ES2622112T3 - Protección contra la disfunción de la barrera endotelial a través de la inhibición del gen relacionado con la tirosina quinasa Abl (ARG) - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de la función del gen relacionado con Abl (ARG) para usar en el tratamiento de un individuo que padece o está en riesgo de padecer edema inflamatorio, en donde dicho inhibidor se selecciona de: a) un inhibidor de la actividad tirosina quinasa de la proteína codificada por dicho gen relacionado con Abl (ARG), seleccionado entre nilotinib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, dasatinib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, e imatinib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; b) un anticuerpo anti-ARG que se une a ARG e inhibe su función; y c) una molécula de ácido nucleico que provoca la degradación de ARG o inhibe la función, la transcripción o traducción de ARG.

Description

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DESCRIPCION

Proteccion contra la disfuncion de la barrera endotelial a traves de la inhibicion del gen relacionado con la tirosina quinasa Abl (ARG)

La invencion se refiere al campo de la disfuncion de la barrera endotelial. En particular, la invencion se refiere a nuevos metodos para el tratamiento de smdromes/enfermedades caracterizados por una disfuncion de la barrera endotelial, tal como el edema inflamatorio.

Las tirosina quinasas no receptoras protema Abl estan implicadas en la regulacion de una serie de procesos celulares que incluyen proliferacion, supervivencia y migracion. Existen dos miembros de la familia Abl en mairnferos: c-Abl (Abl 1) y gen relacionado con Abl (ARG) conocido ademas como Abl 2 (Kruh, y otros. Science Dic 1986:1545-1548).Los dominios de tirosina quinasa de c-Abl y ARG son 94 % identicos, sin embargo su similitud diverge en el extremo C- terminal. Aunque tanto c-Abl como ARG contienen un dominio de union a actina F con homologfa a la calponina, c-Abl tiene un dominio de union al ADN y un dominio de union a la actina G y ARG contiene adicionalmente un dominio de union a la actina F similar a la talina y un dominio de union a microtubulos.

ARG se ha implicado en procesos que afectan el citoesqueleto. Por ejemplo, la activacion de ARG conduce a la polimerizacion de actina y la formacion de filamentos de actina F a traves del empaquetamiento de la actina F.3233 Ademas, ARG regula la estructura de los filamentos de actina mediante la fosforilacion dependiente de ARG de las protemas que se adaptan a la actina cortactina34 y N-WASp.35 La participacion de ARG en la regulacion del citoesqueleto conlleva a un papel importante de la ARG en los movimientos celulares como la migracion, la contraccion celular, la formacion de lamelipodios, etc. La funcion exacta de ARG en estos procesos puede depender de la distribucion espacial y la regulacion temporal de la actividad de ARG.

c-Abl se conoce mejor por su papel como un protooncogen. La fusion de los genes Bcr y c-Abl da como resultado una protema Bcr-Abl quimerica que tiene actividad Abl tirosina quinasa activada de manera constitutiva.(Lugo y otros, Science 1990, 247: 1079-1082).Bcr-Abl es la causa subyacente de la leucemia mieloide cronica. Uno de los tratamientos para la leucemia positiva a Brc-Abl,5'7 es el uso de imatinib.Imatinib es un inhibidor de molecula pequena que bloquea la actividad ATPasa de c-Abl, asf como ARG, PDGFR y c-KIT.4

Ademas c-Abl participa en la regulacion de la funcion de barrera endotelial mediante la fosforilacion de la quinasa de la cadena ligera de miosina no muscular. La disfuncion de la barrera endotelial esta implicada en la fisiopatologfa de una amplia variedad de enfermedades. Debido a que el endotelio controla estrechamente el flujo de fluido desde la circulacion a los tejidos circundantes, la disfuncion de esta barrera en un estado patologico (por ejemplo, inflamacion) conduce a la extravasacion descontrolada de lfquido y edema.12 Si estan implicados organos vitales, el edema puede conducir a una insuficiencia organica con la consiguiente morbilidad y mortalidad.

Los mecanismos implicados en la disfuncion de la barrera endotelial se han descrito anteriormente. Por ejemplo, Van Nieuw Amerongen y otros describen la implicacion de Rho quinasa en el mantenimiento de la barrera endotelial (Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2007 27:2332-2339).Wang y otros describen la participacion de RhoA y de la protema quinasa II dependiente de calmodulina/calcio delta 6 en la disfuncion de la barrera endotelial inducida por trombina (J Bio Chem 2010 28:21303-21312).Birukova y otros describen el papel de PAK1 en la fuga vascular pulmonar inducida por LPS (AM J. PHYSIOL-LUNG C 2010 299:652-663). Armulik y otros investigan el papel de los pericitos en la barrera hematoencefalica mediante la generacion de una mutacion en un raton que tiene un numero reducido de pericitos en el SNC (Nature 2010 468:557-561) siRNA against c-Abl resulted in a decrease in endothelial cell barrier integrity after treatment with a barrier-enhancing agonist, i.e, sphingosine 1-phosphate (Dudek y otros. Mol Bio Cell 2010 21:4042-4056).El efecto de la inhibicion de c-Abl sobre la alteracion de la integridad de la barrera de celulas endoteliales se apoya ademas por uno de los efectos secundarios del tratamiento a largo plazo con imatinib, es decir el edema.7

Contrario a los estudios que informan edema subcutaneo como consecuencia del tratamiento cronico con imatinib, la presente descripcion demuestra que el tratamiento a corto plazo con imatinib protege contra la disfuncion de la barrera endotelial.La Figura 1A-D demuestra que el tratamiento a corto plazo de imatinib atenua la hiperpermeabilidad endotelial inducida por la trombina.Imatinib ejerce estos efectos mediante la preservacion de la integridad de las uniones de adherencia (AJ) y la adhesion celula a celula (Figura 1E-F).Teniendo en cuenta informes anteriores sobre el edema subcutaneo como un efecto secundario7 del tratamiento con imatinib, es importante tener en cuenta ademas que, en las concentraciones usadas en el estudio, imatinib no afecto la integridad de la barrera endotelial basal. Estos hallazgos sugieren que el edema subcutaneo como un efecto secundario del tratamiento con imatinib da como resultado mas probable la inhibicion cronica de PDGFR en los pericitos y la consiguiente perturbacion del soporte vascular.

La disociacion de las uniones de adherencia, inducida por la trombina, y la perdida de la adhesion celula a celula implica la contraccion actina-miosina mediada por Ca2+ y por RhoA/Rho quinasa.224 Dado que se ha informado que la mayona de las quinasas sensibles a imatinib (c-Abl25, PDGFR26 y Arg2728) afectan la actividad de Rho quinasa, planteamos la hipotesis de que el imatinib atenua los cambios inducidos por trombina en el citoesqueleto de actina mediante la

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inhibicion de la ruta de la RhoA/Rho quinasa. Sorprendentemente, el efecto protector de imatinib sobre la barrera de celulas endoteliales fue independiente de la ruta de la RhoA/Rho quinasa (Figura 2B-E).

Dado que el imatinib se desarrollo principalmente para dirigirse a c-Abl, planteamos la hipotesis de que la inhibicion de c-Abl es la razon de los efectos protectores de imatinib. Sorprendentemente, ni la inhibicion de c-Abl, PDGFR, o c-KIT es responsable de los efectos protectores de la barrera observados para imatinib (Figura 3). Sin embargo, un ARNip contra ARG, demostro que es, de hecho, la inhibicion de la actividad de la ARG quinasa quien media los efectos de imatinib, protectores de la barrera (Figura 4).Nuestros datos sugieren que, mientras Arg media la disfuncion de la barrera endotelial, c-Abl apoya la funcion de la barrera endotelial (Figura 3Ay Figura 7A).

Estos hallazgos sugieren que el tratamiento a corto plazo con un inhibidor de ARG, por ejemplo, imatinib, sena beneficioso en los smdromes caracterizados por una disfuncion de la barrera endotelial.

En consecuencia, en un aspecto, la descripcion proporciona un metodo para el tratamiento de un individuo que padece o esta en riesgo de padecer edema inflamatorio, el metodo comprende administrar un inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG) a dicho individuo para tratar de esta manera dicho edema en dicho individuo.

El edema puede definirse como una acumulacion anormal de fluido en los intersticios de las celulas, en los espacios tisulares o en las cavidades corporales. Puede ser provocado por un movimiento excesivo de fluido desde el sistema vascular hacia los tejidos o un movimiento inadecuado de fluido de los tejidos de regreso al sistema vascular.El intercambio normal de fluido entre estos dos compartimentos depende del equilibrio de la presion osmotica y la presion hidrostatica que actuan en direcciones opuestas a traves de las paredes capilares semipermeables.El edema es el resultado de un desequilibrio en estas fuerzas, que tiende a provocar una acumulacion anormal de fluido en los espacios intersticiales.

El edema puede caracterizarse como inflamatorio o no inflamatorio. La composicion del fluido extravascular que se acumula en edema vana de acuerdo con su etiologfa. En el caso de un edema provocado por mecanismos no inflamatorios, el fluido (trasudado) comprende una concentracion relativamente baja de protemas y tiene una densidad espedfica menor, lo que indica que el endotelio del sitio afectado es normal. En tales casos, el trasudado es esencialmente un ultrafiltrado de plasma sangumeo. Este tipo de edema no inflamatorio es provocado principalmente por alteraciones en las fuerzas hemodinamicas a traves de la pared capilar y ademas se conoce como edema hemodinamico. Por otro lado, en el caso de un edema que es provocado por una respuesta inflamatoria, el fluido extravascular (exudado) comprende una alta concentracion de protemas, celulas y restos celulares y tiene una alta densidad espedfica. Esto indica una alteracion significativa en la permeabilidad normal de los vasos sangumeos pequenos en la zona afectada.

Un aumento en la permeabilidad vascular es una de las principales caractensticas de la respuesta inflamatoria del cuerpo contra los estfmulos, especialmente en el caso de la inflamacion aguda. De hecho, el edema es uno de los principales signos de inflamacion aguda. Durante la inflamacion, los factores qrnmicos derivados del plasma y activados por estfmulos inflamatorios median una serie de respuestas vasculares y celulares en el sitio afectado. Estos cambios estructurales en la microvasculatura dan como resultado un aumento de la permeabilidad de la membrana de los vasos sangumeos, lo que provoca el movimiento de protemas y celulas plasmaticas, por ejemplo, leucocitos de la circulacion al intersticio, que finalmente da lugar a un edema espedfico del sitio. El edema inflamatorio puede atribuirse en gran medida a la accion directa de la histamina, la bradiquinina y otras sustancias liberadas. Los principales mecanismos de aumento de la permeabilidad vascular en la inflamacion incluyen contraccion de celulas endoteliales, retraccion de las uniones, lesion directa, fugas dependientes de leucocitos, regeneracion del endotelio, entre otros. El aumento de la filtracion de fluido hacia el intersticio aumenta aun mas por la accion vasodilatadora arteriolar de mediadores de la inflamacion, lo que aumenta el flujo sangumeo, el area de superficie perfundida, la presion hidrostatica capilar, y facilita el edema tambien por otros mecanismos. Preferentemente, el edema inflamatorio afecta a un organo distinto del pulmon y/o el cerebro.

Preferentemente, el edema inflamatorio que se trata es edema inducido por trombina, por ejemplo, la formacion de edema despues de una hemorragia intracerebral. Preferentemente, el edema inflamatorio es edema inducido por histamina.Preferentemente, el edema inflamatorio se debe a la disfuncion de la barrera endotelial. La disfuncion de la barrera endotelial puede definirse funcionalmente, por ejemplo, como un aumento del paso de macromoleculas a traves de una monocapa endotelial cultivada o una disminucion de la resistencia a traves de una monocapa endotelial, o morfologicamente, por ejemplo, por la presencia de espacios intercelulares en una monocapa endotelial.

Preferentemente, un individuo que padece o que esta en riesgo de padecer un edema inflamatorio esta padeciendo de sepsis, smdrome de fuga capilar sistemica, lesion pulmonar aguda/smdrome de insuficiencia respiratoria aguda (ALI/ARDS), preeclampsia, estenosis con no reflujo, edema pulmonar (preferentemente edema pulmonar despues de radiacion o edema pulmonar despues de endarterectoirna). La sepsis se define como la presencia y crecimiento de microorganismos en la circulacion. Un medio para el diagnostico incluye la presencia de dos o mas de los siguientes criterios: temperatura corporal anormal (<36 °C o >38 °C), conteos anormales de globulos blancos (<4 o >12 x109/L), un fuente clmica de la infeccion, microbiologicamente probada, taquicardia (>90/min) y taquipnea (>20/min o una presion parcial de dioxido de carbono arterial (PaCO2) <32 mmHg).ALl/ARDS pueden desarrollarse como consecuencia de

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enfermedades pulmonares (por ejemplo, neumoma, contusion pulmonar o ahogamiento), o como consecuencia de una enfermedad sistemica (por ejemplo, sepsis).ALI y ARDS se diagnostican de acuerdo con los criterios de la Conferencia de Consenso de America y Europa. El edema pulmonar grave puede seguir a una radioterapia, en dependencia de la dosis y la duracion de la irradiacion. El edema pulmonar tras la irradiacion se diagnostica por evidencia de edema pulmonar en una radiografia de torax o TAC de torax e hipoxemia. El edema pulmonar con reperfusion se produce por lo general dentro de las 72 horas despues de una endarterectomia pulmonar (Levinson y otros. J Thorac Cardiovasc Surg. abril de 1990; 99 (4): 670-8; Levinson y otros. Am Rev Respir Dis. diciembre de 1986; 134(6):1241-5), y se diagnostica por la presencia de edema pulmonar en una radiografia de torax o TAC (torax), tension de oxigeno arterial y saturacion de la hemoglobina por oxigeno. La estenosis de no reflujo es un fenomeno que se observa comunmente durante la cateterizacion cardiaca por la estenosis de las arterias coronarias, lo que es provocado probablemente por la formacion de edema en la pared vascular que rodea la lesion. La preeclampsia se refiere a una afeccion en la que se produce hipertension en asociacion con cantidades significativas de protema en la orina.

En un aspecto adicional, se proporciona un metodo para inhibir la disfuncion de la barrera endotelial en una coleccion de celulas endoteliales que comprenden una barrera endotelial que no funciona adecuadamente o esta en riesgo de disfuncion, dicho metodo comprende proporcionar una coleccion de celulas endoteliales in vitro con un inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG).

En un aspecto adicional, se proporciona una coleccion de celulas endoteliales que comprenden una barrera endotelial que no funciona adecuadamente o esta en riesgo de disfuncion, dichas celulas comprenden un inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG).

Un inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG) se refiere a la inhibicion o alteracion del gen ARG, ARNm de ARG o protema de ARG. Una secuencia ilustrativa de la protema ARG humana es

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Se proporcionan inhibidores de la funcion de ARG para usar en el tratamiento de un individuo que padece o esta en riesgo de padecer un edema inflamatorio tal como se describe en la presente.

En una modalidad preferida, el inhibidor de ARG inhibe preferentemente la isoforma Arg 1a sin el grupo miristoilo. En una modalidad preferida, el inhibidor de ARG inhibe preferentemente la isoforma Arg 1b sin el grupo miristoilo40.

Un inhibidor de la funcion de ARG inhibe la actividad tirosina quinasa de la protema codificada por ARG y se selecciona de nilotinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, dasatinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, e imatinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Los ejemplos preferidos de tales inhibidores incluyen nilotinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo (preferentemente clorhidrato de nilotinib monohidratado, es decir, Tasigna™); y dasatinib (Sprycel™) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. El nilotinib se describe qmmicamente como 4-metil-N-[3-(4-metil-1H-imidazol-1-il)-5-(trifluorometil)fenil]-3-[[-4-(3-piridinil)-2 pirimidinil]amino]-benzamida y su preparacion se describe en la patente de los Estados Unidos num. 7,169,791.El dasatinib se describe qmmicamente como N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4- pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida y su preparacion se describe en la patente de los Estados Unidos num. 6,596,746.En algunas modalidades, los efectos secundarios del dasatinib seran inaceptables y el inhibidor utilizado no sera dasatinib. En algunas modalidades, el inhibidor no es nilotinib.

Los compuestos de mayor preferencia son imatinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo mesilato (preferentemente mesilato de imatinib, referido ademas como STI-571, CGP 57148 y Gleevec™). El imatinib se describe qmmicamente como 4-[(4-metiM-piperazinil)metil]-N-[4-metil-3-[[(4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]amino]-fenil]benzamida

metano sulfonato y su preparacion se describe en la patente de los Estados Unidos num. 5,521,184.

Los inhibidores de la funcion de ARG incluyen ademas anticuerpos que se unen a ARG e inhibicion su funcion. El termino "anticuerpo" incluye, por ejemplo, tanto los anticuerpos de origen natural como de origen no natural, anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quimericos y anticuerpos completamente sinteticos y fragmentos de los mismos, tales como, por ejemplo, los fragmentos Fab', F(ab')2, Fv o Fab, u otros fragmentos de inmunoglobulinas de reconocimiento de antfgenos. Los metodos de preparacion de anticuerpos se conocen bien en la tecnica. Preferentemente, un inhibidor de la funcion de ARG inhibe la actividad tirosina quinasa de la protema ARG en al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 80 %, 90 % o mas en comparacion con la actividad tirosina quinasa de la protema ARG no tratada.

Preferentemente, un inhibidor de ARG muestra una concentracion IC50 para la actividad tirosina quinasa de ARG de menos de 1 micromolar, con mayor preferencia el inhibidor de ARG tiene una concentracion IC50 de 0,5 micromolar o menos. La IC50 de imatinib para la actividad tirosina quinasa de ARG se ha informado como 0,5 micromolar (Okuda y otros. Blood, 2001).

Preferentemente, un inhibidor de la actividad tirosina quinasa de ARG inhibe espedficamente la actividad tirosina quinasa de la protema codificada por ARG. La inhibicion espedfica se refiere a un inhibidor que inhibe la actividad tirosina quinasa de ARG al menos dos veces, preferentemente al menos cinco veces, o al menos 10 veces mas de lo que inhibe la actividad tirosina quinasa de c-Abl.

Preferentemente, el inhibidor espedfico de la actividad tirosina quinasa no inhibe significativamente la actividad tirosina quinasa de C-kit, PDGFR-alfa y/o C-Abl.

En algunas modalidades, el inhibidor de ARG es una molecula de acido nucleico cuya presencia en una celula provoca la degradacion o inhibe la funcion, transcripcion o traduccion de su gen diana, es decir, ARG, de una manera espedfica de la secuencia. Las moleculas de acido nucleico ilustrativas incluyen aptameros, ARNip, microARN artificial, ARN de interferencia o ARNi, ARNbc, ribozimas, oligonucleotidos antisentido, y casetes de expresion de ADN que codifican dichas moleculas de acido nucleico.

Preferentemente, la molecula de acido nucleico es un oligonucleotido antisentido.Los oligonucleotidos antisentido (ASO) generalmente inhiben su objetivo mediante la union al ARNm diana y el bloqueo esterico de la expresion mediante la obstruccion del ribosoma. Los ASO ademas pueden inhibir su objetivo al unirse al ARNm diana y formar asf un hfbrido ADN-ARN que pueda ser una sustancia para la RNasa H. Los ASO ademas pueden producirse como estructuras compuestas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos, mimeticos de oligonucleotidos, o regiones o porciones de los mismos. Dichos compuestos ademas se han denominado en la tecnica como hfbridos o gapmeros. Los metodos para disenar y modificar dichos gapmeros se describen, por ejemplo, en las publicaciones de patentes de los Estados Unidos nums. 20110092572 y 20100234451.

Recientemente se ha demostrado que los oligonucleotidos antisentido pueden utilizarse ademas para alterar el procesamiento del pre-ARNm, referido en la presente descripcion como "AON de omision de exon". Los oligonucleotidos antisentido de omision de exones tfpicamente permiten saltar de un exon o la parte 5' o 3' del mismo. Los oligonucleotidos antisentido pueden dirigirse hacia del sitio de corte y empalme en 5', el sitio de corte y empalme en 3', a ambos sitios de corte y empalme, a uno o mas sitios internos de exones y a secuencias de intrones, por ejemplo espedfico para el punto de ramificacion. Este ultimo permite la omision del exon corriente arriba. Se dice que un

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oligonucleotido se dirige hacia una secuencia interna de exon si la region de complementariedad que contiene la identidad de secuencia con el complemento inverso del pre-ARNm diana esta dentro del Kmite del exon. Se han descrito metodos para disenar oligonucleotidos de omision de exones (ver, por ejemplo, Aartsma-Rus y otros, Mol Ther 17(3):548 (2009)).

Preferentemente, los AON utiles en los metodos descritos en la presente tienen al menos una modificacion qmmica que aumenta la resistencia del compuesto a la escision de la RNasa H. Tales modificaciones incluyen, pero sin limitaciones, nucleotidos con modificaciones del azucar. Como se usa en la presente descripcion, un nucleotido con un azucar modificado incluye, pero sin limitaciones uno o mas restos de azucar que son mono- o disustituidos en la posicion 2', 3' y/o 5', tal como un -OH; -F; alquilo, alquenilo, alquinilo, alcarilo, alilo, arilo, o aralquilo sustituidos o no sustituidos, lineales o ramificados inferiores (Cl-ClO) que pueden estar interrumpidos por uno o mas heteroatomos; O-, S-, o N- alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; O-, S-, o N-alilo; O-alquil-O-alquilo, -metoxi, -aminopropoxi; -amino xi; metoxietoxi; -dimetilaminooxietoxi; y -dimetilaminoetoxietoxi. El resto de azucar puede ser una piranosa o un derivado de la misma, o una desoxipiranosa o un derivado de la misma, preferentemente una ribosa o un derivado de la misma, o una desoxirribosa o un derivado de la misma. Tales restos de azucares derivatizados preferidos comprenden un acido nucleico bloqueado (LNA), en el cual el atomo de carbono 2' esta unido al atomo de carbono 3' o 4' del anillo del azucar lo que forma asf un resto de azucar bidclico. Un LNA preferido comprende un acido nucleico con puente de 2'-0,4'-C- etileno (Morita y otros2001. Nucleic Acid Res Supplement num. 1:241-242).Estas sustituciones hacen que el analogo de nucleotido o equivalente resistentes a las nucleasas y a la RNasa H y aumentan la afinidad por el ARN diana.

Los AON pueden comprender ademas cadenas principales modificadas, tales como cadenas principales de morfolino, cadenas principales de carbamato, cadenas principales de siloxano, cadenas principales de sulfuro, sulfoxido y sulfona, cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo, cadenas principales de metileneformacetilo, cadenas principales de riboacetilo, cadenas principales que contienen alqueno, cadenas principales de sulfamato, sulfonato y sulfonamida, cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino, y cadenas principales de amida. Preferentemente, el AON tiene una cadena principal de morfolino fosforodiamidato. Estos oligomeros tienen una cadena principal no cargada en la que el azucar desoxirribosa del ADN se reemplaza por un anillo de seis miembros y el enlace fosfodiester se reemplaza por un enlace fosforodiamidato. Un equivalente o analogo de nucleotido preferido comprende un acido nucleico peptfdico (PNA), que tiene una cadena principal de poliamida modificada (Nielsen, y otros (1991) Science 254, 1497-1500).

Otra cadena principal preferida comprende un analogo o equivalente de nucleotido de morfolino, en el que el azucar ribosa o desoxirribosa se reemplaza por un anillo de morfolino de 6 miembros. Un analogo o equivalente de nucleotido de mayor preferencia comprende un oligomero de morfolino fosforodiamidato (PMO), en el que el azucar ribosa o desoxirribosa se reemplaza por un anillo de morfolino de 6 miembros, y el enlace fosfodiester anionico entre los anillos de morfolino adyacentes se reemplaza por un enlace fosforodiamidato no ionico.

Aun en una modalidad adicional, un AON comprende una sustitucion de uno de los atomos de oxfgeno que no participa en el puente, en el enlace fosfodiester. Esta modificacion desestabiliza ligeramente el apareamiento de bases, pero anade una resistencia significativa a la degradacion por nucleasas.Un analogo o equivalente de nucleotido preferido comprende fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriester, aminoalquilfosfotriester, H-fosfonato, fosfonato de metilo y otros grupos alquilo que incluyen 3'-alquileno fosfonato, 5'-alquileno fosfonato y fosfonato quiral, fosfinato, fosforamidato que incluye 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidato, tionofosforamidato, tionoalquilfosfonato, tionoalquilfosfotriester, selenofosfato o boranofosfato.

Un experto en la tecnica entiende que no es necesario que todas las posiciones en un oligonucleotido se modifiquen de manera uniforme. Ademas, mas de uno de los analogos o equivalentes antes mencionados pueden incorporarse en un solo oligonucleotido o incluso en una sola posicion dentro de un oligonucleotido. En determinadas modalidades, un oligonucleotido de la invencion tiene al menos dos tipos diferentes de analogos o equivalentes.

Un AON preferido comprende un oligonucleotido antisentido de alquil fosforotioato, tal como ribosa modificada 2'-O- metilo (ARN), ribosa modificada 2'-O-etilo, ribosa modificada 2'-O-propilo, y/o derivados sustituidos de estas modificaciones tales como derivados halogenados. Un AON de mayor preferencia de acuerdo con la invencion comprende ribosa 2'-O-metil fosforotioato.

Los AON comprenden tipicamente entre 12 a 80, preferentemente entre 15 a 40, nucleobases.Preferentemente, los AON comprenden un tramo de al menos 8 nucleobases que tienen 100 % de complementariedad con el ARNm diana.

Preferentemente, la molecula de acido nucleico es una molecula de ARNi, es decir, una molecula de interferencia de ARN.Las moleculas de ARNi preferidos incluyen ARNip, shARN y microARN artificial.

Un ARNip comprende una estructura de doble cadena que contiene tfpicamente de 15 a 50 pares de bases y preferentemente de 19 a 25 pares de bases y que tiene una secuencia de nucleotidos identica o casi identica a un gen diana expresado o ARN dentro de la celula. Un ARNip puede estar compuesto de dos polinucleotidos hibridados o un solo polinucleotido que forma una estructura de horquilla. Como se usa en la presente descripcion "shARN" o "ARN pequeno en horquilla" (denominado ademas bucle de tallo) es un tipo de ARNip. En una modalidad, estos shARN se componen de una cadena antisentido corta, por ejemplo aproximadamente 10 a aproximadamente 25 nucleotidos,

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seguida por un bucle de nucleotidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 nucleotidos, y la cadena sentido analoga. Alternativamente, la cadena sentido puede preceder a la estructura del bucle de nucleotidos y puede seguir la cadena antisentido.

El diseno y la produccion de moleculas de ARNip se conocen bien por un experto en la tecnica (Hajeri PB, Singh SK. Drug Discov Today. 2009 14(17-18):851-8). Los metodos de administracion de ARNip terapeutico tambien son bien conocidos para un experto en la tecnica (Manjunath N, y Dykxhoorn DM. Discov Med. Mayo de 2010; 9(48):418-30; Guo J y otros, Mol Biosyst. 15 de julio de 2010; 6(7):1143-6l). Una molecula de ARNip comprende una cadena antisentido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), en donde la cadena antisentido es complementaria a una secuencia de ARN o una porcion de la misma que codifica. ARNip contra ARG tambien esta disponible comercialmente (ver, por ejemplo, los numeros de catalogo de Invitrogen™ HSS100051, HSS100052, y HSS178493) y se describe en la publicacion de patente de los Estados Unidos num. 20050246794.

Las moleculas de microARN artificiales son pre-microARN o pri-microARN que comprenden una estructura(s) de tallo- bucle que se deriva de un microARN endogeno espedfico en el que el tallo(s) de la estructura(s) de tallo-bucle incorpora un hnbrido de una cadena madura y una cadena pasajera donde la secuencia de la cadena madura es distinta de la secuencia de la cadena madura endogena del microARN endogeno referido espedfico. La secuencia de la cadena pasajera de un microARN de origen no natural de la descripcion tambien es diferente de la secuencia de la cadena pasajera endogena del microARN endogeno referido espedfico. Pueden utilizarse muchos precursores de microARN, que incluyen sin limitacion un microARN que comprende un diseno de cadena principal de miR-15a, -16, -19b, -20, -23a, -27b, -29a, -30b, -30c, -104, -132s, -181, -191, - 223 (ver, por ejemplo, las publicaciones de patentes de los Estados Unidos nums. 20050075492 y 20100292310 para el diseno y la produccion de moleculas de microARN artificiales).

La interferencia de ARN se refiere a una disminucion en el nivel de ARNm en una celula para un gen diana heterologo en al menos aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 %, aproximadamente 100 % del nivel de ARNm que se encuentra en la celula sin la presencia, por ejemplo, de la molecula de interferencia de microARN o ARNip.

Las moleculas de ARNi pueden incluir ademas analogos qmmicos tales como, por ejemplo, analogos de 2'-O-metil ribosa de oligonucleotidos quimericos de ARN, ADN, LNA y ARN, y otros analogos qmmicos de oligonucleotidos de acidos nucleicos.

Los inhibidores de moleculas de acido nucleico pueden sintetizarse qmmicamente y proporcionarse directamente a las celulas de interes. El compuesto de acido nucleico puede proporcionarse a una celula como parte de un vehnculo de suministro genico. Un vehnculo de este tipo es preferentemente un liposoma o un vehnculo de suministro de genes virales. Los liposomas se conocen en la tecnica y muchas variantes estan disponibles para propositos de transferencia de genes. Actualmente se utilizan varios suministros de genes virales para transferir genes a las celulas diana. En la presente descripcion se prefiere utilizar los vectores virales que no expresan sus propios genes, sino solo los genes transferidos. El compuesto de acido nucleico puede estar presente como tal en el vehnculo de suministro de genes. En un vector viral, el compuesto de acido nucleico se proporciona preferentemente como un casete de expresion en donde el casete de expresion codifica un transcripto que comprende dicho compuesto.

En consecuencia, los inhibidores de moleculas de acido nucleico pueden proporcionarse en el. Un "vector" es un constructo de acido nucleico recombinante, tal como un plasmido, genoma de fase, genoma de virus, cosmido, o cromosoma artificial, al que puede unirse otro segmento de ADN. El termino "vector" incluye tanto medios virales como no virales para introducir el acido nucleico en una celula in vitro, ex vivo o in vivo.Los vectores no virales incluyen plasmidos, liposomas, lfpidos cargados electricamente (citofectinas), complejos de ADN y protema, y biopolfmeros. Los vectores virales incluyen retrovirus, virus adeno-asociados, viruela, baculovirus, vaccinia, herpes simple, virus de Epstein-Barr y vectores de adenovirus, como se expone en mayor detalle mas abajo. Las secuencias de los vectores pueden contener ademas una o mas regiones reguladoras y/o marcadores de seleccion utiles para seleccionar, mediry controlar los resultados de transferencia de acidos nucleicos (transferencia a que tejidos, duracion de la expresion, etc.).

Preferentemente, las secuencias de los vectores proporcionan el suministro de las moleculas de acido nucleico a las celulas apropiadas. Un vehnculo de suministro preferido es un vector viral tal como un vector de virus adeno-asociado (AAV), o un vector retroviral tal como un vector lentivirus y similares (Goyenvalle A, y otros. Science 2004;306(5702):1796-9).

Ademas los plasmidos, cromosomas artificiales, plasmidos adecuados para la recombinacion homologa dirigida y la integracion en el genoma humano de las celulas pueden aplicarse convenientemente para el suministro de un compuesto de acido nucleico. Los preferidos son los vectores en donde la transcripcion se conduce a partir de promotores de la Pol III, y/o en donde los transcriptos estan en la forma de fusiones con los transcriptos de U1 o U7, que producen buenos resultados para el suministro de pequenos transcriptos. Dentro de las habilidades del experto esta el diseno de transcriptos adecuados. Los preferidos son los transcriptos dirigidos por la Pol III.

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En contraste con los estudios que informan edema subcutaneo como consecuencia del tratamiento con imatinib a largo plazo, la presente descripcion demuestra que el tratamiento a corto plazo con imatinib protege contra la disfuncion de la barrera endotelial. En consecuencia, se prefiere en los metodos descritos en la presente que el inhibidor de la funcion de ARG se proporcione a un individuo durante un periodo de tiempo de entre 1-20 semanas. Preferentemente, el inhibidor se proporciona durante un penodo de tiempo de entre 1-12 semanas, con mayor preferencia el inhibidor se proporciona durante hasta 3 semanas.

El inhibidor de la funcion de ARG puede formularse en cualquier preparacion farmaceutica adecuada para su administracion y comprende ademas, por ejemplo, un vehnculo farmaceuticamente aceptable, relleno, conservante, adyuvante, solubilizante, diluyente y/o excipiente. Tal vehnculo, relleno, conservante, adyuvante, solubilizante, diluyente y/o excipiente farmaceuticamente aceptables pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ma Edicion. Baltimore, MD:Lippincott Williams & Wilkins, 2000.Si el inhibidor es un compuesto de acido nucleico, los excipientes preferidos son capaces de formar complejos, vesfculas y/o liposomas que lo suministren a traves de una membrana celular. Los excipientes adecuados incluyen polietilenimina (PEI) o polfmeros cationicos similares, que incluyen copolfmeros de polipropilenimina o polietilenimina (PEC) y derivados, ExGen 500, anfifflicos sinteticos (SAINT-18), lipofectina™, y DOTAP.

Un experto puede determinar la via de administracion para tales preparaciones farmaceuticas, tales como por administracion oral, intravenosa, subcutanea, intramuscular, intratecal y/o intraventricular. Preferentemente, el inhibidor se administra por via oral o intravenosa.

Un experto puede determinar facilmente una dosis y regimen de dosificacion adecuados del inhibidor para la administracion. Una dosis ilustrativa de imatinib, por ejemplo, es una dosis diaria de 400 mg que resulta en niveles plasmaticos de imatinib entre 1 y 10 micromolar (Singh y otros, Eur J Clin Pharmacol (2009) 65:545-549).Si no se observa respuesta clmica a los pocos dfas del inicio del tratamiento la dosificacion se puede aumentar, por ejemplo a 400 mg dos veces al dfa.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1 - Imatinib atenua la disfuncion de la barrera endotelial inducida portrombina a traves de la estabilizacion de las uniones adherentes.Para probar los efectos de imatinib sobre la barrera endotelial, se sembraron HUVEC sobre filtros de policarbonato (paso de HRP) o electrodos de oro ECIS (mediciones de resistencia) y se cultivaron hasta la confluencia. Las celulas confluentes se trataron previamente con imatinib o DMSO (0,1 %), y se estimularon con trombina (IIa, 1 U/ml) o el vector. A) Curva de tiempo del paso de HRP en presencia o ausencia de imatinib. Media ± SEM de N = 4 experimentos, cada uno representa mediciones triplicadas.** P <0,01, *** P <0,001 en comparacion con DMSO + IIa. B) Efectos de imatinib sobre la resistencia endotelial normalizada durante la estimulacion con trombina .La resistencia absoluta se normalizo hasta el momento justo antes de la adicion de la trombina. Media ± SEM de N = 5 experimentos, cada uno representa mediciones por duplicado. C) Cuantificacion de la maxima disminucion de la resistencia normalizada segun se midio en B. Media ± SEM de N = 4 experimentos, cada uno representa mediciones por duplicado.*** P <0,001.D) Pase de HRP sobre monocapas de celulas endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMVEC) cultivadas en filtros de policarbonato (paso de HRP).Las celulas se trataron previamente con imatinib (10 jM) o (DMSO 0,1 %), y posteriormente se estimularon con trombina (IIa, 1 U/ml) o el vector. Media ± SEM de 5-6 mediciones en N = 2 experimentos. E) Las HUVEC se cultivaron hasta la confluencia en cubreobjetos de vidrio, tratadas previamente con DMSO (paneles superiores) o imatinib 10 jM (paneles inferiores) y estimuladas con trombina durante 30 min. Las celulas fijadas se tineron para VE-cadherina (verde) y el nucleo (DAPI, azul).Imagenes representativas de N = 3 experimentos.F) Tincion de inmunofluorescencia de p-catenina despues de 30 minutos de estimulacion con trombina. Imagenes representativas de N = 2 experimentos. Las barras de escala representan 20 pm. Todas las flechas indican perdida de la tincion en la membrana, lo que sugiere espacios intercelulares. Las imagenes se tomaron con microscopio de fluorescencia invertido de campo amplio Axiovert 200 Marianas, mediante el uso de una lente de aire Zeiss 40x (NA 0,75).

Figura 2 - Imatinib inhibe la disfuncion de la barrera endotelial sin afectar la senalizacion de RhoA/Rho quinasa (ROCK). Las HUVEC se sembraron en filtros de policarbonato, electrodos de oro ECIS, o cubreobjetos de vidrio y se cultivaron hasta la confluencia. Las celulas confluentes se trataron previamente con imatinib (10 jM), el inhibidor de ROCK Y- 27632 (10 jM) o DMSO (0,1 %), y posteriormente se estimularon con trombina (IIa, 1 U/ml) o vector. A) Tincion de actina F (rodamina/faloidina) de las celulas confluentes tratadas previamente con imatinib o DMSO y estimuladas con trombina o vector. Las barras de escala representan 10 jm. Las imagenes se realizaron con un microscopio invertido de fluorescencia de campo amplio Axiovert 200 Marianas, mediante el uso de una lente de aceite Zeiss 63x (NA 1,4).Imagenes representativas de N = 2 experimentos. B) Los efectos del tratamiento previo con imatinib y/o Y-27632 sobre el paso de HRP inducido por trombina sobre monocapas de HUVEC despues de 30 min. Media ± SEM de 6 mediciones en N = 2 experimentos. C) Resistencia electrica de monocapas de HUVEC durante la estimulacion con trombina, despues del tratamiento previo con imatinib, Y-27632 o DMSO. La resistencia se normalizo hasta el momento justo antes de la adicion de la trombina. Media ± SEM de N = 3 experimentos, cada uno representa mediciones por duplicado. D) La cuantificacion de la maxima disminucion de la resistencia relativa segun se midio en C. Media ± SEM

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de N = 3 experimentos. E) Efectos del imatinib sobre la activacion de RhoA inducida por trombina en HUVEC, expresado en unidades arbitrarias (U.A.).Media ± SEM de 4 mediciones en N = 2 experimentos.* P <0,05, *** P <0,001.

Figura 3 - La inhibicion de c-Abl, PDGFR o c-KIT no es la razon de los efectos protectores de imatinib. Las HUVEC se transfectaron con ARNip contra c-Abl, PDGFR-a y -p, c-KIT o ARN aleatorio (scARN), mediante el uso de Amaxa Technology. Despues de la transfeccion, las celulas se sembraron en pocillos de 5 cm2 para el analisis de transferencia Western o sobre electrodos de oro ECIS, y SE CULTIVARON hasta la confluencia durante 48 horas. Las celulas se trataron previamente con HSA al 1 %/M199, y posteriormente se estimularon con trombina (IIa, 1 U/ml).A) El tratamiento con ARNip resulto en una disminucion del 80-90 % en la expresion de la protema c-Abl, como se confirmo por analisis de transferencia Western para el total de c-Abl. La p-actina sirvio como control de carga (inserto).Resistencia absoluta en condiciones estimuladas con trombina o control. Media ± SEM de 4 mediciones en N = 2 experimentos.B) Disminucion inducida por trombina en la resistencia endotelial normalizada despues de la transfeccion con ARNip o scARN para c-Abl. La resistencia se normalizo hasta el momento justo antes de la adicion de la trombina. Media ± SEM de N = 4 mediciones en 2 experimentos independientes.C) Disminucion inducida por trombina en la resistencia endotelial normalizada despues de la reduccion de PDGFR-a, -p o la combinacion. La resistencia se normalizo hasta el momento justo antes de la adicion de la trombina. Media ± SEM de 4 mediciones en N = 2 experimentos. D) El efecto de reduccion de c-KIT sobre la cafda inducida por trombina en la resistencia endotelial normalizada. La resistencia se normalizo hasta el momento justo antes de la adicion de la trombina. Media ± SEM de N = 3 experimentos, cada uno representa mediciones por duplicado.

Figura 4 - La inhibicion de Arg imita los efectos de imatinib durante la estimulacion con trombina. Las HUVEC se transfectaron con ARNip contra Arg, se sembraron en filtros de policarbonato, electrodos de oro ECIS o pocillos de 5 cm2, y se cultivaron hasta la confluencia durante 48 horas (mediciones ECIS y transferencia Western) o 120 horas (paso de hRp y transferencia Western).Las celulas confluentes se trataron previamente con imatinib (10 jM), DMSO (0,1 %) o HSA al 1 %/M199, y se estimularon con trombina (IIa, 1 U/ml) o vector. A) Curva de tiempo del paso de HRP en celulas transfectadas con scARN o ARNip para Arg despues de la estimulacion con trombina o vector.Media ± SEM de N = 4 experimentos.** P <0,01 en comparacion con scARN + IIa.B) Curva de tiempo del paso de HRP en celulas transfectadas con scARN o ARNip para Arg, tratadas previamente con imatinib o DMSO, y posteriormente estimuladas con trombina. Media ± SEM de N = 4 experimentos. scARN + DMSO + IIa frente a siArg + DMSO + IIa, P <0,05; scARN + DMSO + IIa frente a scARN + Imatinib 10 jM + IIa, P <0,001; scARN + DMSO + IIa frente a siArg + Imatinib 10 jM + IIa, P <0,001; siArg + DMSO + IIa frente a scARN + Imatinib 10 jM + IIa, P <0,05; siArg + DMSO + IIa frente a siArg + Imatinib 10 jM + IIa, P <0,01 en ANOVA de mediciones repetidas. C) Resistencia endotelial normalizada durante la estimulacion con trombina en HUVEC transfectadas con scARN o ARNip para Arg. La resistencia se normalizo hasta el momento justo antes de la estimulacion con trombina. La respuesta a la trombina se cuantifico mediante el calculo de la disminucion maxima en la resistencia normalizada (inserto).Media ± SEM de N = 4 experimentos.* P <0,05.D) Resistencia normalizada en celulas transfectadas con scARN o ARNip para Arg, tratadas previamente con imatinib o DMSO, y estimuladas con trombina. Media ± SEM de N = 5 experimentos.E) La respuesta a la trombina se cuantifico mediante el calculo de la disminucion maxima en la resistencia normalizada. Media ± SEM de N = 5 experimentos.* P <0,05, ** P <0,01.F) Expresion de la protema Arg en celulas transfectadas con scARN o ARNip para Arg, lisadas 48 horas o 120 horas despues de la transfeccion (inserto). La expresion de protema se cuantifico con un metodo semicuantitativo, y se normalizo para la carga con p-actina. Media de N = 2 experimentos.

Figura 5

A) Las HUVEC se sembraron en filtros de policarbonato y se cultivaron hasta la confluencia durante 120 horas.Las celulas confluentes se trataron previamente con concentraciones crecientes de imatinib (1, 2, 5, 10 jM) o DMSO (en concentraciones correspondientes), y se estimularon con trombina (IIa, 1 U/ml) o vector.Media de N = 2 experimentos, cada una representa mediciones portriplicado.B) Las HPMVEC se sembraron en electrodos de oro ECIS y se cultivaron hasta la confluencia.La resistencia endotelial absoluta de las monocapas de HPMVEC se trataron previamente con imatinib (10 jM) o DMSO (0,1 %), y posteriormente se estimularon con trombina (IIa, 1 U/ml).Media ± desviacion estandar (SD) de 3 mediciones en 1 experimento.C) Las HFMVEC se sembraron en electrodos de oro ECIS y se cultivaron hasta la confluencia.La resistencia endotelial absoluta de las monocapas de celulas endoteliales microvasculares de piel humana (HSMVEC) se trataron previamente con imatinib (10 jM) o DMSO (0,1 %) y posteriormente se estimularon con trombina (IIa, 1 U/ml).Media ± SD de N = 3 experimentos, cada uno representa mediciones por duplicado.

Figura 6

Las HUVEC o HPMVEC se sembraron en electrodos de oro ECIS.A) Resistencia de la interaccion celula a celula (Rb) en HUVEC durante la estimulacion con trombina (IIa, 1 U/ml) despues del tratamiento previo con DMSO (0,1 %) o imatinib (10 jM).Media ± SEM de N = 3 experimentos, cada uno representa mediciones por duplicado. B) Resistencia de la interaccion celula-matriz (Alfa) en HUVEC durante la estimulacion con trombina despues del tratamiento previo con DMSO o imatinib. Media ± SEM de N = 3 experimentos, cada uno representa mediciones por duplicado. C) Resistencia provocado por la interaccion celula-celula (Rb) en HPMVEC tratadas previamente con DMSO (0,1 %) o imatinib (10 jM), y estimuladas con trombina (IIa, 1 U/ml). D) Resistencia provocada por la interaccion celula-matriz (Alfa) en HPMVEC tratadas previamente con DMSO o imatinib, y estimuladas con trombina.

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Figura 7

A) Las HUVEC se transfectaron con scARN o ARNip para c-Abl y se sembraron en electrodos de oro ECIS. Las celulas se cultivaron hasta la confluencia durante 48 horas, se pretrataron con HSA al 1 % y se estimularon con trombina (IIa, 1 U/ml).A partir de mediciones de ECIS se calcularon la resistencia provocada por la interaccion celula-celula (Rb) y la resistencia provocada por la interaccion celula-matriz (alfa).Aqm se representa el efecto de la reduccion de c-Abl sobre la disminucion inducida por trombina en Rb normalizada. Media ± SEM de 4 mediciones en N = 2 experimented. B) Las celulas se transfectaron con scARN o ARNip para c-Abl y se cultivaron hasta la confluencia. Despues de 48 horas las celulas se trataron previamente con imatinib (10 pM) y posteriormente se estimularon con trombina (IIa, 1 U/ml).Media de N = 2 experimentos, cada uno representa mediciones por duplicado. C) Las HUVEC se transfectaron con scARN, ARNip para PDGFR-a o -p o la combinacion de ARNip para PDGFR-a y -p, se sembraron en electrodos de oro ECIS, y se cultivaron hasta la confluencia. Despues de 48 horas las celulas se trataron previamente con HSA al 1 %, y se estimularon con trombina (IIa, 1 U/ml).Los datos representan la resistencia endotelial absoluta. D) Curva de tiempo del paso de HRP en celulas transfectadas con scARN, ARNip para PDGFR-a o -p o una combinacion de ARNip para PDGFR-a y -p despues de la estimulacion con trombina o vector. Media ± SEM de 3-6 mediciones en N = 2 experimentos. E) Las HUVEC se sembraron en pocillos de cultivo de 5 cm2 y se cultivaron hasta la confluencia. A las celulas confluentes se les sustituyo el suero durante 24 horas con medio que contema 1 % (1 % s) o 2 % (2 % s) de suero de ternero recien nacido, o se cultivaron en medio de crecimiento normal (cM199).Despues de 24 horas las celulas se lisaron y los lisados celulares se analizaron para determinar la expresion de PDGFR-a o p por transferencia Western. Los lisados de fibroblastos de pulmon humano (FB) sirvieron como control positivo para la expresion de PDGFR. Imagenes representativas de N = 3 experimentos. F) Cuantificacion de la disminucion maxima en la resistencia normalizada en HUVEc tratadas previamente con concentraciones crecientes de Tirfostina AG1296 (2, 10, 50 pM) o DMSO (0,1 %) y estimuladas con trombina (IIa, 1 U/ml) o vector. Media ± SEM de N = 5 experimentos, *** P <0,001 en comparacion con DMSO + IIa.

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Lista de referencia

1. Lee WL, Slutsky AS. Sepsis and endothelial permeability. N Engl J Med. 2010;363(7):689-691.

2. Mehta D, Malik AB. Signaling mechanisms regulating endothelial permeability. Physiol Rev. 2006;86(1):279-367.

3. Overbeek MJ, van Nieuw Amerongen GP, Boonstra A, Smit EF, Vonk-Noordegraaf A. Possible role of imatinib in clinical pulmonary veno-occlusive disease. Eur Respir J. 2008;32(1):232-235.

4. Waller CF. Imatinib mesylate. Recent Results Cancer Res. 2010;184:3-20.

5. Schiffer CA. BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors for chronic myelogenous leukemia. N Engl J Med. 2007;357(3):258- 265.

6. Deininger MW, Goldman JM, Lydon N, Melo JV. The tyrosine kinase inhibitor CGP57148B selectively inhibits the growth of BCR-ABL-positive cells. Blood. 1997;90(9):3691-3698.

7. Druker BJ, Talpaz M, Resta DJ y otros. Efficacy and safety of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia. N Engl J Med. 2001;344(14):1031-1037.

8. van Oosterom AT, Judson I, Verweij J y otros. Safety and efficacy of imatinib (STI571) in metastatic gastrointestinal stromal tumours: a phase I study. Lancet. 2001;358(9291):1421-1423.

9. Daniels CE, Wilkes MC, Edens M y otros. Imatinib mesylate inhibits the profibrogenic activity of TGF-beta and prevents bleomycin-mediated lung fibrosis. J Clin Invest. 2004;114(9):1308-1316.

10. Schermuly Rt, Dony E, Ghofrani HA y otros. Reversal of experimental pulmonary hypertension by PDGF inhibition. J Clin Invest. 2005;115(10):2811-2821.

11. Kerkela R, Grazette L, Yacobi R y otros. Cardiotoxicity of the cancer therapeutic agent imatinib mesylate. Nat Med. 2006;12(8):908-916.

12. Hellberg C, Ostman A, Heldin CH. PDGF and vessel maturation. Recent Results Cancer Res. 2010;180:103-114.

13. Su EJ, Fredriksson L, Geyer M y otros. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat Med. 2008;14(7):731-737.

14. Armulik A, Genove G, Mae M y otros. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 2010;468(7323):557-561.

15. van Nieuw Amerongen GP, Draijer R, Vermeer MA, van Hinsbergh VWM. Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA. Circ Res. 1998;83(11):1115-1123.

16. Shelton JL, Wang L, Cepinskas G y otros. Albumin leak across human pulmonary microvascular vs. umbilical vein endothelial cells under septic conditions. Microvasc Res. 2006;71(1):40-47.

17. van Hinsbergh VWM, Spengers ED, Kooistra T. Effect of thrombin on the production of plasminogen activators and PA inhibitor-1 by human foreskin microvascular endothelial cells. Thromb Haemost. 1987;57(2):148-153.

18. Vogel SM, Gao X, Mehta D y otros. Abrogation of thrombin-induced increase in pulmonary microvascular permeability in PAR-1 knockout mice. Physiol Genomics. 2000;4(2):137-145.

19. Tauseef M, Kini V, Knezevic N y otros. Activation of sphingosine kinase-1 reverses the increase in lung vascular permeability through sphingosine-1-phosphate receptor signaling in endothelial cells. Circ Res. 2008;103(10):1164-1172.

20. Minami T, Sugiyama A, Wu SQ y otros. Thrombin and phenotypic modulation of the endothelium. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24(1):41-53.

21. Giaever I, Keese CR. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci USA. 1991;88(17):7896-7900.

22. Lo CM, Keese CR, Giaever I. Cell-substrate contact: another factor may influence transepithelial electrical resistance of cell layers cultured on permeable filters. Exp Cell Res. 1999;250(2):576-580.

23. Dejana E, Orsenigo F, Lampugnani MG. The role of adherens junctions and VE-cadherin in the control of vascular permeability. J Cell Sci. 2008;121(Pt 13):2115-2122.

24. van Nieuw Amerongen GP, van Delft S, Vermeer MA, Collard JG, van Hinsbergh VWM. Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases. Circ Res. 2000;87(4):335- 340.

25. Huang X, Wu D, Jin H, Stupack D, Wang JYJ. Induction of cell retraction by the combined actions of Abl-CrkII and Rho-ROCK1 signaling. J Cell Biol. 2008;183(4):711-723.

26. Kim J, Wu Q, Zhang Y y otros. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(40):17206-17210.

27. Hernandez SE, Settleman J, Koleske AJ. Adhesion-dependent regulation of p190RhoGAP in the developing brain by the Abl-related gene tyrosine kinase. Curr Biol. 2004;14(8):691-696.

28. Bradley WD, Hernandez SE, Settleman J, Koleske AJ. Integrin signaling through Arg activates p190RhoGAP by promoting its binding to p120RasGAP and recruitment to the membrane. Mol Biol Cell. 2006;17(11):4827-4836.

29. Kurimoto N, Nan yS, Chen ZY y otros. Effects of specific signal transduction inhibitors on increased permeability across rat endothelial monolayers induced by neuropeptide Y or VEGF. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;287(1):H100-H106.

30. Singh N, Kumar L, Meena R, Velpandian T. Drug monitoring of imatinib levels in patients undergoing therapy for chronic myeloid leukaemia: comparing plasma levels of responders and non-responders. Eur J Clin Pharmacol. 2009;65(6):545-549.

31. Demetri GD, Wang Y, Wehrle E y otros. Imatinib plasma levels are correlated with clinical benefit in patients with unresectable/metastatic gastrointestinal stromal tumors. J Clin Oncol. 2009;27(19):3141-3147.

32. Wang Y, Miller AL, Mooseker MS, Koleske AJ. The Abl-related gene (Arg) nonreceptor tyrosine kinase uses two F- actin-binding domains to bundle F-actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(26):14865-14870.

33. Galkin VE, Orlova A, Koleske AJ, Egelman EH. The Arg non-receptor tyrosine kinase modifies F-actin structure. J Mol Biol. 2005;346(2):565-575.

34. Lapetina S, Mader CC, Machida K, Mayer BJ, Koleske AJ. Arg interacts with cortactin to promote adhesion- dependent cell edge protrusion. J Cell Biol. 2009;185(3):503-519.

5 35. Miller MM, Lapetina S, MacGrath SM y otros. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge

protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochemistry. 2010;49(10):2227-2234.

36. Boyle SN, Koleske AJ. Use of a chemical genetic technique to identify myosin IIb as a substrate of the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase. Biochemistry. 2007;46(41):11614-11620.

37. Kolega J. Asymmetric distribution of myosin IIB in migrating endothelial cells is regulated by a rho-dependent kinase 10 and contributes to tail retraction. Mol Biol Cell. 2003;14(12):4745-4757.

38. Peacock JG, Couch BA, Koleske AJ. The Abl and Arg non-receptor tyrosine kinases regulate different zones of stress fiber, focal adhesion, and contractile network localization in spreading fibroblasts. Cytoskeleton (Hoboken). 2010;67(10):666-675.

39. Shikata Y, Birukov KG, Garcia JGN. SIP induces FA remodeling in human pulmonary endothelial cells: role of Rac, 15 GIT1, FAK, and paxillin. J Appl Physiol. 2003;94(3):1193-1203.

40. Bradley WD, Koleske Aj. Regulation of cell migration and morphogenesis by Abl-family kinases: emerging mechanisms and physiological contexts. J Cell Sci. 2009;122 (Pt 19):3441-3454.

41. Zandy NL, Playford M, Pendergast AM. Abl tyrosine kinases regulate cell-cell adhesion through Rho GTPases. Proc Natl Acad Sci U S f\. 2007;104 (45):17686-17691.

20 42. Wang B, Kruh GD. Subcellular localization of the Arg protein tyrosine kinase. Oncogene. 1996;13(1):193-197.

43. Dudek SM, Chiang ET, Camp SM y otros. Abl tyrosine kinase phosphorylates nonmuscle Myosin light chain kinase to regulate endothelial barrier function. Mol Biol Cell. 2010;21(22):4042-4056.

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La invencion se explica adicionalmente en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invencion, sino que simplemente sirven para aclarar la invencion.

Ejemplos

Ejemplo l.Imatinib atenua la hiperpermeabilidad endotelial inducida portrombina.

Para evaluar los efectos de imatinib sobre la funcion de la barrera endotelial, las HUVEC se trataron previamente con imatinib, y posteriormente se estimularon con trombina (1 U/ml).La trombina se utilizo para imitar las condiciones inflamatorias, ya que la trombina es un potente inductor de la permeabilidad endotelial,1819 y se incrementa en la sepsis y en sitios de lesion vascular.20 La funcion de barrera endotelial se evaluo mediante el paso de HRP a traves de las monocapas endoteliales cultivadas en filtros porosos y mediante la resistencia electrica de las monocapas endoteliales cultivadas en electrodos de oro (Deteccion de la impedancia electrica de las celulas y el sustrato (ECIS)). Imatinib no afecto la funcion de la barrera endotelial basal en ambas mediciones (Figuras 1A y C).La trombina indujo un aumento de 5 a 10 veces en el paso de HRP traves de las monocapas endoteliales (Figura 1A), lo cual se atenuo por imatinib de manera dependiente de la dosis con un efecto maximo a 10 pM (Figura 5A). Imatinib 10 pM redujo el paso de HRP inducido por trombina de manera similar en todos los puntos de tiempo (inhibicion de 35 - 44 %, P <0,001; Figura 1A).En las mediciones de ECIS la trombina redujo fuertemente la resistencia electrica endotelial hasta alcanzar un maximo despues de 30 minutos, seguido de una recuperacion gradual de la resistencia EC (Figura 1B). Imatinib atenuo la disminucion inducida por trombina en la resistencia endotelial, como se indica por una cafda significativamente menor en la resistencia, y una recuperacion mas rapida hacia la lmea de base (Figuras 1B y 1C, disminucion maxima en la resistencia normalizada de -0,54 ± 0,02 en celulas tratadas previamente con DMSO frente a - 0,41 ± 0,03 en celulas tratadas previamente con imatinib, P <0,001).

Para evaluar si los efectos observados de imatinib se producen ademas en otros tipos de celulas endoteliales, los ensayos de permeabilidad se realizaron en celulas endoteliales microvasculares de pulmon humano (HPMVEC) y celulas endoteliales microvasculares de prepucio humano (HFMVEC).En las HPMVEC, el imatinib redujo el paso de la macromolecula inducido por trombina (Figura 1D) y atenuo la cafda maxima de la resistencia endotelial (Figura 5B).De manera similar, el imatinib atenuo la cafda maxima inducida por trombina en la resistencia endotelial en las HFMVEC (Figura 5C).

Ejemplo 2.Imatinib atenua la desintegracion, inducida portrombina, de las uniones endoteliales

La resistencia electrica a traves de una monocapa endotelial es el resultado tanto de la interaccion celula-celula (adhesion intercelular) como de la interaccion celula-sustrato (adhesion celular a la matriz subcelular).2122 El calculo de la resistencia provocada por la interaccion celula-celula (Rb) revelo que la trombina disminuye fuertemente la adhesion celula-celula, lo cual se atenuo por imatinib (Figura 6A, disminucion maxima en Rb normalizada -0,97 ± 0,02 en celulas tratadas previamente con DMSO frente a -0,87 ± 0,03 en celulas tratadas previamente con imatinib, p = 0,05).Esto se acompano por la atenuacion de la cafda inducida portrombina en la interaccion celula-matriz (Figura 6B).Se observaron efectos comparables de imatinib sobre Rb y alfa en las HPMVEC (Figura 6C y D).

Para analizar adicionalmente el efecto de imatinib sobre la adhesion celula a celula, se realizo una tincion de inmunofluorescencia de las protemas de AJ VE-cadherina y p-catenina, las cuales son necesarias para la integridad de AJ. 223 A los 15 minutos (datos no mostrados) y 30 minutos, la perdida, la trombina indujo perdida de VE-cadherina (Figura 1E) y p-catenina (Figura IF) de la membrana, como indica la reduccion de la senal de fluorescencia en la periferia de las celulas, y la formacion de espacios intercelulares (flechas, Figura 1E y F).La perdida de VE-cadherina y p-catenina de la membrana podna revertirse parcialmente por el tratamiento previo con imatinib, indicado por la preservacion de tincion de la membrana y reduccion del numero de espacios intercelulares.

En conjunto, estos datos demuestran que imatinib protege contra la disfuncion de la barrera endotelial durante la estimulacion con trombina. Imatinib ejerce estos efectos mediante la preservacion de la integridad de AJ y la adhesion celula a celula.

Ejemplo 3.Los efectos de imatinib de proteccion de la barrera son independientes de la ruta de RhoA/Rho quinasa.

La disociacion de las AJ inducida por la trombina y la perdida de la adhesion de celula a celula implica Ca2+ y la contraccion por actina y miosina mediada por RhoA/Rho quinasa.224 Para evaluar la contraccion por actina y miosina, las HUVEC se tineron para la actina F.La trombina (15 min) altero el citoesqueleto de actina F de una banda de actina F periferica predominante (Figura 2A, panel superior izquierdo) a un nuevo patron con robustas fibras de estres de actina F (flechas, Figura 2A, panel superior derecho).En las celulas tratadas previamente con imatinib la actina F no se organizo en fibras de estres de actina F, sino en una red bien estructurada de pequenos filamentos de actina F en la periferia de la celula. La ausencia de fibras de estres en las celulas tratadas previamente con imatinib se asocio con la perdida de la morfologfa celular contractil y menos espacios intercelulares (Figura 2A, panel inferior derecho).

Dado que se ha informado que la mayona de las quinasas sensibles a imatinib (c-Abl25, PDGFR26 y Arg2728) afectan la actividad de Rho quinasa, planteamos la hipotesis de que el imatinib atenua los cambios inducidos por trombina en el

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citoesqueleto de actina mediante la inhibicion de la ruta de la RhoA/Rho quinasa. Las HUVEC se trataron previamente con imatinib y/o el inhibidor de Rho quinasa Y-27632, y se estimularon con trombina. Tanto imatinib como Y-27632 redujeron la permeabilidad endotelial inducida por trombina segun se determino mediante el paso de HRP y la resistencia electrica transendotelial. Los efectos inhibidores de imatinib y Y-27632 sobre el paso de HRP fueron independientes y aditivos (Figura 2B, P <0,05).Similarmente, las mediciones de ECIS apuntaron a un efecto aditivo de imatinib y Y-27632 (Figuras 2C y D, cafda maxima de la resistencia electrica de -0,44 ± 0,02 en las celulas tratadas previamente con imatinib solo frente a -0,18 ± 0,04 en las celulas tratadas previamente con una combinacion de imatinib y Y-27632, P <0,05).

Para analizar el efecto de imatinib sobre la activacion de RhoA, se analizaron los lisados celulares para determinar la actividad de RhoA con un ensayo de la actividad de RhoA G-LISA.La actividad de RhoA tuvo un gran aumento tras la estimulacion con trombina, pero no se afecto por el tratamiento previo con imatinib (Figura 2E).Dado que imatinib no afecta la activacion de RhoA y tiene un efecto aditivo a la inhibicion de ROCK, imatinib atenua la permeabilidad endotelial independiente de la ruta de la RhoA/Rho quinasa. Mediante el uso de BAPTA-AM como un quelante de calcio intracelular, se excluyo ademas un efecto del imatinib sobre el Ca2+ citoplasmatico (datos no mostrados).

Estos datos indican que imatinib reduce la formacion de fibras de estres de actina F y la contraccion celular sin afectar la ruta de la RhoA/Rho quinasa. Esto implica que, durante la disfuncion de la barrera endotelial, existe una regulacion de la estructura de la actina F independiente de la ruta de la RhoA/Rho quinasa.

Ejemplo 4. La inhibicion de c-Abl, PDGFR o c-KIT no es la razon de los efectos protectores de la barrera del imatinib.

Para determinar cual de las quinasas sensibles a imatinib (c-Abl, PDGFR, Arg y c-KIT) esta implicada en la hiperpermeabilidad endotelial inducida por trombina, se obtuvo una disminucion por ARNip sistematico de las quinasas sensibles a imatinib. Dado que imatinib se desarrollo principalmente para dirigirse a c-Abl, planteamos la hipotesis de que la inhibicion de c-Abl es la razon de los efectos protectores de imatinib. Las HUVEC se transfectaron con ARNip para c-Abl para disminuir a c-Abl, lo que resulto en una reduccion del 85 % en la expresion de la protema c-Abl en comparacion a la transfeccion con ARN aleatorio (scARN, Figura 3A inserto). Las mediciones de ECIS demostraron que la disminucion de c-Abl deterioro en algo la integridad de la barrera endotelial basal (reduccion de 100 Q en comparacion con las celulas control, Figura 3A). La trombina indujo una disminucion identica en la resistencia electrica en las celulas control y las celulas deficientes en c-Abl (Figura 3A y 3B).Sin embargo, el calculo de Rb revelo que la respuesta a la trombina fue mas prominente en las celulas endoteliales deficientes de c-Abl (Figura 7A). En las celulas deficientes de c-Abl, imatinib todavfa atenuo la respuesta a la trombina (Figura 7B).Por lo tanto, la inhibicion de c-Abl no es la razon de los efectos protectores de imatinib sobre la funcion de barrera endotelial.

Posteriormente, probamos si la inhibicion de PDGFR era la responsable de los efectos de imatinib sobre la permeabilidad endotelial.Las HUVEC se transfectaron con ARNip contra PDGFR-a o -p, o la combinacion. Aunque la disminucion combinada de PDGFR-a y p aumento la resistencia endotelial basal (Figura 7C), no se observo efecto protector sobre la respuesta a la trombina (Figura 3C).Similarmente, no se detectaron diferencias en el paso de HRP entre las celulas transfectadas con scARN y ARNip para PDGFR (Figura 7D).La expresion de protemas de PDGFR-a y - p estaba por debajo del lfmite de deteccion (Figura 7E), lo que respalda aun mas el hallazgo de que PDGFR no esta involucrado en la respuesta a la trombina.

Similarmente, la disminucion de c-KIT con ARNip no afecto la respuesta a la trombina (Figura 3D).Para confirmar los resultados de la disminucion de PDGFR y c-KIT, las HUVEC se trataron previamente con Tirfostina AG1296, un inhibidor farmacologico de ambos PDGFR y c-KIT. Similar a la disminucion combinada de PDGFR-a y -p, AG1296 mejoro la funcion de barrera basal, pero no inhibio la respuesta a la trombina (Figura 7F).En conjunto, estos datos indican que ni la inhibicion de c-Abl, ni la inhibicion de PDGFR o c-KIT son la razon de los efectos protectores de la barrera del imatinib.

Ejemplo 5.La tirosina quinasa Arg es un mediador de la hiperpermeabilidad inducida por trombina.

Finalmente, se investigo si Arg esta implicada en la disfuncion de la barrera endotelial inducida por trombina. La disminucion de Arg redujo significativamente el paso de HRP inducido por la trombina. El paso de HRP fue menor en las celulas transfectadas con ARNip para Arg en comparacion con las celulas transfectadas con scARN (Figura 4A; 15,5 ± 1,1 % frente a 20,1 ± 1,5 %, respectivamente, P <0,01 despues de 1 hora y 21,3 ± 1,5 % frente a 27,3 ± 1,8 %, respectivamente, P <0,01 despues de 2 horas).El tratamiento previo con imatinib tuvo un efecto aditivo a la disminucion de Arg sobre la respuesta a la trombina, ya que el paso de hRp fue significativamente menor en las celulas deficientes de Arg tratadas previamente con imatinib, en comparacion con las celulas deficientes de Arg tratadas previamente con DMSO (Figura 4B, P <0,01).En las mediciones de ECIS la disminucion de Arg atenuo la respuesta a la trombina como se indica por una cafda menor en la resistencia endotelial y una recuperacion mas rapida hacia los valores basales (Figura 4C).La disminucion de Arg imito el tratamiento previo con imatinib, ya que ese observo una disminucion similar en la resistencia normalizada en las celulas deficientes de Arg y las celulas tratadas previamente con imatinib, mientras que el tratamiento previo con imatinib no tuvo ningun efecto aditivo (Figura 4D y E).La eficacia de la disminucion de Arg fue mayor despues de 48 horas que despues de 120 horas (Figura 4F).Como el intervalo entre la transfeccion y la medicion difiere para las mediciones de ECIS (48 horas) y los experimentos del paso de HRP (120 horas), la diferencia

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en la disminucion de Arg probablemente explica la observacion de que la disminucion de Arg imito exactamente al imatinib en las mediciones de ECIS, pero no en los experimented del paso de HRP.

Estos dates indican que imatinib atenua la hiperpermeabilidad inducida por trombina a traves de la inhibicion de Arg. Ademas, estos datos identifican a Arg como un nuevo mediador de la respuesta a la trombina. Arg contribuye de manera importante a la disfuncion de la barrera endotelial inducida por la trombina, ya que la inhibicion de Arg reduce el paso de macromoleculas inducido por la trombina hasta un 40 %.

Ejemplo 6.Tratamiento de la sepsis con un inhibidor de ARG

La sepsis se diagnostica si dos o mas de los siguientes criterios estan presentes: temperatura corporal anormal (< 36 °C o > 38 °C), conteos anormales de leucocitos (< 4 o > 12 x109/L), una fuente de infeccion clmica o microbiologicamente probada, taquicardia (> 90/min) y taquipnea (> 20/min o una presion parcial de dioxido de carbono arterial (PaCO2) < 32 mmHg).Tras el diagnostico de la sepsis, el tratamiento con imatinib se iniciara a una dosis de 400 mg al dfa, administrada por via oral o intravenosa.Los indicadores de respuesta clmica son: presencia de edema pulmonar en la radiograffa o TAC de torax, saturacion de la hemoglobina por oxfgeno, presion parcial de oxfgeno arterial (relacion PaO2)/fraccion de oxfgeno inspirado (FO2), dependencia de ventilador, dependencia de vasopresores y presion arterial sistemica.Si no hay respuesta clmica durante 2 dfas, la dosis de imatinib se puede aumentar a 400 mg dos veces al dfa.La duracion maxima del tratamiento es de 3 semanas.

Ejemplo 7.Tratamiento de edema pulmonar despues de la radiacion con inhibidor de ARG

El edema pulmonar grave puede seguir a una radioterapia, en dependencia de la dosis y la duracion de la irradiacion. El edema pulmonar tras la irradiacion se diagnostica por evidencia de edema pulmonar en una radiograffa de torax o TAC de torax e hipoxemia. Tras el diagnostico de un edema pulmonar despues de la radiacion el tratamiento con imatinib se iniciara con una dosis inicial de 400 mg al dfa administrada por via oral o intravenosa. Los parametros para el seguimiento del edema pulmonar incluyen: presencia de edema pulmonar en la radiograffa de torax o CT (torax), tension de oxfgeno arterial y saturacion de la hemoglobina por oxfgeno. Si no hay respuesta clmica durante 2 dfas, la dosis de imatinib se puede aumentar a 400 mg dos veces al dfa. La duracion maxima del tratamiento es superior a las 3 semanas.

Ejemplo 8.Tratamiento del edema pulmonar con reperfusion despues de una endarterectoiTHa pulmonar con inhibidor de ARG

El edema pulmonar de reperfusion se produce por lo general dentro de las 72 horas despues de una endarterectom^a pulmonar (Levinson y otros.J Thorac Cardiovasc Surg. Abr de 1990; 99 (4): 670-8; Levinson y otros. Am Rev Respir Dis.Dic de 1986; 134(6):1241-5), y se diagnostica por la presencia de edema pulmonar en una radiograffa de torax o TAC (torax), tension de oxfgeno arterial y saturacion de la hemoglobina por oxfgeno. Despues de realizar una endarterectom^a pulmonar, el tratamiento con imatinib se iniciara con una dosis inicial de 400 mg administrados diariamente por via oral o intravenosa para prevenir el desarrollo de edema pulmonar. Los parametros para el seguimiento del edema pulmonar incluyen: presencia de edema pulmonar en la radiograffa de torax o CT (torax), tension de oxfgeno arterial, saturacion de la hemoglobina por oxfgeno y dependencia de ventilador. Si no hay respuesta clmica durante 2 dfas, la dosis de imatinib se puede aumentar a 400 mg dos veces al dfa. La duracion maxima del tratamiento es de 3 semanas.

Ejemplo 9.Tratamiento de la estenosis de no reflujo con inhibidor de ARG

La estenosis de no reflujo es un fenomeno que se observa comunmente durante la cateterizacion cardfaca por la estenosis de las arterias coronarias, lo que es provocado probablemente por la formacion de edema en la pared vascular que rodea la lesion. El tratamiento con imatinib se iniciara 12 horas (dosis unica de 400 mg administrada por via oral o intravenosa) antes del comienzo de la cateterizacion cardfaca para prevenir el desarrollo de edema en la pared vascular durante el procedimiento y continua despues del procedimiento (400 mg al dfa) para evitar la formacion de edema en la fase postoperatoria. La duracion maxima del tratamiento es de 1 semana.

Ejemplo 10.Tratamiento de la lesion pulmonar aguda/smdrome de insuficiencia respiratoria aguda (ALI/ARDS)

ALI/ARDS pueden desarrollarse como consecuencia de enfermedades pulmonares (por ejemplo, neumoma, contusion pulmonar o ahogamiento), o como consecuencia de una enfermedad sistemica (por ejemplo, sepsis) .ALI y ARDS se diagnostican de acuerdo con los criterios de la Conferencia de Consenso de America y Europa. Tras el diagnostico de ALI/ARDS, el tratamiento con imatinib se iniciara ademas del tratamiento regular como se indica en las directrices sobre el tratamiento para ALI/ARDS. La dosis inicial de imatinib sera de 400 mg al dfa, administrados por via oral o intravenosa. Los indicadores de respuesta clmica son: presencia de edema pulmonar en la radiograffa o TAC de torax, saturacion de la hemoglobina por oxfgeno, presion parcial de oxfgeno arterial relacion (PaO2)/fraccion de oxfgeno inspirado (FO2), dependencia de ventilador y agua pulmonar extravascular, segun se mide por la tecnica de termodilucion de indicador individual. Si no hay respuesta clmica durante 2 dfas, la dosis de imatinib se puede aumentar a 400 mg dos veces al dfa. La duracion maxima del tratamiento es de 3 semanas.

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Materiales y Metodos Reactivos

El mesilato de imatinib se adquirio de ChemieTek (Indianapolis, IN, Estados Unidos) y se disolvio en dimetilsulfoxido (DMSO) a una concentracion madre de 10 mM.Tirfostina AG1296 se adquirio de Sigma Aldrich (Steinheim, Alemania) y se disolvio en DMSO a una concentracion madre de 5 mM.La trombina se adquirio de Sigma Aldrich (Zwijndrecht, Pafses Bajos).Y-27632 se adquirio de Tocris Cookson Ltd (Londres, Reino Unido).Los ARN pequenos de interferencia (ARNip) contra c-Abl, PDGFR-a y -p, Arg, c-KIT y ARN aleatorios (scARN) eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, Estados Unidos). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti c-Abl (num. 2862), anti PDGFR-a (num. 3174) y -p (num. 3169), todos de Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, Estados Unidos), anti p-actina (Sigma Aldrich), anti VE-cadherina (SC-6458, Santa Cruz) y Arg (SC-6356, Santa Cruz) y p-catenina (clon 8E7, Upstate/Millipore, Temecula, CA, Estados Unidos).

Cultivo celular

Para las celulas endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), los cordones umbilicales se obtuvieron de Amstelland Ziekenhuis, Amstelveen. Las celulas se aislaron de donantes sanos, y se caracterizaron extensamente como se describio anteriormente.15 Despues del aislamiento, las celulas se resuspendieron en medio M199 (BioWhittaker/Lonza, Verviers, Belgica), suplementado con penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 mg/ml (BioWhittaker/Lonza, Verviers, Belgica), suero humano inactivado por calor al 10 % (Sanquin cLb, Amsterdam, Pafses Bajos), suero de ternero recien nacido al 10 % inactivado por calor (Gibco, Grand Island, Nueva York), factor de crecimiento de celulas endoteliales crudo 150 pg/ml (preparado a partir de cerebros bovinos), L-glutamina 2 mmol/l (Biowhittaker/Lonza), y heparina 5 U/ml (Leo Pharmaceutical Products, Weesp, Pafses Bajos).Las celulas se cultivaron a 37 °C y 5 % de CO2, con un cambio del medio de cultivo cada dos dfas. Las celulas se cultivaron hasta el pase 2, para los experimentos se utilizaron celulas de 1-2 pases.

Las celulas microvasculares pulmonares humanas se aislaron a partir de tejido pulmonar humano como se describio previamente.16 Las celulas se cultivaron en medio de cultivo EGM2-MV (medio EBM2 suplementado con 5 % de suero fetal bovino, factor de crecimiento epidermico humano, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento similar a la insulina, hidrocortisona, acido ascorbico, gentamicina y anfotericina de acuerdo con el protocolo de los fabricantes [BioWhittaker/Lonza], y con penicilina [100 U/ml] y estreptomicina [100 mg/ml]) y se sembraron en frascos de cultivo de 25 cm2 revestidos con gelatina. Las celulas se cultivaron hasta la confluencia a 37°C y 5 % de CO2, con un cambio del medio de cultivo cada dos dfas. Se caracterizaron ampliamente como celulas endoteliales por la presencia de marcadores endoteliales y la ausencia de marcadores de celulas epiteliales, linfaticas y de musculo liso. Las celulas se cultivaron hasta el pase 7, para los experimentos se utilizaron celulas de 4-7 pases. Las celulas microvasculares de prepucio humano se aislaron a partir de prepucio humano17, y se cultivaron con medio de cultivo EGM2-MV. Las celulas se cultivaron hasta confluencia a 37 °C y 5 % de CO2, con un cambio del medio de cultivo cada dos dfas, y se caracterizaron de manera similar a las celulas endoteliales.17

Aislamiento de celulas endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HPMVEC) El tejido pulmonar se obtuvo a partir de pacientes sometidos a lobectoirna por cancer de pulmon primario o metastasis (Departamento de Cirugfa Toracica, Centro Medico Universitario VU, Amsterdam). Despues de enjuagar el tejido pulmonar en solucion salina tamponada con fosfato (PBS), se elimino el tejido pleural y el tejido restante se corto en piezas durante 5 minutos. El tejido cortado se incubo en 20 ml de solucion de colagenasa tipo II al 0,3% (Sigma, St. Louis, Missouri, Estados Unidos) en PBS durante 60 minutos bajo agitacion suave. La digestion se detuvo mediante la adicion de medio de cultivo EGM2- MV (medio EBM2 suplementado con 5 % de suero fetal bovino, factor de crecimiento epidermico humano, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento similar a la insulina, hidrocortisona, acido ascorbico de acuerdo con el protocolo de los fabricantes [Lonza, Basel, Suiza], y con penicilina [100 U/ml] y estreptomicina [100 mg/ml, Lonza, BioWhittaker, Verviers, Belgica]). Despues de la digestion, la suspension se lavo abundantemente a traves de un filtro de celulas de 100 pM y 70 pm (Bd Biosciences, Bedford, Estados Unidos).La suspension filtrada se centrifugo durante 5 min a 230 x G/21 °C, y el sedimento se resuspendio en 120 pl de EGM2-MV, 40 pl de reactivo de bloqueo de FcR y 40 pl de perlas magneticas recubiertas con cD31 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania) y se incubaron durante 15 min a 4 °C. Las celulas endoteliales CD31+ se separaron de otras celulas al pasar la suspension celular a traves de un campo magnetico. Las celulas endoteliales recien aisladas se sembraron en frascos de cultivo de 25 cm2 recubiertos de gelatina y fibronectina. Despues de 7-10 dfas de cultivo, las celulas se purificaron adicionalmente mediante la repeticion del procedimiento de las perlas magneticas hasta alcanzar un cultivo 95-100 % puro. Las celulas se caracterizaron ampliamente como celulas endoteliales por la presencia de marcadores endoteliales (CD31, VE-cadherina, vWF, Tie2 y union de lectina de Ulex), y la ausencia de marcadores de celulas epiteliales (pancitoqueratina), de celulas de musculo liso vascular (a-actina de musculo liso) o marcadores linfaticos (LYVE-1).Las celulas se caracterizaron ademas como celulas endoteliales microvasculares (lectina de Ulex).

Funcion de barrera endotelial

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La funcion de barrera endotelial se evaluo con el paso de la peroxidasa de rabano picante (HRP) y deteccion de la impedancia electrica de las celulas y el sustrato (lEM).Para la medicion del paso de HRP, las celulas confluentes se sembraron en densidad de 1:1 en filtros de policarbonato Costar de 0,33 cm2, tamano de poro de 3,0 pm (Corning, Lowell, MA, Estados Unidos) y se cultivaron hasta la confluencia en 4 o 5 dfas, con cambio de medio de cultivo cada dos dfas. Para el pretratamiento, los inhibidores farmacologicos o vector se disolvieron en M199 suplementado con 1 % de albumina de suero humano (HSA, Sanquin CLB), y despues de la eliminacion del medio de cultivo, se anadieron las soluciones al compartimiento superior de los filtros durante 60 min. Para la estimulacion, el medio de pretratamiento se cambio por HSA al 1 %/M199 que contemas los inhibidores designados, HRP 5 pg/ml (Sigma Aldrich) y trombina 1 U/ml. Se anadio HSA al 1 %/M199 al compartimiento inferior.En los puntos de tiempo indicados se tomaron muestras del compartimento inferior; la concentracion de HRP se detecto en las muestras mediante la medicion de quimioluminiscencia despues de la adicion de TMB/E (Upstate/Millipore).

Para las mediciones de ECIS, las celulas se tripsinizaron y se sembraron en densidad de 1:1 en arreglos de ECIS recubiertos con gelatina, cada uno contema 8 pocillos con 10 electrodos de oro/pocillo (8W10E, Applied Biophysics, Troy, Nueva York, Estados Unidos).El medio de cultivo se renovo 24 horas despues de la siembra, mientras que los experimentos se llevaron a cabo 48 horas despues de la siembra. Para el pretratamiento, el vector o los inhibidores farmacologicos designados se disolvieron en M199 suplementado con HSA al 1 %.Despues de 90 minutos de pretratamiento, se anadio la trombina directamente a las celulas para una concentracion final de 1 U/ml. Durante la estimulacion se midio la impedancia a multiples frecuencias para permitir el calculo de la resistencia atribuible a la adhesion celula a celula (Rb) y la resistencia atribuible a la interaccion celula-matriz (alfa).Se midio la resistencia absoluta, mientras que la resistencia relativa se calculo mediante normalizacion al punto de tiempo justo antes de la adicion de la trombina, para corregir las diferencias de la lmea de base.

Tincion de inmunofluorescencia

Las celulas se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con gelatina al 1 % y tratados previamente con glutaraldetndo al 0,5 % (Fluka, St. Gallen, Suiza). Las celulas se sembraron en densidad de 1:1 y se cultivaron hasta la confluencia en 48-72 horas. Para el pretratamiento, el medio de cultivo se cambio a HSA al 1 %/M199, que contema los inhibidores farmacologicos o el vector. Despues de 60 minutos de pretratamiento, se anadio la trombina directamente a los pocillos para una concentracion final de 1 U/ml. En los puntos de tiempo indicados, se retiro el medio y se anadio paraformaldetndo al 2 % caliente (Sigma Aldrich) a las celulas, mientras se manteman en hielo durante 15 min. Las celulas se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,05 % (Sigma Aldrich) en solucion salina tamponada con fosfato (PBS), y se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios para p-catenina (1:100), VE-cadherina (1:400) o Arg (1:150) en HSA al 0,1 %/PBS. Posteriormente, las celulas se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con FITC (Invitrogen, Paisly, Reino Unido) y rodamina/faloidina (Invitrogen) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las celulas se lavaron y se sellaron en medio de montaje Vectashield que contema DAPI (Vector Laboratories Inc., Burlingham, CA, Estados Unidos) para la tincion nuclear. La toma de imagenes de inmunofluorescencia se realizo con un microscopio invertido de fluorescencia de campo amplio Axiovert 200 Marianas™, mediante el uso de una lente de aire Zeiss de 40x 0,75) y una lente de aceite Zeiss 63x (NA 1,4).Todas las imagenes se trabajaron con el programa informatico Slidebook (Intelligent Imaging Innovation, Denver, CO, Estados Unidos).

Ensayo de actividad de RhoA

Para el analisis de la actividad de RhoA, 10 cm2 de celulas confluentes/condicion se pretrataron con imatinib (10 pM) o vector (DMSO 0,1 %) y se estimularon con trombina (1 U/ml) durante los intervalos indicados. Despues de la estimulacion, las celulas se lavaron con PBS frio y se lisaron con tampon de lisis que contema 0,02 mM Tris/HCl pH 8,0, 0,15 M NaCl, 0,09 M KCl, 2 mM de EDTA/NaOH pH 8,0, 5 % de Igepal, y 0,5 % de Triton X-100, suplementado adicionalmente con el inhibidor de proteasa PhosStop (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), y el inhibidor de fosfatasa libre de EDTA completo (Roche Diagnostics).Despues de la centrifugacion de los lisados celulares, el sobrenadante se congelo de manera instantanea y se almaceno a -80 °C. La actividad de RhoA relativa se determino con un Ensayo de la actividad de RhoA G-LISA (Cytoskeleton Inc, Denver, CO, Estados Unidos), de acuerdo con el protocolo de los fabricantes.

Transfecciones

Las celulas se transfectaron con Amaxa Technology (Amaxa Biosystems, Lonza), de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. El 80-90 % de las celulas confluentes (pase 1) se tripsinizaron y se transfectaron con los ARNip indicados (0,05 nmol para 10 cm2 de celulas) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Despues de la transfeccion, las celulas se sembraron en matrices ECIS recubiertas de gelatina o pocillos de cultivo de 5 cm2.Para el control de la expresion de protemas en celulas transfectadas, 5 cm2 de celulas confluentes/condicion se lisaron 48 horas o 120 horas despues de la transfeccion.20 pg de protema total/condicion se sometieron a electroforesis, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sometieron a inmunotransferencia para c-Abl (1:1000, durante la noche a 4 °C), PDGFR-a y -p (ambos 1:200, durante la noche a 4 °C), y Arg (1:150, durante la noche a 4 °C). La p-actina (1:100 000) sirvio como control de carga.

Analisis estad^stico

Todos los datos se presentan como Media ± Error estandar de la media (SEM).N se refiere al numero de experimentos independientes. Para la comparacion de 2 grupos se utilizo una prueba t de Student, para la comparacion de mas de 2 5 grupos se utilizo un ANOVA de una via con la prueba post-hoc de Tukey. Un valor de p < 0,05 se considero significativo.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   Reivindicaciones

   1. Un inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG) para usar en el tratamiento de un individuo que padece o esta en riesgo de padecer edema inflamatorio, en donde dicho inhibidor se selecciona de:

   a) un inhibidor de la actividad tirosina quinasa de la protema codificada por dicho gen relacionado con Abl (ARG), seleccionado entre nilotinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, dasatinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, e imatinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;

   b) un anticuerpo anti-ARG que se une a ARG e inhibe su funcion; y

   c) una molecula de acido nucleico que provoca la degradacion de ARG o inhibe la funcion, la transcripcion o traduccion de ARG.
2. 2. Un inhibidor para usar de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde dicho edema inflamatorio es edema inducido por trombina.
3. 3. Un inhibidor para usar de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde dicho individuo que padece o esta en riesgo de padecer edema inflamatorio, padece de sepsis, ALI/ARDS, preeclampsia, estenosis de no reflujo, edema pulmonar y preferentemente edema pulmonar despues de la radiacion o edema pulmonar despues de una endarterectoirna.
4. 4. Un inhibidor para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho inhibidor de la actividad tirosina quinasa no inhibe significativamente la actividad tirosina quinasa de C-kit, PDGFR-alfa y/o C- Abl.
5. 5. Un inhibidor para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG) es imatinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
6. 6. Un inhibidor para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG) comprende un oligonucleotido antisentido espedfico para un pre- ARNm codificado por dicho gen relacionado con Abl (ARG).
7. 7. Un inhibidor para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG) comprende un ARNip espedfico para un ARNm codificado por dicho gen relacionado con Abl (ARG).
8. 8. Un inhibidor para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG) se proporciona durante un penodo de tiempo de entre 1-20 semanas.
9. 9. Un metodo para inhibir la disfuncion de la barrera endotelial en una coleccion in vitro de celulas endoteliales que comprende una barrera endotelial que no funciona adecuadamente o esta en riesgo de disfuncion, dicho metodo comprende proporcionar dicha coleccion de celulas endoteliales con un inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG), en donde dicho inhibidor se selecciona de:

   a) un inhibidor de la actividad tirosina quinasa de la protema codificada por dicho gen relacionado con Abl (ARG), seleccionado entre nilotinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, dasatinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, e imatinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;

   b) un anticuerpo anti-ARG que se une a ARG e inhibe su funcion; y

   c) una molecula de acido nucleico que provoca la degradacion de ARG o inhibe la funcion, la transcripcion o traduccion de ARG.
10. 10. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde dicho inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG) es imatinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo
11. 11. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde dicho inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG) es una molecula de acido nucleico que provoca la degradacion de ARG o inhibe la funcion, la transcripcion o la traduccion de ARG.
12. 12. Una coleccion de celulas endoteliales que comprenden una barrera endotelial que no funciona adecuadamente o esta en riesgo de disfuncion, dichas celulas comprenden un inhibidor de la funcion del gen relacionado con Abl (ARG), en donde dicho inhibidor se selecciona de:

    a) un inhibidor de la actividad tirosina quinasa de la protema codificada por dicho gen relacionado con Abl (ARG), seleccionado entre nilotinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, dasatinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, e imatinib o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo;

    b) un anticuerpo anti-ARG que se une a ARG e inhibe su funcion; y

    c) una molecula de acido nucleico que provoca la degradacion de ARG o inhibe la funcion, la transcripcion o traduccion de ARG.