ES2621359T3

ES2621359T3 - Polisacáridos modificados para vacunas conjugadas

Info

Publication number: ES2621359T3
Application number: ES08771342.6T
Authority: ES
Inventors: Francis Michon; Arun Sarkar
Original assignee: Pfizer Ireland Pharmaceuticals
Current assignee: Pfizer Ireland Pharmaceuticals
Priority date: 2007-06-20
Filing date: 2008-06-18
Publication date: 2017-07-03
Anticipated expiration: 2028-06-18
Also published as: EP2170391A4; CN101754773A; AU2008265767A2; AU2008265767A1; AU2008265767B2; JP2010532793A; US20130197203A1; US20100189740A1; JP5555623B2; CA2692069A1; HK1214129A1; CN105267974A; EP2170391A1; EP2170391B1; US20160175430A1; CA2692069C; WO2008157590A1

Abstract

Un método de elaborar un glicoconjugado inmunogénico que comprende a) sustituir al menos un grupo N-acetilo en un oligosacárido o polisacárido antigénico comprendiendo uno o más aminoazúcares sustituidos por N-acetilo por una fracción N-acilo que comprende una fracción alquilo no saturada mayor que 5 carbonos, donde al menos un doble enlace se encuentra entre dos carbonos que no sean entre los carbonos 1 y 2 o entre los carbonos 2 y 3 de la fracción alquilo no saturada; b) poner en contacto el oligosacárido o polisacárido sustituido con un agente oxidante para generar al menos un grupo aldehído activo en un sitio de no saturación de dicha fracción alquilo; y c) conjugar el oligosacárido o polisacárido a través del al menos un grupo aldehído activo con una proteína portadora, generando de esta manera un glicoconjugado inmunogénico.

Description

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DESCRIPCION

Polisacaridos modificados para vacunas conjugadas

1. CAMPO DE LA INVENClON

[0001] La presente invencion se refiere a metodos de elaboracion de glicoconjugados inmunogenicos, en concreto para la utilizacion en composiciones farmaceuticas para inducir una respuesta inmunitaria terapeutica en un sujeto. Los glicoconjugados inmunogenicos de la invencion comprenden uno o mas oligosacaridos o polisacaridos que estan conjugados con una o mas protemas portadoras a traves de un grupo aldehfdo activo. En consecuencia, la invencion da a conocer metodos de elaboracion de (i) oligosacaridos o polisacaridos microbianos no saturados derivados de N-acilo; (ii) conjugados novedosos de derivados de N-acilo no saturados; y (iii) composiciones de glicoconjugados que comprenden moleculas conjugadas de fragmentos de derivados de N-acilo microbianos no saturados que sirven como enlace covalente a una o mas protemas. La invencion tambien abarca las composiciones farmaceuticas de glicoconjugados inmunogenicos para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad infecciosa.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENClON

[0002] Las infecciones microbianas provocadas por bacterias grampositivas, tales como Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix y Clostridium, y por las bacterias gramnegativas, tales como Haemophilus, Shigella, Vibrio cholerae, Neisseria y determinados tipos de Escherichia coli provocan una morbilidad considerable alrededor del mundo. Los estreptococos, por ejemplo, constituyen un genero amplio y variado de bacterias grampositivas que se han ordenado en diversos grupos en funcion de la antigenicidad y estructura de su polisacarido de pared celular (Lancefield, R. C. 1933. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J.Exp.Med. 57:571-595. Lancefield, R. C. 1938. A micro-precipitin technique for classifying hemolytic streptococci and improved methods for producing antigen. Proc.Soc.Exp.Biol.and Med. 38:473-478).

[0003] Los estreptococos del grupo B, por ejemplo, se clasifican en diversos tipos en funcion del polisacarido capsular, tales como los tipos la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII y VIII, que representan la mayona de la patogenicidad. Al igual que los descubrimientos con otros muchos patogenos bacterianos humanos, los polisacaridos capsulares de los estreptococos del grupo B pueden proporcionar proteccion eficaz contra infecciones con estas bacterias cuando se utilizan en vacunas (Vease Wessels, et al. 1990. Immunogenicity in animals of a polysaccharide- protein conjugate vaccine against type III group B Streptococcus. J. Clin. Invest. 86:1428-1433. Wessels, et al. 1993. Stimulation of protective antibodies against type Ia and lb group B streptococci by a type Ia polysaccharide- tetanus toxoid conjugate vaccine. Infect. Immun. 61:4760-4766).

[0004] Las bacterias gramnegativas tambien constituyen una causa importante de morbilidad y mortalidad. Hasta el reciente desarrollo y utilizacion de vacunas polisacarido-protema dirigidas contra bacterias Haemophilus influenzae tipo b (Hib, pos sus siglas en ingles), las infecciones bacterianas causadas por Hib eran las responsables de muchos casos de retraso mental en infantes.

[0005] Los infantes y los ninos pequenos suelen tener respuestas inmunogenicas pobres a antfgenos polisacaridos. Estas respuestas se caracterizan por ser independientes de celulas T y, por lo tanto, no estan asociadas con atributos importantes como la memoria, la conmutacion isotfpica o la maduracion de la afinidad, que son necesarios para conferir proteccion inmunologica duradera contra infecciones posteriores. Para sortear la carencia de una respuesta inmunogenica eficaz en infantes y ninos pequenos a polisacaridos, el sector ha trabajado en el desarrollo de enfoques para convertir la respuesta independiente de celulas T en una respuesta dependiente de celulas T mediante el acoplamiento de forma covalente de antfgenos bacterianos polisacaridos con una protema portadora para formar una molecula conjugada. Vease, Jennings et al. patente estadounidense con n.° 4,356,170).

[0006] Los adyuvantes son sustancias que incrementan la respuesta inmunitaria a antfgenos y, por consiguiente, se han utilizado en muchas vacunas y vacunas candidatas. El efecto estimulante inmunitario de los adyuvantes no es espedfico a un antfgeno, puesto que estimulan respuestas inmunitarias hacia muchos tipos distintos de antfgenos. Los unicos adyuvantes que la FDA aprueba actualmente para uso humano son las sales de aluminio, pero muchos adyuvantes utilizados en la vacunacion de animales y en nuevas vacunas candidatas son de procedencia microbiana (White, R. G., 1976. The adjuvant effect of microbial products on the immune response. Ann.Rev.Microbiol. 30:579-595; incorporado en el presente documento como referencia en su totalidad). Dichos adyuvantes incluyen el adyuvante de Freund, el Corynebacterium parvum, el muramil dipeptido, el toxoide tetanico, etc.

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[0007] La conjugacion de un polisacarido con una protema portadora puede hacer de forma eficaz que ese polisacarido sea mas inmunogenico. Las protemas portadoras conocidas en la tecnica incluyen toxina/toxoide tetanica/o, CRM197, protemas de la membrana exterior de bacterias gramnegativas, por ejemplo, protemas de alto peso molecular, P6 y P4 de Haemophilus influenzae no tipificable, CD y USPA de Moraxella catarrhalis, toxina/toxoide difterica/o, toxina A de Pseudomonas aeruginosa destoxificada, toxina/toxoide del colera, toxina/toxoide pertussis, exotoxinas/toxoide de Clostridium perfringens, antigeno de superficie de la hepatitis B, antigeno central de la hepatitis B, protema de rotavirus VP 7 o protemas F y G del virus respiratorio sincitial.

[0008] El toxoide tetanico se ha utilizado durante decadas en esta capacidad como un portador, y se ha establecido su perfil de seguridad.

[0009] Las vacunas conjugadas de polisacaridos capsulares (PC) que tienen como objetivo una diversidad de infecciones bacterianas estan actualmente en desarrollo y evaluacion clmica. La inclusion de multiples PC serotipos combinados en una inyeccion unica se encuentra actualmente en estudio. La combinacion de vacunas conjugadas de PC en una inyeccion unica polivalente, sin embargo, puede dar lugar a una competicion entre los diferentes componentes y, de forma desfavorable, afectar a la inmunogenicidad de cualquier conjugado individual (Fattom et al., 1999, Vaccine 17: 126-33).

[0010] En la tecnica, se han descrito diversos procedimientos para conjugar polisacaridos capsulares con protemas. La conjugacion de un polisacarido con una protema portadora puede hacer de forma eficaz que ese polisacarido sea mas inmunogenico (Robbins, J. B. and R. Schneerson. 1990. Polysaccharide-protein conjugates: A new generation of vaccines. J. Infect. Dis. 161:821-832). Para otro analisis, vease Contributions to Microbiology and Immunology, vol 10, Conjugate Vaccines, volume editions J. M. Cruse y R. E. Lewis, Jr., 1989. En un metodo, se somete a los polisacaridos a hidrolisis con acido suave para producir grupos terminales reductores capaces de reaccionar con protema para formar un enlace covalente (Anderson, P. A., 1983, Infect. Immun., 39:233-238).

Sin embargo, los grupos glucidos terminales que participan en la conjugacion con protema estan en equilibrio entre un semiacetal y aldetudo y, por consiguiente, se acoplan a la protema con escasa eficacia. Para superar la escasa reactividad del azucar reductor terminal, la tecnica cambio a la oxidacion suave para introducir grupos aldetudos estables en posiciones terminales de polisacaridos utilizados para conjugarse con protema (vease Jennings et al. patente estadounidense con n.° 4,356,170, supra).

[0011] Otros metodos disponibles, por ejemplo, la activacion mediante oxidacion con IO4' de algunos polisacaridos, pueden generar solamente un sitio activo por molecula de polisacarido y el acoplamiento consiguiente a protema portadora genera vacunas glicoconjugadas de terminal unico. Esta disposicion se encuentra, por ejemplo, en vacunas glicoconjugadas para Neisseria meningitidis tipo C, tipo B y Streptococcus del grupo A. Sin embargo, un unico sitio activo por molecula limita el grado de mejora de inmunogenicidad.

[0012] El documento WO9640239 expone polisacaridos de N. meningitidis modificados donde se conjuga una protema con el terminal del polisacarido.

3. SUMARIO DE LA INVENCION

[0013] La invencion a la que se refiere la presente memoria es como se establece en las reivindicaciones adjuntas a la presente descripcion.

[0014] La presente invencion da a conocer polisacaridos con multiples sitios activos que permiten la generacion de vacunas glicoconjugadas reticuladas inmunogenicas a traves de la conjugacion con una protema portadora adecuada. Asimismo, el metodo tambien se puede aplicar a cualquier polisacarido que contenga un aminoazucar, una clara ventaja sobre el metodo de oxidacion con IO4' existente, que requiere dos grupos adyacentes, esto es, vecinales, libres de (-OH) hidroxi en la cadena de azucar.

[0015] La presente invencion se refiere a metodos de elaboracion de glicoconjugados inmunogenicos, en concreto para la utilizacion en composiciones farmaceuticas para inducir una respuesta inmunitaria terapeutica en un sujeto. Los glicoconjugados inmunogenicos de la invencion comprenden uno o mas oligosacaridos o polisacaridos que estan conjugados con una o mas protemas portadoras a traves de un grupo aldehfdo activo. Al contrario que otros metodos de conjugacion anteriores conocidos en la tecnica, la presente invencion da a conocer metodos que se pueden aplicar a cualquier polisacarido que contenga al menos un aminoazucar; dichos metodos tambien producen conjugados solubles bien definidos que mantienen la antigenicidad.

[0016] La exposicion da a conocer metodos de elaboracion de un glicoconjugado inmunogenico que comprenden las siguientes etapas: desacetilar al menos un grupo N-acetilo en un oligosacarido o polisacarido que comprende

uno o mas aminoazucares, formar un oligosacarido o polisacarido que tiene al menos un aminoazucar o preferiblemente multiples aminoazucares, comprendiendo un grupo amino primario; sustituir al menos uno de los grupos amino primarios con una fraccion N-acilo que comprende una fraccion alquilo no saturada que mide al menos 4 carbonos, generando de esta manera un oligosacarido o polisacarido que comprende al menos un sitio 5 activo o preferiblemente multiples sitios activos en el sitio de no saturacion de la una o mas fracciones alquilo; poner en contacto el compuesto con un agente oxidante, generar un grupo aldetudo activo (-CHO) en el uno o mas sitios no saturados en el oligosacarido o polisacarido; y conjugar el compuesto con una protema portadora, con la consiguiente generacion un glicoconjugado inmunogenico.

[0017] En modos de realizacion alternativos, la exposicion da a conocer metodos de elaboracion de un 10 glicoconjugado inmunogenico que comprenden las siguientes etapas: sustituir al menos un grupo N-acetilo en un

oligosacarido o polisacarido que comprende uno o mas aminoazucares por una fraccion N-acilo que comprende una fraccion alquilo no saturada que mide al menos 4 carbonos, con la consiguiente generacion de un oligosacarido o polisacarido que comprende al menos un sitio activo o preferiblemente multiples sitios activos en el sitio de no saturacion de la una o mas fracciones alquilo; poner en contacto el compuesto con un agente 15 oxidante, generar un grupo aldetudo activo (-CHO) en el uno o mas sitios no saturados de las fracciones alquilo en el oligosacarido o polisacarido; y conjugar el compuesto con una protema portadora, con la consiguiente generacion de un glicoconjugado inmunogenico.

[0018] De acuerdo con los metodos de la exposicion, la fraccion N-acilo comprende una fraccion alquilo no saturada. En determinados modos de realizacion, la fraccion alquilo no saturada es una fraccion C3 C4, C5, Ca,

20 C7, C7, C8, C9, C10, o C11 y puede comprender uno o mas dobles enlaces en la cadena principal de carbono. En determinados modos de realizacion, la fraccion alquilo no saturada comprende solamente un doble enlace, esto es, un sitio de no saturacion. En otros modos de realizacion, la fraccion N-acilo es una fraccion N-pentenoilo. La fraccion N-acilo no saturada puede comprender cualquier fraccion alquilo no saturada descrita en el presente documento o conocida en la tecnica que sea adecuada para la oxidacion de un aldetudo activo en el sitio de no

25 saturacion y la conjugacion consiguiente con una protema portadora, por ejemplo, un anhudrido de acilo no

saturado (p. ej., antudrido pentenoico) o un haluro de acilo no saturado (p. ej., cloruro de pentenoilo, cloruro de acroloilo).

[0019] La oxidacion de las moleculas de la exposicion se limita preferiblemente a la oxidacion de los dobles enlaces de la fraccion N-acilo no saturada (esto es, el/los sitio(s) de no saturacion de la fraccion alquilo no

30 saturada) y, por consiguiente, se lleva a cabo en condiciones moderadas como se define en el presente documento o como se conoce en la tecnica, por ejemplo, oxidacion con la utilizacion de peryodato en un intervalo de pH de 4-9.5, como se conoce en la tecnica. Debido a las condiciones moderadas de oxidacion, los sitios de no saturacion situados muy cerca del grupo acilo no se oxidaran y/o no formaran un grupo aldetudo activo para permitir la conjugacion consiguiente con una protema portadora. En consecuencia, para utilizarse en los metodos 35 de la invencion, el sitio de no saturacion (esto es, la ubicacion del doble enlace) del grupo alquilo no saturado no

se encuentra ni entre los carbonos 1 y 2 ni entre los carbonos 2 y 3 del grupo alquilo no saturado (vease, p. ej., la figura 1 para la numeracion del grupo alquilo, como se acepta en la tecnica y se utiliza en el presente documento). En determinados modos de realizacion, la fraccion alquilo no saturada comprende solamente un doble enlace. En otros modos de realizacion, la fraccion alquilo no saturada comprende un doble enlace entre los 40 dos carbonos terminales de la cadena principal de carbono.

[0020] La exposicion tambien da a conocer un glicoconjugado inmunogenico que comprende: a) al menos un oligosacarido o polisacarido que comprende uno o mas aminoazucares preparados mediante

i) desacetilacion del grupo N-acetilo de dicho uno o mas aminoazucares; ii) sustitucion del grupo amino primario resultante del aminoazucar con un grupo N-acilo que comprende un grupo alquilo no saturado de al 45 menos 4 carbonos; y iii) oxidacion de dicho grupo alquilo no saturado para generar un grupo alquilo de al menos 3 carbonos con un grupo aldetudo activo en el terminal de la cadena principal; y b) una protema portadora conjugada con ello. De acuerdo con los metodos de la invencion, el sitio de no saturacion, esto es, el doble enlace del grupo alquilo no saturado no se encuentra ni entre los carbonos 1 y 2 ni entre los carbonos 2 y 3 de la cadena principal (vease, p. ej., la figura 1 para la numeracion de carbono). En los modos 50 de realizacion preferidos, la cadena de alquilo no saturada es una cadena de al menos 5 carbonos de longitud. En otros modos de realizacion, el sitio de no saturacion o la cadena de alquilo previa a la oxidacion esta entre los dos carbonos terminales de la cadena de alquilo no saturada. Segun los metodos de la invencion, la protema portadora se conjuga con el al menos un polisacarido u oligosacarido a traves del grupo aldetudo activo por medio de cualquier metodo conocido en la tecnica y/o descrito en el presente documento.

55 [0021] La exposicion tambien proporciona un glicoconjugado inmunogenico que comprende: a) al menos un

oligosacarido o polisacarido que comprende uno o mas aminoazucares que comprenden uno o mas grupos N- acetilo, donde dictio uno o mas grupos N-acetilo tian sido sustituidos por un grupo N-acilo que comprende un

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grupo alquilo de al menos 3 carbonos que comprende un grupo aldeddo activo en el terminal de dicha cadena principal de grupo alquilo y b) una protema portadora conjugada con ello. En los modos de realization preferidos, la cadena de alquilo que comprende el grupo aldehido activo tiene al menos 4 carbonos de longitud. Segun los metodos de la invention, la protema portadora se conjuga con el al menos un polisacarido u oligosacarido a traves del grupo aldehido activo por medio de cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, aminacion reductiva, y/o descrito en el presente documento.

[0022] De acuerdo con la exposition, el al menos un grupo N-acetilo en el uno o mas aminoazucares del polisacarido u oligosacarido se sustituye para formar el compuesto como sigue (Formula I):

azucar

[

NH

imagen1

Ri

donde Ri es una fraction alquilo no saturada C3 C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10 o Cn y [azucar] representa el dicho uno o mas aminoazucares del polisacarido u oligosacarido. En determinados modos de realizacion, dicho uno o mas aminoazucares es un componente de la unidad repetitiva del polisacarido u oligosacarido. En otros modos de realizacion, dicho uno o mas aminoazucares no es un componente de la unidad repetitiva del polisacarido u oligosacarido. En modos de realizacion espetificos, R1 es C3 o C4, por ejemplo, de manera que se forme un grupo N-butenoilo o grupo N-pentenoilo, respectivamente. En otros modos de realizacion, R1 contiene solamente un doble enlace, esto es, sitio de no saturation; dicho doble enlace esta situado entre los dos carbonos terminales de la cadena principal de alquilo.

[0023] La fraccion N-acilo no saturada sirve como fraccion de enlace para la conjugation del oligosacarido o polisacarido con la protema portadora a traves de la oxidation del sitio de no saturacion con un grupo aldehido activo y la conjugacion consiguiente de dicha protema. La oxidacion del sitio de no saturacion de la fraccion alquilo puede llevarse a cabo mediante cualquier metodo descrito en el presente documento y/o conocido en la tecnica, por ejemplo, con peryodato. Puesto que la oxidacion puede escindir la cadena de polisacarido, la etapa de oxidacion abarcada por la presente invencion se lleva a cabo solamente en condiciones moderadas, por ejemplo, baja temperatura (por ejemplo, aproximadamente 4 °C a aproximadamente 27 °C) a un intervalo de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.5. Debido a las condiciones moderadas de oxidacion, para que el sitio de no saturacion se oxide de manera eficaz, el doble enlace de la fraccion alquilo no saturada no puede estar entre los carbonos 1 y 2 o entre los carbonos 2 y 3 de la cadena principal de alquilo no saturada (vease, p. ej., la figura 1 para la numeration de carbono). En un ejemplo no limitativo segun este modo de realizacion, donde R1 es una fraccion no saturada C3 (que forma un grupo N-butenoilo en la Formula 1), el grupo N-acilo comprende un doble enlace entre los carbonos 3 y 4 de la cadena principal de alquilo. En otros modos de realizacion, donde R1 comprende una cadena mayor de 3 carbonos, el sitio de no saturacion puede estar en posiciones mayores que el carbono 4.

[0024] Segun los productos y metodos de la exposicion posteriores a la oxidacion y la conjugacion, la protema y el oligosacarido o polisacarido del glicoconjugado estan enlazados de forma covalente a traves de un enlace como se muestra a continuation (en el cuadrado; Formula II):

imagen2

Proteina

donde R2 es una fraccion alquilo saturada C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 o C10, y donde NH (en el cuadrado) pertenece a uno de los grupos NH2 primario de la protema, por ejemplo, residuos de lisinila o residuos de

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arginila. El [azucar] de la Formula II representa el dicho uno o mas aminoazucares del polisacarido u oligosacarido. En determinados modos de realizacion, dicho uno o mas aminoazucares es un componente de la unidad repetitiva del polisacarido u oligosacarido. En otros modos de realizacion, el dicho uno o mas aminoazucares no es un componente de la unidad repetitiva del polisacarido u oligosacarido. R2 de la Formula II se deriva de R1 de la Formula I. R1 de la Formula I (esto es, una fraccion alquilo no saturada) se selecciona de manera que se obtenga, despues de la oxidacion y la conjugacion, como se conoce en la tecnica y/o se describe en el presente documento, la fraccion enlace deseada R2 o Formula II (esto es, una fraccion alquilo saturada).

[0025] Segun los metodos de la invencion, el N-acetilo del uno o mas aminoazucares del polisacarido u oligosacarido puede estar enlazado con el aminoazucar en cualquier posicion, incluidas 1, 2, 3, 4 o 5 del azucar. Las estructuras de los aminoazucares se conocen en la tecnica y, por lo tanto, la posicion de dicho enlace puede determinarse de forma rutinaria. Por ejemplo, donde el aminoazucar es GlcNac, el grupo N-acetilo del azucar esta en el carbono 2; donde el aminoazucar es acido sialico, el grupo N-acetilo del azucar esta en el carbono 4.

[0026] En un modo de realizacion espedfico, el grupo N-acetilo de la molecula de azucar se sustituye por un grupo N-pentenoilo, donde el grupo N-pentenoilo sirve como fraccion de enlace para la conjugacion del polisacarido u oligosacarido con la protema portadora, por ejemplo, conjugacion mediante aminacion reductiva. En un modo de realizacion espedfico, posterior a la oxidacion y la conjugacion, el grupo de enlace es un grupo N-acilo saturado con una cadena principal C4 saturada. Segun los metodos de la invencion, el grupo N-acetilo que ha de ser sustituido puede ser el de cualquier aminoazucar, incluyendo, pero sin caracter limitativo, GlcNAc, ManNAc, GalNAc y acido sialico.

[0027] En determinados modos de realizacion de la invencion, la sustitucion de los grupos N-acetilo se lleva a cabo con un alcali.

[0028] La invencion abarca la utilizacion de cualquier protema portadora conocida en la tecnica y/o descrita en el presente documento que sea adecuada para su utilizacion en vacunas conjugadas inmunogenicas y que funcione para convertir una respuesta inmunitaria independiente de celulas T en una respuesta inmunitaria dependiente de celulas T. En determinados modos de realizacion, la protema portadora es una protema bacteriana o un fragmento de la misma, por ejemplo, una toxina bacteriana o toxoide bacteriano o un fragmento de los mismos. Ejemplos no limitativos de protemas portadoras que pueden utilizarse segun los metodos de la invencion incluyen toxina/toxoide tetanica/o, CRM197, protemas de la membrana exterior de bacterias gramnegativas, P6 y P4 de Haemophilus influenzae no tipificable, protema derivada de Haemophilus influenzae tipo B, CD y USPA de Moraxella catarrhalis, toxina/toxoide difterica/o, toxina A de Pseudomonas aeruginosa destoxificada, toxina/toxoide del colera, toxina/toxoide pertussis, exotoxinas/toxoide de Clostridium perfringens, antfgeno de superficie de la hepatitis B, antfgeno central de la hepatitis B, protema de rotavirus VP7 y protemas F y G del virus respiratorio sincitial.

[0029] En determinados modos de realizacion, el oligosacarido o polisacarido utilizado de acuerdo con los metodos de la invencion es un polisacarido de una bacteria o de un fragmento antigenico de la misma. Dichas bacterias incluyen, pero sin caracter limitativo, Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix, Clostridium, Shigella, Klebsiella, Vibrio cholerae, Neisseria y Escherichia. En modos de realizacion relacionados, el oligosacarido o polisacarido es un polisacarido capsular derivado de cualesquiera bacterias capsulares, por ejemplo, estreptococos del grupo B Ia, Ib, II, III, V, VI o VIII; Streptococcus del grupo A; Neisseria meningitidis tipos B, C, Y o W135; S. pneumoniae tipos III, IV o XIV; o Escherichia coli K1. En los modos de realizacion preferidos, el oligosacarido o polisacarido se elige de modo que sea capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra las bacterias de las que se deriva. En determinados modos de realizacion, el oligosacarido o polisacarido no es un oligosacarido o polisacarido de origen natural, por ejemplo, pueden sintetizarse mediante cualquier tecnica conocida en la tecnica, o pueden derivarse de compuestos de origen natural pero modificarse de manera que el oligosacarido o polisacarido resultante no se halle en la naturaleza. Por ejemplo, el polisacarido u oligosacarido puede modificarse con el fin de incrementar la antigenicidad, por ejemplo, inducir una respuesta inmunitaria incrementada contra el polisacarido u oligosacarido de tipo salvaje relativo. Segun los metodos de la invencion, los polisacaridos utiles comprenden al menos un epftopo antigenico capaz de inducir una respuesta inmunoespedfica. Dichos polisacaridos u oligosacaridos contienen preferiblemente al menos 7 fracciones sacaridas, pero pueden manifestar actividad con tan solo dos fracciones sacaridas. Los polisacaridos u oligosacaridos pueden estar no ramificados o ramificados y pueden tener un peso molecular de desde aproximadamente 1000 a varios millones de daltones. En determinados modos de realizacion, los polisacaridos u oligosacaridos poseen una o mas modificaciones qmmicas. Ejemplos no limitativos de modificaciones qmmicas abarcadas por la presente invencion incluyen carboxilacion, sulfonacion, derivados sulfatados y fosfatados de polisacaridos, sus sales y mezclas de los mismos.

[0030] La presente exposicion tambien abarca la utilizacion de composiciones, en concreto composiciones farmaceuticas, que comprenden uno o mas inmunoglicoconjugados en concentraciones terapeuticamente

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eficaces para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto. La induccion de una respuesta inmunitaria al oligosacarido o polisacarido del inmunoglicoconjugado es util para el tratamiento y/o prevencion de una infeccion por el/los organismo(s) patogeno(s) de los que se deriva el oligosacarido o polisacarido. En consecuencia, en determinados modos de realizacion, el glicoconjugado de la invencion puede utilizarse como una vacuna para la profilaxis o como un terapeutico. En determinados modos de realizacion, un inmunoglicoconjugado comprende una pluralidad de polisacaridos y/u oligosacaridos derivados de mas de un tipo o cepa de bacterias, de manera que induce una respuesta inmunitaria contra mas de una especie/tipo o cepa de bacterias. En otros modos de realizacion, el oligosacarido o polisacarido utilizado en la elaboracion del inmunoglicoconjugado de la invencion se sintetiza para comprender multiples dominios antigenicos de multiples especies/cepas de bacterias y/u otros organismos patogenos, por ejemplo, protozoarios, de manera que se genere una respuesta inmunitaria polivalente en la administracion a un sujeto.

[0031] La invencion tambien se refiere a preparaciones inmunogenicas para humanos o animales, en concreto a composiciones inmunogenicas que comprenden uno o mas inmunoglicoconjugados de la invencion. En determinados modos de realizacion, las preparaciones inmunogenicas comprenden una pluralidad de inmunoglicoconjugados y/o una pluralidad de protemas portadoras. Puesto que los inmunoglicoconjugados pueden crearse para comprender polisacaridos u oligosacaridos de multiples tipos o cepas de bacterias y/o crearse para comprender un polisacarido u oligosacarido quimerico (esto es, un polisacarido u oligosacarido que comprende epftopos de multiples tipos y/o cepas de bacterias), las formulaciones inmunogenicas de la invencion pueden crearse para la profilaxis o la terapia contra multiples tipos de bacterias, variante de cepa o variantes de cepas. Pueden utilizarse muchos metodos conocidos y la rutina en la tecnica para inmunizar a un sujeto con las formulaciones inmunogenicas de la invencion incluyendo, pero sin caracter limitativo, via intranasal, intratraqueal, oral, intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutanea.

3.1 terminologJa

[0032] Como se utiliza en el presente documento, el termino "aproximadamente", cuando se utiliza junto con un numero se refiere a cualquier numero dentro de 1, 5 o 10 % del numero referenciado o dentro del error experimental tfpico de los metodos estandar utilizados para la medicion y/o determinacion de dicho numero.

[0033] Los terminos "portador/a", "protema portadora" o "polipeptido portador" se utilizan de forma intercambiable para referirse a una fraccion polipeptida a la que estan enlazados los antfgenos polisacaridos de forma covalente. Una protema portadora es normalmente inmunogenica y, por lo tanto, puede contribuir tambien a la valencia de la vacuna. El enlace a la protema portadora normalmente incrementa la antigenicidad de las moleculas de carbohidratos conjugadas. La protema portadora puede provenir del mismo organismo diana que los polisacaridos enlazados a el o provenir de un organismo distinto. Por ejemplo, la protema portadora puede ser una protema bacteriana, incluyendo, pero sin caracter limitativo, una toxina bacteriana o toxoide bacteriano. En modos de realizacion preferidos, la protema portadora se selecciona de manera que funcione para convertir una respuesta inmunitaria independiente de celulas T en una respuesta inmunitaria dependiente de celulas T.

[0034] Como se utiliza en el presente documento, el termino "en combinacion" en el contexto de la administracion de una/s terapia/s a un sujeto, se refiere a la utilizacion de mas de una terapia (p. ej., mas de un agente profilactico y/o agente terapeutico). La utilizacion del termino "en combinacion" no restringe el orden en el que las terapias (por ejemplo, agentes profilacticos y/o terapeuticos) se administran a un sujeto. Una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profilactico o terapeutico) puede administrarse antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas antes), simultaneamente con o despues de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas) la administracion de una segunda terapia (por ejemplo, un segundo agente profilactico o terapeutico) a un sujeto. En modos de realizacion espedficos, los glicoconjugados inmunogenicos de la invencion pueden utilizarse en combinacion con una o mas terapias adicionales, por ejemplo, vacunas, conocidas en la tecnica para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad infecciosa, por ejemplo, una enfermedad provocada por una infeccion con una o mas especies/cepas de bacterias.

[0035] Como se utilizan en el presente documento, los terminos "controlar", "que controla" y "control" se refieren a los efectos beneficiosos que deriva un sujeto de una terapia (por ejemplo, un agente profilactico o terapeutico), que no da lugar a una cura de la enfermedad. En determinados modo de realizacion, se administran una o mas terapias a un sujeto (por ejemplo, agentes profilacticos o terapeuticos, tales como una composicion de la invencion) para "controlar" una enfermedad infecciosa o una afeccion o smtoma asociados a la misma, para prevenir el avance o el empeoramiento de la enfermedad/trastorno.

[0036] Como se utilizan en el presente documento, los terminos "prevenir", “que previene” y "prevencion" se refieren a la prevencion del inicio de, la reaparicion o una reduccion de uno o mas smtomas de una enfermedad/trastorno (por ejemplo, infeccion por una bacteria) en un sujeto como resultado de la administracion

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de una terapia (por ejemplo, una composicion profilactica o terapeutica). Como se utiliza en el presente documento, "prevencion" tambien abarca la prevencion de infecciones por uno o mas tipos y/o cepas de bacterias que se asocian con la utilizacion de los inmunoconjugados de la invencion como una vacuna.

[0037] El termino "polisacarido" y "oligosacarido", como se utilizan en el presente documento, se utilizan en su sentido mas amplio para referirse a los sacaridos que comprenden una pluralidad de unidades repetitivas, incluyendo, pero sin caracter limitativo, los sacaridos que tienen desde 2 hasta mas de 2000 unidades repetitivas. Normalmente, como se acepta en la tecnica y como se utiliza en el presente documento, el termino "polisacarido" se refiere a un sacarido que tiene desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 2000 o mas unidades repetitivas. Como se acepta en la tecnica y como se utiliza en el presente documento, el termino "oligosacarido" se refiere a un sacarido que tiene desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 40, 45 o 50 unidades repetitivas. La unidad repetitiva de un polisacarido puede ser una unica molecula de monosacarido o puede ser una molecula de disacarido. En determinados modos de realizacion, la unidad repetitiva es 3 o mas moleculas de monosacarido. Segun los metodos de la invencion, pueden unirse qmmicamente o sinterizarse sinteticamente fragmentos de polisacaridos u oligosacaridos de diferentes tipos y/o cepas de bacterias para formar una unica cadena de polisacarido u oligosacarido que comprende multiples epttopos de los multiples tipos y/o cepas de bacterias de los que derivan y/o se identifican originalmente los fragmentos; en consecuencia, la composicion de la unidad o las unidades repetitivas del polisacarido u oligosacarido de la invencion necesita ser constante a lo largo de la cadena de sacarido entera. Los polisacaridos u oligosacaridos abarcados por los metodos de la invencion comprenden uno o mas aminoazucares. En determinados modos de realizacion, dicho uno o mas aminoazucares es un componente de la unidad repetitiva del polisacarido u oligosacarido. En otros modos de realizacion, el dicho uno o mas aminoazucares no es un componente de la unidad repetitiva del polisacarido u oligosacarido.

[0038] Como se utilizan en el presente documento, los terminos "sujeto" o "paciente" se utilizan de forma intercambiable. Como se utilizan en el presente documento, los terminos "sujeto" y "sujetos" se refieren a un animal (por ejemplo, mairnferos). En algunos modos de realizacion, el sujeto es un mairnfero, incluidos no primates (por ejemplo, camellos, burros, cebras, vacas, caballos, gatos, perros, ratas y ratones) y primates (por ejemplo, monos, chimpances y humanos). En algunos modos de realizacion, el sujeto es un mairnfero no humano. En otros modos de realizacion, el sujeto es un humano. En determinados modos de realizacion, el sujeto es un infante humano, nino pequeno, adolescente, mujer o mujer embarazada.

[0039] El termino, "respuesta inmunitaria terapeutica", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un incremento en la inmunidad humoral y/o celular, como se mide con tecnicas estandar, que se dirige hacia el glicoconjugado. Preferiblemente, pero sin caracter limitativo, el nivel inducido de inmunidad humoral dirigido hacia el glicoconjugado es al menos cuatro veces, ocho veces o diez veces, preferiblemente al menos dieciseis veces mayor que los niveles de la inmunidad humoral dirigida hacia el glicoconjugado antes de la administracion de las composiciones de la presente invencion al sujeto. La respuesta inmunitaria tambien puede medirse cualitativamente, por medio de un ensayo in vitro o in vivo adecuado, donde un paro en el avance o una remision de una enfermedad infecciosa o los smtomas de la misma en el sujeto se considera que indica la induccion de una respuesta inmunitaria terapeutica.

[0040] Como se utilizan en el presente documento, los terminos "terapias" y "terapia" pueden referirse a cualquier protocolo o protocolos, metodo o metodos y/o agente o agentes que pueden utilizarse en la prevencion, tratamiento, control o mejora de una enfermedad/trastorno (por ejemplo, infeccion bacteriana o una afeccion o smtoma asociado con la misma). En determinados modos de realizacion, los terminos "terapias" y "terapia" se refieren a terapia biologica, terapia de apoyo, y/u otras terapias utiles en el tratamiento, control, prevencion o mejora de una enfermedad o afeccion o smtoma(s) asociados con la misma, una infeccion o una afeccion o smtoma asociado con la misma, que conozca un experto en la materia.

[0041] Como se utilizan en el presente documento, los terminos "agente terapeutico" y "agentes terapeuticos" se refieren a cualquier agente o agentes que pueden utilizarse en la prevencion, tratamiento, control o mejora de una enfermedad (por ejemplo, infeccion bacteriana o una afeccion o smtoma asociado con la misma). Preferiblemente, un agente terapeutico es un agente que se conoce por ser util para, o ha sido utilizado o se utiliza actualmente para la prevencion, tratamiento, control o mejora de una enfermedad o smtoma asociado con la misma (por ejemplo, una infeccion bacteriana o una afeccion o smtoma asociado con la misma).

[0042] Como se utilizan en el presente documento, los terminos "tratar", "tratamiento" y “que trata” en el contexto de la administracion de una terapia a un sujeto para una enfermedad se refiere a la erradicacion, reduccion o mejora de los smtomas de dicha enfermedad/trastorno (por ejemplo, trastorno bacteriano).

4. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

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La figura 1 muestra un flujograma esquematico de un metodo general de sintetizacion de un glicoconjugado N-acilado, donde n=numero de unidades repetitivas, que vana en funcion del tipo de oligo/polisacarido y puede ser 1 hasta 1000 o mas.

La figura 2 muestra un flujograma esquematico de un metodo general de conjugacion polisacarido- protema, por ejemplo, la preparacion del conjugado polisacarido-protema de Streptococcus del grupo A a traves de N-Pentenoilacion. n=numero de unidades repetitivas, que depende de la naturaleza del polisacarido u oligosacarido y puede ser 1 hasta 1000 o mas.

La figura 3 representa el espectro de 600 MHz de 1H-RMN del polisacarido de Streptococcus del grupo A nativo y modificado.

La figura 4 muestra un flujograma esquematico de un metodo general de conjugacion polisacarido- protema, por ejemplo, la preparacion de conjugados polisacarido-protema de meningococo B a traves de N- pentenoilacion, donde n=numero de unidades repetitivas.

La figura 5 representa el espectro de 600 MHz de 1H-RMN del polisacarido meningococico B modificado.

La figura 6 muestra la respuesta inmunitaria contra polisacaridos generados por vacunacion con conjugados toxoide tetanico-polisacarido de Streptococcus del grupo A (GASP-TT, por sus siglas en ingles) en ratones Balb/c. Leyendas: Preinmune: Concentracion de suero IgG contra el polisacarido de Streptococcus del grupo A antes de la inmunizacion con conjugados. GASP-TT: Concentracion de suero IgG contra el polisacarido de Streptococcus del grupo A tras la inmunizacion con conjugado polisacarido- protema de Streptococcus del grupo A, preparado mediante el metodo tradicional (reduccion del polisacarido nativo y generacion de solamente un sitio activo por molecula de polisacarido mediante oxidacion moderada con Na-metaperyodato). N-But-GASP-TT(I): Concentracion de suero IgG contra el polisacarido de Streptococcus del grupo A tras la inmunizacion con conjugados polisacarido-protema de Streptococcus del grupo A, preparados mediante el metodo nuevo (generacion de multiples sitios activos por molecula de polisacarido mediante N-pentenoilacion y oxidacion del polisacarido nativo). Aproximadamente 5-10 % de los residuos de GlcNAc se pentenoilaron. N-But-GASP-TT(2): Concentracion de suero IgG contra el polisacarido de Streptococcus del grupo A tras la inmunizacion con conjugados polisacarido-protema de Streptococcus del grupo A, preparados mediante el metodo nuevo (generacion de multiples sitios activos por molecula de polisacarido mediante N-pentenoilacion y oxidacion del polisacarido nativo). Aproximadamente 15-20 % de los residuos de GlcNAc se pentenoilaron.

5. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0044] La presente invencion da a conocer, en general, metodos de elaboracion de (i) oligosacaridos o polisacaridos microbianos no saturados derivados de N-acilo; (ii) conjugados inmunogenicos novedosos derivados de los oligosacaridos o polisacaridos no saturados derivados de N-acilo enlazados de forma covalente a una protema portadora; y (iii) composiciones de glicoconjugados inmunogenicas que comprenden moleculas de la invencion y un portador farmaceuticamente aceptable. La exposicion tambien abarca metodos de utilizacion de estas composiciones como vacunas. Como se expone en el presente documento, la invencion proporciona metodos que pueden facilitar la generacion de multiples sitios activos por oligosacarido o polisacarido, en concreto para la conjugacion con una o mas protemas, por ejemplo, protemas portadoras. La invencion tambien proporciona metodos de formacion de oligosacaridos o polisacaridos con multiples sitios activados que, cuando se conjugan con una o mas protemas portadoras adecuadas, generan vacunas glicoconjugadas reticuladas con eficacia mejorada en comparacion con los metodos de elaboracion anteriormente conocidos en la tecnica. En determinados modos de realizacion, los metodos de la presente invencion tambien generan vacunas glicoconjugadas que muestran inmunogenicidad mejorada en comparacion con vacunas similares conocidas en la tecnica. El metodo que se presenta en el presente documento tambien puede aplicarse a cualquier polisacarido que contenga al menos un aminoazucar, una clara ventaja sobre los metodos de oxidacion con peryodato existentes, que requieren dos grupos adyacentes libres de hidroxi en la cadena de azucar.

[0045] Los oligosacaridos o polisacaridos que contienen al menos un aminoazucar que tiene un grupo N-acetilo (por ejemplo, pero sin caracter limitativo, los que comprenden uno o mas de GlcNAc, ManNAc, GalNAc y/o acido sialico) se tratan para desacetilar el uno o mas grupos N-acetilo para generar en el oligosacarido o polisacarido al menos un aminoazucar y preferiblemente multiples aminoazucares que contengan un grupo amino primario. El al menos uno o varios grupos amino primarios, a continuacion, se sustituye por una fraccion N-acilo para generar al menos un sitio activo y preferiblemente multiples sitios activos por molecula de polisacarido u oligosacarido. Para

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permitir la oxidacion consiguiente, la N-acilacion se lleva a cabo utilizando al menos una cadena alifatica no saturada de 5 carbonos (por ejemplo, pentenoilacion). La utilization de cadenas alifaticas no saturadas de mas de 5 carbonos de longitud tambien se abarcan en la invention (p. ej., una cadena alifatica no saturada de 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12, 13- o 14- o mas carbonos), siempre que el sitio de no saturation no este entre los carbonos 1 y 2 o entre los carbonos 2 y 3 de dicha fraction (Vease la figura 1 o, segun la Formula I, entre el carbono del grupo aldehido y Ci de Ri o entre Ci y C2 de Ri. Puesto que la oxidacion puede escindir la cadena de polisacarido u oligosacarido, los metodos de oxidacion abarcados por la invencion se seleccionan (como se describe en el presente documento y/o como se conoce en la tecnica) para oxidar solamente el sitio o los sitios de no saturacion de la cadena alifatica no saturada. Dichas condiciones de oxidacion se denominan normalmente "moderadas" en la tecnica y pueden determinarse mediante experimentation rutinaria. Por lo tanto, los metodos de la invencion abarcan la utilizacion de un agente oxidante que oxida grupos no saturados (por ejemplo, la utilizacion de O3 [para ozonolisis] o H2O2, en condiciones moderadas (por ejemplo, en un intervalo de temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 27 °C y un intervalo de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.5 en una solution considerablemente tamponada) para generar un grupo aldehido activo (CHO) en el sitio o los sitios de no saturacion de dicha fraccion alquilo. En determinados modos de realization, el sitio de no saturacion de la fraccion alquilo esta entre los dos carbonos terminales de la cadena principal de alquilo. La oxidacion del doble enlace escinde la cadena de alquilo principal en el sitio de no saturacion y genera un grupo aldetido activo en el nuevo terminal de la cadena de alquilo. Por ejemplo, en modos de realizacion donde la cadena alifatica no saturada es una C5 con un doble enlace unico entre los carbonos C4 y C5, la oxidacion dara lugar a la cadena de 4 carbonos con el aldehido en C4. En modos de realizacion donde la cadena alifatica no saturada tiene mas de un doble enlace, esto es, sitios de no saturacion, la reaction de oxidacion puede afectar a uno o ambos sitios de no saturacion; sin embargo, puesto que la reaccion escinde la cadena principal de carbono, el grupo aldehido siempre estara en el terminal de cadena alifatica recien formado. En consecuencia, donde la cadena principal que comprende el grupo no saturado tenga mas de un sitio de no saturacion, la reaccion de oxidacion puede dar lugar a N-acilo saturado o no saturado de distintas longitudes (en funcion de si uno o todos los sitios no saturados se oxidaron, respectivamente, y de la ubicacion de los dobles enlaces) comprendiendo, sin embargo, cada fraccion un grupo aldehido activo en el terminal de la cadena principal alifatica.

[0046] El polisacarido u oligosacarido de la invencion se conjuga con una protema portadora mediante cualquier metodo descrito en el presente documento y/o conocido en la tecnica (p. ej., aminacion reductiva) para generar un glicoconjugado inmunogenico. Un flujograma esquematico de un metodo general se muestra en la figura 1.

[0047] La exposition se refiere a oligosacaridos o polisacaridos microbianos no saturados derivados de N-acilo de la Formula I:

-----\-----azucar------------

^ ^

NH

°=<

Ri

donde R1 es una fraccion alquilo no saturada C3 C4, C5, C6, C7, Cs, C9, C10, o C11 que comprende al menos un carbono no saturado y el [azucar] representa el dicho uno o mas aminoazucares del polisacarido u oligosacarido. En determinados modos de realizacion, dicho uno o mas aminoazucares es un componente de la unidad repetitiva del polisacarido u oligosacarido. En otros modos de realizacion, el dicho uno o mas aminoazucares no es un componente de la unidad repetitiva del polisacarido u oligosacarido. Si bien la invencion abarca R1 que comprende multiples carbonos no saturados (esto es, multiples dobles enlaces), segun los metodos proporcionados en el presente documento, R1 solo necesita tener un unico carbono no saturado (esto es, un unico doble enlace; dicho doble enlace no se encuentra entre C1 y C2 de R1). En un determinado modo de realizacion de la exposicion, R1 de la Formula I es una fraccion alquilo no saturada C3, C4, C5, C6, C7, Cs, C9, C10 o C11, que comprende un unico doble enlace. En un modo de realizacion adicional de la invencion, R1 de la Formula I es una fraccion alquilo no saturada C3, C4, C5, C6, C7, Cs, C9, C10 o C11, y la position del doble enlace se situa entre los dos carbonos terminales de la cadena alifatica.

[0048] En modos de realizacion espetificos, la fraccion N-acilo no saturada se oxida a un grupo aldehido (en el terminal de la cadena principal de la fraccion alquilo) para servir como enlace en la conjugation de un compuesto con la protema portadora. El grupo aldehido en la fraccion N-acilo puede, a continuation, enlazarse con la protema portadora mediante cualquier metodo de conjugacion conocido en la tecnica y/o descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante aminacion reductiva.

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[0049] En todavia otro modo de realization adicional, el grupo amino (=NH) esta enlazado a un residuo de azucar del oligosacarido o polisacarido en cualquier position, incluidas 1,2, 3, 4 o 5 del azucar. Las estructuras de aminoazucares se conocen en la tecnica y, por lo tanto, la posicion de dicho enlace puede determinarse de forma rutinaria. Por ejemplo, donde el aminoazucar es GlcNac, el grupo N-acetilo del azucar esta en el carbono 2; donde el aminoazucar es acido sialico, el grupo N-acetilo del azucar esta en el carbono 4.

[0050] Un ejemplo no limitativo de los polisacaridos modificados, por ejemplo, polisacaridos derivados de N-acilo de la Formula I utiles en la presente invention es el polisacarido derivado N-pentenoilado, que contiene al menos un grupo N-pentenoilo (CH2=CH-CH2-CH2-CONH-), como se muestra en la Formula III a continuation:

O.

;Azucar-

[

^NH

C

ch2

H,C

H2C

i

^ch

donde el grupo N-pentenoilo sirve como enlace a la protema conjugada.

[0051] Se puede emplear cualquier modo de conjugation para conjugar el oligosacarido o polisacarido modificado con la protema portadora. Un metodo de ejemplo, que se basa en la presencia de grupos hidroxilo vecinales terminales para formar un grupo aldehido activo, se describe en la patente estadounidense con n.° 4,356,170 ("la patente '170). La patente '170 describe la introduction de un grupo aldehido terminal en polisacarido y el acoplamiento de los grupos aldehidos a los grupos amino de protema mediante aminacion reductiva. El polisacarido y la protema se enlazan de esta manera a traves del grupo, como se muestra a continuacion (en el cuadrado) en la Formula II:

imagen3

Proteina

donde R2 es una fraction alquilo saturada C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, o C10, y donde el NH fuera del cuadrado

(en el cuadrado) pertenece al uno de los grupos NH2 primarios de la protema (por ejemplo, residuos de lisinila o residuos de arginila). El [azucar] de la Formula II representa el dicho uno o mas aminoazucares del polisacarido u oligosacarido. En determinados modos de realizacion, dicho uno o mas aminoazucares es un componente de la unidad repetitiva del polisacarido u oligosacarido. En otros modos de realizacion, el dicho uno o mas aminoazucares no es un componente de la unidad repetitiva del polisacarido u oligosacarido.

[0052] Los conjugados protema-polisacarido N-acilados resultantes de la invencion se han sometido a ensayo en in vivo en ratones, y en general han mostrado poseer propiedades inmunogenicas mejoradas en comparacion con el polisacarido N-propionilado conocido en la tecnica anterior (p. ej., los descritos en la patente estadounidense con n.° 5,902,586). En consecuencia, se espera que las vacunas de la invencion sean utiles contra la meningitis provocada por N. meningitidis grupo B o por los organismos E. coli K1. Son de especial interes las vacunas para la protection de sujetos que presentan un riesgo mayor de contraer infecciones bacterianas (p. ej., meningitis bacteriana), por ejemplo, individuos que presentan deficiencias inmunitarias e infantes.

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[0053] En modos de realizacion espedficos no limitativos de la invencion, puede ser deseable incluir mas de una especie de oligosacarido o polisacarido y/o mas de una protema portadora con el fin de optimizar la respuesta inmunitaria. Dicho enfoque puede ser especialmente ventajoso en la prevencion o el tratamiento de las infecciones caracterizadas por el rapido desarrollo de mutaciones que den lugar a la evasion de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, las infecciones protozoarias. Ademas, un glicoconjugado inmunogenico de la invencion puede incluir mas de un dominio inmunogenico/antigenico y/o mas de un epftopo. Por ejemplo, la invencion abarca conjugados polivalentes donde al menos dos polisacaridos u oligosacaridos distintos que son espedficos para distintos antfgenos se conjugan con una unica molecula portadora y/o donde dos polisacaridos u oligosacaridos distintos que son espedficos para distintos antfgenos se combinan en una unica molecula de polisacarido u oligosacarido conjugada con una protema portadora. La invencion tambien abarca conjugados que comprenden una pluralidad de polisacaridos u oligosacaridos y una pluralidad de protemas portadoras. Puesto que los metodos de la invencion generan al menos un sitio activo y preferiblemente multiples sitios activos por molecula de polisacarido u oligosacarido, el polisacarido u oligosacarido puede estar enlazado de forma covalente a la protema portadora en uno o mas sitios; ademas, el polisacarido u oligosacarido pueden estar enlazados a una o mas protemas portadoras. En consecuencia, en determinados modos de realizacion, el conjugado es una red de moleculas de polisacarido y de protemas portadoras.

[0054] El polisacarido u oligosacarido para su utilizacion en las composiciones de glicoconjugados de la invencion pueden variar en tamano. Como se define en el presente documento, un oligosacarido para su utilizacion en la presente invencion comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 unidades repetitivas (por ejemplo, residuos de azucar) y preferiblemente desde 10 hasta aproximadamente 50 unidades repetitivas. Un polisacarido, como se define en el presente documento, es mayor que 50 unidades repetitivas y puede ser tan grande como aproximadamente 600 hasta aproximadamente 2000 unidades repetitivas o mayor. En algunos casos, se desean constructos grandes para la mejora de la inmunogenicidad. Los metodos de la presente invencion proporcionan la utilizacion de polisacaridos muy grandes puesto que pueden introducirse muchos sitios reactivos en un unico polisacarido.

5.1 Polisacaridos y aislamiento de los mismos

[0055] Polisacaridos adecuados para su utilizacion en los modos de realizacion preferidos incluyen polisacaridos y oligosacaridos de bacterias encapsuladas. Los polisacaridos y oligosacaridos pueden ser de cualquier fuente, por ejemplo, pueden derivarse de bacterias de origen natural, bacterias creadas geneticamente o pueden producirse sinteticamente. Los polisacaridos y oligosacaridos pueden someterse a una o mas etapas de procesamiento antes de la activacion, por ejemplo, purificacion, funcionalizacion, despolimerizacion mediante la utilizacion de condiciones moderadas de oxidacion, desacetilacion y similares. Tambien pueden emplearse etapas de posprocesamiento, si se desea. Puede emplearse cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica para sintetizar, preparar y/o purificar polisacaridos y oligosacaridos adecuados.

[0056] Los polisacaridos y oligosacaridos para su utilizacion segun los metodos de la invencion incluyen, pero sin caracter limitativo, polisacaridos neumococicos de, por ejemplo, Serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9n, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33f; polisacaridos meningococicos de Serotipos A, B, C, W135 e Y, polisacarido de Haemophilus influenzae tipo b (fosfato de poliribosilribitol), polisacaridos estreptococicos Grupo B de Serotipos III y V y polisacarido Vi de Salmonella Typhi. Otros polisacaridos de serotipos neumococicos y estreptococicos Grupo B, y serogrupos meningococicos tambien son adecuados para su utilizacion en el presente documento, como son otros antfgenos polisacaridos y oligosacaridos T- independientes normalmente, por ejemplo, los polisacaridos u oligosacaridos derivados de streptococcus del grupo A, estafilococos, enterococos, Klebsiella pneumoniae, E.coli, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus anthracis. Si bien se prefieren especialmente los polisacaridos y oligosacaridos bacterianos, tambien pueden emplearse lipopolisacaridos y lipooligosacaridos bacterianos (gramnegativos) y sus derivados polisacaridos y oligosacaridos, asf como polisacaridos y oligosacaridos virales.

[0057] Los polisacaridos se afslan de capsulas bacterianas mediante metodos que se conocen en la tecnica. Por ejemplo, en uno de estos metodos, bacterias tales como meningococicas grupo B (cepa 981B) se cultivan a 37 °C en un fermentador utilizando 30 g de caldo Todd Hewitt (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) deshidratado por litro de agua destilada. Antes del crecimiento en fermentador, la cepa liofilizada se cultiva inicialmente en una palmatoria a 37 °C en placas de agar sangre de oveja 5 % (v/v) (Difco Laboratories, Detroit, Mich.). A continuacion, se transfieren las bacterias a 1,0 litro de caldo Todd Hewitt (como anteriormente) en un matraz Erlenmeyer que se agita a 37 °C durante 7 horas a 190 rpm. A continuacion, se transfiere el inoculo al fermentador. Tras el crecimiento en fermentador (16 horas) se matan las bacterias mediante la adicion de formalina a la concentracion final de 0,75 %. Se eliminan las bacterias mediante centrifugacion continua y se afsla el polisacarido del sobrenadante y se purifica esencialmente, como describe Bundle et al, J. Biol. Chem., 249, 4797-4801 (1974) excepto que la protema se extrae mediante la agitacion de una solucion del polisacarido crudo con fenol frio (4 °C) 90 % en lugar de caliente (50-60 °C). El ultimo proceso asegura que se produce una

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forma de alto peso molecular del polisacarido, por ejemplo, una forma de alto peso molecular de polisacarido meningococico grupo B (GBMP, por sus siglas en ingles).

[0058] En otros modo de realizacion espedficos, los polisacaridos u oligosacaridos pueden aislarse de bacterias, por ejemplo, E. coli (018:K1:H7) (NRCC 4283), mediante cultivo a 37 °C en un fermentador que contiene infusion cerebro-corazon (BHI, por sus siglas en ingles) (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) en una concentracion de 37 g/litro en agua destilada. Los cultivos de trabajo pueden iniciarse a partir de soluciones madre liofilizadas mediante la reconstitucion de soluciones madre y cultivo inicial en 50 ml de solucion BHI (supra) en una matraz Erlenmeyer que se agita a 37 °C durante 7 horas a 200 rpm. A continuacion, se transfiere el cultivo a 1,5 litros de BHI (como anteriormente) y se cultiva en las mismas condiciones que se describen anteriormente durante 7 horas. A continuacion, se transfiere el inoculo al fermentador. El aislamiento y la purificacion del polisacarido capsular de bacterias cultivado en las mismas condiciones, por ejemplo, E. coli K1, se puede llevar a cabo con cualquier metodo conocido en la tecnica y/o descrito en el presente documento.

[0059] Se observara que los procedimientos de aislamiento y purificacion descritos anteriormente no son los unicos que pueden utilizarse, y que otros procedimientos publicados estan disponibles, por ejemplo los descritos por Watson et al, J. Immunol., 81, 331 (1958) y en la patente estadounidense citada anteriormente con n.° 4,727,136.

5.2 Sustitucion de grupos N-acetilo en oligosacaridos o polisacaridos:

[0060] Los grupos N-acetilo en oligosacaridos o polisacaridos nativos pueden sustituirse para proporcionar un grupo amino reactivo en las partes de residuo de acido sialico de la molecula. La sustitucion puede llevarse a cabo mediante cualquier metodo conocido, por ejemplo, mediante un alcali, por ejemplo, en un medio acuoso basico a elevadas temperaturas, por ejemplo, aproximadamente 90 °C hasta 110 °C, y a un pH de aproximadamente 13 hasta 14. En determinados modos de realizacion, la sustitucion abarca la desacetilacion del grupo N-acetilo para formar un grupo amino primario. El medio acuoso basico puede comprender una solucion de hidroxido de metal alcalino acuosa, por ejemplo, hidroxido de sodio de aproximadamente concentracion 2M. De forma alternativa, puede utilizarse hidracina en solucion acuosa. Ejemplos no limitativos de bases que pueden utilizarse segun la presente invencion son NaOH, KOH, LiOH, NaHCO3, Na2CO3, K2CO3, KCN, Et3N, NH3, H2N2H2, NaH, NaOMe, NaOEt o KOtBu. Bases tales como NaOH, KOH, LiOH, NaH, NaOMe o KOtBu se utilizan de forma mas eficaz en un rango de 0,5 N-5,0 N. Bases tales como NaHCO3, Na2CO3, K2CO3 y KCN pueden utilizarse en concentraciones tan altas como permitan sus solubilidades. Bases tales como NH3 o H2N2H2 pueden utilizarse en casi cualquier concentracion incluyendo 100 %. Pueden utilizarse disolventes tales como agua, alcoholes (preferiblemente C1-C4), dimetilsulfoxido, dimetilformamida o mezclas de estos y otros disolventes organicos. Las soluciones de base que comprenden agua son las mas preferibles.

[0061] En modos de realizacion espedficos, el intervalo de pH preferido para la sustitucion de los grupos N-

acetilo del polisacarido u oligosacarido es desde aproximadamente 9 hasta aproximadamente 14 siendo el pH optimo alrededor de 12. Despues de eso, el polisacarido N-sustituido se purifica a partir de reactivos residuales mediante ultrapurificacion utilizando membranas o dialisis con metodos estandar conocidos en la tecnica. El grado de sustitucion de grupo N-acetilo puede variar desde una sustitucion de al menos un grupo N-acetilo hasta e incluyendo una sustitucion de 100 % de los grupos N-acetilo del oligosacarido o polisacarido. En determinados modos de realizacion, el grado de sustitucion de grupo N-acetilo es aproximadamente 2 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %,

aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %,

aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %,

aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %,

aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 100 %. Preferiblemente, se sustituye 90 hasta 99 % de los grupos N-acetilo nativos. Los oligosacaridos o polisacaridos sustituidos se recuperan, por ejemplo, mediante enfriamiento, neutralizacion, purificacion y liofilizacion. El analisis del alcance de la sustitucion N-acetilo y la purificacion de producto sustituido puede llevarse a cabo mediante cualquier metodo conocido en la tecnica y/o descrito en el presente documento. Por ejemplo, los oligosacaridos y/o polisacaridos pueden dializarse contra agua desionizada con una membrana Spectra/Por® Membrane MWCO:3.500 para la purificacion/recuperacion. El alcance de N-desacetilacion puede analizarse mediante 1H-RMN a 500 MHz con metodos conocidos en la tecnica.

[0062] Antes del procedimiento de sustitucion de grupo N-acetilo, los oligosacaridos o polisacaridos nativos tienen un amplio rango de pesos moleculares promedios, por ejemplo, en el campo de aproximadamente 1000 hasta aproximadamente 1 000 000 daltones; dicho peso molecular promedio es sustancialmente reducido por la reaccion de sustitucion de grupo N-acetilo. Por ejemplo, el polisacarido meningococico grupo B (GBMP, por sus siglas en ingles) tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500 000 hasta aproximadamente 800 000 daltones; despues de la sustitucion de grupo N-acetilo segun metodos de la invencion, se producen

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normalmente fragmentos del polisacarido N-acetil-sustituido que tienen un peso molecular promedio que vana desde aproximadamente 3000 hasta aproximadamente 50 000 daltones. La longitud completa o los fragmentos de polisacaridos son de utilidad segun los metodos de la invencion. Por ejemplo, la longitud completa de los polisacaridos u oligosacaridos puede fragmentarse para producir tamanos mas adecuados para su utilizacion en vacunas conjugadas. Por ejemplo, se emplea material N-acilado de peso molecular promedio de 10 000 hasta 40 000 daltones, preferiblemente, aproximadamente 10 000 hasta aproximadamente 15 000 daltones. Pueden obtenerse fragmentos de tamano deseado mediante cualquier metodo conocido en la tecnica incluyendo, por ejemplo, metodos de centrifugacion o de filtracion. En determinados modos de realizacion, pueden obtenerse fracciones de tamanos concretos o separacion de un intervalo de peso molecular deseado mediante la utilizacion de una columna de fraccionamiento, por ejemplo, mediante la recopilacion de fracciones del eluato de una columna de separacion por tamanos (p. ej., un tamiz molecular) en el que se ha introducido el material inicial, por ejemplo, material GBMP N-acilado. En determinados modos de realizacion, se recopila material N-acilado de peso molecular promedio superior, por ejemplo en el campo de 30 000 hasta 40 000 daltones, para su utilizacion en los metodos de la invencion.

[0063] A continuacion, los fragmentos de polisacarido sustituidos por grupo N-acetilo o los polisacaridos de longitud completa se N-acilan para producir el producto N-acilado correspondiente. La N-acilacion puede llevarse a cabo mediante la disolucion de los polisacaridos sustituidos por grupo N-acetilo en un medio tamponado acuoso en condiciones basicas moderadas. Preferiblemente, dichas soluciones acuosas tamponadas moderadas tienen un pH de aproximadamente 7.5 hasta 9.0. A continuacion, se anade el reactivo de acilo al sacarido que contiene solucion y se enfna a menos de 10 °C hasta que se complete la reaccion. El reactivo de acilo se selecciona en base al grupo alquilo deseado al finalizarse la conjugacion, por ejemplo, el R2 deseado en la Formula II. El sitio de no saturacion del reactivo de acilo se oxidara a un aldehfdo activo y, por consiguiente, determinara la longitud de R2. Por ejemplo, el reactivo de acilo puede ser un anhfdrido de acilo no saturado (por ejemplo, anhfdrido de acetilo o anhfdrido de propionilo) o un haluro de acilo no saturado (por ejemplo, cloruro de pentenoilo). La reaccion se mezcla de forma opcional con un alcohol para incrementar la solubilidad. Si se desea, el medio de reaccion puede purificarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Un ejemplo no limitativo de un metodo de purificacion que puede utilizarse es dialisis seguida de recuperacion del producto N- acilado mediante liofilizacion. La reaccion esta sustancialmente completa en aproximadamente 10 a 20 horas. A continuacion, el grado de N-acilacion de los grupos N-acetilo se determina mediante metodos analfticos conocidos en la tecnica, por ejemplo, 1H-RMN a alta resolucion, por ejemplo, 500 MHz, y es preferiblemente al menos 90 % y mas preferiblemente aproximadamente 100 %. La reaccion de N-acilacion no da lugar a ninguna reduccion considerable del peso molecular de los fragmentos.

5.3 Protemas portadoras

[0064] La protema o las protemas con las que se conjuga el polisacarido se eligen de modo que conviertan de manera adecuada una respuesta inmunitaria independiente de celulas T al componente sacarido de la vacuna en una que sea dependiente de celulas T. En determinados modos de realizacion de la invencion, la protema portadora puede ser toxina nativa o una toxina desintoxicada (esto es, toxoide). Ademas, pueden utilizarse tambien formas mutacionales no toxicas de toxinas proteicas. Preferiblemente, dichas mutaciones retienen epftopos de la toxina nativa. Dichas toxinas mutantes se han denominado "protemas interreactivas" o CRM (por sus siglas en ingles). CRM197 tiene un unico cambio de aminoacido de la toxina difterica activa y es inmunologicamente indistinguible de la toxina activa. CRM197 se ha utilizado ampliamente en infantes como un componente de una vacuna conjugada de Haemophilus influenzae.

[0065] El polisacarido u oligosacarido activado se acopla a una protema para producir una vacuna conjugada. Protemas adecuadas incluyen toxinas bacterianas que son portadores inmunologicamente eficaces que son seguras gracias a medios qmmicos o geneticos para la administracion a un sujeto. Ejemplos incluyen toxinas bacterianas inactivadas tales como toxoide difterico, CRM.sub.197, toxoide tetanico, toxoide pertussis, E.coli LT, E.coli ST y exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Tambien pueden utilizarse protemas bacterianas de la membrana exterior tales como complejo c de la membrana exterior (OMPC, por sus siglas en ingles), porinos, protemas de union a transferrina, neumolisis, protema de superficie neumococica A (PspA, por sus siglas en ingles), protema de adhesina neumococica (PsaA, por sus siglas en ingles) o protemas de superficie neumococica BVH-3 y BVH-11. Otras protemas, tales como antfgeno protector (PA, por sus siglas en ingles) de Bacillus anthracis, ovoalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH, por sus siglas en ingles), seroalbumina humana, seroalbumina bovina (BSA, por sus siglas en ingles) y derivado de protema purificada de tuberculina (PPD, por sus siglas en ingles) pueden utilizarse tambien. Las protemas son preferiblemente protemas que son no toxicas y no reactogenicas y se pueden obtener en cantidad y pureza suficiente que son susceptibles para los metodos de conjugacion de los modos de realizacion preferidos. Por ejemplo, la toxina difterica puede purificarse a partir de cultivos de Corynebacteria diphtheriae y desintoxicarse qmmicamente mediante la utilizacion de formaldefudo para producir una protema adecuada.

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[0066] Ejemplos no limitativos de protemas portadoras incluyen toxina/toxoide tetanica/o, CRM197, Ca, protema Cp (por ejemplo, de Streptococcus del grupo B, incluyendo protema C-p de no union a IgA), toxoide difterico, hemolisina alfa o leucocidina de Panton-Valentine (pVl, por sus siglas en ingles), protemas de la membrana exterior de bacterias gramnegativas, por ejemplo, protemas de la membrana exterior de Neisseria meningitidis, protemas de alto peso molecular, P6 y P4 de Haemophilus influenzae no tipificable, CD y USPA de Moraxella catarrhalis, toxina/toxoide difterica/o, toxina/toxoide A de Pseudomonas aeruginosa destoxificada/o, toxina/toxoide del colera, toxina/toxoide pertussis, exotoxinas/toxoide de Clostridium perfringens, antigeno de superficie de la hepatitis B, antfgeno central de la hepatitis B, protema de rotavirus VP7, protemas F y G del virus respiratorio sincitial, subunidad B de la toxina del colera, neumolisoide, toxoide pertussis, protema sintetica que contiene residuos de lisina o cistema y similares. La protema portadora puede ser una protema nativa, una protema qmmicamente modificada, una protema desintoxicada o una protema recombinante. Con respecto al componente de protema, las moleculas conjugadas preparadas segun la presente invencion pueden ser monomericas, dimericas, trimericas y moleculas con mayor reticulacion.

[0067] La presente invencion da a conocer la capacidad de producir moleculas conjugadas donde una protema portadora se enlace a un N-acetilo que contiene polisacarido u oligosacarido. El tamano del polisacarido u oligosacarido puede variar en gran medida. Uno o una multiplicidad de polisacaridos u oligosacaridos puede reticularse con una o una multiplicidad de protemas. Los conjugados de la presente invencion son preferiblemente estructuras reticulares.

5.4 El conjugado

[0068] En la tecnica se conocen muchos metodos para conjugar un polisacarido activado, esto es, que comprende al menos una fraccion, deben ser capaces de enlazarse de forma covalente a una protema y son adecuados para su utilizacion en el presente documento. Por ejemplo, la patente estadounidense. con n.° 4,356,170, concedida a Jennings, describe la conjugacion de un polisacarido que comprende un grupo aldetudo activo con una protema portadora mediante aminacion reductiva utilizando cianoborohidruro.

[0069] Los metodos de la invencion permiten la generacion de al menos un sitio activo y preferiblemente multiples sitios activos (esto es, grupos aldehfdos activos) por molecula de polisacarido u oligosacarido. Una molecula de polisacarido activada puede reaccionar con una o mas protemas portadoras y formar mas de un enlace a una o varias de las mismas. Por consiguiente, en determinados modos de realizacion, el producto conjugado puede ser una mezcla de diversas estructuras reticulares o de tipo matriz reticuladas.

[0070] Tras la conjugacion, el conjugado puede purificarse mediante cualquier metodo adecuado. La purificacion se emplea para eliminar polisacaridos, protemas o subproductos de reaccion de moleculas pequenas no reaccionados. Metodos de purificacion incluyen ultrafiltracion, cromatograffa de exclusion por tamanos, centrifugacion en gradiente de densidad, cromatograffa de interaccion hidrofobica, fraccionamiento con sulfato de amonio y similares, como se conocen en la tecnica. En determinados modos de realizacion, puede no necesitarse purificacion o puede ser deseable solamente un grado menor de purificacion. El conjugado puede concentrarse o diluirse o procesarse en cualquier forma adecuada para su utilizacion en composiciones farmaceuticas, como se desee.

5.5 COMPOSICIONES FARMACEUTICAS

[0071] Preferiblemente, una composicion (p. ej., composicion farmaceutica) incluye, al mezclarse, un excipiente, portador o diluyente farmaceuticamente aceptables y uno o mas de un agente bioactivo (p. ej., glicoconjugado, oligosacarido, polisacarido, polipeptido o peptido), como se describe en el presente documento, como ingrediente activo. La preparacion de las composiciones farmaceuticas que contienen agentes bioactivos como ingredientes activos se conoce bien en la tecnica. Normalmente, dichas composiciones se preparan como soluciones o suspensiones lfquidas, sin embargo, tambien pueden prepararse formas solidas para su solucion o suspension en lfquido antes de la administracion. La preparacion tambien puede emulsionarse. El ingrediente activo terapeutico, normalmente, se mezcla con excipientes que son farmaceuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo, por ejemplo, un potenciador de permeacion. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, salino, dextrosa, glicerina, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Portadores preferidos, excipientes y diluyentes de la invencion comprenden suero fisiologico (esto es, 0,9 % de NaCl). Ademas, si se desea, la composicion puede contener pequenas cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores de pH, que mejoran la efectividad del ingrediente activo.

[0072] Las composiciones de la invencion incluyen composiciones de farmaco a granel utiles en la elaboracion de composiciones farmaceuticas (p. ej., composiciones impuras o no esteriles) y composiciones farmaceuticas (esto es, composiciones que son adecuadas para su administracion a un sujeto o paciente) que pueden utilizarse

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en la preparacion de formas de dosis unitaria. Dichas composiciones comprenden una cantidad profilactica o terapeuticamente eficaz de un agente profilactico y/o terapeutico expuesto en el presente documento o una combinacion de estos agentes y un portador farmaceuticamente aceptable. En determinados modos de realizacion, las composiciones de la invencion comprenden una cantidad inmunogenica de al menos un glicoconjugado inmunogenico y, opcionalmente, un portador farmaceuticamente aceptable. En otros modos de realizacion, las composiciones de la invencion comprenden una cantidad profilactica o terapeuticamente eficaz de al menos un glicoconjugado inmunogenico y, opcionalmente, un portador farmaceuticamente aceptable.

[0073] En un modo de realizacion espedfico, el termino "farmaceuticamente aceptable" significa fisiologicamente compatible. Preferiblemente, farmaceuticamente aceptable significa aprobado por un organismo regulador del gobierno federal o de un estado o que este enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para la utilizacion en animales y, mas concretamente, en humanos. El termino "portador" se refiere a un diluyente, excipiente, potenciador de permeacion (como se describe en la tecnica anteriormente) o vetuculo con el que se administra la terapia. Dichos portadores farmaceuticos incluyen, pero sin caracter limitativo, ftquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petroftfero, animal, vegetal o sintetico, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. Excipientes farmaceuticos adecuados comunes incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sflice, estearato de sodio, monoestearato de glicerina, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerina, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composicion, si se desea, puede contener tambien pequenas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores de pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsion, comprimidos, pastillas, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares.

[0074] Las composiciones farmaceuticas de la invencion que comprenden glicoconjugados inmunogenicos, como se establece anteriormente, se denominan en el presente documento "vacunas". El termino vacuna se utiliza para indicar que las composiciones de la invencion pueden utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria profilactica o terapeutica. Una vacuna de la invencion puede comprender un glicoconjugado con un unico dominio o epftopo antigenico, o un glicoconjugado con una pluralidad de dominios o epftopos antigenicos. Asimismo, una vacuna puede comprender una mezcla de glicoconjugados con un unico dominio o epftopo antigenico o con pluralidades de dominios o epftopos antigenicos o con cualquier combinacion de los anteriores. Las composiciones farmaceuticas que comprenden vacunas conjugadas de la invencion pueden ofrecer diversas ventajas sobre las vacunas convencionales, incluyendo inmunogenicidad mejorada de antfgenos poco inmunogenicos (p. ej., polisacaridos u oligosacaridos bacterianos), reduccion potencial de la cantidad de antfgeno utilizado, inmunizaciones de recuerdo menos frecuentes, eficacia mejorada, estimulacion de inmunidad preferente o determinacion potencial de respuestas inmunitarias.

[0075] Una composicion de vacuna que comprende uno o mas glicoconjugados inmunogenicos segun la invencion puede administrarse por via cutanea, subcutanea, intradermal, intravenosa, intramuscular, parenteral, intrapulmonar, intravaginal, intrarrectal, nasal, oral o topica. La composicion de vacuna puede suministrarse mediante inyeccion, bombardeo de partfculas, oralmente o mediante aerosol.

[0076] Las composiciones de vacuna de acuerdo con la invencion tambien pueden incluir diversos materiales adicionales, tales como un portador farmaceuticamente aceptable. Portadores adecuados incluyen cualquier portador estandar farmaceuticamente aceptado, tales como solucion salina tampon fosfato, agua, emulsiones tales como una emulsion aceite/agua o una emulsion de trigliceridos, diversos tipos de agentes humectantes, comprimidos, comprimidos recubiertos y capsulas. Un ejemplo de una emulsion de trigliceridos aceptable util en la administracion intravenosa e intraperitoneal de los compuestos es la emulsion de trigliceridos conocida comercialmente como Intralipid.RTM. Normalmente, dichos portadores contienen excipientes tales como almidon, leche, agua, azucar, determinados tipos de arcilla, gelatina, acido estearico, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Dichos portadores pueden incluir tambien aditivos de sabor y color u otros ingredientes.

[0077] La composicion de vacuna de la invencion puede incluir tambien diluyentes adecuados, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes (p. ej., fosfato, hidroxido o sulfato de aluminio) y/o portadores. Dichas composiciones pueden estar en forma de formulaciones ftquidas o liofilizadas o desecadas de otro modo y pueden incluir diluyentes de diverso contenido de tampon (p. ej., acetato y fosfato Tris-HCl), pH y fuerza ionica, aditivos tales como albumina o gelatina para evitar absorcion a superficies, detergentes (p. ej., Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de acido biliar), agentes solubilizantes (p. ej., glicerina, glicerina de polietileno) antioxidantes (p. ej., acido ascorbico, metabisulfito de sodio), conservantes (p. ej.,Thimesoral, alcohol bendlico, parabenos), sustancias de carga o modificadores de tonicidad (p. ej., lactosa, manitol, sorbitol) union covalente de poftmeros tales como polietilenglicol a la protema, complejacion con iones metalicos o incorporacion del material en o sobre preparaciones particuladas de compuestos polimericos tales como acido polilactico, acido poliglicolico, hidrogeles, etc. o sobre liposomas, microemulsiones, micelas, vesfculas unilamelares o

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multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoplastos. Dichas composiciones influiran en el estado ffsico, solubilidad, estabilidad, tasa de liberacion in vivo y tasa de depuracion in vivo. La eleccion de composiciones dependera de las propiedades ffsicas y qmmicas de la vacuna. Por ejemplo, un producto derivado de una forma limitada por membrana de un polisacarido y/o protema portadora puede requerir una formulacion que contiene detergente. Composiciones controladas o de liberacion sostenida incluyen formulacion en depositos lipofflicos (p. ej., acidos grasos, ceras, aceites). Otros modos de realizacion de las composiciones de la invencion incorporan revestimientos de proteccion de formas particuladas, inhibidores de la proteasa o potenciadores de permeacion para diversas vfas de administracion incluidas intramuscular, parenteral, pulmonar, nasal y oral.

[0078] Las composiciones de la invencion pueden formularse como formas neutras o de sal. Sales farmaceuticamente aceptables incluyen, pero sin caracter limitativo, las formadas con aniones tales como los derivados de acidos clorfndricos, fosforicos, aceticos, oxalicos, tartaricos, etc. y las formadas con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidroxidos ferricos, isopropilamina, trietilamina, 2- etilaminoetanol, histidina, procama, etc.

[0079] Las composiciones de la invencion, por ejemplo, las vacunas, pueden comprender tambien uno o mas adyuvantes para mejorar la eficacia inmunogenica de la composicion. El adyuvante utilizado puede ser cualquier adyuvante conocido en la tecnica que sea adecuado para su utilizacion con vacunas basadas en polisacaridos (vease, p. ej., la patente estadounidense con n.°:5,773,007). Adyuvantes adecuados incluyen, pero sin caracter limitativo, formulaciones de emulsion de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes espedficos tales como muramil peptidos o componentes de pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo (a) MF59. TM. (WO 90/14837; Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), que contiene escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 % (que contiene opcionalmente MTP-PE) formulado en partfculas submicronicas utilizando un microfluidizador, (b) SAF, que contiene escualano al 10 % , Tween 80 al 0,4 %, polfmero L121 bloqueado por pluronico al 5 % y thr-MDP bien microfluidizado en una emulsion submicronica o bien agitado en vortex para generar una emulsion de tamano de partfcula mayor y (c) sistema adyuvante RIBI™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o mas componentes de pared celular bacteriana tales como monofosforil lfpido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL-CWS (Detox.TM.). Otros adyuvantes incluyen adyuvantes de saponina (tales como QS21 o Stimulon. TM. (Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.) o partfculas generadas a partir de los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes), ISCOM que pueden estar desprovistos de detergente adicional, por ejemplo el documento WO 00/07621); adyuvante completo de Freud (CFA) y adyuvante incompleto de Freud (IFA); citocinas (tales como interleucinas (p. ej., IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (documento WO99/44636), etc.), interferones (p. ej., interferon gamma), factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.); monofosforil lfpido A (MPL) o MPL 3-Odeacilado (3dMPL) (p. ej., los documentos GB-2220221, EP-A-0689454, opcionalmente en ausencia sustancial de alumbre cuando se utiliza con sacaridos neumococicos, por ejemplo, el documento WO 00/56358); combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (p. ej., los documentos EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231); oligonucleotidos que comprenden motivos CpG (Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622; Krieg Curr opin Mol Ther2001 3:15-24; Roman et al., Nat. Med, 1997, 3, 849-854; Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al, J. Immunol, 1998, 160, 810-876; Chu et al., J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al, Ear. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; Moldoveami e/ al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas et al, J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al, J. Immunol, 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al, Cell Immunol, 1996, 167, 72-78; Yamamoto et al, Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey et al, J. Immunol., 1996, 157,2116-2122; Messina et al, J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764; Yi et al, J. Immunol, 1996, 157,4918-4925; Yi et al, J. Immunol, 1996, 157, 5394-5402; Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761; y Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 5898-5906; las solicitudes de patente internacionales WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 y WO 98/52581] es decir, que contienen al menos un dinucleotido CG, donde la citosina no esta metilada); un eter de polioxietileno o ester de polioxietileno (p. ej., el documento WO 99/52549); un tensioactivo de ester de sorbitan polioxietilenado en combinacion con un octoxinol (el documento WO 01/21207) o un eter de alquilo de polioxietileno o tensioactivo de ester en combinacion con al menos un tensioactivo no ionico adicional tal como un octoxinol (el documento WO 01/21152); una saponina y un oligonucleotido inmunoestimulante (p. ej., un oligonucleotido CpG) (el documento WO 00/62800); un inmunoestimulante y una partfcula de sal metalica (p. ej., el documento WO 00/23105); una saponina y una emulsion de aceite en agua, por ejemplo, el documento WO 99/11241; una saponina (p. ej., QS21)+3dMPL+IM2 (opcionalmente+un esterol) por ejemplo, el documento WO 98/57659; y/u otras sustancias que actuan como agentes inmunoestimulantes para potenciar la eficacia de la composicion.

[0080] Las composiciones farmaceuticas pueden contener sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables, como se requiere para aproximarse a las condiciones fisiologicas tales como agentes ajustadores y tamponadores de pH, agentes ajustadores de toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de

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sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentracion de antigeno en estas formulaciones puede variar en gran medida (p. ej., desde menos de aproximadamente 0,1 %, normalmente o al menos aproximadamente 2 % hasta 20 % o 50 % o mas en peso) y se seleccionara fundamentalmente de acuerdo con los volumenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares segun el modo concreto de administracion seleccionado y las necesidades del paciente. Las composiciones resultantes pueden adoptar la forma de una solucion, suspension, comprimido, pastilla, capsula, polvo, gel, crema, locion, unguento o aerosol.

[0081] Los conjugados preparados de acuerdo con el modo de realizacion preferido se administran a un sujeto en una dosis inmunologicamente eficaz en una forma adecuada para tratar y/o prevenir enfermedades infecciosas. El termino "sujeto", como se utiliza en el presente documento, se refiere a animales, tales como mairnferos. Por ejemplo, los mairnferos contemplados incluyen humanos, primates, perros, gatos, ovejas, reses, cabras, cerdos, caballos, ratones, ratas, conejos, cobayas y similares. El termino "sujeto", "paciente" y "huesped" se utilizan de forma intercambiable. Como se utiliza en el presente documento, una dosis "inmunologicamente eficaz" de la vacuna conjugada es una dosis que es adecuada para provocar una respuesta inmunitaria. La dosificacion concreta depende de la edad, el peso y el estado medico del sujeto que se ha de tratar, asf como en el metodo de administracion. Los expertos en la materia pueden determinar facilmente las dosis adecuadas.

[0082] En la practica de protocolos de inmunizacion para el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades precisas, se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de conjugado a un sujeto. Como se utiliza en el presente documento, el termino "cantidad eficaz" significa la cantidad total de agente terapeutico (p. ej., conjugado) u otro componente activo que basta para mostrar un beneficio significativo en el sujeto, por ejemplo, respuesta inmunitaria, tratamiento, curacion, prevencion o mejora potenciados de la condicion medica pertinente (enfermedad, infeccion o similares) o un incremento del ritmo del tratamiento, prevencion o mejora de dichas condiciones. Cuando se aplica "cantidad eficaz" a un agente terapeutico individual administrado solo, el termino se refiere a ese agente terapeutico solamente. Cuando se aplica a una combinacion, el termino se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes que dan lugar al efecto terapeutico, ya sea mediante administracion en combinacion, en serie o simultaneamente. Como se utiliza en el presente documento, la frase "administracion de una cantidad eficaz" de un agente terapeutico significa que se trata al sujeto con dicho agente o agentes terapeuticos en una cantidad y durante un tiempo que bastan para inducir una mejora, y preferiblemente una mejora sostenida, en al menos un indicador que refleje la gravedad de la enfermedad, infeccion o trastorno.

[0083] Las vacunas conjugadas de la invencion pueden administrarse como dosis unica o en una serie que incluye una o mas de recuerdo. Por ejemplo, un infante o un nino puede recibir una dosis unica en una etapa temprana de la vida y, mas tarde, recibir la administracion de una dosis de recuerdo hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas anos despues. La dosis de recuerdo genera anticuerpos de celulas B cebadas, es decir, una respuesta anamnesica. La vacuna conjugada provoca una respuesta primaria elevada de anticuerpos funcionales en infantes o ninos, y es capaz de provocar una respuesta anamnesica tras una administracion de recuerdo, lo que muestra que la respuesta inmunitaria protectora provocada por la vacuna conjugada es duradera.

[0084] Las vacunas de la invencion pueden formularse en preparaciones lfquidas para la administracion, por ejemplo, por via oral, nasal, anal, rectal, bucal, vaginal, peroral, intragastrica, mucosa, perlingual, alveolar, gingival, olfatoria o por mucosa respiratoria. Formas adecuadas para dicha administracion incluyen suspensiones, jarabes y elixires. Las vacunas conjugadas tambien pueden formularse para la administracion parenteral, subcutanea, intradermal, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa, administracion inyectable, liberacion sostenida de implantes o administracion mediante colirio. Formas adecuadas para dicha administracion incluyen suspensiones y emulsiones esteriles. Dichas vacunas conjugadas pueden mezclarse con un portador, diluyente o excipiente adecuados tales como agua esteril, suero fisiologico, glucosa y similares. Las vacunas conjugadas tambien pueden liofilizarse. Las vacunas conjugadas pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes emulsionantes o humectantes, agentes tamponadores de pH, aditivos gelificantes o potenciadores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colores y similares, en funcion de la via de administracion y la preparacion deseadas. Pueden consultarse textos estandar, tales como "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition (Jun. 1, 2003) y "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Pub. Co.; 18.sup.th and 19.sup.th editions (diciembre 1985, y junio 1990, respectivamente), para preparar preparaciones adecuadas, sin experimentacion indebida. Dichas preparaciones pueden incluir agentes complejantes, iones metalicos, compuestos polimericos tales como acido poliacetico, acido poliglicolico, hidrogeles, dextrano y similares, liposomas, microemulsiones, micelas, vesfculas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoplastos. Lfpidos adecuados para la formulacion liposomal incluyen, pero sin caracter limitativo, monogliceridos, digliceridos, sulfatidos, lisolecitina, fosfolfpidos, saponina, acidos biliares y similares. La presencia de dichos componentes adicionales puede influir en el estado ffsico, solubilidad, estabilidad, tasa de liberacion in vivo, y tasa de depuracion in vivo y, por consiguiente, se seleccionan segun la aplicacion deseada, de manera que las caractensticas del portador se ajusten a la via de administracion seleccionada.

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[0085] Las composiciones farmaceuticas de la invencion son preferiblemente isotonicas con la sangre u otro fluido corporal del receptor. La isotonicidad de las composiciones puede obtenerse con la utilizacion de tartrato de sodio, propilenglicol u otros solutos organicos o inorganicos. Se prefiere especialmente el cloruro de sodio. Pueden emplearse agentes tampon, tales como acido acetico y sales, acido cftrico y sales, acido borico y sales, y acido fosforico y sales. Vehfculos parenterales incluyen solucion de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer y aceites fijos. Vehfculos intravenosos incluyen reforzadores de fluidos y nutrientes, reforzadores electrolito (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares.

[0086] Las composiciones farmaceuticas y/o vacunas de la invencion pueden administrarsele a un sujeto que tiene riesgo de contraer una enfermedad o trastorno (p. ej., infeccion bacteriana) para prevenir o al menos detener de forma parcial el desarrollo de la enfermedad y/o un smtoma o complicacion asociados con la misma. Las cantidades eficaces para utilizacion terapeutica dependeran de, por ejemplo, la composicion del antfgeno, el modo de administracion, el peso y el estado general de salud del paciente, asf como de la opinion del medico que prescriba los farmacos. Pueden administrarse dosis unicas o multiples de las composiciones de antfgeno en funcion de la dosificacion y frecuencia requeridas y toleradas por el paciente y la via de administracion.

5.5.1 Regimen de inmunizacion

[0087] Las composiciones farmaceuticas y/o vacunas de la invencion se le administran a un huesped de modo que proporcionen la produccion de anticuerpos antipolisacarido o antioligosacarido selectivos, preferiblemente, con poca produccion de autoanticuerpos en el huesped o con una produccion no detectable.

[0088] En modos de realizacion concretos, las composiciones de vacuna descritas en el presente documento se administran en serie. En primer lugar, se administra una dosis inmunologicamente eficaz de una vacuna de la invencion a un sujeto. Generalmente, la primera dosis se administra en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria (p. ej., celulas T de activacion). En general, las cantidades para la inmunizacion inicial vanan desde aproximadamente 0,001 mg hasta aproximadamente 1,0 mg por paciente de 70 kilogramos, mas comunmente desde aproximadamente 0,001 mg hasta aproximadamente 0,2 mg por paciente de 70 kilogramos, normalmente aproximadamente 0,005 mg hasta aproximadamente 0,015 mg por paciente de 70 kilogramos. Pueden utilizarse dosificaciones desde 0,001 hasta aproximadamente 10 mg por paciente al dfa, concretamente cuando no se administre el antfgeno en el flujo sangumeo, tal como en una cavidad corporal o en un lumen de un organo. En la administracion oral, nasal o topica son posibles dosificaciones considerablemente superiores (p. ej, 10 a 100 mg o mas).

[0089] Tras la administracion de la primera dosificacion de vacuna, se administra al sujeto una segunda dosis de la vacuna de la invencion terapeuticamente eficaz despues de haber cebado inmunologicamente al sujeto mediante la exposion a la primera dosis. La dosis de recuerdo puede administrarse dfas, semanas o meses despues de la inmunizacion inicial, en funcion de la respuesta y la condicion del paciente.

[0090] La existencia de una respuesta inmunitaria a la primera administracion de vacuna puede determinarse mediante metodos conocidos (p. ej., mediante la obtencion de suero del individuo antes y despues de la inmunizacion inicial y la demostracion de un cambio en el estado inmunitario del individuo, por ejemplo un ensayo de inmunoprecipitacion o un ELISA o un ensayo bactericida o una inmunoelectrotransferencia o ensayo citometrico de flujo o similares) y/o demostracion de que la magnitud de la respuesta inmunitaria a la segunda inyeccion es superior que la de animales de control inmunizados por primera vez con la constitucion de la materia utilizada para la segunda inyeccion (p. ej., cebado inmunologico). El cebado inmunologico y/o la existencia de una respuesta inmunitaria a la primera administracion de vacuna pueden obtenerse tambien mediante la espera de un periodo de tiempo despues de que la primera inmunizacion que, segun la experiencia anterior, constituye un tiempo suficiente para que se hayan dado una respuesta inmunitaria y/o un cebado, por ejemplo, 2, 4, 6, 10 o 14 semanas. Las dosificaciones de recuerdo de la segunda inmunizacion vanan normalmente desde aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 1,0 mg de antfgeno, en funcion de la naturaleza del inmunogeno y la via de inmunizacion.

[0091] En determinados modos de realizacion, se le administra al sujeto una dosis terapeuticamente eficaz de la tercera composicion de vacuna despues de haber cebado al individuo y/o de que se haya aumentado una respuesta inmunitaria a la segunda composicion de vacuna. La tercera dosis de recuerdo puede administrarse dfas, semanas o meses despues de la segunda inmunizacion, en funcion de la respuesta y la condicion del sujeto.

[0092] La presente invencion tambien contempla la utilizacion de una cuarta, quinta, sexta o mayor inmunizacion de recuerdo, mediante la utilizacion de las mismas formulaciones de vacuna o de diferentes formulaciones.

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[0093] En determinados modos de realizacion, las composiciones de antigeno se le administran a un sujeto mamffero (p. ej., humano) que es inmunologicamente primitivo con respecto a la fuente bacteriana de los polisacaridos u oligosacaridos del inmunoconjugado. En un modo de realizacion concreto, el mairnfero es un nino humano de alrededor de cinco anos o mas joven, y preferiblemente alrededor de dos anos o mas joven, y las composiciones de antigeno se administran en cualquiera o cualesquiera de los siguientes intervalos de tiempo: dos semanas, un mes, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10 u 11 meses, o un ano o 15, 18 o 21 meses despues del nacimiento,

0 a los 2, 3, 4 o 5 anos de edad.

[0094] En los modos de realizacion preferidos, la administracion a cualquier marnffero se inicia antes del primer signo de smtomas de enfermedad, o en el primer signo de exposicion posible o real a la infeccion o enfermedad (p. ej. debido a la exposicion o infeccion por Neisseria o E. coli K1).

[0095] Las composiciones de vacuna o farmaceuticas pueden administrarse de manera compatible con la

formulacion de dosificacion y en una cantidad terapeuticamente eficaz. La cantidad que se ha de administrar depende del sujeto que se ha de tratar, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para utilizar el ingrediente activo y el grado de modulacion requerido. Las cantidades eficaces de ingrediente activo requeridas para administrarse dependen de la opinion del medico y son espedficas para cada individuo. Sin embargo, para los infantes humanos, una dosis terapeuticamente eficaz del glicoconjugado inmunogenico dentro de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion comprende aproximadamente 5 a aproximadamente 7,5 |jg, aproximadamente 5 a aproximadamente 10 |jg, aproximadamente 5 a aproximadamente 12,5 |jg,

aproximadamente 5 a aproximadamente 15 jig, aproximadamente 5 a aproximadamente 17,5 jig, aproximadamente 5 a aproximadamente 20 jg, aproximadamente 5 a aproximadamente 25 jg,

aproximadamente 5 a aproximadamente 30 jg, aproximadamente 5 a aproximadamente 35 jg,

aproximadamente 5 a aproximadamente 40 jg, aproximadamente 5 a aproximadamente 45 jg, o aproximadamente 5 a aproximadamente 50 jg; y/o en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente

1.5 jg, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 jg, aproximadamente 1 a aproximadamente 2,5 jg, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 jg, aproximadamente 1 a aproximadamente 3,5 jg, aproximadamente

1 a aproximadamente 4 jg, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 jg, aproximadamente 1 a

aproximadamente 6 jg, aproximadamente 1 a aproximadamente 7 jg, aproximadamente 1 a aproximadamente 8 jg, aproximadamente 1 a aproximadamente 9 jg, o aproximadamente 1 a aproximadamente 10 jg por kg de peso corporal.

[0096] Las composiciones de vacuna o farmaceuticas de la invencion pueden administrarse en combinacion con diversas vacunas que actualmente se utilizan o se encuentran en desarrollo, ya sea previstas para sujetos humanos o no humanos. Ejemplos de vacunas para sujetos humanos y dirigidas a enfermedades infecciosas incluyen la vacuna combinada de toxoide difterico y tetanico; la vacuna de celulas enteras contra la tos ferina; la vacuna antigripal inactivada; la vacuna neumococica 23 valente; vacuna contra el sarampion viva; vacuna contra las paperas viva; vacuna contra la rubeola viva; vacuna Bacillus de Calmette y Guerin (BCG) contra la tuberculosis; vacuna contra la hepatitis A; vacuna contra la hepatitis B; vacuna contra la hepatitis C; vacuna contra la rabia (p. ej., vacuna con celulas diploides humanas); vacuna contra la poliomielitis; vacuna meningococica polisacarida; vacuna meningococica cuadrivalente; vacuna contra el virus vivo de la fiebre amarilla; vacuna de celulas enteras muertas contra la tifoidea; vacuna contra el colera; vacuna con virus inactivado contra la encefalitis B japonesa; vacuna contra el adenovirus; vacuna contra el citomegalovirus; vacuna contra el rotavirus; vacuna contra la varicela; vacuna anticarbuncosa; vacuna contra la viruela; y otras vacunas disponibles en el mercado y experimentales.

5.6 Caracterizacion y demostracion de utilidad terapeutica

[0097] Diversos aspectos de las composiciones farmaceuticas de la invencion se someten a ensayo preferiblemente in vitro, es decir, en un sistema de cultivo celular y, a continuacion, in vivo, por ejemplo, en un organismo modelo animal, tal como un sistema de modelo de animales roedores, para la actividad terapeutica deseada antes de la utilizacion en humanos. Los ensayos que pueden utilizarse para analizar las probabilidades de generar una respuesta inmunitaria terapeutica a una composicion de vacuna concreta se conocen en la tecnica.

[0098] Combinaciones de agentes profilacticos y/o terapeuticos pueden someterse a ensayo en sistemas de modelos animales adecuados antes de su utilizacion en humanos. Dichos sistemas de modelos animales incluyen, pero sin caracter limitativo, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, cerdos, perros, conejos, etc. Puede utilizarse cualquier sistema animal conocido en la tecnica. En un modo de realizacion espedfico de la invencion, se someten a ensayo combinaciones de agentes profilacticos y/o terapeuticos en un sistema de modelo de raton. Pueden administrarse de forma repetida agentes profilacticos y/o terapeuticos. Diversos aspectos del procedimiento pueden variar, tal como el regimen temporal de la administracion de los agentes profilacticos y/o terapeuticos, y si dichos agentes se administran de forma separada o como una mezcla.

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5.7 Estudios de toxicidad

[0099] La toxicidad y/o la eficacia de las composiciones de la presente invencion pueden determinate mediante procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos celulares o animales de experimentacion, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la poblacion) y la ED50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50 % de la poblacion). La proporcion de dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico y puede expresarse como la proporcion LD50/ED50. Se prefieren las terapias que muestran altos indices terapeuticos. Si bien pueden utilizarse las terapias que muestran efectos secundarios toxicos, debena tenerse cuidado para disenar un sistema de suministro que dirija dichos agentes al lugar de tejido danado con el fin de minimizar los posibles danos a celulas no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.

[0100] Los datos obtenidos a partir de estudios animales pueden utilizarse en la formulacion de un rango de dosificacion de las terapias para la utilizacion en sujetos. La dosificacion de dichos agentes se situa preferiblemente en una franja de concentraciones que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificacion puede variar dentro de este intervalo en funcion de la forma de dosificacion empleada y de la via de administracion utilizada. Para cualquier terapia utilizada en el metodo de la invencion, la dosis terapeuticamente eficaz puede calcularse inicialmente a partir de ensayos animales. Puede formularse una dosis en modelos animales para obtener un intervalo de concentracion administrado que incluye la IC50 (es decir, la concentracion del compuesto de ensayo que obtiene una inhibicion media maxima de los smtomas) como se determina en los modelos de animales. Dicha informacion puede utilizarse para determinar de forma mas precisa dosis utiles en sujetos (p. ej., humanos).

5.8 Kits

[0101] La invencion tambien abarca kits, que tienen una dosis unitaria de la composicion presente en una forma de almacenamiento estable, que se puede disolver o diluir hasta la dosificacion deseada junto con dispositivos de embalaje y de manipulacion adecuados para facilitar la mezcla y para mantener la esterilidad antes de su instilacion. Dicho kit puede incluir, por ejemplo, un primer recipiente que contiene ingrediente activo en una forma de almacenamiento estable, como una dosis unitaria en una solucion madre o una dosis unitaria como polvo liofilizado; y un segundo recipiente que contiene diluyente o solvente y diluyente, por separado o en combinacion, cuyo volumen proporcionara una dosis unitaria de compuesto terapeutico en un volumen adecuado para la administracion; medios para combinar diluyente con la solucion madre o polvo liofilizado; y, opcionalmente, medios para administrar la dosis al paciente. Medios para transferir diluyente a la solucion madre o polvo liofilizado pueden incluir, pero sin caracter limitativo, jeringas o recipientes multicamara que tienen un cierre interno que puede romperse que separa el ingrediente activo del diluyente.

[0102] La invencion da a conocer un pack o kit farmaceutico que comprende uno o mas recipientes llenos de la composicion farmaceutica de la invencion o de una porcion de la misma. Adicionalmente, tambien pueden incluirse en el pack o kit farmaceutico uno o mas agentes profilacticos o terapeuticos utiles para el tratamiento de una enfermedad o trastorno. La invencion da a conocer tambien un pack o kit farmaceutico que comprenden uno o mas recipientes llenos de uno o mas de los ingredientes de las composiciones farmaceuticas de la invencion. De forma opcional, puede haber una nota asociada con dicho o dichos recipientes en la forma prescrita por un organismo gubernamental que regule la fabricacion, utilizacion o venta de productos farmaceuticos o biologicos; dicha nota refleja la aprobacion del organismo de fabricacion, utilizacion o venta para la administracion humana.

[0103] Por lo general, los ingredientes de las composiciones de la invencion se suministran por separado o mezclados en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente cerrado hermeticamente tal como una ampolla o sobre que indica la cantidad de agente activo. En determinados modos de realizacion, las composiciones de la invencion tambien comprenden agentes de carga, tales como cloruro de sodio, manitol, polivinilpirrolidona y similares, para proporcionar suficiente materia para facilitar la manipulacion tras la liofilizacion.

[0104] La presente invencion da a conocer kits que pueden utilizarse en los metodos anteriores. En un modo de realizacion, un kit comprende una o mas composiciones farmaceuticas de la invencion. En otro modo de realizacion, un kit tambien comprende uno o mas agentes profilacticos o terapeuticos utiles para el tratamiento de una enfermedad infecciosa o smtoma asociado a la misma, en uno o mas recipientes.

[0105] Si bien se ha expuesto la invencion mediante ejemplos de modos de realizacion espedficos, otros modos de realizacion, metodos, composiciones, ingredientes activos, indicaciones, composiciones y kits seran evidentes para los expertos en la materia. Todas dichas alteraciones y extensiones se incluyen con la invencion, como se expone y se reivindica en el presente documento.

6. EJEMPLOS

6.1 EJEMPLO I: Conjugacion:

[0106] La figura 1 presenta un flujograma esquematico del metodo generalizado de la invencion. Al menos uno de los grupos N-acetilo (por ejemplo, de GlcNAc, ManNAc, GalNAc y acido sialico) en un polisacarido se

5 sustituye por una fraccion N-acilo para formar el compuesto de la Formula I con la utilizacion de un alcali, seguido de N-pentenoilacion (con la utilizacion de una cadena alifatica no saturada de 5 carbonos). A continuacion, el compuesto acilado resultante se oxida para generar grupos aldehfdos activos en el sitio no saturado de los grupos pentenoilos. El compuesto oxidado, a continuacion, se conjuga con una protema portadora mediante aminacion reductiva del polisacarido activado, generando el glicoconjugado inmunogenico. 10 Puede mostrarse la inmunogenicidad del producto mediante la utilizacion de un modelo animal (infra).

[0107] Para todos los experimentos, se analizo el progreso de la conjugacion con un sistema biologico (Bio-Rad) equipado con una columna superose 12. Se indico la conjugacion del polisacarido con la protema antigenica a traves del incremento progresivo en un pico, monitorizado por la medicion de la absorbancia UV a 280 nm, con elucion en el volumen nulo de la columna. Despues de completarse la conjugacion, se neutralizaron las

15 soluciones a pH7 con 0,1N HCI y, a continuacion, se dializo contra PBS. Se purifico el conjugado pasandolo sobre una columna de Superdex 200 PG (Pharmacia) de 1,6x60 cm y se eluyo con PBS que contema 0,01 % de timerosal. Se agruparon fracciones correspondientes al pico de volumen nulo. Se calculo el contenido de carbohidratos y protemas en el conjugado mediante el ensayo fenol-sulfurico de Dubois et al. (51) y el ensayo Coomassie de Bradford (9).

20 6.2 EJEMPLO II. CONJUGADO POLISACARIDO-PROTEJnA DE STREPTOCOCCUS DEL GRUPO A (GAS,

por sus siglas en ingles)

Sustitucion de una porcion (35-40 %) de los grupos N-acetilo de polisacarido de GAS

[0108] Se trato polisacarido de GAS (30 mg/ml) en 0,012 N de NaOH con NaBH4 (8 mg/ml) durante 75 min con agitacion a temperatura ambiente ((TA) aproximadamente 20-25 °C). Se anadieron 3 N de NaOH (1/2 del

25 volumen de 0,012 N de NaOH) a la mezcla de reaccion con agitacion para obtener una concentracion final de polisacarido de GAS de 20 mg/ml. A continuacion, se mantuvo la mezcla de reaccion a 80 °C durante 1 h. A continuacion, se enfrio a TA y se diluyo con agua a una concentracion final de polisacarido de GAS de 4 mg/ml. Se diafiltro contra agua utilizando membrana de celulosa regenerada 3K en una celula con agitacion. Se utilizo un volumen 15x de agua para la diafiltracion para obtener una concentracion de GAS de 24 mg/ml. El grado de 30 sustitucion de grupos N-acetilo por grupos amino primarios se monitorizo mediante espectroscopia 1H-RMN.

N-acilacion (por ejemplo, N-pentenoilacion) (15-25 %) de polisacarido de GAS sustituido por grupo N-acetilo:

[0109] Se anadio 4-cloruro de pentenoilo (1ml/100 mg de polisacarido) en 1,4 dioxano (1 ml/ml de 4-cloruro de pentenoilo) gota a gota a una solucion de polisacarido de GAS sustituido por grupo N-acetilo (24 mg/ml) durante un periodo de 75 min con agitacion a TA. El pH de la solucion se mantuvo entre 6.8 y 9.5 mediante la adicion

35 gota a gota de 3 N de NaOH. El pH de la mezcla de reaccion se elevo a 12.7 mediante la adicion gota a gota de

3 N de NaOH y se agito a TA durante 45 min. A continuacion, el pH de la mezcla de reaccion se disminuyo a 7.7 mediante la adicion gota a gota de 1 N de HCl a TA. La mezcla de reaccion se diluyo con agua a una concentracion final de 4 mg/ml de polisacarido de GAS y se diafiltro utilizando membranas 3k en una celula con agitacion utilizando agua. Se recogio un 10x de volumen de agua como filtrado. Finalmente, el retenido se 40 concentro a una concentracion de polisacarido de 24 mg/ml y se almaceno a -20 °C.

Terminacion de cadena opcional (por ejemplo, N-acetilacion) del polisacarido de GAS sustituido por grupo N- acetilo (por ejemplo, N-pentenoilado) (vease la figura 2):

[0110] Se anadio anhfdrido acetico (0,6 ml/100 mg de polisacarido) gota a gota a una solucion agitada de polisacarido de GAS N-pentenoilado (24 mg/ml) durante un periodo de 75 min a TA. El pH de la solucion se

45 mantuvo entre 6.8 y 9.5 mediante la adicion gota a gota de 3 N de NaOH. A continuacion, el pH de la mezcla de

reaccion se elevo a 12.7 mediante la adicion gota a gota de 3 N de NaOH y se agito a TA durante 60 min. A continuacion, el pH de la mezcla de reaccion se disminuyo a 7.7 mediante la adicion gota a gota de 1 N de HCl a TA. La mezcla de reaccion se diluyo con agua a una concentracion final de 4 mg/ml de polisacarido de GAS y se diafiltro utilizando membranas 3K en una celula con agitacion utilizando agua. Se recogio un 15x de volumen de 50 agua como filtrado. Finalmente, el retenido se concentro a una concentracion de polisacarido de 24 mg/ml y se almaceno a -20 °C. Se calculo la incorporacion de grupos pentenoilo en los polisacaridos mediante analisis 1H- RMN 600 MHz (vease la figura 3).

Oxidacion del polisacarido de GAS sustituido por grupo N-acilo (por eiemplo, N-pentenoilado) (vease la figura 2):

[0111] Se anadio metanol (1/2 el volumen de la solucion de polisacarido) lentamente a una solucion agitada de polisacarido de GAS N-pentenoilo en agua (24 mg/ml) a TA. La mezcla se enfrio a entre aproximadamente -15 y -20 °C mediante la utilizacion de un bano de etanol-hielo seco. Se hizo borbotear ozono (generado a partir del

5 aire mediante la utilizacion del ozonizador Ozomax 1) en la mezcla de reaccion lentamente agitada durante 40

min manteniendo la temperatura de -15 a -20 °C. A continuacion, se hizo borbotear nitrogeno en la mezcla durante 10 min para expulsar el exceso de ozono. A continuacion, se diluyo la reaccion con agua a una concentracion final de 5 mg/ml de polisacarido y se diafiltro utilizando membranas 3K en una celula con agitacion utilizando agua. Se recogio 25x el volumen de agua como filtrado y se concentro el retenido a una concentracion 10 de polisacarido de 20 mg/ml. A continuacion, se liofilizo para su utilizacion en la siguiente etapa.

Coniugacion con toxoide tetanico/toxoide tetanico recombinante. fragmento C:

[0112] Se anadio polisacarido de GAS N-butiloxi (N-BuO) (96 mg/ml, 1 ml) (resultante de la oxidacion de un polisacarido de GAS N-pentenoilo) en tampon fosfato 0,2 mM (pH 7.7) a una solucion de toxoide tetanico (conc. 120 mg/ml, 0,25 ml) en tampon fosfato (pH 7.7). Se anadio cianoborohidruro de sodio (40 mg) a la solucion y se

15 agito la mezcla de reaccion para obtener una mezcla homogenea. Se incubo la mezcla de reaccion a 37 °C

durante 48 h con agitacion suave. Tras 24 h, se anadieron otros 16 mg de cianoborohidruro de sodio y se dejo continuar la reaccion durante otras 48 h. Tras 48 h, se anadieron otros 4 mg adicionales de cianoborohidruro de sodio y se dejo la reaccion a 37 °C con agitacion durante 24 h adicionales.

[0113] A continuacion, se anadio una solucion 5 % de borohidruro de sodio en 0,05 N de NaOH (0,5 ml) y se

20 agito suavemente a TA durante 1 h. Seguidamente, se anadio una solucion de 1 N de acido acetico (0,72 ml en 3

partes) con agitacion a TA. Se diluyo la reaccion con PBS (pH 7.4) a 32 ml y se purifico en un sistema Labscale TFF mediante la utilizacion de una membrana 30K. Se recogio un 30x de volumen de filtrado. Se filtro el retenido (30 ml) a traves de un filtro de 0,2 micras y se anadio una solucion 10 % de timerosal en PBS (0,3 ml) a la solucion de conjugado. La solucion de conjugado se almaceno a 2-8 °C. En la tabla 1, se muestran 25 composiciones de polisacarido-protema de GAS.

6.3 Ejemplo III. Conjugados polisacarido-protema de meningococo B:

N-acilacion (por eiemplo, N-pentenoilacion) (15-25 %) de polisacarido meningococico B sustituido por grupo N- acetilo:

[0114] Se anadio 4-cloruro de pentenoilo (1 ml/100 mg de polisacarido) en 1,4 dioxano (1 ml/ml de 4-cloruro de

30 pentenoilo) gota a gota a una solucion de polisacarido sustituido por grupo N-acetilo (24 mg/ml) durante 75 min

con agitacion a TA. El pH de la solucion se mantuvo entre 6.8 y 9.5 mediante la adicion gota a gota de 3 N de NaOH. A continuacion, el pH de la mezcla de reaccion se elevo a 12.7 mediante la adicion gota a gota de 3 N de NaOH y se agito a TA durante 45 min. A continuacion, el pH de la mezcla de reaccion se disminuyo a 7.7 mediante la adicion gota a gota de 1 N de HCl a TA. A continuacion, se diluyo la mezcla de reaccion con agua a 35 una concentracion final de 4 mg/ml de polisacarido y se diafiltro utilizando membranas 3K en una celula con agitacion utilizando agua. Se recogio un 10x de volumen de agua como filtrado. Finalmente, el retenido se concentro a una concentracion de polisacarido de 24 mg/ml y se almaceno a -20 °C.

Terminacion de cadena opcional (por eiemplo, N-propionilacion) del polisacarido meningococico B sustituido por grupo N-acetilo (por eiemplo, N-pentenoilado) (vease la figura 4):

40 [0115] Se anadio gota a gota una mezcla de etanol anhidro propionico (2,5:1, 0,84 ml/100 mg de polisacarido) a

una solucion de polisacarido N-pentenoilado (24 mg/ml) durante 75 min con agitacion a TA. El pH de la solucion se mantuvo entre 6.8 y 9.5 mediante la adicion gota a gota de 3 N de NaOH. A continuacion, el pH de la mezcla de reaccion se elevo a 12.7 mediante la adicion gota a gota de 3 N de NaOH y se agito a TA durante 60 min. A continuacion, el pH de la mezcla de reaccion se disminuyo a 7.7 mediante la adicion gota a gota de 1 N de HCl a 45 TA. La mezcla de reaccion se diluyo con agua a una concentracion final de 4 mg/ml de polisacarido y se diafiltro utilizando membrana 3K en una celula con agitacion utilizando agua. Se recogio un 15x de volumen de agua como filtrado. Finalmente, el retenido se concentro a una concentracion de polisacarido de 24 mg/ml y se almaceno a -20 °C. Se calculo la incorporacion de grupos pentenoilo en los polisacaridos mediante analisis 1H- RMN 600 MHz (vease la figura 5).

50 Oxidacion del polisacarido meningococico B del grupo B (GBMP. por sus siglas en ingles) sustituido por grupo N- acilo (por eiemplo, N-pentenoilado) y opcionalmente con terminacion de cadena (por eiemplo, N-propionilado)

5

10

15

20

25

30

35

(Vease la figura 4):

[0116] Se anadio metanol (1/2 el volumen de la solucion de polisacarido) lentamente a una solucion de GBMP N- pent-N-Pr en agua (24 mg/ml) con agitacion a TA. A continuacion, se enfrio la mezcla a entre aproximadamente - 15 y -20 °C mediante la utilizacion de un bano de etanol-hielo seco. Se hizo borbotear ozono (generado a partir del aire mediante la utilizacion del ozonizador Ozomax 1) en la mezcla de reaccion ligeramente agitada durante 40 min manteniendo la temperatura a aproximadamente -15 a -20 °C. A continuacion, se hizo borbotear nitrogeno en la mezcla durante 10 min para expulsar el exceso de ozono. A continuacion, se diluyo la reaccion con agua a una concentracion final de 5 mg/ml de polisacarido y se diafiltro utilizando membranas 3K en una celula con agitacion con agua. Se recogio 25x el volumen de agua como filtrado y se concentro el retenido a una concentracion de polisacarido de 20 mg/ml. A continuacion, se liofilizo para su utilizacion en la siguiente etapa.

Coniugacion con protena meningococica recombinante (rPorB)/proteina de la membrana exterior (OMPC, por sus siglas en ingles) de bacterias meningococicas:

[0117] Se anadio GBMP activado N-butanoiloxi-(NbuO)N-Pr (N-But-[-CH=O]-N-Pr-GBMP, 17 mg/ml, 1 ml) en tampon HEPES (pH 8.5) a solucion de rPorB/OMPC (conc. 15 mg/ml) en tampon HEPES (pH 8.5). La concentracion final de la protema y el polisacarido en la mezcla de reaccion era 1:3. Se anadio cianoborohidruro de sodio (0,5 veces la masa del polisacarido) y se agito la mezcla de reaccion para asegurar una mezcla homogenea. Se incubo la mezcla de reaccion a 37 °C durante 24 h con agitacion suave. Tras 24 h, se volvio a anadir cianoborohidruro de sodio (0,125 veces la masa de polisacarido) y se continuo la reaccion durante otras 48 h. Tras 48 h, se anadio una cantidad adicional de cianoborohidruro de sodio (0,032 veces la masa de polisacarido) a la mezcla y se mantuvo la reaccion a 37 °C con agitacion durante 24 h.

[0118] A continuacion, se anadio una solucion 5 % de borohidruro de sodio en 0,05 N de NaOH (0,2 x del volumen de reaccion original) y se agito ligeramente a TA durante 1 h. Se anadio una solucion de 1 N de acido acetico (0,3 x del volumen de reaccion original en 3 partes) con agitacion a TA. Se diluyo la reaccion con PBS (pH 7.4) a y, a continuacion, se purifico en un sistema Labscale TFF mediante la utilizacion de una membrana 30K. Se recogio un 30x de volumen de filtrado. Se filtro el retenido a traves de un filtro de 0,2 micras y se anadio una solucion 10 % de timerosal en PBS (concentracion final de timerosal 0,01 %) a la solucion de conjugado. La solucion de conjugado se almaceno a 2-8 °C. En la tabla 1, se muestran composiciones de conjugados polisacarido-protema meningococico B.

6.4 EJEMPLO IV. CONJUGADO POUSACARIDO-PROTEfNA DE MENINGOCOCO C:

[0119] Se llevo a cabo la sustitucion de parte de los grupos N-acetilo, la acilacion, oxidacion y conjugacion con protema siguiendo los procedimientos descritos anteriormente. En la tabla 1, se muestran las composiciones de conjugados polisacarido-protema de meningococo C.

6.5 EJEMPLO V. CONJUGADO POUSACARIDO-PROTEfNA DE STREPTOCOCCUS TIPO III DEL GRUPO B:

[0120] Se llevo a cabo la activacion y la conjugacion polisacarido-protema de Streptococcus tipo III del grupo B mediante procedimientos experimentales similares a los descritos anteriormente. En la tabla 1, se muestran las composiciones de conjugados polisacarido-protema de Streptococcus tipo III del grupo B.

Tabla 1. Composicion del conjugado polisacarido-protema.

Conjugados: Polisacarido Protema (%) de protema en el conjugado (%) de polisacarido en el conjugado

GASP-TT: Parcial-N-But- (CH=O)-GASP Toxoide tetanico 57 43

GASP-rTT(C): Parcial-N-But- (CH=O)-GASP Toxoide tetanico recombinante (fragmento C) 70 30

B-rPorB meningococico: N-But-(CH=O)-N- Pr-MenB Por B recombinante 50 50

C-TT meningococico: Parcial N-But- (CH=O)-MenC Toxoide tetanico 57 43

TT de Streptococcus tipo III del grupo B: Parcial N-But- (CH=O)-GBSIII Toxoide tetanico 60 40

5

10

15

20

25

6.6 EJEMPLO VI. INMUNIZACION DE RATONES BALB C CON CONJUGADOS GASP-TT

[0121] Los conjugados (10 |jg/ml en tampon PBS) se formularon con gel anhidro (1 mg/ml). Se inyectaron suspensiones de solucion de conjugado (200 ml, 2 jg equivalente de polisacarido conjugado) en gel anhidro en ratones Balb/c a intervalos de 2 semanas. Tras 3 inyecciones consecutivas, se recogieron muestras de sangre 1 semana despues de la ultima inyeccion. Se separo el suero de la muestra y se cuantificaron los anticuerpos antipolisacarido en el suero sangumeo mediante ELISA. En la figura 6, se muestran los resultados de la respuesta inmunitaria inducida por los conjugados de polisacarido-toxoide tetanico de Streptococcus del grupo A contra los polisacaridos en ratones Balb/c.

6.7 EJEMPLO VII. INMUNIZACION DE RATONES CD1 CON CONJUGADOS MENGB-RPORB:

[0122] Los conjugados (10 jg/ml en tampon PBS) se formularon con gel anhidro (1 mg/ml). Se inyectaron suspensiones de solucion de conjugado (200 ml, 2 jg equivalente de polisacarido conjugado) en gel anhidro en ratones CD1 a intervalos de 2 semanas. Tras 3 inyecciones consecutivas, se recogieron muestras de sangre 1 semana despues de la ultima inyeccion y se separo el suero. Se determinaron anticuerpos espedficos polisacaridos en el suero mediante ELISA. Se determino la actividad bactericida del suero mediante la medicion de la inhibicion del crecimiento bacteriano en placa recubierta de agar chocolate en presencia de un suero. En la tabla 2, se muestra la actividad bactericida del suero generada por los conjugados de polisacarido-rPorB meningococico B en ratones CD1.

[0123] La actividad bactericida del suero (ABS) de los sueros generada por 3 lotes separados de conjugados NPr-(NbuO)-GBMP-rPorB, lote 1 a lote 3, preparados segun la invencion, fue considerablemente superior despues del sangrado en los dfas 42 y 52 que la ABS de los sueros generados a partir de los conjugados NPr- GBMP-rPorB, que se prepararon mediante aminacion reductiva convencional de los terminales de cadena del acido sialico (Vease la tabla 2). Se cree que los conjugados preparados segun la invencion logran una respuesta inmunitaria mejorada debido a la utilizacion de fracciones polisacaridas de tamano relativamente mayor, que se activan en multiples sitios a lo largo de la cadena de polisacarido y mejoran la reticulacion de los conjugados.

Tabla 2. Actividad bactericida del suero generada por los conjugados polisacarido-rPorB de

meningococo B en ratones CD1.

Conjugados: *ABS dia 42 *ABS dia 52

N-Pr-GBMP-rPorB: 1090 1949

N-Pr (NBut)-GBMP-rPorB, lote 1: 4753 8073

N-Pr-(NBut)-GBMP-rPorB, lote 2: 2080 6154

N-Pr-(NBut)-GBMP-rPorB, lote 3: 3373 4100

*Actividad bactericida del suero.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

10
2.

15
3.

20
4.

25 5.
6.
7.

30
8. 9.

Un metodo de elaborar un glicoconjugado inmunogenico que comprende

a) sustituir al menos un grupo N-acetilo en un oligosacarido o polisacarido antigenico comprendiendo uno o mas aminoazucares sustituidos por N-acetilo por una fraction N-acilo que comprende una fraccion alquilo no saturada mayor que 5 carbonos, donde al menos un doble enlace se encuentra entre dos carbonos que no sean entre los carbonos 1 y 2 o entre los carbonos 2 y 3 de la fraccion alquilo no saturada;

b) poner en contacto el oligosacarido o polisacarido sustituido con un agente oxidante para generar al menos un grupo aldehido activo en un sitio de no saturation de dicha fraccion alquilo; y

c) conjugar el oligosacarido o polisacarido a traves del al menos un grupo aldehido activo con una protema portadora,

generando de esta manera un glicoconjugado inmunogenico.

El metodo segun la reivindicacion 1, donde dicha sustitucion del al menos un grupo N-acetilo comprende, en primer lugar, des-N-acetilar el al menos un grupo N-acetilo de dicho oligosacarido o polisacarido antigenico para formar un oligosacarido o polisacarido que tiene al menos un aminoazucar que comprende un grupo amino primario y, a continuation, unir dicha fraccion N-acilo en dicho grupo amino primario.

El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, donde el grupo N-acetilo del oligosacarido o polisacarido se sustituye por un grupo N-acilo no saturado para formar la formula I:

donde R1 es una fraccion alquilo no saturada C6, C7, C8, Cg, C10, o Cn y {azucar} representa dicho uno o mas aminoazucares.

El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el alquilo no saturado tiene 6 carbonos de longitud.

El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde un doble enlace se ubica entre los dos carbonos terminales de la fraccion alquilo no saturada.

El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicha fraccion alquilo no saturada tiene un doble enlace, dicho doble enlace se ubica entre los dos carbonos terminales de la fraccion alquilo.

El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, donde dicha fraccion N-acilo esta enlazada a dicho uno o mas aminoazucares en la posicion 1, 2, 3, 4 o 5 de dicho uno o mas aminoazucares.

El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, donde el oligosacarido o polisacarido esta conjugado con la protema portadora a traves del grupo aldehido de la fraccion N-acilo mediante aminacion reductiva.

El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, donde la protema portadora y el oligosacarido o polisacarido del glicoconjugado estan enlazados de forma covalente a traves de un enlace como sigue:

imagen1

5

10

15

20

25

30

35

azucar

r

,MH

o=<

Ra

m

i

Protema

donde R2 es una fraction alquilo saturada C6, C7, C8, C9, o C10, donde el NH del enlace pertenece a un grupo NH2 primario de la protefna, y donde {azucar} representa dicho uno o mas aminoazucares.
10. El metodo segun la reivindicacion 1, donde el grupo N-acetilo se sustituye por un grupo N-pentenoilo, y donde el grupo N-pentenoilo sirve como enlace en la conjugation del compuesto con la protefna portadora.
11. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, donde el grupo N-acelilo es una fraccion de dicho uno o mas aminoazucares, dicho uno o mas aminoazucares es uno o mas de GlcNAc, ManNAc, GalNAc y acido sialico.
12. El metodo segun la reivindicacion 1, donde el grupo N-acetilo se sustituye por una fraccion N-acilo para formar la formula I mediante la utilization de un alcali.
13. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, donde la protefna portadora es toxina/toxoide tetanica/o, CRM197, protefnas de la membrana exterior de bacterias gramnegativas, P6 y P4 de Haemophilus influenzae no tipificable, CD y USPA de Moraxella catarrhalis, toxina/toxoide difterica/o, toxina A de Pseudomonas aeruginosa destoxificada, toxina/toxoide del colera, toxina/toxoide pertussis, exotoxinas/toxoide de Clostridium perfringens, antfgeno de superficie de la hepatitis B, antfgeno central de la hepatitis B, protefna de rotavirus VP7 o protefnas F y G del virus respiratorio sincitial o una parte activa de los mismos.
14. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, donde el oligosacarido o polisacarido es un oligosacarido o polisacarido de una bacteria, donde la bacteria es Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix, Clostridium, Haemophilus, Shigella, Klebsiella, Vibrio cholerae, Neisseria, o Escherichia; o donde el oligosacarido o polisacarido es un polisacarido capsular derivado de estreptococos del grupo B, estreptococos del grupo A, Neisseria meningitides, S. pneumoniae, o Escherichia coli; o donde dicho polisacarido capsular se deriva de: estreptococos del grupo B tipo la, Ib, II, III, V, VI o VIII, o de Neisseria meningitidis tipo B, C, Y, o W135; o de S. pneumoniae tipo III, IV, o XIV; o de Escherichia coli KI.
15. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, donde el glicoconjugado inmunogenico comprende al menos dos oligosacaridos o polisacaridos conjugados con una unica protefna portadora y/o al menos dos protefnas portadoras conjugadas con un unico oligosacarido o polisacarido.
16. Una composition farmaceutica que comprende el glicoconjugado inmunogenico segun la reivindicacion 1, 2 o 15 y un portador farmaceuticamente aceptable; comprendiendo opcionalmente tambien una pluralidad de oligosacaridos o polisacaridos; y/o comprendiendo ademas una pluralidad de protefnas portadoras; y/o comprendiendo una pluralidad de glicoconjugados inmunogenicos; y/o comprendiendo ademas uno o mas adyuvantes.
17. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 16 para su utilizacion en un metodo de induction de una respuesta inmunitaria a uno o mas tipos de bacterias, o para su utilizacion en un metodo de tratamiento o prevention de una infection bacteriana en un sujeto que la necesite.

Figura 1.

-Azucar -

OH" ( Alcali

NHAc

Sustitucion/Desacetilacion del al menos un grupo N- acetilo

■ Azucar■

NH,

Aminoazucar: Oligosacarido o polisacarido que contiene al menos un grupo N-acetilo

/- 1. N-Acilacion (p. ej., cloruro de acilo o anhidrido de acilo, por ejemplo, N- Pentenoilacion con cloruro de pentenoilo o anhidrido pentenoico
2. Terminacion de cadena opcional: N- acilacion (p., ej. N-acetilacion mediante la utilizacion de anhidrido acetico

imagen2

Azucar N-acilado (p. ej., azucar N-pentenoilado)

Oxidacion

imagen3

Conjugacion

"Azucar"

NHC 2

NH"

■Protelna

O

Figura 2.

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

Figura 3.

Polisacarido parcialmente sustituido

Polisacarido nativo por grupo N-aceti|0

imagen10

imagen11

Polisacarido parcialmente N-pentenoilado Polisacarido activado tras oxidacion

imagen12

imagen13

Figura 4.

imagen14

Figura 5.

Polisacarido sustituido-N-Ac Polisacarido N-Pent

H3-eq-NeuAc

imagen15

Polisacarido sustituido-Pent-NPr

-CH3

imagen16

imagen17

Polisacarido N-But-(CH=O)-N-Pr

imagen18

Figura 6.

imagen19

Inmunizaciones