos de N, P o S sustituidos.

En una realización, el enlazador Q1 comprende uno o más aminoácido(s).

En una realización, el enlazador Q1 comprende una cadena peptídica.

En una realización, Q2 es un enlazador y comprende uno o más aminoácidos.

En una realización tanto Q1 como Q2 son enlazadores y comprenden uno o más aminoácidos.

En una realización, el enlazador Q1 comprende uno o más nucleótidos.

En una realización, Q2 es un enlazador y comprende uno o más nucleótidos.

En una realización tanto Q1 como Q2 son enlazadores y comprenden uno o más nucleótidos.

En una realización, Q2 se selecciona del grupo que consiste en -C6H4-(CH2)2 y -C6H4-(CH2)2-CO-.

En la fórmula II (n) es un número entero de 1-50, indicando que la fórmula I (b) y Q2 están presentes (n) veces en el

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Esquema 2: síntesis de un compuesto de fórmula II

5 Conjugados que comprenden los nuevos compuestos de fórmula I o II y otros aspectos de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado que comprende un compuesto electroquimioluminiscente basado en iridio de fórmula I, o de fórmula II, respectivamente, tal como se describe y define en el presente documento y está unido covalentemente al mismo una sustancia biológica. Ejemplos de

10 sustancias biológicas adecuadas son células, virus, partículas subcelulares, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), oligosacáridos, polisacáridos, lipopolisacáridos, metabolitos celulares, haptenos, hormonas, sustancias farmacológicas, alcaloides, esteroides, vitaminas, aminoácidos y azúcares.

15 En una realización, la sustancia biológica de un conjugado de acuerdo con la presente invención, es decir, unida covalentemente a un compuesto de acuerdo con la fórmula I, o de fórmula II, respectivamente, es un agente de unión por afinidad. Un agente de unión por afinidad es una molécula con capacidad de unión molecular a otra molécula debido a la interacción atractiva entre estas moléculas que da lugar a una asociación estable en la que las moléculas están cerca una de otra. El resultado de la unión molecular es la formación de un complejo molecular. La

20 unión atractiva entre los componentes de un complejo es normalmente más débil que en un enlace covalente. En el presente caso, el agente de unión es un agente de unión por afinidad que significa que es capaz de unirse a un complejo de afinidad, es decir, un complejo estable bajo las correspondientes condiciones, por ejemplo. En medio acuoso bajo condiciones normales. Las moléculas que pueden participar en la unión molecular incluyen, pero no se limitan a, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y moléculas orgánicas pequeñas tales como fármacos.

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seis HVR confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir antígeno, aunque con una afinidad más baja que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab contiene los dominios variables de cadena pesada y ligera y contiene también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación de la presente invención para Fab' en la que el(los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, véase, por ejemplo, Plueckthun, en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg y Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), páginas 269-315.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VHVL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de la otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, PE 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; y Holliger, P. et al., PNAS USA 90 (1993) 6444-6444. Los triacueropos y tetracuerpos también se describen en Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo no siendo una mezcla de anticuerpos individuales. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en el que la secuencia polipeptídica de unión a diana se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección de una única secuencia de polipéptido de unión diana a partir de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fago o clones de DNA recombinante. Debe entenderse que una secuencia de unión a diana seleccionada puede alterarse adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, humanizar la secuencia de unión a diana, mejorar su producción en cultivo celular, reducir su inmunogenicidad in vivo, crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a la diana alterada es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un solo determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas porque típicamente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas.

Como se ha mencionado, los compuestos y conjugados como se describen en la presente invención tienen propiedades bastante favorables. Por ejemplo, los compuestos o conjugados descritos, respectivamente, muestran una alta eficiencia EQL. Esta alta eficiencia también está presente si las mediciones correspondientes se realizan en un sistema acuoso en comparación con muchos marcadores de EQL que sólo han mostrado una alta eficiencia de EQL cuando se analizan en un disolvente orgánico. Por ejemplo, muchos colorantes OLED usualmente se analizan en acetonitrilo y tampoco son solubles en una solución acuosa o, si son solubles, no muestran electroquimioluminiscencia eficiente en una solución acuosa.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al uso de un compuesto o de un conjugado, respectivamente, como se describe en la presente invención para llevar a cabo una reacción de electroquimioluminiscencia en una solución acuosa. Una solución acuosa es cualquier solución que comprende al menos 90% de agua (peso en peso). Obviamente, tal solución acuosa puede contener además ingredientes como compuestos tampón, detergentes y por ejemplo aminas terciarias como tripropilamina como donador de electrones en la reacción de EQL.

En un aspecto, la presente invención se refiere al uso de un compuesto o de un conjugado, respectivamente, como se describe en la presente invención en un método de detección basado en electroquimioluminiscencia.

En un aspecto, la presente invención se refiere al uso de un compuesto o de un conjugado, respectivamente, como

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se describe en la presente invención en la detección de un analito.

Un analito de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier molécula inorgánica u orgánica, incluyendo cualquier sustancia biológica de interés. Ejemplos de sustancias biológicas adecuadas que representan un analito 5 en el sentido de la presente invención son sacáridos, metabolitos celulares, haptenos, hormonas, sustancias farmacológicas, alcaloides, esteroides, vitaminas, aminoácidos y azúcares.

El analito puede seleccionarse del grupo que consiste en un polipéptido, un carbohidrato y una molécula de fármaco inorgánico u orgánico.

10 Un polipéptido o proteína es una molécula que está esencialmente compuesta de aminoácidos y que tiene al menos dos aminoácidos unidos por enlace peptídico. En el caso de que el analito de interés que se va a investigar en un método descrito aquí, el polipéptido preferiblemente consistirá de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25 y 30 hasta aproximadamente 10.000 aminoácidos. Preferiblemente, el polipéptido contendrá de 5 a 2.000, también se prefiere

15 de 10 a 1.000 aminoácidos.

En el caso de que el analito sea un ácido nucleico, estos ácidos nucleicos preferiblemente son oligonucleótidos de DNA o RNA de origen natural.

20 En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para medir un analito por un método in vitro, comprendiendo el método las etapas de (a) proporcionar una muestra sospechosa o conocida por comprender el analito, (b) poner en contacto dicha muestra con un conjugado de acuerdo con un agente de unión por afinidad y un compuesto de acuerdo con la fórmula I o de fórmula II, respectivamente, como se describe en la presente invención en condiciones apropiadas para la formación de un complejo de analito conjugado, y (c) medir el complejo formado

25 en la etapa (b) y obteniendo así una medida del analito.

En una realización que mide un medio analito que detecta la cantidad de un analito en una muestra.

En una realización, la medición en el método anterior para la detección de un analito se lleva a cabo utilizando un

30 procedimiento de detección basado en electroquimioluminiscencia. También se prefiere el método en una solución acuosa.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, cuyo alcance real se expone en las reivindicaciones adjuntas.

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Ejemplos

Ejemplo 1

40 Síntesis de fenilfenantridinas sustituidas

Ejemplo 1.1

Procedimiento general para la síntesis de 2-aminobifenilos sustituidos:

45 Con la reacción de acoplamiento Suzuki-Miyaura como se describe por Youn, S.W., en Tetrahedron Lett. 50 (2009) 4598-4601 entre derivados de 2-bromoanilina comercialmente disponibles y el correspondiente ácido arilborónico, se pueden sintetizar los 2-aminobifenilos apropiados, los cuales son necesarios para reacciones adicionales a fenantridinas.

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Procedimiento típico:

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55 a: 10 mol % de PdCl2 (PPh3) 2, K2CO3, DMF/H2O (5/1), 80ºC, 24 h Otros Ejemplos:

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Utilizando cloruro de naftaleno-carbonilo en lugar de cloruro de ácido fenílico se obtiene:

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1H-RMN (400 MHz, CDCl3)  8,74 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,65 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,27 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,23 (s, 1H), 8,15 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,97-7,94 (m, 2H), 7,90-7,85 (m, 2H), 7,80-7,69 (m, 2H), 7,62 (t, J = 14,2, 7,1 Hz, 1H), 7,59-7,55 (m, 2H).

10 EM: [M+H]+ 306,3

Ejemplo 1.3

Procedimiento para la síntesis de 6-(2-sulfofenil) fenantridina

15 La 6-(2-sulfofenil)fenantridina puede sintetizarse calentando suavemente arilanilina (0,01 mol) con anhídrido cíclico de ácido 2-sulfobenzoico (0,01 mol) en CH3CN durante 6 horas usando el procedimiento descrito por Nicolai, E., en Chem. Pharm. Bull. 42 (1994) 1617-1630.

20 Después de la purificación, el producto puede convertirse en la fenantridina apropiada basándose en el método descrito en el ejemplo 1.2.

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25 Ejemplo 1.4

Procedimiento para la síntesis de 6-fenil-alquilsulfonil-fenantridina

La 6-fenil-alquilsulfonil-fenantridina se puede sintetizar calentando suavemente alquilsulfonil-arilanilina (0,01 mol) 30 con cloruro de ácido benzoico (0,01 mol) en cloroformo usando el procedimiento descrito por Lion, C. en Bull. Soc. Chim. Belg. 98 (1989) 557-566, véase el ejemplo 1.2.

Después de la purificación, el producto puede convertirse en la fenantridina apropiada basada en el método descrito en el ejemplo 1.2.

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1H-RMN (400 MHz, CDCl3)  8,92 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,75 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,68 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 8,35 (dd, J = 8,7, 2,0 Hz, 1H), 8,30 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,89 (t, J = 15,3, 7,1 Hz, 1H), 7,81-7,73 (m, 3H), 7,64-7,56 (m, 3H), 3,12 (s, 40 3H).

EM: [M+H]+ 334,3

La 6-(4-metilsulfofenil) fenantridina puede prepararse también siguiendo el procedimiento descrito por Cymerman, J., 45 en J. Chem. Soc. (1949) 703-707.

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Una mezcla del ligando 3-(4-(fenantridin-6-il)fenoxi)propano-1-sulfonato de cesio (500 mg, 0,92 mmol) e IrCl3 (159,5 mg, 0,45 mmol) en una mezcla de 2-EtOEtOH:agua (3:1, 16 ml), se sometió a reflujo bajo atmósfera de nitrógeno 5 durante 36 h. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se concentró hasta la sequedad. El residuo se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.

EM [ESI-EM (-)]: [Ir(CN)2-2Cs+]-calculado 975,13858, encontrado 975,13882

10 Ejemplo 3

El precursor de la sal de yoduro de 3-etoxicarbonilmetil-4-metil-1-fenil-1H-[1,2,4] triazol-4-io del ligando de carbeno puede sintetizarse de acuerdo con el procedimiento descrito por Moderhack, D. et al., J. Heterocyclic Chem. 44 (2007) 393.

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Síntesis del complejo (6-fenilfenantridina)2Ir-(3-etoxicarbonilmetil-4-metil-1-fenil-1H-[1,2,4]triazol)

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Se agitan 50 mg de sal yoduro de 3-etoxicarbonilmetil-4-metil-1-fenil-1H-[1,2,4] triazol-4-io y 20 mg de Ag2O en 5 ml de dioxano a temperatura ambiente durante 40 horas bajo una atmósfera de gas inerte. Se añaden 25 mg de (6fenilfenantridina)2IrCl]2 y la mezcla se somete a reflujo durante 24 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, el

25 residuo se separa por filtración y puede purificarse adicionalmente mediante HPLC preparativa.

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Claims

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